JP2019510488A - 抗腫瘍免疫を誘導するための、腫瘍関連抗原の複数のエピトープを発現するウイルスベクター - Google Patents

抗腫瘍免疫を誘導するための、腫瘍関連抗原の複数のエピトープを発現するウイルスベクター Download PDF

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クリスティン パンペノ
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Abstract

少なくとも1つの腫瘍関連抗原の、複数、例えば2つ以上のエピトープをコードする、ポリヌクレオチドおよびウイルスベクター、特に、アルファウイルスベクター、例えばシンドビスウイルスベクターであって、各エピトープがプロセシング部位または酵素切断部位によって隔てられている、ポリヌクレオチドおよびウイルスベクターが提供される。記載のポリヌクレオチドおよびウイルスベクターによってコードされる、2つ以上の腫瘍関連抗原の複数のエピトープは、同じであっても異なっていてもよい。腫瘍関連抗原エピトープを発現するがんまたは腫瘍を有する哺乳動物対象を処置する方法であって、該複数のエピトープと他の免疫刺激または免疫調節成分とをコードするウイルスベクターが、抗がんまたは抗腫瘍免疫応答を生じ、高レベルのエフェクターT細胞が、腫瘍を持つ哺乳動物対象の生存可能性を増加させてエピトープスプレッディングをもたらし、その結果としてさらなる免疫応答の増強を提供する、方法が提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2016年3月4日に出願された米国仮出願第62/303,923号の恩典を主張するものであり、その内容全体は、参照によって本明細書に組み入れられる。
発明の背景
過去20年にわたって実施されてきた侵襲的な外科的アプローチおよび併用化学療法レジメンを含み得る利用可能ながん処置があるにもかかわらず、様々ながんが、免疫系の細胞による検知および破壊を日常的に回避し、そのようながんを患っている患者に対して極めて厳しい予後をもたらしている。
防御免疫を含む抗がん免疫は、免疫応答の規模と、Tセントラルメモリー細胞（Tcm）およびTエフェクターメモリー細胞（Tem）を含む記憶免疫応答の表現型との両方に基づくと考えられる。Tcmは、CD62L+CD127+表現型によって特徴付けられ、一方Temは、CD62L-CD127+表現型によって定義される。Temは、非リンパ系組織を経由して往来し、かつ、末梢において即時エフェクター機能を発揮し、一方Tcmは、二次リンパ系臓器に局在し、そこで、Tcmは、樹状細胞によって提示される抗原に遭遇したときに大規模に増殖することによって二次防衛ラインを構成する。T細胞記憶免疫応答の誘導は、サイトカイン環境、抗原刺激の長さ、および抗原の用量といった様々な因子に依存する。CD8+T細胞の記憶増大は、エフェクターメモリー表現型を有する高頻度の機能的なAg特異的CD8+T細胞プールの蓄積、および末梢臓器中での濃縮によって特徴付けられる。このタイプの応答は、がんの成長および再発に対する効果的な免疫応答にとってより力強くかつ望ましい。
シンドビスウイルス（SV）は、アポトーシスによって腫瘍細胞を殺傷することができる、プラス鎖RNAゲノムを有する腫瘍溶解性アルファウイルスである。これまで、腫瘍溶解性ウイルスを使用したがん処置アプローチは、概して、がんまたは腫瘍の完全な寛解を導いてこなかった。さらに、いくつかの腫瘍細胞は、これまでがん処置において使用されてきたウイルスによって効率的に標的とされない場合があり、したがって、このことは、抗がん処置を増強する新しい治療法および追加の手法を開発する必要性を強調している。多くのタイプのがんの治療および予防において現在存在している多くの困難を考慮すれば、新しい改良された抗がん治療物質、とりわけ腫瘍およびがん細胞に対して向けられる免疫応答を誘発する抗がん治療物質、ならびに、哺乳動物における腫瘍およびがんの処置および根絶において免疫応答を増大するためのそのような作用物質の投与法の強い必要性が存在する。
本発明は、様々な腫瘍関連抗原、腫瘍回避変異体、および異なるHLAハプロタイプによって提示される抗原に対するエフェクターT細胞応答の刺激を増大してそれによって抗腫瘍（抗がん）免疫を誘導するための、アルファウイルスタンパク質またはその断片、および1つまたは複数の腫瘍関連抗原（TAA）の複数（例えば、2つ以上）のエピトープをコードするポリヌクレオチドであって、各エピトープが酵素切断部位によって隔てられている、ポリヌクレオチド、ならびに、該ポリヌクレオチドを含むウイルスベクター、ウイルス粒子および薬学的組成物を特徴とする。特定の態様において、アルファウイルスタンパク質またはその断片は、シンドビスウイルスタンパク質またはその断片である。ある態様において、該ポリヌクレオチドはまた、1つまたは複数のサイトカイン、免疫刺激分子、もしくは細胞シグナル伝達分子、またはそのエピトープを含み得る。
本発明は、さらに、1つまたは複数の腫瘍関連抗原（TAA）の複数（例えば、2つ以上）のエピトープをコードするポリヌクレオチドであって、各エピトープが酵素切断部位によって隔てられている、ポリヌクレオチドを含む、ウイルスベクターまたはウイルス粒子を特徴とする。ある態様において、ウイルスベクターは、アルファウイルスベクターまたは偽型アルファウイルスベクターである。特定の態様において、ウイルスベクターは、シンドビスウイルスベクターである。他の態様において、ウイルスベクターは、1つまたは複数のアルファウイルスエンベロープタンパク質、例えば、E1、E2、またはE3で偽型化されたレトロウイルスまたはレンチウイルスである。他の態様において、ウイルスベクターは、シンドビスウイルスエンベロープタンパク質、例えばE1〜E3またはZZ E2で偽型化されたレトロウイルスまたはレンチウイルスである。ある態様において、腫瘍関連抗原のエピトープは、5〜50アミノ酸を含む。他の態様において、腫瘍関連抗原のエピトープは、5〜30アミノ酸、5〜25アミノ酸、5〜20アミノ酸、7〜25アミノ酸、7〜20、または7〜14アミノ酸を含む。ある態様において、酵素切断部位は、以下に記載のとおりの酵素によって認識される配列を含む。
ある局面において、本発明は、1つまたは複数の腫瘍関連抗原（TAA）の2つ以上のエピトープをコードするポリヌクレオチドであって、各エピトープが酵素切断部位によって隔てられている、ポリヌクレオチドを提供する。ある態様において、該ポリヌクレオチドは、DNAまたはRNA（一本鎖（ss）RNAであることができる）を含む。ある態様において、該ポリヌクレオチドは、以下に記載のとおりのウイルスベクターまたはウイルス粒子中に担持される。ある態様において、該ポリヌクレオチドは、5〜50アミノ酸を含む2つ以上のエピトープを含む。ある態様において、該ポリヌクレオチドは、5〜30アミノ酸を含む2つ以上のエピトープを含む。ある態様において、1つまたは複数の腫瘍関連抗原は、がん細胞もしくは腫瘍細胞の表面に（例えば、細胞外に）発現されるか、またはがん細胞もしくは腫瘍細胞の内部で細胞内に発現される。ある態様において、該ポリヌクレオチドによってコードされる2つ以上のエピトープは、表1〜28のいずれか1つに列挙される腫瘍関連抗原のアミノ酸配列を含む。
ある態様において、以下の腫瘍関連抗原の1つまたは複数の2つ以上のエピトープが、本明細書に記載されるポリヌクレオチド、ウイルスベクター、またはウイルス粒子によってコードされ得る：カリクレイン4、パピローマウイルス結合因子（PBF）、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、ウィルムス腫瘍-1（WT1）、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ様1（HSDL1）、メソテリン、がん精巣抗原（NY-ESO-1）、がん胎児性抗原（CEA）、p53、ヒト上皮成長因子受容体2／神経受容体チロシンキナーゼ（Her2/Neu）、がん関連上皮細胞接着分子（EpCAM）、卵巣および子宮がん抗原（CA125）、葉酸受容体α、精子タンパク質17、腫瘍関連差示的発現遺伝子-12（TADG-12）、ムチン-16（MUC-16）、L1細胞接着分子（L1CAM）、マンナン-MUC-1、ヒト内因性レトロウイルスK（HERV-K-MEL）、Kita-kyushu肺がん抗原-1（KK-LC-1）、ヒトがん／精巣抗原（KM-HN-1）、がん精巣抗原（LAGE-1）、メラノーマ抗原-A1（MAGE-A1）、精子表面透明帯結合タンパク質（Sp17）、滑膜肉腫Xブレイクポイント4（SSX-4）、一過性軸索糖タンパク質-1（TAG-1）、一過性軸索糖タンパク質-2（TAG-2）、Enabledホモログ（Enabled Homolog）（ENAH）、マンモグロビン（mammoglobin）-A、NY-BR-1、乳がん抗原（BAGE-1）、Bメラノーマ抗原、メラノーマ抗原-A1（MAGE-A1）、メラノーマ抗原-A2（MAGE-A2）、ムチンk、滑膜肉腫Xブレイクポイント2（SSX-2）、タキソール耐性関連遺伝子-3（TRAG-3）、トリ骨髄球腫症ウイルスがん遺伝子（c-myc）、サイクリンB1、ムチン1（MUC1）、p62、サバイビン、リンパ球共通抗原（CD45）、Dickkopf WNTシグナル伝達経路阻害因子1（DKK1）、テロメラーゼ、カーステンラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ（K-ras）、G250、腸カルボキシルエステラーゼ、アルファ-フェトプロテイン、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、カスパーゼ5（CASP-5）、シトクロムCオキシダーゼアセンブリ因子1ホモログ（COA-1）、O-結合型β-N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（OGT）、増幅された骨肉腫（Osteosarcoma Amplified）9、小胞体レクチン（OS-9）、形質転換成長因子ベータ受容体2（TGF-ベータRII）、マウス白血病糖タンパク質70（gp70）、カルシトニン関連ポリペプチドアルファ（CALCA）、プログラム細胞死1リガンド1（CD274）、マウス二重微小染色体2ホモログ（mdm-2）、アルファ-アクチニン-4、伸長因子2、リンゴ酸酵素1（ME1）、核転写因子YサブユニットC（NFYC）、G抗原1,3（GAGE-1,3）、メラノーマ抗原-A6（MAGE-A6）、がん精巣抗原XAGE-1b、前立腺の6つの膜貫通上皮抗原1（STEAP1）、PAP、前立腺特異的抗原（PSA）、線維芽細胞成長因子5（FGF5）、熱ショックタンパク質hsp70-2、メラノーマ抗原-A9（MAGE-A9）、Arg特異的ADP-リボシルトランスフェラーゼファミリーC（ARTC1）、B-Rafがん原遺伝子（B-RAF）、セリン／トレオニンキナーゼ、ベータ-カテニン、細胞分裂周期27ホモログ（Cdc27）、サイクリン依存性キナーゼ4（CDK4）、サイクリン依存性キナーゼ12（CDK12）、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子2A（CDKN2A）、カゼインキナーゼ1アルファ1（CSNK1A1）、フィブロネクチン1（FN1）、成長停止特異的7（GAS7）、糖タンパク質非転移性メラノーマタンパク質B（GPNMB）、HAUSオーグミン様複合体サブユニット3（HAUS3）、LDLR-フコシルトランスフェラーゼ、T細胞によって認識されるメラノーマ抗原2（MART2）、ミオスタチン（MSTN）、メラノーマ関連抗原（突然変異型）1（MUM-1-2-3）、ポリ（A）ポリメラーゼガンマ（ネオ-PAP）、ミオシンクラスI、プロテインホスファターゼ1調節サブユニット3B（PPP1R3B）、ペルオキシレドキシン-5（PRDX5）、受容体型チロシン-プロテインホスファターゼカッパ（PTPRK）、形質転換タンパク質N-Ras（N-ras）、網膜芽細胞腫関連因子600（RBAF600）、サーチュイン-2（SIRT2）、SNRPD1、トリオースリン酸イソメラーゼ、眼白皮症1型タンパク質（OA1）、RASがん遺伝子ファミリーメンバー（RAB38）、チロシナーゼ関連タンパク質1-2（TRP-1-2）、メラノーマ抗原Gp75（gp75）、チロシナーゼ、メラン-A（MART-1）、糖タンパク質100メラノーマ抗原（gp100）、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼV遺伝子（GnTVf）、リンパ球抗原6複合体遺伝子座K（LY6K）、メラノーマ抗原-A10（MAGE-A10）、メラノーマ抗原-A12（MAGE-A12）、メラノーマ抗原-C2（MAGE-C2）、メラノーマ抗原NA88-A、タキソール耐性関連タンパク質3（TRAG-3）、PDZ結合キナーゼ（pbk）、カスパーゼ8（CASP-8）、肉腫抗原1（SAGE）、ブレイクポイントクラスター領域アベルソンがん遺伝子（BCR-ABL）、白血病における融合タンパク質dek-can、伸長因子Tu GTP結合ドメイン含有2（EFTUD2）、ETS変異体遺伝子6/急性骨髄性白血病融合タンパク質（ETV6-AML1）、FMS様チロシンキナーゼ-3遺伝子内縦列重複（FLT3-ITD）、サイクリン-A1、フィブロネクチンIII型ドメイン含有3B（FDNC3B）、前骨髄球性白血病／レチノイン酸受容体アルファ融合タンパク質（pml-RARアルファ）、メラノーマ抗原-C1（MAGE-C1）、膜タンパク質選択的スプライシングアイソフォーム（D393-CD20）、メラノーマ抗原-A4（MAGE-A4）、またはメラノーマ抗原-A3（MAGE-A3）。
いくつかの態様において、該ポリヌクレオチドによってコードされる2つ以上のエピトープの少なくとも1つは、腫瘍関連抗原NY-ESO-1、腫瘍関連抗原MAGE-A3および／または腫瘍関連抗原pbkに由来する。特定の態様において、該ポリヌクレオチドは、アミノ酸配列LLMWITQCF（SEQ ID NO: 1）を含む腫瘍関連抗原NY-ESO-1由来のエピトープおよびアミノ酸配列GSPFPAAVI（SEQ ID NO: 2）を含む腫瘍関連抗原pbk由来のエピトープをコードする。ある態様において、該ポリヌクレオチドによってコードされる2つ以上のエピトープの1つは、腫瘍関連抗原NY-ESO-1に由来し、2つ以上のエピトープの1つは、腫瘍関連抗原サバイビンに由来する。特定の態様において、該ポリヌクレオチドは、アミノ酸配列RGPESRLLE（SEQ ID NO: 3）を含む腫瘍関連抗原NY-ESO-1由来のエピトープおよびアミノ酸配列AFLTVKKQM（SEQ ID NO: 4）を含む腫瘍関連抗原サバイビン由来のエピトープをコードする。ある態様において、該ポリヌクレオチドは、1つまたは複数の腫瘍関連抗原の3つ以上のエピトープをコードする。ある特定の態様において、3つ以上のエピトープは、同じ腫瘍関連抗原のエピトープである。他の態様において、3つ以上のエピトープは、少なくとも1つの異なる腫瘍関連抗原に由来する。ある特定の態様において、該ポリヌクレオチドは、1つまたは複数の腫瘍関連抗原の8つ以上のエピトープをコードする。ある態様において、記載のとおりのポリペプチドは、卵巣がん、乳がん、精巣がん、膵臓がん、肝臓がん、結腸がん、大腸がん、甲状腺がん、肺がん、前立腺がん、腎臓がん、メラノーマ、扁平上皮がん、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、前骨髄球性白血病、多発性骨髄腫、B細胞リンパ腫、膀胱がん、頭頚部がん、食道がん、脳がん、咽頭がん、舌がん、滑膜細胞がん、神経芽腫、子宮がん、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、基底細胞がん、類表皮がん、腺がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん、肝細胞がん、胆管がん、絨毛がん、精上皮腫、胎生期がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、小細胞肺がん、上皮がん、膠芽腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、希突起膠芽腫、髄膜腫、神経膠腫、または網膜芽細胞腫の、がん細胞もしくは腫瘍細胞の表面に、またはがん細胞もしくは腫瘍細胞の細胞質ゾル中に発現される腫瘍関連抗原のエピトープ、特に、2つ以上のエピトープをコードする。
いくつかの態様において、該ポリヌクレオチドは、プロセシング部位または酵素切断部位（プロテアーゼ切断部位である）をさらにコードする。ある態様において、酵素切断部位は、セリンプロテアーゼ切断部位である。特定の態様において、セリンプロテアーゼ切断部位は、フーリン、PC1、PC2、PC4、PC5、PACE4、PC7から選択されるタンパク質またはそれらの組み合わせによって切断される。別の特定の態様において、セリンプロテアーゼ切断部位は、フーリンによって切断される。ある態様において、該ポリヌクレオチドによってコードされる酵素切断部位は、アミノ酸配列XRSKRX（SEQ ID NO: 5）（式中、Xは、疎水性アミノ酸を表す）を含む。別の態様において、該ポリヌクレオチドによってコードされる酵素切断部位は、アミノ酸配列（R/K）Xn（R/K）(SEQ ID NO: 6）（式中、Xは、アミノ酸を表し、nは、0〜6の整数である）を含む。ある態様において、該ポリヌクレオチドは、5'小胞体シグナル配列を含む。ある特定の態様において、該ポリヌクレオチドは、アルファウイルス、インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質由来ペプチドM57-68または組織プラスミノーゲン活性化因子ペプチドに由来する5'小胞体シグナル配列を含む。ある態様において、該ポリヌクレオチドは、熱ショックタンパク質70、IgG1 Fcドメイン、リソソーム関連膜タンパク質（LAMP）、破傷風毒素ユニバーサルヘルパーT（Th）エピトープ、または大腸菌（E. coli）易熱性エンテロトキシンBサブユニットから選択される免疫原性タンパク質をコードする3'配列を含む。別の態様において、該ポリヌクレオチドは、1つまたは複数の免疫刺激タンパク質をコードする。例として、そのようなタンパク質は、非限定的に、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20〜IL-36、CCケモカインCCL1〜CCL27、CXCケモカインCXCL1〜CXCL13、Cケモカイン、CX3Cケモカイン、サイトカインもしくはケモカイン受容体、可溶性受容体、形質転換成長因子-ベータ（TGF-β）、または腫瘍壊死因子アルファ（TNFα）の1つまたは複数を含む。特定の態様において、該ポリヌクレオチドは、免疫刺激タンパク質IL-12をコードする。別の態様において、該ポリヌクレオチドは、不活性プロドラッグ、例えば、非限定的に、ガンシクロビル、アシクロビル、1-(2-デオキシ-2-フルオロ-β-D-アラビノフラノシル)-5-ヨードウラシル（FIAU）、6-メトキシプリンアラビノシド、または5-フルオロシトシンを、細胞傷害性代謝物へと変換することができる1つまたは複数の自殺遺伝子をさらに含む。ある態様において、1つまたは複数の自殺遺伝子は、単純ヘルペスウイルス（HSVtk）または水痘帯状疱疹ウイルス（VZV-tk）に由来することができるシトシンデアミナーゼまたはチミジンキナーゼをコードする。当業者に認識されるように、由来するとは、供給源、例えば、ウイルス、細菌、微生物、または生物学的供給源由来のポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはペプチドの全てまたは一部（典型的には、機能的なまたは活性な一部）から得られる、それを起源とする、またはそれから産生されることを指す。
その局面の別例では、本発明は、上記および下記のとおりのポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを対象とする。ある態様において、ウイルスベクターは、アルファウイルス、レンチウイルス、またはレトロウイルスから選択される。ある態様において、ウイルスベクターは、1つまたは複数のアルファウイルスのウイルスエンベロープタンパク質で偽型化される。ある態様において、ウイルスベクターは、アルファウイルスのE1タンパク質、E2タンパク質、E1タンパク質およびE2タンパク質の両方、またはその断片で偽型化される。特定の態様において、ウイルスベクターは、シンドビスウイルスベクターであるかまたはシンドビスウイルスに由来する。ある態様において、ウイルスベクターは、1つまたは複数のシンドビスウイルスエンベロープタンパク質で偽型化される。ある態様において、ウイルスベクターは、シンドビス-ZZ E2タンパク質またはその断片で偽型化される。特定の態様において、ウイルスベクターは、シンドビス-ZZ E2タンパク質を含み得る1つまたは複数のシンドビスウイルスエンベロープタンパク質で偽型化されたレンチウイルスである。特定の態様において、ウイルスベクターは、シンドビス-ZZ E2タンパク質を含み得る1つまたは複数のシンドビスウイルスエンベロープタンパク質で偽型化されたレトロウイルスである。ある態様において、ウイルスベクターは、複製欠損ウイルスベクターである。ある態様において、ウイルスベクターは、複製可能ウイルスベクターである。ある態様において、ウイルスベクターは、非組み込みウイルスベクターである。ある態様において、ウイルスベクターは、がんまたは腫瘍を有する対象、好ましくはヒト対象または患者への投与後に、1つまたは複数の腫瘍関連抗原の2つ以上のエピトープを発現する腫瘍またはがんに対する免疫応答を誘発することができる。ある態様において、免疫応答は、腫瘍関連抗原エピトープを発現するがん細胞または腫瘍細胞を特異的に殺傷する細胞傷害性T細胞を生成する。上の態様の全てにおいて、ウイルスベクターは、上記および下記のポリヌクレオチド（ミニ遺伝子とも呼ばれる）であって、そのコードされた生成物がウイルスベクターと細胞とのインビトロおよびインビボ接触後に細胞中に発現される、ポリヌクレオチドを含有する。
特定の局面において、腫瘍関連抗原の5〜30アミノ酸を含む2つ以上のエピトープをコードするポリヌクレオチドを含むシンドビスウイルスベクターであって、各エピトープがフーリン酵素切断部位によって隔てられている、シンドビスウイルスベクターが提供される。別の特定の局面において、1つまたは複数のシンドビスウイルスエンベロープタンパク質で偽型化されたウイルスベクターであって、ウイルスベクターが、腫瘍関連抗原の5〜30アミノ酸を含む2つ以上のエピトープをコードするポリヌクレオチドを含み、各エピトープがフーリン酵素切断部位によって隔てられている、ウイルスベクターが提供される。ある態様において、上のウイルスベクターの2つ以上のエピトープは、表1〜28のいずれか1つに列挙される腫瘍関連抗原のアミノ酸配列を含む。ある態様において、2つ以上のエピトープは、カリクレイン4、PBF、PRAME、WT1、HSDL1、メソテリン、NY-ESO-1、CEA、p53、Her2/Neu、EpCAM、CA125、葉酸受容体α、精子タンパク質17、TADG-12、MUC-16、L1CAM、マンナン-MUC-1、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、MAGE-A4、Sp17、SSX-4、TAG-1、TAG-2、ENAH、マンモグロビン-A、NY-BR-1、BAGE-1、MAGE-A1、MAGE-A2、ムチンk、SSX-2、TRAG-3、c-myc、サイクリンB1、MUC1、p62、サバイビン、CD45、DKK1、RU2AS、テロメラーゼ、K-ras、G250、ヘプシン、腸カルボキシルエステラーゼ、アルファ-フェトプロテイン、M-CSF、PSMA、CASP-5、COA-1、OGT、OS-9、TGF-ベータRII、gp70、CALCA、CD274、mdm-2、アルファ-アクチニン-4、伸長因子2、ME1、NFYC、GAGE-1、MAGE-A6、XAGE-1b、PSMA、STEAP1、PAP、PSA、GAGE3、FGF5、ヘプシン、hsp70-2、MAGE-A9、ARTC1、B-RAF、ベータ-カテニン、Cdc27、CDK4、CDK12、CDKN2A、CLLP、CSNK1A1、FN1、GAS7、GPNMB、HAUS3、LDLR-フコシルトランスフェラーゼ、MART2、MATN、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ネオ-PAP、ミオシンクラスI、PPP1R3B、PRDX5、PTPRK、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、トリオースリン酸イソメラーゼ、OA1、RAB38、TRP-1、gp75、TRP2、チロシナーゼ、MART-1、gp100、GnTVf、LY6K、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-C2、NA88-A、TRAG-3、TRP2-INT2g、pbk、CASP-8、SAGE、BCR-ABL、dek-can、EFTUD2、ETV6-AML1、FLT3-ITD、サイクリン-A1、FDNC3B、pml-RARアルファ、MAGE-C1、D393-CD20、MAGE-A4、およびMAGE-A3からなる群より選択される1つまたは複数の腫瘍関連抗原のエピトープである。特定の態様において、2つ以上のエピトープの少なくとも1つは、腫瘍関連抗原NY-ESO-1に由来し、2つ以上のエピトープの少なくとも1つは、腫瘍関連抗原サバイビンまたはpbkに由来する。特定の態様において、腫瘍関連抗原NY-ESO-1由来のエピトープは、アミノ酸配列LLMWITQCF（SEQ ID NO: 1）またはアミノ酸配列RGPESRLLE（SEQ ID NO: 3）を含み、腫瘍関連抗原サバイビン由来のエピトープは、アミノ酸配列AFLTVKKQM（SEQ ID NO: 4）を含み、腫瘍関連抗原pbk由来のエピトープは、アミノ酸配列GSPFPAAVI（SEQ ID NO: 2）を含む。別の態様において、2つ以上のエピトープの1つは、腫瘍関連抗原NY-ESO-1に由来し、ウイルスベクターによってコードされる2つ以上のエピトープの1つは、腫瘍関連抗原サバイビンに由来する。別の態様において、腫瘍関連抗原NY-ESO-1由来のエピトープは、アミノ酸配列RGPESRLLE（SEQ ID NO: 3）を含み、腫瘍関連抗原サバイビン由来のエピトープは、アミノ酸配列AFLTVKKQM（SEQ ID NO: 4）を含む。ある態様において、ウイルスベクターに含有されるポリヌクレオチドは、1つまたは複数の腫瘍関連抗原の3つ以上のエピトープまたは8つ以上のエピトープをコードする。ある態様において、ウイルスベクターは、卵巣がん、乳がん、精巣がん、膵臓がん、肝臓がん、大腸がん、甲状腺がん、肺がん、前立腺がん、腎臓がん、メラノーマ、扁平上皮がん、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、前骨髄球性白血病、多発性骨髄腫、B細胞リンパ腫、膀胱がん、頭頚部がん、食道がん、脳がん、咽頭がん、舌がん、滑膜細胞がん、神経芽腫、子宮がん、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、基底細胞がん、類表皮がん、腺がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん、肝細胞がん、胆管がん、絨毛がん、精上皮腫、胎生期がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、小細胞肺がん、上皮がん、膠芽腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、希突起膠芽腫、髄膜腫、神経膠腫、または網膜芽細胞腫の、がん細胞もしくは腫瘍細胞の表面に、またはがん細胞もしくは腫瘍細胞の細胞質ゾル中に発現される腫瘍関連抗原のエピトープ、特に、2つ以上のエピトープをコードする。ある態様において、上のシンドビスウイルスベクターまたは偽型ウイルスベクターは、5'小胞体シグナル配列を含み、その配列は、任意でアルファウイルス、インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質由来ペプチドM57-68または組織プラスミノーゲン活性化因子ペプチドに由来する。ある態様において、ウイルスベクターは、熱ショックタンパク質70、IgG1 Fcドメイン、リソソーム関連膜タンパク質（LAMP）、破傷風毒素ユニバーサルヘルパーT（Th）エピトープ、または大腸菌易熱性エンテロトキシンBサブユニットから選択される免疫原性タンパク質をコードする3'配列を含む。ある態様において、ウイルスベクターに含有されるポリヌクレオチドは、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20〜IL-36、CCケモカインCCL1〜CCL27、CXCケモカインCXCL1〜CXCL13、Cケモカイン、CX3Cケモカイン、サイトカインもしくはケモカイン受容体、可溶性受容体、形質転換成長因子-ベータ（TGF-β）、または腫瘍壊死因子アルファ（TNFα）から選択される1つまたは複数の免疫刺激タンパク質をコードする。ある態様において、ウイルスベクターは、不活性プロドラッグを細胞傷害性代謝物へと変換することができる1つまたは複数の自殺遺伝子を含む。例として、不活性プロドラッグは、ガンシクロビル、アシクロビル、1-(2-デオキシ-2-フルオロ-β-D-アラビノフラノシル)-5-ヨードウラシル（FIAU）、6-メトキシプリンアラビノシド、または5-フルオロシトシンであり得る。ある態様において、1つまたは複数の自殺遺伝子は、任意で単純ヘルペスウイルス（HSVtk）または水痘帯状疱疹ウイルス（VZV-tk）に由来する、シトシンデアミナーゼまたはチミジンキナーゼをコードする。ある態様において、ウイルスベクターは、がんまたは腫瘍を有する対象、好ましくはヒト対象または患者への投与後に、1つまたは複数の腫瘍関連抗原の2つ以上のエピトープを発現する腫瘍またはがんに対する免疫応答を誘発することができる。ある態様において、免疫応答は、腫瘍関連抗原エピトープを発現するがん細胞または腫瘍細胞を特異的に殺傷する細胞傷害性T細胞を生成する。上の態様の全てにおいて、シンドビスウイルスベクターまたは偽型ウイルスベクターは、上記および下記のポリヌクレオチド（ミニ遺伝子とも呼ばれる）であって、そのコードされた生成物がウイルスベクターと細胞とのインビトロおよびインビボ接触後に細胞中に発現される、ポリヌクレオチドを含有する。
本発明の別の局面として、1つまたは複数の遺伝子改変されたシンドビスウイルスエンベロープタンパク質で偽型化されたレンチウイルスベクターであって、上記および下記のとおりのポリヌクレオチドを含む、レンチウイルスベクターが提供される。また、上記および下記のとおりのポリヌクレオチドを含む、1つまたは複数の遺伝子改変されたシンドビスウイルスエンベロープタンパク質で偽型化されたレンチウイルスベクターであって、該ポリヌクレオチドが、NY-ESO-1、MAGE-A3、pbk、サバイビン、またはそれらの組み合わせから選択される1つまたは複数の腫瘍関連抗原のエピトープをコードする、レンチウイルスベクターが、本発明によって提供される。
別の局面において、本発明は、上記および下記のとおりのウイルスベクター、例えばシンドビスウイルスベクターまたは偽型ウイルスベクターを含むウイルス粒子を提供する。別の局面において、本発明は、上記および下記のとおりのアルファウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはその偽型ベクターを含むウイルス粒子を提供する。
別の局面において、本発明は、上記および下記のとおりのポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。他の局面において、本発明は、上記および下記のとおりのウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを含む細胞をさらに提供する。ある局面において、本発明は、上記および下記のとおりのウイルス粒子を含む細胞を提供する。
なお別の局面において、上記および下記のとおりのポリヌクレオチド、ウイルス粒子、および／またはウイルスベクターと、薬学的に許容し得るビヒクル、担体、または希釈剤とを含む薬学的組成物が提供される。ある態様において、薬学的組成物は、液体剤形である。
別の局面において、2つ以上の腫瘍関連抗原の1つまたは複数のエピトープを発現するがん細胞または腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導する方法であって、がん細胞または腫瘍細胞と上記および下記のとおりのポリヌクレオチド、ウイルス粒子、ウイルスベクター、および／または薬学的組成物の有効量とを接触させて、がん細胞または腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導する工程を伴う方法が提供される。ある態様において、免疫応答は、腫瘍関連抗原エピトープを発現するがん細胞または腫瘍細胞を特異的に殺傷する細胞傷害性T細胞を生成する。別の局面において、がんまたは腫瘍発生を有するかまたはそれを有するリスクのある対象におけるがんを処置する方法であって、上記および下記のとおりのポリヌクレオチド、ウイルス粒子、ウイルスベクター、および／または薬学的組成物の治療有効量を対象に投与して、対象におけるがんを処置する工程を伴う方法が提供される。該方法のある態様において、対象は、好ましくは、卵巣がん、子宮頸がん、子宮がん、乳がん、精巣がん、膵臓がん、肝臓がん、大腸がん、甲状腺がん、肺がん、前立腺がん、腎臓がん、メラノーマ、扁平上皮がん、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、前骨髄球性白血病、多発性骨髄腫、B細胞リンパ腫、膀胱がん、頭頚部がん、食道がん、脳がん、咽頭がん、舌がん、滑膜細胞がん、神経芽腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、基底細胞がん、類表皮がん、腺がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん、肝細胞がん、胆管がん、絨毛がん、精上皮腫、胎生期がん、ウィルムス腫瘍、小細胞肺がん、上皮がん、膠芽腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、希突起膠芽腫、髄膜腫、神経膠腫、または網膜芽細胞腫の、1つまたは複数から選択されるがんまたは腫瘍を有するかまたはそれを有するリスクのあるヒト患者である。該方法の特定の態様において、対象のがんは、卵巣がん、子宮頸がん、乳がん、または結腸がんの、1つまたは複数である。該方法のある態様において、該ポリヌクレオチド、ウイルス粒子、ウイルスベクター、または薬学的組成物は、腫瘍関連抗原NY-ESO-1、p53、sp17、サバイビン、pbk、CEA、CA125、またはWT1の1つまたは複数の、2つ以上のエピトープをコードする。該方法のある態様において、該ポリヌクレオチド、ウイルス粒子、ウイルスベクター、または薬学的組成物は、非経口的にまたは予防薬として投与される。該方法のある態様において、対象は、化学療法または放射線でさらに処置される。該方法のある態様において、対象のエフェクターT細胞のレベルを決定することによって評価された場合の対象の免疫応答の低下後に、追加免疫が対象に投与される。ある態様において、追加免疫は、複製欠損アデノウイルスベクター、例えばアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスを含む異種追加免疫である。ある態様において、アデノウイルス追加免疫ベクターは、2つ以上の腫瘍関連抗原の1つまたは複数のエピトープを含むポリヌクレオチドであって、各エピトープがプロセシング部位、例えば酵素切断部位によって隔てられている、ポリヌクレオチドを含む。ある態様において、エピトープは、表1〜28のいずれか1つに列挙される腫瘍関連抗原、例として、カリクレイン4、PBF、PRAME、WT1、HSDL1、メソテリン、NY-ESO-1、CEA、p53、Her2/Neu、EpCAM、CA125、葉酸受容体α、精子タンパク質17、TADG-12、MUC-16、L1CAM、マンナン-MUC-1、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、MAGE-A4、Sp17、SSX-4、TAG-1、TAG-2、ENAH、マンモグロビン-A、NY-BR-1、BAGE-1、MAGE-A1、MAGE-A2、ムチンk、SSX-2、TRAG-3、c-myc、サイクリンB1、MUC1、p62、サバイビン、CD45、DKK1、RU2AS、テロメラーゼ、K-ras、G250、ヘプシン、腸カルボキシルエステラーゼ、アルファ-フェトプロテイン、M-CSF、PSMA、CASP-5、COA-1、OGT、OS-9、TGF-ベータRII、gp70、CALCA、CD274、mdm-2、アルファ-アクチニン-4、伸長因子2、ME1、NFYC、GAGE-1、MAGE-A6、XAGE-1b、PSMA、STEAP1、PAP、PSA、GAGE3、FGF5、ヘプシン、hsp70-2、MAGE-A9、ARTC1、B-RAF、ベータ-カテニン、Cdc27、CDK4、CDK12、CDKN2A、CLLP、CSNK1A1、FN1、GAS7、GPNMB、HAUS3、LDLR-フコシルトランスフェラーゼ、MART2、MATN、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ネオ-PAP、ミオシンクラスI、PPP1R3B、PRDX5、PTPRK、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、トリオースリン酸イソメラーゼ、OA1、RAB38、TRP-1、gp75、TRP2、チロシナーゼ、MART-1、gp100、GnTVf、LY6K、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-C2、NA88-A、TRAG-3、TRP2-INT2g、pbk、CASP-8、SAGE、BCR-ABL、dek-can、EFTUD2、ETV6-AML1、FLT3-ITD、サイクリン-A1、FDNC3B、pml-RARアルファ、MAGE-C1、D393-CD20、MAGE-A4、またはMAGE-A3のアミノ酸配列を含む。ある態様において、該ポリヌクレオチド、ウイルス粒子、ウイルスベクター、または薬学的組成物の投与の少なくとも1日〜少なくとも2週間後に、追加免疫が対象に投与される。該方法のある態様において、上記および下記のとおりのポリヌクレオチド、ウイルス粒子、ウイルスベクター、または薬学的組成物の投与、または追加免疫（利用される場合）は、対象においてエピトープスプレッディングを引き起こす。ある態様において、上記および下記のとおりのポリヌクレオチド、ウイルス粒子またはウイルスベクターは、CD4+T細胞応答を誘導するためのアミノ酸配列
Figure 2019510488
をコードする核酸配列をさらに含む。
上記および下記のとおりのポリヌクレオチド、ウイルスベクター、ウイルス粒子および薬学的組成物を使用した、哺乳動物のがんまたは腫瘍の治療的処置、予防的処置、または組み合わせた治療的処置および予防的処置が本発明によって提供される。
本発明の特定の局面は、1つまたは複数の腫瘍関連抗原の、例えば、5〜50アミノ酸または5〜30アミノ酸を含む2つ以上のエピトープをコードするポリヌクレオチドを含有するように分子的に改変された非組み込みアルファウイルスベクター（例えば、シンドビスウイルスベクター）であって、各エピトープ配列が、腫瘍関連抗原エピトープポリペプチドおよびペプチド生成物の細胞内プロセシングにおける再現可能性のために、プロセシング部位、例えば酵素切断部位、例えば、フーリン酵素切断部位によって隔てられている、非組み込みアルファウイルスベクターを提供する。いくつかの態様において、ウイルスベクターはまた、本明細書に記載されるウイルスベクターおよびウイルス粒子によって誘発される腫瘍関連抗原エピトープに対する免疫応答を増強および改良するための、ならびにその治療的および／または予防的使用のための、1つまたは複数の新生抗原、サイトカイン、ケモカイン、抗体、突然変異したがん遺伝子、または過剰発現されたがん遺伝子をコードする1つまたは複数の核酸配列を含有する。ある局面において、本明細書に記載されるとおりのシンドビスウイルスベクターは、腫瘍関連抗原の複数のエピトープに対する強いT細胞応答（CD8+T細胞応答を含む）を誘発する。
別の局面において、本明細書に記載されるとおりのポリヌクレオチド、ウイルスベクター、またはウイルス粒子のアルファウイルスタンパク質またはその断片は、バーマフォレストウイルス、バーマフォレストウイルス群、東部ウマ脳炎ウイルス（EEEV）、東部ウマ脳炎ウイルス群、ミデルブルグウイルス、ミデルブルグウイルス群、ヌドゥムウイルス、ヌドゥムウイルス群、セムリキフォレストウイルス、セムリキフォレストウイルス群、ベバルウイルス、チクングニヤウイルス、マヤロウイルス、亜型ウナウイルス、オニョンニョンウイルス、亜型イボ-オラウイルス、ロスリバーウイルス、亜型ゲタウイルス、亜型ベバルウイルス、亜型サギヤマウイルス、亜型メトリウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（VEEV）、VEEV群、カバソウウイルス、エバーグレーズウイルス、モッソダスペドラスウイルス、ムカンボウイルス、パラマナウイルス、ピクスナウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス（WEEV）、リオネグロウイルス、トロカラウイルス、亜型ビジューブリッジウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス群、アウラウイルス、ババンキウイルス、キジラガチウイルス、シンドビスウイルス、オケルボウイルス、ワタロアウイルス、バギークリークウイルス、フォートモーガンウイルス、ハイランドJウイルス、エイラートウイルス、サケ膵臓病ウイルス（SPDV）、ミナミゾウアザラシウイルス（SESV）、タイフォレストウイルス、またはトナテウイルスの1つまたは複数に由来する。
定義
別段の定義がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味を有する。以下の参考文献は、当業者に本発明において使用される用語の多くの一般定義を提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al.(eds.), Springer Verlag (1991); and Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書において使用される場合、以下の用語は、別段の指定がない限り、以下においてそれらに付与された意味を有する。
「作用物質」とは、ペプチド、ポリペプチド、核酸分子、もしくは低分子化合物、抗体、またはその断片を意味する。
「変更」とは、本明細書に記載されるもののような標準的な当技術分野において公知の方法によって検出された場合の、遺伝子またはポリペプチドの発現レベルまたは活性の変化（増加または減少）を意味する。本明細書において使用される場合、変更は、発現レベルの10%の変化、発現レベルの25%の変化、40%の変化、もしくは50%またはそれ以上の変化を含む。
「改善する」および「改善」とは、疾患の発症または進行を減少する、抑制する、減弱する、低下させる、停止させる、または安定化させることを意味する。
「類似体」または「誘導体」とは、同一ではないが類似した機能的または構造的特徴を有する分子を意味する。例えば、ポリペプチド類似体は、天然に存在するポリペプチドに対して類似体の機能を相対的に増強するある特定の生化学的修飾を有しながら、対応する天然に存在するポリペプチドの生物学的活性を保持する。そのような生化学的修飾は、類似体のプロテアーゼ耐性、膜透過性、または半減期を、例えばリガンド結合を変更することなしに増加させることもできる。類似体は、非天然アミノ酸を含み得る。
本明細書において使用される場合、用語「抗原」は、体液性または細胞性の免疫応答を誘発することができる物質を指す。抗原は、例えば、抗体の生成を誘導することも、T細胞受容体の活性化を通じてT細胞の活性を刺激することも可能であり得る。抗原は、典型的には、タンパク質または多糖であり、かつ、細菌、ウイルス、および他の微生物の成分（例えば、被膜、莢膜、細胞壁、カプシド、鞭毛、および毒素）であり得る。該用語は、本明細書において使用される場合、適応性および先天性免疫系によってならびに抗体または抗体断片によってインビトロまたはインビボで認識されることができる全ての物質を包含する。
本明細書において使用される場合、用語「リスクのある」は、細胞増殖疾患、例えばがん（例えば、本明細書に記載されるがん）に適用されたとき、腫瘍減量手術を受けている患者、またはがんの家族歴を有しかつ/もしくは遺伝子リスク因子の遺伝子を有すると診断された個体を指す。
本明細書において使用される場合、用語「担体」は、組成物または薬学的組成物（例えば、ポリヌクレオチド、ウイルスベクター、またはウイルス粒子を含む）と共に投与することができる、希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビヒクルを指す。薬学的担体および薬学的に許容し得る担体は、滅菌液、例えば水および油（例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などのような石油、動物、植物または合成起源の油を含む）を含む。水または水性生理食塩水ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液を、特に注射用液剤用の、担体として採用してよい。担体はまた、結合剤（圧縮丸剤用の）、滑剤、封入剤、香味剤、および着色剤の1つまたは複数を非限定的に含む、固体剤形を含み得る。好適な薬学的担体は、E.W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。
本開示において、「を含む（comprise）」、「を含んでいる（comprising）」、「を含有している（containing）」および「を有する（having）」などは、米国特許法においてそれらに付与された意味を有することができ、かつ、「を含む（include）」、「を含んでいる（including）」などを意味することができる；「から本質的になる（consisting essentially of）」または「本質的になる（consist essentially）」も同様に、米国特許法において付与された意味を有し、該用語は、無制限（open-ended）であり、列挙されていることの基本的または新規の特徴が列挙されていることを超える存在によって変化させられない限り列挙されていることを超える存在を許容するが、先行技術の態様は除外する。
「検出する」は、検出されるべき分子、化合物、または作用物質の存在、非存在または量を特定することを指す。
「検出可能な標識」とは、関心対象の分子に連結されたとき、その分子を、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段を介して検出可能にする、組成物を意味する。例えば、有用な標識は、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ELISAにおいて一般的に使用されているとおりの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンを含む。
「疾患」とは、細胞、組織、臓器、または身体の一部の正常な機能に悪影響を及ぼすか、損傷を与えるかまたはそれと干渉する、任意の病態または障害、例えばがんまたは腫瘍発生を意味する。
「有効量」とは、未処置の患者に相対して疾患の症状を改善するのに必要な量を意味する。疾患の治療的処置のため本発明を実施するのに使用される活性化合物の有効量は、投与の様式、対象の年齢、体重、および総体的な健康に応じて変動する。最終的には、担当の医師または獣医が適切な量および投薬レジメンを決定する。そのような量は、「有効」量と称される。一態様において、有効量は、がん細胞の増殖率を低減または安定化させるのに必要な本発明の作用物質の量である。別の態様において、有効量は、がん細胞の生存を低減するのに必要な本発明の作用物質の量である。別の態様において、有効量は、がん細胞の死を誘導するのに必要な本発明の作用物質の量である。
本明細書において使用される場合、用語「内因性」は、特定の生物（例えば、ヒト）においてまたは生物内の特定の位置（例えば、臓器、組織、または細胞、例えばヒト細胞）において天然に見いだされる分子（例えば、ポリペプチド、ペプチド、核酸、または補因子）のことを言う。
本明細書において使用される場合、用語「エピトープ」または「抗原決定基」は、（例えば、免疫応答の誘導の間に）リガンド、抗体、またはT細胞受容体が結合することができる抗原（例えば、腫瘍関連抗原）上の部位、例えば、アミノ酸配列を指し、これは、連続アミノ酸または不連続アミノ酸（タンパク質の三次フォールディングによって空間的に近位するようにされる）のいずれかから形成されることができる。他のエピトープは、四次構造によって、例えば、数種のポリペプチドのアセンブリによって形成される。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒への曝露に対して保持されるが、三次または四次フォールディングによって形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒での処理によって失われる。エピトープは、例えば、独特の空間立体配置であり得る、3〜30アミノ酸残基、または5〜30もしくは5〜25アミノ酸残基、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30アミノ酸残基を含み得る。エピトープの空間立体配置を決定する方法は、当技術分野において公知であり、例えば、X線結晶学および2次元核磁気共鳴（NMR）を含む。そのような方法は、例えば、Morris, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, (1996)に詳述されている。
本明細書において使用される場合、用語「エピトープスプレッディング」（「抗原スプレッディング」とも呼ばれる）は、自己または外来の抗原またはタンパク質に対して向けられた当初の集中的なエピトープ特異的免疫応答（例えば、細胞傷害性T細胞による）から、該タンパク質上の（分子内スプレッディング）または他のタンパク質上の（分子間スプレッディング）サブドミナントおよび/もしくは潜在性エピトープ、または突然変異したエピトープへの、エピトープ特異性の多様化を指す。エピトープスプレッディングによって、患者の免疫系が、腫瘍集団における回避変異体の可能性を低減すると同時に、免疫系の細胞（例えば、細胞傷害性T細胞）によって当初は認識されないさらなるエピトープに対する免疫応答を高めることを可能とし得、ひいては、疾患（がん）の進行を減弱し得る。一態様において、本明細書に記載されるベクターのワクチン接種後、元々のワクチン製剤において見られなかった腫瘍関連抗原に応答するT細胞が生成され、このことは、腫瘍細胞に由来する抗原による第二ラウンドのT細胞プライミングが起こったことを示している。
本明細書において使用される場合、用語「外因性」は、特定の生物（例えば、ヒト）においてまたは生物内の特定の位置（例えば、臓器、組織、または細胞、例えばヒト細胞）において天然にまたは内因的に見いだされない分子（例えば、ポリペプチド、ペプチド、核酸、または補因子）を指す。外因性材料は、外部供給源から生物へまたはそれから抽出された培養物へ提供されるものを含む。
「断片」とは、ポリペプチドまたは核酸分子の一部分を意味する。この部分は、参照核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%を含有する。断片は、10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100、200、300、400、500、600、700、800、900、または1000ヌクレオチドまたはアミノ酸を含有し得る。
本明細書において使用される場合、用語「免疫応答」は、免疫系によって外来または異種として認識される1つまたは複数の抗原（例えば、免疫原性タンパク質またはペプチド）、および／または抗原のエピトープに対する対象の免疫系の応答または反応を指す。免疫応答は、細胞性免疫応答（すなわち、エフェクターT細胞、例えば抗原特異的または非特異的T細胞、例えばCD8+T細胞、Th1細胞、Th2細胞、およびTh17細胞によって媒介される応答）、ならびに体液性免疫応答（すなわち、B細胞活性化および抗原特異的抗体の産生によって特徴付けられる応答）の両方を含む。用語「免疫応答」は、抗原または免疫原（例えば、腫瘍関連抗原および／またはその関連エピトープ）に対する先天性免疫応答、ならびに、獲得免疫の結果でありかつB細胞もしくはT細胞のいずれかまたは両方を伴うことができる記憶応答の両方を包含する。
用語「単離された」、「精製された」または「生物学的に純粋な」は、その天然状態で見いだされる場合に通常それに付随しているかまたはそれと結合している成分を様々な程度で含まない材料を指す。「単離する」は、元々の供給源または環境からの分離の一程度を表す。「精製する」は、単離よりも高い分離の程度を表す。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、いかなる不純物もタンパク質の生物学的特性に物質的に影響を及ぼさないか、または他の有害事象を引き起こさないほど十分に、他の材料を含まない。すなわち、核酸またはペプチドは、組換えDNA技術によって生産されたときには、細胞材料、ウイルス材料、もしくは培養培地を、または、化学合成されたときには、化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まなければ、精製されている。純度および均一性は、典型的には、分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを使用して決定される。用語「精製された」は、核酸、タンパク質、またはペプチドが電気泳動ゲルにおいて本質的に1つのバンドを生じることを表すことができる。修飾、例えば、リン酸化またはグリコシル化に供することができるタンパク質にとって、異なる修飾は、異なる単離されたタンパク質を生じる場合があり、これらは別々に精製することができる。
「単離されたポリヌクレオチド」とは、本発明の核酸分子が由来する生物の天然に存在するゲノム中でこの遺伝子に隣接する遺伝子を含まない核酸（例えば、DNA）を意味する。該用語は、それゆえ、例えば、ベクターに；自己複製プラスミドもしくはウイルスに；または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれた組換えDNA、あるいは他の配列とは独立した別個の分子（例えば、PCRまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって産生されたcDNAまたはゲノム断片もしくはcDNA断片）として存在する組換えDNAを含む。加えて、該用語は、DNA分子から転写されるRNA分子も、追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAも、含む。
「単離されたポリペプチド」とは、このポリペプチドに天然に付随する成分から分離されているポリペプチドを意味する。典型的には、ポリペプチドは、それが天然に結合しているタンパク質および天然に存在する有機分子を少なくとも60重量%含まないときに、単離されている。好ましくは、調製物は、少なくとも75重量%、または少なくとも85重量%、または少なくとも90重量%、または少なくとも99重量%の所望のポリペプチドである。単離されたポリペプチドは、例えば、天然供給源からの抽出によって、そのようなポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって、またはタンパク質を化学合成することによって、得てもよい。純度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析によって測定することができる。
「マーカー」とは、疾患または障害と関連する発現レベルまたは活性の変更を有する任意のタンパク質またはポリヌクレオチドを意味する。
「ネオエピトープ」は、本明細書において言及されるとき、免疫系によってこれまで認識されなかった新たに形成された（すなわち、ネオ）エピトープ（例えば、抗原決定基）である。ネオエピトープは、新たに形成された抗原であるネオ抗原上のエピトープを包含する。往々にして腫瘍抗原と結合するネオ抗原は、発がん細胞に見いだされる。記載のウイルスベクター内で、突然変異したネオエピトープを有する大量のタンパク質が生成され、免疫系の抗原提示細胞の細胞質へ分泌されることができ、そこで、これらはプロセシングおよび使用されて腫瘍特異的T細胞を活性化し、次いで、この腫瘍特異的T細胞ががん細胞を標的とし破壊することができる。
本明細書において使用される場合、「作用物質を得ること」において見られるような「を得ること」は、作用物質を合成すること、購入すること、またはそうでなければ取得することを含む。
「ポリヌクレオチド」とは、1つまたは複数のポリペプチドをコードする核酸分子、例えば、二本鎖（ds）DNAポリヌクレオチド、一本鎖（ss）DNAポリヌクレオチド、dsRNAポリヌクレオチド、またはssRNAポリヌクレオチドを意味する。該用語は、プラス鎖（すなわち、タンパク質コード）DNAポリヌクレオチドを包含し、これは、転写されてRNA転写産物を形成することができ、その後、1つまたは複数の任意のRNAプロセシング事象（例えば、RNAスプライシングによるイントロン切除、または5'キャップもしくは3'ポリアデニルテールのライゲーション）に続いて翻訳されてポリペプチドを産生することができる。該用語は、追加的に、1つまたは複数の任意のRNAプロセシング事象に続いて直接翻訳されてポリペプチドを産生することができる、プラス鎖RNAポリヌクレオチドを包含する。本明細書において使用される場合、ポリヌクレオチドは、ウイルスベクター、例えばシンドビスウイルスベクター内に含有され得る。「ミニ遺伝子」は、本明細書において使用される場合、抗原、例えば腫瘍関連抗原（TAA）の、少なくとも1つ、好ましくは2つ以上のエピトープ、または2つ以上の腫瘍関連抗原の、1つまたは複数、好ましくは2つ以上のエピトープをコードするよう設計された、異なる成分をコードする配列を含有する分子的に改変されたポリヌクレオチド、例えば、多重遺伝子構築物を指す。2つ以上のエピトープは、同じ腫瘍関連抗原由来であっても異なる腫瘍関連抗原由来であってもよい。ミニ遺伝子ポリヌクレオチドは、エピトープコード配列に加えて、フレームワーク配列またはモチーフ配列（例えば、1つまたは複数の酵素切断部位）およびプロセシング配列、例えばリボソーム結合部位、シグナル配列（例えば、小胞体シグナル配列）、5'隣接領域および3'終止コドン配列を非限定的に含む核酸配列をさらに含み得る。該ポリヌクレオチドはまた、他の抗原（例えば、腫瘍関連抗原）、細胞受容体および免疫刺激または免疫調節分子、例えばサイトカイン、ケモカイン、細胞シグナル伝達分子などをコードする核酸配列を含有し得る。前述の配列のいくつかまたは全てが該ポリヌクレオチドに含まれ得る。ミニ遺伝子は、プラス鎖ポリヌクレオチドの産生のための鋳型として役立つ、マイナス鎖DNAまたはRNAポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドであり得る。
本明細書において使用される場合、語句「薬学的に許容し得る」は、患者（例えば、ヒト患者）に投与されたときに生理学的に忍容性でありかつ典型的にはアレルギー反応または他の有害反応、例えば異常亢進、眩暈などを生じない、分子実体、生物学的生成物および組成物を指す。
本明細書において使用される場合、用語「を予防する（prevent）」、「を予防している（preventing）」、「予防（prevention）」、「予防的処置（prophylactic treatment）」などは、障害または病態を有さないがそれを発症するリスクのあるまたはそれを発症し易い対象における障害または病態を発症する可能性を低減することを指す。
本明細書において使用される場合、用語「偽型化された」は、1つまたは複数の外来ウイルス構造タンパク質、例えば、エンベロープ糖タンパク質を含有するウイルスベクターを指す。偽型ウイルスは、エンベロープを持ったウイルスのエンベロープ糖タンパク質またはエンベロープを持たないウイルスのカプシドタンパク質が元々のウイルスゲノムおよびゲノム複製装置の供給源とは異なるウイルスを起源とするものであり得る（D.A. Sanders, 2002, Curr. Opin. Biotechnol., 13:437-442）。偽型ウイルスの外来ウイルスエンベロープタンパク質を利用して、宿主指向性を変更することも、ウイルス粒子の安定性を増加または減少させることもできる。偽型ウイルスベクターの例は、野生型レトロウイルスまたはレンチウイルスの外部には天然には生じない1つまたは複数のエンベロープ糖タンパク質、例えばアルファウイルスに由来する1つまたは複数のタンパク質（例えば、シンドビスウイルス、例えばシンドビス-ZZ E2タンパク質（Morizono, K. et al., 2010, J. Virol., 84(14):6923-6934）、またはシンドビスE1、E2および／またはE3タンパク質）を含有する、レトロウイルスまたはレンチウイルスを含む。偽型ウイルスベクターは、細胞に感染して、ウイルスベクター内に含有されるポリヌクレオチド、例えば、「ミニ遺伝子」によってコードされるタンパク質を発現および産生することができる。
「低減する」とは、少なくとも5%、10%、25%、50%、75%、または100%の負の変更を意味する。
「参照」とは、標準状態または対照状態を意味する。
「特異的に結合する」とは、本発明のポリペプチドを認識および結合するが、本発明のポリペプチドを天然に含む試料中の、例えば、生物学的試料中の他の分子を実質的に認識および結合しない、化合物または抗体を意味する。
「対象」とは、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物、例えばヒト以外の霊長類、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、またはネコ科の哺乳動物を非限定的に含む、哺乳動物を意味する。対象は、典型的には、本明細書に記載されるとおりの特定の疾患または病態（例えば、細胞増殖疾患、例えばがんまたは腫瘍）のための処置を受ける患者、例えばヒト患者である。対象および患者の例は、そのような疾患もしくは病態のための処置を受けるまたはそのような疾患もしくは病態を有するリスクのある、哺乳動物、例えばヒトを含む。
本明細書において使用される場合、用語「自殺遺伝子」は、細胞死を、例えば、アポトーシスによって、誘導することができるポリペプチドをコードする遺伝子を指す。自殺遺伝子は、プロドラッグを細胞傷害性分子へと変換することができるタンパク質またはペプチドをコードすることによって機能し得る。例示的な自殺遺伝子は、とりわけ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSV-TK）、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、カルボキシルエステラーゼ、シトクロムP450、およびプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（PNP）を非限定的に含む。
本明細書において提供される範囲は、該範囲内の全ての値の省略表現であると理解される。例えば、1〜50という範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50からなる群からの任意の数字、数字の組み合わせ、または部分範囲を含むと理解される。
本明細書において使用される場合、用語「治療有効量」は、処置を必要とする患者に投与したときに疾患、障害、および／または病態の1つまたは複数の症状を治療、診断、予防、および／または発生を遅延させるのに十分な治療物質の量を指す。いくつかの場合では、治療有効量はまた、疾患またはその症状、例えばがんまたは腫瘍を発症するリスクのある対象に予防的に（例えば、進行した疾患が生じる前に）投与される治療物質の量を指す場合もある。
本明細書において使用される場合、用語「を処置する（treat）」、「を処置している（treating）」、「処置（treatment）」などは、障害および／またはそれと関連する症状を低減または改善することを指す。障害または病態を処置することは、その障害、病態またはそれと関連する症状が完全に排除されることを必要としないが、それが否定されるわけでもないことが認識されるだろう。「を処置する」または「処置」は、その目的が望ましくない生理学的変化または障害、例えば細胞増殖障害（例えば、がん）の進行を防止するまたは減速させる（減少または低減する）ことである、治療的処置を指す場合もある。有益なまたは所望の臨床結果は、検出可能であるか検出不可能であるかにかかわらず、症状の軽減、疾患の程度の低下、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化させない）、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の改善または緩和、および寛解（部分的か全体的かにかかわらず）を含むがこれらに限定されない。処置を必要とするものは、病態もしくは障害を既に有するものだけでなく、病態もしくは障害を有する傾向のあるものまたは病態もしくは障害が予防されるべきであるものも含む。
本明細書において使用される場合、用語「腫瘍関連抗原」または「TAA」は、がん細胞、例えば固形腫瘍内の細胞によって発現されるタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを指す。腫瘍関連抗原は、がん細胞の表面に発現されるかまたは非がん性細胞に相対して過剰発現されるタンパク質またはペプチド抗原も、野生型タンパク質の突然変異から発生するタンパク質も含む。野生型細胞タンパク質の突然変異から発生するタンパク質は、がん細胞または腫瘍細胞において生じるネオエピトープおよび新生抗原、例えば、突然変異したk-Rasタンパク質を包含する。したがって、腫瘍関連抗原は、がん細胞または腫瘍細胞の表面に発現される細胞表面受容体タンパク質、例えば、膜結合タンパク質を包含する。腫瘍関連抗原はまた、がん細胞または腫瘍細胞内で発現される、細胞内タンパク質、例えば、細胞質タンパク質、核タンパク質、または膜結合タンパク質を包含する。腫瘍関連抗原は、抗原の発現が特定のタイプのがん細胞に制限される場合に、腫瘍特異的であり得る。あるいは、腫瘍関連抗原は、数種のがんに共通し、したがって、様々ながん細胞タイプの表面に発現され得る。
本明細書において使用される場合、用語「ベクター」は、核酸（例えば、DNAベクター、例えばプラスミド）、RNAベクター、ウイルスまたは他の好適なレプリコン（例えば、ウイルスベクター）を指す。外因性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを原核細胞または真核細胞へ送達するために、様々なベクターが開発されている。ベクターは、関心対象の遺伝子（例えば、腫瘍関連抗原および／またはそのエピトープをコードする遺伝子）を含むポリヌクレオチド配列と、例えば、これらのポリヌクレオチド配列の転写、翻訳、および／または細胞のゲノムへの組み込みを調節することができる追加の配列エレメントとを含有し得る。ベクターは、遺伝子転写を指令する調節配列、例えばプロモーター、例えばサブゲノムプロモーター領域およびエンハンサー領域を含有し得る。ベクターは、これらの遺伝子の翻訳の速度を増強するかまたは遺伝子転写から生じるmRNAの安定性もしくは核輸送を向上させる、ポリヌクレオチド配列を含有し得る。これらの配列エレメントは、発現ベクター上に担持される遺伝子の効率的な転写を指令するために、例えば、5'および3'非翻訳領域、内部リボソーム侵入部位（IRES）、および／またはポリアデニル化シグナル部位を含み得る。
本明細書において使用される場合、用語「ビヒクル」は、薬学的組成物の溶媒、希釈剤、または担体成分を指す。
「実質的に同一」とは、参照のアミノ酸配列（例えば、本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれか1つ）または核酸配列（例えば、本明細書に記載される核酸配列のいずれか1つ）に対して少なくとも50%の同一性を示すポリペプチドまたは核酸分子を意味する。好ましくは、そのような配列は、比較のために使用される配列に対してアミノ酸レベルまたは核酸で、例えば、指定の比較ウィンドウにわたって、少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは80%もしくは85%、最も好ましくは90%、95%もしくはさらに99%同一である。最適な整列は、相同性整列アルゴリズムを使用して実行され得る（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol., 48:443）。2つのペプチドまたはポリペプチド配列が実質的に同一であることの指標は、一方のペプチドまたはポリペプチドが、第二のペプチドまたはポリペプチドに対して産生された特異的抗体と免疫学的に反応性であることであるが、そのような交差反応性は、2つのポリペプチドが実質的に同一であると見なされるために必須ではない。したがって、ペプチドまたはポリペプチドは、例えば、第二のペプチドまたはポリペプチドと保存的置換だけが異なる場合、その2つは実質的に同一である。「実質的に類似」したペプチドまたはポリペプチドは、同一でない残基位置が保存的アミノ酸変化だけ異なり得ることを除き、上に述べたとおりの配列を共有する。保存的置換は、典型的には、以下の群間の置換を含むがこれらに限定されない：グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシン、およびロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；セリンおよびトレオニン；リシンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン、そして、当業者に公知の他のもの。
配列同一性は、典型的には、配列解析ソフトウェア（例えば、the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705のSequence Analysis Software Package、BLAST、BESTFIT、GAP、またはPILEUP/PRETTYBOXプログラム）を使用して測定される。そのようなソフトウェアは、種々の置換、欠失、および／または他の修飾に対する相同性の程度を割り当てることによって、同一または類似の配列をマッチさせる。保存的置換は、典型的には、以下の群間の置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定する例示的なアプローチでは、BLASTプログラムを使用してよく、ここで、e-3〜e-100の間の確率スコアは密接に関連している配列を示す。
本発明の方法において有用なポリヌクレオチドおよびウイルス核酸分子は、本明細書に記載されるウイルスベクターの成分、ならびにウイルスベクター、例えばアルファウイルスベクターおよびシンドビスウイルスベクターなどによってコードされるポリペプチド生成物、ならびにそのペプチドまたは断片をコードする、任意の核酸分子を含む。そのような核酸分子は、ウイルスベクター核酸配列と100%同一である必要はないが、典型的には実質的な同一性を示す。ウイルスベクター配列に対して実質的な同一性を有するポリヌクレオチドは、典型的には、ウイルスベクター核酸分子の少なくとも1つの鎖とハイブリダイズすることができる。本発明の方法において有用な核酸分子は、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子を含む。内因性配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも1つの鎖とハイブリダイズすることができる。「ハイブリダイズする」とは、一対の核酸分子が、種々のストリンジェンシー条件下で、相補的なポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される遺伝子または核酸配列）間、またはその部分間で二本鎖分子を形成することを意味する（例えば、Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507を参照のこと）。
例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約750mM NaClおよび75mMクエン酸三ナトリウム未満、好ましくは約500mM NaClおよび50mMクエン酸三ナトリウム未満、より好ましくは約250mM NaClおよび25mMクエン酸三ナトリウム未満である。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えば、ホルムアミドの非存在下で得ることができるが、一方で、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約35%ホルムアミド、より好ましくは少なくとも約50%ホルムアミドの存在下で得ることができる。ストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約30℃、より好ましくは少なくとも約37℃、最も好ましくは少なくとも約42℃の温度を含む。様々な追加のパラメーター、例えば、ハイブリダイゼーション時間、界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の濃度、および担体DNAを含有するか否かが、当業者に周知である。ストリンジェンシーの種々のレベルは、必要に応じてこれらの種々の条件を組み合わせることによって成し遂げられる。好ましい態様において、ハイブリダイゼーションは、750mM NaCl、75mMクエン酸三ナトリウム、および1% SDS中、30℃で起こる。より好ましい態様において、ハイブリダイゼーションは、500mM NaCl、50mMクエン酸三ナトリウム、1% SDS、35%ホルムアミド、および100.mu.g/ml変性サケ精子DNA（ssDNA）中、37℃で起こる。最も好ましい態様において、ハイブリダイゼーションは、250mM NaCl、25mMクエン酸三ナトリウム、1% SDS、50%ホルムアミド、および200μg/ml ssDNA中、42℃で起こる。これらの条件に対する有用な変動は、当業者には容易に明らかであろう。
大部分の適用に関して、ハイブリダイゼーションに続く洗浄工程もストリンジェンシーが変動する。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩濃度によっておよび温度によって定義されることができる。上記のとおり、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を減少することによってまたは温度を上昇させることによって、増加させることができる。例えば、洗浄工程のためのストリンジェントな塩濃度は、好ましくは、約30mM NaClおよび3mMクエン酸三ナトリウム未満、最も好ましくは、約15mM NaClおよび1.5mMクエン酸三ナトリウム未満である。洗浄工程のためのストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約25℃、より好ましくは少なくとも約42℃、さらにより好ましくは少なくとも約68℃の温度を含む。好ましい態様において、洗浄工程は、30mM NaCl、3mMクエン酸三ナトリウム、および0.1% SDS中、25℃で起こる。より好ましい態様において、洗浄工程は、15mM NaCl、1.5mMクエン酸三ナトリウム、および0.1% SDS中、42℃で起こる。より好ましい態様において、洗浄工程は、15mM NaCl、1.5mMクエン酸三ナトリウム、および0.1% SDS中、68℃で起こる。これらの条件に対する追加の変動は、当業者には容易に明らかであろう。ハイブリダイゼーション技術は、当業者に周知であり、例えば、Benton and Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York); and Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載されている。
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、これらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合、なお実質的に同一である。これは、例えば、遺伝コードによって許容される最大コドン縮重を使用して核酸のコピーが作られるときに起こる。そのような場合、核酸は、典型的には、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の非限定例は、40%ホルムアミド、1M NaCl、1% SDSの緩衝液中37℃でのハイブリダイゼーション、および1×SSC中45℃での洗浄を含む。陽性ハイブリダイゼーションは、少なくともバックグラウンドの2倍である。当業者であれば、別のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を利用して類似のストリンジェンシー条件を提供できることを容易に認識するであろう。
「オルソログ」とは、別の生物由来の参照タンパク質または核酸配列と高度に関連する生物の任意のポリペプチドまたは核酸分子を意味する。関連性の程度は、例えば、blast検索により、参照タンパク質が配列を同定する確率として表してよい。参照配列がランダム配列をオルソログとして同定する確率は、極度に低く、e-10、e-20、e-30、e-40、e-50、e-75、e-100未満である。当業者は、オルソログが参照タンパク質または核酸配列に機能的に関連している可能性が高いことを理解する。言い換えれば、オルソログおよびその参照分子は、それらのそれぞれの生物、例えば、マウスおよびヒトオルソログにおいて、等価までいかないにしても類似の機能的役割を果たすと見込まれるだろう。
オルソログは、参照配列と整列されたとき、参照配列に対して特定のアミノ酸配列同一性度を有する必要はない。タンパク質オルソログは、例えばタンパク質の全長にわたって顕著なアミノ酸配列同一性を共有しても、代替的に、タンパク質の単一の機能的に重要なドメインだけにわたって顕著なアミノ酸配列同一性を共有してもよい。そのような機能的に重要なドメインは、遺伝子突然変異によって定義しても構造機能アッセイによって定義してもよい。オルソログは、当技術分野において実施されている方法を使用して特定してよい。オルソログの機能的役割は、当業者に周知の方法を使用してアッセイしてよい。例えば、機能は、生化学的、免疫学的、もしくは酵素的アッセイ；または形質転換救出を使用してインビボまたはインビトロでアッセイしてよい。あるいは、バイオアッセイを組織培養物において実施してよい；機能はまた、遺伝子不活性化（例えば、RNAi、siRNA、または遺伝子ノックアウトによる）、または遺伝子過剰発現によって、ならびに他の方法によってアッセイしてもよい。
特に明記しない限りまたは文脈から明白ではない限り、本明細書において使用される場合、用語「または」は、包括的であると理解される。特に明記しない限りまたは文脈から明白ではない限り、本明細書において使用される場合、用語「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、単数または複数であると理解される。
本明細書において使用される場合、用語「約」または「およそ」は、記載される値の種類および該値を測定するために使用される方法について許容される誤差範囲内を意味する。例えば、これらの用語は、所与の値または範囲の20%以内、より好ましくは10%以内、最も好ましくはさらに5%以内を示すことができる。より具体的には、「約」は、既定の値または範囲の20%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、または0.01%以内であると理解することができる。あるいは、とりわけ生物系において、用語「約」は、所与の値の一対数（すなわち、一桁）以内、好ましくは2倍以内を意味する。特に明記しない限りまたは文脈から明白ではない限り、本明細書において使用される場合、用語「約」は、当技術分野における一般公差の範囲内、例えば平均値の標準偏差2以内と理解される。別段文脈から明らかでない限り、本明細書において提供される全ての数値は、約という用語によって修飾される。
本明細書において提供される任意の組成物または方法を、本明細書において提供される他の組成物および方法の任意の1つまたは複数と組み合わせることができる。
本明細書に記載されるとおりの酵素切断部位（例えば、フーリン酵素）によって隔てられている1つまたは複数、例えば、3つの腫瘍関連抗原の、2つ以上、例えば3つのエピトープを含む、種々の成分をコードするポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）の設計および配列の概略図を描写する。図1Aは、3つの腫瘍関連抗原の複数（3つ）のエピトープをコードするシンドビスウイルスベクターを構築するためのポリヌクレオチドの概略図を示す。図1Aで「SV/MG」と命名されるポリヌクレオチド構築物は、ポリヌクレオチドをシンドビスウイルスベクター「骨格」へ挿入するために、その5'端にXba1制限酵素部位（TCTAGA、SEQ ID NO: 8）を、かつ、その3'端にApa1制限酵素部位（GGGCCC、SEQ ID NO: 9）を含有する。5'から3'へ、該ポリヌクレオチドは、リボソーム結合部位開始コドン、小胞体シグナル配列、NY-ESO-1腫瘍関連抗原のエピトープ、gp70糖タンパク質腫瘍関連抗原のエピトープ、サバイビン腫瘍関連抗原のエピトープ、腫瘍関連抗原エピトープの各々を隔てるフーリン切断部位、および終止コドンを含有する。図1Bは、図1Aに記載されるポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）のポリヌクレオチド配列（SEQ ID NO: 10）ならびに該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドおよびペプチド成分の対応するアミノ酸配列（SEQ ID NO: 11）を記載する。ポリヌクレオチドの成分遺伝子およびコードされるポリペプチド／ペプチドが図1Bの配列の下に特定される。 CT26由来腫瘍を保有するマウスを腫瘍関連抗原の複数のエピトープをコードするシンドビスウイルスベクターで処置する処置プロトコル、および処置した後の腫瘍成長のプロットを表す。図2Aは、CT26腫瘍マウスモデルにおける、成長している腫瘍を内在するマウスに図1Aおよび1Bのポリヌクレオチドを含有するシンドビスウイルスベクターを投与するための治療的処置プロトコルを描写する。図2Bは、下記の実施例2に記載されるとおり、対照と比較した、図1Aの複数のエピトープをコードするシンドビスウイルスベクター、すなわち、SV/MA（複数のTAAは、NY-ESO-1、サバイビンおよびgp70を含む）で腫瘍担持動物が処置された後の腫瘍成長を、処置後日数の関数として示すグラフを提示する。対照（対照：いかなるシンドビスウイルスベクターも与えられていないマウス；SV/LacZ：無関係の細菌酵素β-ガラクトシダーゼをコードするシンドビスウイルスベクター；およびSV/NY-ESO-1：NY-ESO-1腫瘍関連抗原をコードする陽性対照）と比較して、複数の腫瘍関連抗原、NY-ESO-1、サバイビンおよびgp70のエピトープをコードするSV/MGウイルスベクターは、腫瘍担持動物への注射後、CT26腫瘍細胞の成長の阻害において極めて効果的であった（図2B）。図2Bのグラフの下に、マウスの対照群および上記のとおり処置された実験群における腫瘍成長を示す相対発光量（RLU）値が示される。 下記の実施例3に記載のとおり、qPCR後のDNA試料を含有する染色したアガロースゲルのUV画像を示す。SV RNAゲノムに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いてqPCRを実施した。ゲル中、レーン（-）は、未感染BHK（対照）由来のcDNAを含有し；レーン（+）は、pSV/MG-CT.26 DNAプラスミド（対照）を含有し；レーンMは、100塩基対ラダーマーカー（対照）を含有した。-4、-3、-2、-1および0の印の付いたレーンは、それぞれ、BHK細胞に感染するために使用されたSV/MG-CT.26ウイルスの10-4、10-3、10-2、10-1および100希釈物を反映する。qPCR断片（約200bp）のサイズは、プラスミドDNA対照で得られたものと一致する。ウイルス100μlを細胞に加えたため、10-4希釈でのウイルスRNAの出現は、105のウイルス粒子/mlの力価を示した。この力価は、qPCR CT（閾値サイクル）値によって決定された力価と一致した。 腫瘍担持（LacZ+CT26腫瘍）マウスを、代表的な腫瘍関連抗原LacZをコードするシンドビスウイルスベクター（本明細書において「SV/TAA」）で処置すると、対照と比較して生存を実質的に延長し、エピトープスプレッディングを誘導し、TAAの喪失を回避することを示す。図4Aは、LacZ+CT26腫瘍保有マウスを、SV/LacZシンドビスウイルスベクター、GFPタンパク質をコードする対照SVベクター（SV/GFP）、または培地／PBS（モック）のいずれかで処置したこと、および、SV/LacZシンドビスウイルスベクターだけが少なくとも60日間完全な腫瘍寛解（100%動物生存）を誘導したことを示す。データをカプラン-マイヤー（Kaplan-Meier）生存プロットとして提示する。曲線間の有意な値を*P<0.05；**P<0.01で示す。図4Bは、四量体（Altman, J.D. et al., 1996, Science, 274(5284):94-96）を使用して、SV/LacZ処置マウス由来の脾臓細胞が、LacZ（示さず）およびgp70（CT26細胞によって発現される内因性腫瘍関連抗原）の両方に特異的なCD8+T細胞を含有したことを実証し、したがって、このことは、エピトープスプレッディングが起こったことを示している。図4Cは、対照マウス（「ナイーブ」）および図4Aに記載のとおりのSV/LacZウイルスベクターを注射した後のその腫瘍が生き残ったマウス（「SV/LacZ生存体」）の写真を提示し、これは、LacZ（-）CT26腫瘍がナイーブマウスにおいて成長したが、LacZをコードするSV/LacZウイルスベクターで処置されたマウス（SV/LacZ生存体マウス）では成長しなかったことを実証している。これらの結果は、SV/LacZ誘導エピトープスプレッディングが、腫瘍関連抗原（すなわち、LacZ）発現の喪失に対抗するのに成功したとの知見を支持する。 少なくとも1つの腫瘍関連抗原をコードするシンドビスウイルスベクター（「SV/TAA」としてSV/ルシフェラーゼ）を用いた動物の処置／免疫療法の効果を評価するための、イメージングおよびフローサイトメトリーの組み合わせを示す。図5Aは、腫瘍関連抗原としてルシフェラーゼをコードするシンドビスウイルスベクターを動物に注射した後の、代表的な腫瘍関連抗原ホタルルシフェラーゼの発現の部位を非侵襲的かつ縦方向に決定するために使用されたインビボイメージングの結果を示す。動物において評価されたT細胞活性化マーカーCD69発現レベルによって実証されるとおり、ルシフェラーゼ（TAAとして）送達の部位として特定された縦隔リンパ節（MLN）がまた、強力なCD8+T細胞活性化の部位であることも見いだされた。ILN＝対照の鼠径リンパ節（図5B）。コードされたルシフェラーゼの使用は、ルシフェラーゼ遺伝子を発現するよう腫瘍細胞が分子的に改変された（例えば、トランスフェクトされた）動物モデルにおける腫瘍成長の測定を可能にし、これにより、腫瘍細胞のイメージングおよびこれらの細胞を含む腫瘍の成長の評価が可能となる。 LacZ+CT26腫瘍を有するマウスにPBS（対照、図6A）または腫瘍関連抗原としてLacZをコードするシンドビスウイルスベクター（SV/LacZ）(図6B〜6D）を注射した後の腫瘍成長対時間（日）のグラフを示す。皮下腫瘍に対するSV/LacZの治療効果（すなわち、キャリパーによって測定された場合の、腫瘍成長の低減）は、対照マウス（図6A）で見られた結果と比較したとき、CD4+T細胞（図6B）、CD8+T細胞（図6C）、または両方（図6D）が枯渇したマウスにおいて観察されなかった。
発明の詳細な説明
対象のがんまたは腫瘍によって発現される複数の腫瘍関連抗原に対して、最適にはHLA/MHC抗原の状況において、強力な免疫応答を対象において誘導するための、1つまたは複数の腫瘍関連抗原（TAA）の複数のエピトープをコードする、ポリヌクレオチドおよびウイルスベクター、特に、アルファウイルスベクターが、本発明によって提供される。記載のとおりのポリヌクレオチドおよびウイルスベクターはまた、複数のTAAに対する免疫応答を増強するのに役立つ、投与後のエピトープスプレッディングをもたらす。
以下により詳細に報告されるとおり、本発明は、複数の腫瘍関連抗原（例えば、NY-1 ESO、サバイビン、gp70）をコードするシンドビスベクターが、腫瘍保有マウスの長期生存および複数の腫瘍抗原に対する長続きするCD8+T細胞の生成をもたらしたという発見に少なくとも一部基づくものである。意義深いことに、複数の腫瘍関連抗原をコードするシンドビスベクターを用いた治療は、エピトープスプレッディングを導き、腫瘍関連抗原の喪失または改変による腫瘍回避の問題の有望な解決法を提供した。gp70は、マウスレトロウイルス糖タンパク質であるので、それは、前臨床研究に特に有用である。同様に使用されるがヒトウイルス（レンチウイルス）に由来する糖タンパク質の例は、非限定的に、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）のgp120およびgp41エンベロープタンパク質、またはその断片を含む。
本明細書に記載される分子的に改変されたウイルスベクターは、1つまたは複数の腫瘍抗原（腫瘍関連抗原とも呼ばれる）の遺伝情報を、腫瘍関連抗原の複数の選択されたエピトープ（ネオエピトープを含む）として内在するよう、かつ、特異的免疫応答を開始および持続させ、最終的には、がんまたは腫瘍を特異的に殺傷するために活性化される細胞傷害性T細胞（例えば、エフェクターCD8+T細胞）を生成するよう設計された効率的かつ効果的な送達系を提供する。
本発明は概して、それを必要とする対象、例えばがんを有する患者におけるがんおよび腫瘍発生および／またはその症状を処置するために有用であるウイルスベクターに基づく組成物および方法を特徴とする。本明細書に記載されるとおりの1つまたは複数の腫瘍関連抗原（TAA）の、複数、例えば、2つ以上のエピトープをコードするポリヌクレオチドを内在するよう設計されたウイルスベクターを利用する方法は、ウイルスベクター、ウイルス粒子、または該ウイルスベクターもしくは粒子を含む薬学的組成物の治療有効量を、対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）に、特に、腫瘍関連抗原およびそのエピトープを発現する対象のがんまたは腫瘍に対するT細胞媒介性免疫応答を誘発するために、投与する工程を伴う。
本明細書に記載されるウイルスベクターは、T細胞受容体によって認識される腫瘍関連抗原の複数のエピトープ、例えば、複数のアミノ酸配列、すなわち、「T細胞エピトープ」を、コードかつ発現するよう設計される。本発明のウイルスベクターによるマルチエピトープの発現は、様々な腫瘍抗原に対して免疫応答をトリガーする可能性を増加させることができ、かつまた、異なるHLAハプロタイプを有する対象の処置を包含する。そのようなウイルスベクター生成物はまた、T細胞受容体に対して最適な親和性を有する腫瘍関連抗原のエピトープを含有かつ発現するよう設計され得る。本明細書に記載されるポリヌクレオチド、ウイルスベクターおよびウイルス粒子は、1つまたは1つより多い腫瘍関連抗原の複数のエピトープ、ならびに免疫刺激および免疫調節分子を担持するよう設計されるため、これらの生成物は、複数のがんおよび腫瘍タイプを標的とすることができる。
したがって、本発明に係る腫瘍関連抗原の複数のエピトープをコードかつ発現するウイルスベクター生成物は、全生物誘導性免疫を模倣または増大しかつ潜在的な免疫病原性または抑制的応答を防止し得る、がんおよび腫瘍を処置するためのアプローチであって、1つまたは複数の腫瘍関連抗原の複数のエピトープがエフェクターT細胞によって認識されて、処置を受けている対象において強力な免疫応答を生じる、アプローチを提供する。本明細書に記載されるとおりのウイルスベクターは、エフェクターT細胞、例えば、CD4+T細胞、CD8+T細胞、または両方によって認識されるよう設計された腫瘍関連抗原の複数のエピトープを含有する。ウイルスベクターは、異なる細胞傷害性リンパ球（CTL）決定因子に対する応答を同時に誘導し、それによって、がん細胞および腫瘍細胞を攻撃および殺傷しかつがんの成長および再発を防ぐのに必要な幅広さおよび強度のCD8+CTL応答を誘導することによって、インビボ免疫原性を最適化および最大化することができる。
本発明に従うと、1つまたは複数の腫瘍関連抗原の複数のエピトープ、例えば、2つ以上のエピトープをコードかつ発現する、ポリヌクレオチド、ウイルスベクター、ウイルス粒子ならびにこれらの生成物を含有する細胞および薬学的組成物の設計は、活性化T細胞レパートリーを拡大するために使用することができる生物学的生成物を提供する。したがって、そのような活性化T細胞は、腫瘍関連抗原およびそれらの関連するエピトープを発現するがん細胞および腫瘍細胞に対して反応する（例えば、殺傷する）ことができ、ひいては、1つまたは複数の腫瘍関連抗原の2つ以上のエピトープをコードするポリヌクレオチドを含有するよう構築された本明細書に記載されるウイルスベクター、例えば、アルファウイルス（例えば、シンドビスウイルス（SV））、レンチウイルス、レトロウイルス、または偽型ベクターの治療的適用性および有効性を拡げる。ある態様において、腫瘍関連抗原エピトープの各々は、発現されたエピトープの再現可能なプロセシングのため、プロセシング部位、例えば酵素切断部位、例えば、フーリン切断部位によって隔てられている。
本発明によれば、がんまたは腫瘍を有する対象への投与後、1つまたは複数の腫瘍関連抗原（TAA）に由来する複数、例えば、2つ以上のエピトープをコードするウイルスベクターおよびウイルス粒子、またはその薬学的組成物は、複数のエピトープをRNAの形態で細胞に送達する。このRNAは、HLA/MHC抗原の状況において、免疫系の細胞、例えばマクロファージおよび樹状細胞によってCD8+T細胞の前駆体に最適に提示されるタンパク質およびタンパク質断片、例えばエピトープペプチドへと、細胞内でプロセシングされる。免疫系のアクセサリー細胞によるそのような抗原提示は、CD8+T細胞を活性化し、それは、増殖して、腫瘍関連抗原（新生抗原を含む）の特定のエピトープを発現するがん細胞および腫瘍細胞を殺傷する多数の細胞傷害性T細胞を産生する。したがって、本明細書に記載されるポリヌクレオチドおよびウイルスベクターによってコードされるエピトープは最適に提供されて、対応する腫瘍関連抗原の1つまたは複数を発現するがん細胞または固形腫瘍に対して特異的に向けられた、高められた免疫応答、特にT細胞媒介性免疫応答を誘発する。いくつかの態様において、本発明のウイルスベクターに含有されるポリヌクレオチドは、ミニ遺伝子またはポリヌクレオチド構築物と呼ばれる。いくつかの態様において、本発明のポリヌクレオチド、ウイルスベクター、または薬学的組成物は、同じ腫瘍関連抗原に由来する1つまたは複数の、好ましくは2つ以上の（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、またはそれより多い）エピトープを含み得る。例として、本発明のポリヌクレオチド、ウイルスベクター、または薬学的組成物は、同じエピトープの1つまたは複数のコピーを含み得る。いくつかの態様において、本発明のポリヌクレオチド、ウイルスベクター、または薬学的組成物は、異なる腫瘍関連抗原に由来する1つまたは複数の、好ましくは2つ以上の（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、またはそれより多い）エピトープを含み得る。
腫瘍関連抗原（TAA）
本発明のポリヌクレオチドおよびウイルスベクターによって発現されるエピトープが由来する腫瘍関連抗原は、がんまたは腫瘍、例えば、非限定的に、卵巣がん、乳がん、精巣がん、膵臓がん、肝臓がん、大腸がん、甲状腺がん、肺がん、前立腺がん、腎臓がん、メラノーマ、扁平上皮がん、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、前骨髄球性白血病、多発性骨髄腫、B細胞リンパ腫、膀胱がん、頭頚部がん、食道がん、脳がん、咽頭がん、舌がん、滑膜細胞がん、神経芽腫、子宮がん、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、基底細胞がん、類表皮がん、腺がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん、肝細胞がん、胆管がん、絨毛がん、精上皮腫、胎生期がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、小細胞肺がん、上皮がん、膠芽腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、希突起膠芽腫、髄膜腫、神経膠腫、および網膜芽細胞腫と、関連し得るか、または、前記がんまたは腫瘍によって、例えば、細胞外または細胞内のいずれかに発現され得る。したがって、本発明のポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）、ウイルスベクターおよび薬学的組成物を使用して、上の病態の1つまたは複数を患っている対象、例えばヒト患者を処置してよい。
ある態様において、1つまたは複数の腫瘍関連抗原の2つ以上の異なるエピトープは、同じがんまたは腫瘍タイプと関連し得る。別の態様において、2つ以上のエピトープは、異なるがんタイプ、例えば、2つ以上のがんタイプの腫瘍関連抗原と関連し得る。例として、いくつかの態様において、本発明のポリヌクレオチド、ウイルスベクター、または薬学的組成物は、1つのタイプのがん細胞または腫瘍細胞、例えば、卵巣がん細胞、によって発現される腫瘍関連抗原の1つまたは複数のエピトープと、別のタイプのがん細胞または腫瘍細胞、例えば、乳がん細胞、によって発現される腫瘍関連抗原に由来する1つまたは複数のエピトープとを含む。いくつかの態様において、本発明のポリヌクレオチド、ウイルスベクター、または薬学的組成物は、1つまたは複数のがんタイプ（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、19、18、19、20、30、40、50、またはそれより多いがんまたは腫瘍タイプ）の表面に発現される腫瘍関連抗原の1つまたは複数のエピトープ、または2つ以上のエピトープを含む。他の態様において、腫瘍関連抗原の1つまたは複数のエピトープ、または2つ以上のエピトープは、1つまたは複数のがんまたは腫瘍タイプにおいて細胞内に発現される。
いくつかの態様において、本発明のポリヌクレオチド、ウイルスベクター、または薬学的組成物は、上のがんタイプと関連する1つまたは複数の腫瘍関連抗原の2つ以上のエピトープを含む。以下の表1〜28は、本明細書に記載されるとおりのポリヌクレオチド、ウイルスベクター、もしくはウイルス粒子によってコードされ得るかまたは本発明の組成物に組み込まれ得る、種々の腫瘍関連抗原およびそのエピトープの非限定的リストを提供する。腫瘍関連抗原およびそれらのエピトープは、ヒト腫瘍関連抗原およびそのエピトープならびに腫瘍関連抗原およびそのエピトープのヒトオルソログを包含する。例として、いくつかの態様において、本発明のポリヌクレオチド、ウイルスベクター、または薬学的組成物は、表1〜28のいずれか1つに列挙される1つまたは複数の腫瘍関連抗原の1つまたは複数の、または2つ以上（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90の、またはそれより多い）のエピトープを含む。いくつかの態様において、本発明のポリヌクレオチド、ウイルスベクター、または薬学的組成物は、表1〜28のいずれか1つに列挙されるアミノ酸配列の1つまたは複数、または2つ以上（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、またはそれより多い）を含む。
ある態様において、本発明のポリヌクレオチド、ウイルスベクター、またはウイルス粒子によってコードされる腫瘍関連抗原のエピトープの各々は、本明細書に記載されるとおりの酵素切断（またはプロセシング）部位、例えば、フーリン切断部位、または他の酵素切断もしくはプロセシング部位によって隔てられている。本発明に係るポリヌクレオチドおよびウイルスベクターによってコードされるエピトープペプチドを切断する際に使用するための追加のプロセシング酵素の非限定例は、セリンプロテアーゼ、シグナラーゼ、フーリンプロテアーゼ、およびフーリン関連エンドペプチダーゼ、例えばPC1/2、PC4/5、PACE4、およびPC7を含む。これらの酵素は、プロセシングシグナル（R/K）Xn（R/K）（式中、Xnは、任意の0〜6アミノ酸のスペーサーを指す）（SEQ ID NO: 6）を認識する（Seidah and Prat, 2012, Nature Reviews Drug Discovery, 11:367-383）。本明細書に記載されるとおりのポリヌクレオチド、ウイルスベクター、またはウイルス粒子が、コードされたエピトープの各々を隔てる酵素切断部位を内包していることは、有利なことに、投与後の、発現されたエピトープのプロセシングにおける再現可能性を可能にし、対象を処置する際に使用するためのより安全な生成物を提供する。例えば、本発明に係るポリヌクレオチドが、腫瘍関連抗原エピトープをコードする核酸配列の各々の間に点在する酵素切断部位を含有することで、エピトープのプロセシングおよび産生が、とりわけインビボ細胞において、均一になること、ならびに、設計されたポリペプチドが再現性よく作動して、コードされた標的抗原に対して向けられる適切な免疫応答（例えば、T細胞応答）を生じることが確実となる。ある態様において、腫瘍関連抗原エピトープが、例えば、エフェクターT細胞への最適な提示のために、MHC/HLA分子への結合に基づいて選択され、その結果として、本明細書に記載されるとおりの最適な免疫応答を確実にする再現可能性を提供する。
他の態様において、1つまたは複数の腫瘍関連抗原のエピトープは、各々、1つの酵素切断部位によって隔てられている。いくつかの態様において、エピトープは、酵素切断部位によって隔てられておらず、コードされた配列は、本明細書に記載されるウイルスベクターによる細胞への送達後に、細胞内で切断される。
（表１）卵巣がん
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（表２）乳がん
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（表３）精巣がん
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（表４）膵臓がん
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（表５）肝臓がん
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（表６）大腸がん
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（表７）甲状腺がん
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（表８）肺がん
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（表９）前立腺がん
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（表１０）腎臓がん
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（表１１）メラノーマ
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（表１２）扁平上皮がん
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（表１３）慢性骨髄性白血病
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（表１４）急性リンパ芽球性白血病
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（表１５）急性骨髄性白血病
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（表１６）慢性リンパ性白血病
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（表１７）前骨髄球性白血病
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（表１８）多発性骨髄腫
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（表１９）Ｂ細胞リンパ腫
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（表２０）膀胱がん
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（表２１）頭頚部がん
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（表２２）食道がん
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（表２３）脳がん
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（表２４）咽頭がん
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（表２５）舌の腫瘍
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（表２６）滑膜細胞肉腫
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（表２７）神経芽腫
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（表２８）子宮がん
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TAAの追加の例は、当技術分野において公知であり、例えば、Reuschenbach et al., Cancer Immunol. Immunother. 58:1535-1544 (2009); Parmiani et al., J. Nat. Cancer Inst. 94:805-818 (2002); Zarour et al., Cancer Medicine. (2003); Bright et al., Hum. Vaccin. Immunother. 10:3297-3305 (2014); Wurz et al., Ther. Adv. Med. Oncol. 8:4-31 (2016); Criscitiello, Breast Care 7:262-266 (2012); Chester et al., J. Immunother. Cancer 3:7 (2015); Li et al., Mol. Med. Report 1:589-594 (2008); Liu et al., J. Hematol. Oncol. 3:7 (2010); Bertino et al., Biomed. Res. Int. 731469 (2015); and Suri et al., World J. Gastrointest. Oncol. 7:492-502 (2015)に記載されている。
本発明のポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）、ウイルスベクターおよびウイルス粒子は、がんまたは腫瘍のための処置を必要とする患者内に存在する腫瘍細胞またはがん細胞によって発現される1つまたは複数の腫瘍関連抗原の、2つ以上（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90の、またはそれより多い）のエピトープをコードする。ある態様において、本発明のポリヌクレオチドならびにウイルスベクターおよび粒子生成物、ならびに組成物および方法における使用に好適な2つ以上のTAA由来エピトープおよび腫瘍関連抗原は、表1〜28のいずれか1つに列挙されるものである。ある態様において、本発明のポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）、ウイルスベクター、ウイルス粒子、および薬学的組成物は、がんまたは腫瘍を患っている対象、例えば患者へ投与されると、TAAエピトープを発現するがんまたは腫瘍に対して向けられる免疫応答を誘発する、がんまたは腫瘍によって発現される1つまたは複数の腫瘍関連抗原またはそのエピトープと十分に免疫学的に交差反応性である1つまたは複数の腫瘍関連抗原の複数、例えば、2つ以上のエピトープをコードする。
エピトープを有しかつがん細胞または固形腫瘍によって発現される、任意の腫瘍関連抗原（TAA）を、本発明の組成物および方法と併せて利用することができる。しかしながら、対象における免疫応答を誘導するまたは増加させる異なるTAAおよびそれらの関連するエピトープの有効性に変動性が存在し得ることが予想されるが、その理由は、いくつかのTAAおよび／またはそれらのエピトープは、より強固な応答（すなわち、免疫優性TAA）を誘導する可能性があるからである。関連する報告、例えば、前臨床および臨床研究報告を使用して、本発明のポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）、ウイルスベクター、ウイルス粒子、または薬学的組成物に組み込まれるべきTAAまたはそのエピトープの選択を導くことができる。いくつかの態様において、MHCクラスIタンパク質に高い親和性で結合するか、またはMHCクラスIIタンパク質に高い親和性で結合する、強固な免疫応答を誘導することができるTAAまたはそのエピトープのコード配列が、本発明のポリヌクレオチド、ウイルスベクター、ウイルス粒子、または薬学的組成物に組み込まれる。例として、NY-ESO-1（がん-精巣抗原）は、がん免疫療法のための腫瘍関連抗原としての使用に望ましく、その理由は、NY-ESO-1が、数種の異なるがんおよび腫瘍タイプ、例えば、乳がん、肺がん、メラノーマ、ならびに精巣および胎盤において発現されるが、他の正常な成体組織には発現されないからである。
本明細書に記載されるウイルスベクターに基づく抗がん治療において使用するためのTAAまたはその複数のエピトープの選択について当業者に伝える様々な資料が利用可能である。例えば、国立がん研究所（NCI：National Cancer Institute）は、5年間にわたって実施された臨床試験からのがん抗原データを評価する専門家委員会を設置した。NCI委員会は、基準を策定し、加重階層分析法を使用して75の代表的なTAAをランク付けした（Cheevers et al., Clin Cancer Res., 15: 5323-5337, 2009）。関連分野における技術者は、本発明のポリヌクレオチド、ウイルスベクター、ウイルス粒子、または薬学的組成物に内包するためのTAAまたはその複数のエピトープを選択するためのデータベースの使用を熟知している。そのような参考文献は、非限定的に、van der Bruggen P. et al., Peptide database: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun, 2013. URL: http://www.cancerimmunity.org/peptide/; Vigneron et al. Cancer Immun. 2013; 13: 15; TANTIGEN: Tumor T cell Antigen Database, http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/; HPtaa database, http://www.bioinfo.org.cn/hptaa/; Backert, L. and Kohlbacher, O., 2015, Genome Medicine, 7:119; Nielsen, M. et al., 2010, Immunology, 130(3):319-328; Wang, P. et al., 2008, PLoS Comput. Biol., 44(4):e10000048; Wang, P. et al., 2010, BMC Bioinformatics, 11:568; Chang, S.T. et al., 2006, Bioinformatics, 22(22):2761-2767; Guillaume, P. et al., 2009, Cancer Immun. (http://www.cancerimmunity.org/tetramers/); Chen, Y.T. et al., 2000, In: Rosenberg, S.A., Ed., Principles and practice of the biologic therapy of cancer, 3rd ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, pp. 557-570を含む。利用可能な刊行物に加えて、以下の表29に提示される様々なインターネット上のソースで利用可能なアルゴリズムを使用して、T細胞受容体への結合強度について推定エピトープを分析することもできる。エピトープ選択のための表29に列挙されるアルゴリズムの使用の一例が以下の実施例6に示される。
より個別化されたワクチンアプローチでは、患者の腫瘍によって発現される腫瘍関連抗原、およびそのエピトープを、患者の生検材料から、または生検材料が入手可能でないときは生物学的試料から特定することができる。対象（患者）から得られる生物学的試料は、非限定的に、血液、血清、血漿、尿、糞、痰、唾液、涙液、脳脊髄液、腹水、皮膚、組織、細胞、組織および皮膚の剥離物、ならびにそれらの処理された、例えば、ホモジナイズまたは再構成された形態を含み得る。ヒトTAAを特定するために、cDNA発現ライブラリの血清学的分析（SEREX）がこれまで使用されてきた。ELISAまたはウェスタンブロットアッセイのいずれかを使用することによって公知のTAAタンパク質のパネルに対して対象の血清試料を試験することもできる。当技術分野において公知の方法、例えばT細胞活性化を測定するElispotアッセイを使用して、対象の血清から特定されたTAAのエピトープを、患者のT細胞のエフェクター活性を刺激する能力についてさらに試験することができる。
（表２９）HLA/MHCエピトープ結合をランク付けするアルゴリズムのURL
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エピトープ選択
一般に、CD8+細胞傷害性T細胞は、全ての有核細胞上のMHCクラスI分子と関連するペプチド（エピトープアミノ酸配列）を認識するようプログラムされている。これらのペプチドまたはエピトープは、ある特定の一般的な特徴を有する。典型的には、CD8+ T細胞応答を誘発することができるエピトープは、MHCクラスI分子に結合するアミノ酸配列またはペプチドであり、かつ約3〜50アミノ酸長、または約3〜30アミノ酸長、または約5〜30アミノ酸長、または約5〜25アミノ酸長、または約7〜20アミノ酸長、または約8〜10アミノ酸長である。理論に束縛されることを望むものではないが、エピトープペプチドは、MHCクラスIペプチド結合溝に沿って伸長された立体配置に依拠する。しかしながら、ペプチドの長さの変動は、大抵の場合、ペプチド骨格のねじれによって、調整されるようである。それゆえ、CD8+T細胞活性化エピトープのある程度の長さの変動が可能である。
CD4+T細胞応答を誘発することができるエピトープは、典型的には、MHCクラスII分子に結合するペプチド（エピトープアミノ酸配列）である。MHCクラスII分子に結合するペプチドは、少なくとも13アミノ酸長であり、さらに長い可能性がある。エピトープペプチドは、MHCクラスIIペプチド結合溝に沿って伸長された立体配置に依拠する。エピトープペプチドは、多型残基で覆われている浅いポケットおよび深いポケット内に突き出たペプチド側鎖によって、ならびに、ペプチド骨格と全てのMHCクラスII分子内のペプチド結合クレフトを覆う保存アミノ酸の側鎖との間の相互作用によってこの溝に保持される。ペプチドは、その骨格によって結合され、結合溝の両端から現れることが可能なので、原則として、MHCクラスII分子に結合することもできるペプチドの長さに上限はない。しかしながら、MHCクラスII分子に結合したより長いペプチドは、典型的には、ペプチダーゼによって大抵の場合13〜17アミノ酸長にトリミングされる。
T細胞応答を誘発すると予想されるエピトープの選択を、文献、データベース（Vigneron、N. et al., 2013, Database of T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun., Vol. 13; および Immune Epitope Database）およびインシリコアルゴリズム（表29）によって導くことができるが、そのようなアプローチは、限定されるものではなく、腫瘍細胞に関連して見いだされた上記のエピトープの説明とほぼ一致するTAAエピトープを検出する任意の手段を使用することができる。データベースは、エピトープが免疫応答を誘発することに成功したかどうかを示している文献からデータを収集する。多くのエピトープ予測アルゴリズムが利用可能であり、そのいくつかが表29に列挙される。構造、物理化学的特性、フレキシビリティ、電荷およびプロテアーゼプロセシングを含む、MHC受容体およびT細胞に結合する可能性が最も高いペプチド領域についてのアミノ酸配列を分析する、種々の基準を使用したコンピュータプログラムが利用可能である（Yang and Yu, 2009, Rev. Med. Virol., 19:77-96）。数種のアルゴリズムを使用して腫瘍関連抗原タンパク質のアミノ酸配列を分析して、抗がん／抗腫瘍免疫応答を誘発するための最良のコンセンサスエピトープを見つけることができる。本発明において使用するためのエピトープを選択するエピトープ予測アルゴリズムの使用の一例が以下の実施例6に示される。
実験結合アッセイ、例えばiTopia Epitope Discovery System（Beckman Coulter）は、エピトープの選択をさらに洗練する。iTopiaスクリーニングアッセイは、MHC結合親和性およびペプチド:MHC複合体安定性に基づく予測エピトープの優先順位付けを可能にする。高頻度で集団に存在するHLA対立遺伝子に拘束されたエピトープを選択して、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）、ウイルスベクター、ウイルス粒子、および組成物に含まれるTAA由来エピトープの適用性を拡げることができる。HLA IおよびHLA II対立遺伝子の頻度は、世界中の集団について集められており、当業者により利用可能である（例えば、www.allelefrequencies.net; bioinformatics.bethematchclinical.org）。所与のTAAについて数種のエピトープが検討中であるとき、個々の患者の個別化された処置を可能にするために、最も頻度の高いHLA対立遺伝子に結合するTAAエピトープを選択することが有用であり得る。
腫瘍関連抗原および他のポリペプチドのエピトープをコードするポリヌクレオチド
シンドビスウイルスベクターへ組み込むための記載のとおりのポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）は、例えば、ペプチドエピトープ-MHC相互作用を増大する分子をコードする配列をさらに含み得る。例えば、カルレティキュリンおよびカルネキシンは、MHCクラスIタンパク質の産生における内在性タンパク質を代表する。カルネキシンは、新たに合成されたMHCクラスIα鎖に、これらが小胞体に侵入したときに結合し、その結果として、それらを部分的に折り畳まれた状態に保つ。β2-ミクログロブリンがペプチドローディング複合体（PLC）に結合した後、カルレティキュリン（ERp57と共に）は、MHCクラスIタンパク質をシャペロニング（chaperoning）する機能を引き継ぎ、一方で、タパシンは、その複合体を抗原プロセシング（TAP）複合体と会合した輸送体に連結する。この会合は、細胞表面上での提示のために抗原に結合するために、MHCクラスI分子を調製する。したがって、1つまたは複数の腫瘍関連抗原の複数のエピトープをコードするポリヌクレオチドに連結されたカルレティキュリン（CRT）をコードするシンドビスウイルスレプリコン粒子を構築することができる。
例として、「オーバーラップ伸長法による遺伝子スプライシング（gene Splicing by Overlap Extension）」すなわち「遺伝子SOE」として公知のプロセスにおいて、一連の重複DNAオリゴマープライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を介して、ポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）を構築することができる（Horton, R. M., et al., 2013. BioTechniques, 8(5):528-535; (November 1990); Horton et al., Biotechniques. 2013;54:129-133）。マルチエピトープポリペプチドのフーリンプロセシングは、T細胞活性化を効率的に誘導する。シンドビスウイルスポリペプチドはフーリンによって天然にプロセシングされるので、本発明のポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）、ウイルスベクター、ウイルス粒子、および薬学的組成物は、複数のエピトープコード配列を隔てるフーリン切断部位を含むよう設計される。例として、本発明の組成物は、シンドビスフーリン消化配列XRSKRX（SEQ ID NO: 5）（式中、Xは、疎水性残基を表す）を含み得る。本発明に係るポリヌクレオチドおよびウイルスベクターによってコードされるエピトープペプチドを切断する際に使用するための追加のプロセシング酵素の非限定例は、フーリン関連エンドペプチダーゼ、例えばPC1/2、PC4/5、PACE4、およびPC7を含む。これらの酵素は、プロセシングシグナル（R/K）Xn（R/K）（式中、Xnは、任意の0〜6アミノ酸のスペーサーを指す）(SEQ ID NO: 6）を認識する（Seidah and Prat, 2012, Nature Reviews Drug Discovery, 11:367-383）。連続エピトープをコードする核酸配列（Thompson et al., 1998, J. Immunol., 160:1717-23）またはスペーサー、例えばAAAまたはGGGを有するエピトープをコードする核酸配列を、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）またはウイルスベクターに含めてよく、その結果として細胞プロセシングが可能になる。いくつかの態様において、本発明のポリヌクレオチド、ウイルスベクター、または薬学的組成物は、酵素切断部位またはスペーサーなしの連続エピトープをコードする。
また、システインプロテアーゼカテプシンS（CAT S）も、本発明のポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）またはウイルスベクターによってコードされるペプチドおよびポリペプチドのタンパク質分解プロセシングにおける使用に好適である。CAT Sは、抗原提示細胞、例えば樹状細胞、マクロファージ、およびBリンパ球のエンドソーム区画に位置し、かつ、提示（特にMHC II上での）のための抗原プロセシングにおいて役割を果たし得る。CAT S用のエンドリシン切断部位は、PMGAP（SEQ ID NO: 270）およびPMGLP（SEQ ID NO: 271）である。
本発明のポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）またはウイルスベクターによってコードされる腫瘍関連抗原由来エピトープペプチドは、例えば、5〜50アミノ酸残基を含有し得る。ある態様において、腫瘍関連抗原のエピトープは、5〜30アミノ酸残基、5〜25アミノ酸残基、5〜20アミノ酸残基、7〜25アミノ酸残基、7〜20アミノ酸残基、または7〜14アミノ酸残基を含む。非限定例として、本発明のポリヌクレオチドは、21〜42残基をコードする。シンドビス構造遺伝子をコードするおよそ3700ヌクレオチドは、1つまたは複数の腫瘍関連抗原の複数のエピトープをコードするシンドビスウイルスベクターの産生の間にレプリコンベクターから除去されるので、フーリン切断部位が隣接する約60〜90エピトープコード配列を、本発明のウイルスベクター、例えば、本明細書に記載されるとおりのpT7StuI-R/エピトープベクターに挿入することができると推定される。
1つまたは複数の腫瘍関連抗原の複数のエピトープをコードするポリヌクレオチドおよびウイルスベクター
いくつかの態様において、1つまたは複数の腫瘍関連抗原の2つ以上のエピトープをコードするポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）を含有するウイルスベクター、ウイルス粒子、または薬学的組成物であって、該エピトープが強固な免疫応答（例えば、体液性または細胞性免疫応答）を誘導する、ウイルスベクター、ウイルス粒子、または薬学的組成物が提供される。ある態様において、該ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるとおりのアルファウイルスタンパク質またはその断片をコードする。ある態様において、該ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるとおりのシンドビスウイルスタンパク質またはその断片をコードする。例えば、腫瘍関連抗原に対して生じた抗体力価、または患者のインビボでのもしくは患者から得られた生物学的試料におけるTAA媒介性T細胞活性化の程度を決定することによって、誘発された免疫応答を評価し得る。強固な体液性または細胞性免疫応答を誘導しかつ本発明のポリヌクレオチド、ウイルスベクター、ウイルス粒子、または組成物に組み込まれ得る、腫瘍関連抗原およびそのエピトープを選択する方法が本明細書にさらに詳細に記載される。
ある特定の態様において、限定することを望まないが、本発明のポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）、ポリヌクレオチド、ウイルスベクター、ウイルス粒子、または薬学的組成物は、以下の腫瘍関連抗原の1つまたは複数の、2つ以上のエピトープをコードするポリヌクレオチドを含有する：NY-ESO-1、CEA、k-Ras、c-myc、HPV E6、HPV E7、サイクリンB1、Her2、MUC1、p53、p62、サバイビン、WT1、sp17、およびPdz結合キナーゼ（PBK）。例えば、いくつかの態様において、該ポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）、ウイルスベクター、ウイルス粒子、または薬学的組成物は、腫瘍関連抗原NY-ESO-1の1つまたは複数のエピトープ（例えば、表1〜28のいずれか1つに列挙されるNY-ESO-1のエピトープ）、および腫瘍関連抗原CEAの1つまたは複数のエピトープ（例えば、表1〜28のいずれか1つに列挙されるCEAのエピトープ）をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、該ポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）、ウイルスベクター、ウイルス粒子、または薬学的組成物は、NY-ESO-1の1つまたは複数のエピトープ（例えば、表1〜28のいずれか1つに列挙されるNY-ESO-1のエピトープ）、および腫瘍関連抗原k-Rasの1つまたは複数のエピトープ（例えば、表1〜28のいずれか1つに列挙されるk-Rasのエピトープ）をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、該ポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）、ウイルスベクター、ウイルス粒子、または薬学的組成物は、NY-ESO-1の1つまたは複数のエピトープ（例えば、表1〜28のいずれか1つに列挙されるNY-ESO-1のエピトープ）、および腫瘍関連抗原c-mycの1つまたは複数のエピトープをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、該ポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）、ウイルスベクター、ウイルス粒子、または薬学的組成物は、NY-ESO-1の1つまたは複数のエピトープ（例えば、表1〜28のいずれか1つに列挙されるNY-ESO-1のエピトープ）、およびサイクリンB1の1つまたは複数のエピトープをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、該ポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）、ウイルスベクター、ウイルス粒子、または薬学的組成物は、NY-ESO-1の1つまたは複数のエピトープ（例えば、表1〜28のいずれか1つに列挙されるNY-ESO-1のエピトープ）、およびHer2の1つまたは複数のエピトープ（例えば、表1〜28のいずれか1つに列挙されるHer2のエピトープ）をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、該ポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）、ウイルスベクター、ウイルス粒子、または薬学的組成物は、NY-ESO-1の1つまたは複数のエピトープ（例えば、表1〜28のいずれか1つに列挙されるNY-ESO-1のエピトープ）、およびMUC1の1つまたは複数のエピトープをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、該ポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）、ウイルスベクター、ウイルス粒子、または薬学的組成物は、NY-ESO-1の1つまたは複数のエピトープ（例えば、表1〜28のいずれか1つに列挙されるNY-ESO-1のエピトープ）、およびp53の1つまたは複数のエピトープ（例えば、表1〜28のいずれか1つに列挙されるp53のエピトープ）をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、該ポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）、ウイルスベクター、ウイルス粒子、または薬学的組成物は、NY-ESO-1の1つまたは複数のエピトープ（例えば、表1〜28のいずれか1つに列挙されるNY-ESO-1のエピトープ）、およびp62の1つまたは複数のエピトープをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、該ポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）、ウイルスベクター、ウイルス粒子、または薬学的組成物は、NY-ESO-1の1つまたは複数のエピトープ（例えば、表1〜28のいずれか1つに列挙されるNY-ESO-1のエピトープ）、およびサバイビンの1つまたは複数のエピトープまたはそのエピトープをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、該ポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）、ウイルスベクター、ウイルス粒子、または薬学的組成物は、NY-ESO-1の1つまたは複数のエピトープ（例えば、表1〜28のいずれか1つに列挙されるNY-ESO-1のエピトープ）、およびWT1の1つまたは複数のエピトープ（例えば、表1〜28のいずれか1つに列挙されるWT1のエピトープ）をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、該ポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）、ウイルスベクター、ウイルス粒子、または薬学的組成物は、NY-ESO-1の1つまたは複数のエピトープ（例えば、表1〜28のいずれか1つに列挙されるNY-ESO-1のエピトープ）、およびsp17の1つまたは複数のエピトープ（例えば、表1〜28のいずれか1つに列挙されるsp17のエピトープ）をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、該ポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）、ウイルスベクター、ウイルス粒子、または薬学的組成物は、NY-ESO-1の1つまたは複数のエピトープ（例えば、表1〜28のいずれか1つに列挙されるNY-ESO-1のエピトープ）、およびgp70の1つまたは複数のエピトープをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、該ポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）、ウイルスベクター、ウイルス粒子、または薬学的組成物は、NY-ESO-1の1つまたは複数のエピトープ（例えば、表1〜28のいずれか1つに列挙されるNY-ESO-1のエピトープ）およびpbk（多くの腫瘍で過剰発現されるPDZ結合キナーゼ）の1つまたは複数のエピトープをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、該ポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）、ウイルスベクター、ウイルス粒子、または薬学的組成物は、NY-ESO-1の1つまたは複数のエピトープ（例えば、表1〜28のいずれか1つに列挙されるNY-ESO-1のエピトープ）およびサバイビンの1つまたは複数のエピトープをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の態様において、該ポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）、ウイルスベクター、ウイルス粒子、または薬学的組成物は、NY-ESO-1の1つまたは複数のエピトープ（例えば、表1〜28のいずれか1つに列挙されるNY-ESO-1のエピトープ）、p53の1つまたは複数のエピトープ（例えば、表1〜28のいずれか1つに列挙されるp53のエピトープ）、sp17の1つまたは複数のエピトープ（例えば、表1〜28のいずれか1つに列挙されるsp17のエピトープ）、サバイビンの1つまたは複数のエピトープ、およびWT1の1つまたは複数のエピトープ（例えば、表1〜28のいずれか1つに列挙されるWT1のエピトープ）をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、該ポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）、ウイルスベクター、ウイルス粒子、または薬学的組成物は、例えば、以下の実施例2に記載のとおり、NY-ESO-1の1つまたは複数のエピトープ（例えば、表1〜28のいずれか1つに列挙されるNY-ESO-1のエピトープ）、gp70の1つまたは複数のエピトープ、およびpbkの1つまたは複数のエピトープをコードするポリヌクレオチドを含む。
ウイルスおよびウイルスベクター
アルファウイルス、シンドビスウイルスおよびシンドビスウイルスベクター
アルファウイルスは、小さな球状のエンベロープを持ったプラス鎖の一本鎖RNAウイルスであるIV群トガウイルス科ウイルスファミリーに属する。大部分のアルファウイルスは、脊椎動物宿主、および、蚊などの吸血性節足動物に感染して複製する。アルファウイルスビリオンは、正20面体ヌクレオカプシドが脂質-タンパク質エンベロープ中に封入された球状である。アルファウイルスRNAは、キャッピングおよびポリアデニル化されているおよそ4×106ダルトンの単一の42S鎖である。アルファウイルスエンベロープは、宿主細胞の原形質膜に由来する脂質二重層を含み、かつ、2つのウイルス糖タンパク質E1（48,000ダルトン）およびE2（52,000ダルトン）を含有する。E3タンパク質（10,000〜12,000ダルトン）がウイルスと会合したままであるセムリキフォレストウイルス以外のアルファウイルスでは、第三の小さなE3タンパク質が可溶性タンパク質としてウイルスから放出される。
本明細書に記載されるとおり、アルファウイルスタンパク質またはその断片と、1つまたは複数の腫瘍関連抗原の2つ以上のエピトープとをコードするポリヌクレオチドであって、各エピトープが酵素切断部位によって隔てられている、ポリヌクレオチドが、本発明によって包含される。加えて、本発明は、他のウイルスタイプ由来のタンパク質、例えば、エンベロープタンパク質で偽型化されたウイルスベクターおよび粒子を包含する。本明細書に記載されるポリヌクレオチド、ウイルスベクターおよびウイルス粒子は、種々の株、抗原複合体、種および亜型を含むアルファウイルス属のメンバーの核酸配列およびポリペプチド配列を包含する。アルファウイルス、系統発生学的に関連するアルファウイルス、アルファウイルス群、およびそれらの構造成分、例えばエンベロープタンパク質、例えば、E1（例えば、Powers, A.M. et al., 2011, J. Virol., 75(21):10118-10131に記載のとおり）が本発明によって包含される。本明細書に記載されるとおりのポリヌクレオチド、ウイルスベクターおよびウイルス粒子において使用され得るアルファウイルス、ならびにそのポリヌクレオチドおよびタンパク質、さらにはそれらのポリヌクレオチドおよびタンパク質の断片の非限定例は、バーマフォレストウイルス、バーマフォレストウイルス群、東部ウマ脳炎ウイルス（EEEV）、東部ウマ脳炎ウイルス群、ミデルブルグウイルス、ミデルブルグウイルス群、ヌドゥムウイルス、ヌドゥムウイルス群、セムリキフォレストウイルス、セムリキフォレストウイルス群、ベバルウイルス、チクングニヤウイルス、マヤロウイルス、亜型ウナウイルス、オニョンニョンウイルス、亜型イボ-オラウイルス、ロスリバーウイルス、亜型ゲタウイルス、亜型ベバルウイルス、亜型サギヤマウイルス、亜型メトリウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（VEEV）、VEEV群、カバソウウイルス、エバーグレーズウイルス、モッソダスペドラスウイルス、ムカンボウイルス、パラマナウイルス、ピクスナウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス（WEEV）、リオネグロウイルス、トロカラウイルス、亜型ビジューブリッジウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス群、アウラウイルス、ババンキウイルス、キジラガチウイルス、シンドビスウイルス、オケルボウイルス、ワタロアウイルス、バギークリークウイルス、フォートモーガンウイルス、ハイランドJウイルス、エイラートウイルス、サケ膵臓病ウイルス（SPDV）、ミナミゾウアザラシウイルス（SESV）、タイフォレストウイルスおよびトナテウイルスを含む。
アルファウイルスとして、シンドビスウイルスは小さなエンベロープを持ったプラス鎖の一本鎖RNAウイルスである。アルファウイルス属の他のメンバーは、非限定的に、セムリキフォレストウイルス（SFV）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（VEEV）およびロスリバーウイルス（RRV）を含む。シンドビスウイルスを含むアルファウイルスは、直径60〜70nmの球状粒子を形成する；多くのアルファウイルスの正20面体構造は、低温電子顕微鏡法（cryo-EM）および結晶学的研究によって非常に高い分解能まで定義されており、構造タンパク質間の相互作用の詳細が明らかになっている（Jose, J. et al., 2009, Future Microbiol., 4:837-856）。そのゲノムは、プラス鎖RNAの一本鎖から構成され、該RNAは、およそ11〜12kb長であり、かつ、ウイルスの複製および病原性に関与する4つの非構造タンパク質（nsP1〜nsP4）と、ビリオン粒子を構成する5つの構造タンパク質、すなわち、ヌクレオカプシドタンパク質C、ならびにエンベロープタンパク質P62（成熟エンベロープタンパク質E2およびE3へとタンパク質分解により切断される）およびE1タンパク質とをコードする。アルファウイルスは、効率的な複製を示し、かつ、広範な感受性かつ許容性の宿主を有する；それゆえ、これらのウイルスは、異種遺伝子発現にも遺伝子治療送達ベクターとしても非常に好適である。アルファウイルスベクターは、本明細書に記載されるとおりの腫瘍関連抗原のマルチエピトープを送達するためのポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）をコードする上での使用に好適である。
複製可能ベクター（例えば、米国特許第8,282,916号を参照のこと）および複製欠損ベクター（例えば、米国特許第7,303,898号、第7,306,792号、および第8,093,021号を参照のこと）を含む任意のシンドビスウイルスベクターが、本発明のポリヌクレオチド、ウイルスベクター、組成物および方法と併用する上で好適である。複製欠損ベクターは、健康な組織の感染を防ぐ別の層を提供するため、本発明において使用するために好ましい。また、当技術分野において公知の方法を使用して、複数の遺伝子を発現する複数のサブゲノムプロモーターを含有するシンドビスベクターを構築することもできる。
例として、pT7StuI-R/エピトープベクターを生産するために、シンドビスレプリカーゼ遺伝子（nsP1〜nsP4）をコードするレプリコンプラスミドおよびウイルス構造遺伝子（カプシドタンパク質C、E1、E2、E3、および6K）をコードするヘルパープラスミドをインビトロ転写した。インビボのウイルス複製を制限するために、レプリコン遺伝子は構造遺伝子から分離されており、それは、ウイルス粒子への組み込みを防止する突然変異したパッケージングシグナルを追加的に含有する（Bredenbeek, P. J. et al., 1993, J Virol 67: 6439-6446）。インビトロで合成されたシンドビスレプリコンRNAおよびヘルパーRNA転写産物を用いたベビーハムスター腎臓（BHK）細胞の一過性トランスフェクションによってウイルス粒子を生産した。細胞内で、シンドビスレプリカーゼによってゲノムRNAを複製し、キャッピングされたレプリコンRNA転写産物から発現させた。構造タンパク質をヘルパーRNA転写産物から発現させた。レプリコンRNAだけがカプシド中にパッケージングされてヌクレオカプシドを形成し、次いでこれが、ウイルス糖タンパク質E1およびE2と会合し、細胞外へ伸び始める。生じたビリオンは、ウイルスレプリカーゼをコードするnsP1〜nsP4遺伝子のキャッピングされたSV一本鎖RNAメッセージ、レプリカーゼが関心対象の挿入遺伝子を転写することができるサブゲノムプロモーター（Psg）およびポリAテールを含有した。
複数のTAAエピトープをコードしかつ抗腫瘍T細胞レパートリーを刺激する潜在性を示すシンドビスウイルスベクター（「SV/TAA」）を製剤化するために、各々酵素切断部位によって隔てられている複数のT細胞認識エピトープをコードするポリヌクレオチド（例えば、DNAミニ遺伝子）を、シンドビスベクター（例えば、pT7StuI-R LacZ#202; 米国特許第8,093,021号）に挿入した。SV/TAAビリオンは、強い先天性の免疫応答を誘導し、かつ、CD8+T細胞を活性化するTAAエピトープを発現するので、本発明のウイルスベクターは、シグナルペプチドおよび免疫原性ペプチドを必要としないが、所望であればそのようなペプチドを含んでもよい。所望であれば、下記のとおりの免疫増強エレメントを含むようにベクターを容易に操作することができる。
レンチウイルス
レンチウイルスベクターは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染する能力を有するため、遺伝子の長期発現に特に有用である。安全性の増加のために第三世代レンチウイルス系が好ましい（Breckpot, K., et al., 2007, Gene Ther, 14: 847-862）。これらは、例えば、腫瘍関連抗原の2つ以上のエピトープをコードする核酸配列が挿入された導入プラスミド、gag遺伝子およびpol遺伝子用のパッケージングプラスミドならびにrev遺伝子用の別のパッケージングプラスミドを含む。最適な発現のために、導入発現ベクターは、スプライスドナー、パッケージングシグナル（psi）、Rev反応性エレメント（RRE）、スプライスアクセプター、中央のポリプリントラクト（cPPT）、およびウッドチャック肝炎ウイルス転写応答エレメント（WPRE）を含む（Shaw and Cornetta, 2014, Biomedicines, 2:14-35）。導入ベクター構築物はまた、哺乳動物細胞における発現のためのプロモーターを含有し得る。構成的プロモーター、例えばサイトメガロウイルス（CMV）、哺乳動物のベータアクチン、またはユビキチンプロモーターを本発明の組成物に組み込んでもよい。いくつかの態様において、CD4+T細胞特異的プロモーターのような組織特異的プロモーターが利用される。
レンチウイルスベクターを生成するためのプラスミドをAddgene（Cambridge, MA、非営利プラスミド保存団体）から得て、必要に応じて、当技術分野における標準的な技術を使用して改変することができる。標準的な第3世代パッケージングプラスミドを使用することができる。好適な導入ベクターは、例えば、pLX301、pFUGW、およびpWPXLを含む。これらのベクターは、上に挙げた必要な特徴の全てを含有する。安全性を高めるために、レンチウイルス導入ベクターを、突然変異させて感染細胞への組み込みを減少させかつエピソーム複製を増加させるようにすることができる。例として、当技術分野において公知の標準的な技術を使用して、以下の改変を実施することができる：自己不活性化LTR（SIN-LTR）を作製するために3'LTRのU3領域内を欠失させる；U3およびU5 LTR領域内のLTR att部位を欠失または突然変異させる；3'LTR-近位ポリプリントラクト（PPT）を欠失させるまたは改変する（Shaw and Cornetta, 2014）。
偽型ウイルスベクターおよびビリオンもまた、本発明のポリヌクレオチドおよび組成物と併用する上で好適である。そのようなビリオンは、ウイルス粒子および1つまたは複数の外来ウイルスエンベロープタンパク質を含有する（D.A. Sanders, 2002, Curr. Opin. Biotechnol., 13:437-442）。いくつかの態様において、本発明のウイルスベクターは、アルファウイルスタンパク質またはその断片、例えば、エンベロープタンパク質またはその機能的な断片を含有する、レンチウイルスであり得る。いくつかの態様において、本発明のウイルスベクターは、シンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質またはある特定のシンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質を含有する、レンチウイルスであり得る。例として、1つまたは複数のシンドビスエンベロープタンパク質で偽型化されたレンチウイルス骨格を含む構築物（例えば、偽型ウイルスベクター）を生産するために、シンドビスエンベローププラスミド、例えば、T7 DMヘルパー#101（米国特許第8,093,021号）をBHKまたは293細胞にレンチウイルスプラスミドと共にトランスフェクトして、偽型ビリオンを得る。
レトロウイルス
レトロウイルスベクターもまた、本発明に係る使用に好適である。いくつかの態様において、レトロウイルスベクターは、シンドビスエンベロープタンパク質で偽型化されたモロニーマウス白血病ウイルス（Mo-MuLV）である。当技術分野において公知の方法を使用して偽型化を実施することができる（例えば、Sharkey et al., 2001, J. Virology, 75(6):2653-2659を参照のこと）。いくつかの態様において、Mo-MuLVに基づくレトロウイルス粒子を、当技術分野において公知であり実施されている方法を使用して、アルファウイルスロスリバーウイルス（RRV）の糖タンパク質を含みかつ発現するように改変する。
シンドビスウイルスエンベロープ偽型ベクター
シンドビスウイルス（SV）エンベロープは、遺伝子またはポリヌクレオチド送達ベクターとしての使用に有利である。SVは、比較的長い半減期を有する血液感染性ウイルスである。安定なウイルスが容易に産生され、これを投与のために濃縮することができる。細胞表面分子に結合するシンドビスE2エンベロープタンパク質の改変は、細胞への侵入に必要であるE1融合性エンベロープタンパク質に影響を及ぼさず、したがって、改変されたウイルスは標的指向することが可能となる。シンドビスウイルスは、多くの腫瘍によって過剰発現される高親和性ラミニン受容体（LAMR）と相互作用することによって腫瘍を特異的に標的とし（米国特許第7,306,792号）、正常な組織には感染しない。血液感染性ウイルスとして、シンドビスウイルスは、血流を介して播種性の転移性腫瘍細胞と接触することができる。
シンドビスウイルスエンベロープ構造タンパク質は、他のウイルスベクター、例えばレンチウイルス、レトロウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス（VSV）を偽型化して、その標的指向能力を向上させ、ビリオン安定性を高めることができる。特に、E2エンベロープタンパク質に挿入された、黄色ブドウ球菌（S. aureus）プロテインAのFc結合ドメインを含有するよう設計されたシンドビス-ZZタンパク質（米国特許第6,432,699号）は、SVおよび他のベクターの標的指向を再度向けなおすための細胞表面特異的抗体との併用に役立つ。
複数のエピトープの長期の安定な発現が望まれるある特定の態様において、野生型または改変型シンドビスウイルスエンベロープタンパク質で偽型化されたレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターが採用される。分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染するため、レンチウイルスベクターが有利である。シンドビスウイルスゲノムと同じく、レンチウイルスゲノムを2つまたは3つのベクターに分割することができ、遺伝子を改変または欠失させて、安全性を向上させることができる。レトロウイルス亜型レンチウイルスは、宿主ゲノムに自然に組み込まれる。しかしながら、長い末端反復（LTR）またはインテグラーゼ酵素突然変異のいずれかを含有するベクターは、細胞核内で安定な非組み込みエピソームとして存在することができる（Breckpot, K., et al., 2007, Gene Ther., 14:847-862）。
記載のウイルスベクター、例えば、シンドビスウイルスベクターの免疫原性の増強
本明細書に記載されるウイルスベクター、例えばpT7StuI-R/エピトープベクターによってコードされる複数のTAA関連エピトープによって誘発される免疫応答の増大が、本発明によって包含される。例えば、CD4+T細胞（T細胞ヘルプ）の増加を促進することは、腫瘍抗原の交差提示を増強し、CD8+メモリーT細胞の産生を刺激することができる。実際に、1つまたは複数の腫瘍関連抗原の複数のエピトープをコードするシンドビスウイルスベクター（SV/TAA）によって提供される免疫応答および抗がん治療は、マウスがCD4 T細胞を枯渇したときには起こらなかった（図6A〜6D）。
汎HLA-DR反応性エピトープ：
Figure 2019510488
は、種々のHLAクラスII分子に高い親和性で結合してT細胞ヘルプを刺激する、抗原特異的CD4+T細胞を生成することができる（Alexander, J. et al., 1994, Immunity, 1:751-761）。ある特定の態様において、本発明のポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）、ウイルスベクター、またはウイルス粒子は、1つまたは複数の腫瘍関連抗原の、複数、例えば2つ以上のエピトープをコードする配列であって、エピトープ配列が、プロセシング部位、例えば酵素切断部位によって隔てられている、配列に加えて、PADREエピトープをコードする配列を含有する。加えて、同種CD4+ T細胞エピトープをコードする配列およびCD8+ T細胞エピトープをコードする配列をポリヌクレオチドおよびウイルスベクターに含めて、有効性を高めることができる。
小胞体（ER）シグナル配列の内包は、フーリン消化が行われるERへのマルチエピトープポリペプチド転移を容易にすることができる。潜在的なERシグナルペプチドは、アルファウイルス小胞体シグナル配列（Garoff, H. et al., 1990, J. Cell. Biol., 111:867-876）、インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質由来ペプチドM57-68（Anderson, K. et al., 1991, J Exp Med, 174: 489-492）、または組織プラスミノーゲン活性化因子ペプチド（Aurisicchio, L. et al., 2014, Oncoimmunology 3:e27529）などの配列を含む。本発明において使用するためのシグナル配列は以下に示される。
投与後のマルチエピトープポリペプチドの細胞内プロセシングを増強するために本明細書に記載されるポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）およびウイルスベクターに組み込むことができる追加のERシグナルコード核酸配列は、非限定的に、アデノウイルスERシグナル：
Figure 2019510488
および組織プラスミノーゲン活性化因子ペプチド：
Figure 2019510488
を含む。
また、免疫原性ペプチドをコードする核酸配列を、本明細書に記載されるとおりのポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）およびウイルスベクターに含めることもできる。そのような配列は、非限定的に、大腸菌易熱性エンテロトキシンサブユニットB（LTB）：
Figure 2019510488
；インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質M57-68：
Figure 2019510488
；破傷風毒素断片c：
Figure 2019510488
；リソソーム関連膜タンパク質（LAMP）：
Figure 2019510488
；およびHsp70ペプチド：
Figure 2019510488
を含む。
いくつかの態様において、投与および発現後の免疫応答を増大するために、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）またはウイルスベクターのカルボキシル末端（3'端）に、ポリペプチドアジュバントをコードする核酸配列を内包することが採用される。免疫応答の増強に有用な例示的な配列は、熱ショックタンパク質70、リソソーム関連膜タンパク質（LAMP）、破傷風毒素由来のユニバーサルヘルパーT細胞（Th）エピトープ、および大腸菌易熱性エンテロトキシンBサブユニットを含む（Facciabene, A. et al., 2007, Vaccine, 26: 47-58; および 2006, Hum Gene Ther., 17: 81-92）。
他の態様において、酵素切断部位などのプロセシング部位、例えばフーリン切断部位によって隔てられている、突然変異したまたは過剰発現したがん遺伝子、サイトカイン、ケモカイン、抗体、および公知の免疫原性TAAのエピトープをコードする核酸配列が、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）およびウイルスベクターに含まれる。突然変異したがん遺伝子は、自己免疫をトリガーする可能性のある自己遺伝子を最小化し得る。全てのこれらの遺伝子を、それらの間の酵素切断部位とだけタンデムで連結することによって、これらの遺伝子の全ての発現を、ベクター内の1つまたは複数のサブゲノムプロモーターから駆動することができる。非限定例として、本発明のポリヌクレオチドおよびウイルスベクターに含まれ得る、1つまたは複数のがん遺伝子またはその突然変異した形態の複数のエピトープをコードするポリヌクレオチド配列は、アンドロゲン受容体（Olson, B.M. et al., 2013, Cancer Immunol. Immunother., 62(3):585-596）、Her-2/neu（Parmiani, G. et al., 2002, J. Natl. Cancer Inst., 94(11):805-818）、P53（Ito, D. et al., 2007, Int. J. Cancer, 120(12):2618-2624）、EphA2（Tandon, M. et al., 2011, Expert Opin. Ther. Targets, 15(1):31-51）、K-Ras（Gjertsen, M.K. et al., 1997, Int. J. Cancer, 72(5):784-790）およびH-Ras（Fossum, B. et al., 1993, J. Immunol., 23:2687-2691）を含む。他の態様において、本発明のポリヌクレオチドおよびウイルスベクターに含まれ得る、1つまたは複数の免疫療法増強遺伝子の複数のエピトープをコードするポリヌクレオチド配列の非限定例は、サバイビン（Siegel, S.A. et al., 2003, Br. J. Haematol., 122:911-914; Yang, Z. et al., 2008, Mol. Immunol., 45:1674-1681）、WT1（Miwa, H. et al., 1992, Leukemia, 6:405; Oji, Y. et al., 1999, Japan. J. Cancer. Res., 90:194; Oka Y. et al., 2000, J. Immunol. 2000, 164(4):1873-80; Li Z. et al., 2008, Microbiol. Immunol., 52:551-558）、HTERT（Bright, R.K., et al., 2014, Human Vaccines & Immunotherapeutics, 10(11):3297-3305）、腫瘍タンパク質D52（Bright, R.K., et al., 2014, Ibid.）、IL-12（Tseng, J.C. et al., 2004, Cancer Res., 64:6684-6692; Tseng, J.C. et al., 2004, Nature Biotechnol., 22:70-77; Granot, T. et al., 2013, Mol. Ther., 22(1):112-122; Granot, T. et al., 2011, PLoS One, 6(6): e20598）、インターフェロン-ガンマ（Granot, T. et al., 2013, Mol. Ther., 22(1):112-122; Granot, T. et al., 2011, PLoS One, 6(6):e20598）およびカルレティキュリン（Wang, H.T. et al., 2012, Int. J. Cancer, 130:2892-2902）を含む。
複数（2つ以上）の腫瘍関連抗原エピトープをコードするシンドビスウイルスベクターによって誘発される免疫応答の調節
CD8+T細胞を活性化することならびに腫瘍抗原およびそのエピトープに対するそれらの応答性を誘発することに加えて、腫瘍関連抗原の複数のエピトープをコードするシンドビスウイルスベクターを用いた治療は、CD4+T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、好中球、および他の細胞を非限定的に含む追加の免疫（または非免疫）細胞、ならびに体液性免疫応答を活性化することができる。エピトープスプレッディングは、CD8+T細胞だけではなく、CD4+T細胞においても起こることができる（Granot, T., and D. Meruelo, 2012, Cancer Gene TheR., 19: 588-591; Granot, T. et al., 2011, PLoS One 6: e20598; Granot, T. et al., 2014, Mol Ther, 22:112-122）。リンパ節におけるT細胞刺激の最適な条件を作り出すために、本発明のある態様は、ある特定の免疫刺激サイトカインをコードする核酸配列（遺伝子）と併せて、（1つまたは複数の）腫瘍関連抗原の複数（例えば、2つ以上）のエピトープをコードする核酸配列を含有かつ送達するポリヌクレオチドおよびウイルスベクター、例えばシンドビスウイルス発現ベクターを包含する。そのような免疫刺激サイトカインは、インターロイキンIL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、およびIL-17を含むがこれらに限定されない。追加のサイトカインは、IL-18〜IL-36を含む。
また、CCL1〜CCL27および他のCCケモカイン；CXCL1〜CXCL13および他のCXCケモカイン；Cケモカイン；ならびにCX3Cケモカインを非限定的に含むケモカインをコードする核酸配列を、ポリヌクレオチドおよびウイルスベクター核酸配列に含めることができる。サイトカインまたはケモカイン受容体および可溶性受容体をコードする核酸配列を使用することもできる。本発明のポリヌクレオチドおよびウイルスベクター、例えばSV/TAAの核酸配列において使用するかつ組み込むことができる追加の免疫調節因子をコードする核酸配列は、非限定的に、TGF-βおよびTNFαを含む。上に挙げた（または代替的）サイトカインの異なる組み合わせを使用することもできる。免疫刺激分子をコードする核酸配列（遺伝子）を、追加のプロモーター（例えば、本明細書に記載されるとおりの複数のTAAエピトープをコードするシンドビスウイルスベクターに挿入された）から発現させることもできるし、共投与される別個のベクターに含めてもよいことが認識されるだろう。
薬学的組成物
本発明は、がんもしくは腫瘍を患っているかまたはがんもしくは腫瘍を発症するリスクのある対象を処置するための薬学的組成物または製剤を含む。ある態様において、薬学的組成物は、腫瘍関連抗原の複数（例えば、2つ以上）のエピトープ（各エピトープが、酵素切断部位、例えば、フーリン切断部位によって隔てられている）をコードするポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）、ならびに本明細書に記載されるとおりのコードされたエピトープのプロセシングおよび発現のための他の配列、および該ポリヌクレオチドに含まれ得る他のコード配列、例えば、免疫刺激分子コード配列と、薬学的に許容し得る担体、賦形剤、または希釈剤とを含む。ある態様において、薬学的組成物は、腫瘍関連抗原の複数（例えば、2つ以上）のエピトープ（各エピトープは、酵素切断部位、例えば、フーリン切断部位によって隔てられている）をコードするポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）、ならびに本明細書に記載されるとおりのコードされたエピトープのプロセシングおよび発現のための他の配列、および該ポリヌクレオチドに含まれ得る他のコード配列、例えば、免疫刺激分子コード配列を含有する、本明細書に記載されるとおりのウイルスベクターまたは粒子、例えば、シンドビスウイルスベクターまたは偽型ウイルスベクターと、薬学的に許容し得る担体、賦形剤、または希釈剤とを含む。薬学的組成物へと製剤化されるとき、本発明の治療用化合物または生成物を、薬学的に許容し得る担体、希釈剤、または賦形剤と混合することができる。
がんまたは腫瘍の処置のための、本明細書における作用物質の組み合わせを含む組成物の投与は、他の成分と組み合わされて、対象におけるがんを改善する、低減する、または安定化させるのに効果的である治療薬の濃度をもたらす、任意の好適な手段によるものであり得る。例えば、生理食塩水のような薬学的に許容し得る緩衝液中で製剤化された組成物は、全身に投与され得る。投与の経路は、例えば、作用物質の連続的で持続したレベルを患者において最適に提供する、例えば、注射による、皮下（s.c.）、静脈内（i.v.）、腹腔内（i.p.）、筋肉内（i.m.）、または皮内投与を含む。投与されるべき治療物質の量は、投与の様式、患者の年齢、健康状態および体重に依存して、かつ、がんまたは腫瘍の臨床症状に合わせて変動する。一般に、量は、がんまたは腫瘍の処置において採用される他のウイルスベクターに基づく作用物質で使用されている量の範囲にあるが、ある特定の状況下において、作用物質が高い特異性を示す場合には、より少ない量が必要となる。組成物は、当業者に公知の方法によって決定された場合に、免疫細胞（例えば、エフェクターT細胞；CD8+T細胞）レベル、特にTAAエピトープ特異的T細胞レベルを増加させるような治療効果を示すか、またはがん細胞増殖を減少する、投与量で投与される。
治療物質は、任意の好適な担体物質に任意の適切な量で含有されてよく、一般に、組成物の総重量の1〜95%（重量）の量で存在する。組成物は、作用物質、例えば本明細書に記載されるウイルスベクターが全身に送達されるように、非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、または腹腔内）投与経路に好適である剤形で提供されてよい。薬学的組成物は、慣用の薬学的実践に従って製剤化されてよい（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000 and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New Yorkを参照のこと）。
本発明に係る薬学的組成物は、実質的に投与後すぐにまたは投与後の任意の所定の時間もしくは期間に活性作用物質を放出するように製剤化されてよい。後者のタイプの組成物は、一般に、制御放出製剤として知られており、これは、（i）長時間にわたって体内で作用物質の濃度を実質的に一定に保つ製剤；（ii）所定のタイムラグ後に長時間にわたって体内で薬物の濃度を実質的に一定に保つ製剤；（iii）活性物質の血漿レベルの増減に伴う望ましくない副作用を同時に最小化しながら体内で相対的に一定の有効レベルを維持することによって所定の時間作用を持続する製剤（鋸歯状動力学パターン）；（iv）例えば、腫瘍に隣接するまたはそれと接触させる制御放出組成物の空間配置によって、作用を限局化する製剤；（v）例えば1または2週間毎に一回用量が投与されるような、便利な投薬を可能にする製剤；ならびに（vi）治療物質を特定の細胞タイプ（例えば、がん細胞または腫瘍細胞）に送達する担体または化学誘導体を使用してがんを標的とする製剤、を含む。いくつかの用途では、制御放出製剤は、投与された作用物質の血漿レベルを治療レベルで持続するための1日の頻回投薬の必要性をなくす。
問題の作用物質の代謝速度を放出速度が上回る制御放出を得るための方法は、限定されることを意味しない。例として、制御放出は、種々の製剤パラメーターおよび成分（例えば、種々のタイプの制御放出組成物およびコーティングを含む）の適切な選択によって得られる。したがって、治療物質は、適切な賦形剤と共に、投与時に作用物質を制御された様式で放出する薬学的組成物へと製剤化される。例には、単一または複数単位の錠剤またはカプセル組成物、油液剤、懸濁剤、乳剤、マイクロカプセル、マイクロスフェア、分子複合体、ナノ粒子、パッチ剤、およびリポソームが含まれる。
薬学的組成物は、慣用の無毒の薬学的に許容し得る担体および補助剤を含有する、剤形または製剤での（皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内などへの）注射、注入またはインプランテーションによるか、または好適な送達デバイスもしくはインプラントを介して、非経口的に投与されてよい。そのような組成物の製剤および調製物は、医薬製剤の当業者に周知であり、例えば、上記のRemington: The Science and Practice of Pharmacyに見いだすことができる。
非経口送達および投与のための組成物は、単位剤形（例えば、単一用量アンプル）で提供されても、複数の用量を含有しかつ好適な防腐剤が加えられ得るバイアルで提供されてもよい（以下参照）。組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、注入デバイス、またはインプランテーション用の送達デバイスの形態であってもよく、使用前に水または別の好適なビヒクルで再構成される乾燥粉剤として提示されてもよい。組成物は、活性作用物質（例えば、本明細書に記載されるポリヌクレオチド、ウイルスベクターまたは粒子）とは別に、好適な非経口的に許容し得る担体および／または賦形剤を含み得る。制御放出のために、活性治療物質をマイクロスフェア、マイクロカプセル、ナノ粒子、リポソームなどに組み込んでよい。さらに、組成物は、懸濁剤、可溶化剤、安定化剤、pH調整剤、浸透圧調整剤、および／または分散剤を含み得る。
いくつかの態様において、活性治療薬（すなわち、本明細書に記載されるポリヌクレオチド、ウイルスベクターまたは粒子）を含む組成物は、静脈内送達のために製剤化される。上に述べたとおり、本発明に係る薬学的組成物は、滅菌注射に好適な形態であり得る。そのような組成物を調製するために、好適な治療薬は、非経口的に許容し得る液体ビヒクルに溶解または懸濁される。採用され得る許容し得るビヒクルおよび溶媒は、水、適切な量の塩酸もしくは水酸化ナトリウムまたは好適な緩衝液の添加によって好適なpHに調整された水、1,3-ブタンジオール、リンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液およびデキストロース溶液を含む。水性製剤はまた、1つまたは複数の防腐剤（例えば、p-ヒドロキシ安息香酸メチル、エチルまたはn-プロピル）を含有し得る。作用物質の1つが水に難溶性であるかまたはわずかに可溶性である場合、溶解増強剤または可溶化剤を加えることができるか、または、溶媒が10〜60%（w/w）のプロピレングリコールなどを含み得る。
送達の方法
対象、例えば、がんを有する患者への、上記のがんの1つまたは複数を処置するための本発明のポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）、ウイルスベクター、または薬学的組成物の投与は、患者内でエピトープスプレッディングを引き起こし得る。先行のがんワクチン戦略の欠点の1つは、処置によって誘導された選択圧と共に、ワクチンにおいて使用された腫瘍関連抗原の喪失または改変による腫瘍回避を導き得る、腫瘍細胞集団の不均一性およびゲノム不安定性であった。この状況において、本発明のある有利な局面は、エピトープスプレッディング、すなわち、がん細胞または腫瘍細胞に内在するががんワクチンを用いた治療の間にベクターによって能動的に送達されない腫瘍関連抗原のエピトープに対して向けられる抗腫瘍T細胞応答の拡大を誘導する潜在性である。臨床試験では、エピトープスプレッディングの分析がますます取り入れられており、いくつかの場合では、エピトープスプレッディングの誘導と治療有効性との間の正の相関が示されている。
ある態様において、作用物質によってコードされる腫瘍関連抗原の複数のエピトープに対するT細胞応答を誘発するのに有用である、本発明のポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）、ウイルスベクター、ウイルス粒子、または薬学的組成物は、例えば細胞（特に、がん細胞または腫瘍細胞）に、該ポリヌクレオチド、ウイルスベクター、粒子または組成物が、コードされた配列を発現するのに機能的かつ活性であるような任意の様式で送達されてよい。例として、複数の腫瘍関連抗原エピトープのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、細胞におけるエピトープの異種発現のために細胞に送達されてよい。したがって、本発明は、細胞とポリヌクレオチド、ウイルスベクター、もしくはウイルス粒子を含む組成物とを接触させることによって、またはポリヌクレオチド、ウイルスベクター、もしくはウイルス粒子を細胞内で異種発現させることによって、細胞に送達される、ポリヌクレオチド、ウイルスベクター、またはウイルス粒子を特徴とする。
ポリヌクレオチド治療
がんまたは腫瘍発生を処置するための1つの治療的アプローチは、本発明の腫瘍関連抗原エピトープ、例えば1つまたは複数の腫瘍関連抗原の2つ以上のエピトープをコードするポリヌクレオチドを使用したポリヌクレオチド治療である。関連する細胞におけるそのようなポリヌクレオチドまたは核酸分子の発現は、免疫応答、例えば細胞傷害性T細胞応答を刺激し、細胞の生存を低減し、かつ／または細胞死を増加させると期待される。そのような核酸分子を、がんまたは腫瘍を有する対象の細胞に送達することができる。核酸分子は、対象の細胞に、コードされた生成物の治療有効レベルを産生できるように核酸分子が取り込まれることができる形態で送達されるべきである。
ウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）ベクターの形質導入を、とりわけそれらの高効率の感染ならびに安定な組み込みおよび発現のために、コードされたタンパク質およびペプチド生成物を細胞に送達するために使用することができる（例えば、Cayouette et al., Human Gene Therapy, 8:423-430, 1997; Kido et al., Current Eye Research, 15:833-844, 1996; Bloomer et al., Journal of Virology, 71:6641-6649, 1997; Naldini et al., Science, 272:263-267, 1996; and Miyoshi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94:10319, 1997を参照のこと）。例えば、1つまたは複数の腫瘍関連抗原の複数のエピトープをコードするポリヌクレオチドを、本明細書に記載されるとおりのベクター、例えば、シンドビスウイルスベクターまたは偽型ウイルスベクターにクローニングすることができ、その内因性プロモーターから、レトロウイルスの長い末端反復から、または関心対象の標的細胞タイプに特異的なプロモーターから、発現を駆動することができる。使用することができる他のウイルスベクターは、例えば、ワクシニアウイルス、ウシパピローマウイルス、またはヘルペスウイルスを含む（例えば、Miller, Human Gene Therapy, 15-14, 1990; Friedman, Science, 244:1275-1281, 1989; Eglitis et al., BioTechniques, 6:608-614, 1988; Tolstoshev et al., Current Opinion in Biotechnology, 1:55-61, 1990; Sharp, The Lancet, 337:1277-1278, 1991; Cornetta et al., Nucleic Acid Research and Molecular Biology, 36:311-322, 1987; Anderson, Science, 226:401-409, 1984; Moen, Blood Cells, 17:407-416, 1991; Miller et al., Biotechnology, 7:980-990, 1989; Le Gal La Salle et al., Science, 259:988-990, 1993; および Johnson, Chest, 107:77S-83S, 1995の、ベクターを参照のこと）。レトロウイルスベクターは、十分に開発されており、例えば、Rosenberg et al., NEJM, 323:370, 1990; Anderson et al.、および米国特許第5,399,346号に記載のとおり使用されている。いくつかの態様において、複数の腫瘍関連抗原エピトープをコードするポリヌクレオチドまたはミニ遺伝子を含有するウイルスベクターは全身に投与される。
当業者に認識されるように、T細胞エピトープ免疫応答の誘導を必要とする対象の細胞への治療用ポリペプチドの導入に非ウイルスアプローチを採用して、がんもしくは腫瘍の成長を阻害するかまたはがん細胞もしくは腫瘍細胞死を誘導することもできる。例えば、核酸を、リポフェクション（Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413, 1987; Ono et al., Neuroscience Letters, 17:259, 1990; Brigham et al., Am. J. Med. Sci., 298:278, 1989; Staubinger et al., Methods in Enzymology, 101:512, 1983）、アシアロオロソムコイド-ポリリシンコンジュゲーション（Wu et al., Journal of Biological Chemistry, 263:14621, 1988; Wu et al., Journal of Biological Chemistry, 264:16985, 1989）の存在下で、または外科的条件下でのマイクロインジェクション（Wolff et al., Science, 247:1465, 1990）によって投与することによって、核酸分子を細胞に導入することができる。加えて、核酸を、リポソームおよびプロタミンと組み合わせて投与することができる。
また、インビトロトランスフェクション法を使用して遺伝子導入を達成することもできる。そのような方法は、リン酸カルシウム、DEAEデキストラン、エレクトロポレーション、およびプロトプラスト融合の使用を含む。リポソームもまた、細胞へのDNAの送達に潜在的に有益であることができる。
ポリヌクレオチド治療法において使用するためのcDNA発現を、任意の好適なプロモーター（例えば、シンドビスウイルスプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）、サルウイルス40（SV40）、またはメタロチオネインプロモーター）から指令して、任意の適切な哺乳動物の調節エレメントによって調節することができる。例えば、所望であれば、特定の細胞タイプにおいて遺伝子発現を優先的に指令すると知られているエンハンサーを使用して、核酸の発現を指令することができる。使用されるエンハンサーは、非限定的に、組織または細胞特異的エンハンサーとして特徴付けられるものを含むことができる。あるいは、上記のプロモーターまたは調節エレメントのいずれかを含む、同種調節配列によって、または、所望であれば、異種供給源に由来する調節配列によって、調節を媒介することができる。
投与の方法および処置プロトコル
それを必要としている対象（例えば、がんもしくは腫瘍を有するか、またはそのような処置が必要であると特定された対象）に治療物質を投与する方法であって、本明細書に記載されるとおりのポリヌクレオチド、ウイルスベクター、もしくはウイルス粒子、または本明細書に記載される組成物の有効量が対象に投与されて治療効果を産生する、方法が提供される。本発明によれば、治療効果は、非限定的に、TAA関連エピトープをそれらの表面に発現するがん細胞および腫瘍細胞に対するエピトープ特異的免疫応答であって、例えば、任意でMHCクラスIまたはクラスII分子と会合した、腫瘍関連抗原の複数のエピトープをコードするポリヌクレオチドまたはウイルスベクター、例えばシンドビスウイルスベクターによってコードされる複数のエピトープによって活性化されたエフェクターT細胞（例えば、CD8+T細胞）による免疫応答を含む。そのような処置を必要とする対象を特定することは、対象または医療専門家の判断であることができ、かつ、主観的（例えば、見解）または客観的（例えば、試験または診断法によって測定可能）であることができる。
本発明の治療法（予防的な処置を含む）は、一般には、本明細書に記載される作用物質、例えばポリヌクレオチド、ウイルスベクター、ウイルス粒子、または前述した作用物質を含有する組成物の治療有効量の、哺乳動物をはじめとするそれを必要とする対象（例えば、動物、ヒト）、特にヒトへの投与を含む。そのような処置は、がんまたは腫瘍を患っている、それを有する、それに感受性である、またはそのリスクのある対象、特にヒトに、好適に投与される。「リスクのある」対象の決定は、診断検査または対象もしくは医療提供者の見解（例えば、遺伝子検査、酵素もしくはタンパク質マーカーまたはバイオマーカー、家族歴など）による任意の客観的または主観的な決定によってなされることができる。本明細書に記載されるポリヌクレオチドおよびウイルスベクター作用物質はまた、1つまたは複数の腫瘍関連抗原の複数のエピトープが関与し得る任意の他の疾患または障害の処置において使用されてもよい。
マウスを使用した前臨床研究において、1つまたは複数の腫瘍関連抗原の複数（例えば、2つ以上）のエピトープをコードするシンドビスウイルスベクター（SV/TAA）の治療有効量（約107のウイルス粒子）の単回腹腔内（i.p.）注射は、リンパ節への急速な免疫原性送達をもたらし、かつ、腫瘍に対して向けられる検出可能なCD8+媒介性免疫応答を誘発した（以下の実施例5）。当業者には、ヒト対象において最大応答を達成するのに他のレジメンが必要となり得ることが認識される。例えば、ヒト患者では、本発明のベクターの治療有効量は、約1週間〜数週間の期間にわたって約1〜約8回のi.p.注射で投与される、1回の処置当たり約6〜約12 Log10のベクター粒子/kgの広い範囲であることができ、数週間、数ヶ月、または数年、例えば、1年以上後に、1または複数の追加免疫注射を注射する可能性がある。
本発明のウイルスベクター、ポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）および薬学的組成物を、がんもしくは腫瘍を患っている患者を治療するために治療的に使用することも、ある特定のがんもしくは腫瘍のリスクのある患者にワクチン接種するために予防的に使用する（例えば、一般集団におけるがん用の予防ワクチン）こともできる。本発明のベクターの予防有効量は、レシピエントの体重1キログラム当たり約102 TU（形質導入単位）〜レシピエントの体重1キログラム当たり約106 TUの範囲であり得る。関連するがんのマウスモデルを使用して、投与量およびレジメンを最適化することができる。エフェクターおよびメモリー両方のCD8+T細胞を含む効果的で持続性の免疫応答を促進するために、最適な投与量および免疫間隔が確立される。初回のアルファウイルスワクチンに対するCD8+T細胞応答は急速に縮小し、メモリーT細胞の発生を可能にする。この縮小より前には、ウイルスベクターの追加の投与は、免疫応答を増加させない（Knudsen, M. L. et al., 2014, J Virol., 88:12438-12451）。アルファウイルスRNA増幅に対する強いI型インターフェロン（IFN）応答は、樹状細胞を活性化することによってメモリーT細胞の生成を刺激して、クロスプライミングを促進する（Fuertes, M. B. et al., J Exp Med, 208: 2005-2016）。
本発明の組成物を使用した典型的な処置レジメンは、SV/マルチTAAエピトープウイルスベクターを投与し、続いて、フローサイトメトリーを使用してリンパ球を1週間に数回モニタリングして、エフェクターCD8+T細胞（CD62L- CD127-）のピークおよび低下を決定することを含み得る。この時点で、ベクターの追加免疫を投与して、エフェクターメモリーT細胞（CD62L- CD127+）、セントラルメモリーT細胞（CD62L+ CD127+）および持続的な高いリコール能を有するT細胞（CD27+ CD43-）を増加させることができる。有効性は、陽性免疫応答および低い腫瘍再発によって決定される。
本発明は、免疫化および追加免疫に使用されるベクターに関して限定されない。DNAから起動されたアルファウイルスレプリコンによって誘導されたT細胞部分集団の分布を、異種追加免疫によって変化させることができる（Knudsen, M.L. et al., 2-14, J. Virology, 88:12438-12451）。例えば、ポックスウイルスベクター（改変ワクシニアアンカラ、すなわちMVA）を用いた追加免疫は、有効性を大きく増大することができるT細胞コンパートメントの拡大を強化することができる。この態様において、追加免疫投与に採用されるウイルスベクターは、1つまたは複数の腫瘍関連抗原の複数（例えば、2つ以上）のエピトープをコードする。任意の抗原送達系を使用して、本発明のベクターによって誘導される免疫応答を強化することができる。非限定例は、複製欠損アデノウイルス、鶏痘ウイルス、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、センダイウイルス、裸のDNA、プラスミドおよびペプチドを含む（Woodland, D.L., 2004, TRENDS in Immunology, Vol. 25(2):98-104）。
ベクター投与の例示的な経路は、非限定的に、例えば腹腔内、静脈内、皮下、定位的、筋肉内、鼻腔内、皮内、眼窩内、結節内および腫瘍内注射による、非経口投与を含む。他の投与様式は、経口、頭蓋内、眼内、眼窩内、耳内、直腸、膣内、坐薬、髄腔内、吸入、エアロゾルなどを含み得る。
ある特定の態様において、処置に使用されるベクターは、欠損シンドビスウイルスベクターであり、腫瘍は、がんまたは腫瘍、例えば卵巣がんであり、腫瘍関連抗原の2つ以上のコードされたエピトープは、p53、SP17、サバイビン、WT1、およびNY-ESO-1を含む。別の態様において、TAAは、NY-ESO-1、gp70、およびpbkである。別の態様において、TAAは、NY-ESO-1およびサバイビンを含む。
本発明のウイルスベクターが投与される患者は、当業者に周知であるとおり、補助的または追加の処置、例えば化学療法および／または放射線処置から恩恵を受け得る。特に、SV/TAAシンドビスウイルスベクターを、化学療法処置と組み合わせることができる。ある特定の場合では、SVおよび化学療法は相乗効果を与え（例えば、米国特許出願公開第2016/0008431号）、その結果として、処置効果および／または転帰の向上の可能性を提供する。好適な化学療法は、非限定的に、免疫系を刺激するか、または免疫系におけるサプレッサーエレメントを阻害するか、または腫瘍細胞に影響を及ぼしそれらをT細胞（または他の免疫細胞）細胞傷害性により感受性にする、化学療法処置を含む。例えば、免疫抑制細胞の活性を減弱し、それによって、SV/TAAウイルスベクターによる免疫刺激を増強するという理由から、本明細書に記載されるSV/TAAウイルスベクターを用いた処置および治療を容易にすることができるある特定の化学療法が存在する。加えて、化学療法は、T細胞媒介性の細胞傷害性に対する腫瘍細胞の感受性を増強し得る。
キット
本発明は、がんまたは腫瘍、特に1つまたは複数の腫瘍関連抗原の複数のエピトープを発現するがんまたは腫瘍の治療または予防のためのキットを提供する。一態様において、キットは、酵素切断部位によって隔てられている1つまたは複数の腫瘍関連抗原の2つ以上のエピトープをコードするポリヌクレオチドを含む、本明細書に記載されるとおりのポリヌクレオチド、ウイルスベクター、またはウイルス粒子の有効量を含有する治療用または予防用組成物を含む。ある態様において、ポリヌクレオチドは、アルファウイルスタンパク質またはその断片をコードする。ある態様において、アルファウイルスタンパク質またはその断片は、シンドビスウイルスタンパク質またはその断片である。ある態様において、エピトープおよび腫瘍関連抗原は、上記の表1〜28に提示されているものである。いくつかの態様において、キットは、治療用または予防用組成物を含有する滅菌容器を含む；そのような容器は、ボックス、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、小袋、ブリスターパック、または当技術分野において公知の他の好適な容器形態であることができる。容器は、プラスチック製、ガラス製、ラミネート紙製、金属箔製、または医薬を収容するのに好適な他の材料製であることができる。
所望であれば、本発明の1つまたは複数のTAAの複数のエピトープをコードするウイルスベクター作用物質を含む組成物が、がんまたは腫瘍を有するかまたはそれを発症するリスクのある対象へ作用物質を投与するための説明書と一緒に提供される。説明書は、一般には、がんまたは腫瘍の治療または予防のための組成物の使用についての情報を含む。他の態様において、説明書は、以下の少なくとも1つを含む：治療物質の説明；虚血もしくはその症状の治療もしくは予防のための投薬スケジュールおよび投与；注意事項；警告；適応症；禁忌；過剰投薬情報；有害反応；動物薬理学；臨床研究；ならびに／または参考文献。説明書は、容器（存在するとき）に直接印刷されても、容器に貼り付けられるラベルとして印刷されても、容器内にまたは付属して同梱される別個のシート、パンフレット、カード、またはフォルダーとして印刷されてもよい。
本発明の実施は、別段の指示がない限り、十分に当業者の範囲内である分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の慣用の技術を採用する。そのような技術は、“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, second edition（Sambrook, 1989); “Oligonucleotide Synthesis”(Gait, 1984); “Animal Cell Culture”(Freshney, 1987); “Methods in Enzymology” “Handbook of Experimental Immunology”(Weir, 1996); “Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells”(Miller and Calos, 1987); “Current Protocols in Molecular Biology”(Ausubel, 1987); “PCR: The Polymerase Chain Reaction”(Mullis, 1994); “Current Protocols in Immunology”(Coligan, 1991)のような文献に十分に説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチド、ウイルスベクターおよびウイルス粒子の生産に適用可能であり、そのようなものとして、本発明を作製および実施する上で考慮されてよい。特定の態様に特に有用な技術は、以下のセクションにおいて考察される。
以下の実施例は、本発明のアッセイ、スクリーニング、および治療の方法をどのように作りあげおよび使用するかの完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されるものであり、本発明者らが本発明と見なすものの範囲を限定することを意図するものではない。
実施例1-方法
ベクターの調製：組換えウイルスベクターの構築を、プラスミド精製、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、ポリメラーゼ連鎖反応およびDNA配列決定を非限定的に含む、分子生物学の分野の当業者に周知の標準的な技術を使用して実施した（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, EM. Ausubel et al. (Eds), John Wiley and Sons, Inc., NY, USA. (1998) and Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.), J. Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis (Eds), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA. (1989))。
LacZをコードするシンドビスウイルスベクター（SV/LacZ）を免疫原性SV/TAA作用物質として、ならびにSV/FlucおよびSV/GFPを対照ベクターとして使用する実験のために、ベクターを過去に記載のとおり生産した（Tseng J.C. et al, 2004, Nat. Biotechnol., 22:70-77）。簡単に述べると、レプリコン（SinRep5-LacZ、SinRep5-GFP、またはSinRep5-Fluc）またはDHBBヘルパーRNA（SinRep5-tBB）を担持するプラスミドを、XhoI（SinRep5-LacZ、SinRep5-GFP、およびSinRep5-tBBについて）またはPacI（SinRep5-Flucについて）で線状化した。mMessage mMachine RNA転写キット（Ambion, Austin, TX）を使用してインビトロ転写を実施した。次いで、ヘルパーRNAおよびレプリコンRNAをBHK細胞にエレクトロポレーションし、10% FBSを補充したα-MEM中37℃でインキュベートした。12時間後、培地を、CaCl2（100μg/ml）を補充したOPTI-MEM I（Invitrogen, Carlsbad, CA）に交換し、細胞を37℃でインキュベートした。24時間後、上清を収集し、遠心分離して細胞残屑を除去し、-80℃で凍結した。ベクター力価を、当技術分野において公知のとおり決定し（Tseng J.C., et al., 2002, J Natl Cancer Inst., 94:1790-1802）、これは全ての3つのベクター（SV/LacZ、SV/Fluc、およびSV/GFP）において類似していた。
細胞株および細胞培養：ベビーハムスター腎臓（BHK）細胞、CT26.WT細胞、およびLacZ発現CT26.CL25細胞を、American Type Culture Collection（ATCC）（Manassas, VA）から得た。BHK細胞を、10%ウシ胎児血清（FBS）（Atlanta Biologicals, Norcross, GA）を含む最小必須α-変法培地（α-MEM）（Mediatech, VA）中で維持した。CT26.WT細胞、CT26.CL25細胞を、10% FBSを補充した4.5g/Lグルコース（Mediatech）を含有するダルベッコ変法必須培地（DMEM）中で維持した。全ての基礎培地に100mg/mLのペニシリン-ストレプトマイシン（Mediatech） および0.5mg/mLのアンホテリシンB（Mediatech）を補充した。
ビリオン生産：シンドビスウイルスベクターを、米国特許第7,303,898号、第7,306,792号、および第8,093,021号に記載のとおり生産した。簡単に述べると、レプリコンpT7StuI-RまたはDHBBヘルパーRNA（SinRep5-tBB）を担持するプラスミドを、適切な制限酵素で線状化した。mMessage RNA転写キット（Ambion, TX）を使用し製造業者の説明書に従って、インビトロ転写を実施した。次いで、ヘルパーRNAおよびレプリコンRNAをBHK細胞にエレクトロポレーションし、10% FBSを補充したMEM中37℃でインキュベートした。12時間後、培地を、CaCl2（100g/mL）を補充したOPTIMEM I（Life Sciences, CA）に交換し、細胞を37℃でインキュベートした。24時間後、上清を収集し、遠心分離して細胞残屑を除去し、-80℃で凍結した。ベクターの力価を、当技術分野において実施されているとおりRT-qPCRを使用して決定した。
マウス、腫瘍接種および治療有効性：4〜8週齢の雌のBALB/cマウスをTaconic（Germantown, NY）から購入した。腹腔内（i.p.）腫瘍モデルについて、0.2mL PBS中の2.5×104または5×104のCT26.CL25細胞を各マウスに腹腔内注射した。肺腫瘍モデルについて、0.2ml PBS中の0.3×106のCT26.WT.FlucまたはCT26.CL25.Fluc細胞を各マウスに静脈内注射した。治療有効性を3つの方法：腫瘍体積（皮下腫瘍について、メカニカルキャリパーで測定した）、腫瘍発光、および生存でモニタリングした。IVISスペクトルイメージングシステム（Caliper Life Sciences, Inc., MA）を使用して非侵襲的生物発光イメージングを実施し、Living Image 3.0ソフトウェア（Caliper Life Sciences）を使用して腫瘍成長を定量した。動物の生存を毎日モニタリングし記録した。
フローサイトメトリー：フローサイトメトリーを使用して、臓器、腹膜または末梢血から抽出したリンパ球を分析した。細胞を、1×RBC溶解緩衝液（eBioscience）で処置して赤血球細胞を除去した。腹膜細胞を収集し、種々のAbで染色し、HBSS緩衝液（Mediatech）で2回洗浄し、そして、LSR II機器（BD Biosciences, San Jose, CA）を使用して分析した。FlowJo（Tree Star, San Carlos, CA）を使用してデータを分析した。
SV/Flucの生物発光イメージング：腫瘍を持つマウスおよび腫瘍を持たないマウスに、SV/Fluc（OPTI-MEM I 0.5mlの0.5ml中約107のプラーク形成単位）を腹腔内注射した。処置後、生物発光シグナルを、IVISによって表示の時点に検出した（Tseng, J.C. et al., 2004）。
実施例2-抗腫瘍免疫を誘導するための、複数のエピトープを発現するシンドビスウイルスベクターの構築
フーリン酵素切断部位によって隔てられている複数のT細胞認識エピトープをコードするポリヌクレオチド（DNA配列；ミニ遺伝子）を、標準的な分子生物学的方法を使用してGeneArt（登録商標）（Life Technologies Corp., Waltham MA）によって合成した。合成ポリヌクレオチドは、リボソーム結合部位、翻訳開始コドン、小胞体シグナル配列、続いてエピトープコード配列が点在するフーリン切断部位、終止コドンおよび制限酵素部位（ポリヌクレオチド配列がシンドビスレプリコンpT7StuI-RLacZ#202（WO 2015/035213 A2）のXbaI/ApaI制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入されてLacZ遺伝子に取って代わるのを可能にした）を含有した。シンドビスレプリコンは、XbaI部位から上流のウイルスサブゲノムプロモーター配列およびApaI部位の下流に位置するmRNAポリA配列を含有した。この合成されたDNA配列およびそのコードされたアミノ酸配列は、以下のとおりである:
DNA配列
Figure 2019510488
アミノ酸配列
Figure 2019510488
。
合成されたポリヌクレオチド配列をGeneArt pMXプラスミドに挿入し、DNAプラスミドとして提供した。プラスミドをNEB 5-アルファコンピテント大腸菌細胞（New England BioLabs）に形質転換した。クローンを増殖させて、プラスミドDNAを精製した。DNA配列決定（Macrogen USA）によってクローンを検証した。制限酵素XbaIおよびApaIを使用して、pMXプラスミドベクターからDNAポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）を切り出した。抜き出した後、ポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）をpT7StuI-RLacZ#202ベクターにクローニングした。模式的に、記載のとおりのミニ遺伝子を図1Aに図示し、正確な配列順序を図1Bに示す。
シンドビスウイルスポリペプチドは、フーリンによって自然にプロセシングされるので、シンドビスフーリン消化モチーフXRSKRX（SEQ ID NO: 5）（式中、Xは、疎水性残基である）をコードする核酸配列をポリヌクレオチドに組み込んで、腫瘍関連抗原のコードされたエピトープの適切なプロセシングを可能にした。また、フーリン-エピトープ-フーリン配列の5'隣接領域に、リボソーム結合部位、開始コドンおよびアルファウイルス小胞体（ER）シグナル配列もコードした。フーリン消化が起こるERへのマルチエピトープポリペプチド転移を容易にするERシグナル配列を含めた。ポリヌクレオチド（ミニ遺伝子）の3'端に終止コドンを含めた。合成されたポリヌクレオチド配列を高レベルの転写を駆動するウイルスサブゲノムプロモーターのすぐ下流のシンドビスウイルスベクター核酸にクローニングするために、制限酵素部位XbaIおよびApaIをそれぞれ、ポリヌクレオチドの5'端および3'端へと分子的に遺伝子操作した。
この実施例では、異なる腫瘍関連抗原の2つ以上のエピトープ、すなわち3つの異なるエピトープ、具体的には、本明細書に記載されるとおりのヒトNY-ESO-1（ヒト卵巣がんおよび他のヒトがんにおいて発現される腫瘍関連抗原）のエピトープ；gp70（内因性マウス白血病ウイルス抗原）のエピトープ；およびサバイビン（多くの腫瘍において高度に発現される抗アポトーシスタンパク質）のエピトープをシンドビスウイルスベクターに組み込んだ。3つのエピトープを表30に提示し、これらは、CT26腫瘍において高度に発現されるが、正常なマウス組織では低発現を有する。
（表３０）SV/MGに含まれるエピトープ
Figure 2019510488
インビボ抗腫瘍有効性の決定：上記のとおりの異なる腫瘍関連抗原（TAA）の複数（3つ）のエピトープをコードするシンドビスウイルスベクター(本明細書において「SV/MG」または「SV/MG-CT26」で表す）の抗腫瘍有効性を試験するために、CT26/NY-ESO-1細胞をBALB/cマウスに腹腔内注射したBalb/c CT26結腸がん腫瘍モデルを使用した。CT26は、ヒトNY-ESO-1 cDNAをトランスフェクトされたマウス結腸がん細胞株であり、ヒトNY-ESO-1およびそのエピトープを安定に発現し、American Type Culture Collection（ATCC, Manassas, VA）から入手可能である。細胞は、感受性マウスに注射されると、その動物において固形腫瘍を形成する。また、CT26細胞に、タンパク質、例えば、LacZ、ルシフェラーゼ、GFPをトランスフェクトして、動物研究における腫瘍の検出を助けることができる。例示的な投与レジメンを図2Aに示す。
腫瘍のイメージング：IVISシステムを使用して生物発光シグナルを定期的にモニタリングした。Living Imageソフトウェア（Xenogen Corp., Alameda, CA）を使用して、イメージングデータをグリッド化し、各ボックス領域で全生物発光シグナル（RLU）を統合して図2Bに示すデータを得た。野生型CT26細胞およびLacZ発現CT26細胞（CT26.CL25（LacZ）細胞）を、American Type Culture Collection（Manassas, VA）から得た。CT26.CL.25（LacZ）細胞は、数種の腫瘍関連抗原を発現する（Castle, J.C. et al., 2014, BMC Genomics, 15:190）。NY-ESO-1エピトープを発現するCT26.CL25細胞は、Gnjatic, S. et al., 2006, Adv Cancer Res, 95:1-30に記載のとおりである。非侵襲的生物発光イメージングのためのホタルルシフェラーゼ（Fluc）発現CT26細胞（CT26.WT.FlucおよびCT26.CL25.Fluc）を、Fluc発現プラスミドのCT26.WTおよびCT26.CL25細胞への安定なトランスフェクションによって生成した。SV40プロモーター配列をpGL4.20ベクター（Promega, WI）のマルチクローニング部位に導入することによってFluc発現プラスミドを構築した（Granot, T. et al., 2014, Mol. Ther., 22:112-122）。
図2Bに示すとおり、マルチTAAエピトープシンドビスウイルスベクター（SV/MG）で処置された動物におけるCT26/NY-ESO-1腫瘍細胞の増殖は、陰性対照および無関係の対照シンドビスウイルスベクターで処置された動物と比較して、長期間にわたり、例えば、投与後27日目まで著しく低かった。図2Bに示す対照は、シンドビスウイルスベクターを与えられなかったマウス（対照）、無関係の腫瘍関連抗原であるSV/LacZ（細菌酵素ベータ-ガラクトシダーゼ（LacZ）をコードするシンドビスウイルスベクター）；および陽性対照シンドビスウイルスベクターSV/NY-ESO-1（NY-ESO-1腫瘍関連抗原をコードし、かつ、腫瘍を内在する動物におけるCT26/NY-ESO-1腫瘍細胞の増殖を効果的に低減した）を受けたマウスであった。
関連実施例では、腫瘍関連抗原の複数のエピトープをコードする別のシンドビスウイルスベクター（例えば、SV/MGベクターと呼ばれる）を、CT26腫瘍マウスモデルでの試験について上記した同じ技術を使用して調製することができる。CT26マウスモデルにおいて腫瘍を処置するために作製されたシンドビスウイルスベクターは、腫瘍関連抗原NY-ESO-1のエピトープ、ウイルス抗原gp70のエピトープ、および腫瘍関連抗原Pbk（T細胞起源のプロテインキナーゼのTOPKとも呼ばれる）由来のエピトープをコードする。有利なことに、これらのエピトープは、CT26.CL25腫瘍細胞において高度に発現されるが、マウス組織では低い発現を有する。SV/MGベクターに含まれるエピトープ配列を以下の表31に示す。ある態様において、HIV gp120またはgp41のエピトープ配列およびヒトpbkまたはヒトpbkオルソログ由来のエピトープ配列をSVベクターに含めてよい。
（表３１）シンドビスウイルスマルチTAAエピトープベクターに使用されるエピトープ
Figure 2019510488
シンドビスウイルスベクター発現のための、腫瘍関連抗原NY-ESO-1、gp70およびpbkの複数のエピトープ配列を含むポリヌクレオチドを、以下に示すとおり、二本鎖オリゴマーおよびDNAプライマー（GeneLink Inc.）を合成することによって調製した。通常のPCR技術を使用して、相同の領域を共有するようにミスプライミングによって修飾された末端を有する2つの断片を生成した。これらの2つの断片が混合され、変性され、再アニーリングされると、断片の上鎖の3'端が断片の下鎖の3'端上にアニーリングされ、この重複が伸長されて組換え生成物を形成した。全てのエピトープ断片が組み込まれるまでこのプロセスを反復した。
A. オリゴマー
Figure 2019510488
RSKR=フーリン配列
B. プライマー
Figure 2019510488
PCRおよびオーバーハング伸長によるスプライシング（SOE: splicing by overhang extension）PCR反応を、サーマルサイクラー内にて、各々、94℃で1分、50℃で2分、および72℃で3分からなる25サイクルで行った。dNTP（200μM）、フォワードプライマーおよびリバースプライマー（0.5μM/各）ならびに1μ Taq-DNAポリメラーゼを最終体積20μlで含有する反応緩衝液を用いて、Taq-PCR反応を実施した。PCR生成物をアガロースゲル中での電気泳動によって分析し、DNAバンドをゲルから切り出して、ゲル抽出キット（Zymo Research）で精製した。完成したマルチエピトープ断片を、pT7StuI-R ΔLacZ#202プラスミドベクターのNaeI部位に平滑末端ライゲーションし、大腸菌に形質転換し、精製および配列決定した。
実施例3-腫瘍関連抗原の複数のエピトープをコードするシンドビスウイルスベクターは、ポリエピトープmRNAを産生する
上記の実施例2に記載のとおりの腫瘍関連抗原、すなわち、NY-ESO-1、gp70およびサバイビンの複数のエピトープをコードするシンドビスウイルスベクター（SV/MG-CT26）が正確な複数のエピトープmRNAを産生したかどうかを決定する実験を実行した。その実験のために、本明細書において「SV/MG-CT.26」と呼ばれる複数のエピトープをコードするシンドビスウイルスベクターの10倍段階希釈物（100〜10-11）を使用して、2×104のベビーハムスター腎臓細胞に感染させた。一晩インキュベーションした後、遠心分離によって細胞を収集し、そして、Qiagen kit（Qiagen, Hilden, Germany）を使用し製造業者の説明書に従ってRNAを単離した。RNAを、ナノドロップ分光光度計を使用して定量した。
ThermoScript（Life Technologies, CA）を使用し製造業者の説明書に従って、各試料1マイクログラム（1μg）を逆転写した。cDNA5_Rリバースプライマー
Figure 2019510488
を50μMの濃度で使用して、RNAをcDNAへと転写した。全cDNA反応物30μlのうち5μlを使用して、定量PCR（qPCR）を実施した。サイバーグリーンマスター（Syber green master）反応ミックスを製造業者の説明書に従って使用した（BioRad, CA）。ウイルスベクターが作製されるpT7StuI-R-MG_CT26プラスミドDNAの10倍希釈物を使用して、標準曲線を作成した。qPCRを実施するために、フォワードプライマーは、シンドビス位置7692：
Figure 2019510488
であり、リバースプライマーは、cDNA5_R位置7990：
Figure 2019510488
であった。使用したプライマー濃度は10μMであった。MyiQ cycler（BioRad, CA）を使用してqPCRを実施した。希釈係数および産生された転写産物のピコグラム（pg）を以下の表に提示する。
（表３２）
Figure 2019510488
図3は、アガロースゲル電気泳動に供された染色qPCR DNA生成物のUV画像を表す。qPCRからの染色されたDNA試料のUV画像において、レーンは以下のとおり特定される：レーン（-）：未感染BHK由来のcDNA；レーン（+）：pSV/MGプラスミド由来のRNA/cDNA；レーンM、100塩基対ラダーマーカー；レーン（-4）、レーン（-3）、レーン（-2）、レーン（-1）およびレーン（0）は、それぞれ、既定の希釈でSV/MG-CT.26を感染させたベビーハムスター腎臓（BHK）細胞由来のRNAのそれぞれ、10-4、10-3、10-2、10-1、および100希釈でのqPCR生成物を示す。表32に提示するとおりのqPCR実験からの結果は、腫瘍関連抗原NY-ESO-1、gp70およびサバイビンの複数のエピトープをコードするポリヌクレオチドがBHK細胞において転写されたことを示す。アガロースゲル電気泳動は、qPCR転写産物が204塩基対（bp）の予想されたサイズであることを示す（図3）。
実施例4-SV/マルチエピトープベクターを用いた前臨床予防的および治療的処置
上記の実施例2に記載のおよび図2Aに示すとおりの腫瘍関連抗原、特にNY-ESO-1がん抗原の複数のエピトープをコードするシンドビスウイルスベクターを投与することによるCT26/NY-ESO-1腫瘍細胞の予防的、治療的および組み合わせ処置の試験に、表33に提示される処置プロトコルを使用した。腫瘍細胞の接種の前の、複数の腫瘍関連抗原由来の、すなわち、SV/NY-ESO-1-gp70-サバイビン由来のエピトープを発現するシンドビスウイルスベクター（例えば、シンドビスウイルスベクターワクチン）を用いた動物の予防的処置の効果を決定するように、プロトコルを設計した。また、2つの時間間隔で投与された追加の追加免疫接種の効果を決定するようにプロトコルを設計した；腫瘍接種後のみのベクター療法の効果；および組み合わせたワクチンおよび治療用ベクター処置の効果。
（表３３）SV/マルチエピトープベクターを使用した処置プロトコル
Figure 2019510488
実施例5-シンドビスウイルス-マルチエピトープベクターを用いた臨床処置
例えば、NY-ESO-1、CEAまたはCA-125の2つ以上を含む卵巣がん腫瘍関連抗原（SV/マルチエピトープベクター）の複数のエピトープをコードするシンドビスウイルスベクター（Schwab, C.L. et al., 2014, Immunotherapy, 6:1279-1293）は、卵巣がんを処置する際に使用するのに有利であろう。腫瘍減量手術を受けている患者由来の腫瘍のスクリーニングを使用して、腫瘍関連抗原の複数のエピトープをコードするシンドビスウイルスベクターを用いた処置が、例えば、下記の実施例6に記載のとおり、患者のがん細胞または腫瘍細胞上および患者の特異的抗原提示HLAハプロタイプ上のTAAの存在に基づいて有益であるかどうかを決定することができる。1つまたは複数の腫瘍関連抗原の複数のエピトープをコードするシンドビスウイルスベクターの投与に続いて、患者の免疫応答を調べて処置レジメンをガイドするために、選択された患者の体液試料、例えば、血液、血清、または血漿を得て血液リンパ球をモニタリングすることができる。例えば、患者の血液を、エフェクターCD8+T細胞の存在について経時的に分析し、エフェクター細胞が減少してメモリー（CD27+CD43-CD8+）T細胞が現れるかどうかを決定することができる。当技術分野における通常の技術、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学、染色（例えば、免疫蛍光染色）は、適切なT細胞の存在について患者の血液試料を分析するのに好適である。メモリー細胞応答が検出されたら、腫瘍関連抗原エピトープをコードするシンドビスウイルスベクターの第二の投与を施して、患者の免疫応答を強化することができる。
例示的な腫瘍関連抗原（TAA）LacZを発現するSVベクターが、CT26腫瘍マウスモデルにおいて効果的であり、かつ、LacZ発現CT26腫瘍を有するマウスの生存を維持したこと（図4A）、さらには腫瘍モデルに対するCD8+T細胞応答の多様化を誘導したこと（図4B）が、細菌のβ-ガラクトシダーゼ（LacZ）酵素をコードするシンドビスウイルスベクター（SV/LacZ）、および緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードする比較対照シンドビスウイルスベクター（SV/GFP）を使用した本発明者らの研究によって実証された。図4Aは、上記の異なるシンドビスウイルスベクターで処置されたマウスの生存プロットを示す。これらの研究のために、CT26腫瘍保有マウスを、腫瘍接種の4日後に、SV/LacZベクター、対照SV/GFPベクター、または培地（モック）のいずれかで処置した。Optimem（Mediatech, VA）0.5ml中の107のウイルス粒子の腹腔内接種をマウスに投与した。SV/LacZベクターだけが、完全な腫瘍寛解を少なくとも60日間誘導したことが見いだされた。図4Bは、シンドビスベクターSV/LacZで処置されたマウスにおける特異的T細胞を同定するための感知手段として、四量体、すなわち標識四量体MHC分子（Altman, J.D. et al., 1996, Science, 274(5284）:94-96）の使用を包含した。LacZをコードするシンドビスベクターを用いた処置後に、SV/LacZ処置マウス由来の脾臓細胞は、LacZおよびgp70（内因性CT26腫瘍関連抗原）の両方に特異的なCD8+T細胞を含有することが見いだされた。このように、マウスに投与されたSV/LacZベクターによって産生されるものとは異なる抗原に対して向けられるエフェクターT細胞の産生は、SV/LacZで処置された動物においてエピトープスプレッディングが起こったことを示した。図4Cは、SV/LacZベクターまたはナイーブ対照を用いた処置の14日後に撮像した代表的なマウスの写真を表し、その中で、腫瘍（CT26結腸腫瘍）が、ナイーブマウス（すなわち、SV/LacZで処置されていないもの）において成長したが、LacZ抗原を発現するSV/LacZベクターで処置されたマウス（SV/LacZ生存体マウス）では成長しなかったことが見いだされた。
図5Bに提示する結果は、SV/LacZ誘導エピトープスプレッディングがLacZ発現の喪失に対抗することに成功したことを実証する。CT26腫瘍マウスモデルにおいてSV/LacZベクターをマウスに投与することによって生じたそのようなSV/LacZ依存性エピトープスプレッディングは、SV/LacZで処置されたマウスにおける腫瘍細胞の増殖の低減によって証明されるとおり、SV/LacZシンドビスウイルスベクターで処置されたマウスにおける腫瘍の成長の完全な抑制、およびそれらの生存に有意に寄与した（図4C）。これらの結果は、βガラクトシダーゼ（LacZ）を担持するSVベクターがLacZ発現CT26腫瘍担持マウスにおいて顕著な治療効果を有したことを裏付ける。
図5Aおよび5Bは、腫瘍関連抗原、すなわち、LacZポリペプチドに由来する少なくとも1つのエピトープ、およびウイルス送達のイメージングのためのホタルルシフェラーゼを発現するシンドビスウイルスベクター（SV/TAA）を使用したインビボ処置（免疫療法）の結果を評価するために使用したイメージングおよびフローサイトメトリーの組み合わせを示す。図5Aは、代表的なインビボイメージングの結果を示し、これを使用して、マウスにSV/TAAベクターを注射した後の、本明細書に記載されるとおりのシンドビスウイルスベクターによってコードされるルシフェラーゼ腫瘍関連抗原の発現の部位をマウスにおいて非侵襲的かつ縦方向に決定した。SV/TAAベクター接種の3時間後、マウスを撮像した。24時間の時点で、縦隔および鼠径リンパ節を摘出し、T細胞を単離して、T細胞活性化マーカーCD69の存在について評価した。鼠径リンパ節（ILN）における対照のT細胞活性化マーカーCD69の発現レベルと比較して（図5Aおよび5B）、縦隔リンパ節（MLN）は、ルシフェラーゼ抗原の送達の部位として特定され（図5A）、また、24時間後の強力なCD8+T細胞活性化の部位であることも見いだされた（図5B）。
図6A〜6Dは、皮下LacZ+CT26腫瘍を有するマウスにおける相対腫瘍成長対上記のとおりのLacZポリペプチドをコードするシンドビスウイルスベクター（例えば、SV/LacZ）を用いた処置後の日数のグラフを表す。対照またはベクターで処置された腫瘍担持マウスにおいて、以下のとおり抗CD8抗体および抗CD4抗体を使用してCD8+およびCD4+T細胞を枯渇させた実験から、グラフに提示する結果を得た：SV/LacZウイルスベクターまたはモック対照を用いた最初の処置の1日前に開始して、PBS 0.2ml中の各種抗体0.4mgを各マウスに注射し、次いで、抗体をその後2〜3日毎に2週間注射した。モック対照マウスにはPBSを注射した。LacZ+CT26腫瘍保有マウスを、SV/LacZウイルスベクター（シンドビス/LacZ）またはPBS（モック）のいずれかで処置した。キャピラリー測定によって腫瘍成長を決定した。図6Aは、モックで処置されたまたはSV/LacZベクターで処置された、対照の腫瘍担持マウスを使用した結果を示す。図6Bは、モックで処置されたまたはSV/LacZベクターで処置された、CD4+T細胞が枯渇した腫瘍担持マウスを使用した結果を示す。図6Cは、モックで処置されたまたはSV/LacZベクターで処置された、CD8+T細胞が枯渇した腫瘍担持マウスを使用した結果を示す。図6Dは、モックで処置されたまたはSV/LacZベクターで処置された、CD4+T細胞およびCD8+T細胞の両方が枯渇した腫瘍担持マウスを使用した結果を示す。
図6B〜6Dに描写する結果は、皮下腫瘍の成長の減少に対するSV/LacZベクターの治療効果が、T細胞の正常な完全体を有する対照マウスにおいて観察された一方で、T細胞枯渇マウスでは治療効果は観察されなかったことを実証する。本発明に従うと、1つまたは複数の腫瘍関連抗原の少なくとも1つ、好ましくは2つ以上のエピトープをコードするシンドビスウイルスベクター、すなわち、SV/TAAウイルスベクターを用いた処置から得られる治療的恩恵は、必ずしも腫瘍細胞を直接標的とすることを必要としない。本明細書における実施例によって支持されるとおり、SV/TAA治療は、注射部位から流出（drain）したリンパ節への、特に、図5Aに実証されるとおり、SV/TAAウイルスベクターの腹腔内注射の場合は縦隔リンパ節（MLN）への、腫瘍関連抗原の一過性の早期の送達に関与した。SV/TAAウイルスベクターを用いた処置はまた、強力なTAA特異的CD8+T細胞応答を誘導し、これは、その後、同種TAAを発現する腫瘍細胞に対して再度向けられた。さらに、SV/TAA治療は、エピトープスプレッディングを導き、TAAの喪失または改変による腫瘍回避の問題の可能な解決策を提供し、SV/TAA治療は、最終的に、腫瘍保有マウスの長期生存、複数のTAAに対する長続きするメモリーCD8+T細胞の生成を導いた。図6A〜6Dは、SV/LacZウイルスベクターの投与後の腫瘍減少がT細胞枯渇マウスでは観察されなかったので、少なくとも1つ、好ましくは2つ以上の腫瘍関連抗原エピトープをコードするシンドビスウイルスベクターを用いた処置のインビボ治療効果がT細胞依存性である証拠を提供する（図6B〜6D）。
複数の腫瘍関連エピトープをコードするSVベクターを利用したインビボ実験からの結果は、SVが、複数のTAAエピトープの免疫原性送達のための効果的な治療プラットフォームを提供することを裏付ける。さらに、SV/TAAから得られる治療的恩恵は、腫瘍細胞それ自体がベクターによって直接標的とされなくても、腫瘍細胞殺傷をもたらす抗腫瘍免疫応答を生じた。SV/TAA治療は、注射部位から流出したリンパ節への、特に、腹腔内SV注射の場合はMLNへの、TAAエピトープの一過性の早期の送達に関与する。加えて、SV/TAA治療は、強力なTAA特異的CD8+T細胞応答を誘導し、これは、その後、同種TAAを発現する腫瘍細胞に対して再度向けられて、エピトープスプレッディングを導き、その結果として、TAAの喪失または改変による腫瘍回避の問題の可能な解決策を提供する。本明細書における実験結果によって示されるとおり、SV/TAA治療は、最終的に、腫瘍保有マウスの長期生存、複数のTAAに対する長続きするメモリーCD8+T細胞の生成を導く。
実施例6-シンドビスウイルスベクターにおいて使用するための腫瘍関連抗原エピトープの予測
本発明に係るシンドビスウイルスベクターへ組み込むための1つまたは複数の腫瘍関連抗原の複数のエピトープアミノ酸配列を、Immune Epitope Database（www.IEDB.org）を使用して分析して、例えば、BALB/c H2dクラスI MHCへのエピトープ結合をランク付けすることができる。
この実施例は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドおよびウイルスベクターによってコードされかつ発現される複数のエピトープの選択において使用するための異なるエピトープ予測アルゴリズムを提供する。腫瘍関連抗原NY-ESO-1のアミノ酸配列を、3つの予測プログラムによって分析した。すなわち、BIMAS：BioInformatics and Molecular Analysis Section（HLA対立遺伝子からの予測解離定数によってペプチドをランク付けする）；IEDB：Immune Epitope Database（IEDB.org）；および下記のとおりのMHC分子へのペプチド結合の予測のためのRankpep。
最適なT細胞応答を生じるエピトープを決定するために分析されたNY-ESO-1配列を以下に提示する。
NY-ESO-1配列>gi|4503119|ref|NP_001318.1|がん/精巣抗原1[ホモ・サピエンス]
Figure 2019510488
エピトープをスクリーニングするために、HLA-A0201（共通ヒト対立遺伝子）を使用した。
BIMAS：BioInformatics and Molecular Analysis Section（BIMAS）、米国国立衛生研究所情報技術センター（Center for Information Technology, National Institutes of Health）(http://www-bimas.cit.nih.gov）。このウェブサイトは、使用者が、HLAクラスI分子のペプチド結合モチーフを含有する8mer、9mer、または10merのペプチドを位置付けおよびランク付けすることを可能にする。ランク付けは、Kenneth Parker博士による文献、ボストン小児病院（Boston’s Children’s Hospital）、ハーバード大学医学大学院（Harvard Medical School）、およびメリーランド州(Maryland)ベセスダ(Bethesda)の米国国立衛生研究所（NIH: National Institutes of Health）にある米国国立アレルギー・感染症研究所（NIAID: National Institute of Allergy and Infectious Diseases）の文献から推定されるアミノ酸／位置係数表を採用する。ウェブサイトは、Parker博士と共同して、米国国立衛生研究所のBIMAS、計算バイオサイエンス工学研究所（CBEL: Computational Bioscience and Engineering Laboratory）、コンピュータ研究・技術（CIT: Computer Research & Technology）課のRonald Taylorによって作成された。BISMASを介して実行することができるHLAペプチドモチーフ研究に関する情報および背景は、（https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/hla_motif_search_info.html）を介して入手可能である。BISMASは、HLAペプチド結合予測、およびHLA対立遺伝子からの予測解離定数によってペプチドをランク付けするアルゴリズムを提供する。HLAペプチド結合予測は、HLAクラス1分子に対する解離の予測半減時間に基づいて潜在的な8〜10merペプチドをランク付けする。ペプチド／MHCクラスIペプチド結合モチーフの分析およびHLA結合ペプチドのランク付けについての参考文献は、例えば、Maier, R. et al., 1994, Immunogenetics, 40:306-308; Raghavan, et al., 1996, Protein Science, 5:2080-2088; Parker, K.C. et al., 1994, J. Immunol., 152:163-175; および Rammensee, H.G. et al., 1999, Immunogenetics, 50:213-219を含む。ペプチド配列およびMHC特異性の分析に基づいたエピトープ配列に関する情報を得るための別のデータベースおよびコンピュータソフトウェアソース（H.G. Rammensee）は、SYFPEITHI（BMI Biomedical Informatics, SYFPEITHI@BMI-Heidelberg.com）である。
表34は、HLAペプチドモチーフのサーチ結果、およびBIMASを介して取得可能な関連したユーザーパラメーターおよびスコアリング情報を示す。表34の「部分配列残基一覧」に示されるアミノ酸配列は、以下のとおりである：
Figure 2019510488
。
（表３４）HLAペプチドモチーフのサーチ結果
Figure 2019510488
IEDB：Immune Epitope Database（IEDB.org）。IEDB予測ツールは、HLA対立遺伝子へのエピトープ結合を予測する異なるアルゴリズムのコンセンサスを使用する。次いで、エピトープがランク付けされる（より低いパーセンタイルは、より高い結合を予測する）。MHC-1結合の予測の結果を以下の表35に示す。表35に示すペプチドは、以下のとおり特定される：
Figure 2019510488
。
（表３５）
Figure 2019510488
Rankpep：このエピトープ実験ツールは、MHC/HLAに結合する公知のペプチドからの実験データを使用し、次いで、位置特異的スコアリングマトリックスを使用して配列を比較する。Rankpepは、位置特異的スコアリングマトリックス（PSSM）、またはMHC-ペプチド結合の予測因子として所与のMHC分子に結合すると知られている一連の整列されたペプチド（例えば、構造または配列類似性によって整列されたペプチド）からのプロファイルを使用する（http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep_help.html）。それはまた、ペプチドがプロテアーゼによってプロセシングされる可能性が高いことも考慮に入れる（Reche P.A. et al., 2002, Prediction of MHC Class I Binding Peptides Using Profile Motifs, Human Immunology, 63: 701-709; Reche P.A. et al., 2004, Enhancement to the RANKPEP resource for the prediction of peptide binding to MHC molecules using profiles, Immunogenetics, 56:405-419; Reche P.A. および Reinherz E.L., 2007, Prediction of peptide-MHC binding using profiles. Methods Mol Biol., 409:185-200）。遺伝子配列、多型などを含むMHCデータベースの非限定例は、IMGT（ImMunoGene Tics database）；IMGT/HLA database、dbMHC（NCBIのデータベース）、Allele Frequencies database；HLA Informatics group；IHWG（International Histocompatibility Working Group）；Genetics and Molecular Genetics of the MHC；およびTumor Gene Databaseを含む。ペプチドデータベースの非限定例は、MHCPEP、SYFPEITHI、HIV Molecular Immunology Database、MHCPEP HLA Ligand/Motif Database；MHCBN Database（MHC結合および非結合ペプチドの統合データベース）；HLA Ligand/Motif Database；JenPep Database（MHCおよびTAPリガンド、TおよびB細胞エピトープ）；FIMM Database（TおよびB細胞エピトープ）；ならびにMPID（MHC-ペプチド相互作用データベース）を含む。
Rankpepアウトプットに基づいたMHC分子に結合するペプチドの予測の結果を以下の表36に示す。表36に示すペプチド配列は、以下のとおり特定される：
Figure 2019510488
。
（表３６）
Figure 2019510488
上の表36において、明灰色で強調された行1〜5は、予測結合因子を表す。表の行2、5および7は、C末端が切断モデルによって予測されたペプチドについての情報を提供する。
結果の分析
NY-ESO-1腫瘍関連抗原のエピトープ分析の結果は、上記アルゴリズムを使用したタンパク質中の数種の異なるエピトープのランク付けを示した。がん免疫療法に頻繁に使用されるNY-ESO-1エピトープは、SLLMWITQC（SEQ ID NO: 32）である。3つのアルゴリズムの使用によって決定された場合のこのエピトープのランクは以下のとおりであった：
以下の表37に示すとおり、BIMAS：7；IEDB：10；Rankpep：7（10+7+7=24）。
結果は、ペプチドRLLEFYLAM（SEQ ID NO: 298）が全ての3つのアルゴリズムによって高くランク付けされるので、それが良好なエピトープであり得ることを示している。
（表３７）BIMAS、IEDBおよびRANKPEPアルゴリズムに基づいたエピトープのランク付け
Figure 2019510488
他の態様
前述の説明から、本明細書に記載される発明が種々の使用および条件に用いられるように、該発明に対して変更および改変がなされてもよいことが明らかであろう。そのような態様はまた、添付の特許請求の範囲内にある。
本明細書における可変物の任意の定義における要素の一覧の列挙は、任意の単一の要素または一覧された要素の組み合わせ（または部分的組み合わせ）としてその可変物の定義を含む。本明細書におけるある態様の列挙は、任意の単一の態様または任意の他の態様もしくはその一部との組み合わせとしてその態様を含む。
本明細書において言及される全ての特許および刊行物は、各々独立した特許および刊行物が参照によって組み入れられることを具体的かつ個別に示されたかのように同程度に、参照によって本明細書に組み入れられる。

Claims (101)

  1. アルファウイルスタンパク質またはその断片と、1つまたは複数の腫瘍関連抗原の2つ以上のエピトープとをコードするポリヌクレオチドであって、各エピトープが酵素切断部位によって隔てられている、ポリヌクレオチド。
  2. アルファウイルスタンパク質またはその断片が、シンドビスウイルスタンパク質またはその断片である、請求項1記載のポリヌクレオチド。
  3. 2つ以上のエピトープが5〜30アミノ酸を含む、請求項1または請求項2記載のポリヌクレオチド。
  4. 腫瘍関連抗原が、がん細胞もしくは腫瘍細胞の表面に発現されるか、またはがん細胞もしくは腫瘍細胞の細胞質ゾル中に発現される、請求項1〜3のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
  5. 2つ以上のエピトープが、表1〜28のいずれか1つに列挙される腫瘍関連抗原のアミノ酸配列を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
  6. 2つ以上のエピトープが、カリクレイン4、パピローマウイルス結合因子（PBF）、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、ウィルムス腫瘍-1（WT1）、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ様1（HSDL1）、メソテリン、がん精巣抗原（NY-ESO-1）、がん胎児性抗原（CEA）、p53、ヒト上皮成長因子受容体2／神経受容体チロシンキナーゼ（Her2/Neu）、がん関連上皮細胞接着分子（EpCAM）、卵巣および子宮がん抗原（CA125）、葉酸受容体α、精子タンパク質17、腫瘍関連差示的発現遺伝子-12（TADG-12）、ムチン-16（MUC-16）、L1細胞接着分子（L1CAM）、マンナン-MUC-1、ヒト内因性レトロウイルスK（HERV-K-MEL）、Kita-kyushu肺がん抗原-1（KK-LC-1）、ヒトがん／精巣抗原（KM-HN-1）、がん精巣抗原（LAGE-1）、メラノーマ抗原-A1（MAGE-A1）、精子表面透明帯結合タンパク質（Sp17）、滑膜肉腫Xブレイクポイント4（SSX-4）、一過性軸索糖タンパク質-1（TAG-1）、一過性軸索糖タンパク質-2（TAG-2）、Enabledホモログ（Enabled Homolog）（ENAH）、マンモグロビン（mammoglobin）-A、NY-BR-1、乳がん抗原（BAGE-1）、Bメラノーマ抗原、メラノーマ抗原-A1（MAGE-A1）、メラノーマ抗原-A2（MAGE-A2）、ムチンk、滑膜肉腫Xブレイクポイント2（SSX-2）、タキソール耐性関連遺伝子-3（TRAG-3）、トリ骨髄球腫症ウイルスがん遺伝子（c-myc）、サイクリンB1、ムチン1（MUC1）、p62、サバイビン、リンパ球共通抗原（CD45）、Dickkopf WNTシグナル伝達経路阻害因子1（DKK1）、テロメラーゼ、カーステンラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ（K-ras）、G250、腸カルボキシルエステラーゼ、アルファ-フェトプロテイン、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、カスパーゼ5（CASP-5）、シトクロムCオキシダーゼアセンブリ因子1ホモログ（COA-1）、O-結合型β-N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（OGT）、増幅された骨肉腫（Osteosarcoma Amplified）9、小胞体レクチン（OS-9）、形質転換成長因子ベータ受容体2（TGF-ベータRII）、マウス白血病糖タンパク質70（gp70）、カルシトニン関連ポリペプチドアルファ（CALCA）、プログラム細胞死1リガンド1（CD274）、マウス二重微小染色体2ホモログ（mdm-2）、アルファ-アクチニン-4、伸長因子2、リンゴ酸酵素1（ME1）、核転写因子YサブユニットC（NFYC）、G抗原1,3（GAGE-1,3）、メラノーマ抗原-A6（MAGE-A6）、がん精巣抗原XAGE-1b、前立腺の6つの膜貫通上皮抗原1（STEAP1）、PAP、前立腺特異的抗原（PSA）、線維芽細胞成長因子5（FGF5）、熱ショックタンパク質hsp70-2、メラノーマ抗原-A9（MAGE-A9）、Arg特異的ADP-リボシルトランスフェラーゼファミリーC（ARTC1）、B-Rafがん原遺伝子（B-RAF）、セリン／トレオニンキナーゼ、ベータ-カテニン、細胞分裂周期27ホモログ（Cdc27）、サイクリン依存性キナーゼ4（CDK4）、サイクリン依存性キナーゼ12（CDK12）、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子2A（CDKN2A）、カゼインキナーゼ1アルファ1（CSNK1A1）、フィブロネクチン1（FN1）、成長停止特異的7（GAS7）、糖タンパク質非転移性メラノーマタンパク質B（GPNMB）、HAUSオーグミン様複合体サブユニット3（HAUS3）、LDLR-フコシルトランスフェラーゼ、T細胞によって認識されるメラノーマ抗原2（MART2）、ミオスタチン（MSTN）、メラノーマ関連抗原（突然変異型）1（MUM-1-2-3）、ポリ（A）ポリメラーゼガンマ（ネオ-PAP）、ミオシンクラスI、プロテインホスファターゼ1調節サブユニット3B（PPP1R3B）、ペルオキシレドキシン-5（PRDX5）、受容体型チロシン-プロテインホスファターゼカッパ（PTPRK）、形質転換タンパク質N-Ras（N-ras）、網膜芽細胞腫関連因子600（RBAF600）、サーチュイン-2（SIRT2）、SNRPD1、トリオースリン酸イソメラーゼ、眼白皮症1型タンパク質（OA1）、RASがん遺伝子ファミリーメンバー（RAB38）、チロシナーゼ関連タンパク質1-2（TRP-1-2）、メラノーマ抗原Gp75（gp75）、チロシナーゼ、メラン-A（MART-1）、糖タンパク質100メラノーマ抗原（gp100）、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼV遺伝子（GnTVf）、リンパ球抗原6複合体遺伝子座K（LY6K）、メラノーマ抗原-A10（MAGE-A10）、メラノーマ抗原-A12（MAGE-A12）、メラノーマ抗原-C2（MAGE-C2）、メラノーマ抗原NA88-A、タキソール耐性関連タンパク質3（TRAG-3）、BDZ結合キナーゼ（pbk）、カスパーゼ8（CASP-8）、肉腫抗原1（SAGE）、ブレイクポイントクラスター領域アベルソンがん遺伝子（BCR-ABL）、白血病における融合タンパク質dek-can、伸長因子Tu GTP結合ドメイン含有2（EFTUD2）、ETS変異体遺伝子6／急性骨髄性白血病融合タンパク質（ETV6-AML1）、FMS様チロシンキナーゼ-3遺伝子内縦列重複（FLT3-ITD）、サイクリン-A1、フィブロネクチンIII型ドメイン含有3B（FDNC3B）、前骨髄球性白血病／レチノイン酸受容体アルファ融合タンパク質（pml-RARアルファ）、メラノーマ抗原-C1（MAGE-C1）、膜タンパク質選択的スプライシングアイソフォーム（D393-CD20）、メラノーマ抗原-A4（MAGE-A4）、またはメラノーマ抗原-A3（MAGE-A3）から選択される1つまたは複数の腫瘍関連抗原のエピトープである、請求項4記載のポリヌクレオチド。
  7. 2つ以上のエピトープの少なくとも1つが腫瘍関連抗原NY-ESO-1に由来する、請求項6記載のポリヌクレオチド。
  8. 2つ以上のエピトープの少なくとも1つが腫瘍関連抗原MAGE-A3に由来する、請求項6記載のポリヌクレオチド。
  9. 2つ以上のエピトープの1つが腫瘍関連抗原NY-ESO-1に由来し、2つ以上のエピトープの1つが腫瘍関連抗原pbkに由来する、請求項6記載のポリヌクレオチド。
  10. 腫瘍関連抗原NY-ESO-1由来のエピトープがアミノ酸配列LLMWITQCF（SEQ ID NO: 1）を含み、腫瘍関連抗原pbk由来のエピトープがアミノ酸配列GSPFPAAVI（SEQ ID NO: 2）を含む、請求項9記載のポリヌクレオチド。
  11. 2つ以上のエピトープの1つが腫瘍関連抗原NY-ESO-1に由来し、2つ以上のエピトープの1つが腫瘍関連抗原サバイビンに由来する、請求項6記載のポリヌクレオチド。
  12. 腫瘍関連抗原NY-ESO-1由来のエピトープがアミノ酸配列RGPESRLLE（SEQ ID NO: 3）を含み、腫瘍関連抗原サバイビン由来のエピトープがアミノ酸配列AFLTVKKQM（SEQ ID NO: 4）を含む、請求項11記載のポリヌクレオチド。
  13. 1つまたは複数の腫瘍関連抗原の3つ以上のエピトープをコードする、請求項1〜6のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
  14. 3つ以上のエピトープが同じ腫瘍関連抗原のエピトープである、請求項13記載のポリヌクレオチド。
  15. 3つ以上のエピトープが少なくとも1つの異なる腫瘍関連抗原に由来する、請求項13記載のポリヌクレオチド。
  16. 1つまたは複数の腫瘍関連抗原の8つ以上のエピトープをコードする、請求項1〜6のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
  17. エピトープが、卵巣がん、乳がん、精巣がん、膵臓がん、肝臓がん、結腸がん、大腸がん、甲状腺がん、肺がん、前立腺がん、腎臓がん、メラノーマ、扁平上皮がん、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、前骨髄球性白血病、多発性骨髄腫、B細胞リンパ腫、膀胱がん、頭頚部がん、食道がん、脳がん、咽頭がん、舌がん、滑膜細胞がん、神経芽腫、子宮がん、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、基底細胞がん、類表皮がん、腺がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん、肝細胞がん、胆管がん、絨毛がん、精上皮腫、胎生期がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、小細胞肺がん、上皮がん、膠芽腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、希突起膠芽腫、髄膜腫、神経膠腫、または網膜芽細胞腫のがん細胞の表面に発現される腫瘍関連抗原のエピトープである、請求項1〜16のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
  18. エピトープが、卵巣がん細胞、乳がん細胞、結腸がん細胞、または子宮頸がん細胞の表面に発現される腫瘍関連抗原のエピトープである、請求項17記載のポリヌクレオチド。
  19. 酵素切断部位がプロテアーゼ切断部位である、請求項1〜18のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
  20. 酵素切断部位がセリンプロテアーゼ切断部位である、請求項19記載のポリヌクレオチド。
  21. セリンプロテアーゼ切断部位が、フーリン、PC1、PC2、PC4、PC5、PACE4、PC7から選択されるタンパク質またはそれらの組み合わせによって切断される、請求項20記載のポリヌクレオチド。
  22. セリンプロテアーゼ切断部位がフーリンによって切断される、請求項21記載のポリヌクレオチド。
  23. 酵素切断部位が、アミノ酸配列XRSKRX（SEQ ID NO: 5）（式中、Xは、疎水性アミノ酸を表す）を含む、請求項1〜20のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
  24. 酵素切断部位が、アミノ酸配列（R/K）Xn（R/K）（SEQ ID NO: 6）（式中、Xは、アミノ酸を表し、かつnは、0〜6の整数である）を含む、請求項1〜20のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
  25. 5'小胞体シグナル配列を含む、請求項1〜24のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
  26. 5'小胞体シグナル配列が、アルファウイルス、インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質由来ペプチドM57-68または組織プラスミノーゲン活性化因子ペプチドに由来する、請求項25記載のポリヌクレオチド。
  27. 熱ショックタンパク質70、IgG1 Fcドメイン、リソソーム関連膜タンパク質（LAMP）、破傷風毒素ユニバーサルヘルパーT（Th）エピトープ、または大腸菌（E. coli）易熱性エンテロトキシンBサブユニットから選択される免疫原性タンパク質をコードする3'配列を含む、請求項1〜26のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
  28. IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20〜IL-36、CCケモカインCCL1〜CCL27、CXCケモカインCXCL1〜CXCL13、Cケモカイン、CX3Cケモカイン、サイトカインもしくはケモカイン受容体、可溶性受容体、形質転換成長因子-ベータ（TGF-β）、または腫瘍壊死因子アルファ（TNFα）から選択される1つまたは複数の免疫刺激タンパク質をコードする、請求項1〜27のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
  29. 1つまたは複数の免疫刺激タンパク質がIL-12である、請求項1〜28のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
  30. 1つまたは複数の自殺遺伝子を含む、請求項1〜29のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
  31. 1つまたは複数の自殺遺伝子が、不活性プロドラッグを細胞傷害性代謝物へと変換することができる、請求項30記載のポリヌクレオチド。
  32. 不活性プロドラッグが、ガンシクロビル、アシクロビル、1-(2-デオキシ-2-フルオロ-β-D-アラビノフラノシル)-5-ヨードウラシル（FIAU）、6-メトキシプリンアラビノシド、および5-フルオロシトシンからなる群より選択される、請求項31記載のポリヌクレオチド。
  33. 1つまたは複数の自殺遺伝子がチミジンキナーゼまたはシトシンデアミナーゼをコードする、請求項30〜32のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
  34. チミジンキナーゼが単純ヘルペスウイルス（HSVtk）または水痘帯状疱疹ウイルス（VZV-tk）に由来する、請求項33記載のポリヌクレオチド。
  35. RNAまたはDNAを含む、請求項1〜34のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
  36. 一本鎖RNAを含む、請求項35記載のポリヌクレオチド。
  37. 請求項1〜36のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含む、ウイルス粒子。
  38. 請求項1〜36のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含む、ウイルスベクター。
  39. アルファウイルス、レンチウイルス、またはレトロウイルスから選択される、請求項38記載のウイルスベクター。
  40. シンドビスウイルスに由来する、請求項39記載のウイルスベクター。
  41. 1つまたは複数のシンドビスウイルスエンベロープタンパク質で偽型化されている、請求項39記載のウイルスベクター。
  42. 1つまたは複数のシンドビスウイルスエンベロープタンパク質が、シンドビス-ZZ E2タンパク質を含む、請求項41記載のウイルスベクター。
  43. 1つまたは複数のシンドビスウイルスエンベロープタンパク質で偽型化されたレンチウイルスである、請求項39記載のウイルスベクター。
  44. 1つまたは複数のシンドビスウイルスエンベロープタンパク質で偽型化されたレトロウイルスである、請求項39記載のウイルスベクター。
  45. 複製欠損ウイルスベクターまたは複製可能ウイルスベクターである、請求項38〜44のいずれか一項記載のウイルスベクター。
  46. 非組み込みウイルスベクターである、請求項38〜45のいずれか一項記載のウイルスベクター。
  47. 対象への投与後に、1つまたは複数の腫瘍関連抗原の2つ以上のエピトープを発現する腫瘍またはがんに対する免疫応答を誘発することができる、請求項38〜46のいずれか一項記載のウイルスベクター。
  48. 対象がヒト患者である、請求項47記載のウイルスベクター。
  49. 腫瘍関連抗原の5〜30アミノ酸を含む2つ以上のエピトープをコードするポリヌクレオチドを含むシンドビスウイルスベクターであって、各エピトープがフーリン酵素切断部位によって隔てられている、シンドビスウイルスベクター。
  50. 1つまたは複数のシンドビスウイルスエンベロープタンパク質で偽型化されたウイルスベクターであって、該ウイルスベクターが、腫瘍関連抗原の5〜30アミノ酸を含む2つ以上のエピトープをコードするポリヌクレオチドを含み、各エピトープがフーリン酵素切断部位によって隔てられている、ウイルスベクター。
  51. 2つ以上のエピトープが、表1〜28のいずれか1つに列挙される腫瘍関連抗原のアミノ酸配列を含む、請求項49または請求項50記載のウイルスベクター。
  52. 2つ以上のエピトープが、カリクレイン4、PBF、PRAME、WT1、HSDL1、メソテリン、NY-ESO-1、CEA、p53、Her2/Neu、EpCAM、CA125、葉酸受容体α、精子タンパク質17、TADG-12、MUC-16、L1CAM、マンナン-MUC-1、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、MAGE-A4、Sp17、SSX-4、TAG-1、TAG-2、ENAH、マンモグロビン-A、NY-BR-1、BAGE-1、MAGE-A1、MAGE-A2、ムチンk、SSX-2、TRAG-3、c-myc、サイクリンB1、MUC1、p62、サバイビン、CD45、DKK1、RU2AS、テロメラーゼ、K-ras、G250、ヘプシン、腸カルボキシルエステラーゼ、アルファ-フェトプロテイン、M-CSF、PSMA、CASP-5、COA-1、OGT、OS-9、TGF-ベータRII、gp70、CALCA、CD274、mdm-2、アルファ-アクチニン-4、伸長因子2、ME1、NFYC、GAGE-1、MAGE-A6、XAGE-1b、PSMA、STEAP1、PAP、PSA、GAGE3、FGF5、ヘプシン、hsp70-2、MAGE-A9、ARTC1、B-RAF、ベータ-カテニン、Cdc27、CDK4、CDK12、CDKN2A、CLLP、CSNK1A1、FN1、GAS7、GPNMB、HAUS3、LDLR-フコシルトランスフェラーゼ、MART2、MATN、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ネオ-PAP、ミオシンクラスI、PPP1R3B、PRDX5、PTPRK、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、トリオースリン酸イソメラーゼ、OA1、RAB38、TRP-1、gp75、TRP2、チロシナーゼ、MART-1、gp100、GnTVf、LY6K、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-C2、NA88-A、TRAG-3、TRP2-INT2g、pbk、CASP-8、SAGE、BCR-ABL、dek-can、EFTUD2、ETV6-AML1、FLT3-ITD、サイクリン-A1、FDNC3B、pml-RARアルファ、MAGE-C1、D393-CD20、MAGE-A4、およびMAGE-A3からなる群より選択される1つまたは複数の腫瘍関連抗原のエピトープである、請求項51記載のウイルスベクター。
  53. 2つ以上のエピトープの少なくとも1つが腫瘍関連抗原NY-ESO-1に由来し、2つ以上のエピトープの少なくとも1つが腫瘍関連抗原サバイビンに由来する、請求項52記載のウイルスベクター。
  54. 2つ以上のエピトープの1つが腫瘍関連抗原NY-ESO-1に由来し、2つ以上のエピトープの1つが腫瘍関連抗原pbkに由来する、請求項52記載のウイルスベクター。
  55. 腫瘍関連抗原NY-ESO-1由来のエピトープがアミノ酸配列LLMWITQCF（SEQ ID NO: 1）またはアミノ酸配列RGPESRLLE（SEQ ID NO: 3）を含み、腫瘍関連抗原pbk由来のエピトープがアミノ酸配列GSPFPAAVI（SEQ ID NO: 2）を含む、請求項52記載のウイルスベクター。
  56. 2つ以上のエピトープの1つが腫瘍関連抗原NY-ESO-1に由来し、2つ以上のエピトープの1つが腫瘍関連抗原サバイビンに由来する、請求項52記載のウイルスベクター。
  57. 腫瘍関連抗原NY-ESO-1由来のエピトープがアミノ酸配列RGPESRLLE（SEQ ID NO: 3）を含み、腫瘍関連抗原サバイビン由来のエピトープがアミノ酸配列AFLTVKKQM（SEQ ID NO: 4）を含む、請求項52記載のウイルスベクター。
  58. ポリヌクレオチドが、1つまたは複数の腫瘍関連抗原の3つ以上のエピトープをコードする、請求項49〜57のいずれか一項記載のウイルスベクター。
  59. ポリヌクレオチドが、1つまたは複数の腫瘍関連抗原の8つ以上のエピトープをコードする、請求項49〜57のいずれか一項記載のウイルスベクター。
  60. 1つまたは複数のエピトープが、卵巣がん、乳がん、精巣がん、膵臓がん、肝臓がん、大腸がん、甲状腺がん、肺がん、前立腺がん、腎臓がん、メラノーマ、扁平上皮がん、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、前骨髄球性白血病、多発性骨髄腫、B細胞リンパ腫、膀胱がん、頭頚部がん、食道がん、脳がん、咽頭がん、舌がん、滑膜細胞がん、神経芽腫、子宮がん、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、基底細胞がん、類表皮がん、腺がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん、肝細胞がん、胆管がん、絨毛がん、精上皮腫、胎生期がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、小細胞肺がん、上皮がん、膠芽腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、希突起膠芽腫、髄膜腫、神経膠腫、または網膜芽細胞腫のがん細胞もしくは腫瘍細胞の表面にまたは細胞質ゾル中に発現される腫瘍関連抗原のエピトープである、請求項49〜59のいずれか一項記載のウイルスベクター。
  61. 5'小胞体シグナル配列を含む、請求項49〜60のいずれか一項記載のウイルスベクター。
  62. 5'小胞体シグナル配列が、アルファウイルス、インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質由来ペプチドM57-68または組織プラスミノーゲン活性化因子ペプチドに由来する、請求項61記載のウイルスベクター。
  63. 熱ショックタンパク質70、IgG1 Fcドメイン、リソソーム関連膜タンパク質（LAMP）、破傷風毒素ユニバーサルヘルパーT（Th）エピトープ、または大腸菌易熱性エンテロトキシンBサブユニットから選択される免疫原性タンパク質をコードする3'配列を含む、請求項49〜62のいずれか一項記載のウイルスベクター。
  64. ポリヌクレオチドが、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20〜IL-36、CCケモカインCCL1〜CCL27、CXCケモカインCXCL1〜CXCL13、Cケモカイン、CX3Cケモカイン、サイトカインもしくはケモカイン受容体、可溶性受容体、形質転換成長因子-ベータ（TGF-β）、または腫瘍壊死因子アルファ（TNFα）から選択される1つまたは複数の免疫刺激タンパク質をコードする、請求項49〜63のいずれか一項記載のウイルスベクター。
  65. 1つまたは複数の自殺遺伝子を含む、請求項49〜64のいずれか一項記載のウイルスベクター。
  66. 1つまたは複数の自殺遺伝子が、不活性プロドラッグを細胞傷害性代謝物へと変換することができる、請求項65記載のウイルスベクター。
  67. 不活性プロドラッグが、ガンシクロビル、アシクロビル、1-(2-デオキシ-2-フルオロ-β-D-アラビノフラノシル)-5-ヨードウラシル（FIAU）、6-メトキシプリンアラビノシドおよび5-フルオロシトシンからなる群より選択される、請求項66記載のウイルスベクター。
  68. 1つまたは複数の自殺遺伝子がチミジンキナーゼまたはシトシンデアミナーゼをコードする、請求項65〜67のいずれか一項記載のウイルスベクター。
  69. チミジンキナーゼが単純ヘルペスウイルス（HSVtk）または水痘帯状疱疹ウイルス（VZV-tk）に由来する、請求項68記載のウイルスベクター。
  70. 対象への投与後に、1つまたは複数の腫瘍関連抗原の2つ以上のエピトープを発現する腫瘍またはがんに対する免疫応答を誘発することができる、請求項49〜69のいずれか一項記載のウイルスベクター。
  71. 対象がヒトである、請求項70記載のウイルスベクター。
  72. 1つまたは複数の遺伝子改変されたシンドビスウイルスエンベロープタンパク質で偽型化されたレンチウイルスベクターであって、請求項1〜36のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含む、レンチウイルスベクター。
  73. 1つまたは複数の遺伝子改変されたシンドビスウイルスエンベロープタンパク質で偽型化されたレンチウイルスベクターであって、NY-ESO-1、MAGE-A3、pbk、サバイビン、またはそれらの組み合わせから選択される1つまたは複数の腫瘍関連抗原のエピトープをコードする請求項1〜35のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含む、レンチウイルスベクター。
  74. 請求項38〜71のいずれか一項記載のウイルスベクターを含む、ウイルス粒子。
  75. 請求項72または請求項73記載のレンチウイルスベクターを含む、ウイルス粒子。
  76. 請求項1〜36のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含む、細胞。
  77. 請求項38〜71のいずれか一項記載のウイルスベクターまたは請求項72もしくは請求項73記載のレンチウイルスベクターを含む、細胞。
  78. 請求項37、74、または75のいずれか一項記載のウイルス粒子を含む、細胞。
  79. 請求項1〜35のいずれか一項記載のポリヌクレオチド；請求項37、74、もしくは75のいずれか一項記載のウイルス粒子；または請求項38〜71、72、もしくは73のいずれか一項記載のウイルスベクターと、薬学的に許容し得るビヒクル、担体、または希釈剤とを含む、薬学的組成物。
  80. 液体剤形である、請求項79記載の薬学的組成物。
  81. 2つ以上の腫瘍関連抗原の1つまたは複数のエピトープを発現するがん細胞または腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導する方法であって、該がん細胞または腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導するために、該がん細胞または腫瘍細胞と、請求項1〜36のいずれか一項記載のポリヌクレオチド；請求項37、74、もしくは75のいずれか一項記載のウイルス粒子；請求項38〜71、72、もしくは73のいずれか一項記載のウイルスベクター；または請求項79もしくは請求項80記載の薬学的組成物の有効量とを接触させる工程を含む、方法。
  82. がんまたは腫瘍発生を有するかまたはそれを有するリスクのある対象におけるがんを処置する方法であって、該対象におけるがんを処置するために、請求項1〜36のいずれか一項記載のポリヌクレオチド；請求項37、74、もしくは75のいずれか一項記載のウイルス粒子；請求項38〜71、72、もしくは73のいずれか一項記載のウイルスベクター；または請求項79もしくは請求項80記載の薬学的組成物の治療有効量を該対象に投与する工程を含む、方法。
  83. 対象がヒト患者である、請求項82記載の方法。
  84. がんまたは腫瘍が、卵巣がん、子宮頸がん、子宮がん、乳がん、精巣がん、膵臓がん、肝臓がん、大腸がん、甲状腺がん、肺がん、前立腺がん、腎臓がん、メラノーマ、扁平上皮がん、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、前骨髄球性白血病、多発性骨髄腫、B細胞リンパ腫、膀胱がん、頭頚部がん、食道がん、脳がん、咽頭がん、舌がん、滑膜細胞がん、神経芽腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、基底細胞がん、類表皮がん、腺がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん、肝細胞がん、胆管がん、絨毛がん、精上皮腫、胎生期がん、ウィルムス腫瘍、小細胞肺がん、上皮がん、膠芽腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、希突起膠芽腫、髄膜腫、神経膠腫、または網膜芽細胞腫の1つまたは複数から選択される、請求項81〜83のいずれか一項記載の方法。
  85. がんが、卵巣がん、子宮頸がん、乳がん、または結腸がんの1つまたは複数である、請求項84記載の方法。
  86. ポリヌクレオチド、ウイルス粒子、ウイルスベクター、または薬学的組成物が、腫瘍関連抗原NY-ESO-1、p53、sp17、サバイビン、pbk、CEA、CA125、またはWT1の1つまたは複数の2つ以上のエピトープをコードする、請求項81〜85のいずれか一項記載の方法。
  87. ポリヌクレオチド、ウイルス粒子、ウイルスベクター、または薬学的組成物が、非経口的にまたは予防薬として投与される、請求項81〜85のいずれか一項記載の方法。
  88. 対象を化学療法または放射線で処置する工程をさらに含む、請求項81〜87のいずれか一項記載の方法。
  89. 対象のエフェクターT細胞のレベルを決定することによって評価された場合の該対象の免疫応答の低下後に、追加免疫を該対象に投与する工程をさらに含む、請求項81〜88のいずれか一項記載の方法。
  90. 追加免疫が、複製欠損アデノウイルスベクターを含む異種追加免疫である、請求項81〜89のいずれか一項記載の方法。
  91. 複製欠損アデノウイルスベクターが、2つ以上の腫瘍関連抗原の1つまたは複数のエピトープをコードするポリヌクレオチドを含み、各エピトープが酵素切断部位によって隔てられている、請求項90記載の方法。
  92. 1つまたは複数のエピトープが、表1〜28のいずれか1つに列挙される腫瘍関連抗原のアミノ酸配列を含む、請求項91記載の方法。
  93. 1つまたは複数のエピトープが、カリクレイン4、PBF、PRAME、WT1、HSDL1、メソテリン、NY-ESO-1、CEA、p53、Her2/Neu、EpCAM、CA125、葉酸受容体α、精子タンパク質17、TADG-12、MUC-16、L1CAM、マンナン-MUC-1、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、MAGE-A4、Sp17、SSX-4、TAG-1、TAG-2、ENAH、マンモグロビン-A、NY-BR-1、BAGE-1、MAGE-A1、MAGE-A2、ムチンk、SSX-2、TRAG-3、c-myc、サイクリンB1、MUC1、p62、サバイビン、CD45、DKK1、RU2AS、テロメラーゼ、K-ras、G250、ヘプシン、腸カルボキシルエステラーゼ、アルファ-フェトプロテイン、M-CSF、PSMA、CASP-5、COA-1、OGT、OS-9、TGF-ベータRII、gp70、CALCA、CD274、mdm-2、アルファ-アクチニン-4、伸長因子2、ME1、NFYC、GAGE-1、MAGE-A6、XAGE-1b、PSMA、STEAP1、PAP、PSA、GAGE3、FGF5、ヘプシン、hsp70-2、MAGE-A9、ARTC1、B-RAF、ベータ-カテニン、Cdc27、CDK4、CDK12、CDKN2A、CLLP、CSNK1A1、FN1、GAS7、GPNMB、HAUS3、LDLR-フコシルトランスフェラーゼ、MART2、MATN、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ネオ-PAP、ミオシンクラスI、PPP1R3B、PRDX5、PTPRK、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、トリオースリン酸イソメラーゼ、OA1、RAB38、TRP-1、gp75、TRP2、チロシナーゼ、MART-1、gp100、GnTVf、LY6K、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-C2、NA88-A、TRAG-3、TRP2-INT2g、pbk、CASP-8、SAGE、BCR-ABL、dek-can、EFTUD2、ETV6-AML1、FLT3-ITD、サイクリン-A1、FDNC3B、pml-RARアルファ、MAGE-C1、D393-CD20、MAGE-A4およびMAGE-A3からなる群より選択される2つ以上の腫瘍関連抗原のエピトープである、請求項92記載の方法。
  94. ポリヌクレオチド、ウイルス粒子、ウイルスベクター、または薬学的組成物の投与の少なくとも1日〜少なくとも2週間後に、追加免疫が対象に投与される、請求項89〜93のいずれか一項記載の方法。
  95. 投与する工程が、対象においてエピトープスプレッディングを引き起こす、請求項82〜94のいずれか一項記載の方法。
  96. CD4+T細胞応答を誘導するためのアミノ酸配列
    Figure 2019510488
    をコードする核酸配列をさらに含む、請求項1〜36のいずれか一項記載のポリヌクレオチド；請求項37、74、もしくは75のいずれか一項記載のウイルス粒子；または請求項38〜71、72、もしくは73のいずれか一項記載のウイルスベクター。
  97. 1つまたは複数のアルファウイルスエンベロープタンパク質で偽型化されたウイルスベクターであって、該ウイルスベクターが、腫瘍関連抗原の5〜30アミノ酸を含む2つ以上のエピトープをコードするポリヌクレオチドを含み、各エピトープが酵素切断部位によって隔てられている、ウイルスベクター。
  98. 2つ以上のエピトープが、表1〜28のいずれか1つに列挙される腫瘍関連抗原のアミノ酸配列を含む、請求項97記載のウイルスベクター。
  99. 2つ以上のエピトープが、カリクレイン4、PBF、PRAME、WT1、HSDL1、メソテリン、NY-ESO-1、CEA、p53、Her2/Neu、EpCAM、CA125、葉酸受容体α、精子タンパク質17、TADG-12、MUC-16、L1CAM、マンナン-MUC-1、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、MAGE-A4、Sp17、SSX-4、TAG-1、TAG-2、ENAH、マンモグロビン-A、NY-BR-1、BAGE-1、MAGE-A1、MAGE-A2、ムチンk、SSX-2、TRAG-3、c-myc、サイクリンB1、MUC1、p62、サバイビン、CD45、DKK1、RU2AS、テロメラーゼ、K-ras、G250、ヘプシン、腸カルボキシルエステラーゼ、アルファ-フェトプロテイン、M-CSF、PSMA、CASP-5、COA-1、OGT、OS-9、TGF-ベータRII、gp70、CALCA、CD274、mdm-2、アルファ-アクチニン-4、伸長因子2、ME1、NFYC、GAGE-1、MAGE-A6、XAGE-1b、PSMA、STEAP1、PAP、PSA、GAGE3、FGF5、ヘプシン、hsp70-2、MAGE-A9、ARTC1、B-RAF、ベータ-カテニン、Cdc27、CDK4、CDK12、CDKN2A、CLLP、CSNK1A1、FN1、GAS7、GPNMB、HAUS3、LDLR-フコシルトランスフェラーゼ、MART2、MATN、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ネオ-PAP、ミオシンクラスI、PPP1R3B、PRDX5、PTPRK、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、トリオースリン酸イソメラーゼ、OA1、RAB38、TRP-1、gp75、TRP2、チロシナーゼ、MART-1、gp100、GnTVf、LY6K、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-C2、NA88-A、TRAG-3、TRP2-INT2g、pbk、CASP-8、SAGE、BCR-ABL、dek-can、EFTUD2、ETV6-AML1、FLT3-ITD、サイクリン-A1、FDNC3B、pml-RARアルファ、MAGE-C1、D393-CD20、MAGE-A4、およびMAGE-A3からなる群より選択される1つまたは複数の腫瘍関連抗原のエピトープである、請求項98記載のウイルスベクター。
  100. 酵素切断部位がフーリン酵素切断部位である、請求項97〜99のいずれか一項記載のウイルスベクター。
  101. アルファウイルスタンパク質またはその断片が、バーマフォレストウイルス、バーマフォレストウイルス群、東部ウマ脳炎ウイルス（EEEV）、東部ウマ脳炎ウイルス群、ミデルブルグウイルス、ミデルブルグウイルス群、ヌドゥムウイルス、ヌドゥムウイルス群、セムリキフォレストウイルス、セムリキフォレストウイルス群、ベバルウイルス、チクングニヤウイルス、マヤロウイルス、亜型ウナウイルス、オニョンニョンウイルス、亜型イボ-オラウイルス、ロスリバーウイルス、亜型ゲタウイルス、亜型ベバルウイルス、亜型サギヤマウイルス、亜型メトリウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（VEEV）、VEEV群、カバソウウイルス、エバーグレーズウイルス、モッソダスペドラスウイルス、ムカンボウイルス、パラマナウイルス、ピクスナウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス（WEEV）、リオネグロウイルス、トロカラウイルス、亜型ビジューブリッジウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス群、アウラウイルス、ババンキウイルス、キジラガチウイルス、シンドビスウイルス、オケルボウイルス、ワタロアウイルス、バギークリークウイルス、フォートモーガンウイルス、ハイランドJウイルス、エイラートウイルス、サケ膵臓病ウイルス（SPDV）、ミナミゾウアザラシウイルス（SESV）、タイフォレストウイルス、またはトナテウイルスに由来する、請求項1記載のポリヌクレオチド、請求項37記載のウイルス粒子、または請求項38もしくは請求項97記載のウイルスベクター。
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