CN112135628A - 抗白介素31的肽疫苗 - Google Patents

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Abstract

提供一种用于免疫和/或保护哺乳动物使其免于IL‑31介导的病症的疫苗组合物，其中所述组合物包含：载体多肽与至少一种选自由猫IL‑31模拟表位、犬IL‑31模拟表位、马IL‑31模拟表位和人类IL‑31模拟表位组成的组的模拟表位的组合；以及佐剂。此类疫苗可以是呈药物组合物的形式，其可用于治疗或保护哺乳动物例如猫、狗、马或人使其免于IL‑31介导的病症。

Description

抗白介素31的肽疫苗
技术领域
本发明涉及肽疫苗及其在临床和科学程序(包括诊断程序)中的用途的领域。本发明的肽疫苗可用于免疫和/或保护哺乳动物例如猫、狗、马或人使其免于IL-31介导的病症。
背景技术
特应性皮炎已被美国兽医皮肤病学会(American College of VeterinaryDermatology)特别工作组定义为“具有特征性临床特征的遗传易感性炎性和瘙痒性过敏性皮肤病”(Olivry等人Veterinary Immunology and Immunopathology 2001；81：143-146)。特别工作组还认识到犬科动物中的疾病与过敏原特异性IgE有关(Olivry等人2001同上；Marsella&Olivry Clinics in Dermatology 2003；21：122-133)。对于宠物主人来说，严重瘙痒伴随继发性脱毛和红斑是最明显且最受关注的症状。
过敏性皮炎中涉及的潜在因素很多，并且知之甚少。食物中的组分可能引发特应性皮炎(Picco等人Vet Dermatol.2008；19：150-155)，并且环境过敏原，诸如跳蚤、尘螨、豚草、植物提取物等也一样。遗传因素也起着重要的作用。尽管没有确认的品种偏好性，但认为某些遗传模式会增加特应性皮炎的易感性(Sousa&Marsella Veterinary Immunologyand Immunopathology 2001；81：153-157；Schwartzman等人Clin.Exp.Immunol.1971；9：549-569)。
据估计特应性皮炎的患病率为犬类群体总数的10％(Marsella&Olivry 2003同上；Scott等人Canadian Veterinary Journal 2002；43：601-603；Hillier VeterinaryImmunology and Immunopathology 2001；81：147-151)。在全球范围内，约450万只狗患有这种慢性和终身病状。发病率似乎正在增加。犬品种和性别偏好已受到怀疑，但可能因地理区域而有很大差异(Hillier，2001同上；Picco等人2008同上)。
猫过敏性皮炎是一种炎性和瘙痒性皮肤病状，其被认为是由免疫系统对在健康猫中不会诱导反应的物质的异常应答而引起。猫过敏性皮炎的最一致的特征是慢性复发性瘙痒。猫过敏性皮炎的常见临床表现包括自发性脱毛、粟粒性皮炎、嗜酸性肉芽肿复杂病变(包括斑块、肉芽肿和无痛性溃疡)以及特征在于表皮剥蚀、糜烂和/或溃疡的集中性头颈部瘙痒。尚未证明品种和性别偏好性，并且幼猫似乎更容易患上这种疾病(Hobi等人VetDermatol 2011 22：406-413；Ravens等人Vet Dermatol 2014；25：95-102；Buckely InPractice 2017；39：242-254)。
当前对诊断患有过敏性皮炎的猫的治疗取决于临床体征的严重程度、持续时间和主人的偏好，并包括过敏原特异性免疫疗法和止痒药，例如糖皮质激素和环孢菌素(Buckley，同上)。免疫疗法治疗对某些患者是有效的，但需要频繁注射，并且可能在6-9个月内未见临床改善(Buckley，同上)。免疫抑制药物如糖皮质激素和环孢菌素通常是有效的，但是长期使用通常导致不期望的副作用。
马特应性皮炎被认为是潜在的瘙痒原因。越来越认识到环境过敏原在马特应性皮炎中的作用。所述疾病可能是季节性或非季节性的，这取决于所涉及的一种或多种过敏原。尚未广泛报告年龄、品种和性别偏好。在加州大学戴维斯分校的兽医学院(School ofVeterinary Medicine，University of Califomia，Davis，SVM-UCD)的初步工作中，中值发病年龄为6.5岁，纯种马是最常见的品种，占马的25％，并且雄性(通常为阉马)则几乎是母马的两倍；但是，这些数据仅来自24匹马，并且尚未与普通医院群体进行比较。经常针对面部、远端腿部或躯干的瘙痒是马特应性皮炎的最常见临床体征。脱毛、红斑、荨麻疹和丘疹都可能存在。荨麻疹性病变可能很严重，但不瘙痒。马荨麻疹性特应性皮炎可能存在家族因素。马可能患有继发性脓皮病，典型表现为过度落屑、小表皮环形脱屑或结壳丘疹(“粟粒性皮炎”)。特应性皮炎的诊断是基于临床体征和其他诊断的排除，尤其是昆虫(库蠓)超敏性(White Clin Tech Equine Pract 2005；4：311-313；Fadok Vet Clin Equine 2013；29541-550)。当前，通过抑制由过敏应答引发的炎症和瘙痒，并通过解决具体原因(即，通过鉴定负责的过敏原并通过配制过敏原特异性疫苗)，对症地对马特应性皮炎进行管理。在短期内通常需要对症治疗，以使患者感到舒适并最大程度地减少自身创伤。这种方法依赖于局部和全身疗法的组合使用，包括抗组胺药、必需脂肪酸、己酮可可碱和糖皮质激素。控制环境过敏的主要方法涉及鉴定引发超敏反应的过敏原。皮肤科医生普遍认为，过敏原特异性免疫疗法对特应性马有帮助。但是，一般而言，大多数马仅在免疫疗法的前6个月后才显示出改善(Marsella Vet Clin Equine 2013；29：551-557)。而且，对马长期使用免疫抑制药物可能会导致不期望的副作用。
由2型T辅助细胞产生的细胞因子白介素31(IL-31)已显示在人、小鼠和狗中诱导瘙痒(Bieber N Engl J Med 2008；358：1483-1494；Dillon等人Nat Immunol 2004；5：752-60；Bammert等人的美国专利号8,790,651；Gonzalez等人Vet Dermatl.2013；24(1)：48-53)。IL-31结合由IL-31受体A(IL-31RA)和制瘤素M受体(OSMR)组成的共受体(Dillon等人2004同上以及Bilsborough等人J Allergy Clin Immunol.2006 117(2)：418-25)。受体活化导致STAT通过JAK受体磷酸化。共受体的表达已在巨噬细胞、角质形成细胞和背根神经节中显示。
最近，已经发现IL-31牵涉于皮炎、瘙痒性皮肤病变、过敏和气道超敏反应。由新泽西州帕西帕尼佐伊蒂斯公司(Zoetis Inc.，Parsippany，NJ)生产的犬类抗IL-31单克隆抗体
Figure BDA0002776924470000031
已显示可减轻患有特应性皮炎的狗的瘙痒和皮肤病变(Gonzalez等人2013同上，Michels等人Vet Dermatol.2016；12月；27(6)：478-e129)。期望提供预防和治疗哺乳动物中的IL-31介导的病症的替代性方法。特别期望提供减少患有特应性皮炎的狗、猫、马和人的瘙痒和皮肤损伤的疫苗。
发明内容
在一个实施方案中，本发明提供了一种疫苗组合物，其用于免疫和/或保护哺乳动物使其免于IL-31介导的病症，其中所述组合物包含：载体多肽与至少一种选自猫IL-31模拟表位、犬IL-31模拟表位、马IL-31模拟表位或人IL-31模拟表位的模拟表位的组合；以及佐剂。
在所述疫苗组合物的一个实施方案中，犬IL-31模拟表位为氨基酸序列SVPADTFECKSF(SEQ ID NO：186)、SVPADTFERKSF(SEQ ID NO：187)、NSSAILPYFRAIRPLSDKNIIDKIIEQLDKLKF(SEQ ID NO：192)、APTHQLPPSDVRKIILELQPLSRG(SEQ ID NO：196)、TGVPES(SEQ ID NO：200)或其保留抗IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
在所述疫苗组合物的另一个实施方案中，猫IL-31模拟表位为氨基酸序列SMPADNFERKNF(SEQ ID NO：188)、NG SAILPYFRAIRPLSDKNTIDKIIEQLDKLKF(SEQ ID NO：193)、APAHRLQPSDIRKIILELRPM SKG(SEQ ID NO：197)、IGLPES(SEQ ID NO：201)或其保留抗IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
在所述疫苗组合物的另一个实施方案中，马IL-31模拟表位为氨基酸序列SMPTDNFERKRF(SEQ ID NO：189)、NS SAILPYFKAISPSLNNDKSLYIIEQLDKLNF(SEQ ID NO：194)、GPIYQLQPKEIQAIIVELQNLS KK(SEQ ID NO：198)、KGVQKF(SEQ ID NO：202)或其保留抗IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
在所述疫苗组合物的另一个实施方案中，人IL-31模拟表位为氨基酸序列SVPTDTHECKRF(SEQ ID NO：190)、SVPTDTHERKRF(SEQ ID NO：191)、HSPAIRAYLKTIRQLDNKSVIDEIIEHLDKLIF(SEQ ID NO：195)、LPVRLLRPSDDVQKIVEELQSLSKM(SEQ ID NO：199)、KGVLVS(SEQ ID NO：203)或其保留抗IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
在一个实施方案中，疫苗组合物中含有的模拟表位结合至抗IL31抗体或其抗原结合部分，所述抗IL31抗体或其抗原结合部分特异性结合至哺乳动物IL-31蛋白上涉及IL-31蛋白与其共受体的相互作用的区域。在一个实施方案中，所述抗体与所述区域的结合受到选自由以下组成的组的15H05表位结合区中的突变的影响：
a)由SEQ ID NO：157(猫_IL31_野生型)表示的猫IL-31序列的约氨基酸残基124与135之间的区域；
b)由SEQ ID NO：155(犬_IL31)表示的犬IL-31序列的约氨基酸残基124与135之间的区域；以及
c)由SEQ ID NO：165(马_IL31)表示的马IL-31序列的约氨基酸残基118与129之间的区域。
在一个实施方案中，模拟表位结合至抗IL-31抗体或其抗原结合部分，其包含以下互补决定区(CDR)序列的组合中的至少一种：
1)抗体15H05：SYTIH(SEQ ID NO：1)的可变重链(VH)-CDR1、NINPTSGYTENNQRFKD(SEQ ID NO：2)的VH-CDR2、WGFKYDGEWSFDV(SEQ ID NO：3)的VH-CDR3、RASQGISIWLS(SEQ IDNO：4)的可变轻链(VL)-CDR1、KASNLHI(SEQ ID NO：5)的VL-CDR2和LQSQTYPLT(SEQ ID NO：6)的VL-CDR3；
2)抗体ZIL1：SYGMS(SEQ ID NO：13)的可变重链(VH)-CDR1、HINSGGSSTYYADAVKG(SEQ ID NO：14)的VH-CDR2、VYTTLAAFWTDNFDY(SEQ ID NO：15)的VH-CDR3、SGSTNNIGILAAT(SEQ ID NO：16)的可变轻链(VL)-CDR1、SDGNRPS(SEQ ID NO：17)的VL-CDR2和QSFDTTLDAYV(SEQ ID NO：18)的VL-CDR3；
3)抗体ZIL8：DYAMS(SEQ ID NO：19)的VH-CDR1、GIDSVGSGTSYADAVKG(SEQ ID NO：20)的VH-CDR2、GFPGSFEH(SEQ ID NO：21)的VH-CDR3、TGSSSNIGSGYVG(SEQ ID NO：22)的VL-CDR1、YNSDRPS(SEQ ID NO：23)的VL-CDR2、SVYDRTFNAV(SEQ ID NO：24)的VL-CDR3；
4)抗体ZIL9：SYDMT(SEQ ID NO：25)的VH-CDR1、DVNSGGTGTAYAVAVKG(SEQ ID NO：26)的VH-CDR2、LGVRDGLSV(SEQ ID NO：27)的VH-CDR3、SGESLNEYYTQ(SEQ ID NO：28)的VL-CDR1、RDTERPS(SEQ ID NO：29)的VL-CDR2、ESAVDTGTLV(SEQ ID NO：30)的VL-CDR3；
5)抗体ZIL11：TYVMN(SEQ ID NO：31)的VH-CDR1、SINGGGSSPTYADAVRG(SEQ ID NO：32)的VH-CDR2、SMVGPFDY(SEQ ID NO：33)的VH-CDR3、SGESLSNYYAQ(SEQ ID NO：34)的VL-CDR1、KDTERPS(SEQ ID NO：35)的VL-CDR2、ESAVSSDTIV(SEQ ID NO：36)的VL-CDR3；
6)抗体ZIL69：SYAMK(SEQ ID NO：37)的VH-CDR1、TINNDGTRTGYADAVRG(SEQ ID NO：38)的VH-CDR2、GNAESGCTGDHCPPY(SEQ ID NO：39)的VH-CDR3、SGESLNKYYAQ(SEQ ID NO：40)的VL-CDR1、KDTERPS(SEQ ID NO：41)的VL-CDR2、ESAVSSETNV(SEQ ID NO：42)的VL-CDR3；
7)抗体ZIL94：TYFMS(SEQ ID NO：43)的VH-CDR1、LISSDGSGTYYADAVKG(SEQ ID NO：44)的VH-CDR2、FWRAFND(SEQ ID NO：45)的VH-CDR3、GLNSGSVSTSNYPG(SEQ ID NO：46)的VL-CDR1、DTGSRPS(SEQ ID NO：47)的VL-CDR2、SLYTDSDILV(SEQ ID NO：48)的VL-CDR3；
8)抗体ZIL154：DRGMS(SEQ ID NO：49)的VH-CDR1、YIRYDGSRTDYADAVEG(SEQ IDNO：50)的VH-CDR2、WDGSSFDY(SEQ ID NO：51)的VH-CDR3、KASQSLLHSDGNTYLD(SEQ ID NO：52)的VL-CDR1、KVSNRDP(SEQ ID NO：53)的VL-CDR2、MQAIHFPLT(SEQ ID NO：54)的VL-CDR3；
9)抗体ZIL159：SYVMT(SEQ ID NO：55)的VH-CDR1、GINSEGSRTAYADAVKG(SEQ IDNO：56)的VH-CDR2、GDIVATGTSY(SEQ ID NO：57)的VH-CDR3、SGETLNRFYTQ(SEQ ID NO：58)的VL-CDR1、KDTERPS(SEQ ID NO：59)的VL-CDR2、KSAVSIDVGV(SEQ ID NO：60)的VL-CDR3；
10)抗体ZIL171：TYVMN(SEQ ID NO：61)的VH-CDR1、SINGGGSSPTYADAVRG(SEQ IDNO：62)的VH-CDR2、SMVGPFDY(SEQ ID NO：63)的VH-CDR3、SGKSLSYYYAQ(SEQ ID NO：64)的VL-CDR1、KDTERPS(SEQ ID NO：65)的VL-CDR2、ESAVSSDTIV(SEQ ID NO：66)的VL-CDR3；或者
11)1)至10)的变体，其与相应亲本抗体15H05、ZIL1、ZIL8、ZIL9、ZIL11、ZIL69、ZIL94、ZIL154、ZIL159或ZIL171的不同之处在于在VH或VL CDR1、CDR2或CDR3的至少一个中添加、缺失和/或取代一个或多个氨基酸残基。
在一些实施方案中，用于本发明的疫苗组成物中的模拟表位结合至与猫IL-31结合的抗IL-31抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含VL链，所述VL链包含选自以下的框架2(FW2)变化：在位置42处以天冬酰胺代替赖氨酸、在位置43处以异亮氨酸代替缬氨酸、在位置46处以缬氨酸代替亮氨酸、在位置49处以天冬酰胺代替赖氨酸及其组合，其中所述位置参照SEQ ID NO：127(FEL_15H05_VL1)的编号。
在上文所述的疫苗组合物的一个实施方案中，模拟表位是限制性模拟表位。在一个特定实施方案中，限制性模拟表位是化学连接的环状肽。
在上文所述的疫苗组合物的一些实施方案中，模拟表位化学缀合至载体多肽。在其他实施方案中，载体多肽和模拟表位是重组融合蛋白的一部分。
在上文所述的疫苗组合物的一个实施方案中，与模拟表位组合的载体多肽包括细菌类毒素或其衍生物、钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)或病毒样颗粒。在一个实施方案中，模拟表位与选自破伤风类毒素、白喉类毒素、破伤风类毒素、脑膜炎双球菌B组的外膜蛋白复合物、假单胞菌外毒素或白喉毒素无毒突变体(CRM197)的细菌类毒素或衍生物组合。在另一个实施方案中，模拟表位与选自HBsAg、HBcAg、大肠杆菌噬菌体Qβ、诺沃克病毒，犬瘟热病毒(CDV)或流感HA的病毒样颗粒组合。在一个具体实施方案中，模拟表位与包含CRM197或由其组成的载体多肽组合。
在一个实施方案中，本发明的上文所述的疫苗组合物中含有的佐剂选自水包油佐剂、聚合物和水佐剂、油包水佐剂、氢氧化铝佐剂、维生素E佐剂及其组合。
在一个实施方案中，佐剂是包含皂苷、固醇、季铵化合物和聚合物的制剂。在一个具体实施方案中，皂苷为Quil A或其纯化级分，固醇为胆固醇，季铵化合物为二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)，并且聚合物为聚丙烯酸。
在另一个实施方案中，佐剂包含一种或多种分离的免疫刺激性寡核苷酸、固醇和皂苷的组合。在一个具体实施方案中，一种或多种分离的免疫刺激性寡核苷酸包括CpG，固醇为胆固醇，并且皂苷为Quil A或其纯化级分。
本发明还提供一种保护哺乳动物使其免于IL-31介导的病症的方法。此种方法包括向哺乳动物施用根据本发明的疫苗组合物。在一个实施方案中，根据本发明的疫苗所施用的哺乳动物选自狗、猫、马或人。在一个具体实施方案中，疫苗组合物包含IL-31肽模拟表位，其以每剂量约10μg至约100μg或引起等效免疫应答的对应剂量向哺乳动物施用。在一个实施方案中，疫苗组合物包含IL-31模拟表位，其以每剂量约10μg向哺乳动物例如猫施用。
在一个实施方案中，IL-31介导的病症是瘙痒或过敏性病状。在一些实施方案中，瘙痒或过敏性病状是选自特应性皮炎、湿疹、银屑病、硬皮病和瘙痒的瘙痒病状。在其他实施方案中，瘙痒或过敏性病状是选自以下的过敏性病状：过敏性皮炎、夏季湿疹、荨麻疹、肺气肿、气道炎性疾病、复发性气道阻塞、气道高反应性、慢性阻塞性肺病和自身免疫引起的炎症过程。在其他实施方案中，IL-31介导的病症是肿瘤进展。在一些实施方案中，IL-31介导的病症是嗜酸性疾病或肥大细胞瘤。
本文还提供一种确定样品中抗IL-31抗体的身份和/或量的方法。此种方法包括将包含抗IL-31抗体的样品与至少一种选自猫IL-31模拟表位、犬IL-31模拟表位、马IL-31模拟表位和人IL-31模拟表位的模拟表位一起孵育；以及确定样品中抗IL-31的身份和/或数量。
在一个实施方案中，用于确定样品中抗IL-31抗体的身份和/或量的方法中的犬IL-31模拟表位为氨基酸序列SVPADTFECKSF(SEQ ID NO：186)、SVPADTFERKSF(SEQ ID NO：187)、NSSAILPYFRAIRPLSDKNIIDKIIEQLDKLKF(SEQ ID NO：192)、APTHQLPPSDVRKIILELQPLSRG(SEQ ID NO：196)、TGVPES(SEQ ID NO：200)或其保留抗IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
在另一个实施方案中，用于此种方法中的猫IL-31模拟表位为氨基酸序列SMPADNFERKNF(SEQ ID NO：188)、NGSAILPYFRAIRPLSDKNTIDKIIEQLDKLKF(SEQ ID NO：193)、APAHRLQPSDIRKIILELRPM SKG(SEQ ID NO：197)、IGLPES(SEQ ID NO：201)或其保留抗IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
在另一个实施方案中，用于此种方法中的马IL-31模拟表位为氨基酸序列SMPTDNFERKRF(SEQ ID NO：189)、NSSAILPYFKAISPSLNNDKSLYIIEQLDKLNF(SEQ ID NO：194)、GPIYQLQPKEIQAIIVELQNLS KK(SEQ ID NO：198)、KGVQKF(SEQ ID NO：202)或其保留抗IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
更进一步地，用于此种方法中的人IL-31模拟表位为氨基酸序列SVPTDTHECKRF(SEQ ID NO：190)、SVPTDTHERKRF(SEQ ID NO：191)、HSPAIRAYLKTIRQLDNKSVIDEIIEHLDKLIF(SEQ ID NO：195)、LPVRLLRPSDDVQKIVEELQSLSKM(SEQ ID NO：199)、KGVLVS(SEQ ID NO：203)或其保留抗IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
在上文所述的诊断方法的一个实施方案中，模拟表位为结合至固体表面的捕获试剂。在一个实施方案中，将样品添加到模拟表位捕获试剂中；并且然后添加第二检测试剂，以对样品中抗体的量进行定量。
本发明还提供一种确定来自哺乳动物的样品中IL-31的量的方法。此种方法包括将包含IL-31的哺乳动物样品与拴系至固体表面的标记的抗IL-31抗体：IL-31模拟表位复合物一起孵育，其中复合物中的模拟表位选自由猫IL-31模拟表位、犬IL-31模拟表位、马IL-31模拟表位和人IL-31模拟表位组成的组；以及确定样品中IL-31的水平，其中复合物中标记的抗IL-31抗体对复合物中的模拟表位的亲和力低于其对样品中的IL-31的亲和力。在此方法的一个实施方案中，确定步骤包括测量当样品中的IL-31结合至复合物的标记的抗IL-3抗体时从固体表面释放的标记的抗体的信号，样品中的IL-31与信号成反比。
在一个实施方案中，用于确定样品中IL-31的量的方法中的犬IL-31模拟表位为氨基酸序列SVPADTFECKSF(SEQ ID NO：186)、SVPADTFERKSF(SEQ ID NO：187)、NSSAILPYFRAIRPLSDKNIIDKIIEQLDKLKF(SEQ ID NO：192)、APTHQLPPSDVRKIILELQPLSRG(SEQ ID NO：196)、TGVPES(SEQ ID NO：200)或其保留IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
在另一个实施方案中，用于此种方法中的猫IL-31模拟表位为氨，基酸序列SMPADNFERKNF(SEQ ID NO：188)、NGSAILPYFRAIRPLSDKNTIDKIIEQLDKLKF(SEQ ID NO：193)、APAHRLQPSDIRKIILELRPM SKG(SEQ ID NO：197)、IGLPES(SEQ ID NO：201)或其保留抗IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
在又另一个实施方案中，用于此种方法中的马IL-31模拟表位为氨基酸序列SMPTDNFERKRF(SEQ ID NO：189)、NSSAILPYFKAISPSLNNDKSLYIIEQLDKLNF(SEQ ID NO：194)、GPIYQLQPKEIQAIIVELQNLS KK(SEQ ID NO：198)、KGVQKF(SEQ ID NO：202)或其保留抗IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
在另一个实施方案中，用于此种方法中的人IL-31模拟表位为氨基酸序列SVPTDTHECKRF(SEQ ID NO：190)、SVPTDTHERKRF(SEQ ID NO：191)、HSPAIRAYLKTIRQLDNKSVIDEIIEHLDKLIF(SEQ ID NO：195)、LPVRLLRPSDDVQKIVEELQSLSKM(SEQ ID NO：199)、KGVLVS(SEQ ID NO：203)或其保留抗IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
在本发明的任何上文所述的诊断方法的一些实施方案中，模拟表位结合至抗IL31抗体或其抗原结合部分，所述抗IL31抗体或其抗原结合部分特异性结合至哺乳动物IL-31蛋白上涉及IL-31蛋白与其共受体的相互作用的区域。在本发明的诊断方法的一个实施方案中，所述抗体与所述区域的结合受到选自由以下组成的组的15H05表位结合区域中的突变的影响：
a)由SEQ ID NO：157(猫_IL31_野生型)表示的猫IL-31序列的约氨基酸残基124与135之间的区域；
b)由SEQ ID NO：155(犬_IL31)表示的犬IL-31序列的约氨基酸残基124与135之间的区域；以及
c)由SEQ ID NO：165(马_IL31)表示的马IL-31序列的约氨基酸残基118与129之间的区域。
在本发明的任何诊断方法的一个具体实施方案中，模拟表位结合至抗IL-31抗体或其抗原结合部分，所述IL-31抗体或其抗原结合部分包含以下互补决定区(CDR)序列的组合中的至少一种：
1)抗体15H05：SYTIH(SEQ ID NO：1)的可变重链(VH)-CDR1、NINPTSGYTENNQRFKD(SEQ ID NO：2)的VH-CDR2、WGFKYDGEWSFDV(SEQ ID NO：3)的VH-CDR3、RASQGISIWLS(SEQ IDNO：4)的可变轻链(VL)-CDR1、KASNLHI(SEQ ID NO：5)的VL-CDR2和LQSQTYPLT(SEQ ID NO：6)的VL-CDR3；
2)抗体ZIL1：SYGMS(SEQ ID NO：13)的可变重链(VH)-CDR1、HINSGGSSTYYADAVKG(SEQ ID NO：14)的VH-CDR2、VYTTLAAFWTDNFDY(SEQ ID NO：15)的VH-CDR3、SGSTNNIGILAAT(SEQ ID NO：16)的可变轻链(VL)-CDR1、SDGNRPS(SEQ ID NO：17)的VL-CDR2和QSFDTTLDAYV(SEQ ID NO：18)的VL-CDR3；
3)抗体ZIL8：DYAMS(SEQ ID NO：19)的VH-CDR1、GIDSVGSGTSYADAVKG(SEQ ID NO：20)的VH-CDR2、GFPGSFEH(SEQ ID NO：21)的VH-CDR3、TGSSSNIGSGYVG(SEQ ID NO：22)的VL-CDR1、YNSDRPS(SEQ ID NO：23)的VL-CDR2、SVYDRTFNAV(SEQ ID NO：24)的VL-CDR3；
4)抗体ZIL9：SYDMT(SEQ ID NO：25)的VH-CDR1、DVNSGGTGTAYAVAVKG(SEQ ID NO：26)的VH-CDR2、LGVRDGLSV(SEQ ID NO：27)的VH-CDR3、SGESLNEYYTQ(SEQ ID NO：28)的VL-CDR1、RDTERPS(SEQ ID NO：29)的VL-CDR2、ESAVDTGTLV(SEQ ID NO：30)的VL-CDR3；
5)抗体ZIL11：TYVMN(SEQ ID NO：31)的VH-CDR1、SINGGGSSPTYADAVRG(SEQ ID NO：32)的VH-CDR2、SMVGPFDY(SEQ ID NO：33)的VH-CDR3、SGESLSNYYAQ(SEQ ID NO：34)的VL-CDR1、KDTERPS(SEQ ID NO：35)的VL-CDR2、ESAVSSDTIV(SEQ ID NO：36)的VL-CDR3；
6)抗体ZIL69：SYAMK(SEQ ID NO：37)的VH-CDR1、TINNDGTRTGYADAVRG(SEQ ID NO：38)的VH-CDR2、GNAESGCTGDHCPPY(SEQ ID NO：39)的VH-CDR3、SGESLNKYYAQ(SEQ ID NO：40)的VL-CDR1、KDTERPS(SEQ ID NO：41)的VL-CDR2、ESAVSSETNV(SEQ ID NO：42)的VL-CDR3；
7)抗体ZIL94：TYFMS(SEQ ID NO：43)的VH-CDR1、LISSDGSGTYYADAVKG(SEQ ID NO：44)的VH-CDR2、FWRAFND(SEQ ID NO：45)的VH-CDR3、GLNSGSVSTSNYPG(SEQ ID NO：46)的VL-CDR1、DTGSRPS(SEQ ID NO：47)的VL-CDR2、SLYTDSDILV(SEQ ID NO：48)的VL-CDR3；
8)抗体ZIL154：DRGMS(SEQ ID NO：49)的VH-CDR1、YIRYDGSRTDYADAVEG(SEQ IDNO：50)的VH-CDR2、WDGSSFDY(SEQ ID NO：51)的VH-CDR3、KASQSLLHSDGNTYLD(SEQ ID NO：52)的VL-CDR1、KVSNRDP(SEQ ID NO：53)的VL-CDR2、MQAIHFPLT(SEQ ID NO：54)的VL-CDR3；
9)抗体ZIL159：SYVMT(SEQ ID NO：55)的VH-CDR1、GINSEGSRTAYADAVKG(SEQ IDNO：56)的VH-CDR2、GDIVATGTSY(SEQ ID NO：57)的VH-CDR3、SGETLNRFYTQ(SEQ ID NO：58)的VL-CDR1、KDTERPS(SEQ ID NO：59)的VL-CDR2、KSAVSIDVGV(SEQ ID NO：60)的VL-CDR3；
10)抗体ZIL171：TYVMN(SEQ ID NO：61)的VH-CDR1、SINGGGSSPTYADAVRG(SEQ IDNO：62)的VH-CDR2、SMVGPFDY(SEQ ID NO：63)的VH-CDR3、SGKSLSYYYAQ(SEQ ID NO：64)的VL-CDR1、KDTERPS(SEQ ID NO：65)的VL-CDR2、ESAVSSDTIV(SEQ ID NO：66)的VL-CDR3；或者
11)1)至10)的变体，其与相应亲本抗体15H05、ZIL1、ZIL8、ZIL9、ZIL11、ZIL69、ZIL94、ZIL154、ZIL159或ZIL171的不同之处在于在VH或VL CDR1、CDR2或CDR3的至少一个中添加、缺失和/或取代一个或多个氨基酸残基。
在一些实施方案中，用于本发明的诊断方法中的模拟表位结合至与猫IL-31结合的抗IL-31抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含VL链，所述VL链包含选自以下的框架2(FW2)变化：在位置42处以天冬酰胺代替赖氨酸、在位置43处以异亮氨酸代替缬氨酸、在位置46处以缬氨酸代替亮氨酸、在位置49处以天冬酰胺代替赖氨酸及其组合，其中所述位置参照SEQ ID NO：127(FEL_15H05_VL1)的编号。
附图说明
图1是示出来自不同物种的IL-31之间的氨基酸序列保守性的比对。特别是，示出了SEQ ID NO：155(犬IL-31)、SEQ ID NO：157(猫IL-31)、SEQ ID NO：165(马IL-31)和SEQID NO：181(人IL-31)之间的比较。还指出了犬、猫、马和人IL-31之间的氨基酸序列同一性百分比。
图2详述了在Biacore系统(Biacore Life Sciences(GE Healthcare)，Uppsala，Sweden)上使用表面等离子体共振(SPR)获得的具有来源于小鼠来源的CDR的候选抗体与猫和犬IL-31结合的亲和力。
图3是示出通过犬和猫细胞测定法测量的具有来源于小鼠来源的CDR的候选抗体的效力(IC50(μg/ml))的表。特别地，评定候选抗体在犬DH-82或猫FCWF4巨噬细胞样细胞中抑制IL-31介导的STAT磷酸化的能力。
图4示出使用间接ELISA和Biacore方法获得的具有狗来源的CDR的候选单克隆抗体与各种蛋白质结合的结果。对于间接ELISA，评定与野生型猫IL-31和在单克隆抗体15H05表位区域中具有突变的猫IL-31 15H05突变体的结合(ELISA OD)。为了确认结合，使用犬、猫、马、人、猫15H05突变体和猫11E12突变体IL-31蛋白作为表面和单一测试浓度的抗体进行biacore分析。猫IL-31 11E12突变体在单克隆抗体11E12表位区域中具有突变。
图5-图5A示出了小鼠抗体11E12 VL序列(SEQ ID NO：73)的比对，将指定为Can_11E12_VL_cUn_1(SEQ ID NO：182)和CAN_11E12_VL_cUn_FW2(SEQ ID NO：184)的先前公开的犬源化11E12序列与指定为FEL_11E12_VH1(SEQ ID NO：111)和FEL_11E12_VL1_FW2(SEQID NO：117)的猫源化形式进行比较。图5A中的比对下方标注了示出Fel_11E12_VL1的相关变化的位置的点，所述位置是恢复此抗体与IL-31蛋白的亲和力所必需的。图5B示出了本文指定为MU_15H05_VL(SEQ ID NO：69)的小鼠抗体15H05 VL序列与本文指定为FE1_15H05_VL1(SEQ ID NO：127)和FE1_15H05_VL_FW2(SEQ ID NO：135)的猫源化15H05 VL序列的比对。图5B中的比对下方的点表示与此抗体的小鼠形式和嵌合形式相比，是不仅恢复而且提高其对犬和猫IL-31的亲和力所需的猫源化15H05 VL(Fel_15H05_VL1)的必要改变。
图6-图6A示出了野生型猫IL-31(SEQ ID NO：157)与突变体15H05(SEQ ID NO：163)和11E12(SEQ ID NO：161)的比对，其突出了发生丙氨酸取代的位置。图6B示出了猫IL-31同源模型，其突出了与抗体11E12(位点1)和15H05(位点2)的结合有关的两个氨基酸的位置。图6C是示出当野生型和这些突变体用作包被抗原时对于单克隆抗体11E12和15H05与野生型猫IL-31以及与突变体IL-31蛋白15H05(SEQ ID NO：163)和11E12(SEQ ID NO：161)的结合所获得的结果的图表。
图7是示出使用Biacore进行mAb 15H05和11E12的竞争结合评定的图表。图7A示出了小鼠15H05和11E12抗体对犬IL-31的竞争结合数据。图7B示出了抗体15H05和11E12在猫IL-31表面上的竞争结合数据。
图8是示出当野生型和这些突变体用作包被抗原时对于OSMR和IL-31Ra的各个受体亚基与野生型猫IL-31以及与突变体IL-31蛋白15H05(SEQ ID NO：163)和11E12(SEQ IDNO：161)的结合所获得的结果的图表。
图9是示出小鼠：猫11E12嵌合体、小鼠：猫15H05嵌合体和猫源化11E12(猫11E121.1)在猫的IL-31诱导的瘙痒模型中的初步功效的图表。
图10是示出在猫瘙痒攻击模型中对称为ZTS-361的猫源化15H05抗IL-31抗体的功效进行的体内评估的图表。图10A示出了从第-7天到第28天T01媒介物安慰剂和T02抗体ZTS-361组的基线攻击前瘙痒行为，其中第0天是向T02组施用抗体的那天。图10B示出了抗体ZTS-361的功效，证实与媒介物安慰剂对照相比在IL-31攻击后第7天(p＜.0001)、第21天(p＜0.0027)和第28天(p＜0.0238)观察到的瘙痒显著减少。
图11-图11A是示出与正常实验室相比在患有特应性和过敏性皮炎的狗中客户拥有的动物中的IL-31的血浆水平的图表。图11B是示出测定来自美国几个不同地理区域的疑似诊断为过敏性皮炎(AD)的猫的血清IL-31水平的最近研究结果的图表。图11C是示出在施用1.75μg/kg皮下剂量的犬IL-31之后犬IL-31在狗中的药代动力学曲线的图表。
图12是示出包含图12中概述的氨基酸的犬IL-31的完全置换扫描的结果的表。所描绘的每个位置在全长犬IL-31蛋白(SEQ ID NO：155)中分别用其他可能的19个氨基酸之一置换，并使用间接ELISA评定抗体15H05的结合。为了比较，示出了猫(SEQ ID NO：157)、马(SEQ ID NO：165)和人IL-31(SEQ ID NO：181)上的对应区域。
图13-图13A是示出各种限制性肽的序列和化学接头的表。肽ZTS-561含有氨基酸序列N-TEISVPADTFERKSFILT-C，其对应于SEQ ID NO：155的位置121至138，其中在位置编号132处以精氨酸(R)取代半胱氨酸(C)。肽ZTS-562含有氨基酸序列N-EISVPADTFERKSF-C，其对应于SEQ ID NO：155的位置122至135，其中在位置编号132处以精氨酸(R)取代半胱氨酸(C)。肽ZTS-563含有氨基酸序列N-AKVSMPADNFERKNFILT-C，其对应于SEQ ID NO：157的位置121至138，其中在位置编号138处以苏氨酸(T)取代丙氨酸(A)。肽ZTS-564含有氨基酸序列N-TEISVPADTFERKSFILT-C，其对应于SEQ ID NO：155的位置121至138。肽ZTS-561、ZTS-562、ZTS-563和ZTS-564各自还包含如图所示的N末端和C末端半胱氨酸，以便于使用游离硫醇基进行缀合化学。图13B示出了已独立地缀合至载体多肽(CRM-197)的肽ZTS-561、ZTS-562、ZTS-563和ZTS-564的亲和力评定的结果。为了进行亲和力评定，将每种肽独立固定在biacore表面上，并确定猫源化抗IL-31 15H05 mAb(ZTS-927)的KD。
图14描绘了免疫原性研究的研究设计，所述研究旨在评定CRM-197缀合的IL-31模拟表位生成针对IL-31蛋白相关区域驱动的表位特异性免疫应答的能力，在所述相关区域中抗体15H05和本文公开的其他抗-IL-31抗体结合。
图15是示出了治疗组所组织的用IL-31 15H05犬和猫模拟表位以及全长猫IL-31蛋白疫苗接种狗之后生成的血清滴度的曲线图，示出了在每天采集血清时的应答。图15A描绘了针对全长猫IL-31蛋白(SEQ ID NO：159)的平均犬抗体滴度。图15B描绘了针对全长猫IL-3115H05突变体(SEQ ID NO：163)的平均犬抗体滴度。图15C描绘了针对全长犬IL-31(SEQ ID NO：155)的平均犬抗体滴度。图15D描绘了针对全长马IL-31(SEQ ID NO：165)的平均犬抗体滴度。图15E描绘了针对全长人IL-31(SEQ ID NO：181)的平均犬抗体滴度。
图16-图16A描绘了免疫原性研究的设计，所述研究旨在评定CRM-197缀合的全长犬IL-31蛋白或模拟表位在实验室比格犬中引发免疫应答的能力。本文所述的每个模拟表位被设计以生成针对IL-31蛋白相关区域驱动的表位特异性免疫应答，在所述相关区域中抗体15H05和本文公开的其他抗IL-31抗体结合。各种模拟表位肽的序列和化学接头示出为组T02-T04。肽ZTS-420含有氨基酸序列N-TEISVPADTFERKSFILT-C，其对应于SEQ ID NO：155的位置121至138，其中在位置编号132处以精氨酸(R)取代半胱氨酸(C)。肽ZTS-421含有氨基酸序列N-TNISVPTDTHECKRFILT-C，其对应于SEQ ID NO：181的位置122至139。肽ZTS-766含有氨基酸序列N-NSSAILPYFRAIRPLSDKNIIDKIIEQLDKLKF-C，其对应于SEQ ID NO：155的位置83至115。肽ZTS-420、ZTS-421和ZTS-766各自还包含如图所示的N末端和C末端半胱氨酸，以便于使用游离硫醇基进行缀合化学。ZTS-766还包含紧接N末端半胱氨酸的额外三个氨基酸间隔序列(GSG)。图16B示出了允许将犬BC螺旋模拟表位(ZTS-766)与来自猫、马和人IL-31的对应序列进行比较的同源序列，并包括各自的序列参考编号和氨基酸位置。
图17是示出了治疗组所组织的用IL-31 15H05犬和人拟表位、犬BC螺旋拟表位和全长猫IL-31蛋白疫苗接种狗之后生成的血清滴度，示出了在每天采集血清时的应答。在用箭头指示的第0、28和56天向狗给药。图17A描绘了针对全长犬IL-31蛋白(SEQ ID NO：155)的平均犬抗体滴度。图17B描绘了仅T03组在第0、42和84天针对全长人IL-31(SEQ ID NO：181)的平均犬抗体滴度。T03组的狗(人15H05模拟表位)对犬IL-31不具有CRAR(数据未示出)。
图18-图18A描绘了免疫原性研究的设计，所述研究旨在评定CRM-197缀合的全长猫IL-31蛋白或模拟表位在实验室猫中引发免疫应答的能力。所有治疗组均用佐剂混合物配制，所述佐剂混合物包含糖脂佐剂Bay R1005(N-(2-脱氧基-2-L-亮氨酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-N-十八烷基十二烷酰基酰胺氢乙酸盐)以及CpG寡核苷酸。
本文所述的每个模拟表位被设计以生成针对IL-31蛋白相关区域驱动的表位特异性免疫应答，在所述相关区域中抗体15H05和本文公开的其他抗IL-31抗体结合。各种模拟表位肽的序列和化学接头示出为组T02-T05。肽ZTS-563含有氨基酸序列N-AKVSMPADNFERKNFILT-C，其对应于SEQ ID NO：157的位置121至138，其中在位置编号138处以苏氨酸(T)取代丙氨酸(A)。肽ZTS-418含有氨基酸序列N-TEVSMPTDNFERKRFILT-C，其对应于SEQ ID NO：165的位置115至132。肽ZTS-423含有氨基酸序列N-NGSAILPYFRAIRPLSDKNTIDKIIEQLDKLKF-C，其对应于SEQ ID NO：157的位置83至115。肽ZTS-422含有氨基酸序列N-AKVSMPADNFERKNFILT-C，其对应于SEQ ID NO：157的位置121至138，其中在位置编号138处以苏氨酸(T)取代丙氨酸(A)。肽ZTS-563、ZTS-418、ZTS-423和ZTS-422各自还包含如图所示的N末端和C末端半胱氨酸，以便于使用游离硫醇基进行缀合化学。ZTS-422还含有在两个N末端半胱氨酸之间的额外氨基己酸接头(Ahx)。ZTS-423还含有紧邻N末端半胱氨酸的额外三个氨基酸间隔序列(GSG)。图18B描绘了除T03以外的所有治疗组的对全长猫IL-31(SEQID NO：157)的平均猫抗体滴度。在T03组中的猫(马15H05模拟表位)对猫IL-31不具有CRAR(数据未示出)。
图19A是根据WO 2018/156367(Kindred Biosciences，Inc.)的由抗犬IL-31抗体M14结合的最小表位氨基酸序列。示出了多个物种、序列参考ID和相对氨基酸位置的比较。图19B示出了在黑框中突出的犬IL-31上的此最小氨基酸序列。此图还示出了蛋白质周围区域中的序列比对以及所示序列ID中对应氨基酸的相对位置。
图20示出了IL-31蛋白的片段，所述片段是由螺旋A与尾随无规卷曲序列会合形成的环，所述环与15H05环共享位置和结构属性。示出了来自多个物种的氨基酸序列的比较以及序列ID和氨基酸位置的参考。
图21A示出了表示所述蛋白质上的不同关键性表位区域的三个马IL-31模拟表位肽的氨基酸序列。模拟表位15H05含有氨基酸序列N-TEVSMPTDNFERKRFILT-C，其对应于SEQID NO：165的位置115至132。模拟表位BC螺旋含有氨基酸序列N-NSSAILPYFKAISPSLNNDKSLYIIEQLDKLNF-C，其对应于SEQ ID NO：165的位置77至109。模拟表位A螺旋含有氨基酸序列N-GPIYQLQPKEIQAIIVELQNLSKK-C，其对应于SEQ ID NO：165的位置20至43。模拟表位15H05还包含如图所示的N末端和C末端半胱氨酸，以便于使用游离硫醇基团进行缀合化学。所有三个模拟表位都含有紧接N生物素基团的额外三个氨基酸间隔序列(GSG)，在序列中以粗体和下划线示出。示出了SEQ ID NO：165中每个氨基酸残基的对应位置。图21B示出了使用生物层干涉术进行结合测定的结果。所指示的模拟表位被吸收到链霉亲和素针上，并用于探测小鼠血清的多个稀释度。所用的血清是来自用马IL-31蛋白(SEQ ID NO：165)接种的小鼠，或是来自用无关蛋白接种的小鼠的对照血清。
具体实施方式
定义
在详细描述本发明之前，将定义在本发明的上下文中使用的几个术语。除这些术语外，根据需要在说明书的其他地方定义其他术语。除非本文另外明确定义，否则本说明书中使用的技术术语将具有本领域公认的含义。
如说明书和权利要求书中所用的，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述”包括复数引用，除非上下文另外明确指出。例如，对“一个抗体”的提及包括多个此类抗体。作为另一个实例，对“模拟表位”、“IL-31模拟表位”等的提及包括多个此类模拟表位。
如本文所用，术语“包含(comprising)”旨在意指所述组合物和方法包括所述的要素，但不排除其他要素。
如本文所用，术语“疫苗组合物”包含药学上可接受的媒介物中的至少一种抗原或免疫原，其可用于在宿主中诱导免疫应答。考虑到诸如受体哺乳动物的年龄、性别、体重、种族和状况以及施用途径等因素，疫苗组合物可以按照医学或兽医领域技术人员熟知的剂量和剂量施用。施用途径可以是经皮、通过粘膜施用(例如，口服、经鼻、肛门、阴道)或通过胃肠外途径(皮内、透皮、肌内、皮下、静脉内或腹膜内)。疫苗组合物可以单独施用，或者可以与其他治疗或疗法共同施用或相继施用。施用形式可以包括混悬剂、糖浆剂或酏剂，以及用于胃肠外、皮下、皮内、肌内或静脉内施用(例如注射施用)的制剂，例如无菌混悬剂或乳液。疫苗组合物可以喷雾剂形式施用，或者可以混合到食物和/或水中，或者与合适的载体、稀释剂或赋形剂(诸如无菌水、生理盐水、葡萄糖等)混合来递送。所述组合物可含有辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、佐剂、胶凝或粘性增强添加剂、防腐剂、调味剂、着色剂等，这取决于施用途径和所需的制备。可以咨询标准药物文献，例如“Remington’sPharmaceutical Sciences”(1990)，以制备合适的制剂，而无需进行过多实验。
如本文所用，术语“免疫应答”是指在动物或人中引起的应答。免疫应答可以是指细胞免疫(CMI)、体液免疫，或者可能涉及到两者。本发明还预期受限于一部分免疫系统的应答。通常，“免疫应答”包括但不限于以下作用中的一种或多种：抗体、B细胞、辅助T细胞、抑制性T细胞和/或细胞毒性T细胞和/或yd T细胞的产生或活化，专门针对目标组合物或疫苗中包含的一种或多种抗原。优选地，宿主将表现出治疗性或保护性免疫应答，从而将增强对疾病或病症的抵抗力，和/或降低疾病的临床严重性。此种保护可以通过受影响宿主通常表现出的症状减轻或不存在、恢复时间更快和/或受影响宿主中抗原(例如IL-31)滴度降低来证明。
如本文所用，术语“保护”意指赋予宿主哺乳动物治疗性免疫应答，从而将增强对疾病或病症的抵抗力，和/或在宿主哺乳动物中降低疾病的临床严重性。
如本文所用，术语“免疫原性”意指能够在宿主哺乳动物中产生针对一种或多种抗原的免疫应答。这种免疫应答形成疫苗针对特异性抗原引发的保护性免疫的基础。
如本文所用，免疫(immunizing)、免疫(immunization)等是通常通过施用疫苗使哺乳动物对疾病免疫或抵抗疾病的过程。疫苗刺激哺乳动物自身的免疫系统，以保护哺乳动物使其免于后续疾病。
如本文所用，“佐剂”意指包含一种或多种增强对抗原的免疫应答的物质的组合物。佐剂如何起作用的机制尚不完全清楚。据信一些佐剂通过缓慢释放抗原来增强免疫应答，而其他佐剂本身具有强免疫原性，并被认为协同起作用。
如本文所用，表位是指抗体的CDR所识别的抗原决定簇。换句话说，表位是指能够被抗体识别并结合的任何分子的那部分。除非另有说明，否则本文所用的术语“表位”是指抗IL-31试剂与其反应的IL-31区域。
“抗原”是能够被抗体结合的分子或分子的一部分，其还能够被抗体识别并结合(对应抗体结合区可以称为互补位)。通常，表位由分子的化学活性表面基团(例如氨基酸或糖侧链)组成，并且具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位是蛋白质上的被免疫系统识别的抗原决定簇。识别表位的免疫系统的组分是抗体、T细胞和B细胞。T细胞表位被展示在抗原呈递细胞(APC)的表面上，并且长度通常为8-11个(I类MHC)或15个以上(II类MHC)氨基酸。T细胞对展示的MHC肽复合物的识别对其活化至关重要。这些机制允许适当识别自身蛋白质与“非自身”蛋白质，例如细菌和病毒。不一定连续的独立氨基酸残基有助于与APC结合槽相互作用并随后被T细胞受体识别(Janeway，Travers，Walport，Immunobiology：The Immune System in Health and Disease.第5版New York：GarlandScience；2001)。被可溶抗体和细胞表面相关性B细胞受体识别的表位的长度和连续性程度发生极大改变(Sivalingam和Shepherd，Immunol.2012年7月；51(3-4)：304-3099)。同样，甚至线性表位或在蛋白质序列的连续片段中发现的表位经常具有不连续氨基酸，所述不连续氨基酸表示与抗体互补位或B细胞受体接触的关键点。被抗体和B细胞识别的表位可以在三维空间中与包含蛋白质上的共同接触区域的氨基酸构象化，并且依赖于蛋白质的三级和四级结构特征。这些残基通常可见于一级氨基酸序列的空间不同区域中。
如本文所用，“模拟表位”是模拟抗原表位的线性或限制性肽。模拟表位可以具有能够引发T细胞效应应答的一级氨基酸序列和/或结合B细胞使得动物中的获得性免疫应答成熟所必需的三维结构。给定表位抗原的抗体将识别模拟该表位的模拟表位。IL-31模拟表位在本文中可替代地称为IL-31肽模拟表位。在一些实施方案中，用于本发明的组合物和/或方法中的模拟表位(线性或限制性)是长度为约5个氨基酸残基至约40个氨基酸残基的肽和/或包含作为其一部分的所述肽。
在抗体结合的背景下，术语“特异性地”是指抗体与特异性抗原(即多肽或表位)的高亲合力和/或高亲和力结合。在许多实施方案中，特异性抗原是用于免疫从中分离出产生抗体的细胞的动物宿主的抗原(或抗原的片段或亚部分)。抗体与抗原的特异性结合比相同抗体与其他抗原的结合更强。特异性结合至多肽的抗体能够以弱但可检测的水平(例如，与目标多肽显示的结合的10％或更少)结合其他多肽。此类弱结合或背景结合容易从特异性抗体与主题多肽的结合中辨别出来，例如，通过使用适当的对照。通常，特异性抗体结合至抗原的结合亲和力为10-7M或更小的KD，例如10-8M或更小(例如10-9M或更小、10-10或更小、10-11或更小、10-12或更小或10-13或更小等)。
如本文所用，术语“抗体”是指具有两条轻链和两条重链的完整免疫球蛋白。因此，单个分离的抗体或片段可以是多克隆抗体、单克隆抗体、合成抗体、重组抗体、嵌合抗体、异源嵌合抗体、犬源化抗体、猫源化抗体、完全犬抗体、完全猫抗体、完全马抗体或完全人抗体。术语“抗体”优选地是指可以结合至IL-31蛋白及其片段或修饰的片段的单克隆抗体及其片段(例如包括但不限于抗体的抗原结合部分)，以及其免疫结合等效物。IL-31的此类片段和修饰的片段可包括用于本发明的各种实施方案中的IL-31肽模拟表位。例如，针对IL-31上的给定表位的抗体将识别模拟该表位的IL-31肽模拟表位。术语抗体用于指均质分子或混合物，例如由多种不同分子实体组成的血清产物。
“天然抗体”和“天然免疫球蛋白”通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与一条重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链之间不同。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条重链在一个末端具有可变结构域(VH)，接着是多个恒定结构域。每条轻链在一个末端具有可变结构域(VL)，并且在另一末端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链可变结构域对齐。据信特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。
术语“抗体片段”是指少于完整抗体结构，包括但不限于分离的单抗体链、Fv构建体、Fab构建体、Fc构建体、轻链可变区或互补决定区(CDR)序列等。例如，抗体片段可包含所述抗体的抗原结合部分。
术语“可变”区包括框架和CDR(另称为高变区)，并且是指可变结构域的某些部分的序列在抗体之间差异很大的事实，并用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。但是，可变性并非均匀分布在抗体的可变结构域中。它集中在轻链和重链可变结构域的三个被称为高变区的区段中。可变结构域中保守性更高的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含多个FR，主要采用由形成环连接的三个高变区连接的β-折叠构型，并且在一些情况下，形成β-折叠结构的一部分。各链的高变区由FR紧密靠近地结合在一起，并且与来自其他链的高变区一起有助于形成抗体的抗原结合位点(参看Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)，第647-669页)。虽然恒定结构域并不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。
术语“高变区”当在本文中使用时是指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(Kabat等人(1991)，上文)和/或来自“高变环”的那些残基(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987)。“框架”或“FR”残基是除本文定义的高变区残基以外的那些可变结构域残基。
木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同抗原结合片段，其称为“Fab”片段，各自具有单个抗原结合位点；和残余“Fc”片段，其名称反映其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原组合位点并且仍能够使抗原发生交联的F(ab’)2片段。
“Fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。此区由一个重链可变结构域与一个轻链可变结构域紧密、非共价缔合形成的二聚体组成。在此构型中，每个可变结构域的三个高变区相互作用以限定在VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。总之，六个高变区赋予抗体抗原结合特异性。然而，甚至单一可变结构域(或仅包含三个高变区的对抗原具有特异性的一半Fv)具有识别并结合抗原的能力，尽管与整个结合位点相比，其亲和力更低。
Fab片段也含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab’片段因在重链CH1结构域的羧基端添加少量残基(包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸)而不同于Fab片段。Fab’-SH是本文中对其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基携带游离硫醇基团的Fab’的名称。F(ab’)2抗体片段最初以在其之间具有铰链半胱氨酸的Fab’片段对形式产生。抗体片段的其他化学偶合也是已知的。
来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可基于其恒定结构域的氨基酸序列来指定为两种明显不同类型(称为卡帕(κ)和拉姆达(λ))中的一者。
根据其重链的恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可被指定为不同的类别。目前，免疫球蛋白主要存在五个主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2(如通过小鼠和人命名所定义的)。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型在多种物种中是熟知的。与这些恒定结构域相关的各个同种型和功能活性的发生率是物种特异性的，并且必须通过实验确定。
如本文所定义，“单克隆抗体”是由细胞的单个克隆(例如，杂交瘤细胞的单个克隆)产生的抗体，并且因此是单一纯均质类型的抗体。由相同克隆产生的所有单克隆抗体都是相同的，并且具有相同的抗原特异性。术语“单克隆”涉及细胞的单个克隆、单个细胞以及该细胞的后代。
如本文所定义，“完全犬抗体”是由细胞克隆(通常是CHO细胞系)产生的单克隆抗体，并且因此是单一纯均质类型的抗体。在鉴定其可变结构域序列之后，将从免疫的哺乳动物(诸如狗)的单个B细胞中鉴定出的抗体以重组IgG蛋白形式产生。将这些可变结构域接枝到犬恒定结构域(重链和轻链κ或λ恒定结构域)，导致生成重组完全犬抗体。从同一克隆产生的所有完全犬单克隆抗体是相同的，并且具有相同的抗原特异性。术语“单克隆”涉及细胞的单个克隆、单个细胞以及该细胞的后代。
如本文所定义，“完全猫抗体”是由细胞克隆(通常是CHO细胞系)产生的单克隆抗体，并且因此是单一纯均质类型的抗体。在鉴定其可变结构域序列之后，将从免疫的哺乳动物(诸如狗)的单个B细胞中鉴定出的抗体以重组IgG蛋白形式产生。将这些可变结构域接枝到猫恒定结构域(重链和轻链κ或λ恒定结构域)，导致生成重组完全猫抗体。从同一克隆产生的所有完全猫单克隆抗体是相同的，并且具有相同的抗原特异性。术语“单克隆”涉及细胞的单个克隆、单个细胞以及该细胞的后代。
如本文所定义，“完全马抗体”是由细胞克隆(通常是CHO细胞系)产生的单克隆抗体，并且因此是单一纯均质类型的抗体。在鉴定其可变结构域序列之后，将从免疫的哺乳动物(诸如狗)的单个B细胞中鉴定出的抗体以重组IgG蛋白形式产生。将这些可变结构域接枝到马恒定结构域(重链和轻链κ或λ恒定结构域)，导致生成重组完全马抗体。从同一克隆产生的所有完全马单克隆抗体是相同的，并且具有相同的抗原特异性。术语“单克隆”涉及细胞的单个克隆、单个细胞以及该细胞的后代。
如本文所定义，“完全人抗体”是由细胞克隆(通常是CHO细胞系)产生的单克隆抗体，并且因此是单一纯均质类型的抗体。在鉴定其可变结构域序列之后，将从免疫的哺乳动物(诸如狗)的单个B细胞中鉴定出的抗体以重组IgG蛋白形式产生。将这些可变结构域接枝到人恒定结构域(重链和轻链κ或λ恒定结构域)，导致生成重组完全人抗体。从同一克隆产生的所有完全人单克隆抗体是相同的，并且具有相同的抗原特异性。术语“单克隆”涉及细胞的单个克隆、单个细胞以及该细胞的后代。
在本文中单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种的抗体中的对应序列相同或同源，而所述链的其余部分与来源于另一物种的抗体以及此类抗体的片段中的对应序列相同或同源，只要它们表现出所需的生物学活性即可。通常，嵌合抗体是其轻链和重链基因通常通过基因工程化由属于不同物种的抗体可变区和恒定区基因构建的抗体。例如，可以将来自小鼠单克隆抗体的基因的可变区段连接到犬恒定区段。在嵌合小鼠：犬IgG的一个实施方案中，抗原结合位点来源于小鼠，而FC部分来源于犬。
非犬(例如鼠)抗体的“犬源化”形式是含有衍生自非犬免疫球蛋白的最小序列的基因工程化抗体。犬源化抗体是犬免疫球蛋白序列(受体抗体)，其中受体的高变区残基被来自非犬物种(供体抗体)(例如具有所需特异性、亲和力和能力的小鼠)的高变区残基置换。在一些情况下，犬免疫球蛋白序列的框架区(FR)残基被对应的非犬残基置换。此外，犬源化抗体可包含受体抗体或供体抗体中不可见的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，犬源化抗体将包含至少一个并且通常两个可变结构域的基本上所有，其中所有或基本上所有的高变区对应于非犬免疫球蛋白序列的那些并且所有或基本上所有的FR是犬免疫球蛋白序列的那些。犬源化抗体还将任选地包含完整或至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是犬免疫球蛋白序列的恒定区。在小鼠IgG的物种形成或犬源化的一个实施方案中，将小鼠CDR接枝到犬框架。
非猫(例如鼠)抗体的“猫源化”形式是含有衍生自非猫免疫球蛋白的最小序列的基因工程化抗体。猫源化抗体是猫免疫球蛋白序列(受体抗体)，其中受体的高变区残基被来自非猫物种(供体抗体)(例如具有所需特异性、亲和力和能力的小鼠)的高变区残基置换。在一些情况下，猫免疫球蛋白序列的框架区(FR)残基被对应的非猫残基置换。此外，猫源化抗体可包含受体抗体或供体抗体中不可见的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，猫源化抗体将包含至少一个并且通常两个可变结构域的基本上所有，其中所有或基本上所有的高变区对应于非猫免疫球蛋白序列的那些并且所有或基本上所有的FR是猫免疫球蛋白序列的那些。猫源化抗体还将任选地包含完整或至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是猫免疫球蛋白序列的恒定区。
非马(例如鼠)抗体的“马源化”形式是含有衍生自非马免疫球蛋白的最小序列的基因工程化抗体。马源化抗体是马免疫球蛋白序列(受体抗体)，其中受体的高变区残基被来自非马物种(供体抗体)(例如具有所需特异性、亲和力和能力的小鼠)的高变区残基置换。在一些情况下，马免疫球蛋白序列的框架区(FR)残基被对应的非马残基置换。此外，马源化抗体可包含受体抗体或供体抗体中不可见的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，马源化抗体将包含至少一个并且通常两个可变结构域的基本上所有，其中所有或基本上所有的高变区对应于非马免疫球蛋白序列的那些并且所有或基本上所有的FR是马免疫球蛋白序列的那些。马源化抗体还将任选地包含完整或至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是马免疫球蛋白序列的恒定区。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的基因工程化抗体。人源化抗体是人免疫球蛋白序列(受体抗体)，其中受体的高变区残基被来自非人物种(供体抗体)(例如具有所需特异性、亲和力和能力的小鼠)的高变区残基置换。在有些情况下，所述人免疫球蛋白的构架区(FR)残基由对应非人残基替代。此外，人源化抗体可包含受体抗体或供体抗体中不可见的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体将包含至少一个并且通常两个可变结构域的基本上所有，其中所有或基本上所有的高变区对应于非人免疫球蛋白序列的那些并且所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还将任选地包含完整或至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白序列的恒定区。
“完全犬”抗体是不含有衍生自非犬免疫球蛋白的序列的基因工程化抗体。完全犬抗体是犬免疫球蛋白序列(受体抗体)，其中高变区残基衍生自具有所需特异性、亲和力和能力的天然存在的犬抗体(供体抗体)。在一些情况下，犬免疫球蛋白序列的框架区(FR)残基被对应的非犬残基置换。此外，完全犬抗体可包含受体抗体或供体抗体中不可见的残基，例如包括但不限于CDR的改变以修饰亲和力。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，完全犬抗体将包含至少一个并且通常两个可变结构域的基本上所有，其中所有或基本上所有的高变区对应于犬免疫球蛋白序列的那些并且所有或基本上所有的FR是犬免疫球蛋白序列的那些。完全犬抗体还将任选地包含完整或至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是犬免疫球蛋白序列的恒定区。
“完全猫”抗体是不含有衍生自非猫免疫球蛋白的序列的基因工程化抗体。完全猫抗体是猫免疫球蛋白序列(受体抗体)，其中高变区残基衍生自具有所需特异性、亲和力和能力的天然存在的猫抗体(供体抗体)。在一些情况下，猫免疫球蛋白序列的框架区(FR)残基被对应的非猫残基置换。此外，完全猫抗体可包含受体抗体或供体抗体中不可见的残基，例如包括但不限于CDR的改变以修饰亲和力。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，完全猫抗体将包含至少一个并且通常两个可变结构域的基本上所有，其中所有或基本上所有的高变区对应于猫免疫球蛋白序列的那些并且所有或基本上所有的FR是猫免疫球蛋白序列的那些。完全猫抗体还将任选地包含完整或至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是猫免疫球蛋白序列的恒定区。
“完全马”抗体是不含有衍生自非马免疫球蛋白的序列的基因工程化抗体。完全马抗体是马免疫球蛋白序列(受体抗体)，其中高变区残基衍生自具有所需特异性、亲和力和能力的天然存在的马抗体(供体抗体)。在一些情况下，马免疫球蛋白序列的框架区(FR)残基被对应的非马残基置换。此外，完全马抗体可包含受体抗体或供体抗体中不可见的残基，例如包括但不限于CDR的改变以修饰亲和力。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，完全马抗体将包含至少一个并且通常两个可变结构域的基本上所有，其中所有或基本上所有的高变区对应于马免疫球蛋白序列的那些并且所有或基本上所有的FR是马免疫球蛋白序列的那些。完全马抗体还将任选地包含完整或至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是马免疫球蛋白序列的恒定区。
“完全人”抗体是不含有衍生自非问免疫球蛋白的序列的基因工程化抗体。完全人抗体是人免疫球蛋白序列(受体抗体)，其中高变区残基衍生自具有所需特异性、亲和力和能力的天然存在的人抗体(供体抗体)。在有些情况下，所述人免疫球蛋白的构架区(FR)残基由对应非人残基替代。此外，完全人抗体可包含受体抗体或供体抗体中不可见的残基，例如包括但不限于CDR的改变以修饰亲和力。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，完全人抗体将包含至少一个并且通常两个可变结构域的基本上所有，其中所有或基本上所有的高变区对应于人免疫球蛋白序列的那些并且所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的那些。完全人抗体还将任选地包含完整或至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白序列的恒定区。
如本文所定义，术语“异源嵌合的”是指这样的抗体，其中一条抗体链(重链或轻链)例如被犬源化、猫源化、马源化或人源化，而另一条是嵌合的。在一个实施方案中，将猫源化可变重链(其中所有CDR均为小鼠并且所有FR均为猫)与嵌合可变轻链(其中所有CDR均为小鼠并且所有FR均为小鼠)配对。在此实施方案中，可变重链和可变轻链融合到猫恒定区。
如本文所用，术语“变体”是指具有一个或多个保守氨基酸变化或其他微小修饰，使得对应肽或多肽当与野生型肽或多肽相比时具有基本上等效的功能的肽、多肽或编码所述肽或多肽的核酸序列。通常，用于本发明的变体肽模拟表位将与亲本模拟表位具有至少30％同一性，与亲本模拟表位具有更优选地至少50％，更优选地至少75％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％，以及最优选地至少95％序列同一性。
“变体”抗IL-31抗体在本文中是指氨基酸序列与“亲本”抗IL-31抗体氨基酸序列的不同之处在于在亲本抗体序列中添加、缺失和/或取代一个或多个氨基酸残基并保留了亲本抗IL-31抗体的至少一种所需活性的分子。期望的活性可以包括特异性结合抗原的能力，在动物中降低、抑制或中和IL-31活性的能力，以及在基于细胞的测定中抑制IL-31介导的pSTAT信号传导的能力。在一个实施方案中，变体在亲本抗体的一个或多个高变区和/或框架区中包含一个或多个氨基酸取代。例如，所述变体可以在亲本抗体的一个或多个高变区和/或框架区中包含至少一个，例如约一至约十个，优选地约二至约五个取代。通常，变体将具有与亲本抗体重链或轻链可变结构域序列具有至少50％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，更优选地至少65％，更优选地至少75％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％，以及最优选地至少95％序列同一性。相对于此序列的同一性或同源性在本文中定义为在必要时比对序列并引入缺口以获得最大的序列同一性百分比之后候选序列中氨基酸残基与亲本抗体残基相同的百分比。抗体序列中的N末端、C末端或内部延伸、缺失或插入都不应被解释为影响序列同一性或同源性。所述变体保留结合IL-31的能力，并且优选具有优于亲本抗体的期望活性。例如，在基于细胞的测定中，变体可以具有更强的结合亲和力，增强的降低、抑制或中和动物中的IL-31活性的能力，和/或增强的抑制IL-31介导的pSTAT信号传导的能力。
“变体”核酸在本文中是指序列与“亲本”核酸不同的分子。多核苷酸序列差异可能源于突变变化，例如一个或多个核苷酸的缺失、取代或添加。这些变化中的每一个可以单独或组合地在给定序列中发生一次或多次。
本文的“亲本”抗体是由用于制备变体的氨基酸序列编码的抗体。在一个实施方案中，亲本抗体具有犬框架区，并且如果存在，则具有犬抗体恒定区。例如，亲本抗体可以是犬源化抗体或犬抗体。作为另一个实例，亲本抗体可以是猫源化抗体或猫抗体。作为又另一个实例，亲本抗体可以是马源化抗体或马抗体。在另一个实例中，亲本抗体可以是人源化或人抗体。仍在又另一个实例中，亲本抗体是鼠单克隆抗体。
在整个说明书和权利要求书中使用的术语“抗原结合区”、“抗原结合部分”等是指抗体分子中含有与抗原相互作用并赋予抗体其对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基的部分。抗体结合区包含维持抗原结合残基的适当构象所必需的“框架”氨基酸残基。根据本发明的抗体的抗原结合部分在本文中可替代地称为例如IL-31特异性肽或多肽或者抗IL-31肽或多肽。
术语“分离的”意指从其自然环境的组分中分离和/或回收材料(例如抗体或核酸)。其自然环境的污染组分是会干扰所述材料的诊断或治疗用途的材料，并且可包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。关于核酸，分离的核酸可以包括与在染色体中通常与之缔合的5’至3’序列分离的核酸。在优选的实施方案中，将材料纯化至大于材料的95重量％，最优选地大于99重量％。分离的材料包括重组细胞内的原位材料，因为将不存在所述材料的自然环境的至少一种组分。然而，通常，分离的材料将通过至少一个纯化步骤来制备。
当在本文中使用时，词语“标记”是指直接或间接缀合至例如抗体、核酸或模拟表位的可检测化合物或组合物。标记本身可以是自身可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或者在酶标记的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。
术语“核酸”、“多核苷酸”、“核酸分子”等在本文中可以互换使用，并且是指DNA和RNA中的一系列核苷酸碱基(也称为“核苷酸”)。核酸可含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物。术语“核酸”包括例如单链分子和双链分子。核酸可以是例如基因或基因片段、外显子、内含子、DNA分子(例如cDNA)、RNA分子(例如mRNA)、重组核酸、质粒以及其他载体、引物和探针。包括5’至3’(有义)多核苷酸和3’至5’(反义)多核苷酸。
“受试者”或“患者”是指可以受到本发明的分子影响的需要治疗的哺乳动物。可以根据本发明治疗的哺乳动物包括脊椎动物，特别优选的实例是哺乳动物，例如犬、猫、马和人哺乳动物。
“治疗有效量”(或“有效量”)是指活性成分(例如本发明的剂)当向受试者或患者施用时足以产生有益或期望结果的量。有效量可以分一次或多次施用、应用或剂量来施用。本领域普通技术人员可以容易地确定根据本发明的组合物的治疗有效量。在本发明的上下文中，“治疗有效量”是在与IL-31介导的病症(诸如瘙痒病状或过敏性病状或肿瘤进展)的治疗(包括临床症状改善在内)相关的一个或多个参数中产生客观测量的变化的量。当然，治疗有效量将根据所治疗的特定受试者和病状、受试者的体重和年龄、疾病病状的严重性、所选择的特定化合物、待遵循的施用方案、施用时间、施用方式等而变化，所有这些都可以由本领域普通技术人员容易地确定。
如本文所用，术语“治疗性”涵盖疾病或病症的全范围治疗。本发明的“治疗”剂可以防治性或预防性方式起作用，包括并入旨在靶向可被鉴定为有风险(药物遗传学)的动物的程序的那些方式；或以本质上改善或治愈的方式；或可能会减缓所治疗疾病或病症的至少一种症状的进展速率或程度。
“治疗(Treatment)”、“治疗(treating)”等是指治疗性治疗和防治性或预防性措施。需要治疗的动物包括已经患有病症的动物以及待预防所述病症的动物。术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”疾病或病症包括预防或防治疾病或病症(即，导致临床症状不发展)；抑制疾病或病症(即，阻止或抑制临床症状的发展；和/或缓解疾病或病症(即，导致临床症状的消退)。可以理解，并非总是可以区分“预防”和“抑制”疾病或病症，因为一个或多个最终的诱导事件可能是未知的或潜在的。因此，术语“预防”应理解为构成涵盖“预防”和“抑制”的“治疗”类型。因此，术语“治疗”包括“预防”。
术语“过敏性病状”在本文中被定义为由免疫系统与身体外来物质之间的相互作用引起的病症或疾病。这种外来物质被称为“过敏原”。常见的过敏原包括气源性过敏原，例如花粉、灰尘、霉菌、尘螨蛋白、昆虫叮咬注入的唾液等。过敏性病状的实例包括但不限于以下：过敏性皮炎、夏季湿疹、荨麻疹、肺气肿、气道炎性疾病、复发性气道阻塞、气道高反应性、慢性阻塞性肺病和自身免疫引起的炎症过程，例如肠易激综合征(IBS)。
术语“瘙痒病状”在本文中定义为以强烈的瘙痒感为特征的疾病或病症，所述瘙痒感产生摩擦或刮擦皮肤以获得缓解的冲动。瘙痒病状的实例包括但不限于以下：特应性皮炎、过敏性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病和瘙痒。
如本文所用，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换使用。所有这些术语还包括它们的后代，所述后代是任何和所有后代。可以理解，由于故意或无意的突变，所有后代可能都不相同。在表达异源核酸序列的上下文中，“宿主细胞”是指位于体外或体内的原核细胞或真核细胞(例如，细菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞)。例如，宿主细胞可以位于转基因动物中。宿主细胞可以用作载体的受体，并且可以包括能够复制载体和/或表达由载体编码的异源核酸的任何可转化生物体。
“组合物”旨在意指活性剂和可能为惰性(例如标记)或活性(例如佐剂)的另一种化合物或组合物的组合。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”和“药学上可接受的媒介物”是可互换的，并且是指用于含有疫苗抗原且可注射到宿主中而无不良作用的流体媒介物。适用于本发明的药学上可接受的载体是本领域技术人员所熟知的。此类载体包括但不限于水、盐水、缓冲盐水、磷酸盐缓冲液、醇/水溶液、乳液或悬浮液。可以根据常规技术添加其他常规使用的稀释剂、佐剂以及赋形剂。这些载体可以包括乙醇、多元醇及其合适的混合物、植物油以及可注射的有机酯。也可以使用缓冲剂和pH值调节剂。缓冲剂包括但不限于由有机酸或有机碱制备的盐。代表性缓冲剂包括但不限于有机酸盐，诸如柠檬酸的盐，例如柠檬酸盐、抗坏血酸盐、葡萄糖酸盐、组氨酸-HCl、碳酸盐、酒石酸盐、丁二酸盐、乙酸盐、或邻苯二甲酸盐、Tris、三甲胺盐酸盐或磷酸盐缓冲剂。胃肠外载体可以包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖、海藻糖、蔗糖和氯化钠、乳酸化林格氏液或不挥发性油。静脉内载体可以包括体液和营养补充剂、电解质补充剂(诸如基于林格氏右旋糖的那些)等。在药物载体中也可以提供防腐剂和其他添加剂，例如像抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂(例如EDTA)、惰性气体等。本发明不受载体选择的限制。由上文所述的组分制备具有适当pH等渗性、稳定性和其他常规特性的这些药学上可接受的组合物是在本领域的技术范围内。参见例如教科书，例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版，Lippincott Williams&Wilkins，publ.，2000；以及The Handbook of Pharmaceutical Excipients，第4增补版，R.C.Rowe等人编辑，APhA Publications，2003。
术语“保守性氨基酸取代”表示任何氨基酸对给定氨基酸残基的取代，其中所述取代残基在化学上与给定残基类似，使得多肽功能(例如酶活性)没有显著降低。保守性氨基酸取代是本领域公知的，并且其实例描述于例如美国专利号6,790,639、6,774,107、6,194,167或5,350,576中。在一个优选的实施方案中，保守性氨基酸取代将是在以下六组中的一组内出现的任一个
·1.小脂肪族基本非极性残基：Ala、Gly、Pro、Ser和Thr；
·2.大脂肪族非极性残基：Ile、Leu和Val；Met；
·3.极性带负电荷的残基及其酰胺：Asp和Glu；
·4.极性带负电荷的残基的酰胺：Asn和Gln；His；
·5.极性带正电荷的残基：Arg和Lys；His；以及
·6.大芳族残基：Trp和Tyr；Phe。
在一个优选的实施方案中，保守性氨基酸取代将是以下中的任一个，它们被列为天然残基(保守性取代)对：Ala(Ser)；Arg(Lys)；Asn(Gln；His)；Asp(Glu)；Gln(Asn)；Glu(Asp)；Gly(Pro)；His(Asn；Gln)；Ile(Leu；Val)；Leu(Ile；Val)；Lys(Arg；Gln；Glu)；Met(Leu；Ile)；Phe(Met；Leu；Tyr)；Ser(Thr)；Thr(Ser)；Trp(Tyr)；Tyr(Trp；Phe)；以及Val(Ile；Leu)。
正如多肽可以含有一个或多个保守性氨基酸取代一样，其多核苷酸可以含有一个或多个保守性密码子取代。如果密码子取代在表达时产生如上文所述的保守性氨基酸取代，则认为其是保守的。导致没有氨基酸取代的简并密码子取代也可用于根据本发明的多核苷酸。因此，例如，可通过简并密码子取代来使编码可用于本发明的实施方案的所选多肽的多核苷酸突变，以便接近待用其转化的表达宿主细胞所表现出的密码子使用频率，或以其他方式改善其表达。
应理解本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂等，并且因此可变化。本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制本发明的范围，所述范围仅由权利要求书限定。
除非另有定义，否则与本文所述的疫苗组合物和抗体结合使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。通常，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学以及蛋白质和寡核苷酸或多核苷酸化学以及杂交结合使用的命名和技术是本领域熟知且常用的那些。
使用标准技术进行重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转染(例如电穿孔、脂质转染)。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书或如本领域通常完成或如本文所述进行。前述技术和程序通常根据本领域熟知的常规方法来进行，并且如在本说明书全文中引用和讨论的各种一般性和更具体的参考文献中所述，参见例如Sambrook等人MOLECULARCLONING：LAB.MANUAL(第3版，Cold Spring Harbor Lab.Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，2001)和Ausubel等人Current Protocols in Molecular Biology(New York：GreenePublishing Association/Wiley Interscience)，1993。与本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学结合使用的命名以及实验室程序和技术是本领域熟知且常用的那些。使用标准技术进行化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者治疗。
除了操作实施例中或另有说明外，在所有情况下，表示本文所用的成分的量或反应条件的所有数值应理解为均由术语“约”修饰。
为了描述和公开例如在可能与本发明结合使用的此类出版物中描述的方法，将所有已鉴定的专利和其他出版物以引用的方式明确并入本文。这些出版物仅因在本申请的申请日之前公开而提供。
组合物
本发明提供了IL-31模拟表位(肽)及其变体以及其在临床和科学程序(包括诊断程序)中的用途。如本文所用，此种IL-31模拟表位是模拟抗原表位的线性或限制性肽。给定IL-31表位抗原的抗IL-31抗体将识别模仿该表位的IL-31模拟表位。
IL-31模拟表位(肽)用于根据本发明的疫苗组合物中。此类疫苗组合物可用于保护哺乳动物使其免于IL-31介导的病症，例如瘙痒或过敏性病状。在一些实施方案中，IL-31介导的瘙痒或过敏性病状是选自特应性皮炎、湿疹、银屑病、硬皮病和瘙痒的瘙痒病状。在其他实施方案中，IL-31介导的瘙痒或过敏性病状是选自以下的过敏性病状：过敏性皮炎、夏季湿疹、荨麻疹、肺气肿、气道炎性疾病、复发性气道阻塞、气道高反应性、慢性阻塞性肺病和自身免疫引起的炎症过程。在其他实施方案中，IL-31介导的病症是肿瘤进展。在一些实施方案中，IL-31介导的病症是嗜酸性疾病或肥大细胞瘤。
在一个实施方案中，根据本发明的疫苗组合物包含载体多肽与至少一种选自猫IL-31模拟表位、犬IL-31模拟表位、马IL-31模拟表位和人IL-31模拟表位的模拟表位的组合；以及佐剂。在一些实施方案中，本发明的疫苗组合物可包含多于一种来自给定物种的IL-31模拟表位，或甚至包含来自不同物种的IL-31模拟表位的组合。在一些实施方案中，用于本发明的组合物和/或方法中的模拟表位(线性或限制性)是长度为约5个氨基酸残基至约40个氨基酸残基的肽和/或包含作为其一部分的所述肽。
在一个实施方案中，至少一种用于本发明的组合物和方法中的模拟表位选自IL-31 15H05模拟表位、IL-31螺旋BC区域模拟表位、IL-31螺旋A区域模拟表位、IL-31 AB环区域模拟表位或其任何组合。
在一个实施方案中，至少一种用于本发明的组合物和方法中的模拟表位生成中和IL-31的生物活性的抗体。
在另一个实施方案中，本发明的疫苗组合物能够在哺乳动物中引起集中的免疫应答以生成针对IL-31上的至少一个中和表位的抗体，而不是针对IL-31上的非中和表位的抗体。
在一个实施方案中，疫苗组合物包含犬IL-31模拟表位，所述模拟表位为氨基酸序列SVPADTFECKSF(SEQ ID NO：186)、SVPADTFERKSF(SEQ ID NO：187)、NSSAILPYFRAIRPLSDKNIIDKIIEQLDKLKF(SEQ ID NO：192)、APTHQLPPSDVRKIILELQPLSRG(SEQ ID NO：196)、TGVPES(SEQ ID NO：200)或其保留抗IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
在另一个实施方案中，疫苗组合物包含猫IL-31模拟表位，所述模拟表位为氨基酸序列SMPADNFERKNF(SEQ ID NO：188)、NGSAILPYFRAIRPLSDKNTIDKIIEQLDKLKF(SEQ ID NO：193)、APAHRLQPSDIRKIILELRPM SKG(SEQ ID NO：197)、IGLPES(SEQ ID NO：201)或其保留抗IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
在另一个实施方案中，疫苗组合物包含马IL-31模拟表位，所述模拟表位为氨基酸序列SMPTDNFERKRF(SEQ ID NO：189)、NSSAILPYFKAISPSLNNDKSLYIIEQLDKLNF(SEQ ID NO：194)、GPIYQLQPKEIQAIIVELQNLS KK(SEQ ID NO：198)、KGVQKF(SEQ ID NO：202)或其保留抗IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
在另一个实施方案中，疫苗组合物包含人IL-31模拟表位，所述模拟表位为氨基酸序列SVPTDTHECKRF(SEQ ID NO：190)、SVPTDTHERKRF(SEQ ID NO：191)、HSPAIRAYLKTIRQLDNKSVIDEIIEHLDKLIF(SEQ ID NO：195)、LPVRLLRPSDDVQKIVEELQSLSKM(SEQ ID NO：199)、KGVLVS(SEQ ID NO：203)或其保留抗IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
在一个实施方案中，用于根据本发明的疫苗组合物中的模拟表位是限制性模拟表位。在一个实施方案中，此种限制性模拟表位是化学连接的环状肽。
线性IL-31模拟表位可以化学合成或重组产生。限制性IL-31模拟表位，例如化学连接的环状肽，可以化学合成或者也可以使用化学合成和重组技术的组合制备。在一些实施方案中，用于疫苗组合物中的IL-31模拟表位化学缀合至载体多肽。在其他实施方案中，载体多肽和模拟表位是重组融合蛋白的一部分。
与IL-31模拟表位组合的载体多肽可以是或可以作为其一部分包含细菌类毒素或其衍生物、钥孔血蓝蛋白(KLH)或病毒样颗粒。作为非限制性实例，细菌类毒素或衍生物可以是破伤风类毒素、白喉类毒素、破伤风类毒素、脑膜炎双球菌B组的外膜蛋白复合物、假单胞菌外毒素或白喉毒素无毒突变体(CRM197)。作为其他非限制性实例，病毒样颗粒可以是HBsAg、HBcAg、大肠杆菌噬菌体Qβ、诺沃克病毒、犬瘟热病毒(CDV)或流感HA。在一个优选的实施方案中，IL-31模拟表位与包含CRM197或由其组成的载体多肽组合。
根据本发明的疫苗组合物包含至少一种佐剂或佐剂制剂，如将在下文进一步详细描述的。
可以按照公认的惯例配制本发明的疫苗，以包含用于动物(包括人(如果适用))的药学上可接受的载体，例如标准缓冲液、稳定剂、稀释剂、防腐剂和/或增溶剂，并且也可以配制来促进持续释放。稀释剂包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油等。用于等渗性的添加剂包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇和乳糖以及其他添加剂。稳定剂包括白蛋白以及其他稳定剂。其他合适的疫苗媒介物和添加剂，包括特别可用于配制弱毒活疫苗的那些，是本领域技术人员已知或清楚的。参见例如Remington’s Pharmaceutical Science，第18版，1990，Mack Publishing，其以引用的方式并入本文。
本发明的疫苗可还包含一种或多种额外免疫调节组分，例如佐剂或细胞因子以及其他组分。用于本发明的组合物中的合适佐剂的类型包括：水包油佐剂、聚合物和水佐剂、油包水佐剂、氢氧化铝佐剂、维生素E佐剂及其组合。佐剂的一些具体实例包括但不限于完全弗氏佐剂(Freund’s adjuvant)、不完全弗氏佐剂、短小棒状杆菌(Corynebacteriumparvum)、卡介苗(Bacillus Calmette Guerin)、氢氧化铝凝胶、葡聚糖、硫酸葡聚糖、氧化铁、海藻酸钠、芽孢杆菌佐剂(Bacto-Adjuvant)、某些合成聚合物诸如聚氨基酸和氨基酸共聚物、嵌段共聚物(CytRx，Atlanta，Ga.)、QS-21(Cambridge Biotech Inc.，CambridgeMass.)、SAF-M(Chiron，Emeryville Calif.)、
Figure BDA0002776924470000421
佐剂、皂苷、Quill A或其他皂苷组分、单磷酰基脂质A以及阿夫立定脂质(Avridine lipid)-胺佐剂(N，N-二十八烷基-N’，N’-双(2-羟乙基)-丙二胺)、“REGRESSIN”(Vetrepharm，Athens，Ga.)、石蜡油、RIBI佐剂系统(Ribi Inc.，Hamilton，Mont.)、胞壁酰二肽等。
可用于本发明的疫苗中的水包油乳液的非限制性实例包括修饰的SEAM62和SEAM1/2制剂。修饰的SEAM62是含有5％(v/v)角鲨烯(Sigma)、1％(v/v)
Figure BDA0002776924470000422
85洗涤剂(ICI表面活性剂)、0.7％(v/v)
Figure BDA0002776924470000423
80洗涤剂(ICI表面活性剂)、2.5％(v/v)乙醇、200μg/ml Quil A、100μg/ml胆固醇和0.5％(v/v)卵磷脂的水包油乳液。修饰的SEAM1/2是包含5％(v/v)角鲨烯、1％(v/v)
Figure BDA0002776924470000424
85洗涤剂、0.7％(v/v)Tween 80洗涤剂、2.5％(v/v)乙醇、100μg/ml Quil A和50μg/ml胆固醇的水包油乳液。
可用于本发明的组合物中的佐剂的另一个实例是SP-油。如在本说明书和权利要求书中所用，术语“SP油”表示的油乳液包含聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、角鲨烷、聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯和缓冲盐溶液。聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物是有助于使固体和液体组分悬浮的表面活性剂。这些表面活性剂可作为聚合物以商品名
Figure BDA0002776924470000425
商购获得。优选的表面活性剂是泊洛沙姆401，其可以商品名
Figure BDA0002776924470000426
L-121商购获得。通常，SP油乳液是将包含约1体积％至3体积％的嵌段共聚物、约2体积％至6体积％的角鲨烷、更特别地约3体积％至6体积％的角鲨烷以及约0.1体积％至0.5体积％的聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯并且其余部分为缓冲盐溶液的免疫刺激佐剂混合物。
可包含在疫苗中的“免疫调节剂”包括例如免疫刺激性寡核苷酸、一种或多种白介素、干扰素或其他已知的细胞因子。在一个实施方案中，佐剂可以是环糊精衍生物或聚阴离子聚合物，例如分别在美国专利号6,165,995和6,610,310所述的那些。
在一个实施方案中，佐剂是包含皂苷、固醇、季铵化合物和聚合物的制剂。在一个具体实施方案中，皂苷为Quil A或其纯化级分，固醇为胆固醇，季铵化合物为二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)，并且聚合物为聚丙烯酸。
在另一个实施方案中，佐剂包含一种或多种分离的免疫刺激性寡核苷酸、固醇和皂苷的组合。在一个具体实施方案中，一种或多种分离的免疫刺激性寡核苷酸包括CpG，固醇为胆固醇，并且皂苷为Quil A或其纯化级分。如本文所用，在实施例部分中提及的ZA-01佐剂包括Quil A(皂苷)、胆固醇、CpG和稀释剂。
在另一个实施方案中，待在本发明的组合物中使用的有用佐剂包括含有CpG的免疫刺激性寡核苷酸。含有CpG的寡核苷酸描述于例如美国专利号：8,580,280种。在一个具体实施方案中，用于本发明的佐剂是包含至少一种糖脂佐剂和含有CpG的寡核苷酸的混合物。有用佐剂的具体实例是包含糖脂佐剂Bay R1005(N-(2-脱氧基-2-L-亮氨酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-N-十八烷基十二烷酰基酰胺氢乙酸盐)以及CpG寡核苷酸的混合物。
在一个实施方案中，佐剂或佐剂混合物以每个剂量约100μg至约10mg的量添加。在另一个实施方案中，佐剂或佐剂混合物以每个剂量约200μg至约5mg的量添加。在另一个实施方案中，佐剂或佐剂混合物以每个剂量约300μg至约1mg的量添加。
随着分子生物学方法和重组技术的出现，可以通过重组方法生成上述肽和多肽，并因此生成编码在所述肽或多肽结构中可见的特定氨基酸序列的基因序列。在一个实施方案中，所述肽是IL-31模拟表位或是IL-31模拟表位的至少一部分。在另一个实施方案中，所述多肽是与IL-31模拟表位组合存在的载体多肽。在另一个实施方案中，多肽是抗体，例如用于本发明的疫苗组合物或诊断方法中的IL-31模拟表位所结合的抗体。可通过克隆编码所述抗体的多肽链的基因序列或通过直接合成所述多肽链，并组装合成的链以形成对特异性表位和抗原决定簇具有亲和力的活性四聚体(H2L2)结构来产生此类抗体。这允许容易产生具有来自不同物种和来源的中和抗体的特征性序列的抗体。
不论抗体的来源如何、或抗体如何重组构建、或抗体如何使用转基因动物、实验室或商业规模的大细胞培养、使用转基因植物或通过在所述过程的任何阶段不使用活生物体的直接化学合成在体外或体内合成，所有抗体均具有相似的整体三维结构。所述结构通常以H2L2给出并且是指抗体通常包含两条轻(L)氨基酸链和2条重(H)氨基酸链的事实。两种链均具有能够与结构互补的抗原靶标相互作用的区域。与靶标相互作用的区域被称为“可变”区或“V”区，并且其特征在于与具有不同抗原特异性的抗体的氨基酸序列差异。H或L链的可变区含有能够特异性结合至抗原靶标的氨基酸序列。
术语抗体的“抗原结合区”或“抗原结合部分”是指抗体分子中含有与抗原相互作用并赋予抗体其对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基的部分。抗体结合区包含维持抗原结合残基的适当构象所必需的“框架”氨基酸残基。本说明书和权利要求书中提及的抗体的抗原结合部分在本文中可以称为例如IL-31特异性肽或多肽或者抗IL-31肽或多肽。
在提供抗原结合区的H或L链的可变区内是被称为“高变”的较小序列，因为它们在具有不同特异性的抗体之间具有极大的可变性。此类高变区也称为“互补决定区”或“CDR”区。这些CDR区解释了抗体对特定抗原决定簇结构的基本特异性。
CDR表示可变区内的氨基酸的非连续片段，但无论物种如何，已发现这些关键氨基酸序列在可变重链和轻链区内的位置在可变链的氨基酸序列内具有相似的位置。所有抗体的可变重链和轻链各自具有三个CDR区，每个CDR区彼此不连续。
在所有哺乳动物物种中，抗体肽含有恒定(即高度保守性)区和可变区，并且在后者内，存在CDR和由重链或轻链可变区内但在CDR外的氨基酸序列组成的所谓“框架区”。
关于由抗体的CDR区识别的抗原决定簇，这也被称为“表位”。换句话说，表位是指能够被抗体识别并结合的任何分子的部分(对应的抗体结合区可以被称为互补位)。
“抗原”是能够被抗体结合的分子或分子的一部分，其还能够诱导动物产生能够结合至所述抗原的表位的抗体。抗原可以具有一个或多个表位。上文提及的特异性反应意图指示抗原将以高度选择性的方式与其对应抗体反应，而不与可能被其他抗原诱发的多种其他抗体反应。
本文提及的抗体意图包括完整的免疫球蛋白分子以及其部分、片段、肽和衍生物，例如像Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fse、CDR区、互补位、或能够结合抗原或表位的抗体的任何部分(例如，多肽)或肽序列。如果抗体能够与分子特异性反应从而使所述分子与抗体结合，则所述抗体被认为“能够结合”所述分子。
本文提及的抗体还包括通过任何已知技术(例如但不限于酶切、肽合成或重组技术)提供的嵌合抗体、异嵌合抗体、犬源化抗体、猫源化抗体、马源化抗体、人源化抗体、完全犬抗体、完全猫抗体、完全马抗体、完全人抗体以及其片段、部分、区域、肽或衍生物。本文提及的此类抗体能够特异性结合犬IL-31、猫IL-31、马IL-31或人IL-31中的至少一种。抗体片段或部分可能缺乏完整抗体的Fc片段，从循环中更快清除，并且可能具有比完整抗体更少的非特异性组织结合。可以使用本领域熟知的方法，例如通过用诸如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab’).2片段)的酶进行蛋白水解切割来由完整抗体产生抗体片段的实例。参见例如Wahl等人，24 J.Nucl.Med.316-25(1983)。抗体的部分可以通过任何上述方法来制备，或者可以通过表达重组分子的一部分来制备。例如，可以分离重组抗体的CDR区并将其亚克隆到合适的表达载体中。参见例如美国专利号6,680,053。
克隆15H05、ZIL1、ZIL8、ZIL9、ZIL11、ZIL69、ZIL94、ZIL54、ZIL159和ZIL171核苷酸 和氨基酸序列
在一些实施方案中，本发明提供了结合至新型单克隆抗体的IL-31模拟表位，所述新型单克隆抗体特异性结合至犬IL-31、猫IL-31或马IL-31中的至少一种。此类单克隆抗体可以与IL-31模拟表位一起用于本发明的诊断方法中。在一个实施方案中，本说明书和权利要求书中提及的单克隆抗体结合至犬IL-31、猫IL-31或马IL-31，并防止其结合和活化其包含IL-31受体A(IL-31Ra)和制瘤素M特异性受体(OsmR或IL-31Rb)的共受体复合物。此类单克隆抗体的实例在本文中被鉴定为“15H05”、“ZIL1”、“ZIL8”、“ZIL9”、“ZIL11”、“ZIL69”、“ZIL94”、“ZIL154”、“ZIL159”和“ZIL171”，这些是指分配给其克隆的编号。在本文中，“15H05”、“ZIL1”、“ZIL8”、“ZIL9”、“ZIL11”、“ZIL69”、“ZIL94”、“ZIL154”、“ZIL159”和“ZIL171”还是指单克隆抗体、互补位或CDR的部分，所述部分因为其分别结合15H05、ZIL1、ZIL8、ZIL9、ZIL11、ZIL69、ZIL94、ZIL154、ZIL159和ZIL171抗体的能力而与鉴定为15H05、ZIL1、ZIL8、ZIL9、ZIL11、ZIL69、ZIL94、ZIL154、ZIL159和ZIL171的IL-31表位特异性结合。本文所述的15H05、ZIL1、ZIL8、ZIL9、ZIL11、ZIL69、ZIL94、ZIL154、ZIL159和ZIL171的几种重组、嵌合、异嵌合、犬源化、猫源化、马源化、完全犬、完全猫和/或完全马形式可以用相同的名称来指示。
在一个实施方案中，根据本发明的疫苗组合物包含结合至抗IL31抗体或其抗原结合部分的模拟表位，所述抗IL31抗体或其抗原结合部分特异性结合至哺乳动物IL-31蛋白上涉及IL-31蛋白与其共受体的相互作用的区域。在一个实施方案中，所述抗体与所述区域的结合受到选自以下的15H05表位结合区域中的突变的影响：a)由SEQ ID NO：157(猫_IL31_野生型)表示的猫IL-31序列的约氨基酸残基124与135之间的区域；b)由SEQ ID NO：155(犬_IL31)表示的犬IL-31序列的约氨基酸残基124与135之间的区域；以及c)由SEQ IDNO：165(马_IL31)表示的马IL-31序列的约氨基酸残基118与129之间的区域。在一个实施方案中，用于本发明的组合物中的模拟表位结合至与上述15H05表位区域特异性结合的抗IL-31抗体或其抗原结合部分。
在根据本发明的疫苗组合物的一个特定实施方案中，模拟表位结合至抗IL-31抗体或其抗原结合部分，所述抗IL-31抗体或其抗原结合部分包含以下互补决定区(CDR)序列的组合中的至少一种：
1)抗体15H05：SYTIH(SEQ ID NO：1)的可变重链(VH)-CDR1、NINPTSGYTENNQRFKD(SEQ ID NO：2)的VH-CDR2、WGFKYDGEWSFDV(SEQ ID NO：3)的VH-CDR3、RASQGISIWLS(SEQ IDNO：4)的可变轻链(VL)-CDR1、KASNLHI(SEQ ID NO：5)的VL-CDR2和LQSQTYPLT(SEQ ID NO：6)的VL-CDR3；
2)抗体ZIL1：SYGMS(SEQ ID NO：13)的可变重链(VH)-CDR1、HINSGGSSTYYADAVKG(SEQ ID NO：14)的VH-CDR2、VYTTLAAFWTDNFDY(SEQ ID NO：15)的VH-CDR3、SGSTNNIGILAAT(SEQ ID NO：16)的可变轻链(VL)-CDR1、SDGNRPS(SEQ ID NO：17)的VL-CDR2和QSFDTTLDAYV(SEQ ID NO：18)的VL-CDR3；
3)抗体ZIL8：DYAMS(SEQ ID NO：19)的VH-CDR1、GIDSVGSGTSYADAVKG(SEQ ID NO：20)的VH-CDR2、GFPGSFEH(SEQ ID NO：21)的VH-CDR3、TGSSSNIGSGYVG(SEQ ID NO：22)的VL-CDR1、YNSDRPS(SEQ ID NO：23)的VL-CDR2、SVYDRTFNAV(SEQ ID NO：24)的VL-CDR3；
4)抗体ZIL9：SYDMT(SEQ ID NO：25)的VH-CDR1、DVNSGGTGTAYAVAVKG(SEQ ID NO：26)的VH-CDR2、LGVRDGLSV(SEQ ID NO：27)的VH-CDR3、SGESLNEYYTQ(SEQ ID NO：28)的VL-CDR1、RDTERPS(SEQ ID NO：29)的VL-CDR2、ESAVDTGTLV(SEQ ID NO：30)的VL-CDR3；
5)抗体ZIL11：TYVMN(SEQ ID NO：31)的VH-CDR1、SINGGGSSPTYADAVRG(SEQ ID NO：32)的VH-CDR2、SMVGPFDY(SEQ ID NO：33)的VH-CDR3、SGESLSNYYAQ(SEQ ID NO：34)的VL-CDR1、KDTERPS(SEQ ID NO：35)的VL-CDR2、ESAVSSDTIV(SEQ ID NO：36)的VL-CDR3；
6)抗体ZIL69：SYAMK(SEQ ID NO：37)的VH-CDR1、TINNDGTRTGYADAVRG(SEQ ID NO：38)的VH-CDR2、GNAESGCTGDHCPPY(SEQ ID NO：39)的VH-CDR3、SGESLNKYYAQ(SEQ ID NO：40)的VL-CDR1、KDTERPS(SEQ ID NO：41)的VL-CDR2、ESAVSSETNV(SEQ ID NO：42)的VL-CDR3；
7)抗体ZIL94：TYFMS(SEQ ID NO：43)的VH-CDR1、LISSDGSGTYYADAVKG(SEQ ID NO：44)的VH-CDR2、FWRAFND(SEQ ID NO：45)的VH-CDR3、GLNSGSVSTSNYPG(SEQ ID NO：46)的VL-CDR1、DTGSRPS(SEQ ID NO：47)的VL-CDR2、SLYTDSDILV(SEQ ID NO：48)的VL-CDR3；
8)抗体ZIL154：DRGMS(SEQ ID NO：49)的VH-CDR1、YIRYDGSRTDYADAVEG(SEQ IDNO：50)的VH-CDR2、WDGSSFDY(SEQ ID NO：51)的VH-CDR3、KASQSLLHSDGNTYLD(SEQ ID NO：52)的VL-CDR1、KVSNRDP(SEQ ID NO：53)的VL-CDR2、MQAIHFPLT(SEQ ID NO：54)的VL-CDR3；
9)抗体ZIL159：SYVMT(SEQ ID NO：55)的VH-CDR1、GINSEGSRTAYADAVKG(SEQ IDNO：56)的VH-CDR2、GDIVATGTSY(SEQ ID NO：57)的VH-CDR3、SGETLNRFYTQ(SEQ ID NO：58)的VL-CDR1、KDTERPS(SEQ ID NO：59)的VL-CDR2、KSAVSIDVGV(SEQ ID NO：60)的VL-CDR3；
10)抗体ZIL171：TYVMN(SEQ ID NO：61)的VH-CDR1、SINGGGSSPTYADAVRG(SEQ IDNO：62)的VH-CDR2、SMVGPFDY(SEQ ID NO：63)的VH-CDR3、SGKSLSYYYAQ(SEQ ID NO：64)的VL-CDR1、KDTERPS(SEQ ID NO：65)的VL-CDR2、ESAVSSDTIV(SEQ ID NO：66)的VL-CDR3；或者
11)1)至10)的变体，其与相应亲本抗体15H05、ZIL1、ZIL8、ZIL9、ZIL11、ZIL69、ZIL94、ZIL154、ZIL159或ZIL171的不同之处在于在VH或VL CDR1、CDR2或CDR3的至少一个中添加、缺失和/或取代一个或多个氨基酸残基。
在一个实施方案中，用于疫苗组合物中的IL-31模拟表位结合至特异性结合猫IL-31的抗体，其中所述抗体结合至由SEQ ID NO：157(猫_IL31_野生型)表示的猫IL-31序列的约氨基酸残基125与134之间的区域。在一些实施方案中，此种抗体包含VL链，所述VL链包含选自以下的框架2(FW2)变化：在位置42处以天冬酰胺代替赖氨酸、在位置43处以异亮氨酸代替缬氨酸、在位置46处以缬氨酸代替亮氨酸、在位置49处以天冬酰胺代替赖氨酸及其组合，其中所述位置参照SEQ ID NO：127(FEL_15H05_VL1)的编号。
在一些实施方案中，模拟表位结合至抗体，其特征在于：
1)抗体ZIL1包含以下至少一种：
a)包含CAN-ZIL1_VL的可变轻链：
Figure BDA0002776924470000491
Figure BDA0002776924470000492
以及
b)包含CAN-ZIL1_VH的可变重链：
Figure BDA0002776924470000501
2)抗体ZIL8包含以下至少一种：
a)包含CAN-ZIL8_VL的可变轻链：
Figure BDA0002776924470000502
Figure BDA0002776924470000503
以及
b)包含CAN-ZIL8_VH的可变重链：
Figure BDA0002776924470000504
3)抗体ZIL9包含以下至少一种：
a)包含CAN-ZIL9_VL的可变轻链：
Figure BDA0002776924470000505
Figure BDA0002776924470000506
以及
b)包含CAN-ZIL9_VH的可变重链：
Figure BDA0002776924470000507
4)抗体ZIL11包含以下至少一种：
a)包含CAN-ZIL11_VL的可变轻链：
Figure BDA0002776924470000511
Figure BDA0002776924470000512
以及
b)包含CAN-ZIL11_VH的可变重链：
Figure BDA0002776924470000513
5)抗体ZIL69包含以下至少一种：
a)包含CAN-ZIL69_VL的可变轻链：
Figure BDA0002776924470000514
Figure BDA0002776924470000515
以及
b)包含CAN-ZIL69_VH的可变重链：
Figure BDA0002776924470000516
6)抗体ZIL94包含以下至少一种：
a)包含CAN-ZIL94_VL的可变轻链：
Figure BDA0002776924470000517
Figure BDA0002776924470000518
以及
b)包含CAN-ZIL94_VH的可变重链：
Figure BDA0002776924470000519
7)抗体ZIL154包含以下至少一种：
a)包含CAN-ZIL154_VL的可变轻链：
Figure BDA0002776924470000521
Figure BDA0002776924470000522
以及
b)包含CAN-ZIL154_VH的可变重链：
Figure BDA0002776924470000523
8)抗体ZIL159包含以下至少一种：
a)包含CAN-ZIL159_VL的可变轻链：
Figure BDA0002776924470000524
Figure BDA0002776924470000525
以及
b)包含CAN-ZIL159_VH的可变重链：
Figure BDA0002776924470000526
Figure BDA0002776924470000527
并且
9)抗体ZIL171包含以下至少一种：
a)包含CAN-ZIL171_VL的可变轻链：
Figure BDA0002776924470000528
Figure BDA0002776924470000531
以及
b)包含CAN-ZIL171_VH的可变重链：
Figure BDA0002776924470000532
宿主细胞可用于产生上文所述的抗体。此类抗体可以用于作为本发明的一部分描述的诊断程序中，尽管诊断程序不限于这些特定抗体。
编码抗IL-31抗体的轻链和重链的可变区的核苷酸序列可以用于制备本文所述的抗IL-31抗体。此类核苷酸序列包括但不限于编码15H05、ZIL1、ZIL8、ZIL9、ZIL11、ZIL69、ZIL94、ZIL154、ZIL159或ZIL171抗体或其IL-31特异性多肽或肽的氨基酸序列的任何核苷酸序列。另外，在一个实施方案中，编码IL-31模拟表位的核苷酸序列可用于重组产生单独的或作为融合蛋白的一部分与载体多肽一起的模拟表位。可替代地或另外地，模拟表位可以化学合成。
在一些实施方案中，分离的核酸可用于制备有用的抗体(诸如在本文所述的诊断方法之一中使用的抗体)，其中所述核酸序列编码以下可变重链互补决定区(CDR)序列的组合中的至少一种：
1)15H05：SYTIH(SEQ ID NO：1)的可变重链(VH)-CDR1、NINPTSGYTENNQRFKD(SEQID NO：2)的VH-CDR2和WGFKYDGEWSFDV(SEQ ID NO：3)的VH-CDR3；
2)ZIL1：SYGMS(SEQ ID NO：13)的VH-CDR1、HINSGGSSTYYADAVKG(SEQ ID NO：14)的VH-CDR2和VYTTLAAFWTDNFDY(SEQ ID NO：15)的VH-CDR3；
3)ZIL8：DYAMS(SEQ ID NO：19)的VH-CDR1、GIDSVGSGTSYADAVKG(SEQ ID NO：20)的VH-CDR2和GFPGSFEH(SEQ ID NO：21)的VH-CDR3；
4)ZIL9：SYDMT(SEQ ID NO：25)的VH-CDR1、DVNSGGTGTAYAVAVKG(SEQ ID NO：26)的VH-CDR2和LGVRDGLSV(SEQ ID NO：27)的VH-CDR3；
5)ZIL11：TYVMN(SEQ ID NO：31)的VH-CDR1、SINGGGSSPTYADAVRG(SEQ ID NO：32)的VH-CDR2和SMVGPFDY(SEQ ID NO：33)的VH-CDR3；
6)ZIL69：SYAMK(SEQ ID NO：37)的VH-CDR1、TINNDGTRTGYADAVRG(SEQ ID NO：38)的VH-CDR2和GNAESGCTGDHCPPY(SEQ ID NO：39)的VH-CDR3；
7)ZIL94：TYFMS(SEQ ID NO：43)的VH-CDR1、LISSDGSGTYYADAVKG(SEQ ID NO：44)的VH-CDR2和FWRAFND(SEQ ID NO：45)的VH-CDR3
8)ZIL 154：DRGMS(SEQ ID NO：49)的VH-CDRl、YIRYDGSRTDYADAVEG(SEQ ID NO：50)的VH-CDR2和WDGSSFDY(SEQ ID NO：51)的VH-CDR3；
9)ZIL159：SYVMT(SEQ ID NO：55)的VH-CDR1、GINSEGSRTAYADAVKG(SEQ ID NO：56)的VH-CDR2和GDIVATGTSY(SEQ ID NO：57)的VH-CDR3；
10)ZIL171：TYVMN(SEQ ID NO：61)的VH-CDRl、SINGGGSSPTYADAVRG(SEQ ID NO：62)的VH-CDR2和SMVGPFDY(SEQ ID NO：63)的VH-CDR3，或者
11)1)至10)的变体，其与相应亲本抗体15H05、ZIL1、ZIL8、ZIL9、ZIL11、ZIL69、ZIL94、ZIL154、ZIL159或ZIL171的CDR的不同之处在于在vH CDR1、CDR2或CDR3的至少一个中添加、缺失和/或取代一个或多个氨基酸残基。
在另一个实施方案中，分离的核酸包含编码以下可变轻链互补决定区(CDR)序列的组合中的至少一种的核酸序列：
1)15H05：RASQGISIWLS(SEQ ID NO：4)的可变轻链(VL)-CDR1、KASNLHI(SEQ IDNO：5)的VL-CDR2和LQSQTYPLT(SEQ ID NO：6)的VL-CDR3；
2)ZIL1：SGSTNNIGILAAT(SEQ ID NO：16)的VL-CDRl、SDGNRPS(SEQ ID NO：17)的VL-CDR2和QSFDTTLDAYV(SEQ ID NO：18)的VL-CDR3；
3)ZIL8：TGSSSNIGSGYVG(SEQ ID NO：22)的VL-CDR1、YNSDRPS(SEQ ID NO：23)的VL-CDR2和SVYDRTFNAV(SEQ ID NO：24)的VL-CDR3；
4)ZIL9：SGESLNEYYTQ(SEQ ID NO：28)的VL-CDR1、RDTERPS(SEQ ID NO：29)的VL-CDR2和ESAVDTGTLV(SEQ ID NO：30)的VL-CDR3；
5)ZIL11：SGESLSNYYAQ(SEQ ID NO：34)的VL-CDR1、KDTERPS(SEQ ID NO：35)的VL-CDR2和ESAVSSDTIV(SEQ ID NO：36)的VL-CDR3；
6)ZIL69：SGESLNKYYAQ(SEQ ID NO：40)的VL-CDR1、KDTERPS(SEQ ID NO：41)的VL-CDR2和ESAVSSETNV(SEQ ID NO：42)的VL-CDR3；
7)ZIL94：GLNSGSVSTSNYPG(SEQ ID NO：46)的VL-CDR1、DTGSRPS(SEQ ID NO：47)的VL-CDR2和SLYTDSDILV(SEQ ID NO：48)的VL-CDR3；
8)ZIL 154：KASQSLLHSDGNTYLD(SEQ ID NO：52)的VL-CDR1、KVSNRDP(SEQ ID NO：53)的VL-CDR2和MQAIHFPLT(SEQ ID NO：54)的VL-CDR3；
9)ZIL159：SGETLNRFYTQ(SEQ ID NO：58)的VL-CDR1、KDTERPS(SEQ ID NO：59)的VL-CDR2和KSAVSIDVGV(SEQ ID NO：60)的VL-CDR3；
10)ZIL171：SGKSLSYYYAQ(SEQ ID NO：64)的VL-CDR1、KDTERPS(SEQ ID NO：65)的VL-CDR2和ESAVSSDTIV(SEQ ID NO：66)的VL-CDR3；或者
11)1)至10)的变体，其与相应亲本抗体15H05、ZIL1、ZIL8、ZIL9、ZIL11、ZIL69、ZIL94、ZIL154、ZIL159或ZIL171的CDR的不同之处在于在VL CDR1、CDR2或CDR3的至少一个中添加、缺失和/或取代一个或多个氨基酸残基。
在又另一个实施方案中，在本文所述的抗体的制造中使用的分离的核酸包含编码相应亲本抗体15H05、ZIL1、ZIL8、ZIL9、ZIL11、ZIL69、ZIL94、ZIL154、ZIL159或ZIL171或其变体的上文所述的可变轻链互补决定区(CDR)序列以及上文所述的可变重链CDR序列的核酸序列。
包含至少一种上文所述的核酸的载体可以用于制造这些抗体。如将在下文中进一步详细描述的，编码上文所述的可变重链互补决定区(CDR)序列的组合中的至少一种的核酸序列可以与编码上文所述的可变轻链CDR序列的组合中的至少一种的核酸序列一起包含在同一载体上。或者，编码上文所述的可变轻链CDR序列的组合的至少一种的核酸序列与编码上文所述的可变重链CDR序列的组合的至少一种的核酸序列可各自包含在单独的载体上。
因为遗传密码是简并的，所以可以使用多于一个密码子来编码特定的氨基酸。使用遗传密码，可以鉴定一个或多个不同的核苷酸序列，每个序列都能够编码氨基酸。通过考虑异常碱基配对关系和在表达抗IL-31抗体或其IL-31特异性部分的真核或原核细胞中实际使用特定密码子(编码特定氨基酸)的频率，可以估计特定寡核苷酸实际上构成实际XXX-编码序列的概率。此类“密码子使用规则”由Lathe等人，183 J.Molec.Biol.1-12(1985)公开。使用Lathe的“密码子使用规则”，可以鉴定出含有能够编码抗IL-31序列的理论“最可能”核苷酸序列的单个核苷酸序列或一组核苷酸序列。还预期，抗体编码区也可以通过使用产生本文所述的抗体和肽的变体(激动剂)的标准分子生物学技术改变现有抗体基因来提供。此类变体包括但不限于在抗IL-31抗体或IL-31特异性多肽或肽的氨基酸序列(诸如抗体部分或片段)中的缺失、添加和取代。同样，可以通过改变编码亲本肽模拟表位的核苷酸序列来制备本文所述的肽模拟表位的变体。
例如，一类取代是保守性氨基酸取代。此类取代是用具有类似特征的另一个氨基酸取代抗IL-31抗体或IL-31特异性多肽或肽中的给定氨基酸的那些取代。同样，与此类抗体或其抗原结合部分结合的IL-31模拟表位可以包含保守性取代或其他类型的氨基酸取代。脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile之间的彼此置换；羟基残基Ser和Thr的互换、酸性残基Asp和Glu的交换、酰胺残基Asn和Gln之间的取代、碱性残基Lys和Arg的互换、芳族残基Phe、Tyr等之间的置换通常被视为保守性取代。在Bowie等人，247 Science 1306-10(1990)中找到了有关哪些氨基酸改变可能是表型沉默的指导。
变体或激动剂抗IL-31抗体或IL-31特异性多肽或肽可能具有完全功能，或可能缺乏一种或多种活性的功能。同样地，变体或激动剂IL-31模拟表位在一种或多种活性方面可能具有完全功能性或可能缺乏功能。完全功能性变体通常仅含有保守性变异或非关键残基或非关键区域中的变异。功能性变体也可以含有相似的氨基酸取代，这些取代不会导致功能改变或不显著的改变。或者，此类取代可以在某种程度上对功能产生正面或负面的影响。非功能性变体通常含有一个或多个非保守性氨基酸取代、缺失、插入、倒置或截短或在关键残基或关键区域中的取代、插入、倒置或缺失。
对于功能必需的氨基酸可以通过本领域已知的方法鉴定，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变。Cunningham等人，244 Science 1081-85(1989)。后一种程序在分子的每个残基处引入单个丙氨酸突变。然后测试所得的突变体分子的生物活性，例如表位结合或体外ADCC活性。对于配体-受体结合关键的位点也可以通过结构分析诸如晶体学、核磁共振或光亲和标记来确定。Smith等人，224 J.Mol.Biol.899-904(1992)；de Vos等人，255Science306-12(1992)。
此外，多肽通常含有除二十种“天然存在的”氨基酸以外的氨基酸。此外，许多氨基酸(包括末端氨基酸)可以通过天然过程诸如加工和其他翻译后修饰，或通过本领域熟知的化学修饰技术来修饰。已知的修饰包括但不限于乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸盐的形成、甲酰化、y羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯基化、外消旋化、硒化、硫酸化、转移RNA介导的氨基酸向蛋白质的添加(诸如精氨酰化)以及泛素化。
这些修饰对于本领域技术人员是熟知的，并且已经在科学文献中详细描述。例如，在大多数基础课本，诸如Proteins--Structure and Molecular Properties(第2版，T.E.Creighton，W.H.Freeman&Co.，NY，1993)中描述了几种特别常见的修饰，即糖基化、脂质附接、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、羟基化和ADP-核糖基化。关于这个主题有许多详细的综述，例如Wold，Posttranslational Covalent Modification of proteins，1-12(Johnson编辑，Academic Press，NY，1983)；Seifter等人182Meth.Enzymo1.626-46(1990)；以及Rattan等人663 Ann.NY Acad.Sci.48-62(1992)。
因此，本文所述的IL-31特异性抗体、多肽和肽以及本文所述的IL-31肽模拟表位还包括取代的氨基酸残基不是由遗传密码编码的氨基酸残基的衍生物或类似物。
类似地，刚刚描述的氨基酸序列中的添加和取代以及变化和修饰可以同样适用于IL-31抗原和/或其表位或肽的氨基酸序列，并且因此包括在本发明中。
抗体和模拟表位衍生物
抗体和模拟表位衍生物包括在本发明的范围内。抗体或模拟表位的“衍生物”含有通常不是蛋白质或肽的一部分的其他化学部分。蛋白质或肽的共价修饰包括在本发明的范围内。可通过使抗体或模拟表位的靶向氨基酸残基与能够与所选择的侧链或末端残基反应的有机衍生剂反应来将这些修饰引入分子中。例如，本领域熟知的使用双功能试剂进行衍生化可用于将抗体或片段或模拟表位与水不溶性支持基质或其他大分子载体交联。
衍生物还包括放射性标记的单克隆抗体或模拟表位。例如，使用放射性碘(125I、131I)、碳(14C)、硫(35S)、铟(111In)、氚(3H)等；单克隆抗体与生物素或抗生物素蛋白以及酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡糖淀粉酶、羧酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶或葡萄糖6-磷酸脱氢酶)的缀合物；以及单克隆抗体与生物发光剂(例如荧光素酶)、化学发光剂(例如吖啶酯)或荧光剂(例如藻胆蛋白)的缀合物。同样地，在一些实施方案中，可以标记模拟表位。
另一种衍生性双功能抗体是双特异性抗体，其通过将识别两个不同抗原基团的两个单独抗体的部分组合而生成。这可以通过交联或重组技术来实现。
另外，可以向抗体或其部分中或向本文所述的IL-31模拟表位中添加部分以增加体内半衰期(例如，通过延长从血流中清除的时间)。此类技术包括例如添加PEG部分(也称为聚乙二醇化)，并且是本领域中熟知的。参见美国专利申请公布号20030031671。
抗体、模拟表位和载体多肽的重组表达
在一些实施方案中，将编码主题单克隆抗体或含有模拟表位和载体多肽二者的融合蛋白的核酸直接引入宿主细胞，并且在足以诱导编码的抗体或融合蛋白表达的条件下孵育细胞。在将主题核酸引入细胞后，通常在37℃下，有时在选择下将细胞孵育约1-24小时的时间段，以允许抗体或携带肽模拟表位和载体多肽的融合蛋白表达。在一个实施方案中，抗体或融合蛋白被分泌到细胞在其中生长的培养基的上清液中。
传统上，单克隆抗体在鼠杂交瘤细胞系中以天然分子形式产生。除了该技术之外，本发明提供了单克隆抗体的重组DNA表达。这允许在选择的宿主物种中产生犬源化抗体、猫源化抗体、马源化抗体、人源化抗体、完全犬抗体、完全猫抗体、完全马抗体和完全人抗体，以及一系列抗体衍生物和融合蛋白。
可以根据常规技术，将编码至少一种抗IL-31抗体、其部分或IL-31特异性多肽的核酸序列或编码作为其一部分的至少一种结合至此种抗体或其部分的IL-31肽模拟表位的核酸序列与载体DNA重组，所述常规技术包括用于连接的平末端或交错末端的末端、提供适当的末端的限制酶消化、在适当时填充粘性末端、避免不期望的连接的碱性磷酸酶处理以及用适当的连接酶连接。用于此类操作的技术例如由Maniatis等人，MOLECULAR CLONING，LAB.MANUAL，(Cold Spring Harbor Lab.Press，NY，1982和1989)以及Ausubel等人1993同上公开，可用于构建编码单克隆抗体分子或其抗原结合区或IL-31肽模拟表位的核酸序列。
如果核酸分子(例如DNA)含有具有转录和翻译调控信息的核苷酸序列，并且此类序列“可操作地连接”到编码多肽的核苷酸序列，则认为其“能够表达”多肽。可操作的连接是这样的连接，其中调控性DNA序列和寻求表达的DNA序列以允许以可回收量使基因表达为抗IL-31肽或抗体部分或携带IL-31模拟表位的融合蛋白的方式连接。如在类似领域中熟知的，基因表达所需的调控区的精确性质可能因生物体不同而不同。参见例如Sambrook等人，2001同上；Ausubel等人，1993同上。
因此，本发明包括抗IL-31抗体或IL-31特异性多肽或肽或者包含IL-31模拟表位的融合蛋白在原核细胞或真核细胞中的表达。合适的宿主包括细菌或真核宿主，包括体内或原位的细菌、酵母、昆虫、真菌、鸟和哺乳动物细胞、或哺乳动物、昆虫、鸟或酵母来源的宿主细胞。哺乳动物细胞或组织可以是人类、灵长类、仓鼠、兔、啮齿动物、牛、猪、绵羊、马、山羊、狗或猫来源，但是可以使用任何其他哺乳动物细胞。
在一个实施方案中，将引入的核苷酸序列掺入能够在受体宿主中自主复制的质粒或病毒载体中。出于此目的，可以使用多种载体中的任一种。参见例如Ausubel等人，1993同上。选择特定质粒或病毒载体的重要因素包括：可从不含载体的受体细胞中识别并选择含有所述载体的受体细胞的容易程度；在特定宿主中所需的载体拷贝数；以及是否期望能够在不同物种的宿主细胞之间“穿梭”载体。
本领域已知的示例性原核载体包括质粒，例如能够在大肠杆菌中复制的质粒(例如，pBR322、ColE1、pSC101、pACYC 184、pi.VX)。此类质粒例如公开于Maniatis等人，1989同上；Ausubel等人，1993同上中。芽孢杆菌质粒包括pC194、pC221、pT127等。此类质粒由Gryczan，THE MOLEC.BIO.OF THE BACILLI 307-329(Academic Press，NY，1982)公开。合适的链霉菌质粒包括pIJ101(Kendall等人，169 J.Bacteriol.4177-83(1987))以及链霉菌噬菌体诸如.phi.C31(Chater等人，SIXTH INT’L SYMPOSIUM ON ACTINOMYCETALES BIO.45-54(Akademiai Kaido，Budapest，Hungary 1986)。假单胞菌质粒在John等人，8Rev.Infect.Dis.693-704(1986)；Izaki，33 Jpn.J.Bacteriol.729-42(1978)；以及Ausubel等人，1993同上中进行综述。
或者，可用于表达编码抗IL-31抗体或肽或如本文所述的融合蛋白的cDNA的基因表达元件包括但不限于(a)病毒转录启动子及其增强子元件，例如SV40早期启动子(Okayama等人，3 Mol.Cell.Biol.280(1983))、劳斯肉瘤病毒LTR(Gorman等人，79Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 6777(1982))和莫洛尼鼠白血病病毒LTR(Grosschedl等人，41Cell 885(1985))；(b)剪接区和聚腺苷酸化位点，例如衍生自SV40晚期区域的那些(Okayarea等人，MCB，3：280(1983)，以及(c)聚腺苷酸化位点，例如SV40(Okayama等人，1983，同上)。
免疫球蛋白cDNA基因可以如Weidle等人，51(1)Gene 21-29(1987)所述，使用SV40早期启动子及其增强子、小鼠免疫球蛋白H链启动子增强子、SV40晚期区域mRNA剪接、兔S珠蛋白插入序列、免疫球蛋白和兔S珠蛋白聚腺苷酸化位点以及SV40聚腺苷酸化元件作为表达元件来表达。
对于由部分cDNA、部分基因组DNA组成的免疫球蛋白基因(Whittle等人，1Protein Engin.499-505(1987))，转录启动子可以是人巨细胞病毒，启动子增强子可以是巨细胞病毒和小鼠/人免疫球蛋白，并且mRNA剪接和聚腺苷酸化区域可以是天然的染色体免疫球蛋白序列。
在一个实施方案中，为了在啮齿动物细胞中表达cDNA基因，转录启动子是病毒LTR序列，转录启动子增强子是小鼠免疫球蛋白重链增强子和病毒LTR增强子中的任一个或两个，剪接区含有大于31bp的内含子，并且聚腺苷酸化和转录终止区衍生自对应于所合成的免疫球蛋白链的天然染色体序列。在其他实施方案中，将编码其他蛋白质的cDNA序列与上文所述的表达元件组合以实现蛋白质在哺乳动物细胞中的表达。
每个融合基因可以组装在表达载体中或插入表达载体中。然后将能够表达嵌合免疫球蛋白链基因产物的受体细胞用抗IL-31肽或嵌合H或嵌合L链编码基因单独转染，或用嵌合H和嵌合L链基因共转染。在允许掺入基因表达的条件下培养转染的受体细胞，并从培养物中回收表达的免疫球蛋白链或完整抗体或片段。
在一个实施方案中，将编码抗IL-31肽或嵌合的H和L链或其部分的融合基因组装在单独的表达载体中，然后将其用于共转染受体细胞。或者，可将编码嵌合的H和L链的融合基因组装在同一表达载体上。
为了转染表达载体并产生嵌合抗体，受体细胞系可以是骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞可以合成、组装并分泌由转染的免疫球蛋白基因编码的免疫球蛋白，并具有使免疫球蛋白糖基化的机制。骨髓瘤细胞可以在培养物中或在小鼠的腹膜腔中生长，其中分泌的免疫球蛋白可以从腹水获得。其他合适的受体细胞包括淋巴样细胞，例如人或非人来源的B淋巴细胞、人或非人来源的杂交瘤细胞或种间异质杂交瘤细胞。
携带编码嵌合、犬源化、猫源化、马源化、人源化、完全犬、完全猫、完全马或完全人抗IL-31抗体构建体序列或IL-31特异性多肽或肽(例如本文所述的抗体的抗原结合部分)的核苷酸序列的表达载体或者携带编码如本文所述的融合蛋白的核苷酸序列的表达载体可以通过多种合适方法中的任一种引入合适的宿主细胞中，所述方法包括诸如转化、转染、缀合、原生质体融合、磷酸钙沉淀以及与聚阳离子如二乙氨基乙基(DEAE)葡聚糖一起使用的生化方法，以及诸如电穿孔、直接显微注射和微粒轰击的机械方法。Johnston等人，240Science 1538-1541(1988)。
酵母可以在产生免疫球蛋白H和L链方面提供优于细菌的显著优点。酵母进行翻译后肽修饰，包括糖基化。现在存在许多利用强启动子序列和高拷贝数质粒的重组DNA策略，它们可用于在酵母中产生所需的蛋白质。酵母识别克隆的哺乳动物基因产物的前导序列，并分泌携带前导序列的肽(即前肽)。Hitzman等人，11th Int’l Conference on Yeast，Genetics&Molec.Biol.(Montpelier，France，1982)。
可以常规评估酵母基因表达系统的抗IL-31肽、抗体和组装的鼠和嵌合、异嵌合、犬源化、猫源化、马源化、人源化、完全犬、完全猫、完全马或完全人抗体、其片段和区域的产生、分泌和稳定性水平。当酵母在富含葡萄糖的培养基中生长时，可以使用并入来自编码大量产生的糖酵解酶的主动表达的基因的启动子和终止元件的一系列酵母基因表达系统中的任一种。已知的糖酵解基因也可以提供非常有效的转录控制信号。例如，可以利用磷酸甘油酸激酶(PGK)基因的启动子和终止子信号。可以采用多种方法来评估用于在酵母中表达克隆的免疫球蛋白cDNA的最佳表达质粒。参见Vol.II DNA Cloning，45-66，(Glover编辑)IRL Press，Oxford，UK 1985)。
细菌菌株也可用作生产本发明所述的抗体分子或肽或融合蛋白的宿主。含有来源于与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体与这些细菌宿主一起使用。载体携带复制位点以及能够在转化细胞中提供表型选择的特异性基因。可以采用多种方法来评估用于在细菌中产生由克隆的免疫球蛋白cDNA编码的鼠抗体、嵌合抗体、异嵌合抗体、犬源化抗体、猫源化抗体、马源化抗体、人源化抗体、完全犬抗体、完全猫抗体、完全马抗体或完全人抗体、片段和区域或抗体链的表达质粒(参见Glover，1985同上；Ausubel，1993同上；Sambrook，2001同上；Colligan等人编著Current Protocols in Immunology，John Wiley&Sons，NY，NY(1994-2001)；Colligan等人编著Current Protocols in Protein Science，John Wiley&Sons，NY，NY(1997-2001)。
宿主哺乳动物细胞可以在体外或体内生长。哺乳动物细胞为免疫球蛋白蛋白分子提供翻译后修饰，包括前导肽的去除、H和L链的折叠和组装、抗体分子的糖基化以及功能性抗体蛋白的分泌。
除上文所述的淋巴样来源的细胞外，可用作产生抗体蛋白的宿主的哺乳动物细胞包括成纤维细胞来源的细胞，例如Vero(ATCC CRL 81)或CHO-K1(ATCC CRL 61)细胞。
许多载体系统可用于在哺乳动物细胞中表达克隆的抗IL-31肽H和L链基因(参见Glover，1985同上)。可以遵循不同的方法以获得完整的H2L2抗体。可以在同一细胞中共表达H和L链，以实现H和L链的细胞内缔合和连接，形成完整的四聚体H2L2抗体和/或抗IL-31肽。共表达可通过在同一宿主中使用相同或不同质粒来进行。可以将H和L链和/或抗IL-31肽的基因置于同一质粒中，然后将其转染到细胞中，从而直接选择表达两条链的细胞。或者，可以首先用编码一条链，例如L链的质粒转染细胞，然后用含有第二选择标记的H链质粒转染所得的细胞系。通过任一途径产生抗IL-31肽和/或H2L2分子的细胞系可以用编码肽、H、L或H加L链的额外拷贝的质粒与额外的选择标记一起转染，以生成具有增强特性的细胞系，例如组装的H2L2抗体分子的更高产量或转染的细胞系的增强的稳定性。
为了长期高产量地生产重组抗体，可以使用稳定的表达。例如，可以将稳定表达抗体分子的细胞系工程化。可以用免疫球蛋白表达盒和选择标记来转化宿主细胞，而不是使用含有病毒复制起点的表达载体。引入外来DNA后，可以使工程化细胞在富集培养基中生长1-2天，并且然后切换为选择性培养基。重组质粒中的选择标记赋予对选择的抗性，并允许细胞将质粒稳定整合到染色体中并生长以形成病灶，继而可以将其克隆并扩增成细胞系。此类工程化细胞系可特别用于筛选并评估与抗体分子直接或间接相互作用的化合物/组分。
一旦产生了抗体，就可以通过本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法对所述抗体进行纯化，例如通过色谱法(例如，离子交换、亲和力(特别是蛋白质A之后对特异性抗原的亲和力)以及分级柱色谱法)、离心、差别溶解度或通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术。在许多实施方案中，抗体从细胞分泌到培养基中并从培养基中收获。
药物应用
本发明的疫苗组合物可用于例如治疗和/或预防哺乳动物诸如狗、猫、马和人的IL-31介导的病症，诸如瘙痒和/或过敏性病状。本发明的药物组合物可用于胃肠外施用，例如皮下、肌内或静脉内。本文描述了其他合适的施用模式。
本发明的疫苗可以作为单独的治疗剂施用或与其他治疗剂组合施用。它们可以单独施用，但是通常与基于所选择的施用途径和标准药学实践来选择的药物载体一起施用。
本文公开的疫苗组合物的施用可以通过任何合适的方式进行，包括胃肠外注射(例如腹膜内、皮下或肌内注射)、口服或通过将疫苗局部施用于气道表面。可以通过鼻内施用(例如通过使用滴管、拭子或吸入器)对气道表面进行局部施用。还可以通过吸入施用，例如通过产生作为气雾剂悬浮液的含有疫苗的药物制剂的可吸入颗粒(包括固体和液体颗粒)并且然后使受试者吸入可吸入颗粒来向气道表面局部施用疫苗。用于施用药物制剂的可吸入颗粒的方法和装置是熟知的，并且可以采用任何常规技术。口服施用可以是例如可摄取的液体或固体制剂的形式。
在一些期望的实施方案中，通过胃肠外注射来施用疫苗。对于胃肠外施用，可以将疫苗与药学上可接受的胃肠外媒介物一起配制成溶液、悬浮液、乳液或冻干粉剂。例如，媒介物可以是模拟表位和载体多肽的组合(例如，模拟表位缀合物)或其混合物溶解在可接受载体(例如水性载体)中的溶液，此类媒介物是水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液、海藻糖或蔗糖溶液或5％血清白蛋白、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等。也可以使用脂质体和非水媒介物，例如不挥发性油。这些溶液是无菌的并且通常不含颗粒物质。这些组合物可以通过常规的熟知的灭菌技术进行灭菌。组合物可含有模拟生理条件所需要的药学上可接受的辅助物质，诸如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。而且，如本文所述，本发明的疫苗组合物包含佐剂或佐剂制剂。这些疫苗组合物中的模拟表位缀合物的浓度可以广泛变化，例如小于约0.5重量％、通常为或至少约1重量％至多达15重量％或20重量％，并且将根据所选择的特定施用模式主要基于流体体积、粘度等进行选择。媒介物或冻干粉末可含有保持等渗性(例如，氯化钠、甘露醇)和化学稳定性(例如，缓冲剂和防腐剂)的添加剂。所述制剂通过常用技术进行灭菌。
用于制备胃肠外施用的组合物的实际方法将是本领域技术人员已知的或清楚的，并且详细描述于例如REMINGTON’S PHARMA.SCI.(第15版，Mack Pub.Co.，Easton，Pa.，1980)中。
可以将本发明的疫苗冻干保存并在使用前在合适的载体中重构。可以采用任何合适的冻干和重构技术。本领域技术人员将理解，冻干和重构可导致不同程度的活性损失，并且可能必须调整使用水平以进行补偿。
可以施用含有本发明IL-31模拟表位(例如，IL-31模拟表位缀合物)或其混合物的组合物，以预防现有疾病复发和/或对现有疾病进行治疗性治疗。在最新版的REMINGTON’SPHARMACEUTICALSCIENCES(此技术领域的标准参考文献)中描述了合适的药物载体。
在治疗应用中，将组合物以足以治愈或至少部分地阻止或减轻疾病及其并发症的量施用于已经患有疾病的受试者。足以实现此目的的量被定义为“治疗有效剂量”或“治疗有效量”。有效用于此用途的量将取决于疾病的严重性和受试者自身免疫系统的一般状态。根据本发明的疫苗组合物的治疗有效量可容易由本领域普通技术人员确定。
当然，施用的剂量将根据已知因素而变化，所述因素例如特定剂的药效动力学特性、其施用方式和途径；接受者的年龄、健康状况和体重；症状的性质和程度、并行治疗的种类、治疗频率以及所需的效果。
作为非限制性实例，可以上文所述的剂量范围内的本发明的疫苗的每两周或每月剂量提供对狗、猫、马或人中的IL-31相关性病理的治疗。
疫苗组合物的单次或多次施用可以由治疗兽医或医师选择的剂量水平和模式进行。在任何情况下，药物制剂应提供足以有效治疗受试者的一定量的本发明的疫苗组合物。
诊断应用
本发明还提供了IL-31模拟表位和抗IL-31抗体，其用于在哺乳动物样品中检测IL-31或抗IL-31抗体的诊断方法，所述样品包括但不限于已知或疑似患有瘙痒和/或过敏性病状的哺乳动物的样品。
例如，本发明提供一种确定样品中抗IL-31抗体的身份和/或量的方法。此方法包括将包含抗IL-31抗体的样品与至少一种IL-31模拟表位(例如猫IL-31模拟表位、犬IL-31模拟表位、马IL-31模拟表位或人IL-31模拟表位)一起孵育；以及确定样品中抗IL-31的身份和/或数量。
在一个实施方案中，用于确定样品中抗IL-31抗体的身份和/或量的方法中的犬IL-31模拟表位为氨基酸序列
SVPADTFECKSF(SEQ ID NO：186)、SVPADTFERKSF(SEQ ID NO：187)、NSSAILPYFRAIRPLSDKNIIDKIIEQLDKLKF(SEQ ID NO：192)、APTHQLPPSDVRKIILELQPLSRG(SEQ ID NO：196)、TGVPES(SEQ ID NO：200)或其保留IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
在另一个实施方案中，用于此种方法中的猫IL-31模拟表位为氨基酸序列SMPADNFERKNF(SEQ ID NO：188)、NGSAILPYFRAIRPLSDKNTIDKIIEQLDKLKF(SEQ ID NO：193)、APAHRLQPSDIRKIILELRPM SKG(SEQ ID NO：197)、IGLPES(SEQ ID NO：201)或其保留抗IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
在另一个实施方案中，用于此种方法中的马IL-31模拟表位为氨基酸序列SMPTDNFERKRF(SEQ ID NO：189)、NSSAILPYFKAISPSLNNDKSLYIIeQLDKLNF(SEQ ID NO：194)、GPIYQLQPKEIQAIIVELQNLS KK(SEQ ID NO：198)、KGVQKF(SEQ ID NO：202)或其保留抗IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
更进一步地，用于此种方法中的人IL-31模拟表位为氨基酸序列SVPTDTHECKRF(SEQ ID NO：190)、SVPTDTHERKRF(SEQ ID NO：191)、HSPAIRAYLKTIRQLDNKSVIDEIIEHLDKLIF(SEQ ID NO：195)、LPVRLLRPSDDVQKIVEELQSLSKM(SEQ ID NO：199)、KGVLVS(SEQ ID NO：203)或其保留抗IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
在上文所述的诊断方法的一个实施方案中，模拟表位为结合至固体表面的捕获试剂。在一个实施方案中，将样品添加到模拟表位捕获试剂中；并且然后添加第二检测试剂，以对样品中抗体的量进行定量。
本发明还提供一种确定来自哺乳动物的样品中IL-31的量的方法。此种方法将具有用于从多种物种检测IL-31的效用。此种方法包括将包含IL-31的哺乳动物样品与拴系至固体表面的标记的抗IL-31抗体：IL-31模拟表位复合物一起孵育，其中复合物中的模拟表位选自由猫IL-31模拟表位、犬IL-31模拟表位、马IL-31模拟表位和人IL-31模拟表位组成的组；以及确定样品中IL-31的水平，其中复合物中的标记的抗IL-31抗体对复合物中的模拟表位的亲和力低于其对样品中的IL-31的亲和力。在此方法的一个实施方案中，确定步骤包括测量当样品中的IL-31结合至复合物的标记的抗IL-3抗体时从固体表面释放的标记的抗体的信号，样品中的IL-31与信号成反比。
在一个实施方案中，用于确定样品中IL-31的量的方法中的犬IL-31模拟表位为氨基酸序列
SVPADTFECKSF(SEQ ID NO：186)、SVPADTFERKSF(SEQ ID NO：187)、NSSAILPYFRAIRPLSDKNIIDKIIEQLDKLKF(SEQ ID NO：192)、APTHQLPPSDVRKIILELQPLSRG(SEQ ID NO：196)、TGVPES(SEQ ID NO：200)或其保留IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
在另一个实施方案中，用于此种方法中的猫IL-31模拟表位为氨基酸序列SMPADNFERKNF(SEQ ID NO：188)、NGSAILPYFRAIRPLSDKNTIDKIIEQLDKLKF(SEQ ID NO：193)、APAHRLQPSDIRKIILELRPM SKG(SEQ ID NO：197)、IGLPES(SEQ ID NO：201)或其保留抗IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
在又另一个实施方案中，用于此种方法中的马IL-31模拟表位为氨基酸序列SMPTDNFERKRF(SEQ ID NO：189)、NSSAILPYFKAISPSLNNDKSLYIIEQLDKLNF(SEQ ID NO：194)、GPIYQLQPKEIQAIIVELQNLS KK(SEQ ID NO：198)、KGVQKF(SEQ ID NO：202)或其保留抗IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
在另一个实施方案中，用于此种方法中的人IL-31模拟表位为氨基酸序列SVPTDTHECKRF(SEQ ID NO：190)、SVPTDTHERKRF(SEQ ID NO：191)、HSPAIRAYLKTIRQLDNKSVIDEIIEHLDKLIF(SEQ ID NO：195)、LPVRLLRPSDDVQKIVEELQSLSKM(SEQ ID NO：199)、KGVLVS(SEQ ID NO：203)或其保留抗IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
在本发明的任何诊断方法的一些实施方案中，模拟表位结合至抗IL31抗体或其抗原结合部分，所述抗IL31抗体或其抗原结合部分特异性结合至哺乳动物IL-31蛋白上涉及IL-31蛋白与其共受体的相互作用的区域。在本发明的诊断方法的一个实施方案中，所述抗体与所述区域的结合受到选自由以下组成的组的15H05表位结合区域中的突变的影响：
a)由SEQ ID NO：157(猫_IL31_野生型)表示的猫IL-31序列的约氨基酸残基124与135之间的区域；
b)由SEQ ID NO：155(犬_IL31)表示的犬IL-31序列的约氨基酸残基124与135之间的区域；以及
c)由SEQ ID NO：165(马_IL31)表示的马IL-31序列的约氨基酸残基118与129之间的区域。
在本发明的诊断方法的一个实施方案中，模拟表位结合至与上述15H05表位区域特异性结合的抗IL31抗体或其抗原结合部分。在本发明的任何诊断方法的一个具体实施方案中，模拟表位结合至抗IL-31抗体或其抗原结合部分，所述IL-31抗体或其抗原结合部分包含以下互补决定区(CDR)序列的组合中的至少一种：
1)抗体15H05：SYTIH(SEQ ID NO：1)的可变重链(VH)-CDR1、NINPTSGYTENNQRFKD(SEQ ID NO：2)的VH-CDR2、WGFKYDGEWSFDV(SEQ ID NO：3)的VH-CDR3、RASQGISIWLS(SEQ IDNO：4)的可变轻链(VL)-CDR1、KASNLHI(SEQ ID NO：5)的VL-CDR2和LQSQTYPLT(SEQ ID NO：6)的VL-CDR3；
2)抗体ZIL1：SYGMS(SEQ ID NO：13)的可变重链(VH)-CDR1、HINSGGSSTYYADAVKG(SEQ ID NO：14)的VH-CDR2、VYTTLAAFWTDNFDY(SEQ ID NO：15)的VH-CDR3、SGSTNNIGILAAT(SEQ ID NO：16)的可变轻链(VL)-CDR1、SDGNRPS(SEQ ID NO：17)的VL-CDR2和QSFDTTLDAYV(SEQ ID NO：18)的VL-CDR3；
3)抗体ZIL8：DYAMS(SEQ ID NO：19)的VH-CDR1、GIDSVGSGTSYADAVKG(SEQ ID NO：20)的VH-CDR2、GFPGSFEH(SEQ ID NO：21)的VH-CDR3、TGSSSNIGSGYVG(SEQ ID NO：22)的VL-CDR1、YNSDRPS(SEQ ID NO：23)的VL-CDR2、SVYDRTFNAV(SEQ ID NO：24)的VL-CDR3；
4)抗体ZIL9：SYDMT(SEQ ID NO：25)的VH-CDR1、DVNSGGTGTAYAVAVKG(SEQ ID NO：26)的VH-CDR2、LGVRDGLSV(SEQ ID NO：27)的VH-CDR3、SGESLNEYYTQ(SEQ ID NO：28)的VL-CDR1、RDTERPS(SEQ ID NO：29)的VL-CDR2、ESAVDTGTLV(SEQ ID NO：30)的VL-CDR3；
5)抗体ZIL11：TYVMN(SEQ ID NO：31)的VH-CDR1、SINGGGSSPTYADAVRG(SEQ ID NO：32)的VH-CDR2、SMVGPFDY(SEQ ID NO：33)的VH-CDR3、SGESLSNYYAQ(SEQ ID NO：34)的VL-CDR1、KDTERPS(SEQ ID NO：35)的VL-CDR2、ESAVSSDTIV(SEQ ID NO：36)的VL-CDR3；
6)抗体ZIL69：SYAMK(SEQ ID NO：37)的VH-CDR1、TINNDGTRTGYADAVRG(SEQ ID NO：38)的VH-CDR2、GNAESGCTGDHCPPY(SEQ ID NO：39)的VH-CDR3、SGESLNKYYAQ(SEQ ID NO：40)的VL-CDR1、KDTERPS(SEQ ID NO：41)的VL-CDR2、ESAVSSETNV(SEQ ID NO：42)的VL-CDR3；
7)抗体ZIL94：TYFMS(SEQ ID NO：43)的VH-CDR1、LISSDGSGTYYADAVKG(SEQ ID NO：44)的VH-CDR2、FWRAFND(SEQ ID NO：45)的VH-CDR3、GLNSGSVSTSNYPG(SEQ ID NO：46)的VL-CDR1、DTGSRPS(SEQ ID NO：47)的VL-CDR2、SLYTDSDILV(SEQ ID NO：48)的VL-CDR3；
8)抗体ZIL154：DRGMS(SEQ ID NO：49)的VH-CDR1、YIRYDGSRTDYADAVEG(SEQ IDNO：50)的VH-CDR2、WDGSSFDY(SEQ ID NO：51)的VH-CDR3、KASQSLLHSDGNTYLD(SEQ ID NO：52)的VL-CDRl、KVSNRDP(SEQ ID NO：53)的VL-CDR2、MQAIHFPLT(SEQ ID NO：54)的VL-CDR3；
9)抗体ZIL159：SYVMT(SEQ ID NO：55)的VH-CDR1、GINSEGSRTAYADAVKG(SEQ IDNO：56)的VH-CDR2、GDIVATGTSY(SEQ ID NO：57)的VH-CDR3、SGETLNRFYTQ(SEQ ID NO：58)的VL-CDR1、KDTERPS(SEQ ID NO：59)的VL-CDR2、KSAVSIDVGV(SEQ ID NO：60)的VL-CDR3；
10)抗体ZIL171：TYVMN(SEQ ID NO：61)的VH-CDR1、SINGGGSSPTYADAVRG(SEQ IDNO：62)的VH-CDR2、SMVGPFDY(SEQ ID NO：63)的VH-CDR3、SGKSLSYYYAQ(SEQ ID NO：64)的VL-CDR1、KDTERPS(SEQ ID NO：65)的VL-CDR2、ESAVSSDTIV(SEQ ID NO：66)的VL-CDR3；或者
11)1)至10)的变体，其与相应亲本抗体15H05、ZIL1、ZIL8、ZIL9、ZIL11、ZIL69、ZIL94、ZIL154、ZIL159或ZIL171的不同之处在于在VH或VL CDR1、CDR2或CDR3的至少一个中添加、缺失和/或取代一个或多个氨基酸残基。
在一些实施方案中，用于本发明的诊断方法中的模拟表位结合至与猫IL-31结合的抗IL-31抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含VL链，所述VL链包含选自以下的框架2(FW2)变化：在位置42处以天冬酰胺代替赖氨酸、在位置43处以异亮氨酸代替缬氨酸、在位置46处以缬氨酸代替亮氨酸、在位置49处以天冬酰胺代替赖氨酸及其组合，其中所述位置参照SEQ ID NO：127(FEL_15H05_VL1)的编号。
本发明的抗IL-31抗体、多肽和/或肽以及IL-31肽模拟表位可用于检测或定量样品中的IL-31或抗IL-31抗体的免疫测定。IL-31的免疫测定通常包括在能够选择性结合至IL-31的本发明的可检测标记的高亲和力(或高亲合力)抗IL-31抗体、多肽或肽存在下孵育临床或生物样品并检测样品中结合的标记的多肽、肽或抗体。在一个优选的实施方案中，IL-31模拟表位结合至固体表面并用于捕获标记的抗IL-31抗体，使得标记的抗IL-31抗体：IL-31模拟表位复合物被拴系至固体表面。复合物中标记的抗IL-31抗体对复合物中的模拟表位的亲和力低于其对样品中的IL-31的亲和力。因此，可以通过测量当样品中的IL-31结合至抗IL-31抗体：IL-31模拟表位复合物的标记的抗IL-31抗体时从固体表面释放的标记的抗体的信号来确定样品中的IL-31水平。在一些情况下，样品中的IL-31水平与信号成反比。各种临床测定程序是本领域熟知的。参见例如IMMUNOASSAYS FOR THE 80’S(Voller等人编辑，Univ.Park，1981)。此类样品包括组织活检物、血液、血清和粪便样品，或从动物受试者收集并进行如下所述的ELISA分析的液体。
在一些实施方案中，在不使用固体支持物的情况下检测抗原与抗体的结合。例如，可以液体形式检测抗原与抗体的结合。
在其他实施方案中，IL-31肽模拟表位或抗IL-31抗体、多肽或肽可以例如固定在硝化纤维素或能够固定细胞、细胞颗粒或可溶性蛋白质的另一种固体支持物上。然后可以用合适的缓冲液洗涤支持物，然后用可检测标记的IL-31特异性多肽、肽或抗体处理。然后可以用缓冲液第二次洗涤固相支持物以去除未结合的多肽、肽或抗体。然后可以通过已知的方法步骤检测固体支持物上结合的标记的量。
“固相支持物”或“载体”是指能够结合多肽、肽、抗原或抗体的任何支持物。熟知的支持物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚偏二氟乙烯(PVDF)、右旋糖酐、尼龙、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。出于本发明的目的，载体的性质可以是在一定程度上可溶的或不可溶的。只要偶合的分子能够结合至IL-31肽模拟表位、IL-31或抗IL-31抗体，则支持材料可以实际上具有任何可能的结构构型。可以设想的是，如果需要，与支持物结合的IL-31模拟表位本身可以缀合至载体多肽。因此，支持物构型可以是球形，例如在珠粒中，或者是圆柱形，例如在试管的内表面或杆的外表面。或者，表面可以是平坦的，例如片、培养皿、测试条等。例如，支持物可以包括聚苯乙烯珠粒。本领域技术人员将知道许多用于结合抗体、多肽、肽或抗原的其他合适的载体，或者可以通过常规实验确定它们。
熟知的方法步骤可以确定给定批次的模拟表位或抗IL-31多肽、肽和/或抗体的结合活性。本领域技术人员可以通过常规实验确定操作和最佳测定条件。
可以通过几种不同的方法，包括与用于酶免疫测定(EIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)的酶连接来完成可检测地标记IL-31特异性多肽、肽和/或抗体以及IL-31肽模拟表位(或其缀合物)的标记。连接的酶与暴露的底物反应以生成化学部分，所述化学部分可以例如通过分光光度法、荧光法或通过可视方法检测。可用于可检测地标记本文所述的IL-31特异性抗体或模拟表位的酶包括但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。
通过放射性标记IL-31特异性抗体或模拟表位，可以通过使用放射免疫测定(RIA)检测IL-31。参见Work等人，LAB.TECHNIQUES&BIOCHEM.1N MOLEC.Bio.(No.HollandPub.Co.，NY，1978)。放射性同位素可通过诸如使用γ计数器或闪烁计数器的方法或通过放射自显影来检测。对于本发明的目的特别有用的同位素包括：3H、125I、131I、35S、14C和125I。
也可以用荧光化合物标记IL-31特异性抗体或模拟表位。当荧光标记的抗体暴露于适当波长的光时，那么可因为荧光而检测到它的存在。最常用的荧光标记化合物是异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺。
还可以使用发射荧光的金属(例如125Eu或其他镧系元素)对IL-31特异性抗体或模拟表位进行标记。这些金属可以使用诸如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)等金属螯合基团连接到IL-31特异性抗体或模拟表位。
IL-31特异性抗体也可以通过与化学发光化合物偶合而被可检测地标记。然后通过检测在化学反应过程期间产生的发光的存在来确定化学发光标记的抗体或模拟表位的存在。有用的化学发光标记化合物的实例是鲁米诺、异鲁米诺、芳香吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
同样，生物发光化合物可用于标记模拟表位或IL-31特异性抗体、其部分、片段、多肽或衍生物。生物发光是在生物系统中发现的一种化学发光，其中催化蛋白提高化学发光反应的效率。通过检测发光的存在来确定生物发光蛋白的存在。用于标记目的的重要生物发光化合物是萤光素、萤光素酶和水母发光蛋白。
模拟表位、IL-31特异性抗体、部分、片段、多肽或衍生物的检测可以例如在可检测的标记是放射性γ发射体时通过闪烁计数器来完成，或者例如在标记是荧光材料时通过荧光计来完成。在酶标记的情况下，检测可以通过使用酶底物的比色法来完成。检测还可以通过目测比较底物的酶促反应程度与类似制备的标准物来完成。
出于本发明的目的，通过上述测定法检测的IL-31可以存在于生物样品中。可以使用含有IL-31的任何样品。例如，样品是生物流体，例如像血液、血清、淋巴液、尿液、粪便、炎性渗出液、脑脊髓液、羊水、组织提取物或匀浆等。本发明不限于仅使用这些样品的测定，但是根据本说明书，本领域的普通技术人员可以确定允许使用其他样品的合适条件。
原位检测可通过从动物受试者中取出组织学标本并向此种标本中添加标记的抗体(单独或与本文所述的IL-31模拟表位复合)来完成。还可以设想的是，复合物中的抗体可以仅构成所述抗体的一部分。抗体(或其部分)可以通过将标记的抗体(或部分)施加或覆盖到生物样品来提供。通过使用此程序，不仅可以确定IL-31的存在，而且可以确定被检组织中IL-31的分布。使用本发明，本领域普通技术人员将容易地认识到，可以修改多种组织学方法(例如染色程序)中的任一种以便实现这种原位检测。
本发明的模拟表位、抗体、片段或衍生物可以适于用于免疫测定法，也称为“双位点”或“夹心”测定法。在典型的免疫测定法中，使一定量的未标记的抗体(或抗体片段)结合至不溶于正测试流体的固体支持物，并添加一定量的可检测标记的可溶性抗体以允许对固相抗体、抗原和标记的抗体之间形成的三元复合物进行检测和/或定量。
抗体或抗体：模拟表位复合物可用于定量或定性检测样品中的IL-31或检测表达IL-31的细胞的存在。这可以通过采用荧光标记的抗体或抗体：模拟表位复合物(参见下文)的免疫荧光技术结合荧光显微法、流式细胞术或荧光检测来完成。出于诊断目的，抗体可以是标记的或未标记的。未标记的抗体可与和抗体反应的其他标记的抗体(第二抗体)，诸如对犬或猫免疫球蛋白恒定区具有特异性的抗体组合使用。或者，可以直接标记抗体。可以使用多种标记，例如放射性核素、荧光素、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、配体(特别是半抗原)等。许多类型的免疫测定法，例如前面讨论的那些都是可用的并且是本领域技术人员熟知的。
在一个实施方案中，用于检测IL-31的诊断方法是侧流免疫测定测试。这也称为免疫色谱测定、快速免疫迁移(RIMTM)或条带测试。侧流免疫测定法本质上是适于沿着单轴操作以适合测试条带形式的免疫测定法。所述技术的许多变型已发展成商业产品，但它们均根据相同的基本原理进行操作。典型的测试条带由以下组件组成：(1)样品垫-在其上施加测试样品的吸收垫；(2)缀合物或试剂垫-其含有对与有色颗粒(通常为胶体金颗粒或胶乳微球)缀合的靶分析物具有特异性的抗体；(3)反应膜-通常是疏水性硝化纤维素或醋酸纤维素膜，抗靶分析物抗体被固定在膜上的作为捕获区或测试线的一条线上(也可能存在对照区，其含有对缀合物抗体具有特异性的抗体)；以及(4)芯吸或废物储存器-另一个吸收垫，其被设计成通过毛细作用将样品拉过反应膜并将其收集。条带的组件通常固定到惰性背衬材料，并且可以简单的浸量尺形式存在或存在于具有样品口和显示捕获区和对照区的反应窗的塑料外壳内。
在微生物测试中使用两种主要类型的侧流免疫测定：双抗体夹心测定和竞争测定。在双抗体夹心形式中，样品从样品垫迁移通过缀合物垫，在所述缀合物垫中存在的任何靶分析物将结合至缀合物。然后，样品继续迁移穿过整个膜，直到其到达捕获区，在捕获区中靶/缀合物复合物将结合至固定的抗体，从而在膜上产生可见线。然后使样品沿着条带进一步迁移，直到其到达对照区，在对照区中过量的缀合物将结合并在膜上产生第二条可见线。此对照线表明样品已按预期迁移穿过整个膜。膜上两条清晰的线是阳性结果。对照区中的单条线是阴性结果。竞争性测定法与双抗体夹心形式的不同之处在于，缀合物垫含有已与靶分析物或其类似物结合的抗体。如果靶分析物存在于样品中，则它将因此不会与缀合物结合，并将保持未标记。当样品沿膜迁移并到达捕获区时，过量的未标记分析物将结合至固定的抗体并阻止缀合物的捕获，因此不会产生可见线。然后，未结合的缀合物将与对照区中的抗体结合，产生可见的对照线。膜上的单个对照线是阳性结果。捕获区和对照区中的两条可见线是阴性结果。但是，如果不存在过量的未标记靶分析物，则在捕获区中可能会产生弱线，这表明结果尚无定论。侧流技术有多种变型。膜上的捕获区可含有固定的抗原或酶(取决于靶分析物)，而不是抗体。也可以应用多个捕获区来创建多重测试。例如，已经开发出能够在同一样品中分别检测EHEC志贺毒素(Shiga toxin)ST1和ST2的商业测试条带。
重要的是，本文所述的模拟表位和抗体可有助于诊断狗、猫或马的瘙痒和/或过敏。更具体地说，抗体：模拟表位复合物中的抗体可结合至样品中的IL-31，并有助于鉴定IL-31在哺乳动物(包括伴侣动物)中的过表达。因此，可以与模拟表位结合使用的本文所述的抗体可以提供重要的免疫组织化学工具。在一个实施方案中，在此构想了一种测定设计，由此IL-31模拟表位(肽)用于捕获被标记以用于在测定中检测到的本发明的抗体。此捕获的抗体对连接的模拟表位的亲和力低于宿主物种中天然循环IL-31的亲和力。在此实施方案中，将源自宿主物种的流体的孵育与拴系到固体表面的标记抗体：模拟表位复合物一起孵育。源自宿主物种的测试流体中IL-31的存在对抗体具有更高的亲和力，从而从固体表面释放出标记的抗体，其中所述抗体可以在洗涤步骤中去除。因此，测试流体中IL-31的水平可能与在模拟表位结合的表面上出现的信号的缺乏相关。可以构想的是，这种测定可具有在研究或临床环境中用作诊断测试测量IL-31的效用。
本文所述的抗体和模拟表位可以在高度适合于测量基因表达谱的抗体阵列上使用。
试剂盒
用于实施主题治疗方法和诊断方法的试剂盒也包括在本发明的范围内。在一个实施方案中，根据本发明的试剂盒至少包括本发明的疫苗组合物。在一个实施方案中，本发明的疫苗通常可以冻干形式提供在容器中。在另一个实施方案中，根据本发明的试剂盒可包括实施本发明的诊断方法所必需的组分。例如，本发明的试剂盒可包括作为其组分之一的如本文所述的IL-31模拟表位，例如猫IL-31模拟表位、犬IL-31模拟表位、马IL-31模拟表位或人IL-31模拟表位。此种模拟表位可能已经结合至固体表面。根据本发明的试剂盒也可以包括抗体。试剂盒中通常包括可与标记或毒素缀合或未缀合的抗体，以及缓冲液(例如Tris、磷酸盐、碳酸盐等)、稳定剂、杀生物剂、惰性蛋白质(例如血清白蛋白)等。通常，基于活性抗体的量，这些物质将以小于5重量％存在，并且再次基于抗体浓度，通常以至少约0.001重量％的总量存在。通常，期望包括惰性增量剂或赋形剂以稀释活性成分，其中赋形剂可以总组合物的约1重量％至99重量％存在。当在测定中使用能够结合至第一抗体的第二抗体时，其通常存在于单独的小瓶中。第二抗体通常与标记缀合，并以与上文所述的抗体制剂类似的方式配制。所述试剂盒通常还将包括一组使用说明书。
在一个实施方案中，根据本发明的试剂盒是可用于检测样品中的IL-31，诸如犬、猫、马或人IL-31蛋白的测试条试剂盒(侧流免疫测定试剂盒)。此测试条通常将包括在其上施加测试样品的样品垫；含有对犬、猫、马或人IL-31具有特异性的抗体或抗体：模拟表位的缀合物或试剂垫，其中所述抗体或抗体：模拟表位复合物与有色颗粒(通常是胶体金颗粒)缀合；反应膜，抗IL-31抗体或抗体：模拟表位复合物被固定在所述膜上的作为捕获区或测试线的一条线上(也可能存在对照区，其含有对缀合物抗体具有特异性的抗体或抗体：模拟表位复合物)；以及另一个吸收垫，其被设计成通过毛细作用将样品拉过反应膜并将其收集。测试条试剂盒通常还将包括使用说明。
现在将通过以下非限制性实施例进一步描述本发明。在以下实施例部分和附图中，对于在其名称中含有“11E12”的抗体呈现的任何数据都是为了与本发明的抗体进行比较。
实施例
1.实施例1
1.1.从中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生犬白介素31(cIL-31)
白介素31蛋白的氨基酸序列保守性在同源物种之间有所不同(图1)，但据信与I型细胞因子家族的其他成员具有共同的结构架构(Boulay等人2003，Immunity.8月；19(2)：159-632003；Dillon等人2004 Nat Immunol.7月；5(7)：752-60)。这种上下束拓扑结构对于这些细胞因子共有的受体识别模式是重要的(Dillon等人同上，Comelissen等人2012Eur JCell Biol.6月-7月；91(6-7)：552-66)。随着不同物种之间IL-31蛋白序列同一性的变化，鉴于表位倾向和局部氨基酸组成不同，无法预测针对一种物种产生的抗体是否会与其他物种交叉反应。因此，在此工作中考虑了表示多种物种和表达系统的多种形式的IL-31蛋白。产生犬IL-31蛋白(cIL-31)以用作测试抗体命中的亲和力和效力的免疫原和试剂。使用CHROMOS ACE(人工染色体表达)系统(Chromos Molecular Systems，Inc.，Burnaby，British Columbia)在CHO细胞中产生重组cIL-31，以生成具有序列(SEQ ID NO：155；犬_IL31)的分泌的犬IL-31蛋白，其对应的核苷酸序列为(SEQ ID NO：156；犬_IL31)。获得来自400ml细胞培养物(CHO细胞系)的条件培养基，并用10体积的QA缓冲液(20mM Tris pH 8.0，20mM NaCl)透析4.5小时。将透析的培养基进行0.2μm过滤，并以1ml/min加载到用QA缓冲液预平衡的SOURCETM Q柱(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)上。使用多步线性梯度洗脱蛋白质。大部分cIL-31保留在流通(FT)级分中，少量cIL-31早期在梯度中洗脱。先前通过Western免疫印迹和胰蛋白酶消化物的质谱(MS)分析来确认了蛋白质的身份。将FT级分中的蛋白质浓缩4-5倍，并在4℃下用磷酸盐缓冲盐水(PBS)透析过夜。在PBS中透析后检查蛋白质的稳定性。在4℃下几天后未观察到沉淀，并且也未观察到蛋白水解。使用N-糖苷酶F进行的去糖基化实验导致蛋白质在SDS-PAGE上浓缩至约15kDa的单个条带。使用二辛可宁酸测定法(BCA测定法)，以牛血清白蛋白(BSA)为标准品(ThermoFisher Scientific，Inc.，Rockford，IL)测定蛋白质浓度。将蛋白质溶液分成等分试样，速冻(液态N2)并储存在-80℃下。
1.2.从CHO细胞中瞬时表达野生型和突变体猫白介素31(fIL-31)
为了帮助鉴定具有适当表位结合特性的抗体，在哺乳动物表达系统中表达野生型和突变体猫IL-31蛋白，以在亲和力和基于细胞的测定法中进行生产、纯化和评定。先前已描述了抗体11E12在IL-31上的结合位点(Bammert等人的美国专利号8,790,651)。本文描述了由抗体15H05识别的IL-31上的新结合位点的特征。野生型名称是全长猫IL-31蛋白，其天然氨基酸残基没有变化。突变体蛋白由其对应的抗体名称(11E12和15H05)表示，是指IL-31蛋白中的氨基酸(当改变时)影响与每种对应抗体的结合的突变。在以下1.10部分中描述了猫IL-31 15H05蛋白所需的适当突变的鉴定。目标是改变IL-31表位中的氨基酸，并观察到与每种相应抗体的结合表型的损失。然后可以在筛选过程中进行比较，以查看新的候选抗体是否与野生型蛋白结合而不与突变体结合。然后可以根据和与抗体11E12或15H05相同或相似的表位的结合来对新抗体命中进行分类。
对表达构建体进行密码子优化并合成以在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达。将合成的基因克隆到pD2529(ATUM载体)中以用于瞬时表达。野生型猫IL-31蛋白由(SEQ ID NO：157；猫_IL31_野生型)表示，其对应的核苷酸序列为(SEQ ID NO：158；猫_IL31_野生型)。突变体猫IL-31 11E12蛋白由(SEQ ID NO：161；猫_IL31_11E12_突变体)表示，其对应的核苷酸序列为(SEQ ID NO：162；猫_IL31_11E12_突变体)。突变体猫IL-31 15H05蛋白由(SEQ IDNO：163；猫_IL31_15H05_突变体)表示，其对应的核苷酸序列为(SEQ ID NO：164；猫_IL31_15H05_突变体)。遵循制造商针对瞬时CHO表达的最大滴度方案，使重组猫IL-31蛋白在ExpiCHO-STM细胞(ThermoFisher Scientific，Inc.，Rockford，IL)中表达。转染后十二天，将细胞离心并过滤以捕获在条件培养基中分泌的蛋白质。对于每种构建体(野生型和突变体)，通过添加NaCl、5mM咪唑和pH 7.4将120mL条件培养基(来自CHO细胞培养物，0.2μm过滤)调节至30mS/em。将每种培养基样品与已用5mM咪唑、20mM磷酸钠、300mM NaCl、pH 7.4平衡的5mL HisPur钴树脂(ThermoFisher Scientific，Inc.，Rockford，IL)组合。将每种样品和树脂在4℃下混合过夜。通过倾倒穿过BioRad Econcolumns(Bio-Rad，Hercules，CA)收集树脂(并与未结合的级分分离)。用5×5mL缓冲液(如上所述)洗涤树脂并且然后用5×5mL在相同缓冲液中的500mM咪唑洗脱。通过SDS-PAGE评估级分。使用标准方法通过BCA蛋白测定法测量浓度。
1.3.由大肠杆菌产生猫白介素31(fIL-31)
重组猫IL-31蛋白在大肠杆菌表达宿主中生成，以用作测定试剂并在体内攻击研究中用于诱导猫的瘙痒应答。合成代表猫IL-31的基因以在大肠杆菌中最佳表达。用含有N末端6-His标签的全长猫IL-31基因创建表达构建体，以用于检测和纯化。所述猫IL-31蛋白由(SEQ ID NO：159；猫_IL_31_大肠杆菌)表示，其对应的核苷酸序列为(SEQ ID NO：160；猫_IL_31_大肠杆菌)。将序列确认的质粒用于转化大肠杆菌BL21 DE3(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)，并随后进行蛋白表达。
如下裂解来自大肠杆菌的细胞糊(262.3g)：将细胞糊重悬于500mL 50mM Tris pH8中，通过不锈钢筛网过滤器过滤以去除颗粒，然后在1300psi下通过两次穿过微流化器来裂解。将裂解物(约1200mL体积)分到四个瓶，在10℃下以12,000g离心20分钟。倾析并丢弃上清液。通过悬浮在300mL 5mM EDTA、0.5％Triton X-100、pH 9.0中并且然后在10℃下以12,000g离心50分钟来洗涤每个沉淀。倾析并丢弃上清液。将洗涤的沉淀储存在-20℃下直至折叠并分离。
分离前，将其中一个沉淀用水洗涤以去除残留的洗涤剂，并且然后在4℃下以10,000g离心20分钟。再次倾析上清液。最后，将洗涤的沉淀溶于60mL 50mM磷酸钠、300mMNaCl、6M胍-HCl、5mM咪唑、pH 7.4中。使沉淀在室温下混合约25分钟，然后在4℃下以10,000g再次离心20分钟。此时，倾析上清液并保存以进一步处理。将沉淀(重悬于水中至原始体积)静置，仅用于SDS-PAGE。在折叠前，进行粗制IMAC(固定化金属亲和色谱)以提高纯度。在这种情况下，将15mL Ni-NTA Superflow(Qiagen Inc，Germantown，MD，目录号30450，在同一缓冲液中预先平衡)添加到澄清的上清液中，并在室温下混合约90分钟。倾析未结合的级分，并静置用于SDS-PAGE。将IMAC树脂用5mM咪唑、50mM磷酸钠、300mM NaCl、6M胍-HCl、pH7.4(与溶解缓冲液相同)洗涤。将树脂用(首先7.5mL，然后是15mL的倍数，通过Bradford测定监测蛋白质洗脱)200mM咪唑、50mM磷酸钠、300mM NaCl、6M胍-HCl、pH 7.4洗脱。将含有蛋白质的洗脱级分(根据Bradford)合并(125mL)以进一步处理。
IL-31蛋白如下折叠。通过添加二硫苏糖醇至最终10mM来将IL-31还原，并使其在室温下混合2小时。然后在快速搅拌下将稀释的样品逐滴稀释到2500mL(20X体积)的PBS+1MNaCl中。此时，尿素的理论浓度应为约0.4M。通过在4℃下用3次PBS交换液(每次4L)透析过夜来缓慢去除剩余的尿素。透析后，将样品0.2μm过滤，以去除任何未折叠/沉淀的蛋白质。
通过第二轮IMAC进一步纯化样品，这次使用线性梯度洗脱。将15mL Ni-NTASuperflow树脂添加至样品中，并通过在4℃下(用悬浮的搅拌棒)搅拌过夜来使其分批结合。再次，倾析未结合的部分并静置。将Ni-NTA Superflow树脂装在XK16柱(GE HealthcareLifesciences，Marlborough，MA)中，并连接到AKTA牌色谱系统(GE HealthcareLifesciences，Marlborough，MA)。然后用50mM Tris、300mM NaCl、pH 8.2洗涤柱，并通过从0到500mM咪唑(各自在洗涤缓冲液中)的150mL线性梯度洗脱。通过SDS-PAGE分析级分。将具有足够纯度的IL-31的级分合并，并通过在4℃用3次PBS交换液(每次2L)透析过夜来再次交换缓冲液。最后，从透析收集折叠和纯化的样品，无菌过滤，等分测量浓度，在干冰/异丙醇浴中速冻，并储存在-80℃下。
1.4.使用表面等离子体共振测定抗IL-31抗体对IL-31的亲和力的方法
在Biacore系统(Biocore Life Sciences(GE Healthcare)，Uppsala，Sweden)上使用表面等离子体共振(SPR)测定候选mAb结合犬和猫IL-31的亲和力。为避免在将抗体固定到表面时可能发生的与不同表面制备相关的亲和力差异；采用了将IL-31直接缀合到表面的策略。使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)/1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)化学，通过胺偶合5μg/mL IL-31来获得固定化。用乙醇胺淬灭芯片，并评估所有候选mAb结合至固定化IL-31的亲和力。所有曲线均拟合至1∶1模型。小于1x10-11M(1E-11M)的亲和常数(KD)低于仪器的检测定量下限。本文描述了亲和力测量的结果。
1.5.确定通过抑制犬和猫巨噬细胞中犬和猫IL-31诱导的pSTAT3信号传导来评定 的抗IL-31抗体效力的方法
为了鉴定具有抑制活性的候选物，在基于犬或猫细胞的测定中评定了抗体影响IL-31介导的STAT3磷酸化的能力。在犬DH-82(
Figure BDA0002776924470000851
CRL-10389TM)或猫FCWF4巨噬细胞样细胞(ATCC CRL-2787)中测定STAT3磷酸化。将DH82和FCWF4细胞分别用10ng/mL犬干扰素γ(R&D Systems，Minneapolis，MN)致敏24小时并用125ng/mL猫干扰素γ(R&D Systems，Minneapolis，MN)致敏96小时，以增加受体表达。在IL-31和mAb处理前，两种细胞均需血清饥饿2小时。使用两种独立的方法，评估了所有候选mAb抑制1μg/mL犬或0.2μg/mL猫IL-31诱导的STAT3磷酸化的能力。还进行了测定以证明犬和猫细胞因子的交叉反应性以及抗体在两种物种中抑制信号传导的交叉功能。为了确保形成复合物，在细胞刺激前将mAb和IL-31细胞因子共孵育一小时。将IL-31细胞刺激进行五分钟。使用AlphaLISA SureFire ULTRATM技术(Perkin Elmer，Waltham，MA)测量STAT3磷酸化。在抗体浓度和纯度未知的情况下，与1mg/ml犬或0.2mg/ml猫IL-31共孵育1小时后，定性测量杂交瘤上清液抑制STAT3磷酸化的能力。在这些测定中，由单个单克隆抗体抑制IL-31介导的STAT3磷酸化的能力所定义的其效力被认为是进一步改进所选抗体的关键性选择标准。术语效力是指由这些测定计算出的IC50值，并且是由IL-31诱导的信号传导降至其最大值的一半时的抗体浓度。本文所述的增加的效力与较低IC50值相关。
1.6.识别犬和猫白介素31的小鼠和犬单克隆抗体的鉴定
为了鉴定抗体，用重组犬IL-31(SEQ ID No.155)免疫化小鼠和犬。使用酶联免疫吸附测定(ELISA)测定免疫动物的血清抗体滴度。将犬或猫IL-31(50ng/孔)固定到聚苯乙烯微板，并用作捕获抗原。将免疫动物的血清在含0.05％tween-20的磷酸盐缓冲盐水(PBST)中稀释。用适当的二级HRP标记抗体检测抗IL-31抗体的存在。添加生色底物(SureBlue Reserve TMB 1-组分微孔过氧化物酶底物，KPL，Inc.，Gaithersburg，MD)并在室温(RT)下孵育十分钟后，通过添加100μL 0.1N HCl终止反应。在450nm的光密度(OD)下测定每个孔的吸光度。使用ELISA针对结合犬和猫IL-31的能力选择抗体。在某些情况下，在选择时使用ELISA使用猫IL-31蛋白的突变体形式作为捕获抗原进行进一步表征。选择产生具有所需结合和抑制特性的抗体的细胞，用于对代表可变重(VH)和可变轻(VL)IgG链的RNA转录物进行序列分析。
在小鼠抗体的情况下，将来自单个应答CF-1小鼠的供体脾细胞用于融合，并通过ELISA筛选杂交瘤上清液中结合至犬或猫IL-31蛋白的抗体。这导致鉴定出对两种IL-31具有亚纳摩尔亲和力的单一小鼠抗体Mu-15H05(图2A)。将小鼠抗IL-31 15H05进一步亚克隆以生成杂交瘤，所述杂交瘤产生均质抗体并用于对可变重链和轻链进行测序。针对抗体15H05测定的小鼠抗IL-31可变序列如下：15H05可变重链(SEQ ID NO：67；MU-15H05-VH)，其对应的核苷酸序列为(SEQ ID NO：68；MU-15H05-VH)，15H05可变轻链(SEQ ID NO：69；MU-15H05-VL)，其对应的核苷酸序列为(SEQ ID NO：70；MU-15H05-VL)。除了小鼠抗体15H05之外，还进一步考虑了小鼠衍生化抗体11E12，所述抗体先前描述于Bammert等人的美国专利号8,790,651中。本文描述的数据显示抗体11E12以高亲和力结合犬和猫IL-31蛋白的能力。11E12结合猫IL-31的能力使所述抗体成为猫源化的和猫中潜在治疗用途的合适候选物。先前针对抗体11E12测定的小鼠抗IL-31可变序列如下：11E12可变重链(SEQ ID NO：71；MU-11E12-VH)，其对应的核苷酸序列为(SEQ ID NO：72；MU-11E12-VH)，11E12可变轻链(SEQ IDNO：73；MU-11E12-VL)，其对应的核苷酸序列为(SEQ ID NO：74；MU-11E12-VL)。
选择在疫苗接种后具有提高的抗IL-31滴度的狗，用于分析产生具有所需表型的抗体的B细胞群。B细胞来源于PBMC、骨髓、脾脏或淋巴结，以用于进一步分析。使用US2012/0009671A1、US2016/0252495A1、US 9,188,593、WO 2015/176162 A9和WO 2016/123692 A1中所述的方法，将单个B细胞分离到各个孔中，并测定能够结合犬IL-31的野生型、11E12突变体和15H05突变体形式(AbCellera，Vancouver，BC)的分泌的IgG的存在。
所述筛选策略是基于IL-31蛋白的已知区域，所述区域对于通过其共受体复合物进行结合和信号转导是至关重要的。在本申请的1.2部分中描述了用于筛选的这些突变体蛋白的选择。从单个候选B细胞进行RT-PCR反应后，对可变重链和轻链IgG结构域进行测序。这些筛选使得鉴定出针对进一步评估选择的九种犬抗体。这些犬抗IL-31可变序列如下：ZIL1可变重链(SEQ ID NO：75；CAN-ZIL1_VH)，其对应的核苷酸序列为(SEQ ID NO：76；CAN-ZIL1_VH)，ZIL1可变轻链(SEQ ID NO：77；CAN-ZIL1_VL)，其对应的核苷酸序列为(SEQ IDNO：78；CAN-ZIL1_VL)；ZIL8可变重链(SEQ ID NO：79；CAN-ZIL8_VH)，其对应的核苷酸序列为(SEQ ID NO：80；CAN-ZIL8_VH)，ZIL8可变轻链(SEQ ID NO：81；CAN-ZIL8_VL)，其对应的核苷酸序列为(SEQ ID NO：82；CAN-ZIL8_VL)；ZIL9可变重链(SEQ ID NO：83；CAN-ZIL9_VH)，其对应的核苷酸序列为(SEQ ID NO：84；CAN-ZIL9_VH)，ZIL9可变轻链(SEQ ID NO：85；CAN-ZIL9_VL)，其对应的核苷酸序列为(SEQ ID NO：86；CAN-ZIL9_VL)；ZIL11可变重链(SEQID NO：87；CAN-ZIL11_VH)，其对应的核苷酸序列为(SEQ ID NO：88；CAN-ZIL11_VH)，ZIL11可变轻链(SEQ ID NO：89；CAN-ZIL11_VL)，其对应的核苷酸序列为(SEQ ID NO：90；CAN-ZIL11_VL)；ZIL69可变重链(SEQ ID NO：91；CAN-ZIL69_VH)，其对应的核苷酸序列为(SEQID NO：92；CAN-ZIL69_VH)，ZIL69可变轻链(SEQ ID NO：93；CAN-ZIL69_VL)，其对应的核苷酸序列为(SEQ ID NO：94；CAN-ZIL69_VL)；ZIL94可变重链(SEQ ID NO：95；CAN-ZIL94_VH)，其对应的核苷酸序列为(SEQ ID NO：96；CAN-ZIL94_VH)，ZIL94可变轻链(SEQ ID NO：97；CAN-ZIL94_VL)，其对应的核苷酸序列为(SEQ ID NO：98；CAN-ZIL94_VL)；ZIL154可变重链(SEQ ID NO：99；CAN-ZIL154_VH)，其对应的核苷酸序列为(SEQ ID NO：100；CAN-ZIL154_VH)，ZIL154可变轻链(SEQ ID NO：101；CAN-ZIL154_VL)，其对应的核苷酸序列为(SEQ IDNO：102；CAN-ZIL154_VL)；ZIL159可变重链(SEQ ID NO：103；CAN-ZIL159_VH)，其对应的核苷酸序列为(SEQ ID NO：104；CAN-ZIL159_VH)，ZIL159可变轻链(SEQ ID NO：105；CAN-ZIL159_VL)，其对应的核苷酸序列为(SEQ ID NO：106；CAN-ZIL159_VL)；ZIL171可变重链(SEQ ID NO：107；CAN-ZIL171_VH)，其对应的核苷酸序列为(SEQ ID NO：108；CAN-ZIL171_VH)，ZIL171可变轻链(SEQ ID NO：109；CAN-ZIL171_VL)，其对应的核苷酸序列为(SEQ IDNO：110；CAN-ZIL171_VL)。
选择用于进一步表征的上述九种单克隆抗体可以在说明书、附图或权利要求书的其他地方称为ZIL1、ZIL8、ZIL8、ZIL11、ZIL69、ZIL94、ZIL154、ZIL159和ZIL171。
1.7.重组嵌合抗体和完全犬抗体的构建
抗体可变结构域负责抗原结合。预期将完全可变结构域接枝到对应恒定区上对抗体结合IL-31免疫原的能力影响很小或没有影响。为了同时证实鉴定出重链和轻链可变区的正确序列并产生均质材料，设计了在哺乳动物表达系统中产生重组嵌合抗体或完全犬抗体的表达载体。在此描述的嵌合抗体由接枝到猫或犬IgG分子的对应重链和轻链恒定区上的宿主物种抗体的可变序列(CDR和框架)组成(例如，小鼠可变：犬恒定被称为小鼠：犬嵌合体)。在此描述的完全犬抗体由接枝到犬IgG分子的对应重链和轻链恒定区上的宿主物种抗体(犬)的可变序列(CDR和框架)组成。构建用于所选抗体的可变重链(VH)和可变轻链(VL)序列的合成DNA序列。这些序列含有独特的限制性核酸内切酶位点、Kozak共有序列和N末端分泌前导序列，以促进重组抗体从哺乳动物细胞系中表达和分泌。
对于小鼠：猫嵌合体，将每个对应可变区克隆到哺乳动物表达质粒中，所述质粒含有猫IgG重链(SEQ ID NO：173；猫_HC_等位基因A_1)，其对应的核苷酸序列为(SEQ ID NO：174；猫_HC_等位基因A_1)，或轻链(SEQ ID NO：175；猫_LC_κ_G_负)，其对应的核苷酸序列为(SEQ ID NO：176；猫_LC_κ_G_负)恒定区。对于小鼠：犬嵌合体或完全犬抗体，将每个小鼠或犬可变区克隆到哺乳动物表达质粒中，所述质粒含有犬IgG重链(SEQ ID NO：177；犬_HC_65_1)，其对应的核苷酸序列为(SEQ ID NO：178；犬_HC_65_1)，或轻链(SEQ ID NO：179；犬_LC_κ)，其对应的核苷酸序列为(SEQ ID NO：180；犬_LC_κ)恒定区。使用标准方法，将在CMV启动子的控制下编码每条重链和轻链的质粒共转染到HEK 293细胞中。表达六天后，根据用于蛋白纯化的标准方法，使用MabSelect Sure蛋白A树脂(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)从50ml瞬时转染的HEK293FS细胞上清液中纯化嵌合mAb。将洗脱级分合并，使用10,000标称MW截留值Nanosep Omega离心装置(Pall Corp.，Port Washington，NY)浓缩至约500μl，在4℃下于1x PBS、pH7.2中透析过夜，并在4℃下储存用于进一步使用。下文描述了选择的重组抗体的亲和力和基于细胞的效力。
图2详述了使用biacore的抗体与来源于小鼠来源的CDR的亲和力。图2a示出了小鼠抗IL-31抗体11E12和15H05对猫和犬IL-31表面的亲和力以及猫和犬嵌合形式对猫和犬IL-31表面的对应亲和力。这些观察结果证实了两种小鼠抗体的正确序列，并表明与小鼠亲本相比，转化成嵌合体形式产生具有同等或更高的亲和力的抗体，除了由于转化为嵌合形式而丧失了对两种IL-31种类的一些亲和力的小鼠：猫15H05嵌合体。在部分1.5中所述的犬和猫细胞测定中也测试了抗体11E12和15H05的完全小鼠和嵌合形式的活性。图3示出了这些测定的结果。使用犬和猫IL-31测试小鼠抗体11E12和15H05针对犬和猫细胞类型的活性，以刺激信号传导。使用猫细胞因子，两种小鼠抗体对犬和猫细胞的效力是相当的，除了在猫FCWF4细胞中针对猫IL-31的15H05显示IC50轻微增加。小鼠15H05能够在猫和犬细胞中阻断犬IL-31信号传导，在犬测定中的效力略高。这些结果表明，由这些抗体识别的对应表位存在于犬和猫IL-31上，并且这些抗体的结合能够中和来自两种物种的相关细胞系中的受体介导的细胞信号传导。
图3还描述了选择的嵌合体在两种细胞测定中的效力。在猫效力测定中，将小鼠抗体转化为猫和犬嵌合体对针对猫IL-31的效力具有最小的影响(IC50范围为1.15-3.45μg/ml)。当针对犬DH82细胞系上的猫IL-31信号传导测试这些嵌合体时，观察到相似的结果，其中针对15H05小鼠：犬嵌合体观察到效力略有增加(IC50＝0.71μg/ml)。通常，在犬和猫细胞类型中，针对犬IL-31的IC50值均增加。在此测定形式中小鼠：猫15H05嵌合体的效力与小鼠：犬形式相比稍弱(IC50 28.61对比12.49μg/ml)。与对小鼠抗体的观察一致，转化为犬和猫嵌合形式导致效力发生微小变化。
在鉴定其可变结构域序列之后，将从免疫狗的单个B细胞中鉴定出的上文所述的抗体构建为重组IgG蛋白。将这些可变结构域接枝到犬重链Fc(65_1同种型)上，导致生成重组完全犬抗体。令人感兴趣的是，鉴定与野生型猫IL-31结合并且其与猫IL-31 15H05突变体(即针对15H05表位)的结合降低的其他犬抗体。从这种替代来源(犬对比小鼠)获得的这些抗体提供了识别15H05表位的其他互补位(抗体的识别IL-31蛋白的部分，包括CDR)，从而增加了具有不同物理特性的抗体的多样性以从中进行选择。
图4示出了使用ELISA和Biacore方法对于这些重组犬抗体与各种蛋白的结合获得的结果。对于间接ELISA方法，评定了抗体与野生型和猫IL-31 15H05突变体蛋白的结合。所有九种犬单克隆抗体(ZIL1、ZIL8、ZIL8、ZIL11、ZIL69、ZIL94、ZIL154、ZIL159和ZIL171)均能够结合至野生型猫IL-31，并且结合受到mAb 15H05表位区域中的突变的影响，从而证实在用于鉴定它们的初始筛选期间确定的正确结合表型。相比之下，11E12抗体与野生型猫IL-31结合并且其结合不受15H05表位区域中的突变的影响，如图4中的数据所证实。为了确认结合，使用犬、猫、马、人、猫15H05突变体和猫11E12突变体IL-31蛋白作为表面和单一测试浓度的抗体进行biacore分析。与ELISA观察结果相似，所有测试的抗体均与野生型猫IL-31结合。与本章节中上文所述的数据一致，小鼠抗体11E12和15H05均与犬和猫IL-31表面结合。显示出具有这种双重结合特性的三种其他抗体：ZIL69(部分犬结合)、ZIL94和ZIL159。在这组九种完全犬抗体中，仅ZIL1和ZIL9与马IL-31发生交叉反应。值得注意的是，抗体15H05是本文测定的与犬、猫和马IL-31结合的所有抗体中的唯一一种，这表明在这三种物种中存在一定水平的表位保守性。相反，本文描述的抗体均不与人IL-31结合。其他biacore表面用于验证ELISA观察结果，所述观察结果显示抗体与野生型猫IL-31和在15H05(15H05突变体)或11E12(11E12突变体)表位中具有突变的两种蛋白的差异结合。正如预期的，对照小鼠抗体11E12与15H05 IL-31突变体结合并且由于表位中的突变而不与11E12 IL-31突变体结合。同样，小鼠15H05不与15H05突变体结合，并保持与11E12 IL-31突变体结合，从而进一步区分了由这两种抗体识别的单独的结合表位。与ELISA结果一致，除ZIL94、ZIL154和ZIL171(部分受影响)外，所有完全犬抗体均受15H05突变影响。不同的结果可以归因于两种测定方法的差异。另外，还显示以下三种抗体的结合受11E12突变的影响；ZIL1(部分受影响)、ZIL8和ZIL159。这些结果表明由这些抗体识别的表位受IL-31蛋白的两个区域中的变化影响。总之，这些结果支持表征来源于犬B细胞的九种抗体，所述抗体共享与猫IL-31蛋白上被抗体15H05识别的区域的结合。
1.8.鼠11E12和15H05抗体的猫源化和结合亲和力的优化
抗药物抗体(ADA)的生成可能与包括单克隆抗体的任何生物治疗蛋白的效力损失相关。文献的综合评估表明，尽管可以找到免疫原性完全人mAb和非免疫原性嵌合mAb的实例，但单克隆抗体的物种形成可以降低mAb具有免疫原性的倾向。为了帮助减轻与本文提供的抗IL-31单克隆抗体的ADA形成相关的风险，采用了猫源化策略。这种猫源化策略是基于鉴定用于CDR接枝的最合适的猫种系抗体序列。在全面分析所有可获得的可变重链和轻链的猫种系序列后，基于它们与小鼠mAb的同源性选择了候选种系，并将来自小鼠祖细胞mAb的CDR置换为天然猫CDR。目标是使用猫抗体框架保留高亲和力和基于细胞的活性，以使体内免疫原性的潜力最小化。表达猫源化mAb，并对其对猫IL-31的亲和力及其在基于细胞的测定中的效力进行表征。在猫源化抗体丧失其结合IL-31的能力的情况下，进行系统解剖以鉴定；1)负责功能损失的链，2)负责功能损失的框架，以及3)负责功能损失的氨基酸。
制备了代表mAb 11E12和15H05的猫源化可变重链和轻链的合成核苷酸构建体。在将每个可变链亚克隆到含有对应猫重链或κ恒定区的质粒中之后，将质粒共转染以在HEK293细胞中表达抗体。使抗体11E12猫源化的最初尝试集中在利用单个猫VH框架(SEQ IDNO：111；FEL_11E12_VH1)，其对应的核苷酸序列为(SEQ ID NO：112；FEL_11E12_VH1)，与以下VL框架独立配对：(SEQ ID NO：113；FEL_11E12_VL1)，所述框架的对应核苷酸序列为(SEQID NO：114；FEL_11E12_VL1)，以及(SEQ ID NO：115；FEL_11E12_VL2)，其对应的核苷酸序列为(SEQ ID NO：116；FEL_11E12_VL2)，以分别形成猫11E12 1.1和猫11E12 1.2。与小鼠形式的抗体相比，这种物种形成的尝试导致猫11E12 1.1与猫和犬IL-31蛋白的亲和力损失以及与猫11E12 1.2 mAb的结合完全损失(图2b)。使用猫IL-31细胞因子，在犬DH82和猫FCWF4细胞测定中测试了这些物种形成的抗体的效力。与小鼠形式的抗体相比，在猫FCWF测定中，猫源化11E12 1.1对猫IL-31的效力降低了约两倍。与猫源化11E12 1.2的亲和力损失一致，观察到此抗体的细胞效力完全损失(图3)。基于mAb 11E12直系同源物的犬源化期间的先前经验，采取了相似的策略以试图恢复猫源化的亲和力损失(Bammert等人的美国专利号8,790,651)。用来自(SEQ ID NO：73；Mu_11E12_VL)(其对应的核苷酸序列为(SEQ ID NO：74；Mu_11E12_VL))的小鼠FW2取代猫11E12 VL1的猫源化框架2(FW2)区，以生成猫11E12 VL1 FW2。另外，在猫VL的位置46(K46Q)处进行单取代，以生成(SEQ ID NO：119；FEL_11E12_VL1_K46Q)，其对应的核苷酸序列为(SEQ ID NO：120；FEL_11E12_VL1_K46Q)。将以上VL与Fel_11E12_VH1配对，分别产生猫11E12 1.1 FW2和猫11E12 1.1 K46Q。改变FW2导致猫11E121.1 FW2对猫IL-31蛋白的亲和力得以恢复，从而导致KD等效于小鼠和嵌合形式的KD(图2A和2B)。然而，这些变化对于猫11E12 1.1 FW2对犬IL-31蛋白的亲和力具有不利影响，这表明抗体11E12与猫和犬细胞因子上的此表位结合的能力的性质存在明显区别。猫11E12 1.1K46Q中的单个氨基酸取代无法影响此抗体的亲和力。在犬DH82测定中，抗体11E12 1.1 FW2与猫IL-31蛋白的亲和力增加导致针对猫细胞因子的效力增加(图3)。
小鼠抗体15H05的猫源化努力集中在总共9种猫源化mAb的三种猫VH框架与三种猫VL框架的组合上。将对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：122；FEL_15H05_VH1)的FEL_15H05_VH1(SEQ ID NO：121；FEL_15H05_VH1)与对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：128；FEL_15H05_VL1)的(SEQ ID NO：127；FEL_15H05_VL1)、对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：130；FEL_15H05_VL2)的(SEQ ID NO：129；FEL_15H05_VL2)以及对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：132；FEL_15H05_VL3)的(SEQ ID NO：131；FEL_15H05_VL3)组合，以分别产生猫15H05 1.1、猫15H05 1.2和猫15H05 1.3。将对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：124；FEL_15H05_VH2)的FEL_15H05_VH2(SEQID NO：123；FEL_15H05_VH2)与对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：128；FEL_15H05_VL1)的(SEQID NO：127；FEL_15H05_VL1)、对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：130；FEL_15H05_VL2)的(SEQID NO：129；FEL_15H05_VL2)以及对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：132；FEL_15H05_VL3)的(SEQ ID NO：131；FEL_15H05_VL3)组合，以分别产生猫15H05 2.1、猫15H05 2.2和猫15H052.3。将对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：126；FEL_15H05_VH3)的FEL_15H05_VH3(SEQ ID NO：125；FEL_15H05_VH3)与对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：128；FEL_15H05_VL1)的(SEQ IDNO：127；FEL_15H05_VL1)、对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：130；FEL_15H05_VL2)的(SEQ IDNO：129；FEL_15H05_VL2)以及对应核苷酸序列(SEQ ID NO：132；FEL_15H05_VL3)的(SEQ IDNO：131；FEL_15H05_VL3)组合，以分别产生猫15H05 3.1、猫15H05 3.2和猫15H05 3.3。与抗体11E12的观察结果相似，与小鼠15H05相比，首次将抗体15H05猫源化的尝试导致对猫IL-31蛋白的亲和力降低，并且与15H05小鼠猫嵌合体相比，导致中性效应(图2A和2C)。与猫源化抗体11E12与犬IL-31结合的观察结果相似，猫15H05 VH和VL框架的某些组合对于对犬IL-31的亲和力具有中性至积极影响(参见图2C，猫15H05 1.1、2.2和3.2)。
为了恢复猫源化抗体15H05的亲和力，将每个猫源化15H05 VH与小鼠15H05 VL配对以生成异嵌合抗体。将对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：122；FEL_15H05_VH1)的FEL_15H05_VH1(SEQ ID NO：121；FEL_15H05_VH1)与对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：70；MU_15H05_VL)的MU_15H05_VL(SEQ ID NO：69；MU_15H05_VL)组合，以生成猫15H05 VH1小鼠VL。将对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：124；FEL_15H05_VH2)的FEL_15H05_VH2(SEQ ID NO：123；FEL_15H05_VH2)与对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：70；MU_15H05_VL)的MU_15H05_VL(SEQID NO：69；MU_15H05_VL)组合，以生成猫15H05 VH2小鼠VL。将对应核苷酸序列为(SEQ IDNO：126；FEL_15H05_VH3)的FEL_15H05_VH3(SEQ ID NO：125；FEL_15H05_VH3)与对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：70；MU_15H05_VL)的MU_15H05_VL(SEQ ID NO：69；MU_15H05_VL)组合，以生成猫15H05 VH3小鼠VL。分析这些猫源化VH小鼠VL异嵌合体对犬和猫IL-31的亲和力。将猫源化15H05 VH1和VH3与小鼠15H05 VL配对可使对猫IL-31的亲和力恢复到与小鼠和嵌合形式相当或比之更好。还观察到了与犬IL-31蛋白的亲和力提高的趋势(图2A和2C)。
为了进一步剖析15H05框架中负责亲和力损失的位置，使用15H05的单一猫源化VH(FEL_15H05_VH1)与来自小鼠15H05 VL的各个框架取代配对。将对应核苷酸序列为(SEQ IDNO：123；FEL_15H05_VH1)的FEL_15H05_VH1(SEQ ID NO：122；FEL_15H05_VH1)单独地与对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：134；FEL_15H05_VL1_FW1)的FEL_15H05_VL1_FW1(SEQ ID NO：133；FEL_15H05_VL1_FW1)、对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：136；FEL_15H05_VL1_FW2)的FEL_15H05_VL1_FW2(SEQ ID NO：135；FEL_15H05_VL1_FW2)以及对应核苷酸序列为(SEQ IDNO：138；FEL_15H05_VL1_FW3)的FEL_15H05_VL1_FW3(SEQ ID NO：137；FEL_15H05_VL1_FW3)组合，以分别产生猫15H05 1.1FW1、猫15H05 1.1 FW2和猫15H05 1.1 FW3。小鼠15H05 FW1取代到猫15H05 1.1上不利于与猫和犬IL-31的亲和力，但是，当将小鼠FW2或FW3取代在猫15H05 1.1上时，实现优异的对犬和猫IL-31的亲和力，其中FW2对于这两个种类均是优越的(图2C)。通过此方法进行其他成对框架取代，以确定亲和力调节程度。将对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：122；FEL_15H05_VH1)的FEL_15H05_VHl(SEQ ID NO：121；FEL_15H05_VH1)单独地与对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：140；FEL_15H05_VL1_FW1_FW2)的FEL_15H05_VL1_FW1_2(SEQ ID NO：139；FEL_15H05_VL1_FW1_FW2)、对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：144；FEL_15H05_VL1_FW2_FW3)的FEL_15H05_VL1_FW2_3(SEQ ID NO：143；FEL_15H05_VL1_FW2_FW3)以及对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：142；FEL_15H05_VL1_FW1_FW3)的FEL_15H05_VL1_FW1_3(SEQ ID NO：141；FEL_15H05_VL1_FW1_FW3)组合，以分别得到猫15H05 1.1 FW1_2、猫15H05 1.1 FW2_3和猫15H05 1.1 FW1_3。有趣的是，单独取代小鼠FW1不利于亲和力，而FW1与FW2或FW3的组合则对猫和犬IL-31均产生良好的亲和力(图2C)。
最后，尝试从猫源化VH和VL序列的最有希望的组合开始，使猫框架中的回复突变数量最小化。为此，将对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：122；FEL_15H05_VHl)的FEL_15H05_VHl(SEQ ID NO：121；FEL_15H05_VH1)单独地与对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：146；FEL_15H05_VL1_FW2_K42N)的FEL_15H05_VL1_FW2_K42N(SEQ ID NO：145；FEL_15H05_VL1_FW2_K42N)、对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：148；FEL_15H05_VL1_FW2_V43I)的FEL_15H05_VL1_FW2_V43I(SEQ ID NO：147；FEL_15H05_VL1_FW2_V43I)、对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：150；FEL_15H05_VL1_FW2_L46V)的FEL_15H05_VL1_FW2_L46V(SEQ ID NO：149；FEL_15H05_VL1_FW2_L46V)、对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：152；FEL_15H05_VL1_FW2_Y49N)的FEL_15H05_VL1_FW2_Y49N(SEQ ID NO：151；FEL_15H05_VL1_FW2_Y49N)以及对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：154；FEL_15H05_VL1_FW2_K42N_V43I)的FEL_15H05_VL1_FW2_K42N_V43I(SEQID NO：153；FEL_15H05_VL1_FW2_K42N_V43I)组合，以分别得到猫15H05 1.1 K42N、猫15H051.1 V43I、猫15H05 1.1 L46V、猫15H05 1.1 Y49N和猫15H05 1.1 K42N_V43I。虽然将整个小鼠FW2框架取代到猫源化15H05 VL1上会产生对犬和猫IL-31具有优异亲和力的抗体(图2C，猫15H05 1.1 FW2)，但FW2氨基酸残基的单个回复突变具有中性或有害作用，表明所有4个取代是维持用于将CDR定位在IL-31表位上的最佳三级结构所必需的。猫源化15H05 1.1FW2对猫和犬IL-31的亲和力增加，从而选择了此抗体用于进一步工作。
图5A示出了小鼠抗体11E12 VL序列的比对，其将先前提到的犬源化11E12序列与猫源化形式进行比较。在比对下方标注了示出Fel_11E12_VL1相关变化的位置的点，所述位置是恢复此抗体与IL-31蛋白的亲和力所必需的。同样，图5B示出了猫源化15H05 VL(Fel_15H05_VL1)的必要改变，所述改变与此抗体的小鼠和嵌合形式相比，是不仅恢复而且提高其对犬和猫IL-31的亲和力所需的。
1.9.由谷氨酰胺合成酶(GS)质粒生成表达猫源化抗IL-31抗体的细胞系
选择猫源化15H05 1.1 FW2作为用于生成稳定细胞系的候选物，所述细胞系将产生均匀的抗体供应以用于进一步表征。将用于细胞系产生的编码猫源化重链和轻链的基因分别克隆到GS质粒pEE 6.4和pEE 12.4中(Lonza，Basel，Switzerland)。根据制造商的方案消化所得质粒，并连接在一起以形成单一哺乳动物表达质粒。对于ZTS-927，重链为与对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：172；猫_HC_等位基因A_wt)的猫IgG轻链恒定区(SEQ ID NO：171；猫_HC_等位基因A_wt)组合的对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：122；FEL_15H05_VHl)的(SEQ ID NO：121；FEL_15H05_VHl)。对于ZTS-927，轻链为与对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：176；猫_LC_κ_G_负)的猫IgG轻链恒定区(SEQ ID NO：175；猫_LC_κ_G_负)组合的对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：136；FEL-15H05-VL1_FW2)的(SEQ ID NO：135；FEL-15H05-VL1_FW2)。对于ZTS-361，重链为与对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：174；猫_HC_等位基因A_1)的猫IgG重链恒定区(SEQ ID NO：173；猫_HC_等位基因A_1)组合的对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：122；FEL_15H05_VH1)的(SEQ ID NO：121；FEL_15H05_VH1)。对于ZTS-361，轻链为与对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：176；猫_LC_κ_G_负)的猫IgG轻链恒定区(SEQ ID NO：175；猫_LC_κ_G_负)组合的对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：136；FEL-15H05-VL1_FW2)的(SEQ ID NO：135；FEL-15H05-VL1_FW2)。
为了证明抗体的瞬时产生，将每种质粒用于转染HEK 293细胞，并在各种大小的培养物中进行表达。根据标准蛋白质纯化方法，使用蛋白质A亲和色谱从条件化HEK培养基中分离蛋白质。将培养基加载到色谱树脂上，并通过pH改变来洗脱。使用前，对洗脱的蛋白质进行pH调节、透析和无菌过滤。ZTS-361随后用于在猫瘙痒模型中评估，以评估体内功效。
测试由单个GS质粒ZTS-927和ZTS-361产生的抗体的亲和力和效力。图2D示出了使用biacore对这些抗体进行亲和力评定的结果。ZTS-927和ZTS-361对猫IL-31的亲和力与祖先小鼠mAb 15H05的小鼠和嵌合形式的亲和力高度一致。使用犬和猫细胞测定法测定了这两种抗体针对犬和猫IL-31的效力(图3)。与先前的观察结果一致，当两种细胞类型使用IL-31的犬形式时，IC50值成比例地更高。ZTS-927和ZTS-361针对猫IL-31的IC50值也与衍生自抗体的嵌合和小鼠形式的值高度一致，这表明由单个GS质粒产生的mAb 15H05的最终猫源化形式适用于细胞系开发。
为了生成产生候选抗体的稳定细胞系，在用在质粒骨架的单个位点处切割的限制酶PvuI转染之前，将GS质粒线性化。通过电穿孔，用线性化质粒DNA转染GS-CHOK1SV(克隆144E12)细胞。转染后，将细胞接种在48孔板(48WP)中以生成稳定池。当池在48WP中至少50％汇合时，使用ForteBio Octet和蛋白A生物传感器(Pall ForteBio，Fremont，CA)分析100μl上清液的IgG表达。将表达最佳的克隆按比例放大到6孔板(6WP)中，并且然后按比例放大到125mL摇瓶(SF)中。一旦细胞适于在125mL烧瓶中进行悬浮培养，则将每个细胞系池的2个小瓶堆积用于LN储存。由于生产细胞系必须是克隆的，因此通过在96孔培养板中进行有限稀释来亚克隆前3个表达最高的池。为了证明克隆性并避免第二轮有限稀释，使用Molecular Devices Clone-Select成像器(CSI)(Molecular Devices LLC，San Jose，CA)对96孔板进行成像，所述成像器捕获单细胞的图像及其后续生长。基于在96WP中的成功CSI图像、生长和生产来选择克隆。
为了评定细胞培养物生长和生产力，在125mL SF中以14天的补料进一步评估表达最佳的池。将细胞接种在平台培养基和由Life Technologies的CD CHO加上4种氨基酸、专有进料CDF v6.2和10％葡萄糖组成的进料中。在14天补料后，将池离心，并在纯化前通过经0.20μm聚醚砜(PES)膜过滤上清液来分离CD CHO产生的mAB。
典型的纯化由将两升条件培养基(来自CHO细胞培养液，0.2μm过滤)加载到235mLMabSelect柱上(GE Healthcare，目录号17-5199-02)来组成。所述柱已经用PBS预平衡。在＞2.5分钟停留时间下加载样品。加载后，将所述柱再次用PBS洗涤，然后用pH近中性的25mM乙酸钠洗涤。将所述柱用pH 3.6的25mM乙酸洗脱，并且然后用250mM乙酸、250mM氯化钠、pH约2.2汽提。在洗脱和汽提步骤期间收集级分(50mL)。整个过程中监测A280的UV吸光度。将峰级分合并，通过添加20mM乙酸钠将pH值调节至约5.5，并且然后用三次缓冲液交换液进行透析。收集透析液，将其无菌过滤，并储存在4℃下。
1.10.鉴定IL-31上的由抗体15H05识别的表位
了解IL-31上的由抗体识别的表位对于理解其中和细胞因子使其免于结合至IL-31Ra：OSMR共受体所借助的机制是至关重要的。另外，了解表位能够(但不限于)优化抗体结合亲和力和肽表位模拟表位(模拟表位)设计，所述肽表位模拟表位可以作为分析捕获试剂和引发相关集中免疫应答的亚单位疫苗具有极大的效用。使用CLIPS(肽与支架的化学连接(Chemical Linkage of Peptides onto Scaffolds))技术(Timmerman等人J MolRecognit.2007；20(5)：283-299)的多步过程用于鉴定和优化能够与mAb 15H05(Pepscan，Lelystad Netherlands)的互补位结合的肽。mAb 15H05对犬和猫IL-31蛋白的亲和力都很高(图2，MU-15H05)，因此两种IL-31种类的一级序列被认为与此工作有关。创建了代表犬IL-31蛋白的肽微阵列文库，并使用间接ELISA将所述肽微阵列文库用于鉴定能够结合mAb15H05的肽。在鉴定一级氨基酸序列代表IL-31上的mAb 15H05结合区的肽之后，使用代表IL-31区段的肽并在每个位置处用19个其他可能的氨基酸残基置换此mAb 15H05结合区中的12个氨基酸中的每一个来进行集中的完全置换分析。此分析对于鉴定IL-31上参与mAb15H05结合的关键氨基酸残基是必需的，并且还证明犬一级序列上的取代会导致抗体结合增强。
先前描述了犬IL-31蛋白上的由抗体11E12识别的氨基酸(Bammert等人的美国专利号8,790,651)。其中描述了犬IL-31蛋白的突变分析，其显示犬IL-31蛋白上的位置在转化为丙氨酸时影响mAb11E12的结合。基于以上对mAb 15H05所述的完全置换分析和以前对11E12的结合表位的了解，通过用丙氨酸取代每种抗体识别的表位上的两个关键残基来产生猫IL-31蛋白的突变体形式(以上1.2部分中所述的突变体)。根据识别突变位点的抗体来命名每个表位的突变(突变体11E12和15H05对比天然野生型蛋白序列)。
图6A示出野生型猫IL-31(SEQ ID NO：157)与突变体15H05(SEQ ID NO：163)和11E12(SEQ ID NO：161)的比对，其突出显示了发生丙氨酸取代的位置。IL-31属于IL-6细胞因子家族，其四个螺旋束具有上下结构(CATH数据库，Dawson等人2017 Nucleic AcidsRes.2017年1月4日；45(数据库问题)：D289-D295)。使用MOE软件(Chemical ComputingGroup，Montreal，QC，Canada)，基于人IL-6结构1P9M(Boulanger等人2003 Science.6月27日；300(5628)：2101-4)产生同源性模型。图6B示出了猫IL-31同源性模型，其突出显示了参与抗体11E12(位点1)和15H05(位点2)的结合的氨基酸位置。每种抗体的结合位点似乎位于IL-31蛋白上的不同位置。
为了确定mAb 11E12和15H05结合猫IL-31的这些突变体形式的能力的影响，使用直接包被在免疫测定板上的突变体进行间接ELISA。图6C示出了此ELISA的结果，这表明mAb11E12和15H05能够在这种测定形式中结合至野生型猫IL-31。当将突变体11E12用作捕获蛋白时，mAb 11E12的结合被极大地减弱，而mAb 15H05的结合被部分减弱。先前对犬IL-31上的11E12表位的分析(在Bammert等人的美国专利号8,790,651中描述)表明，4个氨基酸残基当突变为丙氨酸时会影响mAb的结合，因此在这种情况下，2个残基的突变可能不足以完全消除使用这种ELISA形式得到的mAb 11E12的高亲和力结合。mAb 15H05与11E12突变体的结合轻微减弱可能是由于由影响15H05结合位点的两个前螺旋移动引起的突变的翻译效应。设计来影响mAb 15H05结合的突变(突变体15H05)通过ELISA显示mAb 1505结合此IL-31突变体的能力完全损失。与11E12突变体不同，由mAb 15H05(突变体15H05)识别的无规卷曲的变化对mAb11E12结合没有影响，这进一步支持了两个表位之间的区别(图6C)。
1.11.使用biacore对mAb 15H05和11E12进行竞争结合评定
为了进一步表征由mAb 15H05和11E12结合的IL-31表位，使用biacore进行阻断实验，其中生成含有IL-31蛋白的表面，然后依次添加抗体。图7示出了在捕获11E12或15H05后每种抗体与IL-31的相对结合。标记为HBS-EP(测定缓冲液)的列表示由在没有竞争的情况下每种抗体单独与IL-31表面结合所获得的最大信号。图7A示出了小鼠15H05和11E12抗体对犬IL-31的竞争结合数据。这些结果清楚地表明，抗体15H05和11E12能够在彼此存在的情况下结合至犬IL-31，这表明它们识别蛋白质上的不同表位。与图7A相关的传感图显示，两种抗体在这个新形成的biacore表面上的解离动力学都非常缓慢，因此在添加相同抗体的情况下不会发生对结合位点的额外占用(数据未示出)。
图7B示出了抗体15H05和11E12在猫IL-31表面上的竞争结合数据，这再次显示所识别的表位没有重叠。在存在相同抗体的情况下，其他抗体的结合是由于所用表面质量较差导致脱落率增加的结果。图2中可以看到增加的脱落率，并将其与新形成的猫IL-31表面的KD值进行比较。
这些结果进一步支持1.10部分中的表位作图数据，所述数据表明与MU-11E12相比，抗体MU-15H05中含有的CDR识别出不同的表位。由抗体15H05识别的表位不同于(Bammert等人的美国专利号8,790,651)中描述的抗体11E12，并且是IL-31蛋白上用于中和多种物种中的这种细胞因子活性的新型靶标。这些发现突出显示了在猫IL-31同源性模型中描述的结合位点的独特空间关系(图6B)，并支持了细胞因子的这一面对于与IL-31Ra：OSMR受体复合物的相互作用至关重要的假设。
1.12.可溶性猫IL-31共受体(IL-31RA和OSMR)的合成和表征
由IL31Ra和OSMR亚基组成的人IL-31异聚受体共复合物被证明是IL31介导的JAK-STAT途径的细胞间活化所必需的，并且涉及特应性皮肤病(Dillon等人2004Nat Immunol.7月；5(7)：752-60，Dreuw等人.2004 J Biol Chem.279：36112-36120；以及Diveu等人2004Eur Cytokine Netw.15：291-302)。后来将人IL-31 Ra亚基描述为当IL-31与细胞表面受体接触时发生的初始结合事件，并且此事件是募集OSMR并随后形成高亲和力共受体复合物的先决条件(Le Saux等人2010 J Biol Chem.Jan 29；285(5)：3470-7)。我们在此描述了猫IL-31蛋白能够单独地结合OSMR和IL-31Ra的证据。此观察结果是新颖的，并且对于理解IL-31蛋白如何与IL-31Ra：OSMR共受体相互作用并且对于IL-31在其单独地与各个亚基相互作用时的生物学作用具有重要意义。
为了能够理解IL-31如何与其共受体结合并表征已鉴定抗体的抑制特性，合成了两种受体形式。将对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：170；猫_IL31Ra_HIgG1_Fc_X1_Fn3)的单个IL-31受体亚基IL-31Ra(SEQ ID NO：169；猫_IL31Ra_HIgG1_Fc_X1_Fn3)和对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：168；猫_OSMR_hIgG1_Fc)的OSMR-(SEQ ID NO：167；猫_OSMR_hIgG1_Fc)都构建为人IgG1 Fc融合体。通过与人类同源物的同源性，鉴定了细胞因子结合、纤连蛋白III和Ig样结构域。为了评估单个受体亚基，将OSMR和IL-31Ra的胞外结构域(具有预期的N末端近侧纤连蛋白III结构域)生成为人IgG1 Fc融合体，两者均使用其天然信号肽。将所有合成盒克隆到pcDNA3.1中，在ExpiCHO系统中表达并如上文所述地纯化。
为了分析这些受体形式结合野生型和突变体IL-31蛋白质的能力，通过在4℃下在carb/bicarb缓冲液(sigma C3041-100CAP)中将100ul每种相应的蛋白质包被在immulon2HB平板(1μg/ml)上过夜来进行间接ELISA。然后在室温下用PBST中的5％NFDM封闭缓冲液封闭ELISA板1小时，然后在室温下结合多种浓度的每种受体构建体1小时。用PBST洗涤后，在室温下使用小鼠抗人IgG1(Lifetech A10684，1∶500稀释度)1小时来鉴定结合受体(Fc融合体)的存在。将孔再次用PBST洗涤，并用KPL sureblue3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)微孔底物显影。图8示出了使用猫IL-31蛋白的野生型和突变体形式作为捕获物进行间接ELISA的结果。这些数据证明了野生型猫IL-31单独地结合至IL-31Ra和OSMR受体亚基的能力。这些观察结果与先前的报告相反，这表明IL-31蛋白最初结合至IL-31Ra亚基并进一步将OSMR募集到所述位点。由于仍在确定IL-31的生物学作用，因此理解受体结合的动力学以及减弱其在诸如特应性皮炎的疾病中的作用的潜在后果是至关重要的。出于这个原因，在表征与能够破坏IL-31识别IL-31Ra和OSMR的能力的表位结合的抗体时，应进一步考虑这些观察结果。
在1.2部分中，我们描述了减弱的抗体11E12和15H05与突变体的结合，其中突变体的结合位点中的关键氨基酸转化为丙氨酸(分别为突变体11E12和15H05)。因此，非常有趣的是理解这些突变对结合至单个IL-31Ra和OSMR受体亚基的能力的影响。图8显示11E12或15H05结合位点中的突变完全破坏了IL-31Ra和OSMR的结合能力，这表明两种抗体均结合了IL-31与两种受体亚基相互作用所必需的表位。缺乏结合也可能是由于由突变引起的IL-31构象(confirmation)的改变，但是这些突变体仍然能够结合至抗体，这表明情况并非如此。此关键发现支持抗体11E12和15H05(及其衍生物)识别IL-31上的表位的能力，这些表位中和细胞因子通过其共受体发出信号的能力并在此过程期间进一步阻断细胞因子与任一受体的细胞缔合。这些数据支持能够从循环中去除IL-31并使其不能结合至细胞表面或可溶性受体形式的抗体的鉴定。
1.13.在猫IL-31瘙痒攻击模型中对嵌合抗体进行体内评估
抗体有效中和其靶标的能力可以在体外在允许外推至体内效力的基于细胞的测定中通过以适当的亲和力和效力检测与靶蛋白上的相关表位的结合来评定。上文描述了为了表征由小鼠祖细胞mAb11E12和15H05生成的两个系列抗体而采取的步骤。1.7部分描述了mAb 11E12和15H05的小鼠：猫嵌合形式的生成，其对犬和猫IL-31的所得亲和力与原始小鼠单克隆抗体相当(图2A)。11E12和15H05的小鼠：猫嵌合形式也具有相当的IC50值，这表明在犬和猫巨噬细胞中猫IL-31诱导的pSTAT3信号传导受到抑制(图3)。在1.8部分中的猫源化过程期间，小鼠mAb 11E12被转化为猫源化形式(猫11E121.1)，其随后丧失对犬和猫IL-31的亲和力(图3)并丧失针对在犬和猫细胞中的猫IL-31信号传导的效力(图3)。在优化1.8部分中描述的猫源化11E12和15H05抗体之前，令人感兴趣的是了解这些初步猫源化和嵌合形式在猫攻击模型中中和猫IL-31的瘙痒活动的能力。令人感兴趣的是这些不同抗体对瘙痒中和的药效动力学作用，并理解可能影响效力的与亲和力、细胞效力或表位识别的任何相关性。在瘙痒攻击模型中进行与体内功效相关的一系列细胞效力可以使用体外测定预测必需的进一步优化。
为了测试小鼠：猫11E12嵌合体、小鼠：猫15H05嵌合体和猫源化11E12(猫11E121.1)的初步功效，开发了IL-31诱导的猫瘙痒模型。静脉内给药0.5μg/kg猫IL-31(SEQ IDNO：159；猫_IL_31_大肠杆菌)(其对应的核苷酸序列为(SEQ ID NO：160；猫_IL_31_大肠杆菌))之后，猫将表现出短暂的瘙痒行为，包括(但不限于)舔、咀嚼、抓挠以及摇头或摇身。摩擦笼子不认为是瘙痒活动。在施用IL-31蛋白之前30分钟以及之后1小时，由训练有素的研究人员进行瘙痒观察。对于本研究，在抗体给药前长达1个月，用猫IL-31进行基线攻击。在第0天，将0.5mg/kg抗体剂量与0.5μg/kg猫IL-31在室温下组合60分钟，然后将预结合的复合物注射到每只动物中。对照包括“无mAb”对照。mAb的剂量表示抗体相对于细胞因子的总摩尔过量。在第0、7和21天如所述监测瘙痒活动。图9中的结果显示，在第0、7和21天，与安慰剂对照相比，利用mAb小鼠：猫15H05嵌合体的瘙痒评分得到显著改善(p＜0.05)。尽管小鼠：猫11E12嵌合体在第0天显示出功效的初始趋势，但与媒介物安慰剂相比，它在任何时间点均未实现瘙痒的明显减少。与媒介物安慰剂相比，猫11E12 1.1在第0天没有减少瘙痒，并且没有显示出功效趋势，因此在第7天和第21天不再进行IL-31攻击。
总之，这些结果表明这些抗体的活性之间的清楚描绘，猫11E12 1.1在预防由IL-31诱导的猫瘙痒行为方面缺乏功效。猫11E12 1.1的亲和力和效力的丧失可能导致缺乏体内功效。在比较小鼠：猫11E12嵌合体和小鼠：猫15H05嵌合体的功效结果时，区别更加细微。两种mAb的嵌合形式均对其小鼠祖细胞具有相当的KD值，其中小鼠：猫11E12的亲和力略优于猫和犬IL-31(图2A)。但是，这种增加的亲和力并不直接转化为增加的效力，因为在猫FCWF4细胞中小鼠：猫15H05嵌合体针对猫IL-31诱导的pSTAT3信号传导的IC50大约是小鼠：猫11E12嵌合体的2倍(图3)。这些数据表明，抗体15H05 CDR识别猫IL-31的方式在中和细胞因子通过其共受体发出信号的能力方面是优越的，从而使其更有效地阻断猫瘙痒。在这些细胞测定中观察到的IC50的差异提供了一种有希望的方法来预测体内效力并区分一系列抗体内和之间的表位识别的细微差异。
1.14.在猫瘙痒攻击模型中对猫源化15H05抗IL-31抗体功效进行体内评估
基于使用上文所述的小鼠：猫15H05嵌合体的阳性功效结果，进行进一步工作以增加猫源化15H05的亲和力和效力(以上1.8部分中描述)。在抗体猫15H05 1.1中对可变轻链猫框架的系统取代导致鉴定出与小鼠15H05相比对猫和犬IL-31的亲和力增加的猫15H051.1 FW2(图2)。从HEK和CHO表达系统产生后，将猫15H05 1.1 FW2的重链和轻链组合到单个质粒中，导致形成ZTS-927和ZTS-361抗体。由单个质粒表达产生的两种抗体的亲和力和效力也分别描述于图2和3中。
在IL-31诱导的体内猫模型中，评定完全猫源化抗猫IL-31 mAb ZTS-361中和瘙痒行为的能力。图10A示出了从第-7天到第28天T01媒介物安慰剂和T02抗体ZTS-361组的基线攻击前瘙痒行为，其中第0天是向T02组施用抗体的那天。如此图表所示，在30分钟的观察期内，在IL-31攻击之前对T01和T02组进行评分的瘙痒行为的变化不大，观察到的瘙痒事件数目在0与10之间。此研究与以上1.13部分所述的初步猫攻击模型的不同之处在于，在第0天，向猫皮下给药4mg/kg ZTS-361，而不是与猫IL-31组合以生成预结合的复合物。这代表对功效的更严格评定，因为抗体ZTS-361在首次IL-31攻击之前循环七天，需要抗体充分暴露以结合并中和循环的IL-31。
对于此研究，在IL-31蛋白进行0.5μg/kg静脉内攻击后，在第7、21和28天评定瘙痒行为1小时。图10B示出了抗体ZTS-361的功效，证实与媒介物安慰剂对照相比在IL-31攻击后第7天(p＜.0001)、第21天(p＜0.0027)和第28天(p＜0.0238)观察到的瘙痒显著减少。来自此攻击模型的数据支持先前的观察结果，其证明了小鼠：猫15H05嵌合体的功效，并支持猫IL-31上由15H05 CDR识别的表位的基于细胞的效力和相关性。这些数据进一步支持抗体ZTS-361在体内中和猫IL-31诱导的瘙痒的能力，并表明此抗体可以用作治疗猫的IL-31介导的疾病(包括特应性皮炎)的治疗剂。
检查客户拥有的动物中的IL-31血浆水平的最新数据显示，与正常实验室比格犬相比，患有特应性皮炎和过敏性皮炎的狗的循环中的细胞因子的量增加(图11A)。最近进行一项研究以确定来自美国几个不同地理区域的疑似诊断为过敏性皮炎(AD)的猫的血清IL-31水平。图11B示出了此评定的结果，表明与患有特应性皮炎和过敏性皮炎的狗一样，用此推定诊断调查的73只猫具有8799fg/ml的平均循环IL-31水平，相比之下，17只年龄匹配的对照猫为205fg/ml。为了理解在先前模型开发研究中犬IL-31的水平，在施用1.75μg/kg皮下剂量后，对犬中的犬IL-31的药代动力学特征进行分析。图11C示出在第一小时内达到约30ng/ml最大值并在三小时达到约400pg/ml维持水平的峰值血浆水平。基于这些发现，可以合理地认为，在此猫模型中使用0.5μg/kg静脉内剂量的猫IL-31将导致循环量远超过在狗和猫的天然存在的疾病状态中观察到的循环量。
2.实施例2-IL-31模拟表位在疫苗和诊断中的表征和用途
2.1.犬IL-31上涉及抗体15H05结合的氨基酸残基
如本申请的部分1.10所述，对犬IL-31蛋白进行完全置换扫描，其包括图12中概述的氨基酸。IL-31在此部分中描述的每个位置均在全长蛋白质中用其他可能的19个氨基酸之一置换，并使用间接ELISA评定抗体15H05的结合。那些对结合没有影响的取代产生的ELISA信号等同于(或高于)IL-31蛋白的ELISA信号，而对抗体结合产生影响的取代则导致来自测定的信号更低(或没有信号)。如图12所示，犬IL-31上的某些位置可耐受所示氨基酸的某些取代(SEQ ID NO：155；位置124、125、129和132-135)，而其他位置则不耐受(SEQ IDNO：155；位置126、127、128、130和131)。为了比较，示出了猫(SEQ ID NO：157)、马(SEQ IDNO：165)和人IL-31(SEQ ID NO：181)上的对应区域。可以将犬IL-31中的突变观察结果推导到另一种类，以设计同源肽。犬IL-31上表位区域的这种精细位置定位允许设计线性和限制性肽，以模拟由抗体15H05识别的IL-31蛋白上的结合位点。这些结果与部分1.10中描述的猫IL-31模型(图6B)结合表明，由mAb15H05识别的表位是形成无规卷曲的会合区域，从而产生细胞因子的第四螺旋结构域的连续氨基酸区域。此表位的呈递允许mAb 15H05以与限制性形式相关联的更大亲和力结合至线性和限制性肽表示形式。上文所述的突变数据(部分1.12)进一步强调了此表位(以及先前在Bammert等人的美国专利US 8,790,651中描述的11E12表位)在IL-31蛋白表面上关于与共受体复合物结合的重要位置。
2.2.表示由抗体15H05识别的IL-31上的表位的肽模拟物的表征
如先前所述，肽表位模拟物(模拟表位)的设计可以作为分析捕获试剂和引发相关集中免疫应答，从而在动物中产生针对IL-31上的中和表位的抗体的亚单位疫苗具有极大效用。朝着这个目标，设计并表征犬和猫肽对抗体ZTS-927的亲和力以及其阻断抗体ZTS-361抑制猫FCFW4细胞上的IL-31介导的受体信号传导能力的能力。抗体ZTS-927和ZTS-361(二者均含有来自小鼠抗体15H05的CDR)的构建在以上部分1.9中进行描述。肽ZTS-561含有氨基酸序列N-TEISVPADTFERKSFILT-C，其对应于SEQ ID NO：155的位置121至138，其中在位置编号132处以精氨酸(R)取代半胱氨酸(C)。肽ZTS-561还包含N末端和C末端半胱氨酸，以便于使用游离硫醇基进行缀合化学。肽ZTS-562含有氨基酸序列N-EISVPADTFERKSF-C，其对应于SEQ ID NO：155的位置122至135，其中在位置编号132处以精氨酸(R)取代半胱氨酸(C)。肽ZTS-562还包含N末端和C末端半胱氨酸，以便于使用游离硫醇基进行缀合化学。肽ZTS-563含有氨基酸序列N-AKVSMPADNFERKNFILT-C，其对应于SEQ ID NO：157的位置121至138，其中在位置编号138处以苏氨酸(T)取代丙氨酸(A)。肽ZTS-563还包含N末端和C末端半胱氨酸，以便于使用游离硫醇基进行缀合化学。肽ZTS-564含有氨基酸序列N-TEISVPADTFERKSFILT-C，其对应于SEQ ID NO：155的位置121至138。肽ZTS-564还包含N末端和C末端半胱氨酸，以便于使用游离硫醇基进行缀合化学。使用CLIPS技术(Timmerman等人JMol Recognit.2007；20(5)：283-299)的多步过程用于鉴定和优化能够与mAb 15H05(Pepscan，Lelystad Netherlands)的互补位结合的这四种肽。出于生成免疫原的目的，使用标准交联化学将这四种肽(图13A中所示)独立地缀合至载体蛋白，所述载体蛋白是白喉毒素的无活性突变体(无毒)形式(CRM197)。为了进行亲和力评定，将每种肽独立固定至biacore表面，并确定了猫源化抗IL-31 15H05 mAb(ZTS-927)的KD(图13B)。所有四种肽都以纳摩尔亲和力结合ZTS-927，表明它们是全长IL-31上的结合位点的紧密表示。为了评定每种肽的效力，将剂量滴定的缀合或未缀合肽在37℃下与0.2μM(6.5μg/ml)mAb ZTS-361共同孵育1小时，之后在FCWF-4(猫巨噬细胞样细胞)上添加猫IL-31。使用增加的肽浓度(x轴)对比作用百分比(y轴)来计算IC50值，所述作用百分比被定义为肽结合并阻断mAb ZTS-361抑制猫FCWF-4巨噬细胞中IL-31蛋白介导的STAT3磷酸化的能力。肽ZTS-564在溶液中的溶解度降低，这可能导致缀合效率低下、表位密度低和效力差。肽ZTS-561在缀合形式下的效力较差，但在未缀合时仍保持良好的效力(IC60～1.7μg/ml)。ZTS-562和ZTS-563均具有优异的未缀合效力，其IC50分别为1.046μg/ml和1.742μg/ml。在缀合之后，效力下降大约3倍，其中ZTS-562和ZTS-563的IC50分别为3.024μg/ml和3.384μg/ml(图13B)。这些肽阻断mAbZTS-361与IL-31蛋白的高亲和力结合的能力非常有前途，并提供了支持它们作为IL-31相关表位的表位模拟物(进一步称为IL-31 15H05模拟表位)的效用的进一步证据。进一步探讨这些IL-31 15H05模拟表位作为引发抗IL-31免疫应答的免疫原的效用。
2.3.用于在用IL-31 15H05犬和猫模拟表位和全长猫IL-31蛋白免疫比格犬后生 成对IL-31的血清滴度的研究设计
进行免疫原性研究，其旨在评定CRM-197缀合的IL-31 15H05模拟表位生成针对IL-31蛋白相关区域驱动的表位特异性免疫应答的能力，在所述相关区域中抗体15H05结合并中和了细胞因子活化IL-31Ra：OSMR共受体的能力。研究设计示出于图14中。向纯种雄性比格犬皮下施用以ZA-01为佐剂的缀合的IL-31 15H05模拟表位。以下图表按组显示了实验设计。在ZA-01(T02)中包括对照组，其含有单独的ZA-01佐剂CRM-197(T01)以及CRM-197缀合的猫IL-31(SEQ ID NO：159；猫_IL-31_大肠杆菌)，其对应的核苷酸序列为(SEQ ID NO：160；猫_IL-31_大肠杆菌)。在第0、28和56天皮下施用10μg/剂量的每种加佐剂模拟表位或对照(0.5ml的20μg/ml溶液)。在第0(给药前)、7、12、28(给药前)、35、42、49、56(给药前)、63、70、77和84天采集血清血液。另外，在第35和84天，从每只动物收集约40ml血液到肝素锂试管中，并使用标准方法处理以分离PBMC。分离后将PBMC冷冻保存，直到进一步评估抗原特异性B细胞。
2.4.用IL-31 15H05犬和猫模拟表位以及全长猫IL-31蛋白疫苗接种狗之后生成 的血清滴度
评定每只动物的在上文部分2.3中指出的每个研究日的血清滴度。使用间接ELISA确定滴度，其中全长IL-31蛋白用作每种相应测定的捕获材料。测定来自每个研究组的血清与猫、猫15H05突变体、犬、马和人IL-31蛋白的结合。目标在于了解由猫IL-31蛋白(SEQ IDNO：159；猫_IL-31_大肠杆菌)或15H05肽模拟表位针对多种彼此具有一系列氨基酸序列同一性的IL-31引发的免疫应答(图1A)。治疗组2(全长猫IL-31 CRM)表示对跨越整个蛋白质序列的多个表位的适应性免疫应答。使用全蛋白作为免疫原将生成对IL-31的生物活性既中和又非中和的抗体。先前在小鼠中描述针对IL-31信号传导的中和抗体的鉴定的工作表明，这些抗体的百分比较小并且因此大多数对全长蛋白质的多克隆应答将是非中和型的(Bammert等人的US8790651)。作为疫苗方法，生成针对IL-31的非中和抗体可能对安全性和功效具有不利影响。非中和抗体可导致循环中由结合的抗体细胞因子复合物产生的生物活性IL-31的量增加。这些复合物可以允许IL-31的单体形式或聚集形式存在于循环中，从而允许IL-31的受体结合部分可用于与IL-31：OSMR共受体相互作用。由循环中IL-31增加引起的pSTAT信号传导增加会加剧疾病状态如特应性皮炎的瘙痒性活动(Gonzales等人，VetDermatol.2013年2月；24(1)：48-53.e11-2)。
图15A-15E示出了由治疗组所组织的对每种相应IL-31蛋白的平均滴度结果，示出了在每天采集血清时的应答。使用多种蛋白质检查血清的IL-31滴度，以了解可能发生的交叉反应性抗体应答(CRAR)程度。对每个血清样品测试的最大稀释度为1∶50,000，因此，当滴度超过此值时，将其指定为50,000。为了清楚起见，将根据各个治疗组对用于捕获ELISA的每种IL-31蛋白的应答进行以下附图描述。
对于用全长猫IL-31(T02)疫苗接种的狗，考虑到同源物之间的百分比同一性高，因此预期生成的多克隆血清将结合多种种类。图15A示出了生成的与猫IL-31结合的犬抗体滴度。对T02组的分析显示，在持续至第84天研究终止时的第三剂量之后，对全长猫IL-31蛋白产生中度和持续的抗体应答。当检查针对猫15H05突变蛋白(SEQ ID NO：163；猫_IL31_15H05_突变体)的T02组应答时，看到类似概况，甚至在第63、70和77天滴度进一步升高也如此(图15B)。图15C示出了对犬IL-31的滴度。当查看来自T02组的滴度时，检查了疫苗接种的犬将CRAR固定至犬IL-31蛋白的程度。在第三剂量的猫IL-31CRM之前未观察到应答。在第56天第3剂量之后，从第63-77天观察到短暂的CRAR，到第84天恢复到接近基线。抗犬应答的强度类似于抗猫应答，但是持续时间更短。有趣的是，对马和人IL-31的CRAR分别可忽略不计至微小(图15D和15E，人在第63天和84天)。总之，狗对猫IL-31 CRM的免疫应答最强，并且对猫IL-31蛋白本身更持久。猫和犬IL-31彼此共享76％氨基酸同一性，这似乎是足以使犬蛋白发生CRAR的足够高的水平。在人蛋白滴度的情况下，马和人IL-31与猫分别具有57％和49％同一性，仅产生次要的CRAR。
IL-31 15H05模拟表位ZTS-561表示犬IL-31上被抗体15H05识别的结合位点。在图15A-15E中将来自用ZTS-561 CRM疫苗接种的狗的抗体应答描述为T03。此处的目标为评定针对IL-31上的此特定区域的抗体应答，所述区域已知涉及细胞因子与其受体的相互作用。将免疫应答集中于特定表位将确保抗体针对蛋白质上将导致中和其生物活性的某个区域。ZTS-561 CRM是表示犬IL-31蛋白上被具有与鼠抗体15H05(SEQ ID NO：67；MU_15H05_VH)相同的CDR的抗体识别的部分的限制性20聚体，所述鼠抗体的对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：68；MU_15H05_VH)，所述鼠抗体与对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：70；MU_15H05_VL)的VL(SEQ ID NO：69；MU_15H05_VL)配对。在整个研究(图15A)中，模拟表位ZTS-561未能产生强烈的抗猫IL-31应答，包括对猫IL-31 15H05突变体(图15B)的应答。相比之下，在第二次注射后第35天开始，狗对针对犬IL-31蛋白的ZTS-561CRM的免疫应答非常强，并持续到第84天研究终止时(图15C)。在研究的第56天，ZTS-561对马IL-31引发的CRAR可忽略不计，并且对人仅观察到很小的应答(图15D和15E)。有趣的是注意到，尽管猫和犬蛋白在此蛋白区域具有高同一性程度(图1)，但在用犬15H05模拟表位疫苗接种狗之后针对狗IL-31蛋白的种类特异性免疫应答。
ZTS-562 CRM是再次表示犬IL-31蛋白的被具有与鼠抗体15H05(SEQ ID NO：67；MU_15H05_VH)相同的CDR的抗体识别的部分的ZTS-561的限制性16聚体截短形式，所述鼠抗体的对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：68；MU_15H05_VH)，所述鼠抗体与对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：70；MU_15H05_VL)的VL(SEQ ID NO：69；MU_15H05_VL)配对。在图15A-15E中发现作为T04组的狗对ZTS-562的应答的数据。有趣的是，由此较短版本引发的CRAR在第35天到第70天更明显，产生适度的抗猫滴度(图15A)。在第35天至第63天之间，还观察到对突变体15H05 IL-31蛋白的某些应答(图15B)。由此模拟表位引发的抗犬IL-31应答在第二剂量之后第35天开始突出，并持续到第84天研究终止时。与犬肽ZTS-561 CRM的其他结果一致，ZTS-562 CRM对马和人蛋白不具有CRAR。
ZTS-563 CRM是限制性18聚体，并且是表示猫IL-31蛋白的被具有与鼠抗体15H05(SEQ ID NO：67；MU_15H05_VH)相同的CDR的抗体识别的部分的唯一模拟表位，所述鼠抗体的对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：68；MU_15H05_VH)，所述鼠抗体与对应核苷酸序列为(SEQID NO：70；MU_15H05_VL)的VL(SEQ ID NO：69；MU_15H05_VL)配对。在图15A-15E中发现作为T05组的狗对ZTS-563的应答的数据。与先前对犬模拟表位的种类特异性应答的观察结果一致，猫模拟表位(ZTS-563)在狗中引发猫特异性抗IL31应答。图15A示出对用ZTS-563进行的疫苗接种的抗猫IL-31滴度应答，在第35天达到大于1∶50,000，并且保持此水平直到第77天，在第84天适度下降。比较图15A与15B之间的T05(ZTS-563)治疗组，可以清楚地看到猫IL-31与猫IL-31 15H05突变体之间的滴度差异。突变体蛋白滴度的时间依赖性降低(当与野生型蛋白相比时)表明，免疫应答的重要部分是针对由模拟表位ZTS-563表示的蛋白质的非常特定的部分。值得注意的是，抗犬IL-31应答是适度至低的，这进一步支持由狗免疫系统生成的种类特异性应答，以应对两种种类的氨基酸序列的细微差异。用ZTS-563进行疫苗接种是唯一在狗中生成对马IL-31蛋白的CRAR的模拟表位。这些观察结果表明，模拟表位序列中的细微变化可导致物种特异性，并且还可赋予跨物种的免疫原性应答。了解这些特性有利于使用此技术设计用于单一物种或多物种用途的针对IL-31的疫苗。
最后是与ZTS-561相同的限制性18聚体但使用替代接头mT2b的ZTS-564 CRM(图15A)。ZTS-564 CRM表示犬IL-31蛋白的被具有与鼠抗体15H05(SEQ ID NO：67；MU_15H05_VH)相同的CDR的部分，所述鼠抗体的对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：68；MU_15H05_VH)，所述鼠抗体与对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：70；MU_15H05_VL)的VL(SEQ ID NO：69；MU_15H05_VL)配对。在图15A-15E中发现作为T06组的狗对ZTS-564的应答的数据。与其他观察结果一致，此模拟表位几乎没有引发狗抗猫IL-31应答(图15A和15B)。ZTS-564生成的抗犬IL-31应答非常强。图15C示出此研究中的所有治疗组，T06(ZTS-564)是唯一在单剂量后生成针对犬IL-31的免疫应答的治疗组。第二剂量和第三剂量之后生成的抗犬IL-31滴度在第35天到第84天研究终止时产生最大的测定应答(大于1∶50000)。没有观察到对马IL-31的CRAR，但是此模拟表位产生在治疗组间观察到的对人IL-31的唯一一致的应答。值得注意的是，接头化学的这种细微差异以及可能mT2b接头的更限定的限制可能提供更精确的定向抗IL-31应答，从而潜在地减轻对更频繁给药的需要。
来自此研究的数据表明，表示中和性抗IL-31抗体15H05的结合位点的肽模拟物能够在动物中引发免疫应答，并且此免疫应答是针对由抗体15H05 CDR识别的表位。从这些数据可以想到，使用重组IL-31共受体对该抗血清的进一步表征可用于定义在此多克隆应答期间生成的IL-31中和级分。这些结果进一步表明此种方法可用作针对IL-31介导的病症如特应性皮炎的疫苗的效用。
2.5.从用IL-31 15H05模拟表位免疫的比格犬的浆细胞分离的单个B细胞中鉴定 IL-31中和抗体
如上文所述，出于分离PBMC的目的，在研究的第35和84天收获血液。由于强烈的针对15H05表位的应答，来自用ZTS-563CRM(猫模拟表位)疫苗接种的单个T05狗的PBMC被用于进一步评估抗体阳性B细胞(图15A和15B)。使用与珠粒偶合的抗犬IgG Fc抗体，针对那些细胞分泌抗体筛选活化的记忆B细胞。同时评定分泌的IgG结合野生型猫IL-31以及结合猫IL-31 15H05突变体的能力。这些初步筛选结果导致从此PBMC细胞群体中选择7个命中。在这7次命中中，有3次未结合至15H05突变体，这表明这些B细胞由于使用IL-31 15H05模拟表位ZTS-563进行免疫而制成具有15H05表位的最紧密识别的抗体(数据未示出)。在对这7个命中的可变重链和轻链进行测序之后，构建重组完全犬齿版本，使其在HEK细胞中表达，并如本文先前所述进行纯化。对这7种重组犬IgG进行重新筛选，仅导致保留与猫IL-31蛋白的结合的单次命中(ZIL1)(图4)。此外，使用ELISA和Biacore方法减少ZIL1与IL-31 15H05突变体的结合，这表明此抗体结合至与15H05抗体共同的表位区域。部分1.6和图4中直接从犬B细胞获得的额外命中(ZIL8-ZIL171)来自用全长猫IL-31免疫的狗以及本文先前所述的其他组织来源。在用肽模拟表位疫苗接种后，仅ZIL1抗体来源于PBMC。
这些发现的重要方面是在用来自IL-31蛋白的肽模拟表位免疫后在狗的循环中鉴定出分泌mAb 15H05表位特异性抗体的B细胞的能力。这些结果证实了模拟IL-31上的表位区域的肽的用途，所述表位区域已知与抗体15H05的抑制作用模式有关。由于具有衍生自mAb15H05的CDR的抗体能够在体内预防IL-31介导的瘙痒，因此这些结果进一步支持了使用被设计为生成针对集中于表位的免疫应答的此模拟物作为用于预防IL-31介导的疾病诸如特应性皮炎的疫苗方法进行免疫的概念。
2.6.使用IL-31 15H05模拟表位作为捕获试剂以测量抗体15H05及其衍生物的身 份和效力
IL-31 15H05模拟表位表示IL-31蛋白上被来自小鼠祖细胞mAb 15H05的CDR识别的结合位点。如先前所述，期望使得此种试剂用于ELISA(或其他)测定形式以在整个制造过程中监测抗体生产过程。本文中构想的是，所述此类模拟表位将具有这样的效用，其中制成一个生产批次的抗IL-31抗体，并且肽模拟表位将用于分析测定中以验证所产生的抗体的身份和数量。
2.7.使用IL-31 15H05模拟表位作为诊断以测量宿主物种中的抗体水平或确定 IL-31水平
在本文中还构想了使用所述肽模拟表位用作分析测定试剂以测量在治疗IL-31介导的病症诸如特应性皮炎之后宿主中循环抗体的量。将来自动物的体液直接添加到与固体表面结合的模拟表位，并且然后添加适当的第二检测试剂以对抗体水平进行定量。另外，在此构想了一种测定设计，由此模拟表位用于捕获被标记以用于在测定中检测到的抗体。此捕获的抗体对连接的模拟表位的亲和力低于宿主物种中天然循环IL-31的亲和力。在此实施方案中，将源自宿主物种的流体的孵育与拴系到固体表面的标记抗体：模拟表位复合物一起孵育。源自宿主物种的测试流体中IL-31的存在对抗体具有更高的亲和力，从而从固体表面释放出标记的抗体，其中所述抗体可以在洗涤步骤中去除。因此，测试流体中IL-31的水平可能与在模拟表位结合的表面上出现的信号的缺乏相关。可以构想的是，这种测定可具有在研究或临床环境中用作诊断测试测量IL-31的效用。
2.8.在用IL-31模拟表位和全长犬IL-31蛋白免疫比格犬之后血清对IL-31的滴度
使用纯种的绝育雄性比格犬进行第二次血清学研究，如本文在部分2.3中所述的研究设计，但在此研究中比较了不同的模拟表位。向纯种雄性比格犬皮下施用以ZA-01为佐剂的缀合的IL-31模拟表位。在ZA-01(T01)中包括对照组，其含有CRM-197缀合的犬IL-31(SEQ ID NO：155；犬_IL-31)，其对应的核苷酸序列为(SEQ ID NO：156；犬_IL-31)。在第0、28和56天皮下施用10μg/剂量的每种加佐剂模拟表位或对照(0.5ml的20μg/ml溶液)。在第-1、0(给药前)、14、28(给药前)、42、56(给药前)、70和84天采集血清血液。此外，在第-1、35和63天，从每只动物中收集约40ml血液到肝素锂试管中，并使用标准方法处理以分离PBMC。分离后将PBMC冷冻保存，直到进一步评估抗原特异性B细胞。
治疗组1(全长犬IL-31 CRM)表示使用全长猫蛋白的对跨越全长蛋白质序列的多个表位的适应性免疫应答，如部分2.4中所述。图16A示出了概述研究治疗组的表。除了针对T01所述的全长蛋白以外，还使用了表示犬(T02，ZTS-420)和人(T03，ZTS-421)上的15H05表位的两个模拟表位。ZTS-420类似于先前在猫血清学研究中描述的ZTS-561，但是与ZTS-561中可见的mT2a接头相比，ZTS-420受限于由肽的N末端和C末端的半胱氨酸形成的二硫键。ZTS-421是人IL-31蛋白(SEQ ID NO：181；人_IL-31)上的通过将N末端和C末端与图13A中所述的mT2b接头连接来限制的同源区域。在图12中可以找到对涉及抗体15H05结合的关键氨基酸序列的参考。包括第四组，以使用两种已知中和犬中的IL-31介导的pSTAT信号传导和IL-31介导的瘙痒的抗体探索先前描述的犬IL-31上关键抗体结合区的免疫原性潜力(Bammert等人的US8790651)。在图6B所示的同源性模型中突出显示了猫IL-31上的此区域。IL-31的公认模型是四螺旋结构域细胞因子，其螺旋形成上下交替的拓扑结构。为了进一步描述，将描述IL-31蛋白的关于犬IL-31(SEQ ID NO：155；犬_IL-31)上的这四个螺旋的结构，相对于来自其他物种的同源IL-31蛋白上的对应位置，所述犬IL-31的对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：156；犬_IL-31)(图1)。螺旋A由约氨基酸33至59的序列组成，螺旋B由约氨基酸83至98的序列组成，螺旋C由约氨基酸101至114的序列组成，螺旋D由组成约氨基酸129至156的序列组成。在约氨基酸97至101之间存在定义的环区域。存在螺旋A之后约氨基酸57至62的环和螺旋D之前约氨基酸126至129之间的环。缺少预测的二级结构的任何间插序列都将被称为无规卷曲。治疗组4(ZTS-766)是表示犬IL-31的螺旋B和C的模拟表位，并包含N末端半胱氨酸残基，以便于使CRM-197载体蛋白偶合。图16B示出了IL-31蛋白的此区域的肽序列比对，其比较了犬、猫、马和人蛋白与标注的对应序列参考编号和氨基酸位置。
使用间接ELISA确定滴度，其中全长IL-31蛋白用作每种相应测定的捕获材料。测定来自每个研究组的血清与犬和人IL-31蛋白的结合(分别为图17A和17B)。用CRM-197缀合的全长犬IL-31蛋白(T01)疫苗接种的狗在第28天的第二剂量之后第42天显示滴度适度增加。甚至在第56天的第三剂量后，此组持续研究持续时间显示出逐渐降低的滴度应答。鉴于对IL-31蛋白上的所有表位的一般应答(中和以及非中和)以及较差的滴度，用全长IL-31蛋白接种疫苗不太可能表示疫苗开发的可行候选者。此研究的第2组(ZTS-420)是犬类15H05模拟表位，其类似于部分2.4中所述的ZTS-561，但是与ZTS-561上的mT2a接头相反，ZTS-420受限于在所述肽的N末端和C末端处添加的半胱氨酸之间的二硫键。与mT2a限制性形式相比，此模拟表位无法产生强大的免疫应答(比较图17A至15C)。在第56天的第三剂量之后第84天观察到滴度适度增加。在CRM-197缀合期间，二硫键环化作用可能不足或被修饰，导致免疫原次最佳呈递至犬免疫细胞。表示犬IL-31的螺旋B和C的第4组(ZTS-766)产生最强的应答，其中滴度在第28天的第二剂量之后出现并增加直至第84天研究完成时。鉴于识别先前所述的此序列的抗体的IL-31中和能力，此模拟表位表示用于预防IL-31介导的病症的有前景的疫苗候选物。治疗组3(ZTS-421)是在模拟表位的此区域中使用人IL-31序列的15H05表位。有趣的是，用此模拟表位疫苗接种的狗没有生成针对犬IL-31蛋白的应答(数据未示出)，但是在第二剂量和第三剂量之后观察到对人IL-31蛋白的免疫应答(图17B)。鉴于15H05模拟表位的核心表位区域之间的序列相似性，这是狗抗人IL-31应答的显着特异性(图12)。
2.9.用IL-31猫和马模拟表位以及全长猫IL-31蛋白免疫实验猫之后血清对IL-31 的滴度
使用实验室猫进行血清学研究，如本文部分2.3中所述的研究设计，但是在此研究中比较了猫和马模拟表位。向实验猫皮下施用以混合物为佐剂的缀合的IL-31模拟表位，所述混合物包含糖脂佐剂Bay R1005(N-(2-脱氧基-2-L-亮氨酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-N-十八烷基十二烷酰基酰胺氢乙酸盐)以及CpG寡核苷酸。包括对照组，其含有佐剂混合物中的CRM-197缀合的猫IL-31(SEQ ID NO：157；猫_IL31_野生型)，其对应的核苷酸序列为(SEQID NO：158；猫_IL-31_野生型)，所述佐剂混合物包含糖脂佐剂Bay R1005(N-(2-脱氧基-2-L-亮氨酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-N-十八烷基十二烷酰基酰胺氢乙酸盐)以及CpG寡核苷酸。(T01)。在第0、28和56天皮下施用10μg/剂量的每种加佐剂模拟表位或对照(0.5ml的20μg/ml溶液)。在第-14、0(给药前)、28(给药前)、42、56(给药前)、70和84天采集血清血液。此外，在第35和63天，从每只动物中收集约40ml血液到肝素锂试管中，并使用标准方法处理以分离PBMC。分离后将PBMC冷冻保存，直到进一步评估抗原特异性B细胞。研究治疗组概述在图18A中。ZTS-563(T02)在本文的部分2.4中描述为在先前狗血清学研究中使用的免疫原。ZTS-563是与CRM-197缀合的mT2a限制性15H05模拟表位。T03(ZTS-418)是具有马序列的15H05模拟表位(图16A中比较同源犬版本ZTS-420)。治疗组4是表示部分2.8所述的具有猫IL-31序列的BC螺旋的模拟表位肽ZTS-423。治疗组5是具有氨基己酸(Ahx)mT2b接头的猫15H05模拟表位ZTS-422。图18B示出使用间接ELISA得到的治疗组T01、T02、T04和T05在第-14、42和84天对全长猫IL-31的血清抗体应答的结果(T03对猫IL-31蛋白不具有CRAR，数据未示出)。再一次，全长IL-31蛋白(T01)的缀合形式在对全长IL-31的滴度不超过1∶20000的猫中持续研究持续时间显示最差抗体应答。在整个研究中，T02(ZTS-563)具有适度应答，直到第84天具有剂量依赖性增加，这表明猫15H05表位的这种呈递可能是合适的疫苗。在三个剂量的ZTS-423(T04)之后，猫对全长猫IL-31蛋白的平均滴度在第二剂量和第三剂量之后呈剂量依赖性增加至大于1∶100,000，这表明对高度相关的表位区域具有突出的免疫应答。表示具有AhX mT2b接头的15H05模拟表位的ZTS-422(T05)在第二剂量和第三剂量之后在滴度超过1∶100000的猫中也显示强烈免疫反应。这种形式的15H05表位明显是IL-31蛋白此区域的相关呈递，并且代表中和体内IL-31活性的有前景的疫苗模拟表位。
2.10.用于适当设计用作疫苗的模拟表位的序列和结构考虑因素
本文描述了IL-31蛋白上的表位(模拟表位)的几种肽呈递，其独特序列对应于其起源物种的氨基酸。疫苗设计的最终目标是表位的描绘，由此使免疫系统识别它们并生成强烈的特异性应答。通过但不限于添加载体蛋白(如CRM-197)和具有佐剂的制剂来促进疫苗设计。本文描述了已基于结合抗原的抗体的特性鉴定出的表位的实例。关键表位是IL-31蛋白上的那些区域，当与抗体结合时，这些区域不能进一步接合IL-31RA：OSMR受体复合物并且因此不能在细胞培养物或体内引发pSTAT信号传导应答。因此，阻断IL-31介导的受体信号传导是预防和/或治疗IL-31介导的病症如特应性皮炎的方法。
使用突变技术标测在蛋白质上的抗体结合位点是鉴定涉及抗体：抗原识别的关键残基的有效方法，如先前在Bammert等人的US8790651中对于IL-31所述。基于此知识，能够设计犬和猫BC螺旋模拟表位，其在本文中被描述为在犬和猫中引发强烈的抗IL-31应答的有效免疫原。最近描述了另一种使用GST犬IL-31融合蛋白来标测抗犬IL-31抗体M14的方法(WO 2018/156367(Kindred Biosciences，Inc.)。这些作者试图定义由包含氨基酸PSDX1X2KI(SEQ ID NO 155，氨基酸34-40)的M14抗体识别的最小表位序列，其中X是任何氨基酸。与同源IL-31种类相比，此序列的描述可在图19A中找到。图19B描述了进一步的描述，包括围绕上述内容的侧接序列。在鉴定出图19B中所示的最小结合片段(氨基酸34-42周围的灰色阴影框)之后，作者使用此肽片段的GST融合物在每个位置处生成丙氨酸取代。根据这些数据，描述了上述M14最小结合片段。这种方法的根本缺陷在于，在GST融合蛋白的背景下，所述结合片段的性质取决于其结构。不受单一理论约束，据信由M14抗体识别的氨基酸序列是本文描述为螺旋A的有序α螺旋结构域的一部分。肽和蛋白质中存在α螺旋，但不限于羰基的氧与胺主链基团的氮之间的氢键合模式的配位作用(Corey-Pauling规则，化学词典，2008年)。认为对于M14抗体所述的最小结合片段不能表示表位的适当描述，因为没有证据表明在GST支架不存在下的结合特性。此外，围绕并包括所报告的M14表位的序列的组成含有大量非极性氨基酸(I、L、V、P、G、A、M)(图19B)。在间插的极性或带电荷氨基酸不存在下，肽中这些氨基酸的物理性质将导致其水不溶性和二级结构紊乱。因此，在本文中构想的是，WO 2018/156367(Kindred Biosciences，Inc.)中描述的M14抗体的最小结合片段取决于由GST融合产物所赋予的特性，而不是肽本身固有的特性。
本文描述了IL-31表位的几种肽呈递，其特性在融合蛋白不存在下作为独立肽存在。这在部分2.2(图13B)中举例说明，所述部分示出了呈缀合和未缀合形式的15H05类模拟表位的结合和抑制特性。除了肽的二级结构特征以外，一级氨基酸序列还表示在T细胞表面上适当呈递所必需的疫苗设计的另一个关键方面。适当的氨基酸序列连同具有B细胞表位和T细胞表位的载体蛋白一起将引发针对IL-31蛋白关键区域的免疫应答。本文已经描述了IL-31上的多个区域，其适合于在狗和猫中引发定向的免疫应答。疫苗模拟表位的成功取决于本文所述的因素，并最终在体内由应答的有效性确定。然而，基于对在此描述的IL-31上的几个表位区域的学习，可以构想的是，可能存在其他此类表位，其可以制成合适疫苗模拟表位。抗体15H05识别示出为图6B上的位点2的在螺旋D之前的环。可以构想的是，蛋白质上的其他环可表示抗体可及的表位。例如，由螺旋A与尾随无规卷曲序列会合形成的环与15H05环共享此类位置和结构属性。在图20中描述了与来自多个物种的一级氨基酸序列相比的此AB环。不希望局限于作为单个实例的此情况，据信蛋白质上的其他此类区域可共享免疫原性。
2.11.在用全长马IL-31蛋白疫苗接种小鼠后对马IL-31模拟表位的血清滴度
用缀合至CRM-197的对应核苷酸序列为(SEQ ID NO：166；犬_IL-31)的全长马IL-31(SEQ ID NO：165；马_IL-31)免疫小鼠，如本申请部分1.6中所述的方法。表示本文所述的三个表位区域的生物素缀合的肽被设计用于生物层干涉术结合测定法(Octet，ForteBio)。这些肽的描述在图21A中描述。每个肽都含有具有三个氨基酸间隔序列(GSG)的N末端生物素，所述间隔序列在图中用粗体下划线标出。在图中也指示了来自SEQ ID NO 165的对应氨基酸序列位置编号。15H05模拟表位包含两个末端半胱氨酸残基(也以粗体和下划线突出显示)，以便于通过二硫键环化。图21B示出了生物层干涉法的结果，其中图21A中所述的肽固定至链霉亲和素包被的针，并且然后用于探测小鼠抗马IL-31或对照小鼠血清的多种稀释液。对照小鼠血清来自用无关蛋白疫苗接种的小鼠。在图的y轴上表示此处描述为抗血清缔合120秒后的信号幅度的响应。由这些数据，可以评定由全马IL-31蛋白上的表位呈递所引起的免疫应答。另外，可以通过结合来评定这些IL-31模拟表位被那些免疫应答识别的能力。这些数据表明，在体内对马IL-31蛋白进行加工和呈递后，所描述的所有三种模拟表位肽(15H05，BC螺旋和A螺旋)均被视为相关免疫原。观察到对照血清与每个模拟表位结合的最小信号，除了A螺旋显示一些稀释依赖性信号。类似于本文描述的引起针对全长蛋白质的免疫应答的模拟表位的呈递，此实验描述了这些表位的相互验证，其中验证了蛋白质针对模拟表位的免疫应答。
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<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 9
Ala Arg Gly Gly Thr Ser Val Ile Arg Asp Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 10
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met His
1 5 10 15
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 11
Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 12
Gln Gln Ser Asn Lys Asp Pro Leu Thr
1 5
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 13
Ser Tyr Gly Met Ser
1 5
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 14
His Ile Asn Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ala Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 15
<211> 15
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 15
Val Tyr Thr Thr Leu Ala Ala Phe Trp Thr Asp Asn Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 16
<211> 13
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 16
Ser Gly Ser Thr Asn Asn Ile Gly Ile Leu Ala Ala Thr
1 5 10
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 17
Ser Asp Gly Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 18
Gln Ser Phe Asp Thr Thr Leu Asp Ala Tyr Val
1 5 10
<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 19
Asp Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 20
Gly Ile Asp Ser Val Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Ala Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 21
Gly Phe Pro Gly Ser Phe Glu His
1 5
<210> 22
<211> 13
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 22
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Gly Tyr Val Gly
1 5 10
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 23
Tyr Asn Ser Asp Arg Pro Ser
1 5
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 24
Ser Val Tyr Asp Arg Thr Phe Asn Ala Val
1 5 10
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 25
Ser Tyr Asp Met Thr
1 5
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 26
Asp Val Asn Ser Gly Gly Thr Gly Thr Ala Tyr Ala Val Ala Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 27
Leu Gly Val Arg Asp Gly Leu Ser Val
1 5
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 28
Ser Gly Glu Ser Leu Asn Glu Tyr Tyr Thr Gln
1 5 10
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 29
Arg Asp Thr Glu Arg Pro Ser
1 5
<210> 30
<211> 10
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 30
Glu Ser Ala Val Asp Thr Gly Thr Leu Val
1 5 10
<210> 31
<211> 5
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 31
Thr Tyr Val Met Asn
1 5
<210> 32
<211> 17
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 32
Ser Ile Asn Gly Gly Gly Ser Ser Pro Thr Tyr Ala Asp Ala Val Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 33
Ser Met Val Gly Pro Phe Asp Tyr
1 5
<210> 34
<211> 11
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 34
Ser Gly Glu Ser Leu Ser Asn Tyr Tyr Ala Gln
1 5 10
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 35
Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser
1 5
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 36
Glu Ser Ala Val Ser Ser Asp Thr Ile Val
1 5 10
<210> 37
<211> 5
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 37
Ser Tyr Ala Met Lys
1 5
<210> 38
<211> 17
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 38
Thr Ile Asn Asn Asp Gly Thr Arg Thr Gly Tyr Ala Asp Ala Val Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 39
<211> 15
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 39
Gly Asn Ala Glu Ser Gly Cys Thr Gly Asp His Cys Pro Pro Tyr
1 5 10 15
<210> 40
<211> 11
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 40
Ser Gly Glu Ser Leu Asn Lys Tyr Tyr Ala Gln
1 5 10
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 41
Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser
1 5
<210> 42
<211> 10
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 42
Glu Ser Ala Val Ser Ser Glu Thr Asn Val
1 5 10
<210> 43
<211> 5
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 43
Thr Tyr Phe Met Ser
1 5
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 44
Leu Ile Ser Ser Asp Gly Ser Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ala Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 45
Phe Trp Arg Ala Phe Asn Asp
1 5
<210> 46
<211> 14
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 46
Gly Leu Asn Ser Gly Ser Val Ser Thr Ser Asn Tyr Pro Gly
1 5 10
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 47
Asp Thr Gly Ser Arg Pro Ser
1 5
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 48
Ser Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Ile Leu Val
1 5 10
<210> 49
<211> 5
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 49
Asp Arg Gly Met Ser
1 5
<210> 50
<211> 17
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 50
Tyr Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Thr Asp Tyr Ala Asp Ala Val Glu
1 5 10 15
Gly
<210> 51
<211> 8
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 51
Trp Asp Gly Ser Ser Phe Asp Tyr
1 5
<210> 52
<211> 16
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 52
Lys Ala Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp
1 5 10 15
<210> 53
<211> 7
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 53
Lys Val Ser Asn Arg Asp Pro
1 5
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 54
Met Gln Ala Ile His Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 55
<211> 5
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 55
Ser Tyr Val Met Thr
1 5
<210> 56
<211> 17
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 56
Gly Ile Asn Ser Glu Gly Ser Arg Thr Ala Tyr Ala Asp Ala Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 57
<211> 10
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 57
Gly Asp Ile Val Ala Thr Gly Thr Ser Tyr
1 5 10
<210> 58
<211> 11
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 58
Ser Gly Glu Thr Leu Asn Arg Phe Tyr Thr Gln
1 5 10
<210> 59
<211> 7
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 59
Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser
1 5
<210> 60
<211> 10
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 60
Lys Ser Ala Val Ser Ile Asp Val Gly Val
1 5 10
<210> 61
<211> 5
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 61
Thr Tyr Val Met Asn
1 5
<210> 62
<211> 17
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 62
Ser Ile Asn Gly Gly Gly Ser Ser Pro Thr Tyr Ala Asp Ala Val Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 63
<211> 8
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 63
Ser Met Val Gly Pro Phe Asp Tyr
1 5
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 64
Ser Gly Lys Ser Leu Ser Tyr Tyr Tyr Ala Gln
1 5 10
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 65
Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser
1 5
<210> 66
<211> 10
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 66
Glu Ser Ala Val Ser Ser Asp Thr Ile Val
1 5 10
<210> 67
<211> 122
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 67
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Ala Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Asn Pro Thr Ser Gly Tyr Thr Glu Asn Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Thr Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Gly Phe Lys Tyr Asp Gly Glu Trp Ser Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 68
<211> 366
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 68
caggtccagc tgcagcagtc tgcagctgaa ctggcaagac ctggggcctc agtgaagatg 60
tcctgcaaga cttctggcta cacatttact tcctacacga tacactggat aaaacagagg 120
cctggacagg gtctggaatg gattggaaac attaatccca ccagtggata cactgagaac 180
aatcagaggt tcaaggacaa gaccacattg actgtagaca gatcctccaa cacagcctat 240
ttgcaactgc acagcctgac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagatggggc 300
tttaaatatg acggagaatg gtccttcgat gtctggggcg cagggaccac ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 69
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 69
Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Ile Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ile Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Asn Lys Ala Ser Asn Leu His Ile Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Gln Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn
100 105
<210> 70
<211> 321
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 70
gacatccaaa tgaaccagtc tccatccagt ctgtctgcat ccctcggaga cacaatcacc 60
gtcacttgcc gtgccagtca gggcatcagt atttggttaa gctggtacca gcagaaacca 120
ggaaatattc ctaaagtatt gatcaataag gcttccaact tgcacatagg agtcccacca 180
aggtttagtg gcagtggatc tggaacacat ttcacattaa ctatcaccag cctacagcct 240
gaagacattg ccacttacta ctgtctacag agtcaaactt atcctctcac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggaaataaa c 321
<210> 71
<211> 121
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 71
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Lys Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Thr Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Thr Ser Val Ile Arg Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 72
<211> 363
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 72
caggttcagc tgcagcagtc tggagctgaa ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagttg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcaaa tactatgata taaactgggt gaggcagagg 120
cctgaacagg gacttgagtg gattggatgg atttttcctg gagatggtgg tactaagtac 180
aatgagacgt tcaagggcaa ggccacactg actacagaca aatcctccag cacagcctac 240
atgcagctca gcaggctgac atctgaggac tctgctgtct atttctgtgc aagagggggg 300
acttcggtga taagggatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 73
<211> 111
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 73
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Thr Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Lys Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 74
<211> 333
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 74
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atctcctgca gagccagcga aagtgttgat aattatggca ttagttttat gcactggtac 120
cagcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa cctagaatct 180
gggatccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattaat 240
cctgtggaga ctgatgatgt tgcaacctat tactgtcagc aaagtaataa ggatccgctc 300
acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaa 333
<210> 75
<211> 124
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 75
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val
35 40 45
Ala His Ile Asn Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Glu Val Tyr Thr Thr Leu Ala Ala Phe Trp Thr Asp Asn Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 76
<211> 372
<212> DNA
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 76
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgtgg cttctggatt caccttcagt agttatggca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctgcagtg ggtcgcacac attaacagtg gtggaagtag cacatactac 180
gcagacgctg tgaagggacg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgctctat 240
ctgcagatga acagcctgag agctgaggac acggccgtct attactgtgt ggaggtttac 300
actacgttag ctgcattctg gacagacaat tttgactact ggggccaggg aaccctggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 77
<211> 110
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 77
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Thr Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Asn Asn Ile Gly Ile Leu
20 25 30
Ala Ala Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu
35 40 45
Val Tyr Ser Asp Gly Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Asn Ser Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Phe Asp Thr Thr Leu
85 90 95
Asp Ala Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 78
<211> 330
<212> DNA
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 78
cagtctgtgc tgactcagcc gacctcagtg tcggggtccc ttggccagag ggtcaccatc 60
tcctgctctg gaagcacgaa caacatcggt attcttgctg cgacctggta ccaacaactc 120
ccaggaaagg cccctaaagt cctcgtgtac agtgatggga atcgaccgtc aggggtccct 180
gaccggtttt ccggctccaa gtctggcaac tcagccaccc tgaccatcac tgggcttcag 240
gctgaggacg aggctgatta ttactgccag tcctttgata ccacgcttga tgcttacgtg 300
ttcggctcag gaacccaact gaccgtcctt 330
<210> 79
<211> 117
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 79
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Gln Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Asp Ser Val Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Phe Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Phe Pro Gly Ser Phe Glu His Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 80
<211> 351
<212> DNA
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 80
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctgcagggtc cctgagactg 60
tcctgtgtgg cctctggatt caccttcagt gactatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
cctgggaggg gactgcagtg ggtcgcaggt attgacagtg ttggaagtgg cacaagctac 180
gcagacgctg tgaagggccg attcacaatc tccagagacg acgccaagaa cacactgtat 240
ctgcagatgt tcaacctgag agccgaggac acggccatat attactgtgc gagcgggttc 300
cctgggtcct ttgagcactg gggccagggc accctggtca ccgtctcctc a 351
<210> 81
<211> 104
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 81
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Gly
20 25 30
Tyr Val Gly Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Gly Pro Arg Thr Leu
35 40 45
Ile Tyr Tyr Asn Ser Asp Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Arg Ser Gly Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Val Tyr Asp Arg Thr Phe
85 90 95
Asn Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr
100
<210> 82
<211> 327
<212> DNA
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 82
cagtctgtac tgactcagcc ggcctcagtg tctgggtccc tgggccagaa ggtcaccatc 60
tcctgcactg gaagtagttc caacattggt agtggttatg tgggctggta ccagcagctc 120
ccaggaacag gccccagaac cctcatctat tataacagtg accgaccttc gggggtcccc 180
gatcgattct ctggctccag gtcaggcacc acagcaaccc tgaccatctc tggactccag 240
gctgaggacg aggctgatta ttactgctca gtatatgaca ggactttcaa tgctgtgttc 300
ggcggaggca cccacctgac cgtcctc 327
<210> 83
<211> 118
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 83
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Pro Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Ser Gly Gly Thr Gly Thr Ala Tyr Ala Val Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Leu Gly Val Arg Asp Gly Leu Ser Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 84
<211> 354
<212> DNA
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 84
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctccagggtc cctgagactg 60
tcctgtgtgg cctctggatt caccttcagc agttatgaca tgacctgggt ccgccaggct 120
cctgggaagg gactgcagtg ggtcgcagat gttaacagtg gtggaactgg cacggcctac 180
gcagtcgctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa aacactctat 240
ttacagatga acagcctgag agccgaagac acggccgttt attattgtgc gaaactaggt 300
gtgagagatg gtctttctgt ctggggccag ggcaccctgg tcaccgtctc ctcg 354
<210> 85
<211> 107
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 85
Ser Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ile Ser Cys Ser Gly Glu Ser Leu Asn Glu Tyr Tyr Thr
20 25 30
Gln Trp Phe Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Arg Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr His Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Arg Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Glu Ser Ala Val Asp Thr Gly Thr Leu
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Ala Val Leu
100 105
<210> 86
<211> 321
<212> DNA
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 86
tccagtgtgc tgactcagcc tccctcggta tcagtgtctc tgggacagac agcaaccatc 60
tcctgctctg gagagagtct gaatgaatat tatacacaat ggttccagca gaaggcaggc 120
caagcccctg tcttggtcat atatagggac actgagcggc cctctgggat ccctgaccga 180
ttctctggct ccagttcagg gaacacacac accctaacca tcagcggggc tcgggccgag 240
gacgaggctg actattactg cgagtcagcg gtcgacactg gaacccttgt ctttggcgga 300
ggcacccacc tggccgtcct c 321
<210> 87
<211> 117
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 87
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr
20 25 30
Val Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Asn Gly Gly Gly Ser Ser Pro Thr Tyr Ala Asp Ala Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Gln Asn Ser Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Val Val Ser Met Val Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 88
<211> 351
<212> DNA
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 88
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctgcagggtc cctgagactg 60
tcctgtgtgg cctctggatt caccttcagg acctatgtca tgaactgggt ccgccaggct 120
cctgggaagg ggctgcaatg ggtcgcaagt attaacggtg gtggaagtag cccaacctac 180
gcagacgctg tgaggggccg attcaccgtc tccagggaca acgcccagaa ctcactgttt 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acagccgtgt atttttgtgt cgtgtcgatg 300
gttgggccct tcgactactg gggccaaggg accctggtca ccgtgtcctc a 351
<210> 89
<211> 102
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 89
Ser Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ile Ser Cys Ser Gly Glu Ser Leu Ser Asn Tyr Tyr Ala
20 25 30
Gln Trp Phe Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr His Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Arg Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Glu Ser Ala Val Ser Ser Asp Thr Ile
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr
100
<210> 90
<211> 321
<212> DNA
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 90
tccagtgtgc tgactcagcc tccctcggta tcagtgtctc tggggcagac agcaaccatc 60
tcctgctctg gagagagtct gagtaactat tatgcacaat ggttccagca gaaggcaggc 120
caagcccctg tgttggtcat atataaggac actgagcggc cctctgggat ccctgaccga 180
ttctctggct ccagttcagg gaacacacac accctgacca tcagcggggc tcgggccgag 240
gacgaggctg actattactg tgagtcagca gtcagttctg atactattgt gttcggcgga 300
ggcacccacc tgaccgtcct c 321
<210> 91
<211> 124
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 91
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Asn Asp Gly Thr Arg Thr Gly Tyr Ala Asp Ala Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Lys Gly Asn Ala Glu Ser Gly Cys Thr Gly Asp His Cys Pro Pro
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 92
<211> 372
<212> DNA
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 92
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctgcggggtc cctgagactg 60
tcctgtgtgg cctctggatt caccttcagt agttatgcca tgaaatgggt ccgccaggct 120
cctgggaagg ggctgcagtg ggtcgcgact attaacaatg atggaaccag aacaggctac 180
gcagacgctg tgaggggccg attcaccatc tccaaagaca acgccaaaaa cacactgtat 240
ctgcagatgg acagcctgag agccgacgac acggccgtct attactgtac aaagggcaat 300
gccgaatccg gctgtactgg tgatcactgt cctccctact ggggccaggg aaccctggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 93
<211> 107
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 93
Ser Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ile Ser Cys Ser Gly Glu Ser Leu Asn Lys Tyr Tyr Ala
20 25 30
Gln Trp Phe Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ala Gly Asn Thr His Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Arg Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Glu Ser Ala Val Ser Ser Glu Thr Asn
85 90 95
Val Phe Gly Ser Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 94
<211> 321
<212> DNA
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 94
tccagtgtgc tgactcagcc tccctcggta tcagtgtctc tgggacagac agcaaccatc 60
tcctgctctg gagagagtct gaataaatat tatgcacaat ggttccaaca gaaggcaggc 120
caagcccctg tgttggtcat atataaggac actgagcggc cctctgggat ccctgaccga 180
ttctccggct ccagtgcagg caacacacac accctgacca tcagcggggc tcgggccgag 240
gacgaggctg actattactg cgagtcagca gtcagttctg aaactaacgt gttcggctca 300
ggaacccaac tgaccgtcct t 321
<210> 95
<211> 116
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 95
Glu Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Phe Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Gln Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Ser Ser Asp Gly Ser Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ile Phe Trp Arg Ala Phe Asn Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 96
<211> 348
<212> DNA
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 96
gaggtacaac tggtggactc tgggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgtgg cctctggatt caccttcagt acctacttca tgtcctgggt ccgccaggct 120
ccagggaggg ggcttcagtg ggtcgcactt attagcagtg atggaagtgg cacatactac 180
gcagacgctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggctatgt attactgtgc gatattctgg 300
cgggccttta acgactgggg ccagggcacc ctggtcaccg tctcctca 348
<210> 97
<211> 110
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 97
Gln Thr Val Val Ile Gln Glu Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Leu Asn Ser Gly Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Pro Gly Trp Tyr Gln Gln Thr Arg Gly Arg Thr Pro Arg Thr
35 40 45
Ile Ile Tyr Asp Thr Gly Ser Arg Pro Ser Gly Val Pro Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Ile Ser Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Leu Tyr Thr Asp Ser
85 90 95
Asp Ile Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 98
<211> 330
<212> DNA
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 98
cagactgtgg taatccagga gccatcactc tcagtgtctc caggagggac agtcacactc 60
acatgtggcc tcaactctgg gtcagtctcc acaagtaatt accctggctg gtaccagcag 120
acccgaggcc ggactcctcg cacgattatc tacgacacag gcagtcgccc ctctggggtc 180
cctaatcgct tctccggatc catctctgga aacaaagccg ccctcaccat cacaggagcc 240
cagcccgagg atgaggctga ctattactgt tccttatata cggatagtga cattcttgtt 300
ttcggcggag gcacccacct gaccgtcctc 330
<210> 99
<211> 117
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 99
Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Trp Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Arg
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Thr Asp Tyr Ala Asp Ala Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Gly Ser Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 100
<211> 351
<212> DNA
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 100
gaggtgcatt tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc cttgggggtc cttgagactg 60
tcctgtgtgg cctctggatt cacctttagt gatcgtggca tgagctgggt ccgtcagtct 120
ccagggaagg ggctgcagtg ggtcgcatat attaggtatg atgggagtag gacagactac 180
gcagacgctg tggagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgctctac 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagatgggac 300
ggtagttctt ttgactattg gggccagggc accctggtca ccgtctcctc a 351
<210> 101
<211> 112
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 101
Asp Ile Val Val Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ala Ser Phe Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Phe Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Pro Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Gly Val Glu Ala Asp Asp Ala Gly Leu Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Ile His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 102
<211> 336
<212> DNA
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 102
gatattgtcg tgacacagac cccgctgtcc ctgtccgtca gccctggaga gactgcctcc 60
ttctcctgca aggccagtca gagcctcctg cacagtgatg gaaacacgta tttggattgg 120
ttccgacaga agccaggcca gtctccacag cgtttgatct acaaggtctc caacagagac 180
cctggggtcc cagacaggtt cagtggcagc gggtcaggga cagatttcac cctgagaatc 240
agcggagtgg aggctgacga tgctggactt tattactgca tgcaagcaat acactttcct 300
ctgacgttcg gagcaggaac caaggtggag ctcaaa 336
<210> 103
<211> 119
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 103
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Asn Ser Glu Gly Ser Arg Thr Ala Tyr Ala Asp Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gly Asp Ile Val Ala Thr Gly Thr Ser Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 104
<211> 357
<212> DNA
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 104
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctgcagggtc cctgagactg 60
tcctgtgtgg cctctggatt caccttcagt agttatgtca tgacctgggt ccgccaggct 120
cctgggaagg gactgcagtg ggtcgcaggc attaatagtg aggggagtag gacagcctac 180
gcagacgctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa tacactttat 240
ctacaaatag acagcctgag agccgaggac acggccatat attactgtgc gacaggcgat 300
atagtagcga ctggtacttc gtattggggc cagggcaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 105
<211> 107
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 105
Ser Asn Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ile Ser Cys Ser Gly Glu Thr Leu Asn Arg Phe Tyr Thr
20 25 30
Gln Trp Phe Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Ile His Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Arg Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Ala Tyr Tyr Cys Lys Ser Ala Val Ser Ile Asp Val Gly
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Phe
100 105
<210> 106
<211> 321
<212> DNA
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 106
tccaatgtac tgactcagcc tccctcggta tcagtgtctc tgggacagac agcaaccatc 60
tcctgctctg gagagactct gaatagattt tatacacaat ggttccagca gaaggcaggc 120
caagcccctg tgttggtcat atataaggac actgagcggc cctctgggat ccctgaccga 180
ttctccggct ccagttcagg gaacatacac accctgacca tcagcggggc tcgggccgag 240
gacgaggctg cctattactg caagtcagca gtcagtattg atgttggtgt gttcggcgga 300
ggcacccacc tgaccgtctt c 321
<210> 107
<211> 117
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 107
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr
20 25 30
Val Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Asn Gly Gly Gly Ser Ser Pro Thr Tyr Ala Asp Ala Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Gln Asn Ser Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys
85 90 95
Val Val Ser Met Val Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly His Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 108
<211> 351
<212> DNA
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 108
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctgcagggtc cctgagactg 60
tcctgtgtgg cctctggatt caccttcagg acctatgtca tgaactgggt ccgccaggct 120
cctgggaagg ggctgcaatg ggtcgcaagt attaacggtg gtggaagtag cccaacctac 180
gcagacgctg tgaggggccg attcaccgtc tccagggaca acgcccagaa ctcactgttt 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acagccatat atttttgtgt cgtgtcgatg 300
gttgggccct tcgactactg gggccatggg accctggtca ccgtgtcctc a 351
<210> 109
<211> 107
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 109
Ser Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ile Ser Cys Ser Gly Lys Ser Leu Ser Tyr Tyr Tyr Ala
20 25 30
Gln Trp Phe Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr His Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Arg Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Glu Ser Ala Val Ser Ser Asp Thr Ile
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 110
<211> 321
<212> DNA
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 110
tccagtgtgc tgactcagcc tccctcggta tcagtgtctc tggggcagac agcaaccatc 60
tcctgctctg gaaagagtct gagttactat tatgcacaat ggttccagca gaaggcaggc 120
caagcccctg tgttggtcat atataaggac actgagcggc cctctgggat ccctgaccga 180
ttctctggct ccagttcagg gaacacacac accctgacca tcagcggggc tcgggccgag 240
gacgaggctg actattactg tgagtcagca gtcagttctg atactattgt gttcggcgga 300
ggcacccacc tgaccgtcct c 321
<210> 111
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自小家鼠和家猫的猫源化可变重链mAb序列
<400> 111
Gln Val Leu Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Phe Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ile Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Thr Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Leu Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Thr Ser Val Ile Arg Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 112
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码来自小家鼠和家猫的猫源化可变重链mAb序列的核苷酸序列
<400> 112
caggtgctgc tggtccagtc aggagcagag gtaaaaaagc ccggggcgag tgtcaagatt 60
ttctgtaagg cctccggata ctcttttacg tattacgata ttaactggct tcgccaggcc 120
cctgagcagg ggctcgaatg gatgggttgg atattccccg gagatggggg aaccaagtac 180
aacgaaacct tcaaggggag gctgaccctg actgcagata ccagcacgaa cacagtgtat 240
atggagttgt cctcactgcg atctgctgat actgccatgt actactgcgc tcgcggcggc 300
acttcagtta tcagggatgc catggactat tgggggcagg gcgcactcgt cactgtctcg 360
agc 363
<210> 113
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列
<400> 113
Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Lys Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr
100 105
<210> 114
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列的核苷酸序列
<400> 114
gaaatccaga tgacacaatc tcccagctcc ctcagcgcat ctcctggcga cagggtaacc 60
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caacaaaagc ccgggaaagt ccccaaactg ttgatttaca gagcaagcaa tctcgagtca 180
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列
<400> 115
Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Ser Ala Phe Leu Ser Arg Thr Leu Lys
1 5 10 15
Glu Lys Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gln Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Val Lys Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ala Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Pro Glu Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
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100 105
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列的核苷酸序列
<400> 116
gaggtggtgc tgactcagag tagcgcgttt ctgtctcgga ccctgaaaga gaaagctacc 60
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cagcagaaac ctaatcaggc gcctaagctg ctcgtgaaaa gagcctccaa ccttgagagc 180
ggcgcaccat caaggttttc aggaagtggc agcgggacag acttcaccct tacaatctct 240
agtccagagc cggaggacgc agctacctac tattgccagc aatccaataa agacccgttg 300
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列
<400> 117
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
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65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
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<220>
<223> 编码来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列的核苷酸序列
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gagatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgagtgcta gcccggggga tcgagtgact 60
ataacatgtc gggccagtga atcagtggac aactatggaa tcagttttat gcactggtat 120
cagcagaagc ccggccagcc accgaagctg ttgatttatc gcgcaagcaa tctggagtca 180
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列
<400> 119
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
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Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Val Pro
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Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
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Ser Leu Glu Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列的核苷酸序列
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gagatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgagtgcta gcccggggga tcgagtgact 60
ataacatgtc gggccagtga atcagtggac aactatggaa tcagttttat gcactggtat 120
cagcagaagc ccggccaggt cccgaagctg ttgatttatc gcgcaagcaa tctggagtca 180
ggagtgccct ctagattttc tgggagcggt tctggcacag atttcacact cacaatatca 240
tccttggaac cggaagacgc agccacatac tattgccagc agagtaacaa ggaccctttg 300
acttttggcc agggtacc 318
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自小家鼠和家猫的猫源化可变重链mAb序列
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Gln Val Leu Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Thr Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Ile Phe Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
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Thr Ile His Trp Leu Arg Gln Ala Pro Ala Gln Gly Leu Glu Trp Met
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码来自小家鼠和家猫的猫源化可变重链mAb序列的核苷酸序列
<400> 122
caagtgcttc tggtgcaaag cggggcggaa gttaggaccc caggagcctc agtaaaaatt 60
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<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自小家鼠和家猫的猫源化可变重链mAb序列
<400> 123
Gln Val Leu Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Thr Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Phe Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Gly Phe Thr Ser Tyr
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码来自小家鼠和家猫的猫源化可变重链mAb序列的核苷酸序列
<400> 124
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tcgagc 366
<210> 125
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自小家鼠和家猫的猫源化可变重链mAb序列
<400> 125
Gln Val Leu Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Ile Phe Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码来自小家鼠和家猫的猫源化可变重链mAb序列的核苷酸序列
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列
<400> 127
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100 105
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<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列的核苷酸序列
<400> 128
gaaattcaga tgactcaatc accttcatct ttgagtgcat cacccggaga tagagttaca 60
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<220>
<223> 来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列
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Glu Ile Thr Met Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala Gly Ser Pro Gly
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Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln His Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
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<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列的核苷酸序列
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列
<400> 131
Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Ser Ala Phe Leu Ser Arg Thr Leu Lys
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Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gln Ala Pro Lys Leu Leu Val
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列的核苷酸序列
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列
<400> 133
Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列的核苷酸序列
<400> 134
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<220>
<223> 来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列
<400> 135
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列的核苷酸序列
<400> 136
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<220>
<223> 来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列
<400> 137
Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ile Trp
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列的核苷酸序列
<400> 138
gaaattcaga tgactcaatc accttcatct ttgagtgcat cacccggaga tagagttaca 60
atcacctgca gggcgagtca agggatctcc atatggttgt catggtatca gcagaaaccc 120
ggaaaggtcc cgaaactctt gatctacaag gcctctaacc tgcacattgg ggtcccccca 180
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<210> 139
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列
<400> 139
Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
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100 105
<210> 140
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列的核苷酸序列
<400> 140
gacattcaga tgaatcagtc tcctagctca ctgtcagcca gccttggaga caccattaca 60
gtcacttgca gggcgagtca agggatctcc atatggttgt catggtatca gcagaaaccg 120
ggcaatatcc caaaggtgct gattaacaag gcctctaacc tgcacattgg cgtgccaagc 180
cgattcagcg ggagcggaag tggcaccgac tttactctga cgatcagttc actggagccc 240
gaggacgctg caacatacta ttgtctgcaa tctcagacct accctctcac ctttggagga 300
ggtaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 141
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列
<400> 141
Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Ile Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ile Trp
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Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Gln Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 142
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列的核苷酸序列
<400> 142
gacattcaga tgaatcagtc tcctagctca ctgtcagcca gccttggaga caccattaca 60
gtcacttgca gggcgagtca agggatctcc atatggttgt catggtatca gcagaaaccc 120
ggaaaggtcc cgaaactctt gatctacaag gcctctaacc tgcacattgg ggtcccccca 180
aggttcagcg gatctggatc cgggacccac tttactctga ccataacaag cctgcagcct 240
gaagacattg ctacctatta ctgcctgcaa tctcagacct accctctcac ctttggagga 300
ggtaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 143
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列
<400> 143
Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ile Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Asn Lys Ala Ser Asn Leu His Ile Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Gln Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 144
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列的核苷酸序列
<400> 144
gaaattcaga tgactcaatc accttcatct ttgagtgcat cacccggaga tagagttaca 60
atcacctgca gggcgagtca agggatctcc atatggttgt catggtatca gcagaaaccg 120
ggcaatatcc caaaggtgct gattaacaag gcctctaacc tgcacattgg ggtcccccca 180
aggttcagcg gatctggatc cgggacccac tttactctga ccataacaag cctgcagcct 240
gaagacattg ctacctatta ctgcctgcaa tctcagacct accctctcac ctttggagga 300
ggtaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 145
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列
<400> 145
Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ile Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Gln Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 146
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列的核苷酸序列
<400> 146
gaaatccaga tgacacagtc ccccagtagc ctttccgctt caccgggcga tagagtcact 60
attacgtgca gggcctccca gggtatttct atctggctga gctggtatca gcagaagccc 120
ggtaatgtgc caaagctctt gatctacaag gcatctaacc ttcatatcgg agtgccctca 180
agatttagtg ggtcaggcag cggaaccgat ttcacattga ccattagttc tctggaacca 240
gaggacgctg ccacttacta ctgcctgcag tcccaaacat accctttgac ttttgggggg 300
ggtaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 147
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列
<400> 147
Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ile Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ile Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Gln Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 148
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列的核苷酸序列
<400> 148
gagattcaga tgacccagag cccatcaagc ctctccgctt cccccggaga ccgggtgacc 60
atcacatgca gagcttcaca gggaatctca atctggctca gctggtatca gcagaagcca 120
ggcaagattc cgaagttgct tatctataag gccagtaacc tgcatatcgg agttccatca 180
agattcagtg gtagcggaag tgggacagat ttcactctca ccatcagctc cctcgaacca 240
gaggacgctg caacttacta ctgcctgcag tcccagacat atccacttac tttcggcggg 300
ggtaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 149
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列
<400> 149
Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ile Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Gln Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 150
<211> 322
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列的核苷酸序列
<400> 150
gagattcaga tgactcagag cccatctagt ctctctgcat ctcccggaga cagagttacg 60
atcacctgca gggctagcca agggatatca atttggctgt cctggtatca gcaaaaacct 120
ggcaaagtgc caaaggtctt gatttacaaa gcatccaatt tgcacatcgg cgtccctagt 180
cgcttttccg ggtctggtag cggcaccgac ttcaccctca ccataagctc actcgagccg 240
gaagatgccg ctacttacta ttgcctgcag tctcagactt accccctgac tttcggcgga 300
ggtaccaagc tggagatcaa ac 322
<210> 151
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列
<400> 151
Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ile Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Asn Lys Ala Ser Asn Leu His Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Gln Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 152
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列的核苷酸序列
<400> 152
gagatccaga tgacgcagag ccctagcagc ctctctgcat ccccaggaga cagagtaaca 60
attacctgtc gcgccagcca gggaatatct atatggctgt catggtatca acagaaaccg 120
ggaaaggttc caaagctctt gatcaataag gctagcaatc tgcatattgg agtgccctcc 180
cgcttctctg gtagcggaag tggcacagat ttcaccctga ccattagtag tctggagcct 240
gaggatgcgg ccacctacta ctgcctccag tcccaaacct atcccctgac cttcggagga 300
ggtaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 153
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列
<400> 153
Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ile Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Gln Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 154
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码来自小家鼠和家猫的猫源化可变轻链mAb序列的核苷酸序列
<400> 154
gaaattcaga tgactcagag tcctagcagc ctgtccgcaa gcccaggtga ccgagtcacc 60
ataacctgca gggccagtca ggggatctcc atatggctct cttggtatca acagaaaccc 120
ggcaatatcc ctaagctcct gatttataaa gcgtcaaatc tgcatatcgg ggtgccatca 180
agattctctg ggtccggctc aggaaccgac tttaccctga ccatttcttc tctcgaaccc 240
gaggatgccg ccacctatta ttgccttcaa agccagacat acccattgac cttcggcggc 300
ggtaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 155
<211> 159
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 155
Met Leu Ser His Thr Gly Pro Ser Arg Phe Ala Leu Phe Leu Leu Cys
1 5 10 15
Ser Met Glu Thr Leu Leu Ser Ser His Met Ala Pro Thr His Gln Leu
20 25 30
Pro Pro Ser Asp Val Arg Lys Ile Ile Leu Glu Leu Gln Pro Leu Ser
35 40 45
Arg Gly Leu Leu Glu Asp Tyr Gln Lys Lys Glu Thr Gly Val Pro Glu
50 55 60
Ser Asn Arg Thr Leu Leu Leu Cys Leu Thr Ser Asp Ser Gln Pro Pro
65 70 75 80
Arg Leu Asn Ser Ser Ala Ile Leu Pro Tyr Phe Arg Ala Ile Arg Pro
85 90 95
Leu Ser Asp Lys Asn Ile Ile Asp Lys Ile Ile Glu Gln Leu Asp Lys
100 105 110
Leu Lys Phe Gln His Glu Pro Glu Thr Glu Ile Ser Val Pro Ala Asp
115 120 125
Thr Phe Glu Cys Lys Ser Phe Ile Leu Thr Ile Leu Gln Gln Phe Ser
130 135 140
Ala Cys Leu Glu Ser Val Phe Lys Ser Leu Asn Ser Gly Pro Gln
145 150 155
<210> 156
<211> 477
<212> DNA
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 156
atgctctccc acacaggacc atccaggttt gccctgttcc tgctctgctc tatggaaacc 60
ttgctgtcct cccatatggc acccacccat cagctaccac caagtgatgt acgaaaaatc 120
atcttggaat tacagccctt gtcgagggga cttttggaag actatcagaa gaaagagaca 180
ggggtgccag aatccaaccg taccttgctg ctgtgtctca cctctgattc ccaaccacca 240
cgcctcaaca gctcagccat cttgccttat ttcagggcaa tcagaccatt atcagataag 300
aacattattg ataaaatcat agaacagctt gacaaactca aatttcaaca tgaaccagaa 360
acagaaattt ctgtgcctgc agatactttt gaatgtaaaa gcttcatctt gacgatttta 420
cagcagttct cggcgtgcct ggaaagtgtg tttaagtcac taaactctgg acctcag 477
<210> 157
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 表示具有C末端His标签的野生型猫IL-31的氨基酸序列
<400> 157
Met Leu Ser His Ala Gly Pro Ala Arg Phe Ala Leu Phe Leu Leu Cys
1 5 10 15
Cys Met Glu Thr Leu Leu Pro Ser His Met Ala Pro Ala His Arg Leu
20 25 30
Gln Pro Ser Asp Ile Arg Lys Ile Ile Leu Glu Leu Arg Pro Met Ser
35 40 45
Lys Gly Leu Leu Gln Asp Tyr Leu Lys Lys Glu Ile Gly Leu Pro Glu
50 55 60
Ser Asn His Ser Ser Leu Pro Cys Leu Ser Ser Asp Ser Gln Leu Pro
65 70 75 80
His Ile Asn Gly Ser Ala Ile Leu Pro Tyr Phe Arg Ala Ile Arg Pro
85 90 95
Leu Ser Asp Lys Asn Thr Ile Asp Lys Ile Ile Glu Gln Leu Asp Lys
100 105 110
Leu Lys Phe Gln Arg Glu Pro Glu Ala Lys Val Ser Met Pro Ala Asp
115 120 125
Asn Phe Glu Arg Lys Asn Phe Ile Leu Ala Val Leu Gln Gln Phe Ser
130 135 140
Ala Cys Leu Glu His Val Leu Gln Ser Leu Asn Ser Gly Pro Gln His
145 150 155 160
His His His His His
165
<210> 158
<211> 495
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 表示具有编码的C末端His标签的野生型猫IL-31基因的核苷酸序列
<400> 158
atgctttcac acgctggacc agcccgattc gccctcttcc tcctctgctg tatggagact 60
ctgttgccgt cccacatggc cccggcacat aggctgcagc cgtctgacat ccggaagatc 120
attctcgaac ttcgccccat gtcgaagggg ttgctgcaag actacctgaa gaaggagatc 180
ggcctgcccg aaagcaacca ctcctcgctg ccttgcctgt caagcgattc ccagctgccc 240
cacattaacg gttccgccat cctcccgtac ttccgggcca tcagaccact gtcggacaag 300
aacaccatcg acaagatcat tgaacagctg gacaagctga agtttcagcg cgagcctgaa 360
gccaaagtgt ccatgcccgc cgataacttc gagcggaaga atttcattct cgcggtgctg 420
cagcagttct ccgcgtgcct ggagcacgtc ctgcaatccc tgaacagcgg acctcagcac 480
caccatcacc accat 495
<210> 159
<211> 148
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 表示具有N末端His标签的猫IL-31蛋白的氨基酸序列
<400> 159
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ser His Met Ala
1 5 10 15
Pro Ala His Arg Leu Gln Pro Ser Asp Ile Arg Lys Ile Ile Leu Glu
20 25 30
Leu Arg Pro Met Ser Lys Gly Leu Leu Gln Asp Tyr Leu Lys Lys Glu
35 40 45
Ile Gly Leu Pro Glu Ser Asn His Ser Ser Leu Pro Cys Leu Ser Ser
50 55 60
Asp Ser Gln Leu Pro His Ile Asn Gly Ser Ala Ile Leu Pro Tyr Phe
65 70 75 80
Arg Ala Ile Arg Pro Leu Ser Asp Lys Asn Thr Ile Asp Lys Ile Ile
85 90 95
Glu Gln Leu Asp Lys Leu Lys Phe Gln Arg Glu Pro Glu Ala Lys Val
100 105 110
Ser Met Pro Ala Asp Asn Phe Glu Arg Lys Asn Phe Ile Leu Ala Val
115 120 125
Leu Gln Gln Phe Ser Ala Cys Leu Glu His Val Leu Gln Ser Leu Asn
130 135 140
Ser Gly Pro Gln
145
<210> 160
<211> 444
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 表示具有编码的N末端His 标签的猫IL-31基因的核苷酸序列
<400> 160
atgagaggat cccatcacca tcaccaccac ggctcatctc atatggcccc cgcacatcgc 60
ctgcagccga gtgacattcg taaaattatc ttggagctgc gcccgatgtc caagggctta 120
ctgcaggatt atctgaagaa agagatcggg ctgcctgaaa gcaaccatag tagcctgccg 180
tgtttatcgt ctgatagcca gttaccacac atcaatggct ctgcgatttt gccctacttt 240
cgcgccatcc gtccgctgtc cgataaaaat accatcgaca aaattatcga acaactggat 300
aaattgaagt ttcagcgcga gcctgaagcg aaagtttcga tgccagcmga taacttcgaa 360
cgcaaaaact ttattttagc ggtgttgcag cagttttctg cctgtctgga acacgtgctc 420
cagtcactca atagtgggcc acaa 444
<210> 161
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 表示具有C末端His 标签的突变体猫IL-31 11E12蛋白的氨基酸序列
<400> 161
Met Leu Ser His Ala Gly Pro Ala Arg Phe Ala Leu Phe Leu Leu Cys
1 5 10 15
Cys Met Glu Thr Leu Leu Pro Ser His Met Ala Pro Ala His Arg Leu
20 25 30
Gln Pro Ser Asp Ile Arg Lys Ile Ile Leu Glu Leu Arg Pro Met Ser
35 40 45
Lys Gly Leu Leu Gln Asp Tyr Leu Lys Lys Glu Ile Gly Leu Pro Glu
50 55 60
Ser Asn His Ser Ser Leu Pro Cys Leu Ser Ser Asp Ser Gln Leu Pro
65 70 75 80
His Ile Asn Gly Ser Ala Ile Leu Pro Tyr Phe Arg Ala Ile Arg Pro
85 90 95
Leu Ser Asp Lys Asn Thr Ile Ala Lys Ile Ala Glu Gln Leu Asp Lys
100 105 110
Leu Lys Phe Gln Arg Glu Pro Glu Ala Lys Val Ser Met Pro Ala Asp
115 120 125
Asn Phe Glu Arg Lys Asn Phe Ile Leu Ala Val Leu Gln Gln Phe Ser
130 135 140
Ala Cys Leu Glu His Val Leu Gln Ser Leu Asn Ser Gly Pro Gln His
145 150 155 160
His His His His His
165
<210> 162
<211> 495
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 表示具有编码的C末端His标签的突变体猫IL-31 11E12基因的核苷酸序列
<400> 162
atgctctctc acgccggtcc tgcccggttc gcactgttcc tcctctgttg catggagact 60
ctgcttccct cccacatggc accggcccat agactgcagc cgtccgacat cagaaagatc 120
atccttgaat tgcgccctat gagcaagggg ctgctgcagg attacctgaa aaaggagatc 180
ggcctgccgg aatcgaacca cagctcactg ccatgcctgt cctccgactc gcaactgccc 240
cacatcaatg gatccgccat tctgccgtac ttccgcgcta ttcggcctct ctccgacaag 300
aacaccatcg ccaagattgc cgagcagctg gataagctga agttccagag ggagccagaa 360
gccaaggtgt ccatgcccgc tgacaacttc gagcggaaga actttatcct cgcggtgctg 420
cagcagttct cagcgtgcct cgaacacgtc ttgcaaagcc tgaactcggg accccagcac 480
caccaccatc atcac 495
<210> 163
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 表示具有C末端His标签的突变体猫IL-31 15H05蛋白的氨基酸序列
<400> 163
Met Leu Ser His Ala Gly Pro Ala Arg Phe Ala Leu Phe Leu Leu Cys
1 5 10 15
Cys Met Glu Thr Leu Leu Pro Ser His Met Ala Pro Ala His Arg Leu
20 25 30
Gln Pro Ser Asp Ile Arg Lys Ile Ile Leu Glu Leu Arg Pro Met Ser
35 40 45
Lys Gly Leu Leu Gln Asp Tyr Leu Lys Lys Glu Ile Gly Leu Pro Glu
50 55 60
Ser Asn His Ser Ser Leu Pro Cys Leu Ser Ser Asp Ser Gln Leu Pro
65 70 75 80
His Ile Asn Gly Ser Ala Ile Leu Pro Tyr Phe Arg Ala Ile Arg Pro
85 90 95
Leu Ser Asp Lys Asn Thr Ile Asp Lys Ile Ile Glu Gln Leu Asp Lys
100 105 110
Leu Lys Phe Gln Arg Glu Pro Glu Ala Lys Val Ser Met Ala Ala Ala
115 120 125
Asn Phe Glu Arg Lys Asn Phe Ile Leu Ala Val Leu Gln Gln Phe Ser
130 135 140
Ala Cys Leu Glu His Val Leu Gln Ser Leu Asn Ser Gly Pro Gln His
145 150 155 160
His His His His His
165
<210> 164
<211> 495
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 表示具有编码的C末端His标签的突变体猫IL-31 15H05基因的核苷酸序列
<400> 164
atgctctctc acgccggtcc tgcccggttc gcactgttcc tcctctgttg catggagact 60
ctgcttccct cccacatggc accggcccat agactgcagc cgtccgacat cagaaagatc 120
atccttgaat tgcgccctat gagcaagggg ctgctgcagg attacctgaa aaaggagatc 180
ggcctgccgg aatcgaacca cagctcactg ccatgcctgt cctccgactc gcaactgccc 240
cacatcaatg gatccgccat tctgccgtac ttccgcgcta ttcggcctct ctccgacaag 300
aacaccatcg acaagattat tgagcagctg gataagctga agttccagag ggagccagaa 360
gccaaggtgt ccatggccgc tgccaacttc gagcggaaga actttatcct cgcggtgctg 420
cagcagttct cagcgtgcct cgaacacgtc ttgcaaagcc tgaactcggg accccagcac 480
caccaccatc atcac 495
<210> 165
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 具有C末端His标签的马IL-31蛋白的氨基酸序列
<400> 165
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gly Pro Ile Tyr Gln Leu Gln Pro Lys Glu Ile Gln Ala
20 25 30
Ile Ile Val Glu Leu Gln Asn Leu Ser Lys Lys Leu Leu Asp Asp Tyr
35 40 45
Leu Asn Lys Glu Lys Gly Val Gln Lys Phe Asp Ser Asp Leu Pro Ser
50 55 60
Cys Phe Thr Ser Asp Ser Gln Ala Pro Gly Asn Ile Asn Ser Ser Ala
65 70 75 80
Ile Leu Pro Tyr Phe Lys Ala Ile Ser Pro Ser Leu Asn Asn Asp Lys
85 90 95
Ser Leu Tyr Ile Ile Glu Gln Leu Asp Lys Leu Asn Phe Gln Asn Ala
100 105 110
Pro Glu Thr Glu Val Ser Met Pro Thr Asp Asn Phe Glu Arg Lys Arg
115 120 125
Phe Ile Leu Thr Ile Leu Arg Trp Phe Ser Asn Cys Leu Glu His Arg
130 135 140
Ala Gln His His His His His His
145 150
<210> 166
<211> 456
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 具有编码的C末端His标签的马IL-31基因的核苷酸序列
<400> 166
atgggctggt cctgcatcat tctgtttctg gtggccacag ccaccggcgt gcactctgga 60
cctatctatc agctgcagcc caaagagatc caggccatca tcgtggaact gcagaacctg 120
agcaagaagc tgctggacga ctacctgaac aaagaaaagg gcgtgcagaa gttcgacagc 180
gacctgccta gctgcttcac cagcgattct caggcccctg gcaacatcaa cagcagcgcc 240
atcctgcctt acttcaaggc catctctccc agcctgaaca acgacaagag cctgtacatc 300
atcgagcagc tggacaagct gaacttccag aacgcccctg aaaccgaggt gtccatgcct 360
accgacaact tcgagcggaa gcggttcatc ctgaccatcc tgcggtggtt cagcaactgc 420
ctggaacaca gagcccagca ccaccaccat caccat 456
<210> 167
<211> 652
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 与人IgG1 Fc 融合的猫OSMR 的细胞外结构域的氨基酸序列
<400> 167
Met Ala Leu Phe Ser Ala Phe Gln Thr Thr Phe Leu Leu Ala Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Thr Tyr Gln Ser Glu Val Leu Ser Glu Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Ala Pro Glu Ser Leu Glu Val Ser Ile Asp Ser Ala Arg Gln Cys Leu
35 40 45
His Leu Lys Trp Ser Val His Asn Leu Ala Tyr His Gln Glu Leu Lys
50 55 60
Met Val Phe Gln Ile Glu Ile Ser Arg Ile Lys Thr Ser Asn Val Ile
65 70 75 80
Trp Val Glu Asn Tyr Ser Thr Thr Val Lys Arg Asn Gln Val Leu Arg
85 90 95
Trp Ser Trp Glu Ser Lys Leu Pro Leu Glu Cys Ala Lys His Ser Val
100 105 110
Arg Met Arg Gly Ala Val Asp Asp Ala Gln Val Pro Glu Leu Arg Phe
115 120 125
Trp Ser Asn Trp Thr Ser Trp Glu Glu Val Asp Val Gln Ser Ser Leu
130 135 140
Gly His Asp Pro Leu Phe Val Phe Pro Lys Asp Lys Leu Val Glu Glu
145 150 155 160
Gly Ser Asn Val Thr Ile Cys Tyr Val Ser Arg Ser His Gln Asn Asn
165 170 175
Ile Ser Cys Tyr Leu Glu Gly Val Arg Met His Gly Glu Gln Leu Asp
180 185 190
Pro Asn Val Cys Val Phe His Leu Lys Asn Val Pro Phe Ile Arg Glu
195 200 205
Thr Gly Thr Asn Ile Tyr Cys Lys Ala Asp Gln Gly Asp Val Ile Lys
210 215 220
Gly Ile Val Leu Phe Val Ser Lys Val Phe Glu Glu Pro Lys Asp Phe
225 230 235 240
Ser Cys Glu Thr Arg Asp Leu Lys Thr Leu Asn Cys Thr Trp Ala Pro
245 250 255
Gly Ser Asp Ala Gly Leu Leu Thr Gln Leu Ser Gln Ser Tyr Thr Leu
260 265 270
Phe Glu Ser Phe Ser Gly Lys Lys Thr Leu Cys Lys His Lys Ser Trp
275 280 285
Cys Asn Trp Gln Val Ser Pro Asp Ser Gln Glu Met Tyr Asn Phe Thr
290 295 300
Leu Thr Ala Glu Asn Tyr Leu Arg Lys Arg Ser Val His Leu Leu Phe
305 310 315 320
Asn Leu Thr His Arg Val His Pro Met Ala Pro Phe Asn Val Phe Val
325 330 335
Lys Asn Val Ser Ala Thr Asn Ala Thr Met Thr Trp Lys Val His Ser
340 345 350
Ile Gly Asn Tyr Ser Thr Leu Leu Cys Gln Ile Glu Leu Asp Gly Glu
355 360 365
Gly Lys Val Ile Gln Lys Gln Asn Val Ser Val Lys Val Asn Gly Lys
370 375 380
His Leu Met Lys Lys Leu Glu Pro Ser Thr Glu Tyr Ala Ala Gln Val
385 390 395 400
Arg Cys Ala Asn Ala Asn His Phe Trp Lys Trp Ser Glu Trp Thr Arg
405 410 415
Arg Asn Phe Thr Thr Ala Glu Ala Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
420 425 430
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
435 440 445
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
450 455 460
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
465 470 475 480
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
485 490 495
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
500 505 510
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
515 520 525
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
530 535 540
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
545 550 555 560
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
565 570 575
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
580 585 590
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
595 600 605
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
610 615 620
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
625 630 635 640
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
645 650
<210> 168
<211> 2076
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码与人IgG1 Fc 融合的猫OSMR 的细胞外结构域的核苷酸序列
<400> 168
atggccctgt tcagcgcctt ccagaccacc ttcctgctgg ccctgctgag cctgaaaacc 60
taccagagcg aggtgctgag cgagcccctg tctctggccc ctgagagcct ggaagtgtcc 120
atcgacagcg ccagacagtg cctgcacctg aagtggagcg tgcacaacct ggcctaccac 180
caggaactga agatggtgtt ccagatcgag atcagccgga tcaagaccag caacgtgatc 240
tgggtggaaa actacagcac caccgtgaag cggaaccagg tgctgcggtg gtcctgggag 300
tctaagctgc ctctggaatg cgccaagcac agcgtgcgga tgagaggcgc cgtggatgat 360
gcccaggtgc ccgagctgag attctggtcc aactggacct cctgggaaga ggtggacgtg 420
cagtctagcc tgggccacga ccccctgttc gtgttcccca aggacaagct ggtggaagag 480
ggctccaacg tgaccatctg ctacgtgtcc agaagccacc agaacaacat cagctgctac 540
ctggaaggcg tgcgcatgca cggcgagcag ctggacccta acgtgtgcgt gttccacctg 600
aagaacgtgc ccttcatcag agagacaggc accaacatct actgcaaggc cgaccagggc 660
gacgtgatca agggcatcgt gctgtttgtg tccaaggtgt tcgaggaacc caaggacttc 720
agctgcgaga cacgggatct gaaaaccctg aactgtacct gggcccctgg ctccgatgcc 780
ggactgctga ctcagctgtc ccagagctac accctgttcg agagcttcag cggcaaaaag 840
accctgtgca agcacaagag ctggtgcaac tggcaagtgt cccccgatag ccaggaaatg 900
tacaacttca ccctgaccgc cgagaactac ctgcggaaga gatccgtgca tctgctgttc 960
aacctgaccc acagagtgca ccccatggcc cccttcaacg tgttcgtgaa gaatgtgtcc 1020
gccaccaacg ccaccatgac atggaaggtg cacagcatcg gcaactactc caccctgctg 1080
tgtcagatcg agctggacgg cgagggcaaa gtgatccaga aacagaacgt gtcagtgaaa 1140
gtgaacggca agcacctgat gaagaagctg gaacccagca ccgagtacgc cgcccaggtg 1200
cgctgtgcca acgccaacca cttctggaag tggagtgaat ggacccggcg gaacttcacc 1260
acagccgaag ccgccgctga gaacgaggtg tccacaccta tgcaggccct gaccaccaac 1320
aaggacgacg acaacatcct gttccgggac tccgccaatg ccaccagcct gcctgtgcag 1380
gatagcagct ctgtgctgcc cgccaagccc gagaacatct cctgcgtgtt ctactacgag 1440
gaaaacttca cttgcacctg gtcccccgag aaagaggcca gctacacctg gtacaaagtg 1500
aagagaacct acagctacgg ctacaagagc gacatctgcc ccagcgacaa cagcaccaga 1560
ggcaaccaca ccttctgcag ctttctgccc cccaccatca ccaaccccga caactacacc 1620
atccaggtgg aagcccagaa cgccgacggc atcatcaagt ccgacatcac ccactggtcc 1680
ctggacgcca tcacaaagat cgagcccccc gagatcttct ccgtgaagcc tgtgctgggc 1740
gtgaagagga tggtgcagat caagtggatc cggcccgtgc tggccccagt gtctagcacc 1800
ctgaagtaca ccctgcggtt caagaccgtg aacagcgcct actggatgga agtgaatttc 1860
accaaagagg acatcgaccg ggacgagaca tacaatctga ccggactgca ggccttcaca 1920
gagtacgtgc tggctctgag atgcgccacc aaagaatcca tgttttggag cggctggtcc 1980
caggaaaaga tgggcaccac cgaagagggt aagcctatcc ctaaccctct cctcggtctc 2040
gattctacgc gtaccggtca tcatcaccat caccat 2076
<210> 169
<211> 474
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 与人IgG1 Fc 融合的猫IL-31-Ra 的氨基酸序列
<400> 169
Met Met Trp Pro Gln Val Trp Gly Leu Glu Ile Gln Phe Ser Pro Gln
1 5 10 15
Pro Ala Cys Ile Asp Leu Gly Met Met Trp Ala His Ala Leu Trp Thr
20 25 30
Leu Leu Leu Leu Cys Lys Phe Ser Leu Ala Val Leu Pro Ala Lys Pro
35 40 45
Glu Asn Ile Ser Cys Val Phe Tyr Tyr Glu Glu Asn Phe Thr Cys Thr
50 55 60
Trp Ser Pro Glu Lys Glu Ala Ser Tyr Thr Trp Tyr Lys Val Lys Arg
65 70 75 80
Thr Tyr Ser Tyr Gly Tyr Lys Ser Asp Ile Cys Pro Ser Asp Asn Ser
85 90 95
Thr Arg Gly Asn His Thr Phe Cys Ser Phe Leu Pro Pro Thr Ile Thr
100 105 110
Asn Pro Asp Asn Tyr Thr Ile Gln Val Glu Ala Gln Asn Ala Asp Gly
115 120 125
Ile Ile Lys Ser Asp Ile Thr His Trp Ser Leu Asp Ala Ile Thr Lys
130 135 140
Ile Glu Pro Pro Glu Ile Phe Ser Val Lys Pro Val Leu Gly Val Lys
145 150 155 160
Arg Met Val Gln Ile Lys Trp Ile Arg Pro Val Leu Ala Pro Val Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Lys Tyr Thr Leu Arg Phe Lys Thr Val Asn Ser Ala Tyr
180 185 190
Trp Met Glu Val Asn Phe Thr Lys Glu Asp Ile Asp Arg Asp Glu Thr
195 200 205
Tyr Asn Leu Thr Gly Leu Gln Ala Phe Thr Glu Tyr Val Leu Ala Leu
210 215 220
Arg Cys Ala Thr Lys Glu Ser Met Phe Trp Ser Gly Trp Ser Gln Glu
225 230 235 240
Lys Met Gly Thr Thr Glu Glu Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
245 250 255
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
260 265 270
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
275 280 285
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
290 295 300
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
305 310 315 320
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
325 330 335
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
340 345 350
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
355 360 365
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
370 375 380
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
385 390 395 400
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
420 425 430
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
435 440 445
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
450 455 460
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 170
<211> 1422
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码与人IgG1 Fc融合的猫IL-31 Ra的核苷酸序列
<400> 170
atgatgtggc cacaagtgtg gggcctggag atccagttca gcccccagcc tgcctgcatc 60
gatctgggca tgatgtgggc tcacgctctg tggaccctgc tgctgctgtg caagttttcc 120
ctggccgtgc tgcccgctaa gcctgagaac atcagctgcg tgttctacta tgaggagaac 180
ttcacctgta catggtcccc cgagaaggag gctagctata cctggtacaa ggtgaagaga 240
acatacagct atggctacaa gtctgatatc tgccccagcg acaactctac ccgcggcaat 300
cacacattct gttcttttct gccccctacc atcacaaacc ctgataatta taccatccag 360
gtggaggccc agaacgctga tggcatcatc aagtctgaca tcacccattg gtccctggac 420
gccatcacaa agatcgagcc acccgagatt ttctccgtga agcccgtgct gggcgtgaag 480
aggatggtgc agatcaagtg gatcaggcct gtgctggctc cagtgtccag caccctgaag 540
tatacactga gattcaagac cgtgaactcc gcttactgga tggaggtgaa cttcaccaag 600
gaggacatcg atagggacga gacctataat ctgacaggcc tgcaggcctt caccgagtac 660
gtgctggccc tgaggtgcgc tacaaaggag tccatgtttt ggtccggctg gagccaggag 720
aagatgggca ccacagagga ggataagacc cacacatgcc ctccatgtcc agctccagag 780
ctgctgggag gaccaagcgt gttcctgttt ccacctaagc ctaaggacac cctgatgatc 840
tctcgcaccc ctgaggtgac atgcgtggtg gtggacgtgt cccacgagga cccagaggtg 900
aagtttaact ggtatgtgga tggcgtggag gtgcataatg ccaagaccaa gcctagagag 960
gagcagtata acagcaccta ccgcgtggtg tctgtgctga cagtgctgca tcaggactgg 1020
ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtg agcaataagg ccctgcctgc tccaatcgag 1080
aagaccatct ctaaggctaa gggacagcca agggagccac aggtgtatac actgccaccc 1140
agccgggagg agatgaccaa gaaccaggtg tctctgacat gtctggtgaa gggcttctac 1200
ccatctgata tcgctgtgga gtgggagtcc aatggccagc ccgagaacaa ttataagacc 1260
acacctccag tgctggattc tgacggctcc ttctttctgt actccaagct gaccgtggac 1320
aagagcaggt ggcagcaggg caacgtgttt tcttgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1380
aatcattaca cacagaagag cctgtctctg tccccaggca ag 1422
<210> 171
<211> 335
<212> PRT
<213> 家猫(Felis catus)
<400> 171
Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly
1 5 10 15
Thr Thr Ser Gly Ala Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Leu Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ala Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Leu Ser Asp Thr
65 70 75 80
Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Arg Lys Thr Asp His Pro Pro Gly Pro Lys Pro Cys Asp Cys
100 105 110
Pro Lys Cys Pro Pro Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Ile Phe Ile
115 120 125
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu
130 135 140
Val Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asp Val Gln
145 150 155 160
Ile Thr Trp Phe Val Asp Asn Thr Gln Val Tyr Thr Ala Lys Thr Ser
165 170 175
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
180 185 190
Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys
195 200 205
Val Asn Ser Lys Ser Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
210 215 220
Ala Lys Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ala
225 230 235 240
Gln Glu Glu Leu Ser Arg Asn Lys Val Ser Val Thr Cys Leu Ile Lys
245 250 255
Ser Phe His Pro Pro Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile Thr Gly Gln
260 265 270
Pro Glu Pro Glu Asn Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ser
275 280 285
Asp Gly Thr Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Arg Ser His
290 295 300
Trp Gln Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val Ser His Glu Ala Leu
305 310 315 320
His Ser His His Thr Gln Lys Ser Leu Thr Gln Ser Pro Gly Lys
325 330 335
<210> 172
<211> 1005
<212> DNA
<213> 家猫(Felis catus)
<400> 172
gcctccacca cggccccatc ggtgttccca ctggccccca gctgcgggac cacatctggc 60
gccaccgtgg ccctggcctg cctggtgtta ggctacttcc ctgagccggt gaccgtgtcc 120
tggaactccg gcgccctgac cagcggtgtg cacaccttcc cggccgtcct gcaggcctcg 180
gggctgtact ctctcagcag catggtgaca gtgccctcca gcaggtggct cagtgacacc 240
ttcacctgca acgtggccca cccgcccagc aacaccaagg tggacaagac cgtgcgcaaa 300
acagaccacc caccgggacc caaaccctgc gactgtccca aatgcccacc ccctgagatg 360
cttggaggac cgtccatctt catcttcccc ccaaaaccca aggacaccct ctcgatttcc 420
cggacgcccg aggtcacatg cttggtggtg gacttgggcc cagatgactc cgatgtccag 480
atcacatggt ttgtggataa cacccaggtg tacacagcca agacgagtcc gcgtgaggag 540
cagttcaaca gcacctaccg tgtggtcagt gtcctcccca tcctacacca ggactggctc 600
aaggggaagg agttcaagtg caaggtcaac agcaaatccc tcccctcccc catcgagagg 660
accatctcca aggccaaagg acagccccac gagccccagg tgtacgtcct gcctccagcc 720
caggaggagc tcagcaggaa caaagtcagt gtgacctgcc tgatcaaatc cttccacccg 780
cctgacattg ccgtcgagtg ggagatcacc ggacagccgg agccagagaa caactaccgg 840
acgaccccgc cccagctgga cagcgacggg acctacttcg tgtacagcaa gctctcggtg 900
gacaggtccc actggcagag gggaaacacc tacacctgct cggtgtcaca cgaagctctg 960
cacagccacc acacacagaa atccctcacc cagtctccgg gtaaa 1005
<210> 173
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 以修饰工程化以调节抗体效应子功能的猫重链的氨基酸序列
<400> 173
Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly
1 5 10 15
Thr Thr Ser Gly Ala Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Leu Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ala Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Leu Ser Asp Thr
65 70 75 80
Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Arg Lys Thr Asp His Pro Pro Gly Pro Lys Pro Cys Asp Cys
100 105 110
Pro Lys Cys Pro Pro Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Ile Phe Ile
115 120 125
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu
130 135 140
Val Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asp Val Gln
145 150 155 160
Ile Thr Trp Phe Val Asp Asn Thr Gln Val Tyr Thr Ala Lys Thr Ser
165 170 175
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
180 185 190
Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys
195 200 205
Val Asn Ser Lys Ser Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
210 215 220
Ala Lys Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ala
225 230 235 240
Gln Glu Glu Leu Ser Arg Asn Lys Val Ser Val Thr Cys Leu Ile Lys
245 250 255
Ser Phe His Pro Pro Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile Thr Gly Gln
260 265 270
Pro Glu Pro Glu Asn Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ser
275 280 285
Asp Gly Thr Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Arg Ser His
290 295 300
Trp Gln Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val Ser His Glu Ala Leu
305 310 315 320
His Ser His His Thr Gln Lys Ser Leu Thr Gln Ser Pro Gly Lys
325 330 335
<210> 174
<211> 1005
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码以修饰工程化以调节抗体效应子功能的猫重链的核苷酸序列
<400> 174
gcctccacca cggccccatc ggtgttccca ctggccccca gctgcgggac cacatctggc 60
gccaccgtgg ccctggcctg cctggtgtta ggctacttcc ctgagccggt gaccgtgtcc 120
tggaactccg gcgccctgac cagcggtgtg cacaccttcc cggccgtcct gcaggcctcg 180
gggctgtact ctctcagcag catggtgaca gtgccctcca gcaggtggct cagtgacacc 240
ttcacctgca acgtggccca cccgcccagc aacaccaagg tggacaagac cgtgcgcaaa 300
acagaccacc caccgggacc caaaccctgc gactgtccca aatgcccacc ccctgaggcg 360
gctggagcac cgtccatctt catcttcccc ccaaaaccca aggacaccct ctcgatttcc 420
cggacgcccg aggtcacatg cttggtggtg gacttgggcc cagatgactc cgatgtccag 480
atcacatggt ttgtggataa cacccaggtg tacacagcca agacgagtcc gcgtgaggag 540
cagttcaaca gcacctaccg tgtggtcagt gtcctcccca tcctacacca ggactggctc 600
aaggggaagg agttcaagtg caaggtcaac agcaaatccc tcccctcccc catcgagagg 660
accatctcca aggccaaagg acagccccac gagccccagg tgtacgtcct gcctccagcc 720
caggaggagc tcagcaggaa caaagtcagt gtgacctgcc tgatcaaatc cttccacccg 780
cctgacattg ccgtcgagtg ggagatcacc ggacagccgg agccagagaa caactaccgg 840
acgaccccgc cccagctgga cagcgacggg acctacttcg tgtacagcaa gctctcggtg 900
gacaggtccc actggcagag gggaaacacc tacacctgct cggtgtcaca cgaagctctg 960
cacagccacc acacacagaa atccctcacc cagtctccgg gtaaa 1005
<210> 175
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 以在位置103处进行糖基化敲除(G-)来工程化的猫κ轻链的氨基酸序列
<400> 175
Arg Ser Asp Ala Gln Pro Ser Val Phe Leu Phe Gln Pro Ser Leu Asp
1 5 10 15
Glu Leu His Thr Gly Ser Ala Ser Ile Val Cys Ile Leu Asn Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Lys Glu Val Asn Val Lys Trp Lys Val Asp Gly Val Val Gln
35 40 45
Asn Lys Gly Ile Gln Glu Ser Thr Thr Glu Gln Asn Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Met Ser Ser Thr Glu Tyr Gln
65 70 75 80
Ser His Glu Lys Phe Ser Cys Glu Val Thr His Lys Ser Leu Ala Ser
85 90 95
Thr Leu Val Lys Ser Phe Gln Arg Ser Glu Cys Gln Arg Glu
100 105 110
<210> 176
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码以糖基化敲除(G-)工程化的猫κ轻链的核苷酸序列
<400> 176
cggagtgatg ctcagccatc tgtctttctc ttccaaccat ctctggacga gttacataca 60
ggaagtgcct ctatcgtgtg catattgaat gacttctacc ccaaagaggt caatgtcaag 120
tggaaagtgg atggcgtagt ccaaaacaaa ggcatccagg agagcaccac agagcagaac 180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacga tgtccagtac ggagtaccaa 240
agtcatgaaa agttctcctg cgaggtcact cacaagagcc tggcctccac cctcgtcaag 300
agcttccaga ggagcgagtg tcagagagag 330
<210> 177
<211> 335
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 177
Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr
65 70 75 80
Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys
100 105 110
Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile
115 120 125
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu
130 135 140
Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln
145 150 155 160
Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln
165 170 175
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
180 185 190
Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys
195 200 205
Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
210 215 220
Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser
225 230 235 240
Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys
245 250 255
Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln
260 265 270
Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu
275 280 285
Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg
290 295 300
Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu
305 310 315 320
His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
325 330 335
<210> 178
<211> 1005
<212> DNA
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 178
gcctcaacaa ctgctcctag cgtgtttccc ctggccccta gctgcggaag tacctcaggc 60
agcacagtgg ccctggcttg tctggtgtct ggatatttcc ctgagccagt gaccgtgagt 120
tggaacagcg gctctctgac ctccggggtg cacacatttc catctgtgct gcagtctagt 180
ggcctgtact ccctgtcaag catggtgact gtgccttcct ctaggtggcc atcagaaact 240
ttcacctgca acgtggccca tcccgccagc aagaccaaag tggacaagcc cgtgcctaaa 300
agggagaatg gaagggtgcc aagaccacct gattgcccta agtgtccagc tccagaagcg 360
gcgggagcac caagcgtgtt catctttcca cccaagccca aagacacact gctgattgct 420
agaactcccg aggtgacctg cgtggtggtg gacctggatc cagaggaccc cgaagtgcag 480
atctcctggt tcgtggatgg gaagcagatg cagacagcca aaactcagcc tcgggaggaa 540
cagtttaacg gaacctatag agtggtgtct gtgctgccaa ttggacacca ggactggctg 600
aagggcaaac agtttacatg caaggtgaac aacaaggccc tgcctagtcc aatcgagagg 660
actatttcaa aagctagggg acaggctcat cagccttccg tgtatgtgct gcctccatcc 720
cgggaggaac tgtctaagaa cacagtgagt ctgacttgtc tgatcaaaga tttctttccc 780
cctgacattg atgtggagtg gcagagcaat gggcagcagg agccagaatc caagtacaga 840
accacaccac cccagctgga cgaagatggc tcctatttcc tgtacagtaa gctgtcagtg 900
gacaaatcta ggtggcagcg cggggatacc tttatctgcg ccgtgatgca cgaggctctg 960
cacaatcatt acacacaaga aagtctgtca catagccccg gcaag 1005
<210> 179
<211> 106
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 179
Arg Asn Asp Ala Gln Pro Ala Val Tyr Leu Phe Gln Pro Ser Pro Asp
1 5 10 15
Gln Leu His Thr Gly Ser Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Ser Phe
20 25 30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Val Asp Gly Val Ile Gln
35 40 45
Asp Thr Gly Ile Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Met Ser Ser Thr Glu Tyr Leu Ser
65 70 75 80
His Glu Leu Tyr Ser Cys Glu Ile Thr His Lys Ser Leu Pro Ser Thr
85 90 95
Leu Ile Lys Ser Phe Gln Arg Ser Glu Cys
100 105
<210> 180
<211> 318
<212> DNA
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 180
aggaacgacg cccagcctgc tgtgtatctg tttcagccct cccctgatca gctgcacact 60
ggctctgcta gtgtggtgtg tctgctgaac agcttctacc caaaggatat caatgtgaag 120
tggaaagtgg acggcgtgat ccaggatact gggattcagg agtccgtgac cgaacaggac 180
aaagattcaa catatagcct gagctccact ctgaccatgt ctagtaccga gtacctgagc 240
cacgaactgt attcctgcga gatcactcat aagtccctgc cctctaccct gatcaagagc 300
ttccagagat cagagtgt 318
<210> 181
<211> 164
<212> PRT
<213> 智人(Felis catus)
<400> 181
Met Ala Ser His Ser Gly Pro Ser Thr Ser Val Leu Phe Leu Phe Cys
1 5 10 15
Cys Leu Gly Gly Trp Leu Ala Ser His Thr Leu Pro Val Arg Leu Leu
20 25 30
Arg Pro Ser Asp Asp Val Gln Lys Ile Val Glu Glu Leu Gln Ser Leu
35 40 45
Ser Lys Met Leu Leu Lys Asp Val Glu Glu Glu Lys Gly Val Leu Val
50 55 60
Ser Gln Asn Tyr Thr Leu Pro Cys Leu Ser Pro Asp Ala Gln Pro Pro
65 70 75 80
Asn Asn Ile His Ser Pro Ala Ile Arg Ala Tyr Leu Lys Thr Ile Arg
85 90 95
Gln Leu Asp Asn Lys Ser Val Ile Asp Glu Ile Ile Glu His Leu Asp
100 105 110
Lys Leu Ile Phe Gln Asp Ala Pro Glu Thr Asn Ile Ser Val Pro Thr
115 120 125
Asp Thr His Glu Cys Lys Arg Phe Ile Leu Thr Ile Ser Gln Gln Phe
130 135 140
Ser Glu Cys Met Asp Leu Ala Leu Lys Ser Leu Thr Ser Gly Ala Gln
145 150 155 160
Gln Ala Thr Thr
<210> 182
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自小家鼠和家犬的犬源化可变轻链mAb 序列
<400> 182
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
35 40 45
Gln Arg Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser
65 70 75 80
Arg Val Glu Ala Asp Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Lys Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 183
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码来自小家鼠和家犬的犬源化可变轻链mAb 序列的核苷酸序列
<400> 183
gacatcgtga tgacccagac ccccctgagc ctgagcgtgt cccctggcga gcctgccagc 60
atcagctgca gagccagcga gagcgtggac aactacggca tcagcttcat gcactggttc 120
cagcagaagc ccggccagag cccccagcgg ctgatctaca gagccagcaa cctggaaagc 180
ggcgtgcccg atcggtttag cggctctggc agcggcaccg acttcaccct gcggatctct 240
cgggtggaag ccgatgacgc cggagtgtac tactgccagc agagcaacaa ggaccccctg 300
acctttggcg ccggtaccaa gctggagatc aag 333
<210> 184
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自小家鼠和家犬的犬源化可变轻链mAb 序列
<400> 184
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser
65 70 75 80
Arg Val Glu Ala Asp Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Lys Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 185
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码来自小家鼠和家犬的犬源化可变轻链mAb 序列的核苷酸序列
<400> 185
gatatagtga tgacacaaac tcctctcagt ctttccgtat caccgggaga accggcttcc 60
atttcctgtc gggcctcaga gtctgtggac aactacggga tatccttcat gcactggtat 120
cagcagaaac ccggccagcc ccctaaactc cttatttaca gggccagtaa tctggaaagc 180
ggtgtgcccg atcgatttag cggttccggg agcggcacag atttcaccct gcgaatctct 240
agagttgaag cggatgatgc aggagtatat tactgccagc aatccaataa ggatcccctt 300
acattcggcg cgggtaccaa gctggagatc aag 333
<210> 186
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 犬IL-31 15H05模拟表位序列
<400> 186
Ser Val Pro Ala Asp Thr Phe Glu Cys Lys Ser Phe
1 5 10
<210> 187
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 犬IL-31 15H05模拟表位序列
<400> 187
Ser Val Pro Ala Asp Thr Phe Glu Arg Lys Ser Phe
1 5 10
<210> 188
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 猫IL-31 15H05模拟表位序列
<400> 188
Ser Met Pro Ala Asp Asn Phe Glu Arg Lys Asn Phe
1 5 10
<210> 189
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 马IL-31 15H05模拟表位序列
<400> 189
Ser Met Pro Thr Asp Asn Phe Glu Arg Lys Arg Phe
1 5 10
<210> 190
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人IL-31 15H05模拟表位序列
<400> 190
Ser Val Pro Thr Asp Thr His Glu Cys Lys Arg Phe
1 5 10
<210> 191
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人IL-31 15H05模拟表位序列
<400> 191
Ser Val Pro Thr Asp Thr His Glu Arg Lys Arg Phe
1 5 10
<210> 192
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 犬IL-31螺旋BC区域模拟表位序列
<400> 192
Asn Ser Ser Ala Ile Leu Pro Tyr Phe Arg Ala Ile Arg Pro Leu Ser
1 5 10 15
Asp Lys Asn Ile Ile Asp Lys Ile Ile Glu Gln Leu Asp Lys Leu Lys
20 25 30
Phe
<210> 193
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 猫IL-31螺旋BC区域模拟表位序列
<400> 193
Asn Gly Ser Ala Ile Leu Pro Tyr Phe Arg Ala Ile Arg Pro Leu Ser
1 5 10 15
Asp Lys Asn Thr Ile Asp Lys Ile Ile Glu Gln Leu Asp Lys Leu Lys
20 25 30
Phe
<210> 194
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 马IL-31螺旋BC区域模拟表位序列
<400> 194
Asn Ser Ser Ala Ile Leu Pro Tyr Phe Lys Ala Ile Ser Pro Ser Leu
1 5 10 15
Asn Asn Asp Lys Ser Leu Tyr Ile Ile Glu Gln Leu Asp Lys Leu Asn
20 25 30
Phe
<210> 195
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人IL-31螺旋BC区域模拟表位序列
<400> 195
His Ser Pro Ala Ile Arg Ala Tyr Leu Lys Thr Ile Arg Gln Leu Asp
1 5 10 15
Asn Lys Ser Val Ile Asp Glu Ile Ile Glu His Leu Asp Lys Leu Ile
20 25 30
Phe
<210> 196
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 犬IL-31螺旋A区域模拟表位序列
<400> 196
Ala Pro Thr His Gln Leu Pro Pro Ser Asp Val Arg Lys Ile Ile Leu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Pro Leu Ser Arg Gly
20
<210> 197
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 猫IL-31螺旋A区域模拟表位序列
<400> 197
Ala Pro Ala His Arg Leu Gln Pro Ser Asp Ile Arg Lys Ile Ile Leu
1 5 10 15
Glu Leu Arg Pro Met Ser Lys Gly
20
<210> 198
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 马IL-31螺旋A区域模拟表位序列
<400> 198
Gly Pro Ile Tyr Gln Leu Gln Pro Lys Glu Ile Gln Ala Ile Ile Val
1 5 10 15
Glu Leu Gln Asn Leu Ser Lys Lys
20
<210> 199
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人IL-31螺旋A区域模拟表位序列
<400> 199
Leu Pro Val Arg Leu Leu Arg Pro Ser Asp Asp Val Gln Lys Ile Val
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ser Leu Ser Lys Met
20 25
<210> 200
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 犬IL-31 AB环区域模拟表位序列
<400> 200
Thr Gly Val Pro Glu Ser
1 5
<210> 201
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 猫IL-31 AB环区域模拟表位序列
<400> 201
Ile Gly Leu Pro Glu Ser
1 5
<210> 202
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 马IL-31 AB环区域模拟表位序列
<400> 202
Lys Gly Val Gln Lys Phe
1 5
<210> 203
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人IL-31 AB环区域模拟表位序列
<400> 203
Lys Gly Val Leu Val Ser
1 5

Claims (40)

1.一种用于免疫和/或保护哺乳动物使其免于IL-31介导的病症的疫苗组合物，其中所述组合物包含：
载体多肽与至少一种选自由猫IL-31模拟表位、犬IL-31模拟表位、马IL-31模拟表位和人IL-31模拟表位组成的组的模拟表位的组合；以及
佐剂。
2.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述犬IL-31模拟表位为氨基酸序列SVPADTFECKSF(SEQ ID NO：186)、SVPADTFERKSF(SEQ ID NO：187)、NSSAILPYFRAIRPLSDKNIIDKIIEQLDKLKF(SEQ ID NO：192)、APTHQLPPSDVRKIILELQPLSRG(SEQ ID NO：196)、TGVPES(SEQ ID NO：200)或其保留抗IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
3.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述猫IL-31模拟表位为氨基酸序列SMPADNFERKNF(SEQ ID NO：188)、NGSAILPYFRAIRPLSDKNTIDKIIEQLDKLKF(SEQ ID NO：193)、APAHRLQPSDIRKIILELRPM SKG(SEQ ID NO：197)、IGLPES(SEQ ID NO：201)或其保留抗IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
4.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述马IL-31模拟表位为氨基酸序列SMPTDNFERKRF(SEQ ID NO：189)、NSSAILPYFKAISPSLNNDKSLYIIEQLDKLNF(SEQ ID NO：194)、GPIYQLQPKEIQAIIVELQNLS KK(SEQ ID NO：198)、KGVQKF(SEQ ID NO：202)或其保留抗IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
5.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述人IL-31模拟表位为氨基酸序列SVPTDTHECKRF(SEQ ID NO：190)、SVPTDTHERKRF(SEQ ID NO：191)、HSPAIRAYLKTIRQLDNKSVIDEIIEHLDKLIF(SEQ ID NO：195)、LPVRLLRPSDDVQKIVEELQSLSKM(SEQ ID NO：199)、KGVLVS(SEQ ID NO：203)或其保留抗IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
6.如权利要求1-5中任一项所述的疫苗组合物，其中所述模拟表位结合至抗IL31抗体或其抗原结合部分，所述抗IL31抗体或其抗原结合部分特异性结合至哺乳动物IL-31蛋白上涉及所述IL-31蛋白与其共受体的相互作用的区域。
7.如权利要求6所述的疫苗组合物，其中所述抗体与所述区域的结合受到选自由以下组成的组的15H05表位结合区域中的突变的影响：
a)由SEQ ID NO：157(猫_IL31_野生型)表示的猫IL-31序列的约氨基酸残基124与135之间的区域；
b)由SEQ ID NO：155(犬_IL31)表示的犬IL-31序列的约氨基酸残基124与135之间的区域；以及
c)由SEQ ID NO：165(马_IL31)表示的马IL-31序列的约氨基酸残基118与129之间的区域。
8.如权利要求6所述的疫苗组合物，其中所述模拟表位结合至抗IL-31抗体或其抗原结合部分，所述抗IL-31抗体或其抗原结合部分包含以下互补决定区(CDR)序列的组合中的至少一种：
1)抗体15H05：SYTIH(SEQ ID NO：1)的可变重链(VH)-CDR1、NINPTSGYTENNQRFKD(SEQID NO：2)的VH-CDR2、WGFKYDGEWSFDV(SEQ ID NO：3)的VH-CDR3、RASQGISIWLS(SEQ ID NO：4)的可变轻链(VL)-CDR1、KASNLHI(SEQ ID NO：5)的VL-CDR2和LQSQTYPLT(SEQ ID NO：6)的VL-CDR3；
2)抗体ZIL1：SYGMS(SEQ ID NO：13)的可变重链(VH)-CDR1、HINSGGSSTYYADAVKG(SEQID NO：14)的VH-CDR2、VYTTLAAFWTDNFDY(SEQ ID NO：15)的VH-CDR3、SGSTNNIGILAAT(SEQID NO：16)的可变轻链(VL)-CDR1、SDGNRPS(SEQ ID NO：17)的VL-CDR2和QSFDTTLDAYV(SEQID NO：18)的VL-CDR3；
3)抗体ZIL8：DYAMS(SEQ ID NO：19)的VH-CDR1、GIDSVGSGTSYADAVKG(SEQ ID NO：20)的VH-CDR2、GFPGSFEH(SEQ ID NO：21)的VH-CDR3、TGSSSNIGSGYVG(SEQ ID NO：22)的VL-CDR1、YNSDRPS(SEQ ID NO：23)的VL-CDR2、SVYDRTFNAV(SEQ ID NO：24)的VL-CDR3；
4)抗体ZIL9：SYDMT(SEQ ID NO：25)的VH-CDR1、DVNSGGTGTAYAVAVKG(SEQ ID NO：26)的VH-CDR2、LGVRDGLSV(SEQ ID NO：27)的VH-CDR3、SGESLNEYYTQ(SEQ ID NO：28)的VL-CDR1、RDTERPS(SEQ ID NO：29)的VL-CDR2、ESAVDTGTLV(SEQ ID NO：30)的VL-CDR3；
5)抗体ZIL11：TYVMN(SEQ ID NO：31)的VH-CDR1、SINGGGSSPTYADAVRG(SEQ ID NO：32)的VH-CDR2、SMVGPFDY(SEQ ID NO：33)的VH-CDR3、SGESLSNYYAQ(SEQ ID NO：34)的VL-CDR1、KDTERPS(SEQ ID NO：35)的VL-CDR2、ESAVSSDTIV(SEQ ID NO：36)的VL-CDR3；
6)抗体ZIL69：SYAMK(SEQ ID NO：37)的VH-CDR1、TINNDGTRTGYADAVRG(SEQ ID NO：38)的VH-CDR2、GNAESGCTGDHCPPY(SEQ ID NO：39)的VH-CDR3、SGESLNKYYAQ(SEQ ID NO：40)的VL-CDR1、KDTERPS(SEQ ID NO：41)的VL-CDR2、ESAVSSETNV(SEQ ID NO：42)的VL-CDR3；
7)抗体ZIL94：TYFMS(SEQ ID NO：43)的VH-CDR1、LISSDGSGTYYADAVKG(SEQ ID NO：44)的VH-CDR2、FWRAFND(SEQ ID NO：45)的VH-CDR3、GLNSGSVSTSNYPG(SEQ ID NO：46)的VL-CDR1、DTGSRPS(SEQ ID NO：47)的VL-CDR2、SLYTDSDILV(SEQ ID NO：48)的VL-CDR3；
8)抗体ZIL154：DRGMS(SEQ ID NO：49)的VH-CDRl、YIRYDGSRTDYADAVEG(SEQ ID NO：50)的VH-CDR2、WDGSSFDY(SEQ ID NO：51)的VH-CDR3、KASQSLLHSDGNTYLD(SEQ ID NO：52)的VL-CDR1、KVSNRDP(SEQ ID NO：53)的VL-CDR2、MQAIHFPLT(SEQ ID NO：54)的VL-CDR3；
9)抗体ZIL159：SYVMT(SEQ ID NO：55)的VH-CDR1、GINSEGSRTAYADAVKG(SEQ ID NO：56)的VH-CDR2、GDIVATGTSY(SEQ ID NO：57)的VH-CDR3、SGETLNRFYTQ(SEQ ID NO：58)的VL-CDR1、KDTERPS(SEQ ID NO：59)的VL-CDR2、KSAVSIDVGV(SEQ ID NO：60)的VL-CDR3；
10)抗体ZIL171：TYVMN(SEQ ID NO：61)的VH-CDR1、SINGGGSSPTYADAVRG(SEQ ID NO：62)的VH-CDR2、SMVGPFDY(SEQ ID NO：63)的VH-CDR3、SGKSLSYYYAQ(SEQ ID NO：64)的VL-CDR1、KDTERPS(SEQ ID NO：65)的VL-CDR2、ESAVSSDTIV(SEQ ID NO：66)的VL-CDR3；或者
11)1)至10)的变体，其与相应亲本抗体15H05、ZIL1、ZIL8、ZIL9、ZIL11、ZIL69、ZIL94、ZIL154、ZIL159或ZIL171的不同之处在于在VH或VL CDR1、CDR2或CDR3的至少一个中添加、缺失和/或取代一个或多个氨基酸残基。
9.如权利要求1-8中任一项所述的疫苗组合物，其中所述模拟表位是限制性模拟表位。
10.如权利要求9所述的疫苗组合物，其中所述限制性模拟表位是化学连接的环状肽。
11.如权利要求1-10中任一项所述的疫苗组合物，其中所述模拟表位化学缀合至所述载体多肽。
12.如权利要求1-10中任一项所述的疫苗组合物，其中所述载体多肽和所述模拟表位是重组融合蛋白的一部分。
13.如权利要求1-12中任一项所述的疫苗组合物，其中所述载体多肽包含细菌类毒素或其衍生物、钥孔血蓝蛋白(KLH)或病毒样颗粒。
14.如权利要求13所述的疫苗组合物，其中所述细菌类毒素或衍生物是破伤风类毒素、白喉类毒素、破伤风类毒素、脑膜炎双球菌B组的外膜蛋白复合物、假单胞菌外毒素或白喉毒素无毒突变体(CRM197)。
15.如权利要求13所述的疫苗组合物，其中所述病毒样颗粒是HBsAg、HBcAg、大肠杆菌噬菌体Qβ、诺沃克病毒、犬瘟热病毒(CDV)或流感HA。
16.如权利要求14所述的疫苗组合物，其中所述载体多肽包含CRM197或由其组成。
17.如权利要求1-16中任一项所述的疫苗组合物，其中所述佐剂选自由水包油佐剂、聚合物和水佐剂、油包水佐剂、氢氧化铝佐剂、维生素E佐剂及其组合组成的组。
18.如权利要求1-17中任一项所述的疫苗组合物，其中所述佐剂是包含皂苷、固醇、季铵化合物和聚合物的制剂。
19.如权利要求18所述的疫苗组合物，其中所述皂苷为Quil A或其纯化级分，所述固醇为胆固醇，所述季铵化合物为二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)，并且所述聚合物为聚丙烯酸。
20.如权利要求1-17中任一项所述的疫苗组合物，其中所述佐剂包含一种或多种分离的免疫刺激性寡核苷酸、固醇和皂苷的组合。
21.如权利要求20所述的疫苗组合物，其中所述一种或多种分离的免疫刺激性寡核苷酸包括CpG，所述固醇为胆固醇，并且所述皂苷为QuilA或其纯化级分。
22.一种保护哺乳动物使其免于IL-31介导的病症的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用如权利要求1-21中任一项所述的疫苗组合物。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述哺乳动物选自由狗、猫、马和人组成的组。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述疫苗组合物中所含有的所述IL-31模拟表位以每剂量约10μg至约100μg向所述哺乳动物施用。
25.一种确定样品中抗IL-31抗体的身份和/或量的方法，所述方法包括
将包含抗IL-31抗体的样品与至少一种选自由猫IL-31模拟表位、犬IL-31模拟表位、马IL-31模拟表位和人IL-31模拟表位组成的组的模拟表位一起孵育；以及
确定所述样品中所述抗IL-31的身份和/或数量。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述犬IL-31模拟表位为氨基酸序列SVPADTFECKSF(SEQ ID NO：186)、SVPADTFERKSF(SEQ ID NO：187)、NSSAILPYFRAIRPLSDKNIIDKIIEQLDKLKF(SEQ ID NO：192)、APTHQLPPSDVRKIILELQPLSRG(SEQ ID NO：196)、TGVPES(SEQ ID NO：200)或其保留抗IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
27.如权利要求25所述的方法，其中所述猫IL-31模拟表位为氨基酸序列SMPADNFERKNF(SEQ ID NO：188)、NGSAILPYFRAIRPLSDKNTIDKIIEQLDKLKF(SEQ ID NO：193)、APAHRLQPSDIRKIILELRPM SKG(SEQ ID NO：197)、IGLPES(SEQ ID NO：201)或其保留抗IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
28.如权利要求25所述的方法，其中所述马IL-31模拟表位为氨基酸序列
SMPTDNFERKRF(SEQ ID NO：189)、NSSAILPYFKAISPSLNNDKSLYIIEQLDKLNF(SEQ ID NO：194)、GPIYQLQPKEIQAIIVELQNLS KK(SEQ ID NO：198)、KGVQKF(SEQ ID NO：202)或其保留抗IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
29.如权利要求25所述的方法，其中所述人IL-31模拟表位为氨基酸序列SVPTDTHECKRF(SEQ ID NO：190)、SVPTDTHERKRF(SEQ ID NO：191)、HSPAIRAYLKTIRQLDNKSVIDEIIEHLDKLIF(SEQ ID NO：195)、LPVRLLRPSDDVQKIVEELQSLSKM(SEQ ID NO：199)、KGVLVS(SEQ ID NO：203)或其保留抗IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
30.如权利要求25-29中任一项所述的方法，其中所述模拟表位是结合至固体表面的捕获试剂。
31.如权利要求30所述的方法，其中将所述样品添加到所述模拟表位捕获试剂中；并且然后添加第二检测试剂以对所述样品中所述抗体的量进行定量。
32.一种用于确定来自哺乳动物的样品中IL-31的量的方法，所述方法包括：
将包含IL-31的哺乳动物样品与拴系至固体表面的标记的抗IL-31抗体：IL-31模拟表位复合物一起孵育，其中所述复合物中的所述模拟表位选自由猫IL-31模拟表位、犬IL-31模拟表位、马IL-31模拟表位和人IL-31模拟表位组成的组；以及
确定所述样品中所述IL-31的水平，其中所述复合物中所述标记的抗IL-31抗体对所述复合物中的所述模拟表位的亲和力低于其对所述样品中的所述IL-31的亲和力。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述确定步骤包括测量当所述样品中的所述IL-31结合至所述复合物的所述标记的抗IL-3抗体时从所述固体表面释放的标记的抗体的信号，所述样品中的IL-31水平与所述信号成反比。
34.如权利要求32或权利要求33所述的方法，其中所述犬IL-31模拟表位为氨基酸序列SVPADTFECKSF(SEQ ID NO：186)、SVPADTFERKSF(SEQ ID NO：187)、NSSAILPYFRAIRPLSDKNIIDKIIEQLDKLKF(SEQ ID NO：192)、APTHQLPPSDVRKIILELQPLSRG(SEQ ID NO：196)、TGVPES(SEQ ID NO：200)或其保留抗IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
35.如权利要求32或权利要求33所述的方法，其中所述猫IL-31模拟表位为氨基酸序列SMPADNFERKNF(SEQ ID NO：188)、NGSAILPYFRAIRPLSDKNTIDKIIEQLDKLKF(SEQ ID NO：193)、APAHRLQPSDIRKIILELRPM SKG(SEQ ID NO：197)、IGLPES(SEQ ID NO：201)或其保留抗IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
36.如权利要求32或权利要求33所述的方法，其中所述马IL-31模拟表位为氨基酸序列SMPTDNFERKRF(SEQ ID NO：189)、NSSAILPYFKAISPSLNNDKSLYIIEQLDKLNF(SEQ ID NO：194)、GPIYQLQPKEIQAIIVELQNLS KK(SEQ ID NO：198)、KGVQKF(SEQ ID NO：202)或其保留抗IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
37.如权利要求32或权利要求33所述的方法，其中所述人IL-31模拟表位为氨基酸序列SVPTDTHECKRF(SEQ ID NO：190)、SVPTDTHERKRF(SEQ ID NO：191)、HSPAIRAYLKTIRQLDNKSVIDEIIEHLDKLIF(SEQ ID NO：195)、LPVRLLRPSDDVQKIVEELQSLSKM(SEQ ID NO：199)、KGVLVS(SEQ ID NO：203)或其保留抗IL-31结合的变体，和/或包含作为其一部分的所述氨基酸序列或变体。
38.如权利要求25-37中任一项所述的方法，其中所述模拟表位结合至抗IL31抗体或其抗原结合部分，所述抗IL31抗体或其抗原结合部分特异性结合至哺乳动物IL-31蛋白上涉及所述IL-31蛋白与其共受体的相互作用的区域。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述抗体与所述区域的结合受到选自由以下组成的组的15H05表位结合区域中的突变影响：
a)由SEQ ID NO：157(猫_IL31_野生型)表示的猫IL-31序列的约氨基酸残基124与135之间的区域；
b)由SEQ ID NO：155(犬_IL31)表示的犬IL-31序列的约氨基酸残基124与135之间的区域；以及
c)由SEQ ID NO：165(马_IL31)表示的马IL-31序列的约氨基酸残基118与129之间的区域。
40.如权利要求38所述的方法，其中所述模拟表位结合至抗IL-31抗体或其抗原结合部分，所述抗IL-31抗体或其抗原结合部分包含以下互补决定区(CDR)序列的组合中的至少一种：
1)抗体15H05：SYTIH(SEQ ID NO：1)的可变重链(VH)-CDR1、NINPTSGYTENNQRFKD(SEQID NO：2)的VH-CDR2、WGFKYDGEWSFDV(SEQ ID NO：3)的VH-CDR3、RASQGISIWLS(SEQ ID NO：4)的可变轻链(VL)-CDR1、KASNLHI(SEQ ID NO：5)的VL-CDR2和LQSQTYPLT(SEQ ID NO：6)的VL-CDR3；
2)抗体ZIL1：SYGMS(SEQ ID NO：13)的可变重链(VH)-CDR1、HINSGGSSTYYADAVKG(SEQID NO：14)的VH-CDR2、VYTTLAAFWTDNFDY(SEQ ID NO：15)的VH-CDR3、SGSTNNIGILAAT(SEQID NO：16)的可变轻链(VL)-CDR1、SDGNRPS(SEQ ID NO：17)的VL-CDR2和QSFDTTLDAYV(SEQID NO：18)的VL-CDR3；
3)抗体ZIL8：DYAMS(SEQ ID NO：19)的VH-CDR1、GIDSVGSGTSYADAVKG(SEQ ID NO：20)的VH-CDR2、GFPGSFEH(SEQ ID NO：21)的VH-CDR3、TGSSSNIGSGYVG(SEQ ID NO：22)的VL-CDR1、YNSDRPS(SEQ ID NO：23)的VL-CDR2、SVYDRTFNAV(SEQ ID NO：24)的VL-CDR3；
4)抗体ZIL9：SYDMT(SEQ ID NO：25)的VH-CDR1、DVNSGGTGTAYAVAVKG(SEQ ID NO：26)的VH-CDR2、LGVRDGLSV(SEQ ID NO：27)的VH-CDR3、SGESLNEYYTQ(SEQ ID NO：28)的VL-CDR1、RDTERPS(SEQ ID NO：29)的VL-CDR2、ESAVDTGTLV(SEQ ID NO：30)的VL-CDR3；
5)抗体ZIL11：TYVMN(SEQ ID NO：31)的VH-CDR1、SINGGGSSPTYADAVRG(SEQ ID NO：32)的VH-CDR2、SMVGPFDY(SEQ ID NO：33)的VH-CDR3、SGESLSNYYAQ(SEQ ID NO：34)的VL-CDR1、KDTERPS(SEQ ID NO：35)的VL-CDR2、ESAVSSDTIV(SEQ ID NO：36)的VL-CDR3；
6)抗体ZIL69：SYAMK(SEQ ID NO：37)的VH-CDR1、TINNDGTRTGYADAVRG(SEQ ID NO：38)的VH-CDR2、GNAESGCTGDHCPPY(SEQ ID NO：39)的VH-CDR3、SGESLNKYYAQ(SEQ ID NO：40)的VL-CDR1、KDTERPS(SEQ ID NO：41)的VL-CDR2、ESAVSSETNV(SEQ ID NO：42)的VL-CDR3；
7)抗体ZIL94：TYFMS(SEQ ID NO：43)的VH-CDR1、LISSDGSGTYYADAVKG(SEQ ID NO：44)的VH-CDR2、FWRAFND(SEQ ID NO：45)的VH-CDR3、GLNSGSVSTSNYPG(SEQ ID NO：46)的VL-CDR1、DTGSRPS(SEQ ID NO：47)的VL-CDR2、SLYTDSDILV(SEQ ID NO：48)的VL-CDR3；
8)抗体ZIL154：DRGMS(SEQ ID NO：49)的VH-CDR1、YIRYDGSRTDYADAVEG(SEQ ID NO：50)的VH-CDR2、WDGSSFDY(SEQ ID NO：51)的VH-CDR3、KASQSLLHSDGNTYLD(SEQ ID NO：52)的VL-CDR1、KVSNRDP(SEQ ID NO：53)的VL-CDR2、MQAIHFPLT(SEQ ID NO：54)的VL-CDR3；
9)抗体ZIL159：SYVMT(SEQ ID NO：55)的VH-CDR1、GINSEGSRTAYADAVKG(SEQ ID NO：56)的VH-CDR2、GDIVATGTSY(SEQ ID NO：57)的VH-CDR3、SGETLNRFYTQ(SEQ ID NO：58)的VL-CDR1、KDTERPS(SEQ ID NO：59)的VL-CDR2、KSAVSIDVGV(SEQ ID NO：60)的VL-CDR3；
10)抗体ZIL171：TYVMN(SEQ ID NO：61)的VH-CDR1、SINGGGSSPTYADAVRG(SEQ ID NO：62)的VH-CDR2、SMVGPFDY(SEQ ID NO：63)的VH-CDR3、SGKSLSYYYAQ(SEQ ID NO：64)的VL-CDR1、KDTERPS(SEQ ID NO：65)的VL-CDR2、ESAVSSDTIV(SEQ ID NO：66)的VL-CDR3；或者
11)1)至10)的变体，其与相应亲本抗体15H05、ZIL1、ZIL8、ZIL9、ZIL11、ZIL69、ZIL94、ZIL154、ZIL159或ZIL171的不同之处在于在VH或VL CDR1、CDR2或CDR3的至少一个中添加、缺失和/或取代一个或多个氨基酸残基。
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