JP2024516882A - 構築物と免疫刺激性化合物の共発現 - Google Patents

構築物と免疫刺激性化合物の共発現 Download PDF

Info

Publication number
JP2024516882A
JP2024516882A JP2023568692A JP2023568692A JP2024516882A JP 2024516882 A JP2024516882 A JP 2024516882A JP 2023568692 A JP2023568692 A JP 2023568692A JP 2023568692 A JP2023568692 A JP 2023568692A JP 2024516882 A JP2024516882 A JP 2024516882A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antigen
vector
unit
human
antigens
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023568692A
Other languages
English (en)
Inventor
ブルンスビク フレドリクセン アンゲネテ
トリュッゲ ハウゲン ベルサース アウドゥン
グラヌン スティン
ディラール ピエール
Original Assignee
ナイコード セラピューティクス アルメン アクスイェ セルスカプ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ナイコード セラピューティクス アルメン アクスイェ セルスカプ filed Critical ナイコード セラピューティクス アルメン アクスイェ セルスカプ
Publication of JP2024516882A publication Critical patent/JP2024516882A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/521—Chemokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55516—Proteins; Peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A61K2039/55538—IL-12
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本発明は、別個の分子として共発現するように操作された複数の核酸配列を含むＤＮＡプラスミドなどのベクターに関する。このような別個の分子は、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニット、二量体化ユニットなどの多量体化ユニット、及び１又は複数の抗原又はその一部、及び１又は複数の免疫刺激性化合物を含む抗原ユニットを含む第１のポリペプチドを含む。

Description

本発明は、別個の分子として共発現するように操作された複数の目的の核酸配列を含むＤＮＡプラスミドなどのベクター、そのようなベクターを含む医薬組成物、及び疾患の治療又は予防におけるそのようなベクター及びそのような医薬組成物の使用に関する。
Ｂ細胞（体液性／抗体媒介）応答とＴ細胞応答は、病原体による感染に対する防御応答の重要な構成要素である。病原体抗原に対する特異的抗体は、以下のような広範なエフェクター機能を媒介する。ａ）毒素や病原体の直接的な中和、ｂ）病原体の病原性因子の中和、ｃ）病原体のムチンへの結合と捕捉、ｄ）補体を活性化して抗病原体の食作用性のクリアランス、分解、又は溶解を媒介する、ｅ）好中球のオプソノファゴサイトーシスを活性化する、ｆ）マクロファージのオプソノファゴサイトーシスを誘導する、ｇ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の脱顆粒を活性化して感染細胞を死滅させる、ｈ）樹状細胞によるＴ細胞及びＢ細胞への抗原アップデート（ａｎｔｉｇｅｎ ｕｐｄａｔｅ）、プロセシング、提示を増強する、ｉ）寄生虫感染症における肥満細胞、好塩基球及び好酸球の脱顆粒を誘導する（Ｌ． Ｌｕ ｅｔ ａｌ、 Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８（１）， ２０１８， ４６）。
これらの活性を補完するＴ細胞応答は、感染細胞を死滅させ、アポトーシスを誘導し、抗ウイルス物質を放出し、及び／又は既に感染している細胞の細胞内溶解を増加させることにより、ウイルスの複製と感染を制限するために重要であり、その結果、疾患の予防、重症度の軽減、又は治癒に役立つ。さらに、両免疫における効果的かつ長期的な反応には、通常、Ｔ－ヘルパー（Ｔｈ１及びＴｈ２）リンパ球からのさらなる支援が必要である。
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）もまた、細胞内病原体などで重要な役割を果たしており（Ｆ． Ｓｈｅｐｅｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ ２１， ２０２０， ６１４４）、ここで、ＭＨＣクラスＩ制限ＣＤ８＋ Ｔ細胞は細菌感染を除去するのに重要であり、かつ、様々な細菌種に対する防御免疫を提供することが知られている。ＭＨＣクラスＩＩ制限ＣＤ４＋ Ｔ細胞はメモリーＣＤ８＋ Ｔ細胞応答をサポートし、かつ、細菌感染に対する防御免疫に重要である。ナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞は、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）やＴｈ２細胞のようなエフェクター能力を持つ細胞のサブセットを分化させる。抗原提示細胞（ＡＰＣ）表面の特異的Ｔ細胞エピトープと結合した後、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞は、抗体免疫とＣＴＬ免疫のバランスを調節する特異的な可溶性のサイトカインシグナルを供給する。このように、効果的な免疫には、Ｔヘルパー細胞による特異的病原体免疫原決定基（エピトープ）の複数の抗原認識イベントと、それに続くＢ細胞、ＣＴＬ、又はその両方による分子認識が関与している。
異なるタイプのリンパ球（Ｂ細胞、ＣＴＬ、及びＴｈ細胞）は、病原体の異なるタイプのエピトープを特異的に認識する。Ｂ細胞エピトープは、線状エピトープとコンフォメーション型エピトープに分類することができ、線状エピトープは多くの場合、ネイティブタンパク質中のコンフォメーション型Ｂ細胞エピトープの一部である。コンフォメーション型エピトープは、ウイルスエンベロープ、細菌外膜、分泌された細菌毒素など、病原体表面に露出した構造的特徴である。Ｔ細胞エピトープは、病原体のあらゆるタンパク質に由来する短いペプチドであり、宿主の抗原処理機構及びＭＨＣ結合機構、特にクラスＩ又はクラスＩＩのＭＨＣハプロタイプ制限機構に適合していればよい。適切なＴ細胞エピトープは、宿主集団や病原体にもよるが、アミノ酸配列２００－５００個に１個の頻度で存在すると推定される。
病原体に対するワクチンは、病原体又はその一部を、危害や病気を引き起こさないように改変したものを含むが、宿主がその感染因子に直面したときに、免疫系がその感染因子が病気を引き起こす前に十分に無力化できるようにしたものである。１００年超にわたり、ワクチンは２つのアプローチのうちの１つによって行われてきた：免疫系が直接反応する特異的抗原を導入する方法、又は病気を引き起こすことなく宿主内で複製し、その後免疫系を刺激する抗原を合成する弱毒生感染因子を導入する方法である。
最近、根本的に新しいワクチン接種法が開発された。免疫応答を刺激できる抗原をコードするポリヌクレオチド配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を適切な組織に直接導入し、標的抗原をｉｎ ｓｉｔｕで産生させるのである。この方法は、Ｂ細胞及びＴ細胞の両方の応答を刺激すること、ワクチンの安定性が向上すること、感染因子が存在しないこと、大規模な製造が比較的容易であることなどを含む、従来の方法と比較して多くの潜在的な利点を提供する。
癌の治療は過去数十年の間に改善され、特に早期発見・早期診断により、癌患者の生存率は著しく向上したが、診断から５年後に生存している癌患者は全体の６０％程度に過ぎない。現在行われている癌治療のほとんどは、外科手術、放射線療法、細胞毒性化学療法であるが、いずれも深刻な副作用がある。最近では、既知の癌関連抗原を標的とした抗体を用いた治療も行われている。
ここ数年、患者自身の免疫システムの助けを借りて癌細胞を標的とする癌免疫療法、すなわち癌ワクチンが注目を集めている。このような治療法は、従来の癌治療に伴う副作用を軽減したり、あるいはなくしたりするかもしれない。
したがって、感染症の治療又は予防と、癌の治療又は予防の両方に使用できる効率的な薬剤及び医薬品が必要とされている。
ワクチボディ（Ｖａｃｃｉｂｏｄｙ）構築物は、２つのポリペプチドからなる二量体融合タンパク質であり、それぞれが、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニット、二量体化ユニット、及び１つ又は複数の抗原又はその一部を含む抗原ユニットを含み、対象（例えば動物又はヒト）への投与後、抗原ユニットに含まれる抗原又はその一部、例えばエピトープに対する免疫応答を効率的に発生させる。別の実施形態では、ワクチボディ構築物は、複数のポリペプチドからなる多量体融合タンパク質であり、それぞれが、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニット、多量体化ユニット、及び１つ又は複数の抗原又はその一部を含む抗原ユニットを含み、対象への投与後、抗原ユニット中に含まれる抗原又はその一部、例えばエピトープに対する免疫応答を効率的に生じることが示されている。
ワクチボディ構築物は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えばＤＮＡプラスミドなどのベクターに含まれるポリヌクレオチドの形態で対象に投与されてもよい。宿主細胞への投与後、例えば対象の筋肉細胞への投与後、多量体化ユニット、例えば二量体化ユニットに起因して、多量体融合タンパク質、例えば二量体を形成するポリペプチドが発現される。
本発明者らは、ワクチボディが発現される同じベクターから１又は複数の免疫刺激性化合物を共発現させることにより、ワクチボディの全体的な免疫応答を高めることが可能であるという驚くべき観察を行った。
第一の態様において、本発明は、以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニット、二量体化ユニットなどの多量体化ユニット、及び１又は複数の抗原又はその一部を含む抗原ユニットを含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列
を含むベクターに関し、
前記ベクターは、第１のポリペプチドと1又は複数の免疫刺激性化合物とを別々の分子として共発現させることを可能にする。
一実施形態では、本発明のベクターは、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列を含み、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニット、二量体化ユニットなどの多量体化ユニット、及び1又は複数の疾患関連抗原又はその部分を含む抗原ユニットを含む。このようなベクターは、例えば、このようなベクター及び薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む医薬組成物の形態で、疾患の予防的又は治療的処置、例えば、癌の治療的処置のため、又は感染症の予防的又は治療的処置のために、このような予防的又は治療的処置を必要とする対象に組成物を投与することにより使用されてもよい。
本発明のベクターで使用するための共発現エレメント 本発明のベクターで使用するためのＩＲＥＳ共発現エレメントを示し、これは２つのコード領域の間に挿入される。ｍＲＮＡが産生されると、２つのリボソーム（Ｔ）がｍＲＮＡ上の２つの別々の部位で翻訳を開始することができ、２つのタンパク質（Ａ及びＢ）が形成される。Ａ及びＢは、例えば、第１のポリペプチド及び免疫刺激性化合物とすることができる。 本発明のベクターで使用するための共発現エレメント 本発明のベクターで使用するための２Ａ自己切断ペプチド共発現エレメントを示し、これは２つの遺伝子の間に挿入される。転写後、１つのリボソームがｍＲＮＡを翻訳し、２つのタンパク質（ＡとＢ）が形成される。図の上は、２Ａペプチド配列がコード配列の一部でない場合、融合タンパク質がどのように形成されるかを示している。ＡとＢは例えば、第１のポリペプチドと免疫刺激性化合物である。 本発明のベクターで使用するための共発現エレメント 図３ａは、本発明のベクターで使用する双方向性プロモーター（Ｐ）共発現エレメントを示し、これは２つのコード領域の間に位置する。１つのｍＲＮＡが産生され、２つのリボソーム（Ｔ）が別々の方向に翻訳を開始することができ、２つのタンパク質（Ａ及びＢ）が形成される。Ａ及びＢは、例えば、第１のポリペプチド及び免疫刺激性化合物とすることができる。図３ａは、２つのコード領域の前に位置する２つのプロモーター（Ｐ）、すなわち本発明のベクターで使用するための共発現エレメントを示している。２つのｍＲＮＡが産生され、２つのリボソーム（Ｔ）が２つの異なるｍＲＮＡで翻訳を開始することができ、２つのタンパク質（Ａ及びＢ）が形成される。Ａ及びＢは、例えば、本発明の第１のポリペプチド及び免疫刺激性化合物とすることができる。 第１のポリペプチドの実施形態 本発明のベクターに含まれる第1の核酸配列によってコードされる第1のポリペプチドの実施形態を示す。 ＤＮＡプラスミドによってコードされるタンパク質の発現と分泌レベル マウスａ－ヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメインキャプチャーＡｂ（ＭＣＡ８７８Ｇ）及びａ－ヒトＭＩＰ－１αビオチン化キャプチャーＡｂ（ＢＡＦ２７０）を用いた酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって、前記ＤＮＡプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の上清中に検出された、ＤＮＡプラスミドＶＢ４１９４、ＶＢ４１６８、ＶＢ４１６９及びＶＢ４１７０によってコードされる第１のポリペプチドのタンパク質発現及び分泌レベルを示す。Ｌｉｐｏ ｎｅｇ ｃｔｒｌ（＝ネガティブコントロールとして機能するトランスフェクション剤リポフェクタミンで処理した細胞のみ）。 ＤＮＡプラスミドによってコードされるタンパク質の発現と分泌レベル マウスａ－ヒトＦＬＴ３ＬキャプチャーＡｂ（ＭＡＢ６０８）及びマウスａ－ヒトＦＬＴ３Ｌビオチン化検出Ａｂ（ＢＡＦ３０８）を用いたＥＬＩＳＡによって、前記ＤＮＡプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の上清中に検出された、ＤＮＡプラスミドＶＢ４１６８、ＶＢ４１６９及びＶＢ４１７０によりコードされる免疫刺激性化合物ＦＬＴＬ３のタンパク質発現及び分泌レベルを示す。 ＤＮＡプラスミドによってコードされるタンパク質の発現と分泌レベル ラットａ－マウスＧＭ－ＣＳＦキャプチャーＡｂ（ＭＡＢ４１５）及びヤギａ－マウスＧＭ－ＣＳＦビオチン化検出Ａｂ（ＢＡＭ２１５）を用いたＥＬＩＳＡによって、前記ＤＮＡプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の上清中に検出された、ＤＮＡプラスミドＶＢ４１６９及びＶＢ４１７０によりコードされる免疫刺激性化合物ＧＭ－ＣＳＦのタンパク質発現及び分泌レベルを示す。 ＤＮＡプラスミドによってコードされるタンパク質の発現と分泌レベル ラットａ－マウスＣＣＬ５キャプチャーＡｂ（ＭＡＢ４７８１）及びヤギａ－マウスＣＣＬ５ビオチン化検出Ａｂ（ＢＡＦ４７８）を用いたＥＬＩＳＡによって、前記ＤＮＡプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の上清中に検出された、ＤＮＡプラスミドＶＢ４１７０によりコードされる免疫刺激性化合物ＣＣＬ５のタンパク質発現及び分泌レベルを示す。 DNAプラスミドの免疫原性 これらのプラスミドを投与したマウスにおける、ＤＮＡプラスミドＶＢ４１９４、ＶＢ４１６８及びＶＢ４１６９の免疫原性を、Ｔ細胞からのＩＦＮ－γ分泌（総Ｔ細胞応答）を測定する方法で、ネガティブコントロールＶＢ１０２６と比較して示す。 ＤＮＡプラスミドの免疫原性 これらのプラスミドを投与したマウスにおける、ＤＮＡプラスミドＶＢ４１９４、ＶＢ４１６８及びＶＢ４１６９の免疫原性を、Ｔ細胞からのＴＮＦ－α分泌（総Ｔ細胞応答）を測定することにより、ネガティブコントロールＶＢ１０２６と比較して示す。 ＤＮＡプラスミドの免疫原性 これらのプラスミドを投与したマウスにおける、ＤＮＡプラスミドＶＢ４１９４、ＶＢ４１６８及びＶＢ４１６９の免疫原性を、Ｔ細胞からのＩＦＮ－γ＋ＴＮＦ－α共分泌（総Ｔ細胞応答）を測定することにより、ネガティブコントロールＶＢ１０２６と比較して示す。 ＤＮＡプラスミドの免疫原性 これらのプラスミドを投与したマウスにおける、ＤＮＡプラスミドＶＢ４１９４、ＶＢ４１６８及びＶＢ４１６９の免疫原性を、ＣＤ８＋ Ｔ細胞（ＣＤ４＋ Ｔ細胞枯渇サンプル）からのＩＦＮ－γ分泌を測定することにより、ネガティブコントロールＶＢ１０２６と比較して示す。 ＤＮＡプラスミドの免疫原性 これらのプラスミドを投与したマウスにおけるＤＮＡプラスミドＶＢ４１９４、ＶＢ４１６８及びＶＢ４１６９の免疫原性を、ＣＤ８＋ Ｔ細胞（ＣＤ４＋ Ｔ細胞枯渇サンプル）からのＴＮＦ－α分泌を測定することにより、ネガティブコントロールＶＢ１０２６と比較して示す。 ＤＮＡプラスミドの免疫原性 これらのプラスミドを投与したマウスにおけるＤＮＡプラスミドＶＢ４１９４、ＶＢ４１６８及びＶＢ４１６９の免疫原性を、ＣＤ８＋ Ｔ細胞（ＣＤ４＋ Ｔ細胞枯渇サンプル）からのＩＦＮ－γ ＋ ＴＮＦ－α分泌を測定することにより、ネガティブコントロールＶＢ１０２６と比較して示す。 ＤＮＡプラスミドがコードするタンパク質の発現と分泌レベル マウスａ－ヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメインキャプチャーＡｂ（ＭＣＡ８７８Ｇ）及びａ－ヒトＭＩＰ－１αビオチン化キャプチャーＡｂ（ＢＡＦ２７０）を用いたＥＬＩＳＡにより、前記ＤＮＡプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の上清中に検出された、ＤＮＡプラスミドＶＢ４２０２によりコードされる第１のポリペプチドのタンパク質発現及び分泌レベルを示す。Ｌｉｐｏ（＝ネガティブコントロールとして機能するトランスフェクション剤リポフェクタミンで処理した細胞のみ）。 ＤＮＡプラスミドがコードするタンパク質の発現と分泌レベル ラットａ－マウスＧＭ－ＣＳＦキャプチャーＡｂ（ＭＡＢ４１５）及びヤギａ－マウスＧＭ－ＣＳＦビオチン化検出Ａｂ（ＢＡＭ２１５）を用いたＥＬＩＳＡにより、前記ＤＮＡプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の上清（１：１０００希釈）中に検出された、ＤＮＡプラスミドＶＢ４２０２によりコードされる免疫刺激性化合物ＧＭ－ＣＳＦのタンパク質発現及び分泌レベルを示す。 ＤＮＡプラスミドの免疫原性 これらのプラスミドを投与したマウスにおけるＤＮＡプラスミドＶＢ４１９４及びＶＢ４２０２の免疫原性を、Ｔ細胞からのＩＦＮ－γ分泌（総Ｔ細胞応答）を測定することにより、ネガティブコントロールＶＢ１０２６と比較して示す。 ＤＮＡプラスミドの免疫原性 ＤＮＡプラスミドＶＢ１０２６、ＶＢ４１９４及びＶＢ４２０２を投与したマウスにおける、樹状細胞（ＤＣ）の応答を単一細胞レベルで評価するために使用したフローサイトメトリー評価を示す。図はＤＣを定義するために用いたゲーティング戦略を示している。 Ａ． すべてのイベントは、流体力学的不整合を除外するために、時間パラメータを用いて検査された。 Ｂ． 側方散乱（ＳＳＣ）の高さと面積のパラメータを使用して、ダブレットの除外を行った。 ＤＮＡプラスミドの免疫原性 ＤＮＡプラスミドＶＢ１０２６、ＶＢ４１９４及びＶＢ４２０２を投与したマウスにおける、樹状細胞（ＤＣ）の応答を単一細胞レベルで評価するために使用したフローサイトメトリー評価を示す。図はＤＣを定義するために用いたゲーティング戦略を示している。 Ｃ． 前方散乱（ＦＳＣ）の高さと面積のパラメータを使用して、ダブレットの除外を行った。 Ｄ． 死細胞、好中球、Ｔ細胞は除外し、ＣＤ４５＋免疫細胞をさらなる解析に用いた。 ＤＮＡプラスミドの免疫原性 ＤＮＡプラスミドＶＢ１０２６、ＶＢ４１９４及びＶＢ４２０２を投与したマウスにおける、樹状細胞（ＤＣ）の応答を単一細胞レベルで評価するために使用したフローサイトメトリー評価を示す。図はＤＣを定義するために用いたゲーティング戦略を示している。 Ｅ． ＭＨＣＩＩ発現細胞はゲーティングされ、さらなる解析に使用された。 Ｆ． Ｂ細胞と形質細胞様（ｐ）ＤＣは解析から除外した。 ＤＮＡプラスミドの免疫原性 ＤＮＡプラスミドＶＢ１０２６、ＶＢ４１９４及びＶＢ４２０２を投与したマウスにおける、樹状細胞（ＤＣ）の応答を単一細胞レベルで評価するために使用したフローサイトメトリー評価を示す。図はＤＣを定義するために用いたゲーティング戦略を示している。 Ｇ． ＤＣはＣＤ２４＋と定義した。 Ｈ． ＣＤ１１ｂとＣＤ６４の発現に基づいて、全てのＤＣを単球由来（ｍｏ）ＤＣと古典的（ｃ）ＤＣに分けた。 ＤＮＡプラスミドの免疫原性 ＤＮＡプラスミドＶＢ１０２６、ＶＢ４１９４及びＶＢ４２０２を投与したマウスにおける、樹状細胞（ＤＣ）の応答を単一細胞レベルで評価するために使用したフローサイトメトリー評価を示す。図はＤＣを定義するために用いたゲーティング戦略を示している。 Ｉ． 古典的ＤＣは、ＸＣＲ１とＣＤ１７２ａマーカーの発現に基づいて、ｃＤＣ１とｃＤＣ２に分けられた。 ＤＮＡプラスミドの免疫原性 ＤＮＡプラスミドＶＢ４１９４（比較）ＶＢ１０２６（ネガティブコントロール）と比較した、ＤＮＡプラスミドＶＢ４２０２の筋肉内投与１、２、４日後の投与部位における生きたＣＤ４５＋細胞の割合を示す。Ｎｏ ＥＰ Ｎｏ ｖａｃｃは、プラスミドを投与せず、エレクトロポレーション処理も行わなかったマウス群の結果を示す。 ＤＮＡプラスミドの免疫原性 ＤＮＡプラスミドＶＢ４１９４（比較）ＶＢ１０２６（ネガティブコントロール）と比較した、ＤＮＡプラスミドＶＢ４２０２の筋肉内投与１、２、４日後の投与部位の生きたＣＤ４５＋細胞におけるＤＣの割合を示す。Ｎｏ ＥＰ Ｎｏ ｖａｃｃは、プラスミドを投与せず、エレクトロポレーション処理も行わなかったマウス群の結果を示す。 ＤＮＡプラスミドの免疫原性 ＤＮＡプラスミドＶＢ４１９４（比較）ＶＢ１０２６（ネガティブコントロール）と比較した、ＤＮＡプラスミドＶＢ４２０２の筋肉内投与１、２、４日後の投与部位の生きたＣＤ４５＋細胞におけるｃＤＣ１細胞の割合を示す。Ｎｏ ＥＰ Ｎｏ ｖａｃｃは、プラスミドを投与せず、エレクトロポレーション処理も行わなかったマウス群の結果を示す。 ＤＮＡプラスミドの免疫原性 ＤＮＡプラスミドＶＢ４１９４（比較）ＶＢ１０２６（ネガティブコントロール）と比較した、ＤＮＡプラスミドＶＢ４２０２の筋肉内投与１、２、４日後の投与部位の生きたＣＤ４５＋細胞におけるｍｏＤＣ細胞の割合を示す。Ｎｏ ＥＰ Ｎｏ ｖａｃｃは、プラスミドを投与せず、エレクトロポレーション処理も行わなかったマウス群の結果を示す。 ＤＮＡプラスミドがコードするタンパク質の発現と分泌レベルマウスａ－ヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメインキャプチャーＡｂ（ＭＣＡ８７８Ｇ）及びａ－ヒトＭＩＰ－１αビオチン化キャプチャーＡｂ（ＢＡＦ２７０）を用いたＥＬＩＳＡにより、前記ＤＮＡプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の上清中に検出された、ＤＮＡプラスミドＶＢ１０２０、ＶＢ４１９５及びＶＢ４１９６によりコードされる第１のポリペプチドのタンパク質発現及び分泌レベルを示す。リポフェクタミン（＝ネガティブコントロールとして機能するトランスフェクション剤リポフェクタミンのみで処理した細胞）。 ＤＮＡプラスミドがコードするタンパク質の発現と分泌レベルマウスａ－ヒトＦＬＴ３ＬキャプチャーＡｂ（ＭＡＢ６０８）及びマウスａ－ヒトＦＬＴ３Ｌビオチン化検出Ａｂ（ＢＡＦ３０８）を用いたＥＬＩＳＡにより、前記ＤＮＡプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の上清（１：５００希釈）中に検出された、ＤＮＡプラスミドＶＢ４１９５及びＶＢ４１９６によりコードされる免疫刺激性化合物ＦＬＴ３Ｌのタンパク質発現量及び分泌量を示す。リポフェクタミン（＝ネガティブコントロールとして機能するトランスフェクション剤リポフェクタミンのみで処理した細胞）、リポフェクタミンのみで処理した細胞の上清はＥＬＩＳＡ用に希釈しなかった。 ＤＮＡプラスミドがコードするタンパク質の発現と分泌レベルラットａ－マウスＧＭ－ＣＳＦキャプチャーＡｂ（ＭＡＢ４１５）及びヤギａ－マウスＧＭ－ＣＳＦビオチン化検出Ａｂ（ＢＡＭ２１５）を用いたＥＬＩＳＡにより、前記ＤＮＡプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の上清（１：５００希釈）中に検出された、ＤＮＡプラスミドＶＢ４１９６によりコードされる免疫刺激性化合物ＧＭ－ＣＳＦのタンパク質発現及び分泌レベルを示す。リポフェクタミン（＝ネガティブコントロールとして機能するトランスフェクション剤リポフェクタミンのみで処理した細胞）、リポフェクタミンのみで処理した細胞の上清はＥＬＩＳＡ用に希釈しなかった。 ＤＮＡプラスミドがコードするインタクトなタンパク質の発現と分泌 ＤＮＡプラスミドＶＢ１０２０、ＶＢ４１９５、ＶＢ４１９６をトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の非還元上清（左）と還元上清（右）のウェスタンブロット。一次抗体：ヤギａ－ヒトＭＩＰ－１α（ＢＡＦ２７０）。二次抗体：ロバ抗ヤギ、Ｄｙｌｉｇｈｔ ５５０ （ＳＡ５－１００８７）。Ｃｈｅｍｉｄｏｃ ｃｈａｎｎｅｌｓ Ｄｙｌｉｇｈｔ ５５０ ａｎｄ ６５０（タンパク質標準用）。黒く塗られたレーンは、この出願に関連しないサンプルを含む。 ＤＮＡプラスミドがコードするインタクトなタンパク質の発現と分泌 ＤＮＡプラスミドＶＢ１０２０、ＶＢ４１９５、ＶＢ４１９６をトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の非還元上清（左）と還元上清（右）のウェスタンブロット。一次抗体：ヤギａ－ヒトＭＩＰ－１α（ＢＡＦ２７０）。二次抗体：ロバ抗ヤギ、Ｄｙｌｉｇｈｔ ５５０ （ＳＡ５－１００８７）。Ｃｈｅｍｉｄｏｃ ｃｈａｎｎｅｌｓ Ｄｙｌｉｇｈｔ ５５０ ａｎｄ ６５０（タンパク質標準用）。黒く塗られたレーンは、この出願に関連しないサンプルを含む。 ＤＮＡプラスミドがコードするインタクトなタンパク質の発現と分泌 ＤＮＡプラスミドＶＢ１０２０、ＶＢ４１９５、ＶＢ４１９６をトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の還元上清サンプル（レーン１－４）と脱グリコシル化上清サンプル（レーン５－６）のウエスタンブロット。左：一次抗体 ヤギ ａ－ヒト ＦＬＴ３Ｌ（ＢＡＦ３０８）。二次抗体：ロバ抗ヤギ、Ｄｙｌｉｇｈｔ ５５０ （ＳＡ５－１００８７）。右： 一次抗体 ヤギ ａ－マウス ＧＭ－ＣＳＦ（ＢＡＦ４１５）。二次抗体：ロバ抗ヤギ， Ｄｙｌｉｇｈｔ ５５０ （ＳＡ５－１００８７）。Ｃｈｅｍｉｄｏｃ ｃｈａｎｎｅｌｓ Ｄｙｌｉｇｈｔ ５５０ ａｎｄ ６５０（タンパク質標準用）。黒く塗られたレーンは、この出願に関連しないサンプルを含む。 ＤＮＡプラスミドがコードするインタクトなタンパク質の発現と分泌 ＤＮＡプラスミドＶＢ１０２０、ＶＢ４１９５、ＶＢ４１９６をトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の還元上清サンプル（レーン１－４）と脱グリコシル化上清サンプル（レーン５－６）のウエスタンブロット。左：一次抗体 ヤギ ａ－ヒト ＦＬＴ３Ｌ（ＢＡＦ３０８）。二次抗体：ロバ抗ヤギ、Ｄｙｌｉｇｈｔ ５５０ （ＳＡ５－１００８７）。右： 一次抗体 ヤギ ａ－マウス ＧＭ－ＣＳＦ（ＢＡＦ４１５）。二次抗体：ロバ抗ヤギ， Ｄｙｌｉｇｈｔ ５５０ （ＳＡ５－１００８７）。Ｃｈｅｍｉｄｏｃ ｃｈａｎｎｅｌｓ Ｄｙｌｉｇｈｔ ５５０ ａｎｄ ６５０（タンパク質標準用）。黒く塗られたレーンは、この出願に関連しないサンプルを含む。 ＤＮＡプラスミドがコードするタンパク質の発現と分泌レベル マウスａ－ヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメインキャプチャーＡｂ（ＭＣＡ８７８Ｇ）及びａ－ヒトＭＩＰ－１αビオチン化キャプチャーＡｂ（ＢＡＦ２７０）を用いたＥＬＩＳＡにより、前記ＤＮＡプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の上清（１：１０希釈）中に検出された、ＤＮＡプラスミドＶＢ１０２０及びＶＢ４２０４によりコードされる第１ポリペプチドのタンパク質発現及び分泌レベルを示す。Ｌｉｐｏ（＝ネガティブコントロールとして機能するトランスフェクション剤リポフェクタミンで処理した細胞のみ）。 ＤＮＡプラスミドがコードするタンパク質の発現と分泌レベル ラットａ－マウスＧＭ－ＣＳＦキャプチャーＡｂ（ＭＡＢ４１５）及びヤギａ－マウスＧＭ－ＣＳＦビオチン化検出Ａｂ（ＢＡＭ２１５）を用いたＥＬＩＳＡにより、前記ＤＮＡプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の上清（１：１０００希釈）中に検出された、ＤＮＡプラスミドＶＢ４２０４によりコードされる免疫刺激性化合物ＧＭ－ＣＳＦのタンパク質発現及び分泌レベルを示す。Ｌｉｐｏ（＝ネガティブコントロールとして機能するトランスフェクション剤リポフェクタミンで処理した細胞のみ）。 ＤＮＡプラスミドの免疫原性 ＤＮＡプラスミドＶＢ１０２０とＶＢ４２０４をマウスに投与した場合のＤＮＡプラスミドＶＢ１０２０とＶＢ４２０４の免疫原性、及びＤＮＡプラスミドＶＢ１０２０とｐＧＭ－ＣＳＦを共投与した場合の免疫原性を、ネガティブコントロールＶＢ１０２６と比較して、Ｔ細胞からのＩＦＮ－γ分泌（全Ｔ細胞応答）を測定する方法で示す。 ＤＮＡプラスミドの免疫原性 ＤＮＡプラスミドＶＢ１０２０及びＶＢ４２０４を投与したマウスの脾臓細胞において、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、又はＴＮＦ－αとＩＦＮ－γを共分泌するＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合を、ネガティブコントロールＶＢ１０２６と比較して示す。 ＤＮＡプラスミドがコードするタンパク質の発現と分泌レベル マウスａ－ヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメインキャプチャーＡｂ（ＭＣＡ８７８Ｇ）及びａ－ヒトＭＩＰ－１αビオチン化キャプチャーＡｂ（ＢＡＦ２７０）を用いたＥＬＩＳＡにより、前記ＤＮＡプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の上清（１：１０希釈）中に検出された、ＤＮＡプラスミドＶＢ１０２０及びＶＢ４２０５によりコードされる第１のポリペプチドのタンパク質発現及び分泌レベルを示す。Ｌｉｐｏ（＝ネガティブコントロールとして機能するトランスフェクション剤リポフェクタミンで処理した細胞のみ）。 ＤＮＡプラスミドがコードするタンパク質の発現と分泌レベル ラットａ－マウスＣＣＬ５キャプチャーＡｂ（ＭＡＢ４７８１）及びヤギａ－マウスＣＣＬ５ビオチン化検出Ａｂ（ＢＡＦ４７８）を用いたＥＬＩＳＡにより、前記ＤＮＡプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の上清（１：５００希釈）中に検出された、ＤＮＡプラスミドＶＢ４２０５がコードする免疫刺激性化合物ＣＣＬ５のタンパク質発現及び分泌レベルを示す。Ｌｉｐｏ（＝ネガティブコントロールとして機能するトランスフェクション剤リポフェクタミンで処理した細胞のみ）。 ＤＮＡプラスミドの免疫原性 これらのプラスミドを投与したマウスにおいて、ＤＮＡプラスミドＶＢ１０２０及びＶＢ４２０５の免疫原性を、Ｔ細胞からのＩＦＮ－γ分泌（総Ｔ細胞応答）を測定することで、ネガティブコントロールＶＢ１０２６と比較して示す。 ＤＮＡプラスミドの免疫原性 ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝８／群）に１ｘ１０５ ＣＴ２６腫瘍細胞をＤ０に接種し、続いて、ＤＮＡプラスミドＶＢ４１９４、ＶＢ４２０８、ＶＢ４２０２、及びｐＧＭ－ＣＳＦ ＋ ＶＢ４１９４をＤ４とＤ１１に投与（共注入）した際のＣＴ２６腫瘍の成長を、ネガティブコントロールＶＢ１０２６と比較して示す。 ＤＮＡプラスミドの免疫原性 Ｄ０に１ｘ１０５ ＣＴ２６腫瘍細胞を接種し、続いて、Ｄ４及びＤ１１にＤＮＡプラスミドＶＢ４１９４、ＶＢ４２０８、ＶＢ４２０２、及びｐＧＭ－ＣＳＦ ＋ ＶＢ４１９４を投与した（共注入）ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝８／群）の生存割合を、ネガティブコントロールＶＢ１０２６と比較して示す。 ＤＮＡプラスミドがコードするタンパク質の発現と分泌レベル ＤＮＡプラスミドＶＢ２０６０、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２１、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２２及びＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２３によりコードされる第１のポリペプチドの分泌を、ＥＬＩＳＡにより、前記ＤＮＡプラスミドでトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の上清中で検出したことを示す。上清を１：１５００に希釈し、マウスａ－ヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメインキャプチャーＡｂ（ＭＣＡ８７８Ｇ）及びａ－ヒトＭＩＰ－１αビオチン化キャプチャーＡｂ（ＢＡＦ２７０）を用いてＥＬＩＳＡを行った。Ｅｘｐｉｆｅｃｔ（＝ネガティブコントロールとして機能するトランスフェクション剤Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅで処理した細胞のみ）。 ＤＮＡプラスミドがコードするタンパク質の発現と分泌レベル それぞれ、ＥＬＩＳＡにより、前記ＤＮＡプラスミドでトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の上清中に検出した、ＤＮＡプラスミドＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２１、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２２及びＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２３によりコードされる免疫刺激性化合物ＧＭ－ＣＳＦ（３８ａ： ｃａｐｔｕｒｅ Ａｂ ＭＡＢ６０８， ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｂ ＢＡＦ３０８）、ＩＬ－１２ （３８ｂ： ｃａｐｔｕｒｅ Ａｂ ＭＡＢ４１９， ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｂ ＢＡＦ４１９）、及び ＩＬ－２１ （３８ｃ： ｃａｐｔｕｒｅ Ａｂ ＡＦ５９４， ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｂ ＢＡＦ５９４）のタンパク質発現及び分泌レベルを示す。 ＤＮＡプラスミドがコードするインタクトなタンパク質の発現と分泌 最初のポリペプチドの分泌を示すウェスタンブロット。トランスフェクションコントロール、ＶＢ２０６０、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２１、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２２、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２３の還元上清サンプル。一次抗体：ヤギ抗ヒト ＭＩＰ－１α （ＡＦ２７０）。二次抗体：ロバ抗ヤギ、Ｄｙｌｉｇｈｔ ８００ （ＳＡ５－１００９２）。Ｃｈｅｍｉｄｏｃ ｃｈａｎｎｅｌｓ Ｄｙｌｉｇｈｔ ８００ ａｎｄ ６５０（タンパク質標準用）。 ＤＮＡプラスミドがコードするインタクトなタンパク質の発現と分泌 ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２１がコードする免疫刺激性化合物ＧＭ－ＣＳＦの分泌を示すウェスタンブロット。トランスフェクションコントロール、ＶＢ２０６０、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２１の還元上清サンプル。一次抗体：ヤギ抗マウスＧＭ－ＣＳＦ（ＢＡＦ４１５）。二次抗体：ロバ抗ヤギ、Ｄｙｌｉｇｈｔ ８００ （ＳＡ５－１００９２）。Ｃｈｅｍｉｄｏｃ ｃｈａｎｎｅｌｓ Ｄｙｌｉｇｈｔ ８００ ａｎｄ ６５０（タンパク質標準用）。 ＤＮＡプラスミドがコードするインタクトなタンパク質の発現と分泌 ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２２がコードする免疫刺激性化合物ＩＬ－１２の分泌を示すウェスタンブロット。トランスフェクションコントロール、ＶＢ２０６０、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２２の還元上清サンプル（左パネル）と非還元上清サンプル（右パネル）。一次抗体：ヤギ抗マウスＩＬ－１２（ＢＡＦ４１９）。二次抗体：ロバ抗ヤギ、Ｄｙｌｉｇｈｔ ８００ （ＳＡ５－１００９２）。Ｃｈｅｍｉｄｏｃ ｃｈａｎｎｅｌｓ Ｄｙｌｉｇｈｔ ８００ ａｎｄ ６５０（タンパク質標準用）。 ＤＮＡプラスミドがコードするインタクトなタンパク質の発現と分泌 ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２２がコードする免疫刺激性化合物ＩＬ－１２の分泌を示すウェスタンブロット。トランスフェクションコントロール、ＶＢ２０６０、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２２の還元上清サンプル（左パネル）と非還元上清サンプル（右パネル）。一次抗体：ヤギ抗マウスＩＬ－１２（ＢＡＦ４１９）。二次抗体：ロバ抗ヤギ、Ｄｙｌｉｇｈｔ ８００ （ＳＡ５－１００９２）。Ｃｈｅｍｉｄｏｃ ｃｈａｎｎｅｌｓ Ｄｙｌｉｇｈｔ ８００ ａｎｄ ６５０（タンパク質標準用）。 ＤＮＡプラスミドがコードするインタクトなタンパク質の発現と分泌 ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２３がコードする免疫刺激性化合物ＩＬ－２１の分泌を示すウェスタンブロット。トランスフェクションコントロール、ＶＢ２０６０、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２３の還元上清サンプル。一次抗体：ヤギ抗マウスＩＬ－１２（ＢＡＦ５９４）。二次抗体：ロバ抗ヤギ、Ｄｙｌｉｇｈｔ ８００ （ＳＡ５－１００９２）。Ｃｈｅｍｉｄｏｃ ｃｈａｎｎｅｌｓ Ｄｙｌｉｇｈｔ ８００ ａｎｄ ６５０（タンパク質標準用）。 ＤＮＡプラスミドの免疫原性 これらのプラスミドを投与したマウスにおいて、ＤＮＡプラスミドＶＢ２０６０、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２１、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２２及びＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２３の免疫原性を、ＲＢＤタンパク質に結合する総ＩｇＧ抗体を測定することで、ネガティブコントロールＶＢ１０２６と比較して示す。個々のマウス及び平均±ＳＥＭを示す。＊（ｐ＜０．０５）， ＊＊（ｐ＜０．０１）、両側Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定。 ＤＮＡプラスミドの免疫原性 Ａ）これらのプラスミドを投与したマウスにおいて、ＤＮＡプラスミドＶＢ２０６０、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２１、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２２及びＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２３の免疫原性を、Ｔ細胞からのＩＦＮ－γ分泌量（全Ｔ細胞応答）を測定することで、ネガティブコントロールＶＢ１０２６と比較して示す。Ｂ）これらのプラスミドを投与したマウスにおいて、ＤＮＡプラスミドＶＢ２０６０、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２１、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２２及びＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２３の免疫原性を、ＣＤ８＋ Ｔ細胞からのＩＦＮ－γ分泌（ＣＤ４＋ Ｔ細胞枯渇サンプル）を測定することで、ネガティブコントロールＶＢ１０２６と比較して示す。
（発明の詳細な説明）
第1のポリペプチド及び／又は多量体タンパク質は、本明細書では「構築物」とも称される。本明細書に記載の第１のポリペプチド／多量体タンパク質は、一般に免疫原性構築物である。
「免疫原性構築物」とは、特に、投与に適した形態で、免疫応答を惹起するのに有効な量（すなわち、免疫学的に有効な量）で対象に投与された場合に、免疫応答を惹起するものである。
「対象」とは、動物、例えばマウス、又はヒト、好ましくはヒトである。本明細書において、「マウス」、「ネズミ（ｍｕｒｉｎｅ）」及び「ｍ」という用語は、マウスを表すか、又はマウスを指すために互換的に使用される。ヒト及び“ｈ”という用語は、本明細書において、ヒトを示すため、又はヒトを指すために互換的に使用される。対象は、患者、すなわち、治療的処置が必要な疾患に罹患しているヒトであってもよいし、予防的処置が必要な、例えば、感染症に罹患している対象であってもよいし、疾患に罹患している疑いのある対象であってもよい。本明細書では、「対象」及び「個体」という用語は互換的に使用される。
「疾患」とは、通常、対象に特定の徴候や症状を伴う異常な医学的状態のことである。
「感染症」とは、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫を含む1又は複数の病原体によって引き起こされる疾患である。
「癌」とは、体内の異常細胞の制御不能な増殖を特徴とする様々な疾患の広範なグループを指す。「癌」又は「癌組織」には腫瘍が含まれ、本明細書で使用する場合、固形腫瘍と血液などの体液中に見られる腫瘍細胞の両方を包含し、転移癌も含まれる。無秩序な細胞分裂及び増殖の結果、隣接組織に浸潤し得る悪性腫瘍が形成され、リンパ系又は血流を介して身体の遠隔部に転移することもある。転移後の遠隔部の腫瘍は、転移前の腫瘍に「由来する」と言える。
「治療」とは、予防的治療又は治療的治療のことである。
「予防的治療」とは、疾患の徴候又は症状を示さない（又はまだ示さない）若しくは、疾患の初期の徴候又は症状を示すだけの対象に投与される治療であり、疾患及び／又は疾患に関連する症状の発症リスクを予防又は低減する目的で投与される治療である。予防的治療は、疾患に対する予防的治療として、又は疾患及び／もしくはその関連症状のさらなる発症もしくは増強を抑制もしくは軽減する治療として機能する。本明細書では、予防的治療、予防法（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）及び予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）という用語は互換的に使用される。
「治療的治療（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、疾患の症状又は徴候を示す対象に投与される治療のことであり、この治療は、それらの徴候又は症状を軽減もしくは消失させる目的で、又は疾患の進行を遅延もしくは停止させる目的で、対象に投与される。
本明細書で用いる「T細胞エピトープ」とは、個別の単一T細胞エピトープ、又は複数のT細胞エピトープ、例えばホットスポットのような複数の最小T細胞エピトープを含む抗原の一部又は領域を指す。
「ヌクレオチド配列」とは、ヌクレオチドからなる配列のことである。「ヌクレオチド配列」及び「核酸配列」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
１又は複数の免疫刺激性化合物は、第１のポリペプチド／多量体タンパク質の効果を増強する。本発明の利点は、単一のベクター、例えばＤＮＡプラスミドから第１のポリペプチド及び１又は複数の免疫刺激性化合物を共発現させることにより、そのような単一のベクターのみを対象に投与されればよいことである。したがって、第１のポリペプチド／多量体タンパク質の効果を増強するために、免疫刺激性化合物をコードする追加のベクターを製造して投与したり、そのような化合物をタンパク質又はペプチドの形態で共投与したりする必要はなく、製造コストを低減し、薬剤製造を合理化することができる。また、単一の製剤を投与することで、患者が治療を受け入れやすくなり、医療従事者にとって製剤の取り扱い、例えば再構成や患者への投与が容易になる。
さらに、理論に縛られることを望まないが、共発現は細胞レベルでも顕著な利点がある。ベクターでトランスフェクションする場合、ベクターは様々な細胞に接触する。うまく取り込まれ、転写と翻訳が機能的に開始されるかどうかは、ある程度ランダムなプロセスである。2つの異なるベクターでトランスフェクションを行う場合、これらのベクターによってコードされたタンパク質がどの細胞で発現されるかはコントロールできない。血流へのタンパク質の分泌を目的としたトランスフェクションでは、この空間的分布は気にならない。本発明では、本発明のベクターは異なるタンパク質を産生する。構築物をコードするベクターを筋肉内に投与すると、構築物は筋肉細胞から分泌され、隣接する抗原提示細胞に送達される。免疫刺激性化合物は同じ筋肉細胞で発現し、同じ筋肉細胞から分泌されるので、同じ抗原提示細胞を刺激し、それによって当該抗原提示細胞に直接作用することができる。一例として、抗原提示細胞が樹状細胞である場合、免疫刺激性化合物は樹状細胞の誘引、活性化、成熟を促進することができる。
本明細書で使用されているセクションの見出しは、整理の目的のみのものであり、記載されている主題を限定するものとして解釈されるものではない。
ベクター
本発明のベクターは、ＤＮＡやＲＮＡなどの外来核酸配列を細胞内に運び、そこで発現させるのに適した分子、すなわち発現ベクターであれば何でもよい。
一実施形態では、ベクターは、ＤＮＡプラスミドなどのＤＮＡベクター、又はアデノウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、サイトメガロウイルス及びセンダイウイルスからなる群から選択されるＤＮＡウイルスベクターなどのＤＮＡウイルスベクターである。
別の実施形態では、ベクターは、ＲＮＡプラスミドのようなＲＮＡベクター、又はレトロウイルスベクター、例えばアルファウイルス、レンチウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス及びラブドウイルスからなる群から選択されるレトロウイルスベクターのようなＲＮＡウイルスベクターである。
好ましい実施形態では、ベクターはDNAベクターであり、より好ましくはDNAプラスミドである。
ＤＮＡプラスミド
プラスミドとは、細胞内に存在する小さな染色体外ＤＮＡ分子のことで、染色体ＤＮＡとは物理的に分離されており、独立して複製することができる。プラスミドは主に細菌に存在する小さな円形の二本鎖ＤＮＡ分子であるが、古細菌や真核生物にも存在することがある。人工プラスミドは、分子クローニングにおけるベクターとして広く使用されており、宿主生物内で組換えＤＮＡ配列を送達し、高発現を保証する役割を果たしている。プラスミドは、プラスミドを含む細胞を選択するための特徴、例えば抗生物質耐性遺伝子、複製起点、多重クローニング部位（ＭＣＳ）、及び挿入された目的の遺伝子の発現を駆動するためのプロモーターを含む、いくつかの重要な特徴を含んでいる。
一般に、プロモーターは、開始因子やポリメラーゼをプロモーターに引き寄せることができる配列であり、その結果、遺伝子が転写される。プロモーターは遺伝子の転写開始点付近、ＤＮＡの上流に位置する。プロモーターの長さは約１００－１０００塩基対である。プロモーターの性質は通常、遺伝子と転写産物、そしてその部位にリクルートされるＲＮＡポリメラーゼのタイプやクラスに依存する。ＲＮＡポリメラーゼがプラスミドのＤＮＡを読むと、ＲＮＡ分子が転写される。プロセシング後、リボソームがｍＲＮＡをタンパク質に翻訳する際、ｍＲＮＡは何度も翻訳され、目的の遺伝子によってコードされるタンパク質のコピーがたくさん生じる。一般に、リボソームは、ｍＲＮＡのコドンに相補的なｔＲＮＡアンチコドン配列を結合させることで、解読を促進する。ｔＲＮＡは特定のアミノ酸を運び、ｍＲＮＡがリボソームを通過し「読まれる」と、鎖状につながったポリペプチドになる。翻訳は、開始、伸長、終結の３段階で進行する。翻訳過程を経て、ポリペプチドは活性タンパク質に折り畳まれ、細胞内でその機能を果たすか、あるいは細胞外に排出され、時にはかなりの数の翻訳後修飾を経て、別の場所でその機能を果たす。
あるタンパク質が細胞外へ輸送される場合、シグナルペプチドによってタンパク質は小胞体へと導かれ、そこでシグナルペプチドが切断され、翻訳が終了した後、タンパク質は細胞周辺へと輸送される。
本発明のＤＮＡプラスミドは、特定のプラスミドに限定されず、当業者は、適切なバックボーンを有する任意のプラスミドが、本開示のエレメント及びユニットを構成するように、当該分野で公知の方法によって選択及び操作され得ることを理解するであろう。
共発現
本開示のベクターは、複数のタンパク質を共発現する。このようなベクター（及びプラスミド）は、マルチシストロニック又はポリシストロニックベクター（及びマルチシストロニック又はポリシストロニックプラスミド）とも呼ばれる。当業者は、これらの複数のタンパク質をコードする配列を含むようにベクターを設計する方法を知っており、これらのタンパク質が別々のタンパク質として１つのベクターから共発現されることを確実にするために、当技術分野で公知の異なる手段を選択し、異なる技術を使用することができる。
したがって、当業者は、異なるタンパク質、すなわち第一のポリペプチドと1又は複数の免疫刺激性化合物を共発現する本発明のベクターを構築することができる。
好ましい実施形態では、本発明のベクターは、１又は複数の共発現エレメント、すなわち、同じベクターからの第１のポリペプチド及び１又は複数の免疫刺激性化合物の共発現を可能にする核酸配列を含む。
本開示の一実施形態では、ベクターは、共発現エレメント（又は１超の共発現エレメント）を含み、これにより、第１のポリペプチド及び１又は複数の免疫刺激性化合物は、単一の転写産物上に転写されるが、第１のポリペプチド及び１又は複数の免疫刺激性化合物に独立して翻訳される。したがって、共発現エレメントの存在により、最終的に別々の翻訳産物が産生される。
ＩＲＥＳ
本開示の一実施形態では、共発現エレメントはＩＲＥＳエレメントであり、その概念を図１に示す。ＩＲＥＳと略記される内部リボソーム進入部位は、タンパク質合成の大きなプロセスの一部として、キャップに依存しない様式で翻訳開始を可能にするＲＮＡエレメントである。真核生物の翻訳では、開始は通常ｍＲＮＡ分子の５’末端で起こる。なぜなら、開始複合体の組み立てには５’キャップの認識が必要だからである。ＩＲＥＳエレメントを２つのコード領域の間に配置することにより、開始複合体はこの部位で組み立てられ、下流のコード領域の翻訳を可能にすることができる。したがって、本開示の一実施形態では、ベクターはＩＲＥＳを含み、ベクターから１つの転写産物が産生され、その後、別々のタンパク質に翻訳される。
ＩＲＥＳエレメントにより、同じプロモーターの制御下で第１のポリペプチドと１又は複数の免疫刺激性化合物を共発現させることができる。プロモーターは、第１のポリペプチドをコードする核酸配列及び１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする核酸配列のコード領域を含む単一のｍＲＮＡの転写を指示する。１超の免疫刺激性化合物が本発明のベクターから発現される場合、本発明のベクターには、免疫刺激性化合物をコードする各核酸配列の上流にＩＲＥＳエレメントが存在する必要がある。あるいは、本発明のベクターから1超の免疫刺激性化合物を発現させる場合には、別のタイプの共発現エレメントを用いてもよい。
本発明のベクターで使用するＩＲＥＳエレメントは、ウイルスゲノム由来でも細胞ｍＲＮＡ由来でもよい。ＤＮＡプラスミドなどのＩＲＥＳエレメントを含むベクターは市販されている。
２Ａ自己切断ペプチド
本開示の別の実施形態では、共発現エレメントは、２Ａ自己切断ペプチド（又は略称「２Ａペプチド」）をコードする核酸配列であり、その概念を図２に示す。
本出願の文脈では、「２Ａ自己切断ペプチド」及び「２Ａペプチド」という用語は、２つのコード領域の間に位置すると、２つのコード領域を単一の転写産物として転写するが、その翻訳は２つの別々のペプチド鎖になる、核酸配列によってコードされるペプチドに対して使用される。一般に、リボソームがｍＲＮＡを翻訳するとき、アミノ酸はＮ末端からＣ末端へ共有結合する。２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸配列が存在すると、リボソームが２ＡペプチドのＣ末端のペプチド結合の合成をスキップするため、２つの別々のペプチド鎖になる。２Ａ自己切断ペプチドは典型的には１８－２２アミノ酸長であり、しばしばコンセンサス配列ＤＸＥＸＮＰＧＰ（配列番号５０）を含み、ここでＸは任意のアミノ酸であり得る。
本発明の一実施形態では、リボソームは２Ａ自己切断ペプチドのＣ末端に見られるグリシンとプロリン残基の間のペプチド結合をスキップする。つまり、上流の遺伝子産物は末端にアミノ酸残基が数個付加されるが、下流の遺伝子産物はプロリンから始まる。
１の実施形態では、２Ａ自己切断ペプチドは、コンセンサス配列ＤＸＥＸＮＰＧＰ（配列番号５０）を含む１８～２２アミノ酸長の配列であり、ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得る。
したがって、２Ａ自己切断ペプチドもまた、同じプロモーターの制御下で、第１のポリペプチドと１又は複数の免疫刺激性化合物の共発現を可能にする。ＩＲＥＳエレメントと同様に、本発明のベクターから１超の免疫刺激性化合物を発現させる場合、２Ａペプチドをコードする核酸配列が、免疫刺激性化合物をコードする各核酸配列の上流にベクター中に存在する必要がある。一例として、ベクターは、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列、第１の免疫刺激性化合物をコードする第２の核酸配列、及び第２の免疫刺激性化合物をコードする第３の核酸配列を含む。ベクターは、第１の核酸配列と第２の核酸配列との間にＴ２Ａペプチドをコードする核酸配列と、第２の核酸配列と第３の核酸配列との間にＰ２Ａペプチドをコードする核酸配列とを含んでいてもよい。あるいは、本発明のベクターから１超の免疫刺激性化合物を発現させる場合には、別のタイプの共発現エレメントを用いてもよい。
さらなる実施形態では、２Ａ自己切断ペプチドは、Ｔ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド及びＦ２Ａペプチドからなる群より選択される２Ａペプチドである。
一実施形態では、Ｔ２Ａペプチドは、表１又は２に列挙されたＴ２Ａ配列と同一のアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態では、アミノ酸配列ＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号５０）が存在するが、Ｔ２Ａアミノ酸配列の残りは、表１のＴ２Ａアミノ酸配列に対して８０％～１００％の配列同一性、例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。別の実施形態では、Ｔ２Ａペプチドは配列番号９のアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、Ｐ２Ａペプチドは、表１又は２に列挙されたＰ２Ａ配列と同一のアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態では、配列ＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号５０）が存在するが、Ｐ２Ａアミノ酸配列の残りは、表１のＰ２Ａアミノ酸配列に対して８０％～１００％の配列同一性、例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。別の実施形態では、Ｐ２Ａペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、Ｅ２Ａペプチドは、表１又は２に列挙されたＥ２Ａ配列と同一のアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態では、配列ＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１７３）が存在するが、Ｅ２Ａアミノ酸配列の残りは、表１のＥ２Ａアミノ酸配列に対して８０％～１００％の配列同一性、例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。別の実施形態では、Ｅ２Ａペプチドは配列番号１４のアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、Ｆ２Ａペプチドは、表１又は２に列挙されたＦ２Ａ配列と同一であるアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態では、配列ＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１７３）が存在するが、Ｆ２Ａアミノ酸配列の残りは、表１のＦ２Ａアミノ酸配列に対して８０％～１００％の配列同一性、例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。別の実施形態では、Ｆ２Ａペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する。
例えば、表２に示すように、野生型配列のＮ末端の前にＧＳＧ配列を挿入することによって、２Ａ－ペプチドの切断効率と発現効率を高めるように調節できることが一般に知られている。
別の実施形態では、本発明のベクターはＩＲＥＳエレメントと２Ａペプチドをコードする核酸配列の両方を含む。一例として、ベクターは、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列、第１の免疫刺激性化合物をコードする第２の核酸配列、及び第２の免疫刺激性化合物をコードする第３の核酸配列を含む。ベクターは、第１の核酸配列と第２の核酸配列との間にＩＲＥＳエレメントと、第２の核酸配列と第３の核酸配列との間に２Ａペプチドをコードする核酸配列とを含んでいてもよい。あるいは、ベクターは、第１の核酸配列と第二の核酸配列の間に２Ａペプチドをコードする核酸配列と、第二の核酸配列と第三の核酸配列の間にＩＲＥＳエレメントとを含んでいてもよい。さらなる免疫刺激性化合物をコードするさらなる核酸配列も同様にベクターに含めることができる。
別の実施形態では、本発明のベクターは、２つの２Ａペプチドをコードする核酸配列を、２つの２Ａペプチドからなる連続配列として含む。一例として、ベクターは、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列と、免疫刺激性化合物をコードする第２の核酸とを含む。ベクターは、第１の核酸配列と第２の核酸配列との間に、２つの２Ａペプチドをコードする核酸配列を連続配列として含んでいてもよい。
双方向性プロモーター
本開示の１つの実施形態では、ベクターは、第１のポリペプチド及び１又は複数の免疫刺激性化合物が別々の転写産物として転写され、その結果、別々の転写産物、したがって別々のタンパク質が生じるようにする共発現エレメント（又は１超の共発現エレメント）を含む。
本開示の一実施形態では、共発現エレメントは双方向性プロモーターであり、その概念は図３ａに示されている。双方向性プロモーターは、典型的には、双方向遺伝子対の遺伝子の５’末端間のＤＮＡの短い（例えば、＜１ｋｂｐ）遺伝子間領域である。双方向性遺伝子ペア」とは、２つの隣接する遺伝子の５’末端が互いに向き合い、反対側の鎖にコードされているものを指す。
本開示の一実施形態では、双方向性プロモーターは、４つのＣＭＶエンハンサーを有するＣＡＧプロモーターの背中合わせの配置である（Ｓｌａｄｉｔｓｃｈｅｋ ＨＬ， Ｎｅｖｅｕ ＰＡら， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １１（５）， ｅ０１５５１７７， ２０１６）。
本開示の一実施形態では、双方向性プロモーターは、ＲＰＢＳＡ（Ｋｅｖｉｎ Ｈｅら、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｓｃｉ． ２１（２３）， ９２５６， ２０２０）である。
本開示の一実施形態では、双方向性プロモーターは、マウスＰｇｋ１及びヒト真核生物翻訳伸長因子１α１プロモーターの背中合わせの構成である（Ｇｏｌｄｉｎｇ ＆ Ｍａｎｎ， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １８， ８１７－８２６， ２０１１）。
一実施形態では、本発明のベクターは、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列と免疫刺激性化合物をコードする第２の核酸配列とを、それらの５’末端間に双方向プロモーターを含む双方向遺伝子対として含むプラスミドである。
複数のプロモーター
本開示の別の実施態様では、共発現エレメントは、種々のプロモーターであり、すなわち、ベクターは、例えば、第１のポリペプチド及び１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする核酸配列の各々に対して別々のプロモーターを含むプラスミドであり、すなわち、第１のポリペプチド及び１又は複数の免疫刺激性化合物の各々の別々の転写のためのプラスミドである。
一実施形態では、前記核酸配列の各々は異なるプロモーターを有し、その概念は図３ｂにも示されている。一実施形態では、すべての核酸配列は、等分子発現を目指すために同じプロモーターを有する。別の実施形態では、１つの核酸配列が他の核酸配列よりも強いプロモーターを有する；すなわち、より強いプロモーターを有する核酸配列は、他の核酸配列よりも高レベルで発現される可能性が高い。
多数のプロモーターが当該分野で知られており、本発明のプラスミドに組み込むのに適している。本開示の１つの実施態様において、プロモーターは、ＣＭＶプロモーターのようなサイトメガロウイルス由来である。
１の実施態様では、本発明のベクターは、１又は複数の共発現エレメント、好ましくはＩＲＥＳエレメント、２Ａペプチド、双方向性プロモーター及びプロモーターからなる群から選択される共発現エレメントを含む。
本発明のベクターは、あらゆる種類の共発現エレメントの組み合わせを含んでもよい。
一例として、本発明のベクターは、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列と、第１の免疫刺激性化合物をコードする第２の核酸配列と、第２の免疫刺激性化合物をコードする第３の核酸配列とを含むＤＮＡプラスミドである。一実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、（プロモーターの制御下で）第１のポリペプチドと第１及び第２の免疫刺激性化合物との共発現を可能にするＩＲＥＳ及び２Ａペプチドを含む。別の実施態様では、ＤＮＡプラスミドは双方向性プロモーターと別のプロモーターを含む。
当業者は、上記の例のように第１、第２及び第３の核酸配列という用語が、本発明のプラスミドが第１、第２及び第３の核酸配列の順序で核酸配列を含むことを意味しないことを知るであろう。第２の核酸配列は第１又は第３の核酸配列の下流又は上流であってもよく、第３の核酸配列は第１又は第２の核酸配列の下流又は上流であってもよく、そして、第１の核酸配列は第２又は第３の核酸配列の上流又は下流であってもよい。別の実施形態では、第１核酸配列と第２核酸配列は、第１核酸配列と第３核酸配列、又は第２核酸配列と第３核酸配列のように、同じＤＮＡ鎖上で反対方向にあるかもしれない。さらなる実施形態では、第１のポリペプチド及び免疫刺激性化合物をコードする核酸配列は、反対のＤＮＡ鎖上にあるかもしれない。
免疫刺激性化合物
本発明のベクターは、1又は複数の免疫刺激性化合物をコードする1又は複数の核酸配列を含む。
本開示の一実施形態では、免疫刺激性化合物は、抗原提示細胞に影響を及ぼす化合物である。別の実施形態では、免疫刺激性化合物は、抗原提示細胞を刺激する化合物である。
抗原提示細胞（ＡＰＣ）とは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）と複合化した抗原を表面に提示する細胞であり、このプロセスは抗原提示として知られている。Ｔ細胞はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いてこれらの複合体を認識する。ＡＰＣは抗原を処理し、Ｔ細胞にそれらを提示する。
ほとんど全ての細胞タイプが何らかの方法で抗原を提示することができる。ランゲルハンス細胞、Ｂ細胞、及び樹状細胞などのマクロファージを含むプロフェッショナルなＡＰＣは、ＭＨＣクラスＩＩを介してヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋）に外来抗原を提示し、一方、ウイルス感染細胞（又は癌細胞）は、ＭＨＣクラスＩを介して細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋）に細胞内部に由来する抗原を提示することができる。ＭＨＣファミリーのタンパク質に加えて、抗原提示はＡＰＣとＴ細胞の両方の表面にある他の特殊なシグナル伝達分子に依存している。
「ＭＨＣ」とは「主要組織適合複合体」の略である。ＭＨＣ分子には、ＭＨＣクラスＩとＭＨＣクラスＩＩという２つの主要なクラスがある。ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩという用語は、本明細書ではＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩと互換的に使用される。ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）はヒトの主要組織適合複合体である。
細胞傷害性Ｔ細胞及びヘルパーＴ細胞の機能はＡＰＣに依存しているため、ＡＰＣは有効な獲得免疫に対して重要である。抗原提示は適応免疫の特異性を可能にし、細胞内外の病原体に対する免疫応答に寄与する。また、腫瘍に対する防御にも関与している。
本開示の一実施形態において、ＡＰＣは、樹状細胞、マクロファージ、ランゲルハンス細胞、Ｂ細胞及び好中球からなる群より選択され、免疫刺激性化合物は、このような細胞を刺激するなど、このような細胞に影響を及ぼす化合物である。
ＡＰＣが影響を受ける、例えば刺激を受けると、その刺激はＡＰＣの誘引、活性化、成熟、及び／又は増殖をもたらす。
本開示の一実施形態では、１又は複数の免疫刺激性化合物は、抗原提示細胞の誘引及び／又は活性化及び／又は成熟及び／又は増殖を促進し、例えば、抗原提示細胞の成長及び／又は拡大を促進する。
本開示の一実施形態では、免疫刺激性化合物は、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーに結合するリガンド、又はパターン認識受容体（ＰＲＲ）に結合するリガンドを含む。
一実施形態では、本発明のベクターはプラスミド、例えばＤＮＡプラスミドである。それは、それを必要とする対象に、例えば筋肉内投与によって投与され得、筋肉細胞から、コードされた化合物は発現され、そして、分泌される。第一のポリペプチド（二量体タンパク質などの多量体タンパク質の形態で分泌される）の効力は、多量体タンパク質及び免疫刺激性化合物が分泌される注射部位／筋肉細胞にＡＰＣを引き付ける免疫刺激性化合物の共発現によって増強される可能性がある。ＡＰＣの誘引は、より強く、かつ、加速された免疫応答をもたらす：多量体タンパク質は血流中で希釈されるだけでなく、ＡＰＣに送達されて取り込まれ、多量体タンパク質に含まれる１又は複数の抗原を他の関連免疫細胞に提示できるＡＰＣの数が局所的により多くなる。
ＡＰＣの誘引を促進する免疫刺激性化合物
したがって、一実施形態では、免疫刺激性化合物はＡＰＣの誘引を促進するものである。
ＡＰＣ誘引は、インビトロトランスウェルアッセイ又は遊走アッセイを含む当該技術分野で公知の方法、フローサイトメトリーによる本発明のベクターが投与された筋肉細胞のインビボでの表面マーカーの測定、又は例えばＲＴ－ｑＰＣＲ、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ又はＲＮＡ配列決定による遺伝子発現パターンの変化によって測定されてもよい。
ＡＰＣを引き寄せることができる分子の一種がケモカインである。ケモカインは細胞から分泌される小さなサイトカイン、すなわちシグナル伝達タンパク質の一群である。ケモカインという名称は、近傍の応答性細胞に指向性走化性を誘導する能力、すなわち走化性サイトカインに由来する。
本開示の一実施形態では、免疫刺激性化合物はケモカインである。
別の実施形態では、免疫刺激性化合物は、ＡＰＣ上の以下の表面分子と相互作用し得る：ＣＣＲ１（Ｃ－Ｃモチーフケモカイン受容体１）、ＣＣＲ３（Ｃ－Ｃモチーフケモカイン受容体３）、ＣＣＲ４（Ｃ－Ｃモチーフケモカイン受容体４）、ＣＣＲ５（Ｃ－Ｃモチーフケモカイン受容体５）、ＣＣＲ６（Ｃ－Ｃモチーフケモカイン受容体６）、ＣＣＲ７（Ｃモチーフケモカイン受容体７）、ＣＣＲ８（Ｃ－Ｃモチーフケモカイン受容体８）又はＸＣＲ１（Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体１）。好ましい実施形態では、免疫刺激性化合物は、ヒトＡＰＣ上の前述の表面分子と相互作用することができる。
本開示のさらに別の実施形態では、免疫刺激性化合物は、マクロファージ炎症性タンパク質α及びそのアイソフォームからなるリストから選択され、マウスＣＣＬ３（又はＭＩＰ－１α）、及びヒトアイソフォームｈＣＣＬ３、ｈＣＣＬ３Ｌ１、ｈＣＣＬ３Ｌ２及びｈＣＣＬ３Ｌ３、好ましくはヒトＭＩＰ－１α（ｈＭＩＰ－１αバリアント、ＬＤ７８β又はＣＣＬ３Ｌ１とも呼ばれる）、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）、好ましくはヒトＣＣＬ５、例えば、配列番号４３のアミノ酸配列を有するヒトＣＣＬ５、ケモカインリガンド４（ＣＣＬ４）、好ましくはヒトＣＣＬ４、ケモカインリガンド２０（ＣＣＬ２０）、好ましくはヒトＣＣＬ２０、ケモカインリガンド１９（ＣＣＬ１９）、好ましくはヒトＣＣＬ１９、ケモカインリガンド２１（ＣＣＬ２１）、好ましくはヒトＣＣＬ２１、及びケモカインモチーフリガンド１又は２（ＸＣＬ１又はＸＣＬ２）、好ましくはヒトＸＣＬ１又はヒトＸＣＬ２を含む。
活性化のプロセスとは、静止状態のＡＰＣをより分化した状態及び／又は成熟した状態へと駆り立てる一連の事象のことである。ＡＰＣは、病原体との相互作用や外来抗原との遭遇によって直接的に活性化され、また、そのような分子を認識する他の細胞種によって産生・放出される化合物（炎症性メディエーターなど）によって間接的に活性化される。ＡＰＣはその後、一連の細胞プロセスを経て活性化され、外来抗原に対する効果的な免疫応答を引き起こす重要な役割を果たす。例えば、樹状細胞の成熟は、貪食能の低下、抗原プロセッシングと提示の増強、リンパ組織への遊走能の向上、Ｂ細胞やＴ細胞を刺激する能力の増大によって特徴づけられる。
ＡＰＣの活性化及び／又は成熟を促進する免疫刺激性化合物
本開示の一実施形態では、免疫刺激性化合物は、ＡＰＣの活性化及び／又は成熟を促進するものである。
ＡＰＣの活性化を測定するために、当技術分野で知られているさまざまな技術が利用可能であり、例えば、ＥＬＩＳｐｏｔ又はＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔによって測定される活性化前後のサイトカインプロファイルの比較、遺伝子発現の全体的変化の決定、及びＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、ＷＢ及びＰＣＲ／配列決定法（ｑＰＣＲ（ＴａｑＭａｎアレイ）、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ及びＲＮＡ－ｓｅｑ）などの様々な技術による発現タンパク質（例えば活性化マーカー）の分析などである。
本開示の一実施形態では、免疫刺激性化合物は、ＣＤ４０（分化クラスタ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７、ＲＡＮＫ及びＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）を含むＴＮＦ受容体スーパーファミリーの受容体からなる群より選択されるＡＰＣ上の表面分子と相互作用することができる。好ましい実施形態では、免疫刺激性化合物は、ヒトＡＰＣ上の前述の表面分子と相互作用することができる。
このような免疫刺激性化合物は、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０リガンド、ＣＤ１５４）、ＣＤ１３７Ｌ（４－１ＢＢＬ、４－１ＢＢリガンド）、ＣＤ７０、ＩＣＯＳＬ（ＣＤ２７５）及びＲＡＮＫＬからなるリストから選択され得る。好ましい実施形態では、免疫刺激性化合物は、ｈＣＤ４０Ｌ、ｈＣＤ１３７Ｌ、ｈＣＤ７０、ｈＩＣＯＳＬ及びｈＲＡＮＫＬからなる群より選択される。
本開示の別の実施形態では、免疫刺激性化合物は、ＩＬ－２、好ましくはヒトＩＬ－２、ＩＬ－１０、好ましくはヒトＩＬ－１０、ＩＬ－１２、好ましくはヒトＩＬ－１２、例えば配列番号：４５及び４７のアミノ酸配列を含むヒトＩＬ－１２、ＩＬ－２１、好ましくはヒトＩＬ－２１、例えば配列番号４９のアミノ酸配列を含むヒトＩＬ－２１、ＴＮＦα、好ましくはヒトＴＮＦα、ＩＦＮγ、好ましくはヒトＩＦＮγ及びＩＬ－１β、好ましくはヒトＩＬ－１βからなる群より選択されるサイトカインである。
本開示のさらに別の実施形態では、免疫刺激性化合物は、ＭｙＤ８８及びＴＲＩＦなどの免疫シグナル伝達分子、好ましくはヒトＭｙＤ８８及びヒトＴＲＩＦなどであり、これらの分子は、それらの表面に存在するＴＬＲ受容体を介してＡＰＣを活性化する。
本開示のさらに別の実施形態では、免疫刺激性化合物は、例えばＲＩＧ－１やＭＤＡ－５などのウイルス感染センサーであり、好ましくはヒトＲＩＧ－１やヒトＭＤＡ－５である。
本開示のさらに別の実施形態では、免疫刺激性化合物は、ＡＰＣ上のパターン認識受容体、例えば、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４又はＴＬＲ５を含むＴｏｌｌ様受容体と相互作用するものである。好ましい実施形態では、免疫刺激性化合物は、ヒトＡＰＣ上の前述の受容体と相互作用する。
一実施形態では、このような免疫刺激性化合物は、フラジェリンなどの病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、ＨＭＧＢ１、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、カルレクチクリン（Ｃａｌｒｅｃｔｉｃｕｌｉｎ）及びアネキシンＡ１などのタンパク質ダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰ）からなるリストから選択される。好ましい実施形態では、このような免疫刺激性化合物は、ヒト病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、ヒトＨＭＧＢ１、ヒト熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、ヒトカルレクチクリン及びヒトアネキシンＡ１のようなヒトタンパク質ダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰ）、からなるリストから選択される。ＰＡＭＰｓ／ＤＡＭＰｓは、本発明のベクターに核酸配列として含めることができ、翻訳後修飾によって導入された機能性基を含んでいてもよい機能性タンパク質として発現されるものを含む。前述の分子は、ＡＰＣ上の以下の受容体を活性化する：ＲＡＧＥ、ＴＬＲ４、ＴＬＲ９及びＴＩＭ－３（ＨＭＧＢ１の場合）、ＦＰＲ（アネキシンＡ１の場合）、ＳＲＥＣ１、ＬＯＸ１及びＣＤ９１（ＨＳＰの場合）。好ましい実施形態では、免疫刺激性化合物は、ヒトＡＰＣ上の前述の受容体を順に活性化する。
ＡＰＣの成長及び／又は拡大を促進する免疫刺激性化合物
免疫反応中、活性化されたＡＰＣは感染や病気と闘うために急速に増殖する。細胞増殖とは、細胞が成長し（質量とサイズが増加し）、分裂して２つの娘細胞を作り出すプロセスである。成長因子は細胞表面のレセプターに結合して細胞を刺激し、その結果細胞が増殖する。細胞増殖は細胞数の指数関数的増加につながり、従って、細胞集団を急速に拡大するメカニズムである。以下では、「拡大」と「増殖」という用語を同じ意味で用いる。
一実施形態では、免疫刺激性化合物は、ＡＰＣの成長及び／又は拡大を促進するものである。
細胞増殖は、例えばＭＴＴ／ＭＴＳアッセイ、タンパク質の翻訳測定、又はＣＦＳＥによる標識など、当技術分野で知られている様々な技術によって測定することができる。当該技術分野でよく知られた方法は、例えば細胞集団の代謝活性を測定することによって実施され、これは細胞増殖の状態を反映する。さらに、細胞内のＡＴＰ含量は厳密に制御されているので、ＡＴＰの検出も細胞増殖に関する情報を提供することができる。死細胞や死にかけた細胞はＡＴＰをほとんど含まないため、細胞溶解液や抽出液中のＡＴＰ濃度と細胞数の間には厳密な直線関係がある。生物発光ルシフェラーゼとその基質であるルシフェリンを用いたＡＴＰ検出は、非常に高感度な結果を得ることができる。ＡＴＰが存在すれば、ルシフェラーゼは発光し、発光強度はＡＴＰ濃度に比例する。さらに、ある種の抗原は増殖細胞にのみ存在し、非増殖細胞にはこれらの抗原がない。細胞増殖は、特異的モノクローナル抗体を利用することで検出できる。例えば、ヒト細胞では、Ｋｉ－６７抗体は、細胞周期のすべての活動期に発現するが、休止期（静止）細胞には存在しない同名のタンパク質を認識する。伝統的に、放射性標識３Ｈ－チミンが増殖の指標として用いられてきた。３Ｈ－チミンは細胞とともに数時間から一晩インキュベートされる。新しく増殖した細胞はＤＮＡに放射性標識を取り込み、抽出後シンチレーションカウンターで検出することができる。
本開示の一実施形態では、免疫刺激性化合物は、ＡＰＣ上の以下の表面分子と相互作用し得る：ＧＭ－ＣＳＦレセプター（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子レセプター、ＣＤ１１６）、ＦＬＴ－３Ｒ（ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３、ＣＤ１３５）、ＩＬ－１５Ｒ又はＩＬ－４Ｒ。好ましい実施形態では、免疫刺激性化合物は、ヒトＡＰＣ上の前述の表面分子と相互作用する。
本開示の一実施形態では、免疫刺激性化合物は、成長因子、例えば、ＧＭ－ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、好ましくは、ヒトＧＭ－ＣＳＦ、例えば、配列番号４１のアミノ酸配列を有するヒトＧＭ－ＣＳＦ、ＦＬＴ－３Ｌ（本明細書において、用語ＦＬＴ－３Ｌ及びＦＬＴ３Ｌは互換的に使用される）、例えば、ヒトＦＬＴ－３Ｌ、好ましくは配列番号１０のアミノ酸配列を有するヒトＦＬＴ－３Ｌ、ＩＬ－１５、好ましくはヒトＩＬ－１５又はＩＬ－４、好ましくはヒトＩＬ－１４である。
別の実施形態では、免疫刺激性化合物は、以下の表３から選択される１又は複数である。好ましい実施形態では、表３に列挙される免疫刺激性化合物は、ヒトＡＰＣ上に存在する表３に列挙される受容体と相互作用するヒト免疫刺激性化合物である：
本開示の一実施形態では、ベクターは、２、３、４、５、６、７又は８個の免疫刺激性化合物をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、ベクターは、２～６の免疫刺激性化合物、すなわち、２又は３又は４又は５又は６の免疫刺激性化合物をコードする核酸配列を含む。免疫刺激性化合物は同一であっても異なっていてもよく、好ましくは異なる。
好ましい実施形態では、異なる免疫刺激性化合物はAPCにも異なる影響を与え、多くの異なるレベルで免疫系を刺激し、それによって第1のポリペプチドの治療効果又は予防効果を最大化する。
一例として、一実施形態では、ベクターは、３つの異なる免疫刺激性化合物をコードする核酸を含み、第１のものは、ＤＣの誘引を促進する免疫刺激性化合物（例えばＸＣＬ１）であり、第２のものは、ＤＣの成長を促進する免疫刺激性化合物（例えばＦＬＴ３Ｌ）であり、第３のものは、ＤＣの活性化を促進する免疫刺激性化合物（例えばＣＤ４０Ｌ）である。一実施形態では、このようなベクターは、感染症の治療及び／又は予防、あるいは癌の治療に使用されてもよい。特定の免疫刺激性化合物の選択は、第１のポリペプチドに構成されるターゲティングユニットにも依存する。なぜなら、前記ターゲティングユニットはＡＰＣを標的とし、免疫刺激性化合物と同様の様式でＡＰＣに影響を及ぼし得るからであり、例えば、ＡＰＣを誘引又は活性化する。
第１の核酸配列
本開示のベクターは、第１の核酸配列、すなわち、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びｍＲＮＡを含むＤＮＡ又はＲＮＡを含み、二本鎖又は一本鎖のいずれかで、第１のポリペプチドをコードする。一実施形態では、第１の核酸配列はＤＮＡである。別の実施形態では、第１の核酸配列は、それが投与される対象の種に最適化される。ヒトに投与する場合、一実施形態では、第１の核酸配列はヒトのコドンに最適化される。
第１の核酸配列は第一のポリペプチドをコードし、この第一のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量化ユニットと、１又は複数の抗原又はその一部、例えば１又は複数の疾患関連抗原又はその一部を含む抗原ユニットとを含む。対象に投与されると、第一のポリペプチドは発現され、多量体化ユニットの存在により、多量体タンパク質を形成し、抗原ユニット中に構成される抗原又はその一部、例えばエピトープに対する免疫応答を誘発し、その結果、対象の免疫系が活性化される。
第１のポリペプチド及び第１のポリペプチドを含む二量体タンパク質又は多量体タンパク質のような構造は、当該技術分野において公知である（例えば ＷＯ ２００４／０７６４８９Ａ１、ＷＯ ２０１１／１６１２４４Ａ１、ＷＯ ２０１７／１１８６９５Ａ１及びＷＯ ２０２２／０１３２７７Ａ１、すべての開示内容は援用により本明細書に含まれる）、当業者は、ベクターの想定される使用及びその投与後の所望の結果に従って、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニット、多量体化ユニット及び抗原ユニットを選択することができる。
第１のポリペプチドは、Ｎ末端開始点とＣ末端終了点を有する（図４に図示）。第１のポリペプチドのエレメント及びユニット－ターゲティングユニット（ＴＵ）、多量体化ユニット、例えばこの図４では二量体化ユニット（ＤｉｍＵ）、及び抗原ユニット－は、抗原ユニットが第１のポリペプチドのＣ末端（図４ａ）又は第１のポリペプチドのＮ末端開始部（図４ｂ）に位置するように、第１のポリペプチド中に配置され得る。好ましくは、抗原ユニットは第一ポリペプチドのＣ末端に位置する。ユニットリンカー（ＵＬ）は、二量体化ユニットのような多量体化ユニットと抗原ユニットとを連結してもよい。図４は、４つのネオエピトープ（ｎｅｏ１、ｎｅｏ２、ｎｅｏ３、ｎｅｏ４）を有する抗原ユニットを示しており、これらはリンカー（ＳＵＬ１、ＳＵＬ２、ＳＵＬ３）によって分離されている。ネオエピトープｎｅｏ１－ｎｅｏ４の配置を説明する別の方法は、これらのネオエピトープが３つの抗原サブユニットに配置され、それぞれがネオエピトープとサブユニットリンカー（ＳＵＬ１、ＳＵＬ２、ＳＵＬ３）、及び最初のポリペプチドのＣ末端又はＮ末端開始点に最も近い末端ネオエピトープ（ｎｅｏ４）から構成されるということである。図中、サブユニットは角括弧で示されている。したがって、ｎ個のネオエピトープを含む抗原ユニットはｎ－１個のサブユニットを含み、各サブユニットはネオエピトープとサブユニットリンカーを含む。本明細書で述べるように、４つのネオエピトープは同一でも異なっていてもよく、３つのリンカー／サブユニットリンカーは同一でも異なっていてもよい。第１のポリペプチドの上記のユニット及びエレメントの順序及び配向は、多量体タンパク質及び第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列において同じである。図４に示すような第１のポリペプチドは、本明細書に記載するように、抗癌ワクチン、例えば個別化抗癌ワクチンとして使用するためのものであってもよい。
以下では、第１のポリペプチドの様々なユニットやエレメントについて詳細に説明する。これらは、ユニット／エレメントをコードする核酸配列として第１の核酸配列中に存在し、一方、これらは、アミノ酸配列として第一のポリペプチド又は多量体タンパク質中に存在する。読みやすくするために、以下では、ユニット／エレメントは主に第一のポリペプチド／多量体タンパク質との関連で、すなわちアミノ酸配列に基づいて説明する。
ターゲティングユニット
本発明のベクターに含まれる第１の核酸によってコードされる第１のポリペプチドは、ＡＰＣを標的とするターゲティングユニットを含む。ＡＰＣは、樹状細胞（ＤＣ）及びそのサブセットを含む。
本明細書で使用する「ターゲティングユニット」という用語は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞へのＭＨＣクラスII制限提示のために、又はＭＨＣクラスＩ制限によるＣＤ８＋ Ｔ細胞への交差提示を提供するために、ポリペプチド／多量体タンパク質を抗原提示細胞に送達するユニットを指す。
ターゲティングユニットの存在により、多量体タンパク質は、ＤＣ、好中球、及び他の免疫細胞を引き付ける。したがって、多量体タンパク質は、その中に構成される抗原ユニットを特定の細胞にターゲティングするだけでなく、ベクターの投与部位に特定の免疫細胞をリクルートすることによって、応答増幅効果（アジュバント効果）を促進する。
ターゲティングユニットは、多量体タンパク質を、ＡＰＣ上に発現する表面分子、例えば、ＡＰＣのいずれか又は多くのタイプに発現する分子、あるいはＡＰＣのサブセット、例えば、ＤＣのサブセットにのみ発現する分子などにターゲティングするように設計されている。
ＡＰＣ上のこのような表面分子の例は、ＨＬＡ、分化クラスタ１４（ＣＤ１４）、分化クラスタ４０（ＣＤ４０）、ＣＬＥＣ９Ａ、ケモカイン受容体及びＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を含む。ケモカイン受容体は、Ｃ－Ｃモチーフケモカイン受容体１（ＣＣＲ１）、Ｃ－Ｃモチーフケモカイン受容体３（ＣＣＲ３）、Ｃ－Ｃモチーフケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）、Ｃ－Ｃモチーフケモカイン受容体５（ＣＣＲ５）、Ｃ－Ｃモチーフケモカイン受容体６（ＣＣＲ６）、Ｃ－Ｃモチーフケモカイン受容体７（ＣＣＲ７）、Ｃ－Ｃモチーフケモカイン受容体８（ＣＣＲ８）及びＸＣＲ１を含む。Ｔｏｌｌ様受容体は、ＴＬＲ－２、ＴＬＲ－４及びＴＬＲ－５を含む。一実施形態では、ターゲティングユニットは、これらの表面分子と相互作用する部分であるか、又はそれを含む。好ましい実施形態では、前述の表面分子はヒトＡＰＣ上に存在する。
したがって、一の実施形態では、ターゲティングユニットは、ＭＨＣ／ＨＬＡ、ＣＤ１４、ＣＤ４０、ＣＬＥＣ９Ａ又はＴｏｌｌ様受容体、好ましくは、ｈＣＤ１４、ｈＣＤ４０、ｈＣＬＥＣ９Ａ又はヒトＴｏｌｌ様受容体に対する特異性を有する抗体可変ドメイン（ＶＬ及びＶＨ）などの抗体結合領域を含むか、又はそれらからなる。別の実施形態では、ターゲティングユニットは、合成又は天然リガンドを含むか、又はそれらからなる。例としては、可溶性ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、好ましくはｈＣＤ４０Ｌ、ケモカインのような天然リガンド、好ましくはそれらのヒト形態、例えばＣ－Ｃモチーフリガンド５（ＣＣＬ５又はＲＡＮＴＥＳ）とも呼ばれるケモカインリガンド５、好ましくはｈＣＣＬ５、例えば配列番号４３のｈＣＣＬ５、マウスＣＣＬ３（又はＭＩＰ－１α）、及びヒトアイソフォームｈＣＣＬ３、ｈＣＣＬ３Ｌ１、ｈＣＣＬ３Ｌ２及びｈＣＣＬ３Ｌ３、ケモカインリガンド４（ＣＣＬ４）及びそのアイソフォームＣＣＬ４Ｌ、好ましくはｈＣＣＬ４及びｈＣＣＬ４Ｌ、ケモカインリガンド１９（ＣＣＬ１９）、好ましくはｈＣＣＬ１９、ケモカインリガンド２０（ＣＣＬ２０）、好ましくはｈＣＣＬ２０、ケモカインリガンド２１（ＣＣＬ２１）、好ましくはｈＣＣＬ２１、ケモカインモチーフリガンド１又は２（ＸＣＬ１又はＸＣＬ２）、好ましくはｈＸＣＬ１又はｈＸＣＬ２を含むマクロファージ炎症性タンパク質α及びそのアイソフォーム、及び例えばフラジェリンのような細菌抗原を含む。
一実施形態では、ターゲティングユニットは、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質に対する親和性を有する。したがって、一実施形態では、ターゲティングユニットは、抗ＨＬＡ－ＤＰ、抗ＨＬＡ－ＤＲ及び抗パンＨＬＡクラスＩＩからなる群から選択されるＭＨＣクラスＩＩタンパク質に対する特異性を有する抗体可変ドメイン（ＶＬ及びＶＨ）などの抗体結合領域を含むか、又はからなる。
別の実施形態では、ターゲティングユニットは、ＣＤ１４、ＣＤ４０、ＴＬＲ－２、ＴＬＲ－４及びＴＬＲ－５からなる群から選択される表面分子に対する親和性を有し、好ましくは、ｈＣＤ１４、ｈＣＤ４０、ｈＴＬＲ－２、ｈＴＬＲ－４及びｈＴＬＲ－５からなる群から選択される表面分子に対する親和性を有する。したがって、一実施形態では、ターゲティングユニットは、ＣＤ１４、ＣＤ４０、ＴＬＲ－２、ＴＬＲ－４又はＴＬＲ－５、好ましくは、ｈＣＤ１４、ｈＣＤ４０、ｈＴＬＲ－２、ｈＴＬＲ－４又はｈＴＬＲ－５に対する特異性を有する、抗ｈＣＤ１４、抗ｈＣＤ４０、抗ｈＴＬＲ－２、抗ｈＴＬＲ－４又は抗ｈＴＬＲ－５、好ましくはｈＣＤ１４、ｈＣＤ４０、ｈＴＬＲ－２、ｈＴＬＲ－４又はｈＴＬＲ－５に対する特異性を有する、例えば、抗ｈＣＤ１４、抗ｈＣＤ４０、抗ｈＴＬＲ－２、抗ｈＴＬＲ－４又は抗ｈＴＬＲ－５に対する特異性を有する、抗体可変ドメイン（ＶＬ及びＶＨ）のような抗体結合領域を含む、又はからなる。
さらに別の実施形態では、ターゲティングユニットは、ｈＴＬＲ－５などのＴＬＲ－５に親和性を有するフラジェリンを含むか、又はからなる。さらに別の実施形態では、ターゲティングユニットは、ＣＬＥＣ９Ａに対する特異性を有する抗体結合領域、例えば、抗ＣＬＥＣ９Ａ又はそのバリアント、例えば、抗ＣＬＥＣ９Ａ Ｆｖを含む、若しくはからなり、又はターゲティングユニットは、ＣＬＥＣ９リガンド、例えば、配列番号１１５を有する核酸配列又は前記核酸配列によってコードされるアミノ酸配列含む、若しくはからなるＣＬＥＣ９リガンドを含む、若しくはからなる。好ましい実施形態では、ターゲティングユニットは、ｈＣＬＥＣ９Ａに対する特異性を有する抗体結合領域、例えば抗ｈＣＬＥＣ９Ａ若しくはそのバリアント、例えば抗ｈＣＬＥＣ９Ａ Ｆｖを含む、若しくはからなり、又はターゲティングユニットはヒトＣＬＥＣ９リガンドを含む、若しくはからなる。
好ましくは、ターゲティングユニットは、ＣＣＲ１、ＣＣＲ３、ＣＣＲ５及びＣＣＲ７から選択されるケモカインレセプターに対して親和性を有し、より好ましくは、ＣＣＲ１、ＣＣＲ３及びＣＣＲ５から選択されるケモカインレセプターに対して親和性を有する。さらなる好ましい実施形態では、ターゲティングユニットは、ｈＣＣＲ１、ｈＣＣＲ３、ｈＣＣＲ５及びｈＣＣＲ７から選択されるケモカインレセプターに対して親和性を有し、より好ましくは、ｈＣＣＲ１、ｈＣＣＲ３及びｈＣＣＲ５から選択されるケモカインレセプターに対して親和性を有する。
一実施形態では、ターゲティングユニットは、ケモカインレセプターＣＣＲ７、好ましくはヒトケモカインレセプターＣＣＲ７に対して親和性を有する。別の実施形態では、ターゲティングユニットは、ＣＣＬ１９、例えば、配列番号１２１のヌクレオチド配列又は前記ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、又はからなるＣＣＬ１９、又はＣＣＬ２１、例えば、ＣＣＬ１９もしくはＣＣＬ２１のヒト形態を含む、又はからなる。
好ましくは、ターゲティングは、ケモカインヒトマクロファージ炎症性タンパク質α（ヒトＭＩＰ－１α（ｈＭＩＰ－１α）バリアント、ＬＤ７８β又はＣＣＬ３Ｌ１とも呼ばれる）を含む、又はからなり、ＡＰＣの細胞表面に発現するＣＣＲ１、ＣＣＲ３及びＣＣＲ５を含むその同族レセプターに結合する。ターゲティングユニットが同族レセプターに結合すると、多量体タンパク質がＡＰＣに内在化され、タンパク質が分解されて小さなペプチドとなり、ＭＨＣ分子にロードされてＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞に提示され、特異的免疫応答が誘導される。一旦刺激されると、活性化されたＣＤ４＋ Ｔ細胞の助けを借りて、ＣＤ８＋ Ｔ細胞は同じ抗原を発現する細胞、例えば同じ抗原を発現する癌細胞を標的として殺傷する。
別の実施形態では、Ｔ細胞応答とＢ細胞応答の両方が誘導される。これはまた、抗体応答、すなわち、ウイルスが循環しているときに例えばウイルス表面タンパク質に結合し、ウイルスが宿主細胞に侵入するのを阻害することによってウイルスを中和する抗体を可能にする。
好ましい一実施形態では、ターゲティングユニットは、配列番号１のアミノ酸配列２４－９３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、例えば、配列番号１のアミノ酸配列２６－９３を含むか、又は配列番号１のアミノ酸配列２８－９３を含む。
さらなる好ましい実施形態では、ターゲティングユニットは、配列番号１のアミノ酸配列２４－９３に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも８６％又は少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらに好ましい実施形態では、ターゲティングユニットは、配列番号１のアミノ酸配列２４～９３を含む。
より好ましい実施形態では、ターゲティングユニットは、配列番号１のアミノ酸配列２４－９３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、例えば、配列番号１のアミノ酸配列２６－９３からなるか、又は配列番号１のアミノ酸配列２８－９３からなる。
さらに好ましい実施形態では、ターゲティングユニットは、配列番号１のアミノ酸配列２４－９３に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも８６％又は少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。さらに別の好ましい実施形態では、ターゲティングユニットは、配列番号１のアミノ酸配列２４～９３からなる。
一の好ましい実施形態では、ターゲティングユニットは、最大６個のアミノ酸が、最大５個のアミノ酸など、最大４個のアミノ酸など、最大３個のアミノ酸など、最大２個のアミノ酸など、又は最大１個のアミノ酸などが、置換、欠失又は挿入されていることを除いて、配列番号１のアミノ酸配列２４～９３を含む。このようなターゲティングユニットの実施形態は、配列番号１のアミノ酸配列２６～９３を含むもの、又は配列番号１のアミノ酸配列２８～９３を含むものである。
別の好ましい実施形態では、ターゲティングユニットは、最大６個のアミノ酸が、最大５個のアミノ酸など、最大４個のアミノ酸など、最大３個のアミノ酸など、最大２個のアミノ酸など、又は最大１個のアミノ酸などが、置換、欠失又は挿入されていることを除いて、配列番号１のアミノ酸配列２４～９３からなる。このようなターゲティングユニットの実施形態は、配列番号１のアミノ酸配列２６～９３からなるもの、又は配列番号１のアミノ酸配列２８～９３からなるものである。
さらなる好ましい実施形態では、ターゲティングユニットは、配列番号２５を有する核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも８６％又は少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。さらに好ましい実施形態では、ターゲティングユニットは、配列番号２５の核酸配列を含む。
より好ましい実施形態では、ターゲティングユニットは、配列番号２５を有する核酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列からなる。
さらなる好ましい実施形態では、ターゲティングユニットは、配列番号２５の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも８６％又は少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列からなる。さらに別の好ましい実施形態では、ターゲティングユニットは、配列番号２５の核酸配列を有する。
一実施形態では、本発明のベクターにおけるターゲットユニット及び免疫刺激性化合物の特定の選択及び／又は組み合わせは、例えば、ターゲティングユニットとしてｈＭＩＰ－１α又はＣＣＬ３を選択し、免疫刺激性化合物としてＣＣＬ４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＦＬＴ３Ｌ及び／又はＩＦＮαを選択することである。別の実施形態では、特定の選択及び／又は組み合わせは、例えば、ターゲティングユニットとしてｈＭＩＰ－１α又はＣＣＬ３を選択し、免疫刺激性化合物としてＣＣＬ５、ＧＭ－ＣＳＦ、ＦＬＴ３Ｌ及び／又はＩＦＮαを選択することである。さらに別の実施形態では、特定の選択及び／又は組み合わせは、例えば、ターゲティングユニットとしてＣＣＬ５を選択し、免疫刺激性化合物としてＸＣＬ１、ＧＭ－ＣＳＦ、ＦＬＴ３Ｌ及び／又はＩＦＮαを選択することである。さらに別の実施形態では、特定の選択及び／又は組み合わせは、例えば、ターゲティングユニットとしてｈＭＩＰ－１α又はＣＣＬ３を選択し、免疫刺激性化合物としてＩＬ－４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ及び／又はＴＮＦαを選択することである。さらに別の実施形態では、特定の選択及び／又は組み合わせは、例えば、ターゲティングユニットとしてｈＭＩＰ－１α又はＣＣＬ３を選択し、免疫刺激性化合物としてＩＬ－４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１β及び／又はＴＮＦαを選択することである。さらに別の実施形態では、特定の選択及び／又は組み合わせは、例えば、ターゲティングユニットとしてｈＭＩＰ－１α又はＣＣＬ３を選択し、免疫刺激性化合物としてＩＬ－４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１β及び／又はＩＦＮγを選択することである。さらに別の実施形態では、特定の選択及び／又は組み合わせは、例えば、ターゲティングユニットとしてＣＣＬ５を選択し、免疫刺激性化合物としてＣＣＬ７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＦＬＴ３Ｌ及び／又はＩＦＮαを選択することである。さらに別の実施形態では、特定の選択及び／又は組み合わせは、例えば、ターゲティングユニットとしてｈＭＩＰ－１α又はＣＣＬ３を選択し、免疫刺激性化合物として４－１ＢＢＬ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＦＬＴ３Ｌ及び／又はＩＦＮαを選択することである。さらに別の実施形態では、特定の選択及び／又は組み合わせは、例えば、ターゲティングユニットとしてｈＭＩＰ－１α又はＣＣＬ３を選択し、免疫刺激性化合物としてＣＤ４０Ｌ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＦＬＴ３Ｌ及び／又はＩＦＮαを選択することである。さらに別の実施形態では、特定の選択及び／又は組み合わせは、例えば、ターゲティングユニットとしてｈＭＩＰ－１α又はＣＣＬ３を選択し、免疫刺激性化合物としてＣＤ２０５、ＧＭ－ＣＳＦ、ＦＬＴ３Ｌ及び／又はＩＦＮαを選択することである。さらに別の実施形態では、特定の選択及び／又は組み合わせは、例えば、ターゲティングユニットとしてＣＣＬ５を選択し、免疫刺激性化合物として４－１ＢＢＬ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＦＬＴ３Ｌ及び／又はＩＦＮαを選択することである。さらに別の実施形態では、特定の選択及び／又は組み合わせは、例えば、ターゲティングユニットとしてＣＣＬ５を選択し、免疫刺激性化合物としてＣＤ４０Ｌ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＦＬＴ３Ｌ及び／又はＩＦＮαを選択することである。さらに別の実施形態では、特定の選択及び／又は組み合わせは、例えば、ターゲティングユニットとして抗ＣＤ２０５を選択し、免疫刺激性化合物としてＣＣＬ５、ＧＭ－ＣＳＦ、ＦＬＴ３Ｌ及び／又はＩＦＮαを選択することである。さらに別の実施形態では、特定の選択及び／又は組み合わせは、例えば、ターゲティングユニットとしてｈＭＩＰ－１α又はＣＣＬ３を選択し、免疫刺激性化合物としてＣＣＬ４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＦＬＴ３Ｌ及び／又はＭｙＤ８８を選択することである。さらに別の実施形態では、特定の選択及び／又は組み合わせは、例えば、ターゲティングユニットとしてｈＭＩＰ－１α又はＣＣＬ３を選択し、免疫刺激性化合物としてＴＲＩＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＦＬＴ３Ｌ及び／又はＭｙＤ８８を選択することである。さらに別の実施形態では、特定の選択及び／又は組み合わせは、例えば、ターゲティングユニットとしてｈＭＩＰ－１α又はＣＣＬ３を選択し、刺激性化合物としてＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１及び／又はＣＤ４０Ｌを選択することである。さらに別の実施形態では、特定の選択及び／又は組み合わせは、例えば、ターゲティングユニットとしてＣＤ１１ｃを選択し、免疫刺激性化合物としてｈＭＩＰ－１α又はＣＣＬ３、ＩＦＮγ、ＧＭ－ＣＳＦ及び／又はＦＬＴ３Ｌを選択することである。さらに別の実施形態では、特定の選択及び／又は組み合わせは、例えば、ターゲティングユニットとしてＣＤ１１ｃを選択し、免疫刺激性化合物としてｈＭＩＰ－１α又はＣＣＬ３、ＴＮＦα、ＧＭ－ＣＳＦ及び／又はＦＬＴ３Ｌを選択することである。さらに別の実施形態では、特定の選択及び／又は組み合わせは、例えば、ターゲティングユニットとしてＣＬＥＣ９Ａを選択し、免疫刺激性化合物としてＣＣＬ５、ＸＣＬ１、ＧＭ－ＣＳＦ及び／又はＦＬＴ３Ｌを選択することである。さらに別の実施形態では、選択及び／又は組み合わせは、例えば、ターゲティングユニットとしてＣＤ１１ｃを選択し、免疫刺激性化合物としてＣＣＬ５、ＸＣＬ１、ＧＭ－ＣＳＦ及び／又はＦＬＴ３Ｌを選択することである。さらに別の実施形態では、特定の選択及び／又は組み合わせは、例えば、ターゲティングユニットとしてＣＡＤＭ１を選択し、免疫刺激性化合物としてＣＣＬ５、ＸＣＬ１、ＧＭ－ＣＳＦ及び／又はＦＬＴ３Ｌを選択することである。さらに別の実施形態では、特定の選択及び／又は組み合わせは、例えば、ターゲティングユニットとしてＣＣＬ１９を選択し、免疫刺激性化合物としてＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１及び／又はＣＤ４０Ｌを選択することである。さらに別の実施形態では、特定の選択及び／又は組み合わせは、例えば、ターゲティングユニットとしてＣＣＬ１９を選択し、免疫刺激性化合物としてＧＭ－ＣＳＦ、ＣＣＬ３Ｌ、ＸＣＬ１及び／又はＣＣＬ５を選択することである。
好ましい実施形態では、前項で挙げたターゲティングユニット及び免疫刺激性化合物はヒトタンパク質である。
多量化ユニット／二量体化ユニット
本発明のベクターに含まれる第１の核酸によってコードされる第１のポリペプチドは、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットを含む。
本明細書で使用する「多量体化ユニット」という用語は、抗原ユニットとターゲティングユニットとの間のヌクレオチド又はアミノ酸の配列を指す。抗原ユニットとターゲティングユニットを連結することに加えて、多量体化ユニットは、２、３、４又はそれ以上のポリペプチドなどの複数のポリペプチドを、二量体タンパク質、三量体タンパク質又は四量体タンパク質などの多量体タンパク質に多量体化すること／接合することを容易にする。さらに、たとえ距離が離れていても、多量体化ユニットは、ターゲティングユニットがＡＰＣ上の表面分子に最適に結合できるように、多量体タンパク質に柔軟性を与える。多量体化ユニットは、これらの要件の１又は複数を満たす任意のユニットであり得る。
２超のポリペプチドの多量体化／結合を促進する多量体化ユニット
一実施形態では、多量体化ユニットは、三量体化ユニット、例えば、コラーゲン由来の三量体化ユニット、例えば、ヒトコラーゲン由来の三量体化ドメイン、例えば、ヒトコラーゲン由来のＸＶＩＩＩ三量体化ドメイン（例えば、Ａ． Ａｌｖａｒｅｚ－Ｃｉｅｎｆｕｅｇｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉ Ｒｅｐ ６， ２８６４３ （２０１６）参照）又はヒトコラーゲンＸＶ三量体化ドメインである。したがって、一実施形態では、多量体化ユニットは、配列番号１１６を有する核酸配列、又は前記核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、又はからなる三量体化ユニットである。別の実施形態では、三量体化ユニットは、Ｔ４フィブリチンのＣ末端ドメインである。従って、一実施形態では、多量体化ユニットは、配列番号５６を有するアミノ酸配列を含む、又はからなる三量体化ユニットである。
別の実施形態では、多量体化ユニットは、四量体化ユニットであり、例えば、p53由来のドメインであり、任意選択で、以下に記載されるようなヒンジ領域をさらに含む。したがって、一実施形態では、多量体化ユニットは、配列番号57を有する核酸配列、又は前記核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、又はからなる四量体化ユニットであり、任意選択で、以下に記載されるようなヒンジ領域をさらに含む。
二量体化ユニット
本明細書で使用する「二量体化ユニット」という用語は、抗原ユニットとターゲティングユニットとの間のヌクレオチド又はアミノ酸の配列を指す。抗原ユニットとターゲティングユニットを連結することに加えて、二量体化ユニットは、２つの単量体ポリペプチドの二量体タンパク質への二量体化／結合を促進させる。さらに、たとえ距離が離れていても、二量体化ユニットは、二量体タンパク質に柔軟性を与え、ターゲティングユニットがＡＰＣ上の表面分子に最適に結合できるようにする。二量体化ユニットは、これらの要件を満たすユニットであればどのようなものでもよい。
従って、一実施形態では、第１のポリペプチドは、ヒンジ領域を含む二量体化ユニットを含む。別の実施形態では、二量体化ユニットは、ヒンジ領域及び二量体化を促進する別のドメインを含む。さらに別の実施形態では、二量体化ユニットは、ヒンジ領域、二量体化ユニットリンカー、及び二量体化を促進する別のドメインを含み、前記二量体化ユニットリンカーは、ヒンジ領域と二量体化を促進する別のドメインとを連結する。一実施形態では、二量体化ユニットリンカーはグリシン－セリンリッチリンカー、好ましくはＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ（配列番号１３４）であり、すなわち二量体化ユニットはグリシン－セリンリッチ二量体化ユニットリンカー、好ましくは二量体化ユニットリンカーＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ（配列番号１３４）を含む。
「ヒンジ領域」という用語は、二量体化ユニットに含まれるアミノ酸配列のうち、2つのポリペプチドの接合に寄与する、すなわち二量体タンパク質の形成を促進するアミノ酸配列を指す。２超のポリペプチドの多量体化／接合を促進する多量体化ユニットの文脈では、「ヒンジ領域」という用語は、2つ以上のポリペプチド、例えば3つ又は4つのポリペプチドの接合に寄与する、及び／又は柔軟なスペーサーとして機能する、そのような多量体化ユニットに構成されるアミノ酸配列を指し、多量体タンパク質の2つのターゲティングユニットが、たとえそれらが可変の距離に位置していても、APC上の複数の表面分子に同時に結合することを可能にする。
さらに、ヒンジ領域は柔軟なスペーサーとして機能し、二量体タンパク質の2つのターゲティングユニットが、たとえそれらが可変の距離に位置していても、APC上の2つの表面分子に同時に結合することを可能にする。ヒンジ領域は、IgG、例えばIgG1又はIgG2又はIgG3に由来するようなIg由来であってもよい。一実施形態では、ヒンジ領域はIgM由来であり、例えば、配列番号119を有するヌクレオチド配列又は前記核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、又はからなる。ヒンジ領域は、共有結合、例えばシステイン間のジスルフィド架橋の形成を介して二量体化に寄与し得る。したがって、一実施形態では、ヒンジ領域は1又は複数の共有結合を形成する能力を有する。好ましくは、共有結合はジスルフィド結合である。
一実施形態では、二量体化ユニットは、ヒンジエキソンh1及びヒンジエキソンh4（ヒトヒンジ領域1及びヒトヒンジ領域4）、好ましくはIgG3由来のヒンジエキソンh1及びヒンジエキソンh4、より好ましくは配列番号1のアミノ酸配列94-120に対して少なくとも80％の配列同一性のアミノ酸配列を有するヒンジエキソンh1及びヒンジエキソンh4を含む、又はからなる。
好ましい実施形態では、二量体化ユニットは、配列番号１のアミノ酸配列９４～１２０に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％又は例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するヒンジエキソンｈ１及びヒンジエキソンｈ４を含む、又はからなる。
好ましい実施形態では、二量体化ユニットは、配列番号１のアミノ酸配列９４－１２０を有するヒンジエキソンｈ１及びヒンジエキソンｈ４を含む、又はからなる。
好ましい一実施形態では、二量体化ユニットは、配列番号１のアミノ酸配列９４～１２０を含む、又はからなる。ただし、最大４個のアミノ酸、例えば、最大３個のアミノ酸、例えば、最大２個のアミノ酸、又は、例えば、最大１個のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入されている。
好ましい一実施形態では、二量体化ユニットは、配列番号２６を有する核酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、又はからなる。
さらなる好ましい実施形態では、二量体化ユニットは、配列番号２６を有する核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも８６％、又は少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、又はからなる。
さらに好ましい実施形態では、二量体化ユニットは、配列番号２６の核酸配列を含む、又はからなる。
別の実施形態では、二量体化ユニットは、二量体化を促進する別のドメインを含み、前記別のドメインは、免疫グロブリンドメイン、例えば、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン又はカルボキシ末端Ｃドメイン（すなわち、ＣＨ３ドメイン）などの免疫グロブリン定常ドメイン（Ｃドメイン）、又はそのようなＣドメインと実質的に同一である配列もしくはそのバリアントである。好ましくは、二量体化を促進する他のドメインは、ＩｇＧ由来のカルボキシ末端Ｃドメインである。より好ましくは、二量体化を促進する他のドメインは、ＩｇＧ３由来のカルボキシ末端Ｃドメインである。
一実施形態では、二量体化ユニットは、配列番号１のアミノ酸配列１３１－２３７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＩｇＧ３由来のカルボキシ末端Ｃドメインを含む、又はからなる。
好ましい実施形態では、二量体化ユニットは、配列番号１のアミノ酸配列１３１～２３７に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％又は例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＩｇＧ３由来のカルボキシ末端Ｃドメインを含む、又はからなる。
好ましい実施形態では、二量体化ユニットは、配列番号１のアミノ酸配列１３１－２３７を有するＩｇＧ３由来のカルボキシ末端Ｃドメインを含む、又はからなる。
好ましい一実施形態では、二量体化ユニットは、配列番号１のアミノ酸配列１３１～２３７を含む、又はからなる。ただし、最大で１６のアミノ酸、例えば、最大で１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入されている。
好ましい一実施形態では、二量体化ユニットは、配列番号２７を有する核酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、又はからなる。
さらなる好ましい実施形態では、二量体化ユニットは、配列番号２７を有する核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも８６％、又は少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、又はからなる。さらに好ましい実施形態では、二量体化ユニットは、配列番号２７の核酸配列を含む、又はからなる。
免疫グロブリンドメインは、非共有結合性相互作用、例えば疎水性相互作用を介して二量体化に寄与する。したがって、一実施形態では、免疫グロブリンドメインは、非共有結合性相互作用を介して二量体を形成する能力を有する。好ましくは、非共有結合性相互作用は疎水性相互作用である。
二量体化ユニットがＣＨ３ドメインを含む場合、ＣＨ２ドメインを含まないことが好ましく、その逆も同様である。
好ましい実施形態では、二量体化ユニットは、ヒンジエキソンｈ１、ヒンジエキソンｈ４、二量体化ユニットリンカー及びヒトＩｇＧ３のＣＨ３ドメインを含む。さらなる好ましい実施形態では、二量体化ユニットは、ヒンジエキソンｈ１、ヒンジエキソンｈ４、二量体化ユニットリンカー及びヒトＩｇＧ３のＣＨ３ドメインからなるポリペプチドを含む。別の好ましい実施形態では、二量体化ユニットは、ヒンジエキソンｈ１、ヒンジエキソンｈ４、二量体化ユニットリンカー及びヒトＩｇＧ３のＣＨ３ドメインからなるポリペプチドからなる。
一実施形態では、二量体化ユニットは、配列番号１のアミノ酸配列９４－２３７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
好ましい実施形態では、二量体化ユニットは、配列番号１のアミノ酸配列９４－２３７に対して少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％又は例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
さらに好ましい実施形態では、二量体化ユニットは配列番号１のアミノ酸配列９４－２３７を含む。
より好ましい実施形態では、二量体化ユニットは、配列番号１のアミノ酸配列９４～２３７に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％又は例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。
さらに好ましい実施形態では、二量体化ユニットは配列番号１のアミノ酸配列９４－２３７からなる。
好ましい一実施形態では、二量体化ユニットは、配列番号１のアミノ酸配列９４～２３７を含む、又はからなる。ただし、最大で２８、例えば、最大で２５、２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１のアミノ酸が置換、欠失又は挿入されている。
好ましい一実施形態では、二量体化ユニットは、配列番号２８を有する核酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、又はからなる。
さらなる好ましい実施形態では、二量体化ユニットは、配列番号２８を有する核酸配列に対して少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、又は少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、又はからなる。
さらに好ましい実施形態では、二量体化ユニットは、配列番号２８の核酸配列を含む、又はからなる。
第１の核酸配列によってコードされる第１のポリペプチドでは、多量体化ユニット、例えば二量体化ユニットは、抗原ユニット及びターゲティングユニットに関して任意の配向を有してもよい。一実施形態では、抗原ユニットは、（例えば、ユニットリンカーを介して）多量体化／二量体化ユニットのＣ末端に連結され、ターゲティングユニットは、多量体化／二量体化ユニットのＮ末端に連結される。別の実施形態では、抗原ユニットは、（例えば、ユニットリンカーを介して）多量体化／二量体化ユニットのＮ末端に連結され、ターゲティングユニットは、多量体化／二量体化ユニットのＣ末端に連結される。抗原ユニットが、例えばリンカーを介して、好ましくはユニットリンカーを介して、多量体化／二量体化ユニットのＣ末端に連結され、ターゲティングユニットが多量体化／二量体化ユニットのＮ末端に連結されることが好ましい。
抗原ユニット
一般に、第１のポリペプチド／多量体タンパク質に含まれる抗原ユニットは、任意のタイプの抗原又はその一部、例えば疾患に関連する抗原又はその一部を含むことができる。例は、１又は複数の癌抗原又はその一部、あるいは感染症、すなわちウイルス、細菌、真菌及び寄生虫を含む病原体によって引き起こされる疾患に関連する１又は複数の抗原又はその一部を含む。
本明細書において、「疾患関連抗原」又は「疾患に関連する抗原」とは、抗原ユニットに含まれる抗原又はその一部が、当該抗原ユニットを含む本発明のベクターが使用されるように設計された特定の疾患に対して役割を果たし、関連性を有することを表すために使用される。一例として、抗原ユニットは１又は複数の癌抗原又はその一部を含み、そのような抗原ユニットを含むベクターは癌の治療に使用するように設計される。別の例では、抗原ユニットは１又は複数の感染性抗原又はその一部、例えば病原体に由来する抗原であり、そのような抗原ユニットを含むベクターは、そのような病原体によって引き起こされる、又はそのような病原体が関与する感染症の治療に使用するように設計されている。
「部分」とは、抗原の一部／断片、すなわち抗原のアミノ酸配列の一部／断片、又はそれをコードするヌクレオチド配列、例えばエピトープを指す。
一実施形態では、抗原ユニットは１のＴ細胞エピトープを含む。別の実施形態では、抗原ユニットは１又は複数のＴ細胞エピトープ、すなわち複数のＴ細胞エピトープを含む。
抗原ユニットに含めるのに適したＴ細胞エピトープは、当該技術分野で既知である、すなわち、ある疾患に関与し、関連性があることが研究され、提案され、及び／又は検証され、例えば科学文献に発表されているものであってもよい。
一実施形態では、抗原ユニットは、７～１５０アミノ酸、好ましくは７～１００アミノ酸、例えば９又は１０～１００アミノ酸、又は１５～１００アミノ酸、又は９～６０アミノ酸、又は９～３０アミノ酸、又は１５～６０アミノ酸、又は１５～３０アミノ酸、又は２０～７５アミノ酸、又は２５～５０アミノ酸の長さのＴ細胞エピトープを含む。
一実施形態では、第一のポリペプチド／多量体タンパク質に含まれる抗原ユニットは、感染症に関連する１又は複数の抗原又はその部分、例えば病原体由来の抗原を含む。
このような抗原は、既知であるか、又は当該技術分野において予測されている、すなわち、ある感染症に関与し、関連することが研究され、提案され、及び／又は検証され、例えば科学文献に発表されている。
別の実施形態では、第一のポリペプチド／多量体タンパク質に含まれる抗原ユニットは、癌に関連する１又は複数の抗原又はその部分、例えばネオ抗原や共有癌抗原などの癌抗原を含んでいる。
個別化第1ポリペプチドの抗原ユニット
一実施形態では、本発明のベクターに含まれる第一の核酸によってコードされる第一のポリペプチドは、抗原ユニットを含み、この抗原ユニットは、そのようなベクターで治療される患者に対してのみ特異的に設計される。従って、このような第一ポリペプチドの抗原ユニットは、1又は複数の患者特異的癌抗原又はその部分を含み、このような抗原には、ネオ抗原又は患者提示共有癌抗原が含まれる。
「患者提示共有癌抗原」とは、本明細書では、患者の腫瘍細胞に存在することが確認された共有癌抗原又は共有腫瘍抗原を指す。
「ネオ抗原」とは、本明細書において、同じ患者の正常（すなわち、健康で癌でない）細胞と比較して1又は複数の変異を有する、患者の腫瘍細胞で見出される癌抗原又は腫瘍抗原を指す。
「患者提示共有癌エピトープ」とは、本明細書において、患者提示共有癌抗原に含まれるアミノ酸配列又はそれをコードする核酸配列で、免疫原性であることが知られている、又は免疫原性であることが予測されているものを指す。
「ネオエピトープ又は患者特異的癌エピトープ」とは、本明細書において、ネオ抗原又は患者特異的癌抗原に含まれるアミノ酸配列、又はそれをコードする核酸配列であって、免疫原性が予測される1又は複数の変異を含むものを指す。
したがって、一実施形態では、本発明は、以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、前記第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、抗原ユニットとを含み、前記抗原ユニットは、１又は複数の患者特異的癌抗原又はその一部、例えば、１又は複数の患者提示共有癌抗原又はその一部及び／又は１又は複数のネオ抗原又はその一部を含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターを提供し、ここで、前記ベクターは、第１のポリペプチド及び１又は複数の免疫刺激性化合物を別々の分子として共発現させることを可能にする。
一実施形態では、抗原ユニットは、１又は複数の患者提示共有癌抗原又はその一部、例えば１つの患者提示共有癌抗原又はそのような患者提示共有癌抗原の１又は複数の部分、例えば１又は複数のエピトープ、又は複数の患者提示共有癌抗原又はそのような複数の患者提示共有癌抗原の１又は複数の部分、例えば１又は複数のエピトープを含む。
本明細書において、「複数（ｓｅｖｅｒａｌ）」という用語は、「複数（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）」、「複数（ａ ｐｌｕｒａｌｉｔｙ）」、「１超（ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｏｎｅ）」という用語と互換的に使用される。
別の実施形態では、抗原ユニットは、１又は複数のネオ抗原又はその一部、例えば１のネオ抗原若しくはそのようなネオ抗原の１又は複数の部分、例えば１又は複数のネオエピトープ、又はいくつかのネオ抗原若しくはそのようないくつかのネオ抗原の１又は複数の部分、例えば１又は複数のネオエピトープを含む。
さらに別の実施形態では、抗原ユニットは前述の実施形態の任意の組み合わせ、すなわち１又は複数の患者提示共有癌抗原又はその一部と、前述の１又は複数のネオ抗原又はその一部との任意の組み合わせを含む。
1又は複数のネオ抗原又はその一部を含む個別化ポリペプチドの抗原ユニット
癌は、患者の正常な組織から、1個又は数個の細胞が突然変異によって異常で制御不能な細胞増殖を開始することによって発生する。癌細胞は変異しているが、ゲノムの大部分は無傷で、患者の残りの細胞と同一である。腫瘍を攻撃する一つのアプローチは、どの患者のどの腫瘍もユニークであるという知識に基づいている。患者特有の突然変異は、患者特有の変異タンパク質、すなわち特定の患者に特有のネオ抗原の発現につながる。これらのネオ抗原は、患者の正常細胞のどのタンパク質とも同一ではない。したがって、このようなネオ抗原は、問題の患者に対してのみ特異的に製造される本発明のベクターを含む治療用医薬組成物、すなわち個別化抗癌ワクチンの標的として適している。
変異は、少なくとも１つのアミノ酸に変化をもたらす変異であれば何でもよい。従って、変異は以下のいずれかであってもよい：
－アミノ酸の変化をもたらす非同義変異
－フレームシフトを引き起こし、それによって変異後の方向に全く異なるオープンリーディングフレームをもたらす変異
－終止コドンが変更又は欠失され、腫瘍特異的エピトープを持つより長いタンパク質になるリードスルー変異
－特異的な腫瘍特異的タンパク質配列につながるスプライス変異
－２つのタンパク質の接合部に腫瘍特異的エピトープを持つキメラタンパク質を生じる染色体再配列。変異が染色体再配列によるものである場合、腫瘍特異的エピトープは少なくとも１つのアミノ酸の変化から、あるいは２つのインフレームコード配列の組み合わせから生じる。
一実施形態では、抗原ユニットは、１又は複数のネオ抗原又はその一部、例えば１のネオ抗原の１又は複数の一部、又は複数のネオ抗原の１又は複数の一部、好ましくは１又は複数のネオエピトープ、より好ましくは複数のネオエピトープを含む。このようなネオエピトープは、予測される治療効果に従って抗原ユニットに含めるために選択され得るが、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれるＷＯ ２０１７／１１８６９５Ａ１を参照。
したがって、一実施形態において、本発明は、以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、抗原ユニットとを含み、前記抗原ユニットは、１又は複数のネオ抗原又はその一部を含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターを提供し、ここで、前記ベクターは、第１のポリペプチドと１又は複数の免疫刺激性化合物とを別々の分子として共発現させることができる。
一実施形態では、抗原ユニットは、１つのネオ抗原の１又は複数の部分、又は複数のネオ抗原の１又は複数の部分、好ましくは１又は複数のネオエピトープを含む。好ましい実施形態では、抗原ユニットでは、ネオエピトープはリンカーによって分離されている。すべてのネオエピトープがリンカーによって分離されていることを説明する別の方法は、末端のネオエピトープを除くすべて、すなわち、第一ポリペプチドのＮ末端開始点又は第一ポリペプチドのＣ末端終点のネオエピトープが抗原サブユニットに配置され、各サブユニットがネオエピトープとサブユニットリンカーを含むことである。リンカーによるネオエピトープの分離により、各ネオエピトープは免疫系に最適な形で提示される。
したがって、ｎ個のネオエピトープを含む抗原ユニットは、ｎ－１個の抗原サブユニットを含み、各サブユニットはネオエピトープとサブユニットリンカーを含み、さらに末端ネオエピトープを含む。一実施形態では、ｎは１～５０の整数であり、例えば３～５０又は１５～４０又は１０～３０又は１０～２５又は１０～２０又は１５～３０又は１５～２５又は１５～２０である。好ましい実施形態では、抗原サブユニットはネオエピトープとサブユニットリンカーからなる。
したがって、好ましい実施形態において、本発明は、以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、抗原ユニットとを含み、前記抗原ユニットが、（ｉ）ｎ－１個の抗原サブユニットであって、各サブユニットがネオエピトープ及びサブユニットリンカーを含む抗原サブユニットと（ｉｉ）末端ネオエピトープとを含み、ここで、ｎが前記抗原ユニット中のネオエピトープの数であり、ｎが１～５０までの整数である、第１の核酸配列；及び
（ｂ）1又は複数の免疫刺激性化合物をコードする1又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターを提供し、ここで、前記ベクターは、第１のポリペプチドと1又は複数の免疫刺激性化合物とを別々の分子として共発現させることを可能にする。
ネオエピトープは、好ましくは、ＨＬＡ分子による提示に適した長さを有する。従って、好ましい実施形態では、ネオエピトープは、７～３０アミノ酸の長さを有する。７～１０アミノ酸、又は１３～３０アミノ酸、例えば２０～３０アミノ酸、例えば２７アミノ酸の長さを有するネオエピトープがより好ましい。
好ましくは、抗原ユニットは複数のネオエピトープを含む。一実施形態では、抗原ユニットは、複数の異なるネオエピトープを含む。別の実施形態では、抗原ユニットは、同一のネオエピトープの複数のコピーを含む。さらに別の実施形態では、抗原ユニットは、複数の異なるネオエピトープ及び同じネオエピトープの複数のコピーを含む。
従って、好ましいアプローチは、所望のＴ細胞効果の希釈のためにネオエピトープに対するＴ細胞を活性化する能力を損なわない一方で、それによって効率的に癌を攻撃するために、抗原ユニット中にできるだけ多くのネオエピトープ（すなわち、同じネオエピトープの異なるコピー及び／又は複数のコピー）を含めることである。さらに、すべてのネオエピトープが同じ抗原提示細胞に効率よくロードされるように、すべてのネオエピトープをコードするヌクレオチド配列は連続したポリヌクレオチド鎖で構成され、その結果、各ネオエピトープを個別のペプチドとして発現させる代わりに、すべてのネオエピトープを含むタンパク質を発現させる。
抗原ユニットを設計するために、患者の腫瘍エクソームを解析してネオ抗原を同定する。好ましくは、１又は複数のネオ抗原から最も免疫原性の高いネオエピトープの配列を選択し、抗原ユニットに含める。
一実施形態では、抗原ユニットは少なくとも１つのネオエピトープを含む。好ましくは、抗原ユニットは少なくとも３つのネオエピトープ、より好ましくは少なくとも５つのネオエピトープ、例えば７つのネオエピトープを含む。別のより好ましい実施形態では、抗原ユニットは少なくとも１０個のネオエピトープを含む。別のより好ましい実施形態では、抗原ユニットは、少なくとも１５個のネオエピトープ、例えば少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個のネオエピトープを含む。
１又は複数のネオエピトープを含む抗原ユニットは、ＷＯ２０１７／１１８６９５Ａ１に詳細に記載されている。このような抗原ユニットのいずれかを、個別化抗癌治療に使用するための本発明のベクターにおいてコードされる第１のポリペプチド中の抗原ユニットとして使用することができる。
1又は複数の患者提示共有癌抗原又はその一部を含む個別化ポリペプチドの抗原ユニット
共有腫瘍抗原は多くの腫瘍で発現しており、同じ癌種の患者間で、又は患者と癌種間で発現している。例えばＨＰＶ１６抗原は、頭頸部扁平上皮癌患者の約５０％に発現しているウイルス抗原であるが、子宮頸癌や外陰扁平上皮癌などの他の癌患者にも発現している。これらの共有抗原の多くは、以前に免疫原性として特徴付けられ、かつ／又は既知である、すなわち、適切な方法によって免疫原性が確認され、その結果が例えば科学刊行物に発表されている。他のものは、例えば当該技術分野で公知のアルゴリズムにより、特定のＨＬＡクラスＩ又はクラスＩＩ対立遺伝子上に提示されることが既に予測されており、その予測された免疫原性は、適切な方法により免疫原性を確認することなく、例えば科学的刊行物において公表されている。
一実施形態では、抗原ユニットは、免疫原性であることが知られており、既知の発現パターンを有し、及び／又は特定のＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩ分子と結合することが知られているか、又は既に予測されている、１又は複数の患者提示共有癌抗原又はその一部、例えば患者提示共有癌エピトープを含む。
患者提示癌抗原に特異的なＴ細胞は腫瘍に移動し、腫瘍微小環境に影響を与えることができるため、さらに腫瘍特異的Ｔ細胞が癌を攻撃できる可能性が高まる。
したがって、一実施形態において、本発明は、以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、抗原ユニットとを含み、前記抗原ユニットは、1又は複数の患者提示共有癌抗原又はその一部を含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）1又は複数の免疫刺激性化合物をコードする1又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターを提供し、ここで、前記ベクターは、第１のポリペプチド及び1又は複数の免疫刺激性化合物を別々の分子として共発現させることができる。
ある患者提示共有癌抗原は、1又は複数の変異を含むアミノ酸配列を含むタンパク質、すなわち免疫原性であることが知られているか、免疫原性であることが予測されている患者提示共有癌エピトープである。その他の患者提示共有癌抗原は、変異を含まないタンパク質、例えば過剰発現された細胞性タンパク質である。
一実施形態では、患者提示共有癌抗原は、過剰発現細胞タンパク質、異常発現細胞タンパク質、癌精巣抗原、ウイルス抗原、分化抗原、変異癌遺伝子及び変異癌抑制遺伝子、癌胎児性の抗原、共有融合抗原、共有イントロン保持抗原、ダークマター抗原、及びスプライセオソーム変異又はフレームシフト変異による共有抗原からなる群より選択される。
一実施形態では、患者提示共有癌抗原は、過剰発現又は異常発現されたヒト細胞性タンパク質、すなわち正常な健常細胞や組織と比較して腫瘍において増加したレベルで見出される細胞性タンパク質である。このような過剰発現又は異常発現した細胞性タンパク質の例は、腫瘍タンパク質Ｄ５２、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、ｈＴＥＲＴ（テロメラーゼ）、サバイビンを含む。
別の実施態様では、患者提示共有癌抗原は、通常、精巣の雄性生殖細胞に発現するが、成人の体組織には発現しない癌精巣抗原である。場合によっては、このような抗原は卵巣や絨毛にも発現する。悪性腫瘍では、この遺伝子制御が乱れ、その結果、様々なタイプの腫瘍の一部で抗原が発現する。癌精巣抗原の例は、ＭＡＧＥ－Ａ、ＭＡＧＥ－Ｂ、ＧＡＧＥ、ＰＡＧＥ－１、ＳＳＸ、ＨＯＭ－ＭＥＬ－４０（ＳＳＸ２）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１及びＳＣＰ－１を含む。
さらに別の実施形態では、患者提示共有癌抗原は分化抗原、例えばチロシナーゼである。
さらに別の実施形態では、患者提示共有抗原はウイルス抗原である。ウイルス抗原の例は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ又はＭＣＰｙＶ）、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）及びヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）を含む。
さらに別の実施形態では、患者提示共有癌抗原は変異した癌遺伝子である。変異癌遺伝子の例は、ＫＲＡＳ、ＣＡＬＲ、ＴＲＰ－２を含む。
さらに別の実施形態では、患者提示共有癌抗原は変異癌抑制遺伝子である。例は、変異ｐ５３、変異ｐＲＢ、変異ＢＣＬ２、及び変異ＳＷＩ／ＳＮＦを含む。
さらに別の実施形態では、患者提示共有癌抗原は癌胎児性の抗原（ｏｎｃｏｆｅｔａｌ ａｎｔｉｇｅｎ）、例えばα－フェトプロテイン又はカルキノエンブリオニック抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）である。
さらに別の実施形態では、患者提示共有抗原は、共有イントロン保持抗原、又はフレームシフト変異による共有抗原、例えばＣＤＸ２又はＣＡＬＲである。
さらに別の実施形態では、患者提示共有抗原はスプライセオソーム変異に起因する共有抗原である。例は、ＳＦ３Ｂ１変異のような変異によって引き起こされる抗原である。
一般に、どのような癌抗原であっても、患者が癌に罹患した時点で免疫寛容が生じている可能性が高い。抗癌ワクチンは、ワクチンに組み込まれた抗原に対する免疫応答を特異的に誘発する必要がある。一実施形態では、プラスミドによってコードされる第一のポリペプチドは抗癌ワクチンとして機能する。選択された抗原に対する末梢免疫寛容は弱くても強くてもよい。このような患者提示共有癌抗原又はその１又は複数の部分を抗原ユニットに組み込むことにより－単独で、又は他の患者提示共有癌抗原若しくはその部分及び／又はネオ抗原若しくはネオエピトープとともに－、このような抗原ユニットを構成するポリペプチドは、腫瘍微小環境に影響を及ぼし、腫瘍に対する患者の免疫応答を抑制型／寛容型から炎症促進型に変化させるのに十分な強さと広さを有する免疫応答を誘発する。このことは、他のいくつかの抗原に対する寛容を解除するのに役立ち、したがって患者にとってかなりの臨床的利益をもたらす。前述した概念は、癌免疫のセットポイントのタイピング（ｔｉｐｐｉｎｇ ｔｈｅ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｓｅｔ ｐｏｉｎｔ）とも呼ばれる。
一実施形態では、抗原ユニットは、ヒト細胞タンパク質、好ましくは過剰発現又は異常発現したヒト細胞タンパク質又は分化抗原である、１又は複数の患者提示共有癌抗原又はその一部を含む。
患者提示共有癌抗原は、以下のような当該技術分野で公知の方法によって、患者の組織又は体液中で検出することができる：
－患者のゲノム又はエクソームのシークエンシング、任意選択で、例えば変異した癌遺伝子又は変異した癌抑制遺伝子を同定するために、全ゲノム／エクソーム－ｓｅｑデータにおいて、例えばオーダーメイドのソフトウェアを用いる検索；
－変異タンパク質の存在を検出するための、患者の腫瘍組織の免疫組織化学；
－例えば、ウイルス抗原又は癌遺伝子における既知の変異の存在を検出するためのＲＴ－ＰＣＲ；
－血清サンプル中の変異腫瘍タンパク質などに対する抗体を用いたＥＬＩＳＡ；
－腫瘍組織のＲＮＡ－ｓｅｑと健常組織との比較による、共有癌抗原の発現／過剰発現の検出；
－イントロン保持抗原を同定するための未加工のＲＮＡ配列データにおけるオーダーメイドのソフトウェアなどでの検索；
－ダークマター抗原のエレメントであるトランスポーザブルエレメントを同定するための全ゲノムｓｅｑデータからオーダーメードのソフトウェアなどでの検索；
－例えばダークマター抗原を同定するための未加工全エクソーム／ＲＮＡ配列データにおける短いリピートの検出；
－例えば共有ウイルス抗原を同定するためのＲＮＡ－ｓｅｑデータ；及び
－患者の腫瘍サンプルのＲＮＡ－ｓｅｑを、患者自身の健常組織と、又はＧＴＥＸ／ＨＰＡ遺伝子発現データなどのコンセンサス転写産物発現に対するコホート／データベース（ＴＣＧＡなど）と比較。
好ましい実施形態では、抗原ユニットは、免疫原性であることが知られている、例えば、他の患者において免疫応答を誘発することが以前に記載されている、又は患者のＨＬＡクラスＩ及び／もしくはクラスＩＩ対立遺伝子に結合することが予測されている、１又は複数の患者に存在する共有癌抗原又はそのような抗原の一部を含む。
一実施形態では、抗原ユニットは１又は複数の患者提示共有癌エピトープを含む。好ましい実施形態では、このようなエピトープは、患者のＨＬＡ対立遺伝子による提示に適した長さを有する。
一実施形態では、抗原ユニットは、ＨＬＡクラスＩ又はＨＬＡクラスＩＩでの特異的提示に適した長さを有する１又は複数の患者提示共有癌エピトープを含む。一実施形態では、エピトープは、ＨＬＡクラスＩ提示のために７～１１アミノ酸の長さを有する。別の実施形態では、エピトープは、ＨＬＡクラスＩＩ提示のために１３～３０アミノ酸の長さを有する。
一実施形態では、抗原ユニットは、７～３０アミノ酸、例えば７～１０アミノ酸（７、８、９、又は１０アミノ酸など）又は１３～３０アミノ酸（１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０アミノ酸など）、例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５のアミノ酸の長さを有する１又は複数の患者提示共有癌エピトープを含む。
抗原ユニットは、１又は複数の患者提示共有癌抗原を全長又はその１又は複数の部分で含んでいてもよい。
一実施形態では、抗原ユニットは、全長の１つの患者提示共有癌抗原を含む。別の実施態様では、抗原ユニットは、各々が全長である複数の患者提示共有癌抗原を含む。
さらに別の実施形態では、抗原ユニットは、患者提示共有癌抗原の１又は複数の部分、例えば１又は複数の患者提示共有癌エピトープを含む。さらに別の実施形態では、抗原ユニットは複数の患者提示共有癌抗原の１又は複数の部分、例えば複数の患者提示共有癌抗原の１又は複数のエピトープを含む。
さらに別の実施形態では、抗原ユニットは、全長の１又は複数の患者提示共有抗原と、１又は複数の患者提示共有癌抗原の１又は複数の部分とを含む。例としては以下が挙げられる：
－抗原ユニットは、全長の１の患者提示共有抗原と、１の患者提示共有癌抗原の１又は複数のエピトープとを含み；及び
－抗原ユニットは、それぞれが全長である複数の患者提示共有抗原と、１の患者提示共有癌抗原の１又は複数のエピトープとを含み；及び
－抗原ユニットは、全長の１の患者提示共有抗原と、複数の患者提示共有癌抗原の１又は複数のエピトープとを含み；及び
－抗原ユニットは、それぞれが全長である複数の患者提示共有抗原と、複数の患者提示共有癌抗原の１又は複数のエピトープとを含む。
好ましい実施形態では、前述のエピトープは、免疫原性であることが既に知られている、例えば文献に免疫原性であることが記載されている、又は患者のＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩ対立遺伝子に結合することが既に予測されている、例えば文献に記載されているように、好ましくは患者のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子に結合することが既に予測されている。別の好ましい実施形態では、前述のエピトープの免疫原性は予測され、例えば、エピトープの患者のＨＬＡクラスＩ及び／又はＨＬＡクラスＩＩ分子の１又は複数への結合は、当該技術分野で公知の方法、例えば、その開示内容が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ ２０２１／２０５０２７ Ａ１に開示された方法、又は「個別化された第１のポリペプチドの抗原ユニットを設計するための方法」の項に記載されたものを含む本明細書に記載された方法によって予測される。
一実施形態では、抗原ユニットは全長の１～１０個の患者提示共有抗原を含む。
別の実施形態では、抗原ユニットは、１又は複数の患者提示共有抗原の１～３０個の部分を含み、これらの部分は、患者のＨＬＡクラスＩ又はクラスＩＩ対立遺伝子に結合すると予測される複数のエピトープを含む。さらに別の実施形態では、抗原ユニットは１～５０個の患者提示共有癌エピトープ、好ましくは患者のＨＬＡクラスＩ又はクラスＩＩ対立遺伝子に結合すると予測されるエピトープを含む。
１又は複数の患者提示共有癌抗原又はその一部及び１つ又は複数のネオ抗原又はその一部を含む個別化ポリペプチドの抗原ユニット
さらなる実施形態では、抗原ユニットは、１又は複数の患者提示共有癌抗原又はその一部を含む抗原ユニットに関する前述の実施形態のすべてと、１又は複数のネオ抗原又はその一部を含む抗原ユニットに関する前述の実施形態のすべてとの組み合わせである。
したがって、一実施形態では、本発明は、以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、抗原ユニットとを含み、前記抗原ユニットは、１又は複数の患者提示共有癌抗原又はその一部、及び１又は複数のネオ抗原又はその一部を含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列、
を含むベクターを提供し、ここで、ベクターは、第１のポリペプチド及び１又は複数の免疫刺激性化合物を別々の分子として共発現させることを可能にする。
１又は複数の患者提示共有癌抗原又はその一部と、任意に１又は複数のネオ抗原及びその一部を含む抗原ユニットは、ＷＯ ２０２１／ ２０５０２７Ａ１に詳細に記載されており、その内容は援用により本明細書に含まれる。このような抗原ユニットのいずれかを、個別化抗癌治療に使用するために、本発明のベクターにコードされる第１のポリペプチド中の抗原ユニットとして使用されてもよい。
個別化された第１のポリペプチドの抗原ユニットを設計するための方法
特定の患者において同定された患者提示共有癌抗原及びネオ抗原は、好ましくは、それらの抗原が抗原ユニットに含まれる場合、第１のポリペプチドを最も効果的にするそれらの抗原を見つけるためにさらに処理される。このような処理の方法と順序は、前記抗原がどのように同定されたか、すなわち、このような処理の基礎となるデータに依存する。
一実施形態では、抗原ユニットに含まれる抗原の処理と選択は以下のように行われる：
１）文献及び／又は１又は複数のデータベースにおける検索を行い、共有癌抗原に関する情報及び配列を検索し、好ましくは、それらの発現パターン、免疫原性又は予測免疫原性、エピトープ及びＨＬＡ提示に関する情報を検索する。このような検索はまた、同定された抗原が患者提示共有癌抗原であるかネオ抗原であるかを決定するために行われる。
２）同定された抗原が患者提示共有癌抗原であると決定された場合、その配列は、患者のＨＬＡクラスＩ／ＩＩ対立遺伝子に結合すると予測されるエピトープ、好ましくは全てのエピトープを同定するために研究される。この予測は、当該技術分野で既知の予測ツール、例えばＮｅｔＭＨＣｐａｎや類似のソフトウェアなど、当該技術分野で既知の予測ソフトウェアを用いて実施することができる。
３）最も免疫原性の高い、あるいは最も免疫原性が高いと予測される、すなわち、患者のＨＬＡクラスＩ／ＩＩ対立遺伝子の１又は複数との結合が予測される、患者提示共有癌抗原の最も有望な配列を、抗原ユニットに含めるために選択する。一実施形態では、例えば、ステップ２で有望なエピトープが数個しか同定されなかった場合や、エピトープ間に非免疫原性の配列が長く存在する場合、最小限のエピトープが選択される。別の実施形態では、患者の特異的ＨＬＡ対立遺伝子に結合するいくつかのエピトープを含む、より長い配列が選択される。さらに別の実施形態では、抗原の全長配列が抗原ユニットに含めるために選択される。
４）ネオ抗原配列の最も有望な部分、例えばネオエピトープが、予測される免疫原性と、そのような配列の患者のＨＬＡクラスＩ／ＩＩ対立遺伝子への結合に基づいて、抗原ユニットに含めるために選択される。
腫瘍変異は、腫瘍組織と正常組織の塩基配列を決定し、腫瘍組織から得られた塩基配列と正常組織の塩基配列を比較することによって発見される。患者のＤＮＡ又はＲＮＡ中の特定の突然変異又は対立遺伝子の存在を検出するために、様々な方法が利用可能である。このような方法には、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、マイクロプレートアレイ対角ゲル電気泳動（ＭＡＤＧＥ）、パイロシーケンス、オリゴヌクレオチド特異的ライゲーション、ＴａｑＭａｎシステム、及びＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＳＮＰチップのような様々なＤＮＡ「チップ」技術を含む。あるいは、タンパク質の直接配列決定によって変異を同定することもできる。
腫瘍エクソーム中のおそらく数百から数千の変異の中から、ＨＬＡ結合予測アルゴリズムに基づき、最も有望な配列がインシリコで選択される。その意図は、関連するエピトープをすべて同定し、ランク付けやスコアリングを行った後、抗原ユニットに含める配列を決定することである。ネオエピトープをスコアリング、ランク付け、選択するのに適した当技術分野で知られている方法としては、ＷＯ ２０２０／０６５０２３Ａ１及びＷＯ ２０２０／２２１／７８３Ａ１に開示されているものを含む。
さらに、このようなスコアリングやランキングには、以下のような任意の適切なアルゴリズムを使用することができる：
ペプチドとＭＨＣの結合を解析するフリーソフト（ＩＥＤＢとＮｅｔＭＨＣｐａｎ）は以下のサイトからダウンロードできる：
ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／
ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣ／
ワクチン設計に最適な配列を予測する市販の高度なソフトウェアはこちらから入手できる：
ｗｗｗ．ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．ｃｏｍ／
ｏｍｉｃｔｏｏｌｓ．ｃｏｍ／ｔ－ｃｅｌｌ－ｅｐｉｔｏｐｅｓ－ｃａｔｅｇｏｒｙ
ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｇｒｉｆｆｉｔｈｌａｂ／ｐＶＡＣ－Ｓｅｑ
ｃｒｄｄ．ｏｓｄｄ．ｎｅｔ／ｒａｇｈａｖａ／ｃａｎｃｅｒｔｏｐｅ／ｈｅｌｐ．ｐｈｐ
ｗｗｗ．ｅｐｉｖａｘ．ｃｏｍ／ｔａｇ／ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ／
各変異はその抗原性に関してスコア化され、最も抗原性の高いネオエピトープが選択され、抗原ユニットに最適に配置される。
非個別化第１のポリペプチドの抗原ユニット
１又は複数の共有癌抗原又はその一部を含む第１のポリペプチドの抗原ユニット
第１のポリペプチド（共有癌抗原を含む第１のポリペプチドともいう）をコードする非個別化又は「オフザセルフ」ベクターは、1又は複数の共有癌抗原又はその一部を含む抗原ユニットをコードするポリヌクレオチド配列を含む。
「共有癌抗原」又は「共有腫瘍抗原」は、本明細書では、同じ癌種の患者全体、又は患者や癌種にわたって、多くの腫瘍で発現することが報告されている抗原を表すために使用される。
本明細書において「共有癌エピトープ」とは、免疫原性が知られている、又は予測されている共有癌抗原に含まれるアミノ酸配列を表すために使用される。
一実施形態では、癌の治療に使用するための抗原ユニット非個別化第１ポリペプチドは、免疫原性であることが知られており、既知の発現パターンを有し、及び／又は特定のＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩ分子に結合することが知られているか、又は既に予測されている、１又は複数の共有癌抗原又はその一部、例えば共有癌エピトープを含む。
したがって、一実施形態では、本発明は、以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、抗原ユニットとを含み、前記抗原ユニットは、1又は複数の共有癌抗原又はその一部を含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）1又は複数の免疫刺激性化合物をコードする1又は複数のさらなる核酸配列、
を含むベクターを提供し、ここで、前記ベクターは、第１のポリペプチドと1又は複数の免疫刺激性化合物とを別々の分子として共発現させることができる。
いくつかの共有がん抗原は、1又は複数の変異を含むアミノ酸配列を含むタンパク質、すなわち免疫原性であることが知られている、あるいは免疫原性であることが予測されている共有がんエピトープである。その他の共有がん抗原は、変異を含まないタンパク質、例えば過剰発現された細胞性タンパク質である。
一実施形態では、共有癌抗原は、過剰発現細胞タンパク質、異常発現細胞タンパク質、癌精巣抗原、ウイルス抗原、分化抗原、変異癌遺伝子及び変異癌抑制遺伝子、癌胎児性の抗原、共有融合抗原、共有イントロン保持抗原、ダークマター抗原、及びスプライセオソーム変異又はフレームシフト変異によって引き起こされる共有抗原からなる群より選択される。
一実施形態では、共有がん抗原は過剰発現又は異常発現されたヒト細胞タンパク質、すなわち正常な健常細胞や組織と比較して腫瘍において増加したレベルで見出される細胞タンパク質である。このような過剰発現又は異常発現した細胞性タンパク質の例としては、腫瘍タンパク質Ｄ５２、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、ｈＴＥＲＴ（テロメラーゼ）、及びサバイビンを含む。
別の実施形態では、共有がん抗原は精巣の男性生殖細胞では通常発現するが、成人の体組織では発現しないがん精巣抗原である。場合によっては、このような抗原は卵巣や絨毛にも発現する。悪性腫瘍では、この遺伝子制御が乱れ、その結果、様々なタイプの腫瘍の一部で抗原が発現する。癌精巣抗原の例は、ＭＡＧＥ－Ａ、ＭＡＧＥ－Ｂ、ＧＡＧＥ、ＰＡＧＥ－１、ＳＳＸ、ＨＯＭ－ＭＥＬ－４０（ＳＳＸ２）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１及びＳＣＰ－１を含む。
さらに別の実施形態では、共有がん抗原は分化抗原、例えばチロシナーゼである。
さらに別の実施形態では、共有抗原はウイルス抗原である。ウイルス抗原の例は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ又はＭＣＰｙＶ）、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）及びヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）を含む。
さらに別の実施形態では、共有癌抗原は変異した癌遺伝子である。変異癌遺伝子の例は、ＫＲＡＳ、ＣＡＬＲ、ＴＲＰ－２を含む。
さらに別の実施形態では、共有癌抗原は変異癌抑制遺伝子である。例は、変異ｐ５３、変異ｐＲＢ、変異ＢＣＬ２、変異ＳＷＩ／ＳＮＦを含む。
さらに別の実施形態では、共有がん抗原は癌胎児性の抗原、例えばα－フェトプロテイン又はカルキノエンブリオニック抗原である。
さらに別の実施形態では、共有抗原は共有イントロン保持抗原又はフレームシフト変異による共有抗原、例えばＣＤＸ２又はＣＡＬＲである。
さらに別の実施形態では、共有抗原はスプライセオソーム変異によって引き起こされる共有抗原である。例は、ＳＦ３Ｂ１変異のような変異によって引き起こされる抗原である。
共有がん抗原のさらなる例は、Ｂ細胞リンパ腫又は多発性骨髄腫の患者では骨髄腫／リンパ腫Ｍ成分とも呼ばれる、骨髄腫又はリンパ腫によって産生されるモノクローナルＩｇに由来するｓｃＦｖ、ＨＩＶ由来配列、例えば、ｇｐｌ２０又はＧａｇ由来の配列、チロシナーゼ関連タンパク質（ＴＲＰ）－１、メラノーマ抗原、前立腺特異抗原及びイディオタイプ、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１及びＬ２からなるリストから選択されるＨＰＶ抗原、例えばＨＰＶ１６及び／又はＨＰＶ１８のＥ６及び／又はＥ７を含む。
特異的エピトープを含む十分な長さの任意の共有がん抗原配列を抗原ユニットとして使用することができる。従って、一実施形態では、抗原ユニットは、少なくとも７のアミノ酸配列、例えば、少なくとも８アミノ酸のアミノ酸配列、そのような抗原ユニットをコードする核酸配列中に、対応する少なくとも２１のヌクレオチド、例えば、少なくとも２４ヌクレオチドを含む。
さらに別の実施形態では、抗原ユニットは、共有がん抗原の１又は複数の部分、例えば１又は複数の共有がんエピトープを含む。さらに別の実施形態では、抗原ユニットは、複数の共有がん抗原の１又は複数の部分、例えば複数の共有がん抗原の１又は複数のエピトープを含む。さらに別の実施形態では、抗原ユニットは、全長の１又は複数の共有抗原と、１又は複数の共有癌抗原の１又は複数の部分とを含む。
例は、以下を含む：
－全長の１の共有抗原と、１の共有がん抗原の１又は複数のエピトープとを含む抗原ユニット；及び
－複数の共有がん抗原を含む抗原ユニットであって、それらの各々が全長であり、かつ１の共有されたがん抗原の1又は複数のエピトープを含む抗原ユニット；及び
－全長の１の共有抗原と複数の共有がん抗原の１又は複数のエピトープを含む抗原ユニット；及び
－複数の共有がん抗原を含む抗原ユニットであって、それらの各々が全長であり、かつ複数の共有がん抗原の１又は複数のエピトープを含む抗原ユニット。
ＨＰＶに対する共有抗原を含むポリペプチドの例は、ＷＯ ２０１３／０９２８７５Ａ１に開示されており、その内容は援用により本明細書に組み込まれる。
共有がん抗原を含む第1のポリペプチドの抗原ユニットを設計するための方法
また、共有がん抗原を含む第一のポリペプチドをコードするベクターの場合、抗原ユニットは、様々な患者、例えば、ある種のがんを有する患者にポリペプチドを有効にする可能性が高い配列を含むように設計される。
一実施形態では、抗原ユニットに含まれる抗原の選択は、文献及び／又は１又は複数のデータベースで検索を行い、共有癌抗原に関する情報及び配列、好ましくはそれらの発現パターン、免疫原性又は予測される免疫原性、エピトープ及び／又はＨＬＡ提示に関する情報を検索することによって行われる。次いで、多くの患者の様々なＨＬＡクラスＩ／ＩＩ対立遺伝子に結合することが知られているか、又は予測されるエピトープが同定され、あるいは、特定の癌適応症及び／又は異なる癌適応症にわたる特定の患者集団において支配的であるＨＬＡクラスＩ／ＩＩ対立遺伝子の特定のサブセットに結合するエピトープが同定される。好ましくは、最も有望なもの、すなわち最も免疫原性の高い、あるいは最も免疫原性が高いと予測される共有がん抗原の配列が、抗原ユニットに含めるために選択される。
1又は複数の感染性抗原又はその一部を含む第１のポリペプチドの抗原ユニット
本発明の別の態様において、本発明のベクター中に構成される第1の核酸によってコードされる第1のポリペプチドは、感染症の治療用に設計された抗原ユニットを含み、ベクター／第1のポリペプチドは、感染症の治療に使用するためのものである。
一実施形態では、第１のポリペプチドに含まれる抗原ユニットは、感染症に関連する1若しくは複数の抗原又はその一部、すなわち1又は複数の感染性抗原、すなわち病原体に由来する抗原又はその一部を含む。
「感染症」とは、本明細書では、病原体によって引き起こされる病態、又は病原体がその原因に関与する病態を指す。後者の例は、寄生虫の卵を含み、卵は病気そのものを引き起こすことはないが、病気を引き起こす幼虫に成長する。
「病原体」には、ウイルス、細菌、真菌、及び寄生虫を含む。
本項で述べる抗原は、「感染性抗原」、すなわち病原体由来の抗原であり、すなわち、疾病を引き起こす、又は疾病を引き起こす際に関与する病原体のタンパク質中に構成される（又は天然に見出される）抗原である。「感染性抗原」及び「病原体由来抗原」という用語は、本明細書において互換的に使用される場合がある。
従って、一実施形態では、本発明は、以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、抗原ユニットとを含み、前記抗原ユニットは、１又は複数の感染性抗原又はその一部を含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列、
を含むベクターに関し、ここで、前記ベクターは、第１のポリペプチドと１又は複数の免疫刺激性化合物とを別々の分子として共発現させることができる。
別の実施態様では、本発明は、以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、抗原ユニットとを含み、前記抗原ユニットは、１又は複数の病原体由来の１又は複数の抗原又はそのような抗原の一部を含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターに関し、ここで、前記ベクターは、第１のポリペプチド及び１又は複数の免疫刺激性化合物を別々の分子として共発現させることができる。
上記の実施形態では、抗原ユニットは、病原体由来の１又は複数の抗原、又はそのような抗原の一部を含み、例えば、病原体由来の１の抗原又は病原体由来の１超の抗原、すなわち、病原体由来の複数の抗原、例えば、そのような病原体の同一又は異なるタンパク質に含まれる抗原から構成される。
一実施形態では、抗原ユニットは、１若しくは複数の、複数の病原体に由来する抗原又はそのような抗原の部分を含む。一実施形態では、複数の病原体は複数の異なる病原体である。その文脈において、「異なる病原体」とは、例えば、異なるウイルスもしくは細菌、又は同じウイルスもしくは細菌の異なる株であってもよいし、同じ株であっても、１又は複数の変異を含んでいてもよい。
複数の病原体に由来する１又は複数の抗原又はその一部を含むベクターは、パンワクチン、例えば異なる（季節性）ウイルスを標的とするワクチンに使用されてもよい。例えば、パンワクチンはベータコロナウイルスとインフルエンザを標的にしたり、ベータコロナウイルスなどの異なる株や同じ株の異なる変異を標的にすることができる。
病原体由来の感染性抗原／抗原の例は、細菌由来のもの、例えば結核抗原やブルセラ症由来のＯＭＰ３１、あるいはウイルス由来のもの、例えばＨＩＶ由来の配列、例えば、ｇｐ１２０由来の配列、ＨＳＶ－２由来の糖タンパク質Ｄ、ヘマグルチニン、核タンパク質、Ｍ２などのインフルエンザウイルス抗原、ＨＰＶ由来抗原、例えば、ＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８のＥ６及びＥ７などのＥ１、Ｅ２、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１又はＬ２である。
一実施形態では、抗原ユニットは、１又は複数のベータコロナウイルス抗原又はその一部を含む。
ベータコロナウイルスは、オルトコロナウイルス亜科（ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｏｒｔｈｏｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）の一属を示す。ベータコロナウイルスは、エンベロープ型のポジティブセンス一本鎖ＲＮＡウイルスである。属内では、Ａ系統（エンベコウイルス亜属（ｓｕｂｇｅｎｕｓ Ｅｍｂｅｃｏｖｉｒｕｓ））、Ｂ系統（サルベコウイルス亜属（ｓｕｂｇｅｎｕｓ Ｓａｒｂｅｃｏｖｉｒｕｓ））、Ｃ系統（マーベコウイルス（Ｍｅｒｂｅｃｏｖｉｒｕｓ））、Ｄ系統（ノベコウイルス（Ｎｏｂｅｃｏｖｉｒｕｓ））の４系統が一般的に認識されている。ベータコロナウイルスには、ヒトで流行／パンデミックを引き起こした、あるいはヒトに感染する可能性のある以下のウイルスが含まれる：重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）を引き起こすＳＡＲＳ－ＣｏＶ、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）を引き起こすＭＥＲＳ－ＣｏＶ、コロナウイルス病２０１９（Ｃｏｖｉｄ－１９）を引き起こすＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１。ＳＡＲＳ－ＣｏＶとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は系統Ｂ（サルベコウイルス亜属）に属し、ＭＥＲＳ－ＣｏＶは系統Ｃ（マーベコウイルス）に属し、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３とＨＣｏＶ－ＨＫＵ１は系統Ａ（エンベコウイルス亜属）に属する。
一実施形態では、抗原はＳＡＲＳ－ＣｏＶ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質又はその一部である。
本発明の１つの実施態様では、抗原は、スパイクタンパク質又は膜タンパク質又はエンベロープタンパク質又はヌクレオカプシドタンパク質又はＯＲＦ１ａ／ｂ又はＯＲＦ３ａタンパク質の配列の一部であるＴ細胞エピトープであってもよい。別の実施形態において、Ｔ細胞エピトープは、以下の遺伝子／タンパク質の一部である：ＮＣＡＰ、ＡＰ３Ａ、スパイク、ＯＲＦ１ａ／ｂ、ＯＲＦ３ａ、ＶＭＥ１及びＶＥＭＰ。
いくつかの実施形態では、本発明のベクターの抗原ユニットは、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、ＣＭＶ、ＨＰＶ、ＨＢＶ、ブルセラ菌、ＨＩＶ、ＨＳＶ－２及び結核菌からなるリストから選択される１又は複数の病原体に由来する１又は複数の抗原又はその一部を含む。
感染症の治療に用いる本発明のベクターは、迅速で強力な免疫応答を誘導することができるため、パンデミックや伝染病との戦いに理想的である。このようなベクターは、１又は複数の感染性抗原の全長又は一部を抗原ユニットに含めることによって抗原効果を誘導するように設計されており、このような一部は、例えば、選択されたＴ細胞エピトープであってもよく、又はそれらの組み合わせであってもよい。
一実施形態では、このような第１のポリペプチドのターゲティングユニットは、抗－パンＨＬＡクラスＩＩ又はヒトＭＩＰ－１αであり、免疫応答は、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞を通じて上昇する。一実施形態では、ベクターは、予防的設定もしくは治療的設定、又は予防的設定及び治療的設定の両方で使用され得る。
１又は複数の病原体由来の１又は複数のＴ細胞エピトープを含む第一ポリペプチドの抗原ユニット
一実施形態では、感染症の治療に使用するためのベクター／第一ポリペプチドの抗原ユニットは、１又は複数の病原体由来の少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む。このようなＴ細胞エピトープは、病原体のタンパク質中に構成される（又は天然に見出される）。多くの病原体のゲノムの保存された部分は、免疫応答を開始することができるＴ細胞エピトープを含む。
従って、本発明の一態様は、以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、抗原ユニットとを含み、前記抗原ユニットは、１又は複数の感染性抗原からの少なくとも１のＴ細胞エピトープを含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターに関し、ここで、前記ベクターは、第１のポリペプチドと１又は複数の免疫刺激性化合物とを別々の分子として共発現させることができる。
一実施形態では、本発明は、以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、抗原ユニットとを含み、前記抗原ユニットは、１又は複数の病原体に由来する少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターに関し、ここで、前記ベクターは、第１のポリペプチドと１又は複数の免疫刺激性化合物とを別々の分子として共発現させることができる。
いくつかの実施形態では、抗原ユニットは、病原体の少なくとも１のＴ細胞エピトープ、すなわち病原体の１のＴ細胞エピトープ、又は病原体の１超のＴ細胞エピトープ、すなわち病原体の複数のＴ細胞エピトープを含む。ある実施形態では、複数のＴ細胞エピトープは同じ病原体のものであり、すなわち（当然ながら）病原体の同じタンパク質又は異なるタンパク質に含まれている。他の実施形態では、複数のＴ細胞エピトープは複数の異なる病原体のものであり、すなわち（天然には）異なる病原体のタンパク質に含まれている。
抗原ユニットに含まれる少なくとも一つのＴ細胞エピトープは、７～約２００アミノ酸の長さを有し、より長いＴ細胞エピトープには最小Ｔ細胞エピトープのホットスポットを含む可能性がある。「ミニマムエピトープのホットスポット」とは、異なるＨＬＡ対立遺伝子によって提示されると予測されるいくつかのミニマムＴ細胞エピトープ（例えば、７～１５アミノ酸の長さを有する）を含む領域であり、世界人口の広い範囲をカバーする。
いくつかの実施形態では、抗原ユニットは、７～１５０アミノ酸、好ましくは７～１００アミノ酸、例えば約１０～約１００アミノ酸、又は約１５～約１００アミノ酸、又は約２０～約７５アミノ酸、又は約２５～約５０アミノ酸の長さを有する少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む。
約６０～２００アミノ酸の長さを有するＴ細胞エピトープは、より短い配列に分割され、リンカー、例えば本明細書に記載されるようなリンカーによって分離された抗原ユニットに含まれ得る。例えば、１５０アミノ酸の長さを持つＴ細胞エピトープを、５０アミノ酸ずつの３つの配列に分割して抗原ユニットに含めることができ、リンカーにより３配列が互いに分離している。
一実施形態では、抗原ユニットは、リンカー、例えば、本明細書で言及されたリンカー、例えば本明細書の「抗原ユニット中のリンカー」の項で論じたようなリンカーによって互いに分離された複数のＴ細胞エピトープを含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞エピトープは、ＭＨＣによる提示に適した長さを有する。したがって、いくつかの実施形態では、抗原ユニットは、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩでの特異的提示に適した長さを有する少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩ提示のために７～１１アミノ酸の長さを有する。他の実施形態では、少なくとも１のＴ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ提示のために約１５アミノ酸の長さを有する。
抗原ユニットに含まれるＴ細胞エピトープの数は様々であり、抗原ユニットに含まれる他のエレメント、例えばリンカーの長さや数に依存する。
いくつかの実施形態では、抗原ユニットは、１～１０個のＴ細胞エピトープ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９もしくは１０個のＴ細胞エピトープ、又は１１～２０個のＴ細胞エピトープ、例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個のＴ細胞エピトープ、又は２１～３０個のＴ細胞エピトープ、例えば、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０個のＴ細胞エピトープ、又は３１～４０個のＴ細胞エピトープ、例えば、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０個のＴ細胞エピトープ、又は４１～５０個のＴ細胞エピトープ、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５０個のＴ細胞エピトープを含む。
好ましい実施形態では、少なくとも１のＴ細胞エピトープは、病原体の保存された領域、すなわち、それぞれの病原体のいくつかの亜属、種又は株の間で保存されたものである。
Ｔ細胞エピトープは、病原体のタンパク質、すなわち表面タンパク質だけでなく、ウイルスヌクレオカプシドタンパク質やウイルスレプリカーゼポリタンパク質などの内部タンパク質、あるいはその他の構造タンパク質や非構造タンパク質に含まれていてもよい。
病原体の保存された領域に由来するT細胞エピトープを含む抗原ユニットを含むベクターは、病原体の複数の種／株に対する防御を提供する。このようなベクターはまた、病原体の複数の変異体に対する防御を提供し、これは、将来変異した病原体に対するこのようなベクター／第１のポリペプチドの有効性にとって重要である。ウイルスは変異することが知られており、例えばウイルス抗原ドリフトや抗原シフトが起こる。ウイルス属全体に保存領域が存在することから、これらの保存領域は本質的な構造や機能を維持するために必要であると考えられる。保存領域に対する免疫反応を高めることにより、プラスミドを投与された患者は、将来の変異株（したがって新規株）からも保護されることになる。
従って、本発明の一実施形態では、抗原ユニットは、そのような抗原ユニットに含まれる感染性抗原／病原体由来のＴ細胞エピトープに対するＴ細胞の活性化を通じて、細胞媒介免疫応答を誘発するように設計されている。エピトープが処理され、ＭＨＣ分子に複合化して提示されたときに、Ｔ細胞は、エピトープを認識する。
一実施形態では、Ｔ細胞エピトープは、当該技術分野において既知であり、例えば、研究され、文献に記載されているものであり、例えば、免疫原性であることが既知であり、例えば、その免疫原性が適切な方法によって確認され、その結果が、例えば、科学刊行物において公表されているものである。一実施形態では、抗原ユニットは、免疫原性であることが知られている複数のＴ細胞エピトープを含む。
例えば、当技術分野で知られている有用なＴ細胞エピトープは、ヒトにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ２による感染に対するものであり、Ｇｒｉｆｏｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ． ２０２１ Ｊｕｌ １４； ２９（７）： １０７６-１０９２に見出され得る。したがって、このようなＴ細胞エピトープは、ヒトにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の治療に使用するためのベクターの抗原ユニットに含まれ得る。このようなＴ細胞エピトープの別の例は、Ａ型インフルエンザウイルス由来の核タンパク質の配列ＣＴＥＬＫＬＳＤＹ（配列番号８２）を有するＴ細胞エピトープ、ヒトヘルペスウイルス５（ヒトサイトメガロウイルス）由来の６５ｋＤａリンタンパク質の配列ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号８３）を有するＴ細胞エピトープ、及び結核菌由来のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ／マイコリルトランスフェラーゼＡｇ８５Ｂの配列ＫＬＶＡＮＮＴＲＬ（配列番号８４）を有するＴ細胞エピトープである。
一例として、少なくとも１つのＴ細胞エピトープは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の領域、例えばＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８からのものであってもよく、例えばＥ１、Ｅ２、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１及びＬ２からなる群からのＨＰＶ抗原、例えばＨＰＶ１６及び／又はＨＰＶ１８のＥ６及び／又はＥ７に含まれる少なくとも１つのＴ細胞エピトープであってもよい。このようなＴ細胞エピトープを本開示のベクターに含めることにより、このようなベクターを含む医薬組成物は、ＨＰＶに対する防御を提供することができる。ＨＰＶ感染は、頭頸部の扁平上皮癌、子宮頸癌、外陰扁平上皮癌などの特定の癌に関与している。実際、ＨＰＶ１６ウイルス抗原は、前記癌患者の約５０％に発現している。
別の例として、少なくとも１つのＴ細胞エピトープは、ヒトインフルエンザウイルスＡ、ヒトインフルエンザウイルスＢ、ヒトインフルエンザウイルスＣ、及びヒトインフルエンザウイルスＤなどのヒトインフルエンザウイルスの領域由来であってもよい。一例として、ヒトインフルエンザウイルスは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３などの特定のヘマグルチニン（ＨＡ）サブタイプ、及び／又はＮ１もしくはＮ５などの特定のノイラミニダーゼ（ＮＡ）サブタイプであってもよい。一例として、ヒトインフルエンザウイルスはＨ１Ｎ１サブタイプであってもよい。したがって、このようなＴ細胞エピトープは、インフルエンザ感染の治療に使用するための本開示のベクターの抗原ユニットに含まれ得る。
別の実施形態では、Ｔ細胞エピトープは、免疫原性であると予測され、例えば、ＨＬＡクラスＩ／ＩＩ対立遺伝子に結合する予測される能力に基づいて選択される。一実施形態では、抗原ユニットは、複数のＴ細胞エピトープ、例えば、本明細書で議論されるようなリンカー、例えば、本明細書の「抗原ユニット中のリンカー」の項で議論されるようなリンカーによって互いに分離された、ＨＬＡクラスＩ／ＩＩ対立遺伝子に結合すると予測される複数のＴ細胞エピトープを含む。Ｔ細胞エピトープは、ＨＬＡ結合予測アルゴリズムに基づいてインシリコで選択される。すべての関連エピトープを同定した後、ＨＬＡクラスＩ／ＩＩ対立遺伝子に結合する能力に従ってエピトープをランク付けし、最もよく結合すると予測されるエピトープを選択して抗原ユニットに含める。
適切なＨＬＡ結合アルゴリズムは当技術分野で知られている。
さらに別の実施形態では、抗原ユニットは複数のＴ細胞エピトープを含み、そのうちのいくつかは免疫原性であることが知られており、その他は免疫原性であることが予測される。一実施形態では、Ｔ細胞エピトープは、リンカー、例えば、本明細書で言及されるリンカー、えば、本明細書の「抗原ユニット中のリンカー」の項で論じるようなリンカーによって互いに分離されている。
ベータコロナウイルス感染の予防的及び治療的処置のためのベクターで使用するためのＴ細胞エピトープを含む抗原ユニット、及び感染症の予防的及び治療的処置で使用する本発明のベクターのためのＴ細胞エピトープを選択するための一般に適用可能な方法は、ＷＯ２０２１／２１９８９７Ａ１に詳細に開示されており、その開示内容は援用により本明細書に組み込まれる。
1又は複数の全長感染性抗原もしくはその一部、又は1又は複数の病原体由来の1又は複数のB細胞エピトープを含む第1のポリペプチドの抗原ユニット
本発明の別の態様では、対象は、例えばヒト個体、健康な個体であり、本発明のベクターは、例えば疾患を予防するために予防的に使用される。典型的には、ベクターは、病原体に対する中和抗体を予防的に上昇させることが望まれる個体において免疫を誘導するために、例えば感染を予防するために使用される。
一実施形態では、本発明のベクターは、病原体の全長タンパク質又はそのようなタンパク質の一部である少なくとも1つの感染性抗原を含む抗原ユニットを含む第1のポリペプチドをコードする。このように、1つの実施形態では、少なくとも1つの感染性抗原は、全長表面タンパク質又はその一部、例えば、全長ウイルス表面タンパク質又は細菌表面タンパク質又は他の病原体の全長表面タンパク質である。
他の実施形態では、感染抗原は、細菌によって分泌される、例えば感染体の細胞質に分泌される、全長の細菌タンパク質である。
他の実施形態では、抗原ユニットは１超の感染性抗原又は１超の感染性抗原の一部、例えば複数の全長感染性抗原を含む。
さらに別の実施形態では、抗原ユニットは、１又は複数の、複数の病原体に由来する抗原又はそのような抗原の一部、例えば複数の病原体に由来する複数の全長感染性抗原を含む。一実施形態では、複数の病原体は複数の異なる病原体である。

一実施形態では、病原体のこのようなタンパク質は、例えば、エンベロープタンパク質、スパイクタンパク質、膜タンパク質、及びベータコロナウイルスがエンベコウイルスである場合にはスパイク様タンパク質ヘマグルチニンエステラーゼからなる群から選択される、ベータコロナウイルスタンパク質から選択される。
他の実施形態では、抗原ユニットは１つの感染性抗原の１つの部分を含む。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質のＲＢＤドメイン、又はインフルエンザウイルスのヘマグルチニンのヘッド又はステムドメインは、感染性抗原の一部の例である。
他の実施形態では、抗原ユニットは１の感染性抗原の複数の部分を含む。他の実施形態では、抗原ユニットは複数の感染性抗原の１つの部分、例えば感染性抗原１の１つの部分と感染性抗原２の１つの部分と感染性抗原３の１つの部分とを含む。他の実施形態では、抗原ユニットは複数の感染性抗原のいくつかの部分、例えば感染性抗原１の２つの部分と感染性抗原２の３つの部分を含む。感染性抗原１、２及び３は、１つの病原体に由来してもよいし、複数の異なる病原体に由来してもよい。
１超の感染性抗原が抗原ユニット、又は１若しくは複数の感染性抗原の１超の部分に構成される場合、抗原又はその部分は、リンカーによって、例えば、本明細書で言及されるリンカーによって、例えば本明細書の「抗原ユニット中のリンカー」の項で言及されるようなリンカーによって分離され得る。
１又は複数の感染性抗原又はその一部は、コンフォメーションナルなＢ細胞エピトープを含むが、直鎖状Ｂ細胞エピトープ及び／又はＴ細胞エピトープを含むこともある。本明細書の前節で論じたＴ細胞エピトープとは逆に、これらのＴ細胞エピトープは単離されたものではなく、自然な環境、すなわち抗原中に存在するアミノ酸残基によって挟まれた状態で免疫系に提示される。
したがって、一実施形態では、本発明は、以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、抗原ユニットとを含み、前記抗原ユニットは、1又は複数の全長感染性抗原又はその一部を含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）1又は複数の免疫刺激性化合物をコードする1又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターを提供し、ここで、前記ベクターは、第１のポリペプチドと1又は複数の免疫刺激性化合物とを別々の分子として共発現させることができる。
別の実施形態では、本発明は、以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的化するターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、抗原ユニットとを含み、前記抗原ユニットは、１又は複数の病原体由来の１又は複数の全長抗原、又はそのような全長抗原の一部を含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターを提供し、ここで、前記ベクターは、第１のポリペプチドと１又は複数の免疫刺激性化合物とを別々の分子として共発現させることができる。
一実施形態では、抗原ユニットは、病原体由来の、例えば全長表面タンパク質のような病原体の全長タンパク質、例えば前述のタンパク質のいずれかに含まれるB細胞エピトープを少なくとも含み、好ましくは、病原体由来の、例えば全長の表面タンパク質のような病原体の全長タンパク質に含まれる、例えば前述のタンパク質のいずれかに含まれる複数のB細胞エピトープを含む。少なくとも1つのB細胞エピトープは、線状B細胞エピトープであってもよいし、コンフォメーショナルなB細胞エピトープであってもよい。
さらに別の実施態様では、本発明は、以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、１又は複数の病原体由来の少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む抗原ユニットとを含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターを提供し、ここで、前記ベクターは、第１のポリペプチド及び１又は複数の免疫刺激性化合物を別々の分子として共発現させることを可能にする。
すなわち１又は複数の感染性全長抗原又はそのような抗原の一部を含む抗原ユニットを含む、上記のような本発明のベクター中に構成される第１の核酸によってコードされる第１のポリペプチドを一旦投与されると、Ｂ細胞応答及びＴ細胞応答を誘発し、予防的又は治療的に使用することができる。
このような抗原は、予測される治療効果に従って抗原ユニットに含めるために選択され得るが、その開示内容は援用により本明細書に組み込まれるＷＯ２０２１／２１９８９７Ａ１を参照のこと。
１又は複数の病原体由来のＢ細胞エピトープ及びＴ細胞エピトープを含む第１のポリペプチドの抗原ユニット
一実施形態では、本発明のベクターに含まれる第１の核酸によってコードされる第１のポリペプチドは、対象に投与されると、Ｔ細胞応答及びＢ細胞応答を誘発する。パンデミック又は流行状況においては、最初に個人を診断して、その人が主にＢ細胞応答とＴ細胞応答のどちらを必要としているのか、また予防的治療と治療的治療のどちらが最も医学的に必要なのかを決定するのは時間効率が悪い。感染しているかどうかの判断は、（十分な）該当検査がないために困難である。したがって、予防と治療を同時に行えることが重要である。全長の感染性抗原又は感染性抗原の一部、あるいは感染性抗原中に存在するいくつかのＢ細胞エピトープと、保存Ｔ細胞エピトープなどのＴ細胞エピトープの両方を組み合わせることにより、ベクターが投与されると、強い体液性応答と細胞性応答の両方が惹起される。この応答は、選択されたターゲティングユニットによって、より体液性であったり、より細胞性であったりする。
従って、本発明の１つの態様は、以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、ターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、抗原ユニットとを含み、前記抗原ユニットは、（ｉ）１又は複数の全長感染性抗原又はそのような抗原の一部、及び（ｉｉ）１又は複数の感染性抗原からの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む、第１の核酸配列；ならびに
（ｂ）１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターに関し、ここで、前記ベクターは、第１のポリペプチド及び１又は複数の免疫刺激性化合物を別々の分子として共発現させることができる。
一実施形態では、本発明は、以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、ターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、抗原ユニットとを含み、前記抗原ユニットは、（ｉ）１又は複数の全長抗原又はそのような抗原の一部、及び（ｉｉ）少なくとも１のＴ細胞エピトープを含み、ここで、前記１又は複数の抗原及び前記少なくとも１つのＴ細胞エピトープは、１又は複数の病原体に由来する；及び
（ｂ）１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターに関し、ここで、前記ベクターは、第１のポリペプチドと１又は複数の免疫刺激性化合物とを別々の分子として共発現させることができる。
Ｔ細胞エピトープと感染性抗原又はその一部のこのような組み合わせは、Ｔ細胞エピトープの予測される免疫原性に従って、又は、その内容が援用により本明細書に引用されるＷＯ２０２１／２１９８９７Ａ１に記載されている当該技術分野で公知のＴ細胞エピトープを選択することによって、抗原ユニットに含めるために選択され得る。
一実施形態では、本発明は、以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、ターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、抗原ユニットとを含み、前記抗原ユニットが、（ｉ）1又は複数の感染性抗原からの1又は複数のＢ細胞エピトープ、及び（ｉｉ）1又は複数の感染性抗原からの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）1又は複数の免疫刺激性化合物をコードする1又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターに関し、ここで、前記ベクターは、第１のポリペプチド及び1又は複数の免疫刺激性化合物を別々の分子として共発現させることができる。
さらに別の実施態様では、本発明は、以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、ターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、抗原ユニットとを含み、前記抗原ユニットは、（ｉ）１又は複数のＢ細胞エピトープと（ｉｉ）少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含み、前記１又は複数のＢ細胞エピトープ及び前記少なくとも１つのＴ細胞エピトープは、１又は複数の病原体に由来する；及び
（ｂ）１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターに関し、ここで、前記ベクターは、第１のポリペプチドと１又は複数の免疫刺激性化合物とを別々の分子として共発現させることができる。
一実施形態では、全長感染性抗原／その一部及び少なくとも１つのＴ細胞エピトープは、以下のように抗原ユニット中に配置される：少なくとも１つのＴ細胞エピトープは、ユニットリンカーのような第１のリンカーによって多量体化ユニットに連結されるサブユニット中に配置される。複数のＴ細胞エピトープがサブユニット中に存在する場合、Ｔ細胞エピトープは好ましくはサブユニットリンカーによって分離される。さらに、サブユニットは第２のリンカーによって１又は複数の全長感染性抗原又はその一部から分離される。従って、Ｔ細胞エピトープを有するサブユニットは多量体化ユニットに最も近く、感染性抗原又はその一部はポリペプチドの末端を構成する。
従って、一実施態様では、本発明は、以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、ターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、抗原ユニットとを含み、前記抗原ユニットは、（ｉ）１又は複数の全長感染性抗原又はそのような抗原の一部、及び（ｉｉ）１又は複数のＴ細胞エピトープを含み、ここで、前記１又は複数の抗原及び前記１又は複数のＴ細胞エピトープは、病原体に由来する；及び
（ｂ）１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターに関し、ここで、前記ベクターは、第１のポリペプチド及び１又は複数の免疫刺激性化合物を別個の分子として共発現させることができ；そして
１超のＴ細胞エピトープがサブユニットに含まれる場合、前記抗原ユニットは、サブユニットリンカーによって互いに分離されたＴ細胞エピトープを含むサブユニットを含んでおり、；そして
前記サブユニットが、ユニットリンカーのような第１のリンカーによって多量体化ユニットに連結され、第２のリンカーによって１又は複数の全長感染性抗原又はそのような抗原の部分から分離されている。
サブユニットリンカー、第一のリンカー／ユニットリンカー及び第二のリンカーは、本明細書で言及されるようなリンカー、例えば、本明細書の「抗原ユニットのリンカー」及び「ユニットリンカー」の項で言及されるようなリンカーであってもよい。
抗原ユニットのさらなる実施形態
以下は、本発明のベクターに含まれる第一の核酸によりコードされる第一のポリペプチド中の抗原ユニット一般に適用される。
本願明細書では、抗原という用語は、ネオ抗原、ネオエピトープ、患者提示共有がん抗原、患者提示共有がん抗原の一部、例えば患者提示共有がんエピトープ、共有がん抗原、共有がん抗原の一部、例えば共有がんエピトープ、感染性抗原もしくはその一部、又は感染性抗原のT細胞エピトープに対して使用される。
一実施形態では、抗原ユニットは各抗原の1つのコピーのみを含む。別の実施形態では、抗原ユニットは、１又は複数の抗原の複数のコピーを含む。
一実施形態では、抗原ユニットは各抗原の１つのコピーのみを含むため、例えば１０種類の抗原が抗原ユニットに含まれる場合、前記抗原ユニットを含むベクターは１０種類の抗原すべてに対する免疫応答を誘発し、その結果、がんを効率的に攻撃することができる。
別の実施形態では、例えば、患者のＨＬＡ対立遺伝子に十分に免疫原性である／結合すると予測されるネオエピトープが特定の患者において数個しか同定されなかった場合、抗原に対する免疫応答を強化するために、抗原ユニットは特定の抗原、例えば特定のネオエピトープの少なくとも２コピーを含む。このような患者において、少数のネオエピトープに加え、１つ以上の患者提示共有がん抗原が同定された場合、同じネオエピトープの複数コピーを抗原ユニットに含めるのではなく、このような1又は複数の患者提示共有がん抗原又はその一部を抗原ユニットに含めることが好ましい。
抗原ユニットの長さは、そこに含まれる抗原の長さとその数によって決定される。
一実施形態では、抗原ユニットは、最大３５００個のアミノ酸、例えば６０個～３５００個のアミノ酸、例えば約８０個又は約１００個又は約１５０個のアミノ酸から約３０００個のアミノ酸、例えば約２００個～約２５００個のアミノ酸、例えば約３００個～約２０００個のアミノ酸、又は約４００個～約１５００個のアミノ酸、又は約５００個～約１０００個のアミノ酸を含む。
免疫応答を増強するために、特にネオ抗原を含む第一のポリペプチドの場合、抗原は以下の段落に記載されているように抗原サブユニット中に配置されていてもよい。
抗原ユニットは、Ｎ末端が開始点でＣ末端が終端であるポリペプチドとして記述することができる。抗原ユニットは、例えばリンカーを介して、好ましくはユニットリンカーを介して、二量体化ユニットのような多量体化ユニットに接続される。抗原ユニットは、第一ポリペプチドのＣＯＯＨ末端又はＮＨ２末端のいずれかに位置する。抗原ユニットが第一ポリペプチドのＣＯＯＨ末端にあることが好ましい。
一実施形態では、抗原、好ましくはエピトープは、抗原ユニットのＮ末端始点からＣ末端終点に向かう方向に、抗原性の高いものから低いものの順に配置される。あるいは、特に抗原間で親水性／疎水性が大きく異なる場合には、最も疎水性の抗原が抗原ユニットの実質的に中央に配置され、最も親水性の抗原が抗原ユニットのＮ末端側開始点及び／又はＣ末端側に配置されることが好ましい。
抗原ユニットの真ん中に正確に位置することは、抗原ユニットが奇数個の抗原を含む場合にのみ可能であるため、この文脈における「実質的に」という用語は、偶数個の抗原を含む抗原ユニットを指し、最も疎水性の抗原は、できるだけ真ん中に近い位置に配置される。
一例として、抗原ユニットは５つの抗原サブユニットを含み、各サブユニットはそれぞれ異なるエピトープ、例えば異なるネオエピトープを含み、以下のように配列されている：１，２，３＊，４，５：
１，２，３＊，４，及び５はそれぞれ異なるネオエピトープであり、－はサブユニットリンカーであり、＊は抗原ユニットの中央に位置する最も疎水性のネオエピトープを示す。
別の例では、抗原ユニットは６つの抗原サブユニットを含み、各サブユニットは異なるエピトープ、例えば異なるネオエピトープを含み、それらは以下のように配置される：１－２－３＊－４－５－６、あるいは次のように配置される：１－２－４－３＊－５－６；１，２，３＊，４，５及び６はそれぞれ異なるネオエピトープであり、－はサブユニットリンカーであり、そして、＊は抗原ユニットの実質的に中央に位置する最も疎水性のネオエピトープを示す。
あるいは、抗原サブユニットは親水性抗原と疎水性抗原を交互に配置するようにしてもよい。
任意に、抗原をコードするＧＣリッチ配列（例えば、ネオエピトープ又はエピトープをコードするＧＣリッチ配列）は、ＧＣクラスターが回避されるように配置される。一実施形態では、抗原をコードするＧＣリッチ配列は、それらの間に少なくとも１つの非ＧＣリッチ配列が存在するように配置される。
一実施形態では、抗原ユニットは１又は複数のリンカーを含む。別の実施形態では、抗原ユニットは、複数の抗原、例えば複数のエピトープ、例えばネオエピトープを含み、ここで抗原はリンカーによって分離されている。さらに別の実施形態では、抗原ユニットは複数の抗原を含み、各抗原はリンカーによって他の抗原から分離されている。各抗原がリンカーによって他の抗原から分離されていることを説明する代替的な方法は、末端抗原、すなわちポリペプチドのＮ末端開始点又はＣ末端にある抗原（すなわち、多量体化ユニットに連結されていない抗原ユニットの末端に位置する抗原）を除くすべてが抗原性サブユニットに配置され、各サブユニットが抗原例えばネオエピトープとサブユニットリンカーからなる、又は含む。
従って、ｎ個の抗原を含む抗原ユニットはｎ－１個の抗原サブユニットを含み、各サブユニットは抗原とサブユニットリンカーを含み、さらに末端抗原を含む。一実施形態では、ｎは１～５０の整数であり、例えば３～５０又は１５～４０又は１０～３０又は１０～２５又は１０～２０又は１５～３０又は１５～２５又は１５～２０である。
リンカーによって抗原が分離されているため、各抗原は免疫系に最適な形で提示される。
一実施形態では、抗原ユニットはＢ細胞エピトープとＴ細胞エピトープ、例えば全長の感染性抗原又はその一部と病原体のタンパク質に含まれる１又は複数のＴ細胞エピトープを含み、抗原ユニットはＴ細胞エピトープが多量体化ユニットの最も近くに配置され、感染性抗原が抗原ユニットの末端に位置するように設計される。Ｔ細胞エピトープは好ましくはリンカーによって分離され、感染性抗原は好ましくはリンカーによってＴ細胞エピトープを含む「サブユニット」から分離される。このような抗原ユニットデザインはＰＣＴ／ＥＰ２０２２／０６１８１９に開示されており、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。
抗原ユニットに含まれるリンカー
抗原ユニットは、リンカー、例えばそこに含まれる抗原、例えばネオ抗原、ネオエピトープ、患者提示共有がん抗原又はその一部、例えば患者提示共有がんエピトープ、共有がん抗原又はその一部、例えば共有がんエピトープ、感染性抗原又はその一部、又は感染性抗原のT細胞エピトープを分離するリンカーを含んでいてもよい。上述したように、ネオエピトープなどのすべての抗原は、リンカーによって互いに分離され、サブユニットに配列されていてもよい。以下では、サブユニットリンカーとリンカーという用語を互換的に用い、両者とも抗原ユニット中のリンカーを示す。
一実施形態では、リンカーは非免疫原性であるように設計される。リンカーは、リジッドリンカーであってもよく、これは、それが連結する２つのアミノ酸配列が互いに対して実質的に自由に動くことを許容しないことを意味する。あるいは、フレキシブルリンカー、すなわち、連結する２つのアミノ酸配列が互いに実質的に自由に相対的に動くことを可能にするリンカーであってもよい。どちらのタイプのリンカーも有用である。一実施形態では、リンカーはフレキシブルリンカーであり、抗原ユニットが多数の抗原から構成されていても、抗原をＴ細胞に最適な方法で提示することができる。
一実施形態では、サブユニットリンカーは、４～４０個のアミノ酸、例えば３５、３０、２５又は２０個のアミノ酸、例えば５～２０個のアミノ酸又は５～１５個のアミノ酸又は８～２０個のアミノ酸又は８～１５個のアミノ酸１０～１５個のアミノ酸又は８～１２個のアミノ酸からなるペプチドである。別の実施形態では、サブユニットリンカーは１０アミノ酸からなる。
一実施形態では、例えばネオエピトープを含む抗原ユニットでは、サブユニットリンカーはすべての抗原サブユニットで同一である。しかし、抗原の１又は複数がリンカーの配列と類似の配列を含む場合、隣接するサブユニットリンカーを異なる配列のリンカーで置き換えることが有利になることがある。また、抗原－サブユニットリンカー接合部がそれ自体免疫原性エピトープを構成すると予測される場合には、異なる配列のリンカーを使用することができる。
一実施形態では、サブユニットリンカーはフレキシブルリンカーであり、好ましくは、小さく、非極性（例えばグリシン、アラニン又はロイシン）又は極性（例えばセリン又はスレオニン）アミノ酸を含むフレキシブルリンカーである。これらのアミノ酸のサイズが小さいため柔軟性があり、連結したアミノ酸配列の可動性を可能にする。セリン又はスレオニンの組み込みは、水分子と水素結合を形成することにより、水溶液中でのリンカーの安定性を維持することができ、したがって、リンカーと抗原との間の好ましくない相互作用を減少させることができる。一実施形態では、フレキシブルリンカーはセリン（Ｓ）及び／又はグリシン（Ｇ）に富んだリンカー、すなわち数個のセリン残基及び／又は数個のグリシン残基を含むリンカーである。好ましい例は、ＧＧＧＧＳ（配列番号５８）、ＧＧＧＳＳ（配列番号５９）、ＧＧＧＳＧ（配列番号６０）、ＧＧＳＧＧ（配列番号６１）、ＳＧＳＳＧＳ（配列番号６２）、又は複数のそのバリアント、例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１７）、（ＧＧＧＧＳ）ｍ（配列番号６４）、（ＧＧＧＳＳ）ｍ（配列番号６５）、（ＧＧＳＧＧ）ｍ（配列番号：６６）、（ＧＧＧＳＧ）ｍ（配列番号６７）又は（ＳＧＳＳＧＳ）ｍ（配列番号６８）であり、ここで、ｍは、１～５の整数であり、例えば、１、２、３、４、又は５である。好ましい実施形態では、ｍは２である。別の好ましい実施形態では、セリン及び／又はグリシンリッチリンカーは、少なくとも１つのロイシン（Ｌ）残基、例えば、少なくとも１つ又は少なくとも２つ又は少なくとも３つのロイシン残基、例えば、１、２、３又は４つのロイシン残基をさらに含む。
一実施形態では、サブユニットリンカーは、ＬＧＧＧＳ（配列番号６９）、ＧＬＧＧＳ（配列番号７０）、ＧＧＬＧＳ（配列番号７１）、ＧＧＧＬＳ（配列番号７２）又はＧＧＧＧＬ（配列番号７３）を含む、又はからなる。別の実施形態では、サブユニットリンカーは、ＬＧＧＳＧ（配列番号７４）、ＧＬＧＳＧ（配列番号７５）、ＧＧＬＳＧ（配列番号７６）、ＧＧＧＬＧ（配列番号７７）又はＧＧＧＳＬ（配列番号７８）を含む、又はからなる。さらに別の実施形態では、サブユニットリンカーは、ＬＧＧＳＳ（配列番号７９）、ＧＬＧＳＳ（配列番号８０）又はＧＧＬＳＳ（配列番号８１）を含む、又はからなる。
さらに別の実施形態では、サブユニットリンカーは、ＬＧＬＧＳ（配列番号８５）、ＧＬＧＬＳ（配列番号８６）、ＧＬＬＧＳ（配列番号８７）、ＬＧＧＬＳ（配列番号８８）又はＧＬＧＧＬ（配列番号８９）を含む、又はからなる。さらに別の実施形態では、サブユニットリンカーは、ＬＧＬＳＧ（配列番号９０）、ＧＬＬＳＧ（配列番号９１）、ＧＧＬＳＬ（配列番号９２）、ＧＧＬＬＧ（配列番号９３）又はＧＬＧＳＬ（配列番号９４）を含む、又はからなる。さらに別の実施形態において、サブユニットリンカーは、ＬＧＬＳＳ（配列番号９５）、又はＧＧＬＬＳ（配列番号９６）を含む、又はからなる。
別の実施形態では、サブユニットリンカーは、１０アミノ酸の長さを有し、１又は２個のロイシン残基を含むセリン－グリシンリンカーである。
一実施形態では、サブユニットリンカーは、ＬＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号９７）、ＧＬＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号９８）、ＧＧＬＧＳＧＧＧＳ（配列番号９９）、ＧＧＧＬＳＧＧＧＧＳ（配列番号１００）又はＧＧＧＧＬＧＧＧＳ（配列番号１０１）を含む、又はからなる。別の実施形態では、サブユニットリンカーは、ＬＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１０２）、ＧＬＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１０３）、ＧＧＧＬＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１０４）、ＧＧＧＧＬＧＧＧＳＧ（配列番号１０５）又はＧＧＧＳＬＧＧＧＳＧ（配列番号１０６）を含む、又はからなる。さらに別の実施形態では、サブユニットリンカーは、ＬＧＧＳＳＧＧＧＳＳ（配列番号１０７）、ＧＬＧＳＳＧＧＧＳＳ（配列番号１０８）、ＧＧＬＳＧＧＧＳＳ（配列番号１０９）、ＧＧＧＬＳＧＧＧＳＳ（配列番号１１０）又はＧＧＧＳＬＧＧＧＳＳ（配列番号１１１）を含む、又はからなる。
さらなる実施形態では、サブユニットリンカーは、ＬＧＧＧＳＬＧＧＧＳ（配列番号１１２）、ＧＬＧＧＳＧＬＧＧＳ（配列番号１１３）、ＧＧＬＧＳＧＧＬＧＳ（配列番号１１４）、ＧＧＧＬＳＧＧＧＬＳ（配列番号１１５）又はＧＧＧＧＬＧＧＧＬ（配列番号１１６）を含む、又はからなる。別の実施形態では、サブユニットリンカーは、ＬＧＧＳＧＬＧＧＳＧ（配列番号１１７）、ＧＬＧＳＧＧＬＧＳＧ（配列番号１１８）、ＧＧＬＳＧＧＧＬＳＧ（配列番号１１９）、ＧＧＧＬＧＧＧＬＧ（配列番１２０）又はＧＧＧＳＬＧＧＧＳＬ（配列番号１２１）を含む、又はからなる。さらに別の実施形態では、サブユニットリンカーは、ＬＧＧＳＳＬＧＧＳＳ（配列番号１２２）、ＧＬＧＳＳＧＬＧＳＳ（配列番号１２３）又はＧＧＬＳＳＧＧＬＳＳ（配列番号１２４）を含む、又はからなる。
さらに別の実施形態では、サブユニットリンカーは、ＧＳＧＧＧＡ（配列番号１２５）、ＧＳＧＧＡＧＳＧＧＧＡ（配列番号１２６）、ＧＳＧＧＡＧＳＧＧＡＧＳＧＧＧＡ（配列番号１２７）、ＧＳＧＧＡＧＳＧＧＡＧＳＧＧＡＧＳＧＧＧＡ（配列番号１２８）又はＧＥＮＬＹＦＱＳＧＧ（配列番号１２９）を含む、又はからなる。さらに別の実施形態では、サブユニットリンカーは、ＳＧＧＧＳＳＧＧＧＳ（配列番号１３０）、ＳＳＧＧＧＳＳＧＧＧＧ（配列番号１３１）、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号１３２）、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１３３）、ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ（配列番号１３４）（配列番号１のアミノ酸１２１～１３０）、ＧＧＧＳＳＳ（配列番号１３５）、ＧＧＧＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳ（配列番号１３６）又はＧＬＧＧＬＡＡＡ（配列番号１３７）を含む、又はからなる。
別の実施形態では、サブユニットリンカーはリジッドリンカーである。このようなリジッドリンカーは、（より大きな）抗原を効率的に分離し、互いの干渉を防止するのに有用であり得る。一実施形態では、サブユニットリンカーは、ＫＰＥＰＫＰＡＰＡＰＫＰ（配列番号１３８）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号１３９）、（ＥＡＡＡＫ）ｍ（配列番号１４０）、ＰＳＲＬＥＥＥＬＲＲＲＬＴＥＰ（配列番号１４１）又はＳＡＣＹＣＥＬＳ（配列番号１４２）を含む、又はからなる。
さらに別の実施形態では、サブユニットリンカーは、ＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬ（配列番号１４３）を含む、又はからなる。さらに別の実施形態では、サブユニットリンカーは、ＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬ（配列番号１４４）を含む、又はからなる。
さらに別の実施形態では、サブユニットリンカーは、ＧＧＳＡＧＧＳＧＳＧＳＳＧＧＳＳＧＡＳＧＴＧＴＡＧＴＧＳＧＳＧＴＧＳＧ（配列番号１４５）；又はＧＧＳＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＧＧＳＧＧＳ（配列番号１４６）、又はＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ（配列番号１４７）（配列番号１のアミノ酸９４～１０５）、又はＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰ（配列番号１４８）（配列番号１のアミノ酸１０６～１２０）を含む、又はからなる。
さらに別の実施形態では、サブユニットリンカーは、切断可能なリンカー、例えば、エンドペプチダーゼ、例えば、フリン、カスパーゼ、カテプシンなどのエンドペプチダーゼのための１又は複数の認識部位を含むリンカーである。切断可能なリンカーは、遊離の機能的タンパク質ドメイン（例えば、より大きな抗原によってコードされる）を放出するために導入されてもよく、このことは、このようなドメイン間の立体障害、又は生物活性の低下、生物学的分布の変化のような、このようなドメインの干渉による他の欠点を克服し得る。
好適なリンカーの例は、段落［００９８］～［００９９］及びＷＯ ２０２０／１７６７９７Ａ１の記載配列、ＵＳ ２０１９／００２２２０２Ａ１の段落［０１３５］～［０１３９］、ＷＯ ２０１７／１１８６９５ Ａ１及びＷＯ ２０２１／２１９８９７Ａ１に開示されており、これらはすべて援用により本明細書に組み込まれる。
ユニットリンカー
抗原ユニットは、好ましくはユニットリンカーによって多量体化ユニットに連結される。従って、一実施形態では、本発明のベクターに含まれる第１の核酸配列は、抗原ユニットを多量体化ユニットに連結するユニットリンカーを含む第１のポリペプチドをコードする。
ユニットリンカーは、第１の核酸配列の構築を容易にするために制限部位を含んでいてもよい。一実施形態では、ユニットリンカーは、ＧＬＧＧＬ（配列番号８９）又はＧＬＳＧＬ（配列番号１４９）である。別の実施形態では、ユニットリンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号５８）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１７）、（ＧＧＧＧＳ）ｍ（配列番号６４）、ＥＡＡＡＫ（配列番号１５０）、（ＥＡＡＡＫ）ｍ（配列番号１４０）、（ＥＡＡＡＫ）ｍＧＳ（配列番号１５１）、（ＥＡＡＡＫ）ｍＧＳ（配列番号６３）、ＧＰＳＲＬＥＥＥＬＲＲＲＬＴＥＰＧ（配列番号１５２）、ＡＡＹ又はＨＥＹＧＡＥＡＬＥＲＡＧ（配列番号１５３）を含む、又はからなる。
シグナルペプチド
本開示の一実施形態では、少なくとも１の第１の核酸配列又は1又は複数の免疫刺激性化合物をコードする1又は複数のさらなる核酸配列は、シグナルペプチドもコードする。シグナルペプチドは、第１のポリペプチドにおけるターゲティングユニットの配向に依存して、ターゲティングユニットのＮ末端又はＣ末端のいずれかに位置する。さらに、シグナルペプチドは免疫刺激性化合物のＮ末端に位置する。シグナルペプチドは、本発明のベクターを含む細胞からの第１のポリペプチド／免疫刺激性化合物の分泌を可能にするように設計される。好ましくは、第１の核酸配列及び１又は複数の免疫刺激性化合物をコードするさらなる核酸配列の各々は、シグナルペプチドもコードする。好ましくは、シグナルペプチドは、本明細書に記載のターゲティングユニット又は免疫刺激性化合物のいずれかのＮ末端に天然に存在するものである。
任意の適切なシグナルペプチドを用いることができる。適切なペプチドの例は、Ｉｇ ＶＨシグナルペプチド、好ましくは配列番号２のようなヒトＩｇ ＶＨシグナルペプチド、好ましくはターゲティングユニットが抗体又はその一部である場合、例えば、ｓｃＦｖである。一実施形態では、シグナルペプチドは、ターゲティングユニットであるタンパク質の天然リーダー配列、すなわちターゲティングユニットとして本発明のベクターにコードされるタンパク質のいずれかのＮ末端に天然に存在するシグナルペプチドである。別の実施形態では、シグナルペプチドは免疫刺激性化合物の天然リーダー配列、すなわち免疫刺激性化合物であるタンパク質のＮ末端に天然に存在するシグナルペプチドである。
シグナルペプチドの例は、ヒトＴＰＡシグナルペプチド、例えば、配列番号３、ヒトＭＩＰ１－αシグナルペプチド、例えば、配列番号１のアミノ酸配列１－２３、ヒトＧＭ－ＣＳＦシグナルペプチド、例えば、配列番号４０のアミノ酸配列、ヒトＣＣＬ５シグナルペプチド、例えば、配列番号４２のアミノ酸配列、ヒトＩＬ－１２Ａシグナルペプチド、例えば、配列番号４４のアミノ酸配列、ヒトＩＬ－１２Ｂシグナルペプチド、例えば、配列番号４６のアミノ酸配列、又はヒトＩＬ－２１シグナルペプチド、例えば、配列番号４８のアミノ酸配列である。
好ましい実施形態では、本発明のベクターは、第１のポリペプチドをコードし、かつ、配列番号１のアミノ酸配列１～２３に対して少なくとも８５％、例えば、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するシグナルペプチドをさらにコードする第１のヌクレオチド配列を含む。
別の好ましい実施態様では、本発明のベクターは、第一のポリペプチドと、配列番号１のアミノ酸配列１～２３を含むシグナルペプチドとをさらにコードする第一のヌクレオチド配列を含む。ただし、最大で３個のアミノ酸が、例えば、最大で２個のアミノ酸、又は例えば、最大で１個のアミノ酸が、置換、欠失又は挿入されている。
別の好ましい実施形態では、本発明のベクターは、第１のポリペプチドをコードし、かつ、さらに配列番号１のアミノ酸配列１－２３を有するシグナルペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列を含む。
より好ましい実施形態では、本発明のベクターは、第１のポリペプチドをコードし、かつ、配列番号１のアミノ酸配列１～２３に対して少なくとも８５％、例えば、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するシグナルペプチドをさらにコードする第１のヌクレオチド配列を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明のベクターは、第１のポリペプチドをコードし、かつ、配列番号１のアミノ酸配列１～２３からなり、最大３個のアミノ酸が、例えば、最大２個のアミノ酸、又は最大１個のアミノ酸のように、置換、欠失又は挿入されていることを除くシグナルペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列を含む。
別の好ましい実施形態において、本発明のベクターは、第１のポリペプチドをコードし、さらに配列番号１のアミノ酸配列１－２３を有するシグナルペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列を含む。
一の好ましい実施形態では、本発明のベクターは、第１のポリペプチドをコードし、シグナルペプチドをさらにコードする第１のヌクレオチド配列を含み、ここで、前記シグナルペプチドの前記ヌクレオチド配列は、配列番号２９を有する核酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
さらなる好ましい実施形態では、本発明のベクターは、第１のポリペプチドをコードし、シグナルペプチドをさらにコードする第１のヌクレオチド配列を含み、ここで、前記シグナルペプチドの前記ヌクレオチド配列は、配列番号２９を有する核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも８６％、又は少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
さらに好ましい実施形態では、本発明のベクターは、第１のポリペプチドをコードし、シグナルペプチドをさらにコードする第１のヌクレオチド配列を含み、ここで、前記シグナルペプチドの前記ヌクレオチド配列は、配列番号２９である。
配列同一性
配列同一性は以下のように決定されてもよい：配列同一性が高いということは、第二の配列が第一の配列に由来する可能性が高いことを示す。アミノ酸配列同一性は、アライメントされた２つの配列間で同一のアミノ酸配列を必要とする。したがって、参照配列と７０％のアミノ酸同一性を共有する候補配列は、アラインメント後、候補配列中の７０％のアミノ酸が参照配列中の対応するアミノ酸と同一であることを必要とする。同一性は、限定はしないが、ＣｌｕｓｔａｌＷコンピューターアラインメントプログラム（Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．， Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｊ．， Ｇｉｂｓｏｎ Ｔ．， Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｊ．Ｄ．， Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．Ｇ．， Ｇｉｂｓｏｎ Ｔ．Ｊ．，１９９４。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ：配列の重み付け、位置特異的ギャップペナルティ、重み行列の選択による漸進的多重配列アライメントの感度の向上。Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２：４６７３－４６８０）などのコンピューター解析と、そこで提案されているデフォルトパラメーターとにより決定することができる。このプログラムをデフォルト設定で使用し、クエリの成熟（生理活性）部分と参照ポリペプチドをアライメントする。完全に保存された残基の数を数え、参照ポリペプチドの長さで割る。その際、クエリー配列の一部を形成するタグや融合タンパク質配列は、アラインメントとその後の配列同一性の決定において無視される。
ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムも同様にヌクレオチド配列のアライメントに使用できる。配列同一性は、アミノ酸配列について示したのと同様の方法で計算することができる。
配列の比較に利用される別の好ましい数学的アルゴリズムは、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム、ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）である。このようなアルゴリズムは、ＦＡＳＴＡ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている（Ｐｅａｒｓｏｎ ＷＲ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ２０００， １３２：１８５－２１９）。Ａｌｉｇｎはグローバルアラインメントに基づいて配列同一性を計算する。Ａｌｉｇｎ０は配列の末尾のギャップに対してペナルティを課さない。アミノ酸配列の比較にＡＬＩＧＮとＡｌｉｇｎ０プログラムを使用する場合、ＢＬＯＳＵＭ５０置換マトリックスを使用し、ギャップの開き／延長のペナルティを－１２／－２にすることが望ましい。
アミノ酸配列のバリアントは、第1のポリペプチド及び／又は１又は複数の免疫刺激性化合物をコードするヌクレオチド配列に適切な変化を導入することによって、あるいはペプチド合成によって調製することができる。このような改変には、例えば、アミノ酸配列内の残基の欠失、及び／又は挿入、及び／又は置換が含まれる。アミノ酸配列及び配列同一性に関して本明細書で使用される置換／置換、欠失／欠失及び挿入／挿入という用語は、当業者には周知であり明らかである。欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせは、最終的なタンパク質が所望の特性を有することを条件として、最終的な第1のポリペプチド及び／又は１又は複数の免疫刺激性化合物に到達するためになされ得る。例えば、アミノ酸残基の欠失、挿入又は置換は、サイレントな変化を生じ、機能的に等価なポリペプチド／免疫刺激性化合物をもたらす可能性がある。
意図的なアミノ酸置換は、問題のタンパク質の所望の特性が保持される限り、極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び／又は残基の両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられ；正に荷電したアミノ酸としては、リジン及びアルギニンが挙げられ；そして同様の親水性値を有する非荷電極性頭部基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン及びチロシンが挙げられる。
本明細書では、保存的置換、すなわち塩基性から塩基性、酸性から酸性、極性から極性などのような同種の置換、及び非保存的置換、すなわち残基の1つのクラスから別のクラスへの置換、又はオルニチン、ジアミノ酪酸オルニチン、ノルロイシン、オルニチン、ピリルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン及びフェニルグリシンのような非天然アミノ酸の包含を伴う置換が包含される。実行されうる保存的置換は、例えば、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸、アスパラギン酸）、脂肪族アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン）、極性アミノ酸（グルタミン、アスパラギン、セリン、スレオニン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、ヒドロキシルアミノ酸（セリン、スレオニン）、大アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン）、及び小アミノ酸（グリシン、アラニン）の群の中で行われる。
非天然アミノ酸による置換も可能であり、置換残基としては、α＊及びα－二置換＊アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸＊、乳酸＊、天然アミノ酸のハロゲン化物誘導体、例えば、トリフルオロチロシン＊、ｐ－ＣＩ－フェニルアラニン＊、ｐ－Ｂｒ－フェニルアラニン＊、ｐ－Ｉ－フェニルアラニン＊、Ｌ－アリル－グリシン＊、β－アラニン＊、Ｌ－ａ－アミノ酪酸＊、Ｌ－ｙ－アミノ酪酸＊、Ｌ－ａ－アミノイソ酪酸＊、 Ｌ－ｅ－アミノカプロン酸＊、７－アミノヘプタン酸＊、Ｌ－メチオニンスルホン＊、Ｌ－ノルロイシン＊、Ｌ－ノルバリン＊、ｐ－ニトロ－Ｌ－フェニルアラニン＊、Ｌ－ヒドロキシプロリン＊、Ｌ－チオプロリン＊、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）のメチル誘導体、例えば、４－メチル－Ｐｈｅ＊、ペンタメチル－Ｐｈｅ＊、Ｌ－Ｐｈｅ（４－アミノ）＃、Ｌ－Ｔｙｒ（メチル）＊、Ｌ－Ｐｈｅ（４－イソプロピル）＊、Ｌ－Ｔｉｃ（ｌ，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸）＊、Ｌ－ジアミノプロピオン酸＊及びＬ－Ｐｈｅ（４－ベンジル）＊を含む。
上記の段落において、＊は置換残基の疎水性の性質を示し、＃は置換残基の親水性の性質を示し、＃＊は置換残基の両親媒性の性質を示す。バリアントアミノ酸配列は、グリシン又はβ－アラニン残基のようなアミノ酸スペーサーに加えて、メチル基、エチル基又はプロピル基のようなアルキル基を含む配列の任意の２つのアミノ酸残基の間に挿入され得る適切なスペーサー基を含み得る。更なるバリエーションとして、１又は複数のアミノ酸残基がペプトイドの形で存在する。
ポリペプチド及び多量体／二量体タンパク質
本発明のベクターは、上記のような第1のポリペプチドをコードする。このポリペプチド（及び１又は複数の免疫刺激性化合物）は、ベクターの対象への投与の結果としてインビボで発現される。
二量体化ユニットなどの多量化ユニットの存在により、ポリペプチドが発現されると多量体タンパク質が形成される。
多量体タンパク質は、ホモ多量体であってもヘテロ多量体であってもよく、例えば、タンパク質が二量体タンパク質である場合、二量体タンパク質はホモ二量体、すなわち、２つのポリペプチド鎖が同一であり、その結果、同一のユニット、したがって抗原配列を含む二量体タンパク質であってもよく、あるいは、二量体タンパク質は、２つのポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体であってもよく、ここで、ポリペプチド鎖１は、その抗原ユニットにおいて、ポリペプチド２とは異なる抗原配列を有する。後者は、抗原ユニットに含める抗原の数が抗原ユニットの上限サイズを超える場合に関連し得る。多量体タンパク質はホモ多量体タンパク質であることが好ましい。
ベクターと宿主細胞の生産
本発明のベクターは、一般に、宿主細胞をトランスフェクトし、ａ）第１の核酸配列によってコードされる第１のポリペプチドの発現とそのような第１のポリペプチドの複数から構成される多量体タンパク質の形成、及びｂ）さらなる核酸配列によってコードされる１又は複数の免疫刺激性化合物の発現をそれぞれ行うのに適したベクターである。
一実施態様では、本発明のベクターを含む宿主細胞は、細胞培養の細胞、例えば細菌細胞であり、ベクターによりコードされるタンパク質は、インビトロで発現される。別の実施形態では、本発明のベクターを含む宿主細胞は対象の細胞であり、ベクターによってコードされるタンパク質は、対象へのベクターの投与の結果として、前記対象、すなわちインビボで発現される。
インビトロトランスフェクションに適した宿主細胞は、原核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又は高等真核細胞を含む。インビボトランスフェクションに適した宿主細胞は、例えば筋肉細胞である。
一実施形態では、ベクターにより、上記の様々なユニット、特に個別化抗原ユニットの場合には抗原ユニットの交換が容易にできる。
一実施形態では、ベクターはｐＵＭＶＣ４ａベクター又はＮＴＣ９３８５Ｒベクターバックボーンを含むベクターである。抗原ユニットは、５’部位がＧＬＧＧＬ（配列番号８９）／ＧＬＳＧＬ（配列番号１４９）ユニットリンカーをコードするヌクレオチド配列に組み込まれ、３’部位がベクター中の停止コドンの後に含まれる、ＳｆｉＩ制限酵素カセットによって制限された抗原ユニットカセットと交換されてもよい。
本発明のベクター、例えばＤＮＡ及びＲＮＡプラスミド又はウイルスベクターのような発現ベクターの工学的及び生産方法はよく知られており、当業者はそのような既知の方法を用いて本発明のベクターを工学的／生産することができるであろう。さらに、様々な商業的製造業者がベクターの設計及び製造のためのサービスを提供している。
一態様では、本開示は、以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、1又は複数の抗原又はその一部を含む抗原ユニットとを含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）1又は複数の免疫刺激性化合物をコードする1又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターを製造する方法に関し、ここで、前記ベクターは、第１のポリペプチドと1又は複数の免疫刺激性化合物を別個の分子として共発現させることが可能であり、本方法は以下を含む：
ａ）インビトロで細胞をベクターでトランスフェクトする工程；
ｂ）前記細胞を培養する工程；
ｃ）任意に、細胞を溶解してベクターを細胞から遊離させる工程；そして
ｄ）ベクターを回収し、任意に精製する工程。
一実施形態では、１又は複数の抗原又はその一部は疾患関連抗原又はその一部である。
医薬組成物
本開示の一実施形態では、ベクター、例えばＤＮＡプラスミドは医薬品として使用される。
従って、本開示の一実施形態では、ベクターは、ベクター及び薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む医薬組成物中で提供される。
したがって、一態様では、本開示は、（ｉ）薬学的に許容される担体又は希釈剤と、（ｉｉ）以下；
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、１又は複数の抗原又はその一部を含む抗原ユニットとを含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）１つ又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターを含む医薬組成物に関し、ここで、前記ベクターは、第１のポリペプチドと１又は複数の免疫刺激性化合物とを別々の分子として共発現させることができる。
一実施形態では、１若しくは複数の抗原又はその一部は、疾患関連抗原又はその一部である。
適切な薬学的に許容される担体又は希釈剤としては、生理食塩水、ＰＢＳなどの緩衝生理食塩水、ブドウ糖、水、グリセロール、エタノール、等張水性緩衝液、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、薬学的に許容される担体又は希釈剤は、水性緩衝液である。別の実施形態では、水性緩衝液は、Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液、例えば、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（Ｈｅｐｅｓ）ｐＨ７．４、及び１０ｍＭグルコースを含むＴｙｒｏｄｅ緩衝液である。
医薬組成物は、宿主細胞のトランスフェクションを容易にする分子、すなわちトランスフェクション剤を含んでいてもよい。
いくつかの具体的な実施形態では、医薬組成物は、ポリ（エチレンオキシド）及びポリプロピレンオキシド）のブロックを含む薬学的に許容される両親媒性ブロックコポリマーを含む。
本明細書で使用する「両親媒性ブロックコポリマー」は、ポリ（エチレンオキシド）（「ＰＥＯ」）のブロック及びポリ（プロピレンオキシド）（「ＰＰＯ」）のブロックを含む、又はからなる直鎖状又は分岐状のコポリマーである。有用なＰＥＯ－ＰＰＯ両親媒性ブロックコポリマーの典型的な例は、一般構造ＰＥＯ－ＰＰＯ－ＰＥＯ（ポロキサマー）、ＰＰＯ ＰＥＯ ＰＰＯ、（ＰＥＯ ＰＰＯ－）４ＥＤ（ポロキサミン）、及び（ＰＰＯ ＰＥＯ－）４ＥＤ（逆ポロキサミン）を有し、ここで「ＥＤ」はエチレンジアミニル基である。
「ポロキサマー」とは、ポリ（エチレンオキシド）の１つのブロックとポリ（プロピレンオキシド）の１つのブロックとＰＥＯの１つのブロックとが結合した直鎖状の両親媒性ブロックコポリマー、すなわち、式ＥＯａ－ＰＯｂ－ＥＯａの構造であり、ここで、ＥＯはエチレンオキシド、ＰＯはプロピレンオキシド、ａは２～１３０の整数、ｂは１５～６７の整数である。ポロキサマーは慣例的に３桁の識別子で命名され、最初の２桁に１００を掛けたものがＰＰＯ含量のおおよその分子量を示し、最後の桁に１０を掛けたものがＰＥＯ含量のおおよその割合を示す。例えば、「ポロキサマー１８８」は、分子量約１８００（ｂが約３１のＰＰＯに相当）のＰＰＯブロックと約８０％（ｗ／ｗ）のＰＥＯ（ａが約８２に相当）を含むポリマーを指す。しかし、この値はある程度ばらつくことが知られており、製造者のデータシートによると、どちらもポロキサマー１８８である研究グレードのＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８や臨床グレードのＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ１８８などの市販製品は、分子量に大きなばらつきがあり（７，６８０～９，５１０）、これらの特定の製品について示されているａ及びｂの値は、それぞれ約７９及び２８である。これは、ブロックコポリマーの不均一な性質を反映しており、ａ及びｂの値が最終的な製剤で平均的に見られることを意味している。
「ポロキサミン」又は「逐次ポロキサミン」（Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標）の商品名で市販されている）は、ＰＥＯ－ＰＰＯアームに構成される遊離ＯＨ基とエチレンジアミン部分の一級アミン基との間の結合を介して中央のエチレンジアミン部分に連結された４本のＰＥＯ－ＰＰＯアームを有するＸ字型ブロックコポリマーである。逆ポロキサミンも同様に、ＰＰＯ－ＰＥＯアームに構成される遊離ＯＨ基とエチレンジアミン中の第一級アミン基との間の結合を介して中央のエチレンジアミン部分に連結された４本のＰＰＯ－ＰＥＯアームを有するＸ－形状のブロックコポリマーである。
好ましい両親媒性ブロックコポリマーは、ポロキサマー又はポロキサミンである。ポロキサマー４０７及び１８８、特にポロキサマー１８８が好ましい。好ましいポロキサミンは、式（ＰＥＯ－ＰＰＯ）４－ＥＤの逐次ポロキサミンである。特に好ましいポロキサミンは、それぞれＴｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標）９０４、７０４及び３０４で販売されているものである。これらのポロキサミンの特徴は以下の通りである：Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標）９０４は、６７００の総平均分子量、４０２０のＰＰＯ単位の総平均重量、及び約４０％のＰＥＯ割合を有する。Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標）７０４の総平均分子量は５５００、ＰＰＯ単位の総平均重量は３３００、ＰＥＯの割合は約４０％であり、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標）３０４の総平均分子量は１６５０、ＰＰＯ単位の総平均重量は９９０、ＰＥＯの割合は約４０％である。
一実施形態では、医薬組成物は、０．２％ｗ／ｖ～２０％ｗ／ｖ、例えば０．２％ｗ／ｖ～１８％ｗ／ｖ、０．２％ｗ／ｖ～１６％ｗ／ｖ、０．２％ｗ／ｖ～１４％ｗ／ｖ、０．２％ｗ／ｖ～１２％ｗ／ｖ、０．２％ｗ／ｖ～１０％ｗ／ｖ、０．２％ｗ／ｖ～８％ｗ／ｖ、０．２％ｗ／ｖ～６％ｗ／ｖ、０．２％ｗ／ｖ～４％ｗ／ｖ、０．４％ｗ／ｖ～１８％ｗ／ｖ、０．６％ｗ／ｖ～１８％ｗ／ｖ、０．８％ｗ／ｖ～１８％ｗ／ｖ、１％ｗ／ｖ～１８％ｗ／ｖ、２％ｗ／ｖ～１８％ｗ／ｖ、１％ｗ／ｖ～５％ｗ／ｖ、又は２％ｗ／ｖ～４％ｗ／ｖの量で、両親媒性ブロックコポリマーを含む。０．５％ｗ／ｖから５％ｗ／ｖの範囲の量が特に好ましい。別の実施形態では、医薬組成物は両親媒性ブロックコポリマーを２％ｗ／ｖ～５％ｗ／ｖ、例えば約３％ｗ／ｖの量で含む。
医薬組成物は、対象への投与に適した任意の方法で製剤化することができ、例えば、注射用の液体製剤、例えば、皮内注射用又は筋肉内注射用などである。
医薬組成物は、対象への投与に適した任意の方法で投与することができ、例えば、皮内、筋肉内、又は皮下注射による投与、あるいは鼻腔内又は経口などの粘膜又は上皮適用による投与である。
好ましい実施形態では、医薬組成物は、筋肉内注射又は皮内注射により投与される。
医薬組成物中のベクター、例えばＤＮＡプラスミドの量は、医薬組成物が予防的治療のために投与されるか治療的治療のために投与されるかに応じて変化し得る。
本発明の医薬組成物は、典型的には、０．１～１０ｍｇ、例えば約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９もしくは１ｍｇ、又は例えば２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０ｍｇの範囲のベクター、例えばＤＮＡプラスミドを含む。
好ましい実施形態では、医薬組成物は無菌医薬組成物である。
治療
本開示のいくつかの態様では、ベクター、例えばＤＮＡプラスミドは、ヒトにおける障害などの障害の治療的又は予防的治療に使用するためのものである。
したがって、一態様では、本開示は、疾患を有するか又は前記疾患の予防を必要とする対象を治療する方法に関し、前記方法は、以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的化するターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、前記疾患に関連する１又は複数の抗原又はその一部を含む抗原ユニットとを含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターを対象に投与することを含み、ここで、前記ベクターは、第１のポリペプチドと１又は複数の免疫刺激性化合物とを別個の分子として共発現させることができる。
治療方法において、ベクターは、好ましくは、治療上有効な量又は予防上有効な量で投与される。このような量のベクターは、１回の投与、すなわち１回投与で、又は数回の投与、すなわち反復投与で、例えば数日、数週間又は数ヶ月にわたる一連の投与で投与されてもよい。
実際に投与される量は、治療が予防的治療であるか治療的治療であるか、対象の年齢、体重、性別、病歴、既往症、全身状態、治療される疾患の重症度、及び医療専門家の判断によって異なり、変動する可能性がある。
治療方法において、ベクターは、本明細書に記載の医薬組成物の形態及び投与様式で投与されてもよい。
本発明による治療方法は、患者のケアを監督する臨床医がその方法が有効であり、治療が必要であると判断する限り、続けることができる。
本開示の１つの実施形態では、ベクター、例えばＤＮＡプラスミドは、癌の治療における使用のためのものである。このようなベクター及びこのようなベクターの抗原ユニット、個別化及び非個別化第１ポリペプチドの抗原ユニット及びその種々の実施形態を含むは、本明細書において詳細に記載されている。
したがって、一実施形態では、本開示は、癌を有する対象を治療する方法に関し、前記方法は、以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、1又は複数の癌抗原又はその一部を含む抗原ユニットとを含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターを前記対象に投与することを含み、ここで、前記ベクターは、第１のポリペプチドと１又は複数の免疫刺激性化合物とを別々の分子として共発現させることができる。
がんは固形がんであっても液状がんであってもよい。固形がんの例は、例えば腫瘍のような固形の塊を形成するがんである。液状がんの例は、リンパ腫や血液がんなど、体液中に存在するがんである。
本開示の１つの実施形態では、ベクター、例えば、ＤＮＡプラスミドは、乳癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、骨癌、結腸直腸癌、胃癌、リンパ腫、悪性黒色腫、肝臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、甲状腺癌、腎臓癌、胆管癌、脳腫瘍、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、ホジキン病及び副腎皮質癌からなる群より選択される癌の治療における使用のためのものである。
本開示の別の実施形態では、ベクター、例えばＤＮＡプラスミドは、感染症の治療に使用するためのものである。このようなベクター及びこのようなベクターの抗原ユニットは、本明細書中に詳細に記載されている。
したがって、一実施形態では、本開示は、感染症を有するか又は感染症の予防を必要とする対象を処置する方法に関し、前記方法は、以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、前記感染症に関連する１又は複数の抗原又はその一部を含む抗原ユニットとを含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターを対象に投与することを含み、ここで、前記ベクターは、第１のポリペプチドと１又は複数の免疫刺激性化合物とを別々の分子として共発現させることができる。
感染症に関連する抗原又はその一部、例えば病原体に由来する抗原又はその一部について、本明細書で詳述されている。
以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、疾患に関連する1又は複数の抗原又はその一部を含む抗原ユニットとを含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）1又は複数の免疫刺激性化合物をコードする1又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターが、本明細書において開示され、ここで、前記ベクターは、前記疾患を有するか又は前記疾患の予防を必要とする対象の治療に使用するための別個の分子として、前記第１のポリペプチド及び前記1又は複数の免疫刺激性化合物の共発現を可能にし、ここで、前記ベクターは、前記対象に投与される。
以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、1又は複数の癌抗原又はその一部を含む抗原ユニットとを含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）1又は複数の免疫刺激性化合物をコードする1又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターが、本明細書において開示され、ここで、前記ベクターは、癌を有する対象の治療に使用するために、第１のポリペプチド及び1又は複数の免疫刺激性化合物を別個の分子として共発現させることができ、ここで、前記ベクターは、前記対象に投与される。
以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、感染症に関連する１又は複数の抗原又はその一部を含む抗原ユニットとを含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターが、本明細書において開示され、ここで、前記ベクターは、前記感染症を有するか又は前記感染症の予防を必要とする対象の治療に使用するために、前記第１のポリペプチド及び１又は複数の免疫刺激性化合物を別個の分子として共発現させることができ、前記ベクターは、前記対象に投与される。
以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、疾患に関連する１又は複数の抗原又はその一部を含む抗原ユニットとを含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターが、本明細書において開示され、ここで、前記ベクターは、前記疾患を有するか又は前記疾患の予防の必要性がある対象の治療に使用するための医薬の製造のために、前記対象に前記医薬が投与される、別個の分子としての第１のポリペプチド及び１又は複数の免疫刺激性化合物の共発現を可能にする。
以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、１又は複数の癌抗原又はその一部を含む抗原ユニットとを含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターの使用が、また本明細書において開示され、ここで、前記ベクターは、癌を有する対象の治療に使用するための医薬の製造のために、別個の分子としての第１のポリペプチド及び１又は複数の免疫刺激性化合物の共発現を可能にし、前記医薬が前記対象に投与される。
以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、感染症に関連する１又は複数の抗原又はその一部を含む抗原ユニットとを含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターの使用が、また本明細書において開示され、ここで、前記ベクターは、前記感染症を有するか又は前記感染症の予防を必要とする対象の治療に使用する医薬の製造のために、前記第１のポリペプチド及び１又は複数の免疫刺激性化合物を別個の分子として共発現させることができ、前記医薬は前記対象に投与される。
以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、疾患に関連する１又は複数の抗原又はその一部を含む抗原ユニットとを含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターの使用が、また本明細書において開示され、
ここで、前記ベクターは、前記疾患を有するか又は前記疾患の予防を必要とする対象を治療するために、第１のポリペプチド及び１又は複数の免疫刺激性化合物を別個の分子として共発現させることを可能にする。
以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、１又は複数の癌抗原又はその一部を含む抗原ユニットとを含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターの使用が、また本明細書において開示され、ここで、前記ベクターは、癌を有する対象を治療するために、第１のポリペプチドと１又は複数の免疫刺激性化合物とを別個の分子として共発現させることを可能にする。
以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、感染症に関連する１又は複数の抗原又はその一部を含む抗原ユニットとを含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターの使用が、また本明細書において開示され、ここで、前記ベクターは、前記感染症を有するか又は前記感染症の予防を必要とする対象を治療するために、第１のポリペプチド及び１又は複数の免疫刺激性化合物を別個の分子として共発現させることを可能にする。
以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドが、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、疾患に関連する１又は複数の抗原又はその一部を含む抗原ユニットとを含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターが本明細書において開示され、ここで、前記ベクターは、前記疾患の治療的又は予防的処置において使用される場合、第１のポリペプチドと１又は複数の免疫刺激性化合物とを別個の分子として共発現させることを可能にする。
以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドが、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、１又は複数の癌抗原又はその一部を含む抗原ユニットとを含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターが本明細書において開示され、ここで、前記ベクターは、癌の治療に使用される場合、第１のポリペプチドと１又は複数の免疫刺激性化合物とを別個の分子として共発現させることを可能にする。
以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、感染症に関連する１又は複数の抗原又はその一部を含む抗原ユニットとを含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターが本明細書において開示され、ここで、前記ベクターは、前記感染症の治療的又は予防的処置において使用される場合、第１のポリペプチドと１又は複数の免疫刺激性化合物とを別個の分子として共発現させることを可能にする。
以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、疾患に関連する１又は複数の抗原又はその一部を含む抗原ユニットとを含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターの使用が、また本明細書において開示され、ここで、前記ベクターは、前記疾患の治療的又は予防的処置のために、第１のポリペプチド及び１又は複数の免疫刺激性化合物を別個の分子として共発現させることを可能にする。
以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドが、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、１又は複数の癌抗原又はその一部を含む抗原ユニットとを含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターの使用が、また本明細書において開示され、ここで、ベクターは、癌の治療のために、第１のポリペプチドと１又は複数の免疫刺激性化合物とを別々の分子として共発現させることを可能にする。
以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、感染症に関連する１又は複数の抗原又はその一部を含む抗原ユニットとを含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターの使用が、また本明細書において開示され、ここで、前記ベクターは、前記感染症の治療的又は予防的処置のために、第１のポリペプチド及び１又は複数の免疫刺激性化合物を別個の分子として共発現させることを可能にする。
また、本明細書において開示されるのは、前記疾患を有するか又は前記疾患の予防を必要とする対象に、以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドが、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、前記疾患に関連する１又は複数の抗原又はその一部を含む抗原ユニットとを含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターを投与することによる、前記疾患を有するか又は前記疾患の予防を必要とする対象における疾患の治療又は予防のための医薬であり、ここで、前記ベクターは、第１のポリペプチド及び１又は複数の免疫刺激性化合物を別個の分子として共発現させることを可能にする。
また、本明細書において開示されるのは、癌を有する対象に、以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、１又は複数の癌抗原又はその一部を含む抗原ユニットとを含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターを投与することによる、癌を有する対象における癌の治療のための医薬であり、ここで、前記ベクターは、第１のポリペプチドと１又は複数の免疫刺激性化合物とを別々の分子として共発現させることができる。
また、本明細書において開示されるのは、前記疾患を有するか又は前記疾患の予防の必要性がある対象において、前記疾患を有するか又は前記疾患の予防の必要性がある対象に、以下：
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドが、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、前記疾患に関連する１又は複数の抗原又はその一部を含む抗原ユニットとを含む、第１の核酸配列；及び
（ｂ）１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列を含むベクターを投与することによる、感染性疾患の治療又は予防のための医薬であり、ここで、前記ベクターは、第１のポリペプチド及び１又は複数の免疫刺激性化合物を別個の分子として共発現させることを可能にする。
前述の書面による説明は、当業者が本発明を実施するのに十分であると考えられる。以下の実施例は、例示のみを目的として提供されるものであり、本発明の範囲を何ら限定することを意図するものではない。実際、本明細書に示され記載されたものに加えて、本発明の様々な変更が、前述の説明から当業者に明らかになり、添付の特許請求の範囲に属する。
実施例１：
本明細書に記載の第１のポリペプチドと１又は複数の免疫刺激性化合物を別々の分子として共発現させることができる様々なDNAプラスミドを設計した。
すべてのDNAプラスミド、VB4194、VB4168、VB4169及びVB4170は、以下の表4に示すエレメント／ユニットをコードする核酸配列を含む：
DNAプラスミドはさらに、以下の表5に示すエレメント／ユニットをコードする核酸配列を含む：
以下では、“ｍ”、“マウス（ｍｕｒｉｎｅ）”及び“マウス（ｍｏｕｓｅ）”は互換的に使用され、“ｈ”及びヒトは互換的に使用される。
変異を有する８つのエピトープを含むＤＮＡプラスミドＶＢ４１９４、ＶＢ４１６８、ＶＢ４１６９及びＶＢ４１７０：
マウス大腸癌細胞株ＣＴ２６のエクソームシークエンシングとＲＮＡシークエンシングにより、数百から数千の腫瘍特異的非同義変異が明らかになった。インシリコ法を用いて、潜在的な免疫原性配列、すなわち変異を有するエピトープを同定し、そのうちの８つ（表６）を、上記のＤＮＡプラスミドによってコードされる第１のポリペプチドの抗原ユニットに含めるために選択した。前記抗原ユニット中のエピトープは、グリシン－セリンリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ、配列番号１７）によって分離されている、すなわち、末端エピトープを除くすべてのエピトープはサブユニットに配置されており、各サブユニットは１つのエピトープと１つのＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１７）リンカーを含む。
これらのＤＮＡプラスミドの各々は、個別化された第１のポリペプチドをコードする本発明によるＤＮＡプラスミドのモデル、すなわち、いくつかの患者特異的エピトープ、例えば、いくつかのネオエピトープ及び／又はいくつかの患者提示共有がんエピトープを含む抗原ユニットを含むものであり、患者提示共有がん抗原が変異した患者提示共有がん抗原であるもの、又は非個別化第１のポリペプチドをコードする本発明によるＤＮＡプラスミドのモデル、すなわち複数の共有がんエピトープを含む抗原ユニットを含み、共有がん抗原が変異した共有がん抗原であるものである。
ＤＮＡプラスミドＶＢ４１６８、ＶＢ４１６９及びＶＢ４１７０は、別個の分子として、上記及び表４及び５に記載の第１のポリペプチドと、以下の免疫刺激性化合物との共発現を可能にする（ｈ＝ヒト；ｍ＝マウス）：
－ＶＢ４１９４：第１ポリペプチド（ＶＢ４１６８、ＶＢ４１６９及びＶＢ４１７０と同じ第１ポリペプチド）のみをコードし、免疫刺激性化合物はコードせず、比較として機能する
－ＶＢ４１６８：ｈＦＬＴ３Ｌ
－ＶＢ４１６９：ｈＦＬＴＬ３及びｍＧＭ－ＣＳＦ
－ＶＢ４１７０：ｈＦＬＴＬ３、ｍＧＭ－ＣＳＦ及びｍＣＣＬ５

ＤＮＡプラスミドの生産
実施例に開示されたすべてのＤＮＡプラスミドの抗原ユニット、共発現エレメント及び免疫刺激性化合物の配列は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂ．Ｖ．、オランダ）に注文し、発現ベクターｐＵＭＶＣ４ａ；上記表４に記載されたシグナルペプチド、ターゲティングユニット、二量体化ユニット及びユニットリンカーをコードするヌクレオチド配列を含むマスタープラスミドにクローニングした。
ＤＮＡプラスミドがコードするタンパク質の発現と分泌の評価
ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ）を上記のＤＮＡプラスミドで一過性にトランスフェクションした。簡単に説明すると、２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルを１０％ＦＢＳ増殖培地を用いた２４ウェル組織培養プレートにプレーティングし、リポフェクタミン（登録商標）２０００試薬を用いて、製造元（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から提示された条件下で、それぞれのＤＮＡプラスミドを１μｇトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞は、３７℃、５％ＣＯ２で５日間維持した後、マウス抗ヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメイン抗体（キャプチャー抗体、１００μｌ／ウェル、１μｇ／ｍｌ、ＭＣＡ８７８Ｇ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）とヤギ抗ヒトＭＩＰ－１α抗体（ビオチン化検出抗体、１００μｌ／ウェル、０．２μｇ／ｍｌ、ＢＡＦ２７０、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）（図５）を用いた上清のサンドイッチＥＬＩＳＡによる、プラスドによりコードされるタンパク質の発現及び分泌の特徴づけのために細胞上清を回収した。コードされた免疫刺激性化合物ＦＬＴ３ＬとＧＭ－ＣＳＦの発現と分泌は、マウス抗ヒトＦＬＴ３Ｌ抗体（キャプチャー抗体、１００μｌ／ウェル、０．５μｇ／ｍｌ、ＭＡＢ６０８、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）とマウス抗ヒトＦＬＴ３Ｌ抗体（ビオチン化検出抗体、１００μｌ／ウェル、０．１μｇ／ｍｌ，ＢＡＦ３０８，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（図６）とラット抗マウスＧＭ－ＣＳＦ抗体（キャプチャー抗体，１００μｌ／ウェル，１．０μｇ／ｍｌマウスＧＭ－ＣＳＦ抗体，ＭＡＢ４１５， Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とヤギ抗マウスＧＭ－ＣＳＦ抗体（ビオチン化検出抗体，１００μｌ／ウェル，０．２μｇ／ｍｌ，ＢＡＭ２１５，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（図７）をそれぞれ用いたサンドイッチＥＬＡＳＡにより測定した。コードされた免疫刺激性化合物ＣＣＬ５の発現と分泌は、ラット抗マウスＣＣＬ５（キャプチャー抗体、１００μｌ／ウェル、１．０μｇ／ｍｌ、ＭＡＢ４７８１、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とヤギ抗マウスＣＣＬ５（ビオチン化検出抗体、１００μｌ／ウェル、０．２μｇ／ｍｌ、ＢＡＦ４７８、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡで測定した（図８）。
図５に示した結果は、ＶＢ４１６８、ＶＢ４１６９、及びＶＢ４１７０にコードされる、ターゲッティングユニット、二量体化ユニット、及び抗原ユニットを含む第１のポリペプチド／二量体タンパク質は、比較例のＶＢ４１９４と同程度のレベルで、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から発現及び分泌されたことを示している。第２のタンパク質としてＶＢ４１６８、ＶＢ４１６９、ＶＢ４１７０にコードされるＦＬＴ３Ｌは、図６に示すように、３つのＤＮＡプラスミドすべてから高レベルで発現・分泌される。さらに、ＶＢ４１６９とＶＢ４１７０の３番目のタンパク質としてコードされるＧＭ－ＣＳＦも、図７に示すように高レベルで発現・分泌される。ＶＢ４１７０の４番目のタンパク質としてコードされるＣＣＬ５は、図８に示すように高レベルで発現・分泌される。
実施例２：
ＤＮＡプラスミドＶＢ４１９４、ＶＢ４１６８及びＶＢ４１６９の免疫原性の評価
ＤＮＡプラスミドＶＢ４１９４（比較）、ＶＢ４１６８及びＶＢ４１６９の免疫原性を、このようなプラスミドを投与したマウスにおいて惹起されたＴ細胞免疫応答を測定する方法によって決定した。ネガティブコントロールとして、配列番号１の１～２３７のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＶＢ１０２６を含めた。このＤＮＡプラスミドはＶＢ４１９４と同一であるが、ユニットリンカーも抗原ユニットも含んでいない。
マウスを用いたすべての実験では、以下の研究デザインを適用した：
メスの６週齢マウスをＪａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ（フランス）から入手した。すべての動物はラジウム病院（Ｒａｄｉｕｍ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）（オスロ、ノルウェー）の動物施設で飼育された。すべての動物プロトコールはノルウェー食品安全庁（ノルウェー、オスロ）の承認を得た。抗原ユニットを含むコンストラクトの試験には５匹／群を用い、ネガティブコントロールには３匹／群を用いた。
６μｇのＤＮＡプラスミドをＢＡＬＢ／ｃマウスに１回筋肉内投与した後、エレクトロポレーションを行った。投与１０日後に脾臓を採取し、セルストレーナーでつぶして単細胞懸濁液を得た。試験した各プラスミドについて、単一細胞懸濁液の一部を用いて、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）抗ＣＤ４ビーズを用いてＣＤ４＋ Ｔ細胞を枯渇させた。全脾臓細胞及びＣＤ４＋枯渇脾臓細胞を、製造元のプロトコール（Ｍａｂｔｅｃｈ）に従って、ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイでＩＮＦ－γ及びＴＮＦ－αの産生について試験した。
表６に示したＶＢ４１９４、ＶＢ４１６８及びＶＢ４１６９に含まれる８つのエピトープと同じ配列を有するペプチド（下記表７）を用いて、これらのプラスミドを投与したマウスから採取した脾臓細胞を再刺激した：
ＤＮＡプラスミドＶＢ４１９４、ＶＢ４１６８及びＶＢ４１６９を、表７のペプチドに対するＴ細胞免疫応答を誘発する能力について比較した。ＶＢ１０２６はネガティブコントロールとして加えた。
図９－１４に示すように、ネガティブコントロールＶＢ１０２６を投与したマウスは、表７のペプチドに対して低い基礎免疫原性を示した。
ＶＢ４１９４は８つのエピトープすべてに対してＴ細胞応答を誘導した。ＶＢ４１６８は、ＶＢ４１９４と同じ第１ポリペプチドをコードし、さらにＦＬＴ３Ｌをコードしており、ＶＢ４１９４よりも強いＴ細胞応答を誘導した（図９－１１）。ＶＢ４１６９がコードする８つのエピトープを含む第１ポリペプチドの発現に加えて、ＦＬＴ３ＬとＧＭ－ＣＳＦという２つの免疫刺激性化合物を共発現させると、ＶＢ４１９４やＶＢ４１６８に比べてさらに強い免疫応答が誘導された（図９～１１）。ＩＦＮ－γのみを分泌するＴ細胞数（図９）、ＴＮＦ－αのみを分泌するＴ細胞数（図１０）、及びＩＮＦ－γ＋ＴＮＦ－α共分泌細胞数（図１１）はすべて、ＶＢ４１９４からＶＢ４１６８へ、及びＶＢ４１６８からＶＢ４１６９へ増加した。同様に、ＩＦＮ－γのみを分泌するＣＤ８＋ Ｔ細胞（ＣＤ４＋ Ｔ細胞枯渇サンプル）の数（図１２）、ＴＮＦ－αのみを分泌するＣＤ８＋ Ｔ細胞の数（図１３）、及びＩＦＮ－γ＋ＴＮＦ－α共分泌細胞の数（図１４）はすべて、ＶＢ４１９４からＶＢ４１６８へ、及びＶＢ４１６８からＶＢ４１６９へ増加した。
これらの結果は、前記プラスミドから別個の分子として共発現される第１のポリペプチドと１又は複数の免疫刺激性化合物とをコードする本発明によるＤＮＡプラスミドが、第１のポリペプチドのみをコードするＤＮＡプラスミドと比較して、第１のポリペプチドに含まれる抗原に対する抗原特異的免疫応答を高めることができることを示している。
実施例３：
ＤＮＡプラスミドＶＢ４２０２を、表４に列挙したエレメント／ユニットをコードする核酸配列を含み、そして、さらに以下の表８に列挙したエレメントをコードする核酸配列を含むように設計し、そして作製した：
ＶＢ４２０２がコードするタンパク質の発現と分泌の評価
ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ）を、実施例１に記載したように、上記のＤＮＡプラスミドで一過性にトランスフェクトした。分泌された第一ポリペプチド／二量体タンパク質は、マウス抗ヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメイン抗体（キャプチャー抗体、１００μｌ／ウェル、１μｇ／ｍｌ、ＭＣＡ８７８Ｇ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）及びヤギ抗ヒトＭＩＰ－１α抗体（ビオチン化検出抗体、１００μｌ／ウェル、０．２μｇ／ｍｌ、ＢＡＦ２７０、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた上清のサンドイッチＥＬＩＳＡで特徴づけた（図１５）。コードされた免疫刺激性化合物ＧＭ－ＣＳＦの分泌は、ラット抗マウスＧＭ－ＣＳＦ（キャプチャー抗体、１００μｌ／ウェル、１．０μｇ／ｍｌマウスＧＭ－ＣＳＦ抗体、ＭＡＢ４１５、Ｒ＆Ｄシステムズ）及びヤギ抗マウスＧＭ－ＣＳＦ（ビオチン化検出抗体、１００μｌ／ウェル、０．２μｇ／ｍｌ、ＢＡＭ２１５、Ｒ＆Ｄシステムズ）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより、１：１０００に希釈した上清中で測定した（図１６）。
図１５に示す結果は、ＶＢ４２０２にコードされるターゲティングユニット、二量体化ユニット、及び抗原ユニットを含む第１のポリペプチド／二量体タンパク質が、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から発現及び分泌されたことを示している。ＶＢ４２０２の第二のタンパク質としてコードされるＧＭ－ＣＳＦは、図１６に示すように高レベルで発現・分泌された。
ＤＮＡプラスミドＶＢ４１９４及びＶＢ４２０２の免疫原性の評価
ＤＮＡプラスミドＶＢ４１９４（比較）、ＶＢ１０２６（ネガティブコントロール）及びＶＢ４２０２の免疫原性を、実施例２に記載したようにＢＡＬＢ／ｃマウスで測定した。
図１７に示すように、ＶＢ１０２６投与に対するＩＦＮ－γ産生は検出されなかった。ＶＢ４１９４は、８つのエピトープすべてに対してＴ細胞応答を誘導した。ＶＢ４１９４と同じ第１ポリペプチドをコードし、さらにＧＭ－ＣＳＦをコードするＶＢ４２０２は、ＩＦＮ－γ ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔで分析したＶＢ４１９４よりもさらに強いＴ細胞応答を誘導した。
フローサイトメトリー評価
マルチフローサイトメトリーを用いて、ＶＢ１０２６、ＶＢ４１９４、ＶＢ４２０２を投与したマウスのＡＰＣ／樹状細胞流入を単一細胞レベルで評価した。メス、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスをＪａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ（フランス）から入手した。すべての動物はオスロ大学の動物施設で飼育された。すべての動物プロトコールはノルウェー食品安全庁（ノルウェー、オスロ）の承認を得た。ＶＢ１０２６、ＶＢ４２０２及びＶＢ４１９４を比較するために、１群につき６匹のマウスを使用した。処理しなかった６匹のマウス群をさらにコントロールとして用いた。各ＤＮＡプラスミド６μｇを前脛骨筋に筋肉内投与し、その後エレクトロポレーションを行った。無処置群にはＤＮＡプラスミドもエレクトロポレーションも行わなかった。前脛骨筋を、無菌条件下で、投与後１、２、４日後又は無処置群に抽出した。単細胞懸濁液を得るために、まず筋肉をはさみを用いて機械的に解離し、次に酵素的に消化した。酵素消化では、解離した筋肉を消化培地（ＤＭＥＭ、コラゲナーゼＡ ［２ｍｇ／ｍｌ］、ＤＮａｓｅ ［５０Ｕ／ｍｌ］）中で、攪拌磁石を用い、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、単一細胞懸濁液を７０μｍのフィルターで濾過し、ＰＢＳ中、４００×ｇ、４℃、６分間で２回洗浄した。
フローサイトメトリー解析のために、まず単一細胞懸濁液を死細胞標識試薬（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅ）（ｅＦｌｕｏｒ ７８０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に室温（ＲＴ）で１０分間インキュベートした。死細胞標識試薬をＰＢＳで洗い流した（４００ ｘ ｇで６分間、４℃で２回遠心）。その後、細胞をＦｃブロックとともに室温で１０分間インキュベートし、蛍光抗体の非特異的結合をブロックした。ブロッキング工程の後、細胞を表面マーカー特異的抗体プール（下記表９）で氷上で３０分間染色した。染色した細胞をＢＤ ＦＡＣＳｙｍｐｈｏｎｙ Ａ５フローサイトメーターで測定した。フローサイトメトリーデータはＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて解析した。図１８の説明に記載されているように、樹状細胞（ＤＣ）／ＡＰＣを定義するためにゲーティング戦略が用いられた。
その結果、ＶＢ４１９４を投与したマウスの筋肉に比べ、ＶＢ４２０２を投与したマウスの筋肉への免疫細胞（ＣＤ４５＋細胞）の流入が増加した（図１９）。
筋肉中に存在するＣＤ４５＋細胞集団中のＤＣの割合は、ＶＢ４２０２を投与されたマウスでは、ＶＢ４１９４を投与されたマウスに比べて高かった（図２０）。さらに、ｃＤＣ１集団（図２１）とｍｏＤＣ集団（図２２）はともに、ＶＢ４２０２を投与されたマウスの筋肉では、ＶＢ４１９４を投与されたマウスに比べて増加していた。
要約すると、これらの結果は、別個の分子としてプラスミドから共発現される第１のポリペプチドと１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする本発明に関するDNAプラスミドは、筋肉内投与された場合に、投与場所への樹状細胞の流入を促進でき、最終的に、前記第１のポリペプチドのみをコードするＤＮＡプラスミドと比較して、第１のポリペプチド中に含まれる抗原に対する抗原特異的免疫応答の増大にさらに寄与し得ることを示す。
実施例４：
以下のDNAプラスミドを設計し、そして、作製した：
すべてのDNAプラスミド、VB1020、VB4195、VB4196は、表4に列挙したエレメント／ユニットをコードする核酸配列を含み、かつ、さらに以下の表10に列挙したエレメント／ユニットをコードする核酸配列を含む：
ＤＮＡプラスミドＶＢ１０２０、ＶＢ４１９５及びＶＢ４１９６は、ヒトパピローマウイルス１６（ＨＰＶ１６）抗原Ｅ７及びＥ６を含む抗原ユニットを含む第１のポリペプチドをコードする核酸配列を含む。
これらのＤＮＡプラスミドの各々は、癌の治療に使用するための非個別化第１のポリペプチドをコードする本発明によるＤＮＡプラスミドのモデルであり、すなわち、複数の共有癌抗原を含む抗原ユニットを含むものであり、前記共有癌抗原はウイルス共有癌抗原（ここでは、ある種の癌の原因となるＨＰＶ１６由来の抗原）であり、又は感染症の治療に使用するための第１のポリペプチドをコードする本発明によるＤＮＡプラスミドのモデル、すなわち、病原体由来の抗原（ここでは、ＨＰＶ１６由来の抗原）を含む抗原ユニットを含むものである。
ＤＮＡプラスミドＶＢ４１９５及びＶＢ４１９６は、別個の分子として、上記の第１のポリペプチド及び以下の免疫刺激性化合物の共発現を可能にする：
－ＶＢ１０２０：第１のポリペプチドのみをコードし、免疫刺激性化合物はコードせず、比較の役割を果たす。
－ＶＢ４１９５：ｈＦＬＴ３Ｌ
－ＶＢ４１６９：ｈＦＬＴＬ３及びｍＧＭ－ＣＳＦ
ＤＮＡプラスミドがコードするタンパク質の発現と分泌の評価
ＨＥＫ２９３細胞をＡＴＣＣから入手し、実施例１に記載したようにＶＢ１０２０（比較）、ＶＢ４１９５又はＶＢ４１９６で一過性にトランスフェクトした。
ＤＮＡプラスミドによってコードされた分泌タンパク質は、マウス抗ヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメイン抗体（キャプチャー抗体、１００μｌ／ウェル、１μｇ／ｍｌ、ＭＣＡ８７８Ｇ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）とヤギ抗ヒトＭＩＰ－１α抗体（ビオチン化検出抗体、１００μｌ／ウェル、０．２μｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＢＡＦ２７０）を用いた上清のサンドイッチＥＬＩＳＡで特徴付けた。
ＶＢ４１９５及びＶＢ４１９６の２番目のタンパク質としてコードされているＦＬＴ３Ｌの細胞培養上清（１：５００希釈）中の分泌量は、マウス抗ヒトＦＬＴ３Ｌ抗体（キャプチャー抗体、１００μｌ／ウェル，０．５μｇ／ｍｌ，ＭＡＢ６０８，Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）とマウス抗ヒトＦＬＴ３Ｌ抗体（ビオチン化検出抗体、１００μｌ／ウェル，０．１μｇ／ｍｌ，ＢＡＦ３０８，Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法で測定した。ＶＢ４１９６の３番目のタンパク質としてコードされている細胞培養上清中のＧＭ－ＣＳＦの分泌（１：５００希釈）は、ラット抗マウスＧＭ－ＣＳＦ（キャプチャー抗体、１００μｌ／ウェル、１．０μｇ／ｍｌマウスＧＭ－ＣＳＦ抗体、ＭＡＢ４１５、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）とヤギ抗マウスＧＭ－ＣＳＦ（ビオチン化検出抗体、１００μｌ／ウェル、０．２μｇ／ｍｌ、ＢＡＭ２１５、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。
図２３に示した結果は、ＶＢ４１９５及びＶＢ４１９６にコードされる、ターゲティングユニットと、二量体化ユニットと、抗原ユニットとを含む第１のポリペプチド／二量体タンパク質が、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から良好に発現及び分泌されたことを示している。第二のタンパク質としてＶＢ４１９５とＶＢ４１９６にコードされるＦＬＴ３Ｌは、図２４に示すように、両方のプラスミドから高レベルで発現及び分泌される。さらに、ＶＢ４１９６の３番目のタンパク質としてコードされるＧＭ－ＣＳＦも、図２５に示すように高レベルで発現及び分泌される。
ＶＢ４１９５とＶＢ４１９６から発現したインタクトタンパク質の特性評価
トランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の上清サンプルを用いてウェスタンブロット解析を行い、ＶＢ４１９５とＶＢ４１９６がコードするタンパク質をさらに特徴づけた。ＶＢ４１９５及びＶＢ４１９６と同一の第１のポリペプチドをコードするＶＢ１０２０を比較対象として含めた。
簡単に説明すると、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（３ｘ１０６ 細胞／ｍｌ、１．６ ｍｌ）を６ウェル培養プレートに播種した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．社製）を用いて１μｇ／ｍｌのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトし、プレートを加湿ＣＯ２セルインキュベーター（８％ＣＯ２、３７℃）内のオービタルシェーカー（直径１９ｍｍ、１２５ｒｐｍ）でインキュベートした。１８時間培養後、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．）を各ウェルに添加した。プレートをさらに２８時間インキュベートした後、上清を回収した。トランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の上清７０μｌを、２５μｌの４ｘ Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、５μｌのＤＴＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．）、又は５μｌの超純水と混合し、還元条件及び非還元条件のそれぞれに対して、サンプルを調製した。さらに、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ上清を６４μｌのサンプルと１６μｌのＰＮＧａｓｅ Ｆバッファー（ＮＥＢ）を混合して脱グリコシル化し、８０℃で２分間インキュベートした。冷却後、４μｌ Ｒａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆ ｅｎｚｙｍｅ （ＮＥＢ）を加え、５０℃で１０分間インキュベートした。脱グリコシル化したサンプルをさらに３０μｌ ４ｘ Ｌａｅｍｍｌｉ ｂｕｆｆｅｒと６μｌ ＤＴＴと混合した。サンプル（還元、非還元、又は脱グリコシル化）を７０℃で１０分間加熱し、４％－２０％ Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ ｐｒｅｃａｓｔ ｇｅｌｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に添加した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、１ｘＴｒｉｓ／Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＳＤＳランニングバッファー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｌｌ Ｂｌｕｅ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて行った。Ｔｒａｎ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ ｓｅｍｉ－ｄｒｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、タンパク質をゲルからＥｔＯＨ活性化低蛍光（ＬＦ）０．４５μｍＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に転写した。ＰＶＤＦ膜をＥｖｅｒｙＢｌｏｔバッファー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で５分間ブロッキングし、ヤギ抗ヒトＭＩＰ－１α（ＢＡＦ２７０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヤギ抗マウスＧＭ－ＣＳＦ（ＢＡＦ４１５、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、又はヤギ抗ヒトＦＬＴ３Ｌ（ＢＡＦ３０８、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でプローブし、それぞれ第１のポリペプチド／二量体タンパク質、ＧＭ－ＣＳＦ、又はＦＬＴ３Ｌを検出した。一次抗体の特異性は、それぞれの組換えタンパク質をプローブとした最初のテストで確認した。膜は蛍光色素標識二次抗体と１時間、常温でインキュベートした後、洗浄し乾燥させた。画像はＣｈｅｍｉＤｏｃ（登録商標） ＭＰ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｅｔｔｉｎｇ Ｄｙｌｉｇｈｔ ５５０及び６５０、Ａｕｔｏ Ｏｐｔｉｍａｌ）を用いて取得した。ウェスタンブロット解析は、ＥＬＩＳＡの結果が、ＶＢ４１９５は２種類のタンパク質：第１のポリペプチド／二量体タンパク質（図２６）、及びＦＬＴ３Ｌ（図２７）を発現していることを論証したことを確認した。ＶＢ４１９６は３つのタンパク質を発現した：第１のポリペプチド／二量体タンパク質（図２６）、ＦＬＴ３Ｌ及びＧＭ－ＣＳＦ（図２７）。ＶＢ４１９６のＦＬＴ３ＬとＧＭ－ＣＳＦタンパク質をコードする核酸配列を分離するために用いたＰ２Ａ配列はグリコシル化されているようで、ウェスタンブロットで観察されたタンパク質のサイズにシフトを生じた。ＰＮＧａｓｅＦによる脱グリコシル化プロトコールはこのサイズシフトを減少させた。さらに、Ｐ２ＡペプチドはＦＬＴ３ＬのＣ末端に２１アミノ酸の尾を残し、ウェスタンブロットで約２．２ｋＤａのサイズシフトが観察された。重要なことは、抗ＦＬＴ３Ｌと抗ＧＭ－ＣＳＦのプローブ膜で追加のバンドが観察されなかったことで、Ｐ２ＡとＴ２Ａ配列でのリボソームスキッピングが成功し、その結果、一つのＤＮＡプラスミドから複数の別々のタンパク質が発現されたことを示している。
ＥＬＩＳＡとウェスタンブロットのデータを総合すると、ターゲティングユニットと、二量体化ユニットと、抗原ユニットとを含むインタクトな二量体タンパク質は、異なる２Ａペプチドを共発現エレメントとして使用することにより、１又は複数の他のタンパク質（免疫刺激性化合物）とともにＤＮＡプラスミドから共発現させることができることを示している。
実施例５：
表４に列挙したエレメント／ユニットをコードする核酸配列を含み、そして、さらに以下の表１１に列挙したエレメント／ユニットをコードする核酸配列を含むＤＮＡプラスミドＶＢ４２０４を設計し、かつ作製した。：
さらに、マウスＧＭ－ＣＳＦのナチュラルリーダー配列（配列番号１２）及びマウスＧＭ－ＣＳＦ（配列番号１３）の配列を発現ベクターｐＵＭＶＣ４ａにクローニングすることにより、ＤＮＡプラスミドｐＧＭ－ＣＳＦを設計し、作製した。
ＶＢ４２０４がコードするタンパク質の発現と分泌の評価
ＨＥＫ２９３細胞をＡＴＣＣから入手し、そして、実施例１に記載したようにＶＢ４２０４又はＶＢ１０２０（比較）で一過性にトランスフェクトした。
ＶＢ４２０４又はＶＢ１０２０によってコードされる分泌タンパク質は、マウス抗ヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメイン抗体（キャプチャー抗体、１００μｌ／ウェル、１μｇ／ｍｌ、ＭＣＡ８７８Ｇ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）とヤギ抗ヒトＭＩＰ－１α抗体（ビオチン化検出抗体、１００μｌ／ウェル、０．２μｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＢＡＦ２７０）を用いた上清（１：１０希釈）のサンドイッチＥＬＩＳＡで特徴付けた。
ＶＢ４２０４の２番目のタンパク質としてコードされているＧＭ－ＣＳＦの分泌は、ラット抗マウスＧＭ－ＣＳＦ（キャプチャー抗体、１００μｌ／ウェル、１．０μｇ／ｍｌマウスＧＭ－ＣＳＦ抗体、ＭＡＢ４１５、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とヤギ抗マウスＧＭ－ＣＳＦ（ビオチン化検出抗体、１００μｌ／ウェル、０．２μｇ／ｍｌ、ＢＡＭ２１５、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、細胞培養上清（１：１０００希釈）のサンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。
図２８に示される結果は、ＶＢ４２０４にコードされる、ターゲティングユニットと、二量体化ユニットと、抗原ユニットとを含む第１のポリペプチド／二量体タンパク質が、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からよく発現及び分泌されることを示している。さらに、ＶＢ４２０４に別個の第２のタンパク質としてコードされているＧＭ－ＣＳＦも、図２９に示すように高レベルで発現及び分泌される。
ＶＢ４２０４の免疫原性評価（１）
ＶＢ４２０４、ＶＢ１０２０（比較）及びＶＢ１０２６（ネガティブコントロール）の免疫原性を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて実施例２に記載したように決定したが、ＣＤ４＋ Ｔ細胞枯渇脾臓細胞データは作成されなかった。次に、脾臓細胞におけるＴ細胞応答を、ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイでＩＮＦ－γの産生について試験した。さらに、ＶＢ１０２０（ＶＢ４２０４と同じポリペプチドをコードするが、ＧＭ－ＣＳＦをコードしない）及びｐＧＭ－ＣＳＦ（ＧＭ－ＣＳＦをコードするが、ＶＢ４２０４のポリペプチドをコードしない）の共注入ＤＮＡプラスミド（総ＤＮＡ６μｇ）の免疫原性を、この段落に記載したように決定した。
以下の表１２に記載のＥ６及びＥ７抗原に対応するペプチドを使用して、ＶＢ１０２０、ＶＢ４２０４、ＶＢ１０２６及び（ＶＢ１０２０＋ｐＧＭ－ＣＳＦ）を投与したマウスから採取した脾臓細胞を再刺激した。
ＶＢ１０２０（第１のポリペプチドのみ）、ＶＢ４２０４（第１のポリペプチドとＧＭ－ＣＳＦ）、及びＶＢ１０２０とｐＧＭ－ＣＳＦの共注入を、表１２のペプチドに対するＴ細胞免疫応答を誘発する能力について比較した。ＶＢ１０２６をネガティブコントロールとして含めた。
図３０に示すように、ＶＢ１０２６投与に対するＩＦＮ－γ産生は検出されなかった。
さらに、ＶＢ１０２０は表１２のペプチドに対して強いＴ細胞応答を誘導したが、ＶＢ４２０２はＶＢ１０２０に比べてさらに強いＴ細胞応答を誘導した。さらに、ＶＢ４２０２はまた、ＶＢ１０２０＋ｐＧＭ－ＣＳＦの共注入によって誘導されるよりも強いＴ細胞応答を誘導した（図３０）。
ＶＢ４２０４、ＶＢ１０２０（比較）及びＶＢ１０２６（ネガティブコントロール）の免疫原性をフローサイトメトリーにより決定した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを実施例２に記載したように処理し、脾臓細胞を群ごとにプールし、表１２に記載したＨＰＶ１６ Ｅ７（４９－５７）抗原に対応する単一ペプチドでＲＴで１時間再刺激した後、モネンシン及びブレフェルジンを各ウェルに添加してエンドサイトーシスを阻害した。細胞をさらに３７℃で１５時間インキュベートした。再刺激後、フローサイトメトリー解析のために細胞を回収した。簡単に説明すると、まず単一細胞懸濁液を死細胞標識色素（ｅＦｌｕｏｒ ７８０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に１０分間ＲＴでインキュベートした。死細胞標識色素をＰＢＳで洗い流した（４００ ｘ ｇで６分間、４℃で２回遠心）。その後、細胞をＦｃブロックとともに１０分間インキュベートし、蛍光抗体との非特異的結合をブロックした。ブロッキング工程の後、細胞を表面マーカー特異的抗体プール（表９）で氷上３０分間染色した。抗体をＰＢＳで洗い流し（４００ ｘ ｇで６分間、４℃で２回遠心）、細胞を固定／透過液でインキュベートした（４℃で６０分間）。細胞を遠心分離し、洗浄後、透過化バッファー中の１００μｌの抗体ミックスに再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。染色した細胞をＢＤ ＦＡＣＳｙｍｐｈｏｎｙ Ａ５フローサイトメーターで分析した。フローサイトメトリーデータはＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて解析した。
表１２では、ＤＮＡプラスミドＶＢ４２０２を、シングルペプチドＨＰＶ１６ Ｅ７（４９－５７）に対するＴ細胞免疫応答を誘発する能力について比較した。ＶＢ１０２０は比較として含まれ、ＶＢ１０２６はネガティブコントロールとして含まれた。
図３１に示すように、ＶＢ１０２６投与に対するＩＦＮ－γ又はＴＮＦ－αの産生は検出されなかった。
ＩＦＮ－γのみ、ＴＮＦ－αのみを分泌するＣＤ８＋ Ｔ細胞（ＣＤ４＋ Ｔ細胞枯渇サンプル）の数、及びＩＮＦ－γ＋ＴＮＦ－α共分泌細胞の数は、ＶＢ１０２０からＶＢ４２０２にかけてすべて増加した（図３１）。
これらの結果は、前記プラスミドから別個の分子として共発現される第１のポリペプチドと免疫刺激性化合物とをコードする本発明のＤＮＡプラスミドが、前記第１のポリペプチドのみをコードするＤＮＡプラスミドと比較して、及び同じ第１のポリペプチドをコードするＤＮＡプラスミドと同じ免疫刺激性化合物をコードするプラスミドとの共注入と比較して、第１のポリペプチド中に含まれる抗原に対する抗原特異的Ｔ細胞応答を高めることができることを示している。
実施例６：
表４に列挙したエレメント／ユニットをコードする核酸配列を含み、さらに以下の表１３に列挙したエレメント／ユニットをコードする核酸配列を含むＤＮＡプラスミドＶＢ４２０５を設計し、作製した：
ＶＢ４２０５がコードするタンパク質の発現と分泌の評価
ＨＥＫ２９３細胞をＡＴＣＣから入手し、実施例１に記載したようにＶＢ４２０５又はＶＢ１０２０（比較）を一過性にトランスフェクトした。ＶＢ４２０５又はＶＢ１０２０によってコードされる分泌タンパク質は、マウス抗ヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメイン抗体（キャプチャー抗体、１００μｌ／ウェル、１μｇ／ｍｌ、ＭＣＡ８７８Ｇ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）及びヤギ抗ヒトＭＩＰ－１α抗体（ビオチン化検出抗体、１００μｌ／ウェル、０．２μｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＢＡＦ２７０）を用いた上清のサンドイッチＥＬＩＳＡ（１：１０希釈）で特徴付けられた。
ＶＢ４２０５の第２タンパク質としてコードされるＣＣＬ５の分泌は、ラット抗マウスＣＣＬ５（キャプチャー抗体、１００μｌ／ウェル、１．０μｇ／ｍｌ、ＭＡＢ４７８１、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とヤギ抗マウスＣＣＬ５（ビオチン化検出抗体、１００μｌ／ウェル、０．２μｇ／ｍｌ、ＢＡＦ４７８、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより、上清（１：１０００希釈）中で測定した。
図３２に示す結果は、ＶＢ４２０５にコードされる、ターゲティングユニットと、二量体化ユニットと抗原ユニットとを含む第１のポリペプチド／二量体タンパク質が、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から良好に発現及び分泌されることを示している。さらに、第２のタンパク質としてＶＢ４２０５にコードされるＣＣＬ５は、図３３に示すように高レベルで発現及び分泌される。
ＶＢ４２０５の免疫原性の評価
ＶＢ４２０５の免疫原性をＣ５７ＢＬ／６マウスで測定し、実施例５（１）に記載したように、ＶＢ１０２０（比較）及びＶＢ１０２６（ネガティブコントロール）の免疫原性と比較した。
ＶＢ１０２０（第１のポリペプチドのみ）とＶＢ４２０５（第１のポリペプチドとＣＣＬ５）を、表１２のペプチドに対するＴ細胞免疫応答を誘発する能力について比較した。
図３４に示すように、ＶＢ１０２６の投与に応答してＩＦＮ－γ産生は検出されなかった。ＶＢ１０２０は表１２のペプチドに対して強いＴ細胞応答を誘導したが、ＶＢ４２０５はＶＢ１０２０と比較してさらに強いＴ細胞応答を誘導した。
また、これらの結果は、前記プラスミドから別個の分子として共発現される第１のポリペプチドと免疫刺激性化合物とをコードする本発明のＤＮＡプラスミドが、前記第１のポリペプチドのみをコードするＤＮＡプラスミドと比較して、第１のポリペプチドに含まれる抗原に対する抗原特異的Ｔ細胞応答を高めることができることを示している。
実施例７：
表１４に記載のエレメント／ユニットをコードする核酸配列を有するＤＮＡプラスミドＶＢ１０２６、ＶＢ４２０８、ＶＢ４１９４、ＶＢ４２０２及びｐＧＭ－ＣＳＦを、本明細書に記載のように設計し、作製した：
ＤＮＡプラスミドは以下のタンパク質をコードする：
－ＶＢ４２０２は、上記のような第１のポリペプチド及び免疫刺激性化合物ｍＧＭ－ＣＳＦを別々の分子としてコードし、共発現させることができる
－ＶＢ４１９４：ＣＴ２６エピトープを含む抗原ユニットを含む第１のポリペプチドのみをコードし、免疫刺激性化合物はコードせず、比較として機能する
－ＶＢ１０２６：配列番号１の１－２３７のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、これはＶＢ４１９４によってコードされる第１のポリペプチドと同一であるが、ユニットリンカーも抗原ユニットも含まない。これはネガティブコントロールとして機能する
－ＶＢ４２０８（配列番号２４）：抗原ユニットを含まない、すなわちＣＴ２６エピトープをコードしない第１のポリペプチドとｍＧＭ－ＣＳＦを別々の分子としてコードする。ネガティブコントロールとして機能する
－ｐＧＭ－ＣＳＦ：ｍＧＭ－ＣＳＦをコードし、比較となる。
ＣＴ２６腫瘍チャレンジマウスの治療
ＶＢ４２０２の抗腫瘍効果をＣＴ２６腫瘍チャレンジで評価した。ＶＢ４２０２は、ＶＢ４２０２と同じ第１のポリペプチドをコードするＶＢ４１９４と比較した。さらに、ＶＢ４２０２の抗腫瘍効果を、ＶＢ４１９４とｐＧＭ－ＣＳＦの同時注射と比較した。ＶＢ１０２６とＶＢ４２０８はネガティブコントロールとして含まれた。
各群Ａ－Ｆには８匹のＢＡＬＢ／ｃマウスが含まれ、左脚に１ｘ１０５個の腫瘍細胞を注射することにより、（Ｄ）０日目にＣＴ２６腫瘍細胞を接種した。４日目及び１１日目に、表１５に記載のＤＮＡプラスミドとそれぞれの量をマウスの右脚に筋肉内投与した。ＶＢ４１９４プラスミドとｐＧＭ－ＣＳＦプラスミドとの間でプラスミドサイズにばらつきがあるため、同等のタンパク質レベルが発現されるように、各プラスミドの量をＤ群における単一プラスミド注射のプラスミドコピー数（表１６）と一致するように調整した第２の共注入群（Ｆ群）を含めた。
腫瘍の大きさはキャリパスを用いて測定した。腫瘍は長さと横の２次元で測定し、高さは横幅と同じとした。腫瘍体積は以下の式で算出した：腫瘍体積＝長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）×高さ（ｍｍ）／２０００。治療は３２日目に終了した。
ＶＢ４１９４投与群（Ｃ群）、ＶＢ４２０２投与群（Ｄ群）、ＶＢ４１９４とｐＧＭ－ＣＳＦの共注入群（Ｅ群及びＦ群）の腫瘍は、ＶＢ１０２６及びＶＢ４２０８ネガティブコントロール群（それぞれＡ群及びＢ群）に比べて増殖が遅かった。
ＶＢ４１９４と同じ第１ポリペプチドと及びＧＭ－ＣＳＦを共発現するＶＢ４２０２を投与した群（Ｄ群）は、ＶＢ４１９４単独投与群（Ｃ群）に比べて腫瘍増殖率が低下した。さらに、ＶＢ４２０２の投与は、ＶＢ４１９４とｐＧＭ－ＣＳＦを合計１０μｇ投与した（Ｅ）、又は同等のコピー数に調整した（Ｆ）２つの共注射群と比較して、腫瘍増殖率の低下をもたらした。このような共注入は、ＶＢ４１９４単独投与と同程度の腫瘍増殖率をもたらした。
これらの結果（図３５に示す）は、ＶＢ４１９４と同じ第１のポリペプチドをコードするＶＢ４２０２由来のＧＭ－ＣＳＦの共発現により、ＶＢ４１９４による腫瘍増殖抑制効果がさらに増大したことを示している。図３６に示すように、腫瘍増殖抑制は、ＶＢ４２０２を投与した動物の生存率の上昇を伴っていた。抗腫瘍効果は、ＶＢ４２０２とネガティブコントロールのＶＢ１０２６及びＶＢ４２０８を比較することで示されるように、抗原特異的免疫応答によってもたらされた。さらに、ＶＢ４２０２は、ＶＢ４１９４とｐＧＭ－ＣＳＦを２つの別々のプラスミドとして共注入した場合に観察された効力よりも強い抗腫瘍効力を提供した。
実施例８：
表４に記載のエレメント／ユニットをコードする核酸配列を含み、さらに以下の表１７に記載のエレメント／ユニットをコードする核酸配列を含むＤＮＡプラスミドＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２１、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２２及びＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２３を設計し、作製した：
ＤＮＡプラスミドＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２１、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２２及びＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２３は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）抗原を含む抗原ユニットを含む第１のポリペプチドをコードする核酸配列を含む。
これらのＤＮＡプラスミドの各々は、感染症の治療に使用するための第１のポリペプチド、すなわち病原体由来の抗原（ここではＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の抗原）を含む抗原ユニットをコードする本発明によるＤＮＡプラスミドのモデルである。
ＤＮＡプラスミドＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２１、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２２及びＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２３は、別個の分子として、上記の第１のポリペプチド及び以下の免疫刺激性化合物の共発現を可能にする：
－ＶＢ２０６０：第一ポリペプチドのみをコードし、免疫刺激性化合物はコードせず、比較の役割を果たす。
－ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２１： ｍＧＭ－ＣＳＦ
－ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２２： ｍＩＬ－１２
－ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２３： ｍＩＬ－２１
ＩＬ１２はＩＬ－１２Ａ（ｐ３５）とＩＬ－１２Ｂ（ｐ４０）の２つの遺伝子によってコードされるヘテロ二量体サイトカインである。活性型ヘテロ二量体（ｐ７０と呼ばれる）とｐ４０のホモ二量体はタンパク質合成後に形成される。
ＤＮＡプラスミドがコードするタンパク質の発現と分泌の評価
簡単に説明すると、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（２ｘ１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、１ ｍｌ）を９６ウェル培養プレートに播種した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．社製）を用いて０．６４μｇ／ｍｌのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトし、プレートを加湿ＣＯ２セルインキュベーター（８％ＣＯ２、３７℃）内のオービタルシェーカー（直径３ｍｍ、９００ｒｐｍ）でインキュベートした。プレートを７２時間培養した後、上清を回収した。
マウス抗ヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメイン抗体（キャプチャー抗体、１００ μｌ／ウェル、１ μｇ／ｍｌ、ＭＣＡ８７８Ｇ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）とヤギ抗ヒトＭＩＰ－１α抗体（ビオチン化検出抗体、１００ μｌ／ウェル、０．２ μｇ／ｍｌ、ＢＡＦ２７０、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡで、上清（１：１５００希釈）中の分泌された第１のポリペプチド／二量体タンパク質を特徴づけた（図３７）。
上清中の免疫刺激性化合物 ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、及びＩＬ－２１ のタンパク質発現及び分泌を、抗マウス ＧＭ－ＣＳＦ 抗体（ラット抗マウス ＧＭ－ＣＳＦ キャプチャー抗体、１００ μｌ／ウェル、１．０ μｇ／ｍｌ マウス ＧＭ－ＣＳＦ 抗体、ＭＡＢ４１５、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ヤギ抗マウス ＧＭ－ＣＳＦ ビオチン化検出抗体、１００ μｌ／ウェル、０． ２ μｇ／ｍｌ， ＢＡＭ２１５， Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（図 ３８ａ）、抗マウス ＩＬ－１２ 抗体（ラット抗マウス ＩＬ－１２ キャプチャー抗体， １００ μｌ／ウェル， １．０ μｇ／ｍｌ， ＭＡＢ４１９ Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ； ヤギ抗マウス ＩＬ－１２ ビオチン化検出抗体， １００ μｌ／ウェル， ０． ４ μｇ／ｍｌ， ＢＡＦ４１９， Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）（図 ３８ｂ）、抗マウス ＩＬ－２１ 抗体（ヤギ抗マウス ＩＬ－２１ キャプチャー抗体， １００ μｌ／ウェル， ０．１ μｇ／ｍｌ， ＡＦ５９４， Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ； ヤギ抗マウス ＩＬ－２１ ビオチン化検出抗体， １００ μｌ／ウェル， ０．４ μｇ／ｍｌ， ＢＡＦ５９４， Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）（図 ３８ｃ）をそれぞれ作製した。
図３７に示した結果は、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２１、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２２、及びＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２３にコードされる、ターゲティングユニットと、二量体化ユニットと、抗原ユニットとを含む第１のポリペプチド／二量体タンパク質が、トランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞から発現及び分泌されたことを示している。ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２１、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２２及びＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２３にそれぞれ第２のタンパク質としてコードされるＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２及びＩＬ－２１も、図３８ａ～ｃに示すように、高レベルで発現及び分泌された。
ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２１、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２２及びＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２３から発現したインタクトなタンパク質の特性評価
トランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の上清サンプルについてウェスタンブロット（ＷＢ）解析を行い、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２１、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２２及びＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２３がコードするタンパク質を特徴づけた。前述のＤＮＡプラスミドと同一の第１のポリペプチドをコードするＶＢ２０６０を比較対象として含めた。
トランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の上清７０μｌを、２５μｌの４ｘ Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、５μｌのＤＴＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．）、又は５μｌの超純水と混合し、還元条件及び非還元条件のそれぞれに対して、サンプルを調製した。サンプル（還元又は非還元）を７０℃で１０分間加熱した後、レーンあたり２０μＬを４％～２０％のＣｒｉｔｅｒｉｏｎ ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ ｐｒｅｃａｓｔ ｇｅｌｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に加えた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ は、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｌｌ Ｂｌｕｅ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、１ｘ Ｔｒｉｓ／Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＳＤＳ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で行った。Ｔｒａｎ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ ｓｅｍｉ－ｄｒｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、タンパク質をゲルからＥｔＯＨ活性化低蛍光（ＬＦ）０．４５ μｍ ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に転写した。ＰＶＤＦ膜をＥｖｅｒｙＢｌｏｔバッファー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で５分間ブロッキングし、ヤギ抗ヒトＭＩＰ－１α（ＡＦ２７０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヤギ抗マウスＧＭ－ＣＳＦ（ＢＡＦ４１５、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヤギ抗マウスＩＬ－１２（ＢＡＦ４１９、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、又はヤギ抗マウスＩＬ－２１（ＢＡＦ５９４、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でプローブし、それぞれ第１のポリペプチド、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、及びＩＬ－２１を検出した。膜を洗浄し、蛍光色素標識抗ヤギ二次抗体と室温で １ 時間インキュベートした後、洗浄、及び乾燥（エタノールでリンス）した。画像はＣｈｅｍｉＤｏｃ（登録商標） ＭＰ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｄｙｌｉｇｈｔ ６５０及び８００、Ａｕｔｏ Ｏｐｔｉｍａｌ設定）を用いて取得した。Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ処理細胞（トランスフェクションコントロール）をネガティブコントロールとして各ゲルに加えた。
ＷＢ分析はＥＬＩＳＡの結果を確認し、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２１、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２２、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２３及びＶＢ２０６０の４種類のＤＮＡプラスミドすべてからインタクトな第１のポリペプチドが発現していることが示された（図３９）。ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２１はさらにＧＭ－ＣＳＦ（不均一糖鎖化）を発現した（図４０）。図４１は、還元条件下（左パネル）と非還元条件下（右パネル）で、ヤギ抗マウスＩＬ－１２でプローブしたＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２２のＷＢ解析を示す。ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２２は、第１のポリペプチドを発現していることに加え、グリコシル化ＩＬ－１２Ｂ（ｐ４０）とＩＬ－１２Ａ（ｐ３５）を発現していた（図４１、左パネル）。以前の研究では、生理活性ＩＬ－１２（ｐ７０ヘテロ二量体）を分泌する細胞は、遊離型のｐ４０（単量体）も分泌することが報告されている（Ｊａｌａｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ Ｖｏｌ ２８８， Ｎｏ．９， ６７６３－６７７６， ２０１３）。実際、非還元条件下でＩＬ－１２ ｐ７０ヘテロダイマーとｐ４０モノマーの両方のバンドが検出された（図４１、右パネル）。第１のポリペプチドに加えて、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２３はＩＬ－２１を発現した（図４２）。重要なことは、抗ＧＭ－ＣＳＦ、抗ＩＬ－１２及び抗ＩＬ－２１プローブ膜で追加のバンドが観察されなかったことで、Ｔ２Ａ配列でのリボソームスキッピングが成功し、その結果、単一のＤＮＡプラスミドから複数の別々のタンパク質が発現されたことを示している。
ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロットのデータを総合すると、同一の２Ａペプチドを共発現エレメントとして使用することにより、ターゲティングユニットと、二量体化ユニットと、抗原ユニットとを含むインタクトな第１のポリペプチドを、１又は複数の免疫刺激性化合物とともにＤＮＡプラスミドから共発現させることができることが実証された。
ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２１、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２２及びＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２３の免疫原性の評価
ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２１、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２２及びＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２３の免疫原性を測定し、ＶＢ２０６０及びＶＢ１０２６（ネガティブコントロール）の免疫原性と比較した。
メス、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスはＪａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ（フランス）から入手した。すべての動物はオスロ大学（オスロ、ノルウェー）の動物施設で飼育された。すべての動物プロトコールはノルウェー食品安全庁（ノルウェー、オスロ）の承認を得た。ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２１、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２２、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２３及びＶＢ２０６０の試験には５匹／群を用い、ネガティブコントロールには３匹／群を用いた。
各前脛骨筋に１μｇのＤＮＡプラスミドを筋肉内注射し（２ ｘ ２５μｌ、２０μｇ／ｍｌ）、その後、ＡｇｉｌｅＰｕｌｓｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ （ＢＴＸ， ＵＳＡ）を用いてエレクトロポレーションを行った。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤに対するマウスの体液性免疫応答の評価。
ＤＮＡプラスミドを投与したマウスの血清を投与１３日後に採取し、ＲＢＤタンパク質（Ｗｕｈａｎ ｖａｒｉａｎｔ）に結合する抗ＲＢＤ ＩｇＧ抗体について検査した。
簡単に説明すると、ワクチンを接種したマウスの伏在静脈から血液を採取した。凝固した血液を２回遠心分離し（１０００ｇ、１５分）、血清を採取して清浄なチューブに移した。体液性免疫応答は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２（Ｗｕｈａｎ ｖａｒｉａｎｔ）のＲＢＤ（ａａ３１９－５４２）に結合する血清中の総ＩｇＧを検出するＥＬＩＳＡアッセイで評価した。ＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏプレート）にＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの組換えＲＢＤ－Ｈｉｓタンパク質抗原を４℃で一晩コートした。プレートをＰＢＳ中４％ＢＳＡで１時間室温でブロックした。その後、マウス血清の連続希釈液（ＰＢＳ中０．１％ＢＳＡで希釈）を加え、３７℃で２時間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、ＰＢＳ中０．１％ＢＳＡで１：５０，０００に希釈した抗マウス総ＩｇＧ－ＨＲＰ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）とインキュベートし、３７℃で１時間インキュベートした。最終洗浄後、ＴＭＢ基質（Ｍｅｒｃｋ， ｃａｔ．ＣＬ０７－１０００）を用いてプレートを現像した。ＳＰＡＲＫ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｔｅｃａｎ）を用い、３０分以内に波長４５０ ｎｍでプレートを読み取った。結合抗体エンドポイント価（Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｄｐｏｉｎｔ ｔｉｔｅｒｓ）は、カットオフ値以上のシグナルが得られた最高希釈度の逆数として算出した。試験した結合抗原にはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が含まれる：ＲＢＤ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ４０５９２－Ｖ０８Ｈ； 配列番号３０））。
図４３に示す結果は、抗原ユニット中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｗｕｈａｎ ｖａｒｉａｎｔ）由来のＲＢＤ（ａａ３１９－５４２）を含む第１のポリペプチドと、第２のタンパク質として、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－２１をそれぞれとをコードするＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２１及びＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２３が、前述の第１のポリペプチドのみをコードする比較のＶＢ２０６０よりも、ＲＢＤに対してより強い総ＩｇＧ応答を誘導することを示している（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２１：Ｐ＝０．００８、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２３：Ｐ＝０．０４７）。さらに、前述の第１のポリペプチドと、第２及び第３のタンパク質としてＩＬ－１２の２つのサブドメインをコードするＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２２も、比較のＶＢ２０６０よりもＲＢＤに対して強いＩｇＧ応答を誘導した（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定、Ｐ ＝ ０．０４７）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤに対するＴ細胞応答の評価
ＤＮＡプラスミドを投与したマウスの脾臓を投与１４日後に採取し、セルストレーナーでつぶして単一細胞懸濁液を得た。赤血球は、塩化アンモニウム－カリウム（ＡＣＫ）溶解バッファーで溶解した。脾臓細胞をＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２０２（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ， Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて計数し、６ｘ１０６細胞／ｍｌの最終濃度に再懸濁した。試験した各プラスミドについて、単一細胞懸濁液の一部を用いて、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）抗ＣＤ４ビーズを用いてＣＤ４＋ Ｔ細胞を枯渇させた。次に、全脾臓細胞及びＣＤ４＋ Ｔ細胞枯渇脾臓細胞を、６ｘ１０５細胞／ウェルを播種し、２μｇ／ｍｌのＲＢＤペプチドプール（表１８）で２２．５時間再刺激することにより、ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイでＩＮＦ－γの産生について試験した。ＲＢＤペプチドプールは、ＲＢＤの領域にまたがる１２アミノ酸で重なる１５ｍｅｒのペプチドを含んでいた。
図４４に示す結果は、抗原ユニットにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｗｕｈａｎ ｖａｒｉａｎｔ）由来のＲＢＤ（ａａ３１９－５４２）を含む第１のポリペプチドと、第２のタンパク質としてそれぞれＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－２１とをコードするＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２１及びＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２３が、前述の第１のポリペプチドのみをコードする比較のＶＢ２０６０と比較して、ＲＢＤに対してはるかに強い総Ｔ細胞応答（図４４Ａ）を誘導したことを示している。さらに、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２１及びＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２３は、ＶＢ２０６０と比較して、より強いＣＤ８＋ Ｔ細胞応答（ＣＤ４＋枯渇脾臓細胞画分）を誘導した（図４４Ｂ）。前述の第１のポリペプチド及び第２と第３のタンパク質としてのＩＬ－１２の２つのサブドメインをコードするＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２２もまた、ＶＢ２０６０と比較して、ＲＢＤに対してはるかに強い全Ｔ細胞応答（図４４Ａ）を誘導した。ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２１及びＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２３処理群と比較して、ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２２ ＣＤ４＋Ｔ細胞枯渇サンプルにおける応答のより大きな減少が観察されたことから、ＩＬ－１２サイトカインの添加によって誘導されたＴ細胞応答の増加は、主にＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＦＮ－γ分泌の増加によるものと思われた（図４４Ｂ）。
まとめると、提示された結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤに対するマウスにおいて引き起こされた体液性免疫応答及び細胞性免疫応答は、前述の第１のポリペプチド／二量体タンパク質を単独で発現させた場合と比較して、ターゲティングユニットと二量体化ユニットと感染抗原（病原体ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来するＲＢＤ）を含む抗原ユニットとを含む第１のポリペプチド／二量体タンパク質と、免疫刺激性化合物（ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、又はＩＬ－２１）との共発現により、高まったことを示す。


配列概要
配列番号１
Ｍ１ＱＶＳＴＡＡＬＡＶＬＬＣＴＭＡＬＣＮＱＶＬＳ２３Ａ２４ＰＬＡＡＤＴＰＴＡＣＣＦＳＹＴＳＲＱＩＰＱＮＦＩＡＤＹＦＥＴＳＳＱＣＳＫＰＳＶＩＦＬＴＫＲＧＲＱＶＣＡＤＰＳＥＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥＬＳＡ９３Ｅ９４ＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ１０５Ｅ１０６ＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰ１２０Ｇ１２１ＧＧＳＳＧＧＧＳＧ１３０Ｇ１３１ＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ２３７

配列番号２
シグナルペプチド
ＭＮＦＧＬＲＬＩＦＬＶＬＴＬＫＧＶＱＣ

配列番号３
シグナルペプチド
ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ

配列番号４
ヒトＦＬＴ３Ｌのシグナルペプチド
ＭＴＶＬＡＰＡＷＳＰＴＴＹＬＬＬＬＬＬＬＳＳＧＬＳＧ

配列番号５
ＶＢ４１９４
ＭＱＶＳＴＡＡＬＡＶＬＬＣＴＭＡＬＣＮＱＶＬＳＡＰＬＡＡＤＴＰＴＡＣＣＦＳＹＴＳＲＱＩＰＱＮＦＩＡＤＹＦＥＴＳＳＱＣＳＫＰＳＶＩＦＬＴＫＲＧＲＱＶＣＡＤＰＳＥＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥＬＳＡＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬＫＳＷＩＨＣＷＫＹＬＳＶＱＳＱＬＦＲＧＳＳＬＬＦＲＲＶＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＮＮＬＱＫＹＩＥＩＹＶＱＫＩＮＰＳＲＬＰＶＶＩＧＧＬＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＩＱＴＳＫＹＹＭＲＤＶＩＡＩＥＳＡＷＬＬＥＬＡＰＨＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＩＬＰＱＡＰＳＧＰＳＹＡＴＹＬＱＰＡＱＡＱＭＬＴＰＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＦＶＳＰＭＡＨＹＶＰＧＩＭＡＩＥＳＶＶＡＲＦＱＦＩＶＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＤＶＫＩＨＡＨＫＶＶＬＡＮＩＳＰＹＦＫＡＭＦＴＧＮＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＰＬＲＫＨＴＶＨＡＩＲＫＦＹＬＥＦＫＧＳＳＰＰＰＲＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＫＩＹＥＦＤＹＨＬＹＧＱＮＩＴＭＩＭＴＳＶＳＧＨＬＬＡ

配列番号６
ＶＢ４１６８
ＭＱＶＳＴＡＡＬＡＶＬＬＣＴＭＡＬＣＮＱＶＬＳＡＰＬＡＡＤＴＰＴＡＣＣＦＳＹＴＳＲＱＩＰＱＮＦＩＡＤＹＦＥＴＳＳＱＣＳＫＰＳＶＩＦＬＴＫＲＧＲＱＶＣＡＤＰＳＥＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥＬＳＡＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬＫＳＷＩＨＣＷＫＹＬＳＶＱＳＱＬＦＲＧＳＳＬＬＦＲＲＶＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＮＮＬＱＫＹＩＥＩＹＶＱＫＩＮＰＳＲＬＰＶＶＩＧＧＬＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＩＱＴＳＫＹＹＭＲＤＶＩＡＩＥＳＡＷＬＬＥＬＡＰＨＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＩＬＰＱＡＰＳＧＰＳＹＡＴＹＬＱＰＡＱＡＱＭＬＴＰＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＦＶＳＰＭＡＨＹＶＰＧＩＭＡＩＥＳＶＶＡＲＦＱＦＩＶＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＤＶＫＩＨＡＨＫＶＶＬＡＮＩＳＰＹＦＫＡＭＦＴＧＮＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＰＬＲＫＨＴＶＨＡＩＲＫＦＹＬＥＦＫＧＳＳＰＰＰＲＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＫＩＹＥＦＤＹＨＬＹＧＱＮＩＴＭＩＭＴＳＶＳＧＨＬＬＡＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＴＶＬＡＰＡＷＳＰＴＴＹＬＬＬＬＬＬＬＳＳＧＬＳＧＴＱＤＣＳＦＱＨＳＰＩＳＳＤＦＡＶＫＩＲＥＬＳＤＹＬＬＱＤＹＰＶＴＶＡＳＮＬＱＤＥＥＬＣＧＧＬＷＲＬＶＬＡＱＲＷＭＥＲＬＫＴＶＡＧＳＫＭＱＧＬＬＥＲＶＮＴＥＩＨＦＶＴＫＣＡＦＱＰＰＰＳＣＬＲＦＶＱＴＮＩＳＲＬＬＱＥＴＳＥＱＬＶＡＬＫＰＷＩＴＲＱＮＦＳＲＣＬＥＬＱＣＱＰＤＳＳＴＬＰＰＰＷＳＰＲＰＬＥＡＴＡＰＴＡＰＱＰ

配列番号７
ＶＢ４１６９
ＭＱＶＳＴＡＡＬＡＶＬＬＣＴＭＡＬＣＮＱＶＬＳＡＰＬＡＡＤＴＰＴＡＣＣＦＳＹＴＳＲＱＩＰＱＮＦＩＡＤＹＦＥＴＳＳＱＣＳＫＰＳＶＩＦＬＴＫＲＧＲＱＶＣＡＤＰＳＥＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥＬＳＡＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬＫＳＷＩＨＣＷＫＹＬＳＶＱＳＱＬＦＲＧＳＳＬＬＦＲＲＶＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＮＮＬＱＫＹＩＥＩＹＶＱＫＩＮＰＳＲＬＰＶＶＩＧＧＬＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＩＱＴＳＫＹＹＭＲＤＶＩＡＩＥＳＡＷＬＬＥＬＡＰＨＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＩＬＰＱＡＰＳＧＰＳＹＡＴＹＬＱＰＡＱＡＱＭＬＴＰＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＦＶＳＰＭＡＨＹＶＰＧＩＭＡＩＥＳＶＶＡＲＦＱＦＩＶＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＤＶＫＩＨＡＨＫＶＶＬＡＮＩＳＰＹＦＫＡＭＦＴＧＮＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＰＬＲＫＨＴＶＨＡＩＲＫＦＹＬＥＦＫＧＳＳＰＰＰＲＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＫＩＹＥＦＤＹＨＬＹＧＱＮＩＴＭＩＭＴＳＶＳＧＨＬＬＡＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＴＶＬＡＰＡＷＳＰＴＴＹＬＬＬＬＬＬＬＳＳＧＬＳＧＴＱＤＣＳＦＱＨＳＰＩＳＳＤＦＡＶＫＩＲＥＬＳＤＹＬＬＱＤＹＰＶＴＶＡＳＮＬＱＤＥＥＬＣＧＧＬＷＲＬＶＬＡＱＲＷＭＥＲＬＫＴＶＡＧＳＫＭＱＧＬＬＥＲＶＮＴＥＩＨＦＶＴＫＣＡＦＱＰＰＰＳＣＬＲＦＶＱＴＮＩＳＲＬＬＱＥＴＳＥＱＬＶＡＬＫＰＷＩＴＲＱＮＦＳＲＣＬＥＬＱＣＱＰＤＳＳＴＬＰＰＰＷＳＰＲＰＬＥＡＴＡＰＴＡＰＱＰＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＷＬＱＮＬＬＦＬＧＩＶＶＹＳＬＳＡＰＴＲＳＰＩＴＶＴＲＰＷＫＨＶＥＡＩＫＥＡＬＮＬＬＤＤＭＰＶＴＬＮＥＥＶＥＶＶＳＮＥＦＳＦＫＫＬＴＣＶＱＴＲＬＫＩＦＥＱＧＬＲＧＮＦＴＫＬＫＧＡＬＮＭＴＡＳＹＹＱＴＹＣＰＰＴＰＥＴＤＣＥＴＱＶＴＴＹＡＤＦＩＤＳＬＫＴＦＬＴＤＩＰＦＥＣＫＫＰＶＱＫ

配列番号８
ＶＢ４１７０
ＭＱＶＳＴＡＡＬＡＶＬＬＣＴＭＡＬＣＮＱＶＬＳＡＰＬＡＡＤＴＰＴＡＣＣＦＳＹＴＳＲＱＩＰＱＮＦＩＡＤＹＦＥＴＳＳＱＣＳＫＰＳＶＩＦＬＴＫＲＧＲＱＶＣＡＤＰＳＥＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥＬＳＡＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬＫＳＷＩＨＣＷＫＹＬＳＶＱＳＱＬＦＲＧＳＳＬＬＦＲＲＶＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＮＮＬＱＫＹＩＥＩＹＶＱＫＩＮＰＳＲＬＰＶＶＩＧＧＬＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＩＱＴＳＫＹＹＭＲＤＶＩＡＩＥＳＡＷＬＬＥＬＡＰＨＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＩＬＰＱＡＰＳＧＰＳＹＡＴＹＬＱＰＡＱＡＱＭＬＴＰＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＦＶＳＰＭＡＨＹＶＰＧＩＭＡＩＥＳＶＶＡＲＦＱＦＩＶＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＤＶＫＩＨＡＨＫＶＶＬＡＮＩＳＰＹＦＫＡＭＦＴＧＮＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＰＬＲＫＨＴＶＨＡＩＲＫＦＹＬＥＦＫＧＳＳＰＰＰＲＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＫＩＹＥＦＤＹＨＬＹＧＱＮＩＴＭＩＭＴＳＶＳＧＨＬＬＡＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＴＶＬＡＰＡＷＳＰＴＴＹＬＬＬＬＬＬＬＳＳＧＬＳＧＴＱＤＣＳＦＱＨＳＰＩＳＳＤＦＡＶＫＩＲＥＬＳＤＹＬＬＱＤＹＰＶＴＶＡＳＮＬＱＤＥＥＬＣＧＧＬＷＲＬＶＬＡＱＲＷＭＥＲＬＫＴＶＡＧＳＫＭＱＧＬＬＥＲＶＮＴＥＩＨＦＶＴＫＣＡＦＱＰＰＰＳＣＬＲＦＶＱＴＮＩＳＲＬＬＱＥＴＳＥＱＬＶＡＬＫＰＷＩＴＲＱＮＦＳＲＣＬＥＬＱＣＱＰＤＳＳＴＬＰＰＰＷＳＰＲＰＬＥＡＴＡＰＴＡＰＱＰＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＷＬＱＮＬＬＦＬＧＩＶＶＹＳＬＳＡＰＴＲＳＰＩＴＶＴＲＰＷＫＨＶＥＡＩＫＥＡＬＮＬＬＤＤＭＰＶＴＬＮＥＥＶＥＶＶＳＮＥＦＳＦＫＫＬＴＣＶＱＴＲＬＫＩＦＥＱＧＬＲＧＮＦＴＫＬＫＧＡＬＮＭＴＡＳＹＹＱＴＹＣＰＰＴＰＥＴＤＣＥＴＱＶＴＴＹＡＤＦＩＤＳＬＫＴＦＬＴＤＩＰＦＥＣＫＫＰＶＱＫＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰＭＫＩＳＡＡＡＬＴＩＩＬＴＡＡＡＬＣＴＰＡＰＡＳＰＹＧＳＤＴＴＰＣＣＦＡＹＬＳＬＡＬＰＲＡＨＶＫＥＹＦＹＴＳＳＫＣＳＮＬＡＶＶＦＶＴＲＲＮＲＱＶＣＡＮＰＥＫＫＷＶＱＥＹＩＮＹＬＥＭＳ

配列番号９
Ｔ２Ａ
ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ

配列番号１０
ヒトＦＬＴ３Ｌ
ＴＱＤＣＳＦＱＨＳＰＩＳＳＤＦＡＶＫＩＲＥＬＳＤＹＬＬＱＤＹＰＶＴＶＡＳＮＬＱＤＥＥＬＣＧＧＬＷＲＬＶＬＡＱＲＷＭＥＲＬＫＴＶＡＧＳＫＭＱＧＬＬＥＲＶＮＴＥＩＨＦＶＴＫＣＡＦＱＰＰＰＳＣＬＲＦＶＱＴＮＩＳＲＬＬＱＥＴＳＥＱＬＶＡＬＫＰＷＩＴＲＱＮＦＳＲＣＬＥＬＱＣＱＰＤＳＳＴＬＰＰＰＷＳＰＲＰＬＥＡＴＡＰＴＡＰＱＰ

配列番号１１
Ｐ２Ａ
ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ

配列番号１２
シグナルペプチドマウスＧＭ－ＣＳＦ
ＭＷＬＱＮＬＬＦＬＧＩＶＶＹＳＬＳ

配列番号１３
マウスＧＭ－ＣＳＦ
ＡＰＴＲＳＰＩＴＶＴＲＰＷＫＨＶＥＡＩＫＥＡＬＮＬＬＤＤＭＰＶＴＬＮＥＥＶＥＶＶＳＮＥＦＳＦＫＫＬＴＣＶＱＴＲＬＫＩＦＥＱＧＬＲＧＮＦＴＫＬＫＧＡＬＮＭＴＡＳＹＹＱＴＹＣＰＰＴＰＥＴＤＣＥＴＱＶＴＴＹＡＤＦＩＤＳＬＫＴＦＬＴＤＩＰＦＥＣＫＫＰＶＱＫ

配列番号１４
Ｅ２Ａ
ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ

配列番号１５
シグナルペプチドマウスＣＣＬ５
ＭＫＩＳＡＡＡＬＴＩＩＬＴＡＡＡＬＣＴＰＡＰＡ

配列番号１６
マウスＣＣＬ５
ＳＰＹＧＳＤＴＴＰＣＣＦＡＹＬＳＬＡＬＰＲＡＨＶＫＥＹＦＹＴＳＳＫＣＳＮＬＡＶＶＦＶＴＲＲＮＲＱＶＣＡＮＰＥＫＫＷＶＱＥＹＩＮＹＬＥＭＳ

配列番号１７
リンカー
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ

配列番号１８
ＶＢ４２０２
ＭＱＶＳＴＡＡＬＡＶＬＬＣＴＭＡＬＣＮＱＶＬＳＡＰＬＡＡＤＴＰＴＡＣＣＦＳＹＴＳＲＱＩＰＱＮＦＩＡＤＹＦＥＴＳＳＱＣＳＫＰＳＶＩＦＬＴＫＲＧＲＱＶＣＡＤＰＳＥＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥＬＳＡＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬＫＳＷＩＨＣＷＫＹＬＳＶＱＳＱＬＦＲＧＳＳＬＬＦＲＲＶＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＮＮＬＱＫＹＩＥＩＹＶＱＫＩＮＰＳＲＬＰＶＶＩＧＧＬＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＩＱＴＳＫＹＹＭＲＤＶＩＡＩＥＳＡＷＬＬＥＬＡＰＨＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＩＬＰＱＡＰＳＧＰＳＹＡＴＹＬＱＰＡＱＡＱＭＬＴＰＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＦＶＳＰＭＡＨＹＶＰＧＩＭＡＩＥＳＶＶＡＲＦＱＦＩＶＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＤＶＫＩＨＡＨＫＶＶＬＡＮＩＳＰＹＦＫＡＭＦＴＧＮＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＰＬＲＫＨＴＶＨＡＩＲＫＦＹＬＥＦＫＧＳＳＰＰＰＲＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＫＩＹＥＦＤＹＨＬＹＧＱＮＩＴＭＩＭＴＳＶＳＧＨＬＬＡＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＷＬＱＮＬＬＦＬＧＩＶＶＹＳＬＳＡＰＴＲＳＰＩＴＶＴＲＰＷＫＨＶＥＡＩＫＥＡＬＮＬＬＤＤＭＰＶＴＬＮＥＥＶＥＶＶＳＮＥＦＳＦＫＫＬＴＣＶＱＴＲＬＫＩＦＥＱＧＬＲＧＮＦＴＫＬＫＧＡＬＮＭＴＡＳＹＹＱＴＹＣＰＰＴＰＥＴＤＣＥＴＱＶＴＴＹＡＤＦＩＤＳＬＫＴＦＬＴＤＩＰＦＥＣＫＫＰＶＱＫ

配列番号１９
ＶＢ１０２０
ＭＱＶＳＴＡＡＬＡＶＬＬＣＴＭＡＬＣＮＱＶＬＳＡＰＬＡＡＤＴＰＴＡＣＣＦＳＹＴＳＲＱＩＰＱＮＦＩＡＤＹＦＥＴＳＳＱＣＳＫＰＳＶＩＦＬＴＫＲＧＲＱＶＣＡＤＰＳＥＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥＬＳＡＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬＭＨＧＤＴＰＴＬＨＥＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴＤＬＹＧＹＧＱＬＮＤＳＳＥＥＥＤＥＩＤＧＰＡＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲＴＬＥＤＬＬＭＧＴＬＧＩＶＣＰＩＣＳＱＫＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＭＦＱＤＰＱＥＲＰＲＫＬＰＱＬＣＴＥＬＱＴＴＩＨＤＩＩＬＥＣＶＹＣＫＱＱＬＬＲＲＥＶＹＤＦＡＲＲＤＬＣＩＶＹＲＤＧＮＰＹＡＶＲＤＫＣＬＫＦＹＳＫＩＳＥＹＲＨＹＣＹＳＬＹＧＴＴＬＥＱＱＹＮＫＰＬＣＤＬＬＩＲＣＩＮＲＱＫＰＬＣＰＥＥＫＱＲＨＬＤＫＫＱＲＦＨＮＩＲＧＲＷＴＧＲＣＭＳＣＣＲＳＳＲＴＲＲＥＴＱＬ

配列番号２０
ＶＢ４１９５
ＭＱＶＳＴＡＡＬＡＶＬＬＣＴＭＡＬＣＮＱＶＬＳＡＰＬＡＡＤＴＰＴＡＣＣＦＳＹＴＳＲＱＩＰＱＮＦＩＡＤＹＦＥＴＳＳＱＣＳＫＰＳＶＩＦＬＴＫＲＧＲＱＶＣＡＤＰＳＥＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥＬＳＡＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬＭＨＧＤＴＰＴＬＨＥＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴＤＬＹＧＹＧＱＬＮＤＳＳＥＥＥＤＥＩＤＧＰＡＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲＴＬＥＤＬＬＭＧＴＬＧＩＶＣＰＩＣＳＱＫＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＭＦＱＤＰＱＥＲＰＲＫＬＰＱＬＣＴＥＬＱＴＴＩＨＤＩＩＬＥＣＶＹＣＫＱＱＬＬＲＲＥＶＹＤＦＡＲＲＤＬＣＩＶＹＲＤＧＮＰＹＡＶＲＤＫＣＬＫＦＹＳＫＩＳＥＹＲＨＹＣＹＳＬＹＧＴＴＬＥＱＱＹＮＫＰＬＣＤＬＬＩＲＣＩＮＲＱＫＰＬＣＰＥＥＫＱＲＨＬＤＫＫＱＲＦＨＮＩＲＧＲＷＴＧＲＣＭＳＣＣＲＳＳＲＴＲＲＥＴＱＬＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＴＶＬＡＰＡＷＳＰＴＴＹＬＬＬＬＬＬＬＳＳＧＬＳＧＴＱＤＣＳＦＱＨＳＰＩＳＳＤＦＡＶＫＩＲＥＬＳＤＹＬＬＱＤＹＰＶＴＶＡＳＮＬＱＤＥＥＬＣＧＧＬＷＲＬＶＬＡＱＲＷＭＥＲＬＫＴＶＡＧＳＫＭＱＧＬＬＥＲＶＮＴＥＩＨＦＶＴＫＣＡＦＱＰＰＰＳＣＬＲＦＶＱＴＮＩＳＲＬＬＱＥＴＳＥＱＬＶＡＬＫＰＷＩＴＲＱＮＦＳＲＣＬＥＬＱＣＱＰＤＳＳＴＬＰＰＰＷＳＰＲＰＬＥＡＴＡＰＴＡＰＱＰ

配列番号２１
ＶＢ４１９６
ＭＱＶＳＴＡＡＬＡＶＬＬＣＴＭＡＬＣＮＱＶＬＳＡＰＬＡＡＤＴＰＴＡＣＣＦＳＹＴＳＲＱＩＰＱＮＦＩＡＤＹＦＥＴＳＳＱＣＳＫＰＳＶＩＦＬＴＫＲＧＲＱＶＣＡＤＰＳＥＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥＬＳＡＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬＭＨＧＤＴＰＴＬＨＥＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴＤＬＹＧＹＧＱＬＮＤＳＳＥＥＥＤＥＩＤＧＰＡＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲＴＬＥＤＬＬＭＧＴＬＧＩＶＣＰＩＣＳＱＫＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＭＦＱＤＰＱＥＲＰＲＫＬＰＱＬＣＴＥＬＱＴＴＩＨＤＩＩＬＥＣＶＹＣＫＱＱＬＬＲＲＥＶＹＤＦＡＲＲＤＬＣＩＶＹＲＤＧＮＰＹＡＶＲＤＫＣＬＫＦＹＳＫＩＳＥＹＲＨＹＣＹＳＬＹＧＴＴＬＥＱＱＹＮＫＰＬＣＤＬＬＩＲＣＩＮＲＱＫＰＬＣＰＥＥＫＱＲＨＬＤＫＫＱＲＦＨＮＩＲＧＲＷＴＧＲＣＭＳＣＣＲＳＳＲＴＲＲＥＴＱＬＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＴＶＬＡＰＡＷＳＰＴＴＹＬＬＬＬＬＬＬＳＳＧＬＳＧＴＱＤＣＳＦＱＨＳＰＩＳＳＤＦＡＶＫＩＲＥＬＳＤＹＬＬＱＤＹＰＶＴＶＡＳＮＬＱＤＥＥＬＣＧＧＬＷＲＬＶＬＡＱＲＷＭＥＲＬＫＴＶＡＧＳＫＭＱＧＬＬＥＲＶＮＴＥＩＨＦＶＴＫＣＡＦＱＰＰＰＳＣＬＲＦＶＱＴＮＩＳＲＬＬＱＥＴＳＥＱＬＶＡＬＫＰＷＩＴＲＱＮＦＳＲＣＬＥＬＱＣＱＰＤＳＳＴＬＰＰＰＷＳＰＲＰＬＥＡＴＡＰＴＡＰＱＰＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＷＬＱＮＬＬＦＬＧＩＶＶＹＳＬＳＡＰＴＲＳＰＩＴＶＴＲＰＷＫＨＶＥＡＩＫＥＡＬＮＬＬＤＤＭＰＶＴＬＮＥＥＶＥＶＶＳＮＥＦＳＦＫＫＬＴＣＶＱＴＲＬＫＩＦＥＱＧＬＲＧＮＦＴＫＬＫＧＡＬＮＭＴＡＳＹＹＱＴＹＣＰＰＴＰＥＴＤＣＥＴＱＶＴＴＹＡＤＦＩＤＳＬＫＴＦＬＴＤＩＰＦＥＣＫＫＰＶＱＫ

配列番号２２
ＶＢ４２０４
ＭＱＶＳＴＡＡＬＡＶＬＬＣＴＭＡＬＣＮＱＶＬＳＡＰＬＡＡＤＴＰＴＡＣＣＦＳＹＴＳＲＱＩＰＱＮＦＩＡＤＹＦＥＴＳＳＱＣＳＫＰＳＶＩＦＬＴＫＲＧＲＱＶＣＡＤＰＳＥＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥＬＳＡＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬＭＨＧＤＴＰＴＬＨＥＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴＤＬＹＧＹＧＱＬＮＤＳＳＥＥＥＤＥＩＤＧＰＡＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲＴＬＥＤＬＬＭＧＴＬＧＩＶＣＰＩＣＳＱＫＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＭＦＱＤＰＱＥＲＰＲＫＬＰＱＬＣＴＥＬＱＴＴＩＨＤＩＩＬＥＣＶＹＣＫＱＱＬＬＲＲＥＶＹＤＦＡＲＲＤＬＣＩＶＹＲＤＧＮＰＹＡＶＲＤＫＣＬＫＦＹＳＫＩＳＥＹＲＨＹＣＹＳＬＹＧＴＴＬＥＱＱＹＮＫＰＬＣＤＬＬＩＲＣＩＮＲＱＫＰＬＣＰＥＥＫＱＲＨＬＤＫＫＱＲＦＨＮＩＲＧＲＷＴＧＲＣＭＳＣＣＲＳＳＲＴＲＲＥＴＱＬＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＷＬＱＮＬＬＦＬＧＩＶＶＹＳＬＳＡＰＴＲＳＰＩＴＶＴＲＰＷＫＨＶＥＡＩＫＥＡＬＮＬＬＤＤＭＰＶＴＬＮＥＥＶＥＶＶＳＮＥＦＳＦＫＫＬＴＣＶＱＴＲＬＫＩＦＥＱＧＬＲＧＮＦＴＫＬＫＧＡＬＮＭＴＡＳＹＹＱＴＹＣＰＰＴＰＥＴＤＣＥＴＱＶＴＴＹＡＤＦＩＤＳＬＫＴＦＬＴＤＩＰＦＥＣＫＫＰＶＱＫ

配列番号２３
ＶＢ４２０５
ＭＱＶＳＴＡＡＬＡＶＬＬＣＴＭＡＬＣＮＱＶＬＳＡＰＬＡＡＤＴＰＴＡＣＣＦＳＹＴＳＲＱＩＰＱＮＦＩＡＤＹＦＥＴＳＳＱＣＳＫＰＳＶＩＦＬＴＫＲＧＲＱＶＣＡＤＰＳＥＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥＬＳＡＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬＭＨＧＤＴＰＴＬＨＥＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴＤＬＹＧＹＧＱＬＮＤＳＳＥＥＥＤＥＩＤＧＰＡＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲＴＬＥＤＬＬＭＧＴＬＧＩＶＣＰＩＣＳＱＫＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＭＦＱＤＰＱＥＲＰＲＫＬＰＱＬＣＴＥＬＱＴＴＩＨＤＩＩＬＥＣＶＹＣＫＱＱＬＬＲＲＥＶＹＤＦＡＲＲＤＬＣＩＶＹＲＤＧＮＰＹＡＶＲＤＫＣＬＫＦＹＳＫＩＳＥＹＲＨＹＣＹＳＬＹＧＴＴＬＥＱＱＹＮＫＰＬＣＤＬＬＩＲＣＩＮＲＱＫＰＬＣＰＥＥＫＱＲＨＬＤＫＫＱＲＦＨＮＩＲＧＲＷＴＧＲＣＭＳＣＣＲＳＳＲＴＲＲＥＴＱＬＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＫＩＳＡＡＡＬＴＩＩＬＴＡＡＡＬＣＴＰＡＰＡＳＰＹＧＳＤＴＴＰＣＣＦＡＹＬＳＬＡＬＰＲＡＨＶＫＥＹＦＹＴＳＳＫＣＳＮＬＡＶＶＦＶＴＲＲＮＲＱＶＣＡＮＰＥＫＫＷＶＱＥＹＩＮＹＬＥＭＳ

配列番号２４
ＶＢ４２０８
ＭＱＶＳＴＡＡＬＡＶＬＬＣＴＭＡＬＣＮＱＶＬＳＡＰＬＡＡＤＴＰＴＡＣＣＦＳＹＴＳＲＱＩＰＱＮＦＩＡＤＹＦＥＴＳＳＱＣＳＫＰＳＶＩＦＬＴＫＲＧＲＱＶＣＡＤＰＳＥＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥＬＳＡＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＷＬＱＮＬＬＦＬＧＩＶＶＹＳＬＳＡＰＴＲＳＰＩＴＶＴＲＰＷＫＨＶＥＡＩＫＥＡＬＮＬＬＤＤＭＰＶＴＬＮＥＥＶＥＶＶＳＮＥＦＳＦＫＫＬＴＣＶＱＴＲＬＫＩＦＥＱＧＬＲＧＮＦＴＫＬＫＧＡＬＮＭＴＡＳＹＹＱＴＹＣＰＰＴＰＥＴＤＣＥＴＱＶＴＴＹＡＤＦＩＤＳＬＫＴＦＬＴＤＩＰＦＥＣＫＫＰＶＱＫ

配列番号２５
配列番号１のアミノ酸２４－９３をコードするヌクレオチド配列
ＧＣＡＣＣＡＣＴＴＧＣＴＧＣＴＧＡＣＡＣＧＣＣＧＡＣＣＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＴＣＡＧＣＴＡＣＡＣＣＴＣＣＣＧＡＣＡＧＡＴＴＣＣＡＣＡＧＡＡＴＴＴＣＡＴＡＧＣＴＧＡＣＴＡＣＴＴＴＧＡＧＡＣＧＡＧＣＡＧＣＣＡＧＴＧＣＴＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＴＧＴＣＡＴＣＴＴＣＣＴＡＡＣＣＡＡＧＡＧＡＧＧＣＣＧＧＣＡＧＧＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＣＡＧＴＧＡＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＣＡＧＡＡＡＴＡＣＧＴＣＡＧＴＧＡＣＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＴＧＣＣ

配列番号２６
配列番号１のアミノ酸９４－１２０をコードするヌクレオチド配列
ＧＡＧＣＴＣＡＡＡＡＣＣＣＣＡＣＴＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡ

配列番号２７
配列番号１のアミノ酸１３１－２３７をコードするヌクレオチド配列
ＧＧＡＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＡＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＧＣＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡ

配列番号２８
配列番号１のアミノ酸９４－２３７をコードするヌクレオチド配列
ＧＡＧＣＴＣＡＡＡＡＣＣＣＣＡＣＴＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＴＧＧＡＡＧＣＡＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＡＡＧＴＧＧＡＧＧＡＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＡＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＧＣＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡ

配列番号２９
配列番号１のアミノ酸１－２３をコードするヌクレオチド配列
ＡＴＧＣＡＧＧＴＣＴＣＣＡＣＴＧＣＴＧＣＣＣＴＴＧＣＣＧＴＣＣＴＣＣＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＣＴＣＴＧＣＡＡＣＣＡＧＧＴＣＣＴＣＴＣＴ

配列番号３０
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ （アミノ酸３１９－５４２）
ＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦ

配列番号３１
ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２１
ＭＱＶＳＴＡＡＬＡＶＬＬＣＴＭＡＬＣＮＱＶＬＳＡＰＬＡＡＤＴＰＴＡＣＣＦＳＹＴＳＲＱＩＰＱＮＦＩＡＤＹＦＥＴＳＳＱＣＳＫＰＳＶＩＦＬＴＫＲＧＲＱＶＣＡＤＰＳＥＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥＬＳＡＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＷＬＱＮＬＬＦＬＧＩＶＶＹＳＬＳＡＰＴＲＳＰＩＴＶＴＲＰＷＫＨＶＥＡＩＫＥＡＬＮＬＬＤＤＭＰＶＴＬＮＥＥＶＥＶＶＳＮＥＦＳＦＫＫＬＴＣＶＱＴＲＬＫＩＦＥＱＧＬＲＧＮＦＴＫＬＫＧＡＬＮＭＴＡＳＹＹＱＴＹＣＰＰＴＰＥＴＤＣＥＴＱＶＴＴＹＡＤＦＩＤＳＬＫＴＦＬＴＤＩＰＦＥＣＫＫＰＶＱＫ

配列番号３２
ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２２
ＭＱＶＳＴＡＡＬＡＶＬＬＣＴＭＡＬＣＮＱＶＬＳＡＰＬＡＡＤＴＰＴＡＣＣＦＳＹＴＳＲＱＩＰＱＮＦＩＡＤＹＦＥＴＳＳＱＣＳＫＰＳＶＩＦＬＴＫＲＧＲＱＶＣＡＤＰＳＥＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥＬＳＡＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＣＱＳＲＹＬＬＦＬＡＴＬＡＬＬＮＨＬＳＬＡＲＶＩＰＶＳＧＰＡＲＣＬＳＱＳＲＮＬＬＫＴＴＤＤＭＶＫＴＡＲＥＫＬＫＨＹＳＣＴＡＥＤＩＤＨＥＤＩＴＲＤＱＴＳＴＬＫＴＣＬＰＬＥＬＨＫＮＥＳＣＬＡＴＲＥＴＳＳＴＴＲＧＳＣＬＰＰＱＫＴＳＬＭＭＴＬＣＬＧＳＩＹＥＤＬＫＭＹＱＴＥＦＱＡＩＮＡＡＬＱＮＨＮＨＱＱＩＩＬＤＫＧＭＬＶＡＩＤＥＬＭＱＳＬＮＨＮＧＥＴＬＲＱＫＰＰＶＧＥＡＤＰＹＲＶＫＭＫＬＣＩＬＬＨＡＦＳＴＲＶＶＴＩＮＲＶＭＧＹＬＳＳＡＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＣＰＱＫＬＴＩＳＷＦＡＩＶＬＬＶＳＰＬＭＡＭＷＥＬＥＫＤＶＹＶＶＥＶＤＷＴＰＤＡＰＧＥＴＶＮＬＴＣＤＴＰＥＥＤＤＩＴＷＴＳＤＱＲＨＧＶＩＧＳＧＫＴＬＴＩＴＶＫＥＦＬＤＡＧＱＹＴＣＨＫＧＧＥＴＬＳＨＳＨＬＬＬＨＫＫＥＮＧＩＷＳＴＥＩＬＫＮＦＫＮＫＴＦＬＫＣＥＡＰＮＹＳＧＲＦＴＣＳＷＬＶＱＲＮＭＤＬＫＦＮＩＫＳＳＳＳＳＰＤＳＲＡＶＴＣＧＭＡＳＬＳＡＥＫＶＴＬＤＱＲＤＹＥＫＹＳＶＳＣＱＥＤＶＴＣＰＴＡＥＥＴＬＰＩＥＬＡＬＥＡＲＱＱＮＫＹＥＮＹＳＴＳＦＦＩＲＤＩＩＫＰＤＰＰＫＮＬＱＭＫＰＬＫＮＳＱＶＥＶＳＷＥＹＰＤＳＷＳＴＰＨＳＹＦＳＬＫＦＦＶＲＩＱＲＫＫＥＫＭＫＥＴＥＥＧＣＮＱＫＧＡＦＬＶＥＫＴＳＴＥＶＱＣＫＧＧＮＶＣＶＱＡＱＤＲＹＹＮＳＳＣＳＫＷＡＣＶＰＣＲＶＲＳ

配列番号３３
ＴＥＣＨ００１－ＣＶ０２３
ＭＱＶＳＴＡＡＬＡＶＬＬＣＴＭＡＬＣＮＱＶＬＳＡＰＬＡＡＤＴＰＴＡＣＣＦＳＹＴＳＲＱＩＰＱＮＦＩＡＤＹＦＥＴＳＳＱＣＳＫＰＳＶＩＦＬＴＫＲＧＲＱＶＣＡＤＰＳＥＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥＬＳＡＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＥＲＴＬＶＣＬＶＶＩＦＬＧＴＶＡＨＫＳＳＰＱＧＰＤＲＬＬＩＲＬＲＨＬＩＤＩＶＥＱＬＫＩＹＥＮＤＬＤＰＥＬＬＳＡＰＱＤＶＫＧＨＣＥＨＡＡＦＡＣＦＱＫＡＫＬＫＰＳＮＰＧＮＮＫＴＦＩＩＤＬＶＡＱＬＲＲＲＬＰＡＲＲＧＧＫＫＱＫＨＩＡＫＣＰＳＣＤＳＹＥＫＲＴＰＫＥＦＬＥＲＬＫＷＬＬＱＫＭＩＨＱＨＬＳ

配列番号３４
マウスＩＬ－１２ Ａシグナルペプチド
ＭＣＱＳＲＹＬＬＦＬＡＴＬＡＬＬＮＨＬＳＬＡ

配列番号３５
マウスＩＬ－１２ Ａ
ＲＶＩＰＶＳＧＰＡＲＣＬＳＱＳＲＮＬＬＫＴＴＤＤＭＶＫＴＡＲＥＫＬＫＨＹＳＣＴＡＥＤＩＤＨＥＤＩＴＲＤＱＴＳＴＬＫＴＣＬＰＬＥＬＨＫＮＥＳＣＬＡＴＲＥＴＳＳＴＴＲＧＳＣＬＰＰＱＫＴＳＬＭＭＴＬＣＬＧＳＩＹＥＤＬＫＭＹＱＴＥＦＱＡＩＮＡＡＬＱＮＨＮＨＱＱＩＩＬＤＫＧＭＬＶＡＩＤＥＬＭＱＳＬＮＨＮＧＥＴＬＲＱＫＰＰＶＧＥＡＤＰＹＲＶＫＭＫＬＣＩＬＬＨＡＦＳＴＲＶＶＴＩＮＲＶＭＧＹＬＳＳＡ

配列番号３６
マウスＩＬ－１２ Ｂ シグナルペプチド
ＭＣＰＱＫＬＴＩＳＷＦＡＩＶＬＬＶＳＰＬＭＡ

配列番号３７
マウスＩＬ－１２ Ｂ
ＭＷＥＬＥＫＤＶＹＶＶＥＶＤＷＴＰＤＡＰＧＥＴＶＮＬＴＣＤＴＰＥＥＤＤＩＴＷＴＳＤＱＲＨＧＶＩＧＳＧＫＴＬＴＩＴＶＫＥＦＬＤＡＧＱＹＴＣＨＫＧＧＥＴＬＳＨＳＨＬＬＬＨＫＫＥＮＧＩＷＳＴＥＩＬＫＮＦＫＮＫＴＦＬＫＣＥＡＰＮＹＳＧＲＦＴＣＳＷＬＶＱＲＮＭＤＬＫＦＮＩＫＳＳＳＳＳＰＤＳＲＡＶＴＣＧＭＡＳＬＳＡＥＫＶＴＬＤＱＲＤＹＥＫＹＳＶＳＣＱＥＤＶＴＣＰＴＡＥＥＴＬＰＩＥＬＡＬＥＡＲＱＱＮＫＹＥＮＹＳＴＳＦＦＩＲＤＩＩＫＰＤＰＰＫＮＬＱＭＫＰＬＫＮＳＱＶＥＶＳＷＥＹＰＤＳＷＳＴＰＨＳＹＦＳＬＫＦＦＶＲＩＱＲＫＫＥＫＭＫＥＴＥＥＧＣＮＱＫＧＡＦＬＶＥＫＴＳＴＥＶＱＣＫＧＧＮＶＣＶＱＡＱＤＲＹＹＮＳＳＣＳＫＷＡＣＶＰＣＲＶＲＳ

配列番号３８
マウスＩＬ－２１ シグナルペプチド
ＭＥＲＴＬＶＣＬＶＶＩＦＬＧＴＶＡ

配列番号３９
マウスＩＬ－２１
ＨＫＳＳＰＱＧＰＤＲＬＬＩＲＬＲＨＬＩＤＩＶＥＱＬＫＩＹＥＮＤＬＤＰＥＬＬＳＡＰＱＤＶＫＧＨＣＥＨＡＡＦＡＣＦＱＫＡＫＬＫＰＳＮＰＧＮＮＫＴＦＩＩＤＬＶＡＱＬＲＲＲＬＰＡＲＲＧＧＫＫＱＫＨＩＡＫＣＰＳＣＤＳＹＥＫＲＴＰＫＥＦＬＥＲＬＫＷＬＬＱＫＭＩＨＱＨＬＳ

配列番号４０
ヒトＧＭ－ＣＳＦ シグナルペプチド
ＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳ

配列番号４１
ヒトＧＭ－ＣＳＦ
ＡＰＡＲＳＰＳＰＳＴＱＰＷＥＨＶＮＡＩＱＥＡＲＲＬＬＮＬＳＲＤＴＡＡＥＭＮＥＴＶＥＶＩＳＥＭＦＤＬＱＥＰＴＣＬＱＴＲＬＥＬＹＫＱＧＬＲＧＳＬＴＫＬＫＧＰＬＴＭＭＡＳＨＹＫＱＨＣＰＰＴＰＥＴＳＣＡＴＱＩＩＴＦＥＳＦＫＥＮＬＫＤＦＬＬＶＩＰＦＤＣＷＥＰＶＱＥ

配列番号４２
ヒトＣＣＬ５ シグナルペプチド
ＭＫＶＳＡＡＡＬＡＶＩＬＩＡＴＡＬＣＡＰＡＳＡ

配列番号４３
ヒトＣＣＬ５
ＳＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣＦＡＹＩＡＲＰＬＰＲＡＨＩＫＥＹＦＹＴＳＧＫＣＳＮＰＡＶＶＦＶＴＲＫＮＲＱＶＣＡＮＰＥＫＫＷＶＲＥＹＩＮＳＬＥＭＳ

配列番号４４
ヒトＩＬ－１２Ａ シグナルペプチド
ＭＣＰＡＲＳＬＬＬＶＡＴＬＶＬＬＤＨＬＳＬＡ

配列番号４５
ヒトＩＬ－１２Ａ
ＲＮＬＰＶＡＴＰＤＰＧＭＦＰＣＬＨＨＳＱＮＬＬＲＡＶＳＮＭＬＱＫＡＲＱＴＬＥＦＹＰＣＴＳＥＥＩＤＨＥＤＩＴＫＤＫＴＳＴＶＥＡＣＬＰＬＥＬＴＫＮＥＳＣＬＮＳＲＥＴＳＦＩＴＮＧＳＣＬＡＳＲＫＴＳＦＭＭＡＬＣＬＳＳＩＹＥＤＬＫＭＹＱＶＥＦＫＴＭＮＡＫＬＬＭＤＰＫＲＱＩＦＬＤＱＮＭＬＡＶＩＤＥＬＭＱＡＬＮＦＮＳＥＴＶＰＱＫＳＳＬＥＥＰＤＦＹＫＴＫＩＫＬＣＩＬＬＨＡＦＲＩＲＡＶＴＩＤＲＶＭＳＹＬＮＡＳ

配列番号４６
ヒトＩＬ－１２Ｂシグナルペプチド
ＭＣＨＱＱＬＶＩＳＷＦＳＬＶＦＬＡＳＰＬＶＡ
配列番号４７
ヒトＩＬ－１２Ｂ
ＩＷＥＬＫＫＤＶＹＶＶＥＬＤＷＹＰＤＡＰＧＥＭＶＶＬＴＣＤＴＰＥＥＤＧＩＴＷＴＬＤＱＳＳＥＶＬＧＳＧＫＴＬＴＩＱＶＫＥＦＧＤＡＧＱＹＴＣＨＫＧＧＥＶＬＳＨＳＬＬＬＬＨＫＫＥＤＧＩＷＳＴＤＩＬＫＤＱＫＥＰＫＮＫＴＦＬＲＣＥＡＫＮＹＳＧＲＦＴＣＷＷＬＴＴＩＳＴＤＬＴＦＳＶＫＳＳＲＧＳＳＤＰＱＧＶＴＣＧＡＡＴＬＳＡＥＲＶＲＧＤＮＫＥＹＥＹＳＶＥＣＱＥＤＳＡＣＰＡＡＥＥＳＬＰＩＥＶＭＶＤＡＶＨＫＬＫＹＥＮＹＴＳＳＦＦＩＲＤＩＩＫＰＤＰＰＫＮＬＱＬＫＰＬＫＮＳＲＱＶＥＶＳＷＥＹＰＤＴＷＳＴＰＨＳＹＦＳＬＴＦＣＶＱＶＱＧＫＳＫＲＥＫＫＤＲＶＦＴＤＫＴＳＡＴＶＩＣＲＫＮＡＳＩＳＶＲＡＱＤＲＹＹＳＳＳＷＳＥＷＡＳＶＰＣＳ

配列番号４８
ヒトＩＬ－２１ シグナルペプチド
ＭＲＳＳＰＧＮＭＥＲＩＶＩＣＬＭＶＩＦＬＧＴＬＶ

配列番号４９
ヒトＩＬ－２１
ＨＫＳＳＳＱＧＱＤＲＨＭＩＲＭＲＱＬＩＤＩＶＤＱＬＫＮＹＶＮＤＬＶＰＥＦＬＰＡＰＥＤＶＥＴＮＣＥＷＳＡＦＳＣＦＱＫＡＱＬＫＳＡＮＴＧＮＮＥＲＩＩＮＶＳＩＫＫＬＫＲＫＰＰＳＴＮＡＧＲＲＱＫＨＲＬＴＣＰＳＣＤＳＹＥＫＫＰＰＫＥＦＬＥＲＦＫＳＬＬＱＫＭＩＨＱＨＬＳＳＲＴＨＧＳＥＤＳ


実施形態１
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニット、二量体化ユニットなどの多量体化ユニット、及び１又は複数の抗原又はその一部、例えば１又は複数の疾患関連抗原又はその一部を含む抗原ユニットを含み；及び
（ｂ）１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列、
を含むベクターであって、
前記ベクターは、第１のポリペプチドと１又は複数の免疫刺激性化合物とを別々の分子として共発現させることができる。
実施形態２
前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、樹状細胞、マクロファージ、ランゲルハンス細胞、Ｂ細胞及び好中球を含む抗原提示細胞に影響を与える化合物、例えば抗原提示細胞を刺激する化合物であり、好ましくは、前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ヒト樹状細胞、ヒトマクロファージ、ヒトランゲルハンス細胞、ヒトＢ細胞及びヒト好中球を含むヒト抗原提示細胞に影響を与える化合物である、実施形態１に記載のベクター。
実施形態３
前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、抗原提示細胞の誘引及び／又は活性化及び／又は成熟及び／又は増殖、例えば、成長及び／又は拡大を促進する、実施形態１又は２に記載のベクター。
実施形態４
前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、抗原提示細胞の誘引を促進する、実施形態１～３のいずれかに記載のベクター。
実施形態５
前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ケモカイン、好ましくはヒトケモカインである、実施形態４に記載のベクター。
実施形態６
前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ＣＣＲ１、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８及びＸＣＲ１からなる群より選択される抗原提示細胞上の表面分子と相互作用し得る、好ましくは、前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ｈＣＣＲ１、ｈＣＣＲ３、ｈＣＣＲ４、ｈＣＣＲ５、ｈＣＣＲ６、ｈＣＣＲ７、ｈＣＣＲ８及びｈＸＣＲ１からなる群より選択されるヒト抗原提示細胞上の表面分子と相互作用し得る、実施形態５に記載のベクター。
実施形態７
前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、そのアイソフォーム、例えば、マウスＣＣＬ３、ヒトＣＣＬ３、ヒトＣＣＬ３Ｌ１、ヒトＣＣＬ３Ｌ２及びヒトＣＣＬ３Ｌ３、ＣＣＬ４、好ましくはｈＣＣＬ４、ＣＣＬ５、好ましくはｈＣＣＬ５、ＣＣＬ１９、好ましくはｈＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、好ましくはｈＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、好ましくはｈＣＣＬ２１、ＸＣＬ１、好ましくはｈＸＣＬ１及びＸＣＬ２、好ましくはｈＸＣＬ２を含むマクロファージ炎症性タンパク質αからなるリストから選択される、実施形態５又は６に記載のベクター。
実施形態８
前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、抗原提示細胞の活性化及び／又は成熟を促進する、実施形態３～７のいずれかに記載のベクター。
実施形態９
前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ＣＤ４０（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７、ＲＡＮＫ、及びＩＣＯＳ （ＣＤ２７８）を含むＴＮＦ受容体スーパーファミリーの受容体からなる群から選択される抗原提示細胞上の表面分子と相互作用し得る、好ましくは、前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ｈＣＤ４０、ｈＣＤ１３７、ｈＣＤ２７、ｈＲＡＮＫ及びｈＩＣＯＳを含むヒトＴＮＦ受容体スーパーファミリーの受容体からなる群から選択されるヒト抗原提示細胞上の表面分子と相互作用し得る、実施形態３～８のいずれかに記載のベクター。
実施形態１０
前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ７０、ＲＡＮＫＬ及びＩＣＯＳＬからなるリストから選択される、好ましくは、前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ｈＣＤ４０Ｌ、ｈＣＤ１３７Ｌ、ｈＣＤ７０、ｈＲＡＮＫＬ及びｈＩＣＯＳＬからなるリストから選択される、実施形態９に記載のベクター。
実施形態１１
前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、ＴＮＦα、ＩＦＮγ及びＩＬ－１βからなる群より選択されるサイトカインであり、好ましくは、前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ｈＩＬ－２、ＩｈＬ－１０、ｈＩＬ－１２、ｈＩＬ－２１、ｈＴＮＦα、ｈＩＦＮγ及びｈＩＬ－１βからなる群より選択されるヒトサイトカインである、実施形態３～８のいずれかに記載のベクター。
実施形態１２
前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ＭｙＤ８８又はＴＲＩＦなどのウイルス感染センサー、好ましくはヒトＭｙＤ８８又はヒトＴＲＩＦなどのヒトウイルス感染センサーである、実施形態３～８のいずれかに記載のベクター。
実施形態１３
前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５及びＴＬＲ９を含むＴｏｌｌ様受容体のような抗原提示細胞上のパターン認識受容体、及び／又はＲＡＧＥ、ＴＩＭ－３、ＦＰＲ、ＳＲＥＣ１、ＬＯＸ１及びＣＤ９１からなる群から選択される抗原提示細胞上の受容体と相互作用し得る、好ましくは、前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ｈＴＬＲ２、ｈＴＬＲ４、ｈＴＬＲ５及びｈＴＬＲ９を含むヒトＴｏｌｌ様受容体のようなヒト抗原提示細胞上のパターン認識受容体、及び／又はｈＲＡＧＥ、ｈＴＩＭ－３、ｈＦＰＲ、ｈＳＲＥＣ１、ｈＬＯＸ１及びｈＣＤ９１からなる群から選択されるヒト抗原提示細胞上の受容体と相互作用し得る、実施形態３～８のいずれかに記載のベクター。
実施形態１４
前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、フラジェリンなどの病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、ＨＭＧＢ１、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、カルレクチクリン及びアネキシンＡ１などのタンパク質ダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰ）からなる群から選択される、好ましくは、前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ヒト病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、ｈＨＭＧＢ１、ヒト熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、ヒトカルレクチクリン及びヒトアネキシンＡ１などのヒトタンパク質ダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰ）からなる群から選択される、実施形態１３に記載のベクター。
実施形態１５
前記１又は複数の免疫刺激性化合物が抗原提示細胞の成長及び／又は拡大を促進する、実施形態３～１４のいずれかに記載のベクター。
実施形態１６
前記１又は複数の免疫刺激性化合物が成長因子、好ましくはヒト成長因子である、実施形態３～１５のいずれかに記載のベクター。
実施形態１７
前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ＧＭ－ＣＳＦ－レセプター、ＦＬＴ－３Ｒ、ＩＬ－１５Ｒ及びＩＬ－４Ｒからなる群より選択される抗原提示細胞上の表面分子と相互作用し得る、好ましくは、前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ｈＧＭ－ＣＳＦ－レセプター、ｈＦＬＴ－３Ｒ、ｈＩＬ－１５Ｒ及びｈＩＬ－４Ｒからなる群より選択されるヒト抗原提示細胞上の表面分子と相互作用し得る、実施形態３～１５のいずれかに記載のベクター。
実施形態１８
前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ＧＭ－ＣＳＦ、ＦＬＴ－３Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－４からなる群より選択され、好ましくは、前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ｈＧＭ－ＣＳＦ、ｈＦＬＴ－３Ｌ、ｈＩＬ－１５及びｈＩＬ－４からなる群より選択される、実施形態１６又は１７のいずれに記載のベクター。
実施形態１９
前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ＩＬ－４、ＩＬ－１β、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＬ－１５、ＴＮＦα、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＭｙＤ８８、ＴＲＩＦ、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ－５、Ｃ３ｄのＰ２８領域、ＩＬ－１３、ＩＦＮε、ＩＦＮκ、ＩＦＮω、ＩＦＮβ及びＩＬ－６からなるリストから選択され、好ましくは、前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ｈＩＬ－４、ｈＩＬ－１β、ｈＩＦＮγ、ｈＩＦＮα、ｈＩＬ－１５、ｈＴＮＦα、ｈＩＬ－１０、ｈＩＬ－１２、ｈＩＬ－２、ｈＩＬ－２１、ｈＭｙＤ８８、ｈＴＲＩＦ、ｈＲＩＧ－Ｉ、ｈＭＤＡ－５、ｈＣ３ｄのＰ２８領域、ｈＩＬ－１３、ｈＩＦＮε、ｈＩＦＮκ、ｈＩＦＮω、ｈＩＦＮβ及びｈＩＬ－６からなるリストから選択される、実施形態１～１７のいずれかに記載のベクター。
実施形態２０
複数の免疫刺激性化合物、例えば、２、３、４、５、６、７又は８の免疫刺激性化合物、例えば２、３、４、５、６、７又は８の異なる免疫刺激性化合物をコードする複数のさらなる核酸配列を含む、実施形態１～１９のいずれかに記載のベクター。
実施形態２１
前記複数の免疫刺激性化合物が、抗原提示細胞を異なるように影響する（例えば刺激するなど）異なる免疫刺激性化合物である、実施態様２０に記載のベクター。
実施形態２２
前記ベクターが１又は複数の共発現エレメントを含む、前記実施形態のいずれかに記載のベクター。
実施形態２３
前記１又は複数の共発現エレメントが、単一の転写産物上の第１のポリペプチド及び前記１又は複数の免疫刺激性化合物の転写と、別個の第１のポリペプチド及び別個の１又は複数の免疫刺激性化合物への独立した翻訳とを引き起こす、実施形態２２に記載のベクター。
実施形態２４
前記１又は複数の共発現エレメントがＩＲＥＳエレメント又は２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸配列である、実施形態２２又は２３のいずれかに記載のベクター。
実施形態２５
前記ベクターが、ＩＲＥＳエレメント若しくは２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸配列、又はＩＲＥＳエレメント及び２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸配列である１超の共発現エレメントを含む、実施形態２２又は２３のいずれかに記載のベクター。
実施形態２６
前記２Ａ自己切断ペプチドが、Ｔ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド及びＦ２Ａペプチドからなる群より選択される、実施形態２２～２５のいずれかに記載のベクター。
実施形態２７
前記２Ａ自己切断ペプチドが、配列番号９を有するアミノ酸配列に対して８０％～１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＴ２Ａペプチド、配列番号１１を有するアミノ酸配列に対して８０％～１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＰ２Ａペプチド、配列番号１４を有するアミノ酸配列に対して８０％～１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＥ２Ａペプチド、及び配列番号５１を有するアミノ酸配列に対して８０％～１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＦ２Ａペプチドからなる群より選択される、実施形態２２～２６のいずれかに記載のベクター。
実施形態２８
前記２Ａ自己切断ペプチドが、配列番号９のアミノ酸配列を有するＴ２Ａペプチド、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＰ２Ａペプチド、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＥ２Ａペプチド、及び配列番号５１のアミノ酸配列を有するＦ２Ａペプチドからなる群より選択される、実施形態２２～２７のいずれかに記載のベクター。
実施形態２９
前記１又は複数の共発現エレメントが、別々の転写産物として、第１のポリペプチド及び前記１又は複数の免疫刺激性化合物の転写を引き起こす、実施形態２３に記載のベクター。
実施形態３０
前記１又は複数の共発現エレメントが双方向性プロモーターである、実施態様２９に記載のベクター。
実施形態３１
前記１又は複数の共発現エレメントがプロモーターであり、前記ベクターが、第１のポリペプチド及び前記１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする核酸配列の各々に対して別個のプロモーターを含む、実施形態２９に記載のベクター。
実施形態３２
前記１又は複数の共発現エレメントが双方向性プロモーター及びプロモーターである、実施態様２９に記載のベクター。
実施形態３３
前記ベクターが、ＩＲＥＳエレメント、２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸配列、双方向性プロモーター及びプロモーターからなる群より選択される１又は複数の共発現エレメントを含む、実施形態２３～３３のいずれかに記載のベクター。
実施形態３４
前記抗原ユニットが、１又は複数のネオ抗原又はその一部を含む、実施形態１～３３のいずれかに記載のベクター。
実施形態３５
前記抗原ユニットが、１又は複数のネオ抗原の１又は複数の部分を含む、実施形態３４に記載のベクター。
実施形態３６
前記部分がネオエピトープである、実施態様３５に記載のベクター。
実施形態３７
前記抗原ユニットが、リンカーによって互いに分離された複数のネオエピトープなどの複数のネオエピトープを含む、実施形態３６に記載のベクター。
実施形態３８
前記抗原ユニットが、ｎ－１の抗原サブユニットを含み、各サブユニットが、ネオエピトープと、サブユニットリンカーと、末端ネオエピトープとを含み、ｎが、前記抗原ユニット中のネオエピトープの数であり、かつ、ｎが、１～５０の整数である、実施形態３６又は３７のいずれかに記載のベクター。
実施形態３９
前記ネオエピトープが、７～３０のアミノ酸、例えば、７～１０のアミノ酸（７、８、９もしくは１０アミノ酸など）又は１３～３０のアミノ酸（１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０アミノ酸など）、例えば７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５のアミノ酸などの長さを有する、実施形態３６～３８のいずれかに記載のベクター。
実施形態４０
前記抗原ユニットが、１又は複数の患者提示共有癌抗原又はその一部をさらに含む、実施形態３４又は３５のいずれかに記載のベクター。
実施形態４１
前記抗原ユニットが、１又は複数の患者提示共有癌抗原の１又は複数の一部をさらに含む、実施形態４０に記載のベクター。
実施形態４２
前記一部がエピトープである、実施形態４１に記載のベクター。
実施形態４３
前記抗原ユニットが、複数の患者提示共有癌エピトープをさらに含む、実施形態４０～４１のいずれかに記載のベクター。
実施形態４４
前記患者提示共有癌抗原が、過剰発現又は異常発現したヒト細胞タンパク質、癌精巣抗原、分化抗原、ウイルス抗原、変異癌遺伝子、変異癌抑制遺伝子、癌胎児性の抗原、共有イントロン保持抗原、フレームシフト変異により引き起こされる共有抗原、ダークマター抗原（ｄａｒｋ ｍａｔｔｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、及びスプライセオソーム変異により引き起こされる共有抗原からなる群より選択される、実施形態４０～４３のいずれかに記載のベクター。
実施形態４５
前記抗原ユニットが、１又は複数の患者提示共有癌抗原又はその一部を含む、実施形態１～３３のいずれかに記載のベクター。
実施形態４６
前記抗原ユニットが、１又は複数の患者提示共有癌抗原の１又は複数の部分を含む、実施形態４５に記載のベクター。
実施形態４７
前記部分がエピトープである、実施形態４６に記載のベクター。
実施形態４８
前記抗原ユニットが、複数のエピトープを含む、実施形態４７に記載のベクター。
実施形態４９
前記患者提示共有癌抗原が、過剰発現又は異常発現したヒト細胞タンパク質、癌精巣抗原、分化抗原、ウイルス抗原、変異癌遺伝子、変異癌抑制遺伝子、癌胎児性の抗原、共有イントロン保持抗原、フレームシフト変異により引き起こされる共有抗原、ダークマター抗原（ｄａｒｋ ｍａｔｔｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、及びスプライセオソーム変異により引き起こされる共有抗原からなる群より選択される、実施形態４５又は４６のいずれかに記載のベクター。
実施形態５０
前記抗原ユニットが、１又は複数の共有癌抗原又はその一部を含む、実施形態１～３３のいずれかに記載のベクター。
実施形態５１
前記抗原ユニットが、１又は複数の共有癌抗原の１又は複数の部分を含む、実施形態５０に記載のベクター。
実施形態５２
前記部分がエピトープである、実施形態５１に記載のベクター。
実施形態５３
前記抗原ユニットが、複数のエピトープを含む、実施形態５２に記載のベクター。
実施形態５４
前記患者提示共有癌抗原が、過剰発現又は異常発現したヒト細胞タンパク質、癌精巣抗原、分化抗原、ウイルス抗原、変異癌遺伝子、変異癌抑制遺伝子、癌胎児性の抗原、共有イントロン保持抗原、フレームシフト変異により引き起こされる共有抗原、ダークマター抗原（ｄａｒｋ ｍａｔｔｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、及びスプライセオソーム変異により引き起こされる共有抗原、骨髄腫又はリンパ腫によって産生されるモノクローナルＩｇに由来するｓｃＦｖ、テロメラーゼ、ＨＩＶ抗原、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質（ＴＲＰ）－１、ＴＲＰ－２、メラノーマ抗原、前立腺特異抗原、及びＨＰＶ抗原からなる群より選択される、実施形態５０～５３のいずれかに記載のベクター。
実施形態５５
前記抗原ユニットが、１又は複数の感染性抗原又はその一部を含む、実施形態１～３３のいずれかに記載のベクター。
実施形態５６
前記抗原ユニットが、１又は複数の全長感染性抗原、若しくはそのような全長感染性抗原の１又は複数の部分、又は１又は複数の全長感染性抗原及びそのような全長感染性抗原の１又は複数の部分を含む、実施形態５５に記載のベクター。
実施形態５７
前記抗原ユニットが、１又は複数の感染性抗原の１又は複数の部分を含む、実施形態５５又は５６のいずれかに記載のベクター。
実施形態５８
かかる部分がＢ細胞エピトープであり、その結果、前記抗原ユニットが１又は複数の感染性抗原からの１又は複数のＢ細胞エピトープを含む、実施態様５７に記載のベクター。
実施形態５９
かかる部分がＴ細胞エピトープであり、その結果、前記抗原ユニットが１又は複数の感染性抗原からの１又は複数のＴ細胞エピトープを含む、実施態様５７に記載のベクター。
実施形態６０
前記抗原ユニットが、（ｉ）１又は複数の全長感染性抗原又はそのような抗原の１又は複数の部分、及び（ｉｉ）１又は複数の感染性抗原からの１又は複数のＴ細胞エピトープを含む、実施形態５５又は５６のいずれかに記載のベクター。
実施形態６１
１超のＴ細胞エピトープが前記サブユニット中に構成される場合、前記抗原ユニットが、サブユニットリンカーによって互いに分離された前記１又は複数のＴ細胞エピトープを含むサブユニットを含み；そして前記サブユニットが、ユニットリンカーなどの第１のリンカーによって前記多量化ユニットに連結され、かつ、第２のリンカーによって１又は複数の全長感染性抗原又はそのような抗原の部分から分離される、実施形態６０に記載のベクター。
実施形態６２
前記抗原ユニットが、１又は複数の病原体由来の１又は複数の抗原又はその一部を含む、実施形態１～３３のいずれかに記載のベクター。
実施形態６３
前記抗原ユニットが、１又は複数の病原体由来の１又は複数の全長抗原、若しくはそのような全長抗原の１又は複数の部分、又は１又は複数の病原体由来の１又は複数の全長抗原及びそのような全長抗原の１又は複数の部分を含む、実施形態６２に記載のベクター。
実施形態６４
前記抗原ユニットが１又は複数の病原体に由来する１又は複数の抗原の１又は複数の部分を含む、実施形態６２又は６３のいずれかに記載のベクター。
実施形態６５
かかる部分がＢ細胞エピトープであり、その結果、前記抗原ユニットが１又は複数の病原体に由来する１又は複数のＢ細胞エピトープを含む、実施形態６４に記載のベクター。
実施形態６６
かかる部分がＴ細胞エピトープであり、その結果、前記抗原ユニットが１又は複数の病原体に由来する１又は複数のＴ細胞エピトープを含む、実施形態６４に記載のベクター。
実施形態６７
前記抗原ユニットが、（ｉ）１又は複数の病原体に由来する１又は複数の全長抗原又はかかる抗原の１又は複数の部分、及び（ｉｉ）１又は複数の病原体に由来する１又は複数のＴ細胞エピトープを含む、実施形態６２又は６３のいずれかに記載のベクター。
実施形態６８
１超のＴ細胞エピトープが前記サブユニット中に構成される場合、前記抗原ユニットが、サブユニットリンカーによって互いに分離された前記１又は複数のＴ細胞エピトープを含むサブユニットを含み；そして前記サブユニットが、ユニットリンカーなどの第１のリンカーによって前記多量化ユニットに連結され、かつ、第２のリンカーによって１又は複数の全長感染性抗原又はそのような抗原の部分から分離される、実施形態６７に記載のベクター。
実施形態６９
前記１又は複数の病原体が、ウイルス、細菌、真菌及び寄生虫からなる群より選択される、実施形態６２～６８のいずれかに記載のベクター。
実施形態７０
前記１又は複数の抗原が、結核抗原、ＯＭＰ３１のようなブルセラ症抗原、ｇｐ１２０由来の配列のようなＨＩＶ抗原、糖タンパク質ＤのようなＨＳＶ－２抗原、ヘマグルチニン、ヌクレオタンパク質及びＭ２のようなインフルエンザウイルス抗原、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１又はＬ２、例えばＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８のＥ６及びＥ７のようなＨＰＶ抗原、ＣＭＶ抗原、ＨＢＶ抗原、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ抗原、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ抗原、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原のようなベータコロナウイルス抗原からなる群より選択される、実施形態５５～６８のいずれかに記載のベクター。
実施形態７１
前記抗原ユニットが、最大３５００個のアミノ酸、例えば約２１個～約２０００個のアミノ酸、又は約６０個～３５００個のアミノ酸、例えば約８０個又は約１００個又は約１５０個～約３０００個のアミノ酸、例えば約２００個～約２５００個のアミノ酸、例えば約３００個～約２０００個のアミノ酸、又は約４００個～約１５００個のアミノ酸、又は約５００個～約１０００個のアミノ酸を含む、先の実施形態のいずれかに記載のベクター。
実施形態７２
前記ターゲティングユニットが抗原提示細胞上の表面分子と相互作用する部分であるか、又はそれを含み、好ましくは、前記ターゲティングユニットがヒト抗原提示細胞上の表面分子と相互作用する部分であるか、又はそれを含む、先の実施形態のいずれかに記載のベクター。
実施形態７３
前記表面分子が、ＭＨＣ、ＣＤ１４、ＣＤ４０、ＣＬＥＣ９Ａ、ケモカインレセプター、例えば、ＣＣＲ１、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８及びＸＣＲ１、及びＴｏｌｌ様受容体、例えば、ＴＬＲ－２、ＴＬＲ－４又はＴＬＲ－５からなる群より選択される、好ましくは、前記表面分子が、ＨＬＡ、ｈＣＤ１４、ｈＣＤ４０、ｈＣＬＥＣ９Ａ、ヒトケモカイン受容体、例えば、ｈＣＣＲ１、ｈＣＣＲ３、ｈＣＣＲ４、ｈＣＣＲ５、ｈＣＣＲ６、ｈＣＣＲ７、ｈＣＣＲ８及びｈＸＣＲ１及びトＴｏｌｌ様受容体、例えば、ｈＴＬＲ－２、ｈＴＬＲ－４又はｈＴＬＲ－５からなる群より選択される、実施形態７２に記載のベクター。
実施形態７４
前記ターゲティングユニットが、可溶性ＣＤ４０リガンド、好ましくは、ヒト可溶性ＣＤ４０リガンド、ＣＣＬ４及びそのアイソフォーム、好ましくは、ヒトＣＣＬ４及びそのアイソフォーム、ＣＣＬ５、好ましくは、ヒトＣＣＬ５、ＣＣＬ１９、好ましくは、ヒトＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、好ましくは、ヒトＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、好ましくは、ヒトＣＣＬ２１、そのアイソフォーム、例えば、マウスＣＣＬ３、ヒトＣＣＬ３、ヒトＣＣＬ３Ｌ１、ヒトＣＣＬ３Ｌ２及びヒトＣＣＬ３Ｌ３、ＸＣＬ１、好ましくは、ヒトＸＣＬ１、ＸＣＬ２、好ましくは、ヒトＸＣＬ２を含むマクロファージ炎症性タンパク質α、フラジェリン、抗ＨＬＡ－ＤＰ、抗ＨＬＡ－ＤＲ、抗パンＨＬＡクラスＩＩ、抗ＣＤ４０、好ましくは、抗ヒトＣＤ４０、抗ＴＬＲ－２、好ましくは、抗ヒトＴＬＲ－２、抗ＴＬＲ－４、好ましくは、抗ヒトＴＬＲ－４、抗ＴＬＲ－５、好ましくは、抗ヒトＴＬＲ－５、又は抗ＣＬＥＣ９Ａ、好ましくは、抗ヒトＣＬＥＣ９Ａを含むか、又はからなる、実施形態７２及び７３に記載のベクター。
実施形態７５
前記ターゲティングユニットが、ヒトＭＩＰ－１α（ＬＤ７８β、ＣＣＬ３Ｌ１）を含むか、又はそれを含む、実施形態７４に記載のベクター。
実施形態７６
前記ターゲティングユニットが、配列番号１のアミノ酸配列２４～９３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、配列番号１のアミノ酸配列２６～９３を含むか、又は配列番号１のアミノ酸配列２８～９３を含む、実施形態７５に記載のベクター。
実施形態７７
前記ターゲティングユニットが、配列番号１のアミノ酸配列２４～９３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、配列番号１のアミノ酸配列２６～９３からなるか、又は配列番号１のアミノ酸配列２８～９３からなる、実施形態７６に記載のベクター。
実施形態７８
前記ターゲティングユニットが、配列番号１のアミノ酸配列２４～９３からなる、実施形態７７に記載のベクター。
実施形態７９
前記多量体化ユニットが、二量体化ユニット、三量体化ユニット、例えばコラーゲン由来の三量体化ユニット、例えば、ヒトコラーゲン由来の三量体化ドメイン、例えば、ヒトコラーゲン由来のＸＶＩＩＩ三量体化ドメイン、又はヒトコラーゲンＸＶ三量体化ドメイン、又はＴ４フィブリチンのＣ末端ドメイン、及びｐ５３由来のドメインのような四量体化ユニットからなる群から選択され、前記多量体化ユニットは、任意選択で、ヒンジエキソンｈ１及びヒンジエキソンｈ４のようなヒンジ領域を含む、先の実施形態のいずれかに記載のベクター。
実施形態８０
前記ベクターが、１又は複数の共有結合を形成する能力を有するヒンジ領域を含む、実施形態７９に記載のベクター。
実施形態８１
前記ヒンジ領域がＩｇ由来である、実施形態７９又は８０のいずれかに記載のベクター。
実施形態８２
前記多量体化ユニットが二量体化ユニットであり、そして、前記二量体化ユニットが、二量体化を促進する別のドメインをさらに含む、実施形態７９～８１のいずれかに記載のベクター。
実施形態８３
前記他のドメインが免疫グロブリンドメイン、好ましくは免疫グロブリン定常ドメインである、実施形態８２に記載のベクター。
実施形態８４
前記他のドメインがＩｇＧ、好ましくはＩｇＧ３由来のカルボキシ末端Ｃドメインである、実施形態８２又は８３のいずれかに記載のベクター。
実施形態８５
前記二量体化ユニットが、ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ（配列番号１３４）のようなグリシン－セリンリッチリンカーのような二量体化ユニットリンカーをさらに含む、実施形態８２～８４のいずれかに記載のベクター。
実施形態８６
前記二量体化ユニットリンカーが、前記ヒンジ領域と二量体化を促進する他のドメインとを連結する、実施形態８５に記載のベクター。
実施形態８７
前記二量体化ユニットが、ヒンジエクソンｈ１及びヒンジエクソンｈ４、二量体化ユニットリンカー、及びヒトＩｇＧ３のＣＨ３ドメインを含む、実施形態８２～８６のいずれかに記載のベクター。
実施形態８８
前記二量体化ユニットが、配列番号１のアミノ酸配列９４～２３７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態８７に記載のベクター。
実施形態８９
前記二量体化ユニットが、配列番号１のアミノ酸配列９４～２３７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、実施形態８８に記載のベクター。
実施形態９０
前記二量体化ユニットが、配列番号１のアミノ酸配列９４～２３７からなる、実施形態８９に記載のベクター。
実施形態９１
前記第１の核酸配列が、前記抗原ユニットと前記多量体化ユニットとを連結するユニットリンカーをさらに含む第１のポリペプチドをコードし、前記ユニットリンカーが、非免疫原性リンカー及び／又はフレキシブルもしくはリジッドリンカーである、先の実施形態のいずれかに記載のベクター。
実施形態９２
第１の核酸配列がシグナルペプチドをさらに含む第１のポリペプチドをコードし、好ましくは、前記シグナルペプチドが前記ターゲティングユニットであるタンパク質のナチュラルリーダー配列である、先の実施形態のいずれかに記載のベクター。
実施形態９３
前記シグナルペプチドが、Ｉｇ ＶＨシグナルペプチド、ヒトＴＰＡシグナルペプチド及びヒトＭＩＰ－１αシグナルペプチドからなる群より選択される、実施形態９２に記載のベクター。
実施形態９４
前記ターゲティングユニットがヒトＭＩＰ－１αであり、かつ、前記シグナルペプチドが配列番号１のアミノ酸配列１～２３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態９２又は９３のいずれかに記載のベクター。
実施形態９５
前記シグナルペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列１～２３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、実施形態９４に記載のベクター。
実施形態９６
前記シグナルペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列１～２３からなる、実施形態９５に記載のベクター。
実施形態９７
前記１又は複数のさらなる核酸配列がシグナルペプチドをさらにコードする、先の実施形態のいずれかに記載のベクター。
実施形態９８
前記シグナルペプチドが、前記免疫刺激性化合物のナチュラルリーダー配列である、実施形態９７に記載のベクター。
実施形態９９
前記ベクターが、ＲＮＡウイルスベクターもしくはＤＮＡウイルスベクターなどのウイルスベクター、又はＲＮＡプラスミドもしくはＤＮＡプラスミドなどのプラスミドである、先の実施形態のいずれかに記載のベクター。
実施形態１００
実施形態１～９９のいずれかに記載のベクターを製造する方法であって、
ａ）インビトロで細胞を前記ベクターでトランスフェクトする工程
ｂ）前記細胞を培養する工程
ｃ）任意に、前記細胞を溶解して前記ベクターを前記細胞から遊離させる工程；そして
ｄ）前記ベクターを回収し、任意に精製する工程、
を含む方法。
実施形態１０１
実施形態１～９９のいずれかに記載のベクターを含む宿主細胞であって、例えば、原核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、動物又はヒト由来の細胞などの高等真核細胞からなる群から選択される宿主細胞。
実施形態１０２
医薬品として使用するための、実施形態１～９９のいずれかに記載のベクター。
実施形態１０３
実施形態１～９９のいずれかに記載のベクターと、薬学的に許容される担体又は希釈剤とを含む医薬組成物。
実施形態１０４
薬学的に許容される担体又は希釈剤が、生理食塩水、緩衝生理食塩水、例えばＰＢＳ、ブドウ糖、水、グリセロール、エタノール、等張水性緩衝液及びタイロード緩衝液（Ｔｙｒｏｄｅ’ｓ ｂｕｆｆｅｒ）、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、実施形態１０３に記載の医薬組成物。
実施形態１０５
前記組成物がトランスフェクション剤をさらに含む、実施形態１０３又は１０４のいずれかに記載の医薬組成物。
実施形態１０６
前記組成物が、ポリ（エチレンオキシド）及びポリプロピレンオキシド）のブロックを含む薬学的に許容される両親媒性ブロックコポリマーをさらに含み、例えば、ポリ（エチレンオキシド）及びポリプロピレンオキシド）のブロックを含む薬学的に許容される両親媒性ブロックポリマーを０．２％ ｗ／ｖ～２０％ ｗ／ｖの量でさらに含む、実施形態１０３～１０５のいずれかに記載の組成物。
実施形態１０７
前記組成物が、０．１～１０ｍｇの範囲の前記ベクター、例えば前記ＤＮＡプラスミドを含む、実施形態１０３～１０６のいずれかに記載の医薬組成物。
実施形態１０８
疾患を有するか又は前記疾患の予防を必要とする対象を処置する方法であって、実施形態１～９９のいずれかに記載されるベクター又は実施形態１０～１０８のいずれかに記載される医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。
実施形態１０９
前記ベクター又は前記医薬組成物が、治療的又は予防的に有効な量で投与される、実施形態１０８に記載の方法。
実施形態１１０
ベクター又は医薬組成物が、皮内、筋肉内、若しくは皮下注射によって、又は鼻腔内若しくは経口などの粘膜若しくは上皮適用によって投与される、実施形態１０８又は１０９のいずれかに記載の方法。
実施形態１１１
癌を有する対象を治療する方法であって、実施形態１～５４及び７１～９９のいずれかに記載されるベクター、又はそのようなベクターを含む実施形態１０３～１０７のいずれかに記載される医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。
実施形態１１２
前記ベクター又は前記医薬組成物が、治療上有効な量で投与される、実施形態１１１に記載の方法。
実施形態１１３
前記ベクター又は前記医薬組成物が、皮内、筋肉内、若しくは皮下注射によって、又は鼻腔内若しくは経口などの粘膜若しくは上皮適用によって投与される、実施形態１１１～１１２のいずれかに記載の方法。
実施形態１１４
前記癌が、液体癌又は固体癌、例えば、乳癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、骨癌、結腸直腸癌、胃癌、リンパ腫、悪性黒色腫、肝臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、甲状腺癌、腎臓癌、胆管癌、脳腫瘍、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、ホジキン病（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）及び副腎皮質癌からなる群から選択される癌である、実施形態１１１～１１３のいずれかに記載の方法。
実施形態１１５
感染症を有するか又は感染症の予防を必要とする対象を処置するための方法であって、実施形態１～３３、５５～７０及び７１～９９のいずれかに記載されるベクター、又はそのようなベクターを含む、実施形態１０３～１０７のいずれかに記載される医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。
実施形態１１６
前記ベクター又は前記医薬組成物が、治療的又は予防的に有効な量で投与される、実施形態１１５に記載の方法。
実施形態１１７
ベクター又は医薬組成物が、皮内、筋肉内、若しくは皮下注射によって、又は鼻腔内若しくは経口などの粘膜若しくは上皮適用によって投与される、実施形態１１６～１１６のいずれかに記載の方法。

Claims (62)

  1. （ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列、ここで、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的とするターゲティングユニットと、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと、１又は複数の抗原又はその一部、例えば１又は複数の疾患関連抗原又はその一部を含む抗原ユニットとを含み；及び
    （ｂ）１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする１又は複数のさらなる核酸配列
    を含むベクターであって、
    前記ベクターは、第１のポリペプチドと前記１又は複数の免疫刺激性化合物とを別々の分子として共発現させることができる、前記ベクター。
  2. 前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、抗原提示細胞、好ましくはヒト抗原提示細胞の誘引及び／又は活性化及び／又は成熟及び／又は増殖、例えば、成長及び／又は拡大を促進する、請求項１に記載のベクター。
  3. 前記１又は複数の免疫刺激性化合物が抗原提示細胞の誘引を促進する、請求項１又は２のいずれかに記載のベクター。
  4. 前記１又は複数の免疫刺激性化合物がケモカイン、好ましくはヒトケモカインである、請求項３に記載のベクター。
  5. 前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ＣＣＲ１、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８及びＸＣＲ１からなる群より選択される抗原提示細胞上の表面分子と相互作用し得る、好ましくは、前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ｈＣＣＲ１、ｈＣＣＲ３、ｈＣＣＲ４、ｈＣＣＲ５、ｈＣＣＲ６、ｈＣＣＲ７、ｈＣＣＲ８及びｈＸＣＲ１からなる群より選択されるヒト抗原提示細胞上の表面分子と相互作用し得る、請求項４に記載のベクター。
  6. 前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、例えば、マウスＣＣＬ３、ヒトＣＣＬ３、ヒトＣＣＬ３Ｌ１、ヒトＣＣＬ３Ｌ２及びヒトＣＣＬ３Ｌ３、ＣＣＬ４、好ましくはヒトＣＣＬ４、ＣＣＬ５、好ましくはヒトＣＣＬ５、ＣＣＬ１９、好ましくはヒトＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、好ましくはヒトＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、好ましくはヒトＣＣＬ２１、ＸＣＬ１、好ましくはヒトＸＣＬ１及びＸＣＬ２、好ましくはヒトＸＣＬ２などのそのアイソフォームを含むマクロファージ炎症性タンパク質αからなるリストから選択される、請求項４又は５のいずれかに記載のベクター。
  7. 前記１又は複数の免疫刺激性化合物が抗原提示細胞の活性化及び／又は成熟を促進する、請求項２～６のいずれか一項に記載のベクター。
  8. 前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ＣＤ４０（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７、ＲＡＮＫ、及びＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）を含むＴＮＦ受容体スーパーファミリーの受容体からなる群から選択される抗原提示細胞上の表面分子と相互作用し得る、好ましくは、前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ｈＣＤ４０、ｈＣＤ１３７、ｈＣＤ２７、ｈＲＡＮＫ及びｈＩＣＯＳを含むヒトＴＮＦ受容体スーパーファミリーの受容体からなる群から選択されるヒト抗原提示細胞上の表面分子と相互作用し得る、請求項２～７のいずれか一項に記載のベクター。
  9. 前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ７０、ＲＡＮＫＬ及びＩＣＯＳＬからなるリストから選択される、好ましくは、前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ｈＣＤ４０Ｌ、ｈＣＤ１３７Ｌ、ｈＣＤ７０、ｈＲＡＮＫＬ及びｈＩＣＯＳＬからなるリストから選択される、請求項８に記載のベクター。
  10. 前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、ＴＮＦα、ＩＦＮγ及びＩＬ－１βからなる群より選択されるサイトカインであり、好ましくは、前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ｈＩＬ－２、ＩｈＬ－１０、ｈＩＬ－１２、ｈＩＬ－２１、ｈＴＮＦα、ｈＩＦＮγ及びｈＩＬ－１βからなる群より選択されるヒトサイトカインである、請求項２～７のいずれか一項に記載のベクター。
  11. 前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ＭｙＤ８８又はＴＲＩＦなどのウイルス感染センサー、好ましくはヒトＭｙＤ８８又はヒトＴＲＩＦなどのヒトウイルス感染センサーである、請求項２～７のいずれか一項に記載のベクター。
  12. 前記１若しくは複数の免疫刺激性化合物が、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５及びＴＬＲ９を含むＴｏｌｌ様受容体のような抗原提示細胞上のパターン認識受容体、並びに／又はＲＡＧＥ、ＴＩＭ－３、ＦＰＲ、ＳＲＥＣ１、ＬＯＸ１及びＣＤ９１からなる群から選択される抗原提示細胞上の受容体と相互作用し得る、好ましくは、前記１若しくは複数の免疫刺激性化合物が、ｈＴＬＲ２、ｈＴＬＲ４、ｈＴＬＲ５及びｈＴＬＲ９を含むヒトＴｏｌｌ様受容体のようなヒト抗原提示細胞上のパターン認識受容体、並びに／又はｈＲＡＧＥ、ｈＴＩＭ－３、ｈＦＰＲ、ｈＳＲＥＣ１、ｈＬＯＸ１及びｈＣＤ９１からなる群から選択されるヒト抗原提示細胞上の受容体と相互作用し得る、請求項２～７のいずれか一項に記載のベクター。
  13. 前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、フラジェリンなどの病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、ＨＭＧＢ１、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、カルレクチクリン（Ｃａｌｒｅｃｔｉｃｕｌｉｎ）及びアネキシンＡ１などのタンパク質ダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰ）からなる群から選択される、好ましくは、前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ヒト病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、ｈＨＭＧＢ１、ヒト熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、ヒトカルレクチクリン及びヒトアネキシンＡ１などのヒトタンパク質ダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰ）からなる群から選択される、請求項１２に記載のベクター。
  14. 前記１又は複数の免疫刺激性化合物が抗原提示細胞の成長及び／又は拡大を促進する、請求項２～１３のいずれか一項に記載のベクター。
  15. 前記１又は複数の免疫刺激性化合物が成長因子、好ましくはヒト成長因子である、請求項２～１４のいずれかに記載のベクター。
  16. 前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ＧＭ－ＣＳＦ－レセプター、ＦＬＴ－３Ｒ、ＩＬ－１５Ｒ及びＩＬ－４Ｒからなる群より選択される抗原提示細胞上の表面分子と相互作用し得る、好ましくは、前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ｈＧＭ－ＣＳＦ－レセプター、ｈＦＬＴ－３Ｒ、ｈＩＬ－１５Ｒ及びｈＩＬ－４Ｒからなる群より選択されるヒト抗原提示細胞上の表面分子と相互作用し得る、請求項２～１４のいずれか一項に記載のベクター。
  17. 前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ＧＭ－ＣＳＦ、ＦＬＴ－３Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－４からなる群より選択され、好ましくは、前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ｈＧＭ－ＣＳＦ、ｈＦＬＴ－３Ｌ、ｈＩＬ－１５及びｈＩＬ－４からなる群より選択される、請求項１５又は１６のいずれに記載のベクター。
  18. 前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ＩＬ－４、ＩＬ－１β、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＬ－１５、ＴＮＦα、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＭｙＤ８８、ＴＲＩＦ、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ－５、Ｃ３ｄのＰ２８領域、ＩＬ－１３、ＩＦＮε、ＩＦＮκ、ＩＦＮω、ＩＦＮβ及びＩＬ－６からなるリストから選択され、好ましくは、前記１又は複数の免疫刺激性化合物が、ｈＩＬ－４、ｈＩＬ－１β、ｈＩＦＮγ、ｈＩＦＮα、ｈＩＬ－１５、ｈＴＮＦα、ｈＩＬ－１０、ｈＩＬ－１２、ｈＩＬ－２、ｈＩＬ－２１、ｈＭｙＤ８８、ｈＴＲＩＦ、ｈＲＩＧ－Ｉ、ｈＭＤＡ－５、ｈＣ３ｄのＰ２８領域、ｈＩＬ－１３、ｈＩＦＮε、ｈＩＦＮκ、ｈＩＦＮω、ｈＩＦＮβ及びｈＩＬ－６からなるリストから選択される、請求項１～１７のいずれか一項に記載のベクター。
  19. 前記ベクターが、１超の免疫刺激性化合物、例えば、２、３、４、５、６、７又は８の免疫刺激性化合物、例えば２、３、４、５、６、７又は８の異なる免疫刺激性化合物をコードする複数のさらなる核酸配列を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のベクター。
  20. 前記複数の免疫刺激性化合物が、抗原提示細胞を異なるように影響する（例えば刺激するなど）異なる免疫刺激性化合物である、請求項１９に記載のベクター。
  21. 前記ベクターが１又は複数の共発現エレメントを含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のベクター。
  22. 前記１又は複数の共発現エレメントが、単一の転写産物上の第１のポリペプチド及び前記１又は複数の免疫刺激性化合物の転写と、別個の第１のポリペプチド及び別個の１又は複数の免疫刺激性化合物への独立した翻訳とを引き起こす、請求項２１に記載のベクター。
  23. 前記１又は複数の共発現エレメントがＩＲＥＳエレメント又は２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸配列である、請求項２１又は２２のいずれか一項に記載のベクター。
  24. 前記１又は複数の共発現エレメントが、別々の転写産物として、第１のポリペプチド及び前記１又は複数の免疫刺激性化合物の転写を引き起こす、請求項２１に記載のベクター。
  25. 前記１又は複数の共発現エレメントが、ａ）双方向性プロモーターであるか、又はｂ）プロモーターであり、前記ベクターが、第１のポリペプチド及び前記１又は複数の免疫刺激性化合物をコードする核酸配列の各々に対して別々のプロモーターを含む、請求項２４に記載のベクター。
  26. 前記抗原ユニットが、ネオエピトープなどの１又は複数のネオ抗原又はその一部を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載のベクター。
  27. 前記抗原ユニットが、リンカーによって互いに分離された複数のネオエピトープなどの複数のネオエピトープを含む、請求項２６に記載のベクター。
  28. 前記抗原ユニットが、１又は複数の患者提示共有癌抗原又はその一部、例えば患者提示共有癌エピトープをさらに含む、請求項２６又は２７のいずれかに記載のベクター。
  29. 前記抗原ユニットが、１又は複数の患者提示共有癌抗原又はその一部、例えば患者提示共有癌エピトープを含む、請求項１～２５のいずれ一項に記載のベクター。
  30. 前記抗原ユニットが、１又は複数の共有癌抗原又はその一部、例えば、共有癌エピトープを含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載のベクター。
  31. 前記抗原ユニットが、１又は複数の病原体由来の１又は複数の抗原又はそのような抗原の一部を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載のベクター。
  32. 前記抗原ユニットが、１若しくは複数の病原体に由来する１若しくは複数の全長抗原、若しくはそのような全長抗原の１若しくは複数の部分、又は１若しくは複数の病原体に由来する１若しくは複数の全長抗原及びそのような全長抗原の１若しくは複数の部分を含む、請求項３１に記載のベクター。
  33. 前記抗原ユニットが、１又は複数の病原体に由来する１又は複数の抗原の１又は複数の部分を含む、請求項３１又は３２のいずれかに記載のベクター。
  34. かかる部分がＢ細胞エピトープであり、その結果、前記抗原ユニットが１又は複数の病原体に由来する１又は複数のＢ細胞エピトープを含む、請求項３３に記載のベクター。
  35. かかる部分がＴ細胞エピトープであり、その結果、前記抗原ユニットが１又は複数の病原体に由来する１又は複数のＴ細胞エピトープを含む、請求項３３に記載のベクター。
  36. 前記抗原ユニットが、（ｉ）１若しくは複数の病原体に由来する１若しくは複数の全長抗原、又はかかる抗原の１若しくは複数の部分、及び（ｉｉ）１又は複数の病原体に由来する１又は複数のＴ細胞エピトープを含む、請求項３１又は３２のいずれかに記載のベクター。
  37. 前記１又は複数の病原体が、ウイルス、細菌、真菌及び寄生虫からなる群より選択される、請求項３１～３６のいずれ一項に記載のベクター。
  38. 前記ターゲティングユニットが、抗原提示細胞上の表面分子と相互作用する部分であるか、又は含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載のベクター。
  39. 前記表面分子が、ＭＨＣ、ＨＬＡ、ＣＤ１４、ＣＤ４０、ＣＬＥＣ９Ａ、ケモカインレセプター、例えば、ＣＣＲ１、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８又はＸＣＲ１、及びＴｏｌｌ様受容体、例えば、ＴＬＲ－２、ＴＬＲ－４又はＴＬＲ－５からなる群より選択される、好ましくは、前記表面分子が、ＨＬＡ、ｈＣＤ１４、ｈＣＤ４０、ｈＣＬＥＣ９Ａ、ヒトケモカイン受容体、例えば、ｈＣＣＲ１、ｈＣＣＲ３、ｈＣＣＲ４、ｈＣＣＲ５、ｈＣＣＲ６、ｈＣＣＲ７、ｈＣＣＲ８又はｈＸＣＲ１、及びヒトＴｏｌｌ様受容体、例えば、ｈＴＬＲ－２、ｈＴＬＲ－４又はｈＴＬＲ－５からなる群より選択される、請求項３８に記載のベクター。
  40. 前記ターゲティングユニットが、可溶性ＣＤ４０リガンド、ＣＣＬ４及びそのアイソフォーム、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、例えば、マウスＣＣＬ３、ヒトＣＣＬ３、ヒトＣＣＬ３Ｌ１、ヒトＣＣＬ３Ｌ２及びヒトＣＣＬ３Ｌ３、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２などのアイソフォームを含むマクロファージ炎症性タンパク質α、フラジェリン、抗ＨＬＡ－ＤＰ、抗ＨＬＡ－ＤＲ、抗パンＨＬＡクラスＩＩ、抗ＣＤ４０、抗ＴＬＲ－２、抗ＴＬＲ－４、抗ＴＬＲ－５又は抗ＣＬＥＣ９Ａを含むか、又はからなる、好ましくは、前記ターゲティングユニットが、可溶性ｈＣＤ４０リガンド、ｈＣＣＬ４及びそのアイソフォーム、ｈＣＣＬ５、ｈＣＣＬ１９、ｈＣＣＬ２０、ｈＣＣＬ２１、例えば、ヒトＣＣＬ３、ヒトＣＣＬ３Ｌ１、ヒトＣＣＬ３Ｌ２及びヒトＣＣＬ３Ｌ３、ｈＸＣＬ１、ｈＸＣＬ２などのアイソフォームを含むヒトマクロファージ炎症性タンパク質α、抗ＨＬＡ－ＤＰ、抗ＨＬＡ－ＤＲ、抗パンＨＬＡクラスＩＩ、抗ｈＣＤ４０、抗ｈＴＬＲ－２、抗ｈＴＬＲ－４、抗ｈＴＬＲ－５又は抗ｈＣＬＥＣ９を含むか、又はからなる、請求項３８又は３９に記載のベクター。
  41. 前記ターゲティングユニットがヒトＭＩＰ－１α（ＬＤ７８β、ＣＣＬ３Ｌ１）を含むか、又はからなる、請求項４０に記載のベクター。
  42. 前記多量体化ユニットが、二量体化ユニット、三量体化ユニット、例えばコラーゲン由来の三量体化ユニット、例えば、ヒトコラーゲン由来の三量体化ドメイン、例えば、ヒトコラーゲン由来のＸＶＩＩＩ三量体化ドメイン、又はヒトコラーゲンＸＶ三量体化ドメイン、又はＴ４フィブリチンのＣ末端ドメイン、及びｐ５３由来のドメインのような四量体化ユニットからなる群から選択され、前記多量体化ユニットは、任意選択で、ヒンジエキソンｈ１及びヒンジエキソンｈ４のようなヒンジ領域を含む、請求項１～４１のいずれか一項に記載のベクター。
  43. 前記ベクターが、１又は複数の共有結合を形成する能力を有し、そして、好ましくはＩｇ由来であるヒンジ領域を含む、請求項４２に記載のベクター。
  44. 前記多量体化ユニットが二量体化ユニットであり、前記二量体化ユニットが二量体化を促進する別のドメインをさらに含み、好ましくは、前記他のドメインが免疫グロブリンドメイン、より好ましくは免疫グロブリン定常ドメインである、請求項４２又は４３のいずれかに記載のベクター。
  45. 前記他のドメインがＩｇＧ、好ましくはＩｇＧ３由来のカルボキシ末端Ｃドメインである、請求項４４に記載のベクター。
  46. 前記二量体化ユニットが、ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ（配列番号１３４）のようなグリシン－セリンリッチリンカーのような二量体化ユニットリンカーをさらに含み、そして、好ましくは、前記二量体化ユニットリンカーが前記ヒンジ領域と二量体化を促進する前記他のドメインとを連結する、請求項４４～４５のいずれかに記載のベクター。
  47. 前記二量体化ユニットが、ヒンジエクソンｈ１及びヒンジエクソンｈ４、二量体化ユニットリンカー及びヒトＩｇＧ３のＣＨ３ドメインを含む、請求項４４～４６のいずれか一項に記載のベクター。
  48. 前記第１の核酸配列が、前記抗原ユニットと前記多量体化ユニットとを連結するユニットリンカーをさらに含む第１のポリペプチドをコードし、前記ユニットリンカーが、非免疫原性リンカー及び／又はフレキシブルもしくはリジッドリンカーである、請求項１～４７のいずれかに記載のベクター。
  49. 前記第１の核酸配列がシグナルペプチドをさらに含む第１のポリペプチドをコードし、好ましくは、１又は複数のさらなる核酸配列もシグナルペプチドをさらにコードする、請求項１～４８のいずれか一項に記載のベクター。
  50. 前記ベクターが、ＲＮＡウイルスベクターもしくはＤＮＡウイルスベクターなどのウイルスベクター、又はＲＮＡプラスミドもしくはＤＮＡプラスミドなどのプラスミドである、請求項１～４９のいずれか一項に記載のベクター。
  51. 前記請求項のいずれかに定義されるベクターを製造する方法であって、
    ａ）インビトロで細胞を前記ベクターでトランスフェクトする工程；
    ｂ）前記細胞を培養する工程；
    ｃ）任意に、前記細胞を溶解して前記ベクターを前記細胞から遊離させる工程；そして
    ｄ）前記ベクターを回収し、任意に精製する工程、
    を含む方法。
  52. 請求項１～５０のいずれかに記載のベクターを含む宿主細胞であって、例えば、原核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、動物又はヒト由来の細胞などの高等真核細胞からなる群から選択される宿主細胞。
  53. 医薬品として使用するための、請求項１～５０のいずれかに記載のベクター。
  54. 請求項１～５０のいずれかに記載のベクターと、薬学的に許容される担体又は希釈剤とを含む医薬組成物。
  55. 前記組成物がトランスフェクション剤をさらに含む、請求項５４に記載の医薬組成物。
  56. 前記組成物が０．１～１０ｍｇの範囲の前記ベクター、例えば前記ＤＮＡプラスミドを含む、請求項５４又は５５のいずれかに記載の医薬組成物。
  57. 疾患を有するか又は前記疾患の予防を必要とする対象を治療する方法であって、請求項１～５０のいずれかに記載されるベクター又は請求項５４～５６のいずれかに記載される医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法。
  58. 前記ベクター又は前記医薬組成物が、皮内、筋肉内、若しくは皮下注射によって、又は鼻腔内若しくは経口などの粘膜若しくは上皮適用によって投与されるような、治療的又は予防的に有効な量で投与される、請求項５７に記載の方法。
  59. 癌を有する対象を治療する方法であって、請求項１～３０及び３８～５０のいずれかに記載されるベクター、又はそのようなベクターを含む請求項５４～５６のいずれかに記載される医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法。
  60. 前記ベクター又は前記医薬組成物が、皮内、筋肉内、若しくは皮下注射によって、又は鼻腔内若しくは経口などの粘膜若しくは上皮適用によって投与されるような、治療上有効な量で投与される、請求項５９に記載の方法。
  61. 感染症を有するか又は感染症の予防を必要とする対象を治療する方法であって、請求項１～２５及び３１～５０のいずれかに記載されるベクター又はそのようなベクターを含む請求項５４～５６のいずれかに記載される医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法。
  62. 前記ベクター又は前記医薬組成物が、皮内、筋肉内、若しくは皮下注射によって、又は鼻腔内若しくは経口などの粘膜若しくは上皮適用によって投与されるような、治療的又は予防的に有効な量で投与される、請求項６１に記載の方法。
JP2023568692A 2021-05-10 2022-05-10 構築物と免疫刺激性化合物の共発現 Pending JP2024516882A (ja)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA202170221 2021-05-10
DKPA202170221 2021-05-10
DKPA202170364 2021-07-08
DKPA202170364 2021-07-08
DKPA202270113 2022-03-18
DKPA202270113 2022-03-18
DKPA202270186 2022-04-07
DKPA202270186 2022-04-07
PCT/EP2022/062665 WO2022238420A2 (en) 2021-05-10 2022-05-10 Co-expression of constructs and immunostimulatory compounds

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2024516882A true JP2024516882A (ja) 2024-04-17

Family

ID=82016537

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023568692A Pending JP2024516882A (ja) 2021-05-10 2022-05-10 構築物と免疫刺激性化合物の共発現

Country Status (8)

Country Link
EP (1) EP4337248A2 (ja)
JP (1) JP2024516882A (ja)
KR (1) KR20240019135A (ja)
AU (1) AU2022274154A1 (ja)
BR (1) BR112023023260A2 (ja)
CA (1) CA3216720A1 (ja)
IL (1) IL308310A (ja)
WO (1) WO2022238420A2 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024092025A1 (en) 2022-10-25 2024-05-02 Nykode Therapeutics ASA Constructs and their use

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8932603B2 (en) 2003-02-25 2015-01-13 Vaccibody As Modified antibody
WO2011161244A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Vaccibody As Homodimeric protein constructs
AU2012356969B2 (en) 2011-12-21 2017-05-04 Nykode Therapeutics ASA Vaccines against HPV
EP3362103A4 (en) * 2015-10-12 2020-02-05 Nantomics, LLC COMPOSITIONS AND METHODS USING VIRAL CANCER NEOEPITOPES
KR20180100659A (ko) 2016-01-08 2018-09-11 백시바디 에이에스 치료적 항암 네오에피토프 백신
BR112021005702A8 (pt) 2018-09-27 2022-11-08 Vaccibody As Método para selecionar neoepítopos
CN113631185A (zh) 2019-02-27 2021-11-09 尼克塔治疗公司 用于治疗癌症的免疫治疗组合
WO2020221783A1 (en) 2019-04-29 2020-11-05 Vaccibody As Methods for pre-selection of neoepitopes
KR20230004585A (ko) 2020-04-09 2023-01-06 니코데 테라퓨틱스 에이에스에이 개별화된 치료용 항암 백신
JP2023524054A (ja) 2020-05-01 2023-06-08 ナイコード セラピューティクス アルメン アクスイェ セルスカプ ベータコロナウイルスの予防と治療
EP4181949A1 (en) 2020-07-14 2023-05-24 Evaxion Biotech A/S Apc targeting units for immunotherapy

Also Published As

Publication number Publication date
EP4337248A2 (en) 2024-03-20
IL308310A (en) 2024-01-01
AU2022274154A1 (en) 2023-11-16
CA3216720A1 (en) 2022-11-17
KR20240019135A (ko) 2024-02-14
WO2022238420A3 (en) 2022-12-22
WO2022238420A2 (en) 2022-11-17
BR112023023260A2 (pt) 2024-01-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11479605B2 (en) Homodimeric protein constructs
CN105025932B (zh) 癌疫苗及使用其的治疗方法
JP2022017499A (ja) 治療用抗癌ネオエピトープワクチン
JP2019510488A (ja) 抗腫瘍免疫を誘導するための、腫瘍関連抗原の複数のエピトープを発現するウイルスベクター
WO2010030002A1 (ja) 外来性ｇｉｔｒリガンド発現細胞
CN111533812B (zh) 针对sars-cov-2病毒的dna疫苗及其用途
Mansilla et al. Eradication of large tumors expressing human papillomavirus E7 protein by therapeutic vaccination with E7 fused to the extra domain a from fibronectin
JP6430949B2 (ja) Ｇｍ−ｃｓｆとｉｌ−４のコンジュゲート、組成物、ならびにそれに関連する方法
US8981057B2 (en) B-cell stimulating fusion proteins of an antigen with BAFF or APRIL
KR20230004585A (ko) 개별화된 치료용 항암 백신
WO2018161092A1 (en) Induction and enhancement of antitumor immunity involving virus vectors expressing multiple epitopes of tumor associated antigens and immune checkpoint inhibitors or proteins
JP2024516882A (ja) 構築物と免疫刺激性化合物の共発現
US20230181712A1 (en) Combination therapy with modified pbmcs and an immunoconjugate
KR20240001116A (ko) 백신접종 동안 t-세포 프라이밍을 증진시키는 데 사용하기 위한 바이러스 구축물
CN115477704A (zh) 一种基于lox1构建的嵌合抗原受体免疫细胞制备及其应用
CN118043066A (zh) 构建体和免疫刺激性化合物的共表达
WO2024092025A1 (en) Constructs and their use
KR102297440B1 (ko) 표적 세포 특이적으로 결합하여 다중 면역기능이 강화된 키메라항원 및 이의용도
WO2022238381A2 (en) Immunotherapy constructs for treatment of disease
AU2022381515A1 (en) Immunogenic constructs and vaccines for use in the prophylactic and therapeutic treatment of diseases caused by sars-cov-2
WO2024100196A1 (en) Co-expression of constructs and polypeptides
JP2024511139A (ja) 癌を治療するための治療的組み合わせ
WO2022238363A1 (en) Immunogenic constructs and vaccines for use in the prophylactic and therapeutic treatment of infectious diseases
WO2024062098A1 (en) Recombinant pseudocowpox virus encoding an interleukin-12
JP2019033762A (ja) ホモ二量体タンパク質コンストラクト