KR20180119659A - 항종양 면역을 유도하기 위한 종양 관련 항원의 다중 에피토프를 발현하는 바이러스 벡터 - Google Patents

항종양 면역을 유도하기 위한 종양 관련 항원의 다중 에피토프를 발현하는 바이러스 벡터 Download PDF

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cancer
leu
polynucleotide
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다니엘 메루엘로
크리스틴 팜페노
마르티네즈 알리시아 우르타도
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뉴욕 유니버시티
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Abstract

본 발명은 하나 이상의 종양 관련 항원의 다중, 예를 들어 2개 이상의 에피토프로서 각각이 프로세싱 또는 효소 절단 부위에 의해 분리된 에피토프를 코딩하는 폴리펩티드, 바이러스 벡터, 특히 신드비스 바이러스 벡터와 같은 알파바이러스 벡터를 제공한다. 기재된 폴리뉴클레오티드 및 바이러스 벡터에 의해 코딩되는 둘 이상의 종양 관련 항원의 다중 에피토프는 동일하거나 상이할 수 있다. 종양 관련 항원 에피토프를 발현하는 암 또는 종양을 가진 포유류 대상체를 치료하는 방법으로서, 다중 에피토프뿐 아니라 다른 면역자극 또는 면역조절 성분을 코딩하는 바이러스 벡터는, 높은 수준의 이펙터 T 세포는 종양보유 포유류 대상체의 생존 가능성을 증가시키고 에피토프 확산을 일으켜 면역 반응을 더욱 향상시키는, 항암 또는 항종양 면역 반응을 생성하는 것인 방법을 제공한다.

Description

항종양 면역을 유도하기 위한 종양 관련 항원의 다중 에피토프를 발현하는 바이러스 벡터
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2016년 3월 4일자로 출원된 미국 가출원 제62/303,923호를 우선권으로 주장하며, 그 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
지난 20년간 시행된 침습적인 외과 접근법과 복합 화학요법을 포함할 수 있는 유효한 암 치료법에 불구하고, 다양한 암이 면역계의 세포에 의한 발견 및 파괴를 일상적으로 회피하고 이러한 암에 걸린 환자에게 좋지 않은 예후를 나타낸다.
방어 면역을 포함한 항암 면역은 면역 반응의 크기와 T 중심 기억 세포(Tcm: T central memory cell) 및 T 이펙터 기억 세포(Tem: T effector memory cell)를 포함하는 기억 면역 반응의 표현형 모두에 기반을 둔다고 생각된다. Tcm은 CD62L+ CD127+ 표현형이 특징인 반면, Tem은 CD62L- CD127+ 표현형으로 정의된다. Tem은 비림프 조직을 통해 이동하며 말초에서 즉각적인 이펙터 기능을 발휘하는 한편, Tcm은 2차 림프 기관에 국한되어 수지상 세포에 의해 제시된 항원과 마주칠 때 대량으로 증식하여 2차 방어선을 구성한다. T 세포 기억 면역 반응의 유도는 사이토카인 환경, 항원 자극의 기간 및 항원 양과 같은 다양한 인자에 의존한다. CD8+ T 세포 기억 팽창은 이펙터-기억 표현형을 가진 높은 빈도의 기능적 Ag 특이적 CD8+ T 세포 풀의 축적 및 말초 기관에서의 농축을 특징으로 한다. 암 성장 및 재발에 대한 효과적인 면역 반응을 위해서 이러한 유형의 반응이 더욱 강력하고 바람직하다.
신드비스 바이러스(SV: Sindbis virus)는 아폽토시스를 통해 종양 세포를 사멸시킬 수 있는 양성 가닥 RNA 게놈을 가진 종양 용해성 알파바이러스이다. 현재까지, 종양 용해성 바이러스를 이용한 암 치료법은 일반적으로 암 또는 종양의 완전한 관해를 유도하지 못하였다. 게다가, 일부 종양 세포는 현재까지 암 치료에 사용된 바이러스로 효과적으로 표적화되지 않을 수 있으며, 이에 따라, 항암 치료를 향상시키기 위한 새로운 요법 및 추가적인 방법을 개발할 필요가 있음을 강조한다. 많은 유형의 암을 치료 및 예방함에 있어 현재 존재하는 많은 장애를 감안할 때, 신규의 개선된 항암 치료제, 특히 종양 및 암세포에 대해 지시되는 면역 반응을 유도하는 치료제뿐만 아니라 포유동물에서 종양 및 암의 치료 및 박멸에 있어 면역 반응을 증가시키기 위한 상기 약제의 투여 방법이 절실하게 요구된다.
본 발명은 상이한 HLA 일배체형에 의해 제시되는 다양한 종양 관련 항원, 종양 탈출 변이체 및 항원에 대한 이펙터 T 세포 반응의 자극을 증가시켜 항종양(항암) 면역을 유도하기 위한, 알파바이러스 단백질 또는 이의 단편, 및 하나 이상의 종양 관련 항원(TAA: tumor associated antigen)의 다중(예를 들어, 2개 이상의) 에피토프로서 각각이 효소 절단 부위에 의해 분리된 에피토프를 코딩하는 폴리펩티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터, 바이러스 입자 및 약학 조성물을 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, 알파바이러스 단백질 또는 이의 단편은 신드비스 바이러스 단백질 또는 이의 단편이다. 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 또한 하나 이상의 사이토카인, 면역자극 분자, 또는 세포 신호전달 분자, 또는 이들의 에피토프를 코딩할 수 있다.
본 발명은 또한 하나 이상의 종양 관련 항원(TAA)의 다중(예를 들어, 2개 이상의) 에피토프로서 각각이 효소 절단 부위에 의해 분리된 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터 또는 바이러스 입자를 특징으로 한다. 한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 알파바이러스 벡터 또는 위형 알파바이러스 벡터이다. 특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 신드비스 바이러스 벡터이다. 다른 실시양태에서, 바이러스 벡터는 하나 이상의 알파바이러스 외피(envelope) 단백질, 예를 들어, E1, E2 또는 E3을 가진 위형 레트로바이러스 또는 렌티바이러스이다. 다른 실시양태에서, 바이러스 벡터는 신드비스 바이러스 외피 단백질, 예를 들어 E1-E3 또는 ZZ E2를 가진 위형 레트로바이러스 또는 렌티바이러스이다. 한 실시양태에서, 종양 관련 항원의 에피토프는 5 내지 50개 아미노산을 포함한다. 다른 실시양태에서, 종양 관련 항원의 에피토프는 5-30개 아미노산, 5-25개 아미노산, 5-20개 아미노산, 7-25개 아미노산, 7-20 또는 7-14개 아미노산을 포함한다. 한 실시양태에서, 효소 절단 부위는 하기에 기재되는 효소에 의해 인식되는 서열을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 종양 관련 항원(TAA)의 2개 이상의 에피토프로서 각각이 효소 절단 부위에 의해 분리된 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA를 포함하며, RNA는 단일 가닥(ss: single stranded) RNA일 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 하기에 기재되는 바와 같이 바이러스 벡터 또는 바이러스 입자에 운반된다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5 내지 50개 아미노산을 포함하는 2개 이상의 에피토프를 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5-30개 아미노산을 포함하는 2개 이상의 에피토프를 포함한다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 종양 관련 항원은 암 또는 종양 세포의 표면상에서(예를 들어, 세포 외로) 발현되거나 암 또는 종양 세포 안으로 세포 내 발현된다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 2개 이상의 에피토프는 표 1-28 중 어느 하나에 열거된 종양 관련 항원의 아미노산 서열을 포함한다.
실시양태에서, 하기의 하나 이상의 종양 관련 항원의 2개 이상의 에피토프는 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터, 또는 바이러스 입자에 의해 코딩될 수 있다: 칼리크레인 4, 유두종 바이러스 결합 인자(PBF: papillomavirus binding factor), 흑색종의 우선적으로 발현되는 항원(PRAME: preferentially expressed antigen of melanoma), 윌름스 종양-1(WT1: Wilms' tumor-1), 히드록시스테로이드 데히드로게나아제 유사 1(HSDL1: Hydroxysteroid Dehydrogenase Like 1), 메소텔린, 암 정소 항원(NY-ESO-1), 암배아 항원(CEA: carcinoembryonic antigen), p53, 인간 표피 성장 인자 수용체 2/신경성 수용체 티로신 키나아제(Her2/Neu), 암종 관련 표피 세포 부착 분자(EpCAM: carcinoma-associated epithelial cell adhesion molecule), 난소 및 자궁 암종 항원(CA125), 엽산 수용체 α, 정자 단백질 17, 종양 관련 차등 발현 유전자-12(TADG-12: tumor-associated differentially expressed gene-12), 뮤신-16(MUC-16), L1 세포 부착 분자(L1CAM), 만난-MUC-1, 인간 내인성 레트로바이러스 K(HERV-K-MEL), 키타큐슈 폐암 항원-1(KK-LC-1: Kita-kyushu lung cancer antigen-1), 인간 암/정소 항원(KM-HN-1), 암 정소 항원(LAGE-1), 흑색종 항원-A1(MAGE-A1), 정자 표면 투명대 결합 단백질(Sp17), 활막 육종-X 절단점 4(SSX-4: Synovial Sarcoma, X Breakpoint 4), 일과성 축삭 당단백질-1(TAG-1: Transient axonal glycoprotein-1), 일과성 축삭 당단백질-2(TAG-2), 인에이블드 호몰로그(ENAH: Enabled Homolog), 맘마글로빈-A, NY-BR-1, 유방암 항원(BAGE-1), B 흑색종 항원, 흑색종 항원-A1(MAGE-A1), 흑색종 항원-A2(MAGE-A2), 뮤신 k, 활막 육종-X 절단점 2(SSX-2), 택솔 내성 관련 유전자-3(TRAG-3: Taxol-resistance-associated gene-3), 조류 골수구종증 바이러스 종양유전자(c-myc), 사이클린 B1, 뮤신 1(MUC1), p62, 서바이빈(survivin), 림프구 공통 항원(CD45), 딕코프(Dickkopf) WNT 신호전달 경로 억제 인자 1(DKK1), 텔로머라아제, 커스틴 쥐(Kirsten rat) 육종 바이러스 종양유전자 상동체(K-ras), G250, 장 카복실 에스테라아제, 알파-태아단백질, 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF: Macrophage Colony-Stimulating Factor), 전립선 특이적 막 항원(PSMA: Prostate-specific membrane antigen), 카스파아제 5(CASP-5), 시토크롬 C 산화효소 어셈블리 인자 1 상동체(COA-1: Cytochrome C Oxidase Assembly Factor 1 Homolog-1), O-결합된 β-N-아세틸글루코사민 트랜스퍼라아제(OGT: O-linked β-N-acetylglucosamine transferase), 골육종 증폭된 9(Osteosarcoma Amplified 9), 소포체 렉틴(OS-9), 형질전환 성장 인자 베타 수용체 2(TGF-베타RII: Transforming Growth Factor Beta Receptor 2), 쥣과 백혈병 당단백질 70(gp70), 칼시토닌 관련 폴리펩티드 알파(CALCA: Calcitonin Related Polypeptide Alpha), 세포 예정사 1 리간드 1(Programmed Cell Death 1 Ligand 1)(CD274), 마우스 이중 극미 2 상동체(mdm-2: Mouse Double Minute-2), 알파-액티닌-4, 신장 인자 2, 말산 효소 1(ME1: Malic Enzyme 1), 핵 전사인자 Y 서브유닛 C(NFYC: Nuclear Transcription Factor Y Subunit C), G 항원 1,3(GAGE-1,3), 흑색종 항원-A6(MAGE-A6), 암 정소 항원 XAGE-1b, 전립선의 6회 막관통 상피 항원 1(STEAP1: six transmembrane epithelial antigen of the prostate 1), PAP, 전립선 특이적 항원(PSA: prostate specific antigen), 섬유아세포 성장 인자 5(FGF5: Fibroblast Growth Factor 5), 열 충격 단백질 hsp70-2, 흑색종 항원-A9(MAGE-A9), Arg-특이적 ADP-리보실트랜스퍼라아제 패밀리 C(ARTC1), B-Raf 원종양유전자(B-RAF), 세린/트레오닌 키나아제, 베타-카테닌, 세포 분열 주기 27 상동체(Cdc27: Cell Division Cycle 27), 사이클린 의존성 키나아제 4(CDK4: cycline dependent kinase 4), 사이클린 의존성 키나아제 12(CDK12), 사이클린 의존성 키나아제 억제인자 2A(CDKN2A), 카제인 키나아제 1 알파 1(CSNK1A1: Casein Kinase 1 Alpha 1), 피브로넥틴 1(FN1: Fibronectin 1), 성장 정지 특이적 7(GAS7: Growth Arrest Specific 7), 당백질 비전이성 흑색종 단백질 B(GPNMB: Glycoprotein nonmetastatic melanoma protein B), HAUS 오그민 유사 복합체 서브유닛 3(HAUS3), LDLR-푸코실트랜스퍼라아제, T 세포에 의해 인식되는 흑색종 항원 2(MART2: Melanoma Antigen Recognized By T-Cells 2), 마이오스타틴(MSTN: myostatin), 흑색종 관련 항원(돌연변이된) 1(MUM-1-2-3), 폴리(A) 폴리머라아제 감마(네오(neo)-PAP), 미오신 I형, 단백질 포스파타아제 1 조절 서브유닛 3B(PPP1R3B), 페록시레독신-5(PRDX5), 수용체형 티로신-단백질 포스파타아제 카파(PTPRK), 형질전환 단백질 N-Ras(N-ras), 망막모세포종 관련 인자 600(RBAF600: retinoblastoma-associated factor 600), 시르투인-2(SIRT2), SNRPD1, 트리오스포스페이트 이소머라아제, 눈백색증 1형 단백질(OA1: Ocular Albinism Type 1 Protein), RAS 종양유전자 패밀리 구성원(RAB38), 티로시나아제 관련 단백질 1-2(TRP-1-2), 흑색종 항원 Gp75(gp75), 티로시나아제, 멜란-A(MART-1), 당단백질 100 흑색종 항원(gp100), N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제 V 유전자(GnTVf), 림프구 항원 6 복합체 유전자좌 K(LY6K), 흑색종 항원-A10(MAGE-A10), 흑색종 항원-A12(MAGE-A12), 흑색종 항원-C2(MAGE-C2), 흑색종 항원 NA88-A, 택솔 내성 관련 단백질 3(TRAG-3), PDZ 결합 키나아제(pbk), 카스파아제 8(CASP-8), 육종 항원 1(SAGE), 절단점군 영역-아벨슨 종양유전자(BCR-ABL: Breakpoint Cluster Region-Abelson oncogene), 백혈병 내 융합 단백질, dek-can, 신장 인자 Tu GTP 결합 도메인 함유 2(EFTUD2: Elongation Factor Tu GTP Binding Domain Containing 2), ETS 변이 유전자 6/급성 골수성 백혈병 융합 단백질(ETV6-AML1), FMS 유사 티로신 키나아제-3 내부 순차 중복(FLT3-ITD: FMS-like tyrosine kinase-3 internal tandem duplications), 사이클린-A1, 피브로넥틴 III형 도메인 함유 3B(FDNC3B), 전골수구성 백혈병/레티노산 수용체 알파 융합 단백질(pml-RAR알파), 흑색종 항원-C1(MAGE-C1), 막 단백질 선택적 스플라이싱된 이소형(D393-CD20), 흑색종 항원-A4(MAGE-A4), 또는 흑색종 항원-A3(MAGE-A3).
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 2개 이상의 에피토프 중 적어도 하나는 종양 관련 항원 NY-ESO-1, 종양 관련 항원 MAGE-A3 및/또는 종양 관련 항원 pbk로부터 유래한다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 아미노산 서열 LLMWITQCF(서열 번호 1)을 포함하는 종양 관련 항원 NY-ESO-1 유래의 에피토프 및 아미노산 서열 GSPFPAAVI(서열 번호 2)를 포함하는 종양 관련 항원 pbk 유래의 에피토프를 코딩한다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 2개 이상의 에피토프 중 하나는 종양 관련 항원 NY-ESO-1로부터 유래하고 2개 이상의 에피토프 중 하나는 종양 관련 항원 서바이빈으로부터 유래한다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 아미노산 서열 RGPESRLLE(서열 번호 3)를 포함하는 종양 관련 항원 NY-ESO-1 유래의 에피토프 및 아미노산 서열 AFLTVKKQM(서열 번호 4)을 포함하는 종양 관련 항원 서바이빈 유래의 에피토프를 코딩한다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 종양 관련 항원의 3개 이상의 에피토프를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 3개 이상의 에피토프는 동일한 종양 관련 항원의 것이다. 다른 실시양태에서, 3개 이상의 에피토프는 적어도 하나의 상이한 종양 관련 항원으로부터 유래한다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 종양 관련 항원의 8개 이상의 에피토프를 코딩한다. 실시양태에서, 기재된 바와 같은 폴리펩티드는 하기의 암 또는 종양 세포의 표면상에서 또는 하기의 암 또는 종양 세포의 세포기질에서 발현되는 종양 관련 항원의 에피토프, 특히 2개 이상의 에피토프를 코딩한다: 난소암, 유방암, 고환암, 췌장암, 간암, 결장암, 결장직장암, 갑상선암, 폐암, 전립선암, 신장암, 흑색종, 편평세포 암종, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 전골수구성 백혈병, 다발성 골수종, B 세포 림프종, 방광 암종, 두경부암, 식도암, 뇌암, 인두암, 설암, 활막세포 암종, 신경모세포종, 자궁암, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 기저 세포 암종, 표피모양 암종, 선암종, 한선 암종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질 암종, 기관지원성 암종, 신세포 암종, 간세포암, 담도 암종, 융모막 암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름스 종양, 자궁경부암, 소세포 폐 암종, 상피 암종, 교종(glioma), 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 신경교종(neuroglioma), 또는 망막모세포종.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 또한 프로테아제 절단 부위인 프로세싱 부위 또는 효소 절단 부위를 코딩한다. 한 실시양태에서, 효소 절단 부위는 세린 프로테아제 절단 부위이다. 특정 실시양태에서, 세린 프로테아제 절단 부위는 푸린(furin), PC1, PC2, PC4, PC5, PACE4, PC7 또는 이들의 조합으로부터 선택된 단백질에 의해 절단된다. 또 다른 특정 실시양태에서, 세린 프로테아제 절단 부위는 푸린에 의해 절단된다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 효소 절단 부위는 아미노산 서열 XRSKRX(서열 번호 5)(여기서, X는 소수성 아미노산을 나타냄)을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 효소 절단 부위는 아미노산 서열 (R/K)Xn(R/K)(서열 번호 6)(여기서, X는 아미노산을 나타내고 n은 0 내지 6의 정수임)을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 소포체 신호 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 알파바이러스, 인플루엔자 바이러스 기질 단백질 유래 펩티드 M57-68 또는 조직 플라스미노겐 활성화 인자 펩티드로부터 유래한 5' 소포체 신호 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 열 충격 단백질 70, IgG1 Fc 도메인, 리소좀 관련 막 단백질(LAMP: lysosome-associated membrane protein), 파상풍 독소 유니버셜 헬퍼 T(Th) 에피토프, 또는 이. 콜라이(E. coli) 열 불안정성 장독소 B 서브유닛으로부터 선택된 면역원성 단백질을 코딩하는 3' 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 면역자극 단백질을 코딩한다. 예로써, 상기 단백질은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20 내지 IL-36, 케모카인 CCL1 내지 CCL27, CC 케모카인 CXCL1 내지 CXCL13, CXC 케모카인, C 케모카인, CX3C 케모카인, 사이토카인 또는 케모카인 수용체, 가용성 수용체, 형질전환 성장 인자-베타(TGF-β), 또는 종양 괴사 인자-알파(TNFα: Tumor Necrosis Factor-alpha) 중 하나 이상을 제한 없이 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 면역자극 단백질 IL-12를 코딩한다. 또 다른 실시양태에서 폴리뉴클레오티드는 또한 불활성 프로드러그, 예를 들어, 제한 없이, 간시클로버, 아시클로버, 1-(2-데옥시-2-플루오로-β-D-아라비노푸라노실)-5-요오도우라실(FIAU), 6-메톡시퓨린 아라비노시드, 또는 5-플루오로시토신을 세포독성 대사 물질로 전환할 수 있는 하나 이상의 자살 유전자를 포함한다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 자살 유전자는 단순 포진 바이러스(Herpes Simplex Virus)(HSVtk) 또는 수두 대상포진 바이러스(Varicella Zoster Virus)(VZV-tk)로부터 유래할 수 있는 시토신 데아미나아제 또는 티미딘 키나아제를 코딩한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, ~로부터 유래한다는 것은 공급원, 예를 들어, 바이러스, 박테리아, 미생물, 또는 생물학적 공급원으로부터의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 또는 펩티드의 전부 또는 일부(전형적으로는 기능적 또는 활성 부분)로부터 수득하거나, 이로부터 유래하거나, 이로부터 생산한다는 것을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 및 하기에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터에 관한 것이다. 실시양태에서, 바이러스 벡터는 알파바이러스, 렌티바이러스, 또는 레트로바이러스로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 하나 이상의 알파바이러스 바이러스 외피 단백질로 위형화된다(pseudotyped). 한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 알파바이러스 E1 단백질, E2 단백질, E1 및 E2 단백질 둘 다, 또는 이들의 단편을 가진 위형이다. 특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 신드비스 바이러스 벡터 또는 신드비스 바이러스부터 유래한다. 한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 하나 이상의 신드비스 바이러스 외피 단백질로 위형화된다. 한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 신드비스-ZZ E2 단백질 또는 이의 단편을 가진 위형이다. 특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 신드비스-ZZ E2 단백질을 포함할 수 있는 하나 이상의 신드비스 바이러스 외피 단백질로 위형화된 렌티바이러스이다. 특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 신드비스-ZZ E2 단백질을 포함할 수 있는 하나 이상의 신드비스 바이러스 외피 단백질로 위형화된 레트로바이러스이다. 한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 복제 결함 바이러스 벡터이다. 한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 복제 가능(replication-competent) 바이러스 벡터이다. 한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 비통합(non-integrating) 바이러스 벡터이다. 한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 대상체, 바람직하게는 암 또는 종양을 가진 인간 대상체 또는 환자에게 투여 후 하나 이상의 종양 관련 항원의 2개 이상의 에피토프를 발현하는 종양 또는 암에 대해 면역 반응을 유도할 수 있다. 한 실시양태에서, 면역 반응은 종양 관련 항원 에피토프를 발현하는 암 또는 종양 세포를 특이적으로 사멸시키는 세포 독성 T 세포를 생성한다. 상기 모든 실시양태에서, 바이러스 벡터는 코딩되는 산물이 시험관 내 및 생체 내에서 바이러스 벡터와 세포의 접촉 후에 세포에서 발현되는 상기 및 하기에 기재된 폴리뉴클레오티드(미니유전자(minigene)로도 지칭함)를 포함한다.
특정 측면에서, 종양 관련 항원의 5-30개 아미노산을 포함하는 2개 이상의 에피토프로서 각각이 푸린 효소 절단 부위에 의해 분리된 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 신드비스 바이러스 벡터를 제공한다. 또 다른 특정 측면에서, 하나 이상의 신드비스 바이러스 외피 단백질로 위형화된 바이러스 벡터로서, 바이러스 벡터는 종양 관련 항원의 5-30개 아미노산을 포함하는 2개 이상의 에피토프로서 각각이 푸린 효소 절단 부위에 의해 분리된 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터가 제공된다. 실시양태에서, 상기 바이러스 벡터의 2개 이상의 에피토프는 표 1-28 중 어느 하나에 열거된 종양 관련 항원의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 2개 이상의 에피토프는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 종양 관련 항원의 것이다: 칼리크레인 4, PBF, PRAME, WT1, HSDL1, 메소텔린, NY-ESO-1, CEA, p53, Her2/Neu, EpCAM, CA125, 엽산 수용체 α, 정자 단백질 17, TADG-12, MUC-16, L1CAM, 만난-MUC-1, HERV-K-MEL, KK-LC-1, KM-HN-1, LAGE-1, MAGE-A4, Sp17, SSX-4, TAG-1, TAG-2, ENAH, 맘마글로빈-A, NY-BR-1, BAGE-1, MAGE-A1, MAGE-A2, 뮤신k, SSX-2, TRAG-3, c-myc, 사이클린 B1, MUC1, p62, 서바이빈, CD45, DKK1, RU2AS, 텔로머라아제, K-ras, G250, 헵신, 장 카복실 에스테라아제, 알파-태아단백질, M-CSF, PSMA, CASP-5, COA-1, OGT, OS-9, TGF-베타RII, gp70, CALCA, CD274, mdm-2, 알파-액티닌-4, 신장 인자 2, ME1, NFYC, GAGE-1, MAGE-A6, XAGE-1b, PSMA, STEAP1, PAP, PSA, GAGE3, FGF5, 헵신, hsp70-2, MAGE-A9, ARTC1, B-RAF, 베타-카테닌, Cdc27, CDK4, CDK12, CDKN2A, CLLP, CSNK1A1, FN1, GAS7, GPNMB, HAUS3, LDLR-푸코실트랜스퍼라아제, MART2, MATN, MUM-1, MUM-2, MUM-3, 네오-PAP, 미오신 I형, PPP1R3B, PRDX5, PTPRK, N-ras, RBAF600, SIRT2, SNRPD1, 트리오스포스페이트 이소머라아제, OA1, RAB38, TRP-1, gp75, TRP2, 티로시나아제, MART-1, gp100, GnTVf, LY6K, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-C2, NA88-A, TRAG-3, TRP2-INT2g, pbk, CASP-8, SAGE, BCR-ABL, dek-can, EFTUD2, ETV6-AML1, FLT3-ITD, 사이클린-A1, FDNC3B, pml-RAR알파, MAGE-C1, D393-CD20, MAGE-A4, 및 MAGE-A3. 특정 실시양태에서, 2개 이상의 에피토프 중 적어도 하나는 종양 관련 항원 NY-ESO-1로부터 유래하고 2개 이상의 에피토프 중 적어도 하나는 종양 관련 항원 서바이빈 또는 pbk로부터 유래한다. 특정 실시양태에서, 종양 관련 항원 NY-ESO-1 유래의 에피토프는 아미노산 서열 LLMWITQCF(서열 번호 1) 또는 아미노산 서열 RGPESRLLE(서열 번호 3)를 포함하고, 종양 관련 항원 서바이빈 유래의 에피토프는 아미노산 서열 AFLTVKKQM(서열 번호 4)을 포함하고, 종양 관련 항원 pbk 유래의 에피토프는 아미노산 서열 GSPFPAAVI(서열 번호 2)를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 2개 이상의 에피토프 중 하나는 종양 관련 항원 NY-ESO-1로부터 유래하고 바이러스 벡터에 의해 코딩되는 2개 이상의 에피토프 중 하나는 종양 관련 항원 서바이빈으로부터 유래한다. 또 다른 실시양태에서, 종양 관련 항원 NY-ESO-1 유래의 에피토프는 아미노산 서열 RGPESRLLE(서열 번호 3)를 포함하고 종양 관련 항원 서바이빈 유래의 에피토프는 아미노산 서열 AFLTVKKQM(서열 번호 4)을 포함한다. 한 실시양태에서, 바이러스 벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 종양 관련 항원의 3개 이상의 에피토프 또는 8개 이상의 에피토프를 코딩한다. 실시양태에서, 바이러스 벡터는 하기의 암 또는 종양 세포의 표면상에서 또는 하기 암 또는 종양 세포의 세포기질에서 발현되는 종양 관련 항원의 에피토프, 특히, 2개 이상의 에피토프를 코딩한다: 난소암, 유방암, 고환암, 췌장암, 간암, 결장직장암, 갑상선암, 폐암, 전립선암, 신장암, 흑색종, 편평세포 암종, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 전골수구성 백혈병, 다발성 골수종, B 세포 림프종, 방광 암종, 두경부암, 식도암, 뇌암, 인두암, 설암, 활막세포 암종, 신경모세포종, 자궁암, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 기저 세포 암종, 표피모양 암종, 선암종, 한선 암종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질 암종, 기관지원성 암종, 신세포 암종, 간세포암, 담도 암종, 융모막 암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름스 종양, 자궁경부암, 소세포 폐 암종, 상피 암종, 교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 신경교종, 또는 망막모세포종. 한 실시양태에서, 상기 신드비스 또는 위형 바이러스 벡터는 선택적으로 알파바이러스, 인플루엔자 바이러스 기질 단백질 유래 펩티드 M57-68 또는 조직 플라스미노겐 활성화 인자 펩티드로부터 유래하는 5' 소포체 신호 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 열 충격 단백질 70, IgG1 Fc 도메인, 리소좀 관련 막 단백질(LAMP), 파상풍 독소 유니버셜 헬퍼 T(Th) 에피토프, 또는 이. 콜라이 열 불안정성 장독소 B 서브유닛으로부터 선택된 면역원성 단백질을 코딩하는 3' 서열을 포함한다. 실시양태에서, 바이러스 벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20 내지 IL-36, 케모카인 CCL1 내지 CCL27, CC 케모카인 CXCL1 내지 CXCL13, CXC 케모카인, C 케모카인, CX3C 케모카인, 사이토카인 또는 케모카인 수용체, 가용성 수용체, 형질전환 성장 인자-베타(TGF-β), 또는 종양 괴사 인자-알파(TNFα)로부터 선택된 하나 이상의 면역자극 단백질을 코딩한다. 한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 불활성 프로드러그를 세포독성 대사 물질로 전환할 수 있는 하나 이상의 자살 유전자를 포함한다. 예로써, 불활성 프로드러그는 간시클로버, 아시클로버, 1-(2-데옥시-2-플루오로-β-D-아라비노푸라노실)-5-요오도우라실(FIAU), 6-메톡시퓨린 아라비노시드, 또는 5-플루오로시토신일 수 있다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 자살 유전자는 선택적으로 단순 포진 바이러스(HSVtk) 또는 수두 대상포진 바이러스(VZV-tk)로부터 유래하는 시토신 데아미나아제 또는 티미딘 키나아제를 코딩한다. 한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 대상체, 바람직하게는 암 또는 종양을 가진 인간 대상체 또는 환자에게 투여 후 하나 이상의 종양 관련 항원의 2개 이상의 에피토프를 발현하는 종양 또는 암에 대해 면역 반응을 유도할 수 있다. 한 실시양태에서, 면역 반응은 종양 관련 항원 에피토프를 발현하는 암 또는 종양 세포를 특이적으로 사멸시키는 세포 독성 T 세포를 생성한다. 상기 모든 실시양태에서, 신드비스 바이러스 또는 위형 바이러스 벡터는 코딩되는 산물이 시험관 내 및 생체 내에서 바이러스 벡터와 세포의 접촉 후에 발현되는 상기 및 하기에 기재된 폴리뉴클레오티드(미니유전자로도 지칭함)를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면으로서, 상기 및 하기에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 하나 이상의 유전자 조작된 신드비스 바이러스 외피 단백질로 위형화된 렌티바이러스 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 및 하기에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 하나 이상의 유전자 조작된 신드비스 바이러스 외피 단백질로 위형화된 렌티바이러스 벡터로서, 폴리뉴클레오티드는 NY-ESO-1, MAGE-A3, pbk, 서바이빈, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 종양 관련 항원의 에피토프를 코딩하는 것인 벡터가 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 바이러스 벡터, 예를 들어, 상기 및 하기에 기재된 신드비스 바이러스 벡터 또는 위형 바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 입자를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 및 하기에 기재된 알파바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 이들의 위형 벡터를 포함하는 바이러스 입자를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 및 하기에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 또한 상기 및 하기에 기재된 바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 상기 및 하기에 기재된 바이러스 입자를 포함하는 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 상기 및 하기에 기재된 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 및/또는 바이러스 벡터, 및 약학적으로 허용되는 비히클, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 약학 조성물은 액체 제형이다.
또 다른 측면에서, 둘 이상의 종양 관련 항원의 1개 이상의 에피토프를 발현하는 암 또는 종양 세포에 대해 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 벡터 및/또는 암 또는 종양 세포에 대해 면역 반응을 유도하기 위해서, 상기 및 하기에 기재된 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 바이러스 벡터, 및/또는 약학 조성물의 유효량d을 암 또는 종양 세포와 접촉하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 면역 반응은 종양 관련 항원 에피토프를 발현하는 암 또는 종양 세포를 특이적으로 사멸시키는 세포독성 T 세포를 생성한다. 또 다른 측면에서, 암 또는 종양 형성을 갖고 있거나 가질 위험이 있는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 대상체에서 암을 치료하기 위해서 상기 및 하기에 기재된 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 바이러스 벡터, 및/또는 약학 조성물의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 상기 방법의 실시양태에서, 대상체는 바람직하게는 하기 중 하나 이상으로부터 선택된 암 또는 종양을 갖고 있거나 가질 위험이 있는 인간 환자이다: 난소암, 자궁경부암, 자궁암, 유방암, 고환암, 췌장암, 간암, 결장직장암, 갑상선암, 폐암, 전립선암, 신장암, 흑색종, 편평세포 암종, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 전골수구성 백혈병, 다발성 골수종, B 세포 림프종, 방광 암종, 두경부암, 식도암, 뇌암, 인두암, 설암, 활막세포 암종, 신경모세포종, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 기저 세포 암종, 표피모양 암종, 선암종, 한선 암종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질 암종, 기관지원성 암종, 신세포 암종, 간세포암, 담도 암종, 융모막 암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름스 종양, 소세포 폐 암종, 상피 암종, 교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 신경교종, 또는 망막모세포종. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 대상체의 암은 난소암, 자궁경부암, 유방암, 또는 결장암 중 하나 이상이다. 상기 방법의 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 바이러스 벡터, 또는 약학 조성물은 하나 이상의 종양 관련 항원 NY-ESO-1, p53, sp17, 서바이빈, pbk, CEA, CA125, 또는 WT1의 2개 이상의 에피토프를 코딩한다. 상기 방법의 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 바이러스 벡터, 또는 약학 조성물은 비경구적으로 또는 예방제로서 투여된다. 상기 방법의 실시양태에서, 대상체는 또한 화학요법 또는 방사선으로 치료된다. 상기 방법의 한 실시양태에서, 대상체의 이펙터 T 세포의 수준을 측정하여 평가되는 대상체의 면역 반응의 감소 후, 대상체에게 부스터(booster)가 투여된다. 한 실시양태에서, 부스터는 복제 결합 아데노바이러스 벡터, 예를 들어 아데노바이러스 또는 아데노 관련 바이러스를 포함하는 이종 부스터이다. 한 실시양태에서, 아데노바이러스 부스터 벡터는 둘 이상의 종양 관련 항원의 1개 이상의 에피토프로서 각각이 효소 절단 부위와 같은 프로세싱 부위에 의해 분리된 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 에피토프는 표 1-28 중 어느 하나에 열거된 종양 관련 항원, 예시적으로 하기의 아미노산 서열을 포함한다: 칼리크레인 4, PBF, PRAME, WT1, HSDL1, 메소텔린, NY-ESO-1, CEA, p53, Her2/Neu, EpCAM, CA125, 엽산 수용체 α, 정자 단백질 17, TADG-12, MUC-16, L1CAM, 만난-MUC-1, HERV-K-MEL, KK-LC-1, KM-HN-1, LAGE-1, MAGE-A4, Sp17, SSX-4, TAG-1, TAG-2, ENAH, 맘마글로빈-A, NY-BR-1, BAGE-1, MAGE-A1, MAGE-A2, 뮤신k, SSX-2, TRAG-3, c-myc, 사이클린 B1, MUC1, p62, 서바이빈, CD45, DKK1, RU2AS, 텔로머라아제, K-ras, G250, 헵신, 장 카복실 에스테라아제, 알파-태아단백질, M-CSF, PSMA, CASP-5, COA-1, OGT, OS-9, TGF-베타RII, gp70, CALCA, CD274, mdm-2, 알파-액티닌-4, 신장 인자 2, ME1, NFYC, GAGE-1, MAGE-A6, XAGE-1b, PSMA, STEAP1, PAP, PSA, GAGE3, FGF5, 헵신, hsp70-2, MAGE-A9, ARTC1, B-RAF, 베타-카테닌, Cdc27, CDK4, CDK12, CDKN2A, CLLP, CSNK1A1, FN1, GAS7, GPNMB, HAUS3, LDLR-푸코실트랜스퍼라아제, MART2, MATN, MUM-1, MUM-2, MUM-3, 네오-PAP, 미오신 I형, PPP1R3B, PRDX5, PTPRK, N-ras, RBAF600, SIRT2, SNRPD1, 트리오스포스페이트 이소머라아제, OA1, RAB38, TRP-1, gp75, TRP2, 티로시나아제, MART-1, gp100, GnTVf, LY6K, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-C2, NA88-A, TRAG-3, TRP2-INT2g, pbk, CASP-8, SAGE, BCR-ABL, dek-can, EFTUD2, ETV6-AML1, FLT3-ITD, 사이클린-A1, FDNC3B, pml-RAR알파, MAGE-C1, D393-CD20, MAGE-A4, 또는 MAGE-A3. 한 실시양태에서, 부스터는 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 바이러스 벡터, 또는 약학 조성물의 투여 후 적어도 1일 내지 적어도 2주에 대상체에게 투여된다. 상기 방법의 한 실시양태에서, 상기 및 하기에 기재된 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 바이러스 벡터, 또는 약학 조성물의 투여, 또는 이용되는 경우 부스팅은 대상체에서 에피토프 확산을 일으킨다. 실시양태에서, 상기 및 하기에 기재된 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 또는 바이러스 벡터는 또한 CD4+ T 세포 반응을 유도하기 위한 아미노산 서열 AKFVAAWTLKAAA(서열 번호 7)를 코딩하는 핵산을 포함한다.
본 발명은 상기 및 하기에 기재된 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터, 바이러스 입자, 및 약학 조성물을 사용하여 포유동물의 암 또는 종양의 치료, 예방 또는 병용 치료 및 예방 요법을 제공한다.
본 발명의 특정 측면은, 예를 들어 하나 이상의 종양 관련 항원의 5-50개 아미노산 또는 5-30개 아미노산을 포함하는 2개 이상의 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 분자적으로 조작된 비통합 알파바이러스 벡터(예를 들어, 신드비스 바이러스 벡터)로서, 각 에피토프 서열은 종양 관련 항원 에피토프 폴리펩티드 및 펩티드 산물의 세포 내 프로세싱에 있어 재현성을 위한 효소 절단 부위, 예를 들어 푸린 효소 절단 부위와 같은 프로세싱 부위에 의해 분리되는 것인 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 또한 본원에 기재된 바이러스 벡터 및 바이러스 입자에 의해 유발되는 종양 관련 항원 에피토프에 대한 면역 반응, 및 이의 치료 및/또는 예방 용도를 향상시키고 개선하기 위해서, 하나 이상의 신항원(neo-antigen), 사이토카인, 케모카인, 항체, 돌연변이 종양유전자, 또는 과발현된 종양유전자를 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 본원에 기재된 신드비스 바이러스 벡터는 종양 관련 항원의 다중 에피토프에 대해 CD8+ T 세포 반응을 포함하는 강한 T 세포 반응을 유발한다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터, 또는 바이러스 입자의 알파바이러스 단백질 또는 또는 이의 단편은 하기 중 하나 이상으로부터 유래한다: 바마 포레스트 바이러스(Barmah Forest virus), 바마 포레스트 바이러스 복합체, 동부 말 뇌염 바이러스(EEEV: Eastern equine encephalitis virus), 동부 말 뇌염 바이러스 복합체, 미델뷔르흐 바이러스(Middelburg virus), 미델뷔르흐 바이러스 복합체, 엔두무 바이러스(Ndumu virus), 엔두무 바이러스 복합체, 셈리키 포레스트 바이러스(Semliki Forest virus), 셈리키 포레스트 바이러스 복합체, 베바루 바이러스(Bebaru virus), 치쿤구니아 바이러스(Chikungunya virus), 마야로 바이러스(Mayaro virus), 아형 우나 바이러스(Subtype Una virus), 오니옹 니옹 바이러스(O'Nyong Nyong virus), 아형 이그보-오라 바이러스(Subtype Igbo-Ora virus), 로스 리버 바이러스(Ross River virus), 아형 게타 바이러스(Subtype Getah virus), 아형 베바루 바이러스, 아형 사기야마 바이러스(Subtype Sagiyama virus), 아형 메 트리 바이러스(Subtype Me Tri virus), 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV: Venezuelan equine encephalitis virus), VEEV 복합체, 카바쏘우 바이러스(Cabassou virus), 에버글레이즈 바이러스(Everglades virus), 모쏘 다스 페드라스 바이러스(Mosso das Pedras virus), 무캄보 바이러스(Mucambo virus), 파라마나 바이러스(Paramana virus), 픽수나 바이러스(Pixuna virus), 서부 말 뇌염 바이러스(WEEV: Western equine encephalitis virus), 리오 네그로 바이러스(Rio Negro virus), 트로카라 바이러스(Trocara virus), 아형 비주 브릿지 바이러스(Subtype Bijou Bridge virus), 서부 말 뇌염 바이러스 복합체, 아우라 바이러스(Aura virus), 바반키 바이러스(Babanki virus), 키질라가크 바이러스(Kyzylagach virus), 신드비스 바이러스, 옥켈보 바이러스(Ockelbo virus), 와타로아 바이러스(Whataroa virus), 버기 크릭 바이러스(Buggy Creek virus), 포트 모건 바이러스(Fort Morgan virus), 하이랜즈 J 바이러스(Highlands J virus), 에일라트 바이러스(Eilat virus), 연어 췌장 질환 바이러스(SPDV: Salmon pancreatic disease virus), 남방 코끼리 물범 바이러스(SESV: Southern elephant seal virus), 타이 포레스트 바이러스(Tai Forest virus), 또는 토네이트 바이러스(Tonate virus).
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다. 하기 참고 문헌은 당업자에게 본 발명에서 사용되는 많은 용어의 일반적인 정의를 제공한다[Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al.(eds.), Springer Verlag(1991); 및 Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)]. 본원에서 사용되는 바와 같이, 하기 용어는 달리 명시되지 않는 한, 하기에 그들에 부여된 의미를 갖는다.
"약제(agent)"는 펩티드, 폴리펩티드, 핵산 분자, 또는 소분자 화합물, 항체, 또는 이의 단편을 의미한다.
"변경"은 본원에서 기재되는 것과 같이 공지된 표준 기술 방법에 의해 검출되는 유전자 또는 폴리펩티드의 발현 수준 또는 활성의 변화(증가 또는 감소)를 의미한다. 본원에서 사용되는 변경은 발현 수준의 10% 변화, 발현 수준의 25% 변화, 40% 변화, 또는 50% 이상의 변화를 포함한다.
"개선하다" 및 "개선"은 질환의 발생 또는 진행을 감소, 억제, 약화, 축소, 정지, 또는 안정화시키는 것을 의미한다.
"유사체" 또는 "유도체"는 동일하지는 않지만 비슷한 기능적 또는 구조적 특징을 갖는 분자를 의미한다. 예를 들어, 폴리펩티드 유사체는 천연 발생 폴리펩티드에 비해 유사체의 기능을 향상시키는 특정 생화학적 변형을 가지면서, 상응하는 천연 발생 폴리펩티드의 생물학적 활성을 보유한다. 이러한 생화학적 변형은 예를 들어 리간드 결합을 변화시키지 않으면서 유사체의 프로테아제 내성, 막 투과성 또는 반감기를 증가시킬 수 있다. 유사체는 비천연 아미노산을 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "항원"은 체액성 또는 세포 매개 면역 반응을 유도할 수 있는 물질을 지칭한다. 항원은 예를 들어 항체의 생성을 유도하거나 T 세포 수용체의 활성화를 통해 T 세포 활성을 자극할 수 있다. 항원은 전형적으로 단백질 또는 다당류이며, 박테리아, 바이러스, 및 다른 미생물(예를 들어, 코트, 캡슐, 세포벽, 캡시드, 편모, 및 독소)의 성분일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어는 시험관 내 또는 생체 내에서 항체 또는 항체 단편에 의해 그리고 적응 및 선천성 면역계에 의해 인식될 수 있는 모든 물질을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 암과 같은 세포 증식 질환(예를 들어, 본원에 기재된 암)에 적용될 때 용어 "위험이 있음"은 종양 감소 수술을 받은 환자 또는 암의 가족력이 있고/거나 유전적 위험 인자 유전자를 가진 것으로 진단받는 개체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "담체"는, 예를 들어 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터, 또는 바이러스 입자를 포함하는 조성물 또는 약학 조성물이 함께 투여될 수 있는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 약학적 및 약학적으로 허용되는 담체는 석유, 동물, 식물 또는 합성 유래의 것을 포함하는 물 및 오일과 같은 무균 액체, 예를 들어 땅콩유, 대두유, 광유, 참기름을 포함한다. 물 또는 식염수 용액 및 수성 덱스트로오스 및 글리세롤 용액이 특히 주사액을 위한, 담체로서 사용될 수 있다. 또한, 담체는 결합제(압축된 환제일 경우), 활택제, 캡슐화제, 착 향제, 및 착색제 중 하나 이상을 포함하나 이에 제한되지 않는 고체 제형을 포함할 수 있다. 적합한 약학 담체는 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin]에 기재되어 있다.
본 명세서에서, "포함하다(comprise)", "포함하는(comprising, containing)" 및 "갖는(having)" 등은 미국 특허법에서 그들에게 부여된 의미를 가질 수 있으며 "포함한다(include)", "포함한(including)" 등을 의미할 수 있다. "~로 본질적으로 이루어진" 또는 "본질적으로 이루어진다"는 것은 미국 특허법에서 부여된 의미를 가지며, 용어는 개방적이며, 열거된 것의 기본적 또는 새로운 특징이 열거된 것 이상의 존재에 의해 변화되는 않고 종래 기술의 실시양태를 배제하기만 한다면 열거된 것 이상의 존재를 허용한다.
"검출"은 검출할 분자, 화합물, 또는 약제의 존재, 부재 또는 양을 확인하는 것을 지칭한다.
"검출 가능한 표지"는 분광학, 광화학, 생화학적, 면역 화학적 또는 화학적 수단을 통해 관심 분자에 결합될 때 이를 검출 가능하게 만드는 조성물을 의미한다. 예를 들어, 유용한 표지에는 방사성 동위 원소, 자성 비드, 금속 비드, 콜로이드 입자, 형광 염료, 전자 밀도가 높은 시약, 효소(예를 들어, ELISA에서 일반적으로 사용되는 것), 비오틴, 디곡시제닌 또는 합텐이 포함된다.
"질환"은 암이나 종양 형성과 같은 세포, 조직, 기관 또는 신체의 일부의 정상적인 기능에 악영향을 미치거나 이들을 손상시키거나 방해하는 모든 상태 또는 장애를 의미한다.
"유효량"은 치료받지 않은 환자에 비해 질환의 증상을 개선하는데 필요한 양을 의미한다. 질환의 치료 요법을 위해 본 발명을 실행하는데 사용되는 활성 화합물(들)의 유효량은 투여 방식, 대상체의 연령, 체중 및 일반적인 건강 상태에 따라 달라진다. 궁극적으로, 주치의 또는 수의사는 적절한 양 및 용량 요법을 결정할 것이다. 이러한 양을 "유효"량이라고 한다. 한 실시양태에서, 유효량은 암세포의 증식 속도를 감소시키거나 안정화하는데 필요한 본 발명의 약제의 양이다. 또 다른 실시양태에서, 유효량은 암세포의 생존을 감소시키는데 필요한 본 발명의 약제의 양이다. 또 다른 실시양태에서, 유효량은 암세포의 사멸을 유도하는데 필요한 본 발명의 약제의 양이다.
본원에서 사용되는 용어 "내인성"은 특정 생물체(예를 들어, 인간) 또는 생물체 내의 특정 위치(예를 들어, 기관, 조직, 또는 세포, 예를 들어, 인간 세포)에서 자연적으로 발견되는 분자(예를 들어, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 또는 보조 인자)를 의미한다.
본원에 사용되는 용어 "에피토프" 또는 "항원 결정기"는 리간드, 항체 또는 T 세포 수용체가 (예를 들어, 면역 반응 유도 중에) 결합을 할 수 있는 항원(예를 들어, 종양 관련 항원) 상의 부위, 예를 들어 아미노산 서열을 지칭하며, 인접한 아미노산 또는 단백질의 3차 접힘에 의해 공간적으로 근위가 되는 불연속 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 다른 에피토프는 4차 구조에 의해, 예를 들어 몇몇 폴리펩티드의 어셈블리에 의해 형성된다. 인접한 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 노출시 유지되는 반면, 3차 또는 4차 접힘에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매로 처리시 손실된다. 에피토프는 예를 들어, 특징적인 공간적 형태로 존재할 수 있는 3-30개 아미노산 잔기 또는 5-30개, 또는 5-25개 아미노산 잔기, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 에피토프의 공간적 형태를 결정하는 방법은 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 x-선 결정학 및 2차원 핵자기 공명(NMR: nuclear magnetic resonance)을 포함한다. 이러한 방법은 예를 들어, 문헌[Morris, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, (1996)]에서 자세히 설명된다.
본원에서 사용되는 용어 "에피토프 확산"("항원 확산"으로도 지칭됨)은 자가 또는 외래 항원 또는 단백질에 대해 지시되는 초기의 집중된 에피토프 특이적 면역 반응(예를 들어, 세포 독성 T 세포에 의한)으로부터 단백질(분자 내 확산) 또는 다른 단백질(분자 간 확산) 상의 다음으로 우세하고(subdominant)/거나 잠재적이거나, 돌연변이된 에피토프로의 에피토프 특이성의 다양화를 나타낸다. 에피토프 확산은 종양 개체군에서 탈출 변이체의 가능성을 감소시키면서 환자의 면역계가 면역계의 세포(예를 들어, 세포 독성 T 세포)에 의해 처음에는 인식되지 않는 추가 에피토프에 대한 면역 반응을 시작하는 것을 가능하게 할 수 있어서, 질환(암)의 진행을 약화시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 벡터로 백신접종 후, 본래 백신 제제에 존재하지 않은 종양 관련 항원에 반응하는 T 세포가 생성되어, 종양 세포로부터 유래한 항원으로 2차 T 세포 초회 자극(priming)이 발생하였음을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "외인성"은 특정 생물체(예를 들어, 인간)에서 또는 생물체 내 특정 위치(예를 들어, 기관, 조직, 또는 세포, 예를 들어 인간 세포)에서 자연적으로 또는 내인성으로 발견되지 않는 분자(예를 들어, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 또는 보조 인자)를 지칭한다. 외인성 물질은 외부 공급원으로부터 생물체로 또는 이로부터 추출된 배양물에 제공되는 물질을 포함한다.
"단편"은 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 일부를 의미한다. 이 일부는 기준 핵산 분자 또는 폴리펩티드의 전체 길이의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%를 포함한다. 단편은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000개 뉴클레오티드 또는 아미노산을 포함할 수 있다
본원에서 사용되는 용어 "면역 반응"은 면역계에 의해 외래 또는 이종으로서 인식되는 하나 이상의 항원(예를 들어, 면역원성 단백질 또는 펩티드) 및/또는 항원의 에피토프에 대한 대상체의 면역계 반응 또는 반응을 나타낸다. 면역 반응에는 세포 매개 면역 반응(즉, 이펙터 T 세포, 예를 들어 항원 특이적 또는 비특이적 T 세포, 예를 들어 CD8+ T 세포, Th1 세포, Th2 세포, 및 Th17 세포에 의해 매개되는 반응), 및 체액성 면역 반응(즉, B 세포 활성화 및 항원 특이적 항체의 생산을 특징으로 하는 반응)이 둘 다 포함된다. 용어 "면역 반응"은 항원 또는 면역원(예를 들어, 종양 관련 항원 및/또는 이와 관련된 에피토프)에 대한 선천성 면역 반응과 획득 면역의 결과인 기억 반응을 둘 다 포함하며 B 세포 또는 T 세포, 또는 둘 다를 포함할 수 있다.
용어 "단리된", "정제된" 또는 "생물학적으로 순수한"은 천연 상태로 발견되는 바와 같이 일반적으로 동반되거나 결합된 성분이 변화하는 정도까지 없는 물질을 지칭한다. "단리"는 본래의 출처 또는 주변과의 분리 정도를 나타낸다. "정제"는 단리보다 높은 분리 정도를 나타낸다. "정제된" 또는 "생물학적으로 순수한" 단백질은 불순물이 단백질의 생물학적 특성에 실질적으로 전혀 영향을 미치지 않거나 기타 불리한 결과를 일으키지 않을 정도로 다른 물질이 충분히 없다. 즉, 핵산 또는 펩티드는 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 때 세포 물질, 바이러스 물질, 또는 배양 배지, 또는 화학적으로 합성될 때 화학 전구물질 또는 다른 화학 물질이 실질적으로 없는 경우 정제된 것이다. 순도 및 동질성은 전형적으로 분석 화학 기술, 예를 들어 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 결정된다. 용어 "정제된"은 핵산, 단백질 또는 펩티드가 전기영동 겔에서 본질적으로 하나의 밴드가 생기게 한다는 것을 나타낼 수 있다. 변형, 예를 들어, 인산화 또는 글리코실화될 수 있는 단백질일 경우, 상이한 변형은 별도로 정제될 수 있는 상이한 단리 단백질을 생성할 수 있다.
"단리된 폴리뉴클레오티드"는 본 발명의 핵산 분자가 유래한 생물체의 자연 발생 게놈에서 유전자의 측면에 있는 유전자가 없는 핵산(예를 들어, DNA)을 의미한다. 따라서, 이 용어는 예를 들어 벡터; 자율적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스; 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA로 혼입되거나; 다른 서열과 독립적인 별개의 분자(예를 들어, PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제 분해로 생성된 cDNA 또는 게놈 또는 cDNA 단편)로서 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 또한, 이 용어는 DNA 분자뿐만 아니라 추가 폴리펩티드 서열을 코딩하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA로부터 전사되는 RNA 분자를 포함한다.
"단리된 폴리펩티드"란 자연적으로 동반되는 성분로부터 분리된 폴리펩티드를 의미한다. 전형적으로, 폴리펩티드는 그가 자연적으로 결합된 단백질 및 자연 발생 유기 분자가 없이, 60 중량% 이상일 때 단리된 것이다. 바람직하게는, 제제는 75 중량% 이상, 또는 85 중량% 이상, 또는 90 중량% 이상, 또는 99 중량% 이상의 목적하는 폴리펩티드이다. 단리된 폴리펩티드는 예를 들어, 천연 공급원으로부터의 추출에 의해, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 핵산의 발현에 의해; 또는 단백질을 화학적으로 합성함으로써 수득할 수 있다, 순도는 임의의 적절한 방법, 예를 들어, 칼럼 크로마토그래피, 폴리아크릴 아미드 겔 전기영동 또는 HPLC 분석에 의해 측정할 수 있다.
"마커"는 질환 또는 장애와 관련된 발현 수준 또는 활성이 변화되는 임의의 단백질 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
본원에서 언급되는 "네오-에피토프(neo-epitope)"는 면역계에 의해 이전에 인식된 적이 없는 새로 형성된(또는 네오) 에피토프(예를 들어, 항원 결정기)이다. 네오-에피토프는 새로 형성된 항원인 신항원 상의 에피토프를 포함한다. 종종 종양 항원과 관련된 신항원이 종양발생 세포에서 발견된다. 기재된 바이러스 벡터 내에서, 돌연변이된 네오-에피토프를 가진 많은 양의 단백질이 생성되어 면역계의 항원 제시 세포의 세포질로 분비되고, 여기서 이들 단백질이 프로세싱되어 종양 특이적 T 세포를 활성화하는데 사용되고, 종양 특이적 T 세포는 그 후 암세포를 표적화하여 파괴할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어, "약제를 수득하는 것"에서 "수득하는 것"은 약제를 합성, 구입 또는 그 외 획득하는 것을 포함한다.
"폴리뉴클레오티드"는 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 예를 들어, 이중 가닥(ds: double-stranded) DNA 폴리뉴클레오티드, 단일 가닥(ss: single-stranded) DNA 폴리뉴클레오티드, dsRNA 폴리뉴클레오티드, 또는 ssRNA 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 이 용어는 후속적으로 번역되어 하나 이상의 선택적 RNA 프로세싱 단계(예를 들어, RNA 스플라이싱에 의한 인트론 절제, 또는 5' 캡 또는 3' 폴리아데닐 꼬리의 결찰) 후에 폴리펩티드를 생산할 수 있는 RNA 전사체를 형성하도록 전사될 수 있는 양성 센스(즉, 단백질 코딩) DNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 용어는 하나 이상의 선택적 RNA 프로세싱 단계 후에 폴리펩티드를 생산하도록 바로 번역될 수 있는 양성 센스 RNA 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 본원에서 사용되는 폴리뉴클레오티드는 신드비스 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터 내에 포함될 수 있다. 본원에서 사용되는 "미니유전자"는 분자적으로 조작된 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 종양 관련 항원(TAA)과 같은 항원의 적어도 하나, 바람직하게는 2개 이상의 에피토프, 또는 둘 이상의 종양 관련 항원의 하나 이상, 바람직하게는 2개 이상의 에피토프를 코딩하도록 설계된, 상이한 성분을 코딩하는 서열을 포함하는 다중 유전자 구조물을 지칭한다. 2개 이상의 에피토프는 동일한 종양 관련 항원 또는 상이한 종양 관련 항원으로부터 유래할 수 있다. 미니유전자 폴리뉴클레오티드는 에피토프 코딩 서열 이외에도 골격 또는 모티프 서열(예를 들어, 하나 이상의 효소 절단 부위) 및 프로세싱 서열, 예를 들어 리보솜 결합 부위, 신호 서열(예를 들어, 소포체 신호 서열), 5' 측면 영역 및 3' 정지 코돈 서열을 제한 없이 포함하는 핵산 서열을 또한 포함할 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 다른 항원(예를 들어, 종양 관련 항원), 세포 수용체 및 면역자극 또는 면역조절 분자, 예를 들어 사이토카인, 케모카인, 세포 신호전달 분자 등을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 서열의 일부 또는 전부는 폴리뉴클레오티드에 포함될 수 있다. 미니유전자는 양성 센스 폴리뉴클레오티드의 생산을 위한 주형으로 작용하는, 음성 센스 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드와 같은 폴리뉴클레오티드 일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는"은 생리학적으로 견딜 수 있고 전형적으로 환자(예를 들어, 인간 환자)에게 투여될 때 알레르기 반응 또는 다른 이상 반응, 예를 들어 위장 장애, 어지러움 등을 생성하지 않는 분자체, 생물학적 산물 및 조성물을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "예방하다", "예방하는", "예방", "예방적 요법" 등은 장애 또는 병태가 없지만, 발생할 위험이 있거나 가능성이 있는 대상체에서 장애 또는 병태의 발생 가능성을 감소시키는 것을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "위형(pseudotyped)"은 하나 이상의 외래 바이러스 구조 단백질, 예를 들어 외피 당단백질을 포함하는 바이러스 벡터를 지칭한다. 위형 바이러스는 외피 보유 바이러스의 외피 당단백질 또는 외피 비보유 바이러스의 캡시드 단백질이 원래의 바이러스 게놈 및 게놈 복제 장치의 공급원과 상이한 바이러스로부터 유래하는 것일 수 있다(D.A. Sanders, 2002, Curr . Opin . Biotechnol., 13:437-442). 위형 바이러스의 외래 바이러스 외피 단백질은 숙주 친환성(tropism)을 변화시키거나 바이러스 입자의 안정성을 증가 또는 감소시키는데 이용될 수 있다. 위형 바이러스 벡터의 예로는 야생형 레트로바이러스 또는 렌티바이러스의 외부에서 자연 발생하지 않는 하나 이상의 외피 당단백질, 예를 들어 알파바이러스로부터 유래한 하나 이상의 단백질(예를 들어, 신드비스-ZZ E2 단백질(Morizono, K. et al., 2010, J. Virol., 84(14):6923-6934), 또는 신드비스 E1, E2 및/또는 E3 단백질과 같은 신드비스 바이러스)을 포함하는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스가 포함된다. 위형 바이러스 벡터는 세포를 감염시키고 바이러스 벡터에 내에 포함된 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 "미니유전자"에 의해 코딩되는 단백질을 발현하고 생산할 수 있다.
"감소"는 적어도 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 100%의 부정적인 변형을 의미한다.
"참조(reference)"은 표준 또는 대조 조건을 의미한다.
"특이적으로 결합한다"는 본 발명의 폴리펩티드를 인식하고 결합하지만, 본 발명의 폴리펩티드를 자연적으로 포함하는 샘플, 예를 들어 생물학적 샘플에서 다른 분자를 실질적으로 인식하고 결합하지 않는 화합물 또는 항체를 의미한다.
"대상체"는 인간, 또는 비인간 포유류, 예를 들어 비인간 영장류, 소, 말, 개, 양, 또는 고양이 포유동물을 포함하나 이에 제한되지 않는 포유류를 의미한다. 대상체는 전형적으로 본원에 기재된 특정 질환 또는 병태(예를 들어, 암 또는 종양과 같은 세포 증식 질환)에 대해 치료를 받는 환자, 예를 들어 인간 환자이다. 대상체 및 환자의 예로는 상기 질환 또는 병태에 대해 치료를 받거나, 상기 질환 또는 병태를 가질 위험이 있는 포유동물, 예를 들어 인간이 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "자살 유전자"는, 예를 들어 아폽토시스에 의해, 세포 사멸을 유도할 수 있는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 지칭한다. 자살 유전자는 프로드러그를 세포 독성 분자로 전환할 수 있는 단백질 또는 펩티드를 코딩함으로써 기능을 할 수 있다. 예시적인 자살 유전자는 다른 것들 중에서도 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제(HSV-TK), 시토신 데아미나아제, 니트로리덕타아제, 카복실에스테라아제, 시토크롬 P450, 및 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제(PNP)를 제한 없이 포함한다.
본원에서 제공되는 범위는 범위 내의 모든 값에 대한 단축형으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50으로 이루어진 군 중 임의의 수, 수의 조합, 또는 하위 범위를 포함하는 것으로 이해된다.
본원에서 사용되는 용어 "치료 유효량"은 치료를 필요로 하는 환자에게 투여시 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상을 치료, 진단, 예방 및/또는 그의 개시를 지연시키기에 충분한 치료제의 양을 지칭한다. 일부 경우에, 치료 유효량은 또한 암 또는 종양과 같은 질환 또는 그의 증상이 발생할 위험이 있는 대상체에게 예방적으로(예를 들어, 본격적인 질환의 발생에 앞서) 투여되는 치료제의 양을 지칭할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하다", "치료하는", "치료" 등은 장애 및/또는 그와 관련된 증상을 감소시키거나 개선하는 것을 지칭한다. 배제되지는 않지만, 장애 또는 병태를 치료하는 것은 그와 관련된 장애, 병태 또는 증상이 완전히 제거될 것을 요구하지 않는다는 것을 이해할 것이다. "치료하다" 또는 "치료"는 목적이 바람직하지 않은 생리학적 변화 또는 장애, 예를 들어 암과 같은 세포 증식 장애의 진행을 예방 또는 지연(줄이거나 감소)시키는 치료 요법을 지칭할 수 있다. 유익하거나 바람직한 임상 결과로는 증상의 완화, 질환 정도의 감소, 질환 상태의 안정화(즉, 악화시키지 않음), 질환 진행의 지연 또는 늦추는 것, 질환 상태의 개선 및 경감, 및 관해(부분적 또는 전체적이거나 관계없이)를 검출 가능하거나 검출 가능하지 않거나 관계없이 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 치료가 필요한 자는 병태 또는 장애가 이미 있는 자뿐 아니라 병태 또는 장애를 가질 경향이 있는 자 또는 병태 또는 장애가 예방되어야 하는 자를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "종양 관련 항원" 또는 "TAA"는 암세포, 예를 들어 고형 종양 내 세포에 의해 발현되는 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드를 지칭한다. 종양 관련 항원은 암세포의 표면상에서 발현되거나 비암세포에 비해 과발현되는 단백질 또는 펩티드 항원뿐 아니라 야생형 단백질의 돌연변이로부터 생긴 단백질을 포함한다. 야생형 세포 단백질의 돌연변이로부터 생긴 단백질은 암 또는 종양 세포에서 발생하는 네오-에피토프 및 신항원, 예를 들어 돌연변이된 k-Ras 단백질을 포함한다. 따라서, 종양 관련 항원은 암 또는 종양 세포의 표면상에서 발현되는 세포 표면 수용체 단백질, 예를 들어 막 결합 단백질을 포함한다. 또한, 종양 관련 항원은 암 또는 종양 세포 내에서 발현되는 세포 내, 예를 들어 세포질, 핵, 또는 막 결합 단백질을 포함한다. 종양 관련 항원은 항원의 발현이 특정 유형의 암세포에 제한되는 경우 종양 특이적일 수 있다. 별법으로, 종양 관련 항원은 여러 암에 공통적일 수 있으며, 따라서 다양한 암세포 유형의 표면상에서 발현될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "벡터"는 핵산(예를 들어, 플라스미드와 같은 DNA 벡터), RNA 벡터, 바이러스 또는 다른 적합한 레플리콘(예를 들어, 바이러스 벡터)을 지칭한다. 원핵세포 또는 진핵세포 내로 외인성 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 전달하기 위해 다양한 벡터가 개발되었다. 벡터는 관심 유전자(예를 들어, 종양 관련 항원 및/또는 이의 에피토프를 코딩하는 유전자)를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열뿐 아니라, 예를 들어, 이들 폴리뉴클레오티드 서열의 전사, 번역 및/또는 세포의 게놈으로의 통합을 조절할 수 있는 추가적인 서열 요소를 포함할 수 있다. 벡터는 유전자 전사를 지시하는 프로모터 영역과 같은 조절 서열, 예를 들어 서브게놈 프로모터 영역 및 인핸서 영역을 포함할 수 있다. 벡터는 이들 유전자의 번역 속도를 향상시키거나 유전자 전사에 기인한 mRNA의 안정성 또는 핵 방출을 개선할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열 요소는 발현 벡터 상에 운반되는 유전자의 효율적인 전사를 지시하기 위해, 예를 들어 5' 및 3' 비번역 영역, 내부 리보솜 진입 부위(IRES: internal ribosomal entry site) 및/또는 폴리아데닐화 신호 부위를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "비히클"은 약학 조성물의 용매, 희석제, 또는 담체 성분을 지칭한다.
"실질적으로 동일한"은 참조 아미노산 서열(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 아미노산 서열) 또는 핵산 서열(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 핵산 서열)에 대해 50% 이상의 동일성을 나타내는 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 의미한다. 본원에 기재된 핵산 서열). 바람직하게는, 이러한 서열은 예를 들어, 지정된 비교 창에 대해서, 아미노산 수준 또는 핵산에서 비교에 사용되는 서열과 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 또는 85%, 가장 바람직하게는 90%, 95% 또는 심지어 99% 동일하다. 최적 정렬은 니들만 및 분쉬(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol . Biol., 48:443)의 상동성 정렬 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다. 2개의 펩티드 또는 폴리펩티드 서열이 실질적으로 동일하다는 표시는, 실질적으로 동일하다고 간주하는 2개의 폴리펩티드에 교차 반응성이 요구되지는 않지만, 하나의 펩티드 또는 폴리펩티드가 제2 펩티드 또는 폴리펩티드에 대해 생성된 특이적 항체와 면역학적으로 반응한다는 것이다. 따라서, 예를 들어 둘이 보존적 치환에 의해서만 상이할 경우, 한 펩티드 또는 폴리펩티드는 제2 펩티드 또는 폴리펩티드와 실질적으로 동일하다. "실질적으로 유사한" 펩티드 또는 폴리펩티드는 동일하지 않은 잔기 위치가 보존적 아미노산 변화에 의해 상이할 수 있음을 제외하고는 상기 언급된 서열을 공유한다. 보존적 치환은 전형적으로 다음의 군 내에서의 치환을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 글리신 및 알라닌; 발린, 이소류신 및 류신; 아스파르트산 및 글루탐산; 아스파라긴 및 글루타민; 세린 및 트레오닌; 리신 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 티로신, 및 당업자에게 공지된 다른 것들.
서열 동일성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정된다(예를 들어, 위스콘신주 매디슨 53705 소재 위스콘신 대학교 바오테크놀로지 센터, GCG(the Genetics Computer Group)의 서열 분석 소프트웨어 패키지, BLAST, BESTFIT, GAP, 또는 PILEUP/PRETTYBOX 프로그램). 상기 소프트웨어는 상동성의 정도를 다양한 치환, 결실 및/또는 다른 변형에 할당함으로써 동일하거나 유사한 서열을 일치시킨다. 보존적 치환은 전형적으로 하기 군 내 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 페닐알라닌, 티로신. 동일성의 정도를 결정하기 위한 예시적인 접근법에서, 밀접하게 관련된 서열을 나타내는 e-3과 e-100 사이의 확률 점수를 이용하는 BLAST 프로그램이 사용될 수 있다
본 발명의 방법에 유용한 폴리뉴클레오티드 및 바이러스 핵산 분자는 본원에 기재된 바이러스 벡터의 성분, 및 알파바이러스 벡터, 신드비스 바이러스 벡터 등과 같은 바이러스 벡터에 의해 코딩되는 폴리펩티드 산물뿐 아니라 이의 펩티드 또는 단편을 코딩하는 임의의 핵산 분자를 포함한다. 이러한 핵산 분자는 바이러스 벡터 핵산 서열과 100% 동일할 필요는 없지만, 전형적으로 실질적인 동일성을 나타낼 것이다. 바이러스 벡터 서열과 실질적인 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 바이러스 벡터 핵산 분자의 적어도 하나의 가닥과 혼성화할 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 핵산 분자는 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 단편을 코딩하는 임의의 핵산 분자를 포함한다. 내인성 서열과 "실질적인 동일성"을 갖는 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 이중 가닥 핵산 분자의 적어도 하나의 가닥과 혼성화할 수 있다. "혼성화"는 다양한 엄격도 조건하에서 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 본원에 기재된 유전자 또는 핵산 서열) 또는 이의 일부 사이에서 이중 가닥 분자를 형성하는 핵산 분자 쌍을 의미한다(예를 들어, 문헌[Wahl, G. M. and S. L. Berger(1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R.(1987) Methods Enzymol. 152:507] 참조).
예를 들어, 엄격한 염 농도는 통상적으로 약 750 mM NaCl 및 75 mM 시트르산삼나트륨 미만, 바람직하게는 약 500 mM NaCl 및 50 mM 시트르산삼나트륨 미만, 더 바람직하게는 약 250 mM NaCl 및 25 mM 시트르산삼나트륨 미만일 것이다. 낮은 엄격도 혼성화는 유기 용매, 예를 들어 포름아미드의 부재하에 달성될 수 있는 반면, 높은 엄격도 혼성화는 약 35% 이상의 포름아미드, 더 바람직하게는 약 50% 이상의 포름아미드의 존재하에 달성될 수 있다. 엄격한 온도 조건은 일반적으로 약 30℃ 이상, 더 바람직하게는 약 37℃ 이상, 가장 바람직하게는 약 42℃ 이상의 온도를 포함할 것이다. 혼성화 시간, 계면활성제, 예를 들어 도데실 소듐 설페이트(SDS)의 농도, 및 캐리어(carrier) DNA의 포함 또는 배제와 같은 다양한 부가적인 파라미터는 당업자에게 잘 알려져있다. 필요에 따라 이러한 다양한 조건을 조합하여 다양한 수준의 엄격도를 달성할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 혼성화는 750mM NaCl, 75mM 시트르산삼나트륨 및 1% SDS에서 30℃에서 일어날 것이다. 더 바람직한 실시양태에서, 혼성화는 500 mM NaCl, 50 mM 시트르산삼나트륨, 1% SDS, 35% 포름아미드, 및 100 μg/ml 변성 연어 정자 DNA(ssDNA: salmon sperm DNA)에서 37℃에서 일어날 것이다. 가장 바람직한 실시양태에서, 혼성화는 250 mM NaCl, 25 mM 시트르산삼나트륨, 1% SDS, 50% 포름아미드, 및 200 μg/ml ssDNA에서 42℃에서 일어날 것이다. 이러한 조건에 대한 유용한 변형은 당업자에게 명백할 것이다.
대부분의 적용에서, 혼성화에 뒤따르는 세척 단계는 또한 엄격도가 다양할 것이다. 세척 엄격도 조건은 염 농도 및 온도에 의해 정의될 수 있다. 상기와 같이, 염 농도를 감소시키거나 온도를 상승시킴으로써 세척 엄격도를 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 세척 단계를 위한 엄격한 염 농도는 바람직하게는 약 30 mM NaCl 및 3 mM 시트르산삼나트륨 미만, 가장 바람직하게는 약 15 mM NaCl 및 1.5 mM 시트르산 나트륨 미만일 것이다. 세척 단계를 위한 엄격한 온도 조건은 일반적으로 약 25℃ 이상, 더 바람직하게는 약 42℃ 이상, 더욱더 바람직하게는 약 68℃ 이상의 온도를 포함할 것이다. 바람직한 실시양태에서, 세척 단계는 30 mM NaCl, 3 mM 시트르산삼나트륨 및 0.1% SDS에서 25℃에서 일어날 것이다. 더 바람직한 실시양태에서, 세척 단계는 15 mM NaCl, 1.5 mM 시트르산삼나트륨 및 0.1% SDS 중 42℃에서 일어날 것이다. 더 바람직한 실시양태에서, 세척 단계는 15 mM NaCl, 1.5 mM 시트르산삼나트륨 및 0.1% SDS에서 68℃에서 일어날 것이다. 이들 조건에서 추가 변이는 당업자에게 명백할 것이다. 혼성화 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 예를 들어, 문헌[Benton and Davis(Science 196:180, 1977); Grunstein and Hogness(Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel et al.(Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger and Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York); 및 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York]에 기재되어 있다.
엄격한 조건하에서 서로 혼성화하지 않는 핵산은 그들이 코딩하는 폴리펩티드가 실질적으로 동일할 경우 여전히 실질적으로 동일하다. 이것은 예를 들어 핵산의 복사본이 유전 암호에 의해 허용되는 최대 코돈 축퇴를 사용하여 생성될 때 발생한다. 이 같은 경우, 핵산은 전형적으로 중간 정도의 엄격한 혼성화 조건하에서 혼성화한다. "중간 정도의 엄격한 혼성화 조건"의 비제한적 예로는 40% 포름아미드, 1M NaCl, 1% SDS의 완충액에서 37℃에서 혼성화하고 1 x SSC에서 45℃에서 세척한다. 양성 혼성화는 적어도 배경의 두 배이다. 당업자는 유사한 엄격도 조건을 제공하기 위해 대안적인 혼성화 및 세척 조건이 이용될 수 있음을 쉽게 인식할 것이다.
"오르토로그(ortholog)"는 또 다른 생물체로부터의 참조 단백질 또는 핵산 서열과 고도로 관련이 있는 생물체의 임의의 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 의미한다. 연관성의 정도는 참조 단백질이 예를 들어 블라스트 검색에서 서열을 식별할 확률로서 표현될 수 있다. 참조 서열이 무작위 서열을 오르토로로서 식별할 확률은 e-10, e-20, e-30, e-40, e-50, e-75, e-100 미만으로 매우 낮다. 숙련된 당업자는 오르토로그가 참조 단백질 또는 핵산 서열과 기능적으로 관련이 있을 가능성이 있다는 것을 이해한다. 즉, 오르토로그와 그의 참조 분자는 이들의 각각의 생물체, 예를 들어 마우스 및 인간 오르토로그에서, 동등하지는 않더라도, 유사한 기능적 역할을 수행할 것으로 기대된다.
참조 서열과 정렬될 때 오르토로그는 참조 서열과 특정한 정도의 아미노산 서열 동일성을 가질 필요는 없다. 단백질 오르토로그는 예를 들어, 단백질의 전체 길이에 걸쳐 유의한 아미노산 서열 동일성을 공유할 수 있거나, 대안적으로, 단지 단백질의 기능적으로 중요한 단일 도메인에만 유의한 아미노산 서열 동일성을 공유할 수 있다. 이러한 기능적으로 중요한 도메인은 유전적 돌연변이 또는 구조 기능 분석에 의해 정의될 수 있다. 오르토로그는 당해 분야에서 실시되는 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 오르토로그의 기능적 역할은 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 분석될 수 있다. 예를 들어, 생화학, 면역학 또는 효소 분석; 또는 형질전화 회수(transformation rescue)를 사용하여 생체 내 또는 시험관 내에서 기능을 분석할 수 있다. 별법으로, 조직 배양에서 생물 분석을 수행할 수 있고, 기능은 또한 유전자 불활성화(예를 들어, RNAi, siRNA 또는 유전자 녹아웃(knockout)에 의한), 또는 유전자 과발현에 의해서뿐 아니라 다른 방법에 의해서도 분석될 수 있다.
구체적으로 언급되거나 문맥으로부터 명백하지 않는 한, 본원에 사용되는 용어 "또는"은 포괄적인 것으로 이해된다. 구체적으로 언급되거나 명백하지 않는 한, 본원에 사용되는 용어 "하나의"("a", "an" 및 "the")는 단수 또는 복수로 이해된다.
본원에 사용되는 용어 "약" 또는 "대략"은 기재된 값의 유형 및 값을 측정하는데 사용된 방법에 대해 허용 가능한 오차 범위 내를 의미한다. 예를 들어, 이들 용어는 주어진 값 또는 범위의 20% 이내, 더 바람직하게는 10% 이내, 가장 바람직하게는 5% 이내를 의미할 수 있다. 보다 구체적으로, "약"은 언급된 값 또는 범위의 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 또는 0.01% 내로 이해될 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템에서, 용어 "약"은 주어진 값의 1 로그 단위(즉, 한 자리 수) 내, 바람직하게는 2배 이내를 의미한다. 구체적으로 언급되거나 명백하지 않는 한, 본원에서 사용되는 용어 "약"은 당해 분야의 통상의 허용 범위 내, 예를 들어 평균의 2 표준 편차 이내로 이해된다. 문맥상 명확하지 않은 한, 여기에 제공된 모든 수치는 용어 약으로 수식된다.
본원에서 제공된 임의의 조성물 또는 방법은 본원에서 제공된 하나 이상의 임의의 다른 조성물 및 방법과 조합될 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 본원에 기재된 효소 절단 부위(예를 들어, 푸린 효소)에 의해 분리되는 하나 이상, 예를 들어 3개의 종양 관련 항원의 2개 이상, 예를 들어 3개의 에피토프를 포함하는 다양한 성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(미니유전자)의 설계 및 서열을 개략적으로 나타낸다. 도 1a는 3개의 종양 관련 항원의 다중(3) 에피토프를 코딩하는 신드비스 바이러스 벡터를 제작하기 위한 폴리뉴클레오티드를 개략적으로 나타낸다. 도 1a에 "SV/MG"로 명명된 폴리뉴클레오티드 구조물은 신드비스 바이러스 벡터의 '골격'에 폴리뉴클레오티드를 삽입하기 위해서 5' 말단에 Xba1 제한 효소 부위(TCTAGA, 서열 번호 8) 및 3' 말단의 Apa1 제한 효소 부위(GGGCCC, 서열 번호 9)를 포함한다. 5'에서 3'으로, 폴리뉴클레오티드는 리보솜 결합 부위 개시 코돈, 소포체 신호 서열, NY-ESO-1 종양 관련 항원의 에피토프, gp70 당단백질 종양 관련 항원의 에피토프, 서바이빈 종양 관련 항원의 에피토프, 각각의 종양 관련 항원 에피토프를 분리하는 푸린 절단 부위 및 정지 코돈을 포함한다. 도 1b는 도 1a에 기재된 폴리뉴클레오티드(미니유전자)(서열 번호 10)의 폴리뉴클레오티드 서열 및 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드 및 펩티드 성분의 상응하는 아미노산 서열(서열 번호 11)을 나타낸다. 폴리뉴클레오티드의 성분 유전자 및 코딩되는 폴리펩티드/펩티드는 도 1b의 서열 아래에서 확인된다.
도 2a 및 2B는 종양 관련 항원의 다중 에피토프를 코딩하는 신드비스 바이러스 벡터로의 처리 프로토콜 및 CT26 유래 종양 보유 마우스를 처리한 후 종양 성장의 플롯을 제시한다. 도 2a는 도 1a 및 1B의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 신드비스 바이러스 벡터를 CT26 종양 마우스 모델에서 성장하는 종양 보유 마우스에 투여하기 위한 치료 요법의 프로토콜을 도시한다. 도 2b는 하기 실시예 2에 기재된 대조군과 비교하여 다중 에피토프를 코딩하는 신드비스 바이러스 벡터, 즉 도 1a의 SV/MA(여기서, 다중 TAA는 NY-ESO-1, 서바이빈 및 gp70을 포함함)로 종양보유 동물을 처리한 후 경과일수의 함수로서 종양 성장을 보여주는 그래프를 제시한다. 대조군(대조군: 신드비스 바이러스 벡터를 전혀 받지 않은 마우스; SV/LacZ: 무관한 박테리아 효소인 β-갈락토시다아제를 코딩하는 신드비스 바이러스 벡터; 및 NY-ESO-1 종양 관련 항원을 코딩하는 양성 대조군인 SV/NY-ESO-1)과 비교하여, NY-ESO-1, 서바이빈 및 gp70의 다중 종양 관련 항원 에피토프를 코딩하는 SV/MG 바이러스 벡터는 종양보유 동물에 주사한 후 CT26 종양 세포의 성장을 억제하는데 매우 효과적이었다(도 2b). 상기한 바와 같이 처리된 대조군 및 실험군 마우스에서 종양 성장을 나타내는 상대적인 광 단위(RLU: relative light unit) 값을 도 2b에서 그래프 아래에 나타낸다.
도 3은 하기 실시예 3에 기재된 바와 같이 qPCR 후 DNA 샘플을 포함하는 염색된 아가로오스 겔의 UV 이미지를 나타낸다. qPCR은 SV RNA 게놈에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머로 수행하였다. 겔에서, 레인 (-)는 감염되지 않은 BHK(대조군)로부터의 cDNA를 포함하였으며; 레인 (+)는 pSV/MG-CT.26 DNA 플라스미드(대조군)를 포함하였으며; 레인 M은 100 염기쌍 사다리 마커(대조군)를 포함하였다. -4, -3, -2, -1 및 0으로 표시된 레인은 각각 BHK 세포를 감염시키는데 사용된 SV-MG-CT.26 바이러스의 10-4, 10-3, 10-2, 10-1 및 100 희석액을 반영한다. qPCR 단편(~ 200bp)의 크기는 플라스미드 DNA 대조군으로 얻은 크기와 일치한다. 100 ㎕의 바이러스가 세포에 첨가되었기 때문에, 10-4 희석액에서의 바이러스 RNA의 출현은 105개 바이러스 입자/ml의 역가를 나타냈다. 이 역가는 qPCR CT(역치 주기: threshold cycle) 값에 의해 결정된 역가와 일치한다.
도 4a-4c는 대표적인 종양 관련 항원인 LacZ를 코딩하는 신드비스 바이러스 벡터(본원에서 "SV/TAA")로 종양보유(LacZ+ CT26 종양) 마우스의 처리가 대조군에 비해 실질적으로 생존을 연장하고, 에피토프 확산을 유도하며, TAA 손실을 막는다는 것을 보여준다. 도 4a는 LacZ+ CT26 종양 보유 마우스를 SV/LacZ 신드비스 바이러스 벡터, GFP 단백질을 코딩하는 대조군 SV 벡터(SV/GFP), 또는 배지/PBS(모의) 중 어느 하나로 처리하였다는 것과 SV/LacZ 신드비스 바이러스 벡터만이 적어도 60일 동안 완전한 종양 관해(100% 동물 생존)를 유도하였다는 것을 보여준다. 이 데이터는 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선으로 나타낸다. 곡선 사이에 유의한 값은 *P <0.05; **P <0.01로 나타낸다. 도 4b는 사량체를 사용하여(Altman, J.D. et al., 1996, Science, 274(5284):94-96) SV/LacZ 처리 마우스의 비장 세포가 LacZ(나타내지 않음) 및 CT26 세포에 의해 발현되는 내인성 종양 관련 항원인 gp70 모두에 특이적인 CD8+ T 세포를 포함하였다는 것을 증명하였으며, 이는 따라서 에피토프 확산이 일어났음을 나타낸다. 도 4c는 도 4a에 기재된 바와 같이 대조 마우스("미접촉(Na
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ve)") 및 SV/LacZ 바이러스 벡터로 주사한 후 그의 종양에서 살아남은 마우스(SV/LacZ 생존자)의 사진을 제시하며, 이는 LacZ(-) CT26 종양이 미접촉 마우스에서 성장하였지만, LacZ를 코딩하는 SV/LacZ 바이러스 벡터로 처리된 마우스(SV/LacZ 생존 마우스)에서는 성장하지 못하였음을 입증한다. 이러한 결과는 SV/LacZ 유도된 에피토프 확산이 성공적으로 종양 관련 항원(즉, LacZ) 발현의 손실에 대항한다는 발견을 뒷받침해준다.
도 5A 및 5B는 하나 이상의 종양 관련 항원을 코딩하는 신드비스 바이러스 벡터("SV/TAA"로서 SV/루시퍼라제)로 동물의 치료/면역 요법의 효과를 평가하기 위한 영상화와 유세포 측정법의 조합을 나타낸다. 도 5A는 종양 관련 항원으로서 루시퍼라제를 코딩하는 신드비스 바이러스 벡터로 동물을 주사한 후 대표적인 종양 관련 항원인 반딧불이 루시퍼라제의 발현 부위를 비침습적으로 그리고 종횡적으로 결정하는데 사용된 생체 내 영상화의 결과를 나타낸다. 동물에서 평가된 T 세포 활성화 마커 CD69 발현 수준에 의해 입증되는 바와 같이, 루시퍼라제(TAA로서) 전달 부위로서 확인된 종격 림프절(MLN: mediastinal lymph node)은 또한 강력한 CD8+ T 세포 활성화 부위인 것으로 밝혀졌다. ILN(inguinal lymph node) = 서혜부 림프절 대조군(도 5B). 코딩된 루시퍼라제의 사용으로 종양 세포의 영상화 및 상기 세포를 포함하는 종양 성장의 평가를 허용하는 루시퍼라제 유전자를 발현하도록 종양 세포가 분자적으로 조작된(형질감염된) 동물 모델에서 종양 성장을 측정할 수 있다.
도 6a-6d는 PBS(대조군, 도 6a) 또는 종양 관련 항원으로서 LacZ를 코딩하는 종양 신드비스 바이러스 벡터(SV/LacZ)(도 6b-6d)로 LacZ+ CT26 종양을 갖는 마우스를 주사한 후 시간(경과일수)에 대한 종양 성장의 그래프를 나타낸다. 대조군 마우스(도 6a)에 대해 관찰된 결과와 비교할 때 CD4+ T 세포(도 6b), CD8+ T 세포(도 6c), 또는 이들 모두(도 6d)를 고갈시킨 마우스에서 피하 종양에 대한 SV/LacZ의 치료 효과(즉, 캘리퍼에 의해 측정되는 종양 성장의 감소)는 관찰되지 않았다.
본 발명은, 최적으로는 HLA/MHC 항원과 관련하여, 대상체의 암 또는 종양에 의해 발현되는 다중 종양 관련 항원에 대해 대상체에서 강력한 면역 반응을 유도하는 하나 이상의 종양 관련 항원(TAA)의 다중 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 바이러스 벡터, 특히 알파바이러스 벡터를 제공한다. 또한, 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 및 바이러스 벡터는 투여 후 에피토프 확산을 일으키고, 이는 다중 TAA에 대한 면역 반응을 향상시키는 작용을 한다.
아래에서 보다 상세하게 보고되는 바와 같이, 본 발명은 다중 종양 관련 항원(예를 들어, NY-1 ESO, 서바이빈, gp70)을 코딩하는 신드비스 벡터가 장기간에 종양 보유 마우스의 장기간 생존 및 다중 종양 항원에 대해 오래 지속하는 CD8+ T 세포의 생성의 결과를 가져온다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다. 중요하게는, 다중 종양 관련 항원을 코딩하는 신드비스 벡터를 이용한 요법은 에피토프 확산을 유발하였으며, 이는 종양 관련 항원 손실 또는 변형에 의한 종양 탈출 문제에 대해 유망한 해결책을 제공한다. gp70은 쥣과 레트로바이러스 당단백질이기 때문에, 특히 전임상 연구에 유용하다. 유사한 용도를 위한, 그러나 인간 바이러스(렌티바이러스)로부터 유래하는 당단백질의 예는 제한 없이 인간 면역 결핍 바이러스(HIV: human immunodeficiency virus)의 gp120 및 gp41 외피 단백질, 또는 이들의 단편을 포함한다.
본원에 기재된 분자적으로 조작된 바이러스 벡터는 네오-에피토프를 포함하여 종양 관련 항원의 선택된 다중 에피토프로서 하나 이상의 종양 항원(종양 관련 항원으로도 지칭함)의 유전 정보를 보유하고 암 또는 종양을 특이적으로 사멸시키기 위해 활성화되는 세포 독성 T 세포(예를 들어, 이펙터 CD8+ T 세포)를 궁극적으로 생성하는 특이적 면역 반응을 시작하고 지속시키도록 설계된 효율적이고 효과적인 전달 시스템을 제공한다.
본 발명은 일반적으로 암 및 종양 형성 및/또는 이의 증상의 치료를 필요로 하는 대상체, 예를 들어 암을 가진 환자에서 이의 치료에 유용한 바이러스 벡터 기반 조성물 및 방법을 특징으로 한다. 본원에 기재된 하나 이상의 종양 관련 항원(TAA)의 다중, 예를 들어 2개 이상의 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 보유하도록 설계된 바이러스 벡터를 이용하는 방법은 특히, 종양 관련 항원 및 이의 에피토프를 발현하는 대상체의 암 또는 종양에 대해 T 세포 매개 면역 반응을 유도하기 위해서, 바이러스 벡터, 바이러스 입자, 또는 바이러스 벡터 또는 입자를 포함하는 약학 조성물의 치료 유효량을 대상체(예를 들어, 인간과 같은 포유류에)에게 투여하는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 바이러스 벡터는 다중 에피토프, 예를 들어 T 세포 수용체에 의해서 인식되는 종양 관련 항원, 즉 "T 세포 에피토프"의 아미노산 서열을 코딩하고 발현하도록 설계된다. 본 발명의 바이러스 벡터의 다중 에피토프의 발현은 다양한 종양 항원에 대해 면역 반응을 유도할 가능성을 증가시킬 수 있고 상이한 HLA 일배체형을 가진 대상체의 치료를 또한 포함한다. 이러한 바이러스 벡터 산물은 또한 T 세포 수용체에 대해 최적의 친화도를 갖는 종양 관련 항원의 에피토프를 포함하고 발현하도록 설계될 수 있다. 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터 및 바이러스 입자는 하나 이상의 종양 관련 항원(들)뿐 아니라, 면역자극 및 면역조절 분자의 다중 에피토프를 포함하도록 설계되기 때문에, 이들의 산물은 다수의 암 및 종양 유형을 표적화할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 종양 관련 항원의 다중 에피토프를 코딩하고 발현하는 바이러스 벡터 산물은 전체 생물체 유도 면역을 모방하거나 증가시키고 잠재적인 면역병인 또는 억제 반응을 예방할 수 있는 암 및 종양 치료법으로서, 하나 이상의 종양 관련 항원의 다중 에피토프는 치료를 받는 대상체에서 강력한 면역 반응을 생성하는 이펙터 T 세포에 의해 인식되는 것인 치료법을 제공한다. 본원에 기재된 바이러스 벡터는 이펙터 T 세포, 예를 들어 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 둘 모두에 의해 인식되도록 설계된 종양 관련 항원의 다중 에피토프를 포함한다. 바이러스 벡터는 동시에 상이한 세포 독성 림프구(CTL: cytotoxic lymphocyte) 결정기에 대한 반응을 유도할 수 있고, 이로써, 암 및 종양 세포를 공격하고 사멸시키고 암 성장 및 재발을 방어하는데 필요한 폭과 세기의 CD8+ CTL 반응을 유도하여 생체 내에서 면역원성을 최적화하고 최대화할 수 있다.
본 발명에 따르면, 하나 이상의 종양 관련 항원의 다중 에피토프, 예를 들어 2개 이상의 에피토프를 코딩 및 발현하는 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터, 바이러스 입자, 및 이들의 산물을 포함하는 세포 및 약학 조성물의 설계는 활성화된 T 세포 레퍼토리를 확장하는데 사용될 수 있는 생물학적 산물을 제공한다. 따라서, 이렇게 활성화된 T 세포는 종양 관련 항원 및 이들의 관련 에피토프를 발현하는 암 및 종양 세포와 반응할(사멸시킬) 수 있고, 따라서 하나 이상의 종양 관련 항원의 2개 이상의 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 제작된, 본원에 기재된 바이러스 벡터, 예를 들어, 알파바이러스(예를 들어, 신드비스 바이러스(SV)), 렌티바이러스, 레트로바이러스 또는 위형 벡터의 치료 적용 가능성 및 효능을 넓힌다. 한 실시양태에서, 종양 관련 항원 에피토프 각각은 발현되는 에피토프의 재현 가능한 프로세싱을 위한 효소 절단 부위, 예를 들어, 푸린 절단 부위와 같은 프로세싱 부위에 의해 분리된다.
본 발명에 따르면, 암 또는 종양을 가진 대상체에 투여 후, 하나 이상의 종양 관련 항원(TAA)으로부터 유래한 다중, 예를 들어 2개 이상의 에피토프를 코딩하는 바이러스 벡터 및 바이러스 입자, 또는 이의 약학 조성물은 다중 에피토프를 RNA 형태로 세포에 전달한다. RNA는 HLA/MHC 항원과 관련하여 면역계의 세포, 예를 들어, 대식세포 및 수지상 세포에 의해 CD8+ T 세포의 전구체에 최적으로 제시되는 단백질 및 단백질 단편, 예를 들어 에피토프 펩티드로 세포 내에서 프로세싱된다. 면역계의 보조 세포에 의한 이러한 항원 제시는 CD8+ T 세포를 활성화하고, 이들은 신항원을 포함한 종양 관련 항원의 특이적 에피토프를 발현하는 암 및 종양 세포를 사멸시키는 다수의 세포독성 T 세포를 생성하기 위해서 증식한다. 따라서, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 및 바이러스 벡터에 의해 코딩되는 에피토프는, 상응하는 하나 이상의 종양 관련 항원을 발현하는 암세포 또는 고형 종양에 대해 특이적으로 지시된 상승된 면역 반응, 특히 T 세포 매개 면역 반응을 유도하도록 최적으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 바이러스 벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드는 미니유전자 또는 폴리뉴클레오티드 구조물로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터, 또는 약학 조성물은 동일한 종양 관련 항원으로부터 유래한 하나 이상, 바람직하게는 2개 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90개 이상)의 에피토프를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터, 또는 약학 조성물은 동일한 에피토프의 1개 이상의 복사본을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터, 또는 약학 조성물은 상이한 종양 관련 항원으로부터 유래한 하나 이상, 바람직하게는 2개 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90개 이상)의 에피토프를 포함할 수 있다.
종양 관련 항원( TAA )
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 바이러스 벡터에 의해 발현되는 에피토프가 유래하는 종양 관련 항원은 암 또는 종양, 예를 들어, 제한 없이, 난소암, 유방암, 고환암, 췌장암, 간암, 결장직장암, 갑상선암, 폐암, 전립선암, 신장암, 흑색종, 편평세포 암종, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 전골수구성 백혈병, 다발성 골수종, B 세포 림프종, 방광 암종, 두경부암, 식도암, 뇌암, 인두암, 설암, 활막세포 암종, 신경모세포종, 자궁암, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 기저 세포 암종, 표피모양 암종, 선암종, 한선 암종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질 암종, 기관지원성 암종, 신세포 암종, 간세포암, 담도 암종, 융모막 암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름스 종양, 자궁경부암, 소세포 폐 암종, 상피 암종, 교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종. 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 신경교종, 및 망막모세포종과 관련되거나 이들에 의해, 예를 들어 세포 외 또는 세포 내 발현될 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드(미니유전자), 바이러스 벡터 및 약학 조성물은 상기 병태 중 하나 이상에 걸린 인간 환자와 같은 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 하나 이상의 종양 관련 항원의 2개 이상의 상이한 에피토프는 동일한 암 또는 종양 유형과 관련될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 2개 이상의 에피토프는 상이한 암 유형, 예를 들어 둘 이상의 암 유형의 종양 관련 항원과 관련될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터, 또는 약학 조성물은 한 유형의 암 또는 종양 세포, 예를 들어 난소암 세포에 의해 발현되는 종양 관련 항원의 1개 이상의 에피토프 및 또 다른 유형의 암 또는 종양 세포, 예를 들어 유방암 세포에 의해 발현되는 종양 관련 항원으로부터 유래한 1개 이상의 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터, 또는 약학 조성물은 하나 이상의 암 유형(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 18, 19, 20, 30, 40, 50가지 이상의 암 또는 종양 유형)의 표면상에서 발현되는 종양 관련 항원의 1개 이상의 에피토프, 또는 2개 이상의 에피토프를 포함한다. 다른 실시양태에서, 종양 관련 항원의 1개 이상의 에피토프, 또는 2개 이상의 에피토는 하나 이상의 암 또는 종양 유형에서 세포 내 발현된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터, 또는 약학 조성물은 상기 암 유형과 관련된 하나 이상의 종양 관련 항원의 2개 이상의 에피토프를 포함한다. 하기 표 1-28은 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터 또는 바이러스 입자에 의해 코딩되거나 본 발명의 조성물에 혼입될 수 있는 다양한 종양 관련 항원 및 이의 에피토프의 비제한적인 목록을 제공한다. 종양 관련 항원 및 이의 에피토프는 인간 종양 관련 항원 및 이의 에피토프 및 종양 관련 항원의 인간 오르토로그 및 이의 에피토프를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터, 또는 약학 조성물은 표 1-28 중 어느 하나에 열거된 하나 이상의 종양 관련 항원의 하나 이상, 또는 2개 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90개 이상)의 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터, 또는 약학 조성물은 표 1-28 중 어느 하나에 열거된 아미노산 서열 중 하나 이상, 또는 2개 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90개 이상)의 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터 또는 바이러스 입자에 의해 코딩되는 종양 관련 항원의 에피토프 각각은 효소 절단(또는 프로세싱) 부위, 예를 들어, 푸린 절단 부위, 또는 본원에 기재된 다른 효소 절단 또는 프로세싱 부위에 의해 분리된다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 및 바이러스 벡터에 의해 코딩되는 에피토프 펩티드를 절단하는데 사용하기 위한 추가적인 프로세싱 효소의 비제한적인 예는 세린 프로테아제, 시그널라아제, 푸린 프로테아제, 및 푸린 관련 엔도펩티다아제, 예를 들어, PC1/2, PC4/5, PACE4, 및 PC7을 포함한다. 이들 효소는 프로세싱 신호 (R/K)Xn(R/K)(서열 번호 6)(여기서 Xn은 임의의 0-6개 아미노산의 스페이서를 나타냄)을 인식한다(Seidah and Prat, 2012, Nature Reviews Drug Discovery, 11:367-383). 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터 또는 바이러스 입자 내에 각각의 코딩되는 에피토프를 분리하는 효소 절단 부위를 포함하면 유리하게는 투여 후 발현되는 에피토프의 프로세싱에서 재현성을 허용하여 대상체의 치료에 사용하기에 더 안전한 산물을 제공한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드가 종양 관련 항원 에피토프를 코딩하는 각각 핵산 서열 사이에 산재된 효소 절단 부위를 포함하도록 하는 것은 에피토프의 프로세싱 및 생산이 특히 생체 내 세포에서 균일하도록, 그리고 설계된 폴리펩티드가 코딩되는 표적 항원에 대해 지시되는 적절한 면역 반응(예를 들어, T 세포 반응)을 생성하는데 재현 가능하게 작동하도록 보장한다. 한 실시양태에서, 종양 관련 항원 에피토프는 예를 들어, 이펙터 T 세포에 최적으로 제시하기 위해 MHC/HLA 분자와의 결합을 기준으로 하여 선택되고, 따라서, 본원에 기재된 바와 같이, 최적의 면역 반응을 보장하는 재현성을 제공한다.
다른 실시양태에서, 하나 이상의 종양 관련 항원의 에피토프는 하나의 효소 절단 부위에 의해 각각 분리된다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 효소 절단 부위에 의해 분리되지 않고 코딩된 서열은 본원에 기재된 바이러스 벡터에 의해 세포에 전달된 후 세포 내에서 절단된다.
<표 1>
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TAA의 추가 예는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Reuschenbach et al., Cancer Immunol . Immunother. 58:1535-1544 (2009); Parmiani et al., J. Nat. Cancer Inst. 94:805-818 (2002); Zarour et al., Cancer Medicine. (2003); Bright et al., Hum. Vaccin . Immunother. 10:3297-3305 (2014); Wurz et al., Ther. Adv. Med. Oncol. 8:4-31 (2016); Criscitiello, Breast Care 7:262-266 (2012); Chester et al., J. Immunother . Cancer 3:7 (2015); Li et al., Mol . Med. Report 1:589-594 (2008); Liu et al., J. Hematol . Oncol. 3:7 (2010); Bertino et al., Biomed . Res. Int. 731469 (2015); 및 Suri et al., World J. Gastrointest. Oncol. 7:492-502 (2015)]에 기재되어 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드(미니유전자), 바이러스 벡터 및 바이러스 입자는 암 또는 종양 치료를 필요로 하는 환자 내에 존재하는 종양 또는 암세포에 의해 발현되는 하나 이상의 종양 관련 항원의 2개 이상의 에피토프(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90개 이상)를 코딩한다. 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 바이러스 벡터 및 입자 산물, 및 조성물 및 방법에 사용하기에 적합한 2개 이상의 TAA 유래 에피토프 및 종양 관련 항원은 표 1-28 중 어느 하나에 열거된 것들이다. 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드(미니유전자), 바이러스 벡터, 바이러스 입자, 및 약학 조성물은 대상체, 예를 들어 암 또는 종양에 걸린 환자에게 투여시 TAA 에피토프를 발현하는 암 또는 종양에 대해 지시되는 면역 반응을 유도하기 위해서, 암 또는 종양에 의해 발현되는 하나 이상의 종양 관련 항원 또는 이의 에피토프와 충분히 면역학적으로 교차 반응성인 하나 이상의 종양 관련 항원의 다중, 예를 들어 2개 이상의 에피토프를 코딩한다.
에피토프를 가지며 암세포 또는 고형 종양에 의해 발현되는 임의의 종양 관련 항원(TAA)은 본 발명의 조성물 및 방법과 함께 이용될 수 있다. 그러나 일부 TAA 및/또는 이의 에피토프는 잠재적으로 더 강력한 반응을 유도할 수 있기 때문에(즉, 면역력이 우수한 TAA), 상이한 TAA 및 이들의 관련 에피토프가 대상체에서 면역 반응을 유도하거나 증가시키는 효능에는 가변성이 존재할 것으로 예상된다. 관련 보고, 예를 들어, 전임상 및 임상 연구보고는 본 발명의 폴리뉴클레오티드(미니유전자), 바이러스 벡터, 바이러스 입자 또는 약학 조성물에 혼입될 TAA 또는 이의 에피토프의 선택을 안내하는데 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 강력한 면역 반응을 유도할 수 있고, MHC I형 단백질에 높은 친화도로 결합하거나, MHC II형 단백질에 높은 친화도로 결합하는 TAA 또는 이의 에피토프의 코딩 서열은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터, 바이러스 입자 또는 약학 조성물에 혼입된다. 예로써, 암 정소 항원인 NY-ESO-1은 여러 상이한 암 및 종양 유형, 예를 들어 유방암, 폐암, 흑색종뿐 아니라 고환 및 태반에서 발현되지만 다른 정상의 성인 조직에서는 발현되지 않기 때문에 암 면역요법에 종양 관련 항원으로서 사용하기에 바람직하다.
당업자는 본원에 기재된 바이러스 벡터 기반 항암 치료제에 사용하기 위한 TAA 또는 이의 다중 에피토프를 선택하는데 정보를 얻기 위해 다양한 리소스를 이용할 수 있다. 예를 들어, 국립 암 연구소(NCI: National Cancer Institute)는 5년간 수행된 임상 시험에서 암 항원 데이터를 평가할 전문가 위원회를 구성하였다. NCI 위원회는 가중 계층 분석법(weighted analytical hierarchy process)을 사용하여 기준을 수립하고 75가지의 대표 TAA를 순위화하였다(Cheevers et al., Clin Cancer Res., 15: 5323-5337, 2009). 당업자는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터, 바이러스 입자, 또는 약학 조성물에 포함시키기 위한 TAA 또는 이의 다중 에피토프를 선택하는데 데이터베이스를 사용하는 것에 익숙하다. 그러한 참고 문헌은 문헌[van der Bruggen P. et al., Peptide database: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun, 2013. URL: http://www.cancerimmunity.org/peptide/; Vigneron et al. Cancer Immun. 2013; 13: 15; TANTIGEN: Tumor T cell Antigen Database, http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/; HPtaa database, http://www.bioinfo.org.cn/hptaa/; Backert, L. and Kohlbacher, O., 2015, Genome Medicine, 7:119; Nielsen, M. et al., 2010, Immunology, 130(3):319-328; Wang, P. et al., 2008, PLoS Comput . Biol., 44(4):e10000048; Wang, P. et al., 2010, BMC Bioinformatics, 11:568; Chang, S.T. et al., 2006, Bioinformatics, 22(22):2761-2767; Guillaume, P. et al., 2009, Cancer Immun.(http://www.cancerimmunity.org/tetramers/); Chen, Y.T. et al., 2000, In: Rosenberg, S.A., Ed., Principles and practice of the biologic therapy of cancer, 3rd ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, pp. 557-570]을 제한 없이 포함한다. 이용 가능한 간행물 이외에, 하기 표 29에 제시된 상이한 웹 기반 소스에서 이용 가능한 알고리즘을 사용하여 T 세포 수용체에 대한 결합 세기에 대해 추정 에피토프를 분석할 수도 있다. 에피토프 선택을 위해 표 29에 열거된 알고리즘의 사용 예가 하기 실시예 6에 개시되어있다.
더욱 개별화된 백신 접근법에서, 환자의 종양에 의해 발현되는 종양 관련 항원 및 이의 에피토프는 생검으로부터 또는 생검이 불가능할 때 환자의 생물학적 샘플로부터 확인될 수 있다. 대상체(환자)에서 얻은 생물학적 샘플에는 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 대변, 객담, 타액, 눈물, 뇌척수액, 복막액, 피부, 조직, 세포, 조직 및 피부의 찰과 표본, 및 이들의 처리된, 예를 들어 균질화되거나 재구성된 형태를 제한 없이 포함할 수 있다. cDNA 발현 라이브러리(SEREX)의 혈청학적 분석은 종래에 인간 TAA를 확인하는데 사용되었다. 대상체의 혈청 샘플은 ELISA 또는 웨스턴 블롯 분석법을 사용하여 공지된 TAA 단백질 패널에 대해서도 시험할 수 있다. 대상체의 혈청으로부터 확인된 TAA의 에피토프는 또한 T 세포 활성화를 측정하는 Elispot 분석과 같은 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 환자의 T 세포의 이펙터 활성을 자극하는 능력에 대해 시험할 수 있다.
<표 29>
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에피토프 선별
일반적으로, CD8+ 세포 독성 T 세포는 모든 유핵 세포 상의 MHC I형 분자와 결합되는 펩티드(에피토프 아미노산 서열)를 인식하도록 프로그램된다. 이들 펩티드 또는 에피토프는 어떤 일반적인 특징을 갖는다. 전형적으로, CD8+ T 세포 반응을 유발할 수 있는 에피토프는 MHC I형 분자에 결합하는 아미노산 서열 또는 펩티드이며, 약 3-50개 아미노산 길이, 또는 약 3-30개 아미노산 길이, 또는 약 5-30개 아미노산 길이, 또는 약 5-25개 아미노산 길이, 또는 약 7-20개 아미노산 길이, 또는 약 8-10개 아미노산 길이이다. 이론에 얽매이기를 바라지 않더라도, 상기 에피토프 펩티드는 MHC I형 펩티드 결합 홈(groove)을 따라 신장된 형태로 놓여있다. 그러나 대부분 경우에 펩티드 골격에서 꼬임에 의해 펩티드 길이의 변화가 수용되는 것으로 보인다. 따라서, CD8+ T 세포 활성화 에피토프의 약간의 길이 변화가 가능하다.
CD4+ T 세포 반응을 유발할 수 있는 에피토프는 전형적으로 MHC II형 분자에 결합하는 펩티드(에피토프 아미노산 서열)이다. MHC II형 분자에 결합하는 펩티드는 적어도 13개 아미노산 길이를 가지며 훨씬 길 수 있다. 상기 에피토프 펩티드는 MHC II형 펩티드 결합 홈을 따라 연장된 형태로 놓여있다. 이는 다형성 잔기에 의해 줄지어 선 얕고 깊은 주머니 안으로 튀어나온 펩티드 측쇄에 의해서와 펩티드 골격과 모든 MHC II형 분자에서 펩티드 결합 틈에 줄지어 선 보존된 아미노산의 측쇄 사이의 상호작용에 의해 이 홈에서 유지된다. 펩티드는 그 골격에 의해 결합되고 결합 홈의 양 말단으로부터 나타나도록 허용되기 때문에, 원칙적으로 MHC II형 분자에 결합할 수 있는 펩티드 길이의 상한은 없다. 그러나 MHC II형 분자에 결합된 더 긴 펩티드는 일반적으로 대부분 경우 펩티다아제에 의해 13-17개 아미노산 길이로 절단된다.
T 세포 반응을 유발할 것으로 예상되는 에피토프의 선택은 문헌, 데이터베이스(Vigneron, N. et al., 2013, Database of T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun., Vol. 13; 및 the Immune Epitope Database) 및 인 실리코(in silico) 알고리즘(표 29)에서 안내받을 수 있지만, 그러한 접근법은 제한하려는 것이 아니며, 종양 세포와 관련하여 발견되는 에피토프의 상기 설명과 일반적으로 일치하는 TAA 에피토프를 검출하는 임의의 수단이 사용될 수 있다. 데이터베이스는 에피토프가 면역 반응을 유도하는데 성공적인지를 나타내는 문헌으로부터 데이터를 큐레이트한다. 많은 에피토프 예측 알고리즘이 이용 가능하며, 그 중 일부는 표 29에 열거한다. 구조, 물리화학적 성질, 유연성, 전하 및 프로테아제 프로세싱을 포함하여, MHC 수용체 및 T 세포에 결합할 가능성이 가장 큰 펩티드 영역의 아미노산 서열을 분석하는데 다양한 기준을 사용하는 컴퓨터 프로그램이 이용 가능하다(Yang and Yu, 2009, Rev. Med . Virol., 19:77-96). 여러 가지 알고리즘을 사용하여 종양 관련 항원 단백질의 아미노산 서열을 분석하여 항암/항종양 면역 반응을 유도하는데 최상의 컨센서스(consensus) 에피토프를 찾을 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 에피토프를 선택하는 에피토프 예측 알고리즘의 사용 예는 하기 실시예 6에 개시되어있다.
아이토피아 에피토프 디스커버리 시스템(iTopia Epitope Discovery System)(Beckman Coulter)과 같은 실험적 결합 분석법은 에피토프의 선택을 더 정제한다. 아이토피아 스크리닝 분석은 MHC 결합 친화도 및 펩티드:MHC 복합체 안정성을 기준으로 예측되는 에피토프의 우선순위를 부여할 수 있다. 집단에서 높은 빈도로 존재하는 HLA 대립 유전자에 제한된 에피토프를 선택하여 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드(미니유전자), 바이러스 벡터, 바이러스 입자 및 조성물에 포함된 TAA 유래 에피토프의 적용 가능성을 넓힐 수 있다. HLA I 및 HLA II 대립 유전자의 빈도는 전 세계 인구를 대상으로 집계되며 당업자에게, 예를 들어 www.allelefrequencies.net; bioinformatics.bethematchclinical.org.에서 이용 가능하다. 주어진 TAA에 대한 몇몇 에피토프가 고려될 때, 개별 환자의 맞춤 치료를 가능하게 하는 가장 빈번한 HLA 대립 유전자에 결합하는 TAA 에피토프를 선택하는 것이 유용할 수 있다.
종양 관련 항원 및 다른 폴리펩티드의 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
신드비스 바이러스 벡터에 혼입하기 위해 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드(미니유전자)는, 예를 들어, 펩티드 에피토프-MHC 상호작용을 증가시키는 분자를 코딩하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 칼레티쿨린 및 칼넥신은 MHC I형 단백질의 생산에서 내재성(integral) 단백질을 대표한다. 칼넥신은 새로 합성된 MHC I형 α 쇄가 소포체에 들어갈 때 이들에 결합하여 이들을 부분적으로 접힌 상태로 유지시킨다. β-마이크로글로불린이 펩티드-로딩 복합체(PLC: peptide-loading complex)에 결합한 후, 칼레티쿨린(ERp57과 함께)은 MHC I형 단백질을 샤프로닝(chaperoning)하는 기능을 담당하는 한편, 타파신은 상기 복합체를 항원 프로세싱과 관련된 운반체(TAP: transporter associated with Antigen processing) 복합체에 연결한다. 이 결합은 세포 표면상에 제시하기 위한 항원에 결합하기 위해 MHC I형 분자를 준비시킨다. 따라서, 하나 이상의 종양 관련 항원의 다중 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 연결된 칼레티쿨린(CRT)을 코딩하는 신드비스 바이러스 레플리콘 입자가 제작될 수 있다.
예로써, 폴리뉴클레오티드(미니유전자)는 '중첩 연장에 의한 스플라이싱(Splicing by Overlap Extension)' 또는 유전자 "SOEing"으로 알려진 과정에서 일련의 중첩 DNA 올리고머 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄 반응(PCR: polymerase chain reaction)을 통해 제작될 수 있다(Horton, R. M., et al., 2013. BioTechniques, 8(5):528-535; (November 1990); Horton et al., Biotechniques. 2013;54:129-133). 다중 에피토프 폴리펩티드의 푸린 프로세싱은 T 세포 활성화를 효율적으로 유도한다. 신드비스 바이러스 폴리펩티드가 푸린에 의해 자연적으로 프로세싱되기 때문에, 본 발명의 폴리뉴클레오티드(미니유전자), 바이러스 벡터, 바이러스 입자 및 약학 조성물은 다중 에피토프 코딩 서열을 분리하기 위한 푸린 절단 부위를 포함하도록 설계된다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 신드비스 푸린 분해 서열 XRSKRX(서열 번호 5)(여기서 X는 소수성 잔기를 나타냄)를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 및 바이러스 벡터에 의해 코딩되는 에피토프 펩티드를 절단하는데 사용하기 위한 추가의 프로세싱 효소의 비제한적인 예는 푸린 관련 엔도펩티다아제, 예를 들어, PC1/2, PC4/5, PACE4, 및 PC7을 포함한다. 이들 효소는 프로세싱 신호 (R/K)Xn(R/K)(서열 번호 6)(여기서 Xn은 임의의 0-6개 아미노산의 스페이서를 나타냄)를 인식한다(Seidah and Prat, 2012, Nature Reviews Drug Discovery, 11:367-383). 인접한 에피토프(Thompson et al., 1998, J. Immunol., 160:1717-23) 또는 AAA 또는 GGG와 같은 스페이서를 갖는 에피토프를 코딩하는 핵산 서열은 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드(미니유전자) 또는 바이러스 벡터에 포함될 수 있으며, 따라서 세포 프로세싱을 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터, 또는 약학 조성물은 효소 절단 부위나 스페이서 없이 인접한 에피토프를 코딩한다.
시스테인 프로테아제 카텝신 S(CAT S)는 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드(미니유전자) 또는 바이러스 벡터에 의해 코딩되는 펩티드 및 폴리펩티드의 단백질 분해 프로세싱에서 사용하기에 적합하다. CAT S는 수지상 세포, 대식세포 및 B 림프구와 같은 항원 제시 세포의 엔도솜 구획에 위치하며, 특히 MHC II 상에 제시하기 위한 항원 프로세싱에서 역할을 할 수 있다. CAT S의 내부 분해(endolytic) 부위는 PMGAP(서열 번호 270) 및 PMGLP(서열 번호 271)이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드(미니유전자) 또는 바이러스 벡터에 의해 코딩되는 종양 관련 항원 유래의 에피토프 펩티드는 예를 들어 5 내지 50개 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 실시양태에서, 종양 관련 항원의 에피토프는 5 내지 30개 아미노산 잔기, 5 내지 25개 아미노산 잔기, 5 내지 20개 아미노산 잔기, 7 내지 25개 아미노산 잔기, 7 내지 20개 아미노산 잔기, 또는 7-14개 아미노산 잔기를 포함한다. 비제한적인 예로써, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 21 내지 42개 잔기를 코딩한다. 신드비스 구조 유전자를 코딩하는 약 3700개 뉴클레오티드가 하나 이상의 종양 관련 항원의 다중 에피토프를 코딩하는 신드비스 바이러스 벡터의 생산 과정에서 레플리콘 벡터로부터 제거되기 때문에, 측면에 푸린 절단 부위가 있는 약 60 내지 90개의 에피토프 코딩 서열이 본 발명의 바이러스 벡터, 예를 들어 본원에 기재된 pT7StuI-R/에피토프 벡터로 삽입될 수 있다.
하나 이상의 종양 관련 항원의 다중 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 바이러스 벡터
일부 실시양태에서, 에피토프가 강력한 면역 반응(예를 들어, 체액성 또는 세포 매개 면역 반응)을 유도하는 하나 이상의 종양 관련 항원의 2개 이상의 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(미니유전자)를 포함하는 바이러스 벡터, 바이러스 입자 또는 약학 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 알파바이러스 단백질 또는 이의 단편을 코딩한다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 신드비스 바이러스 단백질 또는 이의 단편을 코딩한다. 유발된 면역 반응은 예를 들어 종양 관련 항원에 대해 생성된 항체 역가 또는 환자 생체 내 또는 환자로부터 얻은 생물학적 샘플에서 TAA 매개 T 세포 활성화의 정도를 결정함으로써 평가될 수 있다. 강력한 체액성 또는 세포 매개 면역 반응을 유도하고 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터, 바이러스 입자, 또는 조성물에 혼입될 수 있는 종양 관련 항원 및 이의 에피토프를 선별하는 방법은 본원에서 더 상세하게 기재되어있다.
특정 실시양태에서, 제한하고자 하는 것은 아니지만, 본 발명의 폴리뉴클레오티드(미니유전자), 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터, 바이러스 입자, 또는 약학 조성물은 하나 이상의 하기 종양 관련 항원 NY-ESO-1, CEA, k-Ras, c-myc, HPV E6, HPV E7, 사이클린 B1, Her2, MUC1, p53, p62, 서바이빈, WT1, sp17, 및 Pdz-결합 키나아제(PBK)의 2개 이상의 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드(미니유전자), 바이러스 벡터, 바이러스 입자, 또는 약학 조성물은 종양 관련 항원 NY-ESO-1의 1개 이상의 에피토프(예를 들어, 표 1-28 중 어느 하나에 열거된 NY-ESO-1의 에피토프), 및 종양 관련 항원 CEA의 1개 이상의 에피토프(예를 들어 표 1-28 중 어느 하나에 열거된 CEA의 에피토프)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드(미니유전자), 바이러스 벡터, 바이러스 입자, 또는 약학 조성물은 NY-ESO-1의 1개 이상의 에피토프(예를 들어, 표 1-28 중 어느 하나에 열거된 NY-ESO-1의 에피토프), 및 종양 관련 항원 k-Ras의 1개 이상의 에피토프(예를 들어, 표 1-28 중 어느 하나에 열거된 k-Ras의 에피토프)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드(미니유전자), 바이러스 벡터, 바이러스 입자, 또는 약학 조성물은 NY-ESO-1의 1개 이상의 에피토프(예를 들어, 표 1-28 중 어느 하나에 열거된 NY-ESO-1의 에피토프), 및 종양 관련 항원 c-myc의 1개 이상의 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드(미니유전자), 바이러스 벡터, 바이러스 입자, 또는 약학 조성물은 NY-ESO-1의 1개 이상의 에피토프(예를 들어, 표 1-28 중 어느 하나에 열거된 NY-ESO-1의 에피토프), 및 사이클린 B1의 1개 이상의 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드(미니유전자), 바이러스 벡터, 바이러스 입자, 또는 약학 조성물은 NY-ESO-1의 1개 이상의 에피토프(예를 들어, 표 1-28 중 어느 하나에 열거된 NY-ESO-1의 에피토프), 및 Her2의 1개 이상의 에피토프(예를 들어, 표 1-28 중 어느 하나에 열거된 Her2의 에피토프)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드(미니유전자), 바이러스 벡터, 바이러스 입자, 또는 약학 조성물은 NY-ESO-1의 1개 이상의 에피토프(예를 들어, 표 1-28 중 어느 하나에 열거된 NY-ESO-1의 에피토프), 및 MUC1의 1개 이상의 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드(미니유전자), 바이러스 벡터, 바이러스 입자, 또는 약학 조성물은 NY-ESO-1의 1개 이상의 에피토프(예를 들어, 표 1-28 중 어느 하나에 열거된 NY-ESO-1의 에피토프), 및 p53의 1개 이상의 에피토프(예를 들어, 표 1-28 중 어느 하나에 열거된 p53의 에피토프)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드(미니유전자), 바이러스 벡터, 바이러스 입자, 또는 약학 조성물은 NY-ESO-1의 1개 이상의 에피토프(예를 들어, 표 1-28 중 어느 하나에 열거된 NY-ESO-1의 에피토프), 및 p62의 1개 이상의 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드(미니유전자), 바이러스 벡터, 바이러스 입자, 또는 약학 조성물은 NY-ESO-1의 1개 이상의 에피토프(예를 들어, 표 1-28 중 어느 하나에 열거된 NY-ESO-1의 에피토프), 및 서바이빈의 1개 이상의 에피토프 또는 이의 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드(미니유전자), 바이러스 벡터, 바이러스 입자, 또는 약학 조성물은 NY-ESO-1의 1개 이상의 에피토프(예를 들어, 표 1-28 중 어느 하나에 열거된 NY-ESO-1의 에피토프), 및 WT1의 1개 이상의 에피토프(예를 들어, 표 1-28 중 어느 하나에 열거된 WT1의 에피토프)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드(미니유전자), 바이러스 벡터, 바이러스 입자, 또는 약학 조성물은 NY-ESO-1의 1개 이상의 에피토프(예를 들어, 표 1-28 중 어느 하나에 열거된 NY-ESO-1의 에피토프), 및 sp17의 1개 이상의 에피토프(예를 들어, 표 1-28 중 어느 하나에 열거된 sp17의 에피토프)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드(미니유전자), 바이러스 벡터, 바이러스 입자, 또는 약학 조성물은 NY-ESO-1의 1개 이상의 에피토프(예를 들어, 표 1-28 중 어느 하나에 열거된 NY-ESO-1의 에피토프), 및 gp70의 1개 이상의 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드(미니유전자), 바이러스 벡터, 바이러스 입자, 또는 약학 조성물은 NY-ESO-1의 1개 이상의 에피토프(예를 들어, 표 1-28 중 어느 하나에 열거된 NY-ESO-1의 에피토프) 및 pbk(많은 종양에서 과발현되는 PDZ 결합 키나아제)의 1개 이상의 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드(미니유전자), 바이러스 벡터, 바이러스 입자, 또는 약학 조성물은 NY-ESO-1의 1개 이상의 에피토프(예를 들어, 표 1-28 중 어느 하나에 열거된 NY-ESO-1의 에피토프) 및 서바이빈의 1개 이상의 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드(미니유전자), 바이러스 벡터, 바이러스 입자, 또는 약학 조성물은 NY-ESO-1의 1개 이상의 에피토프(예를 들어, 표 1-28 중 어느 하나에 열거된 NY-ESO-1의 에피토프), p53의 1개 이상의 에피토프(예를 들어, 표 1-28 중 어느 하나에 열거된 p53의 에피토프), sp17의 1개 이상의 에피토프(예를 들어, 표 1-28 중 어느 하나에 열거된 sp17의 에피토프), 서바이빈의 1개 이상의 에피토프, 및 WT1의 1개 이상의 에피토프(예를 들어, 표 1-28 중 어느 하나에 열거된 WT1의 에피토프)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드(미니유전자), 바이러스 벡터, 바이러스 입자, 또는 약학 조성물은 예를 들어 하기 실시예 2에 기재된 바와 같이, NY-ESO-1의 1개 이상의 에피토프(예를 들어, 표 1-28 중 어느 하나에 열거된 NY-ESO-1의 에피토프), gp70의 1개 이상의 에피토프, 및 pbk의 1개 이상의 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
바이러스 및 바이러스 벡터
알파바이러스 , 신드비스 바이러스 및 신드비스 바이러스 벡터
알파바이러스는 작고, 구형, 외피 보유, 양성-센스, 단일 가닥 RNA 바이러스인 바이러스의 토가비리데(Togaviridae)과 IV 군에 속한다. 대부분의 알파바이러스는 척추동물 숙주 및 모기와 같은 흡혈성 절지동물에 감염되고 복제된다. 알파바이러스 비리온은 지질 단백질 외피에 봉입된 정이십면체 뉴클레오캡시드를 가진 구형이다. 알파바이러스 RNA는 캡핑되고 폴리아데닐화된 약 4 x 106 달톤의 단일 42S 가닥이다. 알파바이러스 외피는 숙주 세포 원형질막으로부터 유래한 지질 이중층을 포함하고, 2개의 바이러스 당단백질인 E1(48,000 달톤) 및 E2(52,000 달톤)를 포함한다. 세 번째, 작은 E3 단백질(10,000-12,000 달톤)은 E3 단백질이 바이러스와 결합되어 있는 셈리키 포레스트 바이러스 이외의 알파바이러스에서 가용성 단백질로서 바이러스로부터 방출된다.
본원에 기재된 바와 같이, 알파바이러스 단백질 또는 이의 단편, 및 하나 이상의 종양 관련 항원의 2개 이상 단편 에피토프로서 각각이 효소 절단 부위에 의해 분리된 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 포함된다. 또한, 본 발명은 다른 바이러스 유형으로부터의 단백질, 예를 들어, 외피 단백질로 위형화된 바이러스 벡터 및 입자를 포함한다. 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터 및 바이러스 입자는 다양한 균주, 항원 복합체, 종 및 아형을 포함하는 알파바이러스 속의 구성원의 핵산 서열 및 폴리펩티드 서열을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Powers, A.M. et al., 2011, J. Virol., 75(21):10118-10131]에 기재된 바와 같이, 알파바이러스, 계통 발생학적으로 연관된 알파바이러스, 알파바이러스 복합체, 및 외피 단백질, 예를 들어 E1과 같은 이들의 구조적 성분은 본 발명에 포함된다. 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터 및 바이러스 입자에 사용될 수 있는 알파바이러스, 및 이의 폴리뉴클레오티드 및 단백질, 게다가 이들의 폴리뉴클레오티드 및 단백질의 단편의 비제한적인 예는 바마 포레스트 바이러스, 바마 포레스트 바이러스 복합체, 동부 말 뇌염 바이러스(EEEV), 동부 말 뇌염 바이러스 복합체, 미델뷔르흐 바이러스, 미델뷔르흐 바이러스 복합체, 엔두무 바이러스, 엔두무 바이러스 복합체, 셈리키 포레스트 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스 복합체, 베바루 바이러스, 치쿤구니아 바이러스, 마야로 바이러스, 아형 우나 바이러스, 오니옹 니옹 바이러스, 아형 이그보-오라 바이러스, 로스 리버 바이러스, 아형 게타 바이러스, 아형 베바루 바이러스, 아형 사기야마 바이러스, 아형 메 트리 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV), VEEV 복합체, 카바쏘우 바이러스, 에버글레이즈 바이러스, 모쏘 다스 페드라스 바이러스, 무캄보 바이러스, 파라마나 바이러스, 픽수나 바이러스, 서부 말 뇌염 바이러스(WEEV), 리오 네그로 바이러스, 트로카라 바이러스, 아형 비주 브릿지 바이러스, 서부 말 뇌염 바이러스 복합체, 아우라 바이러스, 바반키 바이러스, 키질라가크 바이러스, 신드비스 바이러스, 옥켈보 바이러스, 와타로아 바이러스, 버기 크릭 바이러스, 포트 모건 바이러스, 하이랜즈 J 바이러스, 에일라트 바이러스, 연어 췌장 질환 바이러스(SPDV), 남방 코끼리 물범 바이러스(SESV), 타이 포레스트 바이러스, 또는 토네이트 바이러스를 포함한다.
알파바이러스로서, 신드비스 바이러스는 작고, 외피 보유, 양성-센스, 단일 가닥 RNA 바이러스이다. 알파바이러스 속의 다른 구성원은 제한 없이 셈리키 포레스트 바이러스(SFV), 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV) 및 로스 리버 바이러스(RRV)를 포함한다. 신드비스 바이러스를 포함한 알파바이러스는 직경 60-70 nm의 구형 입자를 형성하며; 많은 알파바이러스의 정이십면체 구조는 저온 전자 현미경(cryo-electron microscopy, cryo-EM) 및 결정학 연구에 의해 매우 높은 해상도로 정의되어 구조 단백질들 사이의 상호작용에 대해 상세한 내용을 밝혀냈다(Jose, J. et al., 2009, Future Microbiol., 4:837-856). 게놈은 길이가 약 11 내지 12 kb인 단일 가닥의 양성 센스 RNA로 구성되며 바이러스 복제 및 발병기전에 관여하는 4개의 비구조 단백질(nsP1-nsP4) 및 비리온 입자를 구성하는 5개의 구조 단백질, 즉 뉴클레오캡시드 단백질 C와 외피 단백질, P62(성숙한 외피 단백질 E2와 E3으로 단백질 분해 절단됨) 및 E1 단백질을 코딩한다. 알파바이러스는 효율적인 복제를 나타내며 감수성의 허용 숙주의 범위가 넓다. 따라서, 이들 바이러스는 이종 유전자 발현에 그리고 유전자 요법 전달 벡터로서 매우 적합하다. 알파바이러스 벡터는 본원에 기재된 종양 관련 항원의 다중 에피토프를 전달하기 위한 폴리뉴클레오티드(미니유전자)의 코딩에 사용하기에 적합하다.
임의의 신드비스 바이러스 벡터는 복제 가능 벡터(예를 들어, 미국 특허 제8,282,916호 참조) 및 복제 결함 벡터(예를 들어, 제7,303,898호, 제7,306,792호 및 제8,093,021호 참조)를 포함하여, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터, 조성물 및 방법과 함께 사용하기에 적합하다. 복제 결함 벡터는 건강한 조직의 감염에 대해 또 다른 보호층을 제공하기 때문에 본 발명에 사용하기에 바람직하다. 또한, 신드비스 벡터는 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 둘 이상의 유전자를 발현하는 둘 이상의 서브 게놈 프로모터를 포함하도록 제작될될 수 있다.
예로써, pT7StuI-R/에피토프 벡터를 생산하기 위해, 신드비스 레플리카아제 유전자(nsP1-nsP4)를 코딩하는 레플리콘 플라스미드, 및 바이러스 구조 유전자(캡시드 단백질 C, E1, E2, E3, 및 6K)를 코딩하는 헬퍼 플라스미드를 시험관 내에서 전사하였다. 생체 내에서의 바이러스 복제를 제한하기 위해, 레플리콘 유전자를 구조 유전자와 분리시켰으며, 이들은 바이러스 입자로의 혼입을 방지하는 돌연변이된 패키징 신호를 추가로 포함한다(Bredenbeek, P. J. et al., 1993, J Virol 67: 6439-6446). 바이러스 입자는 시험관 내에서 합성된 신드비스 레플리콘 RNA 및 헬퍼 RNA 전사체로 새끼 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포의 일시적인 형질 감염에 의해 생성되었다. 세포 내에서, 게놈 RNA는 신드비스 레플리카아제에 의해 복제되었고, 캡핑된 레플리콘 RNA 전사체로부터 발현되었다. 구조 단백질은 헬퍼 RNA 전사체로부터 발현되었다. 레플리콘 RNA만이 캡시드에 포장되어 뉴클레오캡시드를 형성한 후, 바이러스 당단백질 E1 및 E2와 결합하여 세포 밖으로 방출되었다. 생성된 비리온은 바이러스 레플리카아제를 코딩하는 nsP1-nsP4 유전자, 레플리카아제가 삽입된 관심 유전자 및 폴리 A 꼬리를 전사할 수 있는 서브게놈 프로모터(Psg)에 대한 캡핑된 SV 단일 가닥 RNA 메시지를 포함하였다.
다중의 TAA 에피토프("SV/TAA")를 코딩하고 항종양 T 세포 레퍼토리를 자극할 가능성을 보이는 신드비스 바이러스 벡터를 제제화하기 위해서, 각각이 효소 절단 부위에 의해 분리된 다중의 T 세포 인식 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, DNA 미니유전자)를 신드비스 벡터(예를 들어, pT7StuI-R LacZ#202; 미국 특허 제8,093,021호)에 삽입하였다. SV/TAA 비리온은 강한 선천적 면역 반응을 유도하고 CD8+ T 세포를 활성화하는 TAA 에피토프를 발현하기 때문에, 본 발명의 바이러스 벡터는 신호 및 면역원성 펩티드를 필요로 하지 않지만, 원하는 경우, 이러한 펩티드가 포함될 수 있다. 원하는 경우, 벡터는 하기에 기재된 면역 상승 요소를 포함하도록 용이하게 조작될 수있다.
렌티바이러스
렌티바이러스 벡터는 분열 세포와 비분열 세포를 모두 감염시킬 수 있기 때문에, 유전자의 장기간 발현에 특히 유용하다. 3세대 렌티바이러스 시스템은 안전성을 높이는데 바람직하다(Breckpot, K., et al., 2007, Gene Ther, 14: 847-862). 이들은 예를 들어, 종양 관련 항원의 2개 이상의 에피토프를 코딩하는 핵산 서열이 삽입된 전달 플라스미드, gag 및 pol 유전자를 위한 패키징 플라스미드 및 rev 유전자를 위한 또 다른 패키징 플라스미드를 포함한다. 최적의 발현을 위해, 전달 발현 벡터는 스플라이스 공여부위, 패키징 시그널(psi), Rev- 반응성 요소(RRE: Rev-responsive element), 스플라이스 수용부위, 중심 폴리-퓨린 트랙(cPPT: central poly-purine tract) 및 우드 척의 간염 바이러스 전사 반응 요소(WPRE: Wood chuck hepatitis virus transcriptional response element)를 포함한다(Shaw and Cornetta, 2014, Biomedicines, 2:14-35). 전달 벡터 구조물은 또한 포유동물 세포에서 발현을 위한 프로모터를 포함할 수 있다. 사이토메갈로바이러스(CMV), 포유동물 베타-액틴, 또는 유비퀴틴 프로모터와 같은 구성 프로모터는 본 발명의 조성물에 혼입될 수있다. 일부 실시양태에서, CD4+ T 세포 특이적 프로모터와 같은 조직 특이적인 프로모터가 이용된다.
렌티바이러스 벡터를 생성하기 위한 플라스미드는 애드진(Addgene)(비영리 플라스미드 저장소)(매사추세츠주 캠브리지 소재)로부터 얻을 수 있고, 필요에 따라 당 업계의 표준 기술을 사용하여 변형시킬 수 있다. 표준 3세대 패키징 플라스미드를 사용할 수 있다. 적합한 전달 벡터는 예를 들어, pLX301, pFUGW 및 pWPXL을 포함한다. 벡터는 상기에 언급된 모든 필수 특성을 포함한다. 안전성을 높이기 위해 렌티바이러스 전달 벡터를 감염된 세포에서 통합을 감소시키고 에피소드 복제를 증가시키도록 돌연변이시킬 수 있다. 예를 들어, 이 분야에 공지된 표준 기술을 사용하여 다음과 같은 변형을 수행할 수 있다: 자가 불활성화 LTR(SIN-LTR)을 생성하는 3'LTR의 U3 영역 내 결실을 만든다; U3 및 U5 LTR 영역 내의 LTR att 부위를 결실시키거나 변이시킨다; 3 'LTR 근위 폴리퓨린 트랙(PPT)을 결실시키거나 변형시킨다(Shaw and Cornetta, 2014).
또한, 위형 바이러스 벡터 및 비리온은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 조성물과 관련하여 사용하기에 적합하다. 이러한 비리온은 바이러스 입자 및 하나 이상의 외래 바이러스 외피 단백질을 포함한다(D.A. Sanders, 2002, Curr . Opin . Biotechnol., 13:437-442). 일부 실시양태에서, 본 발명의 바이러스 벡터는 알파바이러스 단백질 또는 이의 단편, 예를 들어, 외피 단백질 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 렌티바이러스일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 바이러스 벡터는 신드비스 바이러스 외피 당단백질, 또는 특정 신드비스 바이러스 외피 당단백질을 포함하는 렌티바이러스일 수 있다. 예로써, 하나 이상의 신드비스 외피 단백질로 위형화된 렌티바이러스 골격을 포함하는 구조물(예를 들어, 위형 바이러스 벡터)를 생성하기 위해, 신드비스 외피 플라스미드, 예를 들어, T7 DM 헬퍼 #101(미국 특허 제8,093,021호)를 렌티바이러스 플라스미드와 함께 BHK 또는 293 세포에 형질감염시켜 위형 비리온을 생성하였다.
레트로바이러스
또한, 레트로바이러스 벡터는 본 발명에 따라 사용하기에 적합하다. 일부 실시양태에서, 레트로바이러스 벡터는 신드비스 외피 단백질로 위형화된 몰로니 쥣과 백혈병 바이러스(Mo-MuLV: Moloney murine leukemia virus)이다. 위형 형성은 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌[Sharkey et al., 2001, J. Virology, 75(6):2653-2659] 참조). 일부 실시양태에서, Mo-MuLV 기반 레트로바이러스 입자는 당 업계에서 공지되고 실시되는 방법을 사용하여 알파바이러스 로스 리버 바이러스(RRV)의 당단백질을 포함하고 발현하도록 조작된다.
신드비스 바이러스 외피 위형 벡터
신드비스 바이러스(SV) 외피는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드 전달 벡터로서 사용하기에 유리하다. SV는 반감기가 비교적 긴 혈액 매개 바이러스이다. 안정한 바이러스가 쉽게 생산되며 투여를 위해 농축될 수 있다. 세포 표면 분자에 결합하는 신드비스 E2 외피 단백질의 변형은 세포 진입에 필요한 E1 융합성 외피 단백질에 영향을 미치지 않으므로, 바이러스의 조작된 표적화를 가능하게 한다. 신드비스 바이러스는 많은 종양에 의해 과다 발현되고 정상 조직을 감염시키지 않는 고친화도 라미닌 수용체(LAMR: laminin receptor)(미국 특허 제7,306,792호)와 상호작용하여 종양을 특이적으로 표적화한다. 혈액 매개 바이러스로서, 신드비스 바이러스는 혈류를 통해 파종되는 전이성 종양 세포와 접촉할 수 있다.
신드비스 바이러스 외피 구조 단백질은 렌티바이러스, 레트로바이러스 및 수포성 구내염 바이러스(VSV: Vesicular Stomatitis virus)와 같은 다른 바이러스 벡터를 위형으로 만들어 이들의 표적화 능력을 향상시키고 비리온 안정성을 증가시킬 수 있다. 특히, E2 외피 단백질에 삽입된 에스 아우레우스(S. aureus) 단백질 A의 Fc 결합 도메인을 포함하도록 설계된 신드비스-ZZ 단백질(미국 특허 제6,432,699호)은 세포 표면 특이적 항체와 함께 SV 및 다른 벡터의 표적화를 재지시하는데 유용하다.
다중 에피토프의 장기간 안정한 발현이 요구되는 특정 실시양태에서, 야생형 또는 조작된 신드비스 바이러스 외피 단백질로 위형화된 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터가 사용된다. 렌티바이러스 벡터는 분열 세포 및 비분열 세포 모두의 감염에 유리하다. 신드비스 바이러스 게놈과 마찬가지로, 렌티바이러스 게놈은 2개 또는 3개의 벡터로 분리될 수 있으며, 유전자는 안전성을 개선하기 위해 변형되거나 결실될 수 있다. 레트로바이러스 아형 렌티바이러스는 자연적으로 숙주 게놈에 통합된다. 그러나 긴 말단 반복(LTR: long terminal repeat) 또는 인테그라아제 효소 돌연변이를 포함하는 벡터는 세포핵에서 안정한 비통합적 에피솜으로서 존재할 수 있다(Breckpot, K., et al., 2007, Gene Ther., 14:847-862).
기재된 바이러스 벡터, 예를 들어, 신드비스 바이러스 벡터의 면역원성의 향상
pT7StuI-R/에피토프 벡터와 같은 본원에 기재된 바이러스 벡터에 의해 코딩된 다중의 TAA 관련 에피토프에 의해 유발되는 면역 반응의 증가는 본 발명에 포함된다. 예를 들어, CD4+ T 세포(T 세포 헬프)의 증가를 촉진하면 종양 항원의 교차 제시를 향상시키고 CD8+ 기억 T 세포의 생산을 자극할 수 있다. 실제로, 마우스에서 CD4 T 세포를 고갈시켰을 때, 하나 이상의 종양 관련 항원의 다중 에피토프를 코딩하는 신드비스 바이러스 벡터(SV/TAA)에 의해 제공된 면역 반응 및 항암 요법이 제거되었다(도 6a-6d).
Pan HLA-DR 반응성 에피토프인 AKFVAAWTLKAAA(PADRE)(서열 번호 7)는 T 세포 헬프를 자극하기 위해 다양한 HLA II형 분자에 고친화도로 결합하는 항원 특이적 CD4+ T 세포를 생성할 수 있다(Alexander, J. et al., 1994, Immunity, 1:751-761). 특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드(미니유전자), 바이러스 벡터, 또는 바이러스 입자는 하나 이상의 종양 관련 항원의 다중, 예를 들어 2개 이상의 에피토프로서 그 서열이 효소 절단 부위와 같은 프로세싱 부위에 의해 분리된 에피토프를 코딩하는 서열에 이외에 PADRE 에피토프를 코딩하는 서열을 포함한다. 또한, 동족체 CD4+ T 세포 에피토프를 코딩하는 서열 및 CD8+ T 세포 에피토프를 코딩하는 서열은 효능을 강화하기 위해 폴리뉴클레오티드 및 바이러스 벡터에 포함될 수 있다.
소포체(ER) 신호 서열을 포함시켜 푸린 분해가 일어날 ER로의 다중 에피토프 폴리펩티드 이동을 용이하게 할 수 있다. 잠재적인 ER 신호 펩티드는 알파바이러스 소포체 신호 서열(Garoff, H. et al., 1990, J. Cell. Biol., 111:867-876), 인플루엔자 바이러스 기질 단백질 유래 펩티드, M57-68(Anderson, K. et al., 1991, J Exp Med , 174: 489-492), 또는 조직 플라스미노겐 활성화 인자 펩티드(Aurisicchio, L. et al., 2014, Oncoimmunology 3:e27529)와 같은 서열을 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 신호 서열은 아래에 개시된다.
투여 후 다중 에피토프 폴리펩티드의 세포 내 프로세싱을 향상시키기 위해 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드(미니 유전자) 및 바이러스 벡터에 혼입될 수 있는 추가의 ER 신호 코딩 핵산 서열은 아데노바이러스 ER 신호: MRYMILGLLALAAVCSA(서열 번호 272) 및 조직 플라스미노겐 활성화 인자 펩티드: MDAMLRGLCCVLLLCGAVFVSPS(서열 번호 273)를 제한 없이 포함한다.
또한, 면역원성 펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드(미니유전자) 및 바이러스 벡터에 포함될 수 있다. 이러한 서열은 다음을 제한 없이 포함한다; 이. 콜라이 열 불안정성 장독소 서브 유닛 B(LTB): MNKVKFYVLFTALLSSLCAHGAPQSITELCSEYHNTQIYTINDKILSYTESMAGKREMVIITFKSGATFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRITYLTETKIDKLCVWNNKTPNSIAAISMEN(서열 번호 274); 인플루엔자 바이러스 기질 단백질 M57-68 KGILGFVFTLLV(서열 번호 275); 파상풍 독소 단편 c: IDKISDVSTIVPYIGPALNI(서열 번호 276); 리소좀 관련 막 단백질(LAMP): MLIPIAVGGALAGLVLIVLIAYLVG(서열 번호 277); 및 Hsp70 펩티드: TKDNNLLGRFELSG(서열 번호 278).
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드(미니유전자) 또는 바이러스 벡터의 카복실 말단(3' 말단)에서 폴리펩티드 보조제를 코딩하는 핵산 서열을 포함시켜 투여 및 발현 후 면역 반응을 증가시키는데 사용한다. 면역 반응의 상승에 유용한 예시적인 서열은 열 충격 단백질 70, 리소좀 관련 막 단백질(LAMP), 파상풍 독소로부터의 유니버셜 헬퍼 T 세포(Th) 에피토프, 및 이. 콜라이 열 불안정성 장독소 B 서브유닛을 포함한다(Facciabene, A. et al., 2007, Vaccine, 26: 47-58; 및 2006, Hum Gene Ther., 17: 81-92).
다른 실시양태에서, 돌연변이되거나 과발현된 종양유전자, 사이토카인, 케모카인, 항체, 및 공지된 면역원성 TAA의 에피토프를 코딩하는 핵산 서열은 효소, 예를 들어, 푸린 절단 부위와 같은 프로세싱 부위에 의해 분리되어 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드(미니유전자) 및 바이러스 벡터에 포함된다. 돌연변이된 종양유전자는 자가 면역을 유발할 수 있는 자기 유전자를 최소화할 수 있다. 이 모든 유전자를 그들 사이의 단지 효소 절단 부위와 함께 나란히 연결함으로써, 이들 모든 유전자의 발현은 벡터 내 하나 이상의 서브게놈 프로모터(들)로부터 유도될 수 있다. 비제한적 예로서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 바이러스 벡터에 포함될 수 있는 하나 이상의 종양유전자, 또는 이의 돌연변이 형태의 다중 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 안드로겐 수용체(Olson, B.M. et al., 2013, Cancer Immunol . Immunother., 62(3):585-596), Her-2/neu(Parmiani, G. et al., 2002, J. Natl. Cancer Inst., 94(11):805-818), P53(Ito, D. et al., 2007, Int . J. Cancer, 120(12):2618-2624), EphA2(Tandon, M. et al., 2011, Expert Opin . Ther . Targets, 15(1):31-51), K-Ras(Gjertsen, M.K. et al., 1997, Int . J. Cancer, 72(5):784-790) 및 H-Ras(Fossum, B. et al., 1993, J. Immunol., 23:2687-2691)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 바이러스 벡터에 포함될 수 있는 하나 이상의 면역요법 상승 유전자의 다중 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 비제한적인 예는 서바이빈(Siegel, S.A. et al., 2003, Br. J. Haematol., 122:911-914; Yang, Z. et al., 2008, Mol . Immunol., 45:1674-1681), WT1(Miwa, H. et al., 1992, Leukemia, 6:405; Oji, Y. et al., 1999, Japan. J. Cancer. Res., 90:194; Oka Y. et al., 2000, J. Immunol. 2000, 164(4):1873-80; Li Z. et al., 2008, Microbiol . Immunol., 52:551-558). HTERT(Bright, R.K., et al., 2014, Human Vaccines & Immunotherapeutics, 10(11):3297-3305), 종양 단백질 D52(Bright, R.K., et al., 2014, Ibid.), IL-12(Tseng, J.C. et al., 2004, Cancer Res., 64:6684-6692; Tseng, J.C. et al., 2004, Nature Biotechnol., 22:70-77; Granot, T. et al., 2013, Mol . Ther ., 22(1):112-122; Granot, T. et al., 2011, PLoS One, 6(6):e20598), 인터페론-감마(Granot, T. et al., 2013, Mol . Ther ., 22(1):112-122; Granot, T. et al., 2011, PLoS One, 6(6):e20598) 및 칼레티쿨린(Wang, H.T. et al., 2012, Int. J. Cancer, 130:2892-2902)을 포함한다.
다중(2개 이상) 종양 관련 항원 에피토프를 코딩하는 신드비스 바이러스 벡터에 의해 유발된 면역 반응의 조절
CD8+ T 세포를 활성화하고 이들의 종양 항원 및 이의 에피토프에 대한 반응성을 유발하는 것 이외에, 종양 관련 항원의 다중 에피토프를 코딩하는 신드비스 바이러스 벡터를 이용한 요법는 CD4+ T 세포, 자연 살해(NK: natural killer) 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포, 호중구, 및 기타 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 추가적인 면역(또는 비면역) 세포뿐 아니라 체액성 면역 반응을 활성화할 수 있다. 에피토프 확산은 CD8+ T 세포뿐만 아니라 CD4+ T 세포에서도 발생할 수 있다(Granot, T., and D. Meruelo, 2012, Cancer Gene TheR ., 19: 588-591; Granot, T. et al., 2011, PLoS One 6: e20598; Granot, T. et al., 2014, Mol Ther , 22:112-122). 림프절에서 T 세포 자극을 위한 최적의 조건을 만들기 위해, 본 발명의 실시양태는 특정 면역자극 사이토카인을 코딩하는 핵산 서열(유전자)와 함께 (하나 이상의) 종양 관련 항원의 다중(예를 들어, 2개 이상의) 에피토프를 코딩하는 핵산 서열을 포함하고 전달하는 폴리뉴클레오티드 및 바이러스 벡터, 예를 들어 신드비스 바이러스 발현 벡터를 포함한다. 이러한 면역자극 사이토카인으로는 인터류킨 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, 및 IL-17이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 추가의 사이토카인으로는 IL-18 내지 IL-36이 포함된다.
또한, CCL1 내지 CCL27 및 기타 CC 케모카인; CXCL1 내지 CXCL13 및 기타 CXC 케모카인; C 케모카인; 및 CX3C 케모카인을 포함하지만 이에 제한되지 않는 케모카인을 코딩하는 핵산 서열이 폴리뉴클레오티드 및 바이러스 벡터 핵산 서열에 포함될 수 있다. 사이토카인 또는 케모카인 수용체 및 가용성 수용체를 코딩하는 핵산 서열이 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 바이러스 벡터, 예를 들어, SV/TAA의 핵산 서열에 사용 및 혼입될 수 있는 추가 면역조절 인자를 코딩하는 핵산 서열은 TGF-β 및 TNFα를 제한 없이 포함한다. 상기에 언급된(또는 대안적인) 사이토카인의 상이한 조합이 또한 사용될 수있다. 면역자극 분자를 코딩하는 핵산 서열(유전자)은 예를 들어, 본원에 기재된 다중 TAA 에피토프를 코딩하는 신드비스 바이러스 벡터에 삽입된 추가 프로모터로부터 발현될 수 있거나, 동시 투여되는 별도의 벡터에 포함될 수 있음을 이해할 것이다.
약학 조성물
본 발명은 암 또는 종양에 걸리거나 암 또는 종양이 발생할 위험이 있는 대상체를 치료하기 위한 약학 조성물 또는 제제를 포함한다. 한 실시양태에서, 약학 조성물은 종양 관련 항원의 다중 에피토프, 예를 들어 2개 이상의 에피토프로서 각각이 효소 절단 부위, 예를 들어, 푸린 절단 부위에 의해 분리된 에피토프뿐 아니라, 본원에 기재된 바와 같이 코딩된 에피토프를 프로세싱 및 발현시키기 위한 다른 서열, 및 폴리뉴클레오티드 서열에 포함될 수 있는 다른 코딩 서열, 예를 들어 면역자극 분자 코딩 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(미니유전자), 및 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함한다. 한 실시양태에서, 약학 조성물은 종양 관련 항원의 다중 에피토프, 예를 들어 2개 이상의 에피토프로서 각각이 효소 절단 부위, 예를 들어, 푸린 절단 부위에 의해 분리된 에피토프뿐 아니라, 본원에 기재된 바와 같이 코딩된 에피토프를 프로세싱 및 발현시키기 위한 다른 서열, 및 폴리뉴클레오티드 서열에 포함될 수 있는 다른 코딩 서열, 예를 들어 면역자극 분자 코딩 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(미니유전자)를 포함하는 본원에 기재된 바이러스 벡터 또는 입자, 예를 들어 신드비스 바이러스 벡터 또는 위형 바이러스 벡터, 및 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함한다. 약학 조성물로 제제화되는 경우, 본 발명의 치료 화합물 또는 산물은 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합될 수 있다.
암 또는 종양의 치료를 위한 본원에서 약제의 조합물을 포함하는 조성물은 다른 성분와 조합하여 대상체에서 암을 개선, 감소 또는 안정화시키는데 효과적인 치료제의 농도가 되도록 하는 임의의 적합한 방법에 의해서 투여될 수 있다. 조성물은 전신 투여될 수 있으며, 예를 들어 생리 식염수와 같은 약학적으로 허용되는 완충액에 제제화될 수 있다. 투여 경로는 환자에서 약제의 연속적이고 지속적인 수준을 최적으로 제공하는 예를 들어 주사에 의한, 예를 들어 피하(s.c.), 정맥 내(i.v.), 복강 내(i.p.), 근육 내(i.m.) 또는 피내 투여를 포함한다. 치료제의 투여량은 투여 방법, 환자의 연령, 신체 상태 및 체중, 및 암 또는 종양의 임상 증상에 따라 달라진다. 일반적으로, 그 양은 암 또는 종양의 치료에 사용되는 다른 바이러스 벡터 기반 약제에 사용되는 양의 범위에 있을 것이지만, 특정 경우에는 약제가 증가된 특이성을 나타내는 경우 더 적은 양이 필요할 것이다. 조성물은 면역 세포(예를 들어, 이펙터 T 세포, CD8+ T 세포) 수준, 특히 TAA 에피토프 특이적 T 세포 수준의 증가와 같은 치료 효과를 나타내거나 당업자에게 공지된 방법에 의해 결정되는 암 세포 증식을 감소시키는 투여량으로 투여된다.
치료제(들)는 임의의 적절한 양으로 임의의 적합한 담체 물질 중에 포함될 수 있으며, 일반적으로 조성물의 총 중량의 1 내지 95 중량%의 양으로 존재한다. 조성물은 본원에 기재된 바이러스 벡터와 같은 약제가 전신에 전달되도록 비경구(예를 들어, 피하, 정맥 내, 근육 내 또는 복강 내) 투여 경로에 적합한 제형으로 제공될 수 있다. 약학 조성물은 통상적인 약학적 관례에 따라 제제화될 수 있다(예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy(20th ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000 and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York] 참조).
본 발명에 따른 약학 조성물은 투여 직후 또는 투여 후 소정의 시간 또는 기간에 활성제를 실질적으로 방출하도록 제제화될 수 있다. 후자의 유형의 조성물은 일반적으로 제어 방출 제제로서 알려져 있으며, 다음을 포함한다: (i) 연장된 기간에 걸쳐 체내에서 실질적으로 일정한 농도의 약제를 생성하는 제제; (ii) 소정의 지연 시간 후에 연장된 기간에 걸쳐 체내에서 실질적으로 일정한 농도의 약물을 생성하는 제제; (iii) 활성 물질의 혈장 수준의 변동(톱니 동태학 패턴)과 관련된 바람직하지 않은 부작용을 최소화하는 동시에 체내에서 상대적으로 일정하고 효과적인 수준을 유지함으로써 소정의 기간 동안 작용을 유지하는 제제; (iv) 예를 들어, 종양에 인접하거나 또는 종양과 접촉하는 제어 방출 조성물의 공간적 배치에 의해, 작용을 국한시키는 제제; (v) 용량을 예를 들어, 1주 또는 2주마다 1회 투여하도록 편리한 투여를 허용하는 제제; (vi) 담체 또는 화학적 유도체를 사용하여 암을 표적화하여 치료제를 특정 세포 유형(예를 들어, 암 또는 종양 세포)으로 전달하는 제제. 일부 적용에 있어, 제어 방출 제제는 치료 수준으로 투여되는 약제의 혈장 수준을 유지하기 위해 하루 종일 빈번하게 투여할 필요성을 없앤다.
문제의 약제의 대사 속도보다 방출 속도가 더 큰 제어 방출을 얻는 방법은 제한적임을 의미하지 않는다. 예로써, 제어 방출은, 예를 들어 다양한 유형의 제어 방출 조성물 및 코팅제를 포함한 다양한 제제의 매개 변수 및 성분을 적절히 선택함으로써 달성된다. 따라서, 치료제는 적절한 부형제와 함께, 투여시 제어 방식으로 약제를 방출하는 약학 조성물로 제제화된다. 예로는 단일 또는 다중 단위 정제 또는 캡슐 조성물, 오일 용액, 현탁제, 유탁제, 마이크로캡슐, 미소구체, 분자 복합체, 나노 입자, 패치 및 리포좀이 포함된다.
약학 조성물은 제형, 제제, 또는 통상적인 비독성의 약학적으로 허용되는 담체 및 보조제를 함유하는 적합한 전달 장치 또는 이식편을 통해 주사, 주입 또는 이식(피하, 정맥 내, 근육 내, 복강 내 등)에 의해 비경구적으로 투여될 수 있다. 상기 조성물의 제제화 및 제조는 제약 분야의 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 상기 문헌[Remington : The Science and Practice of Pharmacy]에서 찾을 수 있다.
비경구 전달 및 투여용 조성물은 단위 제형(예를 들어, 단일 용량 앰풀) 또는 여러 용량을 함유하고 적합한 방부제가 첨가될 수 있는 바이알(하기 참조)로 제공될 수 있다. 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 주입 장치, 또는 이식용 전달 장치의 형태일 수 있거나, 사용 전에 물 또는 또 다른 적합한 비히클로 재구성될 수 있는 건조 분말로서 제공될 수 있다. 활성제(예를 들어, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터 또는 입자)와는 별도로, 조성물은 적합한 비경구적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함할 수 있다. 활성 치료제(들)는 제어 방출을 위해 미소구체, 마이크로캡슐, 나노 입자, 리포솜 등에 포함될 수 있다. 또한, 조성물은 현탁제, 가용화제, 안정화제, pH 조절제, 긴장도 조절제, 및/또는 분산제를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 활성 치료제(들)(즉, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터 또는 입자)를 포함하는 조성물은 정맥 내 전달용으로 제제화된다. 상기에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 약학 조성물은 무균 주사에 적합한 형태일 수 있다. 이러한 조성물을 제조하기 위해, 적절한 치료제(들)는 비경구적으로 허용 가능한 액체 비히클에 용해되거나 현탁된다. 허용 가능한 비히클 및 용매는 물, 적당한 양의 염산, 수산화나트륨 또는 적합한 완충액의 첨가에 의해 적합한 pH로 조정된 물, 1,3-부탄디올, 링거 용액, 등장성 염화나트륨 용액 및 덱스트로스 용액을 포함한다. 수성 제제는 또한 하나 이상의 방부제(예를 들어, 메틸, 에틸 또는 n-프로필 p-히드록시벤조에이트)를 함유할 수 있다. 약제 중 하나가 물에 거의 용해되지 않거나 약간만 용해되는 경우, 용해 촉진제 또는 용해제가 첨가될 수 있거나 용매는 10-60 % w/w의 프로필렌 글리콜 등을 포함 할 수 있다.
전달 방법
하나 이상의 상기 암을 치료하기 위해 본 발명의 폴리뉴클레오티드(미니유전자), 바이러스 벡터, 또는 약학 조성물을 대상체, 예를 들어, 암을 가진 환자에게 투여하여 환자 내에서 에피토프 확산을 유발할 수 있다. 종래의 암 백신 전략의 단점 중 하나는 종양 세포 집단의 이질성 및 게놈 불안정성이었으며, 이는 치료에 의해 유도되는 선택압과 연결되어 백신에 사용된 종양 관련 항원의 손실 또는 변형에 의한 종양 회피를 일으킬 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 유리한 측면은 에피토프 확산, 즉 암 또는 종양 세포에 내인성이지만 암 백신으로 치료하는 동안 벡터에 의해 능동적으로 전달되지 않는 종양 관련 항원의 에피토프에 대해 지시되는 항종양 T 세포 반응의 확대를 유도할 가능성이다. 임상 시험에 에피토프 확산의 분석이 점진적으로 포함되고 있으며, 일부 경우에, 에피토프 확산의 유도와 치료 효능 사이에 긍정적인 상관관계가 나타났다.
실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드(미니유전자), 바이러스 벡터, 바이러스 입자 또는 약학 조성물에 의해 코딩되는 종양 관련 항원의 다중 에피토프에 대한 T 세포 반응을 유발하는데 유용한 이들 약제는 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터, 입자 또는 조성물이 코딩된 서열을 발현하도록 기능적이며 활성이 되도록 하는 임의의 방식으로, 예를 들어, 세포(특히 암 또는 종양 세포)에 전달될 수 있다. 예시적으로, 다중 종양 관련 항원 에피토프의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세포에서 에피토프의 이종 발현을 위해 세포로 전달될 수 있다. 따라서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터 또는 바이러스 입자를 포함하는 조성물과 세포를 접촉시킴으로써 또는 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터 또는 바이러스 입자를 세포 내에서 이종 발현시킴으로써 세포에 전달되는 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터 또는 바이러스 입자를 특징으로 한다.
폴리뉴클레오티드 요법
암 또는 종양 형성을 치료하기 위한 한 가지 치료법은 본 발명의 종양 관련 항원 에피토프, 예를 들어 하나 이상의 종양 관련 항원의 2개 이상의 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 사용하는 폴리뉴클레오티드 요법이다. 관련 세포에서 이러한 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자의 발현은 세포 독성 T 세포 반응과 같은 면역 반응을 자극하고, 세포의 생존을 감소시키고/거나 세포 사멸을 증가시킬 것으로 기대된다. 이러한 핵산 분자는 암 또는 종양을 갖는 대상체의 세포로 전달될 수 있다. 핵산 분자는 코딩된 산물의 치료 유효 수준이 생산될 수 있도록 포집될 수 있는 형태로 대상체의 세포로 전달되어야 한다.
특히, 높은 감염 효율 및 안정한 통합 및 발현 때문에, 코딩된 단백질 및 펩티드 산물을 세포에 전달하는데 바이러스(예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스) 벡터의 형질도입을 사용할 수 있다(예를 들어, 문헌[Cayouette et al., Human Gene Therapy, 8:423-430, 1997; Kido et al., Current Eye Research, 15:833-844, 1996; Bloomer et al., Journal of Virology, 71:6641-6649, 1997; Naldini et al., Science, 272:263-267, 1996; 및 Miyoshi et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A., 94:10319, 1997] 참조). 예를 들어, 하나 이상의 종양 관련 항원의 다중 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 벡터, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 신드비스 바이러스 벡터 또는 위형 바이러스 벡터에 클로닝할 수 있고, 그의 내인성 프로모터, 레트로바이러스 긴 말단 반복, 또는 관심의 표적 세포 유형에 특이적인 프로모터로부터 발현을 유도할 수 있다. 사용될 수 있는 다른 바이러스 벡터에는 예를 들어, 백시니아 바이러스, 소 유두종 바이러스 또는 헤르페스 바이러스가 포함된다(예를 들어, 문헌[Miller, Human Gene Therapy, 15-14, 1990; Friedman, Science, 244:1275-1281, 1989; Eglitis et al., BioTechniques, 6:608-614, 1988; Tolstoshev et al., Current Opinion in Biotechnology, 1:55-61, 1990; Sharp, The Lancet, 337:1277-1278, 1991; Cornetta et al., Nucleic Acid Research and Molecular Biology, 36:311-322, 1987; Anderson, Science, 226:401-409, 1984; Moen, Blood Cells, 17:407-416, 1991; Miller et al., Biotechnology, 7:980-990, 1989; Le Gal La Salle et al., Science, 259:988-990, 1993; 및 Johnson, Chest, 107:77S-83S, 1995]의 벡터 참조). 레트로바이러스 벡터는 잘 개발되어, 예를 들어, 문헌[Rosenberg et al., NEJM, 323:370, 1990; Anderson et al.] 및 미국 특허 제5,399,346호에 기재된 바와 같이 사용되어왔다. 일부 실시양태에서, 다중 종양 관련 항원 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 미니유전자를 포함하는 바이러스 벡터는 전신 투여된다.
당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 암 또는 종양의 성장을 억제하거나 암 또는 종양 세포 사멸을 유도하기 위해 T 세포 에피토프 면역 반응의 유도를 필요로 하는 대상체의 세포에 치료 폴리펩티드를 도입하는데 비바이러스 접근법이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 리포펙션의 존재하에서 핵산의 투여(Feigner et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 84:7413, 1987; Ono et al., Neuroscience Letters, 17:259, 1990; Brigham et al., Am. J. Med . Sci ., 298:278, 1989; Staubinger et al., Methods in Enzymology, 101:512, 1983), 아시알로오로소뮤코이드-폴리리신 접합(Wu et al., Journal of Biological Chemistry, 263:14621, 1988; Wu et al., Journal of Biological Chemistry, 264:16985, 1989), 또는 외과적 조건하에 미세주사(Wolff et al., Science, 247:1465, 1990)에 의해 세포로 도입될 수 있다. 또한, 핵산은 리포솜 및 프로타민과 함께 투여될 수있다.
또한, 유전자 전달은 시험관 내 형질 감염 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 상기 방법은 인산칼슘, DEAE 덱스트란, 전기 천공 및 원형질체 융합의 사용을 포함한다. 리포솜은 또한 가능하게는 세포 내로의 DNA 전달에 유익할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 요법에 사용하기 위한 cDNA 발현은 임의의 적합한 프로모터(예를 들어, 신드비스 바이러스 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV), 유인원 바이러스 40(SV40: simian virus 40) 또는 메탈로티오네인 프로모터)로부터 지시될 수 있고, 임의의 적절한 포유동물 조절 요소에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 경우, 특정 세포 유형에서 유전자 발현을 우선적으로 지시한다고 알려진 인핸서를 사용하여 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 사용되는 인핸서는 조직 특이적 또는 세포 특이적 인핸서로서 특성화되는 것들을 제한 없이 포함할 수 있다. 대안적으로, 조절은 동족 조절 서열에 의해, 또는 바람직한 경우, 상기 기재된 임의의 프로모터 또는 조절 요소를 포함하는 이종 공급원으로부터 유래한 조절 서열에 의해 매개될 수 있다.
투여 방법 및 치료 프로토콜
필요로 하는 대상체, 예를 들어 암 또는 종양을 갖거나 상기 치료를 필요로 하는 것으로 확인된 대상체에게 치료제를 투여하는 방법으로서, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터 또는 바이러스 입자, 또는 본원에 기재된 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하여 치료 효과를 생성하는 것인 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 치료 효과는, 예를 들어, 선택적으로 MHC I형 또는 II형 분자와 결합된, 종양 관련 항원의 다중 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 벡터, 예를 들어 신드비스 바이러스 벡터에 의해 코딩되는 다중 에피토프에 의해 활성화되는 이펙터 T 세포(예를 들어, CD8+ T 세포)에 의한, 표면상에 TAA 관련 에피토프를 발현하는 암 및 종양 세포에 대한 에피토프 특이적인 면역 반응을 제한 없이 포함한다. 이러한 치료를 필요로 하는 대상체를 식별하는 것은 대상체나 의료 전문가의 판단 내에 있을 수 있으며 주관적(예를 들어, 의견) 또는 객관적(예를 들어, 검사 또는 진단 방법으로 측정 가능)일 수 있다.
(예방 요법을 포함하는) 본 발명의 치료 방법은 일반적으로 본원에 기재된 약제, 예를 들어 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터, 바이러스 입자, 또는 상기 약제를 포함하는 조성물의 치료 유효량을 포유동물, 특히 인간을 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 동물, 인간)에게 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 치료는 암 또는 종양에 걸리거나, 가지고 있거나, 이에 걸리기 쉽거나, 또는 이에 대한 위험이 있는 대상체, 특히 인간에게 적절하게 투여될 것이다. "위험이 있는" 대상체의 결정은 대상체 또는 의료 제공자의 진단 테스트 또는 의견(예를 들어, 유전자 검사, 효소 또는 단백질 마커 또는 바이오마커, 가족력 등)에 의한 임의의 객관적 또는 주관적 결정에 의해 이루어질 수 있다. 폴리뉴클레오티드 및 바이러스 벡터 약제는 또한 하나 이상의 종양 관련 항원의 다중 에피토프가 관련될 수 있는 임의의 다른 질환 또는 장애의 치료에 사용될 수 있다.
마우스를 이용한 전임상 연구에서, 하나 이상의 종양 관련 항원이 다중(예를 들어 2개 이상의) 에피토프를 코딩하는 신드비스 바이러스 벡터(SV/TAA)의 치료 유효량(~107개 바이러스 입자)의 단일 복강 내 주사는 림프절로의 신속한 면역원 전달을 일으키고 종양에 대해 지시되는 검출 가능한 CD8+ 매개 면역 반응을 유도하였다(하기 실시예 5). 당업자는 인간 대상체에서 최대 반응을 달성하기 위해 다른 요법이 필요할 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 인간 환자에서, 본 발명의 벡터의 치료 유효량은 수주, 수개월 또는 수년, 예를 들어 1년 이상 후에 1회 이상의 부스터 주사를 주사할 가능성을 가지며, 약 1주 내지 수주 사이의 기간에 걸쳐 약 1 내지 약 8회 i.p. 주사로 투여되는 치료당 약 6 내지 약 12 Log10 벡터 입자/kg의 넓은 범위일 수 있다.
본 발명의 바이러스 벡터, 폴리뉴클레오티드(미니유전자) 및 약학 조성물은 암 또는 종양에 걸린 환자를 치료하기 위해 치료적으로 사용될 수 있거나, 일반 대중에서 암의 예방 백신과 같이, 특정 암 또는 종양에 대해 위험이 있는 환자를 백신 접종하는데 예방적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 벡터의 예방 유효량은 수여자 체중 킬로그램당 약 102 TU(transducing unit: 형질도입 단위) 내지 수여자 체중 킬로그램당 약 106 TU 범위 일 수 있다. 관련 암의 마우스 모델을 사용하여 투여량 및 요법을 최적화할 수 있다. 이펙터 및 기억 CD8+ T 세포를 모두 포함하는 효과적이고 지속적인 면역 반응을 촉진하기 위해, 최적의 투여량과 면역화 간격이 설정된다. 최초의 알파바이러스 백신에 대한 CD8+ T 세포 반응은 신속하게 축소되고, 기억 T 세포가 발생을 가능하게 한다. 이 축소 이전에, 바이러스 벡터의 추가 투여는 면역 반응을 증가시키지 못 한다(Knudsen, M. L. et al., 2014, J Virol ., 88:12438-12451). 알파바이러스 RNA 증폭에 대한 강력한 I형 인터페론(IFN) 반응은 교차-초회감작을 촉진하는 수지상 세포를 활성화하여 기억 T 세포의 생성을 자극한다(Fuertes, M. B. et al., J Exp Med , 208: 2005-2016).
본 발명의 조성물을 사용하는 전형적인 치료 요법은 SV/다중 TAA 에피토프 바이러스 벡터 투여, 이어서 이펙터 CD8+ T 세포(CD62L-CD127-)의 피크 및 감소를 결정하기 위해서 유세포 분석기를 사용하여 주당 수회 림프구를 모니터하는 단계를 포함할 수 있다. 이 시점에서, 벡터의 부스트를 투여하여 이펙터 기억 T 세포(CD62L- CD127+), 중심 기억 T 세포(CD62L+ CD127+) 및 지속적이고 높은 회상 용량을 갖는 T 세포(CD27+ CD43-)의 증가를 가능하게 할 수 있다. 효능은 양성 면역 반응과 낮은 종양 재발에 의해 결정된다.
본 발명은 면역화 및 부스트(들)에 사용되는 벡터와 관련하여 제한되지 않는다. DNA-론치(launched) 알파바이러스 레플리콘에 의해 유도된 T 세포 아군의 분포는 이종 부스트에 의해 변경될 수 있다(Knudsen, M.L. et al., 2-14, J. Virology, 88:12438-12451). 예를 들어, 폭스바이러스 벡터(변형된 백시니아 안카라(Vaccinia Ankara) 또는 MVA)를 이용한 부스팅은 효능을 크게 증가시킬 수 있는 T 세포 구획의 확장을 부스트할 수 있다. 이 실시양태에서, 부스터 투여에 사용되는 바이러스 벡터는 하나 이상의 종양 관련 항원의 다중(예를 들어, 2개 이상의) 에피토프를 코딩한다. 임의의 항원 전달 시스템을 사용하여 본 발명의 벡터에 의해 유도된 면역 반응을 부스트할 수 있다. 비제한적인 예는 복제 결핍 아데노바이러스, 계두 바이러스, 백시니아 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 센다이 바이러스, 네이키드 DNA, 플라스미드 및 펩티드를 포함한다(문헌 [Woodland, DL, 2004, TRENDS in Immunology, Vol.25(2) : 98-104).
벡터 투여의 예시적인 경로는 복강 내, 정맥 내, 피하, 정위, 근육 내, 비강 내, 피내, 안와 내, 결절 내 및 종양 내 주사와 같은 비경구 투여를 제한 없이 포함한다. 다른 투여 방식으로는 경구, 두개 내, 안구 내, 안와 내, 이내, 직장, 질내, 좌제, 척수강 내, 흡입, 에어로졸 등이 포함될 수 있다.
특정 실시양태에서, 치료에 사용되는 벡터는 결함있는 신드비스 바이러스 벡터이고, 종양은 난소암과 같은 암 또는 종양이며, 종양 관련 항원의 2개 이상의 코딩된 에피토프는 p53, SP17, 서바이빈, WT1 및 NY-ESO-1을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, TAA는 NY-ESO-1, gp70 및 pbk이다. 또 다른 실시양태에서, TAA는 NY-ESO-1 및 서바이빈을 포함한다.
본 발명의 바이러스 벡터를 투여받은 환자는 또한 당업자에게 잘 알려진 바와 같이 화학요법 및/또는 방사선 치료와 같은 보조 또는 추가 치료가 유익할 수 있다. 특히, SV/TAA 신드비스 바이러스 벡터는 화학요법 치료와 병용될 수 있다. 특정 경우에, SV 및 화학요법이 상승 작용하여(예를 들어, 미국 특허 출원 공보 제2016/0008431호), 개선된 치료 효과 및/또는 결과에 대한 가능성을 제공한다. 적절한 화학요법에는 면역계를 자극하거나 면역계의 억제 요소를 억제하거나, 종양 세포에 영향을 미치고 이들을 T 세포(또는 다른 면역 세포) 세포독성에 좀 더 민감하게 만드는 화학요법 치료가 제한 없이 포함된다. 예를 들어, 면역 억제 세포의 활성을 약화시킴으로써 SV/TAA 바이러스 벡터에 의한 면역자극을 상승시키기 때문에, 본원에 기재된 SV/TAA 바이러스 벡터를 이용한 치료 및 요법을 촉진할 수 있는 특정 화학요법이 있다. 또한, 화학요법은 T 세포 매개 세포독성에 대한 종양 세포 감수성을 향상시킬 수 있다.
키트
본 발명은 암 또는 종양, 특히 하나 이상의 종양 관련 항원의 다중 에피토프를 발현하는 암 또는 종양의 치료 또는 예방용 키트를 제공한다. 한 실시양태에서, 키트는 효소 절단 부위에 의해 분리된 하나의 종양 관련 항원의 2개의 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본원에 기재된 폴리펩티드, 바이러스 벡터 또는 바이러스 입자의 유효량을 포함하는 치료 또는 예방 조성물을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 알파바이러스 단백질 또는 이의 단편을 코딩한다. 한 실시양태에서, 알파바이러스 단백질 또는 이의 단편은 신드비스 바이러스 단백질 또는 이의 단편이다. 실시양태에서, 에피토프 및 종양 관련 항원은 상기 표 1-28에 제시된 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 키트는 치료 또는 예방 조성물을 함유하는 무균 용기를 포함하고; 상기 용기는 상자, 앰플, 병, 바이알, 튜브, 백, 파우치, 블리스터-팩 또는 당 업계에 공지된 다른 적합한 용기 형태일 수 있다. 용기는 플라스틱, 유리, 라미네이트 페이퍼, 금속 호일, 또는 약물을 담기에 적합한 다른 재료로 제조될 수 있다
바람직한 경우, 본 발명의 하나 이상의 TAA 다중 에피토프 코딩 바이러스 벡터 약제를 포함하는 조성물은 암 또는 종양이 있거나 발생할 위험이 있는 대상체에게 약제를 투여하기 위한 설명서와 함께 제공된다. 설명서에는 일반적으로 암 또는 종양의 치료 또는 예방용 조성물의 사용에 대한 정보가 포함된다. 다른 실시양태에서, 설명서는 다음 중 적어도 하나를 포함한다: 치료제의 설명; 허혈 또는 그 증상의 치료 또는 예방을 위한 투여 스케쥴 및 투여; 주의사항; 경고; 징후; 금기사항; 과다 투여 정보; 이상 반응; 동물 약리학; 임상 연구; 및/또는 참고 문헌. 설명서는 용기(있는 경우)에 직접 인쇄되거나 용기에 붙인 라벨, 또는 용기에 또는 용기와 함께 제공되는 별도의 시트, 팜플렛, 카드 또는 폴더로 인쇄될 수 있다.
본 발명의 실시는, 달리 명시되지 않는 한, 당 분야의 숙련자에게 충분히 허용되는 분자 생물학(재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용한다. 이러한 기술은 문헌, 예를 들어 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition(Sambrook, 1989); "Oligonucleotide Synthesis"(Gait, 1984); "Animal Cell Culture"(Freshney, 1987); "Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology"(Weir, 1996); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells"(Miller and Calos, 1987); "Current Protocols in Molecular Biology"(Ausubel, 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis, 1994); "Current Protocols in Immunology"(Coligan, 1991)]에 충분히 설명되어 있다. 이들 기술은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터 및 바이러스 입자의 생산에 적용 가능하며, 따라서 본 발명을 제조하고 실시하는데 고려될 수 있다. 특정 실시양태에 특히 유용한 기술은 다음 부분에서 논의될 것이다.
하기 실시예는 당업자에게 본 발명의 분석, 스크리닝 및 치료 방법을 만들고 사용하는 방법에 대해 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제시된 것이며, 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예
실시예 1 -- 방법
벡터 제조:
재조합 바이러스 벡터의 제작은 플라스미드 정제, 제한 엔도뉴클레아제 분해, 결찰, 형질전환, 중합효소 연쇄 반응 및 DNA 서열 분석을 포함하지만 이에 제한되지 않는 분자 생물학 분야의 당업자에게 잘 알려진 표준 기술을 사용하여 수행하였다(예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, EM. Ausubel et al. (Eds), John Wiley and Sons, Inc., NY, USA.(1998) 및 Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2nd Ed.), J. Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis (Eds), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA. (1989)]).
면역원성 SV/TAA 약제로서 LacZ를 코딩하는 신드비스 바이러스 벡터(SV/LacZ), 및 대조군 벡터로서 SV/Fluc 및 SV/GFP를 사용하는 실험을 위해, 벡터를 종래에 기재된 바와 같이 제조하였다(Tseng J.C. et al,., 2004, Nat. Biotechnol., 22:70-77). 간략하게, 레플리콘(SinRep5-LacZ, SinRep5-GFP, 또는 SinRep5-Fluc) 또는 DHBB 헬퍼 RNA(SinRep5-tBB)를 포함하는 플라스미드를 XhoI(SinRep5-LacZ, SinRep5-GFP 및 SinRep5-tBB 경우) 또는 PacI(SinRep5-Fluc 경우)로 선형화하였다. 시험관 내 전사는 m메시지 m머신(mMessage mMachine) RNA 전사 키트(Ambion, Austin, TX)를 사용하여 수행하였다. 그 후, 헬퍼 및 레플리콘 RNA를 BHK 세포에 전기 천공시키고 10% FBS가 보충된 α-MEM 중에 37℃에서 인큐베이션하였다. 12시간 후, 배지를 CaCl2(100 ㎍/ml)가 보충된 옵티멤(OPTIMEM) I(Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 대체하고, 세포를 37℃에서 인큐베이션하였다. 24시간 후에, 상등액을 수집하고 원심분리하여 세포 파편을 제거하고, -80℃에서 동결하였다. 벡터 역가는 당 업계에 공지된 바와 같이 결정하였고(Tseng J.C., et al., 2002, J Natl Cancer Inst., 94:1790-1802), 3가지 벡터(SV/LacZ, SV/Fluc 및 SV/GFP) 모두에서 비슷하였다.
세포주 및 세포 배양: 새끼 햄스터 신장(BHK), CT26.WT 및 LacZ 발현 CT26.CL25 세포는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC: American Type Culture Collection)(버지니아주 매나사스 소재)에서 얻었다. BHK 세포는 10% 소 태아 혈청(FBS)(Atlanta Biologicals, Norcross, GA)을 포함한 최소 필수 α 변형 배지(α-MEM)(Mediatech, VA)에서 유지하였다. CT26.WT, CT26.CL25 세포는 10% FBS가 보충된 4.5 g/L 글루코오스(Mediatech)를 함유한 둘베코 변형 필수 배지(DMEM)에서 유지하였다. 모든 기초 배지에 100 mg/mL의 페니실린-스트렙토마이신(Mediatech)과 0.5 mg/mL의 암포테리신 B(Mediatech)를 보충하였다.
비리온 생산: 신드비스 바이러스 벡터는 미국 특허 제7,303,898호, 제7,306,792호 및 제8,093,021호에 기재된 바와 같이 제조하였다. 간략하게, 레플리 콘 pT7StuI-R 또는 DHBB 헬퍼 RNA(SinRep5-tBB)를 포함하는 플라스미드를 적절한 제한 효소로 선형화하였다. 시험관 내 전사는 m메시지 RNA 전사 키트(Ambion, TX)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 그 후, 헬퍼 및 레플리콘 RNA를 BHK 세포에 전기 천공시키고 10% FBS가 보충된 MEM 중에 37℃에서 인큐베이션하였다. 12시간 후에, CaCl2(100 g/mL)가 보충된 옵티멤 I(Life Sciences, CA)로 교체하고 세포를 37℃에서 인큐베이션하였다. 24시간 후에, 상등액을 수집하고 원심분리하여 세포 파편을 제거하고, -80℃에서 동결하였다. 벡터의 역가는 당 업계에서 실시되는 바와 같이 RT-qPCR을 사용하여 결정하였다.
마우스, 종양 접종 및 치료 효능: 4-8주령 암컷 BALB/c 마우스를 타코닉(Taconic)(뉴욕주 저먼타운 소재)으로부터 구입하였다. i.p. 종양 모델에 대해, 0.2 ml PBS 중의 2.5x104 또는 5x104개 CT26.CL25 세포를 각 마우스에 i.p. 주사하였다. 폐 종양 모델에 대해, 0.2 ml PBS 중의 0.3x106개 CT26.WT.Fluc 또는 CT26.CL25.Fluc 세포를 각 마우스에 정맥 내 주사하였다. 치료 효능은 세 가지 방법으로 모니터하였다: 종양 부피(피하 종양의 경우, 기계식 캘리퍼로 측정), 종양의 발광 및 생존. 비침습적 생물 발광 영상화는 IVIS 스펙트럼(IVIS Spectrum) 영상화 시스템(Caliper Life Sciences, Inc., MA)을 사용하여 수행하였고, 종양 성장은 리빙 이미지(Living Image) 3.0 소프트웨어(Caliper Life Sciences)를 사용하여 정량하였다. 동물의 생존을 모니터하고 매일 기록하였다.
유세포 측정법: 유세포 측정법을 이용하여 기관, 복막 또는 말초 혈액에서 추출한 림프구를 분석하였다. 세포를 1x RBC 용해 완충액(eBioscience)으로 처리하여 적혈구를 제거하였다. 복강 세포를 수집하고 다양한 Ab로 염색하고, HBSS 완충액(Mediatech)으로 2회 세척하고, LSR II 기기(BD Biosciences, San Jose, CA)를 사용하여 분석하였다. 플로우조(FlowJo)(Tree Star, San Carlos, CA)를 사용하여 데이터를 분석하였다.
SV / Fluc의 생물 발광 영상화: 종양 보유 및 종양 비보유 마우스에게 SV/Fluc(0.5ml의 옵티멤 I 0.5ml 중의 ~107 플라크 형성 단위)를 i.p. 주사하였다. 처리 후, 명시된 시점에 IVIS에 의해 생물 발광 신호를 검출하였다(Tseng, J.C. et al., 2004).
실시예 2 - 항종양 면역을 유도하기 위한 다중 에피토프를 발현하는 신드 비스 바이러스 벡터의 제작
푸린 효소 절단 부위에 의해 분리된 다중 T 세포 인식 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(DNA 서열; 미니 유전자)는 표준 분자 생물학적 방법을 사용하여 진아트(GeneArt)®(Life Technologies Corp., Waltham MA)에 의해 합성하였다. 합성 폴리뉴클레오티드는 리보솜 결합 부위, 번역 개시 코돈, 소포체 신호 서열, 이어서 에피토프 코딩 서열이 산재된 푸린 절단 부위, 정지 코돈 및 LacZ 유전자를 대체하기 위하여 신드비스 레플리콘 pT7StuI-RLacZ#202(WO 2015/035213 A2)의 XbaI/ApaI 제한 엔도뉴클레아제 부위에 폴리뉴클레오티드 서열이 삽입되도록 하는 제한 효소 부위를 포함하였다. 신드시스 레플리콘은 XbaI 부위의 상류에 바이러스 서브 게놈 프로모터 서열 및 ApaI 부위의 하류에 위치한 mRNA 폴리 A 서열을 포함하였다. 이 합성된 DNA 서열 및 그 코딩된 아미노산 서열은 다음과 같다:
DNA 서열
TCTAGAGCCACCATGCTGGTGACAGCCATGTGTCTGCTGGGCAATGTCAGCTTCGTC
CGGAGCAAGCGGCTGCGGGGACCAGAGTCTCGGCTCCTGGAGGTGCGGAGCAAGCG
GCTGTCCCCATCTTACGCCTACCACCAGTTCGTCCGGAGCAAGCGGCTGGGCTGTGC
CTTCCTGACCGTGAAGCAGATGCGGAGCAAGCGGCTGTGAGGGCCC(서열 번호 10)
아미노산 서열
MLVTAMCLLGNVSFVRSKRLRGPESRLLEVRSKRLSPSYAYHQFVRSKRLGCAFLTVKQ
MRSKRL*(서열 번호 11)
합성된 폴리뉴클레오티드 서열을 진아트 pMX 플라스미드에 삽입하고 DNA 플라스미드로서 제공하였다. 플라스미드를 NEB 5-알파 이. 콜라이 수용성 세포(New England BioLabs)에 형질전환시켰다. 클론을 배양하고 플라스미드 DNA를 정제하였다. 클론은 DNA 서열분석(Macrogen USA)에 의해 확인하였다. 제한 효소 XbaI 및 ApaI를 사용하여 pMX 플라스미드 벡터로부터 DNA 폴리뉴클레오티드(미니유전자)를 절제하였다. 추출 후, 폴리뉴클레오티드(미니 유전자)를 pT7StuI-RLacZ#202 벡터에 클로닝하였다. 개략적으로, 기재된 미니유전자는 도 1a에 예시하였고 정확한 서열 배열은 도 1b에 나타낸다.
신드비스 바이러스 폴리펩티드가 푸린에 의해 자연적으로 프로세싱되기 때문에, 신드비스 푸린 분해 모티프, XRSKRX(서열 번호 5)(X는 소수성 잔기임)를 코딩하는 핵산 서열을 폴리뉴크레오티드에 혼입하여 종양 관련 항원의 코딩된 에피토프의 적합한 프로세싱을 가능하게 하였다. 또한, 리보솜 결합 부위, 개시 코돈 및 알파바이러스 소포체(ER) 신호 서열을 푸린-에피토프-푸린 서열의 5' 측면 영역에 코딩하였다. 푸린 분해가 일어나는 ER로의 다중 에피토프 폴리펩티드 이동을 용이하게 하기 위해 ER 신호 서열을 포함하였다. 폴리뉴클레오티드(미니 유전자)의 3' 말단에 정지 코돈을 포함하였다. 합성된 폴리뉴클레오티드 서열을 신드비스 바이러스 벡터 핵산에 높은 수준의 전사를 유도하는 바이러스 서브 게놈 프로모터 바로 하류에 클로닝하기 위해서, 제한 효소 부위, XbaI 및 ApaI을 폴리뉴클레오티드의 5' 및 3' 말단에 각각 분자적으로 조작하였다.
이 실시예에서, 상이한 종양 관련 항원의 2개 이상의 에피토프, 즉 3개의 상이한 에피토프, 다시 말해, 본원에 기재되는 바와 같이, 인간 난소암 및 기타 인간 암에서 발현되는 종양 관련 항원인 인간 NY-ESO-1의 에피토프; 내인성 쥣과 백혈병 바이러스 항원인 gp70의 에피토프; 및 많은 종양에서 고발현되는 항아폽토시스 단백질인 서바이빈의 에피토프를 신드비스 바이러스 벡터에 혼입하였다. 3개의 에피토프는 표 30에 나타나 있으며 CT26 종양에서 고발현되지만, 정상 마우스 조직에서는 저발현된다.
<표 30>
Figure pct00073
생체 내 항암 효능의 결정 : 상기에 기재된 바와 같이, 상이한 종양 관련 항원(TAA)의 다중(3) 에피토프를 코딩하는 신드비스 바이러스 벡터의 항종양 효능을 시험하기 위해(본원에서 "SV/MG" 또는 "SV/MG-CT26"으로 나타냄), CT26/NY-ESO-1 세포를 BALB/c 마우스에 복강 내 주사한 Balb/c CT26 결장 암종 종양 모델을 사용하였다. CT26은 인간 NY-ESO-1 cDNA로 형질감염되고 인간 NY-ESO-1 및 이의 에피토프를 안정하게 발현하는 쥣과 결장암 세포주이며, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)(버지니아주 마나사스 소재)으로부터 이용 가능하다. 감수성 마우스에 주사되면, 세포는 동물에서 고형 종양을 형성한다. CT26 세포는 또한 동물 연구에서 종양을 검출하는 것을 돕기 위해 단백질, 예를 들어, LacZ, 루시퍼라제, GFP로 형질 감염될 수 있다. 예시적인 투여 요법은 도 2a에 나타낸다.
종양의 영상화: IVIS 시스템을 사용하여 생물 발광 신호를 주기적으로 모니터하였다. 리빙 이미지 소프트웨어(Xenogen Corp., Alameda, CA)를 사용하여 영상 데이터에 그리드를 표시하고 각각의 박스 영역에서 총 생물 발광 신호(RLU: bioluminescence signal)를 적분하여 도 2b에 나타낸 데이터를 얻었다. 야생형 CT26 세포 및 LacZ 발현 CT26 세포(CT26.CL25(LacZ) 세포)는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(버지니아주 마나사스 소재)에서 얻었다. CT26.CL.25 (LacZ) 세포는 여러 가지 종양 관련 항원을 발현한다 (Castle, J.C. et al., 2014, BMC Genomics, 15:190). NY-ESO-1 에피토프를 발현하는 CT26.CL25 세포는 문헌[Gnjatic, S. et al., 2006, Adv Cancer Res, 95:1-30]에 기재된 바와 같다. Fluc 발현 플라스미드를 CT26.WT 및 CT26.CL25 세포에 안정적으로 형질감염시켜 비침습적 생물 발광 영상화를 위한 반딧불이 루시퍼라아제(Fluc) 발현 CT26 세포(CT26.WT.Fluc 및 CT26.CL25.Fluc)를 생성하였다. Fluc 발현 플라스미드는 SV40 프로모터 서열을 pGL4.20 벡터(Promega, WI)에 도입하여 제작하였다(Granot, T.et al., 2014, Mol. Ther., 22: 112- 122).
도 2b에 나타낸 바와 같이, 다중 TAA 에피토프 신드비스 바이러스 벡터(SV/MG)로 처리한 동물에서 CT26/NY-ESO-1 종양 세포의 성장은 연장된 기간 동안, 예를 들어, 투여 후 제27일까지 음성 대조군 및 무관한 대조군 신드비스 바이러스 벡터로 처리한 동물에서의 성장과 비교하여 현저하게 낮았다. 도 2b에 나타낸 대조군들은 신드비스 바이러스 벡터를 투여받지 않은 마우스(대조군), 무관한 종양 관련 항원인 박테리아 효소 베타-갈락토시다아제(LacZ)를 코딩하는 신드비스 바이러스 벡터 SV/LacZ를 투여받은 마우스; 및 NY-ESO-1 종양 관련 항원을 코딩하고 종양 보유 동물에서 CT26/NY-ESO-1 종양 세포의 성장을 효과적으로 감소시킨 양성 대조군 신드비스 바이러스 벡터, SV/NY-ESO-1이었다.
관련된 실시예에서, 종양 관련 항원의 다중 에피토프를 코딩하는 또 다른 신드비스 바이러스 벡터(예를 들어, SV/MG 벡터로 지칭됨)는 CT26 종양 마우스 모델에서 시험하기 위해 상기 기재된 동일한 기술을 사용하여 제조할 수 있다. CT26 마우스 모델에서 종양을 치료하기 위해 만든 신드비스 바이러스 벡터는 종양 관련 항원 NY-ESO-1의 에피토프, 바이러스 항원 gp70의 에피토프, 및 T 세포 유래된 단백질 키나아제(T-cell-originated protein kinase)에 대해 TOPK로도 지칭되는 종양 관련 항원 Pbk의 에피토프를 코딩한다. 유리하게는, 이들 에피토프는 CT26.CL25 종양 세포에서 고발현되지만, 마우스 조직에서 저발현된다. SV/MG 벡터에 포함된 에피토프 서열은 하기 표 31에 나타낸다. 한 실시양태에서, HIV gp120 또는 gp41의 에피토프 서열 및 인간 pbk 또는 인간 pbk 오르토로그로부터의 에피토프 서열이 SV 벡터에 포함될 수 있다.
<표 31>
Figure pct00074
신드비스 바이러스 벡터 발현을 위한 종양 관련 항원 NY-ESO-1, gp70 및 pbk의 다중 에피토프 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 하기에 개시된 바와 같이 이중 가닥 올리고머 및 DNA 프라이머(GeneLink Inc.)를 합성하여 제조하였다. 통상적인 PCR 기술을 사용하여 상동성 영역을 공유하도록 양끝이 미스-프라이밍(mis-priming)에 의해 변형되는 2개의 단편을 생성하였다. 이 2개의 단편을 혼합, 변성, 재어닐링시켰을 때, 단편의 윗 가닥의 3' 말단은 단편의 아래 가닥의 3' 말단 위에 어닐링되고, 이 중첩이 연장되어 재조합 산물을 형성하였다. 모든 에피토프 단편이 혼입될 때까지 이 과정을 반복하였다.
Figure pct00075
B. 프라이머
프라이머 1: 5' agg agc aaa aga cac agc ccc agc 3'(서열 번호 288)
프라이머 2: 5' tct ttt gct cct gaa ctg gtg gta 3'(서열 번호 289)
프라이머 3: 5' tac cac cag ttc agg agc aaa aga 3'(서열 번호 290)
프라이머 4: 5' tct ttt gct cct gaa gca ctg ggt 3'(서열 번호 291)
프라이머 5: 5' acc cag tgc ttc agg agc aaa aga 3'(서열 번호 292)
프라이머 6: 5' ggt cac agc ggc ggg gaa 3'(서열 번호 293)
PCR 및 오버행 연장에 의한 스플라이싱(SOE: splicing by overhang extension) PCR 반응은 서모사이클러에서 각 사이클이 94℃에서 1분, 50℃에서 2분, 72℃에서 3분으로 이루어진 25 사이클을 수행하였다. Taq-PCR 반응은 dNTP(200 μM), 정방향 및 역방향 프라이머(각각 0.5 μM) 및 1 μ Taq-DNA 중합 효소를 함유하는 반응 완충액으로 최종 부피 20 μl로 수행하였다. PCR 산물을 아가로스 겔에서 전기영동으로 분석하고 DNA 밴드를 겔에서 절제하고 겔 추출 키트(Zymo Research)로 정제하였다. 완성된 다중 에피토프 단편을 pT7StuI-R △LacZ#202 플라스미드 벡터의 NaeI 부위에 평활 말단 결찰시키고, 이. 콜라이에 형질전환시키고, 정제하고 서열분석하였다.
실시예 3 - 종양 관련 항원의 다중 에피토프를 코딩하는 신드비스 바이러스 벡터는 폴리에피토프 mRNA를 생성한다
상기 실시예 2에서 기재된 바와 같이, 종양 관련 항원, 즉 NY-ESO-1, gp70 및 서바이빈의 다중 에피토프를 코딩하는 신드비스 바이러스 벡터(SV/MG-CT26)가 정확한 다중 에피토프 mRNA를 생산하는지를 결정하기 위하여 실험을 수행하였다. 실험을 위해, 본원에서 "SV/MG-CT.26"이라 지칭되는 다중 에피토프를 코딩하는 신드비스 바이러스 벡터의 10배 연속 희석액(100-1011)을 사용하여 2 x 104개 새끼 햄스터 신장 세포를 감염시켰다. 밤새 인큐베이션 후, 세포를 원심분리에 의해 수집하고, 키아젠(Qiagen) 키트(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 RNA를 단리하였다. RNA는 나노드롭 분광 광도계를 사용하여 정량하였다.
각 샘플 1 마이크로그램(1 μg)을 서모스크립트(ThermoScript)(Life Technologies, CA)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 역전사하였다. cDNA5_R 역방향 프라이머 5' TTTTTGAAATGTTAAAAACAAAATTTTGTTG(서열 번호 294)를 50μM의 농도로 사용하여 RNA를 cDNA로 전사하였다. 정량 PCR(qPCR)은 총 cDNA 반응 30 ㎕ 중 5 ㎕를 사용하여 수행하였다. 사이버 그린 마스터(Syber green master) 반응 혼합물을 제조사의 지시(BioRad, CA)에 따라 사용하였다. 바이러스 벡터가 만들어진 pT7StuI-R-MG_CT26 플라스미드 DNA의 10배 희석액을 사용하여 표준 곡선을 생성하였다. qPCR을 수행하기 위해, 정방향 프라이머는 신드비스 위치 7692: TGATCCGACCAGCAAAACTC(서열 번호 295)이었고, 역방향 프라이머는 cDNA5_R 위치 7990: TTTTTGAAATGTTAAAAACAAAATTTTGTTG(서열 번호 294)였다. 사용된 프라이머 농도는 10 μM이었다. qPCR은 MyiQ 사이클러(BioRad, CA)를 사용하여 수행하였다. 생산된 전사체의 희석 배수 및 피코그램(pg)은 아래 표에 제시한다.
<표 32>
Figure pct00076
도 3은 아가로오스 겔 전기영동을 거쳐 염색된 qPCR DNA 산물의 UV 이미지를 나타낸다. qPCR의 염색된 DNA 샘플의 UV 이미지에서, 레인은 다음과 같이 확인된다: 레인(-): 감염되지 않은 BHK의 cDNA; 레인(+) : pSV/MG 플라스미드로부터의 RNA/cDNA; 레인 M, 100 염기쌍 사다리 마커; 레인(-4), 레인(-3), 레인(-2), 레인(-1) 및 레인(0)은 각각 10-4, 10-3, 10-2, 10-1, 및 100 희석액의 SV/MG-CT.26으로 감염된 새끼 햄스터 신장(BHK)의 RNA의 언급된 희석액 각각의 qPCR 산물을 나타낸다. 표 32에 제시된 qPCR 실험의 결과는 NY-ESO-1, gp70 및 서바이빈 종양 관련 항원의 다중 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 BHK 세포에서 전사되었음을 나타낸다. 아가로오스 겔 전기영동은 qPCR 전사체가 204 염기쌍(bp)의 예상 크기임을 나타낸다(도 3).
실시예 4 - SV /다중- 에피토프 벡터를 이용한 전임상 예방 및 치료 요법
표 33에 제시된 치료 프로토콜을 사용하여 상기 실시예 2에 기재되고 도 2a에 나타낸 바와 같이 종양 관련 항원, 특히 NY-ESO-1 암 항원의 다중 에피토프를 코딩하는 신드비스 바이러스 벡터를 투여하여 CT26/NY-ESO-1 종양 세포의 예방, 치료 및 병용 요법을 시험하였다. 종양 세포 접종에 앞서 다중 종양 관련 항원으로부터의 에피토프를 발현하는 신드비스 바이러스 벡터 즉, SV/NY-ESO-1-gp70-서바이빈으로 동물의 예방 요법(예를 들어, 신드비스 바이러스 벡터 백신)의 효과를 결정하도록 프로토콜을 설계하였다. 또한, 2회 간격으로 투여된 추가 부스팅 접종의 효과, 단지 종양의 접종 후에 벡터 요법의 효과; 및 병용된 백신과 치료 벡터 처리의 효과를 결정하도록 프로토콜을 설계하였다.
<표 33>
Figure pct00077
실시예 5 - 신드비스 바이러스-다중 에피토프 벡터를 이용한 임상 치료
예를 들어, NY-ESO-1, CEA 또는 CA-125 중 2개 이상을 포함하여, 난소암 종양 관련 항원의 다중 에피토프를 코딩하는 신드비스 바이러스 벡터(SV/다중 에피토프 벡터)(Schwab, C.L. et al., 2014, Immunotherapy, 6:1279-1293)는 난소암 치료에 사용하기에 유리할 것이다. 종양 감소 수술을 받은 환자의 종양 스크리닝 검사는 종양 관련 항원의 다중 에피토프를 코딩하는 신드비스 바이러스 벡터를 이용한 치료가, 예를 들어 하기 실시예 6에 기재된 바와 같이, 환자의 암 또는 종양 세포 상에서 그리고 환자의 특이적 항원 제시 HLA 일배체형 상에서 TAA의 존재에 근거하여 유익할 것인가를 결정하는데 사용될 수 있다. 하나 이상의 종양 관련 항원의 다중 에피토프를 코딩하는 신드비스 바이러스 벡터의 투여 후, 환자의 면역 반응을 조사하고 치료 요법을 안내하기 위해서, 선택된 환자의 체액 샘플, 예를 들어 혈액, 혈청 또는 혈장을 얻어 혈액 림프구를 모니터할 수 있다. 예를 들어, 환자의 혈액을 시간 경과에 따라 이펙터 CD8+ T 세포의 존재에 대해 분석하고, 이펙터 세포가 감소하고 기억(CD27+CD43-CD8+) T 세포가 나타나는지를 결정할 수 있다. 당 업계의 통상적인 기술, 예를 들어 유세포 측정법, 면역조직화학법, 염색법(예를 들어, 면역 형광 염색)은 환자의 혈액 샘플을 적절한 T 세포의 존재에 대해 분석하는데 적합하다. 기억 세포 반응이 검출되면, 환자의 면역 반응을 부스트하기 위해 종양 관련 항원 에피토프를 코딩하는 신드비스 바이러스 벡터의 2차 투여가 이루어질 수 있다.
예시적인 종양 관련 항원(TAA) LacZ를 발현하는 SV 벡터가 CT26 종양 마우스 모델에서 효과적이었고, LacZ 발현 CT26 종양을 갖는 마우스의 생존을 유지시켰을 뿐 아니라(도 4a), 종양 모델에 대한 CD8+ T 세포 반응의 다양화를 유도하였다(도 4b)는 것은 박테리아 β-갈락토시다아제(LacZ) 효소를 코딩하는 신드비스 바이러스 벡터(SV/LacZ) 및 녹색 형광 단백질(GFP)을 코딩하는 비교 대조군 신드비스 바이러스 벡터(SV/GFP)를 사용한 발명자들의 연구에 의해 입증되었다. 도 4a는 상기에 기재된 상이한 신드비스 바이러스 벡터로 처리된 마우스의 생존 플롯을 나타낸다. 이들 연구에서, CT26 종양 보유 마우스를 종양 접종 4일 후에 SV/LacZ 벡터, 대조군 SV/GFP 벡터, 또는 배지(모의)로 처리하였다. 0.5ml 옵티멤(Mediatech, VA) 중 107개 바이러스 입자를 복강 내 접종으로 마우스에 투여하였다. SV/LacZ 벡터만이 적어도 60일 동안 완전한 종양 관해를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 도 4b는 신드비스 벡터 SV/LacZ로 처리된 마우스에서 특이적인 T 세포를 확인하기 위한 민감한 수단으로서 사량체, 표지된 사량체 MHC 분자(Altman, J.D. et al., 1996, Science, 274(5284):94-96)의 사용을 포함하였다. LacZ를 코딩하는 신드비스 벡터로 처리한 후, SV/LacZ 처리 마우스의 비장 세포는 내인성 CT26 종양 관련 항원인 LacZ 및 gp70에 특이적인 CD8+ T 세포를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 마우스에 투여된 SV/LacZ 벡터에 의해 생성된 것과 상이한 항원에 대해 지시된 이펙터 T 세포의 생산은 SV/LacZ 처리 동물에서 에피토프 확산이 발생했다는 것을 나타냈다. 도 4c는 SV/LacZ 벡터 또는 미접촉 대조군으로 치료 14일 후에 촬영된 대표적인 마우스의 사진을 나타내며, 여기서, 종양(CT26 결장 종양)이 미접촉 마우스(즉, SV/LacZ로 처리되지 않은 마우스)에서 성장하지만, LacZ 항원을 발현하는 SV/LacZ로 처리된 마우스(SV/LacZ 생존 마우스)에서는 성장하지 않은 것으로 밝혀졌다.
도 5B에 제시된 결과는 SV/LacZ 유도된 에피토프 확산이 LacZ 발현의 손실을 저지하는데에 성공적임을 입증한다. CT26 종양 마우스 모델에서 SV/LacZ 벡터를 마우스에 투여함으로써 생성된 이러한 SV/LacZ 의존적 에피토프 확산은 SV/LacZ 처리 마우스에서 음성 종양 세포 성장에 의해 입증된 바와 같이 SV/LacZ 신드비스 바이러스 벡터로 처리된 마우스에서의 종양 성장의 완전한 억제 및 이들의 생존에 크게 기여하였다(도 4c). 이러한 결과는 β-갈락토시다아제(LacZ)를 포함하는 SV 벡터가 LacZ 발현 CT26 종양 보유 마우스에서 현저한 치료 효과를 갖는다는 것을 입증한다.
도 5A 및 5B는 종양 관련 항원, 즉 LacZ 폴리펩티드, 및 바이러스 전달의 영상화를 위한 반딧불이 루시퍼라아제로부터 유래한 1개 이상의 에피토프를 발현하는 신드비스 바이러스 벡터(SV/TAA)를 사용하여 생체 내 처리(면역요법)의 결과를 평가하는데 사용된 영상화 및 유세포 분석법의 조합을 나타낸다. 도 5A는 SV/TAA 벡터로 마우스를 주사한 후, 본원에 기재된 신드비스 바이러스 벡터에 의해 코딩된 루시퍼라아제 종양 관련 항원의 발현 부위를 마우스에서 비침습적이고 종횡적으로 결정하는데 사용된 생체 내 영상화의 대표적인 결과를 나타낸다. SV/TAA 벡터 접종 3시간 후에 마우스를 영상화하였다. 24시간에, 종격동 및 사타구니 림프절을 추출하고 T 세포를 단리하고 T 세포 활성화 마커 CD69의 존재에 대해 평가하였다. 사타구니 림프절(ILN)에서 대조 T 세포 활성화 마커 CD69의 발현 수준과 비교하여(도 5A 및 5B), 종격동 림프절(MLN)은 루시퍼라아제 항원의 전달 부위로 확인되었고(도 5A), 24시간 후에도 강력한 CD8+ T 세포 활성화 부위로도 확인되었다(도 5B).
도 6a 내지 도 6d는 상기에 기재된 바와 같이 LacZ 폴리펩티드를 코딩하는 신드비스 바이러스 벡터(예를 들어, SV/LacZ)로 처리한 후 경과 일수에 대한 피하 LacZ+ CT26 종양을 갖는 마우스의 상대적인 종양 성장 그래프를 나타낸다. 그래프에 제시된 결과는 다음과 같이 항-CD8 항체 및 항-CD4 항체를 사용하여 대조군 또는 벡터 처리된 종양보유 마우스의 CD8+ 및 CD4+ T 세포를 고갈시키는 실험으로부터 얻었다: SV/LacZ 바이러스 벡터 또는 모의 대조군으로 최초 처리하기 1일 전에 시작하여 0.2 ㎖ PBS 중 각 유형 항체 0.4 mg를 각 마우스에 주사하고 나서, 이후로 2주 동안 2-3일 마다 항체를 주사하였다. 모의 대조 마우스에게 PBS를 주사하였다. LacZ+ CT26 종양 보유 마우스를 SV/LacZ 바이러스 벡터(신드비스/LacZ) 또는 PBS(모의)로 처리하였다. 종양 성장은 캘리퍼 측정에 의해 결정하였다. 도 6a는 모의 처리되거나 SV/LacZ 벡터로 처리된 대조 종양보유 마우스를 사용한 결과를 나타낸다. 도 6b는 모의 처리되거나 SV/LacZ 벡터로 처리된 CD4+ T 세포가 고갈된 종양보유 마우스를 사용한 결과를 나타낸다. 도 6c는 모의 처리되거나 SV/LacZ 벡터로 처리된 CD8+ T 세포가 고갈된 종양보유 마우스를 사용한 결과를 나타낸다. 도 6d는 모의 처리되거나 SV/LacZ 벡터로 처리된 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포 모두가 고갈된 종양보유 마우스를 사용한 결과를 나타낸다.
도 6b-6d에 도시된 결과는 T 세포의 정상적인 보체를 갖는 대조 마우스에서 피하 종양의 성장 감소에 대한 SV/LacZ 벡터의 치료 효과가 관찰되었지만, T 세포 고갈 마우스에서는 치료 효과가 관찰되지 않았다는 것을 입증한다. 본 발명에 따르면, 하나 이상의 종양 관련 항원의 적어도 하나, 바람직하게는 2개 이상의 에피토프를 코딩하는 신드비스 바이러스 벡터, 즉 SV/TAA 바이러스 벡터로 처리함으로써 수득된 치료 효과는 반드시 종양 세포의 직접적인 표적화를 필요로 하지 않는다. 본원의 실시예에 의해 뒷받침되는 바와 같이, SV/TAA 요법은 주사 부위를 배수시키는 림프절, 특히, 도 5A에 의해 증명되는 바와 같이, SV/TAA 바이러스 벡터의 복막 내 주사의 경우 종격동 림프절(MLN)로의 종양 관련 항원의 일과성 초기 전달을 수반하였다. SV/TAA 바이러스 벡터의 처리는 또한 동족 TAA를 발현하는 종양 세포에 대해 후속적으로 재지시되는 강력한 TAA 특이적 CD8+ T 세포 반응을 유도하였다. 또한, SV/TAA 요법은 에피토프 확산을 유도하여, TAA 손실 또는 변형에 의한 종양 탈출 문제에 대해 가능한 해결책을 제공하며, SV/TAA 요법은 궁극적으로 종양 보유 마우스의 장기간 생존 및 다중 TAA에 대해 오래 지속하는 기억 CD8+ T 세포의 생성을 유발하였다. 도 6a 내지도 6d는 SV/LacZ 바이러스 벡터의 투여 후 종양 감소가 T 세포 고갈 마우스에서 관찰되지 않았기 때문에 하나 이상, 바람직하게는 2개 이상의 종양 관련 항원 에피토프를 코딩하는 신드비스 바이러스 벡터 처리의 생체 내 치료 효과가 T 세포 의존적임을 입증한다(도 6b-6d).
다중 종양 관련 에피토프를 코딩하는 SV 벡터를 이용하는 생체 내 실험으로부터의 결과는 SV가 다중 TAA 에피토프의 면역원 전달을 위한 효과적인 치료 플랫폼을 제공한다는 것을 입증한다. 또한, SV/TAA에서 얻은 치료 효과로 종양 세포 자체가 벡터에 의해 직접 표적화되지는 않더라도 종양 세포 살해를 유발하는 항종양 면역 반응이 생성되었다. SV/TAA 요법은 주사 부위를 배수시키는 림프절, 특히 i.p. SV 주사의 경우 MLN으로의 TAA 에피토프의 일과성 초기 전달을 수반한다. 또한, SV/TAA 요법은 동족 TAA를 발현하는 종양 세포에 대해 후속적으로 재지시되고 에피토프 확산를 유도하는 강력한 TAA 특이적 CD8+ T 세포 반응을 유도하였으며, 따라서 TAA 손실 또는 변형에 의한 종양 탈출의 문제에 대해 가능한 해결책을 제공한다. 본원에서 실험 결과로 나타난 바와 같이, SV/TAA 요법은 궁극적으로 종양 보유 마우스의 장기간 생존 및 다중 TAA에 대해 오래 지속하는 기억 CD8+ T 세포의 생성을 유도한다.
실시예 6 - 신드비스 바이러스 벡터에서 사용하기 위한 종양 관련 항원 에 피토프의 예측
본 발명에 따른 신드비스 바이러스 벡터에 혼입하기 위한 하나의 종양 관련 항원의 다중 에피토프 아미노산 서열은, 예를 들어 BALB/c H2d I형 MHC에 결합하는 에피토프의 순위화하기 위해, 면역 에피토프 데이터베이스(Immune Epitope Database)(www.IEDB.org)를 사용하여 분석할 수 있다.
이 실시예는 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 및 바이러스 벡터에 의해 코딩되고 발현되는 다중 에피토프의 선별에 사용하기 위한 상이한 에피토프 예측 알고리즘을 제공한다. 종양 관련 항원 NY-ESO-1의 아미노산 서열은 3가지 예측 프로그램, 즉 HLA 대립 유전자로부터 예측되는 해리 상수에 의해 펩티드를 순위화하는 BIMAS(BioInformatics and Molecular Analysis Section) 생물 정보학 및 분자 분석부; IEDB: 면역 에피토프 데이터베이스(IEDB.org); 및 하기 기재된 바와 같이 MHC 분자에 결합하는 펩티드를 예측하는 랭크 펩(Rankpep)에 의해 분석하였다. 최적의 T 세포 반응을 생성하기 위한 에피토프 결정을 위해 분석된 NY-ESO-1 서열은 하기에 제시한다.
Figure pct00078
에피토프를 스크리닝하기 위해 일반적인 인간 대립유전자 HLA-A0201을 사용하였다.
BIMAS: 미국 국립 보건원(NIH: National Institutes of Health) 정보 기술 센터(Center for Information Technology) 생물정보학 및 분자 분석부(BIMAS)(http://www-bimas.cit.nih.gov). 이 웹 사이트에서 사용자는 HLA I형 분자에 대한 펩티드 결합 모티프를 포함하는 8-mer, 9-mer 또는 10-mer 펩티드의 위치를 찾고 순위화할 수 있다. 이 순위화는 하버드 의과 대학의 보스턴 아동 병원 및 미국 국립 보건원(NIH)(메릴랜드주 베데스다 소재)의 국립 알레르기 및 전염병 연구소(NIAID: National Institute of Allergy and Infectious Diseases)의 케네스 파커(Kenneth Parker) 박사의 문헌에서 추론한 아미노산/위치 계수 표를 사용한다. 웹 사이트는 파커 박사와 공동으로 국립 보건원, 컴퓨터 연구 & 기술(CIT: Computer Research & Technology), 컴퓨터 생명과학 및 공학 연구소(CBEL: Computational Bioscience and Engineering Laboratory), BIMAS의 로널드 테일러(Ronald Taylor)에 의해 제작되었다. BISMAS를 통해 실시할 수 있는 HLA 펩티드 모티프 검색에 대한 정보와 배경은 (https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/hla_motif_search_info.html)에서 이용 가능하다. BISMAS는 HLA 펩티드 결합 예측(HLA Peptide Binding Prediction) 및 HLA 대립 유전자로부터 예측된 해리 상수에 의해 펩티드를 순위화하는 알고리즘(들)을 제공한다. HLA 펩티드 결합 예측은 HLA I형 분자에 대해 예측된 해리 반감기를 기준으로 잠재적인 8 내지 10-mer 펩티드를 순위화한다. 펩티드/MHC I형 펩티드 결합 모티프의 분석 및 HLA 결합 펩티드의 순위화에 대한 참고 문헌으로는, 예를 들어, 문헌[Maier, R. et al., 1994, Immunogenetics, 40:306-308; Raghavan, et al., 1996, Protein Science, 5:2080-2088; Parker, K.C. et al., 1994, J. Immunol., 152:163-175; 및 Rammensee, H.G. et al., 1999, Immunogenetics, 50:213-219]이 포함된다. 펩티드 서열 및 MHC 특이성의 분석에 기초하여 에피토프 서열에 대한 정보를 얻기 위한 또 다른 데이터베이스 및 컴퓨터 소프트웨어 소스(H.G. Rammensee)는 SYFPEITHI(BMI Biomedical Informatics, SYFPEITHI@BMI-Heidelberg.com)이다.
표 34는 HLA 펩티드 모티프 검색 결과, 및 BIMAS를 통해 얻을 수 있는 관련된 사용자 파라미터 및 채점 정보를 나타낸다. 표 34의 "부분서열 잔기 목록(Subsequence Residue Listing)"에 개시된 아미노산 서열은 다음과 같다: LMWITQCFL(서열 번호 297), RLLEFYLAM(서열 번호 298), GVLLKEFTV(서열 번호 299), WITQCFLPV(서열 번호 300), QLSLLMWIT(서열 번호 301), QQLSLLMWI(서열 번호 302), SLLMWITQC(서열 번호 32), SLAQDAPPL(서열 번호 303), ILTIRLTAA(서열 번호 304), 및 LWLSISSCL(서열 번호 305).
<표 34>
Figure pct00079
IEDB: 면역 에피토프 데이터베이스(IEDB.org). IEDB 예측 도구는 HLA 대립 유전자에 대한 에피토프 결합을 예측하는 상이한 알고리즘의 컨센서스(consensus)를 사용한다. 그 후, 에피토프를 순위화한다 - 낮은 백분위 수는 높은 결합을 예측한다. MHC-1 결합 예측의 결과를 하기 표 35에 나타내었다. 표 35에 나타낸 펩티드는 다음과 같이 확인된다: SLAQDAPPL(서열 번호 303), LMWITQCFL(서열 번호 297), RLLEFYLAM(서열 번호 298), WITQCFLPV(서열 번호 300), GVLLKEFTV(서열 번호 299), AQDAPPLPV(서열 번호 306), QQLSLLMWI(서열 번호 302), LLMWITQCF(서열 번호 1), LQLSISSCL(서열 번호 307), SLLMWITQC(서열 번호 32), ILTIRLTAA(서열 번호 304), SISSCLQQL(서열 번호 308), LAMPFATPM(서열 번호 46), FATPMEAEL(서열 번호 44), CLQQLSLLM(서열 번호 309), FTVSGNILT(서열 번호 310), FYLAMPFAT(서열 번호 311).
<표 35>
Figure pct00080
랭크펩 : 이 에피토프 실험 도구는 MHC/HLA에 결합하는 공지된 펩티드의 실험 데이터를 사용하고 위치 특이적인 채점표를 사용하여 서열을 비교한다. 랭크펩은 위치 특이적 채점표(PSSM: Position Specific Scoring Matrix), 또는 MHC-펩티드 결합의 예측 인자로서 주어진 MHC 분자에 결합한다고 알려진 정렬된 펩티드 세트(예를 들어, 구조적 또는 서열 유사성에 의해 정렬된 펩티드)로부터의 프로파일을 사용한다(http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep_help.html). 또한, 어떤 펩티드가 프로테아제에 의해 프로세싱될 가능성이 있는지를 고려한다(Reche P.A. et al., 2002, Prediction of MHC Class I Binding Peptides Using Profile Motifs, Human Immunology, 63: 701-709; Reche P.A. et al., 2004, Enhancement to the RANKPEP resource for the prediction of peptide binding to MHC molecules using profiles, Immunogenetics, 56:405-419; Reche P.A. and Reinherz E.L., 2007, Prediction of peptide-MHC binding using profiles. Methods Mol Biol ., 409:185-200). 유전자 서열, 다형성 등을 포함하는 MHC 데이터베이스의 비제한적인 예로는 IMGT(ImMunoGene Tics database); IMGT/HLA 데이터베이스, dbMHC(NCBI 데이터베이스), 대립유전자 빈도 데이터베이스(Allele Frequencies database); HLA 정보학 그룹(HLA Informatics group); IHWG(International Histocompatibility Working Group: 국제 조직적합성 연구단); MHC의 유전학 및 분자 유전학(Genetics and Molecular Genetics of the MHC); 및 종양 유전자 데이터베이스(Tumor Gene Database)가 포함된다. 펩티드 데이터베이스의 비제한적인 예에는 MHCPEP, SYFPEITHI, HIV 분자 면역학 데이터베이스(Molecular Immunology Database), MHCPEP HLA 리간드/모티프 데이터베이스(MHCPEP HLA Ligand/Motif Database); MHCBN 데이터베이스(MHC 결합 및 비결합 데이터의 종합 데이터베이스); HLA 리간드/모티프 데이터베이스; 젠펩(JenPep) 데이터베이스(MHC 및 TAP 리간드, T 및 B 세포 에피토프); FIMM 데이터베이스(T 및 B 세포 에피토프); 및 MPID(MHC-peptide interaction database: MHC-펩티드 상호작용 데이터베이스)가 포함된다.
랭크펩 출력에 기초한 MHC 분자에 결합하는 펩티드의 예측 결과는 하기 표 36에 나타내었다. 표 36에 나타낸 펩티드 서열은 다음과 같이 확인된다: TVSGNILTI(서열 번호 312), SISSCLQQL(서열 번호 308), RLLEFYLAM(서열 번호 298), CLQQLSLLM(서열 번호 313), SLAQDAPPL(서열 번호 303), SLLMWITQC(서열 번호 32), SCLQQLSLL(서열 번호 314), ILTIRLTAA(서열 번호 304), QLQLSISSC(서열 번호 315), 및 WITQCFLPV(서열 번호 300).
<표 36>
Figure pct00081
상기 표 36에서, 밝은 회색으로 강조 표시된 1-5행은 예측된 결합부분을 나타낸다. 표의 2, 5 및 7행은 절단 모델에 의해 예측된 C-말단을 갖는 펩티드에 대한 정보를 제공한다.
결과 분석
NY-ESO-1 종양 관련 항원의 에피토프 분석의 결과는 상기에 기재된 알고리즘을 사용하여 단백질에서 몇몇 상이한 에피토프의 순위화를 나타냈다. 암 면역 요법에 자주 사용되는 NY-ESO-1 에피토프는 SLLMWITQC(서열 번호 32)이다. 3가지 알고리즘을 사용하여 결정된 이 에피토프의 순위는 다음과 같다:
아래 표 37에 나타낸 바와 같이, BIMAS: 7; IEDB: 10; 랭크펩 7 (10+7+7=24).
그 결과는 펩티드 RLLEFYLAM(서열 번호 298)이 또한 3가지 알고리즘 모두에 의해 높이 순위 매겨진 바와 같이 우수한 에피토프일 수 있음을 나타낸다.
<표 37>
Figure pct00082
기타 실시양태
상기 설명으로부터, 다양한 용도 및 조건에 적용하기 위해 본원에 기재된 본 발명에 변화 및 변형이 이루어질 수 있음이 명백할 것이다. 이러한 실시양태들은 또한 하기 청구항들의 범위 내에 있다.
본원에서 변수의 임의의 정의에서 요소 목록의 열거는 나열된 요소의 임의의 단일 요소 또는 조합(또는 하위 조합)으로서 해당 변수의 정의를 포함한다. 본원의 실시양태의 열거는 단일 실시양태로서 또는 다른 실시양태 또는 이들의 일부와 조합된 실시양태를 포함한다.
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 간행물은 각각의 독립적인 특허 및 간행물이 구체적으로 개별적으로 참조로 포함되도록 나타낸 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> New York University <120> VIRUS VECTORS EXPRESSING MULTIPLE EPITOPES OF TUMOR ASSOCIATED ANTIGENS FOR INDUCING ANTITUMOR IMMUNITY <130> 106621.010502PCT <160> 389 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys Phe 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gly Ser Pro Phe Pro Ala Ala Val Ile 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu Glu 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Phe Leu Thr Val Lys Lys Gln Met 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(6) <223> X represents a hydrophobic amino acid, Ala, Phe, Gly, Ile, Leu, Pro, Val. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(6) <223> X represents a hydrophobic amino acid, for example, Ala, Phe, Gly, Ile, Leu, Pro, Val. <400> 5 Xaa Arg Ser Lys Arg Xaa 1 5 <210> 6 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(8) <223> X can be Arg or Lys. N can be an integer from 0 to 6. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(8) <223> X can be Arg or Lys. N can be an integer from 0 to 6 amino acids. <400> 6 Asn Xaa Asn 1 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 8 <211> 6 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 tctaga 6 <210> 9 <211> 6 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 gggccc 6 <210> 10 <211> 216 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 tctagagcca ccatgctggt gacagccatg tgtctgctgg gcaatgtcag cttcgtccgg 60 agcaagcggc tgcggggacc agagtctcgg ctcctggagg tgcggagcaa gcggctgtcc 120 ccatcttacg cctaccacca gttcgtccgg agcaagcggc tgggctgtgc cttcctgacc 180 gtgaagcaga tgcggagcaa gcggctgtga gggccc 216 <210> 11 <211> 65 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Leu Val Thr Ala Met Cys Leu Leu Gly Asn Val Ser Phe Val Arg 1 5 10 15 Ser Lys Arg Leu Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu Glu Val Arg Ser 20 25 30 Lys Arg Leu Ser Pro Ser Tyr Ala Tyr His Gln Phe Val Arg Ser Lys 35 40 45 Arg Leu Gly Cys Ala Phe Leu Thr Val Lys Gln Met Arg Ser Lys Arg 50 55 60 Leu 65 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Phe Leu Gly Tyr Leu Ile Leu Gly Val 1 5 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ser Val Ser Glu Ser Asp Thr Ile Arg Ser Ile Ser Ile Ala Ser 1 5 10 15 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Leu Leu Ala Asn Gly Arg Met Pro Thr Val Leu Gln Cys Val Asn 1 5 10 15 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Arg Met Pro Thr Val Leu Gln Cys Val Asn Val Ser Val Val Ser 1 5 10 15 <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Cys Thr Ala Cys Arg Trp Lys Lys Ala Cys Gln Arg 1 5 10 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Val Leu Asp Gly Leu Asp Val Leu Leu 1 5 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Ser Leu Tyr Ser Phe Pro Glu Pro Glu Ala 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Ala Leu Tyr Val Asp Ser Leu Phe Phe Leu 1 5 10 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Leu Tyr Val Asp Ser Leu Phe Phe Leu 1 5 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr 1 5 10 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu 1 5 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His 1 5 10 <210> 25 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His 1 5 10 15 <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Cys Tyr Met Glu Ala Val Ala Leu 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Ser Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Leu 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Val Leu Pro Leu Thr Val Ala Glu Val 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Ala Leu Gln Gly Gly Gly Pro Pro Tyr 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Leu Tyr Pro Lys Ala Arg Leu Ala Phe 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Ala Phe Leu Pro Trp His Arg Leu Phe 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Ala Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu 1 5 <210> 35 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Met Leu Met Ala Gln Glu Ala Leu Ala Phe Leu 1 5 10 <210> 36 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Tyr Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu 1 5 10 <210> 37 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Ala Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg 1 5 10 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Leu Ala Ala Gln Glu Arg Arg Val Pro Arg 1 5 10 <210> 39 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile Arg 1 5 10 <210> 40 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Ala Pro Arg Gly Pro His Gly Gly Ala Ala Ser Gly Leu 1 5 10 <210> 41 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu 1 5 10 <210> 42 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile 1 5 10 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala 1 5 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu 1 5 <210> 45 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala Arg 1 5 10 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met 1 5 <210> 47 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu Pro Val Phe 1 5 10 <210> 48 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Glu Ala Glu Leu Ala Arg Arg Ser Leu Ala Gln 1 5 10 <210> 49 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Glu Phe Tyr Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met 1 5 10 <210> 50 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Pro Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu Thr 1 5 10 15 Ile Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg 20 25 <210> 51 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Arg Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Met Pro Phe Ala 1 5 10 <210> 52 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Gln Gly Ala Met Leu Ala Ala Gln Glu Arg Arg Val Pro Arg Ala Ala 1 5 10 15 Glu Val Pro Arg 20 <210> 53 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala Arg Arg 1 5 10 <210> 54 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Pro Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu Thr 1 5 10 15 Ile Arg Leu Thr 20 <210> 55 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly 1 5 10 <210> 56 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Ala Ala Asp His Arg Gln Leu Gln Leu Ser Ile Ser Ser Cys Leu Gln 1 5 10 15 Gln Leu <210> 57 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Leu Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile Arg Leu 1 5 10 15 <210> 58 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu Thr 1 5 10 <210> 59 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met 1 5 10 <210> 60 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Ala Gly Ala Thr Gly Gly Arg Gly Pro Arg Gly Ala Gly Ala 1 5 10 <210> 61 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn Leu Ser Leu Ser Cys 1 5 10 <210> 62 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn 1 5 10 <210> 63 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Tyr Ala Cys Phe Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser 1 5 10 15 <210> 64 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro 1 5 10 <210> 65 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile Thr Val Ser Ala Ser Gly 1 5 10 <210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Lys Thr Trp Gly Gln Tyr Trp Gln Val 1 5 <210> 67 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Ala Met Leu Gly Thr His Thr Met Glu Val 1 5 10 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Ile Thr Asp Gln Val Pro Phe Ser Val 1 5 <210> 69 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Tyr Leu Glu Pro Gly Pro Val Thr Ala 1 5 <210> 70 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Leu Leu Asp Gly Thr Ala Thr Leu Arg Leu 1 5 10 <210> 71 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Val Leu Tyr Arg Tyr Gly Ser Phe Ser Val 1 5 10 <210> 72 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Ser Leu Ala Asp Thr Asn Ser Leu Ala Val 1 5 10 <210> 73 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Arg Leu Met Lys Gln Asp Phe Ser Val 1 5 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Arg Leu Pro Arg Ile Phe Cys Ser Cys 1 5 <210> 75 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Leu Ile Tyr Arg Arg Arg Leu Met Lys 1 5 <210> 76 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Ala Leu Leu Ala Val Gly Ala Thr Lys 1 5 <210> 77 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Ile Ala Leu Asn Phe Pro Gly Ser Gln Lys 1 5 10 <210> 78 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Arg Ser Tyr Val Pro Leu Ala His Arg 1 5 <210> 79 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Val Val Pro Cys Glu Pro Pro Glu Val 1 5 <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val 1 5 <210> 81 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Tyr Leu Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys 1 5 10 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val 1 5 <210> 83 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu 1 5 <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu 1 5 <210> 85 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser Ala Val 1 5 <210> 86 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys 1 5 <210> 87 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu 1 5 <210> 88 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88 Arg Tyr Gln Leu Asp Pro Lys Phe Ile 1 5 <210> 89 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Ile Leu Phe Thr Ile Asn Phe Thr Ile 1 5 <210> 90 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Val Leu Phe Thr Ile Asn Phe Thr Ile 1 5 <210> 91 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91 Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu 1 5 <210> 92 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92 Val Leu Gln Gly Leu Leu Lys Pro Leu 1 5 <210> 93 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93 Val Leu Gln Gly Leu Leu Arg Pro Val 1 5 <210> 94 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Val 1 5 <210> 95 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Lys Leu 1 5 <210> 96 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Lys Leu Thr Arg Gly Ile Val Glu Leu 1 5 <210> 97 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Gln Leu Thr Asn Gly Ile Thr Glu Leu 1 5 <210> 98 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98 Gln Leu Thr His Asn Ile Thr Glu Leu 1 5 <210> 99 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val 1 5 <210> 100 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Met Leu 1 5 <210> 101 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 101 Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val 1 5 <210> 102 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102 Ile Leu Asp Ser Ser Glu Glu Asp Lys 1 5 <210> 103 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 103 Tyr Leu Pro Lys Ser Trp Thr Ile Gln Val 1 5 10 <210> 104 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 104 Trp Ile His Glu Gln Met Glu Arg Asp Leu Lys Thr 1 5 10 <210> 105 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 105 Leu Leu Ala Asn Ala Tyr Ile Tyr Val 1 5 <210> 106 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 106 Tyr Leu Leu Cys Lys Ala Phe Gly Ala 1 5 <210> 107 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 107 Lys Leu Ser Pro Tyr Val His Tyr Thr 1 5 <210> 108 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 108 Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly 1 5 10 15 Val Thr Ser Ala 20 <210> 109 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 109 Ser Thr Ala Pro Pro Val His Asn Val 1 5 <210> 110 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110 Leu Leu Leu Leu Thr Val Leu Thr Val 1 5 <210> 111 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111 Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr 1 5 10 <210> 112 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112 Met Leu Ala Val Ile Ser Cys Ala Val 1 5 <210> 113 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 113 Arg Gln Lys Arg Ile Leu Val Asn Leu 1 5 <210> 114 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114 Asn Tyr Asn Asn Phe Tyr Arg Phe Leu 1 5 <210> 115 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 115 Glu Tyr Ser Lys Glu Cys Leu Lys Glu Phe 1 5 10 <210> 116 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 116 Glu Tyr Leu Ser Leu Ser Asp Lys Ile 1 5 <210> 117 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 117 Glu Leu Val Arg Arg Ile Leu Ser Arg 1 5 <210> 118 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 118 Ala Pro Arg Gly Val Arg Met Ala Val 1 5 <210> 119 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 119 Gln Gly Ala Met Leu Ala Ala Gln Glu Arg Arg Val Pro Arg Ala Ala 1 5 10 15 Glu Val Pro Arg 20 <210> 120 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 120 Cys Leu Ser Arg Arg Pro Trp Lys Arg Ser Trp Ser Ala Gly Ser Cys 1 5 10 15 Pro Gly Met Pro His Leu 20 <210> 121 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 121 Ile Leu Ser Arg Asp Ala Ala Pro Leu Pro Arg Pro Gly 1 5 10 <210> 122 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 122 Glu Val Asp Pro Ala Ser Asn Thr Tyr 1 5 <210> 123 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 123 Gly Val Tyr Asp Gly Arg Glu His Thr Val 1 5 10 <210> 124 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 124 Asn Tyr Lys Arg Cys Phe Pro Val Ile 1 5 <210> 125 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 125 Ser Glu Ser Leu Lys Met Ile Phe 1 5 <210> 126 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 126 Ile Asn Lys Thr Ser Gly Pro Lys Arg Gly Lys His Ala Trp Thr His 1 5 10 15 Arg Leu Arg Glu 20 <210> 127 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 127 Tyr Phe Ser Lys Lys Glu Trp Glu Lys Met Lys Ser Ser Glu Lys Ile 1 5 10 15 Val Tyr Val Tyr 20 <210> 128 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 128 Met Lys Leu Asn Tyr Glu Val Met Thr Lys Leu Gly Phe Lys Val Thr 1 5 10 15 Leu Pro Pro Phe 20 <210> 129 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 129 Lys His Ala Trp Thr His Arg Leu Arg Glu Arg Lys Gln Leu Val Val 1 5 10 15 Tyr Glu Glu Ile 20 <210> 130 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 130 Leu Gly Phe Lys Val Thr Leu Pro Pro Phe Met Arg Ser Lys Arg Ala 1 5 10 15 Ala Asp Phe His 20 <210> 131 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 131 Lys Ser Ser Glu Lys Ile Val Tyr Val Tyr Met Lys Leu Asn Tyr Glu 1 5 10 15 Val Met Thr Lys 20 <210> 132 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 132 Ser Leu Gly Trp Leu Phe Leu Leu Leu 1 5 <210> 133 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 133 Leu Ser Arg Leu Ser Asn Arg Leu Leu 1 5 <210> 134 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 134 Thr Met Asn Gly Ser Lys Ser Pro Val 1 5 <210> 135 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 135 Pro Leu Leu Glu Asn Val Ile Ser Lys 1 5 <210> 136 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 136 Ser Leu Ser Lys Ile Leu Asp Thr Val 1 5 <210> 137 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 137 Ala Ala Arg Ala Val Phe Leu Ala Leu 1 5 <210> 138 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 138 Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr 1 5 <210> 139 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 139 Lys Val Leu Glu Tyr Val Ile Lys Val 1 5 <210> 140 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 140 Ser Leu Phe Arg Ala Val Ile Thr Lys 1 5 <210> 141 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 141 Glu Val Tyr Asp Gly Arg Glu His Ser Ala 1 5 10 <210> 142 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 142 Arg Val Arg Phe Phe Phe Pro Ser Leu 1 5 <210> 143 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens 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Homo sapiens <400> 161 Lys Ile Phe Tyr Val Tyr Met Lys Arg Lys Tyr Glu Ala Met Thr 1 5 10 15 <210> 162 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 162 Lys Ile Phe Tyr Val Tyr Met Lys Arg Lys Tyr Glu Ala Met 1 5 10 <210> 163 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 163 Cys Glu Phe His Ala Cys Trp Pro Ala Phe Thr Val Leu Gly Glu 1 5 10 15 <210> 164 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 164 Ser Ser Pro Gln Gly Ser Pro Glu Pro Leu 1 5 10 <210> 165 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 165 Ile Leu Ile Asp Trp Leu Val Gln Val 1 5 <210> 166 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 166 Phe Leu Lys Asn Val Gly Glu Ser Val 1 5 <210> 167 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 167 Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu 1 5 10 <210> 168 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 168 Lys Phe Leu Asp Ala Leu Ile Ser Leu 1 5 <210> 169 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 169 Ala Leu Gly Gly His Pro Leu Leu Gly Val 1 5 10 <210> 170 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 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246 Ser Leu Ile Ala Ala Ala Ala Phe Cys Leu Ala 1 5 10 <210> 247 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 247 Val Val Met Ser Trp Ala Pro Pro Val 1 5 <210> 248 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 248 Asn Ser Asn His Val Ala Ser Gly Ala Gly Glu Ala Ala Ile Glu Thr 1 5 10 15 Gln Ser Ser Ser Ser Glu Glu Ile Val 20 25 <210> 249 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 249 Ile Leu Phe Gly Ile Ser Leu Arg Glu Val 1 5 10 <210> 250 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 250 Lys Val Val Glu Phe Leu Ala Met Leu 1 5 <210> 251 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 251 Ser Ser Ala Leu Leu Ser Ile Phe Gln Ser Ser Pro Glu 1 5 10 <210> 252 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 252 Ser Phe Ser Tyr Thr Leu Leu Ser Leu 1 5 <210> 253 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 253 Val Ser Ser Phe Phe Ser Tyr Thr Leu 1 5 <210> 254 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 254 Lys Pro Leu Phe Arg Arg Met Ser Ser Leu Glu Leu Val Ile Ala 1 5 10 15 <210> 255 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 255 Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr 1 5 <210> 256 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 256 Lys Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu 1 5 <210> 257 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 257 Thr Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe 1 5 <210> 258 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 258 Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu 1 5 <210> 259 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 259 Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr 1 5 10 <210> 260 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 260 Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu 1 5 <210> 261 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 261 Trp Gln Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe 1 5 <210> 262 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 262 Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu Glu Tyr 1 5 10 15 <210> 263 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 263 Arg Lys Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg 1 5 10 15 <210> 264 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 264 Ala Cys Tyr Glu Phe Leu Trp 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PRT <213> Homo sapiens <400> 273 Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Ser 20 <210> 274 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 274 Met Asn Lys Val Lys Phe Tyr Val Leu Phe Thr Ala Leu Leu Ser Ser 1 5 10 15 Leu Cys Ala His Gly Ala Pro Gln Ser Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu 20 25 30 Tyr His Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr 35 40 45 Thr Glu Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys 50 55 60 Ser Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp 65 70 75 80 Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr 85 90 95 Tyr Leu Thr Glu Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys 100 105 110 Thr Pro Asn Ser Ile Ala Ala Ile Ser Met Glu Asn 115 120 <210> 275 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 275 Lys Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu Leu Val 1 5 10 <210> 276 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 276 Ile Asp Lys Ile Ser Asp Val Ser Thr Ile Val Pro Tyr Ile 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Asp Lys Val Leu Val His Leu 1 5 <210> 327 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 327 Gly Leu Phe Gly Asp Ile Tyr Leu Ala 1 5 <210> 328 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 328 Met Ile Phe Glu Lys His Gly Phe Arg Arg Thr Thr Pro Pro 1 5 10 <210> 329 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 329 Ser Leu Ala Asp Glu Ala Glu Val Tyr Leu 1 5 10 <210> 330 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 330 Thr Leu Asp Trp Leu Leu Gln Thr Pro Lys 1 5 10 <210> 331 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 331 Ile Leu Asn Ala Met Ile Ala Lys Ile 1 5 <210> 332 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 332 Trp Arg Arg Ala Pro Ala Pro Gly Ala 1 5 <210> 333 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 333 Pro Val Thr Trp Arg Arg Ala Pro Ala 1 5 <210> 334 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 334 Phe Leu Glu Gly Asn Glu Val Gly Lys Thr Tyr 1 5 10 <210> 335 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 335 Lys Thr Leu Thr Ser Val Phe Gln Lys 1 5 <210> 336 <211> 9 <212> PRT <213> Homo 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Val Leu Tyr Cys Leu 1 5 <210> 365 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 365 Cys Leu Leu Trp Ser Phe Gln Thr Ser Ala 1 5 10 <210> 366 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 366 Tyr Met Asp Gly Thr Met Ser Gln Val 1 5 <210> 367 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 367 Ile Tyr Met Asp Gly Thr Ala Asp Phe Ser Phe 1 5 10 <210> 368 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 368 Gln Cys Ser Gly Asn Phe Met Gly Phe 1 5 <210> 369 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 369 Thr Pro Arg Leu Pro Ser Ser Ala Asp Val Glu Phe 1 5 10 <210> 370 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 370 Leu Pro Ser Ser Ala Asp Val Glu Phe 1 5 <210> 371 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 371 Leu His His Ala Phe Val Asp Ser Ile Phe 1 5 10 <210> 372 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 372 Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe 1 5 <210> 373 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 373 Gln Asn Ile Leu Leu Ser Asn Ala Pro Leu Gly Pro Gln Phe Pro 1 5 10 15 <210> 374 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 374 Ser Tyr Leu Gln Asp Ser Asp Pro Asp Ser Phe Gln Asp 1 5 10 <210> 375 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 375 Phe Leu Leu His His Ala Phe Val Asp Ser Ile Phe Glu Gln Trp Leu 1 5 10 15 Gln Arg His Arg Pro 20 <210> 376 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 376 Tyr Thr Thr Ala Glu Glu Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val Ile 1 5 10 15 Leu Gly Val Leu Leu Leu Ile Gly Cys Trp Tyr Cys Arg Arg 20 25 30 <210> 377 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 377 Ala Leu Asn Phe Pro Gly Ser Gln Lys 1 5 <210> 378 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 378 Val Tyr Phe Phe Leu Pro Asp His Leu 1 5 <210> 379 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 379 Arg Thr Lys Gln Leu Tyr Pro Glu Trp 1 5 <210> 380 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 380 His Thr Met Glu Val Thr Val Tyr His Arg 1 5 10 <210> 381 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 381 Ser Ser Pro Gly Cys Gln Pro Pro Ala 1 5 <210> 382 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 382 Val Pro Leu Asp Cys Val Leu Tyr Arg Tyr 1 5 10 <210> 383 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 383 Leu Pro His Ser Ser Ser His Trp Leu 1 5 <210> 384 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 384 Ser Asn Asp Gly Pro Thr Leu Ile 1 5 <210> 385 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 385 Gly Arg Ala Met Leu Gly Thr His Thr Met Glu Val Thr Val Tyr 1 5 10 15 <210> 386 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 386 Trp Asn Arg Gln Leu Tyr Pro Glu Trp Thr Glu Ala Gln Arg Leu Asp 1 5 10 15 <210> 387 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 387 Thr Thr Glu Trp Val Glu Thr Thr Ala Arg Glu Leu Pro Ile Pro Glu 1 5 10 15 Pro Glu <210> 388 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 388 Thr Gly Arg Ala Met Leu Gly Thr His Thr Met Glu Val Thr Val Tyr 1 5 10 15 His <210> 389 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 389 Glu Ala Glu Leu Ala Arg Arg Ser Leu Ala Gln 1 5 10

Claims (101)

  1. 알파바이러스 단백질 또는 이의 단편, 및 하나 이상의 종양 관련 항원의 2개 이상의 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 각각의 에피토프는 효소 절단 부위에 의해 분리되는 것인 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 알파바이러스 단백질 또는 이의 단편은 신드비스 바이러스 단백질 또는 이의 단편인 폴리뉴클레오티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 2개 이상의 에피토프는 5-30개 아미노산을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 관련 항원은 암 또는 종양 세포의 표면상에서 발현되거나, 암 또는 종양 세포의 세포기질에서 발현되는 것인 폴리뉴클레오티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 에피토프는 표 1-28 중 어느 하나에 열거된 종양 관련 항원의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  6. 제4항에 있어서, 2개 이상의 에피토프는 칼리크레인 4, 유두종 바이러스 결합 인자(PBF: papillomavirus binding factor), 흑색종의 우선적으로 발현되는 항원(PRAME: preferentially expressed antigen of melanoma), 윌름스 종양-1(WT1: Wilms' tumor-1), 히드록시스테로이드 데히드로게나아제 유사 1(HSDL1: Hydroxysteroid Dehydrogenase Like 1), 메소텔린, 암 정소 항원(NY-ESO-1), 암배아 항원(CEA: carcinoembryonic antigen), p53, 인간 표피 성장 인자 수용체 2/신경성 수용체 티로신 키나아제(Her2/Neu), 암종 관련 표피 세포 부착 분자(EpCAM: carcinoma-associated epithelial cell adhesion molecule), 난소 및 자궁 암종 항원(CA125), 엽산 수용체 α, 정자 단백질 17, 종양 관련 차등 발현 유전자-12(TADG-12: tumor-associated differentially expressed gene-12), 뮤신-16(MUC-16), L1 세포 부착 분자(L1CAM), 만난-MUC-1, 인간 내인성 레트로바이러스 K(HERV-K-MEL), 키타큐슈 폐암 항원-1(KK-LC-1: Kita-kyushu lung cancer antigen-1), 인간 암/정소 항원(KM-HN-1), 암 정소 항원(LAGE-1), 흑색종 항원-A1(MAGE-A1), 정자 표면 투명대 결합 단백질(Sp17), 활막 육종-X 절단점 4(SSX-4: Synovial Sarcoma, X Breakpoint 4), 일과성 축삭 당단백질-1(TAG-1: Transient axonal glycoprotein-1), 일과성 축삭 당단백질-2(TAG-2), 인에이블드 호몰로그(ENAH: Enabled Homolog), 맘마글로빈-A, NY-BR-1, 유방암 항원(BAGE-1), B 흑색종 항원, 흑색종 항원-A1(MAGE-A1), 흑색종 항원-A2(MAGE-A2), 뮤신 k, 활막 육종-X 절단점 2(SSX-2), 택솔 내성 관련 유전자-3(TRAG-3: Taxol-resistance-associated gene-3), 조류 골수구종증 바이러스 종양유전자(c-myc), 사이클린 B1, 뮤신 1(MUC1), p62, 서바이빈(survivin), 림프구 공통 항원(CD45), 딕코프(Dickkopf) WNT 신호전달 경로 억제 인자 1(DKK1), 텔로머라아제, 커스틴 쥐(Kirsten rat) 육종 바이러스 종양유전자 상동체(K-ras), G250, 장 카복실 에스테라아제, 알파-태아단백질, 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF: Macrophage Colony-Stimulating Factor), 전립선 특이적 막 항원(PSMA: Prostate-specific membrane antigen), 카스파아제 5(CASP-5), 시토크롬 C 산화효소 어셈블리 인자 1 상동체(COA-1: Cytochrome C Oxidase Assembly Factor 1 Homolog-1), O-결합된 β-N-아세틸글루코사민 트랜스퍼라아제(OGT: O-linked β-N-acetylglucosamine transferase), 골육종 증폭된 9(Osteosarcoma Amplified 9), 소포체 렉틴(OS-9), 형질전환 성장 인자 베타 수용체 2(TGF-베타RII: Transforming Growth Factor Beta Receptor 2), 쥣과 백혈병 당단백질 70(gp70), 칼시토닌 관련 폴리펩티드 알파(CALCA: Calcitonin Related Polypeptide Alpha), 세포 예정사 1 리간드 1(Programmed Cell Death 1 Ligand 1)(CD274), 마우스 이중 극미 2 상동체(mdm-2: Mouse Double Minute-2), 알파-액티닌-4, 신장 인자 2, 말산 효소 1(ME1: Malic Enzyme 1), 핵 전사인자 Y 서브유닛 C(NFYC: Nuclear Transcription Factor Y Subunit C), G 항원 1,3(GAGE-1,3), 흑색종 항원-A6(MAGE-A6), 암 정소 항원 XAGE-1b, 전립선의 6회 막관통 상피 항원 1(STEAP1: six transmembrane epithelial antigen of the prostate 1), PAP, 전립선 특이적 항원(PSA: prostate specific antigen), 섬유아세포 성장 인자 5(FGF5: Fibroblast Growth Factor 5), 열 충격 단백질 hsp70-2, 흑색종 항원-A9(MAGE-A9), Arg-특이적 ADP-리보실트랜스퍼라아제 패밀리 C(ARTC1), B-Raf 원종양유전자(B-RAF), 세린/트레오닌 키나아제, 베타-카테닌, 세포 분열 주기 27 상동체(Cdc27: Cell Division Cycle 27), 사이클린 의존성 키나아제 4(CDK4: cycline dependent kinase 4), 사이클린 의존성 키나아제 12(CDK12), 사이클린 의존성 키나아제 억제인자 2A(CDKN2A), 카제인 키나아제 1 알파 1(CSNK1A1: Casein Kinase 1 Alpha 1), 피브로넥틴 1(FN1: Fibronectin 1), 성장 정지 특이적 7(GAS7: Growth Arrest Specific 7), 당백질 비전이성 흑색종 단백질 B(GPNMB: glycoprotein nonmetastatic melanoma protein B), HAUS 오그민 유사 복합체 서브유닛 3(HAUS3), LDLR-푸코실트랜스퍼라아제, T 세포에 의해 인식되는 흑색종 항원 2(MART2: Melanoma Antigen Recognized By T-Cells 2), 마이오스타틴(MSTN: myostatin), 흑색종 관련 항원(돌연변이된) 1(MUM-1-2-3), 폴리(A) 폴리머라아제 감마(네오-PAP), 미오신 I형, 단백질 포스파타아제 1 조절 서브유닛 3B(PPP1R3B), 페록시레독신-5(PRDX5), 수용체형 티로신-단백질 포스파타아제 카파(PTPRK), 형질전환 단백질 N-Ras(N-ras), 망막모세포종 관련 인자 600(RBAF600: retinoblastoma-associated factor 600), 시르투인-2(SIRT2), SNRPD1, 트리오스포스페이트 이소머라아제, 눈백색증 1형 단백질(OA1: Ocular Albinism Type 1 Protein), RAS 종양유전자 패밀리 구성원(RAB38), 티로시나아제 관련 단백질 1-2(TRP-1-2), 흑색종 항원 Gp75(gp75), 티로시나아제, 멜란-A(MART-1), 당단백질 100 흑색종 항원(gp100), N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제 V 유전자(GnTVf), 림프구 항원 6 복합체 유전자좌 K(LY6K), 흑색종 항원-A10(MAGE-A10), 흑색종 항원-A12(MAGE-A12), 흑색종 항원-C2(MAGE-C2), 흑색종 항원 NA88-A, 택솔 내성 관련 단백질 3(TRAG-3), PDZ 결합 키나아제(pbk), 카스파아제 8(CASP-8), 육종 항원 1(SAGE), 절단점군 영역-아벨슨 종양유전자(BCR-ABL: Breakpoint Cluster Region-Abelson oncogene), 백혈병 내 융합 단백질, dek-can, 신장 인자 Tu GTP 결합 도메인 함유 2(EFTUD2: Elongation Factor Tu GTP Binding Domain Containing 2), ETS 변이 유전자 6/급성 골수성 백혈병 융합 단백질(ETV6-AML1), FMS 유사 티로신 키나아제-3 내부 순차 중복(FLT3-ITD: FMS-like tyrosine kinase-3 internal tandem duplications), 사이클린-A1, 피브로넥틴 III형 도메인 함유 3B(FDNC3B), 전골수구성 백혈병/레티노산 수용체 알파 융합 단백질(pml-RAR알파), 흑색종 항원-C1(MAGE-C1), 막 단백질 선택적 스플라이싱된 이소형(D393-CD20), 흑색종 항원-A4(MAGE-A4), 또는 흑색종 항원-A3(MAGE-A3)으로부터 선택된 하나 이상의 종양 관련 항원의 것인 폴리뉴클레오티드.
  7. 제6항에 있어서, 2개 이상의 에피토프 중 적어도 하나는 종양 관련 항원 NY-ESO-1로부터 유래하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  8. 제6항에 있어서, 2개 이상의 에피토프 중 적어도 하나는 종양 관련 항원 MAGE-A3으로부터 유래하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  9. 제6항에 있어서, 2개 이상의 에피토프 중 하나는 종양 관련 항원 NY-ESO-1로부터 유래하고, 2개 이상의 에피토프 중 하나는 종양 관련 항원 pbk로부터 유래하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  10. 제9항에 있어서, 종양 관련 항원 NY-ESO-1 유래의 에피토프는 아미노산 서열 LLMWITQCF(서열 번호 1)를 포함하고, 종양 관련 항원 pbk 유래의 에피토프는 아미노산 서열 GSPFPAAVI(서열 번호 2)를 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  11. 제6항에 있어서, 2개 이상의 에피토프 중 하나는 종양 관련 항원 NY-ESO-1로부터 유래하고, 2개 이상의 에피토프 중 하나는 종양 관련 항원 서바이빈으로부터 유래하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  12. 제11항에 있어서, 종양 관련 항원 NY-ESO-1 유래의 에피토프는 아미노산 서열 RGPESRLLE(서열 번호 3)를 포함하고, 종양 관련 항원 서바이빈 유래의 에피토프는 아미노산 서열 AFLTVKKQM(서열 번호 4)을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  13. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 종양 관련 항원의 3개 이상의 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  14. 제13항에 있어서, 3개 이상의 에피토프는 동일한 종양 관련 항원의 것인 폴리뉴클레오티드.
  15. 제13항에 있어서, 3개 이상의 에피토프는 하나 이상의 상이한 종양 관련 항원으로부터 유래하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  16. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 종양 관련 항원의 8개 이상의 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 에피토프는 난소암, 유방암, 고환암, 췌장암, 간암, 결장암, 결장직장암, 갑상선암, 폐암, 전립선암, 신장암, 흑색종, 편평세포 암종, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 전골수구성 백혈병, 다발성 골수종, B 세포 림프종, 방광 암종, 두경부암, 식도암, 뇌암, 인두암, 설암, 활막세포 암종, 신경모세포종, 자궁암, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 기저 세포 암종, 표피모양 암종, 선암종, 한선 암종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질 암종, 기관지원성 암종, 신세포 암종, 간세포암, 담도 암종, 융모막 암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름스 종양, 자궁경부암, 소세포 폐 암종, 상피 암종, 교종(glioma), 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 신경교종(neuroglioma), 또는 망막모세포종의 암세포의 표면상에서 발현되는 종양 관련 항원의 것인 폴리뉴클레오티드.
  18. 제17항에 있어서, 에피토프는 난소암 세포, 유방암 세포, 결장암 세포, 또는 자궁경부암 세포의 표면상에서 발현되는 종양 관련 항원의 것인 폴리뉴클레오티드.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 절단 부위는 프로테아제 절단 부위인 폴리뉴클레오티드.
  20. 제19항에 있어서, 효소 절단 부위는 세린 프로테아제 절단 부위인 폴리뉴클레오티드.
  21. 제20항에 있어서, 세린 프로테아제 절단 부위는 푸린(furin), PC1, PC2, PC4, PC5, PACE4, PC7 또는 이들의 조합으로부터 선택된 단백질에 의해 절단되는 것인 폴리뉴클레오티드.
  22. 제21항에 있어서, 세린 프로테아제 절단 부위는 푸린에 의해 절단되는 것인 폴리뉴클레오티드.
  23. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 절단 부위는 아미노산 서열 XRSKRX(서열 번호 5)를 포함하며, 여기서 X는 소수성 아미노산을 나타내는 것인 폴리뉴클레오티드.
  24. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 절단 부위는 아미노산 서열 (R/K)Xn(R/K)(서열 번호 6)를 포함하며, 여기서 X는 아미노산을 나타내고 n은 0 내지 6의 정수인 폴리뉴클레오티드.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 소포체 신호 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  26. 제25항에 있어서, 5' 소포체 신호 서열은 알파바이러스, 인플루엔자 바이러스 기질 단백질 유래 펩티드 M57-68 또는 조직 플라스미노겐 활성화 인자 펩티드로부터 유래하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 열 충격 단백질 70, IgG1 Fc 도메인, 리소좀 관련 막 단백질(LAMP: lysosome-associated membrane protein), 파상풍 독소 유니버셜 헬퍼 T(Th) 에피토프, 또는 이. 콜라이(E. coli ) 열 불안정성 장독소 B 서브유닛으로부터 선택된 면역원성 단백질을 코딩하는 3' 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20 내지 IL-36, 케모카인 CCL1 내지 CCL27, CC 케모카인 CXCL1 내지 CXCL13, CXC 케모카인, C 케모카인, CX3C 케모카인, 사이토카인 또는 케모카인 수용체, 가용성 수용체, 형질전환 성장 인자-베타(TGF-β), 또는 종양 괴사 인자-알파(TNFα: Tumor Necrosis Factor-alpha)로부터 선택된 하나 이상의 면역자극 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 면역자극 단백질은 IL-12인 폴리뉴클레오티드.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 자살 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  31. 제30항에 있어서, 하나 이상의 자살 유전자는 불활성 프로드러그를 세포독성 대사 물질로 전환할 수 있는 것인 폴리뉴클레오티드.
  32. 제31항에 있어서, 불활성 프로드러그는 간시클로버, 아시클로버, 1-(2-데옥시-2-플루오로-β-D-아라비노푸라노실)-5-요오도우라실(FIAU), 6-메톡시퓨린 아라비노시드, 및 5-플루오로시토신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리뉴클레오티드.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 자살 유전자는 티미딘 키나아제 또는 시토신 데아미나아제를 코딩하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  34. 제33항에 있어서, 티미딘 키나아제는 단순 포진 바이러스(Herpes Simplex Virus)(HSVtk) 또는 수두 대상포진 바이러스(Varicella Zoster Virus)(VZV-tk)로부터 유래하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 또는 DNA를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  36. 제35항에 있어서, 단일 가닥 RNA를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 입자.
  38. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터.
  39. 제38항에 있어서, 알파바이러스, 렌티바이러스, 또는 레트로바이러스로부터 선택되는 바이러스 벡터.
  40. 제39항에 있어서, 신드비스 바이러스로부터 유래하는 바이러스 벡터.
  41. 제39항에 있어서, 하나 이상의 신드비스 바이러스 외피 단백질로 위형화된(pseudotyped) 바이러스 벡터.
  42. 제41항에 있어서, 하나 이상의 신드비스 바이러스 외피 단백질은 신드비스-ZZ E2 단백질을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  43. 제39항에 있어서, 하나 이상의 신드비스 바이러스 외피 단백질로 위형화된 렌티바이러스인 바이러스 벡터.
  44. 제39항에 있어서, 하나 이상의 신드비스 바이러스 외피 단백질로 위형화된 레트로바이러스인 바이러스 벡터.
  45. 제38항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 복제 결함 바이러스 벡터 또는 복제 가능 바이러스 벡터인 바이러스 벡터.
  46. 제38항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 비통합(non-integrating) 바이러스 벡터인 바이러스 벡터.
  47. 제38항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에 투여 후, 하나 이상의 종양 관련 항원의 2개 이상의 에피토프를 발현하는 종양 또는 암에 대해 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스 벡터.
  48. 제47항에 있어서, 대상체는 인간 환자인 바이러스 벡터.
  49. 종양 관련 항원의 5-30개 아미노산을 포함하는 2개 이상의 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 신드비스 바이러스 벡터로서, 각각의 에피토프는 푸린 효소 절단 부위에 의해 분리되는 것인 신드비스 바이러스 벡터.
  50. 하나 이상의 신드비스 바이러스 외피 단백질로 위형화된 바이러스 벡터로서, 종양 관련 항원의 5-30개 아미노산을 포함하는 2개 이상의 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 각각의 에피토프는 푸린 효소 절단 부위에 의해 분리되는 것인 바이러스 벡터.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 2개 이상의 에피토프는 표 1-28 중 어느 하나에 열거된 종양 관련 항원의 아미노산 서열을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  52. 제51항에 있어서, 2개 이상의 에피토프는 칼리크레인 4, PBF, PRAME, WT1, HSDL1, 메소텔린, NY-ESO-1, CEA, p53, Her2/Neu, EpCAM, CA125, 엽산 수용체 α, 정자 단백질 17, TADG-12, MUC-16, L1CAM, 만난-MUC-1, HERV-K-MEL, KK-LC-1, KM-HN-1, LAGE-1, MAGE-A4, Sp17, SSX-4, TAG-1, TAG-2, ENAH, 맘마글로빈-A, NY-BR-1, BAGE-1, MAGE-A1, MAGE-A2, 뮤신k, SSX-2, TRAG-3, c-myc, 사이클린 B1, MUC1, p62, 서바이빈, CD45, DKK1, RU2AS, 텔로머라아제, K-ras, G250, 헵신, 장 카복실 에스테라아제, 알파-태아단백질, M-CSF, PSMA, CASP-5, COA-1, OGT, OS-9, TGF-베타RII, gp70, CALCA, CD274, mdm-2, 알파-액티닌-4, 신장 인자 2, ME1, NFYC, GAGE-1, MAGE-A6, XAGE-1b, PSMA, STEAP1, PAP, PSA, GAGE3, FGF5, 헵신, hsp70-2, MAGE-A9, ARTC1, B-RAF, 베타-카테닌, Cdc27, CDK4, CDK12, CDKN2A, CLLP, CSNK1A1, FN1, GAS7, GPNMB, HAUS3, LDLR-푸코실트랜스퍼라아제, MART2, MATN, MUM-1, MUM-2, MUM-3, 네오-PAP, 미오신 I형, PPP1R3B, PRDX5, PTPRK, N-ras, RBAF600, SIRT2, SNRPD1, 트리오스포스페이트 이소머라아제, OA1, RAB38, TRP-1, gp75, TRP2, 티로시나아제, MART-1, gp100, GnTVf, LY6K, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-C2, NA88-A, TRAG-3, TRP2-INT2g, pbk, CASP-8, SAGE, BCR-ABL, dek-can, EFTUD2, ETV6-AML1, FLT3-ITD, 사이클린-A1, FDNC3B, pml-RAR알파, MAGE-C1, D393-CD20, MAGE-A4, 및 MAGE-A3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 종양 관련 항원의 것인 바이러스 벡터.
  53. 제52항에 있어서, 2개 이상의 에피토프 중 적어도 하나는 종양 관련 항원 NY-ESO-1로부터 유래하고, 2개 이상의 에피토프 중 적어도 하나는 종양 관련 항원 서바이빈으로부터 유래하는 것인 바이러스 벡터.
  54. 제52항에 있어서, 2개 이상의 에피토프 중 하나는 종양 관련 항원 NY-ESO-1로부터 유래하고, 2개 이상의 에피토프 중 하나는 종양 관련 항원 pbk로부터 유래하는 것인 바이러스 벡터.
  55. 제52항에 있어서, 종양 관련 항원 NY-ESO-1 유래의 에피토프는 아미노산 서열 LLMWITQCF(서열 번호 1) 또는 아미노산 서열 RGPESRLLE(서열 번호 3)를 포함하고, 종양 관련 항원 pbk 유래의 에피토프는 아미노산 서열 GSPFPAAVI(서열 번호 2)를 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  56. 제52항에 있어서, 2개 이상의 에피토프 중 하나는 종양 관련 항원 NY-ESO-1로부터 유래하고, 2개 이상의 에피토프 중 하나는 종양 관련 항원 서바이빈으로부터 유래하는 것인 바이러스 벡터.
  57. 제52항에 있어서, 종양 관련 항원 NY-ESO-1 유래의 에피토프는 아미노산 서열 RGPESRLLE(서열 번호 3)를 포함하고, 종양 관련 항원 서바이빈 유래의 에피토프는 아미노산 서열 AFLTVKKQM(서열 번호 4)을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  58. 제49항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 종양 관련 항원의 3개 이상의 에피토프를 코딩하는 것인 바이러스 벡터.
  59. 제49항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 종양 관련 항원의 8개 이상의 에피토프를 코딩하는 것인 바이러스 벡터.
  60. 제49항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 에피토프는 난소암, 유방암, 고환암, 췌장암, 간암, 결장직장암, 갑상선암, 폐암, 전립선암, 신장암, 흑색종, 편평세포 암종, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 전골수구성 백혈병, 다발성 골수종, B 세포 림프종, 방광 암종, 두경부암, 식도암, 뇌암, 인두암, 설암, 활막세포 암종, 신경모세포종, 자궁암, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 기저 세포 암종, 표피모양 암종, 선암종, 한선 암종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질 암종, 기관지원성 암종, 신세포 암종, 간세포암, 담도 암종, 융모막 암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름스 종양, 자궁경부암, 소세포 폐 암종, 상피 암종, 교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 신경교종, 또는 망막모세포종의 암 또는 종양 세포의 표면상에서 또는 세포기질에서 발현되는 종양 관련 항원의 것인 바이러스 벡터.
  61. 제49항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 소포체 신호 서열을 포함하는 바이러스 벡터.
  62. 제61항에 있어서, 5' 소포체 신호 서열은 알파바이러스, 인플루엔자 바이러스 기질 단백질 유래 펩티드 M57-68 또는 조직 플라스미노겐 활성화 인자 펩티드로부터 유래하는 것인 바이러스 벡터.
  63. 제49항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 열 충격 단백질 70, IgG1 Fc 도메인, 리소좀 관련 막 단백질(LAMP), 파상풍 독소 유니버셜 헬퍼 T(Th) 에피토프, 또는 이. 콜라이 열 불안정성 장독소 B 서브유닛으로부터 선택된 면역원성 단백질을 코딩하는 3' 서열을 포함하는 바이러스 벡터.
  64. 제49항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20 내지 IL-36, 케모카인 CCL1 내지 CCL27, CC 케모카인 CXCL1 내지 CXCL13, CXC 케모카인, C 케모카인, CX3C 케모카인, 사이토카인 또는 케모카인 수용체, 가용성 수용체, 형질전환 성장 인자-베타(TGF-β), 또는 종양 괴사 인자-알파(TNFα)로부터 선택된 하나 이상의 면역자극 단백질을 코딩하는 것인 바이러스 벡터.
  65. 제49항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 자살 유전자를 포함하는 바이러스 벡터.
  66. 제65항에 있어서, 하나 이상의 자살 유전자는 불활성 프로드러그를 세포독성 대사 물질로 전환할 수 있는 것인 바이러스 벡터.
  67. 제66항에 있어서, 불활성 프로드러그는 간시클로버, 아시클로버, 1-(2-데옥시-2-플루오로-β-D-아라비노푸라노실)-5-요오도우라실(FIAU), 6-메톡시퓨린 아라비노시드, 및 5-플루오로시토신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 바이러스 벡터.
  68. 제65항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 자살 유전자는 티미딘 키나아제 또는 시토신 데아미나아제를 코딩하는 것인 바이러스 벡터.
  69. 제68항에 있어서, 티미딘 키나아제는 단순 포진 바이러스(HSVtk) 또는 수두 대상포진 바이러스(VZV-tk)로부터 유래하는 것인 바이러스 벡터.
  70. 제49항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에 투여 후, 하나 이상의 종양 관련 항원의 2개 이상의 에피토프를 발현하는 종양 또는 암에 대해 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스 벡터.
  71. 제70항에 있어서, 대상체는 인간인 바이러스 벡터.
  72. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 하나 이상의 유전자 조작된 신드비스 바이러스 외피 단백질로 위형화된 렌티바이러스 벡터.
  73. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 하나 이상의 유전자 조작된 신드비스 바이러스 외피 단백질로 위형화된 렌티바이러스 벡터로서, 폴리뉴클레오티드는 NY-ESO-1, MAGE-A3, pbk, 서바이빈, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 종양 관련 항원의 에피토프를 코딩하는 것인 렌티바이러스 벡터.
  74. 제38항 내지 제71항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 입자.
  75. 제72항 또는 제73항에 따른 렌티바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 입자.
  76. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포.
  77. 제38항 내지 제71항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 벡터, 또는 제72항 또는 제73항에 따른 렌티바이러스 벡터를 포함하는 세포.
  78. 제37항, 제74항 및 제75항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 입자를 포함하는 세포.
  79. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드; 제37항, 제74항 및 제75항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 입자; 또는 제38항 내지 제71항, 제72항 및 제73항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 벡터와, 약학적으로 허용되는 비히클, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물.
  80. 제79항에 있어서, 액체 제형인 약학 조성물.
  81. 둘 이상의 종양 관련 항원의 1개 이상의 에피토프를 발현하는 암 또는 종양 세포에 대해 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 상기 암 또는 종양 세포에 대해 면역 반응을 유도하기 위해서, 유효량의 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드; 제37항, 제74항 및 제75항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 입자; 제38항 내지 제71항, 제72항 및 제73항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 벡터; 또는 제79항 또는 제80항에 따른 약학 조성물을 상기 암 또는 종양 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  82. 암 또는 종양 형성을 갖고 있거나 가질 위험이 있는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 대상체에서 암을 치료하기 위해서, 치료 유효량의 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드; 제37항, 제74항 및 제75항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 입자; 또는 제38항 내지 제71항, 제72항 및 제73항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 벡터; 또는 제79항 또는 제80항에 따른 약학 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  83. 제82항에 있어서, 대상체는 인간 환자인 방법.
  84. 제81항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 암 또는 종양은 난소암, 자궁경부암, 자궁암, 유방암, 고환암, 췌장암, 간암, 결장직장암, 갑상선암, 폐암, 전립선암, 신장암, 흑색종, 편평세포 암종, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 전골수구성 백혈병, 다발성 골수종, B 세포 림프종, 방광 암종, 두경부암, 식도암, 뇌암, 인두암, 설암, 활막세포 암종, 신경모세포종, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 기저 세포 암종, 표피모양 암종, 선암종, 한선 암종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질 암종, 기관지원성 암종, 신세포 암종, 간세포암, 담도 암종, 융모막 암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름스 종양, 소세포 폐 암종, 상피 암종, 교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 신경교종, 또는 망막모세포종 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인 방법.
  85. 제84항에 있어서, 암은 난소암, 자궁경부암, 유방암 및 결장암 중 하나 이상인 방법.
  86. 제81항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 바이러스 벡터, 또는 약학 조성물은 종양 관련 항원 NY-ESO-1, p53, sp17, 서바이빈, pbk, CEA, CA125 및 WT1 중 하나 이상의, 2개 이상의 에피토프를 코딩하는 것인 방법.
  87. 제81항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 바이러스 벡터, 또는 약학 조성물은 비경구적으로 또는 예방제로서 투여되는 것인 방법.
  88. 제81항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체를 화학요법 또는 방사선으로 치료하는 단계를 더 포함하는 방법.
  89. 제81항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 이펙터 T 세포의 수준을 측정하여 평가되는 대상체의 면역 반응의 감소 후, 대상체에게 부스터를 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
  90. 제81항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 부스터는 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 이종 부스터인 방법.
  91. 제90항에 있어서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 둘 이상의 종양 관련 항원의 1개 이상의 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 각각의 에피토프는 효소 절단 부위에 의해 분리되는 것인 방법.
  92. 제91항에 있어서, 1개 이상의 에피토프는 표 1-28 중 어느 하나에 열거된 종양 관련 항원의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  93. 제92항에 있어서, 1개 이상의 에피토프는 칼리크레인 4, PBF, PRAME, WT1, HSDL1, 메소텔린, NY-ESO-1, CEA, p53, Her2/Neu, EpCAM, CA125, 엽산 수용체 α, 정자 단백질 17, TADG-12, MUC-16, L1CAM, 만난-MUC-1, HERV-K-MEL, KK-LC-1, KM-HN-1, LAGE-1, MAGE-A4, Sp17, SSX-4, TAG-1, TAG-2, ENAH, 맘마글로빈-A, NY-BR-1, BAGE-1, MAGE-A1, MAGE-A2, 뮤신k, SSX-2, TRAG-3, c-myc, 사이클린 B1, MUC1, p62, 서바이빈, CD45, DKK1, RU2AS, 텔로머라아제, K-ras, G250, 헵신, 장 카복실 에스테라아제, 알파-태아단백질, M-CSF, PSMA, CASP-5, COA-1, OGT, OS-9, TGF-베타RII, gp70, CALCA, CD274, mdm-2, 알파-액티닌-4, 신장 인자 2, ME1, NFYC, GAGE-1, MAGE-A6, XAGE-1b, PSMA, STEAP1, PAP, PSA, GAGE3, FGF5, 헵신, hsp70-2, MAGE-A9, ARTC1, B-RAF, 베타-카테닌, Cdc27, CDK4, CDK12, CDKN2A, CLLP, CSNK1A1, FN1, GAS7, GPNMB, HAUS3, LDLR-푸코실트랜스퍼라아제, MART2, MATN, MUM-1, MUM-2, MUM-3, 네오-PAP, 미오신 I형, PPP1R3B, PRDX5, PTPRK, N-ras, RBAF600, SIRT2, SNRPD1, 트리오스포스페이트 이소머라아제, OA1, RAB38, TRP-1, gp75, TRP2, 티로시나아제, MART-1, gp100, GnTVf, LY6K, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-C2, NA88-A, TRAG-3, TRP2-INT2g, pbk, CASP-8, SAGE, BCR-ABL, dek-can, EFTUD2, ETV6-AML1, FLT3-ITD, 사이클린-A1, FDNC3B, pml-RAR알파, MAGE-C1, D393-CD20, MAGE-A4 및 MAGE-A3으로 이루어진 군으로부터 선택된 둘 이상의 종양 관련 항원의 것인 방법.
  94. 제89항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 부스터는 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 바이러스 벡터, 또는 약학 조성물의 투여 후 적어도 1일 내지 적어도 2주에 대상체에게 투여하는 것인 방법.
  95. 제82항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 투여는 대상체에서 에피토프 확산을 일으키는 것인 방법.
  96. CD4+ T 세포 반응을 유도하기 위해 아미노산 서열 AKFVAAWTLKAAA(서열 번호 7)를 코딩하는 핵산 서열을 더 포함하는, 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드; 제37항, 제74항 및 제75항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 입자; 또는 제38항 내지 제71항, 제72항 및 제73항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 벡터.
  97. 하나 이상의 알파바이러스 외피 단백질로 위형화된 바이러스 벡터로서, 종양 관련 항원의 5-30개 아미노산을 포함하는 2개 이상의 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 포함하며, 각각의 에피토프는 효소 절단 부위에 의해 분리되는 것인 바이러스 벡터.
  98. 제97항에 있어서, 2개 이상의 에피토프는 표 1-28 중 어느 하나에 열거된 종양 관련 항원의 아미노산 서열을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  99. 제98항에 있어서, 2개 이상의 에피토프는 칼리크레인 4, PBF, PRAME, WT1, HSDL1, 메소텔린, NY-ESO-1, CEA, p53, Her2/Neu, EpCAM, CA125, 엽산 수용체 α, 정자 단백질 17, TADG-12, MUC-16, L1CAM, 만난-MUC-1, HERV-K-MEL, KK-LC-1, KM-HN-1, LAGE-1, MAGE-A4, Sp17, SSX-4, TAG-1, TAG-2, ENAH, 맘마글로빈-A, NY-BR-1, BAGE-1, MAGE-A1, MAGE-A2, 뮤신k, SSX-2, TRAG-3, c-myc, 사이클린 B1, MUC1, p62, 서바이빈, CD45, DKK1, RU2AS, 텔로머라아제, K-ras, G250, 헵신, 장 카복실 에스테라아제, 알파-태아단백질, M-CSF, PSMA, CASP-5, COA-1, OGT, OS-9, TGF-베타RII, gp70, CALCA, CD274, mdm-2, 알파-액티닌-4, 신장 인자 2, ME1, NFYC, GAGE-1, MAGE-A6, XAGE-1b, PSMA, STEAP1, PAP, PSA, GAGE3, FGF5, 헵신, hsp70-2, MAGE-A9, ARTC1, B-RAF, 베타-카테닌, Cdc27, CDK4, CDK12, CDKN2A, CLLP, CSNK1A1, FN1, GAS7, GPNMB, HAUS3, LDLR-푸코실트랜스퍼라아제, MART2, MATN, MUM-1, MUM-2, MUM-3, 네오-PAP, 미오신 I형, PPP1R3B, PRDX5, PTPRK, N-ras, RBAF600, SIRT2, SNRPD1, 트리오스포스페이트 이소머라아제, OA1, RAB38, TRP-1, gp75, TRP2, 티로시나아제, MART-1, gp100, GnTVf, LY6K, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-C2, NA88-A, TRAG-3, TRP2-INT2g, pbk, CASP-8, SAGE, BCR-ABL, dek-can, EFTUD2, ETV6-AML1, FLT3-ITD, 사이클린-A1, FDNC3B, pml-RAR알파, MAGE-C1, D393-CD20, MAGE-A4, 및 MAGE-A3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 종양 관련 항원의 것인 바이러스 벡터.
  100. 제97항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 절단 부위는 푸린 효소 절단 부위인 바이러스 벡터.
  101. 알파바이러스 단백질 또는 이의 단편이 바마 포레스트 바이러스(Barmah Forest virus), 바마 포레스트 바이러스 복합체, 동부 말 뇌염 바이러스(EEEV: Eastern equine encephalitis virus), 동부 말 뇌염 바이러스 복합체, 미델뷔르흐 바이러스(Middelburg virus), 미델뷔르흐 바이러스 복합체, 엔두무 바이러스(Ndumu virus), 엔두무 바이러스 복합체, 셈리키 포레스트 바이러스(Semliki Forest virus), 셈리키 포레스트 바이러스 복합체, 베바루 바이러스(Bebaru virus), 치쿤구니아 바이러스(Chikungunya virus), 마야로 바이러스(Mayaro virus), 아형 우나 바이러스(Subtype Una virus), 오니옹 니옹 바이러스(O'Nyong Nyong virus), 아형 이그보-오라 바이러스(Subtype Igbo-Ora virus), 로스 리버 바이러스(Ross River virus), 아형 게타 바이러스(Subtype Getah virus), 아형 베바루 바이러스, 아형 사기야마 바이러스(Subtype Sagiyama virus), 아형 메 트리 바이러스(Subtype Me Tri virus), 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV: Venezuelan equine encephalitis virus), VEEV 복합체, 카바쏘우 바이러스(Cabassou virus), 에버글레이즈 바이러스(Everglades virus), 모쏘 다스 페드라스 바이러스(Mosso das Pedras virus), 무캄보 바이러스(Mucambo virus), 파라마나 바이러스(Paramana virus), 픽수나 바이러스(Pixuna virus), 서부 말 뇌염 바이러스(WEEV: Western equine encephalitis virus), 리오 네그로 바이러스(Rio Negro virus), 트로카라 바이러스(Trocara virus), 아형 비주 브릿지 바이러스(Subtype Bijou Bridge virus), 서부 말 뇌염 바이러스 복합체, 아우라 바이러스(Aura virus), 바반키 바이러스(Babanki virus), 키질라가크 바이러스(Kyzylagach virus), 신드비스 바이러스, 옥켈보 바이러스(Ockelbo virus), 와타로아 바이러스(Whataroa virus), 버기 크릭 바이러스(Buggy Creek virus), 포트 모건 바이러스(Fort Morgan virus), 하이랜즈 J 바이러스(Highlands J virus), 에일라트 바이러스(Eilat virus), 연어 췌장 질환 바이러스(SPDV: Salmon pancreatic disease virus), 남방 코끼리 물범 바이러스(SESV: Southern elephant seal virus), 타이 포레스트 바이러스(Tai Forest virus), 또는 토네이트 바이러스(Tonate virus)로부터 유래하는 것인, 제1항에 따른 폴리뉴클레오티드, 제37항에 따른 바이러스 입자, 또는 제38항 또는 제97항에 따른 바이러스 벡터.
KR1020187028745A 2016-03-04 2017-03-03 항종양 면역을 유도하기 위한 종양 관련 항원의 다중 에피토프를 발현하는 바이러스 벡터 KR20180119659A (ko)

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Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20190351039A1 (en) 2017-02-01 2019-11-21 Modernatx, Inc. Immunomodulatory therapeutic mrna compositions encoding activating oncogene mutation peptides
US12116412B2 (en) 2017-03-03 2024-10-15 New York University Induction and enhancement of antitumor immunity involving virus vectors expressing multiple epitopes of tumor associated antigens and immune checkpoint inhibitors or proteins
SG11202003609VA (en) * 2017-10-25 2020-05-28 Nouscom Ag Eukaryotic cell line
US12097257B2 (en) 2018-03-05 2024-09-24 New York University Induction and enhancement of antitumor immunity involving Sindbis virus vectors expressing immune checkpoint proteins
BR112020017715A2 (pt) 2018-03-16 2020-12-29 Zoetis Services Llc Vacinas de peptídeo contra interleucina-31
TW202000906A (zh) * 2018-05-23 2020-01-01 美商葛利史東腫瘤科技公司 免疫檢查點抑制劑共表現載體
WO2019227106A1 (en) * 2018-05-25 2019-11-28 The Wistar Institute Tumor-specific neoantigens and methods of using the same
CN110856751A (zh) * 2018-08-24 2020-03-03 合成免疫股份有限公司 包含核酸及tcr修饰的免疫细胞的治疗剂及其应用
JOP20210186A1 (ar) 2019-01-10 2023-01-30 Janssen Biotech Inc مستضدات البروستاتا المستحدثة واستخداماتها
WO2020178738A1 (en) * 2019-03-04 2020-09-10 University Health Network T cell receptors and methods of use thereof
DE102019114735A1 (de) * 2019-06-02 2020-12-03 PMCR GmbH HLA-Tumorantigenpeptiden der Klasse I und II zur Behandlung von Mamma-/Brustkarzinomen
WO2020257191A1 (en) * 2019-06-19 2020-12-24 Cue Biopharma, Inc. Multimeric t-cell modulatory polypeptides and methods of use thereof
BR112021026192A2 (pt) * 2019-06-24 2022-06-07 Urteste S A Marcador de diagnóstico para câncer pancreático
EP3845664A1 (en) * 2020-01-02 2021-07-07 Urteste Sp. z o.o. Novel diagnostic marker for prostate cancer
EP4045080A1 (en) * 2019-10-16 2022-08-24 Cancer Research Technology Limited Vector for cancer treatment
WO2021087851A1 (zh) * 2019-11-07 2021-05-14 苏州工业园区唯可达生物科技有限公司 一种重组病毒载体、包含其的免疫组合物以及用途
US12018289B2 (en) 2019-11-18 2024-06-25 Janssen Biotech, Inc. Vaccines based on mutant CALR and JAK2 and their uses
JP2023518935A (ja) * 2020-03-16 2023-05-09 バイオエヌテック セル アンド ジーン セラピーズ ゲーエムベーハー 抗原特異的ｔ細胞受容体およびｔ細胞エピトープ
KR20230014694A (ko) * 2020-04-21 2023-01-30 그릿스톤 바이오, 인코포레이티드 항원-코딩 카세트
CN112457411B (zh) * 2020-11-25 2022-11-01 中国药科大学 一种幽门螺杆菌多表位串联融合蛋白lhuc及其制备方法和应用
WO2023034881A1 (en) * 2021-09-02 2023-03-09 Elixirgen Therapeutics, Inc. Temperature-controllable, rna immunotherapeutic for cancer

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1520303B (zh) * 2001-03-27 2013-04-24 纽约大学 利用基于α病毒且靶向高亲和性层粘连蛋白受体的载体进行肿瘤治疗
AU2002322009A1 (en) * 2001-05-18 2002-12-03 Mayo Foundation For Medical Education And Research Chimeric antigen-specific t cell-activating polypeptides
CN1304559C (zh) * 2001-10-09 2007-03-14 杭州康科生物技术有限公司 表达热休克蛋白的溶瘤微生物及其应用
SI2456786T2 (sl) * 2009-07-24 2017-08-31 Immune Design Corp. Lentiviralni vektorji psevdo-tipizirani z glikoproteinom ovojnice virusa Sindbis
EP3041500B1 (en) * 2013-09-06 2021-05-19 New York University Method for inducing antitumor immunity using sindbis viral vectors and tumor associated antigens

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