BR112020017715A2 - Vacinas de peptídeo contra interleucina-31 - Google Patents

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Abstract

uma composição de vacina para imunizar e/ou proteger um mamífero contra um transtorno mediado por il-31 é fornecido, em que a composição inclui: a combinação de um polipeptídeo portador e pelo menos um mimotopo selecionado de um mimotopo de il-31 felina, um mimotopo de il-31 canina, um mimotopo de il-31 de cavalo e um mimotopo de il-31 humana; e um adjuvante. tais vacinas podem estar na forma de composições farmacêuticas úteis para tratar ou proteger mamíferos, tais como gatos, cães, cavalos ou humanos contra transtornos mediados por il-31.

Description

“VACINAS DE PEPTÍDEO CONTRA INTERLEUCINA-31”
CAMPO DA INVENÇÃO
[001]A presente invenção se refere ao campo de vacinas de peptídeo e seus usos em procedimentos clínicos e científicos, incluindo procedimentos de diagnóstico.
As vacinas de peptídeo da presente invenção são úteis para imunizar e/ou proteger um mamífero, tal como um gato, cão, cavalo ou humano, contra um transtorno mediado por IL-31.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002]A dermatite atópica foi definida pela força-tarefa do American College of Veterinary Dermatology como “uma doença de pele alérgica prurítica e inflamatória geneticamente predisposta com características clínicas distintivas” (Olivry, et al.
Veterinary Immunology and Immunopathology 2001; 81: 143-146). A força-tarefa também reconheceu que a doença em caninos foi associada com IgE específica de alérgeno (Olivry, et al. 2001 supra; Marsella & Olivry Clinics in Dermatology 2003; 21: 122-133). Prurido severo, junto com alopecia e eritema secundários, são os sintomas mais perceptíveis e preocupantes para os donos do animal de estimação.
[003]Os fatores potenciais envolvidos na dermatite alérgica são numerosos e deficientemente entendidos. Os componentes no alimento podem desencadear a dermatite atópica (Picco, et al. Vet Dermatol. 2008; 19: 150-155), bem como alérgenos ambientais, tais como pulgas, ácaros, tasneira, extratos de plantas, etc. Fatores genéticos também desempenham um papel importante. Embora não haja predileção por raça confirmada, acredita-se que algum modo de herança aumente a predisposição para a dermatite atópica (Sousa & Marsella Veterinary Immunology and Immunopathology 2001; 81: 153-157; Schwartzman, et al. Clin. Exp. Immunol. 1971; 9: 549-569).
[004]A prevalência de dermatite atópica é estimada em 10 % da população canina total (Marsella & Olivry 2003 supra; Scott, et al. Canadian Veterinary Journal
2002; 43: 601-603; Hillier Veterinary Immunology and Immunopathology 2001; 81: 147-151). Mundialmente, cerca de 4,5 milhões de cães são afetados por esta condição crônica e vitalícia. A incidência parece estar aumentando. Suspeita-se das predileções de raça e sexo canino, mas podem variar muito dependendo da região geográfica (Hillier, 2001 supra; Picco, et al. 2008 supra).
[005]A dermatite alérgica felina é uma condição inflamatória e prurítica da pele que se acredita ser causada por uma resposta anormal do sistema imune a substâncias que não induzem uma reação em gatos saudáveis. A característica mais compatível da dermatite alérgica felina é prurido recorrente crônico. As apresentações clínicas comuns da dermatite alérgica em gatos incluem alopecia autoinduzida, dermatite miliar, lesões do complexo granuloma eosinofílico (incluindo placas, granulomas e úlcera indolente) e prurido focalizado na cabeça e pescoço caracterizado por escoriações, erosões e/ou úlceras. As predileções por raça e sexo não foram demonstradas e gatos jovens parecem mais propensos à doença (Hobi et al. Vet Dermatol 2011 22: 406-413; Ravens et al. Vet Dermatol 2014; 25: 95-102; Buckely In Practice 2017; 39: 242-254).
[006]Os tratamentos atuais para gatos diagnosticados com dermatite alérgica dependem da severidade dos sinais clínicos, duração e preferências do proprietário e incluem imunoterapia específica para alérgeno e fármacos antipruríticos, tais como glucocorticoides e ciclosporinas (Buckley, supra). O tratamento de imunoterapia é eficaz para alguns pacientes, mas requer injeções frequentes e pode não ser observada melhoria clínica por 6 a 9 meses (Buckley, supra). Fármacos imunossupressores como glucocorticoides e ciclosporinas são geralmente eficazes, entretanto o uso a longo prazo frequentemente resulta em efeitos adversos indesejáveis.
[007]A dermatite atópica em cavalos é reconhecida como uma potencial causa de prurido. O papel de alérgenos ambientais na dermatite atópica equina está se tornando mais bem avaliado.
A doença pode ser sazonal ou não sazonal, dependendo do(s) alérgeno(s) envolvidos.
As predileções de idade, raça e sexo não foram extensivamente relatadas.
Em trabalhos preliminares na School of Veterinary
Medicine, University of California, Davis (SVM-UCD), a idade média de início foi de
6,5 anos, os Puros-sangues foram a raça mais comum, representando 25 % dos cavalos, e os machos (usualmente castrados) foram quase duas vezes mais prevalentes que as éguas; entretanto, estes dados são de apenas 24 cavalos e ainda não foram comparados com a população hospitalar em geral.
O prurido,
frequentemente dirigido contra a face, pernas distais ou tronco, é o sinal clínico mais comum de dermatite atópica equina.
Alopecia, eritema, urticária e pápulas podem estar presentes.
Lesões urticariformes podem ser bastante graves, ainda que não pruríticas.
Pode haver uma predisposição familiar para dermatite atópica urticariforme no cavalo.
Os cavalos podem ter um pioderma secundário, tipificado pela descamação excessiva, pequenos colarinhos epidérmicos ou pápulas incrustadas (“dermatite miliar”). O diagnóstico da dermatite atópica é fundamentado em sinais clínicos e a exclusão de outros diagnósticos, especialmente hipersensibilidade a insetos
(Culicoides) (White Clin Tech Equine Pract 2005; 4: 311-313; Fadok Vet Clin Equine
2013; 29 541-550). Atualmente, o manejo da dermatite atópica em cavalos é feito sintomaticamente, suprimindo-se a inflamação e o prurido desencadeado pela resposta alérgica e abordando-se a causa específica (i.e., identificando os alérgenos responsáveis e formulando uma vacina específica para alérgeno). A abordagem sintomática é tipicamente necessária em curto prazo para deixar o paciente confortável e minimizar o autotrauma.
Esta abordagem depende do uso de uma combinação de terapias tópicas e sistêmicas incluindo anti-histamínicos, ácidos graxos essenciais, pentoxifilina e glucocorticoides.
A abordagem primária para controle de alergia ambiental envolve a identificação de alérgenos que desencadeiam a reação de hipersensibilidade.
É comumente aceito por dermatologistas que a imunoterapia específica para alérgeno pode ser útil para cavalos atópicos. Entretanto, como uma regra geral, a maioria dos cavalos apresenta melhoria apenas depois dos primeiros 6 meses de imunoterapia (Marsella Vet Clin Equine 2013; 29: 551-557).
Além disso, o uso a longo prazo de fármacos imunossupressores em cavalos pode resultar em efeitos adversos indesejáveis.
[008]A interleucina-31 (IL-31), uma citocina produzida por células T auxiliares tipo 2, mostrou induzir o prurido em humanos, camundongos e cães (Bieber N Engl J Med 2008; 358: 1483-1494; Dillon et al. Nat Immunol 2004; 5:752-60; Patente US No
8.790.651 por Bammert et al.; Gonzalez et al. Vet Dermatl. 2013; 24(1): 48-53). A IL- 31 se liga a um composto co-receptor pelo receptor A da IL-31 (IL-31RA) e o receptor da oncostatina M (OSMR) (Dillon et al. 2004 supra e Bilsborough et al. J Allergy Clin Immunol. 2006 117(2): 418-25). A ativação do receptor resulta em fosforilação de STAT através dos receptores JAK. A expressão do co-receptor foi mostrada em macrófagos, queratinócitos e em gânglios da raiz dorsal.
[009]Recentemente, descobriu-se que a IL-31 está envolvida na dermatite, lesões pruríticas da pele, alergia e hipersensibilidade das vias aéreas. Cytopoint®, um anticorpo monoclonal anti-IL-31 canino produzido pela Zoetis Inc., Parsippany, NJ, demonstrou reduzir o prurido e as lesões na pele em cães com dermatite atópica (Gonzalez et al. 2013 supra, Michels et al. Vet Dermatol. 2016; Dec; 27(6): 478-e129).
Seria desejável fornecer abordagens alternativas para prevenir e tratar os transtornos mediados por IL-31 em mamíferos. Seria especialmente desejável fornecer vacinas para reduzir o prurido e as lesões na pele em cães, gatos, cavalos e humanos com dermatite atópica.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[010]Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma composição de vacina para imunizar e/ou proteger um mamífero contra um transtorno mediado por IL-31, em que a composição inclui: a combinação de um polipeptídeo portador e pelo menos um mimotopo selecionado de um mimotopo de IL-31 felina, um mimotopo de IL-31 canina, um mimotopo de IL-31 de cavalo ou um mimotopo de IL-31 humana; e um adjuvante.
[011]Em uma modalidade da composição de vacina, o mimotopo de IL-31 canina é e/ou compreende como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SVPADTFECKSF (SEQ ID NO: 186), SVPADTFERKSF (SEQ ID NO: 187), NSSAILPYFRAIRPLSDKNIIDKIIEQLDKLKF (SEQ ID NO: 192), APTHQLPPSDVRKIILELQPLSRG (SEQ ID NO: 196), TGVPES (SEQ ID NO: 200) ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
[012]Em outra modalidade da composição de vacina, o mimotopo de IL-31 felina é e/ou compreende como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SMPADNFERKNF (SEQ ID NO: 188), NG SAILPYFRAIRPLSDKNTIDKIIEQLDKLKF (SEQ ID NO: 193), APAHRLQPSDIRKIILELRPM SKG (SEQ ID NO: 197), IGLPES (SEQ ID NO: 201) ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
[013]Ainda em uma outra modalidade da composição de vacina, o mimotopo de IL-31 equina é e/ou compreende como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SMPTDNFERKRF (SEQ ID NO: 189), NS SAILPYFKAISPSLNNDKSLYIIEQLDKLNF (SEQ ID NO: 194), GPIYQLQPKEIQAIIVELQNLS KK (SEQ ID NO: 198), KGVQKF (SEQ ID NO: 202) ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
[014]Ainda em uma outra modalidade da composição de vacina, o mimotopo de IL-31 humana é e/ou compreende como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SVPTDTHECKRF (SEQ ID NO: 190), SVPTDTHERKRF (SEQ ID NO: 191), HSPAIRAYLKTIRQLDNKSVIDEIIEHLDKLIF (SEQ ID NO: 195), LPVRLLRPSDDVQKIVEELQSLSKM (SEQ ID NO: 199), KGVLVS (SEQ ID NO: 203) ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
[015]Em uma modalidade, o mimotopo contido na composição de vacina se liga a um anticorpo anti-IL31 ou porção de ligação ao antígeno do mesmo se liga especificamente a uma região em uma proteína IL-31 de mamífero envolvida com a interação da proteína IL-31 com seu co-receptor. Em uma modalidade, a ligação do dito anticorpo à dita região é impactada por mutações em uma região de ligação ao epítopo 15H05 selecionada do grupo consiste em: a) uma região entre cerca de 124 e 135 resíduos de aminoácido de uma sequência de IL-31 felina representada pela SEQ ID NO: 157 (Felina_IL31_tipo selvagem); b) uma região entre cerca de 124 e 135 resíduos de aminoácido de uma sequência de IL-31 canina representada pela SEQ ID NO: 155 (Canina_IL31); e c) uma região entre cerca de 118 e 129 resíduos de aminoácido de uma sequência de IL-31 equina representada pela SEQ ID NO: 165 (Equina_IL31).
[016]Em uma modalidade específica, o mimotopo se liga a um anticorpo anti- IL-31 ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo pelo menos uma das seguintes combinações das sequências da região determinante de complementaridade (CDR): 1) anticorpo 15H05: CDR1 pesada variável (VH) de SYTIH (SEQ ID NO: 1), CDR2 VH de NINPTSGYTENNQRFKD (SEQ ID NO: 2), CDR3 VH de WGFKYDGEWSFDV (SEQ ID NO: 3), CDR1 leve variável (VL) de RASQGISIWLS (SEQ ID NO: 4), CDR2 VL de KASNLHI (SEQ ID NO: 5) e CDR3 VL de LQSQTYPLT (SEQ ID NO: 6); 2) anticorpo ZIL1: CDR1 pesada variável (VH) de SYGMS (SEQ ID NO: 13), CDR2 VH de HINSGGSSTYYADAVKG (SEQ ID NO: 14), CDR3 VH de VYTTLAAFWTDNFDY (SEQ ID NO: 15), CDR1 leve variável (VL) de SGSTNNIGILAAT (SEQ ID NO: 16), CDR2 VL de SDGNRPS (SEQ ID NO: 17 e CDR3 VL de QSFDTTLDAYV (SEQ ID NO: 18); 3) anticorpo ZIL8: CDR1 VH de DYAMS (SEQ ID NO: 19), CDR2 VH de
GIDSVGSGTSYADAVKG (SEQ ID NO: 20), CDR3 VH de GFPGSFEH (SEQ ID NO:
21), CDR1 VL de TGSSSNIGSGYVG (SEQ ID NO: 22), CDR2 VL de YNSDRPS (SEQ
ID NO: 23), CDR3 VL de SVYDRTFNAV (SEQ ID NO: 24);
4) anticorpo ZIL9: CDR1 VH de SYDMT (SEQ ID NO: 25), CDR2 VH de
DVNSGGTGTAYAVAVKG (SEQ ID NO: 26), CDR3 VH de LGVRDGLSV (SEQ ID NO:
27), CDR1 VL de SGESLNEYYTQ (SEQ ID NO: 28), CDR2 VL de RDTERPS (SEQ
ID NO: 29), CDR3 VL de ESAVDTGTLV (SEQ ID NO: 30);
5) anticorpo ZIL11: CDR1 VH de TYVMN (SEQ ID NO: 31), CDR2 VH de
SINGGGSSPTYADAVRG (SEQ ID NO: 32), CDR3 VH de SMVGPFDY (SEQ ID NO:
33), CDR1 VL de SGESLSNYYAQ (SEQ ID NO: 34), CDR2 VL de KDTERPS (SEQ
ID NO: 35), CDR3 VL de ESAVSSDTIV (SEQ ID NO: 36);
6) anticorpo ZIL69: CDR1 VH de SYAMK (SEQ ID NO: 37), CDR2 VH de
TINNDGTRTGYADAVRG (SEQ ID NO: 38), CDR3 VH de GNAESGCTGDHCPPY
(SEQ ID NO: 39), CDR1 VL de SGESLNKYYAQ (SEQ ID NO: 40), CDR2 VL de
KDTERPS (SEQ ID NO: 41), CDR3 VL de ESAVSSETNV (SEQ ID NO: 42);
7) anticorpo ZIL94: CDR1 VH de TYFMS (SEQ ID NO: 43), CDR2 VH de
LISSDGSGTYYADAVKG (SEQ ID NO: 44), CDR3 VH de FWRAFND (SEQ ID NO:
45), CDR1 VL de GLNSGSVSTSNYPG (SEQ ID NO: 46), CDR2 VL de DTGSRPS
(SEQ ID NO: 47), CDR3 VL de SLYTDSDILV (SEQ ID NO: 48);
8) anticorpo ZIL154: CDR1 VH de DRGMS (SEQ ID NO: 49), CDR2 VH de
YIRYDGSRTDYADAVEG (SEQ ID NO: 50), CDR3 VH de WDGSSFDY (SEQ ID NO:
51), CDR1 VL de KASQSLLHSDGNTYLD (SEQ ID NO: 52), CDR2 VL de KVSNRDP
(SEQ ID NO: 53), CDR3 VL de MQAIHFPLT (SEQ ID NO: 54);
9) anticorpo ZIL159: CDR1 VH de SYVMT (SEQ ID NO: 55), CDR2 VH de
GINSEGSRTAYADAVKG (SEQ ID NO: 56), CDR3 VH de GDIVATGTSY (SEQ ID NO:
57), CDR1 VL de SGETLNRFYTQ (SEQ ID NO: 58), CDR2 VL de KDTERPS (SEQ ID
NO: 59), CDR3 VL de KSAVSIDVGV (SEQ ID NO: 60);
10) anticorpo ZIL171: CDR1 VH de TYVMN (SEQ ID NO: 61), CDR2 VH de SINGGGSSPTYADAVRG (SEQ ID NO: 62), CDR3 VH de SMVGPFDY (SEQ ID NO: 63), CDR1 VL de SGKSLSYYYAQ (SEQ ID NO: 64), CDR2 VL de KDTERPS (SEQ ID NO: 65), CDR3 VL de ESAVSSDTIV (SEQ ID NO: 66); ou 11) uma variante de 1) a 10) que se difere do respectivo anticorpo precursor 15H05, ZIL1, ZIL8, ZIL9, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159 ou ZIL171 pela adição, deleção e/ou substituição de um ou mais resíduos de aminoácido em pelo menos uma de CDR1, CDR2 ou CDR3 VH ou VL.
[017]Em algumas modalidades, o mimotopo utilizado nas composições de vacina da presente invenção se liga a um anticorpo anti-IL-31 ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga a IL-31 felina, em que o anticorpo inclui uma cadeia VL compreendendo a Estrutura 2 (FW2) com as alterações selecionadas das seguintes: uma Asparagina no lugar de Lisina na posição 42, uma Isoleucina no lugar de Valina na posição 43, uma Valina no lugar de Leucina na posição 46, uma Asparagina no lugar de Lisina na posição 49 e combinações das mesmas, em que as posições são em referência à numeração da SEQ ID NO: 127 (FEL_15H05_VL1).
[018]Em uma modalidade das composições de vacina descritas acima, o mimotopo é um mimotopo restrito. Em uma modalidade particular, o mimotopo restrito é um peptídeo cíclico ligado quimicamente.
[019]Em algumas modalidades das composições de vacina acima descritas, o mimotopo está quimicamente conjugado ao polipeptídeo portador. Em outras modalidades, o polipeptídeo portador e o mimotopo são parte de uma proteína de fusão recombinante.
[020]Em uma modalidade das composições de vacina descritas acima, o polipeptídeo portador que é combinado com o mimotopo inclui um toxoide bacteriano ou um derivado do mesmo, hemocianina da lapa do buraco da fechadura (KLH) ou uma partícula semelhante a vírus. Em uma modalidade, o mimotopo é combinado com um toxoide bacteriano ou derivado selecionado de toxoide de tétano, um toxoide de difteria, um toxoide de tétano, o complexo de proteína da membrana externa do grupo B N. meningitidis, exotoxina de Pseudomonas ou o mutante não tóxico da toxina da difteria (CRM197). Em outra modalidade, o mimotopo é combinado com uma partícula semelhante a vírus selecionada de HBsAg, HBcAg, Qbeta bacteriófago de E. coli, vírus Norwalk, vírus da cinomose canina (CDV) ou influenza HA. Em uma modalidade específica, o mimotopo é combinado com um polipeptídeo portador que compreende ou consiste em CRM197.
[021]Em uma modalidade, o adjuvante contido nas composições de vacina acima descritas da presente invenção é selecionado de um adjuvante óleo-em-água, um adjuvante de polímero e água, um adjuvante água-em-óleo, um adjuvante de hidróxido de alumínio, um adjuvante de vitamina E e combinações dos mesmos.
[022]Em uma modalidade, o adjuvante é uma formulação compreendendo uma saponina, um esterol, um composto de amônio quaternário e um polímero. Em uma modalidade específica, a saponina é Quil A ou uma fração purificada da mesma, o esterol é colesterol, o composto de amônio quaternário é brometo de dimetil dioctadecil amônio (DDA) e o polímero é ácido poliacrílico.
[023]Em outra modalidade, o adjuvante compreende a combinação de um ou mais oligonucleotídeos imunoestimuladores isolados, um esterol e uma saponina. Em uma modalidade específica, um ou mais oligonucleotídeos imunoestimuladores isolados compreendem CpG, o esterol é colesterol e a saponina é Quil A ou uma fração purificada da mesma.
[024]A presente invenção também fornece um método de proteger um mamífero contra um transtorno mediado por IL-31. Esse método inclui administrar ao mamífero uma composição de vacina de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade, o mamífero ao qual uma vacina de acordo com a presente invenção é administrado é selecionado de um cão, um gato, um cavalo ou um humano. Em uma modalidade particular, a composição de vacina inclui um mimotopo de peptídeo de IL- 31 que é administrado ao mamífero em cerca de 10 μg a cerca de 100 μg por dose ou uma dose correspondente para produzir uma resposta imune equivalente. Em uma modalidade, a composição de vacina inclui um mimotopo de IL-31 que é administrado a um mamífero, tal como um gato, em cerca de 10 μg por dose.
[025]Em uma modalidade, o transtorno mediado por IL-31 é uma condição prurítica ou alérgica. Em algumas modalidades, a condição prurítica ou alérgica é uma condição prurítica selecionada de dermatite atópica, eczema, psoríase, esclerodermia e prurido. Em outras modalidades, a condição prurítica ou alérgica é uma condição alérgica selecionada de dermatite alérgica, eczema de verão, urticária, heaves, doença inflamatória das vias aéreas, obstrução recorrente das vias aéreas, hiperresponsividade das vias aéreas, doença pulmonar obstrutiva crônica e processos inflamatórios resultantes de auto-imunidade. Em outras modalidades, o transtorno mediado por IL-31 é progressão tumoral. Em algumas modalidades, o transtorno mediado por IL-31 é doença eosinofílica ou mastocitomas.
[026]Também é fornecido aqui um método de determinar a identidade e/ou quantidade de um anticorpo anti-IL-31 em uma amostra. Esse método inclui incubar uma amostra compreendendo um anticorpo anti-IL-31 com pelo menos um mimotopo selecionado de um mimotopo de IL-31 felina, um mimotopo de IL-31 canina, um mimotopo de IL-31 de cavalo e um mimotopo de IL-31 humana; e determinar a identidade e/ou quantidade do anti-IL-31 na amostra.
[027]Em uma modalidade, o mimotopo de IL-31 canina utilizado no método para determinar a identidade e/ou quantidade de um anticorpo anti-IL-31 na amostra é e/ou compreende como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SVPADTFECKSF (SEQ ID NO: 186), SVPADTFERKSF (SEQ ID NO: 187), NSSAILPYFRAIRPLSDKNIIDKIIEQLDKLKF (SEQ ID NO: 192), APTHQLPPSDVRKIILELQPLSRG (SEQ ID NO: 196), TGVPES (SEQ ID NO: 200) ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
[028]Em outra modalidade, o mimotopo de IL-31 felina utilizado nesse método é e/ou compreende como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SMPADNFERKNF (SEQ ID NO: 188), NGSAILPYFRAIRPLSDKNTIDKIIEQLDKLKF (SEQ ID NO: 193), APAHRLQPSDIRKIILELRPM SKG (SEQ ID NO: 197), IGLPES (SEQ ID NO: 201) ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
[029]Em uma outra modalidade, o mimotopo de IL-31 equina utilizado nesse método é e/ou compreende como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SMPTDNFERKRF (SEQ ID NO: 189), NSSAILPYFKAISPSLNNDKSLYIIEQLDKLNF (SEQ ID NO: 194), GPIYQLQPKEIQAIIVELQNLS KK (SEQ ID NO: 198), KGVQKF (SEQ ID NO: 202) ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
[030]Em ainda uma outra, o mimotopo de IL-31 humana utilizado nesse método é e/ou compreende como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SVPTDTHECKRF (SEQ ID NO: 190), SVPTDTHERKRF (SEQ ID NO: 191), HSPAIRAYLKTIRQLDNKSVIDEIIEHLDKLIF (SEQ ID NO: 195), LPVRLLRPSDDVQKIVEELQSLSKM (SEQ ID NO: 199), KGVLVS (SEQ ID NO: 203) ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
[031]Em uma modalidade do método de diagnóstico acima descrito, o mimotopo é um reagente de captura ligado a uma superfície sólida. Em uma modalidade, a amostra é adicionada ao reagente de captura mimotopo; e reagentes de detecção secundários são então adicionados para quantificar a quantidade do anticorpo na amostra.
[032]A presente invenção também fornece um método de determinar a quantidade de IL-31 em uma amostra de um mamífero. Esse método inclui incubar uma amostra de mamífero compreendendo IL-31 com um anticorpo anti-IL-31 marcado: complexo mimotopo de IL-31 amarrado a uma superfície sólida, em que o mimotopo no complexo é selecionado do grupo consiste em um mimotopo de IL-31 felina, um mimotopo de IL-31 canina, um mimotopo de IL-31 de cavalo e um mimotopo de IL-31 humana; e determinar o nível da IL-31 na amostra, em que o anticorpo anti- IL-31 marcado no complexo tem uma afinidade para o mimotopo no complexo que é inferior à sua afinidade para a IL-31 na amostra. Em uma modalidade deste método, a etapa de determinar compreende medir o sinal proveniente do anticorpo marcado que é liberado da superfície sólida quando a IL-31 na amostra se liga ao anticorpo anti-IL-3 marcado do complexo, o nível de IL-31 na amostra sendo inversamente proporcional ao sinal.
[033]Em uma modalidade, o mimotopo de IL-31 canina utilizado no método de determinar a quantidade de IL-31 na amostra é e/ou compreende como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SVPADTFECKSF (SEQ ID NO: 186), SVPADTFERKSF (SEQ ID NO: 187), NSSAILPYFRAIRPLSDKNIIDKIIEQLDKLKF (SEQ ID NO: 192), APTHQLPPSDVRKIILELQPLSRG (SEQ ID NO: 196), TGVPES (SEQ ID NO: 200) ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
[034]Em outra modalidade, o mimotopo de IL-31 felina utilizado nesse método é e/ou compreende como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SMPADNFERKNF (SEQ ID NO: 188), NGSAILPYFRAIRPLSDKNTIDKIIEQLDKLKF (SEQ ID NO: 193), APAHRLQPSDIRKIILELRPM SKG (SEQ ID NO: 197), IGLPES (SEQ ID NO: 201) ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
[035]Ainda em uma outra modalidade, o mimotopo de IL-31 equina utilizado nesse método é e/ou compreende como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SMPTDNFERKRF (SEQ ID NO: 189), NSSAILPYFKAISPSLNNDKSLYIIEQLDKLNF (SEQ ID NO: 194), GPIYQLQPKEIQAIIVELQNLS KK (SEQ ID NO: 198), KGVQKF (SEQ ID NO: 202) ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
[036]Ainda em uma outra modalidade, o mimotopo de IL-31 humana utilizado nesse método é e/ou compreende como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SVPTDTHECKRF (SEQ ID NO: 190), SVPTDTHERKRF (SEQ ID NO: 191),
HSPAIRAYLKTIRQLDNKSVIDEIIEHLDKLIF (SEQ ID NO: 195), LPVRLLRPSDDVQKIVEELQSLSKM (SEQ ID NO: 199), KGVLVS (SEQ ID NO: 203) ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
[037]Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos de diagnóstico acima descritos da invenção, o mimotopo se liga a um anticorpo anti-IL31 ou porção de ligação ao antígeno do mesmo se liga especificamente a uma região em uma proteína IL-31 de mamífero envolvida com a interação da proteína IL-31 com seu co- receptor. Em uma modalidade dos métodos de diagnóstico desta invenção, a ligação do dito anticorpo à dita região é impactada por mutações em uma região de ligação ao epítopo 15H05 selecionada do grupo consiste em: a) uma região entre cerca de 124 e 135 resíduos de aminoácido de uma sequência de IL-31 felina representada pela SEQ ID NO: 157 (Felina_IL31_tipo selvagem); b) uma região entre cerca de 124 e 135 resíduos de aminoácido de uma sequência de IL-31 canina representada pela SEQ ID NO: 155 (Canina_IL31); e c) uma região entre cerca de 118 e 129 resíduos de aminoácido de uma sequência de IL-31 equina representada pela SEQ ID NO: 165 (Equina_IL31).
[038]Em uma modalidade específica de qualquer um dos métodos de diagnósticos da presente invenção, o mimotopo se liga a um anticorpo anti-IL-31 ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo pelo menos uma das seguintes combinações das sequências da região determinante de complementaridade (CDR): 1) anticorpo 15H05: CDR1 pesada variável (VH) de SYTIH (SEQ ID NO: 1), CDR2 VH de NINPTSGYTENNQRFKD (SEQ ID NO: 2), CDR3 VH de WGFKYDGEWSFDV (SEQ ID NO: 3), CDR1 leve variável (VL) de RASQGISIWLS (SEQ ID NO: 4), CDR2 VL de KASNLHI (SEQ ID NO: 5) e CDR3 VL de LQSQTYPLT (SEQ ID NO: 6);
2) anticorpo ZIL1: CDR1 pesada variável (VH) de SYGMS (SEQ ID NO: 13),
CDR2 VH de HINSGGSSTYYADAVKG (SEQ ID NO: 14), CDR3 VH de
VYTTLAAFWTDNFDY (SEQ ID NO: 15), CDR1 leve variável (VL) de
SGSTNNIGILAAT (SEQ ID NO: 16), CDR2 VL de SDGNRPS (SEQ ID NO: 17 e CDR3
VL de QSFDTTLDAYV (SEQ ID NO: 18);
3) anticorpo ZIL8: CDR1 VH de DYAMS (SEQ ID NO: 19), CDR2 VH de
GIDSVGSGTSYADAVKG (SEQ ID NO: 20), CDR3 VH de GFPGSFEH (SEQ ID NO:
21), CDR1 VL de TGSSSNIGSGYVG (SEQ ID NO: 22), CDR2 VL de YNSDRPS (SEQ
ID NO: 23), CDR3 VL de SVYDRTFNAV (SEQ ID NO: 24);
4) anticorpo ZIL9: CDR1 VH de SYDMT (SEQ ID NO: 25), CDR2 VH de
DVNSGGTGTAYAVAVKG (SEQ ID NO: 26), CDR3 VH de LGVRDGLSV (SEQ ID NO:
27), CDR1 VL de SGESLNEYYTQ (SEQ ID NO: 28), CDR2 VL de RDTERPS (SEQ
ID NO: 29), CDR3 VL de ESAVDTGTLV (SEQ ID NO: 30);
5) anticorpo ZIL11: CDR1 VH de TYVMN (SEQ ID NO: 31), CDR2 VH de
SINGGGSSPTYADAVRG (SEQ ID NO: 32), CDR3 VH de SMVGPFDY (SEQ ID NO:
33), CDR1 VL de SGESLSNYYAQ (SEQ ID NO: 34), CDR2 VL de KDTERPS (SEQ
ID NO: 35), CDR3 VL de ESAVSSDTIV (SEQ ID NO: 36);
6) anticorpo ZIL69: CDR1 VH de SYAMK (SEQ ID NO: 37), CDR2 VH de
TINNDGTRTGYADAVRG (SEQ ID NO: 38), CDR3 VH de GNAESGCTGDHCPPY
(SEQ ID NO: 39), CDR1 VL de SGESLNKYYAQ (SEQ ID NO: 40), CDR2 VL de
KDTERPS (SEQ ID NO: 41), CDR3 VL de ESAVSSETNV (SEQ ID NO: 42);
7) anticorpo ZIL94: CDR1 VH de TYFMS (SEQ ID NO: 43), CDR2 VH de
LISSDGSGTYYADAVKG (SEQ ID NO: 44), CDR3 VH de FWRAFND (SEQ ID NO:
45), CDR1 VL de GLNSGSVSTSNYPG (SEQ ID NO: 46), CDR2 VL de DTGSRPS
(SEQ ID NO: 47), CDR3 VL de SLYTDSDILV (SEQ ID NO: 48);
8) anticorpo ZIL154: CDR1 VH de DRGMS (SEQ ID NO: 49), CDR2 VH de
YIRYDGSRTDYADAVEG (SEQ ID NO: 50), CDR3 VH de WDGSSFDY (SEQ ID NO:
51), CDR1 VL de KASQSLLHSDGNTYLD (SEQ ID NO: 52), CDR2 VL de KVSNRDP (SEQ ID NO: 53), CDR3 VL de MQAIHFPLT (SEQ ID NO: 54); 9) anticorpo ZIL159: CDR1 VH de SYVMT (SEQ ID NO: 55), CDR2 VH de GINSEGSRTAYADAVKG (SEQ ID NO: 56), CDR3 VH de GDIVATGTSY (SEQ ID NO: 57), CDR1 VL de SGETLNRFYTQ (SEQ ID NO: 58), CDR2 VL de KDTERPS (SEQ ID NO: 59), CDR3 VL de KSAVSIDVGV (SEQ ID NO: 60); 10) anticorpo ZIL171: CDR1 VH de TYVMN (SEQ ID NO: 61), CDR2 VH de SINGGGSSPTYADAVRG (SEQ ID NO: 62), CDR3 VH de SMVGPFDY (SEQ ID NO: 63), CDR1 VL de SGKSLSYYYAQ (SEQ ID NO: 64), CDR2 VL de KDTERPS (SEQ ID NO: 65), CDR3 VL de ESAVSSDTIV (SEQ ID NO: 66); ou 11) uma variante de 1) a 10) que se difere do respectivo anticorpo precursor 15H05, ZIL1, ZIL8, ZIL9, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159 ou ZIL171 pela adição, deleção e/ou substituição de um ou mais resíduos de aminoácido em pelo menos uma de CDR1, CDR2 ou CDR3 VH ou VL.
[039]Em algumas modalidades, o mimotopo utilizado nos métodos de diagnóstico da presente invenção se liga a um anticorpo anti-IL-31 ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga a IL-31 felina, em que o anticorpo inclui uma cadeia VL compreendendo a Estrutura 2 (FW2) com as alterações selecionadas das seguintes: uma Asparagina no lugar de Lisina na posição 42, uma Isoleucina no lugar de Valina na posição 43, uma Valina no lugar de Leucina na posição 46, uma Asparagina no lugar de Lisina na posição 49 e combinações das mesmas, em que as posições são em referência à numeração da SEQ ID NO: 127 (FEL_15H05_VL1).
Breve Descrição dos Desenhos
[040]A Figura 1 é um alinhamento que mostra a conservação da sequência de aminoácidos entre IL-31 de diferentes espécies. Em particular, uma comparação entre SEQ ID NO: 155 (IL-31 canina), SEQ ID NO: 157 (IL-31 felina), SEQ ID NO: 165 (IL- 31 equina) e SEQ ID NO: 181 (IL-31 humana) é mostrada. A porcentagem de identidade de sequência de aminoácidos entre IL-31 canina, felina, de cavalo e humana é também indicada.
[041]A Figura 2 detalha a afinidade com a qual os anticorpos candidatos com CDRs derivadas de origem de camundongo se ligam à IL-31 felina e canina usando ressonância plasmônica de superfície (SPR) em um sistema Biacore (Biacore Life Sciences (GE Healthcare), Uppsala, Suécia).
[042]A Figura 3 é uma tabela que mostra a potência (IC50 (μg/ml)) de anticorpos candidatos com CDRs derivadas de origem de camundongo como medida por ensaios celulares caninos e felinos. Em particular, os anticorpos candidatos foram avaliados para sua capacidade de inibir fosforilação STAT mediada por IL-31 em células como macrófagos DH-82 caninas ou FCWF4 felinas.
[043]A Figura 4 mostra os resultados obtidos para a ligação de anticorpos monoclonais candidatos com CDRs de origem de cão a várias proteínas usando os métodos ELISA indireto e Biacore. Para o ELISA indireto, a ligação (ELISA OD) a IL- 31 felina de tipo selvagem e um mutante 15H05 de IL-31 felina que tinha mutações na região de epítopo 15H05 do anticorpo monoclonal foi avaliada. Para confirmar a ligação, a análise de Biacore foi realizada usando proteínas IL-31 caninas, felinas, equinas, humanas, o mutante 15H05 felino e o mutante 11E12 felino como superfícies e uma única concentração de teste de anticorpo. O mutante 11E12 de IL-31 felina tinha mutações na região de epítopo 11E12 do anticorpo monoclonal.
[044]A Figura 5-Figura 5A mostra um alinhamento de sequência de 11E12 VL de anticorpo de camundongo (SEQ ID NO: 73) comparando as sequências 11E12 caninizadas previamente divulgadas designadas como Can_11E12_VL_cUn_1 (SEQ ID NO: 182) e CAN_11E12_VL_cUn_FW2 (SEQ ID NO: 184) com as versões felinizadas designadas como FEL_11E12_VH1 (SEQ ID NO: 111) e FEL_11E12_VL1_FW2 (SEQ ID NO: 117). Observado abaixo o alinhamento na Figura 5A são pontos que mostram as posições de alterações relevantes para
Fel_11E12_VL1 que foram necessárias para restaurar a afinidade deste anticorpo para a proteína IL-31. A Figura 5B mostra um alinhamento da sequência 15H05 VL de anticorpo de camundongo designada aqui como MU_15H05_VL (SEQ ID NO: 69) com as sequências 15H05 VL felinizadas designadas aqui como FEl_15H05_VL1 (SEQ ID NO: 127) e FEl_15H05_VL_FW2 (SEQ ID NO: 135). Os pontos abaixo do alinhamento na Figura 5 B indicam as alterações necessárias para a 15H05 VL felinizada (Fel_15H05_VL1) que foram necessárias não apenas para restaurar, mas melhorar sua afinidade para a IL-31 canina e felina quando comparada às formas de camundongo e quiméricas deste anticorpo.
[045]A Figura 6-Figura 6A mostra o alinhamento de IL-31 felina de tipo selvagem (SEQ ID NO: 157) com mutantes 15H05 (SEQ ID NO: 163) e 11E12 (SEQ ID NO: 161) destacando as posições onde as substituições de alanina ocorreram. A Figura 6B mostra o modelo de homologia da IL-31 felina destacando as posições de dois aminoácidos envolvidos com a ligação de anticorpos 11E12 (sítio 1) e 15H05 (sítio 2). A Figura 6C é um gráfico que mostra os resultados obtidos para a ligação de anticorpos monoclonais 11E12 e 15H05 à IL-31 felina de tipo selvagem e às proteínas IL-31 mutantes 15H05 (SEQ ID NO: 163) e 11E12 (SEQ ID NO: 161) quando o tipo selvagem e estes mutantes são usados como os antígenos de revestimento.
[046]A Figura 7 é de gráficos que mostram as avaliações de ligação de competição de mAbs 15H05 e 11E12 usando Biacore. A Figura 7A mostra os dados da ligação de competição de anticorpos 15H05 e 11E12 de camundongo para IL-31 canina. A Figura 7B mostra os dados da ligação de competição de anticorpos 15H05 e 11E12 em uma superfície de IL-31 felina.
[047]A Figura 8 é de um gráfico que mostra os resultados obtidos para a ligação das subunidades do receptor individual de OSMR e IL-31Ra para IL-31 felina de tipo selvagem e para proteínas IL-31 mutantes 15H05 (SEQ ID NO: 163) e 11E12 (SEQ ID NO: 161) quando o tipo selvagem e estes mutantes são usados como os antígenos de revestimento.
[048]A Figura 9 é de um gráfico que mostra a eficácia preliminar de quimera 11E12 de camundongo: felina, quimera 15H05 de camundongo: felina e 11E12 felinizada (Felina 11E12 1.1) em um modelo de prurido induzido por IL-31 em gatos.
[049]A Figura 10 é de gráficos que mostram a avaliação in vivo da eficácia de um anticorpo anti-IL-31 15H05 felinizado denominado ZTS-361 em um modelo de desafio de prurido de gato. A Figura 10A mostra a linha de base do comportamento prurítico pré-desafio para os grupos T01 placebo veículo e T02 anticorpo ZTS-361 do dia -7 ao dia 28 com o dia zero sendo o dia da administração do anticorpo para o grupo T02. A Figura 10B mostra a eficácia do anticorpo ZTS-361 demonstrando uma redução significativa no prurido observada nos dias 7 (p< 0,0001), 21 (p < 0,0027) e 28 (p< 0,0238) após o desafio de IL-31 em comparação com placebo veículo controle.
[050]A Figura 11-Figura 11A é de um gráfico que mostra os níveis plasmáticos de IL-31 em animais pertencentes aos clientes entre cães com dermatite atópica e alérgica em comparação com o laboratório normal. A Figura 11B é de um gráfico que mostra os resultados de um estudo recente para determinar os níveis séricos de IL- 31 em gatos com um diagnóstico presuntivo de dermatite alérgica (AD) de várias regiões geográficas diferentes nos USA. A Figura 11C é de um gráfico que mostra o perfil farmacocinético de IL-31 canina em cães após a administração de uma dose subcutânea de 1,75 μg/kg de IL-31 canina.
[051]A Figura 12 é de uma tabela que mostra os resultados de um escaneamento de substituição completo de IL-31 canina abrangendo os aminoácidos esboçados na Figura 12. Cada posição representada foi individualmente substituída na proteína IL-31 canina de comprimento completo (SEQ ID NO: 155) com um dos outros 19 aminoácidos possíveis e a ligação do anticorpo 15H05 foi avaliada usando um ELISA indireto. Para comparação, a região correspondente na IL-31 felina (SEQ ID NO: 157), equina (SEQ ID NO: 165) e humana (SEQ ID NO: 181) é mostrada.
[052]A Figura 13-Figura 13A é de uma tabela que mostra as sequências e conectores químicos de vários peptídeos restritos. O peptídeo ZTS-561 contém a sequência de aminoácidos N-TEISVPADTFERKSFILT-C que corresponde às posições 121 a 138 da SEQ ID NO: 155 com a substituição de Arginina (R) por Cisteína (C) na posição número 132. O peptídeo ZTS-562 contém a sequência de aminoácidos N-EISVPADTFERKSF-C que corresponde às posições 122 a 135 da SEQ ID NO: 155 com a substituição de Arginina (R) por Cisteína (C) na posição número 132. O peptídeo ZTS-563 contém a sequência de aminoácidos N- AKVSMPADNFERKNFILT-C que corresponde às posições 121 a 138 da SEQ ID NO: 157 com a substituição de Treonina (T) por Alanina (A) na posição número 138. O peptídeo ZTS-564 contém a sequência de aminoácidos N-TEISVPADTFERKSFILT-C que corresponde às posições 121 a 138 da SEQ ID NO: 155. Cada um dos peptídeos ZTS-561, ZTS-562, ZTS-563 e ZTS-564 também inclui Cisteínas N e C terminal como representadas para facilitar a conjugação química usando os grupos tiol livres. A Figura 13B mostra os resultados de uma avaliação de afinidade para cada um dos peptídeos ZTS-561, ZTS-562, ZTS-563 e ZTS-564 que foram independentemente conjugados a um polipeptídeo portador (CRM-197). Para a avaliação de afinidade, cada peptídeo foi independentemente imobilizado em uma superfície Biacore e a KD para o mAb 15H05 anti-IL-31 felinizado (ZTS-927) foi determinada.
[053]A Figura 14 representa o projeto de estudo para um estudo de imunogenicidade realizado para avaliar a capacidade de mimotopos de IL-31 conjugados com CRM-197 gerarem uma resposta imune específica de epítopo direcionada para a região relevante na proteína IL-31 onde o anticorpo 15H05 e outros anticorpos anti-IL-31 aqui divulgados se ligam.
[054]A Figura 15 é de gráficos que mostram os títulos séricos gerados após a vacinação de cães com mimotopos de IL-31 15H05 canino e felino e proteína IL-31 felina de comprimento completo organizados por grupo de tratamento que mostram a resposta em cada dia que o soro foi coletado. A Figura 15A representa os títulos médios de anticorpo canino para a proteína IL-31 felina de comprimento completo (SEQ ID NO: 159). A Figura 15B representa os títulos médios de anticorpo canino para o mutante 15H05 de IL-31 felina de comprimento completo (SEQ ID NO: 163). A Figura 15C representa os títulos médios de anticorpo canino para IL-31 canina de comprimento completo (SEQ ID NO: 155). A Figura 15D representa os títulos médios de anticorpo canino para IL-31 equina de comprimento completo (SEQ ID NO: 165).
A Figura 15E representa os títulos médios de anticorpo canino para IL-31 humana de comprimento completo (SEQ ID NO: 181).
[055]A Figura 16-Figura 16A representa o projeto para um estudo de imunogenicidade realizado para avaliar a capacidade de proteínas ou mimotopos de IL-31 canina de comprimento completo conjugada com CRM-197 para produzir uma resposta imune em cães Beagle de laboratório. Cada mimotopo aqui descrito foi designado para gerar uma resposta imune específica de epítopo direcionada para a região relevante na proteína IL-31 onde o anticorpo 15H05 e outros anticorpos anti- IL-31 aqui divulgados se ligam. As sequências e conectores químicos de vários mimotopos de peptídeos são mostrados como os grupos T02-T04. O peptídeo ZTS- 420 contém a sequência de aminoácidos N-TEISVPADTFERKSFILT-C que corresponde às posições 121 a 138 da SEQ ID NO: 155 com a substituição de Arginina (R) por Cisteína (C) na posição número 132. O peptídeo ZTS-421 contém a sequência de aminoácidos N- TNISVPTDTHECKRFILT-C que corresponde às posições 122 a 139 da SEQ ID NO: 181. O peptídeo ZTS-766 contém a sequência de aminoácidos N- NSSAILPYFRAIRPLSDKNIIDKIIEQLDKLKF-C que corresponde às posições 83 a 115 da SEQ ID NO: 155. Cada um dos peptídeos ZTS-420, ZTS-421 e ZTS-766 também inclui Cisteínas N e C terminal como representadas para facilitar a conjugação química usando os grupos tiol livres. ZTS-766 também contém uma sequência espaçadora de três aminoácidos adicional (GSG) próxima à cisteína N terminal. A Figura 16B mostra sequências homólogas que permitem a comparação do mimotopo em hélice BC canino (ZTS-766) com a sequência correspondente de IL-31 felina, equina e humana e inclui o número de referência da sequência e posições dos aminoácidos para cada uma.
[056]A Figura 17 é de gráficos que mostram títulos séricos gerados após a vacinação de cães com IL-31 15H05 canino e mimotopos humanos, mimotopo em hélice BC canino e proteína IL-31 felina de comprimento completo organizados por grupo de tratamento que mostram a resposta em cada dia que o soro foi coletado. Os cães foram doseados nos dias 0, 28 e 56 indicados com setas. A Figura 17A representa os títulos médios de anticorpo canino para a proteína IL-31 canina de comprimento completo (SEQ ID NO: 155). A Figura 17B representa os títulos médios de anticorpo canino para a IL-31 humana de comprimento completo (SEQ ID NO: 181) nos dias 0, 42 e 84 para o grupo T03 apenas. Os cães no grupo T03 (mimotopo 15H05 humano) não tinham CRAR para IL-31 canina (dados não mostrados).
[057]A Figura 18-Figura 18A representa o projeto para um estudo de imunogenicidade realizado para avaliar a capacidade de proteínas ou mimotopos de IL-31 felina de comprimento completo conjugados com CRM-197 para produzir uma resposta imune em gatos de laboratório. Todos os grupos de tratamento foram formulados com uma mistura adjuvante incluindo o adjuvante glicolipídico Bay R1005 (N-(2-Desóxi-2-L-leucilamino-β-D-glucopiranosil)-N- octadecildodecanoilamidehidroacetato) bem como oligonucleotídeos CpG.
[058]Cada mimotopo aqui descrito foi designado para gerar uma resposta imune específica de epítopo direcionada para a região relevante na proteína IL-31 onde o anticorpo 15H05 e outros anticorpos anti-IL-31 aqui divulgados se ligam. As sequências e conectores químicos de vários mimotopos de peptídeos são mostrados como os grupos T02-T05. O peptídeo ZTS-563 contém a sequência de aminoácidos N- AKVSMPADNFERKNFILT-C que corresponde às posições 121 a 138 da SEQ ID
NO: 157 com a substituição de Treonina (T) por Alanina (A) na posição número 138.
O peptídeo ZTS-418 contém a sequência de aminoácidos N- TEVSMPTDNFERKRFILT-C que corresponde às posições 115 a 132 da SEQ ID NO:
165. O peptídeo ZTS-423 contém a sequência de aminoácidos N- NGSAILPYFRAIRPLSDKNTIDKIIEQLDKLKF-C que corresponde às posições 83 a 115 da SEQ ID NO: 157. O peptídeo ZTS-422 contém a sequência de aminoácidos N- AKVSMPADNFERKNFILT-C que corresponde às posições 121 a 138 da SEQ ID NO: 157 com a substituição de Treonina (T) por Alanina (A) na posição número 138. Cada um dos peptídeos ZTS-563, ZTS-418, ZTS-423 e ZTS-422 também inclui Cisteínas N e C terminal como representadas para facilitar a conjugação química usando os grupos tiol livres. ZTS-422 também contém um conector de ácido amino-hexanóico adicional (Ahx) entre as duas cisteínas N terminais. ZTS-423 também contém uma sequência espaçadora de três aminoácidos adicional (GSG) próxima à cisteína N terminal. A Figura 18B representa os títulos médios de anticorpo felino para a IL-31 felina de comprimento completo (SEQ ID NO: 157) para todos os grupos de tratamento exceto T03. Os gatos no grupo T03 (mimotopo 15H05 equino) não tinham CRAR para IL-31 felina (dados não mostrados).
[059]A Figura 19A é a sequência de aminoácidos de epítopo mínimo ligada pelo anticorpo anti-IL-31 canino M14 de acordo com WO 2018/156367 (Kindred Biosciences, Inc.). A comparação de várias espécies, IDs de referência de sequências e posições relativas dos aminoácidos são mostradas. A Figura 19B mostra esta sequência de aminoácidos mínima na IL-31 canina destacada em uma caixa preta.
Esta figura também mostra o alinhamento de sequência na região circundante da proteína e as posições relativas dos aminoácidos correspondentes no ID da sequência indicado.
[060]A Figura 20 mostra um fragmento da proteína IL-31 de uma alça formado pela convergência da hélice A com a sequência espiral aleatória que compartilha atributos posicionais e estruturais com a alça 15H05. A comparação das sequências de aminoácidos de várias espécies e a referência aos IDs de sequência e posições dos aminoácidos são mostradas.
[061]A Figura 21A mostra a sequências de aminoácidos de três mimotopos de peptídeos de IL-31 equina representando diferentes regiões de epítopo chave na proteína. O mimotopo 15H05 contém a sequência de aminoácidos N- TEVSMPTDNFERKRFILT-C que corresponde às posições 115 a 132 da SEQ ID NO:
165. Mimotopo BC hélice contém a sequência de aminoácidos N- NSSAILPYFKAISPSLNNDKSLYIIEQLDKLNF-C que corresponde às posições 77 a 109 da SEQ ID NO: 165. Mimotopo A hélice contém a sequência de aminoácidos N- GPIYQLQPKEIQAIIVELQNLSKK-C que corresponde às posições 20 a 43 da SEQ ID NO: 165. Mimotopo 15H05 também inclui Cisteínas N e C terminal como representadas para facilitar a conjugação química usando os grupos tiol livres. Todos os três mimotopos contêm uma sequência espaçadora de três aminoácidos adicional (GSG) próxima ao grupo biotina N mostrado como negrito e sublinhado nas sequências. As posições correspondentes de cada resíduo de aminoácido na SEQ ID NO: 165 são mostradas. A Figura 21B mostra os resultados de um ensaio de ligação usando interferometria de bio-camada. Os mimotopos indicados foram absorvidos por pins de estreptavidina e usados para sondar diluições múltiplas de soro de camundongo. O soro usado foi de camundongos vacinados com a proteína IL-31 equina (SEQ ID NO: 165) ou soro controle de camundongos vacinados com uma proteína não relacionada.
Definições
[062]Antes de descrever a presente invenção em detalhes, vários termos usados no contexto da presente invenção serão definidos. Além desses termos, outros são definidos em outra parte do relatório descritivo, conforme necessário. A menos que de outro modo expressamente aqui definido, os termos da técnica usados neste relatório descritivo terão seus significados reconhecidos na técnica.
[063]Como usado no relatório descritivo e reivindicações, a forma singular “o/a” e “um/uma” incluem as referências no plural a menos que o contexto indique claramente de outro modo. Por exemplo, a referência a “um anticorpo” inclui uma pluralidade de tais anticorpos. Como outro exemplo, a referência a “um mimotopo”, “um mimotopo de IL-31” e semelhantes inclui uma pluralidade de tais mimotopos.
[064]Como usado aqui, o termo “compreendendo” é intencionado a significar que as composições e métodos incluem os elementos recitados, mas não excluem outros.
[065]Como usado aqui, o termo “composição de vacina” inclui pelo menos um antígeno ou imunógeno em um veículo farmaceuticamente aceitável útil para induzir uma resposta imune em um hospedeiro. As composições de vacina podem ser administradas em dosagens e por técnicas bem conhecidas dos especialistas nas artes médicas ou veterinárias, levando em consideração fatores tais como a idade, sexo, peso, espécie e condição do mamífero receptor, e a via de administração. A via de administração pode ser percutânea, administração via mucosa (e.g., oral, nasal, anal, vaginal) ou via parenteral (intradérmica, transdérmica, intramuscular, subcutânea, intravenosa ou intraperitoneal). As composições de vacina podem ser administradas sozinhas ou podem ser co-administradas ou sequencialmente administradas com outros tratamentos ou terapias. As formas de administração podem incluir suspensões, xaropes ou elixires, e preparações para administração parenteral, subcutânea, intradérmica, intramuscular ou intravenosa (e.g., administração injetável) tal como suspensões ou emulsões estéreis. As composições de vacina podem ser administradas como uma pulverização ou misturadas no alimento e/ou água ou liberadas em mistura com um portador, diluente ou excipiente adequado tal como água estéril, solução salina fisiológica, glicose ou semelhantes. As composições podem conter substâncias auxiliares tais como agentes umectantes ou emulsificadores, agentes tamponantes de pH, adjuvantes, aditivos gelificantes ou de realce de viscosidade, conservantes, agentes flavorizantes, corantes e semelhantes, dependendo da via de administração e da preparação desejada. Textos farmacêuticos padrão, tais como “Remington’s Pharmaceutical Sciences” (1990), podem ser consultados para preparar preparações adequadas, sem experimentação indevida.
[066]O termo “resposta imune” como aqui usado, se refere a uma resposta eliciada em um animal ou humano. Uma resposta imune pode se referir a imunidade celular (CMI), imunidade humoral ou pode envolver ambas. A presente invenção também contempla uma resposta limitada a uma parte do sistema imune. Usualmente, uma “resposta imunológica” inclui, mas não é limitada a um ou mais dos seguintes efeitos: a produção ou ativação de anticorpos, células B, células T auxiliares, células T supressoras e/ou células T citotóxicas e/ou células T yd, dirigida especificamente a um antígeno ou antígenos incluídos na composição ou vacina de interesse.
Preferivelmente, o hospedeiro exibirá uma resposta imunológica terapêutica ou protetora, tal que a resistência à doença ou transtorno seja aumentada e/ou a severidade clínica da doença seja reduzida. Esta proteção será demonstrada por uma redução ou falta dos sintomas normalmente exibidos por um hospedeiro afetado, um tempo de recuperação mais rápido e/ou um título de antígeno diminuído (e.g., IL-31) no hospedeiro afetado.
[067]O termo “proteger” como aqui usado, significa conferir uma resposta imunológica terapêutica a um mamífero hospedeiro, tal que a resistência a uma doença ou transtorno será aumentada e/ou a severidade clínica da doença reduzida no mamífero hospedeiro.
[068]Como aqui usado, o termo “imunogenicidade” significa capaz de produzir uma resposta imune em um mamífero hospedeiro contra um antígeno ou antígenos.
Esta resposta imune forma a base da imunidade protetora eliciada por uma vacina contra um antígeno específico.
[069]Como aqui usado, imunizar, imunização e semelhantes é o processo pelo qual um mamífero é tornado imune ou resistente a uma doença, tipicamente pela administração de uma vacina. As vacinas estimulam o próprio sistema imune do mamífero para proteger o mamífero contra doenças subsequentes.
[070]Um “adjuvante” como aqui usado, significa uma composição composta de uma ou mais substâncias que aumentam a resposta imune a um antígeno. O mecanismo de como um adjuvante opera não é totalmente conhecido. Acredita-se que alguns adjuvantes realçam a resposta imune pela liberação lenta do antígeno, enquanto outros adjuvantes são fortemente imunogênicos por si só, e acredita-se que funcionem sinergicamente.
[071]Epítopo, como aqui usado, se refere ao determinante antigênico reconhecido pelas CDRs do anticorpo. Em outras palavras, epítopo se refere àquela porção de qualquer molécula capaz de ser reconhecida por, e se ligar a, um anticorpo.
A menos que indicado de outro modo, o termo “epítopo” como aqui usado, se refere à região da IL-31 à qual um agente anti-IL-31 é reativo.
[072]Um “antígeno” é uma molécula ou uma porção de uma molécula capaz de ser ligada por um anticorpo que é adicionalmente capaz de ser reconhecida por, e se ligar a, um anticorpo (a região de ligação do anticorpo correspondente pode ser referida como um parátopo). Em geral, os epítopos consistem em agrupamentos de superfície quimicamente ativa de moléculas, por exemplo, cadeias laterais de aminoácidos ou açúcar, e têm características estruturais tridimensionais específicas bem como características de carga específicas. Epítopos são o determinante antigênico em uma proteína que é reconhecido pelo sistema imune. Os componentes do sistema imune que reconhecem epítopos são anticorpos, células T e células B. Os epítopos de células T são exibidos na superfície das células apresentadoras de antígeno (APCs) e têm tipicamente 8 a 11 (MHC classe I) ou 15 mais (MHC classe II) aminoácidos em comprimento. O reconhecimento do complexo MHC-peptídeo exibido por células T é crítico para sua ativação. Estes mecanismos permitem o reconhecimento apropriado de proteínas próprias versus “não próprias”, tais como bactérias e vírus. Resíduos de aminoácidos independentes que não são necessariamente contíguos contribuem para interações com a fenda de ligação da APC e subsequente reconhecimento pelo receptor de Células T (Janeway, Travers, Walport, Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5 a edição; Nova Iorque: Garland Science; 2001). Os epítopos que são reconhecidos por anticorpos solúveis e receptores de células B associados à superfície celular variam muito em comprimento e grau de continuidade (Sivalingam e Shepherd, Immunol. Julho de 2012;51(3-4): 304-309 9). Novamente, mesmo epítopos lineares ou epítopos encontrados em um estiramento contínuo da sequência de proteínas frequentemente terão aminoácidos descontíguos que representam os pontos-chave de contato com os parátopos do anticorpo ou receptor de células B. Os epítopos reconhecidos por anticorpos e células B podem ser conformacionais com aminoácidos compreendendo uma área comum de contato na proteína no espaço tridimensional e são dependentes de características estruturais terciárias e quaternárias da proteína. Estes resíduos são frequentemente encontrados em áreas espacialmente distintas da sequência primária de aminoácidos.
[073]Um “mimotopo” como aqui usado, é um peptídeo linear ou restrito que imita um epítopo de antígeno. Um mimotopo pode ter uma sequência primária de aminoácidos capaz de induzir uma resposta efetora de Células T e/ou uma estrutura tridimensional necessária para ligar células B resultando na maturação de uma resposta imunológica adquirida em um animal. Um anticorpo para um dado antígeno de epítopo reconhecerá um mimotopo que imita esse epítopo. Um mimotopo de IL-31 pode alternativamente ser referido aqui como um mimotopo de peptídeo de IL-31. Em algumas modalidades, um mimotopo (linear ou restrito) para o uso nas composições e/ou métodos da presente invenção é e/ou compreende como parte do mesmo um peptídeo que tem cerca de 5 resíduos de aminoácido a cerca de 40 resíduos de aminoácido em comprimento.
[074]O termo “especificamente” no contexto de ligação de anticorpo, se refere a alta avidez e/ou alta afinidade de ligação de um anticorpo a um antígeno específico, i.e., um polipeptídeo ou epítopo. Em muitas modalidades, o antígeno específico é um antígeno (ou um fragmento ou subfração de um antígeno) usado para imunizar o animal hospedeiro a parti do qual as células produtoras de anticorpos foram isoladas.
O anticorpo que se liga especificamente a um antígeno é mais forte que a ligação do mesmo anticorpo a outros antígenos. Os anticorpos que se ligam especificamente a um polipeptídeo podem ser capazes de se ligarem a outros polipeptídeos em um nível fraco, ainda que detectável (e.g., 10 % ou menos da ligação mostrada ao polipeptídeo de interesse). Essa ligação fraca ou ligação de segundo plano, é facilmente discernível da ligação de anticorpo específico para um polipeptídeo do sujeito, e.g. pelo uso de controles apropriados. Em geral, anticorpos específicos se ligam a um antígeno com uma afinidade de ligação com uma KD de 10-7 M ou menos, e.g., 10-8 M ou menos (e.g., 10-9 M ou menos, 10-10 ou menos, 10-11 ou menos, 10-12 ou menos ou 10-13 ou menos, etc.).
[075]Como aqui usado, o termo “anticorpo” se refere a uma imunoglobulina intacta tendo duas cadeias leves e duas pesadas. Assim, um único anticorpo ou fragmento isolado pode ser um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo sintético, um anticorpo recombinante, um anticorpo quimérico, um anticorpo heteroquimérico, um anticorpo caninizado, um anticorpo felinizado, um anticorpo completamente canino, um anticorpo completamente felino, um anticorpo completamente equino ou um anticorpo completamente humano. O termo “anticorpo” preferivelmente se refere a anticorpos monoclonais e fragmentos dos mesmos (e.g., incluindo, mas não limitado a porções de ligação ao antígeno do anticorpo) e equivalentes de ligação imunológica dos mesmos podem se ligar à proteína IL-31 e fragmentos ou fragmentos modificados da mesma. Estes fragmentos e fragmentos modificados de IL-31 podem incluir os mimotopos peptídeos da IL-31 utilizados nas várias modalidades desta invenção. Por exemplo, um anticorpo para um dado epítopo na IL-31 reconhecerão um mimotopo de peptídeo de IL-31 que imita esse epítopo. O termo anticorpo é usado para se referir a uma molécula homogênea ou uma mistura, tal como um produto de soro feito de uma pluralidade de diferentes entidades moleculares.
[076]“Anticorpos nativos” e “imunoglobulinas nativas” são usualmente glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 Daltons, compostas por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfeto covalente, enquanto o número de ligações dissulfeto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isotipos de imunoglobulina. Cada cadeia pesada e leve também tem pontes de dissulfeto intracadeia regularmente espaçadas. Cada cadeia pesada tem em uma extremidade um domínio variável (VH) seguido por vários domínios constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável em uma extremidade (VL) e um domínio constante em sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada e o domínio variável da cadeia leve está alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Acredita-se que resíduos de aminoácido particulares formem uma interface entre os variáveis domínios de cadeia leve e pesada.
[077]O termo “fragmento de anticorpo” se refere a menos que uma estrutura de anticorpo intacta, incluindo, sem limitação, uma única cadeia de anticorpo isolada, um construto Fv, um construto Fab, um construto Fc, uma sequência de cadeia leve variável ou região determinante de complementaridade (CDR), etc. Por exemplo, um fragmento de anticorpo pode compreender a porção de ligação ao antígeno do anticorpo.
[078]O termo região “variável” compreende estruturas e CDRs (de outro modo conhecidas como hipervariáveis) e se refere ao fato de que certas porções dos domínios variáveis diferem extensivamente na sequência entre anticorpos e são usados na ligação e especificidade de cada anticorpo particular para seu antígeno particular. Entretanto, a variabilidade não é uniformemente distribuída pelos domínios variáveis de anticorpos. Está concentrada em três segmentos chamados regiões hipervariáveis nos domínios variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas dos domínios variáveis são chamadas de região de estrutura (FR). Os domínios variáveis de cadeia leves e pesadas nativas compreendem cada um múltiplas FRs, adotando em grande parte uma configuração em folha β, conectadas por três regiões hipervariáveis, que formam alças de conexão e, em alguns casos formando parte da estrutura em folha β. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em estreita proximidade pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis de outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação ao antígeno de anticorpos (ver Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.
(1991), páginas 647 a 669). Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, tais como participação do anticorpo na toxicidade celular dependente de anticorpo.
[079]O termo “região hipervariável”, quando aqui usado, se refere aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antígeno. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácido de uma “região determinante de complementaridade” ou “CDR” (Kabat, et al. (1991), acima) e/ou os resíduos de uma “alça hipervariável” (Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987).
Os resíduos de “estrutura” ou “FR” são os resíduos de domínio variável exceto os resíduos da região hipervariável como aqui definida.
[080]A digestão de anticorpos com papaína produz dois fragmentos de ligação ao antígeno idênticos, chamados fragmentos “Fab”, cada um com um único sítio de ligação ao antígeno e um fragmento “Fc” residual, cujo nome reflete sua capacidade de cristalizar prontamente. O tratamento com pepsina produz um fragmento F(ab’) 2 que tem dois sítios de combinação de antígeno e ainda é capaz de reticular o antígeno.
[081]“Fv” é o mínimo fragmento de anticorpo que contém um sítio de reconhecimento e ligação ao antígeno completo. Esta região consiste em um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e de cadeia leve em forte associação não covalente. É nesta configuração que as três regiões hipervariáveis de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação ao antígeno na superfície do dímero VH-VL. Coletivamente, as seis regiões hipervariáveis conferem especificidade de ligação ao antígeno para o anticorpo. Entretanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três regiões hipervariáveis específicas para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e se ligar ao antígeno, embora em uma afinidade menor que o sítio de ligação inteiro.
[082]O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab’ diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no terminal carboxila do domínio CH1 da cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab’-SH é a designação aqui para Fab’ em que os resíduos de cisteína dos domínios constantes possuem um grupo tiol livre. O fragmento F(ab’)2 de anticorpos originalmente foram produzidos como pares de fragmentos Fab’ que têm cisteínas de dobradiça entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos também são conhecidos.
[083]As “cadeias leves” de anticorpos (imunoglobulinas) de qualquer espécie vertebrada podem ser atribuídas a um de dois tipos claramente distintos, chamados kappa (κ) e lambda (λ), com base nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes.
[084]Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes.
Presentemente existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias destas podem ainda serem divididas em subclasses (isotipos), e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2 (como definidas para a designação de camundongo e humano). Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem a diferentes classes de imunoglobulinas são chamados alpha, delta, epsilon, gama e mu, respectivamente. As estruturas de subunidades e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas nas várias espécies. A prevalência de isotipos individuais e atividades funcionais associados com esses domínios constantes são específicos de espécie e devem ser experimentalmente definidos.
[085]“Anticorpo monoclonal”, como aqui definido, é um anticorpo produzido por um único clone de células (e.g., um único clone de células de hibridoma) e, portanto, um único tipo puro homogêneo de anticorpo. Todos os anticorpos monoclonais produzidos a partir do mesmo clone são idênticos e têm a mesma especificidade de antígeno. O termo “monoclonal” pertence a um único clone de células, uma única célula e à progênie daquela célula.
[086]“Anticorpo completamente canino”, como aqui definido, é um anticorpo monoclonal produzido por um clone de células (tipicamente uma linhagem celular CHO) e, portanto, um único tipo puro homogêneo de anticorpo. Os anticorpos identificados a partir de células B individuais de mamíferos imunizados, tais como cães, são criados como proteínas IgG recombinantes após a identificação de suas sequências de domínio variável. O enxerto desses domínios variáveis em domínios constantes caninos (constantes de cadeia pesada e cadeia leve kappa ou lambda) resulta na geração de anticorpos recombinantes completamente caninos. Todos os anticorpos monoclonais completamente caninos produzidos a partir do mesmo clone são idênticos e têm a mesma especificidade de antígeno. O termo “monoclonal” pertence a um único clone de células, uma única célula e à progênie daquela célula.
[087]“Anticorpo completamente felino”, como aqui definido, é um anticorpo monoclonal produzido por um clone de células (tipicamente uma linhagem celular CHO) e, portanto, um único tipo puro homogêneo de anticorpo. Os anticorpos identificados a partir de células B individuais de mamíferos imunizados, tais como cães, são criados como proteínas IgG recombinantes após a identificação de suas sequências de domínio variável. O enxerto desses domínios variáveis em domínios constantes felinos (constantes de cadeia pesada e cadeia leve kappa ou lambda) resulta na geração de anticorpos recombinantes completamente felinos. Todos os anticorpos monoclonais completamente felinos produzidos a partir do mesmo clone são idênticos e têm a mesma especificidade de antígeno. O termo “monoclonal” pertence a um único clone de células, uma única célula e à progênie daquela célula.
[088]“Anticorpo completamente equino”, como aqui definido, é um anticorpo monoclonal produzido por um clone de células (tipicamente uma linhagem celular CHO) e, portanto, um único tipo puro homogêneo de anticorpo. Os anticorpos identificados a partir de células B individuais de mamíferos imunizados, tais como cães, são criados como proteínas IgG recombinantes após a identificação de suas sequências de domínio variável. O enxerto desses domínios variáveis em domínios constantes equinos (constantes de cadeia pesada e cadeia leve kappa ou lambda) resulta na geração de anticorpos recombinantes completamente equinos. Todos os anticorpos monoclonais completamente equinos produzidos a partir do mesmo clone são idênticos e têm a mesma especificidade de antígeno. O termo “monoclonal” pertence a um único clone de células, uma única célula e à progênie daquela célula.
[089]“Anticorpo completamente humano”, como aqui definido, é um anticorpo monoclonal produzido por um clone de células (tipicamente uma linhagem celular CHO) e, portanto, um único tipo puro homogêneo de anticorpo. Os anticorpos identificados a partir de células B individuais de mamíferos imunizados, tais como cães, são criados como proteínas IgG recombinantes após a identificação de suas sequências de domínio variável. O enxerto desses domínios variáveis em domínios constantes humanos (constantes de cadeia pesada e cadeia leve kappa ou lambda) resulta na geração de anticorpos recombinantes completamente humanos. Todos os anticorpos monoclonais completamente humanos produzidos a partir do mesmo clone são idênticos e têm a mesma especificidade de antígeno. O termo “monoclonal” pertence a um único clone de células, uma única célula e à progênie daquela célula.
[090]Os anticorpos monoclonais aqui, especificamente incluem anticorpos “quiméricos” (imunoglobulinas) em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homologa às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes nos anticorpos derivados de uma outra espécie, bem como os fragmentos desses anticorpos, desde que eles exibam a atividade biológica desejada. Tipicamente, anticorpos quiméricos são anticorpos cujos genes da cadeia leve e pesada foram construídos, tipicamente por engenharia genética, a partir de genes da região variável e constante de anticorpos pertencentes a diferentes espécies. Por exemplo, os segmentos variáveis dos genes de um anticorpo monoclonal de camundongo podem ser unidos a segmentos constantes caninos. Em uma modalidade de uma IgG de camundongo:canina quimérico, o sítio de ligação ao antígeno é derivado de camundongo enquanto a porção FC é canina.
[091]As formas “caninizadas” de anticorpos não caninos (e.g., murinos) são anticorpos geneticamente manipulados que contêm uma sequência mínima derivada de imunoglobulina não canina. Os anticorpos caninizados são sequências de imunoglobulinas caninas (anticorpo receptor) em que os resíduos da região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos da região hipervariável de uma espécie não canina (anticorpo doador), tal como camundongo, tendo a especificidade,
afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos da região de estrutura (FR) das sequências de imunoglobulinas caninas são substituídos por resíduos não caninos correspondentes. Além disso, os anticorpos caninizados podem incluir resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo caninizado incluirá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas, ou substancialmente todas, as regiões hipervariáveis correspondem àquelas de uma sequência de imunoglobulina não canina e todas, ou substancialmente todas, as FRs são aquelas de uma sequência de imunoglobulina canino. O anticorpo caninizado opcionalmente também compreenderá uma região constante de imunoglobulina (Fc) completa, ou pelo menos uma porção desta, tipicamente a de uma sequência de imunoglobulina canina. Em uma modalidade de especiação ou caninização de uma IgG de camundongo, as CDRs de camundongo são enxertadas em estruturas caninas.
[092]As formas “felinizadas” de anticorpos não felinos (e.g., murinos) são anticorpos geneticamente manipulados que contêm uma sequência mínima derivada de imunoglobulina não felina. Os anticorpos felinizados são sequências de imunoglobulinas felinas (anticorpo receptor) em que os resíduos da região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos da região hipervariável de uma espécie não felina (anticorpo doador), tal como camundongo, tendo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos da região de estrutura (FR) das sequências de imunoglobulinas felinas são substituídos por resíduos não felinos correspondentes. Além disso, os anticorpos felinizados podem incluir resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo felinizado incluirá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas, ou substancialmente todas, as regiões hipervariáveis correspondem àquelas de uma sequência de imunoglobulina não felina e todas, ou substancialmente todas, as FRs são aquelas de uma sequência de imunoglobulina felina. O anticorpo felinizado opcionalmente também compreenderá uma região constante de imunoglobulina (Fc) completa, ou pelo menos uma porção desta, tipicamente a de uma sequência de imunoglobulina felina.
[093]As formas “equinizadas” de anticorpos não equinos (e.g., murinos) são anticorpos geneticamente manipulados que contêm uma sequência mínima derivada de imunoglobulina não equina. Os anticorpos equinizados são sequências de imunoglobulinas equinas (anticorpo receptor) em que os resíduos da região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos da região hipervariável de uma espécie não equina (anticorpo doador), tal como camundongo, tendo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos da região de estrutura (FR) das sequências de imunoglobulinas equinas são substituídos por resíduos não equinos correspondentes. Além disso, os anticorpos equinizados podem incluir resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo equinizado incluirá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas, ou substancialmente todas, as regiões hipervariáveis correspondem àquelas de uma sequência de imunoglobulina não equina e todas, ou substancialmente todas, as FRs são aquelas de uma sequência de imunoglobulina equina. O anticorpo equinizado opcionalmente também compreenderá uma região constante de imunoglobulina (Fc) completa, ou pelo menos uma porção desta, tipicamente a de uma sequência de imunoglobulina equina.
[094]As formas “humanizadas” de anticorpos não humanos (e.g., murinos) são anticorpos geneticamente manipulados que contêm uma sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Os anticorpos humanizados são sequências de imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que os resíduos da região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos da região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador), tal como camundongo, tendo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos da região de estrutura (FR) das sequências de imunoglobulinas humanas são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem incluir resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado incluirá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas, ou substancialmente todas, as regiões hipervariáveis correspondem àquelas de uma sequência de imunoglobulina não humana e todas, ou substancialmente todas, as FRs são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá uma região constante de imunoglobulina (Fc) completa, ou pelo menos uma porção desta, tipicamente a de uma sequência de imunoglobulina humana.
[095]Os anticorpos “Completamente Caninos” são anticorpos geneticamente manipulados que não contêm nenhuma sequência derivada de imunoglobulina não canina. Os anticorpos completamente caninos são sequências de imunoglobulinas caninas (anticorpo receptor) em que os resíduos da região hipervariável são derivados de um anticorpo canino que ocorre naturalmente (anticorpo doador) tendo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos da região de estrutura (FR) das sequências de imunoglobulinas caninas são substituídos por resíduos não caninos correspondentes. Além disso, anticorpos completamente caninos podem incluir resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador, tal como incluindo, mas não limitados às alterações nas CDRs para modificar a afinidade. Essas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo completamente canino incluirá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas, ou substancialmente todas, as regiões hipervariáveis correspondem àquelas de uma sequência de imunoglobulina canina e todas, ou substancialmente todas, as FRs são aquelas de uma sequência de imunoglobulina canina. O anticorpo completamente canino opcionalmente também compreenderá uma região constante de imunoglobulina (Fc) completa, ou pelo menos uma porção desta, tipicamente a de uma sequência de imunoglobulina canina.
[096]Os anticorpos “Completamente Felinos” são anticorpos geneticamente manipulados que não contêm nenhuma sequência derivada de imunoglobulina não felina. Os anticorpos completamente felinos são sequências de imunoglobulinas felinas (anticorpo receptor) em que os resíduos da região hipervariável são derivados de um anticorpo felino que ocorre naturalmente (anticorpo doador) tendo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos da região de estrutura (FR) das sequências de imunoglobulinas felinas são substituídos por resíduos não felinos correspondentes. Além disso, os anticorpos completamente felinos podem incluir resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador, tal como incluindo, mas não limitados às alterações nas CDRs para modificar a afinidade. Essas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo completamente felino incluirá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas, ou substancialmente todas, as regiões hipervariáveis correspondem àquelas de uma sequência de imunoglobulina felina e todas, ou substancialmente todas, as FRs são aquelas de uma sequência de imunoglobulina felina. O anticorpo completamente felino opcionalmente também compreenderá uma região constante de imunoglobulina (Fc) completa, ou pelo menos uma porção desta, tipicamente a de uma sequência de imunoglobulina felina.
[097]Os anticorpos “Completamente Equinos” são anticorpos geneticamente manipulados que não contêm nenhuma sequência derivada de imunoglobulina não equina. Os anticorpos completamente equinos são sequências de imunoglobulinas equinas (anticorpo receptor) em que os resíduos da região hipervariável são derivados de um anticorpo equino que ocorre naturalmente (anticorpo doador) tendo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos da região de estrutura (FR) das sequências de imunoglobulinas equinas são substituídos por resíduos não equinos correspondentes. Além disso, os anticorpos completamente equinos podem incluir resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador, tal como incluindo, mas não limitados às alterações nas CDRs para modificar a afinidade. Essas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo completamente equino incluirá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas, ou substancialmente todas, as regiões hipervariáveis correspondem àquelas de uma sequência de imunoglobulina equina e todas, ou substancialmente todas, as FRs são aquelas de uma sequência de imunoglobulina equina. O anticorpo completamente equino opcionalmente também compreenderá uma região constante de imunoglobulina (Fc) completa, ou pelo menos uma porção desta, tipicamente a de uma sequência de imunoglobulina equina.
[098]Os anticorpos “Completamente Humanos” são anticorpos geneticamente manipulados que não contêm nenhuma sequência derivada de imunoglobulina não humana. Os anticorpos completamente humanos são sequências de imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que os resíduos da região hipervariável são derivados de um anticorpo humano que ocorre naturalmente (anticorpo doador) tendo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos da região de estrutura (FR) das sequências de imunoglobulinas humanas são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos completamente humanos podem incluir resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador, tal como incluindo, mas não limitados às alterações nas CDRs para modificar a afinidade. Essas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo completamente humano incluirá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas, ou substancialmente todas, as regiões hipervariáveis correspondem àquelas de uma sequência de imunoglobulina humana e todas, ou substancialmente todas, as FRs são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo completamente humano opcionalmente também compreenderá uma região constante de imunoglobulina (Fc) completa, ou pelo menos uma porção desta, tipicamente a de uma sequência de imunoglobulina humana.
[099]O termo “heteroquimérico” como aqui definido, se refere a um anticorpo em que uma das cadeias de anticorpos (pesada ou leve) é, por exemplo, caninizada, felinizada, equinizada ou humanizada, enquanto a outra é quimérica. Em uma modalidade, uma cadeia pesada variável felinizada (onde todas as CDRs são de camundongo e todas as FRs são felinas) é pareada com uma cadeia leve variável quimérica (onde todas as CDRs são de camundongo e todas as FRs são de camundongo). Nesta modalidade, as cadeias pesadas variáveis e as cadeias leves variáveis são fundidas a uma região constante felina.
[0100]O termo “variante” como aqui usado, se refere a uma sequência de peptídeo, polipeptídeo ou ácido nucleico que codifica um peptídeo ou polipeptídeo, que tem uma ou mais variações de aminoácido conservadoras ou outras modificações menores, de tal modo que o peptídeo ou polipeptídeo correspondente tenha função substancialmente equivalente em comparação com o peptídeo ou polipeptídeo de tipo selvagem. Comumente, mimotopos de peptídeos variantes para o uso na presente invenção, terão pelo menos 30 % de identidade com o mimotopo precursor, mais preferivelmente pelo menos 50 %, mais preferivelmente pelo menos 75 %, mais preferivelmente pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 85 %, mais preferivelmente pelo menos 90 % e o mais preferivelmente pelo menos 95 % de identidade de sequência com o mimotopo precursor.
[0101]Um anticorpo anti-IL-31 “variante”, se refere aqui a uma molécula que se difere da sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos de um anticorpo anti-IL-31 “precursor” em virtude da adição, deleção e/ou substituição de um ou mais resíduos de aminoácido na sequência do anticorpo precursor e mantém pelo menos uma atividade desejada do anticorpo anti-IL-31 precursor. As atividades desejadas podem incluir a capacidade de se ligar especificamente ao antígeno, a capacidade de reduzir, inibir ou neutralizar a atividade da IL-31 em um animal, e a capacidade de inibir a sinalização de pSTAT mediada por IL-31 em um ensaio de base celular. Em uma modalidade, a variante compreende uma ou mais substituições de aminoácidos em uma ou mais regiões hipervariáveis e/ou de estrutura do anticorpo precursor. Por exemplo, a variante pode compreender pelo menos uma, e.g., de cerca de uma a cerca de dez e, preferivelmente, de cerca de duas a cerca de cinco substituições em uma ou mais regiões hipervariáveis e/ou de estrutura do anticorpo precursor.
Comumente, a variante terá uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50 % de identidade de sequência de aminoácidos com as sequências de domínio variável de cadeia leve ou pesada do anticorpo precursor, mais preferivelmente, pelo menos 65 %, mais preferivelmente, pelo menos 75 %, mais preferivelmente, pelo menos 80 %, mais preferivelmente, pelo menos 85 %, mais preferivelmente, pelo menos 90 % e o mais preferivelmente, pelo menos 95 % de identidade de sequência. Identidade ou homologia com relação a esta sequência é aqui definida como a porcentagem de resíduos de aminoácido na sequência candidata que são idênticos aos resíduos do anticorpo precursor, depois de alinhar as sequências e introduzir espaçamentos (gaps), se necessário, para obter a porcentagem máxima de identidade de sequência.
Nenhuma extensão, deleção ou inserção N-terminal, C-terminal ou interna na sequência do anticorpo deve ser interpretada como afetando a identidade ou homologia de sequência. A variante mantém a capacidade de se ligar a uma IL-31 e, preferivelmente, tem as atividades desejadas que são superiores àquelas do anticorpo precursor. Por exemplo, a variante pode ter uma afinidade de ligação mais forte, capacidade aumentada de reduzir, inibir ou neutralizar a atividade da IL-31 em um animal e/ou capacidade aumentada de inibir a sinalização de pSTAT mediada por IL- 31 em um ensaio de base celular.
[0102]Um ácido nucleico “variante” se refere aqui a uma molécula que se difere da sequência de um ácido nucleico “precursor”. A divergência de sequência polinucleotídica pode resultar de alterações mutacionais tais como deleções, substituições ou adições de um ou mais nucleotídeos. Cada uma dessas alterações pode ocorrer sozinha ou em combinação, uma ou mais vezes em uma dada sequência.
[0103]O anticorpo “precursor” aqui é um que é codificado por uma sequência de aminoácidos usada para a preparação da variante. Em uma modalidade, o anticorpo precursor tem uma região de estrutura canina e, se presente, tem regiões constantes de anticorpo canino. Por exemplo, o anticorpo precursor pode ser um anticorpo caninizado ou canino. Como outro exemplo, o anticorpo precursor pode ser um anticorpo felinizado ou felino. Como ainda outro exemplo, o anticorpo precursor pode ser um anticorpo equinizado ou equino. Em outro exemplo, o anticorpo precursor pode ser um anticorpo humanizado ou humano. Em ainda um outro exemplo, o anticorpo precursor é um anticorpo monoclonal murino.
[0104]O termo “região de ligação ao antígeno”, “porção de ligação ao antígeno” e semelhantes, como usado ao longo do relatório descritivo e reivindicações, se refere àquela porção de uma molécula de anticorpo que contém os resíduos de aminoácido que interagem com um antígeno e conferem ao anticorpo sua especificidade e afinidade para o antígeno. A região de ligação ao anticorpo inclui os os resíduos de aminoácidos de “estrutura” necessários para manter a conformação apropriada dos resíduos de ligação ao antígeno. A porção de ligação ao antígeno de um anticorpo de acordo com a presente invenção pode alternativamente ser referida aqui como um peptídeo ou polipeptídeo específico de IL-31 ou como um peptídeo ou polipeptídeo anti-IL-31, por exemplo.
[0105]O termo “isolado” significa que o material (e.g., anticorpo ou ácido nucleico) é separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural.
Os componentes contaminantes deste ambiente natural são materiais que interfeririam nos usos de diagnóstico ou terapêutico do material e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Com relação ao ácido nucleico, um ácido nucleico isolado pode incluir um que é separado das sequências 5’ a 3’ com as quais ele normalmente está associado no cromossomo. Em modalidades preferidas, o material será purificado para mais de 95 % em peso do material e, o mais preferivelmente, mais de 99 % em peso. O material isolado inclui o material in situ dentro de células recombinantes, visto que pelo menos um componente do ambiente natural do material não estará presente. Comumente, entretanto, o material isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.
[0106]A palavra “marcador”, quando aqui usada, se refere a um composto ou composição detectável que é conjugado diretamente ou indiretamente com o anticorpo, ácido nucleico ou mimotopo, por exemplo. O marcador pode, por si só, ser detectável (e.g., marcadores de radioisótopo ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimático, pode catalisar alteração química de um composto ou composição de substrato que é detectável.
[0107]Os termos “ácido nucleico”, “polinucleotídeo”, “molécula de ácido nucleico” e semelhantes, podem ser usados permutavelmente aqui e se referem a uma série de bases nucleotídicas (também chamadas “nucleotídeos”) no DNA e RNA.
O ácido nucleico pode conter desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e/ou seus análogos. O termo “ácido nucleico” inclui, por exemplo, moléculas de filamento único e de filamento duplo. Um ácido nucleico pode ser, por exemplo, um gene ou fragmento de gene, éxons, íntrons, uma molécula de DNA (e.g., cDNA), uma molécula de RNA (e.g., mRNA), ácidos nucleicos recombinantes, plasmídeos e outros vetores, primers e sondas. Ambos os polinucleotídeos 5’ a 3’ (sentido) e 3’ a 5’ (anti-sentido) estão incluídos.
[0108]Um “sujeito” ou “paciente” se refere a um mamífero em necessidade de tratamento que pode ser afetado pelas moléculas da invenção. Os mamíferos que podem ser tratados de acordo com a invenção incluem vertebrados, com mamíferos tais como caninos, felinos, equinos e mamíferos humanos sendo exemplos particularmente preferidos.
[0109]Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” (ou “quantidade eficaz”) se refere a uma quantidade de um ingrediente ativo, e.g., um agente de acordo com a invenção, suficiente efetuar resultados benéficos ou desejados quando administrado a um sujeito ou paciente. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações, aplicações ou dosagens. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição de acordo com a invenção pode ser facilmente determinada por um especialista na técnica. No contexto desta invenção, uma “quantidade terapeuticamente eficaz” é uma que produz uma mudança objetivamente medida em um ou mais parâmetros associados ao tratamento de um transtorno mediado por IL-31, tal como uma condição prurítica ou uma condição alérgica ou progressão tumoral, incluindo melhoria clínica em sintomas. Certamente, a quantidade terapeuticamente eficaz vai variar dependendo do sujeito particular e condição sendo tratada, o peso e idade do sujeito, a severidade da condição da doença, o composto particular escolhido, o regime de dosagem a ser seguido, tempo de administração, a maneira de administração e semelhantes, todos os quais podem ser facilmente determinados por um especialista na técnica.
[0110]Como aqui usado, o termo “terapêutico” abrange o espectro completo de tratamentos para uma doença ou transtorno. Um agente “terapêutico” da invenção pode agir de uma maneira que é profilática ou preventiva, incluindo aqueles que incorporam procedimentos intencionados a alvejar animais que podem ser identificados como estando em risco (farmacogenética); ou de uma maneira que é melhoradora ou curativa na natureza; ou pode agir para diminuir a taxa ou extensão da progressão de pelo menos um sintoma de uma doença ou transtorno sendo tratado.
[0111]“Tratamento”, “tratar” e semelhantes, se referem ao tratamento terapêutico e medidas profiláticas ou preventivas. Animais em necessidade de tratamento incluem aqueles já com o transtorno, bem como aqueles em que o transtorno deve ser prevenido. O termo “tratamento” ou “tratar” uma doença ou transtorno inclui prevenir ou proteger contra a doença ou transtorno (isto é, faz com que os sintomas clínicos não se desenvolvam); inibir a doença ou transtorno (i.e., interromper ou suprimir o desenvolvimento de sintomas clínicos; e/ou aliviar a doença ou transtorno (i.e., causar a regressão dos sintomas clínicos). Como será avaliado, nem sempre é possível distinguir entre “prevenir” e “suprimir” uma doença ou transtorno visto que o evento ou eventos indutivos finais podem ser desconhecidos ou latentes. Consequentemente, o termo “profilaxia” será entendido como constituindo um tipo de “tratamento” que abrange “prevenir” e “suprimir”. O termo “tratamento”, portanto, inclui a “profilaxia”.
[0112]O termo “condição alérgica” é aqui definido como um transtorno ou doença causada por uma interação entre o sistema imune e uma substância estranha ao corpo. Esta substância estranha é denominada “um alérgeno”. Alérgenos comuns incluem aeroalérgenos, tais como pólen, poeira, mofo, proteínas de ácaros, saliva injetada a partir de picadas de inseto, etc. Exemplos de condições alérgicas incluem,
mas não são limitadas às seguintes: dermatite alérgica, eczema de verão, urticária, heaves, doença inflamatória das vias aéreas, obstrução recorrente das vias aéreas, hiperresponsividade das vias aéreas, doença pulmonar obstrutiva crônica e processos inflamatórios resultantes de auto-imunidade, tais como Síndrome do intestino irritável (IBS).
[0113]O termo “condição prurítica” é aqui definido como uma doença ou transtorno caracterizado por uma sensação de coceira intenso que produz o desejo de esfregar ou coçar a pele para obter alívio. Exemplos de condições pruríticas incluem, mas não são limitados às seguintes: dermatite atópica, dermatite alérgica, eczema, psoríase, esclerodermia e prurido.
[0114]Como aqui usado, os termos “célula”, “linhagem celular” e “cultura celular” podem ser usados permutavelmente. Todos esses termos também incluem sua progênie, que é qualquer e todas as gerações subsequentes. É entendido que toda progênie pode não ser idêntica devido às mutações deliberadas ou inadvertidas.
No contexto de expressar uma sequência heteróloga de ácido nucleico, “célula hospedeira” se refere a uma célula procariótica ou eucariótica (e.g., células bacterianas, células de levedura, células de mamíferos e células de inseto) seja localizada in vitro ou in vivo. Por exemplo, as células hospedeiras podem estar localizadas em um animal transgênico. A célula hospedeira pode ser usada como um receptor para vetores e pode incluir qualquer organismo transformável que é capaz de replicar um vetor e/ou expressar um ácido nucleico heterólogo codificado por um vetor.
[0115]Uma “composição” é intencionada a significar uma combinação de agente ativo e outro composto ou composição que pode ser inerte (e.g., um marcador) ou ativa, tal como um adjuvante.
[0116]Como aqui usado, os termos “portador farmaceuticamente aceitável” e “veículo farmaceuticamente aceitável” são permutáveis e se referem a um veículo fluido para conter os antígenos da vacina que podem ser injetados em um hospedeiro sem efeitos adversos. Portadores farmaceuticamente aceitáveis adequados para o uso na invenção são bem conhecidos pelos especialistas na técnica. Esses portadores incluem, sem limitação, água, solução salina, solução salina tamponada, tampão fosfato, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões. Outros diluentes, adjuvantes e excipientes convencionalmente utilizados podem ser adicionados de acordo com as técnicas convencionais. Esses portadores podem incluir etanol, polióis e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais e ésteres orgânicos injetáveis. Tampões e agentes de ajuste de pH também podem ser utilizados. Tampões incluem, sem limitação, sais preparados a partir de um ácido ou base orgânica. Tampões representativos incluem, sem limitação, sais de ácido orgânico, tais como sais de ácido cítrico, e.g., citratos, ácido ascórbico, ácido glicônico, histidina-HCl, ácido carbônico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido acético ou ácido ftálico, Tris, cloridreto de trimetanmina ou tampões de fosfato. Portadores parenterais podem incluir solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose, trealose, sacarose e cloreto de sódio, óleos de Ringer fixados ou lactados. Portadores intravenosos podem incluir reforçadores de fluidos e nutrientes, reforçadores de eletrólitos, tais como aqueles com base em dextrose de Ringer e semelhantes.
Conservantes e outros aditivos, tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes (e.g., EDTA), gases inertes e semelhantes também podem ser fornecidos nos portadores farmacêuticos. A presente invenção não é limitada pela seleção do portador. A preparação dessas composições farmaceuticamente aceitáveis, a partir dos componentes acima descritos, tendo isotonicidade de pH apropriada, estabilidade e outras características convencionais está dentro da habilidade na técnica. Ver, e.g., textos tais como Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed, Lippincott Williams & Wilkins, publ., 2000; e The Handbook of Pharmaceutical Excipientes, 4.sup.th edit., eds. R. C. Rowe et al.,
APhA Publications, 2003.
[0117]O termo “substituição conservadora de aminoácido” indica qualquer substituição de aminoácido para um dado resíduo de aminoácido, onde o resíduo substituto é tão quimicamente semelhante àquele determinado resíduo que não resulta em nenhuma diminuição substancial na função do polipeptídeo (e.g., atividade enzimática). Substituições conservadoras de aminoácido são comumente conhecidas na técnica e exemplos das mesmas são descritos, e.g., nas Pat. U.S. Nos 6.790.639,
6.774.107, 6.194.167 ou 5.350.576. Em uma modalidade preferida, uma substituição conservadora de aminoácido será qualquer uma que ocorra dentro de um dos seis grupos seguintes • 1. Resíduos alifáticos pequenos substancialmente não polares: Ala, Gly, Pro, Ser e Thr; • 2. Resíduos alifáticos grandes não polares: Ile, Leu e Val; Met; • 3. Resíduos polares negativamente carregados e suas amidas: Asp e Glu; • 4. Amidas de resíduos polares negativamente carregados: Asn e Gln; His; • 5. Resíduos polares positivamente carregados: Arg e Lys; His; e • 6. Resíduos aromáticos grandes: Trp e Tyr; Phe.
Em uma modalidade preferida, uma substituição conservadora de aminoácido será qualquer uma das seguintes, que são listadas como pares de Resíduos Nativos (Substituições Conservadoras): Ala (Ser); Arg (Lys); Asn (Gln; His); Asp (Glu); Gln (Asn); Glu (Asp); Gly (Pro); His (Asn; Gln); Ile (Leu; Val); Leu (Ile; Val); Lys (Arg; Gln; Glu); Met (Leu; Ile); Phe (Met; Leu; Tyr); Ser (Thr); Thr (Ser); Trp (Tyr); Tyr (Trp; Phe); e Val (Ile; Leu).
[0118]Assim como um polipeptídeo pode conter substituição conservadora de aminoácido(s), um polinucleotídeo deste pode conter substituições conservadoras de códon(s). Uma substituição de códon é considerada conservadora se, quando expressada, produz uma substituição conservadora de aminoácido, como descrito acima. Substituição degenerada de códon, que não resulta na substituição de aminoácido, também é útil em polinucleotídeos de acordo com a presente invenção.
Assim, e.g., um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo útil selecionado em uma modalidade da presente invenção pode ser mutado por substituição degenerada de códon de modo a aproximar a frequência de uso do códon exibida por uma célula hospedeira de expressão a ser transformada com ela ou para, de outro modo, melhorar a expressão da mesma.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0119]Deve ser entendido que esta invenção não é limitada à metodologia, protocolos e reagentes particulares, etc., aqui descritos e, como tal, podem variar. A terminologia aqui usada é para o propósito de descrever apenas modalidades particulares, e não é intencionada a limitar o escopo da presente invenção, que é definido somente pelas reivindicações.
[0120]A menos que de outro modo definido, os termos científicos e técnicos usados em relação às composições de vacina e anticorpos aqui descritas devem ter os significados que são comumente entendidos pelo especialista na técnica. Além disso, a menos que de outro modo exigido pelo contexto, termos singulares devem incluir pluralidades e termos plurais devem incluir o singular. Geralmente, as nomenclaturas utilizadas em relação a, e técnicas de cultura de células e tecidos, biologia molecular e química e hibridização de proteína e oligo- ou polinucleotídeo aqui descritas são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica.
[0121]As técnicas padrão são usadas para DNA recombinante, síntese de oligonucleotídeos e cultura e transfecção de tecido (e.g., eletroporação, lipofecção).
As técnicas de reações e purificação enzimática são realizadas de acordo com especificações do fabricante ou como comumente realizado na técnica ou como aqui descrito. As técnicas e procedimentos anteriores são geralmente realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e como descritos em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas ao longo do presente relatório descritivo, Ver e.g., Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: LAB.
MANUAL (3a ed., Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001) e Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (Nova Iorque: Greene Publishing Association/Wiley Interscience), 1993. As nomenclaturas utilizadas em relação aos procedimentos e técnicas de laboratório de química analítica, química orgânica sintética e química médica e farmacêutica, aqui descritos são bem conhecidos e comumente usados na técnica. As técnicas padrão são usadas para sínteses químicas, análises químicas, preparação, formulação e liberação farmacêutica e tratamento de pacientes.
[0122]Exceto nos exemplos operacionais, ou onde de outro modo indicado, todos os números que expressam quantidades de ingredientes ou condições de reação aqui usados devem ser entendidos como modificados em todos os casos pelo termo “cerca de”.
[0123]Todas as patentes e outras publicações identificadas são expressamente incorporadas aqui por referência para o propósito de descrever e divulgar, por exemplo, as metodologias descritas nessas publicações que podem ser usadas em relação à presente invenção. Essas publicações são fornecidas somente para sua divulgação antes da data de depósito do presente pedido.
Composições
[0124]A presente invenção fornece mimotopos de IL-31 (peptídeos) e variantes dos mesmos e seus usos em procedimentos clínicos e científicos, incluindo procedimentos de diagnóstico. Como aqui usado, esse mimotopo de IL-31 é um peptídeo linear ou restrito que imita um epítopo de antígeno. Um anticorpo anti-IL-31 para um dado antígeno de epítopo de IL-31 reconhecerá um mimotopo de IL-31 que imita esse epítopo.
[0125]Mimotopos de IL-31 (peptídeos) são utilizados em composições de vacina de acordo com a presente invenção. Essas composições de vacina são úteis para proteger um mamífero contra um transtorno mediado por IL-31, tal como uma condição prurítica ou alérgica. Em algumas modalidades, a condição prurítica ou alérgica mediada por IL-31 é uma condição prurítica selecionada de dermatite atópica, eczema, psoríase, esclerodermia e prurido. Em outras modalidades, a condição prurítica ou alérgica mediada por IL-31 é uma condição alérgica selecionada de dermatite alérgica, eczema de verão, urticária, heaves, doença inflamatória das vias aéreas, obstrução recorrente das vias aéreas, hiperresponsividade das vias aéreas, doença pulmonar obstrutiva crônica e processos inflamatórios resultantes de auto- imunidade. Em outras modalidades, o transtorno mediado por IL-31 é progressão tumoral. Em algumas modalidades, o transtorno mediado por IL-31 é doença eosinofílica ou mastocitomas.
[0126]Em uma modalidade, uma composição de vacina de acordo com a presente invenção inclui a combinação de um polipeptídeo portador e pelo menos um mimotopo selecionado de um mimotopo de IL-31 felina, um mimotopo de IL-31 canina, um mimotopo de IL-31 de cavalo e um mimotopo de IL-31 humana; e um adjuvante.
Em algumas modalidades, as composições de vacina desta invenção podem incluir mais de um mimotopo de IL-31 de uma dada espécie ou mesmo uma combinação de mimotopos de IL-31 de diferentes espécies. Em algumas modalidades, um mimotopo (linear ou restrito) para o uso nas composições e/ou métodos da presente invenção é e/ou compreende como parte do mesmo um peptídeo que tem cerca de 5 resíduos de aminoácido a cerca de 40 resíduos de aminoácido em comprimento.
[0127]Em uma modalidade, o pelo menos um mimotopo utilizado nas composições e métodos da presente invenção é selecionado de um mimotopo 15H05 de IL-31, um mimotopo de região BC em hélice de IL-31, um mimotopo de região Aa em hélice de IL-31, um mimotopo de região de alça AB de IL-31 ou qualquer combinação dos mesmos.
[0128]Em uma modalidade, o pelo menos um mimotopo para o uso nas composições e métodos da presente invenção gera anticorpos que estão neutralizando a bioatividade de IL-31.
[0129]Em outra modalidade, as composições de vacina desta invenção são capazes de induzir uma resposta imune focalizada para gerar anticorpos no mamífero dirigidos a pelo menos um epítopo neutralizante na IL-31, mas não contra epítopos não neutralizantes na IL-31.
[0130]Em uma modalidade, a composição de vacina inclui um mimotopo de IL-31 canina que é e/ou inclui como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SVPADTFECKSF (SEQ ID NO: 186), SVPADTFERKSF (SEQ ID NO: 187), NSSAILPYFRAIRPLSDKNIIDKIIEQLDKLKF (SEQ ID NO: 192), APTHQLPPSDVRKIILELQPLSRG (SEQ ID NO: 196), TGVPES (SEQ ID NO: 200) ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
[0131]Em outra modalidade, a composição de vacina inclui um mimotopo de IL-31 felina que é e/ou inclui como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SMPADNFERKNF (SEQ ID NO: 188), NGSAILPYFRAIRPLSDKNTIDKIIEQLDKLKF (SEQ ID NO: 193), APAHRLQPSDIRKIILELRPM SKG (SEQ ID NO: 197), IGLPES (SEQ ID NO: 201) ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
[0132]Ainda em uma outra modalidade, a composição de vacina inclui um mimotopo de IL-31 equina que é e/ou inclui como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SMPTDNFERKRF (SEQ ID NO: 189), NSSAILPYFKAISPSLNNDKSLYIIEQLDKLNF (SEQ ID NO: 194), GPIYQLQPKEIQAIIVELQNLS KK (SEQ ID NO: 198), KGVQKF (SEQ ID NO: 202) ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
[0133]Ainda em uma outra modalidade, a composição de vacina inclui um mimotopo de IL-31 humana que é e/ou inclui como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SVPTDTHECKRF (SEQ ID NO: 190), SVPTDTHERKRF (SEQ ID NO:
191), HSPAIRAYLKTIRQLDNKSVIDEIIEHLDKLIF (SEQ ID NO: 195), LPVRLLRPSDDVQKIVEELQSLSKM (SEQ ID NO: 199), KGVLVS (SEQ ID NO: 203) ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
[0134]Em uma modalidade, o mimotopo utilizado nas composições de vacina de acordo com a presente invenção é um mimotopo restrito. Em uma modalidade, esse mimotopo restrito é um peptídeo cíclico ligado quimicamente.
[0135]Os mimotopos lineares de IL-31 podem ser quimicamente sintetizados ou produzidos recombinantemente. Mimotopos restritos de IL-31, tais como um peptídeo cíclico ligado quimicamente, podem ser quimicamente sintetizados ou podem ser fabricados usando uma combinação de síntese química e tecnologia recombinante.
[0136]Em algumas modalidades, o mimetopo de IL-31 utilizado na composição de vacina é quimicamente conjugado com um polipeptídeo portador. Em outras modalidades, o polipeptídeo portador e o mimotopo são parte de uma proteína de fusão recombinante.
[0137]O polipeptídeo portador que é combinado com o mimotopo de IL-31 pode ser ou pode incluir como parte do mesmo um toxoide bacteriano ou um derivado do mesmo, hemocianina da lapa do buraco da fechadura (KLH) ou uma partícula semelhante a vírus. A título de exemplos não limitativos, o toxoide bacteriano ou derivado pode ser um toxoide de tétano, um toxoide de difteria, um toxoide de tétano, o complexo de proteína da membrana externa do grupo B N. meningitidis, exotoxina de Pseudomonas ou o mutante não tóxico da toxina da difteria (CRM197). A título de outros exemplos não limitativos, a partícula semelhante a vírus pode ser HBsAg, HBcAg, Qbeta bacteriófago de E. coli, vírus Norwalk, vírus da cinomose canina (CDV) ou influenza HA. Em uma modalidade preferida, o mimotopo de IL-31 é em uma combinação com um polipeptídeo portador que inclui ou consiste em CRM197.
[0138]As composições de vacina de acordo com a presente invenção incluem pelo menos um adjuvante ou formulação adjuvante, como será descrito em mais detalhes abaixo.
[0139]As as vacinas da presente invenção podem ser formuladas seguindo a convenção aceita para incluir portadores farmaceuticamente aceitáveis para animais, incluindo humanos (se aplicável), tais como tampões, estabilizadores, diluentes, conservantes e/ou solubilizantes padrão, e também podem ser formuladas para facilitar a liberação sustentada. Diluentes incluem água, solução salina, dextrose, etanol, glicerol e semelhantes. Aditivos para isotonicidade incluem cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol e lactose, entre outros. Estabilizadores incluem albumina, entre outros. Outros veículos e aditivos de vacina adequados, incluindo aqueles que são particularmente úteis na formulação de vacinas vivas modificadas, são conhecidos ou serão evidentes para os especialistas na técnica. Ver, e.g., Remington’s Pharmaceutical Science, 18a ed., 1990, Mack Publishing, que é incorporado aqui por referência.
[0140]As vacinas da presente invenção podem compreender ainda um ou mais componentes imunomoduladores adicionais, tais como, e.g., um adjuvante ou citocina, entre outros. Tipos de adjuvantes adequados para o uso nas composições da presente invenção incluem os seguintes: um adjuvante óleo-em-água, um adjuvante de polímero e água, um adjuvante água-em-óleo, um adjuvante de hidróxido de alumínio, um adjuvante de vitamina E e combinações dos mesmos. Alguns exemplos específicos de adjuvantes incluem, mas não são limitados a adjuvante de Freund completo, adjuvante de Freund incompleto, Corynebacterium parvum, Bacillus Calmette Guerin, gel de hidróxido de alumínio, glucano, sulfato de dextrano, óxido de ferro, alginato de sódio, Bacto-Adjuvante, certos polímeros sintéticos, tais como poli aminoácidos e co-polímeros de aminoácidos, Copolímero em bloco (CytRx, Atlanta, Ga.), QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Massa.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), adjuvante AMPHIGEN®, saponina, Quil A ou outra fração de saponina,
monofosforil lipídeo A e adjuvante avridina lipídeo-amina (N,N-dioctadecil-N’,N’-bis(2- hidroxietil)-propanediamina), “REGRESSIN” (Vetrepharm, Athens, Ga.), óleo de parafina, sistema adjuvante RIBI (Ribi Inc., Hamilton, Mont.), muramil dipeptídeo e semelhantes.
[0141]Exemplos não limitativos de emulsões óleo-em-água úteis na vacina da invenção incluem formulações SEAM62 e SEAM 1/2 modificadas. SEAM62 modificada é uma emulsão óleo-em-água contendo 5 % (v/v) de esqualano (Sigma), 1 % (v/v) de detergente SPAN® 85 (ICI Tensoativos), 0,7 % (v/v) de detergente TWEEN® 80 (Tensoativos ICI), 2,5 % (v/v) de etanol, 200 μg/ml de Quil A, 100 μg/ml de colesterol e 0,5 % (v/v) de lecitina. SEAM 1/2 modificada é uma emulsão óleo-em- água compreendendo 5 % (v/v) de esqualano, 1 % (v/v) de detergente SPAN® 85, 0,7 % (v/v) de detergente Tween 80, 2,5 % (v/v) de etanol, 100 μg/ml de Quil A e 50 μg/ml de colesterol.
[0142]Outro exemplo de um adjuvante útil nas composições da invenção é óleo SP. Como usado na relatório descritivo e reivindicações, o termo “óleo SP” designa uma emulsão de óleo compreendendo um copolímero em bloco polioxietileno- polioxipropileno, esqualano, mono-oleato de polioxietileno sorbitano e uma solução salina tamponada. Copolímeros em bloco polioxietileno-polioxipropileno são tensoativos que ajudam os componentes sólidos e líquidos em suspensão. Estes tensoativos são comercialmente disponíveis como polímeros sob o nome comercial Pluronic®. O tensoativo preferido é poloxamer 401 que é comercialmente disponível sob o nome comercial Pluronic® L-121. Em geral, a emulsão de óleo SP é um adjuvante de mistura de imunoestimulação que compreenderá cerca de 1 a 3 % (vol/vol) de copolímero em bloco, cerca de 2 a 6 % (vol/vol) de esqualano, mais particularmente cerca de 3 a 6 % de esqualano, e cerca de 0,1 a 0,5 % (vol/vol) de mono-oleato de polioxietileno sorbitano, com o restante sendo uma solução salina tamponada.
[0143]“Imunomoduladores” que podem ser incluídos na vacina incluem, e.g., oligonucleotídeos imunoestimuladores, um ou mais interleucinas, interferons ou outras citocinas conhecidas. Em uma modalidade, o adjuvante pode ser uma ciclodextrina derivada ou um polímero polianiônico, tal como aqueles descritos na Pat.
U.S. Nos 6.165.995 e 6.610.310, respectivamente.
[0144]Em uma modalidade, o adjuvante é uma formulação compreendendo uma saponina, um esterol, um composto de amônio quaternário e um polímero. Em uma modalidade específica, a saponina é Quil A ou uma fração purificada da mesma, o esterol é colesterol, o composto de amônio quaternário é brometo de dimetil dioctadecil amônio (DDA) e o polímero é ácido poliacrílico.
[0145]Em outra modalidade, o adjuvante compreende a combinação de um ou mais oligonucleotídeos imunoestimuladores isolados, um esterol e uma saponina.
Em uma modalidade específica, um ou mais oligonucleotídeos imunoestimuladores isolados compreendem CpG, o esterol é colesterol e a saponina é Quil A ou uma fração purificada da mesma. Como aqui usado, o adjuvante ZA-01 referido na seção do exemplo inclui Quil A (saponina), colesterol, CpG e diluente.
[0146]Em outra modalidade, um adjuvante útil para ser utilizado nas composições desta invenção inclui oligonucleotídeos imunoestimuladores contendo CpG. Oligonucleotídeos contendo CpG são descritos, por exemplo, na Patente US NO: 8.580.280. Em uma modalidade específica, um adjuvante para o uso na presente invenção é uma mistura incluindo pelo menos um adjuvante glicolipídico e oligonucleotídeos contendo CpG. Um exemplo específico de um adjuvante útil é uma mistura que inclui o adjuvante glicolipídico Bay R1005 (N-(2-Desóxi-2-L-leucilamino- β-D-glucopiranosil)-N-octadecildodecanoilamide-hidroacetato) bem como oligonucleotídeos CpG.
[0147]Em uma modalidade, o adjuvante ou mistura adjuvante é adicionada em uma quantidade de cerca de 100 μg a cerca de 10 mg por dose. Em outra modalidade, a mistura de adjuvante/adjuvante é adicionada em uma quantidade de cerca de 200 μg a cerca de 5 mg por dose. Ainda em uma outra modalidade, a mistura de adjuvante/adjuvante é adicionada em uma quantidade de cerca de 300 μg a cerca de 1 mg/dose.
[0148]Com o advento de métodos de biologia molecular e tecnologia recombinante, é possível produzir os peptídeos e polipeptídeos anteriormente mencionados por meios recombinantes e, desse modo, geram sequências genéticas que codificam as sequências de aminoácidos específicas encontradas na estrutura de peptídeo ou polipeptídeo. Em uma modalidade, o peptídeo é o mimotopo de IL-31 ou é pelo menos parte do mimotopo de IL-31. Em outra modalidade, o polipeptídeo é o polipeptídeo portador que está presente em combinação com o mimotopo de IL-31.
Ainda em uma outra modalidade, o polipeptídeo é um anticorpo, tal como aqueles no qual o mimotopo de IL-31 utilizado na composição de vacina ou métodos de diagnóstico desta invenção se liga. Tais anticorpos podem ser produzidos por clonar as sequências genéticas que codificam as cadeias de polipeptídeo dos ditos anticorpos ou por síntese direta das ditas cadeias de polipeptídeo, com montagem das cadeias sintetizadas para formar estruturas tetraméricas ativas (H2L2) com afinidade para epítopos específicos e antigênicos determinantes. Isto permitiu a produção de anticorpos tendo sequências características de neutralizar anticorpos de diferentes espécies e fontes.
[0149]Independentemente da fonte dos anticorpos, ou como eles são construídos de forma recombinante, ou como são sintetizados, in vitro ou in vivo, usando animais transgênicos, grandes culturas de células de laboratório ou tamanho comercial, usando plantas transgênicas, ou por síntese química direta não empregando organismos vivos em qualquer estágio do processo; todos os anticorpos têm uma estrutura tridimensional geral semelhante. Esta estrutura é frequentemente dada como H2L2 e se refere ao fato de que os anticorpos comumente compreendem duas cadeias leves (L) de aminoácidos e 2 cadeias pesadas (H) de aminoácidos.
Ambas as cadeias possuem regiões capazes de interagir com um alvo antigênico estruturalmente complementar. As regiões que interagem com o alvo são referidas como regiões “variáveis” ou “V” e são caracterizadas por diferenças na sequência de aminoácidos de anticorpos de especificidade antigênica diferente. As regiões variáveis das cadeias H ou L contêm as sequências de aminoácidos capazes de se ligar especificamente a alvos antigênicos.
[0150]A “região de ligação ao antígeno” ou “porção de ligação ao antígeno” de um anticorpo se refere àquela porção de uma molécula de anticorpo que contém os resíduos de aminoácido que interagem com um antígeno e conferem ao anticorpo sua especificidade e afinidade para o antígeno. A região de ligação ao anticorpo inclui os resíduos de aminoácido de “estrutura” necessários para manter a conformação apropriada dos resíduos de ligação ao antígeno. A porção de ligação ao antígeno de um anticorpo referida no relatório descritivo e reivindicações pode ser referida aqui como um peptídeo ou polipeptídeo específico de IL-31 ou como um peptídeo ou polipeptídeo anti-IL-31, por exemplo.
[0151]Dentro das regiões variáveis das cadeias H ou L que fornecem as regiões de ligação ao antígeno estão sequências menores denominadas “hipervariáveis” por causa da sua extrema variabilidade entre anticorpos de especificidade diferente. Essas regiões hipervariáveis também são referidas como “regiões determinantes de complementaridade” ou regiões “CDR”. Essas regiões CDR são responsáveis pela especificidade básica do anticorpo para uma estrutura antigênica determinante particular.
[0152]As CDRs representam trechos não contíguos de aminoácidos dentro das regiões variáveis mas, independentemente da espécie, descobriu-se que as localizações posicionais dessas sequências de aminoácidos críticas dentro das regiões variáveis de cadeia leve e pesada têm localizações similares dentro das sequências de aminoácidos das cadeias variáveis. As cadeias variáveis leves e pesadas de todos os anticorpos têm, cada uma, três regiões CDR, cada uma não contígua com as outras.
[0153]Em todas as espécies de mamíferos, peptídeos de anticorpo contêm regiões constante (i.e., altamente conservadas) e variáveis e, dentro das últimas, existem as CDRs e as assim chamadas “regiões de estrutura” constituídas por sequências de aminoácidos dentro da região variável da cadeia leve ou pesada, mas for a das CDRs. Com relação ao determinado antigênico reconhecido pelas regiões CDR do anticorpo, também é referido como o “epítopo”. Em outras palavras, epítopo se refere àquela porção de qualquer molécula capaz de ser reconhecida por, e se ligar a, um anticorpo (a região de ligação do anticorpo correspondente pode ser referida como um parátopo).
[0154]Um “antígeno” é uma molécula ou uma porção de uma molécula capaz de ser ligada por um anticorpo que é adicionalmente capaz de induzir um animal a produzir um anticorpo capaz de se ligar a um epítopo daquele antígeno. Um antígeno pode ter um ou mais de um epítopo. A reação específica referida acima pretende indicar que o antígeno vai reagir, de uma maneira altamente seletiva, com o seu anticorpo correspondente e não com a multidão de outros anticorpos que podem ser evocados por outros antígenos.
[0155]Os anticorpos referidos aqui pretendem incluir moléculas de imunoglobulinas intactas bem como porções, fragmentos, peptídeos e derivados das mesmas, tais como, por exemplo, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, Fse, regiões CDR, parátopos ou qualquer porção (e.g., um polipeptídeo) ou sequência peptídica do anticorpo que é capaz de se ligar a um antígeno ou epítopo. Diz-se que o anticorpo é “capaz de se ligar a” uma molécula se for capaz de reagir especificamente com a molécula para, desse modo, ligar a molécula ao anticorpo.
[0156]Os anticorpos referidos aqui também incluem anticorpos quiméricos,
anticorpos heteroquiméricos, anticorpos caninizados, anticorpos felinizados, anticorpos equinizados, anticorpos humanizados, anticorpos completamente caninos, anticorpos completamente felinos, anticorpos completamente equinos, anticorpos completamente humanos, bem como fragmentos, porções, regiões, peptídeos ou derivados dos mesmos, fornecidos por qualquer técnica conhecida tal como, mas não limitada a clivagem enzimática, síntese de peptídeo ou técnicas recombinantes. Esses anticorpos referidos aqui são capazes de se ligar especificamente a pelo menos uma de IL-31 canina, IL-31 felina, IL-31 equina ou IL-31 humana. Os fragmentos ou porções de anticorpos podem carecer do fragmento Fc do anticorpo intacto, sair mais rapidamente da circulação e podem ter menos ligação não específica ao tecido que um anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos que podem ser produzidos a partir de anticorpos intacto usando métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, por clivagem proteolítica com enzimas, tais como papaína (para produzir fragmentos Fab) ou pepsina (para produzir fragmentos F(ab’).2). Ver, e.g., Wahl et al., 24 J. Nucl. Med. 316-25 (1983). As porções de anticorpos podem ser feitas por qualquer um dos métodos acima ou podem ser feitas expressando uma porção da molécula recombinante. Por exemplo, a região CDR de um anticorpo recombinante pode ser isolada e subclonada no vetor de expressão apropriado. Ver, e.g., Pat. U.S.
No 6.680.053.
Sequências de Nucleotídeos e Aminoácidos dos Clones 15H05, ZIL1, ZIL8, ZIL9, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159 e ZIL171
[0157]Em algumas modalidades, a presente invenção fornece mimotopos de IL-31 que se ligam a novos anticorpos monoclonais que se ligam especificamente a pelo menos uma de IL-31 canina, IL-31 felina ou IL-31 equina. Esses anticorpos monoclonais podem ser utilizados nos métodos de diagnóstico desta invenção junto com o mimotopo de IL-31. Em uma modalidade, um anticorpo monoclonal referido no relatório descritivo e reivindicações se liga a IL-31 canina, IL-31 felina ou IL-31 equina e impede sua ligação e ativação de seu complexo co-receptor compreendendo receptor A de IL-31 (IL-31Ra) e receptor específico de Oncostatina-M (OsmR ou IL- 31Rb). Exemplos desses anticorpos monoclonais são identificados aqui como “15H05”, “ZIL1”, “ZIL8”, “ZIL9”, “ZIL11”, “ZIL69”, “ZIL94”, “ZIL154”, “ZIL159” e “ZIL171”, que se referem aos números atribuídos aos seus clones. Aqui, “15H05”, “ZIL1”, “ZIL8”, “ZIL9”, “ZIL11”, “ZIL69”, “ZIL94”, “ZIL154”, “ZIL159” e “ZIL171” também se referem à porção do anticorpo monoclonal, o parátopo ou as CDRs, que se ligam especificamente com um epítopo de IL-31 identificados como 15H05, ZIL1, ZIL8, ZIL9, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159 e ZIL171 por causa de sua capacidade de se ligar aos anticorpos 15H05, ZIL1, ZIL8, ZIL9, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159 e ZIL171, respectivamente. As várias formas recombinantes, quiméricas, heteroquiméricas, caninizadas, felinizadas, equinizadas, completamente caninas, completamente felinas e/ou completamente equinas de 15H05, ZIL1, ZIL8, ZIL9, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159 e ZIL171 aqui descritas podem ser referidas pelo mesmo nome.
[0158]Em uma modalidade, uma composição de vacina de acordo com a presente invenção inclui um mimotopo que se liga a um anticorpo anti-IL31 ou porção de ligação ao antígeno do mesmo se liga especificamente a uma região em uma proteína IL-31 de mamífero envolvida com a interação da proteína IL-31 com seu co- receptor. Em uma modalidade, a ligação do dito anticorpo à dita região é impactada por mutações em uma região de ligação ao epítopo 15H05 selecionada de: a) uma região entre cerca de 124 e 135 resíduos de aminoácido de uma sequência de IL-31 felina representada pela SEQ ID NO: 157 (Felina_IL31_tipo selvagem); b) uma região entre cerca de 124 e 135 resíduos de aminoácido de uma sequência de IL-31 canina representada pela SEQ ID NO: 155 (Canina_IL31); e c) uma região entre cerca de 118 e 129 resíduos de aminoácido de uma sequência de IL-31 equina representada pela SEQ ID NO: 165 (Equina_IL31). Em uma modalidade, o mimotopo para o uso nas composições da presente invenção se liga a um anticorpo anti-IL-31 ou porção de ligação ao antígeno do mesmo se liga especificamente à região de epítopo 15H05 anteriormente mencionada.
[0159]Em uma modalidade particular de uma composição de vacina de acordo com esta invenção, o mimotopo se liga a um anticorpo anti-IL-31 ou porção de ligação ao antígeno do mesmo que inclui pelo menos uma das seguintes combinações das sequências da região determinante de complementaridade (CDR): 1) anticorpo 15H05: CDR1 pesada variável (VH) de SYTIH (SEQ ID NO: 1), CDR2 VH de NINPTSGYTENNQRFKD (SEQ ID NO: 2), CDR3 VH de WGFKYDGEWSFDV (SEQ ID NO: 3), CDR1 leve variável (VL) de RASQGISIWLS (SEQ ID NO: 4), CDR2 VL de KASNLHI (SEQ ID NO: 5) e CDR3 VL de LQSQTYPLT (SEQ ID NO: 6); 2) anticorpo ZIL1: CDR1 pesada variável (VH) de SYGMS (SEQ ID NO: 13), CDR2 VH de HINSGGSSTYYADAVKG (SEQ ID NO: 14), CDR3 VH de VYTTLAAFWTDNFDY (SEQ ID NO: 15), CDR1 leve variável (VL) de SGSTNNIGILAAT (SEQ ID NO: 16), CDR2 VL de SDGNRPS (SEQ ID NO: 17 e CDR3 VL de QSFDTTLDAYV (SEQ ID NO: 18); 3) anticorpo ZIL8: CDR1 VH de DYAMS (SEQ ID NO: 19), CDR2 VH de GIDSVGSGTSYADAVKG (SEQ ID NO: 20), CDR3 VH de GFPGSFEH (SEQ ID NO: 21), CDR1 VL de TGSSSNIGSGYVG (SEQ ID NO: 22), CDR2 VL de YNSDRPS (SEQ ID NO: 23), CDR3 VL de SVYDRTFNAV (SEQ ID NO: 24); 4) anticorpo ZIL9: CDR1 VH de SYDMT (SEQ ID NO: 25), CDR2 VH de DVNSGGTGTAYAVAVKG (SEQ ID NO: 26), CDR3 VH de LGVRDGLSV (SEQ ID NO: 27), CDR1 VL de SGESLNEYYTQ (SEQ ID NO: 28), CDR2 VL de RDTERPS (SEQ ID NO: 29), CDR3 VL de ESAVDTGTLV (SEQ ID NO: 30); 5) anticorpo ZIL11: CDR1 VH de TYVMN (SEQ ID NO: 31), CDR2 VH de SINGGGSSPTYADAVRG (SEQ ID NO: 32), CDR3 VH de SMVGPFDY (SEQ ID NO:
33), CDR1 VL de SGESLSNYYAQ (SEQ ID NO: 34), CDR2 VL de KDTERPS (SEQ ID NO: 35), CDR3 VL de ESAVSSDTIV (SEQ ID NO: 36); 6) anticorpo ZIL69: CDR1 VH de SYAMK (SEQ ID NO: 37), CDR2 VH de TINNDGTRTGYADAVRG (SEQ ID NO: 38), CDR3 VH de GNAESGCTGDHCPPY (SEQ ID NO: 39), CDR1 VL de SGESLNKYYAQ (SEQ ID NO: 40), CDR2 VL de KDTERPS (SEQ ID NO: 41), CDR3 VL de ESAVSSETNV (SEQ ID NO: 42); 7) anticorpo ZIL94: CDR1 VH de TYFMS (SEQ ID NO: 43), CDR2 VH de LISSDGSGTYYADAVKG (SEQ ID NO: 44), CDR3 VH de FWRAFND (SEQ ID NO: 45), CDR1 VL de GLNSGSVSTSNYPG (SEQ ID NO: 46), CDR2 VL de DTGSRPS (SEQ ID NO: 47), CDR3 VL de SLYTDSDILV (SEQ ID NO: 48); 8) anticorpo ZIL154: CDR1 VH de DRGMS (SEQ ID NO: 49), CDR2 VH de YIRYDGSRTDYADAVEG (SEQ ID NO: 50), CDR3 VH de WDGSSFDY (SEQ ID NO: 51), CDR1 VL de KASQSLLHSDGNTYLD (SEQ ID NO: 52), CDR2 VL de KVSNRDP (SEQ ID NO: 53), CDR3 VL de MQAIHFPLT (SEQ ID NO: 54); 9) anticorpo ZIL159: CDR1 VH de SYVMT (SEQ ID NO: 55), CDR2 VH de GINSEGSRTAYADAVKG (SEQ ID NO: 56), CDR3 VH de GDIVATGTSY (SEQ ID NO: 57), CDR1 VL de SGETLNRFYTQ (SEQ ID NO: 58), CDR2 VL de KDTERPS (SEQ ID NO: 59), CDR3 VL de KSAVSIDVGV (SEQ ID NO: 60); 10) anticorpo ZIL171: CDR1 VH de TYVMN (SEQ ID NO: 61), CDR2 VH de SINGGGSSPTYADAVRG (SEQ ID NO: 62), CDR3 VH de SMVGPFDY (SEQ ID NO: 63), CDR1 VL de SGKSLSYYYAQ (SEQ ID NO: 64), CDR2 VL de KDTERPS (SEQ ID NO: 65), CDR3 VL de ESAVSSDTIV (SEQ ID NO: 66); ou 11) uma variante de 1) a 10) que se difere do respectivo anticorpo precursor 15H05, ZIL1, ZIL8, ZIL9, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159 ou ZIL171 pela adição, deleção e/ou substituição de um ou mais resíduos de aminoácido em pelo menos uma de CDR1, CDR2 ou CDR3 VH ou VL.
[0160]Em uma modalidade, o mimotopo de IL-31 usado na composição de vacina se liga a um anticorpo que se liga especificamente à IL-31 felina, em que o anticorpo se liga a uma região entre cerca de 125 e 134 resíduos de aminoácido de uma sequência de IL-31 felina representada pela SEQ ID NO: 157 (Felina_IL31_tipo selvagem). Em algumas modalidades, esse anticorpo inclui uma cadeia VL compreendendo a Estrutura 2 (FW2) com as alterações selecionadas das seguintes: uma Asparagina no lugar de Lisina na posição 42, uma Isoleucina no lugar de Valina na posição 43, uma Valina no lugar de Leucina na posição 46, uma Asparagina no lugar de Lisina na posição 49 e combinações das mesmas, em que as posições são em referência à numeração da SEQ ID NO: 127 (FEL_15H05_VL1).
[0161]Em algumas modalidades, o mimotopo se liga a um anticorpo caracterizado pelo fato de que: 1) anticorpo ZIL1 inclui pelo menos um dos seguintes: a) uma cadeia leve variável compreendendo CAN-ZIL1_VL:
QSVLTQPTSVSGSLGQRVTISCSGSTNNIGILAATWYQQLPGKAPKVLVYS
DGNRPSGVPDRFSGSKSGNSATLTITGLQAEDEADYYCQSFDTTLDAYVFGSGTQL TVL (SEQ ID NO: 77), e b) uma cadeia pesada variável compreendendo CAN-ZIL1_VH:
EVQLVESGGDLVKPGGSLRLSCVASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLQWVA
HINSGGSSTYYADAVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVEVYTTLAAF WTDNFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 75); 2) anticorpo ZIL8 inclui pelo menos um dos seguintes: a) uma cadeia leve variável compreendendo CAN-ZIL8_VL:
QSVLTQPASVSGSLGQKVTISCTGSSSNIGSGYVGWYQQLPGTGPRTLIYY
NSDRPSGVPDRFSGSRSGTTATLTISGLQAEDEADYYCSVYDRTFNAVFGGGT (SEQ ID NO: 81), e b) uma cadeia pesada variável compreendendo CAN-ZIL8_VH:
EVQLVESGGDLVKPAGSLRLSCVASGFTFSDYAMSWVRQAPGRGLQWVA
GIDSVGSGTSYADAVKGRFTISRDDAKNTLYLQMFNLRAEDTAIYYCASGFPGSFEH WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 79); 3) anticorpo ZIL9 inclui pelo menos um dos seguintes: a) uma cadeia leve variável compreendendo CAN-ZIL9_VL:
SSVLTQPPSVSVSLGQTATISCSGESLNEYYTQWFQQKAGQAPVLVIYRDTERPSGI PDRFSGSSSGNTHTLTISGARAEDEADYYCESAVDTGTLVFGGGTHLAVL (SEQ ID NO: 85), e b) uma cadeia pesada variável compreendendo CAN-ZIL9_VH:
EVQLVESGGDLVKPPGSLRLSCVASGFTFSSYDMTWVRQAPGKGLQWVA
DVNSGGTGTAYAVAVKGRFTISRDNAKKTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLGVRDGL SVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 83); 4) anticorpo ZIL11 inclui pelo menos um dos seguintes: a) uma cadeia leve variável compreendendo CAN-ZIL11_VL:
SSVLTQPPSVSVSLGQTATISCSGESLSNYYAQWFQQKAGQAPVLVIYKDTERPSGI PDRFSGSSSGNTHTLTISGARAEDEADYYCESAVSSDTIVFGGGT (SEQ ID NO: 89), e b) uma cadeia pesada variável compreendendo CAN-ZIL11_VH:
EVQLVESGGDLVKPAGSLRLSCVASGFTFRTYVMNWVRQAPGKGLQWVASINGG
GSSPTYADAVRGRFTVSRDNAQNSLFLQMNSLRAEDTAVYFCVVSMVGPFDYWG QGTLVTVSS (SEQ ID NO: 87); 5) anticorpo ZIL69 inclui pelo menos um dos seguintes: a) uma cadeia leve variável compreendendo CAN-ZIL69_VL:
SSVLTQPPSVSVSLGQTATISCSGESLNKYYAQWFQQKAGQAPVLVIYKDTERPSGI PDRFSGSSAGNTHTLTISGARAEDEADYYCESAVSSETNVFGSGTQLTVL (SEQ ID NO: 93), e b) uma cadeia pesada variável compreendendo CAN-ZIL69_VH:
EVQLVESGGDLVKPAGSLRLSCVASGFTFSSYAMKWVRQAPGKGLQWVATINNDG
TRTGYADAVRGRFTISKDNAKNTLYLQMDSLRADDTAVYYCTKGNAESGCTGDHC PPYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 91); 6) anticorpo ZIL94 inclui pelo menos um dos seguintes: a) uma cadeia leve variável compreendendo CAN-ZIL94_VL:
QTVVIQEPSLSVSPGGTVTLTCGLNSGSVSTSNYPGWYQQTRGRTPRTIIYDTGSR
PSGVPNRFSGSISGNKAALTITGAQPEDEADYYCSLYTDSDILVFGGGTHLTVL (SEQ ID NO: 97), e b) uma cadeia pesada variável compreendendo CAN-ZIL94_VH:
EVQLVDSGGDLVKPGGSLRLSCVASGFTFSTYFMSWVRQAPGRGLQWVALISSDG
SGTYYADAVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAIFWRAFNDWGQGT LVTVSS (SEQ ID NO: 95); 7) anticorpo ZIL154 inclui pelo menos um dos seguintes: a) uma cadeia leve variável compreendendo CAN-ZIL154_VL:
DIVVTQTPLSLSVSPGETASFSCKASQSLLHSDGNTYLDWFRQKPGQSPQRLIYKV
SNRDPGVPDRFSGSGSGTDFTLRISGVEADDAGLYYCMQAIHFPLTFGAGTKVELK (SEQ ID NO: 101), e b) uma cadeia pesada variável compreendendo CAN-ZIL154_VH:
EVHLVESGGDLVKPWGSLRLSCVASGFTFSDRGMSWVRQSPGKGLQWVAYIRYD
GSRTDYADAVEGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWDGSSFDYWG QGTLVTVSS (SEQ ID NO: 99); 8) anticorpo ZIL159 inclui pelo menos um dos seguintes: a) uma cadeia leve variável compreendendo CAN-ZIL159_VL:
SNVLTQPPSVSVSLGQTATISCSGETLNRFYTQWFQQKAGQAPVLVIYKDTERPSGI PDRFSGSSSGNIHTLTISGARAEDEAAYYCKSAVSIDVGVFGGGTHLTVF (SEQ ID NO: 105), e b) uma cadeia pesada variável compreendendo CAN-ZIL159_VH:
EVQLVESGGDLVKPAGSLRLSCVASGFTFSSYVMTWVRQAPGKGLQWVAGINSEG
SRTAYADAVKGRFTISRDNAKNTLYLQIDSLRAEDTAIYYCATGDIVATGTSYWGQG TLVTVSS (SEQ ID NO: 103); e 9) anticorpo ZIL171 inclui pelo menos um dos seguintes: a) uma cadeia leve variável compreendendo CAN-ZIL171_VL:
SSVLTQPPSVSVSLGQTATISCSGKSLSYYYAQWFQQKAGQAPVLVIYKDTERPSGI PDRFSGSSSGNTHTLTISGARAEDEADYYCESAVSSDTIVFGGGTHLTVL (SEQ ID NO: 109), e b) uma cadeia pesada variável compreendendo CAN-ZIL171_VH:
EVQLVESGGDLVKPAGSLRLSCVASGFTFRTYVMNWVRQAPGKGLQWVASINGG
GSSPTYADAVRGRFTVSRDNAQNSLFLQMNSLRAEDTAIYFCVVSMVGPFDYWGH GTLVTVSS (SEQ ID NO: 107).
[0162]Uma célula hospedeira pode ser usada para produzir um anticorpo descrito acima. Esses anticorpos podem ser usados nos procedimentos de diagnóstico descritos como parte desta invenção, embora os procedimentos de diagnóstico não sejam limitados a estes anticorpos particulares.
[0163]As sequências nucleotídicas que codificam as regiões variáveis das cadeias leves e pesadas do anticorpo anti-IL-31 podem ser utilizadas para produzir os anticorpos anti-IL-31 aqui descritos. Essas sequências nucleotídicas incluem, mas não são limitadas a qualquer sequência nucleotídica que codifica a sequência de aminoácidos dos anticorpos 15H05, ZIL1, ZIL8, ZIL9, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159 ou ZIL171 ou polipeptídeos ou peptídeos específicos de IL-31 dos mesmos.
Além disso, em uma modalidade, as sequências nucleotídicas que codificam os mimotopos de IL-31 podem ser usadas para produzir recombinantemente os mimotopos sozinhos ou como parte de uma proteína de fusão junto com o polipeptídeo portador. Alternativamente ou além disso, os mimotopos podem ser quimicamente sintetizados.
[0164]Em algumas modalidades, um ácido nucleico isolado pode ser utilizado para produzir um anticorpo útil (tal como aquele usado em um dos métodos de diagnóstico aqui descritos), em que a sequência de ácido nucleico codifica pelo menos uma das seguintes combinações das sequências da região determinante de complementaridade (CDR) pesada variável:
1) 15H05: CDR1 pesada variável (VH) de SYTIH (SEQ ID NO: 1), CDR2 VH de NINPTSGYTENNQRFKD (SEQ ID NO: 2) e CDR3 VH de WGFKYDGEWSFDV
(SEQ ID NO: 3);
2) ZIL1: CDR1 VH de SYGMS (SEQ ID NO: 13), CDR2 VH de
HINSGGSSTYYADAVKG (SEQ ID NO: 14) e CDR3 VH de VYTTLAAFWTDNFDY
(SEQ ID NO: 15);
3) ZIL8: CDR1 VH de DYAMS (SEQ ID NO: 19), CDR2 VH de
GIDSVGSGTSYADAVKG (SEQ ID NO: 20) e CDR3 VH de GFPGSFEH (SEQ ID NO:
21);
4) ZIL9: CDR1 VH de SYDMT (SEQ ID NO: 25), CDR2 VH de
DVNSGGTGTAYAVAVKG (SEQ ID NO: 26) e CDR3 VH de LGVRDGLSV (SEQ ID
NO: 27);
5) ZIL11: CDR1 VH de TYVMN (SEQ ID NO: 31), CDR2 VH de
SINGGGSSPTYADAVRG (SEQ ID NO: 32) e CDR3 VH de SMVGPFDY (SEQ ID NO:
33);
6) ZIL69: CDR1 VH de SYAMK (SEQ ID NO: 37), CDR2 VH de
TINNDGTRTGYADAVRG (SEQ ID NO: 38) e CDR3 VH de GNAESGCTGDHCPPY
(SEQ ID NO: 39);
7) ZIL94: CDR1 VH de TYFMS (SEQ ID NO: 43), CDR2 VH de
LISSDGSGTYYADAVKG (SEQ ID NO: 44) e CDR3 VH de FWRAFND (SEQ ID NO:
45)
8) ZIL154: CDR1 VH de DRGMS (SEQ ID NO: 49), CDR2 VH de
YIRYDGSRTDYADAVEG (SEQ ID NO: 50) e CDR3 VH de WDGSSFDY (SEQ ID NO:
51); 9) ZIL159: CDR1 VH de SYVMT (SEQ ID NO: 55), CDR2 VH de GINSEGSRTAYADAVKG (SEQ ID NO: 56) e CDR3 VH de GDIVATGTSY (SEQ ID NO: 57); 10) ZIL171: CDR1 VH de TYVMN (SEQ ID NO: 61), CDR2 VH de SINGGGSSPTYADAVRG (SEQ ID NO: 62) e CDR3 VH de SMVGPFDY (SEQ ID NO: 63), ou 11) uma variante de 1) a 10) que se difere das CDRs do respectivo anticorpo precursor 15H05, ZIL1, ZIL8, ZIL9, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159 ou ZIL171 pela adição, deleção e/ou substituição de um ou mais resíduos de aminoácido em pelo menos uma de VH CDR1, CDR2 ou CDR3.
[0165]Em outra modalidade, o ácido nucleico isolado compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos uma das seguintes combinações de sequências da região determinante de complementaridade (CDR) leve variável: 1) 15H05: CDR1 leve variável (VL) de RASQGISIWLS (SEQ ID NO: 4), CDR2 VL de KASNLHI (SEQ ID NO: 5) e CDR3 VL de LQSQTYPLT (SEQ ID NO: 6); 2) ZIL1: CDR1 VL de SGSTNNIGILAAT (SEQ ID NO: 16), CDR2 VL de SDGNRPS (SEQ ID NO: 17 e CDR3 VL de QSFDTTLDAYV (SEQ ID NO: 18); 3) ZIL8: CDR1 VL de TGSSSNIGSGYVG (SEQ ID NO: 22), CDR2 VL de YNSDRPS (SEQ ID NO: 23) e CDR3 VL de SVYDRTFNAV (SEQ ID NO: 24); 4) ZIL9: CDR1 VL de SGESLNEYYTQ (SEQ ID NO: 28), CDR2 VL de RDTERPS (SEQ ID NO: 29) e CDR3 VL de ESAVDTGTLV (SEQ ID NO: 30); 5) ZIL11: CDR1 VL de SGESLSNYYAQ (SEQ ID NO: 34), CDR2 VL de KDTERPS (SEQ ID NO: 35) e CDR3 VL de ESAVSSDTIV (SEQ ID NO: 36); 6) ZIL69: CDR1 VL de SGESLNKYYAQ (SEQ ID NO: 40), CDR2 VL de KDTERPS (SEQ ID NO: 41) e CDR3 VL de ESAVSSETNV (SEQ ID NO: 42); 7) ZIL94: CDR1 VL de GLNSGSVSTSNYPG (SEQ ID NO: 46), CDR2 VL de
DTGSRPS (SEQ ID NO: 47) e CDR3 VL de SLYTDSDILV (SEQ ID NO: 48); 8) ZIL154: CDR1 VL de KASQSLLHSDGNTYLD (SEQ ID NO: 52), CDR2 VL de KVSNRDP (SEQ ID NO: 53) e CDR3 VL de MQAIHFPLT (SEQ ID NO: 54); 9) ZIL159: CDR1 VL de SGETLNRFYTQ (SEQ ID NO: 58), CDR2 VL de KDTERPS (SEQ ID NO: 59) e CDR3 VL de KSAVSIDVGV (SEQ ID NO: 60); 10) ZIL171: CDR1 VL de SGKSLSYYYAQ (SEQ ID NO: 64), CDR2 VL de KDTERPS (SEQ ID NO: 65) e CDR3 VL de ESAVSSDTIV (SEQ ID NO: 66); ou 11) uma variante de 1) a 10) que se difere das CDRs do respectivo anticorpo precursor 15H05, ZIL1, ZIL8, ZIL9, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159 ou ZIL171 pela adição, deleção e/ou substituição de um ou mais resíduos de aminoácido em pelo menos uma de CDR1, CDR2 ou CDR3 VL.
[0166]Ainda em uma outra modalidade, o ácido nucleico isolado usado na fabricação de um anticorpo aqui descrito compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica as sequências da região determinante de complementaridade (CDR) leve variável acima descritas, bem como as sequências da CDR variável pesada acima descritas do respectivo anticorpo precursor 15H05, ZIL1, ZIL8, ZIL9, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159 ou ZIL171 ou variantes dos mesmos.
[0167]Um vetor incluindo pelo menos um dos ácidos nucleicos descritos acima pode ser usado na fabricação desses anticorpos. Como será descrito em mais detalhes abaixo, a sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos uma das combinações acima descritas de sequências da região determinante de complementaridade (CDR) pesada variável pode estar contida no mesmo vetor junto com a sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos uma das combinações acima descritas de sequências de CDR leve variável. Alternativamente, a sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos uma das combinações acima descritas de sequências de CDR leve variável e a sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos uma das combinações acima descritas de sequências da CDR variável pesada pode, cada uma, estarem contidas em vetores separados.
[0168]Como o código genético é degenerado, mais de um códon pode ser usado para codificar um aminoácido particular. Usando o código genético, uma ou mais sequências nucleotídicas diferentes podem ser identificadas, cada uma das quais de ser capaz de codificar o aminoácido. A probabilidade de que um oligonucleotídeo particular constituirá, de fato, a sequência real de codificação de XXX pode ser estimada considerando-se as relações anormais de emparelhamento de bases e a frequência com que um códon particular é realmente usado (para codificar um aminoácido particular) em células eucarióticas ou procarióticas que expressam um anticorpo anti-IL-31 ou porção específica de IL-31 do mesmo. Essas “regras de uso de códon” são divulgadas por Lathe, et al., 183 J. Molec. Biol. 1-12 (1985). Usando as “regras de uso de códon” de Lathe, uma única sequência nucleotídica ou um conjunto de sequências nucleotídicas que contém uma sequência nucleotídica teórica “mais provável” capaz de codificar sequências anti-IL-31 pode ser identificada. Também é intencionado que as regiões de codificação de anticorpo também possam ser fornecidas alterando-se genes de anticorpos existentes usando técnicas padrão de biologia molecular que resultam em variantes (agonistas) dos anticorpos e peptídeos aqui descritos. Essas variantes incluem, mas não são limitadas a deleções, adições e substituições na sequência de aminoácidos dos anticorpos anti-IL-31 ou polipeptídeos ou peptídeos específicos de IL-31 (tais como porções ou fragmentos de anticorpo).
Além disso, as variantes dos mimotopos de peptídeos aqui descritas podem ser feitas alterando-se a sequência nucleotídica que codifica o mimotopo do peptídeo precursor.
[0169]Por exemplo, uma classe de substituições são as substituições conservadoras de aminoácido. Essas substituições são aquelas que substituem um dado aminoácido em um anticorpo anti-IL-31 ou polipeptídeo ou peptídeo específico de IL-31 por outro aminoácido de características semelhantes. Do mesmo modo, os mimotopos de IL-31 que se ligam a esse anticorpo ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo podem incluir substituições conservadoras ou outros tipos de substituições de aminoácidos. Tipicamente vistas como substituições conservadoras são as substituições, um por outro, entre os aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu e Ile; troca dos resíduos hidroxila Ser e Thr, troca dos resíduos ácidos Asp e Glu, substituição entre os resíduos de amida Asn e Gln, troca dos resíduos básicos Lys e Arg, substituições entre os resíduos aromáticos Phe, Tyr e semelhantes. A orientação sobre quais alterações de aminoácidos são prováveis de serem fenotipicamente silenciosas são encontradas em Bowie et al., 247 Science 1306-10 (1990).
[0170]Os anticorpos anti-IL-31 variantes ou agonistas ou polipeptídeos ou peptídeos específicos de IL-31 podem ser completamente funcionais ou podem carecer de função em uma ou mais atividades. Do mesmo modo, mimotopos de IL-31 variantes ou agonistas podem ser completamente funcionais ou podem carecer de função em uma ou mais atividades. Variantes completamente funcionais tipicamente contêm apenas variações conservadoras ou variações em resíduos não críticos ou em regiões não críticas. Variantes funcionais também podem conter substituição de aminoácidos semelhantes que resulta em nenhuma mudança ou uma mudança insignificante na função. Alternativamente, essas substituições podem afetar positivamente ou negativamente a função em algum grau. Variantes não funcionais tipicamente contêm uma ou mais substituições não conservadoras de aminoácido, deleções, inserções, inversões ou truncamentos ou uma substituição, inserção, inversão ou deleção em um resíduo crítico ou região crítica.
[0171]Os aminoácidos que são essenciais para a função podem ser identificados por métodos conhecidos na técnica, tais como mutagênese dirigida de sítio ou mutagênese de varredura de alanina. Cunningham et al., 244 Science 1081- 85 (1989). O último procedimento introduz mutações únicas de alanina em cada resíduo na molécula. As moléculas mutantes resultantes são então testadas para atividade biológica tal como ligação ao epítopo ou atividade ADCC in vitro. Os sítios que são críticos para a ligação ligante-receptor também podem ser determinados por análise estrutural tal como cristalografia, ressonância magnética nuclear ou marcação de fotoafinidade. Smith et al., 224 J. Mol. Biol. 899-904 (1992); de Vos et al., 255 Science 306-12 (1992).
[0172]Além disso, os polipeptídeos frequentemente contêm aminoácidos diferentes dos vinte aminoácidos “que ocorre naturalmente”. Além disso, muitos aminoácidos, incluindo os aminoácidos terminais, podem ser modificados por processos naturais, tais como processamento e outras modificações pós-traducionais ou por técnicas de modificação química bem conhecidas na técnica. As modificações conhecidas incluem, mas não são limitadas a acetilação, acilação, ribosilação de ADP, amidação, fixação covalente de flavina, fixação covalente de uma porção heme, fixação covalente de um nucleotídeo ou derivado de nucleotídeo, fixação covalente de um lipídio ou derivado de lipídio, fixação covalente de fosfotidilinositol, reticular, ciclização, formação de ligação dissulfeto, desmetilação, formação de reticulações covalentes, formação de cistina, formação de piroglutamato, formilação, carboxilação gama, glicosilação, formação de âncora de GPI, hidroxilação, iodação, metilação, miristoilação, oxidação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfatização, adição mediada por RNA de transferência de aminoácidos para proteínas tal como arginilação e ubiquitinação.
[0173]Essas modificações são bem conhecidas pelos especialistas na técnica e foram descritas em grande detalhe na literatura científica. Várias modificações particularmente comuns, glicosilação, fixação de lipídio, sulfatização, carboxilação gama de resíduos de ácido glutâmico, hidroxilação e ribosilação de ADP, por exemplo, são descritas na maioria dos textos básicos, tais como Proteins--Structure and Molecular Properties (2a ed., T. E. Creighton, W.H. Freeman & Co., NY, 1993). Muitas revisões detalhadas estão disponíveis sobre este assunto, tais como por Wold, Posttranslational Covalent Modification of proteins, 1-12 (Johnson, ed., Academic
Press, NY, 1983); Seifter et al. 182 Meth. Enzymol. 626-46 (1990); e Rattan et al. 663 Ann. NY Acad. Sci. 48-62 (1992).
[0174]Consequentemente, os anticorpos, polipeptídeos e peptídeos específicos de IL-31 aqui descritos, bem como os mimotopos de peptídeos da IL-31 aqui descritos também abrangem derivados ou análogos em que um resíduo de aminoácido substituído não é um codificado pelo código genético.
[0175]Similarmente, as adições e substituições na sequência de aminoácidos bem como as variações e modificações há pouco descritas podem ser igualmente aplicáveis à sequência de aminoácidos do antígeno IL-31 e/ou epítopo ou peptídeos do mesmo e são, portanto, abrangidos pela presente invenção.
Derivados de Anticorpo e Mimotopos
[0176]Estão incluídos dentro do escopo desta invenção derivados de anticorpo e mimotopo. Um “derivado” de um anticorpo ou mimotopo contém porções químicas adicionais que normalmente não fazem parte da proteína ou peptídeo.
Modificações covalentes da proteína ou peptídeo estão incluídas dentro do escopo desta invenção. Essas modificações podem ser introduzidas na molécula reagindo-se resíduos de aminoácido alvejados do anticorpo ou mimotopo com um agente de derivatização orgânico que é capaz de reagir com as cadeias laterais ou resíduos terminais selecionados. Por exemplo, a derivatização com agentes bifuncionais, bem conhecidos na técnica, é útil para reticular o anticorpo ou fragmento ou mimotopo em uma matriz de suporte insolúvel em água ou em outros portadores macromoleculares.
[0177]Os derivados também incluem anticorpos monoclonais ou mimotopos radioativamente marcados. Por exemplo, com iodo radioativo (125I,131I), carbono (14C), enxofre (35S), índio (111In), trítio (3H) ou semelhantes; conjugados de anticorpos monoclonais com biotina ou avidina, com enzimas, tais como peroxidase de raiz forte, fosfatase alcalina, beta-D-galactosidase, glicose oxidase, glucoamilase, anidrase de ácido carboxílico, acetilcolina esterase, lisozima, malato desidrogenase ou glicose 6-
fosfato desidrogenase; e também conjugados de anticorpos monoclonais com agentes bioluminescentes (tais como luciferase), agentes quimioluminescentes (tais como ésteres de acridina) ou agentes fluorescentes (tais como fcobiliproteínas). Do mesmo modo, os mimotopos podem ser marcado em algumas modalidades.
[0178]Outro anticorpo bifuncional derivado é um anticorpo biespecifico, gerado pela combinação de partes de dois anticorpos separados que reconhecem dois grupos antigênicos diferentes. Isso pode ser obtido por reticulação ou técnicas recombinantes.
[0179]Adicionalmente, as porções podem ser adicionadas ao anticorpo ou uma porção do mesmo ou aos mimotopos de IL-31 aqui descritos para aumentar meia- vida in vivo (e.g., alongando-se o tempo para eliminação da corrente sanguínea.
Essas técnicas incluem, por exemplo, adicionar porções de PEG (também denominado PEGuilação) e são bem conhecidas na técnica. Ver Publicação de Pedido de Patente U.S. No 20030031671.
Expressão Recombinante de Anticorpos, Mimotopos e Polipeptídeo Portadores
[0180]Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos que codificam um anticorpo monoclonal ou uma proteína de fusão do sujeito contendo o mimotopo e o polipeptídeo portador são introduzidos diretamente em uma célula hospedeira, e a célula é incubada sob condições suficientes para induzir a expressão do anticorpo codificado ou proteína de fusão. Depois que os ácidos nucleicos do sujeito foram introduzidos em uma célula, a célula é tipicamente incubada, normalmente a 37 °C, às vezes sob seleção, por um período de cerca de 1 a 24 horas de modo a permitir a expressão do anticorpo ou proteína de fusão carregando o mimotopo do peptídeo e polipeptídeo portador. Em uma modalidade, a proteína de fusão ou anticorpo é secretado no sobrenadante do meio em que a célula está crescendo.
[0181]Tradicionalmente, os anticorpos monoclonais foram produzidos como moléculas nativas nas linhagens do hibridoma murino. Além dessa tecnologia, a presente invenção fornece expressão de DNA recombinante de anticorpos monoclonais. Isso permite a produção de anticorpos caninizados, felinizados, equinizados, humanizados, completamente caninos, completamente felinos, completamente equinos e completamente humanos, bem como um espectro de anticorpo derivados e proteínas de fusão em uma espécie hospedeira de escolha.
[0182]Uma sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos um anticorpo anti-IL-31, porção ou polipeptídeo específico de IL-31 do mesmo ou uma sequência de ácido nucleico que codifica como parte do mesma pelo menos um mimotopo de peptídeo de IL-31 que se liga a esse anticorpo ou porção do mesmo pode ser recombinada com a do vetor de acordo com técnicas convencionais, incluindo terminais de extremidades cegas ou extremidades escalonadas para ligação, digestão com enzima de restrição para fornecer terminais apropriados, preenchimento de extremidades coesivas como apropriado, tratamento com fosfatase alcalina para evitar junção indesejável e ligação com ligases apropriadas. Técnicas para essas manipulações que são divulgadas, e.g., por Maniatis et al., MOLECULAR CLONING, LAB. MANUAL, (Cold Spring Harbor Lab. Press, NY, 1982 e 1989) e Ausubel et al.
1993 supra, podem ser usadas para construir sequências de ácidos nucleicos que codificam uma molécula de anticorpo monoclonal ou região de ligação ao antígeno do mesmo ou mimotopo de peptídeo de IL-31.
[0183]Uma molécula de ácido nucleico, tal como DNA, é considerada “capaz de expressar” um polipeptídeo se ela contiver as sequências nucleotídicas que contêm informação reguladora transcricional e traducional e se essas sequências forem “ligadas de maneira operável” às sequências nucleotídicas que codificam o polipeptídeo. Uma ligação operável é uma ligação em que as sequências de DNA reguladoras e a sequência de DNA que se busca expressar estão conectadas de modo a permitir a expressão do gene como peptídeos anti-IL-31 ou porções de anticorpos ou como proteínas de fusão carregando mimotopos de IL-31 em quantidades recuperáveis. A natureza precisa das regiões reguladoras necessária para a expressão do gene pode variar de organismo para organismo, como é bem conhecido na técnica análoga. Ver, e.g., Sambrook et al., 2001 supra; Ausubel et al., 1993 supra.
[0184]A presente invenção consequentemente abrange a expressão de um anticorpo anti-IL-31 ou polipeptídeo específico de IL-31 ou peptídeo ou proteína de fusão incluindo um mimotopo de IL-31, em células procarióticas ou eucarióticas.
Hospedeiros adequados incluem hospedeiros bacterianos ou eucarióticos incluindo bactéria, levedura, insetos, fungos, pássaros e células de mamíferos in vivo ou in situ ou células hospedeiras originadas de mamífero, inseto, pássaros ou levedura. A célula ou tecido de mamíferos pode ser originada de humano, primata, hamster, coelho, roedor, vaca, porco, ovelha, cavalo, cabra, cão ou gato, mas qualquer outra célula de mamífero pode ser usada.
[0185]Em uma modalidade, a sequência nucleotídica introduzida será incorporada em um vetor plasmídeo ou viral capaz de replicação autônoma no hospedeiro receptor. Qualquer um de uma ampla variedade de vetores pode ser utilizado para este propósito. Ver, e.g., Ausubel et al., 1993 supra. Fatores de importância na seleção de um vetor plasmídeo ou viral particular incluem: a facilidade com que as células receptoras que contêm o vetor podem ser reconhecidas e selecionadas das células receptoras que não contêm o vetor; o número de cópias do vetor que são desejadas em um hospedeiro particular; e se é desejável ser capaz de “transportar” o vetor entre células hospedeiras de espécies diferentes.
[0186]Exemplos de vetores procarióticos conhecidos na técnica incluem plasmídeos tais como aqueles capazes de replicação em E. coli (tais como, por exemplo, pBR322, ColE1, pSC101, pACYC 184, .pi.VX). Esses plasmídeos são, por exemplo, divulgados por Maniatis et al., 1989 supra; Ausubel et al., 1993 supra. Os plasmídeos de Bacillus incluem pC194, pC221, pT127, etc. Esses plasmídeos são divulgados por Gryczan, em THE MOLEC. BIO. OF THE BACILLI 307-329 (Academic Press, NY, 1982). Os plasmídeos de Streptomyces adequados incluem pIJ101 (Kendall et al., 169 J. Bacteriol. 4177-83 (1987)) e bacteriófagos de Streptomyces tais como .phi.C31 (Chater et al., em SIXTH INT’L SYMPOSIUM IN ACTINOMYCETALES BIO. 45-54 (Akademiai Kaido, Budapeste, Hungria 1986). Os plasmídeos de Pseudomonas são revisados em John et al., 8 Rev. Infect. Dis. 693-704 (1986); Izaki, 33 Jpn. J. Bacteriol. 729-42 (1978); e Ausubel et al., 1993 supra.
[0187]Alternativamente, elementos de expressão gênica úteis para a expressão de cDNA que codificam anticorpos anti-IL-31 ou peptídeos ou proteínas de fusão como aqui descritos incluem, mas não são limitados a (a) promotores de transcrição viral e seus elementos realçadores, tais como o promotor inicial SV40 (Okayama et al., 3 Mol. Cell. Biol. 280 (1983)), LTR do vírus do sarcoma de Rous (Gorman et al., 79 Proc. Natl. Acad. Sci., USA 6777 (1982)) e LTR do vírus da leucemia murina Moloney (Grosschedl et al., 41 Cell 885 (1985)); (b) regiões de splice e sítios de poliadenilação tais como aqueles derivados da região tardia de SV40 (Okayarea et al., MCB, 3: 280 (1983) e (c) sítios de poliadenilação tais como em SV40 (Okayama et al., 1983, supra).
[0188]Os genes de cDNA da imunoglobulina podem ser expressados como descrito por Weidle et al., 51(1) Gene 21-29 (1987), usando como elementos de expressão o promotor inicial SV40 e seu realçador, as potenciadores do promotor da cadeia H da imunoglobulina de camundongo, splicing de mRNA de região tardia de SV40, sequência de intervenção S-globina de coelho, sítios de poliadenilação de imunoglobulina e S-globina de coelho e elementos de poliadenilação de SV40.
[0189]Para os genes de imunoglobulina compostos por parte de cDNA, parte de DNA genômico (Whittle et al., 1 Protein Engin. 499-505 (1987)), o promotor transcricional pode ser citomegalovírus humano, os potenciadores do promotor podem ser citomegalovírus e imunoglobulina de camundongo/humana e splicing de mRNA e as regiões de poliadenilação podem ser as sequências de imunoglobulina cromossômica nativa.
[0190]Em uma modalidade, para a expressão de genes de cDNA em células de roedor, o promotor transcricional é uma sequência LTR viral, os potenciadores do promotor transcricional são um ou ambos o realçador de cadeia pesada da imunoglobulina de camundongo e o realçador de LTR viral, a região de splice contém um íntron de mais de 31 bp, e as regiões de terminação de poliadenilação e transcrição são derivadas da sequência cromossômica nativa correspondente à cadeia de imunoglobulina sendo sintetizada. Em outras modalidades, as sequências de cDNA que codificam outras proteínas são combinadas com os elementos de expressão citados acima para obter a expressão das proteínas em células de mamíferos.
[0191]Cada gene fundido pode ser montado ou inserido em um vetor de expressão. As células receptoras capazes de expressar o produto do gene da cadeia de imunoglobulina quimérica são então transfectadas isoladamente com um peptídeo anti-IL-31 ou gene que codifica a cadeia H quimérica ou L quimérica ou são co- transfectadas com um gene da cadeia H quimérica e L quimérica. As células receptoras transfectadas são cultivadas sob condições que permitem a expressão dos genes incorporados e a cadeia de imunoglobulinas expressada ou anticorpos intactos ou fragmentos são recuperados da cultura.
[0192]Em uma modalidade, os genes fundidos que codificam o peptídeo anti- IL-31 ou cadeias H e L quiméricas ou porções das mesmas são montados em vetores de expressão separados que são então usados para co-transfectar uma célula receptora. Alternativamente, os genes fundidos que codificam as cadeias H e L quiméricas podem ser montados no mesmo vetor de expressão.
[0193]Para a transfecção dos vetores de expressão e a produção do anticorpo quimérico, a linhagem celular receptora pode ser uma célula de mieloma. As células de mieloma podem sintetizar, montar e secretar imunoglobulinas codificadas por genes de imunoglobulina transfectados e possuem o mecanismo para a glicosilação da imunoglobulina. As células de mieloma podem ser cultivadas em cultura ou na cavidade peritoneal de um camundongo, onde a imunoglobulina secretada pode ser obtida a partir do fluido ascítico. Outras células receptoras adequadas incluem células linfoides, tais como linfócitos B de origem humana ou não humana, células do hibridoma de origem humana ou não humana ou células de hetero-hibridoma interespécies.
[0194]O vetor de expressão carregando uma sequência nucleotídica que codifica as sequências de construto de anticorpo anti-IL-31 quimérico, caninizado, felinizado, equinizado, humanizado, completamente canino, completamente felino, completamente equino ou completamente humano ou um polipeptídeo ou peptídeo específico de IL-31 (e.g., porção de ligação ao antígeno dos anticorpos aqui descritos) ou um vetor de expressão carregando uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína de fusão como aqui descrito, pode ser introduzido em uma célula hospedeira apropriada por qualquer um de uma variedade de meios adequados, incluindo tais meios bioquímicos como transformação, transfecção, conjugação, fusão de protoplasto, precipitação de fosfato de cálcio e aplicação com policátions, tais como dietilaminoetil (DEAE) dextrano e tais meios mecânicos como eletroporação, microinjeção direta e bombardemento de microprojéteis. Johnston et al., 240 Science 1538-1541 (1988).
[0195]A levedura pode fornecer vantagens substanciais sobre as bactérias para a produção de cadeias H e L de imunoglobulina. As leveduras realizam modificações pós-traducional de peptídeos incluindo glicosilação. Agora existem várias estratégias de DNA recombinante que utilizam sequências promotoras fortes e plasmídeos com elevados números de cópias que podem ser usados para a produção das proteínas desejadas na levedura. A levedura reconhece sequências líderes de produto de genes de mamífero clonados e secreta sequências líderes contendo peptídeos (i.e., pré-peptídeos). Hitzman et al., 11a Int’l Conference on Yeast, Genetics & Molec. Biol. (Montpelier, França, 1982). Os sistemas de expressão de genes de levedura podem ser rotineiramente avaliados para os níveis de produção, secreção e a estabilidade de peptídeos anti-IL-31, anticorpo e anticorpos murinos e quiméricos, heteroquiméricos, caninizados, felinizados, equinizados, humanizados, completamente caninos, completamente felinos, completamente equinos ou completamente humanos montados, fragmentos e regiões dos mesmos. Qualquer um de uma série de sistemas de expressão de genes de levedura que incorporam promotor e elementos de terminação a partir de genes ativamente expressados que codificam enzimas glicolíticas produzidas em grandes quantidades quando as leveduras são cultivadas em meio rico em glicose pode ser utilizado. Genes glicolíticos conhecidos também podem fornecer sinais de controle de transcrição muito eficientes.
Por exemplo, os sinais de promotor e terminador do gene fosfoglicerato cinase (PGK) podem ser utilizados. Várias abordagens podem ser tomadas para avaliar plasmídeos de expressão ótima para a expressão de cDNAs de imunoglobulina clonados em levedura. Ver Vol. II DNA Cloning, 45-66, (Glover, ed.,) IRL Press, Oxford, UK 1985).
[0196]As cepas bacterianas também podem ser utilizadas como hospedeiros para a produção de moléculas de anticorpos ou peptídeos ou proteínas de fusão descritas por esta invenção. Os vetores de plasmídeo contendo sequências de replicon e controle que são derivados de espécie compatível com uma célula hospedeira são usados em relação a esses hospedeiros bacterianos. O vetor carrega um sítio de replicação, bem como genes específicos que são capazes de fornecer seleção fenotípica em células transformadas. Várias abordagens podem ser tomadas para avaliar os plasmídeos de expressão para a produção de anticorpos murinos, quiméricos, heteroquiméricos, caninizados, felinizados, equinizados, humanizados,
completamente caninos, completamente felinos, completamente equinos ou completamente humanos, fragmentos e regiões ou cadeias de anticorpos codificados pelo cDNAs de imunoglobulina clonados em bactéria (ver Glover, 1985 supra; Ausubel, 1993 supra; Sambrook, 2001 supra; Colligan et al., eds. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, NY, NY (1994-2001); Colligan et al., eds. Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY (1997-2001).
[0197]As células de mamíferos hospedeiros podem ser cultivadas in vitro ou in vivo. As células de mamíferos fornecem modificações pós-traducionais a moléculas de proteína de imunoglobulina incluindo remoção de peptídeo líder, dobramento e montagem de cadeias H e L, glicosilação das moléculas de anticorpos e secreção de proteína de anticorpo funcional.
[0198]As células de mamíferos que podem ser úteis como hospedeiros para a produção de proteínas de anticorpo, além das células de origem linfoide descritas acima, incluem células de origem de fibroblasto, tais como células Vero (ATCC CRL 81) ou CHO-K1 (ATCC CRL 61).
[0199]Muitos sistemas de vetor estão disponíveis para a expressão de genes clonados das cadeias H e L de peptídeos anti-IL-31 em células de mamíferos (ver Glover, 1985 supra). Diferentes abordagens podem ser seguidas para obter anticorpos H2L2 completos. É possível co-expressar cadeias H e L nas mesmas células para obter associação e ligação intracelular de cadeias H e L em anticorpos H2L2 tetraméricos completos e/ou peptídeos anti-IL-31. A co-expressão pode ocorrer usando o mesmo plasmídeo ou plasmídeos diferentes no mesmo hospedeiro. Genes para as cadeias H e L e/ou peptídeos anti-IL-31 podem ser colocados no mesmo plasmídeo, que é então transfectado em células, selecionando assim diretamente para células que expressam ambas as cadeias. Alternativamente, as células podem ser transfectadas primeiro com um plasmídeo que codifica uma cadeia, por exemplo, a cadeia L, seguido por transfecção da linhagem celular resultante com um plasmídeo da cadeia H contendo um segundo marcador selecionável. As linhagens celulares produzem peptídeos anti-IL-31 e/ou moléculas H2L2 por meio de qualquer das vias podem ser transfectadas com plasmídeos que codificam cópias adicionais de peptídeos, cadeias H, L ou H mais L em conjunto com marcadores selecionáveis adicionais para gerar as linhagens celulares com propriedades aumentadas, tais como maior produção de moléculas de anticorpos H2L2 montadas ou estabilidade aumentada das linhagens celulares transfectadas.
[0200]Para produção de longo prazo e alto rendimento de anticorpos recombinantes, a expressão estável pode ser usada. Por exemplo, as linhagens celulares, que expressam estavelmente a molécula de anticorpo podem ser manipuladas. Em vez de usar vetores de expressão que contêm origens virais de replicação, as células hospedeiras podem ser transformadas com cassetes de expressão de imunoglobulina e um marcador selecionável. Após a introdução do DNA estranho, as células manipuladas podem ser deixadas crescer por 1 a 2 dias em meio enriquecido, e depois são transferidas para um meio seletivo. O marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistência à seleção e permite que as células se integrem estavelmente ao plasmídeo em um cromossomo e cresçam para formar focos, que por sua vez, podem ser clonados e expandidos nas linhagens celulares. Essas linhagens celulares manipuladas podem ser particularmente úteis em triagem e avaliação de compostos/componentes que interagem diretamente ou indiretamente com a molécula de anticorpo.
[0201]Uma vez que um anticorpo foi produzido, pode ser purificado por qualquer método conhecido na técnica para purificação de uma molécula de imunoglobulina, por exemplo, por cromatografia (e.g., troca iônica, afinidade, particularmente afinidade para o antígeno específico depois da Proteína A, e cromatografia em coluna de dimensionamento), centrifugação, solubilidade diferencial ou por qualquer outra técnica padrão para purificação de proteínas. Em muitas modalidades, os anticorpos são secretados da célula em meio de cultura e colhidos do meio de cultura.
Aplicações Farmacêuticas
[0202]As composições de vacina da presente invenção podem ser usadas, por exemplo, no tratamento e/ou proteção contra transtornos mediados por IL-31, tais como condições pruríticas e/ou alérgicas em mamíferos, tais como cães, gatos, cavalos e humanos. As composições farmacêuticas desta invenção são úteis para administração parenteral, e.g., subcutânea, intramuscular ou intravenosa. Outros modos adequados de administração são aqui descritos.
[0203]As vacinas da presente invenção podem ser administradas como agentes terapêuticos individuais ou em combinação com outros agentes terapêuticos.
Elas podem ser administradas sozinhas, mas são geralmente administradas com um portador farmacêutico selecionado com base na via de administração escolhido e prática farmacêutica padrão.
[0204]A administração das composições de vacina aqui divulgadas pode ser realizada por quaisquer meios adequados, incluindo injeção parenteral (tais como injeção intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular), oralmente ou por administração tópica das vacinas em uma superfície das vias aéreas. A administração tópica em uma superfície das vias aéreas pode ser realizada por administração intranasal (e.g., pelo uso de conta-gotas, cotonete ou inalador). A administração tópica das vacinas em uma superfície das vias aéreas também pode ser realizada pela administração por inalação, tal como criando partículas respiráveis de uma formulação farmacêutica (incluindo partículas sólidas e líquidas) contendo as vacinas como uma suspensão em aerossol e depois fazendo com que o sujeito inale as partículas respiráveis. Os métodos e aparelhos para administrar partículas respiráveis de formulações farmacêuticas são bem conhecidos, e qualquer técnica convencional pode ser utilizada. A administração oral pode ser, por exemplo, na forma de uma formulação líquida ou sólida ingerível.
[0205]Em algumas modalidades desejadas, as vacinas são administradas por injeção parenteral. Para a administração parenteral, as vacinas podem ser formuladas como uma solução, suspensão, emulsão ou pó liofilizado em associação com um veículo parenteral farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, o veículo pode ser uma solução da combinação do mimotopo e o polipeptídeo portador (e.g., mimotopo conjugado) ou um coquetel dos mesmos dissolvidos em um portador aceitável, tal como um portador aquoso, tais veículos são água, solução salina, solução de Ringer, solução de dextrose, solução de trealose ou sacarose ou albumina de soro a 5 %, solução salina a 0,4 %, glicina a 0,3 % e semelhantes. Lipossomas e veículos não aquosos, tais como óleos fixos também podem ser usados. Essas soluções são estéreis e geralmente livres de matéria particulada. Essas composições podem ser esterilizada por técnicas de esterilização convencionais bem conhecidas. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis conforme necessário para aproximar as condições fisiológicas, tais como ajuste de pH e agentes tamponantes, agentes de ajuste de toxicidade e semelhantes, por exemplo acetato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, lactato de sódio, etc. Além disso, como aqui descrito, as composições de vacina desta invenção incluem um adjuvante ou formulação adjuvante. A concentração de mimotopo conjugado nestas composições de vacina pode variar amplamente, por exemplo de menos que cerca de 0,5 %, usualmente a ou, pelo menos, cerca de 1 % a tanto quanto 15 % ou 20 % em peso e será selecionada principalmente com base em volumes de fluido, viscosidades, etc., de acordo com o modo particular de administração selecionado. O veículo ou pó liofilizado podem conter aditivos que mantêm a isotonicidade (e.g., cloreto de sódio, manitol) e estabilidade química (e.g., tampões e conservantes). A formulação é esterilizada por técnicas comumente usadas.
[0206]Os métodos reais para preparar composições administráveis parenteralmente serão conhecidos ou evidentes para os especialistas na técnica e são descritos em mais detalhes em, por exemplo, REMINGTON’S PHARMA. SCI. (15 a ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa., 1980).
[0207]As vacinas desta invenção podem ser liofilizada para armazenamento e reconstituídas em um portador adequado antes do uso. Quaisquer técnicas de liofilização e reconstituição adequadas podem ser utilizadas. Será avaliado por um especialista na técnica que a liofilização e reconstituição podem levar a vários graus de perda de atividade e que os níveis de uso podem ter que ser ajustados para compensar.
[0208]As composições contendo os presentes mimotopos de IL-31 (e.g., mimotopo de IL-31 conjugados) ou um coquetel dos mesmos, podem ser administradas para a prevenção de recorrência e/ou tratamentos terapêuticos para a doença existente. Portadores farmacêuticos adequados são descritos na mais recente edição de REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, um texto de referência padrão neste campo da técnica.
[0209]Em aplicação terapêuticas, as composições são administradas em um sujeito já sofrendo de uma doença, em uma quantidade suficiente para curar ou, pelo menos, interromper ou aliviar parcialmente a doença e suas complicações. Uma quantidade adequada para conseguir isso é definida como uma “dose terapeuticamente eficaz” ou uma “quantidade terapeuticamente eficaz”. Quantidades eficazes para este uso vão depender da severidade da doença e do estado geral do sistema imune do sujeito. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição de vacina de acordo com a invenção pode ser facilmente determinada por um especialista na técnica.
[0210]A dosagem administrada irá, certamente, variar dependendo de fatores conhecidos, tais como as características de farmacodinâmica do agente particular e seu modo e via de administração; idade, saúde e peso do receptor; natureza e extensão dos tipos de sintomas do tratamento atual, frequência do tratamento e o efeito desejado.
[0211]Como um exemplo não limitativo, o tratamento de patologias relacionadas a IL-31 em cães, gatos, cavalos ou humanos pode ser fornecido como uma dosagem quinzenal ou mensal das vacinas da presente invenção na faixa de dosagem descrita acima.
[0212]Administrações únicas ou múltiplas das composições de vacina podem ser realizadas com níveis de dose e padrão sendo selecionados pelo veterinário ou medico de tratamento. Em qualquer caso, as formulações farmacêuticas devem fornecer uma quantidade das composições de vacina desta invenção suficiente para tratar eficazmente o sujeito.
Aplicações de Diagnóstico
[0213]A presente invenção também fornece os mimotopos de IL-31 e anticorpos anti-IL-31 para o uso em métodos de diagnóstico para detectar IL-31 ou anticorpos anti-IL-31 em amostras de mamíferos, incluindo, mas não limitadas a amostras de mamíferos conhecidos como tendo ou suspeitos de terem uma condição purítica e/ou alérgica.
[0214]Por exemplo, a presente invenção fornece um método de determinar a identidade e/ou quantidade de um anticorpo anti-IL-31 em uma amostra. Esse método inclui incubar uma amostra incluindo um anticorpo anti-IL-31 com pelo menos um mimotopo de IL-31 tal como um mimotopo de IL-31 felina, um mimotopo de IL-31 canina, um mimotopo de IL-31 de cavalo ou um mimotopo de IL-31 humana; e determinar a identidade e/ou quantidade do anti-IL-31 na amostra.
[0215]Em uma modalidade, o mimotopo de IL-31 canina utilizado no método para determinar a identidade e/ou quantidade de um anticorpo anti-IL-31 na amostra é e/ou compreende como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SVPADTFECKSF (SEQ ID NO: 186), SVPADTFERKSF (SEQ ID NO: 187),
NSSAILPYFRAIRPLSDKNIIDKIIEQLDKLKF (SEQ ID NO: 192), APTHQLPPSDVRKIILELQPLSRG (SEQ ID NO: 196), TGVPES (SEQ ID NO: 200) ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
[0216]Em outra modalidade, o mimotopo de IL-31 felina utilizado nesse método é e/ou compreende como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SMPADNFERKNF (SEQ ID NO: 188), NGSAILPYFRAIRPLSDKNTIDKIIEQLDKLKF (SEQ ID NO: 193), APAHRLQPSDIRKIILELRPM SKG (SEQ ID NO: 197), IGLPES (SEQ ID NO: 201) ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
[0217]Em uma outra modalidade, o mimotopo de IL-31 equina utilizado nesse método é e/ou compreende como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SMPTDNFERKRF (SEQ ID NO: 189), NSSAILPYFKAISPSLNNDKSLYIIEQLDKLNF (SEQ ID NO: 194), GPIYQLQPKEIQAIIVELQNLS KK (SEQ ID NO: 198), KGVQKF (SEQ ID NO: 202) ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
[0218]Em ainda uma outra, o mimotopo de IL-31 humana utilizado nesse método é e/ou compreende como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SVPTDTHECKRF (SEQ ID NO: 190), SVPTDTHERKRF (SEQ ID NO: 191), HSPAIRAYLKTIRQLDNKSVIDEIIEHLDKLIF (SEQ ID NO: 195), LPVRLLRPSDDVQKIVEELQSLSKM (SEQ ID NO: 199), KGVLVS (SEQ ID NO: 203) ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
[0219]Em uma modalidade do método de diagnóstico acima descrito, o mimotopo é um reagente de captura ligado a uma superfície sólida. Em uma modalidade, a amostra é adicionada ao reagente de captura mimotopo; e reagentes de detecção secundários são então adicionados para quantificar a quantidade do anticorpo na amostra.
[0220]A presente invenção também fornece um método de determinar a quantidade de IL-31 em uma amostra de um mamífero. Esse método terá utilidade para detectar IL-31 de várias espécies. Esse método inclui incubar uma amostra de mamífero compreendendo IL-31 com um anticorpo anti-IL-31 marcado: complexo mimotopo de IL-31 amarrado a uma superfície sólida, em que o mimotopo no complexo é selecionado do grupo consiste em um mimotopo de IL-31 felina, um mimotopo de IL-31 canina, um mimotopo de IL-31 de cavalo e um mimotopo de IL-31 humana; e determinar o nível da IL-31 na amostra, em que o anticorpo anti-IL-31 marcado no complexo tem uma afinidade para o mimotopo no complexo que é inferior à sua afinidade para a IL-31 na amostra. Em uma modalidade deste método, a etapa de determinar compreende medir o sinal proveniente do anticorpo marcado que é liberado da superfície sólida quando a IL-31 na amostra se liga ao anticorpo anti-IL-3 marcado do complexo, o nível de IL-31 na amostra sendo inversamente proporcional ao sinal.
[0221]Em uma modalidade, o mimotopo de IL-31 canina utilizado no método de determinar a quantidade de IL-31 na amostra é e/ou compreende como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SVPADTFECKSF (SEQ ID NO: 186), SVPADTFERKSF (SEQ ID NO: 187), NSSAILPYFRAIRPLSDKNIIDKIIEQLDKLKF (SEQ ID NO: 192), APTHQLPPSDVRKIILELQPLSRG (SEQ ID NO: 196), TGVPES (SEQ ID NO: 200) ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
[0222]Em outra modalidade, o mimotopo de IL-31 felina utilizado nesse método é e/ou compreende como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SMPADNFERKNF (SEQ ID NO: 188), NGSAILPYFRAIRPLSDKNTIDKIIEQLDKLKF (SEQ ID NO: 193), APAHRLQPSDIRKIILELRPM SKG (SEQ ID NO: 197), IGLPES (SEQ ID NO: 201) ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
[0223]Ainda em uma outra modalidade, o mimotopo de IL-31 equina utilizado nesse método é e/ou compreende como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SMPTDNFERKRF (SEQ ID NO: 189), NSSAILPYFKAISPSLNNDKSLYIIEQLDKLNF (SEQ ID NO: 194), GPIYQLQPKEIQAIIVELQNLS KK (SEQ ID NO: 198), KGVQKF (SEQ ID NO: 202) ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
[0224]Ainda em uma outra modalidade, o mimotopo de IL-31 humana utilizado nesse método é e/ou compreende como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SVPTDTHECKRF (SEQ ID NO: 190), SVPTDTHERKRF (SEQ ID NO: 191), HSPAIRAYLKTIRQLDNKSVIDEIIEHLDKLIF (SEQ ID NO: 195), LPVRLLRPSDDVQKIVEELQSLSKM (SEQ ID NO: 199), KGVLVS (SEQ ID NO: 203) ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
[0225]Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos de diagnósticos da invenção, o mimotopo se liga a um anticorpo anti-IL31 ou porção de ligação ao antígeno do mesmo se liga especificamente a uma região em uma proteína IL-31 de mamífero envolvida com a interação da proteína IL-31 com seu co-receptor. Em uma modalidade dos métodos de diagnóstico desta invenção, a ligação do dito anticorpo à dita região é impactada por mutações em uma região de ligação ao epítopo 15H05 selecionada do grupo consiste em: a) uma região entre cerca de 124 e 135 resíduos de aminoácido de uma sequência de IL-31 felina representada pela SEQ ID NO: 157 (Felina_IL31_tipo selvagem); b) uma região entre cerca de 124 e 135 resíduos de aminoácido de uma sequência de IL-31 canina representada pela SEQ ID NO: 155 (Canina_IL31); e c) uma região entre cerca de 118 e 129 resíduos de aminoácido de uma sequência de IL-31 equina representada pela SEQ ID NO: 165 (Equina_IL31).
[0226]Em uma modalidade dos métodos de diagnóstico da presente invenção o mimotopo se liga a um anticorpo anti-IL31 ou porção de ligação ao antígeno do mesmo se liga especificamente à região de epítopo 15H05 anteriormente mencionada. Em uma modalidade específica de qualquer um dos métodos de diagnósticos da presente invenção, o mimotopo se liga a um anticorpo anti-IL-31 ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo pelo menos uma das seguintes combinações das sequências da região determinante de complementaridade (CDR):
1) anticorpo 15H05: CDR1 pesada variável (VH) de SYTIH (SEQ ID NO: 1),
CDR2 VH de NINPTSGYTENNQRFKD (SEQ ID NO: 2), CDR3 VH de
WGFKYDGEWSFDV (SEQ ID NO: 3), CDR1 leve variável (VL) de RASQGISIWLS
(SEQ ID NO: 4), CDR2 VL de KASNLHI (SEQ ID NO: 5) e CDR3 VL de LQSQTYPLT
(SEQ ID NO: 6);
2) anticorpo ZIL1: CDR1 pesada variável (VH) de SYGMS (SEQ ID NO: 13),
CDR2 VH de HINSGGSSTYYADAVKG (SEQ ID NO: 14), CDR3 VH de
VYTTLAAFWTDNFDY (SEQ ID NO: 15), CDR1 leve variável (VL) de
SGSTNNIGILAAT (SEQ ID NO: 16), CDR2 VL de SDGNRPS (SEQ ID NO: 17 e CDR3
VL de QSFDTTLDAYV (SEQ ID NO: 18);
3) anticorpo ZIL8: CDR1 VH de DYAMS (SEQ ID NO: 19), CDR2 VH de
GIDSVGSGTSYADAVKG (SEQ ID NO: 20), CDR3 VH de GFPGSFEH (SEQ ID NO:
21), CDR1 VL de TGSSSNIGSGYVG (SEQ ID NO: 22), CDR2 VL de YNSDRPS (SEQ
ID NO: 23), CDR3 VL de SVYDRTFNAV (SEQ ID NO: 24);
4) anticorpo ZIL9: CDR1 VH de SYDMT (SEQ ID NO: 25), CDR2 VH de
DVNSGGTGTAYAVAVKG (SEQ ID NO: 26), CDR3 VH de LGVRDGLSV (SEQ ID NO:
27), CDR1 VL de SGESLNEYYTQ (SEQ ID NO: 28), CDR2 VL de RDTERPS (SEQ
ID NO: 29), CDR3 VL de ESAVDTGTLV (SEQ ID NO: 30);
5) anticorpo ZIL11: CDR1 VH de TYVMN (SEQ ID NO: 31), CDR2 VH de
SINGGGSSPTYADAVRG (SEQ ID NO: 32), CDR3 VH de SMVGPFDY (SEQ ID NO:
33), CDR1 VL de SGESLSNYYAQ (SEQ ID NO: 34), CDR2 VL de KDTERPS (SEQ
ID NO: 35), CDR3 VL de ESAVSSDTIV (SEQ ID NO: 36);
6) anticorpo ZIL69: CDR1 VH de SYAMK (SEQ ID NO: 37), CDR2 VH de
TINNDGTRTGYADAVRG (SEQ ID NO: 38), CDR3 VH de GNAESGCTGDHCPPY
(SEQ ID NO: 39), CDR1 VL de SGESLNKYYAQ (SEQ ID NO: 40), CDR2 VL de
KDTERPS (SEQ ID NO: 41), CDR3 VL de ESAVSSETNV (SEQ ID NO: 42);
7) anticorpo ZIL94: CDR1 VH de TYFMS (SEQ ID NO: 43), CDR2 VH de LISSDGSGTYYADAVKG (SEQ ID NO: 44), CDR3 VH de FWRAFND (SEQ ID NO: 45), CDR1 VL de GLNSGSVSTSNYPG (SEQ ID NO: 46), CDR2 VL de DTGSRPS (SEQ ID NO: 47), CDR3 VL de SLYTDSDILV (SEQ ID NO: 48); 8) anticorpo ZIL154: CDR1 VH de DRGMS (SEQ ID NO: 49), CDR2 VH de YIRYDGSRTDYADAVEG (SEQ ID NO: 50), CDR3 VH de WDGSSFDY (SEQ ID NO: 51), CDR1 VL de KASQSLLHSDGNTYLD (SEQ ID NO: 52), CDR2 VL de KVSNRDP (SEQ ID NO: 53), CDR3 VL de MQAIHFPLT (SEQ ID NO: 54); 9) anticorpo ZIL159: CDR1 VH de SYVMT (SEQ ID NO: 55), CDR2 VH de GINSEGSRTAYADAVKG (SEQ ID NO: 56), CDR3 VH de GDIVATGTSY (SEQ ID NO: 57), CDR1 VL de SGETLNRFYTQ (SEQ ID NO: 58), CDR2 VL de KDTERPS (SEQ ID NO: 59), CDR3 VL de KSAVSIDVGV (SEQ ID NO: 60); 10) anticorpo ZIL171: CDR1 VH de TYVMN (SEQ ID NO: 61), CDR2 VH de SINGGGSSPTYADAVRG (SEQ ID NO: 62), CDR3 VH de SMVGPFDY (SEQ ID NO: 63), CDR1 VL de SGKSLSYYYAQ (SEQ ID NO: 64), CDR2 VL de KDTERPS (SEQ ID NO: 65), CDR3 VL de ESAVSSDTIV (SEQ ID NO: 66); ou 11) uma variante de 1) a 10) que se difere do respectivo anticorpo precursor 15H05, ZIL1, ZIL8, ZIL9, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159 ou ZIL171 pela adição, deleção e/ou substituição de um ou mais resíduos de aminoácido em pelo menos uma de CDR1, CDR2 ou CDR3 VH ou VL.
[0227]Em algumas modalidades, o mimotopo utilizado nos métodos de diagnóstico da presente invenção se liga a um anticorpo anti-IL-31 ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga a IL-31 felina, em que o anticorpo inclui uma cadeia VL compreendendo a Estrutura 2 (FW2) com as alterações selecionadas das seguintes: uma Asparagina no lugar de Lisina na posição 42, uma Isoleucina no lugar de Valina na posição 43, uma Valina no lugar de Leucina na posição 46, uma Asparagina no lugar de Lisina na posição 49 e combinações das mesmas, em que as posições são em referência à numeração da SEQ ID NO: 127 (FEL_15H05_VL1).
[0228]Os anticorpos, polipeptídeos e/ou peptídeos anti-IL-31 da presente invenção e mimotopos de peptídeos da IL-31 são úteis para imunoensaios que detectam ou quantificam a IL-31 ou anticorpos anti-IL-31 em uma amostra. Um imunoensaio para IL-31 tipicamente compreende incubar uma amostra clínica ou biológica na presença de um anticorpo anti-IL-31, polipeptídeo ou peptídeo de alta afinidade (ou alta avidez) detectavelmente marcado da presente invenção capaz de se ligar seletivamente à IL-31 e detectar o polipeptídeo, peptídeo ou anticorpo marcado que está ligado a uma amostra. Em uma modalidade preferida, um mimotopo de IL-31 está ligado a uma superfície sólida e é usado para capturar um anticorpo anti- IL-31 marcado, tal que um complexo anticorpo anti-IL-31 marcado:mimotopo de IL-31 se torna amarrado à superfície sólida. O anticorpo anti-IL-31 marcado no complexo tem uma afinidade para o mimotopo no complexo que é inferior à sua afinidade para a IL-31 na amostra. O nível de IL-31 na amostra pode, portanto, ser determinado medindo-se o sinal proveniente do anticorpo marcado que é liberado da superfície sólida quando a IL-31 na amostra se liga ao anticorpo anti-IL-31 marcado do complexo anticorpo anti-IL-31:mimotopo de IL-31. Neste exemplo, o nível de IL-31 na amostra é inversamente proporcional ao sinal. Vários procedimentos de ensaio clínico são bem conhecidos na técnica. Ver, e.g., IMMUNOASSAYS FOR THE 80’S (Voller et al., eds., Univ. Park, 1981). Essas amostras incluem biópsia do tecido, sangue, soro e amostras fecais ou líquidos coletados de indivíduos animais e submetidos à análise de ELISA como descrito abaixo.
[0229]Em algumas modalidades, a ligação do antígeno ao anticorpo é detectada sem o uso de um suporte sólido. Por exemplo, a ligação do antígeno ao anticorpo pode ser detectada em um formato líquido.
[0230]Em outras modalidades, um mimotopo de peptídeo de IL-31 ou um anticorpo, polipeptídeo ou peptídeo anti-IL-31 pode, por exemplo, ser fixado a nitrocelulose ou outro suporte sólido que é capaz de imobilizar células, partículas de células ou proteínas solúveis. O suporte pode então ser lavado com tampões adequados seguido por tratamento com o polipeptídeo, peptídeo ou anticorpo específico de IL-31 detectavelmente marcado. O suporte de fase sólida pode então ser lavado com o tampão uma segunda vez para remover polipeptídeo, peptídeo ou anticorpo não ligado. A quantidade de marcador ligado no suporte sólido pode então ser detectada por etapas métodos conhecidos.
[0231]“Suporte de fase sólida” ou “portador” se refere a qualquer suporte capaz de se ligar ao polipeptídeo, peptídeo, antígeno ou anticorpo. Os suportes ou portadores bem conhecidos, incluem vidro, poliestireno, polipropileno, polietileno, fluoreto de polivinilideno (PVDF), dextrano, náilon, amilases, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, agaroses e magnetita. A natureza do portador pode ser solúvel em alguma extensão ou insolúvel para os propósitos da presente invenção. O suporte material pode ter virtualmente qualquer configuração estrutural possível desde que a molécula acoplada seja capaz de se ligar ao mimotopo de peptídeo de IL-31, IL-31 ou um anticorpo anti-IL-31. É previsto que o mimotopo de IL-31 ligado ao suporte pode, por si só, ser conjugado com um polipeptídeo portador, se desejado. Assim, a configuração do suporte pode ser esférica, como em uma pérola ou cilíndrica, como no interior da superfície de um tubo de teste ou a superfície externa de um bastão.
Alternativamente, a superfície pode ser plana, tal como uma folha, disco de cultura, tira de teste, etc. Por exemplo, os suportes podem incluir microesferas de poliestireno.
O especialista na técnica conhecerá muitos outros portadores adequados para a ligação do anticorpo, polipeptídeo, peptídeo ou antígeno ou pode determinar o mesmo por experimentação de rotina.
[0232]Etapas métodos bem conhecidos podem determinar a atividade de ligação de um dado lote de mimotopo ou polipeptídeo, peptídeo e/ou anticorpo anti- IL-31. O especialista na técnica pode determinar as condições de ensaio operativas e ótimas por experimentação de rotina.
[0233]A marcação de forma detectável de um polipeptídeo, peptídeo e/ou anticorpo específico de IL-31 bem como a marcação de um mimotopo de peptídeo de IL-31 (ou conjugado do mesmo) pode ser realizada por vários métodos diferentes, incluindo a ligação a uma enzima para o uso em um imunoensaio de enzima (EIA) ou ensaio de imunoabsorção ligado a enzima (ELISA). A enzima ligada reage com o substrato exposto para gerar uma porção química que pode ser detectada, por exemplo, por meios espectrofotométricos, fluorométricos ou visuais. As enzimas que podem ser usadas para marcar detectavelmente os anticorpos ou mimotopos específicos de IL-31 aqui descritos incluem, mas não são limitadas a malato desidrogenase, nuclease estafilocócica, delta-5-esteroide isomerase, desidrogenase alcoólica de levedura, alfa-glicerofosfato desidrogenase, triose fosfato isomerase, peroxidase de raiz forte, fosfatase alcalina, asparaginase, glicose oxidase, beta- galactosidase, ribonuclease, urease, catalase, glicose-6-fosfato desidrogenase, glucoamilase e acetilcolinaesterase.
[0234]Marcando radioativamente os anticorpos ou mimotopos específicos de IL-31, é possível detectar IL-31 através do uso de um radioimunoensaio (RIA). Ver Work et al., LAB. TECHINIQUES & BIOCHEM. 1N MOLEC. Bio. (No Holland Pub. Co., NY, 1978). O isótopo radioativo pode ser detectado por tais meios como o uso de um contador gama ou um contador de cintilação ou por autorradiografia. Os isótopos que são particularmente úteis para o propósito da presente invenção incluem: 3H, 125I, 131I, 35S, 14C e 125I.
[0235]Também é possível marcar os anticorpos ou mimotopos específicos de IL-31 com um composto fluorescente. Quando o anticorpo marcado com fluorescência é exposto à luz do comprimento de onda apropriado, sua presença pode então ser detectada devido à fluorescência. Entre os compostos de marcação fluorescente mais comumente usados estão isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina,
ficocianina, aloficocianina, o-ftaldeído e fluorescamina.
[0236]Os anticorpos ou mimotopos específicos de IL-31 também podem ser detectavelmente marcados usando metais emissores de fluorescência, tais como 125Eu ou outros da série dos lantanídeos. Esses metais podem ser ligados ao anticorpo ou mimotopo específico de IL-31 usando grupos quelantes de metal como ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA) ou ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).
[0237]Os anticorpos específicos de IL-31 também podem ser detectavelmente marcados por acoplamento a um composto quimioluminescente. A presença do anticorpo ou mimotopo marcado quimioluminescentemente é então determinada detectando-se a presença de luminescência que surge durante o curso de uma reação química. Exemplos de compostos de marcação quimioluminescente úteis são luminol, isoluminol, éster de acridínio teromático, imidazol, sal de acridínio e éster de oxalato.
[0238]Do mesmo modo, um composto bioluminescente pode ser usado para marcar o mimotopo ou anticorpo específico de IL-31, porção, fragmento, polipeptídeo ou derivado do mesmo. A bioluminescência é um tipo de quimioluminescência encontrado em sistemas biológicos em que uma proteína catalítica aumenta a eficiência da reação quimioluminescente. A presença de uma proteína bioluminescente é determinada detectando-se a presença de luminescência.
Composto bioluminescentes importantes para os propósitos de marcação são luciferina, luciferase e aequorina.
[0239]A detecção do mimotopo, anticorpo específico de IL-31, porção, fragmento, polipeptídeo ou derivado pode ser realizada por um contador de cintilação, por exemplo, se o marcador detectável é um emissor gama radioativo ou por um fluorômetro, por exemplo, se o marcador é um material fluorescente. No caso de um marcador enzimático, a detecção pode ser realizada por métodos colorométricos que utilizam um substrato para a enzima. A detecção também pode ser realizada por comparação visual da extensão de reação enzimática de um substrato em comparação com padrões similarmente preparados.
[0240]Para os propósitos da presente invenção, a IL-31 que é detectada pelos ensaios acima pode estar presente em uma amostra biológica. Qualquer amostra contendo IL-31 pode ser usada. Por exemplo, a amostra é um fluido biológico, tal como, por exemplo, sangue, soro, linfa, urina, fezes, exsudato inflamatório, fluido cefalorraquidiano, fluido amniótico, um extrato de tecido ou homogenato e semelhantes. A invenção não é limitada aos ensaios usando apenas essas amostras, entretanto, sendo possível para um especialista na técnica, à luz do presente relatório descritivo, determinar condições adequadas que permitem o uso de outras amostras.
[0241]A detecção in situ pode ser realizada removendo-se um espécime histológico de um indivíduo animal e adicionar um anticorpo marcado (sozinho ou em um complexo com um mimotopo de IL-31 aqui descrito) a esse espécime. Também é previsto que o anticorpo no complexo pode compreender apenas uma porção do anticorpo. O anticorpo (ou porção do mesmo) pode ser fornecido aplicando-se ou sobrepondo-se o anticorpo marcado (ou porção) a uma amostra biológica. Através do uso desse procedimento, é possível determinar não apenas a presença de IL-31, mas também a distribuição de IL-31 no tecido examinado. Usando a presente invenção, o especialista na técnica perceberá prontamente que qualquer um de uma ampla variedade de métodos histológicos (tais como procedimentos de coloração) podem ser modificados de modo a obter essa detecção in situ.
[0242]O mimotopo, anticorpo, fragmento ou derivado da presente invenção pode ser adaptado para a utilização em um ensaio imunométrico, também conhecido como um ensaio de “dois sítios” ou “sanduíche”. Em um ensaio imunométrico típico, uma quantidade de anticorpo não marcado (ou fragmento de anticorpo) é ligada a um suporte sólido que é insolúvel no fluido sendo testado e uma quantidade de anticorpo solúvel detectavelmente marcado é adicionada para permitir a detecção e/ou quantificação do complexo ternário formado entre anticorpo de fase sólida, antígeno e anticorpo marcado.
[0243]Os anticorpos ou complexos anticorpo:mimotopo podem ser usados para detectar quantitativamente ou qualitativamente a IL-31 em uma amostra ou detectar a presença de células que expressam a IL-31. Isso pode ser realizado por técnicas de imunofluorescência utilizando um anticorpo fluorescentemente marcado ou complexo anticorpo:mimotopo (ver abaixo) acoplado com microscopia de fluorescência, citometria de fluxo ou detecção fluorométrica. Para fins de diagnóstico, os anticorpos podem ser marcados ou não marcados. Os anticorpos não marcados podem ser usados em combinação com outros anticorpos marcados (segundos anticorpos) que são reativos com o anticorpo, tais como anticorpos específicos para regiões constantes de imunoglobulina canina ou felina. Alternativamente, os anticorpos podem ser diretamente marcados. Uma ampla variedade de marcadores pode ser utilizada, tal como radionuclídeos, fluoros, enzimas, substratos de enzima, cofatores de enzima, inibidores de enzima, ligantes (particularmente haptenos), etc.
Numerosos tipos de imunoensaios, tais como aqueles discutidos previamente estão disponíveis e são bem conhecidos dos especialistas na técnica.
[0244]Em uma modalidade, o método de diagnóstico para detectar IL-31 é um teste de imunoensaio de fluxo lateral. Também é conhecido como o ensaio imunocromatográfico, ImunoMigração Rápida (RIMTM) ou teste de tira. Os imunoensaios de fluxo laterais são essencialmente imunoensaios adaptados para operar ao longo de um único eixo para se adequar ao formato da tira de teste. Várias variações da tecnologia foram desenvolvidas em produtos comerciais, mas todas elas operam de acordo com o mesmo princípio básico. Uma tira de teste típica consiste nos seguintes componentes: (1) almofada de amostra - uma almofada absorvente na qual a amostra de teste é aplicada; (2) almofada conjugada ou reagente - esta contém anticorpos específicos para o analito alvo conjugado com partículas coloridas (usualmente partículas de ouro coloidal ou microesferas de latex); (3) membrana de reação - tipicamente uma membrana de nitrocelulose hidrofóbica ou acetato de celulose na qual anticorpos anti-analito alvo são imobilizados em uma linha através da membrana como uma zona de captura ou linha de teste (uma zona de controle também pode estar presente, contendo anticorpos específicos para os anticorpos conjugados); e (4) pavio ou reservatório de resíduos - uma outra almofada absorvente projetada para puxar a amostra através da membrana de reação pela ação capilar e coletá-la. Os componentes da tira são usualmente fixados a um material de suporte inerte e podem estar apresentados em um formato de vareta simples ou dentro de um invólucro de plástico com uma porta de amostra e janela de reação que mostra as zonas de captura e controle.
[0245]Existem dois tipos principais de imunoensaio de fluxo lateral usados em testes microbiológicos: ensaios em sanduíche de anticorpo duplo e ensaios competitivos. No formato sanduíche do anticorpo duplo, a amostra migra da almofada de amostra para a almofada conjugada onde qualquer analito alvo presente vai se ligar ao conjugado. A amostra então continua migrando através da membrana até atingir a zona de captura onde o complexo alvo/conjugado vai se ligar aos anticorpos imobilizados produzindo uma linha visível na membrana. A amostra então migra aind amais ao longo da tira até atingir a zona de controle, onde o excesso de conjugado vai se ligar e produzir uma segunda linha visível na membrana. Essa linha de controle indica que a amostra migrou através da membrana como intencionado. Duas linhas claras na membrana é um resultado positivo. Uma única linha na zona de controle é um resultado negativo. Ensaios competitivos se diferem do formato sanduíche do anticorpo duplo em que a almofada conjugada contém anticorpos que já estão ligados ao analito alvo ou a um análogo deste. Se o analito alvo estiver presente na amostra ele, portanto, não se ligará ao conjugado e permanecerá não marcado. Como a amostra migra ao longo da membrana e atinge a zona de captura, um excesso de analito não marcado vai se ligar aos anticorpos imobilizados e bloquear a captura do conjugado, de modo que nenhuma linha visível é produzida. O conjugado não ligado vai se ligar aos anticorpos na zona de controle e produzir uma linha de controle visível.
Uma única linha de controle na membrana é um resultado positivo. Duas linhas visíveis nas zonas de captura e controle é um resultado negativo. Entretanto, se um excesso de analito alvo não marcado não estiver presente, uma linha fraca pode ser produzida na zona de captura, indicando um resultado inconclusivo. Existem várias variações na tecnologia de fluxo lateral. A zona de captura na membrana pode conter enzimas ou antígenos imobilizados - dependendo do analito alvo – em vez de anticorpos. Também é possível aplicar múltiplas zonas de captura para criar um teste multiplex. Por exemplo, foram desenvolvidas tiras de teste comerciais capazes de detectar toxinas EHEC Shiga ST1 e ST2 separadamente na mesma amostra.
[0246]Importantemente, os mimotopos e anticorpos aqui descritos podem ser úteis no diagnóstico de uma pruriginose e/ou alergia em cães, gatos ou cavalos. Mais especificamente, o anticorpo no complexo anticorpo:mimotopo pode se ligar à IL-31 na amostra e ajudar a identificar a superexpressão de IL-31 em mamíferos, incluindo animais domésticos. Assim, os anticorpos aqui descritos, que podem ser usados em conjunto com o mimotopo, podem fornecer uma importante ferramenta imunohistoquímica. Em uma modalidade, um projeto de ensaio é concebido aqui, pelo qual um mimotopo de IL-31 (peptídeo) é usado para capturar um anticorpo da presente invenção que é marcado para a detecção em um ensaio. Esse anticorpo capturado deve ter uma afinidade com o mimotopo ligado que é menor que a afinidade de IL-31 circulante nativa em uma espécie hospedeira. Nesta modalidade, a incubação do fluido derivado da espécie hospedeira é incubada com o complexo anticorpo:mimotopo marcado que é amarrado a uma superfície sólida. A presença de IL-31 no fluido de teste derivado da espécie hospedeira terá uma afinidade maior para a anticorpo, liberando assim o anticorpo marcado da superfície sólida onde ele pode ser removido durante as etapas de lavagem. O nível de IL-31 no fluido de teste pode,
portanto, ser correlacionado com a falta de sinal que aparece na superfície ligada ao mimotopo. É concebido que esse ensaio deve ter utilidade para medir a IL-31 em uma pesquisa ou ajuste clínico para o uso como um teste de diagnóstico.
[0247]Os anticorpos e mimotopos aqui descritos podem ser usados em matrizes, altamente adequadas para medir os perfis de expressão do gene.
Kits
[0248]Também estão incluídos dentro do escopo da presente invenção kits para a prática dos métodos terapêuticos e métodos de diagnóstico em questão. Em uma modalidade, um kit de acordo com a presente invenção inclui, pelo menos, uma composição de vacina da presente invenção. Em uma modalidade, uma vacina da presente invenção pode ser fornecida, usualmente em uma forma liofilizada, em um recipiente. Em outra modalidade, um kit de acordo com a presente invenção pode incluir os componentes necessários para realizar os métodos de diagnóstico desta invenção. Por exemplo, um kit desta invenção pode incluir como um de seus componentes um mimotopo de IL-31 como aqui descrito, tal como um mimotopo de IL-31 felina, um mimotopo de IL-31 canina, um mimotopo de IL-31 de cavalo ou um mimotopo de IL-31 humana. Esse mimotopo pode já estar ligado a uma superfície sólida. Um kit de acordo com a presente invenção também pode incluir anticorpos. Os anticorpos, que podem ser conjugados com um marcador ou toxina ou não conjugados, estão tipicamente incluídos nos kits com tampões, tais como Tris, fosfato, carbonato, etc., estabilizadores, biocidas, proteínas inertes, e.g., albumina de soro ou semelhantes. Geralmente, esses materiais estarão presentes em menos que 5 % em peso, com base na quantidade de anticorpo ativo e, usualmente, presentes na quantidade total de pelo menos cerca de 0,001 % em peso, com base novamente na concentração de anticorpo. Frequentemente, será desejável incluir um extensor inerte ou excipiente para diluir os ingredientes ativos, onde o excipiente pode estar presente em cerca de 1 % a 99 % em peso da composição total. Quando um segundo anticorpo capaz de se ligar ao anticorpo primário é utilizado em um ensaio, ele usualmente estará presente em um frasco separado. O segundo anticorpo é tipicamente conjugado com um marcador e formulado de uma maneira análoga às formulações de anticorpo descritas acima. Os kits geralmente também incluirão um conjunto de instruções para o uso.
[0249]Em uma modalidade, um kit de acordo com a presente invenção é um kit de tira de teste (kit de imunoensaio de fluxo lateral) útil para detectar IL-31, tal como proteína IL-31 canina, felina, equina ou humana em uma amostra. Essa tira de teste tipicamente incluirá uma almofada de amostra na qual a amostra de teste é aplicada; uma almofada conjugada ou reagente contendo um anticorpo ou anticorpo:mimotopo específico para IL-31 canina, felina, equina ou humana, em que o anticorpo ou complexo anticorpo:mimotopo é conjugado com partículas coloridas (usualmente partículas de ouro coloidal); uma membrana de reação na qual anticorpos anti-IL-31 ou um complexo anticorpo:mimotopo são imobilizados em uma linha através da membrana como uma zona de captura ou linha de teste (uma zona de controle também pode estar presente, contendo anticorpos ou um complexo anticorpo:mimotopo específico para os anticorpos conjugados); e uma almofada absorvente adicional projetada para puxar a amostra através da membrana de reação por ação capilar e coletá-la. O kit de tira de teste geralmente também incluirá instruções para o uso.
[0250]A invenção será agora descrita mais detalhadamente pelos exemplos não limitativos abaixo. Na seção de exemplos abaixo e nas figuras, quaisquer dados apresentados para anticorpos contendo “11E12” em sua designação são para fins de comparação com os anticorpos da presente invenção.
Exemplos
1. Exemplo 1
1.1. Produção de Interleucina 31 canina (cIL-31) a partir de células de Ovário de Hamster Chinês (CHO)
[0251]A proteína Interleucina 31 varia em conservação da sequência de aminoácidos entre espécies homólogas (A Figura 1), mas acredita-se que tenha arquitetura estrutural comum com outros membros da família de citocinas do tipo I (Boulay et al. 2003, Immunity. Aug; 19(2): 159-632003; Dillon et al. 2004 Nat Immunol.
Jul; 5(7): 752-60). Esta topologia de pacote up-down é significativa para o modo de reconhecimento do receptor compartilhado por essas citocinas (Dillon et al. supra, Cornelissen et al. 2012 Eur J Cell Biol. Jun-Jul; 91(6-7): 552-66). Com a variação nas identidades de sequência de proteína de IL-31 entre diferentes espécies, não é possível prever se os anticorpos criados contra uma espécie terão reação cruzada com outras, dada diferentes propensões de epítopo e composições sítios de aminoácido. Como uma consequência, múltiplas formas de proteína IL-31 foram consideradas para este trabalho, representando múltiplas espécies e sistemas de expressão. A proteína IL-31 canina (cIL-31) foi produzida para usar como um imunógeno e um reagente para testar a afinidade e a potência de resultados de anticorpo. cIL-31 recombinante foi criada em células CHO usando o sistema CHROMOS ACE (Artificial Chromossome Expression) (Chromos Molecular Systems, Inc., Burnaby, British Columbia) para gerar a proteína IL-31 canina secretada tendo a sequência de (SEQ ID NO: 155; Canina_IL31), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 156; Canina_IL31). Meio condicionado de 400 ml de cultura de células (linhagem celular CHO) foi obtido e dialisado contra 10 volumes de tampão QA (Tris 20 mM pH 8,0, NaCl 20 mM) por 4,5 horas. Meio dialisado foi filtrado a 0,2 μm e carregado a 1 ml/min em uma coluna Q SOURCE™ (GE Healthcare, Uppsala, Suécia) pré-equilibrada com tampão QA. A proteína foi eluída usando um gradiente linear de múltiplas etapas. A maioria de cIL-31 permaneceu na fração de fluxo (FT), uma pequena quantidade de cIL-31 eluíu antes do gradiente.
Identidade da proteína foi previamente confirmada por Western immunoblotting, e análise de Espectrometria de Massa (MS) de uma digestão tríptica. A proteína na fração FT foi concentrada 4 a 5 vezes e dialisada durante a noite contra Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS) a 4 °C. A estabilidade da proteína foi verificada após a diálise em PBS. Nenhuma precipitação foi observado, e nenhuma proteólise foi observada depois de vários dias a 4 °C. Experimentos de desglicosilação usando N- glicosidase F resultou na condensação de proteína até uma única banda de ~15 kDa em SDS-PAGE. A concentração de proteína foi determinada usando um ensaio bicinconínico (ensaio BCA) com Albumina de Soro Bovino (BSA) como um padrão (ThermoFisher Scientific, Inc., Rockford, IL). A solução proteica foi dividida em alíquotas, congelada rapidamente (N2 líquido) e armazenada a -80 °C.
1.2. Expressão transiente de Interleucina 31 felina (fIL-31) tipo selvagem e mutante a partir de células CHO
[0252]Para auxiliar na identificação de anticorpos com a propriedade de ligação ao epítopo apropriada, proteínas IL-31 felinas tipo selvagem e mutante foram expressadas em um de sistema de expressão de mamífero para produção, purificação e avaliação na afinidade e ensaios de base celular. O sítio de ligação de anticorpo 11E12 em IL-31 foi descrito previamente (Patente US No 8.790.651 de Bammert, et al.). A caracterização do novo sítio de ligação em IL-31 reconhecido pelo anticorpo 15H05 é descrita aqui. A designação tipo selvagem é proteína IL-31 felina de comprimento completo com nenhuma alteração nos resíduos de aminoácido nativos.
As proteínas mutantes foram designadas pelo nome de anticorpos correspondentes (11E12 e 15H05) referindo-se às mutações em aminoácidos na proteína IL-31 que (quando alteradas) afetam a ligação para cada anticorpo respectivo. A identificação das mutações apropriadas necessárias para a proteína IL-31 15H05 felina é descrita abaixo na seção 1.10. O objetivo foi alterar aminoácidos no epítopo da IL-31 e observar uma perda do fenótipo de ligação para cada anticorpo respectivo. Uma comparação pode então ser feita durante a triagem para ver se novos anticorpos candidatos se ligam à proteína tipo selvagem e não ao mutante. Novos resultados de anticorpo podem então ser agrupados de acordo com a ligação ao mesmo epítopo ou similar como anticorpo 11E12 ou 15H05.
[0253]Os construtos de expressão foram otimizados por códons e sintetizados para expressão em células de Ovário de Hamster Chinês (CHO). Os genes sintetizados foram clonados em pD2529 (vetor ATUM) para uso de expressão transiente. A proteína IL-31 felina tipo selvagem é representada por (SEQ ID NO: 157; Felina_IL31_tipo selvagem), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 158; Felina_IL31_tipo selvagem). Proteína IL-31 11E12 felina mutante é representada por (SEQ ID NO: 161; Felina_IL31_11E12_mutante), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 162; Felina_IL31_11E12_mutante). Proteína IL-31 15H05 felina mutante é representada por (SEQ ID NO: 163; Felina_IL31_15H05_mutante), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 164; Felina_IL31_15H05_mutante). As proteínas IL-31 felinas recombinantes foram expressadas em células ExpiCHO-S™ (ThermoFisher Scientific, Inc., Rockford, IL) seguindo-se o protocolo de título máximo do fabricante para expressão de CHO transiente. Doze dias após a transfecção, as células foram centrifugadas e filtradas para capturar a proteína secretada nos meios condicionados. Para cada construto (tipo selvagem e mutantes), 120 mL de meios condicionados (de cultura de células CHO, 0,2 µm filtrado) foram ajustados para 30 mS/cm com a adição de NaCl, imidazol 5 mM e pH 7,4. Cada amostra de meios foi combinada com 5 mL de resina HisPur Cobalt (ThermoFisher Scientific, Inc., Rockford, IL) que foi equilibrada com imidazol 5 mM, fosfato de sódio 20 mM, NaCl 300 mM, pH 7,4. Cada amostra e resina foi deixada misturar a 4 °C, durante a noite. Resinas foram coletadas (e separadas a partir da fração não ligada) despejando-se através de BioRad Econcolumns (Bio-Rad, Hercules, CA). As resinas foram lavadas com 5 x 5 mL de tampão (como acima) e depois eluídas com 5 x 5 mL de imidazol 500 mM na mesma tampão. As frações foram avaliadas por SDS-PAGE. A concentração foi medida por um ensaio de proteína BCA usando métodos padrão.
1.3. Produção de Interleucina 31 felina (fIL-31) a partir de E. coli
[0254]A proteína IL-31 felina recombinante foi gerada em um hospedeiro de expressão de E. coli para usar como um reagente de ensaio e para estudos de desafio in vivo para induzir uma resposta prurítica em gatos. O gene representando IL-31 felina foi sintetizado para uma expressão ótima em E. coli. Os construtos de expressão foram criados com o gene de IL-31 felina de comprimento completo contendo uma etiqueta 6-His N-terminal para detecção e purificação. Esta proteína IL-31 felina é representada por (SEQ ID NO: 159; Felina_IL-31_E_coli), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 160; Felina_IL-31_E_coli).
Os plasmídeos confirmados pela sequência foram usados para transformar E. coli BL21 DE3 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) e expressão de proteína subsequente realizado.
[0255]A pasta de células (262,3 g) a partir de E. coli foi lisada como a seguir: A pasta de células foi recolocada em suspensão em 500 mL de Tris 50 mM pH 8, filtrada através de um filtro de malha inoxidável para remover as partículas, e depois lisada através de duas passagens através de um microfluidizador a 1300 psi. O lisato (volume de ~1200 mL) foi dividido em quatro frascos, centrifugado a 12.000 g por 20 minutos a 10 °C. O sobrenadante foi decantado e descartado. Cada pelota foi lavada por suspensão em 300 mL de EDTA 5 mM, Triton X-100 a 0,5 %, pH 9,0, e depois centrifugação a 12.000 g, 50 minutos, a 10 °C. O sobrenadante foi decantado e descartado. As pelotas lavadas foram armazenadas a -20 °C até dobragem e isolamento.
[0256]Antes do isolamento, uma das pelotas foi lavada com água para remover o detergente residual, e depois centrifugado a 10.000 g, 20 minutos, a 4 °C.
Novamente, o sobrenadante foi decantado. Finalmente, a pelota lavada foi solubilizada em 60 mL de fosfato de sódio 50 mM, NaCl 300 mM, guanidina-HCl 6 M, imidazol 5 mM, pH 7,4. A pelota foi deixada misturar na temperatura ambiente por aproximadamente 25 minutos antes de centrifugar novamente a 10.000 g, 20 minutos, e 4 °C. Desta vez, o sobrenadante foi decantado e mantido para processamento posterior. A pelota (recolocada em suspensão em água até o volume original) foi reservada apenas para SDS-PAGE. IMAC bruto (cromatografia de afinidade de metal imobilizado) foi realizada para aumentar a pureza antes do dobramento. Neste caso, 15 mL de Ni-NTA Superflow (Qiagen Inc, Germantown, MD, Cat #30450, pré- equilibrado no mesmo tampão) foram adicionados ao sobrenadante clarificado e deixados misturar na temperatura ambiente por aproximadamente 90 minutos. A fração não ligada foi decantada e reservada para SDS-PAGE. A resina IMAC foi lavada com imidazol 5 mM, fosfato de sódio 50 mM, NaCl 300 mM, guanidina-HCl 6 M, pH 7,4 (igual ao tampão de solubilização). A resina foi eluída com (primeiro 7,5 mL e depois múltiplos de 15 mL, monitorando eluição de proteína por ensaio Bradford) imidazol 200 mM, fosfato de sódio 50 mM, NaCl 300 mM, guanidina-HCl 6 M, pH 7,4.
As frações de eluição contendo proteína (de acordo com Bradford) foram reunidas (125 mL) para processamento posterior.
[0257]A proteína IL-31 foi dobrada como a seguir. A IL-31 foi reduzida pela adição de ditiotreitol até um final de 10 mM, e deixada misturar na temperatura ambiente por 2 horas. A amostra diluída depois foi diluída às gotas em 2.500 mL (20X volume) de PBS + NaCl 1 M com agitação rápida. A concentração teórica de ureia deve ser de aproximadamente 0,4 M neste ponto. O restante da ureia foi removido lentamente por diálise contra 3 trocas (4 L cada) de PBS, a 4 °C durante a noite. Após a diálise, a amostra foi filtrada a 0,2 µm para remover qualquer proteína não dobrada/precipitada.
[0258]A amostra foi ainda purificada por uma segunda rodada de IMAC, desta vez com uma eluição de gradiente linear. Quinze mL de resina Ni-NTA Superflow foram adicionados à amostra e deixados ligar em lote por agitação (com uma barra de agitação suspensa) durante a noite a 4 °C. Mais uma vez, a fração não ligada foi decantada e reservada. A resina Ni-NTA Superflow foi empacotada em uma coluna XK16 (GE Healthcare Lifesciences, Marlborough, MA) e conectada a um sistema de cromatografia da marca AKTA (GE Healthcare Lifesciences, Marlborough, MA). A coluna foi então lavada com Tris 50 mM, NaCl 300 mM, pH 8,2 e eluída através de um gradiente linear de 150 mL de imidazol 0 a 500 mM, cada um em tampão de lavagem.
As frações foram analisadas por SDS-PAGE. As frações com pureza suficiente de IL- 31 foram reunidas e o tampão trocado novamente por diálise contra 3 trocas (2 L cada) de PBS, a 4 °C, durante a noite. Finalmente, a amostra dobrada e purificada foi coletada da diálise, esterilizada por filtração, concentração medida em alíquotas, congelamento instantâneo em um banho de gelo seco/isopropanol e armazenada a - 80 °C.
1.4. Método para determinar afinidade de anticorpos anti-IL-31 para IL-31 usando ressonância plasmônica de superfície
[0259]A afinidade com a qual os mAbs candidatos se ligam à IL-31 canina e felina foi determinada usando ressonância plasmônica de superfície (SPR) em um sistema Biacore (Biocore Life Sciences (GE Healthcare), Uppsala, Suécia). Para evitar diferenças de afinidade associadas com preparação de superfície diferencial que pode ocorrer ao imobilizar anticorpos em superfícies; uma estratégia foi utilizada onde IL- 31 foi diretamente conjugada à superfície. Imobilização foi obtida pela amina acoplando 5 μg/mL de IL-31 usando a química de N-hidroxissucinimida (NHS)/1-Etila- 3-(3-dimetilaminopropil)carbodi-imida (EDC). Chips foram extintos com etanolamina e a afinidade com a qual todos os mAbs candidatos ligados à IL-31 imobilizada foi avaliada. Todas as curvas foram ajustadas a um modelo 1:1. As constantes de afinidade (KD) menores que 1 x 10-11M (1E-11 M) estão abaixo do limite inferior de quantificação de detecção para o instrumento. Os resultados das medições de afinidade são descritos aqui.
1.5. Método para determinar a potência de anticorpos anti-IL-31 avaliada pela inibição de IL-31 canina e felina induziu sinalização de pSTAT3 em células macrófagas caninas e felinas
[0260]Para identificar candidatos com atividade inibitória, os anticorpos foram avaliados quanto à sua capacidade de afetar a fosforilação de STAT3 mediada por IL- 31 em um ensaio baseado em células caninas ou felinas. A fosforilação de STAT3 foi determinada em células DH-82 caninas (ATCC® CRL-10389™) ou células semelhantes a macrófagos FCWF4 felinas (ATCC CRL-2787). As células DH82 e FCWF4 foram iniciadas com interferon gama canino (R&D Systems, Minneapolis, MN) a 10 ng/mL por 24 horas ou interferon gama felino (R&D Systems, Minneapolis, MN) a 125 ng/mL por 96 horas, respectivamente, para aumentar a expressão do receptor.
Ambos os tipos de células foram privados de soro durante 2 horas antes do tratamento com IL-31 e mAb. Usando dois métodos independentes, todos os mAbs candidatos foram avaliados quanto à sua capacidade de inibir a fosforilação de STAT3 induzida por IL-31 em 1 μg/mL canina ou 0,2 μg/mL felina. Os ensaios também foram executados para demonstrar a reatividade cruzada de citocinas caninas e felinas e a funcionalidade cruzada da capacidade dos anticorpos de inibir a sinalização em ambas as espécies. Para assegurar a formação do complexo, uma co-incubação de uma hora de mAb e citocina IL-31 antes da estimulação celular foi concluída. A estimulação das células IL-31 foi realizada durante cinco minutos. A fosforilação de STAT3 foi medida usando a tecnologia AlphaLISA SureFire ULTRA™ (Perkin Elmer, Waltham, MA). No caso em que a concentração e a pureza do anticorpo são desconhecidas, os sobrenadantes do hibridoma foram medidos qualitativamente quanto à sua capacidade de inibir a fosforilação de STAT3 após uma co-incubação de 1 hora com IL-31 1 mg/ml canina ou 0,2 mg/ml felina. A potência dos anticorpos monoclonais individuais definida pela sua capacidade de inibir a fosforilação de
STAT3 mediada por IL-31 nestes ensaios foi considerada o critério de seleção chave para o avanço adicional de anticorpos selecionados. O termo potência refere-se ao valor IC50 calculado a partir desses ensaios e é a concentração do anticorpo onde a sinalização induzida por IL-31 é reduzida à metade de seu valor máximo. A potência aumentada aqui descrita se correlaciona com um valor de IC50 mais baixo.
1.6. Identificação de anticorpos monoclonais de camundongos e caninos que reconhecem a Interleucina 31 canina e felina
[0261]Camundongos e cães foram imunizados com IL-31 canina recombinante (SEQ ID No. 155) com o propósito de identificar anticorpos. Os títulos de anticorpos no soro de animais imunizados foram determinados usando um ensaio imunoenzimático (ELISA). IL-31 canina ou felina (50 ng/poço) foi imobilizada em microplacas de poliestireno e usada como antígeno de captura. O soro dos animais imunizados foi diluído em solução salina tamponada com fosfato com tween-20 a 0,05 % (PBST). A presença de anticorpos anti-IL-31 foi detectada com um anticorpo secundário marcado com HRP apropriado. Após a adição de um substrato cromogênico (SureBlue Reserve TMB 1-Component Microwell Peroxidase Substrate, KPL, Inc., Gaithersburg, MD) e uma incubação de dez minutos à temperatura ambiente (RT), a reação foi interrompida com a adição de 100 µL de HCl 0,1 N. A absorvância de cada poço foi determinada a uma densidade óptica (OD) de 450 nm.
Os anticorpos foram selecionados por sua capacidade de ligar IL-31 canina e felina usando um ELISA. Em alguns casos, uma caracterização adicional foi realizada no momento da seleção usando um ELISA com uma forma mutante da proteína IL-31 felina como um antígeno de captura. As células que produzem anticorpos com as propriedades de ligação e inibidoras desejadas foram escolhidas para análise de sequência de transcritos de RNA que representam as cadeias de IgG pesada variável (VH) e leve variável (VL).
[0262]No caso de anticorpos de camundongo, esplenócitos doadores de um único camundongo CF-1 responsivo foram usados para fusão e os sobrenadantes de hibridoma foram selecionados para anticorpos que se ligam às proteínas IL-31 caninas ou felinas por ELISA. Isso resultou na identificação de um único anticorpo de camundongo, Mu-15H05, tendo uma afinidade sub-nanomolar para ambas as espécies de IL-31 (Figura 2A). O 15H05 anti-IL-31 de camundongo foi ainda subclonado para gerar um hibridoma produtor de anticorpo homogêneo e para o sequenciamento das cadeias pesadas e leves variáveis. As sequências variáveis de anti-IL-31 de camundongo determinadas para o anticorpo 15H05 são as seguintes, cadeia pesada variável de 15H05 (SEQ ID NO: 67; MU-15H05-VH), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 68; MU-15H05-VH), cadeia leve variável de 15H05 (SEQ ID NO: 69; MU-15H05-VL), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 70; MU-15H05-VL). Além do anticorpo de camundongo 15H05, consideração adicional foi dada ao anticorpo derivado de camundongo 11E12 que foi previamente descrito na Patente US N o 8.790.651 de Bammert, et al. são descritos neste documento, dados que mostram a capacidade do anticorpo 11E12 de se ligar às proteínas IL-31 caninas e felinas com alta afinidade. A capacidade de 11E12 para se ligar a IL-31 felina tornou este anticorpo um candidato adequado para felinização e potencial uso terapêutico em gatos. As sequências variáveis anti-IL-31 de camundongo previamente determinadas para o anticorpo 11E12 são as seguintes, cadeia pesada variável de 11E12 (SEQ ID NO: 71; MU- 11E12-VH), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 72; MU-11E12-VH), cadeia leve variável de 11E12 (SEQ ID NO: 73; MU-11E12-VL), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 74; MU- 11E12-VL).
[0263]Cães com títulos elevados de anti-IL-31 após vacinação foram selecionados para análise de populações de células B que produzem anticorpos com fenótipos desejados. As células B foram derivadas de PBMCs, medula óssea, baço ou nódulos linfáticos para análise posterior. As células B únicas foram segregadas em poços individuais e testadas quanto à presença de IgGs secretados capazes de se ligar ao tipo selvagem, mutantes 11E12 e mutantes 15H05 de IL-31 canina (AbCellera, Vancouver, BC) usando métodos descritos em US2012/0009671A1, US2016/0252495A1, US 9.188.593, WO 2015/176162 A9 e WO 2016/123692 A1.
[0264]Esta estratégia de triagem é baseada em regiões conhecidas da proteína IL-31 que são críticas para a ligação e a transdução de sinal através de seu complexo co-receptor. A seleção dessas proteínas mutantes para triagem é descrita na seção 1.2 deste pedido. A sequenciação dos domínios IgG pesados e leves variáveis foi realizada após uma reação de RT-PCR de células B candidatas individuais. Estas triagens resultaram na identificação de nove anticorpos caninos selecionados para avaliação posterior. Estas sequências variáveis de IL-31 anti- canina são as seguintes, cadeia pesada variável de ZIL1 (SEQ ID NO: 75; CAN- ZIL1_VH), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 76; CAN-ZIL1_VH), cadeia variável leve de ZIL1 (SEQ ID NO: 77; CAN-ZIL1_VL), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 78; CAN- ZIL1_VL); Cadeia pesada variável de ZIL8 (SEQ ID NO: 79; CAN-ZIL8_VH), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 80; CAN- ZIL8_VH), cadeia leve variável de ZIL8 (SEQ ID NO: 81; CAN-ZIL8_VL), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 82; CAN-ZIL8_VL); cadeia pesada variável de ZIL9 (SEQ ID NO: 83; CAN-ZIL9_VH), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 84; CAN-ZIL9_VH), cadeia leve variável de ZIL9 (SEQ ID NO: 85; CAN-ZIL9_VL), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 86; CAN-ZIL9_VL); cadeia pesada variável de ZIL11 (SEQ ID NO: 87; CAN-ZIL11_VH), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 88; CAN-ZIL11_VH), cadeia leve variável de ZIL11 (SEQ ID NO: 89; CAN-ZIL11_VL), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 90; CAN-ZIL11_VL); cadeia pesada variável ZIL69 (SEQ ID NO: 91; CAN-ZIL69_VH), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 92; CAN-ZIL69_VH), cadeia leve variável de ZIL69 (SEQ ID NO: 93; CAN-ZIL69_VL), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 94; CAN-ZIL69_VL); cadeia pesada variável de ZIL94 (SEQ ID NO: 95; CAN-ZIL94_VH), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 96; CAN-ZIL94_VH), cadeia leve variável de ZIL94 (SEQ ID NO: 97; CAN-ZIL94_VL), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 98; CAN-ZIL94_VL); cadeia pesada variável de ZIL154 (SEQ ID NO: 99; CAN-ZIL154_VH), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 100; CAN-ZIL154_VH), cadeia leve variável de ZIL154 (SEQ ID NO: 101; CAN-ZIL154_VL), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 102; CAN-ZIL154_VL); cadeia pesada variável de ZIL159 (SEQ ID NO: 103; CAN-ZIL159_VH), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 104; CAN-ZIL159_VH), cadeia leve variável de ZIL159 (SEQ ID NO: 105; CAN-ZIL159_VL), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 106; CAN-ZIL159_VL); cadeia pesada variável de ZIL171 (SEQ ID NO: 107; CAN-ZIL171_VH), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 108; CAN-ZIL171_VH), cadeia leve variável de ZIL171 (SEQ ID NO: 109; CAN-ZIL171_VL), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 110; CAN-ZIL171_VL).
[0265]Os nove anticorpos monoclonais acima mencionados que foram selecionados para caracterização adicional podem ser referidos em outro lugar no relatório descritivo, Figuras ou reivindicações como ZIL1, ZIL8, ZIL8, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159 e ZIL171.
1.7. Construção de anticorpos recombinantes quiméricos e completamente caninos
[0266]Os domínios variáveis de anticorpos são responsáveis pela ligação ao antígeno. Espera-se que o enxerto de todo o domínio variável na respectiva região constante tenha pouco ou nenhum impacto na capacidade do anticorpo de se ligar ao imunógeno IL-31. Para confirmar simultaneamente que a sequência correta das regiões variáveis da cadeia pesada e leve foram identificadas e para produzir material homogêneo, os vetores de expressão foram projetados para produzir anticorpos quiméricos recombinantes ou totalmente caninos em sistemas de expressão de mamíferos. Os anticorpos quiméricos descritos aqui consistem na sequência variável (tanto CDR quanto estrutura) do anticorpo da espécie hospedeira enxertado nas respectivas regiões constantes pesadas e leves de uma molécula de IgG felina ou canina (por exemplo; variável de camundongo: constante canina é referida como camundongo: quimera canina). Os anticorpos totalmente caninos descritos aqui consistem na sequência variável (tanto CDR como estrutura) do anticorpo da espécie hospedeira (canino) enxertado nas respectivas regiões constantes de cadeia pesada e leve da molécula de IgG canina. As sequências de DNA sintético foram construídas para as sequências pesada variável (VH) e leve variável (VL) de anticorpos selecionados. Estas sequências contêm sítios de endonuclease de restrição únicos, uma sequência de consenso Kozak e um líder de secreção N-terminal para facilitar a expressão e secreção do anticorpo recombinante de uma linhagem celular de mamífero.
[0267]Para camundongo: quimeras felinas, cada região variável respectiva foi clonada em um plasmídeo de expressão de mamífero contendo a IgG pesada felina (SEQ ID NO: 173; Felina_HC_AleloA_1) a sequência de nucleotídeo correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 174; Felina_HC_AleloA_1) ou de cadeia leve (SEQ ID NO: 175; Felina_LC_Kappa_G_minus), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 176; Felina_LC_Kappa_G_minus) regiões constantes. Para camundongo: quimeras caninas ou anticorpos totalmente caninos, cada camundongo ou região variável canina foi clonada em um plasmídeo de expressão de mamífero contendo a IgG pesada canina (SEQ ID NO: 177; Canina_HC_65_1), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 178; Canina_HC_65_1) ou cadeia leve (SEQ ID NO: 179; Canina_LC_Kappa), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 180; Canina_LC_Kappa) regiões constantes. Os plasmídeos que codificam cada cadeia pesada e leve, sob o controle do promotor CMV, foram cotransfectados em células HEK 293 usando métodos padrão. Após seis dias de expressão, mAbs quiméricos foram purificados a partir de 50 ml de sobrenadantes de células HEK293FS transitoriamente transfectadas usando resina de proteína A MabSelect Sure (GE Healthcare, Uppsala, Suécia) de acordo com métodos padrão para purificação de proteínas. As frações eluídas foram reunidas, concentradas a ~500 μl usando um dispositivo centrífugo Nanosep Omega de corte de MW nominal de 10.000 (Pall Corp., Port Washington, NY), dialisadas durante a noite a 4 °C em 1x PBS, pH 7,2 e armazenado a 4 °C para uso posterior. A afinidade e a potência baseada em células de anticorpos recombinantes selecionados são descritas abaixo.
[0268]A Figura 2 detalha a afinidade de anticorpos com CDRs derivados de origem de camundongo usando Biacore. A Figura 2a mostra a afinidade dos anticorpos 11E12 e 15H05 anti-IL-31 de camundongo e as afinidades correspondentes das formas felinas e caninas quiméricas para ambas as superfícies de IL-31 felina e canina. Estas observações confirmam a sequência correta para ambos os anticorpos de camundongo e indicam que a conversão para os resultados da forma quimérica em anticorpos com afinidade equivalente ou superior quando comparados ao progenitor do camundongo com exceção do camundongo: quimera 15H05 felino que perdeu alguma afinidade para IL-31 espécie como resultado de sua conversão à forma quimérica. Formas totalmente de camundongo e quiméricas dos anticorpos 11E12 e 15H05 também foram testadas quanto à atividade nos ensaios celulares caninos e felinos descritos na seção 1.5. A Figura 3 mostra os resultados para esses ensaios. Os anticorpos de camundongo 11E12 e 15H05 foram testados quanto à atividade contra tipos de células caninas e felinas usando IL-31 canina e felina para estimular a sinalização. A potência de ambos os anticorpos de camundongo foi comparável contra células caninas e felinas usando a citocina felina com exceção de 15H05 contra IL-31 felina em células FCWF4 felinas que mostram um ligeiro aumento em IC50. O camundongo 15H05 foi capaz de bloquear a sinalização de IL-31 canina em células felinas e caninas com a potência no ensaio canino sendo ligeiramente superior. Estes resultados indicam que os respectivos epítopos reconhecidos por estes anticorpos existem em IL-31 canina e felina e a ligação destes anticorpos é capaz de neutralizar a sinalização celular mediada por receptor em uma linhagem celular relevante de ambas as espécies.
[0269]A Figura 3 também descreve a potência de quimeras selecionadas em ambos os ensaios celulares. A conversão de anticorpos de camundongo em quimeras felinas e caninas teve um impacto mínimo na potência contra a IL-31 felina no ensaio de potência felina (intervalo IC50 1,15 a 3,45 μg/ml). Resultados semelhantes foram observados quando essas quimeras foram testadas contra a sinalização de IL-31 felina na linhagem celular DH82 canina com um ligeiro aumento na potência (IC50 = 0,71 μg/ml) observada para o camundongo 15H05: quimera canina. Em geral, houve um aumento nos valores de IC50 contra IL-31 canina em ambos os tipos de células caninas e felinas. O camundongo: quimera 15H05 felino foi ligeiramente menos potente neste formato de ensaio em comparação com o camundongo: forma canina (IC50 28,61 vs. 12,49 μg/ml). Consistente com as observações para os anticorpos de camundongo, a conversão em formas quiméricas caninas e felinas resultou em mudanças mínimas na potência.
[0270]Os anticorpos descritos acima que foram identificados a partir de células B únicas de cães imunizados foram construídos como proteínas IgG recombinantes após a identificação de suas sequências de domínio variável. O enxerto desses domínios variáveis no Fc da cadeia pesada canina (isotipo 65_1) resultou na geração de anticorpos totalmente caninos recombinantes. Era de interesse identificar anticorpos caninos adicionais que se ligam à IL-31 felina tipo selvagem e cuja ligação foi diminuída ao mutante de IL-31 15H05 felino (isto é, são direcionados ao epítopo 15H05). Estes anticorpos obtidos a partir desta fonte alternativa (canino vs. camundongo) fornecem paratopos adicionais (a porção do anticorpo que reconhece a proteína IL-31, inclui CDRs) reconhecendo o epítopo 15H05, aumentando assim a diversidade de anticorpos com diferentes propriedades físicas para selecionar.
[0271]A Figura 4 mostra os resultados obtidos para a ligação desses anticorpos caninos recombinantes a várias proteínas usando os métodos ELISA e Biacore. Para o método ELISA indireto, a ligação do anticorpo às proteínas mutantes de IL-31 15H05 tipo selvagem e felina foi avaliada. Todos os nove anticorpos monoclonais caninos (ZIL1, ZIL8, ZIL8, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159 e ZIL171) foram capazes de se ligar a IL-31 felina tipo selvagem e a ligação foi impactada por mutações na região do epítopo mAb 15H05 confirmando o correto fenótipo de ligação determinado durante a triagem inicial usado para identificá-los. Em comparação, o anticorpo 11E12 ligado à IL-31 felina tipo selvagem e sua ligação não foi afetada pelas mutações na região do epítopo 15H05, conforme evidenciado pelos dados na Figura
4. Para confirmar a ligação, a análise Biacore foi realizada usando canino, proteínas de IL-31 felina, equina, humana, mutante 15H05 felina e mutante 11E12 felina como superfícies e uma única concentração de teste de anticorpo. Semelhante às observações de ELISA, todos os anticorpos testados ligaram-se à IL-31 felina tipo selvagem. De acordo com os dados descritos acima nesta seção, os anticorpos de camundongo 11E12 e 15H05 se ligaram a superfícies de IL-31 canina e felina. Três anticorpos adicionais mostraram ter esta propriedade de ligação dupla, ZIL69 (ligação canina parcial), ZIL94 e ZIL159. Deste grupo de nove anticorpos totalmente caninos, apenas ZIL1 e ZIL9 apresentaram reação cruzada com IL-31 equina. De notar, o anticorpo 15H05 foi o único de todos os aqui ensaiados que se ligou à IL-31 canina, felina e equina, indicando algum nível de conservação de epítopo nas três espécies.
Em contraste, nenhum dos anticorpos aqui descritos se ligou à IL-31 humana.
Superfícies Biacore adicionais foram usadas para verificar as observações de ELISA que mostram a ligação diferencial de anticorpos à IL-31 felina tipo selvagem e duas proteínas com mutações nos epítopos 15H05 (mutante 15H05) ou 11E12 (mutante 11E12). Como esperado, o anticorpo de controle de camundongo 11E12 ligou-se ao mutante 15H05 IL-31 e não se ligou ao mutante 11E12 IL-31 devido a mutações no epítopo. Da mesma forma, o 15H05 de camundongo não se ligou ao mutante 15H05 e reteve a ligação ao mutante 11E12 IL-31, distinguindo ainda os epítopos de ligação separados reconhecidos por estes dois anticorpos. De acordo com os resultados do ELISA, todos os anticorpos totalmente caninos foram impactados pela mutação 15H05, com exceção de ZIL94, ZIL154 e ZIL171 (parcialmente afetados). Resultados divergentes podem ser atribuídos a diferenças nas duas metodologias de ensaio.
Além disso, a ligação de três anticorpos também mostrou ser afetada pela mutação 11E12; ZIL1 (parcialmente efetuado), ZIL8 e ZIL159. Estes resultados indicam que o epítopo reconhecido por esses anticorpos é impactado por alterações em ambas as regiões da proteína IL-31. Tomados em conjunto, estes resultados suportam a caracterização de nove anticorpos derivados de células B caninas que partilham a ligação a uma região na proteína IL-31 felina que é reconhecida pelo anticorpo 15H05.
1.8. Felinização dos anticorpos 11E12 e 15H05 murinos e otimização das afinidades de ligação
[0272]A geração de anticorpos antifármaco (ADAs) pode ser associada à perda de eficácia para qualquer proteína bioterapêutica, incluindo anticorpos monoclonais. A avaliação abrangente da literatura mostrou que a especiação de anticorpos monoclonais pode reduzir a propensão para mAbs serem imunogênicos, embora exemplos de mAbs totalmente humanos imunogênicos e mAbs quiméricos não imunogênicos possam ser encontrados. Para ajudar a mitigar os riscos associados à formação de ADA para os anticorpos monoclonais anti-IL-31 fornecidos neste documento, uma estratégia de felinização foi empregada. Esta estratégia de felinização é baseada na identificação da sequência de anticorpos da linhagem germinativa felina mais apropriada para o enxerto de CDR. Após análise extensiva de todas as sequências de linhagem germinativa felina disponíveis para ambas as cadeias pesadas e leves variáveis, os candidatos de linhagem germinativa foram selecionados com base em sua homologia com os mAbs de camundongo, e as CDRs dos mAbs progenitores de camundongo foram usadas para substituir as CDRs felinas nativas. O objetivo era reter alta afinidade e atividade baseada em células usando estruturas de anticorpos felinos para minimizar o potencial de imunogenicidade in vivo.
Os mAbs felinizados foram expressos e caracterizados por sua afinidade para IL-31 felina e sua potência em ensaios baseados em células. No caso de um anticorpo felinizado perder sua capacidade de se ligar a IL-31, uma disseção sistemática foi realizada para identificar; 1) a cadeia responsável pela perda de função, 2) a estrutura responsável pela perda de função e 3) o(s) aminoácido(s) responsável(is) pela perda de função.
[0273]Foram feitos construtos de nucleotídeos sintéticos que representam as cadeias pesadas e leves variáveis felinizadas dos mAbs 11E12 e 15H05. Após a subclonagem de cada cadeia variável em plasmídeos contendo a respectiva região constante kappa ou pesada felina, os plasmídeos foram cotransfectados para a expressão de anticorpos em células HEK 293. As tentativas iniciais de felinização do anticorpo 11E12 focaram na utilização de uma única estrutura VH felina (SEQ ID NO: 111; FEL_11E12_VH1), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 112; FEL_11E12_VH1) emparelhada independentemente com estruturas VL (SEQ ID NO: 113; FEL_11E12_VL1) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 114; FEL_11E12_VL1) e (SEQ ID NO:
115; FEL_11E12_VL2) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é
(SEQ ID NO: 116; FEL_11E12_VL2) para formar 11E12 1.1 Felino e 11E12 1.2 Felino respectivamente.
Esta tentativa de especiação resultou em uma perda de afinidade com 11E12 1.1 Felino para as proteínas IL-31 felinas e caninas e uma perda total de ligação com o mAb 11E12 1.2 Felino quando comparado com a forma de camundongo do anticorpo (Figura 2b). A potência desses anticorpos especificados foi testada nos ensaios de células DH82 e FCWF4 Felino usando a citocina IL-31 felina.
O 11E12 1.1 felinizado teve uma diminuição de aproximadamente duas vezes na potência contra a
IL-31 felina no ensaio de FCWF felino quando comparado com a versão de camundongo do anticorpo.
De acordo com a perda de afinidade para 11E12 1.2 felinizado, uma perda completa de potência celular foi observada para este anticorpo
(Figura 3). Com base na experiência anterior durante a caninização do ortólogo mAb
11E12, uma estratégia semelhante foi realizada na tentativa de restaurar a perda de afinidade para a felinização (Patente US No 8.790.651 de Bammert, et al.). A substituição da região da estrutura 2 felinizada (FW2) de 11E12 VL1 Felino com o
FW2 de camundongo de (SEQ ID NO: 73; Mu_11E12_VL) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 74; Mu_11E12_VL) foi feita para gerar 11E12 Felino VL1 FW2. Além disso, uma única substituição na posição 46 do VL felino (K46Q) foi realizada para gerar (SEQ ID NO: 119;
FEL_11E12_VL1_K46Q) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é
(SEQ ID NO: 120; FEL_11E12_VL1_K46Q). O emparelhamento dos VLs acima com
Fel_11E12_VH1 resultou em 11E12 1.1 FW2 Felino e 11E12 1.1 K46Q Felino respectivamente.
A alteração de FW2 resultou em uma restauração da afinidade para
11E12 1.1 FW2 Felino para a proteína IL-31 felina resultando em uma KD equivalente ao do camundongo e forma quimérica (Figura 2A e 2B). Estas alterações, no entanto,
tiveram um efeito prejudicial na afinidade do 11E12 1.1 FW2s Felino para a proteína IL-31 canina, indicando uma distinção clara na natureza da capacidade do anticorpo 11E12s para se ligar a este epítopo na citocina felina e canina. A substituição de um único aminoácido em 11E12 1.1 K46Q Felino não foi capaz de influenciar a afinidade deste anticorpo. O aumento da afinidade do anticorpo 11E12 1.1 FW2 para a proteína IL-31 felina resultou no aumento da potência contra a citocina felina no ensaio DH82 canino (Figura 3).
[0274]Os esforços de felinização com anticorpo de camundongo 15H05 focaram nas combinações de três estruturas VH felinas com três estruturas VL felinas para um total de 9 mAbs felinizados. FEL_15H05_VH1 (SEQ ID NO: 121; FEL_15H05_VH1) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 122; FEL_15H05_VH1) foi combinada com (SEQ ID NO: 127; FEL_15H05_VL1) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 128; FEL_15H05_VL1), (SEQ ID NO: 129; FEL_15H05_VL2) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 130; FEL_15H05_VL2) e (SEQ ID NO: 131; FEL_15H05_VL3) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 132; FEL_15H05_VL3) para criar 15H05 1.1 felino, 15H05
1.2 felino e 15H05 1.3 felino respectivamente. FEL_15H05_VH2 (SEQ ID NO: 123; FEL_15H05_VH2) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 124; FEL_15H05_VH2) foi combinada com (SEQ ID NO: 127; FEL_15H05_VL1) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 128; FEL_15H05_VL1), (SEQ ID NO: 129; FEL_15H05_VL2) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 130; FEL_15H05_VL2) e (SEQ ID NO: 131; FEL_15H05_VL3) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 132; FEL_15H05_VL3) para criar 15H05 2.1 Felino, 15H05
2.2 Felino e 15H05 2.3 Felino, respectivamente. FEL_15H05_VH3 (SEQ ID NO: 125; FEL_15H05_VH3) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ
ID NO: 126; FEL_15H05_VH3) foi combinada com (SEQ ID NO: 127; FEL_15H05_VL1) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 128; FEL_15H05_VL1), (SEQ ID NO: 129; FEL_15H05_VL2) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 130; FEL_15H05_VL2) e (SEQ ID NO: 131; FEL_15H05_VL3) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 132; FEL_15H05_VL3) para criar 15H05 3.1 Felino, 15H05
3.2 Felino e 15H05 3.3 Felino, respectivamente. Semelhante às observações com o anticorpo 11E12, a primeira tentativa de felinização do anticorpo 15H05 resultou em uma perda de afinidade para a proteína IL-31 felina quando comparada com 15H05 de camundongo e um efeito neutro quando comparado à quimera felina de camundongo 15H05 (Figura 2A e 2C) semelhante às observações com a ligação do anticorpo felinizado 11E12 à IL-31 canina, certas combinações de estruturas VH e VL de 15H05 felino tiveram um impacto neutro a positivo na afinidade para IL-31 canina (ver Figura 2C 15H05 1.1, 2.2 e 3.2 Felino).
[0275]Em um esforço para restaurar a afinidade do anticorpo 15H05 felinizado, cada VH 15H05 felinizado foi emparelhado com o VL 15H05 de camundongo para gerar anticorpos heteroquiméricos. FEL_15H05_VH1 (SEQ ID NO: 121; FEL_15H05_VH1) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 122; FEL_15H05_VH1) foi combinada com MU_15H05_VL (SEQ ID NO: 69; MU_15H05_VL) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO): 70; MU_15H05_VL) para gerar VL de camundongo VH1 15H05 Felino.
FEL_15H05_VH2 (SEQ ID NO: 123; FEL_15H05_VH2) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 124; FEL_15H05_VH2) foi combinada com MU_15H05_VL (SEQ ID NO: 69; MU_15H05_VL) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO) : 70; MU_15H05_VL) para gerar VL de camundongo 15H05 VH2 Felino. FEL_15H05_VH3 (SEQ ID NO: 125; FEL_15H05_VH3) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ
ID NO: 126; FEL_15H05_VH3) foi combinada com MU_15H05_VL (SEQ ID NO: 69; MU_15H05_VL) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO): 70; MU_15H05_VL) para gerar VL de camundongo 15H05 VH3 Felino. Estas heteroquimeras VL de camundongos VH felinizados foram analisadas quanto à sua afinidade para IL-31 canina e felina. O emparelhamento de 15H05 VH1 e VH3 felinizado com VL de 15H05 de camundongo restaurou a afinidade para IL-31 felina a um equivalente ou melhor do que as formas de camundongo e quiméricas. Esta tendência na afinidade melhorada também foi observada para a proteína IL-31 canina (Figura 2A e 2C).
[0276]Para dissecar ainda mais as posições nas estruturas de 15H05 responsáveis pela perda de afinidade, um único VH felinizado de 15H05 (FEL_15H05_VH1) foi usado para emparelhar com substituições de estrutura individuais a partir de camundongo 15H05 VL. FEL_15H05_VH1 (SEQ ID NO: 122; FEL_15H05_VH1) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 123; FEL_15H05_VH1) foi combinada independentemente com FEL_15H05_VL1_FW1 (SEQ ID NO: 133; FEL_15H05_VL1_FW1) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 134; FEL_15H05_VL1_FW1), FEL_15H05_VL1_FW2 (SEQ ID NO: 135; FEL_15H05_VL1_FW2) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 136; FEL_15H05_VL1_FW2) e FEL_15H05_VL1_FW3 (SEQ ID NO: 137; FEL_15H05_VL1_FW3) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 138; FEL_15H05_VL1_FW3) para criar 15H05 1.1 FW1 Felino, 15H05
1.1 FW2 Felino e 15H05 1.1 FW3 Felino respectivamente. A substituição de camundongo 15H05 FW1 por 15H05 1.1 Felino foi prejudicial à afinidade para IL-31 felina e canina, entretanto, quando FW2 ou FW3 camundongos foram substituídos por 15H05 1.1 Felino, excelente afinidade foi obtida para IL-31 canina e felina com o FW2 sendo superior para ambas as espécies (A Figura 2C). Substituições de estrutura em pares adicionais foram realizadas para determinar a extensão de modulação de afinidade por este método. FEL_15H05_VH1 (SEQ ID NO: 121; FEL_15H05_VH1) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 122; FEL_15H05_VH1) foi combinada independentemente com FEL_15H05_VL1_FW1_2 (SEQ ID NO: 139; FEL_15H05_VL1_FW1_FW2) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 140; FEL_15H05_VL1_FW1_FW2), FEL_15H05_VL1_FW2_3 (SEQ ID NO: 143; FEL_15H05_VL1_FW2_FW3) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 144; FEL_15H05_VL1_FW2_FW3) e FEL_15H05_VL1_FW1_3 (SEQ ID NO: 141; FEL_15H05_VL1_FW1_FW3) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 142; FEL_15H05_VL1_FW1_FW3) para fornecer 15H05 1.1 FW1_2 Felino, 15H05 1.1 FW2_3 Felino e 15H05 1.1 FW1_3 Felino respectivamente.
Curiosamente, a substituição de FW1 de camundongo sozinho foi prejudicial para a afinidade enquanto as combinações de FW1 com FW2 ou FW3 resultaram em boa afinidade para IL-31 felina e canina (Figura 2C).
[0277]Finalmente, foi feita uma tentativa de minimizar o número de retromutações nas estruturas felinas começando com as combinações mais promissoras de sequências VH e VL felinizadas. Para isso, FEL_15H05_VH1 (SEQ ID NO: 121; FEL_15H05_VH1) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 122; FEL_15H05_VH1) foi combinada independentemente com FEL_15H05_VL1_FW2_K42N (SEQ ID NO: 145; FEL_15H05_VL1_FW2_K42N) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 146; FEL_15H05_VL1_FW2_K42N), FEL_15H05_VL1_FW2_V43I (SEQ ID NO: 147; FEL_15H05_VL1_FW2_V43I) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 148; FEL_15H05_VL1_FW2_V43I), FEL_15H05_VL1_FW2_L46V (SEQ ID NO: 149; FEL_15H05_VL1_FW2_L46V) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 150;
FEL_15H05_VL1_FW2_L46V), FEL_15H05_VL1_FW2_Y49N (SEQ ID NO: 151; FEL_15H05_VL1_FW2_Y49N) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 152; FEL_15H05_VL1_FW2_Y49N) e FEL_15H05_VL1_FW2_K42N_V43I (SEQ ID NO: 153; FEL_15H05_VL1_FW2_K42N_V43I) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 154; FEL_15H05_VL1_FW2_K42N_V43I) para fornecer 15H05 1.1 K42N Felino, 15H05 1.1 V43I Felino, 15H05 1.1 L46V Felino, 15H05 1.1 Y49N Felino e 15H05 1.1 K42N_V43I Felino respectivamente. Enquanto a substituição de toda a estrutura de FW2 de camundongo em 15H05 VL1 felinizado resultou em um anticorpo com excelente afinidade para IL-31 canina e felina (Figura 2C, 15H05 1.1 FW2 Felino), as retromutações individuais de resíduos de aminoácido FW2 tiveram um efeito neutro ou prejudicial indicando que todas as 4 substituições são necessárias para manter a estrutura terciária ótima para o posicionamento das CDRs no epítopo da IL-31. A afinidade aumentada de 15H05 1.1 FW2 felinizado para IL-31 felina e canina levou à seleção deste anticorpo para trabalho posterior.
[0278]A Figura 5A mostra um alinhamento de sequência de 11E12 VL de anticorpo de camundongo comparando previamente sequência de 11E12 caninizada referenciada às versões felinizadas. Observado abaixo do alinhamento são pontos que mostram as posições de alterações relevantes para Fel_11E12_VL1 que foram necessárias para restaurar a afinidade deste anticorpo para a proteína IL-31. Do mesmo modo, a Figura 5B mostra as alterações necessárias ao 15H05 VL felinizado (Fel_15H05_VL1) que foram necessárias não apenas para restaurar, mas melhorar, sua afinidade à IL-31 canina e felina quando comparada às formas de camundongo e quiméricas deste anticorpo.
1.9. Geração de linhagens celulares que expressan anticorpos anti-IL-31 felinizados a partir de plasmídeos de Glutamina sintetase (GS)
[0279]15H05 1.1 FW2 felinizado foi escolhido como um candidato para a geração de linhagens celulares estáveis que produziriam um fornecedor homogêneo do anticorpo para caracterização posterior. Os genes que codificam as cadeias pesadas e leves felinizadas para a produção de linhagem celular foram clonados em pEE 6.4 e pEE 12.4 de plasmídeos GS respectivamente (Lonza, Basel, Switzerland).
Os plasmídeos resultantes foram digeridos de acordo com o protocolo do fabricante e ligados para formar um único plasmídeo de expressão de mamífero. Para ZTS-927, a cadeia pesada é (SEQ ID NO: 121; FEL_15H05_VH1) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 122; FEL_15H05_VH1) combinada com constante de cadeia pesada de IgG felina (SEQ ID NO: 171; Felina_HC_AleloA_wt) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 172; Felina_HC_AleloA_wt). Para ZTS-927, a cadeia leve é (SEQ ID NO: 135; FEL-15H05- VL1_FW2) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 136; FEL-15H05-VL1_FW2) combinada com constante de cadeia leve de IgG felina (SEQ ID NO: 175; Felina_LC_Kappa_G_minus) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 176; Felina_LC_Kappa_G_minus). Para ZTS-361, a cadeia pesada é (SEQ ID NO: 121; FEL_15H05_VH1) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 122; FEL_15H05_VH1) combinada com constante de cadeia pesada de IgG felina (SEQ ID NO: 173; Felina_HC_AleloA_1) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 174; Felina_HC_AleloA_1). Para ZTS-361, a cadeia leve é (SEQ ID NO: 135; FEL-15H05-VL1_FW2) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 136; FEL-15H05-VL1_FW2) combinada com constante de cadeia leve de IgG felina (SEQ ID NO: 175; Felina_LC_Kappa_G_minus) a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 176; Felina_LC_Kappa_G_minus).
[0280]Para demonstrar a produção transitória de anticorpo, cada plasmídeo foi usado para transfectar células HEK 293 e a expressão foi realizada em culturas de vários tamanhos. A proteína foi isolada de meio HEK condicionado usando cromatografia de afinidade em Proteína A de acordo com métodos de purificação de proteína padrão. O meio foi carregado em resina cromatográfica e eluído por mudança de pH. A proteína eluída foi ajustada para pH, dialisada e esterilizada por filtração antes do uso. O ZTS-361 foi subsequentemente usado para avaliação no modelo de prurido do gato para avaliar a eficácia in vivo. Os anticorpos produzidos a partir de um único plasmídeo GS, ZTS-927 e ZTS-361, foram testados quanto à afinidade e potência. A Figura 2D mostra os resultados para a avaliação da afinidade desses anticorpos usando Biacore. A afinidade de ZTS-927 e ZTS-361 para a IL-31 felina é altamente consistente com a do camundongo e a forma quimérica do mAb 15H05 de camundongo progenitor. A potência destes dois anticorpos foi determinada contra IL- 31 canina e felina usando ensaios de células caninas e felinas (Figura 3). Consistente com observações anteriores, os valores de IC50 foram proporcionalmente mais altos quando se usou a forma canina de IL-31 com ambos os tipos de células. Os valores de IC50 para ZTS-927 e ZTS-361 contra IL-31 felina também foram altamente consistentes com os valores derivados da forma quimérica e de camundongo do anticorpo, indicando que a versão final felinizada do mAb 15H05 produzido a partir de um único plasmídeo GS era adequado para o desenvolvimento de linhagem celular.
[0281]Para a geração de uma linhagem celular estável produzindo anticorpos candidatos, o plasmídeo GS foi linearizado antes da transfecção com a enzima de restrição, PvuI, que corta em um único sítio na estrutura do plasmídeo. As células GS- CHOK1SV (clone 144E12) foram transfectadas com DNA de plasmídeo linearizado por eletroporação. Após a transfecção, as células foram plaqueadas em placas de 48 poços (48 WP) para gerar pools estáveis. Quando os pools foram pelo menos 50 % confluentes nos 48 WPs, 100 μl do sobrenadante foram analisados para expressão de IgG usando o Octeto ForteBio e biossensores de proteína A (Pall ForteBio, Fremont, CA). Os clones de melhor expressão foram escalados em placas de 6 poços
(6 WP) e, em seguida, em frascos de agitação de 125 mL (SF). Uma vez que as células se adaptaram à cultura em suspensão em frascos de 125 mL, 2 frascos de cada pool de linhagem celular foram armazenados para armazenamento de LN. Uma vez que as linhas de células de fabricação devem ser clonais, os 3 principais pools de maior expressão foram subclonados por diluição limitante em placas de cultura de 96 poços.
A fim de provar a clonalidade e evitar uma segunda rodada de diluição limitante, placas de 96 poços foram fotografadas usando Molecular Devices Clone-Select Imager (CSI) (Molecular Devices LLC, San Jose, CA) que captura imagens de células únicas e seu crescimento subsequente. Os clones foram selecionados com base em imagens de CSI bem-sucedidas, crescimento e produção em 96 WPs.
[0282]A fim de avaliar o crescimento e a produtividade da cultura celular, os pools de expressão superior foram avaliados adicionalmente em um lote alimentado por 14 dias em 125 mL de SFs. As células foram semeadas em meio de plataforma e alimentos consistindo em CD CHO da Life Technologies mais 4 aminoácidos, alimento proprietário CDF v6.2 e 10 % de glicose. Após o Fed-Batch de 14 dias, os pools foram centrifugados e o mAB produzido por CD CHO foi isolado por filtração do sobrenadante através de uma membrana de polietersulfona (PES) de 0,20 µm antes da purificação.
[0283]Uma purificação típica consiste em dois litros de meio condicionado (da cultura de células CHO, 0,2 µm filtrado) carregado em uma coluna de 235 mL de MabSelect (GE Healthcare, cat #17-5199-02). A coluna foi pré-equilibrada com PBS.
A amostra foi carregada em um tempo de residência de >2,5 minutos. Após o carregamento, a coluna foi lavada novamente com PBS e, em seguida, com acetato de sódio 25 mM, pH neutro. A coluna foi eluída com ácido acético 25 mM, pH 3,6 e, em seguida, purificada com ácido acético 250 mM, cloreto de sódio 250 mM, pH ~2,2.
As frações (50 mL) foram coletadas durante as etapas de eluição e remoção. A absorvância de UV em A280 foi monitorada ao longo. As frações de pico foram reunidas, o pH ajustado para ~5,5 com a adição de acetato de sódio 20 mM e, em seguida, dialisadas contra três trocas de tampão. O dialisado foi coletado, esterilizado por filtração e armazenado a 4 °C.
1.10. Identificação do epítopo em IL-31 reconhecida por anticorpo 15H05
[0284]O conhecimento do epítopo em IL-31 que é reconhecido por um anticorpo é crítico para compreender o mecanismo pelo qual ele neutraliza a citocina da ligação ao co-receptor IL-31Ra: OSMR. Além disso, conhecer o epítopo permite (mas não está limitado a) otimização da afinidade de ligação do anticorpo e projeto de miméticos de epítopos peptídicos (mimotopos) que podem ter grande utilidade como reagentes de captura analítica e como vacinas de subunidade para eliciar uma resposta imune focada relevante. Um processo de várias etapas usando a tecnologia CLIPS (Ligação Química de Peptídeos em Scaffolds) (Timmerman et al. J Mol Recognit. 2007; 20 (5): 283-299) foi usado para identificar e otimizar um peptídeo capaz de se ligar ao paratopo do mAb 15H05 (Pepscan, Lelystad Holanda). A afinidade do mAb 15H05 para as proteínas IL-31 caninas e felinas é alta (Figura 2, MU-15H05), então a sequência primária de ambas as espécies de IL-31 foi considerada relevante para este esforço. Uma biblioteca de microarranjos de peptídeos representando a proteína IL-31 canina foi criada e usada para identificar peptídeos capazes de se ligar ao mAb 15H05 usando um ELISA indireto. Após a identificação de peptídeos cujas sequências de aminoácidos primários representam a região de ligação do mAb 15H05 em IL-31, uma análise de substituição completa foi realizada usando peptídeos que representam um segmento de IL-31 e substituindo cada um dos 12 aminoácidos nesta região de ligação de mAb 15H05 com os outros 19 resíduos de aminoácidos possíveis em cada posição. Esta análise foi essencial para identificar os principais resíduos de aminoácidos na IL-31 envolvidos com a ligação do mAb 15H05 e também demonstrou onde as substituições na sequência primária canina levam a um aumento da ligação do anticorpo.
[0285]Os aminoácidos na proteína IL-31 canina que são reconhecidos pelo anticorpo 11E12 foram descritos anteriormente (Patente US No 8.790.651 de Bammert, et al.). Aí foi descrita a análise mutacional da proteína IL-31 canina mostrando posições na proteína IL-31 canina que afetam a ligação do mAb 11E12 quando convertido em alanina. Com base na análise de substituição completa descrita para mAb 15H05 acima e conhecimento prévio do epítopo de ligação de 11E12, formas mutantes da proteína IL-31 felina foram criadas substituindo alanina por dois resíduos-chave no epítopo reconhecido por cada anticorpo (mutantes descritos em seção 1.2 acima). As mutações para cada epítopo foram nomeadas de acordo com o anticorpo que reconhece o sítio da mutação (mutante 11E12 e 15H05 vs. a sequência da proteína tipo selvagem nativa).
[0286]A Figura 6A mostra o alinhamento de IL-31 felina tipo selvagem (SEQ ID NO: 157) com os mutantes 15H05 (SEQ ID NO: 163) e 11E12 (SEQ ID NO: 161) destacando as posições onde ocorrem as substituições de alanina. IL-31 pertence à família IL-6 de citocinas com os quatro feixes helicoidais possuindo uma arquitetura para cima e para baixo (banco de dados CATH, Dawson et al. 2017 Nucleic Acids Res. 4 de janeiro de 2017; 45 (problema do banco de dados): D289–D295). Um modelo de homologia foi gerado com base na estrutura 1P9M de IL-6 humana (Boulanger et al. 2003 Science. 27 de junho; 300 (5628): 2101-4) usando o software MOE (Chemical Computing Group, Montreal, QC, Canadá). A Figura 6B mostra o modelo de homologia de IL-31 felina destacando as posições dos aminoácidos envolvidos com a ligação dos anticorpos 11E12 (sítio 1) e 15H05 (sítio 2). Os sítios de ligação para cada anticorpo parecem estar localizados em posições separadas na proteína IL-31.
[0287]Para determinar o impacto da capacidade dos mAbs 11E12 e 15H05 de se ligar a essas formas mutantes de IL-31 felina, um ELISA indireto foi executado usando os mutantes diretamente revestidos em uma placa de imunoensaio. A Figura
6C mostra os resultados para este ELISA demonstrando que os mAbs 11E12 e 15H05 são capazes de se ligar a IL-31 felina tipo selvagem neste formato de ensaio. Quando o mutante 11E12 é usado como uma proteína de captura, a ligação do mAb 11E12 é altamente atenuada e a ligação do mAb 15H05 é parcialmente atenuada. A análise anterior do epítopo 11E12 na IL-31 canina (descrita na Patente US No 8.790.651 de Bammert et al.) indicou que 4 resíduos de aminoácidos impactam a ligação do mAb quando mutado para alanina, então a mutação de 2 resíduos, neste caso, pode não ser suficiente para eliminar completamente a ligação de alta afinidade do mAb 11E12 usando este formato de ELISA. A atenuação menor da ligação do mAb 15H05s ao mutante 11E12 é provavelmente devido aos efeitos translacionais das mutações do movimento das duas hélices frontais que afetam o sítio de ligação 15H05. As mutações concebidas para afetar a ligação do mAb 15H05s (mutante 15H05) mostram uma perda completa da capacidade do mAb 1505s para se ligar a este mutante IL-31 por ELISA. Ao contrário do mutante 11E12, as alterações na espiral aleatória reconhecidas pelo mAb 15H05 (mutante 15H05) não tiveram impacto na ligação do mAb 11E12, apoiando ainda mais a distinção entre os dois epítopos (Figura 6C).
1.11. Avaliação da ligação de competição de mAbs 15H05 e 11E12 usando Biacore
[0288]Para caracterizar ainda mais os epítopos de IL-31 ligados pelos mAbs 15H05 e 11E12, experiências de bloqueio foram realizadas usando Biacore onde a superfície contendo a proteína IL-31 foi gerada seguida pela adição sequencial de anticorpos. A Figura 7 mostra a ligação relativa de cada anticorpo a IL-31 após a captura de 11E12 ou 15H05. As colunas marcadas com HBS-EP (tampão de ensaio) indicam o sinal máximo obtido a partir de cada ligação do anticorpo à superfície de IL- 31 sozinho sem competição. A Figura 7A mostra os dados de ligação de competição para os anticorpos 15H05 e 11E12 de camundongo para IL-31 canina. Estes resultados indicam claramente que os anticorpos 15H05 e 11E12 são capazes de se ligar à IL-31 canina na presença um do outro, indicando que reconheceram epítopos distintos na proteína. Os sensogramas relacionados à Figura 7A mostram que a cinética de dissociação de ambos os anticorpos é muito lenta nesta superfície de Biacore recém-formada, portanto, nenhuma ocupação adicional de sítios de ligação pode ocorrer com a adição do mesmo anticorpo (dados não mostrados).
[0289]A Figura 7B mostra os dados de ligação de competição para os anticorpos 15H05 e 11E12 em uma superfície de IL-31 felina novamente mostrando nenhuma sobreposição no epítopo reconhecido. A ligação de anticorpo adicional na presença do mesmo anticorpo é o resultado da taxa de desativação aumentada devido à qualidade inferior da superfície usada. As taxas de desligamento aumentadas podem ser vistas e comparadas aos valores de KD de superfícies de IL-31 felinas recém-formadas na Figura 2.
[0290]Estes resultados suportam ainda os dados de mapeamento de epítopo na seção 1.10 indicando que um epítopo distinto é reconhecido pelas CDRs contidas no anticorpo MU-15H05 quando comparado com MU-11E12. O epítopo reconhecido pelo anticorpo 15H05 é distinto do anticorpo 11E12 descrito na (Patente US No
8.790.651 de Bammert, et al.) e é um novo alvo na proteína IL-31 para a neutralização da atividade dessas citocinas em várias espécies. Esses achados destacam a relação espacial distinta dos sítios de ligação descritos no modelo de homologia de IL-31 felina (Figura 6B) e apoiam a hipótese de que esta face da citocina é crítica para a interação com o complexo receptor IL-31Ra:OSMR.
1.12. Síntese e caracterização do co-receptor de IL-31 felina solúvel (IL-31RA e OSMR)
[0291]O co-complexo receptor heteromérico de IL-31 humana, consistindo em subunidades IL31Ra e OSMR, mostrou ser necessário para a ativação intercelular mediada por IL31 da via JAK-STAT e tendo envolvimento em doença cutânea atópica (Dillon et al. 2004 Nat Immunol. Jul; 5 (7): 752-60, Dreuw et al. 2004 J Biol Chem. 279:
36112-36120; e Diveu et al. 2004 Eur Cytokine Netw. 15: 291-302). A subunidade Ra de IL-31 humana foi posteriormente descrita como o evento de ligação inicial que ocorre quando IL-31 está em contato com os receptores da superfície celular e este evento é um pré-requisito para o recrutamento de OSMR com subsequente formação de um co-complexo receptor (Le Saux et al. 2010 J Biol Chem. 29 de janeiro; 285 (5): 3470-7). Descrevemos aqui evidências de que a proteína IL-31 felina é capaz de se ligar a OSMR e a IL-31Ra independentemente. Esta observação é nova e tem implicações importantes para a compreensão de como a proteína IL-31 interage com o co-receptor IL-31Ra:OSMR e para o papel biológico da IL-31, pois ela interage independentemente com as subunidades individuais.
[0292]Para permitir a compreensão de como a IL-31 se liga ao seu co-receptor e para caracterizar as propriedades inibitórias dos anticorpos identificados, duas formas de receptor foram sintetizadas. A subunidade individual do receptor de IL-31 IL-31Ra (SEQ ID NO: 169; Felina_IL31Ra_HIgG1_Fc_X1_Fn3), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 170; Felina_IL31Ra_HIgG1_Fc_X1_Fn3), e OSMRH_Fn3_Fc correspondente); a sequência de nucleotídeos para a qual é (SEQ ID NO: 168; Felina_OSMR_hIgG1_Fc) foram ambas construídas como fusões de IgG1 Fc humana. Por homologia com os homólogos humanos, foram identificados os domínios de ligação de citocina, fibronectina III e de tipo Ig. Para avaliar as subunidades de receptor individuais, os domínios extracelulares de OSMR e IL-31Ra (com seu domínio de fibronectina III proximal N-terminal esperado) foram gerados como fusões Fc de IgG1 humana, ambos empregando seus peptídeos de sinal nativos. Todas os cassetes sintéticos foram clonados em pcDNA3.1, expresso no sistema ExpiCHO e purificado como descrito acima.
[0293]Para analisar a capacidade dessas formas de receptor de se ligar às proteínas IL-31 tipo selvagem e mutantes, o ELISA indireto foi executado revestindo
100 µl de cada proteína respectiva em uma placa de 2HB immulon (1 µg/ml) durante a noite em tampão carb/bicarbe (sigma C3041-100CAP) a 4C. As placas de ELISA foram então bloqueadas com 5 % de tampão de bloqueio NFDM em PBST por 1 hora em temperatura ambiente seguido pela ligação de múltiplas concentrações de cada construção de receptor em ambiente por 1 hora. Após a lavagem com PBST, a presença do receptor ligado (fusão Fc) foi identificada usando IgG1 anti-humano de camundongo (Lifetech A10684, diluição 1:500) por 1 hora em temperatura ambiente.
Os poços foram novamente lavados com PBST e desenvolvidos com substrato de micropoços KPL sureblue 3,3’,5,5’-tetra-metilbenzidina (TMB). A Figura 8 mostra os resultados para este ELISA indireto usando formas selvagens e mutantes da proteína IL-31 felina como uma captura. Estes dados demonstram a capacidade do felino tipo selvagem IL-31 de se ligar independentemente às subunidades do receptor IL-31Ra e OSMR. Estas observações estão em contraste com relatórios anteriores que indicam que a proteína IL-31 se liga inicialmente à subunidade IL-31Ra e recruta ainda mais OSMR para o sítio. Como o papel biológico da IL-31 ainda está sendo determinado, é de grande importância entender a dinâmica da ligação ao receptor e as possíveis consequências para a atenuação de seu papel em doenças como a dermatite atópica. Por esta razão, foi dada consideração adicional a essas observações ao caracterizar anticorpos que se ligam a epítopos capazes de interromper a capacidade de IL-31 para reconhecer IL-31Ra e OSMR.
[0294]Na seção 1.2, descrevemos a ligação atenuada dos anticorpos 11E12 e 15H05 aos mutantes com aminoácidos-chave em seus sítios de ligação convertidos em alanina (mutante 11E12 e 15H05, respectivamente). Foi, portanto, de grande interesse compreender o impacto dessas mutações na capacidade de se ligar às subunidades individuais do receptor IL-31Ra e OSMR. A Figura 8 mostra que a mutação no sítio de ligação 11E12 ou 15H05 interrompe completamente a capacidade de IL-31Ra e OSMRs de se ligar, indicando que ambos os anticorpos se ligam a epítopos que são necessários para a interação de IL-31 com ambas as subunidades do receptor. A falta de ligação também pode ser devido a alterações na confirmação de IL-31 resultante da mutação, no entanto, esses mutantes ainda são capazes de se ligar ao anticorpo, o que sugere que este não é o caso. Esta descoberta chave suporta a capacidade de ambos os anticorpos 11E12 e 15H05 (e derivados) em reconhecer epítopos na IL-31 que neutralizam a capacidade das citocinas de sinalizar através de seu co-receptor e bloquear ainda mais a associação celular da citocina a qualquer receptor durante este processo. Estes dados suportam a identificação de anticorpos que são capazes de remover IL-31 da circulação e torná-la incapaz de se ligar à superfície celular ou a formas solúveis de receptor.
1.13. Avaliação in vivo de anticorpos quiméricos em um modelo de desafio de prurido de IL-31 felina
[0295]A capacidade de um anticorpo neutralizar efetivamente seu alvo pode ser avaliada in vitro através do exame de ligação a um epítopo relevante na proteína alvo com a afinidade e potência apropriadas em ensaios baseados em células que permitem extrapolação para potência in vivo. Descritos acima estão as etapas dadas para caracterizar duas séries de anticorpos gerados a partir dos mAbs progenitores de camundongo 11E12 e 15H05. A seção 1.7 descreve a geração de camundongo: formas quiméricas felinas de mAbs 11E12 e 15H05 com uma afinidade resultante para IL-31 canina e felina que são comparáveis ao anticorpo monoclonal de camundongo original (Figura 2A). O camundongo: as formas quiméricas felinas de 11E12 e 15H05 também tinham valores de IC50 comparáveis mostrando a inibição da sinalização pSTAT3 induzida por IL-31 felina em células de macrófagos caninos e felinos (Figura 3). Durante o processo de felinização na seção 1.8, mAb 11E12 de camundongo foi convertido para a versão felinizada (11E12 1.1 Felino) com subsequente perda de afinidade para IL-31 canina e felina (Figura 3) e perda de potência contra a sinalização de IL-31 felina em caninos e células felinas (Figura 3). Antes da otimização dos anticorpos 11E12 e 15H05 felinizados descritos na seção 1.8, era de interesse compreender a capacidade dessas formas felinizadas e quiméricas preliminares de neutralizar a atividade pruriginosa da IL-31 felina em um modelo de desafio de gato.
De interesse foi o efeito farmacodinâmico destes diferentes anticorpos na neutralização do prurido e para compreender qualquer correlação com a afinidade, potência celular ou reconhecimento do epítopo que pode influenciar a eficácia. No futuro, uma gama de potência celular que se correlaciona com a eficácia in vivo no modelo de desafio de prurido pode ser preditiva de otimização adicional necessária usando ensaios in vitro.
[0296]Para testar a eficácia preliminar de camundongo: quimera felina 11E12, camundongo: quimera 15H05 felino e 11E12 felinizada (11E12 1.1 Felino), um modelo de prurido induzido por IL-31 em gatos foi desenvolvido. Após uma dose intravenosa de 0,5 μg/kg de IL-31 felina (SEQ ID NO: 159; Felina_IL-31_E_coli), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 160; Felina_IL-31_E_coli), os gatos apresentarão um comportamento pruriginoso transitório isso inclui (mas não está limitado a) lamber, mastigar, coçar e sacudir a cabeça ou o corpo. Esfregar-se contra a gaiola não era considerado uma atividade pruriginosa. As observações pruriginosas ocorrem por um investigador treinado durante 30 minutos antes da administração da proteína IL-31 e durante 1 hora a seguir. Para este estudo, um desafio de linha de base com IL-31 felina foi realizado até 1 mês antes da dosagem com o anticorpo. No dia zero, uma dose de 0,5 mg/kg de anticorpo foi combinada com 0,5 μg/kg de IL-31 felina à temperatura ambiente por 60 minutos antes de injetar o complexo pré-ligado em cada animal. Um controle “sem mAb” foi incluído para um controle. A dose de mAb representa um excesso molar bruto de anticorpo para citocina. A atividade pruriginosa foi monitorada conforme descrito nos dias 0, 7 e 21.
Os resultados na Figura 9 mostram melhora significativa (p <0,05) nas pontuações de prurido com mAb de camundongo: quimera 15H05 felino nos dias 0, 7 e 21 em comparação com o placebo ao controle. Embora a quimera camundongo: 11E12 felino tenha mostrado uma tendência inicial na eficácia no dia zero, ela não atingiu uma redução significativa no prurido em qualquer ponto de tempo quando comparado ao veículo placebo. O 11E12 1.1 felino não reduziu o prurido no dia zero e não mostrou nenhuma tendência na eficácia quando comparado ao veículo placebo, portanto, desafios adicionais de IL-31 nos dias 7 e 21 não foram realizados.
[0297]Tomados em conjunto, esses resultados mostram um delineamento claro entre as atividades desses anticorpos com a falta de eficácia para 11E12 1.1 felino na prevenção de comportamento pruriginoso no gato induzido por IL-31. A perda de afinidade e potência do 11E12 1.1 felino provavelmente resultou na falta de eficácia in vivo. Ao comparar o resultado de eficácia de camundongo: quimera felina 11E12 e camundongo: quimera 15H05 felino, a distinção é mais sutil. As formas quiméricas de ambos os mAbs têm um valor KD comparável ao seu progenitor de camundongo com a afinidade de camundongo: 11E12 felino sendo ligeiramente superior para IL-31 felina e canina (Figura 2A). Esta afinidade aumentada, no entanto, não se traduz diretamente em potência aumentada, pois o camundongo: quimera 15H05 felino tem uma IC50 aumentada de aproximadamente 2 vezes em relação ao camundongo: quimera 11E12 felina contra sinalização pSTAT3 induzida por IL-31 felina em células FCWF4 felinas (Figura 3). Estes dados sugerem que a maneira pela qual as CDRs do anticorpo 15H05 reconhecem a IL-31 felina é superior na neutralização da capacidade das citocinas de sinalizar através de seu co-receptor, por sua vez, tornando-a mais eficaz no bloqueio do prurido em gatos. As diferenças em IC50s observadas nestes ensaios celulares oferecem um meio promissor para prever a potência in vivo e discriminar diferenças sutis no reconhecimento de epítopos dentro e entre as séries de anticorpos.
1.14. Avaliação in vivo da eficácia de anticorpos 15H05 anti-IL-31 felinizados em um modelo de desafio de prurido em gato
[0298]Com base no resultado de eficácia positiva utilizando o camundongo: quimera 15H05 felino descrito acima, mais trabalho foi feito para aumentar a afinidade e potência de 15H05 felinizado (descrito acima na seção 1.8). A substituição sistemática das estruturas felinas de cadeia leve variável no anticorpo 15H05 1.1 felino levou à identificação de 15H05 1.1 FW2 felino com afinidade aumentada para IL-31 felina e canina em comparação com 15H05 de camundongo (Figura 2). A combinação das cadeias pesadas e leves de 15H05 1.1 FW2 Felino em um único plasmídeo levou à formação de anticorpos ZTS-927 e ZTS-361 após a produção de sistemas de expressão HEK e CHO. A afinidade e a potência de ambos os anticorpos resultantes da expressão de um único plasmídeo também são descritas nas Figuras 2 e 3, respectivamente.
[0299]A eficácia da IL-31 mAb ZTS-361 anti-felino totalmente felinizado foi avaliada quanto à sua capacidade para neutralizar o comportamento pruriginosa em um modelo de gato in vivo induzido por IL-31. A Figura 10A mostra o comportamento pruriginoso pré-desafio de linha de base para os grupos T01 veículo placebo e anticorpo T02 ZTS-361 do dia -7 ao dia 28, sendo o dia zero o dia da administração do anticorpo ao grupo T02. Conforme mostrado neste gráfico, a variância do comportamento pruriginoso pontuado para os grupos T01 e T02 antes do desafio com IL-31 variou pouco com o número de eventos pruriginosos observados entre 0 e 10 dentro do período de observação de 30 minutos. Este estudo diferiu do modelo de desafio felino preliminar descrito acima na seção 1.13 em que, no dia zero, os gatos receberam uma dose de 4 mg/kg de ZTS-361 por via subcutânea sem combinação com IL-31 felina para gerar um complexo pré-ligado. Isso representa uma avaliação mais rigorosa da eficácia, já que o anticorpo ZTS-361 estará em circulação por sete dias antes do primeiro desafio com IL-31, exigindo que o anticorpo tenha exposição suficiente para ligar e neutralizar a IL-31 circulante.
[0300]Para este estudo, o comportamento pruriginoso foi avaliado nos dias 7,
21 e 28 por 1 hora após um desafio intravenoso de 0,5 μg/kg da proteína IL-31. A Figura 10B mostra a eficácia do anticorpo ZTS-361 demonstrando uma redução significativa no prurido observada nos dias 7 (p <0,0001), 21 (p <0,0027) e 28 (p <0,0238) após desafio com IL-31 em comparação com o veículo controle com placebo.
Os dados deste modelo de desafio suportam observações anteriores que demonstram a eficácia de camundongo: quimera 15H05 felino e suportam a potência baseada em células e a relevância do epítopo em IL-31 felina reconhecido pelas CDRs de 15H05.
Estes dados suportam ainda a capacidade do anticorpo ZTS-361 de neutralizar o prurido induzido pela IL-31 felina in vivo e sugerem que este anticorpo pode servir como um agente terapêutico no tratamento de doenças mediadas por IL-31 em gatos, incluindo dermatite atópica.
[0301]Dados recentes examinando os níveis plasmáticos de IL-31 em animais de propriedade de clientes mostram um aumento da quantidade de citocina em circulação entre cães com dermatite atópica e alérgica em comparação com Beagles de laboratório normais (Figura 11A). Um estudo recente foi realizado para determinar os níveis séricos de IL-31 em gatos com diagnóstico presuntivo de dermatite alérgica (AD) de várias regiões geográficas diferentes nos EUA. A Figura 11B mostra os resultados desta avaliação, indicando que, como cães com dermatite atópica e alérgica, 73 gatos pesquisados com este diagnóstico presuntivo tinham níveis circulantes médios de IL-31 de 8799 fg/ml em comparação com 205 fg/ml nos gatos controle com faixa etária de 17. Para compreender os níveis de IL-31 canina em um estudo de desenvolvimento de modelo anterior, o perfil farmacocinético de IL-31 canina foi analisado em cães após a administração de uma dose subcutânea de 1,75 μg/kg. A Figura 11C mostra os níveis plasmáticos máximos na primeira hora atingindo um máximo de cerca de 30 ng/mL e um nível mantido de cerca de 400 pg/mL em três horas. Com base nessas descobertas, é razoável acreditar que uma dose intravenosa de 0,5 μg/kg de IL-31 felina usada neste modelo felino resultará em uma quantidade circulante que é muito excessiva àquela observada no estado de doença de ocorrência natural para cães e gatos.
2. Exemplo 2 - Caracterização e Uso de Mimotopos de IL-31 em Vacinas e Diagnósticos
2.1. Resíduos de Aminoácidos na IL-31 Canina que estão envolvidos com a ligação do anticorpo 15H05
[0302]Conforme descrito na seção 1.10 deste pedido, uma varredura de substituição completa da proteína canina IL-31 foi realizada abrangendo os aminoácidos descritos na Figura 12. Cada posição descrita nesta seção de IL-31 foi individualmente substituída na proteína de comprimento completo com um dos outros 19 aminoácidos possíveis e a ligação do anticorpo 15H05 foi avaliada usando um ELISA indireto. Essas substituições não tendo impacto na ligação resultaram em um sinal ELISA equivalente a (ou superior) do que a proteína com IL-31, enquanto as substituições impactando a ligação do anticorpo resultaram em um sinal inferior (ou nenhum) do ensaio. Conforme detalhado na Figura 12, algumas posições na IL-31 canina eram tolerantes a certas substituições dos aminoácidos indicados (SEQ ID NO: 155; posições 124, 125, 129 e 132-135), enquanto outras não eram (SEQ ID NO : 155; posições 126, 127, 128, 130 e 131). Para comparação, são mostradas as regiões correspondentes em felino (SEQ ID NO: 157), equino (SEQ ID NO: 165) e IL-31 humana (SEQ ID NO: 181). Pode-se extrapolar as observações mutacionais na IL-31 canina para as outras espécies para a concepção de peptídeos homólogos. Este mapeamento posicional fino da região do epítopo na IL-31 canina permitiu o projeto de peptídeos lineares e restritos que imitam o sítio de ligação na proteína IL-31 reconhecida pelo anticorpo 15H05. Estes resultados em conjunto com o modelo de IL- 31 felina descrito na seção 1.10 (Figura 6B) indicam que o epítopo reconhecido pelo mAb 15H05 é uma região consecutiva de aminoácidos que formam a convergência de uma espiral aleatória que leva ao quarto domínio helicoidal da citocina. A apresentação deste epítopo permite a ligação do mAb 15H05 a representações de peptídeos lineares e restritas com maior afinidade associada à forma restrita. Os dados mutacionais descritos acima (seção 1.12) enfatizam ainda o posicionamento importante deste epítopo (e o epítopo 11E12 anteriormente descrito na Patente US N o
8.790.651 de Bammert et al.) na face da proteína IL-31 em relação à ligação ao complexo co-receptor.
2.2. Caracterização de miméticos de peptídeos que representam o epítopo em IL-31 reconhecido pelo anticorpo 15H05
[0303]Como mencionado anteriormente, o projeto de miméticos de peptídeo de epitopo (mimotopos) pode ter grande utilidade como reagentes de captura analíticos e como vacinas de subunidade para induzir uma resposta imunitária concentrada relevante para gerar anticorpos em um animal dirigida a um epítopo de neutralização sobre a IL-31. Para este objetivo, os peptídeos caninos e felinos foram projetados e caracterizados por sua afinidade ao anticorpo ZTS-927 e sua capacidade de bloquear a capacidade do anticorpo ZTS-361 de inibir a sinalização do receptor mediado por IL-31 em células felinas FCFW4. A construção dos anticorpos ZTS-927 e ZTS-361 (ambos contendo CDRs do anticorpo de camundongo 15H05) são descritos acima na seção 1.9. O peptídeo ZTS-561 contém a sequência de aminoácidos N-TEISVPADTFERKSFILT-C que corresponde às posições 121 a 138 da SEQ ID NO: 155 com a substituição de Arginina (R) por Cisteína (C) na posição número 132. O peptídeo ZTS-561 também inclui cisteínas N e C terminais para facilitar a química de conjugação usando os grupos tiol livres. O peptídeo ZTS-562 contém a sequência de aminoácidos N-EISVPADTFERKSF-C que corresponde às posições 122 a 135 da SEQ ID NO: 155 com a substituição de Arginina (R) por Cisteína (C) na posição número 132. O peptídeo ZTS-562 também inclui cisteínas N e C terminais para facilitar a química de conjugação usando os grupos tiol livres. O peptídeo ZTS- 563 contém a sequência de aminoácidos N-AKVSMPADNFERKNFILT-C que corresponde às posições 121 a 138 da SEQ ID NO: 157 com a substituição de Treonina (T) por Alanina (A) na posição número 138. O peptídeo ZTS-563 também inclui cisteínas N e C terminais para facilitar a química de conjugação usando os grupos tiol livres. O peptídeo ZTS-564 contém a sequência de aminoácidos N- TEISVPADTFERKSFILT-C que corresponde às posições 121 a 138 da SEQ ID NO:
155. O peptídeo ZTS-564 também inclui cisteínas N e C terminais para facilitar a química de conjugação usando os grupos tiol livres. Um processo de várias etapas usando a tecnologia CLIPS (Timmerman et al. J Mol Recognit. 2007; 20 (5): 283-299) foi usado para identificar e otimizar esses quatro peptídeos capazes de se ligar ao paratopo do mAb 15H05 (Pepscan, Lelystad Holanda). Com o propósito de gerar imunógenos, estes quatro peptídeos (representados na Figura 13A) foram conjugados independentemente com uma proteína transportadora que é uma forma mutante inativa (não tóxica) da toxina da difteria (CRM197) usando química de reticulação padrão. Para afinidade avaliação, cada peptídeo foi independentemente imobilizado a um Biacore superfície e a KD para o mAb 15H05 anti-IL-31 felinizado foi determinada (ZTS-927) (Figura 13B). Todos os quatro peptídeos se ligaram a ZTS-927 com afinidade nanomolar, indicando que eles são representações próximas do sítio de ligação em IL-31 de comprimento completo. Para avaliar a potência de cada peptídeo, uma titulação de dose de peptídeos conjugados ou não conjugados foi co-incubada a 37 °C por 1 hora com 0,2 µM (6,5 µg/ml) de mAb ZTS-361 antes da adição de IL-31 felina em FCWF-4 (células semelhantes a macrófagos felinos). Os valores de IC50 foram calculados usando concentrações crescentes de peptídeo (eixo x) versus o efeito percentual (eixo y) definido como a capacidade do peptídeo de se ligar e bloquear a inibição de mAb ZTS-361 da fosforilação de STAT3 mediada por proteína IL-31 em macrófagos de FCWF-4 felino. O peptídeo ZTS-564 tinha solubilidade reduzida em solução, o que provavelmente resultou em conjugação ineficiente, baixa densidade de epítopo e baixa potência. O peptídeo ZTS-561 tinha baixa potência na forma conjugada, mas manteve uma boa potência quando não conjugado (IC60 ~1,7 μg/ml). ZTS-562 e ZTS-563 demonstraram excelente potência não conjugada com IC50s de 1,046 μg/ml e 1,742 μg/ml, respectivamente. A potência diminuiu aproximadamente 3 vezes após a conjugação com IC50s para ZTS-562 e ZTS-563 de 3,024 μg/ml e 3,384 μg/ml, respectivamente (Figura 13B). A capacidade desses peptídeos de bloquear a ligação de alta afinidade do mAb ZTS-361 à proteína IL-31 foi altamente promissora e deu mais evidências para apoiar a sua utilidade como miméticos de epítopos (ainda referidos como mimotopos 15H05 de IL-31) de um relevante epítopo em IL-31. Estes mimotopos 15H05 de IL-31 foram explorados posteriormente quanto à sua utilidade como imunógenos para induzir uma resposta imune anti-IL-31.
2.3. Projeto de estudo para gerar títulos de soro para IL-31 após imunização de cães Beagle com mimotopos caninos e felinos 15H05 de IL-31 e proteína IL-31 felina de comprimento completo
[0304]Um estudo de imunogenicidade foi realizado para avaliar a capacidade de mimotopos 15H05 de IL-31 conjugados com CRM-197 para gerar uma resposta imune específica de epítopo direcionada para a região relevante na proteína IL-31, onde o anticorpo 15H05 se liga e neutraliza as citocinas capacidade de ativar o co- receptor IL-31Ra: OSMR. O projeto do estudo está representado na Figura 14. Cães Beagle machos de raça pura foram administrados por via subcutânea com os mimotopos 15H05 de IL-31 conjugados com adjuvante ZA-01. O diagrama abaixo mostra o projeto experimental por grupo. Os grupos de controle foram incluídos contendo adjuvante ZA-01 CRM-197 sozinho (T01) e IL-31 felina conjugado com CRM-197 (SEQ ID NO: 159; Felina_IL-31_E_coli), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 160; Felina_IL-31_E_coli) em ZA-01 (T02).
10 μg/dose de cada mimotopo ou controle com adjuvante foram administrados por via subcutânea nos dias 0, 28 e 56 (0,5 ml de uma solução de 20 μg/ml). O sangue para soro foi coletado no dia 0 (pré-dose), 7, 12, 28 (pré-dose) 35, 42, 49, 56 (pré-dose), 63, 70, 77 e 84. Além disso, nos dias 35 e 84, aproximadamente 40 ml de sangue foram coletados de cada animal em tubos de heparina de lítio e processados para isolamento de PBMC usando um método padrão. PBMCs foram criopreservados após isolamento até avaliação adicional de células B específicas do antígeno.
2.4. Títulos séricos gerados após a vacinação de cães com mimotopos caninos e felinos 15H05 de IL-31 e proteína IL-31 felina de comprimento completo
[0305]Os títulos séricos de cada dia de estudo indicados na seção 2.3 acima foram avaliados para cada animal. Os títulos foram determinados usando um ELISA indireto, onde uma proteína IL-31 de comprimento completo foi usada como o material de captura para cada respectivo ensaio. O soro foi testado de cada grupo de estudo quanto à ligação a proteínas felinas, mutantes 15H05 felinas, caninas, equinas e humanas. O objetivo era entender a resposta imune induzida pela proteína IL-31 felina (SEQ ID NO: 159; Felina_IL-31_E_coli), ou mimotopos 15H05 de peptídeos, contra múltiplas espécies de IL-31 tendo uma faixa de identidades de sequência de aminoácidos entre si (Figura 1A). O grupo de tratamento 2 (CRM de IL-31 Felina de comprimento completo) representa a resposta imune adaptativa a múltiplos epítopos abrangendo toda a sequência da proteína. Usar a proteína completa como imunógeno irá gerar anticorpos que são neutralizantes e não neutralizantes para a bioatividade de IL-31. Trabalhos anteriores em camundongos que descrevem a identificação de anticorpos neutralizantes para sinalização de IL-31 indicam que a porcentagem desses anticorpos é pequena e, portanto, a maioria da resposta policlonal à proteína de comprimento completo será de um tipo não neutralizante (US8790651 para Bammert, et al.). Como uma abordagem de vacina, a geração de anticorpos não neutralizantes para IL-31 pode ter efeitos adversos na segurança e eficácia. Os anticorpos não neutralizantes podem resultar em quantidades aumentadas de IL-31 bioativa na circulação resultante de complexos de citocinas de anticorpos ligados.
Estes complexos podem permitir a existência de formas monoméricas ou agregadas de IL-31 em circulação, permitindo a disponibilidade da porção de ligação ao receptor da IL-31 para interagir com o co-receptor IL-31: OSMR. O aumento da sinalização pSTAT resultante do aumento da IL-31 na circulação exacerba a atividade pruriginosa em um estado de doença como dermatite atópica (Gonzales et al. Vet Dermatol.
Fevereiro de 2013; 24 (1): 48-53 e 11-2).
[0306]A Figura 15 A-E mostra os resultados do título médio para cada respectiva proteína IL-31 organizada por grupo de tratamento, mostrando a resposta a cada dia em que o soro foi tomado. Os títulos do soro foram examinados para IL-31 usando várias espécies da proteína para compreender a extensão da Resposta de Anticorpo Reativo Cruzado (CRAR) que pode ocorrer. A diluição máxima testada para cada amostra de soro foi de 1:50.000, portanto, quando o título excedeu esse valor, foi designado como 50.000. Para maior clareza, a seguinte descrição das Figuras continuará de acordo com a resposta dos grupos de tratamento individuais para cada proteína IL-31 usada para o ELISA de captura.
[0307]Para os cães vacinados com a IL-31 felina de comprimento completo (T02), esperava-se que o soro policlonal gerado se ligaria múltiplas espécies dada a elevada identidade percentual entre homólogos. A Figura 15A mostra os títulos de anticorpos caninos gerados que se ligam à IL-31 felina. A análise do grupo T02 mostra que uma resposta de anticorpos moderada e sustentada foi gerada para a proteína IL- 31 felina inteira após a terceira dose que persistiu até o término do estudo no dia 84.
Ao examinar a resposta do grupo T02 contra a proteína mutante 15H05 felina (SEQ ID NO: 163; Felina_IL31_15H05_mutante), um perfil semelhante é visto com títulos ainda mais elevados no dia 63, 70 e 77 (Figura 15B). A Figura 15C mostra os títulos para IL-31 canina. Ao observar os títulos do grupo T02, examinamos até que ponto os cães vacinados montaram uma CRAR na proteína IL-31 canina. Nenhuma resposta foi observada antes da terceira dose de CRM de IL-31 felina. Após a dose 3 no dia 56,
uma CRAR transitória pode ser observada dos dias 63-77 retornando ao valor basal próximo ao dia 84. A magnitude da resposta anticanina foi semelhante à resposta antifelina, porém a duração foi mais curta. Curiosamente, a CRAR para cavalo e IL- 31 humana foi insignificante menor, respectivamente (Figuras 15D e E, dias 63 e 84 para humanos). Em resumo, a resposta imune do cão à CRM de IL-31 felina foi mais robusta e persistente contra a própria proteína IL-31 felina. A IL-31 felina e a canina compartilham 76 % de identidade de aminoácidos uma com a outra, que parece ser um nível suficientemente alto para que uma CRAR ocorra na proteína canina. A IL-31 de cavalo e humana têm 57 e 49 % de identidade para felina, respectivamente, produzindo apenas uma CRAR menor no caso de títulos de proteína humana.
[0308]O mimotopo 15H05 de IL-31 ZTS-561 representa o sítio de ligação em IL-31 canina reconhecido pelo anticorpo 15H05. As respostas de anticorpos de cães vacinados com CRM de ZTS-561 são descritas como T03 nas Figuras 15 A-E. O objetivo aqui foi avaliar a resposta do anticorpo a esta região específica na IL-31 conhecida por estar envolvida na interação das citocinas com seu receptor. Focar a resposta imune a um epítopo específico garantirá que os anticorpos sejam direcionados a uma área da proteína que resultará na neutralização de sua atividade biológica. CRM de ZTS-561 é um 20-mer restrito que representa a porção da proteína IL-31 canina reconhecida por anticorpos com CDRs idênticas ao anticorpo 15H05 murino (SEQ ID NO: 67; MU_15H05_VH), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 68; MU_15H05_VH) emparelhada com VL (SEQ ID NO: 69; MU_15H05_VL), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 70; MU_15H05_VL). Mimotopo ZTS-561 falhou em produzir uma forte resposta de IL-31 anti-felina ao longo de todo o estudo (Figura 15A) incluindo para o 15H05 mutante de IL-31 felina (Figura 15B). Em contraste, a resposta imune dos cães ao CRM de ZTS-561 contra a proteína IL-31 canina foi muito forte começando no dia 35 após a segunda injeção e persistindo até o término do estudo no dia 84 (Figura 15C). A CRAR provocada pelo ZTS-561 para a IL-31 equina foi desprezível e para os humanos apenas uma pequena resposta foi observada no dia 56 do estudo (Figura 15 D e E). É interessante notar que, embora as proteínas felinas e caninas compartilhem um alto grau de identidade nesta região da proteína (Figura 1), uma resposta imune específica da espécie foi direcionada para a proteína IL-31 de cão após a vacinação de cães com o mimotopo 15H05 canino.
[0309]CRM de ZTS-562 é uma versão restrita truncada de 16-mer de ZTS- 561 novamente representando a porção da proteína IL-31 canina reconhecida por anticorpos com CDRs idênticas para o anticorpo 15H05 murino (SEQ ID NO: 67; MU_15H05_VH), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 68; MU_15H05_VH) emparelhada com VL (SEQ ID NO: 69; MU_15H05_VL), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 70; MU_15H05_VL). Os dados para a resposta do cão ao ZTS-562 são encontrados como o grupo T04 nas Figuras 15 A-E. Interessante, a CRAR provocada por esta versão mais curta foi mais pronunciada, resultando em títulos antifelinos modestos nos dias 35 a 70 (Figura 15A). Alguma resposta também foi observada para a proteína IL-31 de 15H05 mutante entre os dias 35 e 63 (Figura 15B). A resposta de IL-31 anti-canina induzida por este mimotopo foi excelente começando no dia 35 após a segunda dose e persistindo até o término do estudo no dia 84. Consistente com outros resultados com o CRM de ZTS-561 canino de peptídeo, CRM de ZTS-562 não teve CRAR com as proteínas equinas e humanas.
[0310]CRM de ZTS-563 é um 18-mer restrito e é o único mimotopo que representa a porção da proteína IL-31 felina reconhecida por anticorpos com CDRs idênticas para o anticorpo 15H05 murino (SEQ ID NO: 67; MU_15H05_VH), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 68; MU_15H05_VH) emparelhada com VL (SEQ ID NO: 69; MU_15H05_VL), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 70; MU_15H05_VL). Os dados para a resposta do cão ao ZTS-563 são encontrados como o grupo T05 nas Figuras 15 A-E. Consistente com observações anteriores de uma resposta específica da espécie ao mimotopo canino, o mimotopo de gato (ZTS-563) induziu uma resposta anti-IL31 específica para felinos no cão. A Figura 15A mostra a resposta do título de IL-31 anti-felina à vacinação com ZTS-563 atingindo mais de 1:50.000 no dia 35 e mantida neste nível até o dia 77 caindo modestamente no dia 84. Comparando o grupo de tratamento T05 (ZTS-563) entre as Figuras 15A e 15B pode-se ver claramente a diferença no título entre a IL-31 felina e o 15H05 mutante de IL-31 felina. A diminuição dependente do tempo no título da proteína mutante (quando comparada à proteína do tipo selvagem) indica que uma porção significativa da resposta imune é direcionada a uma porção muito específica da proteína representada pelo mimotopo ZTS-563.
Notavelmente, a resposta de IL-31 anti-canina foi modesta a baixa, apoiando ainda mais a resposta espécie-específica gerada pelo sistema imunológico dos cães, a diferenças sutis nas sequências de aminoácidos das duas espécies. A vacinação com ZTS-563 é o único mimotopo que gerou uma CRAR em cães para a proteína IL-31 equina. Essas observações demonstram que mudanças sutis na sequência mimotópica podem levar à especificidade da espécie e também podem transmitir uma resposta imunogênica entre espécies. Compreender essas propriedades é benéfico para o projeto de uma vacina direcionada à IL-31 para uso em uma ou várias espécies usando esta tecnologia.
[0311]Por último é CRM de ZTS-564, um 18-mer restrito idêntico a ZTS-561 no entanto a utilização de um conector alternativo, mT2b (Figura 15A). CRM de ZTS- 564 representa a porção da proteína IL-31 canina reconhecida por anticorpos com CDRs idênticas ao anticorpo 15H05 murino (SEQ ID NO: 67; MU_15H05_VH), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 68; MU_15H05_VH) emparelhada com VL (SEQ ID NO: 69; MU_15H05_VL), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 70; MU_15H05_VL). Os dados para a resposta do cão ao ZTS-564 são encontrados como o grupo T06 nas Figuras 15 A-E. Consistente com outras observações, há pouca ou nenhuma resposta de IL-31 anti-felina de cão induzida por este mimotopo (Figuras 15A e 15B). A resposta de IL-31 anti-canina gerada pelo ZTS-564 foi muito robusta. A Figura 15C mostra de todos os grupos de tratamento neste estudo, T06 (ZTS-564) é o único que gera uma resposta imune contra IL-31 canina após uma dose única. Os títulos de IL-31 anti- canina gerados após a segunda e a terceira doses resultaram em uma resposta máxima do ensaio (maior que 1:50.000) nos dias 35 até o término do estudo no dia
84. Não houve CRAR para IL-31 equina observada, no entanto, este mimotopo produziu a única resposta consistente à IL-31 humana observada entre os grupos de tratamento. É digno de nota que essas diferenças sutis na química do conector e talvez as restrições mais definidas do conector mT2b fornecem uma resposta anti-IL- 31 direcionada mais precisa, potencialmente aliviando a necessidade de dosagem mais frequente.
[0312]Os dados deste estudo indicam que os miméticos de peptídeos que representam o sítio de ligação do anticorpo neutralizante 15H05 anti-IL-31 são capazes de induzir uma resposta imune em um animal e esta resposta imune é dirigida contra o epítopo reconhecido pelas CDRs do anticorpo 15H05. É concebido a partir destes dados que uma caracterização adicional deste anti-soro usando co-receptores de IL-31 recombinante pode ser usada para definir a fração de neutralização de IL-31 gerada durante esta resposta policlonal. Estes resultados sugerem ainda a utilidade de tal abordagem para uso como vacina contra um distúrbio mediado por IL-31, como dermatite atópica.
2.5. Identificação de anticorpos neutralizantes de IL-31 a partir de células B individuais isoladas de células plasmáticas de cães Beagle imunizados com mimotopos 15H05 de IL-31
[0313]Como descrito acima, o sangue foi colhido nos dias 35 e 84 do estudo para o propósito de PBMCs de isolamento. PBMCs de um único cão T05 vacinado com CRM de ZTS-563 (o mimotopo felino) foram usados para avaliação adicional de células B positivas para anticorpos devido à resposta direcionada ao epítopo 15H05 robusta (Figuras 15A e 15B). As células B de memória ativadas foram selecionadas para aquelas células que secretam anticorpos usando um anticorpo IgG Fc anti-canino acoplado a uma esfera. IgGs secretados foram avaliados simultaneamente quanto à sua capacidade de se ligar à IL-31 felina tipo selvagem e ao mutante 15H05 da IL-31 felina. Estes resultados de triagem primária levam à seleção de 7 resultados desta população de células PBMC. Destas 7 ocorrências, 3 não se ligaram ao mutante 15H05 indicando que essas células B estão produzindo anticorpos com o reconhecimento mais próximo do epítopo 15H05 como resultado da imunização com o mimotopo 15H05 de IL-31 ZTS-563 (dados não mostrados). Após o sequenciamento das cadeias pesadas e leves variáveis para esses 7 resultados, versões totalmente caninas recombinantes foram construídas, expressas em células HEK e purificadas como descrito anteriormente neste documento. A nova triagem desses 7 IgGs caninas recombinantes resultou em apenas um único acerto (ZIL1) que reteve a ligação à proteína IL-31 felina (Figura 4). Além disso, a ligação de ZIL1 ao mutante 15H05 de IL-31 é diminuída, usando métodos ELISA e Biacore, indicando que este anticorpo se liga a uma região de epítopo comum como o anticorpo 15H05. Os resultados adicionais derivados diretamente de células B caninas na seção 1.6 e na Figura 4 (ZIL8 - ZIL171) foram de cães imunizados com IL-31 felina de comprimento completo e de outras fontes de tecido previamente descritas aqui. Apenas o anticorpo ZIL1 foi derivado de PBMCs após vacinação com um mimotopo de peptídeo.
[0314]Um aspecto importante destes resultados é a capacidade de identificar as células B que secretam o anticorpo específico para o epitopo 15H05 mAb na circulação de um cão a seguir à imunização com um mimotopo de peptídeo da proteína IL-31. Estes resultados validam a utilização de um peptídeo que mimetiza a região do epítopo na IL-31, conhecido por ser relevante para o modo de ação inibitória do anticorpo 15H05. Como os anticorpos com CDRs derivados do mAb 15H05 são capazes de prevenir o prurido mediado por IL-31 in vivo, esses resultados apoiam ainda mais o conceito de imunização com tal mimético projetado para gerar uma resposta imune focada no epítopo como uma abordagem de vacina para a prevenção de doenças mediadas por IL -31, como dermatite atópica.
2.6. Uso do mimotopo 15H05 de IL-31 como um reagente de captura para medir a identidade e a potência do anticorpo 15H05 e seus dervativos
[0315]Um mimotopo 15H05 de IL-31 representa o sítio de ligação da proteína IL-31 que seja reconhecido pelas CDRs a partir de mAb 15H05 de camundongo progenitor. Como mencionado anteriormente, é desejável ter esse reagente para usar em um formato de ensaio ELISA (ou outro) para monitorar o processo de produção de anticorpos durante a fabricação. É aqui concebido que tais mimotopos descritos teriam tal utilidade onde um lote de produção de um anticorpo anti-IL-31 é feito e um mimotopo de peptídeo seria usado para um ensaio analítico para verificar a identidade e quantidade de anticorpo produzido.
2.7. Uso do mimotopo 15H05 de IL-31 como diagnóstico para medir os níveis de anticorpos ou para determinar os níveis de IL-31 em uma espécie hospedeira
[0316]É ainda aqui concebido o uso de um mimotopo de peptídeo, conforme descrito para ser usado como um reagente de ensaio analítico para medir a quantidade de anticorpo circulante em um hospedeiro após o tratamento de um agente terapêutico para um distúrbio mediado por IL-31, como dermatite atópica. O fluido corporal de um animal é adicionado diretamente ao mimotopo que está ligado a uma superfície sólida e, em seguida, os reagentes de detecção secundários apropriados são adicionados para quantificar o nível de anticorpo. Além disso, um projeto de ensaio é concebido aqui, em que um mimotopo é usado para capturar um anticorpo que é marcado para detecção em um ensaio. Este anticorpo capturado teria uma afinidade para o mimotopo anexado que é menor do que a afinidade de IL-31 circulante nativa em uma espécie hospedeira. Nesta modalidade, a incubação do fluido derivado da espécie hospedeira é incubada com o complexo anticorpo:mimotopo marcado que é amarrado a uma superfície sólida. A presença de IL-31 no fluido de teste derivado da espécie hospedeira terá uma afinidade maior para o anticorpo, liberando assim o anticorpo marcado da superfície sólida onde pode ser removido durante as etapas de lavagem. O nível de IL-31 no fluido de teste pode, assim, ser correlacionado à falta de sinal que aparece na superfície ligada ao mimotopo. É concebido que tal ensaio teria utilidade para medir IL-31 em uma pesquisa ou ambiente clínico para uso como um teste diagnóstico.
2.8. Títulos séricos para IL-31 após imunização de cães Beagle com mimotopos de IL-31 e proteína IL-31 canina de comprimento completo
[0317]Um segundo estudo sorologia foi realizado utilizando cães Beagles machos castrados de raça pura como o projeto do estudo aqui descritas na seção 2.3 no entanto, neste estudo diferentes mimotopos foram comparados. Cães Beagle machos de raça pura foram administrados por via subcutânea com os mimotopos de IL-31 conjugados com adjuvante ZA-01. Um grupo de controle foi incluído contendo IL-31 canina conjugada com CRM-197 (SEQ ID NO: 155; Canina_IL-31), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 156; Canina_IL-31) em ZA-01 (T01) 10 μg/dose de cada mimotopo ou controle com adjuvante foram administrados por via subcutânea nos dias 0, 28 e 56 (0,5 ml de uma solução de 20 μg/ml). O sangue para soro foi coletado nos dias -1, 0 (pré-dose), 14, 28 (pré-dose), 42, 56 (pré-dose), 70 e 84. Além disso, nos dias -1, 35 e 63, aproximadamente 40 ml de sangue foram coletados de cada animal em tubos de heparina de lítio e processados para isolamento de PBMC usando um método padrão. PBMCs foram criopreservados após isolamento até avaliação adicional de células B específicas do antígeno.
[0318]O grupo de tratamento 1 (CRM de IL-31 canina de comprimento completo) representa a resposta imune adaptativa para múltiplos epitopos que abrangem a sequência da proteína inteira como a lógica descrita na seção 2.4 utilizando proteína felina de comprimento completo.
A Figura 16A mostra uma tabela que descreve os grupos de tratamento do estudo.
Além da proteína de comprimento completo descrita para T01, dois mimotopos que representam o epítopo 15H05 em canino (T02, ZTS-420) e humano (T03, ZTS-421) foram usados.
ZTS-420 é como
ZTS-561 descrito anteriormente no estudo de sorologia felina, no entanto ZTS-420 é restringido por uma ligação dissulfeto formada por cisteínas no terminal N e C do peptídeo em comparação com o conector mT2a encontrado em ZTS-561. ZTS-421 é a região homóloga na proteína IL-31 humana (SEQ ID NO: 181; Humana_IL-31)
restringida pela ligação dos terminais N e C com o conector mT2b descrito na Figura
13A.
A referência às sequências de aminoácidos chave envolvidas com a ligação do anticorpo 15H05 pode ser encontrada na Figura 12. Um quarto grupo foi incluído para explorar o potencial imunogênico de uma região de ligação do anticorpo chave na IL-
31 canina previamente descrita usando dois anticorpos conhecidos por neutralizar a sinalização de pSTAT mediada por IL-31 e prurido mediado por IL-31 em cães
(US8790651 de Bammert, et al.). Esta região na IL-31 felina é destacada no modelo de homologia mostrado na Figura 6B.
O modelo aceito de IL-31 é uma citocina de domínio quatro helicoidal com as hélices formando uma topologia alternada para cima e para baixo.
Para descrições adicionais, a estrutura da proteína IL-31 será descrita em relação a estas quatro hélices na IL-31 canina (SEQ ID NO: 155; Canina_IL-31),
a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 156;
Canine_IL-31) com respeito às posições correspondentes em proteínas IL-31 homólogas de outras espécies (Figura 1). A hélice A é composta pela sequência de cerca do aminoácido 33 a 59, a hélice B é composta pela sequência de cerca do aminoácido 83 a 98, a hélice C é composta pela sequência de cerca do aminoácido
101 a 114 e a hélice D é composta da sequência de cerca do aminoácido 129 a 156.
Existe uma região de alça definida entre cerca do aminoácido 97 a 101. Uma alça após a hélice A existe de cerca do aminoácido 57 a 62 e uma alça precedendo a hélice D de cerca do aminoácido 126 a 129. Qualquer sequência interveniente sem estrutura secundária prevista será referida como espiral aleatória. O grupo de tratamento 4 (ZTS-766) é um mimotopo que representa as hélices B e C da IL-31 canina e inclui um resíduo de cisteína N-terminal para facilitar o acoplamento da proteína transportadora CRM-197. O alinhamento da sequência do peptídeo desta região da proteína IL-31 é mostrado na Figura 16 B comparando as proteínas caninas, felinas, equinas e humanas com o número de referência da sequência correspondente e a posição do aminoácido anotada.
[0319]Os títulos foram determinados utilizando um ELISA indireto onde um de comprimento completo da proteína IL-31 foi utilizado como o material de captura para cada ensaio respectivo. O soro foi testado de cada grupo de estudo quanto à ligação às proteínas IL-31 canina e humana (Figuras 17A e 17B, respectivamente). Os cães vacinados com a proteína IL-31 canina de comprimento completo conjugada com CRM-197 (T01) mostraram um aumento modesto no título no dia 42 após a segunda dose no dia 28. Este grupo apresentou uma resposta de título decrescente durante o estudo, mesmo após uma terceira dose no dia 56. Dada a resposta geral a todos os epítopos da proteína IL-31 (tanto neutralizantes quanto não neutralizantes), juntamente com os títulos fracos, é improvável que a vacinação com uma proteína IL- 31 completa represente um candidato viável para o desenvolvimento de vacinas.
Grupo 2 deste estudo (ZTS-420) é um mimotopo 15H05 canino com ZTS-561 semelhante descrito na seção 2.4, no entanto ZTS-420 é restringido por uma ligação dissulfeto entre cisteínas adicionadas no terminal N e C do peptídeo em contraste com o conector mT2a em ZTS-561. Este mimotopo falhou em produzir uma resposta imune robusta quando comparado à forma restrita de mT2a (compare a Figura 17A a 15C).
Um aumento modesto no título é observado no dia 84 após a terceira dose no dia 56.
É possível que a ciclização por dissulfeto seja inadequada ou modificada durante a conjugação CRM-197, resultando em apresentação subótima do imunógeno às células imunes em cães. Grupo 4 (ZTS-766) que representa as hélices B e C de IL-31 canina produziu a resposta mais robusta com títulos aparecendo após a segunda dose no dia 28 e aumentando até o dia 84 na conclusão do estudo. Dada a capacidade de neutralização de IL-31 dos anticorpos que reconhecem esta sequência previamente descrita, este mimotopo representa uma vacina candidata promissora para a prevenção de distúrbios mediados por IL-31. O grupo de tratamento 3 (ZTS-421) é o epítopo 15H05 usando a sequência de IL-31 humana nesta região do mimotopo.
Curiosamente, nenhum dos cães vacinados com este mimotopo gerou uma resposta contra a proteína IL-31 canina (dados não mostrados), no entanto, uma resposta imune foi observada à proteína IL-31 humana após a segunda e a terceira doses (Figura 17B). Esta é a especificidade notável da resposta de IL-31 anti-humana de cão, dada a semelhança na sequência entre a região do epítopo do núcleo do mimotopo 15H05 (Figura 12).
2.9. Títulos séricos para IL-31 após imunização de gatos de laboratório com mimotopos felinos e equinos de IL-31 e proteína IL-31 felina de comprimento completo
[0320]Um estudo de sorologia foi realizado usando gatos de laboratório como o projeto de estudo aqui descrito na seção 2.3, no entanto, neste estudo foram comparados mimotopos felinos e equinos. Os gatos de laboratório foram administrados por via subcutânea com os mimotopos de IL-31 conjugados com adjuvante uma mistura incluindo o adjuvante glicolipídeo Bay R1005 (N-(2-Desóxi-2- L-leucilamino-β-D-glucopiranosil)-N-octadecildodecanoilamida-hidroacetato), bem como oligonucleotídeos CpG. Um grupo de controle foi incluído contendo IL-31 felina conjugado com CRM-197 (SEQ ID NO: 157; Felina_IL31_tipo selvagem), a sequência de nucleotídeos correspondente para a qual é (SEQ ID NO: 158; Felina_IL-31_tipo selvagem) em uma mistura adjuvante incluindo o adjuvante glicolipídeo Bay R1005
(N-(2-Desóxi-2-L-leucilamino-β-D-glucopiranosil)-N-octadecildodecanoilamida-
hidroacetato), bem como oligonucleotídeos CpG. (T01). 10 μg/dose de cada mimotopo ou controle com adjuvante foram administrados por via subcutânea nos dias 0,28 e 56
(0,5 ml de uma solução de 20 μg/ml). O sangue para soro foi coletado nos dias -14, 0
(pré-dose), 28 (pré-dose), 42, 56 (pré-dose), 70 e 84. Além disso, nos dias 35 e 63,
aproximadamente 40 ml de sangue foi coletado de cada animal em tubos de heparina de lítio e processado para isolamento de PBMC usando um método padrão.
PBMCs foram criopreservados após isolamento até avaliação adicional de células B específicas do antígeno.
Os grupos de tratamento do estudo estão descritos na Figura
18A.
ZTS-563 (T02) é descrito neste documento na seção 2.4 como um imunógeno que foi usado no estudo de sorologia anterior em cães.
ZTS-563 é um mimotopo
15H05 restrito por mT2a conjugado com CRM-197. T03 (ZTS-418) é um mimotopo
15H05 com sequência equina (compare a versão canina homóloga ZTS-420 na Figura
16A). O grupo de tratamento 4 é ZTS-423, um peptídeo mimotopo que representa a hélice BC descrita na seção 2.8 com a sequência de IL-31 felina.
O grupo de tratamento 5 é ZTS-422, um mimotopo 15H05 felino com um conector mT2b de ácido amino-hexanóico (Ahx). A Figura 18B mostra os resultados para a resposta de anticorpos séricos dos grupos de tratamento T01, T02, T04 e T05 (T03 não tinha
CRAR para proteína IL-31 felina, dados não mostrados) nos dias -14, 42 e 84 para IL-
31 felina de comprimento completo usando um ELISA indireto.
Mais uma vez, a forma conjugada da proteína IL-31 de comprimento completo (T01) mostrou a pior resposta de anticorpos em gatos com títulos para IL-31 de comprimento completo nunca excedendo 1:20.000 durante o estudo.
T02 (ZTS-563) teve uma resposta modesta ao longo do estudo com um aumento dependente da dose até o dia 84, indicando que esta apresentação do epítopo 15H05 felino pode ser uma vacina adequada.
O título médio em gatos para a proteína IL-31 felina de comprimento completo após três doses de ZTS-423 (T04) são aumentados de forma dependente da dose para mais de 1:100.000 após a segunda e a terceira doses, indicando uma resposta imune notável a uma região de epítopo altamente relevante. ZTS-422 (T05) representando o mimotopo 15H05 com o conector AhX mT2b mostra também uma resposta imune robusta em gatos com títulos superiores a 1:100.000 após a segunda e a terceira doses. O epítopo 15H05 nesta forma é claramente uma apresentação relevante desta região da proteína IL-31 e representa um mimotopo de vacina promissor para neutralizar a atividade de IL-31 in vivo.
2.10. Sequência e considerações estruturais para o projeto apropriado de mimotopos para uso como vacinas
[0321]São descritas aqui várias representações peptídicas de epítopos na proteína IL-31 (mimotopos) com sequências únicas correspondentes aos aminoácidos de suas espécies de origem. O objetivo final no projeto de vacinas é o retrato de epítopos por meio dos quais o sistema imunológico os reconhece e gera uma resposta robusta e específica. O projeto da vacina é facilitado, mas não limitado à adição de proteínas transportadoras como CRM-197 e formulação com adjuvantes. São descritos aqui exemplos de epítopos que foram identificados com base nas propriedades dos anticorpos aos quais estão ligados. Os epítopos principais são aquelas áreas na proteína IL-31 que, quando ligadas por um anticorpo, não são capazes de envolver ainda mais o complexo receptor IL-31RA:OSMR e, portanto, não são capazes de induzir uma resposta de sinalização de pSTAT em cultura de células ou in vivo. O bloqueio da sinalização do receptor mediado por IL-31 é, portanto, uma abordagem para prevenir e/ou tratar distúrbios mediados por IL-31 como dermatite atópica.
[0322]O mapeamento de sítios de ligação de anticorpos em proteínas usando técnicas de mutação é uma maneira eficaz de identificar resíduos-chave envolvidos com o reconhecimento de anticorpo:antígeno, conforme descrito anteriormente para
IL-31 em US8790651 de Bammert, et al.
Construir com base neste conhecimento permitiu o projeto de mimotopos de hélice BC caninos e felinos que são descritos neste documento como imunógenos eficazes que induzem respostas anti-IL-31 robustas em cães e gatos.
Outro método usando uma proteína de fusão IL-31 canina
GST foi descrito recentemente para mapear o anticorpo M14 de IL-31 anti-canina (WO
2018/156367 (Kindred Biosciences, Inc.). Esses autores procuraram definir uma sequência epítopo mínima reconhecida pelo anticorpo M14 constituído pelos aminoácidos PSDX1X2KI (SEQ ID NO 155, aminoácidos 34-40) em que X é qualquer aminoácido.
A descrição desta sequência em comparação com espécies homólogas de IL-31 pode ser encontrada na Figura 19A.
Uma descrição adicional, incluindo a sequência de flanqueamento ao redor do acima, é descrita na Figura 19B.
Após a identificação de um fragmento de ligação mínimo indicado na Figura 19B (caixa sombreada em cinza em torno dos aminoácidos 34-42), os autores geraram substituições de alanina em cada posição usando uma fusão GST deste fragmento de peptídeo.
A partir destes dados, foi descrito o fragmento de ligação mínimo M14 acima.
A falha fundamental com esta abordagem é que a natureza do fragmento de ligação descrito depende da sua estrutura no conteúdo xt de uma proteína de fusão
GST.
Embora não esteja ligado a uma única teoria, acredita-se que a sequência de aminoácidos reconhecida pelo anticorpo M14 é parte de um domínio alfa helicoidal ordenado aqui descrito como hélice A.
As hélices alfa em peptídeos e proteínas existem, mas não estão limitadas à coordenação dos padrões de ligações de hidrogênio entre o oxigênio da carbonila e o nitrogênio dos grupos da estrutura amina
(regras de Corey-Pauling, um dicionário de química, 2008). Não se acredita que o fragmento de ligação mínimo descrito para o anticorpo M14 represente uma descrição adequada do epítopo, uma vez que nenhuma evidência é dada às propriedades de ligação na ausência de um andaime GST.
Além disso, a composição da sequência que envolve, e incluindo, o epítopo M14 relatado contém uma abundância de aminoácidos não polares (I, L, V, P, G, A, M) (Figura 19B). As propriedades físicas desses aminoácidos em um peptídeo resultarão em insolubilidade aquosa e uma estrutura secundária desordenada na ausência de aminoácidos polares ou carregados intervenientes. É, portanto, concebido aqui que o fragmento de ligação mínimo para o anticorpo M14 descrito em WO 2018/156367 (Kindred Biosciences, Inc.) é dependente das propriedades conferidas pelo produto de fusão GST e não inerente ao próprio peptídeo.
[0323]Várias apresentações peptídicas de epitopos de IL-31 são descritas aqui cujas propriedades existem como peptídeos independentes na ausência de uma proteína de fusão descrita. Isto foi exemplificado na seção 2.2 (Figura 13B) mostrando as propriedades de ligação e inibidoras da classe 15H05 de mimotopos em uma forma conjugada e não conjugada. Além das características estruturais secundárias dos peptídeos, a sequência de aminoácidos primária representa outro aspecto chave do projeto da vacina, necessário para a apresentação apropriada na superfície de células T. As sequências de aminoácidos apropriadas, em conjunto com uma proteína transportadora com epítopos de células B e T, irão induzir uma resposta imune direta a áreas-chave na proteína IL-31. Múltiplas áreas na IL-31 foram aqui descritas como sendo adequadas para induzir uma resposta imune direcionada em cães e gatos. O sucesso dos mimotopos da vacina depende dos fatores aqui descritos e são, em última análise, determinados in vivo pela eficácia da resposta. No entanto, com base na aprendizagem de várias regiões de epítopo em IL-31 descritas aqui, é concebido que outros desses epítopos podem existir que fariam mimotopos de vacina adequados. O anticorpo 15H05 reconhece uma alça que precede a hélice D ilustrada como sítio 2 na Figura 6B. É concebido que outras voltas na proteína podem representar epítopos acessíveis por anticorpos. Como um exemplo, a alça formada pela convergência da hélice A com a sequência de espiral aleatória posterior compartilha atributos posicionais e estruturais como a alça 15H05. Esta alça AB é descrito na Figura 20 com comparação das sequências de aminoácidos primários de várias espécies. Não desejando estar limitado a este como um único exemplo, acredita-se que outras regiões na proteína podem compartilhar imunogênica.
2.11. Títulos de soro para mimotopos de IL-31 equina após vacinação de camundongos com proteína IL-31 equina de comprimento completo
[0324]Os camundongos foram imunizados com IL-31 equina de comprimento completo (SEQ ID NO: 165; Equina_IL-31), a sequência de nucleótidos correspondente para o qual é (SEQ ID NO: 166; Canina_IL-31) conjugada para CRM- 197 como o método descrito na seção 1.6 deste pedido. Peptídeos conjugados com biotina representando três regiões de epítopo aqui descritos foram concebidos para uso com um ensaio de ligação de interferometria de bio-camada (Octet, ForteBio). A descrição desses peptídeos está descrita na Figura 21A. Cada peptídeo contém uma biotina N terminal com uma sequência espaçadora de três aminoácidos (GSG) anotada com texto sublinhado em negrito na figura. O número da posição da sequência de aminoácidos correspondente da SEQ ID NO 165 também está indicado na figura. O mimotopo 15H05 inclui dois resíduos de cisteína terminal (também destacados em negrito e sublinhado) para facilitar a ciclização por uma ligação dissulfeto. A Figura 21B mostra os resultados para uma interferometria de biolamada onde os peptídeos descritos na Figura 21A são imobilizados em pinos revestidos com estreptavidina e então usados para sondar diluições múltiplas de IL-31 anti-equina de camundongo ou soro de camundongo controle. O soro controle de camundongo era de um camundongo vacinado com uma proteína não relacionada. A resposta, descrita aqui como a amplitude do sinal após 120 segundos de associação do anti-soro, é representada no eixo y da figura. A partir desses dados, a resposta imune resultante da apresentação de epítopos na proteína IL-31 equina completa pode ser avaliada.
Além disso, a capacidade desses mimotopos de IL-31 de serem reconhecidos por essas respostas imunes pode ser avaliada através da ligação. Estes dados indicam que todos os três peptídeos mimotópicos descritos (15H05, hélice BC e hélice A) são reconhecidos como imunogênios relevantes a partir do processamento e apresentação da proteína IL-31 equina in vivo.
O sinal mínimo foi observado com a ligação do soro controle a cada mimotopo, exceto para a hélice A que mostrou algum sinal dependente da diluição.
Tal como a apresentação dos mimotopos aqui descritos que induzem respostas imunitárias à proteína de comprimento completo, esta experiência descreve uma validação recíproca destes epítopos onde a resposta imunitária é validada a partir da proteína contra o mimotopo.

Claims (11)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição de vacina para imunizar e/ou proteger um mamífero contra um transtorno mediado por IL-31, a dita composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: a combinação de um polipeptídeo portador e pelo menos um mimotopo selecionado do grupo consiste em um mimotopo de IL-31 felina, um mimotopo de IL- 31 canina, um mimotopo de IL-31 de cavalo e um mimotopo de IL-31 humana; e um adjuvante.
2. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o mimotopo de IL-31 canina é e/ou compreende como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SVPADTFECKSF (SEQ ID NO: 186), SVPADTFERKSF (SEQ ID NO: 187), NSSAILPYFRAIRPLSDKNIIDKIIEQLDKLKF (SEQ ID NO: 192), APTHQLPPSDVRKIILELQPLSRG (SEQ ID NO: 196), TGVPES (SEQ ID NO: 200) ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
3. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o mimotopo de IL-31 felina é e/ou compreende como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SMPADNFERKNF (SEQ ID NO: 188), NGSAILPYFRAIRPLSDKNTIDKIIEQLDKLKF (SEQ ID NO: 193), APAHRLQPSDIRKIILELRPM SKG (SEQ ID NO: 197), IGLPES (SEQ ID NO: 201) ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
4. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o mimotopo de IL-31 equina é e/ou compreende como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SMPTDNFERKRF (SEQ ID NO: 189), NSSAILPYFKAISPSLNNDKSLYIIEQLDKLNF (SEQ ID NO: 194), GPIYQLQPKEIQAIIVELQNLS KK (SEQ ID NO: 198), KGVQKF (SEQ ID NO: 202) ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
5. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o mimotopo de IL-31 humana é e/ou compreende como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SVPTDTHECKRF (SEQ ID NO: 190), SVPTDTHERKRF (SEQ ID NO: 191), HSPAIRAYLKTIRQLDNKSVIDEIIEHLDKLIF (SEQ ID NO: 195), LPVRLLRPSDDVQKIVEELQSLSKM (SEQ ID NO: 199), KGVLVS (SEQ ID NO: 203) ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
6. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADA pelo fato de que o mimotopo se liga a um anticorpo anti-IL31 ou porção de ligação ao antígeno do mesmo se liga especificamente a uma região em uma proteína IL-31 de mamífero envolvida com a interação da proteína IL-31 com seu co-receptor.
7. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de que a ligação do dito anticorpo à dita região é impactada por mutações em uma região de ligação ao epítopo 15H05 selecionada do grupo consiste em: a) uma região entre cerca de 124 e 135 resíduos de aminoácido de uma sequência de IL-31 felina representada pela SEQ ID NO: 157 (Felina_IL31_tipo selvagem); b) uma região entre cerca de 124 e 135 resíduos de aminoácido de uma sequência de IL-31 canina representada pela SEQ ID NO: 155 (Canina_IL31); e c) uma região entre cerca de 118 e 129 resíduos de aminoácido de uma sequência de IL-31 equina representada pela SEQ ID NO: 165 (Equina_IL31).
8. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de que o mimotopo se liga a um anticorpo anti-IL-31 ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo pelo menos uma das seguintes combinações das sequências da região determinante de complementaridade (CDR):
1) anticorpo 15H05: CDR1 pesada variável (VH) de SYTIH (SEQ ID NO: 1),
CDR2 VH de NINPTSGYTENNQRFKD (SEQ ID NO: 2), CDR3 VH de
WGFKYDGEWSFDV (SEQ ID NO: 3), CDR1 leve variável (VL) de RASQGISIWLS
(SEQ ID NO: 4), CDR2 VL de KASNLHI (SEQ ID NO: 5) e CDR3 VL de LQSQTYPLT
(SEQ ID NO: 6);
2) anticorpo ZIL1: CDR1 pesada variável (VH) de SYGMS (SEQ ID NO: 13),
CDR2 VH de HINSGGSSTYYADAVKG (SEQ ID NO: 14), CDR3 VH de
VYTTLAAFWTDNFDY (SEQ ID NO: 15), CDR1 leve variável (VL) de
SGSTNNIGILAAT (SEQ ID NO: 16), CDR2 VL de SDGNRPS (SEQ ID NO: 17 e CDR3
VL de QSFDTTLDAYV (SEQ ID NO: 18);
3) anticorpo ZIL8: CDR1 VH de DYAMS (SEQ ID NO: 19), CDR2 VH de
GIDSVGSGTSYADAVKG (SEQ ID NO: 20), CDR3 VH de GFPGSFEH (SEQ ID NO:
21), CDR1 VL de TGSSSNIGSGYVG (SEQ ID NO: 22), CDR2 VL de YNSDRPS (SEQ
ID NO: 23), CDR3 VL de SVYDRTFNAV (SEQ ID NO: 24);
4) anticorpo ZIL9: CDR1 VH de SYDMT (SEQ ID NO: 25), CDR2 VH de
DVNSGGTGTAYAVAVKG (SEQ ID NO: 26), CDR3 VH de LGVRDGLSV (SEQ ID NO:
27), CDR1 VL de SGESLNEYYTQ (SEQ ID NO: 28), CDR2 VL de RDTERPS (SEQ
ID NO: 29), CDR3 VL de ESAVDTGTLV (SEQ ID NO: 30);
5) anticorpo ZIL11: CDR1 VH de TYVMN (SEQ ID NO: 31), CDR2 VH de
SINGGGSSPTYADAVRG (SEQ ID NO: 32), CDR3 VH de SMVGPFDY (SEQ ID NO:
33), CDR1 VL de SGESLSNYYAQ (SEQ ID NO: 34), CDR2 VL de KDTERPS (SEQ
ID NO: 35), CDR3 VL de ESAVSSDTIV (SEQ ID NO: 36);
6) anticorpo ZIL69: CDR1 VH de SYAMK (SEQ ID NO: 37), CDR2 VH de
TINNDGTRTGYADAVRG (SEQ ID NO: 38), CDR3 VH de GNAESGCTGDHCPPY
(SEQ ID NO: 39), CDR1 VL de SGESLNKYYAQ (SEQ ID NO: 40), CDR2 VL de
KDTERPS (SEQ ID NO: 41), CDR3 VL de ESAVSSETNV (SEQ ID NO: 42);
7) anticorpo ZIL94: CDR1 VH de TYFMS (SEQ ID NO: 43), CDR2 VH de LISSDGSGTYYADAVKG (SEQ ID NO: 44), CDR3 VH de FWRAFND (SEQ ID NO: 45), CDR1 VL de GLNSGSVSTSNYPG (SEQ ID NO: 46), CDR2 VL de DTGSRPS (SEQ ID NO: 47), CDR3 VL de SLYTDSDILV (SEQ ID NO: 48); 8) anticorpo ZIL154: CDR1 VH de DRGMS (SEQ ID NO: 49), CDR2 VH de YIRYDGSRTDYADAVEG (SEQ ID NO: 50), CDR3 VH de WDGSSFDY (SEQ ID NO: 51), CDR1 VL de KASQSLLHSDGNTYLD (SEQ ID NO: 52), CDR2 VL de KVSNRDP (SEQ ID NO: 53), CDR3 VL de MQAIHFPLT (SEQ ID NO: 54); 9) anticorpo ZIL159: CDR1 VH de SYVMT (SEQ ID NO: 55), CDR2 VH de GINSEGSRTAYADAVKG (SEQ ID NO: 56), CDR3 VH de GDIVATGTSY (SEQ ID NO: 57), CDR1 VL de SGETLNRFYTQ (SEQ ID NO: 58), CDR2 VL de KDTERPS (SEQ ID NO: 59), CDR3 VL de KSAVSIDVGV (SEQ ID NO: 60); 10) anticorpo ZIL171: CDR1 VH de TYVMN (SEQ ID NO: 61), CDR2 VH de SINGGGSSPTYADAVRG (SEQ ID NO: 62), CDR3 VH de SMVGPFDY (SEQ ID NO: 63), CDR1 VL de SGKSLSYYYAQ (SEQ ID NO: 64), CDR2 VL de KDTERPS (SEQ ID NO: 65), CDR3 VL de ESAVSSDTIV (SEQ ID NO: 66); ou 11) uma variante de 1) a 10) que se difere do respectivo anticorpo precursor 15H05, ZIL1, ZIL8, ZIL9, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159 ou ZIL171 pela adição, deleção e/ou substituição de um ou mais resíduos de aminoácido em pelo menos uma de CDR1, CDR2 ou CDR3 VH ou VL.
9. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADA pelo fato de que o mimotopo é um mimotopo restrito.
10. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADA pelo fato de que o mimotopo restrito é um peptídeo cíclico ligado quimicamente.
11. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADA pelo fato de que o mimotopo está quimicamente conjugado ao polipeptídeo portador.
12. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo portador e o mimotopo são parte de uma proteína de fusão recombinante.
13. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo portador compreende um toxoide bacteriano ou um derivado do mesmo, hemocianina da lapa do buraco da fechadura (KLH) ou uma partícula semelhante a vírus.
14. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA pelo fato de que o toxoide bacteriano ou derivado é um toxoide de tétano, um toxoide de difteria, um toxoide de tétano, o complexo de proteína da membrana externa do grupo B N. meningitidis, exotoxina de Pseudomonas ou o mutante não tóxico da toxina da difteria (CRM197).
15. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA pelo fato de que a partícula semelhante a vírus é HBsAg, HBcAg, Qbeta bacteriófago de E. coli, vírus Norwalk, vírus da cinomose canina (CDV) ou influenza HA.
16. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo portador compreende ou consiste em CRM197.
17. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, CARACTERIZADA pelo fato de que o adjuvante é selecionado do grupo consiste em um adjuvante óleo-em-água, um adjuvante de polímero e água, um adjuvante água-em-óleo, um adjuvante de hidróxido de alumínio, um adjuvante de vitamina E e combinações dos mesmos.
18. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, CARACTERIZADA pelo fato de que o adjuvante é uma formulação compreendendo uma saponina, um esterol, um composto de amônio quaternário e um polímero.
19. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADA pelo fato de que a saponina é Quil A ou uma fração purificada da mesma, o esterol é colesterol, o composto de amônio quaternário é brometo de dimetil dioctadecil amônio (DDA) e o polímero é ácido poliacrílico.
20. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, CARACTERIZADA pelo fato de que o adjuvante compreende a combinação de um ou mais oligonucleotídeos imunoestimuladores isolados, um esterol e uma saponina.
21. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADA pelo fato de que um ou mais oligonucleotídeos imunoestimuladores isolados compreendem CpG, o esterol é colesterol e a saponina é Quil A ou uma fração purificada da mesma.
22. Método de proteger um mamífero contra um transtorno mediado por IL- 31, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao mamífero uma composição de vacina de acordo com qualquer um de reivindicações 1 a 21.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que o mamífero é selecionado do grupo consiste em um cão, um gato, um cavalo e um ser humano.
24. Método, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que o mimotopo de IL-31 contido na composição de vacina é administrado ao mamífero em cerca de 10 μg a cerca de 100 μg por dose.
25. Método de determinar a identidade e/ou quantidade de um anticorpo anti- IL-31 em uma amostra, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende incubar uma amostra compreendendo um anticorpo anti-IL-31 com pelo menos um mimotopo selecionado do grupo consiste em um mimotopo de IL-31 felina, um mimotopo de IL-31 canina, um mimotopo de IL-31 de cavalo e um mimotopo de IL-31 humana; e determinar a identidade e/ou quantidade do anti-IL-31 na amostra.
26. Método, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que o mimotopo de IL-31 canina é e/ou compreende como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SVPADTFECKSF (SEQ ID NO: 186), SVPADTFERKSF (SEQ ID NO: 187), NSSAILPYFRAIRPLSDKNIIDKIIEQLDKLKF (SEQ ID NO: 192), APTHQLPPSDVRKIILELQPLSRG (SEQ ID NO: 196), TGVPES (SEQ ID NO: 200) ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
27. Método, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que o mimotopo de IL-31 felina é e/ou compreende como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SMPADNFERKNF (SEQ ID NO: 188), NGSAILPYFRAIRPLSDKNTIDKIIEQLDKLKF (SEQ ID NO: 193), APAHRLQPSDIRKIILELRPM SKG (SEQ ID NO: 197), IGLPES (SEQ ID NO: 201) ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
28. Método, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que o mimotopo de IL-31 equina é e/ou compreende como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SMPTDNFERKRF (SEQ ID NO: 189), NSSAILPYFKAISPSLNNDKSLYIIEQLDKLNF (SEQ ID NO: 194), GPIYQLQPKEIQAIIVELQNLS KK (SEQ ID NO: 198), KGVQKF (SEQ ID NO: 202) ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
29. Método, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que o mimotopo de IL-31 humana é e/ou compreende como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SVPTDTHECKRF (SEQ ID NO: 190), SVPTDTHERKRF (SEQ ID NO: 191), HSPAIRAYLKTIRQLDNKSVIDEIIEHLDKLIF (SEQ ID NO: 195), LPVRLLRPSDDVQKIVEELQSLSKM (SEQ ID NO: 199), KGVLVS (SEQ ID NO: 203)
ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 29, CARACTERIZADO pelo fato de que o mimotopo é um reagente de captura ligado a uma superfície sólida.
31. Método, de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra é adicionada ao reagente de captura mimotopo; e reagentes de detecção secundários são então adicionados para quantificar a quantidade do anticorpo na amostra.
32. Método de determinar a quantidade de IL-31 em uma amostra de um mamífero, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende incubar uma amostra de mamífero compreendendo IL-31 com um anticorpo anti-IL-31 marcado: complexo mimotopo de IL-31 amarrado a uma superfície sólida, em que o mimotopo no complexo é selecionado do grupo consiste em um mimotopo de IL-31 felina, um mimotopo de IL-31 canina, um mimotopo de IL-31 de cavalo e um mimotopo de IL-31 humana; e determinar o nível da IL-31 na amostra, em que o anticorpo anti-IL-31 marcado no complexo tem uma afinidade para o mimotopo no complexo que é inferior à sua afinidade para a IL-31 na amostra.
33. Método, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de determinar compreende medir o sinal proveniente do anticorpo marcado que é liberado da superfície sólida quando a IL-31 na amostra se liga ao anticorpo anti-IL-3 marcado do complexo, o nível de IL-31 na amostra sendo inversamente proporcional ao sinal.
34. Método, de acordo com a reivindicação 32 ou reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que o mimotopo de IL-31 canina é e/ou compreende como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SVPADTFECKSF (SEQ ID NO: 186), SVPADTFERKSF (SEQ ID NO: 187),
NSSAILPYFRAIRPLSDKNIIDKIIEQLDKLKF (SEQ ID NO: 192), APTHQLPPSDVRKIILELQPLSRG (SEQ ID NO: 196), TGVPES (SEQ ID NO: 200) ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
35. Método, de acordo com a reivindicação 32 ou reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que o mimotopo de IL-31 felina é e/ou compreende como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SMPADNFERKNF (SEQ ID NO: 188), NGSAILPYFRAIRPLSDKNTIDKIIEQLDKLKF (SEQ ID NO: 193), APAHRLQPSDIRKIILELRPM SKG (SEQ ID NO: 197), IGLPES (SEQ ID NO: 201) ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
36. Método, de acordo com a reivindicação 32 ou reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que o mimotopo de IL-31 equina é e/ou compreende como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SMPTDNFERKRF (SEQ ID NO: 189), NSSAILPYFKAISPSLNNDKSLYIIEQLDKLNF (SEQ ID NO: 194), GPIYQLQPKEIQAIIVELQNLS KK (SEQ ID NO: 198), KGVQKF (SEQ ID NO: 202) ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
37. Método, de acordo com a reivindicação 32 ou reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que o mimotopo de IL-31 humana é e/ou compreende como parte do mesmo a sequência de aminoácidos SVPTDTHECKRF (SEQ ID NO: 190), SVPTDTHERKRF (SEQ ID NO: 191), HSPAIRAYLKTIRQLDNKSVIDEIIEHLDKLIF (SEQ ID NO: 195), LPVRLLRPSDDVQKIVEELQSLSKM (SEQ ID NO: 199), KGVLVS (SEQ ID NO: 203) ou variantes da mesma mantendo a ligação anti-IL-31.
38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 37, CARACTERIZADO pelo fato de que o mimotopo se liga a um anticorpo anti-IL31 ou porção de ligação ao antígeno do mesmo se liga especificamente a uma região em uma proteína IL-31 de mamífero envolvida com a interação da proteína IL-31 com seu co-receptor.
39. Método, de acordo com a reivindicação 38, CARACTERIZADO pelo fato de que a ligação do dito anticorpo à dita região é impactada por mutações em uma região de ligação ao epítopo 15H05 selecionada do grupo consiste em: a) uma região entre cerca de 124 e 135 resíduos de aminoácido de uma sequência de IL-31 felina representada pela SEQ ID NO: 157 (Felina_IL31_tipo selvagem); b) uma região entre cerca de 124 e 135 resíduos de aminoácido de uma sequência de IL-31 canina representada pela SEQ ID NO: 155 (Canina_IL31); e c) uma região entre cerca de 118 e 129 resíduos de aminoácido de uma sequência de IL-31 equina representada pela SEQ ID NO: 165 (Equina_IL31).
40. Método, de acordo com a reivindicação 38, CARACTERIZADO pelo fato de que o mimotopo se liga a um anticorpo anti-IL-31 ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo pelo menos uma das seguintes combinações das sequências da região determinante de complementaridade (CDR): 1) anticorpo 15H05: CDR1 pesada variável (VH) de SYTIH (SEQ ID NO: 1), CDR2 VH de NINPTSGYTENNQRFKD (SEQ ID NO: 2), CDR3 VH de WGFKYDGEWSFDV (SEQ ID NO: 3), CDR1 leve variável (VL) de RASQGISIWLS (SEQ ID NO: 4), CDR2 VL de KASNLHI (SEQ ID NO: 5) e CDR3 VL de LQSQTYPLT (SEQ ID NO: 6); 2) anticorpo ZIL1: CDR1 pesada variável (VH) de SYGMS (SEQ ID NO: 13), CDR2 VH de HINSGGSSTYYADAVKG (SEQ ID NO: 14), CDR3 VH de VYTTLAAFWTDNFDY (SEQ ID NO: 15), CDR1 leve variável (VL) de SGSTNNIGILAAT (SEQ ID NO: 16), CDR2 VL de SDGNRPS (SEQ ID NO: 17 e CDR3 VL de QSFDTTLDAYV (SEQ ID NO: 18); 3) anticorpo ZIL8: CDR1 VH de DYAMS (SEQ ID NO: 19), CDR2 VH de GIDSVGSGTSYADAVKG (SEQ ID NO: 20), CDR3 VH de GFPGSFEH (SEQ ID NO: 21), CDR1 VL de TGSSSNIGSGYVG (SEQ ID NO: 22), CDR2 VL de YNSDRPS (SEQ
ID NO: 23), CDR3 VL de SVYDRTFNAV (SEQ ID NO: 24);
4) anticorpo ZIL9: CDR1 VH de SYDMT (SEQ ID NO: 25), CDR2 VH de
DVNSGGTGTAYAVAVKG (SEQ ID NO: 26), CDR3 VH de LGVRDGLSV (SEQ ID NO:
27), CDR1 VL de SGESLNEYYTQ (SEQ ID NO: 28), CDR2 VL de RDTERPS (SEQ
ID NO: 29), CDR3 VL de ESAVDTGTLV (SEQ ID NO: 30);
5) anticorpo ZIL11: CDR1 VH de TYVMN (SEQ ID NO: 31), CDR2 VH de
SINGGGSSPTYADAVRG (SEQ ID NO: 32), CDR3 VH de SMVGPFDY (SEQ ID NO:
33), CDR1 VL de SGESLSNYYAQ (SEQ ID NO: 34), CDR2 VL de KDTERPS (SEQ
ID NO: 35), CDR3 VL de ESAVSSDTIV (SEQ ID NO: 36);
6) anticorpo ZIL69: CDR1 VH de SYAMK (SEQ ID NO: 37), CDR2 VH de
TINNDGTRTGYADAVRG (SEQ ID NO: 38), CDR3 VH de GNAESGCTGDHCPPY
(SEQ ID NO: 39), CDR1 VL de SGESLNKYYAQ (SEQ ID NO: 40), CDR2 VL de
KDTERPS (SEQ ID NO: 41), CDR3 VL de ESAVSSETNV (SEQ ID NO: 42);
7) anticorpo ZIL94: CDR1 VH de TYFMS (SEQ ID NO: 43), CDR2 VH de
LISSDGSGTYYADAVKG (SEQ ID NO: 44), CDR3 VH de FWRAFND (SEQ ID NO:
45), CDR1 VL de GLNSGSVSTSNYPG (SEQ ID NO: 46), CDR2 VL de DTGSRPS
(SEQ ID NO: 47), CDR3 VL de SLYTDSDILV (SEQ ID NO: 48);
8) anticorpo ZIL154: CDR1 VH de DRGMS (SEQ ID NO: 49), CDR2 VH de
YIRYDGSRTDYADAVEG (SEQ ID NO: 50), CDR3 VH de WDGSSFDY (SEQ ID NO:
51), CDR1 VL de KASQSLLHSDGNTYLD (SEQ ID NO: 52), CDR2 VL de KVSNRDP
(SEQ ID NO: 53), CDR3 VL de MQAIHFPLT (SEQ ID NO: 54);
9) anticorpo ZIL159: CDR1 VH de SYVMT (SEQ ID NO: 55), CDR2 VH de
GINSEGSRTAYADAVKG (SEQ ID NO: 56), CDR3 VH de GDIVATGTSY (SEQ ID NO:
57), CDR1 VL de SGETLNRFYTQ (SEQ ID NO: 58), CDR2 VL de KDTERPS (SEQ ID
NO: 59), CDR3 VL de KSAVSIDVGV (SEQ ID NO: 60);
10) anticorpo ZIL171: CDR1 VH de TYVMN (SEQ ID NO: 61), CDR2 VH de
SINGGGSSPTYADAVRG (SEQ ID NO: 62), CDR3 VH de SMVGPFDY (SEQ ID NO:
63), CDR1 VL de SGKSLSYYYAQ (SEQ ID NO: 64), CDR2 VL de KDTERPS (SEQ
ID NO: 65), CDR3 VL de ESAVSSDTIV (SEQ ID NO: 66); ou
11) uma variante de 1) a 10) que se difere do respectivo anticorpo precursor
15H05, ZIL1, ZIL8, ZIL9, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159 ou ZIL171 pela adição,
deleção e/ou substituição de um ou mais resíduos de aminoácido em pelo menos uma de CDR1, CDR2 ou CDR3 VH ou VL.
Canina_IL31 Felina_IL31_tipo selvagem Equina_IL31
Petição 870200109884, de 31/08/2020, pág. 181/208 Humana_IL31
Canina_IL31 Felina_IL31_tipo selvagem Equina_IL31 Humana_IL31
Canina_IL31 Felina_IL31_tipo selvagem Equina_IL31 Humana_IL31 1/25
Porcentagem de Identidade Felina_IL31 Cavalo_IL3 Humana_IL3 Canina_IL31 Felina_IL31 Cavalo_IL31
Anticorpos com CDRs de Origem de Camundongo Afinidade para IL-31 Felina Afinidade para IL-31 Canina Anticorpo A HBS-EP nenhuma ligação nenhuma ligação MU-15H05 MU-11E12 Quimera de 15H05 de Camundongo:Canina
Petição 870200109884, de 31/08/2020, pág. 182/208 Quimera de 15H05 de Camundongo:Felina Quimera de 11E12 de Camundongo:Canina Quimera de 11E12 de Camundongo:Felina 15H05 Felino 1.1 11E12 Felino 1.2 nenhuma ligação nenhuma ligação Felino_11E12 1.1_FW2 Felino_11E12 1.1_K46Q 15H05 Felino 1.1 15H05 Felino 1.2 15H05 Felino 1.3 15H05 Felino 2.1 15H05 Felino 2.2 15H05 Felino 2.3 nenhuma ligação 15H05 Felino 3.1 15H05 Felino 3.2 2/25
15H05 Felino 3.3 nenhuma ligação VH1 de 15H05 Felino VL de camundongo VH2 de 15H05 Felino VL de camundongo VH3 de 15H05 Felino VL de camundongo 15H05 Felino 1.1 FW1 15H05 Felino 1.1 FW2 15H05 Felino 1.1 FW3 15H05 Felino 1.1 FW1_2 15H05 Felino 1.1 FW2_3 15H05 Felino 1.1 FW1_3 15H05 Felino 1.1 K42N 15H05 Felino 1.1 V43I 15H05 Felino 1.1 L46V 15H05 Felino 1.1 Y49N 15H05 Felino 1.1 K42N V43I
Potência de Anticorpos com CDRs de Origem de Camundongo
Células DH82 Caninas Células FCWF4 Felinas IL-31 IL-31 IL-31 IL-31 Anticorpo Canina Felina Canina Felina Camundongo
Quimera 11E12 de Camundongo:Felina 11E12 de Camundongo:Canina 15H05 de Camundongo:Felina 15H05 de Camundongo:Canina
Felinizado
Não Testado
Ligação de Anticorpos com CDRs de Origem Canina
Petição 870200109884, de 31/08/2020, pág. 184/208 Ligação (ELISA OD) Ligação (Biacore)
IL-31 Felina IL-31 Felina IL-31 Felina IL-31 Felina IL-31 Felina Tipo Selvagem Canino Equino Humano Tipo Selvagem Anticorpo Mutante Mutante Mutante 4/25
Controles Camundongo Camundongo
Petição 870200109884, de 31/08/2020, pág. 186/208 Felina_IL31_tipo selvagem Felina_IL31_11E12_mutante Felina_IL31_15H05_mutante
Felina_IL31_tipo selvagem Felina_IL31_11E12_mutante Felina_IL31_15H05_mutante
Felina_IL31_tipo selvagem Felina_IL31_11E12_mutante 6/25
Felina_IL31_15H05_mutante
Felina_IL31_tipo selvagem Felina_IL31_11E12_mutante Felina_IL31_15H05_mutante
IL-31 Felina Tipo Selvagem (SEQ ID NO:157)
ELISA de Proteína de Captura de IL-31 Felina Tipo Selvagem e Mutante
Concentração
Petição 870200109884, de 31/08/2020, pág. 188/208 de Anticorpo 8/25
Quimera de 11E12 de Quimera de 115H05 de Quimera de 11E12 de Quimera de 115H05 de Quimera de 11E12 de Quimera de 115H05 de camundongo:felina camundongo:felina camundongo:felina camundongo:felina camundongo:felina camundongo:felina Antígeno de revestimento IL-31 Felina Tipo Selvagem 11E12 mutante IL-31 felina 15H05 mutante IL-31 felina fIL-31:
Ligação de Competição à Superfície de IL-31 Canina usando Biacore Porcentagem de Ligação
Segundo Anticorpo de Captura
Primeiro Anticorpo de Captura
Ligação de Competição à Superfície de IL-31 Felina usando Biacore Porcentagem de Ligação
Segundo Anticorpo de Captura
Primeiro Anticorpo de Captura
ELISA de Proteína de Captura de IL-31 Felina Tipo Selvagem e Mutante
Concentração de Receptor
Petição 870200109884, de 31/08/2020, pág. 190/208 10/25
OSMR Felina IL-31Ra Felina OSMR Felina IL-31Ra Felina OSMR Felina IL-31Ra Felina Antígeno de revestimento Felina _IL-31_tipo selvagem Felina _IL-31_11E12 mutante Felina _IL-31_15H05 mutante fIL-31:
Prurido (durante 60 minutos)
T01 Placebo Veículo
T02 Quimera de 11E12 de Camundongo:Felina
T03 Quimera de 15H05 de Camundongo:Felina
T04 11E12 Felina 1.1
Dia de Estudo
* Uma única dose de Quimera 15H0S de Camundongo:Felina reduziu significantemente a atividade prurítica em 2 horas, 7 dias e 21 dias após a dose (p=0,0472, 0,0180 e 0.0025, respectivamente) quando comparada ao placebo veículo (T01).
CONTAGEM DE PRURIDOS PRÉ-DESAFIO Minutos de Prurido (fora de 30)
Dia de Estudo
CONTAGEM DE PRURIDOS PRÉ-DESAFIO Minutos de Prurido (fora de 60)
Dia de Estudo
Significância estatística entre tratamentos foi observada nos Dias de Estudo 7, 21 e 28 (P 0,0238).
Cães Beagle de Cães com Cães com 17 ANIMAIS Laboratório Dermatite Atópica Dermatite Alérgica Número de valores Mínimo 25% Percentil Petição 870200109884, de 31/08/2020, pág. 193/208 Mediano 75% Percentil Máximo Média Desvio Padrão Erro Padrão da Média Cl inferior a 95% da média Cl superior a 95% da média 13/25
CURSO DE TEMPO DE DESAFIO NÍVEIS MÉDIOS DE IL-31 SÉRICA (fg/ml) DE IL-31 IV ÚNICA VS. DIAGNÓSTICO PRESUMTIVO IL-31 SÉRICA (fg/ml) CONC. DE IL-31 (ng/ml)
DIAGÓSTICO PRESUNTIVO DE CONTROLE PAREADO TEMPO (HORAS)
DERMATITE ALÉRGICA POR IDADE
Petição 870200109884, de 31/08/2020, pág. 194/208 SUBSTITUIÇÕES PERMITIDAS DE AMINOÁCIDO EM IL-31 CANINA PARA RETER A LIGAÇÃO DE ANTICORPO 15H05
TODOS TODOS TODOS TODOS
EXCETO EXCETO EXCETO EXCETO
NENHUM NENHUM NENHUM NENHUM NENHUM ESPÉCIES DE IL-31
CANINA
FELINA
EQUINA
HUMANA 14/25 POSIÇÃO DE REF. CANINA DA SEQ ID NO 155
NÚMERO DE PEPTÍDEOS ZTS DESCRIÇÃO TIPO SEQUÊNCIA PEPTÍDICA (N A C TERMINAL) MIMOTOPO 15H05 DE LI31 - CANINO RESTRITO MIMOTOPO 15H05 DE LI31 - CANINO CURTO RESTRITO MIMOTOPO 15H05 DE LI31 - FELINO MIMOTOPO 15H05 DE LI31 – LIGAÇÃO
RESTRITO
ALTERNADA CANINA RESTRITO Petição 870200109884, de 31/08/2020, pág. 195/208 * CISTEÍNAS TERMINAIS (C) SUBLINHADAS CONECTOR mT2b ACIMA FORAM ADICIONADAS PARA CONECTOR mT2a
FACILITAR A CONJUGAÇÃO QUÍMICA
USANDO OS GRUPOS TIOIS LIVRES
PEPTÍDEO
PEPTÍDEO 15/25 INIBIÇÃO DE LIGAÇÃO DE ZTS-361 IL-31
USANDO PEPTÍDEOS IC50 DE CÉLULAS FCWF4 FELINAS (µg/ml) CRM-197
PEPTÍDEO CONJUGADO NÃO CONJUGADO
ND DEVIDO À SOLUBILIDADE POBRE
PEPTÍDEO CANINO DE ZTS-564 CRM DETERMINAR TÍTULOS SÉRICOS PARA:
HUMANA CÃES POR DOSE (N=4/GRUPO)
PEPTÍDEO FELINO DE ZTS-563 CRM MUTANTE
FELINA
PEPTÍDEO CANINO DE ZTS-562 CRM 16/25
EQUINA
PEPTÍDEO CANINO DE ZTS-561 CRM
CANINA CRM DE IL-31 FELINA
FELINA
CRM CONTROLE
PROTEÍNA Petição 870200109884, de 31/08/2020, pág. 196/208 IL-31
TÍTULO MÉDIO PARA IL-31 FELINA (N=4 CÃES/GRUPO) T02 (CRM DE IL-31 FELINA) Petição 870200109884, de 31/08/2020, pág. 197/208
TÍTULO
DIA 17/25 TÍTULO MÉDIO PARA 15H05 MUTANTE DE IL-31 FELINA (N=4 CÃES/GRUPO) T02 (CRM DE IL-31 FELINA)
TÍTULO
DIA
TÍTULO MÉDIO PARA IL-31 CANINA (N=4 CÃES/GRUPO) Imunogênio T02 (CRM DE IL-31 FELINA) Petição 870200109884, de 31/08/2020, pág. 198/208
TÍTULO
DIA 18/25 TÍTULO MÉDIO PARA IL-31 EQUIINA (N=4 CÃES/GRUPO) T02 (CRM DE IL-31 FELINA)
TÍTULO
DIA
Petição 870200109884, de 31/08/2020, pág. 199/208 TÍTULO MÉDIO PARA IL-31 HUMANA (N=4 CÃES/GRUPO) IMUNOGÊNIO T02 (CRM DE IL-31 FELINA)
TÍTULO 19/25
DIA
GRUPOS DE TRATAMENTO PARA SEGUNDO ESTUDO DE SOROLOGIA CANINA
GRUPO DE NÚMERO DE SEQUÊNCIA DE PEPTÍDEOS CONJUGADO TRATAMENTO PEPTÍDEOS ZTS DESCRIÇÃO TIPO (N A C TERMINAL) PARA IL-31 CANINA DE COMPRIMENTO PROTEÍNA
COMPLETO Petição 870200109884, de 31/08/2020, pág. 200/208
RESTRITO MIMOTOPO 15H05 CANINO MIMOTOPO 15H05 HUMANO RESTRITO
MIMOTOPO DE HÉLICE BC LINEAR
CANINO 20/25 ALINHAMENTO DE SEQUÊNCIA DE REGIÃO DE HÉLICE BC DE IL-31 DE MÚLTIPLAS ESPÉCIES
ESPÉCIES DE IL-31 SEQUÊNCIA DE PEPTÍDEOS (N A C TERMINAL)
CANINA
FELINA
EQUINA
HUMANA
NÚMERO DE AMINOÁCIDOS NA SEQUÊNCIA DE REFERÊNCIA
CANINA
FELINA
EQUINA
HUMANA
TÍTULOS DE CÃES PARA IL-31 CANINA E HUMANA APÓS A VACINAÇÃO COM PROTEÍNA OU MIMOTOPOS IL-31 CANINA COM
SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS CANINOS E HUMANOS TÍTULO MÉDIO (4 CÃES/GRUPO) TÍTULOS PARA IL-31 CANINA (SEQ ID NO 155)
DIA DE ESTUDO TÍTULOS PARA IL-31 HUMANA (SEQ ID NO 181) TÍTULO MÉDIO (4 CÃES)
DIA DE ESTUDO
GRUPOS DE TRATAMENTO PARA ESTUDO DE SOROLOGIA FELINA GRUPO DE NÚMERO DE SEQUÊNCIA DE PEPTÍDEOS (N A C CONJUGADO TRATAMENTO PEPTÍDEOS ZTS DESCRIÇÃO TIPO TERMINAL) PARA IL-31 FELINA DE COMPRIMENTO PROTEÍNA
COMPLETO Petição 870200109884, de 31/08/2020, pág. 202/208
RESTRITO CONECTOR mt2A DE MIMOTOPO 15H05 FELINO
RESTRITO MIMOTOPO 15H05 EQUINO LINEAR
MIMOTOPO DE HÉLICE BC FELINO RESTRITO CONECTOR mt2A DE MIMOTOPO 15H05 FELINO 22/25 TÍTULOS PARA IL-31 FELINA (SEQ ID NO 157)
DIA DE ESTUDO TÍTULO MÉDIO (4 CÃES/GRUPO)
NÚMERO DE GRUPO
ALINHAMENTO DE SEQUÊNCIA DE REGIÃO DE HÉLICE A DE IL-31 DE MÚLTIPLAS ESPÉCIES
ESPÉCIES DE IL-31 SEQUÊNCIA DE PEPTÍDEOS (N A C TERMINAL)
CANINA Petição 870200109884, de 31/08/2020, pág. 203/208
FELINA
EQUINA
HUMANA
NÚMERO DE AMINOÁCIDOS NA SEQUÊNCIA DE REFERÊNCIA
CANINA
FELINA
EQUINA
HUMANA 23/25 ALINHAMENTO DE SEQUÊNCIA DE REGIÃO DE HÉLICE A ESTENDIDA DE IL-31 DE MÚLTIPLAS
ESPÉCIES
ESPÉCIES DE IL-31 SEQUÊNCIA DE PEPTÍDEOS (N A C TERMINAL)
CANINA
FELINA
EQUINA
HUMANA
NÚMERO DE AMINOÁCIDOS NA SEQUÊNCIA DE REFERÊNCIA
CANINA
FELINA
EQUINA
HUMANA
ALINHAMENTO DE SEQUÊNCIA DE REGIÃO DE ALÇA AB DE IL-31
DE MÚLTIPLAS ESPÉCIES
ESPÉCIES DE IL-31 SEQUÊNCIA DE PEPTÍDEOS (N A C TERMINAL)
CANINA
FELINA
EQUINA
HUMANA
NÚMERO DE AMINOÁCIDOS NA SEQUÊNCIA DE REFERÊNCIA
CANINA
FELINA
EQUINA
HUMANA
MIMOTOPOS EQUINOS USADOS PARA A RESPOSTA DE IL-31 ANTI-EQUINA DE CAMUNDONGO DE SONDA
ESPÉCIES DE IL-31 MIMOTOPO SEQUÊNCIA DE PEPTÍDEOS (N A C TERMINAL)
EQUINA
EQUINA HÉLICE BC Petição 870200109884, de 31/08/2020, pág. 205/208
EQUINA HÉLICE A
NÚMERO DE AMINOÁCIDOS NA SEQUÊNCIA DE REFERÊNCIA
EQUINA
EQUINA HÉLICE BC
EQUINA HÉLICE A 25/25
LIGAÇÃO DE SORO DE CAMUNDONGO VACINADO VERSUS CONTROLE DE IL-31 EQUINA PARA MIMOTOPOS DE IL-31 EQUINA USANDO INTERFEROMETRIA DE BIO-CAMADA
DILUIÇÃO SÉRICA RESPOSTA (nm) SORO DE IL- SORO SORO DE IL- SORO SORO DE IL- SORO 31 ANTI- CONTROLE 31 ANTI- CONTROLE 31 ANTI- CONTROLE
EQUINA EQUINA EQUINA
HÉLICE BC HÉLICE A
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