DE102019114735A1

DE102019114735A1 - HLA-Tumorantigenpeptiden der Klasse I und II zur Behandlung von Mamma-/Brustkarzinomen

Info

Publication number: DE102019114735A1
Application number: DE102019114735.2A
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Schönharting; Sybille Urban
Original assignee: Pmcr GmbH
Current assignee: Pmcr GmbH
Priority date: 2019-06-02
Filing date: 2019-06-02
Publication date: 2020-12-03
Also published as: CA3140204A1; CN114222583A; EP3976081A1; WO2020245126A1; US20220313804A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung oder zur Profilaxe von Mamma-/Brustkarzinomen, insbesondere lokal wiederkehrenden oder metastasierenden Mammakarzinomen bei einem Patienten oder einer Patientengruppe, der/die an einem Mamma-/Brustkarzinom erkrankt ist oder im Verdacht steht, an einem Mamma-/Brustkarzinom zu erkranken, umfassend zumindest 4 bis 8 HLA-A Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und zumindest 2 Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-II-Komplexe, wobei die HLA Tumorantigenpeptide tumorexklusive oder tumorassoziierte HLA Antigenpeptide sind und gegen zumindest ein MHC-Komplex einschließlich Kombinationen davon gerichtet sind, eine pharmazeutische Zusammensetzung, ein Kit (oder Teile davon), ein Verfahren zum Ermitteln eines HLA-Peptids der Klasse I und/oder II, ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Formulierung und die Verwendung einer erfindungsgemäßen Formulierung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Malignomen, Leukämie und Neoplasien.

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung oder zur Profilaxe von Mamma-/Brustkarzinomen, insbesondere lokal wiederkehrenden oder metastasierenden Mammakarzinomen bei einem Patienten oder einer Patientengruppe, der/die an einem Mamma-/Brustkarzinom erkrankt ist oder im Verdacht steht, an einem Mamma-/Brustkarzinom zu erkranken, umfassend zumindest 4 bis 8 humane Leukozytenantigen-(HLA)-A Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe (hierin auch als „HLA-A restringierte Tumorantigenpeptide“ bezeichnet) und zumindest 2 Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-II-Komplexe (hierin auch bezeichnet als „HLA restringierte Tumorantigenpeptide“, „HLAs“, „Aminosäuresequenzen der Erfindung“, „Verbindungen der Erfindung“ bzw. „Polypeptide der Erfindung“), wobei die HLA Tumorantigenpeptide tumorexklusive oder tumorassoziierte HLA Antigenpeptide sind und gegen die entsprechenden MHC-Komplexe einschließlich Kombinationen davon gerichtet sind (d.h. an diese binden oder eine Affinität dafür aufweisen), ein Kombinationspräparat (oder Teile davon), ein Verfahren zum Bestimmen/Identifizieren zumindest eines HLA-Antigenpeptids entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und/oder MHC-Klasse-II-Komplexe zur Verwendung in der pharmazeutischen Zusammensetzung, ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung und ein Verfahren zum Bestimmen der Regression, des Verlaufs oder des Auftretens einer Erkrankung an einem Mamma-/Brustkarzinom.
Stand der Technik
Trotz interdisziplinärer Ansätze und Ausreizung klassischer Therapien gehören Krebserkrankungen weiterhin zu den Haupttodesursachen. Im Allgemeinen erfolgt die Behandlung von Krebserkrankungen durch etablierte Methoden wie die operative Tumorentfernung (Resektion), Chemotherapie und/oder Strahlentherapie.
Insbesondere die Resistenzbildung von Krebszellen während einer Chemotherapie und/oder Strahlentherapie unterbindet zumeist die vollständige Entfernung aller Krebszellen aus dem Körper eines Probanden.
Neuere therapeutische Konzepte zielen darauf ab, das patienteneigene Immunsystem durch Einsatz von spezifischen Maßnahmen wie Antikörpertherapie gegen Immunsuppressoren und rekombinanten Immuninformatika (d.h. Behandlung mit Informationsträgern) in das therapeutische Gesamtkonzept mit einzubeziehen. Voraussetzung für den Erfolg einer solchen Strategie ist die Erkennung von tumorspezifischen oder tumorassoziierten Antigenen bzw. Epitopen durch das Immunsystem des Probanden, dessen Effektorfunktionen (durch die Immunzellen) verstärkt werden sollen. Tumorzellen unterscheiden sich biologisch wesentlich von ihren nichtmalignen Ursprungszellen. Diese Unterschiede sind durch genetische Veränderungen bedingt, die während der Tumorentwicklung erworben werden, und u.a. auch zur Bildung qualitativ oder quantitativ veränderter molekularer Strukturen in den Tumorzellen führen. Werden solche tumorassoziierten Strukturen vom spezifischen Immunsystem des tumortragenden Wirtes erkannt, spricht man von tumorassoziierten Epitopen.
Cancer/Testis Antigene (CTAs) bezeichnen eine Gruppe von tumorassoziierten Proteinen, die unter anderem von Tumoren unterschiedlicher histologischer Herkunft exprimiert werden (Fratta et al., Molecular Oncology, 5(2), April 2011, 164-182). Bei gesunden erwachsenen Wirbeltieren ist die Expression dieser Proteine auf männliche Keimzellen beschränkt. Bei Krebserkrankungen wird die Expression dieser Entwicklungsantigene jedoch häufig reaktiviert und können somit als Ort der Immunaktivierung dienen. Viele der CTAs sind Onkogene und an zellulären Prozessen wie Zellwachstum und Zellteilung, an der Hemmung der Apoptose und an der Metastasierung beteiligt. Sie sind oftmals ursächlich für Onkogenese und malignen Transformation und werden daher als Tumorantigene eingestuft. Die Expression von CTAs bei verschiedenen Malignomen ist heterogen und korreliert häufig mit der Tumorprogression, weshalb sie auch als Biomarker für den Verlauf einer Tumorerkrankung dienen. HLA-Antigenpeptide solcher CTAs werden oft als Abbauprodukte auf der Oberfläche der Tumorzellen präsentiert. Es ist bekannt, dass eine solche Präsentation von CTA-abgeleiteten HLA-Antigenpeptiden für die Entwicklung neuer Behandlungsmethoden genutzt werden kann, die eine medikamentöse Behandlung mit einer anti-CTA-gerichteten Immuntherapie kombinieren.
Humane Leukozytenantigene (auch HLA-System, HL-Antigene, Histokompatibilitätsantigene genannt, engl. human leukocyte antigen) sind eine Gruppe menschlicher Gene, die für die Funktion des Immunsystems zentral sind. Das HLA-System kommt unter dem Namen Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC von engl. Major Histocompatibility Complex) bei allen Wirbeltieren vor.
Es gibt zwei Arten von MHCs, nämlich MHC-Moleküle der Klasse I (hierin auch „MHC-Komplexe der Klasse /“ oder „HLA-Komplexe der Klasse /“) und MHC-Moleküle der Klasse II (hierin auch „MHC-Komplexe der Klasse //“ oder „HLA-Komplexe der Klasse //“). Beide befinden sich auf der Zelloberfläche aller Zellen mit Zellkern in den Körpern der Kieferwirbeltiere. MHC-Moleküle bestehen aus zwei Polypeptidketten, einer schweren α-Kette und einer leichten β-Kette (siehe auch 1 und 2).
MHC-Moleküle der Klasse I werden auf der Zelloberfläche aller kernhaltigen Zellen exprimiert und von CD8+ T-Zellen (auch als T-Killerzellen oder zytotoxische T-Zellen bezeichnet) erkannt. MHC-Moleküle der Klasse II werden hauptsächlich auf der Zelloberfläche von Antigen-präsentierenden Zellen exponiert und von CD4+ T-Zellen (auch als T-Helferzellen bezeichnet) erkannt.
Bei den Blutzellen werden MHC-Moleküle der Klasse I auf der Zelloberfläche von Thrombozyten exponiert, nicht aber auf roten Blutkörperchen. Ihre Aufgabe ist es, Peptidfragmente von Nicht-Selbst-Proteinen auf ihrer Zelloberfläche zu präsentieren und aus der Zelle heraus in T-Killerzellen (auch zytotoxische T-Zellen) zu übertragen, um eine sofortige Reaktion des Immunsystems gegen ein bestimmtes Nicht-Selbst-Antigen auszulösen, das mit Hilfe eines MHC-Klasse-I-Proteins dargestellt wird. Da MHC-Moleküle der Klasse I Peptide präsentieren, die von zytosolischen Proteinen abgeleitet sind, wird der Weg der Präsentation von MHC-Molekülen der Klasse I oft als zytosolischer oder endogener Weg bezeichnet.
HLA-Antigenpeptide dienen hierbei als Vermittler zwischen dem entsprechenden MHC-Komplex, der auf der Zelloberfläche präsentiert ist, und dem T-Zell-Rezeptor.
HLA-Komplexe der Klasse I (HLA-A, B und C) präsentieren auf der Zelloberfläche der Wirtszellen intrazelluläre Antigenpeptidfragmente (hierin „HLA-Antigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe“ oder „HLA Antigenpeptide des Typs 1“, die 7 bis 11, vorwiegend 9 Aminosäuren - sog. Nonamere - in ihrer Sequenz umfassen) gegenüber T-Killerzellen (auch zytotoxischen T-Zellen), wohingegen HLA-Komplexe der Klasse II (HLA-DR, DQ und DP) exogen abgeleitete Antigenpeptide (hierin „HLA-Antigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-Il-Komplexe“ oder „HLA Antigenpeptide des Typs 2“, die mehr als 11 Aminosäuren, vorzugsweise 12 bis 17 Aminosäuren in ihrer Sequenz umfassen) gegenüber T-Helferzellen präsentieren. Beim Menschen werden die HLA-Antigenpeptide der Klasse I, die der MHC-Klasse I entsprechen, in HLA-A, HLA-B und HLA-C Antigenpeptide unterteilt.
Aus dem Stand der Technik ist bekannt, dass die Bindung von HLA-Antigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-II-Komplexe an die Peptidbindungstasche der entsprechenden HLA-Komplexe der Klasse II primär über die diskreten Ankerreste in den Aminosäurepositionen 1, 4, 6/7 und 9 der HLA-Antigenpeptide erfolgt (siehe hierzu bspw. Sinigaglia und Hammer (1995), J. Exp. Med., 181, 449-451). Besonders bevorzugt ist gemäß dem Stand der Technik die Wechselwirkung zwischen dem Peptidbindetaschenmotiv des HLA-Komplexes der Klasse II und den diskreten Ankerresten in den Aminosäurepositionen 6 und 9 der HLA-Antigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-II-Komplexe. Die Aminosäurereste in den Aminosäurepositionen 2, 3, 5, 7 und 8 der jeweiligen HLA-Antigenpeptide stehen dabei zur Interaktion mit dem T-Zell-Rezeptor zur Verfügung (Sant‘ Angelo et al. (2002), Recognition of core and flanking amino acids of MHC class II-bound peptides by the T-cell receptor, Eur J Immunol, 32(9), 2510-20)
Demgegenüber sind für HLA Antigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe als die primären Ankerreste gegenüber dem entsprechenden HLA-Komplex der Klasse I die Aminosäurepositionen 1, 2 und 9 postuliert (siehe hierzu bspw. Binkowski et al. (2012), PLoS ONE, 7(8), e41710; Yamada (1999), Tissue Antigens, 54(4), 325-32).
Eine neue Studie in den USA untersucht derzeit die spezifische Wirksamkeit ausschließlich eines HLA-Antigenpeptids bei der Behandlung von Krebserkrankungen (siehe hierzu WO 2013/135266 , Inderberg-Suso et al. (2012), Oncoimmunology., 1(5), 670-686 und Slingluff (2011), Cancer J., 17(5), 343-350). Das Therapiespektrum ist daher nur sehr beschränkt und durch die Applikation lediglich eines HLA-Antigenpeptids ist die Wirksamkeit fraglich.
Dies gilt insbesondere bei einer Tumorentität wie dem Mammakarzinom, die sich von anderen Tumorentitäten durch eine geringe Homogenität (d.h. hohe Heterogenität) sowie dem Mangel an initialer Immunogenität auszeichnet. Klinisch wirksame zielgerichtete („targeted“) Immuninformations- und Stimulationstherapien sind von daher auf einen multifaktorellen Informationsansatz angewiesen.
Ein wesentlicher Nachteil von Krebsimmunotherapien besteht also darin, dass diese darauf basieren, dass das individuelle Mutationsmuster (Signaturen) des Tumors jedes einzelnen Krebspatienten entschlüsselt werden muss. Auf das ermittelte Profil des Mutationsmusters werden anschließend für jeden einzelnen Patienten passgenau synthetische Impfstoffe, beispielsweise auf RNA-Basis hergestellt (sog. Vakzinherstellung). Die so erhaltenen Impfstoffe können im Anschluss nur für die individuelle Behandlung dieses bestimmten Patienten eingesetzt werden.
Grundsätzlich taugen diese neuartigen Impfstoffe in der Krebsimmunotherapie daher nicht für andere Patienten mit dem gleichen Tumor, sondern sind nur jeweils für einen einzelnen Patienten einsetzbar, dessen Mutanom für die Vakzinherstellung zuvor analysiert wurde.
Es ist somit eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung - im Unterschied zur vollindividualisierten Krebsimmuntherapie -, eine pharmazeutische Zusammensetzung für unterschiedliche Probanden bzw. eine spezifisch vorbestimmte Patientengruppe (d.h. für eine bestimmte Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel) bereitzustellen, die Überschneidungen in dem Mutanom des malignen oder neoplastischen Gewebes (Mamma-/Brustkarzinom) aufweisen (Ableiten von Patientengruppen).
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, pharmakologisch wirksame Wirkstoffe sowie pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Wirkstoffe umfassen, bereitzustellen, die für die Diagnose, Prävention und/oder Behandlung von Mamma-/Brustkarzinom und weiterer Krankheiten und Störungen, die hierin aufgeführt sind, verwendet werden können; und Verfahren zur Diagnose, Prävention und/oder Behandlung solcher Krebserkrankungen, die die Verabreichung und/oder Verwendung solcher Wirkstoffe und Zusammensetzungen beinhaltet, bereitzustellen.
Insbesondere ist es eine Aufgabe der Erfindung, solche pharmakologisch wirksamen Wirkstoffe, pharmazeutischen Zusammensetzungen und/oder Verfahren bereitzustellen, die bestimmte Vorteile gegenüber den Wirkstoffen, Zusammensetzungen und/oder Verfahren aufweisen, die aktuell verwendet werden und/oder im Stand der Technik bekannt sind. Diese Vorteile ergeben sich aus der nachfolgenden weiteren Beschreibung.
Ganz besonders ist es eine Aufgabe der Erfindung, therapeutisch wirksame HLA-Antigenpeptide bereitzustellen, die als pharmakologisch wirksame HLA-Antigenpeptide bzw. als pharmakologisch aktive Wirkstoffe verwendet werden können, sowie pharmazeutische Zusammensetzungen bereitzustellen, die diese enthalten, für die Diagnose, Prävention und/oder Behandlung von Mamma-/Brustkarzinomen und weiterer Krankheiten und Störungen, insbesondere Krebserkrankungen die hierin aufgeführt sind, verwendet werden können; und Verfahren für die Diagnose, Prävention und/oder Behandlung solcher Krankheiten und Störungen bereitzustellen, die die Verabreichung und/oder Verwendung solcher therapeutisch wirksamen HLA-Antigenpeptide und Zusammensetzungen beinhalten.
Insbesondere ist es eine spezielle Aufgabe der vorliegenden Erfindung, solche HLA-Antigenpeptide bereitzustellen, die für die prophylaktische, therapeutische und/oder diagnostische Verwendung bei warmblütigen Tieren, insbesondere bei einem Säugetier und ganz besonders bei einem Menschen geeignet sind.
Erfindungsgemäß werden diese Aufgaben durch eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung oder zur Profilaxe von Mamma-/Brustkarzinomen, insbesondere lokal wiederkehrenden oder metastasierenden Mammakarzinomen bei einem Patienten oder einer Patientengruppe, der/die an einem Mamma-/Brustkarzinom erkrankt ist oder im Verdacht steht, an einem Mamma-/Brustkarzinom zu erkranken, umfassend eine pharmakologisch wirksame Menge aus 4 bis 8, vorzugsweise 4, 5, 6, 7 oder 8 HLA-A Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und zumindest 2, vorzugsweise 1, 2, 3 oder 4 Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-Il-Komplexe, dadurch gekennzeichnet, dass die HLA Tumorantigenpeptide tumorexklusive oder tumorassoziierte HLA Antigenpeptide sind, gemäß Anspruch 1 gelöst.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen angegeben.
Nach einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung besteht die pharmazeutische Zusammensetzung ausschließlich aus einer Trägerflüssigkeit (vorzugsweise Wasser, eine pharmazeutisch verträgliche Kochsalzlösung und/oder pharmazeutisch DMSO - derartige Zusammensetzungen von Trägerflüssigkeiten sind dem Fachmann bekannt und liegen bspw. im Bereich um 30% DMSO und 70% Wasser), in der eine pharmakologisch wirksame Menge von 4 bis 8 HLA-A Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und 2 Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-II-Komplexe gelöst bzw. suspendiert sind und einem Adjuvans.
Pharmazeutische Zusammensetzung und geeignete Darreichungsformen zur Applikation der pharmazeutisch wirksamen HLA-Tumorantigenpeptide werden gemäß Standardverfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, hergestellt und sind leicht auf jedes neue oder verbesserte Verfahren für deren Herstellung anwendbar.
Besonders vorteilhaft wird durch das Verabreichen der vorgenannten Kombination einer pharmakologisch wirksamen Menge der HLA-Tumorantigenpeptide an den Patienten oder die Patientengruppe, der/die an einem Mamma-/Brustkarzinom erkrankt ist, der CA 15-3 Wert wirksam reduziert. CA 15-3 (Cancer-Antigen 15-3) ist ein sogenanntes Glycoprotein, das als spezifischer Tumormarker bei Mammakarzinomen verwendet wird. Der CA 15-3 Wert ist ein Laborwert, der bei bestimmten Krebserkrankungen, insbesondere Mammakarzinomen signifikant über den Schwellwert ansteigt. Bei gesunden Menschen liegt der CA 15-3 Schwellwert unter 31 Enzymeinheiten pro Milliliter (< 31 U/ml). Vorzugsweise wird der CA 15-3 Wert durch das Verabreichen der pharmakologisch wirksamen Menge der Tumorantigenpeptide an den Patienten oder die Patientengruppe, der/die an einem Mamma-/Brustkarzinom erkrankt ist, unter 60 U/ml, besonders bevorzugt unter 50 U/ml, ganz besonders bevorzugt auf einen Bereich unter 40 U/ml und einen Normalwert (< 31 U/ml) reduziert.
Besonders bevorzugt wird durch das Verabreichen der pharmakologisch wirksamen Menge der HLA-Tumorantigenpeptide an den Patienten oder die Patientengruppe somit das progressionsfreie Überleben des Individuums wirksam, vorzugsweise um zumindest 2 bis 5 Jahre verlängert.
Entgegen der konventionellen Ansätze ist es eine überraschende Erkenntnis der vorliegenden Erfindung, dass Tumorantigenpeptide, die einen K_D-Wert im Bereich zwischen 50 und 500 nM aufweisen, entgegen konventioneller in-silico-Bindungsvorhersagemodellen, die diese als niedrig bindend angesehen haben, Effektorzellen (d.h. zytotoxische T-Zellen) auslösen. Für die Wirksamkeit der Tumorantigenpeptide ist es vielmehr von besonderem Vorteil, dass die zur Behandlung verwendeten HLA-Tumorantigenpeptide beim Patienten bzw. der Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel immunogen sind, was im Vorfeld mit einem Immunogenitätstests (z.B. mittels Westernblot, ELISA-Techniken, insbesondere mittels ELISPOT, vorzugsweise über Interferon-Gamma, Interferon-Alpha oder Interleukin (IL-2), oder Immunodetektion mit mikroskopischer Analyse) bestimmbar ist.
Wie hierin beschrieben, jedoch ohne Beschränkung auf eine Erläuterung, einen Wirkungsmechanismus oder eine Hypothese in der vorliegenden Erfindung, wurden zwei unterschiedliche Klassen von Aminosäuresequenzen der Erfindung bestimmt auf Grundlage ihrer Fähigkeit, die Interaktion von MHC-Komplexen der Klasse I bzw. MHC-Komplexen der Klasse II mit zumindest einem T-Zell-Rezeptor zu erhöhen (insbesondere im Nachweisverfahren, das unten im Ausführungsbeispiel 3 beschrieben wird). Diese zwei Klassen von Aminosäuresequenzen der Erfindung sind (wie nachfolgend beschrieben):

- „HLA-Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe“: (siehe besonders bevorzugte Beispiele in den Tabellen 1-3)
- „HLA-Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-II-Komplexe“: (siehe besonders bevorzugte Beispiele in der Tabelle 4)

Vorteilhaft handelt es sich bei der Verwendung/Applikation der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung bzw. der darin enthaltenen spezifischen Kombination an Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und MHC-Klasse-II-Komplexe an den Patienten bzw. die Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel nicht lediglich um eine passive Immunisierung (wie bei der Behandlung mit Antikörpern, z.B. Herceptin) sondern um eine aktive Immunisierung (d.h. spezifische Aktivierung der T-Zellen bzw. B-Helferzellen über Informationsträger). Da durch die spezifische Aktivierung von MHC-Molekülen der Klasse II, die hauptsächlich auf der Zelloberfläche von Antigen-präsentierenden Zellen exponiert werden, mittels der Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-II-Komplexe spezifisch CD4+ T-Zellen (auch als T-Helferzellen bezeichnet) und B-Zellen aktiviert werden.
Zum Binden an einen T-Zell-Rezeptor weist ein HLA-Tumorantigenpeptid der Erfindung üblicherweise in seiner Aminosäuresequenz einen oder mehrere Aminosäurereste oder einen oder mehrere Abschnitte von Aminosäureresten (d.h. mit jedem „Abschnitt“, der zwei oder mehr Aminosäurereste umfasst, die sich nebeneinander oder in unmittelbarer Nähe zueinander befinden, d.h. in der Primär- oder Tertiärstruktur der Aminosäuresequenz) auf, über die die Aminosäuresequenz der Erfindung an einen T-Zell-Rezeptor (insbesondere eine Bindetasche davon) binden kann, wobei die Aminosäurereste oder Abschnitte der Aminosäurereste somit den „Anker“ zum Binden an einen T-Zell-Rezeptor bilden (hierin auch als „Anker-Aminosäuren“ bezeichnet).
Die Bestimmung dieses „Ankers“ kann beispielsweise mit in silico Verfahren (bspw. das artificial neural network NNAlign, das in dem öffentlich zugängigen NetMHC-4.0 eingesetzt wird) oder durch gezielte Mutation (Insertionen oder Substitutionen in der Aminosäuresequenz der HLA-Tumorantigenpeptide) ermittelt werden.
Die durch diese Erfindung bereitgestellten HLA-Tumorantigenpeptide liegen bevorzugt in im Wesentlichen isolierter Form vor (wie hierin definiert) oder bilden einen Teil eines Proteins oder Polypeptids, die eine oder mehrere HLA-Tumorantigenpeptide der Erfindung umfassen können oder im Wesentlichen daraus bestehen und die optional ferner ein oder mehrere pharmazeutisch wirksame HLA-Tumorantigenpeptid(e) umfassen können (die in einem sog. Oligopeptide alle optional über einen oder mehrere Linker verbunden sind). Zum Beispiel, und ohne Beschränkung, können die Tumorantigenpeptide der Erfindung als Bindeeinheit in solch einem Protein oder Polypeptid verwendet werden, die optional einen oder mehrere weitere Aminosäuresequenzen enthalten können, die als Bindeeinheit dienen können (d.h. gegen ein oder mehrere andere Ziele als einen T-Zell-Rezeptor), um ein monovalentes, multivalentes bzw. multispezifisches Polypeptid der Erfindung, wie hierin beschrieben, bereitzustellen. Solch ein Protein oder Polypeptid kann auch in im Wesentlichen isolierter Form vorliegen (wie hierin definiert).
Es hat sich gezeigt, dass eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine hierin offenbarte spezifische Kombination aus HLA-Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und HLA-Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-II-Komplexe umfasst, besonders vorteilhaft ist, da sie einerseits geeignet ist, spezifisch T-Zellen als auch spezifisch B-Zellen zu aktivieren.
In anderen Erscheinungsformen bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, ein Kit (oder Teile davon), ein Verfahren zum Bestimmen/Identifizieren eines pharmakologisch aktiven HLA-Antigenpeptids entsprechend der MHC-Komplexe der Klasse I und/oder II, ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Formulierung und die Verwendung einer erfindungsgemäßen Formulierung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krebserkrankungen, insbesondere Mamma-/Brustkarzinomen.
Die Polypeptide und pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können insbesondere zur Prävention und Behandlung von Krebserkrankungen, insbesondere Mamma-/Brustkarzinomen verwendet werden, die gekennzeichnet sind durch Mutation(en) (hierin „Aminosäureaustausch“) veränderte Wildtyp-HLA-Antigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und/oder entsprechend der MHC-Klasse-II-Komplexe (sog. HLA Tumorantigenpeptide, wie hierin definiert).
Im Allgemeinen erfolgt(e) im Vorfeld die Behandlung von Krebserkrankungen der Erfindung eines Patienten oder einer Patientengruppe durch klassische Methoden wie die Chemotherapie, Strahlentherapie und/oder Krebsimmuntherapie.
Klassische Methoden zur Behandlung von Krebserkrankungen der Erfindung sind bspw. die operative Tumorentfernung (Resektion), die Chemotherapie und/oder die Strahlentherapie, wobei häufig zwei oder gar alle drei Behandlungsmethoden gleichzeitig bei einem Probanden angewendet werden. Bei den Krebsimmuntherapiemethoden unterscheidet man zwischen der aktiven und der passiven Immunisierung. Bei der aktiven Immunisierung bekommt der Proband Substanzen verabreicht, die in seinem Immunsystem eine Immunantwort auslösen sollen. Bei der passiven Immunisierung kommen Antikörper oder Antikörper-Fragmente zum Einsatz. Bei der adoptiven Immuntherapie (d.h. passive Immuntherapie, da vergleichbar mit der Behandlung mit Antikörpern ohne direkte Immunmodulation) werden dem Probanden Leukozyten entnommen, ex vivo kultiviert und anschließend wieder dem Probanden injiziert. Werden bei der Behandlung nicht alle Zellen des Tumors und seiner Metastasen vernichtet, so ist die weitere Behandlung von Krebserkrankungen durch Resistenzbildung deutlich erschwert.
Die vorliegende Erfindung umfasst daher auch eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Krebserkrankungen, wie vorweg beschrieben, die im Anschluss an die klassischen Methoden zur Behandlung von Krebserkrankungen, nämlich nach erfolgloser operativer Tumorentfernung (Resektion), Chemotherapie und/oder Strahlentherapie erfolgt.
Es ist eine besondere Leistung der Erfinder, herausgefunden zu haben, dass für eine wirkungsvolle Behandlung die erfindungsgemäß verwendeten HLA-A Antigenpeptide bei dem zu behandelnden Individuum auch tatsächlich auf der Zelloberfläche von Zellen des zu behandelnden malignen Gewebes (insbesondere des Mamma-/Brustkarzinoms) präsentiert werden. Daher umfasst die zu applizierende pharmazeutische Zusammensetzung HLA-Antigenpeptide, die auf der Oberfläche der Tumorzellen des Mamma-/Brustkarzinoms des Patienten oder der Patientengruppe präsentiert werden, was vor Applikation und Zusammenstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung mittels Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie (UHPCL) in Verbindung mit ESI Massenspektrometrie (MS) bestimmt wird. Durch eine solche Ligandomuntersuchung wurde - anders als bei konventionellen Krebsimmuntherapien - bereits im Vorfeld die Bindungsfähigkeit der erfindungsgemäßen HLA-A Antigenpeptide gegenüber dem entsprechenden MHC-Komplex der Klasse I bzw. II bewiesen.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung werden zumindest 60%, bevorzugt zumindest 80%, ganz besonders bevorzugt 90%, idealerweise alle HLA-Tumorantigenpeptide, die in der zu applizierenden pharmazeutischen Zusammensetzung enthalten sind, auf der Oberfläche der Tumorzellen des Mamma-/Brustkarzinoms des Patienten oder der Patientengruppe präsentiert, wie durch Verfahren, wie hierin beschrieben, bestimmt.
Nach einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung sind die HLA-Antigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe aus der Gruppe bestehend aus den in SEQ ID Nr. 1 bis 35 angegebenen Aminosäuresequenzen ausgewählt oder weisen gegenüber diesen Aminosäuresequenzen eine Aminosäureidentität von zumindest 85% auf.
Nach einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung sind die HLA-Antigenpeptid entsprechend der MHC-Klasse-II-Komplexe aus der Gruppe bestehend aus den in SEQ ID Nr. 36 bis 48 angegebenen Aminosäuresequenzen ausgewählt.
Es wurde von den Erfindern der vorliegenden Erfindung gefunden, dass sich die hierin explizit offenbarten HLA-A Antigenpeptide entsprechend der MHC Klasse I insbesondere zur Verwendung bei der Behandlung von Mamma-/Brustkarzinomen bei Probanden bzw. einer Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel eignen, die den Subtyp A*01 und/oder A*02 aufweisen. Das bedeutet, dass die hierin verwendeten HLA-A Tumorantigenpeptide vorzugsweise an den entsprechenden MHC-Klasse-I-Komplex des Subtyps A*01 und/oder A*02 binden.
Nach einer besonders bevorzugten Ausgestaltung weisen die Individuen (Probanden bzw. einer Patientengruppe) den Haplotyp mit der Subgruppe A*01:01 und/oder A*02:01 auf.
Alternativ dazu weisen die Individuen (Probanden bzw. einer Patientengruppe) besonders bevorzugt den Haplotyp mit der Subgruppe B*44:01 und/oder A*18:01 auf.
Zwar könnte die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung zur gewebeunabhängigen Behandlung von Malignomen, Neoplasien und/oder Leukämien (d.h. anders als bei herkömmlichen Präparaten spielen die Krebssubtypen zunächst keine Rolle) verwendet werden, sodass die pharmazeutische Zusammensetzung gewebeübergreifend für die Verwendung als Antikrebsmedikament eingesetzt werden kann. Allerdings wurde gefunden, dass die erfindungsgemäße Verabreichung/Applikation der spezifischen Kombination von 4 bis 8 HLA-A Tumorantigenpeptiden und zumindest 2 HLA Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe besonders vorteilhaft zur Behandlung von Brustkrebs verwendet werden kann.
Ein weiterer klinischer Zugewinn bei der Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung bei der Behandlung eines Patienten bzw. einer Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel kann erreicht werden, indem der pharmazeutischen Zusammensetzung, ferner eine pharmakologisch wirksame Menge zumindest eines HLA-B Tumorantigenpeptids, vorzugsweise 1, 2, 3, 4 oder 5 HLA-B Tumorantigenpeptid(e) entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und/oder zumindest eines HLA-C Tumorantigenpeptids, vorzugsweise 1, 2, 3, 4 oder 5 HLA-C Tumorantigenpeptid(e) entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe zugesetzt ist. Es versteht sich, dass auch die HLA-B Tumorantigenpeptide bzw. HLA-C Tumorantigenpeptide entsprechend dem spezifischen Haplotyp des Patienten bzw. der Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel zur Behandlung oder Profilaxe ausgewählt sind.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung weist die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung zumindest 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 HLA-Antigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und/oder MHC-Klasse-II-Komplexe und/oder zumindest ein HLA-Antigenpeptid auf, das analog zu zumindest einem auf der Zelloberfläche von Zellen aus malignem und/oder neoplastischem Gewebe (insbesondere des Mamma-/Brustkarzinoms) des zu behandelnden Individuums exponiertem HLA-Antigenpeptid ist, welches in seiner Aminosäuresequenz zumindest einen Aminosäureaustausch gegenüber dem Wildtyp dieses HLA-Antigenpeptids (sog. Neoantigenpeptid) und zumindest eine 3-fach erhöhte spezifische Affinität gegenüber dem T-Zell-Rezeptor der körpereigenen T-Zellen (entsprechend gemessen und/oder ausgedrückt als K_D-Wert) aufweist. Besonders gute Erfolge konnten mit pharmazeutischen Zusammensetzungen erzielt werden, die zumindest 10, 11 oder 12 HLA-Antigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und/oder MHC-Klasse-II-Komplexe aufwiesen.
Hierbei hat sich gezeigt, dass pharmazeutische Zusammensetzungen besonders bevorzugt sind, die aus einer pharmakologisch wirksamen Menge aus 4 bis 8, vorzugsweise 4, 5, 6, 7 oder 8 HLA-A und/oder HLA-B Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe, insbesondere Neoantigenpeptiden davon und 1, 2, 3 oder 4 Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-II-Komplexe, insbesondere Neoantigenpeptiden davon bestehen.
Nach einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung ist zumindest ein HLA-A Antigenpeptide der Zusammensetzung ein tumorexklusives HLA-A Antigenpeptid (d.h. ein Cancer-Testis-Antigen (CTA), das jenseits der immunprivilegierten Spermatozyten im gesunden/normalen Gewebe des Patienten/der Patientengruppe nicht (mehr) auftaucht oder ein sog. Neoantigenpeptid), und wobei die spezifische Bindung des tumorexklusiven HLA-A Antigenpeptids mit einer spezifischen Dissoziation (K_D) im Bereich von 10 bis 50 nM erfolgt, wie mit Oberflächenplasmonresonanz bestimmt.
Es ist ebenfalls eine herausragende Leistung der Erfinder, herausgefunden zu haben, dass eine pharmazeutische Zusammensetzung auf Basis von HLA-Antigenpeptiden besonders wirksam ist, wenn durch diese sowohl T-Lymphozyten (kurz T-Zellen) als auch B-Lymphozyten (kurz B-Zellen) aktiviert werden.
T-Zellen gehören zur Zellgruppe der Lymphozyten und spielen eine wichtige Rolle im menschlichen Immunsystem. T-Zellen erkennen Antigene über einen spezifischen Rezeptor, den sogenannten T-Zell-Rezeptor (TCR). Dafür muss das Antigen allerdings von einer Antigen-präsentierenden Zelle (APC) angeboten werden.
Die stabile Bindung der T-Zelle an die Antigen-präsentierende Zelle erfordert die Beteiligung sog. Auxilliärproteine. Zu diesen gehören CD4 und CD8 (CD = „Cluster of Differentiation“).
T-Zellen, die das Merkmal CD4 tragen, werden auch als CD4-positive T-Zellen oder T-Helferzellen bezeichnet. Im normalen Blut eines Erwachsenen machen die CD4+ T-Zellen 27-57% der Lymphozyten, also etwa 310-1570 Zellen/µl aus.
In der Gruppe der CD8-positiven (CD8+) T-Zellen, zu der auch regulatorische T-Zellen gehören, finden sich die zytotoxischen T-Zellen bzw. T-Killerzellen. Sie spielen eine besondere Rolle bei der Abtötung von körpereigenen Zellen, die von Viren befallen sind. Diese Eigenschaft der zellulären Immunabwehr ist bei der vorliegenden Erfindung von entscheidender Bedeutung, da die molekularbiologischen und-gentechnischen Veränderungen von Tumorzellen durch diese T-Zell-Population erkannt und lysiert werden kann.
Demgegenüber sind B-Zellen als einzige Zellen in der Lage, Antikörper zu bilden, und machen zusammen mit den T-Zellen den entscheidenden Bestandteil des adaptiven Immunsystems aus. Während T-Zellen an der zellvermittelten Immunantwort beteiligt sind, sind die B-Zellen die Träger der humoralen Immunantwort (und für die Bildung von Antikörpern verantwortlich).
Es hat sich gezeigt, dass eine pharmazeutische Zusammensetzung die tumorassoziierten HLA Antigenpeptide umfasst, deren Expressionsniveau in den Tumorzellen mindestens dreimal höher ist als in den gesunden Zellen des Patienten oder der spezifisch bestimmten Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel, wie beispielsweise mit qPCR bestimmt, und wobei die tumorassoziierten HLA-Antigenpeptide mit der Proliferation, Invasivität, Angiogenese und einer Erhöhung der Zytokeratinproduktion des Mamma-/Brustkarzinoms assoziiert sind, besonders wirksame pharmakologische Effekte bei der Behandlung von Mamma-/Brustkarzinomen aufweisen.
Besonders bevorzugt ist jedes einzelne hierin für die Behandlung von Mamma-/Brustkarzinomen verwendete HLA-Antigenpeptid in der pharmazeutischen Zusammensetzung in einer absoluten Konzentration (d.h. Verabreichungsdosis) von zumindest 100 bis 600 µg, bevorzugt von 300 bis 600 µg enthalten.
Es hat sich in weiteren Versuchen mittlerweile gezeigt, dass pharmazeutische Zusammensetzung, die pro HLA-Tumorantigenpeptid eine absolute Konzentration von > 600 µg, d.h. zumindest 700 bis 1.200 µg, bevorzugt von 800 bis 1.200 µg enthalten, ganz besonders bevorzugt ist, da dadurch die Information (die Aktivierung und/oder das Training des Immunsystems) stark intensiviert ist. Dies ist insbesondere von Vorteil, wenn das Immunsystem des zu behandelnden Probanden durch Vorbehandlung mit einem Standardtherapieverfahren (z.B. mindestens eine Operation, Bestrahlung, Chemotherapie und/oder Hormontherapie) bereits geschwächt ist. Zudem ist die absolute Konzentration pro HLA-Tumorantigenpeptid bevorzugt, da dadurch der Einfluss der Degradation der HLA-Tumorantigenpeptide (bspw. durch Ligasen) nach deren Applikation an den Probanden wesentlich minimiert wird.
Es ist sehr zweckdienlich, dass die pharmazeutische Zusammensetzung ein Adjuvans umfasst, das bei Applikation der Zusammensetzung an einen Patienten dazu geeignet ist, am Ort der Applikation ein Granulom auszubilden. Der Vorteil in der Ausbildung eines Granuloms besteht darin, dass somit eine Depotwirkung erzielt werden kann, wobei die HLA-Tumorantigenpeptide am Ort der Applikation vorteilhaft in Art eines Reservoirs gespeichert werden und über einen längeren Zeitraum an den Organismus des Probanden abgegeben werden können. Besonders vorteilhaft entfallen daher wöchentliche Applikationen der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung. Bevorzugt muss die Applikation der pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krebserkrankungen im Sinne der Erfindung bei Anwendung über einen längeren Zeitraum daher lediglich alle 2 Wochen, besonders bevorzugt nur einmal monatlich erfolgen.
Dabei wird die pharmazeutische Zusammensetzung vorzugsweise subkutan oder intradermal und, vorzugsweise im Wesentlichen gleichzeitig an zumindest 2, besonders bevorzugt an zumindest 3 Applikationsorten, in der Regel an 3 bis 4 Applikationsorten entfernt von einer Tumorläsion und/oder dem krebsartigen Lymphknotenbereich appliziert.
Die im Wesentlichen gleichzeitige (sukzessive) Applikation an mehreren Applikationsorten hat den Vorteil, dass insbesondere bei Applikation hoher absoluter Konzentrationen der einzelnen HLA-Antigenpeptide (d.h. Verabreichungsdosis) im Bereich von > 600 µg, die zum vollständigen Lösen der einzelnen HLA-Antigenpeptide größere Applikationsvolumina (> 1 mL) bedingen, die Applikation der Applikationslösung, die nach dem Öffnen nur eine begrenzte Haltbarkeit aufweist, möglichst gleichzeitig erfolgt.
Vorzugsweise muss die pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend jedes einzelne HLA-Antigenpeptid in der Zusammensetzung in einer absoluten Konzentration (d.h. Verabreichungsdosis) von 300 bis 600 µg, lediglich einmal alle 2 Wochen, vorzugsweise einmal alle 4 Wochen über einen Zeitraum von zumindest einem Jahr intradermal oder subkutan einem Patienten oder einer spezifisch bestimmten Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel verabreicht werden.
Es wurde gefunden, dass eine pharmazeutische Zusammensetzung, bei der zumindest ein HLA-Tumorantigenpeptid zumindest eine Mutation in Bezug auf den Wildtypen des HLA-Tumorantigenpeptids (wie unten im Detail ausgeführt) aufweist, die zu einer Erhöhung der Affinität, vorzugsweise auf < 500 nm, ganz besonders bevorzugt < 50 nm der spezifischen Bindungsaffinität zum T-Zell-Rezeptor (K_D-Wert) des mit HLA-Tumorantigenpeptids behandelten Individuums im Vergleich zu den Wildtyp des HLA-Antigenpeptids führt, besonders vorteilhafte Effekte bei der Behandlung von Mamma-/Brustkarzinomen zeigen.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung wird die pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Mamma-/Brustkarzinomen als Monotherapie oder in Kombination mit anderen bekannten Therapien und/oder Verbindungen zur Behandlung von Mamma-/Brustkarzinomen eingesetzt. Dabei wird die pharmazeutische Zusammensetzung als eine Erstlinientherapie dem Patienten oder der Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel verabreicht werden (sog. adjuvante Monotherapie).
Alternativ kann vorgesehen sein, dass der/die mit der pharmazeutischen Zusammensetzung zu behandelnden Patienten bzw. behandelnde Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel im Vorfeld bereits zumindest ein Standardtherapieverfahren (z.B. mindestens eine Operation, Bestrahlung, Chemotherapie und/oder Hormontherapie) erhalten hat.
Besonders bevorzugt ist das zu behandelnde Mamma-/Brustkarzinom ein hormonpositiver, HER2/neu oder tripple negativer Brustkrebs.
HLA- Tumorantigenpeptid
Von der vorliegenden Erfindung sind auch HLA-Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe oder MHC-Klasse-II-Komplexe, insbesondere zur Verwendung bei der Behandlung oder zur Profilaxe von Mamma-/Brustkarzinomen bei einem Patienten oder einer Patientengruppe, der/die an einem Mamma-/Brustkarzinom erkrankt ist oder im Verdacht steht, an einem Mamma-/Brustkarzinom zu erkranken bzw. für eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung mitumfasst, wobei die HLA-Tumorantigenpeptide die aus der Gruppe bestehend aus den in SEQ ID Nr. 13 bis 35 und SEQ ID Nr. 36 bis 48 angegebenen Aminosäuresequenzen oder die gegenüber einer dieser Aminosäuresequenzen zumindest eine Mutation, vorzugsweise einen Aminosäureaustausch aufweisen.
Besonders bevorzugt ist hierbei die Verwendung der vorgenannten HLA-Tumorantigenpeptide in einem Verfahren zur Behandlung von Mammakarzinomen, insbesondere lokal wiederkehrenden oder metastasierenden Mammakarzinomen bei einem Patienten oder einer Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel, wobei das Verfahren das Verabreichen/Applizieren eines Behandlungsregimes an den Patienten oder die Patientengruppe umfasst, das eine pharmakologisch wirksame Menge zumindest eines der vorgenannten HLA-Tumorantigenpeptide umfasst.
Damit das Immunsystem des Individuums, an das die erfindungsgemäßen HLA-Tumorantigenpeptide bzw. die pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht wird, noch voll funktionsfähig und somit leichter zu trainieren ist, ist es von Vorteil, wenn das Individuum noch keine Bestrahlung, Chemotherapie und/oder Hormontherapie gegen den Brustkrebs, insbesondere bei lokal wiederkehrendem oder metastasierendem Brustkrebs erhalten hat und/oder 12 Monate oder weniger seit der letzten Dosis eines Chemotherapeutikums keine vorhergehende adjuvante Chemotherapie in Rekurrenz mehr erhalten hat.
Besonders bevorzugt, verlängert das hierin beschriebene Behandlungsregime, insbesondere unter Verwendung zumindest eines vorgenannten erfindungsgemäßen HLA-Tumorantigenpeptids das progressionsfreie Überleben des Individuums wirksam.
HLA-A Antigenpeptide und HLA-A Neoantigenpeptide
Ein „HLA-A Tumorantigenpeptid entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe“ ist hierin definiert als ein „HLA-Antigenpeptid der Erfindung“ bzw. „Aminosäuresequenz der Erfindung“ (wie hierin definiert), das folgendes umfasst:

a) eine Aminosäuresequenz bestehend aus 7 bis 11 Aminosäuren; und/oder
b) ein Neoantigenpeptid mit einer Aminosäuresequenz bestehend aus 7 bis 11 Aminosäuren, das
1. i) analog zu zumindest einem auf der Zelloberfläche von Zellen aus malignem und/oder neoplastischem Gewebe (insbesondere des Mamma-/Brustkarzinoms) des zu behandelnden Individuums exponiertem HLA-A Antigenpeptid ist, und
2. ii) in seiner Aminosäuresequenz zumindest einen Aminosäureaustausch gegenüber dem Wildtyp dieses HLA-A Neoantigenpeptids (sog. „HLA-A Neoantigenpeptid“) und
3. iii) zumindest eine 3-fach erhöhte spezifische Affinität gegenüber dem T-Zell-Rezeptor der körpereigenen T-Zellen aufweist

Es ist eine herausragende Leistung der Erfinder, erkannt zu haben, dass HLA-A Neoantigenpeptide, die in ihrer Aminosäuresequenz gegenüber dem Wildtyp dieses HLA-A Antigenpeptids zumindest einen Aminosäureaustausch in den Aminosäurepositionen 1 (N-Terminus), 2, 7/8 und/oder dem C-Terminus aufweisen, eine zumindest 4-fach, besonders bevorzugt zumindest 5-fach, ganz besonders bevorzugt zumindest 8-fach erhöhte spezifische Affinität (K_D) gegenüber dem T-Zell-Rezeptor der körpereigenen T-Zellen aufweisen und daher besonders bevorzugt für die erfindungsgemäße Zusammensetzung eingesetzt werden.
Besonders bevorzugt ist der Aminosäureaustausch in der Aminosäuresequenz des HLA-A Antigenpeptids ein einzelner Aminosäureaustausch in der Aminosäureposition 1 (N-Terminus), 2, 7/8 oder dem C-Terminus.
Bevorzugt ist der Aminosäureaustausch in der Aminosäuresequenz des HLA-A Neoantigens gegenüber dem Wildtyp dieses HLA-A Antigenpeptids ein C/Y, A/V, D/Y, E/K, P/L, N/D oder T/M Austausch.
Bevorzugt weist das HLA-A Peptid bzw. das HLA-A-Neoantigen gegenüber dem T-Zell-Rezeptor eine spezifische Aktivität (K_D), die durch jedes geeignete Nachweisverfahren, das dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt ist, von weniger als 100 nM, besonders bevorzugt weniger als 75 nM oder ganz besonders bevorzugt von weniger als 50 nM, wie beispielsweise weniger als 40 nM, 35 nM, 30 nM, 25 nM oder 20 nM auf.
Bevorzugt ist das HLA-A Tumorantigenpeptid bzw. das HLA-A-Neoantigen in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung mit einer Konzentration, wie oben definiert, von zumindest 100 bis 600 µg, alternativ bevorzugt in absoluter Konzentration von > 600 µg bezogen auf das zu applizierende Volumen der pharmazeutischen Zusammensetzung enthalten.
Bevorzugt sind die HLA-A Tumorantigenpeptide bzw. HLA-A-Neoantigene wie oben unter Punkt (b) definiert ausgewählt.
Nach einer besonders bevorzugten Ausgestaltung ist ein „HLA-A-NeoantigenpepticT, bevorzugt, das folgende Gerüstsequenz umfasst:

(a) eine Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr.: 13 bis 19 und 27 bis 34 ausgewählt ist; und/oder
(b) ein Neoantigen mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID Nr.: 13 bis 19 und 27 bis 34; und/oder
(c) eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenz, die weniger als 100% Sequenzidentität oder Ähnlichkeit mit dem nativen HLA-A-Antigenpeptid aufweist, wie mindestens 85 %, besonders bevorzugt zumindest 90 % Sequenzidentität (wie hierin definiert) mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID Nr.: 1 bis 5, 13 bis 19 und 27 bis 34 aufweisen; und/oder
(d) eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenz, die nur einen Aminosäureaustausch gegenüber der Aminosäuresequenz(en) ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID Nr.: 1 bis 5, 13 bis 19 und 27 bis 34 umfasst bzw. im Wesentlichen daraus besteht; und/oder
(e) Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide, die aus zumindest zwei gleichen oder unterschiedlichen Peptidsequenzen von zumindest einem HLA-A Tumorantigenpeptid und einem HLA-A, HLA-B und/oder HLA-C Tumorantigenpeptid und/oder entsprechenden Neoantigenen daraus bestehen, in denen die HLA Antigenpeptide gegebenenfalls durch geeignete Linker miteinander verbunden sind (sog. Oligopeptide).

Ganz besonders bevorzugt sind HLA-A Tumorantigenpeptide wie unter (b), (d) bzw. (e) definiert. Auch in der Ausführungsform gemäß (e) sind die HLA-A Tumorantigenpeptide bevorzugt wie unter (a) bzw. (d) beschrieben definiert. Im Falle, dass die HLA-A Tumorantigenpeptide und/oder Neoantigene, wie unter (e) definiert, über einen Linker miteinander verbunden sind, so sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik geeignete Linker bekannt.
Der erfindungsgemäße Einsatz von Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide wie unter (e) definiert, die aus zumindest zwei gleichen oder unterschiedlichen Peptidsequenzen von HLA Tumorantigenpeptiden und/oder HLA Neoantigenen bestehen, hat den weiteren Vorteil, dass die längere Aminosäuresequenzen der Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide eine längere Verweildauer in dem Gewebe des Probanden nach der Applikation bewirkt, wobei die Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide nach der Applikation an den Probanden bspw. durch körpereigene Enzyme in kleinere Fragmente (pharmazeutisch aktive Form, umfassend zumindest 7 bis 11 Aminosäuren), die eine biologisch gewünschte Funktion im Sinne der Erfindung aufweisen, zerlegt werden können. D.h., die einzelnen Fragmente des Oligopeptids weisen eine Aktivität als HLA-A, HLA-B oder HLA-C Tumorantigenpeptide auf und tragen somit zur Aktivierung von T-Zellen bei.
In einer besonderen Erscheinungsform kann jede beliebige HLA-A Peptidsequenz eine humanisierte und/oder sequenzoptimierte Sequenz, wie weiter hierin beschrieben, sein.
HLA-B Antigenpeptide und HLA-B Neoantigenpeptide
Ein „HLA-B Antigenpeptid“ ist hierin definiert als ein „HLA-B Antigenpeptid der Erfindung“ bzw. „Aminosäuresequenz der Erfindung“ (wie hierin definiert), das folgendes umfasst:

a) eine Aminosäuresequenz bestehend aus 12 bis 17 Aminosäuren; und/oder
b) ein Neoantigenpeptide mit einer Aminosäuresequenz bestehend aus 12 bis 17 Aminosäuren, das
1. i) analog zu zumindest einem auf der Zelloberfläche von Zellen aus malignem und/oder neoplastischem Gewebe (insbesondere des Mamma-/Brustkarzinoms) des zu behandelnden Individuums exponiertem HLA-B Antigenpeptid ist, und
2. ii) in seiner Aminosäuresequenz zumindest einen Aminosäureaustausch gegenüber dem Wildtyp dieses HLA-B Antigenpeptids (sog. „HLA-B Neoantigenpeptid“) und
3. iii) zumindest eine 3-fach erhöhte spezifische Affinität gegenüber dem T-Zell-Rezeptor der körpereigenen T-Zellen aufweist

Des Weiteren haben die Erfinder erkannt, dass HLA-B Neoantigenpeptide, die in ihrer Aminosäuresequenz gegenüber dem Wildtyp dieses HLA-B Antigenpeptids zumindest einen Aminosäureaustausch in den Aminosäurepositionen 3, 8 und/oder 10 aufweisen, eine zumindest 4-fach, besonders bevorzugt zumindest 7-fach erhöhte spezifische Affinität gegenüber dem T-Zell-Rezeptor der körpereigenen T-Zellen aufweisen und daher besonders bevorzugt für die erfindungsgemäße Formulierung eingesetzt werden.
Besonders bevorzugt ist der Aminosäureaustausch in der Aminosäuresequenz des HLA-B Antigenpeptids ein einzelner Aminosäureaustausch in der Aminosäureposition 3, 8 oder 10.
Bevorzugt ist der Aminosäureaustausch in der Aminosäuresequenz des HLA-B Neoantigens gegenüber dem Wildtyp dieses HLA-B-Antigenpeptids ein E/A, E/K, R/W oder D/A Austausch.
Bevorzugt weist das HLA-B Antigenpeptid bzw. das HLA-B-Neoantigenpeptid gegenüber dem T-Zell-Rezeptor eine spezifische Aktivität (K_D), die durch jedes geeignete Nachweisverfahren, das dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt ist, von weniger als 100 nM, besonders bevorzugt weniger als 75 nM oder ganz besonders bevorzugt von weniger als 50 nM, wie beispielsweise weniger als 40 nM, 35 nM, 30 nM, 25 nM oder 20 nM auf.
Bevorzugt ist das HLA-B Tumorantigenpeptid bzw. das HLA-B-Neoantigen in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung mit einer Konzentration, wie oben definiert, von zumindest 100 bis 600 µg, alternativ bevorzugt in absoluter Konzentration von > 600 µg bezogen auf das zu applizierende Volumen der pharmazeutischen Zusammensetzung enthalten.
Bevorzugt sind die HLA-B Peptide bzw. HLA-B-Neoantigene wie oben unter Punkt b) definiert ausgewählt.
Nach einer besonders bevorzugten Erscheinungsform ist ein „HLA-B-Neoantigen“, bevorzugt, das folgende Gerüstsequenz umfasst:

(a) eine Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID Nr.: 20, 21, 22 und 35 ausgewählt ist; und/oder
(b) eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenz, die zumindest 80 %, wie mindestens 85 %, besonders bevorzugt zumindest 90 % Sequenzidentität (wie hierin definiert) mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID Nr.: 6, 7, 8, 20, 21, 22 und 35 aufweisen; und/oder
(c) eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenz, die nur einen Aminosäureaustausch gegenüber der Aminosäuresequenz(en) ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID Nr.: 6, 7, 8, 20, 21, 22 und 35 umfasst bzw. im Wesentlichen daraus besteht; und/oder
(d) Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide, die aus zumindest zwei gleichen oder unterschiedlichen Peptidsequenzen von zumindest einem HLA-B Tumorantigenpeptid und einem HLA-A, HLA-B und/oder HLA-C Tumorantigenpeptid und/oder entsprechenden Neoantigenen daraus bestehen, in denen die HLA Antigenpeptide gegebenenfalls durch geeignete Linker miteinander verbunden sind (sog. Oligopeptide).

Ganz besonders bevorzugt, sind HLA-B Peptide wie unter (a), (c) bzw. (d) definiert. Auch in der Ausführungsform gemäß (d) sind die HLA-B Peptide bevorzugt wie unter (a) bzw. (c) beschrieben definiert. Im Falle, dass die HLA-B Tumorantigenpeptide und/oder HLA-B Neoantigene, wie unter (e) definiert, über einen Linker miteinander verbunden sind, so sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik geeignete Linker bekannt.
Der erfindungsgemäße Einsatz von Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide wie unter (d) definiert, die aus zumindest zwei gleichen oder unterschiedlichen Peptidsequenzen von HLA Tumorantigenpeptiden und/oder HLA Neoantigenen bestehen, hat den weiteren Vorteil, dass die längere Aminosäuresequenzen der Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide eine längere Verweildauer in dem Gewebe des Probanden nach der Applikation bewirkt, wobei die Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide nach der Applikation an den Probanden bspw. durch körpereigene Enzyme in kleinere Fragmente (pharmazeutisch aktive Form, umfassend zumindest 7 bis 11 Aminosäuren), die eine biologisch gewünschte Funktion im Sinne der Erfindung aufweisen, zerlegt werden können. D.h., die einzelnen Fragmente des Oligopeptids weisen eine Aktivität als HLA-A, HLA-B oder HLA-C Tumorantigenpeptide auf und tragen somit zur Aktivierung von T-Zellen bei.
In einer besonderen Erscheinungsform kann jede beliebige HLA-B Peptidsequenz eine humanisierte und/oder sequenzoptimierte Sequenz, wie weiter hierin beschrieben, sein.
HLA-C Antigenpeptide und HLA-C Neoantigenpeptide
Ein „HLA-C Antigenpeptid“ ist hierin definiert als ein „HLA-Antigenpeptid der Erfindung“ bzw. „Aminosäuresequenz der Erfindung“ (wie hierin definiert), das folgendes umfasst:

a) eine Aminosäuresequenz bestehend aus 8 bis 11 Aminosäuren; und/oder
b) ein Neoantigenpeptid mit einer Aminosäuresequenz bestehend aus 8 bis 11 Aminosäuren, das
1. i) analog zu zumindest einem auf der Zelloberfläche von Zellen aus malignem und/oder neoplastischem Gewebe (insbesondere des Mamma-/Brustkarzinoms) des zu behandelnden Individuums exponiertem HLA-C Antigenpeptid ist, und
2. ii) in seiner Aminosäuresequenz zumindest einen Aminosäureaustausch gegenüber dem Wildtyp dieses HLA-C Peptids (sog. „HLA-C Neoantigenpeptid“) und
3. iii) zumindest eine 3-fach erhöhte spezifische Affinität gegenüber dem T-Zell-Rezeptor der körpereigenen T-Zellen aufweist

Des Weiteren haben die Erfinder erkannt, dass HLA-C Neoantigenpeptide, die in ihrer Aminosäuresequenz gegenüber dem Wildtyp dieses HLA-C Antigenpeptids zumindest einen Aminosäureaustausch in den Aminosäurepositionen 1 (N-Terminus), 4 und/oder dem C-Terminus aufweisen, eine zumindest 4-fach, besonders bevorzugt zumindest 5-fach, ganz besonders bevorzugt zumindest 7-fach erhöhte spezifische Affinität gegenüber dem T-Zell-Rezeptor der körpereigenen T-Zellen aufweisen und daher besonders bevorzugt für die erfindungsgemäße Formulierung eingesetzt werden.
Besonders bevorzugt ist der Aminosäureaustausch in der Aminosäuresequenz des HLA-C Antigenpeptids ein einzelner Aminosäureaustausch in der Aminosäureposition 1 (N-Terminus), 4 oder dem C-Terminus.
Bevorzugt ist der Aminosäureaustausch in der Aminosäuresequenz des HLA-C Neoantigenpeptids gegenüber dem Wildtyp dieses HLA-C Antigenpeptids ein C/Y, A/P, L/F oder T/M Austausch.
Bevorzugt weist das HLA-C Antigenpeptid bzw. das HLA-C-Neoantigenpeptid gegenüber dem T-Zell-Rezeptor eine spezifische Aktivität (K_D), die durch jedes geeignete Nachweisverfahren, das dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt ist, von weniger als 100 nM, besonders bevorzugt weniger als 75 nM oder ganz besonders bevorzugt von weniger als 50 nM, wie beispielsweise weniger als 40 nM, 35 nM, 30 nM, 25 nM oder 20 nM auf.
Bevorzugt ist das HLA-C Tumorantigenpeptid bzw. das HLA-C-Neoantigen in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung mit einer Konzentration, wie oben definiert, von zumindest 100 bis 600 µg, alternativ bevorzugt in absoluter Konzentration von > 600 µg bezogen auf das zu applizierende Volumen der pharmazeutischen Zusammensetzung enthalten.
Bevorzugt sind die HLA-C Antigenpeptide bzw. HLA-C-Neoantigenpeptide wie oben unter Punkt b) definiert ausgewählt.
Nach einer besonders bevorzugten Erscheinungsform ist ein „HLA-C-NeoantigenpepticT“, bevorzugt, das folgende Gerüstsequenz umfasst:

(a) eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID Nr.: 23 bis 26; und/oder
(b) eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenz, die zumindest 80 %, wie mindestens 85 %, besonders bevorzugt zumindest 90 % Sequenzidentität (wie hierin definiert) mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID Nr.: 9 bis 12 und 23 bis 26 aufweisen; und/oder
(c) eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenz, die nur einen Aminosäureaustausch gegenüber der Aminosäuresequenz(en) ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID Nr.: 9 bis 12 und 23 bis 26 umfasst bzw. im Wesentlichen daraus besteht; und/oder
(d) Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide, die aus zumindest zwei gleichen oder unterschiedlichen Peptidsequenzen von zumindest einem HLA-C Tumorantigenpeptid und einem HLA-A, HLA-B und/oder HLA-C Tumorantigenpeptid und/oder entsprechenden Neoantigenen daraus bestehen, in denen die HLA Antigenpeptide gegebenenfalls durch geeignete Linker miteinander verbunden sind (sog. Oligopeptide).

Ganz besonders bevorzugt, sind HLA-C Peptide wie unter (a), (c) bzw. (d) definiert. Auch in der Ausführungsform gemäß (d) sind die HLA-C Antigenpeptide bevorzugt wie unter (a) bzw. (c) beschrieben definiert. Im Falle, dass die HLA-C Tumorantigenpeptide und/oder HLA-C Neoantigene, wie unter (d) definiert, über einen Linker miteinander verbunden sind, so sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik geeignete Linker bekannt.
Der erfindungsgemäße Einsatz von Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide wie unter (d) definiert, die aus zumindest zwei gleichen oder unterschiedlichen Peptidsequenzen von HLA Tumorantigenpeptiden und/oder HLA Neoantigenen bestehen, hat den weiteren Vorteil, dass die längere Aminosäuresequenzen der Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide eine längere Verweildauer in dem Gewebe des Probanden nach der Applikation bewirkt, wobei die Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide nach der Applikation an den Probanden bspw. durch körpereigene Enzyme in kleinere Fragmente (pharmazeutisch aktive Form, umfassend zumindest 7 bis 11 Aminosäuren), die eine biologisch gewünschte Funktion im Sinne der Erfindung aufweisen, zerlegt werden können. D.h., die einzelnen Fragmente des Oligopeptids weisen eine Aktivität als HLA-A, HLA-B oder HLA-C Tumorantigenpeptide auf und tragen somit zur Aktivierung von T-Zellen bei.
In einer besonderen Erscheinungsform kann jede beliebige HLA-C Antigenpeptidsequenz eine humanisierte und/oder sequenzoptimierte Sequenz, wie weiter hierin beschrieben, sein.
HLA Antigenpeptide der Klasse II und HLA-II Neoantigenpeptide
Ein „HLA Antigenpeptid der Klasse //“ ist hierin definiert als ein „HLA-Peptid der Erfindung“ bzw. „Aminosäuresequenz der Erfindung“ (wie hierin definiert), die folgendes umfasst:

a) eine Aminosäuresequenz bestehend aus 13 bis 20 Aminosäuren, besonders bevorzugt 13 bis 17 Aminosäuren; und/oder
b) ein Neoantigen mit einer Aminosäuresequenz bestehend aus 13 bis 20 Aminosäuren, besonders bevorzugt 13 bis 17 Aminosäuren, das
1. i) analog zu zumindest einem auf der Zelloberfläche von Zellen aus malignem und/oder neoplastischem Gewebe (insbesondere des Mamma-/Brustkarzinoms) des zu behandelnden Individuums exponiertem HLA Peptid der Klasse II ist, und
2. ii) in seiner Aminosäuresequenz zumindest einen Aminosäureaustausch gegenüber dem Wildtyp dieses HLA Peptids der Klasse II (sog. „HLA Neoantigen der Klasse //“) und
3. iii) zumindest eine 3-fach erhöhte spezifische Affinität gegenüber dem T-Zell-Rezeptor der körpereigenen T-Zellen aufweist

Des Weiteren haben die Erfinder erkannt, dass HLA Neoantigene der Klasse II, die in ihrer Aminosäuresequenz gegenüber dem Wildtyp dieses HLA Peptids der Klasse II zumindest einen Aminosäureaustausch in den Aminosäurepositionen 3, 6, 10, 12, 13 und/oder 14, besonders bevorzugt in den Aminosäurepositionen 12 und/oder 14 aufweisen, eine zumindest 4-fach erhöhte spezifische Affinität gegenüber dem T-Zell-Rezeptor der körpereigenen T-Zellen aufweisen und daher besonders bevorzugt für die erfindungsgemäße Formulierung eingesetzt werden.
Besonders bevorzugt ist der Aminosäureaustausch in der Aminosäuresequenz des HLA Peptids der Klasse II ein einzelner Aminosäureaustausch in der Aminosäureposition 12 oder 14.
Bevorzugt ist der Aminosäureaustausch in der Aminosäuresequenz des HLA Neoantigens der Klasse II gegenüber dem Wildtyp dieses HLA Peptids der Klasse II ein E/K, E/A, D/Y oder T/M Austausch.
Bevorzugt weist das HLA Peptid der Klasse II bzw. das HLA-Neoantigen der Klasse II gegenüber dem T-Zell-Rezeptor eine spezifische Aktivität (K_D), die durch jedes geeignete Nachweisverfahren, das dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt ist, von weniger als 100 nM, besonders bevorzugt weniger als 75 nM oder ganz besonders bevorzugt von weniger als 50 nM, wie beispielsweise weniger als 40 nM, 35 nM, 30 nM, 25 nM oder 20 nM auf.
Bevorzugt ist das HLA Tumorantigenpeptid entsprechend der MHC-Komplexe der Klasse II bzw. das HLA-Neoantigen entsprechend der MHC-Komplexe der Klasse II in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung mit einer Konzentration, wie oben definiert, von zumindest 100 bis 600 µg, alternativ bevorzugt in absoluten Konzentration von > 600 µg bezogen auf das zu applizierende Volumen der pharmazeutischen Zusammensetzung enthalten.
Bevorzugt sind das/die HLA Peptid(e) der Klasse II bzw. HLA-Neoantigen(e) der Klasse II wie oben unter Punkt b) definiert ausgewählt.
Nach einer besonders bevorzugten Erscheinungsform ist ein „HLA-Neoantigen der Klasse II“, bevorzugt, das folgende Gerüstsequenz umfasst:

(a) eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID Nr.: 36, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48; und/oder
(b) ein Neoantigen mit einer Aminosäuresequenz, die zumindest 80 %, wie mindestens 85 %, besonders bevorzugt zumindest 90 % Sequenzidentität (wie hierin definiert) mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID Nr.: 36 bis 48; aufweisen; und/oder
(c) ein Neoantigen mit einer Aminosäuresequenz, die nur einen Aminosäureaustausch gegenüber der Aminosäuresequenz(en) ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID Nr.: 36 bis 48; umfasst bzw. im Wesentlichen daraus besteht; und/oder
(d) Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide, die aus zumindest zwei gleichen oder unterschiedlichen HLA Peptidsequenzen der Klasse II bestehen, in denen die HLA Antigenpeptide der Klasse II durch geeignete Linker miteinander verbunden sind (sog. Oligopeptide).
(e) Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide, die aus zumindest zwei gleichen oder unterschiedlichen Peptidsequenzen von zumindest einer HLA Antigenpeptidsequenz der Klasse II und einer HLA Antigenpeptidsequenz der Klasse II, HLA-A, HLA-B und/oder HLA-C Antigenpeptidsequenz und/oder entsprechenden Neoantigenen daraus bestehen, in denen die HLA Antigenpeptide gegebenenfalls durch geeignete Linker miteinander verbunden sind (sog. Oligopeptide).

Ganz besonders bevorzugt, sind HLA Antigenpeptide der Klasse II wie unter (a), (c) bzw. (d) definiert. Auch in der Ausführungsform gemäß (d) sind die HLA Antigenpeptide der Klasse II bevorzugt wie unter (a) bzw. (c) beschrieben definiert. Im Falle, dass die HLA Tumorantigenpeptide der Klasse II und/oder entsprechende Neoantigene, wie unter (d) definiert, über einen Linker miteinander verbunden sind, so sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik geeignete Linker bekannt.
Der erfindungsgemäße Einsatz von Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide wie unter (d) definiert, die aus zumindest zwei gleichen oder unterschiedlichen Peptidsequenzen von HLA Tumorantigenpeptiden und/oder HLA Neoantigenen bestehen, hat den weiteren Vorteil, dass die längere Aminosäuresequenzen der Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide eine längere Verweildauer in dem Gewebe des Probanden nach der Applikation bewirkt, wobei die Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide nach der Applikation an den Probanden bspw. durch körpereigene Enzyme in kleinere Fragmente (pharmazeutisch aktive Form, umfassend zumindest 7 bis 11 Aminosäuren), die eine biologisch gewünschte Funktion im Sinne der Erfindung aufweisen, zerlegt werden können. D.h., die einzelnen Fragmente des Oligopeptids weisen eine Aktivität als HLA-A, HLA-B oder HLA-C Tumorantigenpeptide auf und tragen somit zur Aktivierung von T-Zellen bei.
In einer besonderen Erscheinungsform kann jede beliebige HLA Peptidsequenz der Klasse II eine humanisierte und/oder sequenzoptimierte Sequenz, wie weiter hierin beschrieben, sein.
Der erfindungsgemäße Einsatz von zumindest 2 HLA Tumorantigenpeptide der Klasse II zur Behandlung von Brustkrebs hat den signifikanten Vorteil, dass zielgerichtet auch B-Zellen beim zu behandelnden Probanden aktiviert werden.
Der erfindungsgemäße Einsatz von HLA Tumorantigenpeptide der Klasse II hat den weiteren Vorteil, dass HLA Antigenpeptide, die gegenüber HLA Tumorantigenpeptide der Klasse I eine längere Aminosäuresequenzen aufweisen, nach der Applikation an den Probanden bspw. durch körpereigene Enzyme in kleinere Fragmente (umfassend zumindest 7 bis 11 Aminosäuren) zerlegt werden können, die eine Aktivität als HLA-A, HLA-B oder HLA-C Antigenpeptide aufweisen und somit zur Aktivierung von T-Zellen beitragen.
Unter „Fragment“ versteht man einen Teil eines Polypeptids, das vorzugsweise mindestens 10%, 20%, 30%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% oder mehr der gesamten Länge des Referenz-Polypeptids enthält. Ein Fragment kann 7, 8, 9, 10, 11 oder mehr Aminosäuren enthalten.
Insbesondere sind Aminosäuresequenzen und Polypeptide der Erfindung bevorzugt wie diese in den Ansprüchen definiert sind und solche, bei denen:

zumindest ein HLA-Tumorantigenpeptid analog zu zumindest einem auf der Zelloberfläche von Zellen aus malignem und/oder neoplastischem Gewebe des zu behandelnden Individuums exponiertem HLA-Tumorantigenpeptid ist, welches in seiner Aminosäuresequenz zumindest einen Aminosäureaustausch gegenüber dem Wildtyp dieses HLA-Tumorantigenpeptids (d.h. HLA Neoantigenpeptid) und im Vergleich zum Wildtyp dieses HLA-Tumorantigenpeptids zumindest eine 3-fach erhöhte spezifische Affinität gegenüber dem T-Zell-Rezeptor der körpereigenen T-Zellen aufweist.

Es ist eine herausragende Leistung der Erfinder, herausgefunden zu haben, dass eine pharmazeutische Zusammensetzung die mehr als 3 derartige HLA-Tumorantigenpeptide umfasst, besonders wirksam ist. Daher umfasst die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung bevorzugt zumindest sechs, ganz besonders bevorzugt zumindest acht, ganz besonders bevorzugt zehn der vorgenannten HLA-Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC-Komplexe der Klasse I und/oder II umfasst.
Bevorzugt ist eine monovalente Aminosäuresequenz (oder ein Polypeptid, das nur eine Aminosäuresequenz der Erfindung umfasst), die in der Erfindung verwendet wird, solch eine, dass sie an einen T-Zell-Rezeptor der körpereigenen T-Zellen mit einer gegenüber der entsprechenden Wildtyp-HLA-Peptidsequenz 3-fach erhöhten spezifische Affinität binden.
Es wird darauf hingewiesen, dass „kann spezifisch binden an“ und „bindet spezifisch an“ hierin synonym verwendet werden und sich auf die Fähigkeit beziehen, speziell an die entsprechend angegebene Einheit zu binden.
Wichtig in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist, dass die Diagnose der Krebserkrankung(en) bereits im Vorfeld durch den behandelnden Arzt erfolgt.
Es ist möglich, die in der Erfindung verwendeten Aminosäuresequenzen, die zu unterschiedlichen Klassen gehören, in einem einzelnen Polypeptid der Erfindung zu kombinieren. Insbesondere wurde nachgewiesen, dass die Kombination von HLA-A, HLA-B und/oder HLA-C Tumorantigenpeptiden und/oder entsprechenden Neoantigenpeptiden in einem einzelnen Polypeptid der Erfindung einzigartige Bindungseigenschaften aufweisen (vgl. 3).
Vom Fachmann kann die spezifische Aktivität (K_D) der Polypeptide der Erfindung, die mehr als eine Komponente der Aminosäuresequenz der HLA-A, HLA-B und/oder HLA-C Tumorantigenpeptide und/oder Neoantigenpeptide entsprechend der MHC-Komplexe der Klasse I oder II umfassen, nach einem der oben/unten beschriebenen Nachweisverfahren bestimmt werden, wobei die Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide der Erfindung vorzugsweise eine spezifische Aktivität aufweisen, die der spezifischen Aktivität jedes ihrer Bestandteile ähnelt, d.h. eine spezifische Aktivität, die der spezifischen Aktivität jeder der (Einzelkomponenten der) Aminosäuresequenzen der Klasse I oder II ähnelt, die in den Verbindungen, Konstrukten, Proteinen oder Polypeptiden der Erfindung enthalten sind. Einige spezifische, jedoch nicht einschränkende Beispiele der oben genannten bevorzugten Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide sind Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide, die entweder

i) ein Wildtyp HLA-Tumorantigenpeptid entsprechend der MHC-Komplexe der Klasse I (HLA-A, HLA-B bzw. HLA-C Peptid) und/oder II; oder
ii) ein Neoantigen entsprechend der MHC-Komplexe der Klasse I (HLA-A, HLA-B bzw. HLA-C Neoantigen) und/oder II mit einer Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID Nr.: 1 bis 48 ausgewählt sind; oder
iii) ein Neoantigen entsprechend der MHC-Komplexe der Klasse I (HLA-A, HLA-B bzw. HLA-C Neoantigen) und/oder II mit einer Aminosäuresequenz, die zumindest 80 % Sequenzidentität (wie hierin definiert) mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID Nr.: 1 bis 48 aufweisen; oder
iv) eine Aminosäuresequenz, die nur einen Aminosäureaustausch gegenüber der Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID Nr.: 1 bis 48 umfasst bzw. im Wesentlichen daraus besteht; oder
v) Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide, die aus zumindest zwei gleichen oder unterschiedlichen HLA-Antigenpeptidsequenzen bestehen, in denen die HLA-Peptide gegebenenfalls durch geeignete Linker miteinander verbunden sind;

Es ist zu beachten, dass die letzten vorherigen Abschnitte auch im Allgemeinen für alle Aminosäuresequenzen der Erfindung gelten, die eine oder mehrere Aminosäuresequenzen für HLA-Tumorantigenpeptide und/oder HLA-Neoantigenpeptide nach A), B), C) bzw. D) umfassen.
Selbstverständlich können alle oben genannten HLA Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC-Komplexe der Klasse I und II verwendet werden und sind zur Behandlung einer Krebserkrankung, wie hierin offenbart, insbesondere zur Behandlung von Mamma-/Brustkarzinomen wirksam.
Einige spezielle, jedoch nicht einschränkende Beispiele solcher Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide der Erfindung sind beispielsweise in den Tabellen 1-4 aufgeführt oder ergeben sich für den Fachmann auf Grundlage der vorliegenden Offenbarung.
Nach einer anderen bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung liegt das HLA-Tumorantigenpeptid (jeweils) als einzelgliedrige Aminosäuresequenz vor, d.h. nicht als Element von Verbindungen, Konstrukten, Proteinen oder Polypeptiden, die aus zumindest zwei gleichen oder unterschiedlichen Aminosäuresequenzen für HLA-Tumorantigenpeptiden/Neoantigenen bestehen, in denen die HLA-Tumorantigenpeptide/Neoantigene durch geeignete Linker miteinander verbunden.
Vorzugsweise weisen die HLA-Tumorantigenpeptide der Erfindung eine spezifische Aktivität gegenüber T-Zell-Rezeptoren (T-Zellen werden dafür benutzt) auf, die anhand eines beliebigen geeigneten Nachweisverfahrens, das dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt ist, wie beispielsweise anhand von EliSpot AlphaScreen-Nachweisverfahren (wie hierin beschrieben) oder zellbasierten Nachweisverfahren (wie hierin beschrieben) bestimmt werden können. Vorzugsweise wird die blockierende Aktivität anhand eines zellbasierten Nachweisverfahrens bestimmt, wie beispielsweise in den Ausführungsbeispielen 3 und 4 beschrieben.
Insbesondere weisen die Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide der Erfindung, die eine Aminosäuresequenz eines HLA-Antigenpeptids der Erfindung umfassen und zur MHC Klasse I gehören (wie hierin definiert), vorzugsweise gegenüber dem entsprechenden T-Zell-Rezeptor eine spezifische Affinität von 10 bis 50 nM auf.
Auch ist es Bestandteil der vorliegenden Erfindung, dass eine Aminosäuresequenz der Erfindung an zwei oder mehrere MHC-Komplexe der Klasse I bzw. II, Epitope, Komponenten, Domänen oder Untereinheiten eines MHC-Komplexes der Klasse I bzw. II binden können. In solch einem Fall können die MHC-Komplexe, Epitope, Komponenten, Domänen oder Untereinheiten eines MHC-Komplexes, an die die Aminosäuresequenzen und/oder Polypeptide der Erfindung binden, im Wesentlichen gleich oder unterschiedlich sein (und im letzteren Falle können die Aminosäuresequenzen und Polypeptide der Erfindung an solche unterschiedlichen Komplexe, Epitope, Komponenten, Domänen oder Untereinheiten eines MHC-Komplexes der Klasse I bzw. II einschließlich Kombinationen davon mit einer Affinität und/oder Spezifität binden, die gleich oder unterschiedlich sein kann).
Es wird außerdem erwartet, dass die Polypeptide der Erfindung im Allgemeinen an alle natürlich vorkommenden oder synthetischen Analoga, Varianten, Mutanten, Komponenten und Fragmente eines MHC-Komplexes der Klasse I bzw. II binden. Auch in solch einem Fall können die Aminosäuresequenzen und Polypeptide der Erfindung an solche Analoga, Varianten, Mutanten, Allelen, Komponenten und Fragmente mit einer Affinität und/oder Spezifität binden, die der Affinität und Spezifität, mit der die Aminosäuresequenzen der Erfindung an den Wildtypen des MHC-Komplexes der Klasse I bzw. II binden gleich oder verschieden sein.
Auch ist es Bestandteil dieser Erfindung, dass die Aminosäuresequenzen und Polypeptide der Erfindung an einige Analoga, Varianten oder Mutanten eines MHC-Komplexes der Klasse I bzw. II binden, jedoch nicht an andere.
In einer spezifischen, jedoch nicht einschränkenden Erscheinungsform dieser Erfindung können Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide, die ein HLA-Tumorantigenpeptid der Erfindung umfassen, eine erhöhte Halbwertszeit im Serum im Vergleich zu der Aminosäuresequenz aufweisen, von der sie abgeleitet wurden. Zum Beispiel kann eine Aminosäuresequenz dieser Erfindung (chemisch oder anderweitig) mit einer oder mehrerer Gruppen oder Einheiten verbunden sein, die die Halbwertszeit (wie beispielsweise PEG) verlängern, sodass sie ein Derivat einer Aminosäuresequenz der Erfindung mit erhöhter Halbwertszeit darstellen.
Im Allgemeinen haben die Verbindungen oder Polypeptide der Erfindung mit erhöhter Halbwertszeit vorzugsweise eine Halbwertszeit, die mindestens 1,5-mal, vorzugsweise mindestens 2-mal, wie beispielsweise mindestens 5-mal, zum Beispiel mindestens 10-mal oder mehr als 20-mal höher ist als die Halbwertszeit der entsprechenden Aminosäuresequenz der Erfindung an sich. Zum Beispiel haben die Verbindungen oder Polypeptide der Erfindung mit erhöhter Halbwertszeit eine Halbwertszeit, die mehr als 1 Stunde, vorzugsweise mehr als 2 Stunden, besonders bevorzugt mehr als 6 Stunden, wie beispielsweise mehr als 12 Stunden oder sogar mehr als 24, 48 oder 72 Stunden höher ist im Vergleich zur entsprechenden Aminosäuresequenz der Erfindung an sich.
Im Allgemeinen, wenn ein HLA-Tumorantigenpeptid der Erfindung (oder eine Verbindung, ein Konstrukt oder Polypeptid, die dasselbe umfassen) für die Verabreichung an einen Patienten vorgesehen ist (zum Beispiel für therapeutische und/oder diagnostische Zwecke, wie hierin definiert) ist dieses bevorzugt entweder eine Aminosäuresequenz, die nicht natürlich im Patienten vorkommt; oder, wenn diese natürlich im Patienten vorkommt, liegt diese in wesentlich isolierter und zugleich konzentrierter Form vor (wie hierin definiert).
Außerdem wird es für den Fachmann auch klar sein, dass bei pharmazeutischer Verwendung die HLA-Tumorantigenpeptide der Erfindung (sowie die Verbindungen, Konstrukte und Polypeptide, die dasselbe umfassen) gegen einen menschlichen T-Zell-Rezeptor einschließlich Kombinationen davon wie in den Ansprüchen definiert, gerichtet werden; wobei zu veterinären Zwecken die Polypeptide der Erfindung bevorzugt gegen einen T-Zell-Rezeptor einschließlich Kombinationen davon (wie in den Ansprüchen festgelegt) von der zu behandelnden Spezies gerichtet sind oder zumindest kreuzreaktiv gegenüber einem T-Zell-Rezeptor einschließlich Kombinationen davon von den zu behandelnden Spezies sind.
Das zu behandelnde Mamma-/Brustkarzinom ist vorzugsweise ein hormonpositiver, HER2/neu oder tripple negativer Brustkrebs.
Verfahren zum Ermitteln/Identifizieren der HLA-Antigenpeptide
Von der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zum Bestimmen pharmazeutisch wirksamer HLA-Tumorantigenpeptide zur Verwendung bei der Behandlung oder zur Profilaxe von Mamma-/Brustkarzinomen bzw. in einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung umfasst, wobei das Verfahren das Überwachen einer Gewebesektion eines Patienten bzw. einer Patientengruppe umfasst, der/die an einem Mamma-/Brustkarzinom erkrankt ist oder im Verdacht steht, an einem Mamma-/Brustkarzinom zu erkranken, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:

(a) Bereitstellen einer Gewebeprobe aus einer Gewebesektion, vorzugsweise eines Mamma-/Brustkarzinoms des Patienten bzw. der Patientengruppe, wobei die Zellen der Gewebeprobe MHC-Komplexe der Klasse I und/oder II exprimieren und diese auf ihrer Oberfläche präsentiert werden;
(b) Bestimmen folgender Parameter anhand der bereitgestellten Gewebeprobe der Gewebesektion aus Schritt (a):
1. i) dem Transkriptom der bereitgestellten Gewebeprobe zum Ermitteln aller in mRNA-Sequenzen umgeschriebener DNA-Sequenzen und zum Quantifizieren der mRNA-Sequenzen, und Vergleichen des ermittelten Transkriptoms mit dem Transkriptom einer gesunden Gewebeprobe des Patienten bzw. der Patientengruppe zum Bestimmen hoch- und/oder runterregulierter mRNA-Sequenzen, die um den Faktor 3 zum Schwellwert in der gesunden Gewebeprobe abweichen;
2. ii) dem spezifischen HLA Haplotyp, vorzugsweise einschließlich der HLA-Haplosubtypen des Patienten bzw. der Patientengruppe, und ganz besonders bevorzugt in Bezug auf die MHC-Klasse-I-Komplexe, und gegebenenfalls Ableiten der präferierten Ankerpositionen der MHC-Klasse-I-Komplexe (wie hierin definiert);
3. iii) der Exomsequenz der bereitgestellten Gewebeprobe zum Ermitteln aller DNA-Sequenzen, die potenziell für Proteine codieren, und Vergleichen des Exoms der bereitgestellten Gewebeprobe mit dem Exom einer gesunden Gewebeprobe oder mit einer Gendatenbank (Bibliothek) des Patienten bzw. der Patientengruppe zur Bestimmung somatischer Mutationen, wodurch vorteilhaft Keimbahnmutationen im gesunden Gewebe ausgeschlossen werden, sodass eine Autoimmunantwort bei/nach Applikation der ermittelten HLA-Antigenpeptide an den Patienten bzw. die Patientengruppe verhindert wird (die Gewinnung einer gesunden Gewebeprobe des Patienten bzw. die Patientengruppe kann bspw. durch Entnahme einer Blutprobe mit kernhaltigen Zellen erfolgen); und Ermitteln der HLA-Tumorantigenpeptide, mit der Proliferation, Invasivität, Angiogenese und einer Erhöhung der Zytokeratinproduktion des Mamma-/Brustkarzinoms assoziiert sind; und Ermitteln der HLA-Tumorantigenpeptide, die mit der Proliferation, Invasivität, Angiogenese und einer Erhöhung der Zytokeratinproduktion eines Mamma-/Brustkarzinoms assoziiert sind;
4. iv) des Ligandoms zum Bestimmen der in Schritt (iii) ermittelten HLA-Tumorantigenpeptide, die auf der Oberfläche der Zellen des Mamma-/Brustkarzinoms präsentiert sind, wobei optional auch die HLA-Antigenpeptide bestimmt werden, die auf der Oberfläche von Zellen einer gesunden Gewebeprobe des Patienten bzw. der Patientengruppe präsentiert sind;
5. v) der spezifischen Bindungsaffinität der in Schritt (iv) ermittelten HLA Tumorantigenpeptide gegenüber dem entsprechenden MHC-Komplex der Klasse I und/oder II, der in den Zellen der Gewebeprobe, vorzugsweise eines Mamma-/Brustkarzinoms exprimiert und auf der Oberfläche dieser Zellen präsentiert wird, mittels Datenbank und/oder eines Rankingalgoritmus; und/oder
6. vi) optional der Immunogenität der in Schritt (iv) ermittelten HLA-Tumorantigenpeptide mittels eines Immunogenitätstests insbesondere mittels Westernblot, ELISA-Techniken, insbesondere mittels ELISPOT, AFM oder Immunodetektion mit mikroskopischer Analyse;
(c) Auswahl von HLA-Tumorantigenpeptiden, vorzugsweise zumindest 4 bis 8 HLA-A Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und zumindest 2 Antigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-II-Komplexe, die die Kriterien gemäß der in Schritt (b) definierten Parameter erfüllen und die in den Zellen der bereitgestellten Gewebeprobe exprimiert und auf der Oberfläche dieser Zellen präsentiert werden.

Nach einer bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens zum Bestimmen pharmazeutisch wirksamer HLA-Tumorantigenpeptide erfolgt unmittelbar nach dem Bereitstellen der Gewebeprobe des Patienten oder der Patientengruppe in Schritt (a) die Untersuchung der Gene BRCA1 und BRCA2 auf das Vorliegen von Mutationen.
Besonders bevorzugt erfolgt das Bestimmen, ob die HLA-Tumorantigenpeptide auf der Oberfläche der Zellen der in Schritt a) bereitgestellten Gewebeprobe des Patienten oder der Patientengruppe präsentiert werden, mittels Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie (UHPCL) in Verbindung mit ESI Massenspektrometrie (MS) erfolgt.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung umfasst das Verfahren zum Ermitteln eines HLA-Peptids der Klasse I und/oder II in Schritt (b) das Erstellen eines Transkriptoms der Gewebeprobe, die in Schritt (a) bereitgestellt wird.
Bevorzugt erfolgt das Erstellen des Transkriptoms mittels RT-PCR, wobei im Anschluss ein DNA-Microarray oder eine DNA-Sequenzierung durchgeführt wird.
Besonders bevorzugt umfasst das Verfahren zum Ermitteln eines HLA-Antigenpeptids der Klasse I und/oder II in Schritt (b) das Erstellen einer Exomsequenzierung für diese Gewebeprobe, die in Schritt (a) bereitgestellt wird.
Es ist auch wünschenswert, dass das Verfahren zum Ermitteln eines pharmazeutisch aktiven HLA-Tumorantigenpeptids der Klasse I und/oder II in Schritt (b) das Abgleichen der ermittelten Aminosäuresequenzen der HLA-Antigenpeptide entsprechend der MHC-Komplexe der Klasse I und/oder II mit einer Reihe, Sammlung oder Bibliothek von Aminosäuresequenzen umfasst, umso ein Ranking hinsichtlich Proteinquantität (d.h. Faktoren, die mit der Proliferation, Invasivität, Angiogenese und/oder einer Erhöhung der Zytokeratinproduktion des Mamma-/Brustkarzinoms assoziiert sind) und der spezifischen Affinität gegenüber dem T-Zell-Rezeptor der körpereigenen T-Zellen (inhaltliche Faktoren für Tumorprogress, wie Invasivität, Angiogenese, aber auch die Escape Mechanismen des Tumors gegenüber dem Immunangriff) abzuleiten.
Das Verfahren umfasst auch das Abgleichen der ermittelten Parameter mit Aminosäuresequenzen der HLA Tumorantigenpeptide mit einer Reihe, Sammlung oder Bibliothek von Aminosäuresequenzen gesunder Expressionsdaten auf Aminosäuresequenzen, die an MHC-Klasse-I-Komplexe bzw. MHC-Klasse-II-Komplexe einschließlich Kombinationen davon, ermittelt in Schritt (i), binden können oder eine Affinität dafür aufweisen.
In solch einem Verfahren kann die Reihe, Sammlung oder Bibliothek von Aminosäuresequenzen eine geeignete Reihe, Sammlung oder Bibliothek von Aminosäuresequenzen sein. Zum Beispiel kann die Reihe, Sammlung oder Bibliothek von Aminosäuresequenzen eine Reihe, Sammlung oder Bibliothek von HLA-Tumorantigenpeptiden und/oder MHC-Komplexen der Klasse I und Klasse II (wie hierin beschrieben sein), wie beispielsweise eine native Reihe, Sammlung oder Bibliothek von HLA-Tumorantigenpeptiden und/oder MHC-Komplexen der Klasse I und Klasse II sein; eine synthetische oder halbsynthetische Reihe, Sammlung oder Bibliothek von HLA-Tumorantigenpeptiden und/oder MHC-Komplexen der Klasse I und Klasse II und/oder eine Reihe sein; eine Sammlung oder Bibliothek von HLA-Tumorantigenpeptiden und/oder MHC-Komplexen der Klasse I und Klasse II, die einer Affinitätsreifung unterzogen wurden.
Um die pharmazeutische Wirksamkeit der durch das abgeleitete Ranking ermittelten HLA-Tumorantigenpeptide zu spezifizieren und um das Risiko einer Autoimmunantwort in dem Probanden durch die Verabreichung der ermittelten HLA-Tumorantigenpeptide zu verhindern bzw. zu minimieren, wird mit den, durch das erfindungsgemäße Ermittlungsverfahren (vor-)ermittelten HLA-Tumorantigenpeptiden ein Immunogenitätstest, insbesondere mittels Westernblot, ELISA-Techniken, insbesondere mittels ELISPOT, AFM oder Immunodetektion mit mikroskopischer Analyse durchgeführt. Vorteilhaft kann bei dieser Erscheinungsform des Verfahrens zum Ermitteln zumindest eines pharmazeutisch wirksamen HLA-Tumorantigenpeptids auf das zeit- und kostenaufwändige Erstellen eines Transkriptoms und die Exomsequenzierung für diese Gewebeprobe verzichtet werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Verfahren zum Bestimmen der Regression, des Verlaufs oder des Auftretens einer Erkrankung an einem Mamma-/Brustkarzinom, umfassend das Überwachen einer Gewebesektion, insbesondere eines Brustgewebes eines Patienten, der an einem Mamma-/Brustkarzinom erkrankt ist oder im Verdacht steht, an einem Mamma-/Brustkarzinom zu erkranken, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:

(a) Bereitstellen einer Gewebeprobe eines Probanden, wobei die Zellen der Gewebeprobe HLA-Komplexe der Klasse I und/oder II exprimieren und auf ihrer Zelloberfläche präsentieren;
(b) Bestimmen mehrere Parameter anhand der bereitgestellten Gewebeprobe, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
1. i) der Konzentration (dem Expressionsniveau) von zumindest 4 bis 8 HLA-A Antigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und zumindest 2 Antigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-II-Komplexe, die in den Zellen der bereitgestellten Gewebeprobe exprimiert und auf der Zelloberfläche dieser Zellen präsentiert werden; und
2. ii) der Aminosäuresequenz zumindest dieser 4 bis 8 HLA-A Antigenpeptide und zumindest dieser 2 Klasse-II-Antigenpeptiden, die in den Zellen der bereitgestellten Gewebeprobe exprimiert und auf der Zelloberfläche dieser Zellen präsentiert werden; und
3. iii) der spezifischen Bindungsaffinität der in Schritt ii) ermittelten HLA-A Antigenpeptide und der Klasse-II-Antigenpeptide gegenüber dem T-Zell-Rezeptor der körpereigenen T-Zellen; und
4. iv) optional der Immunogenität der ermittelten HLA-A Antigenpeptide und der Klasse-II-Antigenpeptide mittels eines Immunogenitätstests (z.B. mittels Westernblot, ELISA-Techniken, insbesondere mittels ELISPOT oder Immunodetektion mit mikroskopischer Analyse);
(c) Abgleichen der ermittelten Aminosäuresequenzen der HLA Antigenpeptide mit einer Reihe, Sammlung oder Bibliothek von Aminosäuresequenzen auf Aminosäuresequenzen, die an MHC-Klasse-I-Komplexe bzw. MHC-Klasse-II-Komplexe einschließlich Kombinationen davon, ermittelt in Schritt (i), binden können oder eine Affinität dafür aufweisen.

Eine weitere, insbesondere kostenreduzierte Erscheinungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Ermitteln zumindest eines HLA-Tumorantigenpeptids entsprechend der MHC-Komplexe der Klasse I und/oder II für eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung sieht vor, dass ausschließlich (d.h. ohne vorangehendes Erstellen eines Transkriptoms, Exomsequenzierung) die HLA-Tumorantigenpeptide der Klasse I und/oder II ermittelt werden, die auf der Zelloberfläche von Zellen aus malignem und/oder neoplastischem Gewebe des zu behandelnden Individuums exponiert sind (Bestimmen des Ligandoms).
Das Verfahren besteht hierbei aus den folgenden Schritten:

a) Bereitstellen einer Gewebeprobe aus einer Gewebesektion eines Probanden, der vorzugsweise ein lokal wiederkehrenden Mamma-/Brustkarzinom aufweist oder im Verdacht steht, an einem Mamma-/Brustkarzinom zu erkranken; und
b) Ermitteln/Auswahl der HLA-Tumorantigenpeptide, die auf der Zelloberfläche der Zellen des entnommenen Gewebes exponiert sind entsprechend des Bestimmens der Parameter anhand der bereitgestellten Gewebeprobe aus Schritt (a) gemäß Schritt (b) des vorgenannten Verfahrens zum Bestimmen pharmazeutisch wirksamer HLA-Tumorantigenpeptide (wie oben definiert); und
c) Bestimmen der Affinität der HLA-Tumorantigenpeptide, die auf der Zelloberfläche der Zellen des entnommenen Gewebes exponiert sind, gegenüber dem T-Zell-Rezeptor der körpereigenen T-Zellen; und
d) Ableiten eines Rankings hinsichtlich Proteinquantität (wie hierin spezifiziert) und spezifischer Affinität (K_D) gegenüber den T-Zell-Rezeptoren der körpereigenen T-Zellen;

Ausführliche Beschreibung und Definitionen
In der vorliegenden Beschreibung und den vorliegenden Ansprüchen werden folgende Begriffe wie folgt definiert:

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sollen die mit „umfassend“ bestimmten Merkmale der Erfindung so verstanden werden, dass sie die stärker beschränkte Beschreibung von „bestehend aus“ oder „im Wesentlichen bestehend aus“ der gleichen Merkmale der vorliegenden Erfindung enthalten.

Der Begriff „und/oder“ dient der spezifischen Offenbarung der beiden Merkmale oder Komponenten miteinander oder getrennt voneinander. Daher schließt der Begriff „und/oder“ wie beispielsweise bei der Formulierung „I und/oder II“ verwendet in der vorliegenden Offenbarung „I und II“, „I oder II“, „I“ und „II“ ein.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung ist hierin als sog. Informatikum zu verstehen, dass einem Patienten oder einer Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel verabreicht werden kann und die die erfindungsgemäße Kombination an HLA-Tumorantigenpeptide in der hierin offenbarten Konzentration enthält, wobei ein HLA-Tumorantigenpeptid einen Informationsträger darstellt. Dies bedeutet, dass durch die Anordnung der Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der HLA-Tumorantigenpeptide („Code“) eine sequenzspezifische Aktivierung des Immunsystems, insbesondere von T-Zellen (durch HLA-Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe) und/oder B-Zellen (durch HLA-Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-II-Komplexe) induziert wird. Somit macht die in vitro oder in vivo Beladung von MHC-Klasse-I-Komplexe bzw. MHC-Klasse-II-Komplexe der Tumorzellen mit den HLA-Tumorantigenpeptiden der erfindungsgemäßen pharmazeutische Zusammensetzung, die eine gleiche oder geringfügig modifizierte Aminosäuresequenz mit HLA-Tumorantigenpeptiden aufweisen, bzw. das Kontaktieren von T-Zellen mit diesen HLA-Tumorantigenpeptiden Tumorzellen sensitiv für die Lyse der Tumorzellen des Gewebes bzw. der Gewebesektion durch spezifische zytotoxische oder spezifisch aktivierte T-Lymphozyten.
Primäres Ziel der vorliegenden Erfindung ist allerdings nicht die in vitro oder in vivo Beladung von Tumorzellen mit HLA-Tumorantigenpeptiden, sondern die gezielte Aktivierung und das Trainieren des Immunsystems, insbesondere von T-Zellen und B-Zellen gegenüber Tumorzellen zu induzieren. Aus diesem Grund wird die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung vorzugsweise subkutan oder intradermal und, vorzugsweise im Wesentlichen gleichzeitig (d.h. sukzessive) an zumindest 2, besonders bevorzugt an zumindest 3 Applikationsorten, entfernt von einer Tumorläsion und/oder dem krebsartigen Lymphknotenbereich appliziert. Dies hat den besonderen Vorteil, dass das Immunsystem bzw. die T-Zellen, die die applizierten HLA-Tumorantigenpeptiden erkennen, diese in Form von Tumorantigenpeptiden applizierte Information verarbeiten und folglich gezielt Tumorzellen, die diese HLA-Tumorantigenpeptide auf ihrer Oberfläche präsentieren, erkennen und lysieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat daher den Vorteil, dass im Falle, dass die Signale, die der Tumor gegenüber dem Immunsystem aussendet zu schwach (passive) sind oder dass der Tumor aktiv Substanzen ausschüttet, die dessen Wachstum befördern (Makrophagen anregen) (aktive z.B. TREX oder BD1 hochfahren), das Immunsystem, insbesondere die T-Zellen auf die Anwesenheit des Tumors trainiert werden kann, auch wenn die Signale, die vom Tumor ausgesendet werden zu schwach sind. Die Signale, die vom Tumor ausgesendet werden, sind zu schwach, wenn die Präsentation der HLA-Antigenpeptide auf der Zelloberfläche der Tumorzellen gering ist oder als Reaktion auf erfolgte zytotoxische T-Zellenangriffe abnimmt (Escapemechanismus).
Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist ein HLA-Antigenpeptid ein HLA-Tumorantigenpeptid, wenn dieses ein tumorexklusives (d.h. ausschließlich von Tumorzellen exprimiertes und/oder exponiertes HLA-Antigenpeptid; ein Cancer-Testis-Antigen (CTA), das im gesunden/normalen Gewebe des erwachsenen Patienten/der Patientengruppe nicht mehr vorkommt oder ein sog. Neoantigenpeptid) oder ein tumorassoziiertes HLA-Antigenpeptid ist.
„Tumorexklusive HLA-Antigenpeptide“ sind mutierte HLA-Antigenpeptide, die beispielsweise durch eine Mutation eines Gens entstehen, wobei die Mutation des Gens für das Tumorwachstum ursächlich ist und/oder mit der Onkogenese zusammenhängt. Das mutierte Genprodukt im Tumor ist für den einzelnen Patienten oder eine bestimmte Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel spezifisch.
„Tumorassoziierte HLA-Antigenpeptide“ umfassen nicht mutierte HLA-Antigenpeptide, die im adulten Stadium nur in einigen Geweben des Patienten oder einer bestimmten Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel, aber auch in den Tumorzellen exprimiert werden. Die Immunogenität tumorassoziierter HLA-Antigenpeptide ist normalerweise gering, da deren Vorhandensein in gesunden Zellen immunologische Toleranz (Immuntoleranz) erzeugen kann. Gleichwohl besteht in der Induktion einer starken Immunantwort gegen HLA-Antigenpeptide, die lediglich tumorassoziiert sind, die Gefahr einer Autoimmunantwort.
Ein immunogenes HLA Tumorantigenpeptid wird hierin auch als „Epitop“ bezeichnet.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung sind die mit den tumorassoziierten HLA-Antigenpeptiden korrespondierenden MHC-Komplexe mit der Proliferation, Invasivität, Angiogenese und einer Erhöhung der Cytokeratinproduktion des Mamma-/Brustkarzinoms assoziiert. Der Fachmann kennt entsprechende Datenbanken und Literatur, in der diese Auswirkungen aufgeführt sind (bspw. die Datenbanken der National Center for Biotechnology Information (NCBI)).
Das mindestens eine HLA-Tumorantigenpeptid im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist insbesondere zur subkutanen Verabreichung formuliert. Der Ausdruck/Begriff „Zusammensetzung“ bezeichnet daher die Bereitstellung zumindest eines HLA-Tumorantigenpeptides und eines Adjuvans in einer pharmazeutischen Formulierung, die eine gute Anwendbarkeit ermöglicht und umfasst Lösungen, insbesondere Injektionslösungen und Infusionslösungen, Konzentrate zur Herstellung von Injektions- und Infusionszubereitungen, Pulver zur Herstellung von Injektions- und Infusionszubereitungen und subkutane Implantate.
Pharmazeutische Zusammensetzungen werden hergestellt, indem die ermittelten HLA-Tumorantigenpeptide in einer Trägerflüssigkeit (d.h. einem pharmakologisch verträglichem Vehikel) gegebenenfalls unter Zusatz weiterer Hilfsstoffe wie Netzmittel, Farbstoffe, Permeationsförderer, resorptionsfördernde Stoffe, Konservierungsstoffe, Antioxidantien, Lichtschutzmittel gelöst bzw. suspendiert werden.
Die Trägerflüssigkeit ist vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus Natriumchlorid-Injektionslösung, Ringiers Injektionslösung, isotonische Dextrose, steriles Wasser, Dextroselösung, Laktierte Ringers Injektionslösung, destilliertes Wasser oder Mischungen davon, zur lokalen Injektion ausgewählt.
Besonders von Vorteil für eine gute Löslichkeit der ermittelten HLA-Tumorantigenpeptide ist, wenn deren Aminosäuresequenz eine möglichst geringe Anzahl hydrophober Aminosäuren aufweist.
Als Permeationsförderer eignen sich vorzugsweise Dimethylsulfoxid (DMSO), Ethoxyethylendiglycol, Ethanol, Phosphatidylcholine, Propylenglykoldipelargonate (DPPG), oder glycolysierte ethoxylierte Glyceride enthalten.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung Wasser, eine pharmazeutisch verträgliche Kochsalzlösung und/oder DMSO. Beispielsweise eignen sich zur Applikation pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein Gemisch aus etwa 30% DMSO und 70% Wasser enthalten.
Der hier verwendete Ausdruck „HLA-Tumorantigenpeptid (entsprechend der MHC-Komplexe) der Klasse /“ bezeichnet eine Peptidsequenz, die an den MHC-Komplex (beim Menschen an den HLA-Komplex) der Klasse I gebunden bzw. immunogen ist. Der HLA-Proteinkomplex der Klasse I dient der Antigenpräsentation auf der Zelloberfläche und umfasst eine schwere Kette (heavy chain) mit 3 Domänen (α1, α2 und α3) und das β2-Mikroglobulin (β2M).
Der Ausdruck „HLA-Tumorantigenpeptid (entsprechend der MHC-Komplexe) der Klasse //“ bezeichnet eine Polypeptidsequenz, die an den MHC-Komplex (beim Menschen an den HLA-Komplex) der Klasse II gebunden bzw. immunogen ist. Der HLA-Proteinkomplex der Klasse II dient der Antigenpräsentation auf der Zelloberfläche und besteht aus zwei nahezu gleich großen Ketten, einer α-Kette und einer nicht kovalent gebundenen β-Kette, wobei jede Kette zwei extrazelluläre Domänen besitzt (α1 und α2 sowie β1 und β2).
Als solches können die Polypeptide und pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung (wie hierin definiert) zur Verwendung bei der Prävention und Behandlung von Mamma-/Brustkarzinomen (hierin auch als „Krebserkrankung“ bezeichnet) verwendet werden. Allgemeinen können die „Krebserkrankung der Erfindung“ als Krankheiten und Störungen definiert werden, die entsprechend verhindert und/oder behandelt werden können durch angemessene Verabreichung entweder eines Tumorantigenpeptids oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung (und insbesondere einer pharmazeutisch wirksamen Menge davon) an einen Probanden (d.h. eine Person mit der Krankheit oder Störung oder mindestens einem Symptom davon und/oder, bei der die Gefahr besteht, dass sich diese eine derartige Krankheit oder Störung zuzieht oder diese entwickelt).
Eine „Peptidsequenz“ (z.B. ein HLA-Antigenpeptid) mit einer „nativen Sequenz“ umfasst im Sinne der vorliegenden Erfindung eine Peptidsequenz mit der gleichen (d.h. unmodifizierten) Aminosäuresequenz wie eine natürlich im Patienten vorkommende Peptidsequenz. Eine solche Peptidsequenz mit einer „nativen Sequenz“ kann aus der Natur isoliert oder rekombinant bzw. synthetisch hergestellt werden. Der Begriff Peptidsequenz mit einer „nativen Sequenz“ umfasst insbesondere natürlich vorkommende verkürzte oder sekretierte Formen der Peptidsequenz (z.B. eine extrazelluläre Domänensequenz), natürlich vorkommende Varianten (z.B. alternativ gespleißte Formen) und natürlich vorkommende allelische Varianten der Peptidsequenz.
Wie ferner hierin beschrieben, sind die in der Erfindung verwendeten Aminosäuresequenzen einzelne variable HLA-Antigenpeptiddomänen („HLAs“ bzw. „HLA-Komplex“). Eine einzelne variable HLA-Antigenpeptiddomäne ist (wie ferner hierin definiert) ein Bereich innerhalb der Aminosäuresequenz eines Proteins, der aufgrund definierter Eigenschaften von seiner Umgebungssequenz unterschieden werden kann.
Aminosäuresequenzen bzw. Bereiche innerhalb der Aminosäuresequenz eines Proteins der Erfindung, die HLAs sind, werden hierin auch als „HLAs der Erfindung“ bezeichnet. Einige bevorzugte Beispiele für einzelne variable HLA-Antigenpeptiddomänen, die für die Verwendung der Erfindung geeignet sind, ergeben sich aus der weiteren Beschreibung hierin und umfassen insbesondere HLA-A, HLA-B und HLA-C Antigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und HLA-DR, DQ und DP Antigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-II-Komplexe.
Solche Neoantigenpeptide (d.h. ausschließlich von Tumorzellen exprimierte und/oder exponierte HLA-Antigenpeptide), die weniger als 1 00% Sequenzidentität oder Ähnlichkeit mit dem nativen HLA-Antigenpeptid aufweisen, zeichnen sich im Sinne der vorliegenden Erfindung vorzugsweise durch einen Aminosäureaustausch in der Aminosäuresequenz aus.
Die folgenden Begriffe werden verwendet, um die Sequenzbeziehungen zwischen zwei oder mehreren Aminosäuresequenzen bzw. Polypeptidsequenzen zu beschreiben: „Referenzsequenz“, „Aminosäureaustausch“, „Sequenzidentität“, „Prozentsatz der Sequenzidentität“ und „substanzielle Identität“.
Der Begriff „Aminosäureaustausch“ bezeichnet im Rahmen der vorliegenden Erfindung den Austausch einer Aminosäure gegen eine andere Aminosäure innerhalb der Aminosäuresequenz des zu synthetisierenden HLA-Antigenpeptids gegenüber dem Wildtyp dieses HLA-Antigenpeptids (d.h. natives HLA Antigenpeptid). „Sequenzidentität“, „Prozentsatz der Sequenzidentität“ bzw. Identität oder Ähnlichkeit in Bezug auf diese Aminosäuresequenz ist hierin definiert als der Prozentsatz der Aminosäurereste in der Aminosäuresequenz des Polypeptids, die identisch (d.h. gleiche Rest) oder ähnlich (d.h. Aminosäurerest aus derselben Gruppe basierend auf gemeinsamen Seitenketteneigenschaften, siehe unten) zur Aminosäuresequenz des Wildtyps ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst der Aminosäureaustausch für das HLA-Antigenpeptid entsprechend der MHC-Komplexe der Klasse I und/oder II zumindest einen D/Y-, einen C/Y-, einen A/V-, einen T/M, einen E/A- oder einen D/A-Austausch an einer beliebigen Position innerhalb der Aminosäuresequenz gegenüber dem Wildtyp dieses HLA-Peptids.
Die hierin verwendeten Aminosäuren sind nach dem allgemein anerkannten Einbuchstabencode der IUPAC-Nomenklaturkommission abgekürzt. Sind zwei Aminosäuren durch einen Trennstrich (/) voneinander getrennt, so bedeutet dies, dass an einer spezifischen Aminosäureposition in der betreffenden Aminosäuresequenz die Aminosäure des Wildtyps (linke Seite des Trennstrichs) durch eine andere Aminosäure ausgetauscht ist (rechte Seite des Trennstrichs).
Zum Bestimmen/Ableiten bevorzugter Ankerpositionen und eines bevorzugten spezifischen Aminosäureaustauschs in der Aminosäuresequenz der HLA-Tumorantigenpeptide eignen sich insbesondere in silico Modellierungsverfahren, wie bspw. mittels des Algorithmus NetMHC 4.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/) basierend auf den Veröffentlichungen von Andreatta und Nielsen (Bioinformatics (2016) Feb 15;32(4):511-7) und Nielsen et al. (Protein Sci., (2003) 12:1007-17).
Zum Zwecke des Vergleichs von zwei oder mehreren Aminosäuresequenzen kann der Prozentsatz der „Sequenzidentität“ zwischen einer ersten Aminosäuresequenz und einer zweiten Aminosäuresequenz berechnet oder bestimmt werden, indem die Anzahl der Aminosäuren in der ersten Aminosäuresequenz, die mit den Aminosäuren an den entsprechenden Positionen in der zweiten Aminosäuresequenz identisch sind, durch [die Gesamtzahl der Aminosäuren in der ersten Aminosäuresequenz] teilt und mit [100%] multipliziert, wobei jede Deletion, Insertion, Substitution oder Addition einer Aminosäure in der zweiten Aminosäuresequenz - verglichen mit der ersten Aminosäuresequenz - als eine Differenz zu einer einzelnen Aminosäure (Position) betrachtet wird.
Ein HLA-Tumorantigenpeptid ist „immunogen“, wenn die Tumorzellen auf ihrer Zelloberfläche zumindest einen entsprechenden MHC-Klasse-I-Komplex und/oder zumindest einen entsprechend MHC-Klasse-II-Komplex exponieren, der das HLA-Tumorantigenpeptid erkennt und anbindet, d.h. das HLA-Tumorantigenpeptid weist eine hohe spezifische Aktivität gegenüber diesem MHC-Klasse-I-Komplex und/oder MHC-Klasse-II-Komplex auf. Die Immunogenität des HLA-Tumorantigenpeptids kann dabei mittels Westernblot, ELISA-Techniken, insbesondere mittels ELISPOT oder Immunodetektion mit mikroskopischer Analyse erfolgen.
Die HLA-Tumorantigenpeptide der vorliegenden Erfindung sind bevorzugt immunogen und werden daher auch als immunogene HLA-Tumorantigenpeptide („Epitope“) bezeichnet. Die Immunogenität der HLA-Tumorantigenpeptide kann durch geeignete Nachweisverfahren bestimmt werden. Derartige Verfahren sind dem Fachmann bekannt und/oder hierin beschrieben.
Der Begriff „spezifische Affinität“ oder „spezifische Bindungsaffinität“ des HLA-Antigenpeptids gegenüber dem T-Zell-Rezeptor (TCR) bezeichnet die spezifische und reversible Bindung des HLA-Peptids an den TCR der körpereigenen T-Zellen. Diese „spezifische Affinität“ gemäß der vorliegenden Erfindung wird über die durch Ligandenbindungstests ermittelte Dissoziationskonstante (K_D) in Mol ausgedrückt.
Alternativ kann die „spezifische Affinität“ des HLA-Antigenpeptids auch über in silico Methoden bestimmt werden.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung ist zumindest ein HLA-A Tumorantigenpeptide ein tumorexklusives HLA-A Tumorantigenpeptid (d.h. ein Cancer-Testis-Antigen (CTA), das im gesunden/normalen Gewebe des Patienten/der Patientengruppe nicht mehr vorkommt oder ein sog. Neoantigenpeptid), und wobei die spezifische Bindungsaffinität des tumorexklusiven HLA-A Tumorantigenpeptids bestimmt gegenüber den entsprechenden MHC-Klasse-I-Komplex mit einer K_D im Bereich von 10 bis 50 nM erfolgt, wie mit Oberflächenplasmonresonanz bestimmt.
Basierend auf konventionellen in-silico-Bindungsvorhersagemodellen (Modelling) gelten grundsätzlich Tumorantigenpeptide mit einem K_D von <50 nM als stark-bindende und solche mit einem K_D zwischen 50 und 500 nM als schwach-bindende Tumorantigenpeptide. In den erfindungsgemäßen in-vivo-Bestimmungen hat sich nun allerdings gezeigt, dass es nicht zwingend auf den K_D-Wert ankommt. Überraschenderweise wurde gefunden, dass Tumorantigenpeptide, die einen KD-Wert im Bereich zwischen 50 und 500 nM aufwiesen, entgegen konventioneller in-silico-Bindungsvorhersagemodellen, die diese als niedrig bindend angesehen haben, Effektorzellen (d.h. zytotoxische T-Zellen) ausgelöst. Für die Wirksamkeit der Tumorantigenpeptide ist es somit wesentlich, dass die Tumorantigenpeptide immunogen sind.
Der Begriff „Wirkstoffverstärker/Adjuvans“ bezeichnet einen Hilfsstoff, der die Wirkung der HLA-Peptide überhaupt erst auslöst und/oder verstärkt. Grundsätzlich sind alle gängigen dem Fachmann bekannten Adjuvanzien zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Formulierung geeignet.
Als besonders geeignet hat sich allerdings die Verwendung von Montanide ISA 51 VG herausgestellt. Dieser bildet nach Applikation der (Arzneimittel-)Formulierung an den Probanden ein sogenanntes Granulom aus, dass die HLA-Peptide vorteilhaft in Art eines Reservoirs am Ort der Applikation speichert und über einen längeren Zeitraum an den Organismus des Probanden abgibt. Besonders vorteilhaft entfallen daher wöchentliche Applikationen der erfindungsgemäßen (Arzneimittel-)Formulierung. Bevorzugt muss die Applikation der (Arzneimittel-)Formulierung zur Behandlung von Krebserkrankungen im Sinne der Erfindung bei Anwendung über einen längeren Zeitraum daher lediglich alle 2 Wochen, besonders bevorzugt nur einmal monatlich erfolgen.
Der Ausdruck „Individuum“ (hierin auch als „Proband“ oder „Patient“ benannt) wird synonym verwendet mit dem Ausdruck „Proband“ und bezeichnet jedes Säugetier, das gegen eine abnormale physiologische Bedingung behandelt wird oder bei dem eine Krankheit diagnostiziert wurde.
Die Begriffe „Individuum“ und „Proband“ im Sinne der vorliegenden Erfindung schließen Säugetiere, wie beispielsweise ein Nagetier, einen Carnivore, einen Paarhufer, einen Unpaarhufer oder einen Primat ein. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der Proband ein Mensch.
Sofern hierin von einer „Patientengruppe“ gesprochen wird, ist stets eine Gruppe von Individuen, vorzugsweise Menschen die Rede, die alle zumindest ein, vorzugsweise zumindest zwei, ganz besonders bevorzugt zumindest drei identische(s) HLA-Allel(e) aufweisen.
Es ist zulässig, dass die mit der pharmazeutischen Zusammensetzung zu behandelnden Patienten ein Standardtherapieverfahren (z.B. mindestens eine Operation, Bestrahlung, Chemotherapie und/oder Hormontherapie) erhalten haben.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann allerdings auch als eine Erstlinientherapie dem Patienten oder der spezifisch bestimmten Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel verabreicht werden.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung hat das Individuum noch keine Chemotherapie gegen lokal wiederkehrenden oder metastasierenden Brustkrebs erhalten hat und/oder 12 Monate oder weniger seit der letzten Dosis keine vorhergehende adjuvante Chemotherapie in Rekurrenz mehr erhalten hat.
Besonders bevorzugt weist das Individuum den Haplotyp mit der Subgruppe A*01 oder A*02 auf.
Ein „Haplotyp“ (eine Abkürzung für „haploider Genotyp“) ist die Summe der Zusammensetzung aller spezifischen Allelle (= spezifischer Fingerabdruck) eines Probanden und bezeichnet eine Variante einer Nukleotidsequenz auf ein und demselben Chromosom im Genom eines Lebewesens. Ein bestimmter Haplotyp kann individuen-, populations- oder auch artspezifisch sein.
Das Transkriptom umfasst im Sinne dieser Erfindung die Summe aller zu einem bestimmten Zeitpunkt in einer Zelle transkribierten, das heißt von der DNA-Sequenz in mRNA-Sequenzen umgeschriebenen Gene, also die Gesamtheit aller als auch die Quantifizierung der einzelnen in einer Zelle hergestellten mRNA-Moleküle. Allerdings erlaubt die Erstellung des Transkriptoms noch keine Aussage über die „Richtigkeit“ der umgeschriebenen mRNA-Sequenzen.
In diesem Zusammenhang bezeichnet der Begriff „Erstellen eines Transkriptoms“ in der vorliegenden Offenbarung die Analyse des Transkriptoms als Summe aller zu einem bestimmten Zeitpunkt in einer Zelle transkribierten Gene vorzugsweise mittels quantitativer Echtzeit-(RT)-PCR und anschließendem DNA-Microarray oder anschließender DNA-Sequenzierung. Üblicherweise umfasst das Erstellen des Transkriptoms der Gewebeprobe, die in Schritt (a) des erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahrens bereitgestellt wird, das Erfassen von mehr als 40.000 kodierenden DNA-Sequenz (Rohdaten).
Als Exom bezeichnet man in der Genetik die Gesamtheit der Exons eines Organismus, also alle Abschnitte, die potenziell Proteine codieren. Beim Menschen umfasst das Exom etwa 23.000 Gene mit ca. 50 Millionen Nukleobasen. Beim Whole Exome Sequencing (WES) werden alle Exons, d.h. die für Proteine kodierenden Abschnitte im Genom eines Gewebeabschnitts (d.h. gesundes Gewebe oder Tumorgewebe eines Probanden), untersucht. Die genetische Diagnostik fokussiert sich dabei auf diese 1-2% des menschlichen Genoms, in dem 85 % der bekannten krankheitsverursachenden Mutationen zu finden sind.
Die Exom-Analyse umfasst entsprechend die Sequenzierung des Exoms des Patienten (und gegebenenfalls weiterer Angehöriger), der Auswertung der Sequenzdaten und der Zusammenfassung der Ergebnisse in einem medizinischen Befund. Diese Diagnostik stellt, insbesondere bei Patienten mit komplexer oder unspezifischer Symptomatik und oft jahrelang ungeklärter Diagnose, die Methode der Wahl dar, um die Ursache der Erkrankung zu finden.
Im Vergleich zum Whole Exome Sequencing (WES), bei der alle proteincodierenden Bereiche der etwa 23.000 bekannten Gene angereichert und sequenziert werden, wird beim Clinical Exome Sequencing (CES) ein Subset des Exoms angereichert. Bei der WES wird der Fokus auf die Bestimmung krankheitsassoziierter Gene gelegt, die in der Human Gene Mutation Database (HGMD) beschrieben sind.
Das Proteom bezeichnet im Sinne der vorliegenden Erfindung die Gesamtheit aller Proteine zumindest einer Zelle in einem malignen oder neoplastischen Gewebe/einer Gewebesektion oder einem Zellkompartiment davon, unter exakt definierten Bedingungen und zu einem bestimmten Zeitpunkt. Das Proteom einer Zelle kann durch eine Proteomsequenzierung bestimmt werden und ist über das Transkriptom mit dem Genom dieser Zelle verbunden.
Immuntherapien basieren darauf, dass das individuelle Mutationsmuster (Signatur) des Tumors jedes einzelnen Krebspatienten entschlüsselt wird. Auf das Profil des Mutationsmusters werden nach konventionellen Behandlungsansätzen für jeden einzelnen Patienten passgenau synthetische Impfstoffe, beispielsweise auf RNA-Basis hergestellt (d.h. Vakzinherstellung bzw. Herstellung des erfindungsgemäßen Informatikums). Diese werden im Anschluss für die individuelle Behandlung des Patienten eingesetzt.
Grundsätzlich taugen diese neuartigen Impfstoffe nichts für andere Patienten mit dem gleichen Tumor, sondern sind nur jeweils für den Patienten einsetzbar, dessen Mutanom für die Vakzineherstellung bzw. Herstellung des erfindungsgemäßen Informatikums zuvor analysiert wurde. Daher ist es eine herausragende Leistung der Erfinder, erkannt zu haben, dass verschiedene Patienten Überschneidungen in dem Mutanom des malignen oder neoplastischen Gewebes/der Gewebesektion davon aufweisen. Vorteilhaft lassen sich verschiedene Patienten in einheitliche Patientengruppen unterteilen, sodass zumindest 50 % der HLA-Peptide der erfindungsgemäßen Formulierung mit dem Mutanom der Patientengruppe kompatibel ist.
Die Gesamtheit aller HLA-Antigenpeptide, die über MHC-Moleküle auf der Zelloberfläche präsentiert werden, wird im Sinne der Erfindung als das (HLA-)Ligandom bezeichnet. Es wird angenommen, dass mehr als 10⁵ HLA-Moleküle auf der Zelloberfläche exprimiert werden und die Anzahl der identischen präsentierten HLA-Peptide zwischen einigen wenigen und bis zu 10.000 Kopien pro Zelle variieren kann. Folglich werden auf einer Zelle ungefähr 10.000 verschiedene HLA-Peptide in unterschiedlichen Mengenanteilen präsentiert.
Das Ligandom wird durch verschiedene physiologische, intrinsische sowie pathologische (bspw. Krebs oder Nekrose) Faktoren wie beispielsweise den Zelltyp oder die Gewebeart, Infektion oder Transformation der Zelle oder einfach den aktuellen Zustand der Zelle, der von Nährstoffsituation oder äußeren Stressfaktoren abhängt, beeinflusst, was zu Veränderungen der präsentierten HLA-Peptide führt.
Zu Beginn der Analyse des HLA-Ligandoms kann beispielsweise der Edman-Abbau verwendet werden, um erste Erkenntnisse über die präsentierten Peptide zu gewinnen. Zum einen ist es auf diese Weise möglich, über Poolsequenzierungen das allgemeine Peptidmotiv eines Allels zu ermitteln, zum anderen können über die Analyse einzelner reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC)-Fraktionen bereits einzelne Peptidsequenzen ermitteln werden.
Alternativ oder ergänzend kann die Analyse des Ligandoms durch den Einsatz moderner Massenspektrometer in der Proteomik erfolgen, mit der es möglich ist, die Sequenzen vieler einzelner Liganden eindeutig zu ermitteln. Für die hierbei erforderliche Ionisierung der Peptide oder Proteine finden zwei Methoden Verwendung: Die Elektrospray-Ionisation (ESI) und die matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI). Bei der ESI ist die Kopplung mit einem RP-HPLC-System üblich. Mit zunehmender Sensitivität der Massenspektrometer wurde jedoch auch die Kapillarelektrophorese (capillary eletrophoresis, CE) als analytische Trennmethode verwendet.
Um einen höheren Probendurchsatz und eine gesteigerte Sensitivität bei der Ligandomanalyse zu erreichen können die sogenannten UHPLC-Systeme (ultra high performance liquid chromatography) verwendet werden. Diese HPLC-Systeme verwenden als Packmaterial für Trennsäulen lediglich Materialien mit 2 µm Durchmesser, was zu einer verbesserten Geschwindigkeit, Effizienz und chromatographischen Auftrennung führt.
Bei der ESI-Massenspektrometrie ermöglicht die direkte Kopplung von HPLC und ESI-Interface eine online-Trennung der Probe, was in Kombination mit einem Autosampler einen vollständig automatisierten Ablauf der Messprozedur ermöglicht. Wegen des kontinuierlichen Lösungsmittelflusses von der HPLC können die Proben in verhältnismäßig kurzer Zeit gemessen werden. Die ESI-Massenspektrometrie verwendet ein breites Spektrum von Instrumenten zur Analytik wie beispielsweise Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometer, lineare Quadrupol-Ionenfallen, Tripelquadrupole oder lonenfallen-Orbitrap-Hybridsysteme. Dies erlaubt vorteilhaft die Identifikation von hunderten HLA-Peptiden in einer Messung.
Der Ausdruck „Ableiten eines Rankings“ bezieht sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung auf das Ermitteln/die Auswahl der Quantität und der Affinität der HLA-Peptide, die auf der Zelloberfläche der Zellen des entnommenen Gewebes (bzw. einer Gewebesektion davon) exponiert sind.
Mit Hilfe der vorangegangenen Analysen wird ein kumulatives Ranking für die HLA-Antigenpeptide hinsichtlich Proteinqualität und spezifischer Affinität (K_D) gegenüber dem T-Zell-Rezeptor der körpereigenen T-Zellen abgeleitet. Dabei werden hinsichtlich der Proteinqualität insbesondere inhaltliche Faktoren für den Tumorprogress, wie Invasivität, Angiogenese, aber auch die Escape Mechanismen des Tumors gegenüber dem Immunangriff bewertet.
Ein kumulatives Ranking-System wird vom Algorithmus verwendet
Eine kumulative (vorausschauende) Rangfolge wird verwendet, um Sequenzen zu eliminieren,
In einer anderen Verkörperung können die höchstrangigen Sequenzmöglichkeiten durch ihre Existenz in einer Datenbank von möglichen HLA-Antigenpeptiden mit einer hohen spezifischen Affinität gegenüber den körpereigenen T-Zell-Rezeptoren (wie hierin definiert), die aus Sequenzdaten vorhergesagt werden, weiter qualifiziert werden, insbesondere eine, die auf den Organismus/Probanden beschränkt ist, aus dem das HLA-Antigenpeptid gewonnen wurde. In einer anderen Ausführungsform können die höchstrangigen Sequenzmöglichkeiten durch die Trennkoordinaten des HLA-Antigenpeptids (z.B. isoelektrischer Punkt und Molekulargewicht eines Proteins) und/oder dessen Monomerzusammensetzung weiter qualifiziert werden.
Zum Bereitstellen von (Tumor-)Antigenpeptiden können grundsätzlich synthetische oder isolierte HLA-Tumorantigenpeptide, die aus dem kumulativen Ranking abgeleitet wurden für die Herstellung der (Arzneimittel-)Formulierungen der vorliegenden Erfindung und zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung (als sog. Informatikum) verwendet werden.
Es bietet sich jedoch an, synthetische HLA-Peptide zu verwenden. Verfahren zur synthetischen Herstellung von Peptiden sind dem Fachmann bekannt. Beispiele derartiger Herstellungsverfahren sind die Merrifield-Festphasen-Peptidsynthese, die Bailey-PeptidSynthese und die N-Carbonsäureanhydrid-Methode.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch (Arzneimittel-)Formulierungen in unterschiedlichen Darreichungsformen, die die erfindungsgemäße Wirkstoffkombination und gegebenenfalls weitere Wirkstoffe und/oder Hilfsstoffe enthalten.
Bevorzugte Arzneimittelformulierungen sind Tabletten, Kautabletten, Kaugummis, Dragees, Kapseln, Tropfen, Säfte, Sirupe, Suppositorien, transmucale therapeutische Systeme, transdermale therapeutische Systeme, Lösungen, Injektionen, Emulsionen, Suspensionen, leicht rekonstituierbare Trockenzubereitungen, Pulver oder Sprays. Besonders bevorzugte Arzneimittelformulierungen sind Injektionen oder Lösungen.
Alternativ liegt die Arzneimittelformulierung in einer geeigneten Applikationsvorrichtung vor, vorzugsweise als Lyophilisat in einer Spritze, welche eine in situ-Rekonstitution mit einer pharmazeutisch akzeptablen Lösung (z.B. Kochsalzlösung) erlaubt.
Vorzugsweise eignen sich die erfindungsgemäßen (Arzneimittel-)Formulierungen zur oralen, intravenösen, intramuskulären, subkutanen, intrathekalen, epiduralen, bukkalen, sublingualen, pulmonalen, rektalen, transdermalen, nasalen oder intracerebroventrikularen Applikation, wobei (Arzneimittel-)Formulierungen zur subkutanen oder intravenösen Applikation besonders bevorzugt sind.
Im Stand der Technik für das Herstellen von pharmazeutischen Zusammensetzungen bzw. Darreichungsformen bekannte Verfahren werden in zum Beispiel „Remington's Pharmaceutical Sciences“ gefunden. Pharmazeutischen Zusammensetzungen für die parenterale Verabreichung können zum Beispiel Exzipienten, steriles Wasser, oder Salzlösung, Polyalkylenglycole, wie Polyethylenglycole, Öle von pflanzlichem Ursprung, oder hydrierte Naphtalene enthalten. Biokompatible, biologisch-abbaubare Lactid-Polymer, Lactid/Glycolid-Copolymere, oder Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Copolymere können verwendet werden, um die Freisetzung der Verbindungen zu steuern. Andere potentiell nützliche parenterale Abgabesysteme für die therapeutischen Anti-Prion-Verbindungen umfassen Ethylenvinylacetat-Copolymer-Partikel, osmotische Pumpen, implantierbare Infusionssysteme und Liposomen.
Inhaltliche Faktoren für Tumorprogress
Wichtig für das Erstellen des Rankings ist auch das Ermitteln von Faktoren, die für den Tumorprogress (d.h. die Größenzunahme und/oder Metastasierung von Tumoren) eine wesentliche Rolle spielen. Charakteristisch für den Tumorprogress sind eine erhöhte Wachstumsgeschwindigkeit, sowie eine gesteigerte Invasivität des Tumors.
Als Invasivität bezeichnet man den Umfang des gewebedurchsetzenden Wachstums eines malignen Tumors von seinem Ursprungsort in angrenzende Gewebestrukturen.
Angiogenese beschreibt das Entstehen neuer Blutgefäße aus einem bereits vorhandenen Blutgefäßsystem und ist Bestandteil sowohl physiologischer Prozesse (z.B. Embryogenese, Wundheilung), als auch pathologischer Prozesse (z.B. diabetische Retinopathie, chronische Polyarthritis, Tumorwachstum). Seit langem ist bekannt, dass es bei Krebserkrankungen zu einer Gefäßneubildung (Angiogenese) kommt, die als Tumor-Angiogenese bezeichnet wird. Tumore bestehen aus Zellen, die, wie alle anderen Zellen im Körper, Nährstoffe und Sauerstoff benötigen. Weil sich Krebszellen häufig teilen, ist ihr Bedarf sogar besonders hoch. Und deshalb benötigt ein Tumor eigene Blutgefäße.
Wenn ein Tumor entsteht, hat er zunächst noch keine eigenen Blutgefäße. Sein Wachstum ist deshalb stark eingeschränkt. Ohne eigene Blutgefäße wird er nicht größer als 1 bis 2 Millimeter. Auch die Bildung von Metastasen steht in Wechselwirkung mit der Tumor-Angiogenese, denn dazu müssen Tumorzellen in umliegende Blutgefäße gelangen. Erst dann können sie in ferne Körperregionen transportiert werden und dort Metastasen bilden.
Beispielsweise ist bekannt, dass eine gegenseitige Abhängigkeit zwischen Klasse I HLA und Integrin β besteht, um die Signaltransduktion und Zellproliferation zu stimulieren. Dabei hängt die Integrin β-vermittelte Zellmigration von ihrer Wechselwirkung mit dem Klasse I HLA-Molekülen ab (Zhang und Reed, Hum Immunol. 2012 Dec, 73(12), 1239-1244).
Ein HLA-Peptid der Erfindung oder eine Zusammensetzung bzw. Formulierung, die selbige enthält, kann für das Modulieren eines HLA-Komplexes der Klasse I bzw. II einschließlich Kombinationen davon, entweder in vitro (z. B. in einem in-vitro- oder zellulären Nachweisverfahren) oder in vivo (z. B. in einem einzelligen oder in einem mehrzelligen Organismus und insbesondere in einem Säugetier und ganz besonders in einem menschlichen Lebewesen, wie beispielsweise in einem menschlichen Lebewesen, bei dem das Risiko besteht, an einer Krebserkrankung der Erfindung zu erkranken, oder die darunter leiden) verwendet werden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeuten „Modulierung“ oder „Modulieren“ im Wesentlichen das Erhöhen der spezifischen Affinität von T-Zell gegenüber einem tumorexklusiven oder tumorassoziierten MHC-Klasse-I-Komplex bzw. MHC-Klasse-II-Komplex des malignen und/oder neoplastischen Gewebes, wie anhand eines geeigneten in-vitro-, zellulären oder in-vivo-Nachweisverfahrens gemessen (wie beispielsweise den hierin genannten). Insbesondere bedeutet „Modulieren“ oder „modulieren“ das Erhöhen der spezifischen Affinität von körpereigenen T-Zellen des Patienten bzw. der Patientengruppe gegenüber einem tumorexklusiven oder tumorassoziierten MHC-Klasse-I-Komplex bzw. MHC-Klasse-II-Komplex des malignen und/oder neoplastischen Gewebes, um mindestens 1 %, vorzugsweise mindestens 5 %, wie beispielsweise 10 % oder mindestens 25 %, zum Beispiel um mindestens 50 %, mindestens 60 %, mindestens 70 %, mindestens 80 % oder 90 % oder mehr im Vergleich zur Affinität von T-Zellen gegenüber einem tumorexklusiven oder tumorassoziierten MHC-Klasse-I-Komplex bzw. MHC-Klasse-II-Komplex des malignen und/oder neoplastischen Gewebes im selben Nachweisverfahren unter denselben Bedingungen, jedoch ohne Vorhandensein bzw. vorherige Applikation der HLA Tumorantigenpeptide der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung (wie hierin definiert).
In einer besonderen Ausführungsform umfasst die Erfindung das oben genannte Verfahren, wobei das Expressionsprofil von mindestens fünf, vorzugsweise mindestens sechs, ganz besonders von mindestens 6 Markergene, wie in SEQ ID Nr.: 1 bis SEQ ID Nr.: 48 dargestellt, bestimmt wird. Wie oben erwähnt, sind die Markergene auch durch Varianten definiert, die wiederum in den Tabelle 2 bis 4 dargestellt sind. Vorzugsweise wird dieses Expressionsprofil mit dem Expressionsprofil einer „Referenz“ verglichen. Eine Referenz kann zum Beispiel das Expressionsprofil von gesundem Gewebe (z.B. Darmgewebe oder Gewebe der Leber, Lunge etc.) sein. Als „gesundes Gewebe“ kann hierbei Gewebe des betroffenen Individuums (Proband) verwendet werden, wobei von diesem Gewebe bekannt ist, dass es nicht proliferativ verändert oder gar metastatisch ist. Entsprechende Beispiele sind im experimentellen Teil der Erfindung dargestellt. Allerdings können als „Referenz“ oder „Referenzwert“ auch Daten von Geweben von fremden Individuen, vorzugsweise Gesunden herangezogen werden.
Wie hierin dargelegt wird, sollen erfindungsgemäß im Verfahren zur Erkennung eines Karzinoms mindestens 6, vorzugsweise jedoch mindestens 8, ganz besonders bevorzugt mindestens 10 der hier dargestellten HLA-Antigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe bzw. MHC-Klasse-I-Komplexe (ausgewählt aus der Gruppe der Polypeptide/ Polypeptidabschnitte, wie in den SEQ ID Nrn.: 1 bis 48 gezeigt) bestimmt werden. Weitere Ausführungsformen sind dem experimentellen Teil zu entnehmen.
Die vorliegende Erfindung umfasst ferner ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung bzw. einer (Arzneimittel-)Formulierung, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:

(a) Bestimmen von zumindest 4 bis 8 HLA-A Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und zumindest 2 Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-II-Komplexe, die auf der Zelloberfläche von Zellen aus einem Mamma-/Brustkarzinom des zu behandelnden Patienten oder Patientengruppe mit gleichem Haplotyp exponiert sind, mit dem erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahren, wie oben beschrieben;
(b) Synthese der in Schritt (a) ermittelten 4 bis 8 HLA-A Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und zumindest 2 Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-II-Komplexe, wobei die Definition jedes HLA Tumorantigenpeptids die gleiche ist, wie oben definiert; und
(c) Herstellen der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung umfassend zumindest die in Schritt (b) synthetisierten 4 bis 8 HLA-A Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe, der zumindest 2 Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-II-Komplexe und ein Adjuvans, wie hierin definiert.

Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung bzw. der (Arzneimittel-)Formulierung zur Herstellung eines Arzneimittels oder eines Kombinationspräparats zur Behandlung von Malignomen, Leukämie und Neoplasien, insbesondere von Brustkrebs.
Von der Erfindung ist auch eine pharmazeutische Zusammensetzung umfasst, die ein HLA-Peptid im Sinne der Erfindung und einen pharmazeutisch unbedenklichen Hilfsstoff umfasst.
Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf ein HLA Antigenpeptid bzw. ein Neoantigenpeptid der Erfindung zur Verwendung bei der Herstellung einer Formulierung (wie beispielsweise, ohne Beschränkung auf eine pharmazeutische Formulierung, wie ferner hierin beschrieben) für die Behandlung von Krebserkrankungen, entweder in vitro (z. B. in einem in-vitro- oder zellulären Nachweisverfahren) oder in vivo (z. B. in einem einzelligen oder mehrzelligen Organismus und insbesondere in einem Säugetier und ganz besonders in einem menschlichen Lebewesen, wie beispielsweise in einem menschlichen Lebewesen, bei dem das Risiko besteht, an einer Krebserkrankung der Erfindungen zu erkranken, oder die darunter leiden).
Die vorliegende Erfindung umfasst ferner auch ein Kombinationspräparat zur Verwendung bei der Behandlung von Mamma-/Brustkarzinomen mit gleichzeitiger, getrennter, oder aufeinanderfolgender Verabreichung,
das Kombinationspräparat umfasst dabei die folgenden zwei getrennten Präparate (a) und (b):

(a) ein erstes Präparat, das zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel, 4 bis 8 HLA-A Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und zumindest 2 Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-II-Komplexe wie hierin beschrieben umfasst, und die optional mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt wurden, und
(b) ein zweites Präparat, das zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel, ein Antikrebsmittel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antikrebsalkylierungsmitteln, Antikrebs-Antimetaboliten, Antikrebsantibiotika, pflanzlichen Antikrebsmedikamenten, platinkoordinierten Antikrebskomplexverbindungen, Antikrebscamptothecinderivate, Antikrebstyrosinkinaseinhibitoren, monoklonalen Antikörpern, Interferonen, Interleukinen, biologischen Reaktionsmodifikatoren und anderen Antikrebsmitteln oder einem pharmazeutisch verträgliches Salz davon, umfasst.

Das erfindungsgemäße Kombinationspräparat eignet sich insbesondere zur Verwendung bei der Behandlung bzw. zur Profilaxe von Mamma-/Brustkarzinomen, insbesondere lokal wiederkehrenden oder metastasierenden Mammakarzinomen bei einem Patienten oder einer Patientengruppe, der/die an einem Mamma-/Brustkarzinom erkrankt ist oder im Verdacht steht, an einem Mamma-/Brustkarzinom zu erkranken.
Besonders bevorzugt wird das erste Präparat des erfindungsgemäßen Kombinationspräparats dabei subkutan verabreicht.
Besonders gute Erfahrungen wurden bei der Verabreichung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung (erstes Präparat) in Kombination mit der Gabe von pflanzlichen Antikrebsmedikamenten, insbesondere Artesunate und/oder Curcumin als zweites Präparat gemacht.
Gleichwohl bevorzugt ist die kombinierte Verabreichung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung (erstes Präparat) in Kombination mit einem monoklonalen Antikörper, insbesondere gegen immunsuppressive Proteine ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus CTLA4 (hierin z.B. Ipilimumab - Yervoy®), PDL1 (hierin z.B. Nivolumab - Opdivo) , PD1-L, auch EpCam, IDO, MIC, Fas und TRAIL; spezifisch: als Östrogenhemmer für hormonpositive Patienten aus der Gruppe der Aromatasehemmer - (hierin z.B. Letrozol und/oder der Östrogenblocker Fulvestrant); als Antikörper gegen HER2-positive Patienten: Herceptin (TDM-1) als zweites Präparat.
Ebenfalls offenbart ist eine Geschäftsmethode, die die Vermarktung von 4 bis 7 HLA-A Antigenpeptiden und zumindest 2 Antigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-II-Komplexe zur Behandlung von Brustkrebs bei einem Menschen umfasst, um den CA 15-3 Wert eines Patienten oder einer Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel wirksam zu reduzieren, insbesondere das progressionsfreie Überleben zu erhöhen oder die Wahrscheinlichkeit eines Wiederauftretens von Krebs zu verringern oder die Überlebenschancen des Patienten zu erhöhen. In einigen Ausführungsformen folgt auf die Vermarktung die Behandlung des Patienten mit der Kombination der HLA Antigenpeptide.
Figurenliste
Hierin zeigt:

1: schematische Darstellung einer HLA-A-vermittelten Anbindung eines T-Zellrezeptors an ein MHC-Molekül der Klasse I, wobei die Anker(aminosäure)reste des HLA-A-Antigenpeptids (7-11 Aminosäuren in der Länge) dargestellt sind.
2: schematische Darstellung einer HLA-B-vermittelten Anbindung eines T-Zellrezeptors an ein MHC-Molekül, wobei die Anker(aminosäure)reste des HLA-B-Antigenpeptids (12-17 Aminosäuren in der Länge) dargestellt sind.
3: die Entwicklung des Spezifischen Tumormarkers CA 15-3 nach spezifischer Immuninformation durch die erfindungsgemäße Zusammensetzung an Tumorantigenpeptiden gemäß dem Ausführungsbeispiel 3 (INC 14/1713; Stern), die die Epitope des Primärtumors MC-HER2/Neu abbilden. Der abgebildete Verlauf umfasst 26 Wochen.
4: die Entwicklung des Spezifischen Tumormarkers CA 15-3 in Verbindung mit dem Lebermarker Gamma GT nach Applikation spezifischer Immuninformation durch die Zusammensetzung an Tumorantigenpeptiden gemäß dem Ausführungsbeispiel 3 (INC 14/1713; senkrechte Linie), die die spezifischen Metastasen-Epitope der Lebermetastasen des gestreuten MC-HER2/Neu abbilden. Der abgebildete Verlauf umfasst 34 Wochen.
5: die klinische Wirksamkeit der applizierten pharmazeutischen Zusammensetzung von Ausführungsbeispiel 4.

Ausführungsbeispiele
Anhand nachfolgender Figuren und Ausführungsbeispiele soll die vorliegende Erfindung näher erläutert werden, ohne die Erfindung auf diese zu beschränken.

Die nachfolgenden Tabellen führen HLA-Tumorantigenpeptide auf, die alle getestet wurden und immunogen sind. Die SEQ ID Nrn.: 13 bis 48 listen einige bevorzugte, jedoch nicht einschränkende Beispiele für Aminosäuresequenzen von Tumorantigenpeptiden der Erfindung, wobei jedes dieser Beispiele eine weitere Erscheinungsform der vorliegenden Erfindung darstellt. Tabelle 1 [Vergleichsbeispiel]:

Tumorantigenpeptid	Wildtyp HLA-Peptid	spezifische Aktivität gegenüber T-Zell-Rezeptor [nM]	Zielprotein [Sequenzposition in der Gesamtsequenz des Proteins]
HLA-A Antigenpeptid (Subtyp: A29-02)	CVGRRNYRFFY	132,00	ZDHHC18
(SEQ ID Nr.: 1)				p.C228Y
HLA-A Antigenpeptid	HAVFVQSYY	141,00	SMAD 4
(SEQ ID Nr.: 2)	HAVFVQSYY	141,00		p.A406V
HLA-A Antigenpeptid	LLDPEDVD	20986,09	PLEC
(SEQ ID Nr.: 3)	LLDPEDVD	20986,09		p.D220Y
HLA-A Antigenpeptid	HTDIYANY	142,87	PCSK1
(SEQ ID Nr.: 4)	HTDIYANY	142,87		p.T128M
HLA-A Antigenpeptid	AVFVQSYY	65,00	SMAD4
(SEQ ID Nr.: 5)	AVFVQSYY	65,00		p.A406V
HLA-B Antigenpeptid	EEEAAAAAAY	147,31	FBX02
(SEQ ID Nr.: 6)	EEEAAAAAAY	147,31		p.E39A
HLA-B Antigenpeptid	MEVLSQEIVR	5407,15	GRIPAP1
(SEQ ID Nr.: 7)	MEVLSQEIVR	5407,15		p.R822W
HLA-B Antigenpeptid	HMKKMMKDL	131,67	STIM1
(SEQ ID Nr.: 8)	HMKKMMKDL	131,67		p.D247A
HLA-C Antigenpeptid	SSTALHPCPF	180,82	PRR21
(SEQ ID Nr.: 9)	SSTALHPCPF	180,82		p.A63P
HLA-C Antigenpeptid	LSYLHVHTA	283,98	STS
(SEQ ID Nr.: 10)	LSYLHVHTA	283,98		p.L284F
HLA-C Antigenpeptid	YSLLSLLHT	1550,46	STK40
(SEQ ID Nr.: 11)	YSLLSLLHT	1550,46		p.T107M
HLA-C Antigenpeptid	CPFTHGSSPM	160,14	PRR21
(SEQ ID Nr.: 12)	CPFTHGSSPM	160,14		p.C67Y

Tabelle 2:

Neoantigenpeptid (Subtyp)	Aminosäuresequenz des Neoantigenpeptids	Wildtyp HLA-Peptid (Vergleichsbeispiel)	Aminosäureaustausch	spezifische Aktivität gegenüber T-Zell-Rezeptor [nM]	Zielprotein [Sequenzposition in der Gesamtsequenz des Proteins]
HLA-A Neoantigenpeptid	YVGRRNYRFFY	CVGRRNYRFFY	C/Y	16,00	ZDHHC18 [228-238]
(Subtyp: A01.01; A29.02; C16.01)					p.C228Y
(SEQ ID Nr.: 13)					p.C228Y
HLA-A Neoantigenpeptid	HVVFVQSYY	HAVFVQSYY	A/V	32,00	SMAD 4 [405-413]
(Subtyp: A01.01; A29.02)					p.A406V
(SEQ ID Nr.: 14)					p.A406V
HLA-A Neoantigenpeptid	LLDPEDVY	LLDPEDVD	D/Y	45,67	PLEC [372-379]
(Subtyp: A01.01)					p.D379Y
(SEQ ID Nr.: 15)					p.D379Y
HLA-A Neoantigenpeptid	HMDIYANY	HTDIYANY	T/M	24,97	PCSK1 [174-181]
(Subtyp: A01.01; A29.02)					p.T175M
(SEQ ID Nr.: 16)					p.T175M
HLA-A Neoantigenpeptid	VVFVQSYY	AVFVQSYY	A/V	18,00	SMAD4 [406-413]
(Subtyp: A01.01; A29.02)					p.A406V
(SEQ ID Nr.: 17)					p.A406V
HLA-A Neoantigenepitop (TSA)	DEDEIKWWW	DEDEIEWWW	E/K	9,77	TP53BP2 [1091-1099]
(Subtyp: A02.01, B18.01)					p.E1096K
(SEQ ID Nr.: 18)					p.E1096K
HLA-A Neoantigenepitop (TSA)	FVNDKFMPL	FVNDKFMPP	P/L	12,73	ZC3H12A [269-277]
(Subtyp: A02.01)					p.P277L
(SEQ ID Nr.: 19)					p.P277L
HLA-B Neoantigenpeptid	EEAAAAAAAY	EEEAAAAAAY	E/A	41,45	FBX02 [37-46]
(Subtyp: A01.01; B44.03)					p.E39A
(SEQ ID Nr.: 20)					p.E39A
HLA-B Neoantigenpeptid	MEVLSQEIV W	MEVLSQEIVR	R/W	25,66	GRIPAP1 [813-822]
(Subtyp: A01.01; B44.03)					p.R822W
(SEQ ID Nr.: 21)					p.R822W
HLA-B Neoantigenpeptid	HMKKMMKAL	HMKKMMKDL	D/A	16,48	STIM1 [240-248]
(Subtyp: A01.01; B08.01)					p.D247A
(SEQ ID Nr.: 22)
HLA-C Neoantigenpeptid	SSTPLHPYPF	SSTALHPCPF	A/P	44,19	PRR21 [60-69]
(Subtyp: A01.01; C16.01)					p.A63P
(SEQ ID Nr.: 23)
HLA-C Neoantigenpeptid	FSYLHVHTA	LSYLHVHTA	L/F	38,46	STS [284-292]
(Subtyp: A01.01; C16.01)					p.L284F
(SEQ ID Nr.: 24)
HLA-C Neoantigenpeptid	YSLLSLLHM	YSLLSLLHT	T/M	42,42	STK40 [99-107]
(Subtyp: A01.01; C16.01)					p.T107M
(SEQ ID Nr.: 25)
HLA-C Neoantigenpeptid	YPFTHGSSPM	CPFTHGSSPM	C/Y	30,96	PRR21 [67-76]
(Subtyp: C16-01)					p.C67Y
(SEQ ID Nr.: 26) (B08.01)

Tabelle 3:

	Aminosäuresequenz des HLA-Tumorantigenpeptids	Aminosäureaustausch	spezifische Aktivität gegenüber T-Zell-Rezeptor [nM]	Zielprotein [Sequenzposition in der Gesamtsequenz des Proteins]
Klasse I HLA-A Antigenpeptid	TYLPTNASLSF	--	137,50	ERB2
(Subtyp: A24)				[63-72]
(SEQ ID Nr.: 27)				[63-72]
Klasse I HLA-Antigenpeptid	DAVIVKLEI	--	7376,79	PKD2
(Subtyp: B51.01)				[861-869]
(SEQ ID Nr.: 28)				[861-869]
Klasse I HLA-Neoantigen	YYLDLSITR	R/I	3674,81	PKD2
(Subtyp: A24.02)		(p.R3971)		[391-399]
(SEQ ID Nr.: 29)		(p.R3971)		[391-399]
Klasse I HLA-A Antigenpeptid	ILFGISLREV	--	13,61	MAGEC1
(Subtyp: A02)				[26-35]
(SEQ ID Nr.: 30)				[26-35]
Klasse I HLA-A Antigenpeptid	KVVEFLAML	--	58,22	MAGEC1
(Subtyp: A02.01)				[150-158]
(SEQ ID Nr.: 31)				[150-158]
Klasse I HLA-A Neoantigenpeptid	FVNDKFMPL	P/L	12,73	ZC3H12A
(Subtyp: A02.01)		p.P277L		[269-277]
(SEQ ID Nr.: 32)		p.P277L		[269-277]
Klasse I HLA-A Neoantigenpeptid	FLLILKRDS	N/D p.N104D	10793,42	ENTHD2
(Subtyp: A02.01)				[96-105]
(SEQ ID Nr.: 33)				[96-105]
Klasse I HLA-A Neoantigenpeptid	RTPLSALCV	P/L	7172,33	ASIP
(Subtyp: A02.01)		p.P92L		[86-94]
(SEQ ID Nr.: 34)		p.P92L		[86-94]
Klasse I HLA-B Neoantigenpeptid	DEDEIKWWW	E/K	9,77	TP53BP2
(Subtyp: B18.01		p.E1096K		[1091-1099]
(SEQ ID Nr.: 35)		p.E1096K		[1091-1099]

Beispiel 1: Transkriptom-Analyse [mRNA-Expression]
Die Transkriptom-Analyse (Sequenzierung) erfolgte bei allen Patienten mit Hilfe der PANTHER-Chipanalyse (44K-Chip) von Agilent Technologies. Der verwendete 44K-Chip enthält 44.000 Gensonden, so dass mit diesem Chip pro Patientin jeweils die Aktivität von >34.000 Genexpressionsmarkern analysiert werden konnten. Dabei wurden jeweils 1.000 Gene mit erhöhter Relevanz 10-fach bestimmt.
Die Auswertung erfolgt auf der Basis publizierter Gensignaturen, die dem Fachmann bekannt sind.
Beispiel 2: EXOM-Sequenzierung
Die Exom-Sequenzierung erfolgt aus dem Standard Gefrierpräparat der Patienten bei den die Tumor DNA extrahiert wird. Aus der Tumorprobe wird eine Next-Generation-Sequenzierung des Exoms mit Abdeckung von über 95% des gesamten codierenden Exonbereiches des Menschen durchgeführt. Dazu werden u.a. >290.000 relevante Abschnitte der DNA selektiv amplifiziert und durch Halbleiter Sequenztechnik sequenziert.
Ziel der Analyse ist die Definition möglicher Mutationen für das Design einer individuellen Tumorantigenpeptid-Immunisierung. Zum Ausschluss von nicht tumorassoziierten Varianten (SNPs, Single Nucleotide Polymorphism) der Keimbahn, wird gleichzeitig die DNA aus kernhaltigen Blutzellen der Patienten isoliert und mit derselben Methodik vergleichend sequenziert. Die Differenzierung möglicher Neoantigenkandidaten erfolgte dabei in den folgenden sechs Schritten:

1) Die Selektion tumor/somatischer Mutationen wird reduziert durch den Ausschluss von nicht tumorspezifischen Polymorphismen.
2) Die so vordefinierte Auswahl von somatischen Mutationen wird weiter auf Qualitätsparameter, Leseabdeckung und Einfluss auf die Proteinsequenz eingeschränkt. Komplexere Mutationen als Einzelaminosäuresubstitutionen SNPs, und Mutationen in nicht proteincodierenden Bereichen werden dabei ausgeschlossen. Ebenso werden stille Mutationen ausgeschlossen.
3) Die so definierten Mutationen werden anhand der bekannten Proteinsequenzen (RefGene-Datenbank) auf flankierende 20er Oligopeptide erweitert. Aus diesen wurden sequenziell je 12 × 9er Oligopeptide gebildet und die Affinität zu den vorbekannten, patientenspezifischen hypervariablen HLA-I Paratopen bestimmt (Programm NetMHC-4.0). Ausgewählt werden Nonapeptide mit hoher Affinität zu den Paratopen, welche durch die Mutation (SNP) einen weiteren Zugewinn an Affinität gegenüber der Wildtypsequenz aufweisen.
4) Kandidaten die in einen Exompool an gleicher Stelle diese Mutation als Keimbahnmutation tragen werden ausgeschlossen (NIH-NHLBI 6500 exome database version-2 Programm ANNOVAR-Tool2.)
5) Anhand der Ergebnisse der Expressionsanalyse (siehe Befund unter Ausführungsbeispiel 1) können Peptide mit einer geringen Expressionsrelevanz im Tumor ausgeschlossen werden.
6) Abschließend wird im Einzelnen überprüft, ob evtl. weitere Polymorphismen in der Umgebung des Einzelbasenaustausches vorliegen und sich somit weitere, patientenspezifische Abweichungen von der hg19 definierter Genomsequenz darstellen.

Nachstehend ist beispielhaft die Auswertung der Ergebnisse der beschriebenen Mutationsanalyse und Filtrationsschritte für einen Patienten aufgeführt:

1) Vergleich Tumor-DNA gegenüber Normal-DNA
1. a. Die Einzelanlyse „Exome_single_sample_Somatic“ mittels des IonReporter ergibt:
  - - 37494 Varianten in der Normal-DNA, und
  - - 37299 Varianten in der Tumor-DNA.
2. b. Die gepaarte Analyse „AmpliSeq Exome tumor-normal pair“ detektiert und annotiert seltene somatische Varianten (SNPs, InDels, CNVs) mittels statistischer Analysen im Ion AmpliSeq Exome Panel (Ion Reporter Software 4.6. Workflow Version: 1.0). Diese ergibt: 1477 Mutationen im Tumor mit gleichzeitiger Wildtyp Kategorisierung in der Normal-DNA. Diese 1477 Varianten sind Ausgangspunkt, der weiteren Einschränkungen.
2) Einschränkung der Varianten auf proteincodierende SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) mit Aminosäure-Substitution.
- - Einschränkung auf SNPs
- - Mindestens 50x im Tumor und min. 20x im Blut sequenziert
- - Darf im Blut in keinem einzigen Run aufgetreten sein
- - Muss in einem Exon positioniert sein
- - Muss zu einem Aminosäureaustausch führen (missense Mutation)
3) Von diesen Varianten werden 20er Peptide definiert und der HLA-Paratop-Affinitätsanalyse NetMHC zugeführt. Es werden ~25*12 Nonapeptidpaare (Je mutiert und wildtyp) der Affinitätsanalyse zu Analyse in jeweils 9 HLA Loci übergeben. Daraus werden von 5814 Affinitäten (2907 Paare) untersucht. Bei 40 Paaren wird eine mind. 2-fach höhere Affinität im mutierten Peptid als im Wildtyp-Peptid nachgewiesen. Zusammenfassung der Varianten mit erhöhter HLA Affinität
4) Kandidaten die in einen Exompool (NIH-NHLBI 6500 exome database version-2) an gleicher Stelle diese Mutation als Keimbahnmutation tragen, werden ausgeschlossen (Programm ANNOVAR - Tool3.) Verwendete Datenbankfilter: hg19_esp6500siv2_all
5) Auswahl aus verbleibenden 25 Varianten mit signifikanter mRNA Expression (> 3 fold versus Normalgewebe) in Abgleich mit Transkriptom

Beispiel 3: Patienten mit mMC (metastasiertem MammaCarcinom), Typ_HER2-neu
Klinische Vorgeschichte der Patienten
Patient, weiblich
Der klinische Erstbefund: invasiv duktales bifokales Mammakarzinom (Mamma-CA), rechts, Tumor 2 cm bis 5 cm in größter Ausdehnung (pT2), pN1sn pN1 (3/5) G2, NO, ER-, PR-, HER-2 neu: 3+, Ki-67: 55%
Behandlungsverfahren:

▪ 2 Wochen später: Neoadjuvante Chemotherapie (TCH w3) 6 Zyklen, Trastuzumab;
▪ 6 Monate später: Bestrahlung der rechten Brust + Lymphabflußgebiet (LAG)

Tumor durch Strahlen- oder Chemotherapie vollständig zerstört (CR = Vollremission) des Tumors, Befund: Patienten als geheilt aus der Klinik entlassen.
Wiederauftreten: 24 Monate nach dem Erstbefund tritt ein Lokalrezidiv mit zusätzlichen Lebermetastasen (4 Herde) auf; Befund: ER-, PR+ (60%), HER-2 neu: 3+, Ki-67: 80%
Dieses erneut aufgetretene Mamma-CA trat mit Lebermetastasen auf und wies zudem eine erheblich größere Aggressivität auf (Ki-67: 80% versus 55% (Erstbefund)).
Prognose der Klinikärzte: Die Patientin wurde aus der Klinik entlassen mit der Prognose eines OS (overall survival) von voraussichtlich/durchschnittlich 6 Monaten.
Das bekannte Faktum, dass beim Mamma-CA ein erneut aufgeflammter zweiter Primärtumor (second primary malignancy (SPM)) mit schlechterer Prognose und mit schlechterer OS versehen ist (siehe "Breast cancer survivors face excess risk for second primary cancer in SEER analysis", Wei JL & al., Int J Clin Oncol, 19.03.2019), voraussichtlich durch vorhergehende Chemotherapie ausgelöst,
Behandlungsverfahren:

▪ 2 Monate nach Diagnose: operative Entfernung der Brustdrüse und angrenzender Gewebe der rechten Brust (Brustamputation) wegen eines dort aufgetretenen Lokalrezidivs.
▪ 4 Monate nach Diagnose: Auftauchen von Knochenmetastasen (ossäre Metastasen (Wirbelsäule)) und eines Bronchialkarzinoms (suspekte LK Lungenhilus);
▪ 9 Monate nach Diagnose: operative Entfernung der Brustdrüse und angrenzender Gewebe der linken Brust.

Tumor Progress trotz Trastuzumab bzw. T-DM1 Dauertherapie
Individualisierte Immun-Informations-Therapie: Analytik
Nachdem Therapie-/Behandlungsverfahren unter Punkt 1 ohne Erfolg durchgeführt worden, kam im Rahmen eines Heilversuches der immunologische Therapieansatz der Information des patienteneigenen Immunsystems mittels Applikation tumor-assoziierter und tumorspezifischer HLA Antigenpeptide in Form synthetisierter Peptide zum Einsatz.
Der Schwerpunkt wurde dabei auf die zelluläre Immunabwehr, d.h. die Aktivierung der körpereigenen zytotoxischen CD8+T-Zellen gelegt, die als naive T-Zellen durch ein hochdifferenziertes Rezeptorsystem in der Lage sind, quasi alle denkbaren pathogenen wie auch malignen Aminosäuresequenzen (die sogenannten „targets“) zu erkennen und sich so zu Effektorzellen zu entwickeln. Diese Effektor-T-Zellen können die über die HLApräsentierten Antigene erkannten Tumorzellen per Sekretion von Granzym und Perforin zerstören.
Hierzu wurden aus biopsiertem Tumorgewebe der Patienten labortechnisch über „next generation sequenzing“ (NGS) und „liquid chromatography-coupled tandem mass spectrometry“ (LC-MS/MS) über nachfolgende drei Schritte Daten erhoben

▪ die mRNA-Expression sämtlicher codierender Genbereiche (Transkriptom - Schritt (a)),
▪ die tumorspezifischen somatischen miss-sense Mutationen sowie über (Exom-Sequenzierung - Schritt (b))
▪ die von den Tumorzellen präsentierten HLA-restringierten Liganden der HLA-Klassen I+II (HLA-Ligandom - Schritt (c))

zu Schritt (a): Die mRNA-Expressionsdaten (ca. 40.000) wurden mit den Expressionswerten von gesundem Gewebe verglichen und gefiltert hinsichtlich

▪ signifikanter (>3-fach) Abweichung der Expressionswerte, und weiter
▪ hinsichtlich der Bedeutung für betreffenden Gene für die Tumorentwicklung
▪ nach dem Kriterium, dass diese Gene in anderen Gewebearten nicht oder nur geringfügig exprimiert werden dürfen
▪ ferner wurde hinsichtlich der Gruppe der cancer-testis-antigene, die grundsätzlich nicht in gesunden mamma-geweben von Erwachsenen exprimiert werden, nennenswerte Expressionen im Tumor festgehalten, da diese die Qualität eines tumorspezifischen Antigens besitzen können

Hieraus ergab sich ein gesonderter Datensatz von möglichen HLA-Tumorantigenpeptiden (Anzahl 86), die hinsichtlich ihrer Expressionsauffälligkeiten/-abweichungen von normal und ihrer bekannten Bedeutung für die Tumor-Proliferation gewichtet wurden - > Faktor 3 gegen Normal; Bedeutung für Tumorentwicklung: Wachstumsfaktoren, Angiogenesefaktoren, Metastasierungsfaktoren.
zu Schritt (b): Die somatischen miss-sense Mutationen (single nucleotid Varianten (SNV) mit einem Austausch von einer Aminosäure wie auch frame-shift-Mutationen) (Anzahl: 57) wurden in einem weiteren Datensatz zusammengefasst, da sie dem Charakter nach potentiell bedeutsame (Neo-)-Antigene und damit in höchstem Maße tumor-spezifisch sind.
zu Schritt (c): Die HLA-restringierten Liganden (Aminosäurensequenzen von 9-10 AS (entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe) (Anzahl:1 100) und Sequenzen von 12-15 AS (entsprechend der MHC-Klasse-II-Komplexe) (Anzahl:730) wurden mittels Informationen aus spezialisierten Datenbanken überprüft auf

▪ im gesunden Gewebe bereits aufgetaucht (=negativ)
▪ in Proteinübereinstimmung mit aussichtsreichen Sequenzen aus Transkriptom und Exom, ob Sequenzen der ermittelten tumorassoziierten HLA-Antigenpeptide mit der Proliferation, Invasivität, Angiogenese und/oder einer Erhöhung der Zytokeratinproduktion des Mamma-/Brustkarzinoms assoziiert sind.

Parallel zu diesen beschriebenen Tumor-Gewebeuntersuchungen wurde der genetische Haplotyp, die Allele der HLA-Antigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe der Patientin bestimmt. Das patienten-individuelle Ergebnis ergab folgende Zuordnung:

HLA-A*02:01, A*24:02, B*18:01, B*51:01, C*07:01, C*15:02; HLA-DRB1*09:01; DRB1*16:01, DQB1*03:03, DQB1*05:02.

(Mit der Trägerschaft von HLA-A*02:01 i.V.m. B*18:01 repräsentiert diese Patientin ca. 40% der in Europa lebenden Bevölkerung (kaukasisch)).
Individualisierte Immun-Informations-Therapie: Target-Auswahl
zu Schritt (a): Aus den Datensätzen des Transkriptoms wurden zunächst anhand der Aminosäurensequenzen der jeweiligen Proteine Aminosäuresequenzen der HLA-Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Komplexe (Nonamere) mit den höchsten Allele-Affinitäten (spezifische Aktivität gegenüber T-Zell-Rezeptor [nM]) ausgewählt. Mit diesem Auswahlkriterium wird algorithmisch die Wahrscheinlichkeit bestimmt, mit der das jeweilige HLA-Tumorantigenpeptid in vivo auf den entsprechenden MHC-Komplexen präsentiert wird (eine erste Voraussetzung für eine mögliche zelluläre Immunantwort).
zu Schritt (b): Aus den Datensätzen der Mutationsuntersuchungen wurde anhand der Allele des Patienten Nonamere-Varianten, die den Aminosäureaustausch beinhalten, hinsichtlich der höchsten Affinitäten (spezifische Aktivität gegenüber T-Zell-Rezeptor [nM]) bestimmt. Auch wurden hierzu Polymere von 17 Aminosäuren (Oligopeptide) unter dem Affinitätskriterium festgelegt. Mit diesem Auswahlkriterium wird algorithmisch die Wahrscheinlichkeit bestimmt, mit der das jeweilige Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Komplexe in vivo auf den entsprechenden MHC-Komplexen präsentiert wird (eine zweite Voraussetzung für eine mögliche zelluläre Immunantwort).
Schritt (c): Auf Grundlage der unter Schritt (a) und (b) ermittelten neuen Datensätze wurden unter Hinzunahme der HLA-restringierten Liganden (dem Datensatz des Ligandoms) eine Auswahl von HLA-Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und entsprechend der MHC-Klasse-II-Komplexe getroffen, die sowohl einzeln als auch und vor allem in ihrer Kombination die aussichtsreichsten Epitopkandidaten zur Auslösung einer zellulären Immunantwort waren.
Individualisierte Immun-Informations-Therapie: Peptidsynthese und Applikationslösung
Schritt (a): Die für die auf maßgeschneiderten Applikationslösung ausgewählten Peptidkonzepte wurden als chemische Peptide synthetisch hergestellt.

Schritt (b): die nachfolgenden 7 HLA-A Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und 2 HLA Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-II-Komplexe wurden in einer 33%ige DMSO/H₂O Applikationslösung gemischt und in 24 vial-Einheiten à 1 ml aufgeteilt. Sequenzen der neun Tumorantigenpeptide

Nr.	Aminosäuresequenz	Identifikationsnummer	Klasse
1	ILFGISLREV	SEQ-ID Nr.: 30	HLA-A
2	KVVEFLAML	SEQ-ID Nr.: 31	HLA-A
3	DEDEIKWWW	SEQ-ID Nr.: 35	HLA-B
4	FVNDKFMPL	SEQ-ID Nr.: 32	HLA-A
5	TYLPTNASLSF	SEQ-ID Nr.: 25	HLA-A
6	FLLILKRDS	SEQ-ID Nr.: 33	HLA-A
7	DAVIVKLEI	SEQ-ID Nr.: 28	HLA-A
8	RTPLSALCV	SEQ-ID Nr.: 34	HLA-A
9	EDKKIDFSEFLSLLGDI	SEQ-ID Nr.: 36	Klasse II
10	STKYSHKSPQLSVHVTD	SEQ-ID Nr.: 38	Klasse II
11	HGSSFFLLILKRDSAFI	SEQ-ID Nr.: 42	Klasse II
12	KYIQESQALAKRSCGLFQKLGEYYLQNAFL	SEQ-ID Nr.: 39	Klasse II (Oligopeptid)

Dosis pro Tumorantiaenpeptid: 500 µg
Individualisierte Immun-Informations-Therapie: Applikations-Protokoll
Vorbehandlung: 300 mg/m² Cyclophosphamid (einmalige Infusion); 3 Tage vor erster Injektion
Applikation: intra-dermal (i.d.)
Applikationsort: linker und rechter Oberarm
Verabreichungsplan: 23 Vakzinierungen an den Tagen 1, 2, 3, 8, 15, 22, 36, 50, 71 und weiter alle 3 Wochen bis Tag 365
Zugesetzte Adjuvanzien pro Applikation: 12.5 mg Imiquimod in 250 mg Creme (Aldara) topisch an Injektionsort; 200 µg Ipilimumab (Yervoy), da CTLA4 erhöht, abwechselnd mit 300 µg Nivolumab (Opdivo), da PD1 bzw PD-L1 erhöht, subkutan (s.c.) direkt neben Applikationsort
Individualisierte Immun-Informations-Therapie: 2 Belege der klinischen Effekte
Anhand zweier signifikanter Beispiele kann nachfolgend die klinische Wirksamkeit der angewendeten Immuntherapie im dargestellten Fall 1 aufgezeigt werden:

3 zeigt die Entwicklung des Spezifischen Tumormarkers CA 15-3 in Verbindung mit dem Lebermarker Gamma GT nach spezifischer Applikation (i.d.) spezifischen pharmazeutischen Zusammensetzung der Immuninformation durch BITAP-Peptide (Sternlinie), die die spezifischen Metastasen-Epitope der Lebermetastasen des gestreuten mMC-HER2/Neu abbilden (INC 14/1713).

Der abgebildete Verlauf umfasst 34 Wochen.
die Entwicklung des Spezifischen Tumormarkers CA 15-3 nach spezifischer Immuninformation durch die erfindungsgemäße Zusammensetzung an Tumorantigenpeptiden (Stern), die die Epitope des Primärtumors MC-HER2/Neu abbilden (INC 14/1713). Der abgebildete Verlauf umfasst 26 Wochen.
Beispiel 4: Patienten mit mIBC mit Lymphangosis Carinomatose (metastasierter inflammatorischer Brustkrebs)
Klinische Vorgeschichte der Patienten
Patient, weiblich (46 Jahre)
Der klinische Erstbefund: i Inflammatorisches Mammakarzinom rechts mit ausgedehnter Lymphangiosis carcinomatose; Initiales Tumorstadium pT4, pn3a (24/29)(Level II:14/19, Level III: 10/10), M0, L1, V0, G2. HR+, PR+, Androgenr.+, HER2/neu -
Wiederauftreten: Postoperativ bereits nach 3 Monaten ein erstes Rezidiv: Befundprogredienz intramammär im Bereich der rechts unteren Quadranten mit signifikanter Konsistenzvermehrung des Brustgewebes. Die Mittellinie überschreitende Hautinfiltration im Bereich der Thoraxwand sowie lokoregionäre Tumorinfiltration des axillären Fettgewebes und der lateralen Thoraxwand entlang des Musculus pectoralis major rechts.
Nach 5 Monaten lokoregionäres Tumorrezidiv, mit Ausdehnung in die Achselhöhle.
Von Monat 6 bis Monat 11 Chemotherapie, die bei Tumorprogredienz während der Chemotherapie nach 5 Zyklen abgebrochen wurde. Lokoregionäres Tumorrezidiv, 7×11 cm entlang der ventrolateralen Thoraxwand. Haut und Unterhautgewebe großflächig infiltriert und verdickt.
Hormontherapie mit Aromatasehemmer und Bestrahlung der rechten Brust, Brustwand und supraclaviculär/cervical rechts.
Prognose der Klinikärzte: OS für voraussichtlich 3-4 Monate. (Das inflammatorische Mammakarzinom ist eine relativ seltene, besonders aggressive Form des Mammakarzinoms, das in diesem Fall 2 bereits in die Lymphbahnen gestreut hatte (24 von 29 Lymphknoten waren bereits bei Erstdiagnose befallen)).
Erfindungsgemäßes Behandlungsverfahren: Nachdem alle im Standard- und Regelkanon der onkologischen Medizin verfügbaren Therapien ohne Erfolg durchgeführt worden waren, kam im Rahmen eines Heilversuches der immunologische Therapieansatz der Information des patienteneigenen Immunsystems mittels Applikation tumor-assozierter und tumorspezifischer Antigene in Form synthetisierter Peptide zum Einsatz.
Der Schwerpunkt wurde dabei auf die zelluläre Immunabwehr, d.h. die Aktivierung der körpereigenen zytotoxischen CD8+T-Zellen gelegt, die als naive T-Zellen durch ein hochdifferenziertes Rezeptorensystem in der Lage sind, quasi alle denkbaren pathogenen wie auch malignen Aminosäuresequenzen (im Folgenden die „targets“) zu erkennen und sich so zu Effektorzellen zu entwickeln. Diese Effektor-T-Zellen können die über die HLApräsentierten Antigene erkannten Tumorzellen per Sekretion von Granzym und Perforin zerstören.
Die Aktivierung dieser Immunzellen erfolgt über die Liganden der HLA-Klasse I, d.h. die Antigene, die als Sequenzen von 8-10 Aminosäuren auf HLA-Molekülen der Klasse I restringiert präsentiert werden.
In den Monaten 14-84 nach Beginn der individualisierten Immun-Informatikum-Therapie ereigneten sich noch weitere lokale Rezidive (Lymphknoten), die jeweils operativ entfernt wurden. Eine Fern-Metastasierung konnte jedoch verhindert werden.
Individualisierte Immun-Informations-Therapie: Analytik
Um die tumorassoziierten und -spezifischen Antigenpeptide zu identifizieren, wurden aus biopsiertem Tumorgewebe der Patienten labortechnisch über „next generation sequenzing“ (NGS) und „liquid chromatography-coupled tandem mass spectrometry“ (LC-MS/MS) über nachfolgende drei Schritte Daten bestimmt:

Hieraus ergab sich ein gesonderter Datensatz von möglichen HLA-Tumorantigenpeptiden (Anzahl 86), die hinsichtlich ihrer Expressionsauffälligkeiten/-abweichungen von normal und ihrer bekannten Bedeutung für die Tumor-Proliferation gewichtet wurden.
zu Schritt (b): Die somatischen miss-sense Mutationen (single nucleotid Varianten (SNV) mit einem Austausch von einer Aminosäure wie auch frame-shift-Mutationen) (Anzahl: 41) wurden in einem weiteren Datensatz zusammengefasst, da sie dem Charakter nach potentiell bedeutsame (Neo-)-Antigene und damit in höchstem Maße tumor-spezifisch sind.
zu Schritt (c): Die HLA-restringierten Liganden (Aminosäurensequenzen von 9-10 AS (entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe) (Anzahl:1321) und Sequenzen von 12-15 AS (entsprechend der MHC-Klasse-II-Komplexe) (Anzahl:863) wurden mittels Informationen aus spezialisierten Datenbanken überprüft auf

HLA-A*01:01, A*29:02, B*08:01, B*44:03, C*07:01, C*16:01; HLA-DRB1*03:01; DRB1*07:01, DRB3*01:01, DRB1*03:01, DRB4*01:01, DQB1*02:01, DPB1*01:01
(Mit der Trägerschaft von HLA-A*01:01 i.V.m. B*08:01 repräsentiert diese Patientin ca. 25% der in Europa lebenden Bevölkerung (kaukasisch)).

Individualisierte Immun-Informations-Therapie: Target-Auswahl
zu Schritt (a): Aus den Datensätzen des Transkriptoms wurden zunächst anhand der Aminosäurensequenzen der jeweiligen Proteine Aminosäuresequenzen der HLA-Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Komplexe (Nonamere) mit den höchsten Allele-Affinitäten (spezifische Aktivität gegenüber T-Zell-Rezeptor [nM]) ausgewählt. Mit diesem Auswahlkriterium wird algorithmisch die Wahrscheinlichkeit bestimmt, mit der das jeweilige HLA-Tumorantigenpeptid in vivo auf den entsprechenden MHC-Komplexen präsentiert wird (eine erste Voraussetzung für eine mögliche zelluläre Immunantwort).
zu Schritt (b): Aus den Datensätzen der Mutationsuntersuchungen wurde anhand der Allele des Patienten Nonamere-Varianten, die den Aminosäureaustausch beinhalten, hinsichtlich der höchsten Affinitäten (spezifische Aktivität gegenüber T-Zell-Rezeptor [nM]) bestimmt. Auch wurden hierzu Polymere von 17 Aminosäuren unter dem Affinitätskriterium festgelegt. Mit diesem Auswahlkriterium wird algorithmisch die Wahrscheinlichkeit bestimmt, mit der das jeweilige Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Komplexe in vivo auf den entsprechenden MHC-Komplexen präsentiert wird (eine zweite Voraussetzung für eine mögliche zelluläre Immunantwort).
Schritt (c): Auf Grundlage der unter Schritt (a) und (b) ermittelten neuen Datensätze wurden unter Hinzunahme der HLA-restringierten Liganden (dem Datensatz des Ligandoms) eine Auswahl von HLA-Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und entsprechend der MHC-Klasse-II-Komplexe getroffen, die sowohl einzeln als auch und vor allem in ihrer Kombination die aussichtsreichsten Epitopkandidaten zur Auslösung einer zellulären Immunantwort waren.
Individualisierte Immun-Informations-Therapie: Peptidsynthese und Applikationslösung
Schritt (a): Die für die auf maßgeschneiderten Applikationslösung ausgewählten Peptidkonzepte wurden als chemische Peptide synthetisch hergestellt.

Schritt (b): die nachfolgenden 9 HLA-A Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und 2 HLA Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-II-Komplexe wurden in einer 33%ige DMSO/H₂O Applikationslösung gemischt und in 6 vial-Einheiten ä 1,5 ml aufgeteilt. Sequenzen der neun Tumorantigenpeptide

Nr.	Aminosäuresequenz	Identifikationsnummer	Klasse
1	LLDPEDVY	SEQ-ID Nr.: 15	HLA-A
2	HVVFVQSYY	SEQ-ID Nr.: 14	HLA-A
3	HMDIYANY	SEQ-ID Nr.: 16	HLA-A
4	YVGRRNYRFFY	SEQ-ID Nr.: 13	HLA-A
5	VVFVQSYY	SEQ-ID Nr.: 17	HLA-A
6	HMKKMMKAL	SEQ-ID Nr.: 22	HLA-B
7	EEAAAAAAAY	SEQ-ID Nr.: 20	HLA-B
8	SSTPLHPYPF	SEQ-ID Nr.: 23	HLA-B
9	MEVLSQEIVW	SEQ-ID Nr.: 21	HLA-B
10	YSMKCKNVVPLNDLLLE	SEQ-ID Nr.: 43	Klasse II
11	NYLAEETVDVRDEF	SEQ-ID Nr.: 46	Klasse II
12	LLHTEYSLLSLLHMQ	SEQ-ID Nr.: 45	Klasse II

Dosis pro Peptid: 300 µg
Gesamtpeptidgehalt pro Applikationsdosis (vial): 3,3 mg
Individualisierte Immun-Informations-Therapie: Applikations-Protokoll
Vorbehandlung: 3 Mio Einheiten IFN alpha 2b (Roferon), 4 Tage vor erster Injektion
Applikation: subkutan (s.c.)
Applikationsort: linker und rechter Oberarm, linke und rechte Hüfte Verabreichungsplan: 6 Injektionen an den Tagen 1, 8, 22, 50, 180 und 360
Zugesetzte Adjuvanzien pro Applikation: Montanide ISA 51 VG (1.5 ml), Mischung 1:1 mit Peptid-vial (1.5ml); 300 µg Nivolumab (Opdivo), da PD1 bzw PD-L1 erhöht, sub-cutan (s.c.) direkt neben Injektionsort, 30 min vor Peptid/Montanide-Injektion.
Individualisierte Immun-Informations-Therapie: Belege der klinischen Effekte
Die klinische Wirksamkeit der angewendeten Immuntherapie im dargestellten Ausführungsbeispiel 4 ist in 5 aufgezeigt.
Die Graphik stellt die Entwicklung der Tumormarker CEA (Balken 1) und CA15-3 (Balken 2) sowie des Leberwertes Gamma-GT (Balken 3) und der Leukozytenzahl (Balken 4) während eines Zeitraums von 8 Monaten nach der Applikation der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß dem Ausführungsbeispiel 4 dar. Vorausgegangen war eine aggressive Tumorprogredienz - im Wesentlichen auf Basis der inflammatorischen Lymphangiosis Carcinomatose. Die Applikation erfolgte mit einer 1:1 Mischung von Montanide ISA 51 VG mit dem Peptid-Cocktail. Das Volumen betrug 3 ml und wurde s.c. an den 4 unterschiedlichen Applikationsloci (siehe Pkt 5) appliziert. In dieser Peptidzusammensetzung handelt es sich um die initiale Applikation (gefolgt von 4 weiteren Applikationen; siehe Pfeile in 5).
Die in der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß dem Ausführungsbeispiel 4 enthaltenen 10 Peptide sind Tumorantigenpeptide (oder auch Neoantigene). Durch Information sind die Antigene Nr 1-4 und 10 zu Epitopen geworden, d.h. es gelang, die entsprechenden T-Zell-Rezeptoren (TCR) zu aktivieren und Effektor- und Gedächtniszellen zu entwickeln.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

WO 2013/135266 [0014]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Fratta et al., Molecular Oncology, 5(2), April 2011, 164-182 [0005]
Sinigaglia und Hammer (1995), J. Exp. Med., 181, 449-451 [0012]
Angelo et al. (2002), Recognition of core and flanking amino acids of MHC class II-bound peptides by the T-cell receptor, Eur J Immunol, 32(9), 2510-20 [0012]
Binkowski et al. (2012), PLoS ONE, 7(8), e41710; Yamada (1999), Tissue Antigens, 54(4), 325-32 [0013]
Inderberg-Suso et al. (2012), Oncoimmunology., 1(5), 670-686 und Slingluff (2011), Cancer J., 17(5), 343-350 [0014]
Nielsen (Bioinformatics (2016) Feb 15;32(4):511-7) und Nielsen et al. (Protein Sci., (2003) 12:1007-17 [0182]
Zhang und Reed, Hum Immunol. 2012 Dec, 73(12), 1239-1244 [0230]
"Breast cancer survivors face excess risk for second primary cancer in SEER analysis“, Wei JL & al., Int J Clin Oncol, 19.03.2019 [0258]

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung oder zur Profilaxe von Mamma-/Brustkarzinomen, insbesondere lokal wiederkehrenden oder metastasierenden Mammakarzinomen bei einem Patienten oder einer Patientengruppe, der/die an einem Mamma-/Brustkarzinom erkrankt ist oder im Verdacht steht, an einem Mamma-/Brustkarzinom zu erkranken, umfassend eine pharmakologisch wirksame Menge umfassend 4 bis 8 HLA-A Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und zumindest 2 Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-II-Komplexe, dadurch gekennzeichnet, dass die HLA Tumorantigenpeptide tumorexklusive oder tumorassoziierte HLA Antigenpeptide sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Verabreichen der pharmakologisch wirksamen Menge der Tumorantigenpeptide an den Patienten oder die Patientengruppe, der/die an einem Mamma-/Brustkarzinom erkrankt ist, den CA 15-3 Wert wirksam reduziert.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die HLA Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-I- bzw. Klasse-II-Komplexe immunogene HLA Tumorantigenpeptide sind, bestimmt mittels eines Immunogenitätstests, insbesondere mittels Westernblot, ELISA-Techniken, ELISPOT oder Immunodetektion mit mikroskopischer Analyse.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die HLA-A Tumorantigenpeptide an den entsprechenden MHC-Klasse-I-Komplex des Subtyps A*01 und/oder A*02 binden.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, ferner umfassend zumindest ein HLA-B Tumorantigenpeptid entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und/oder zumindest ein HLA-C Tumorantigenpeptid entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die HLA-Tumorantigenpeptide entsprechend des jeweiligen Subtyps der MHC-Klasse-I-Komplexe ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus den in SEQ ID Nr. 13 bis 35 angegebenen Aminosäuresequenzen oder gegenüber diesen Aminosäuresequenzen zumindest einen Aminosäureaustausch aufweisen.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorgenannten Ansprüche, wobei die HLA-Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-II-Komplexe ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus den in SEQ ID Nr. 36 bis 48 angegebenen Aminosäuresequenzen.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorgenannten Ansprüche, wobei die HLA-Tumorantigenpeptide auf der Oberfläche der Tumorzellen des Mamma-/Brustkarzinoms des Patienten oder der Patientengruppe präsentiert werden, bestimmt mittels Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie (UHPCL) in Verbindung mit ESI Massenspektrometrie (MS).
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorgenannten Ansprüche, wobei das Expressionsniveau der tumorassoziierten HLA-Tumorantigenpeptide in den Tumorzellen mindestens dreimal höher ist als in den gesunden Zellen des Patienten oder der Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel, wie mit qPCR bestimmt, und wobei die tumorassoziierten HLA-Antigenpeptide mit der Proliferation, Invasivität, Angiogenese und einer Erhöhung der Zytokeratinproduktion des Mamma-/Brustkarzinoms assoziiert sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorgenannten Ansprüche, wobei: - zumindest ein HLA-A Tumorantigenpeptid ein tumorexklusives HLA-A Tumorantigenpeptid ist, und - die spezifische Bindung des tumorexklusiven HLA-A Tumorantigenpeptids bestimmt gegenüber den entsprechenden MHC-Klasse-I-Komplex mit einer K_D im Bereich von 10 bis 50 nM erfolgt, wie mit Oberflächenplasmonresonanz bestimmt.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorgenannten Ansprüche, wobei die pharmakologisch wirksame Menge jedes einzelnen HLA-Antigenpeptids in der Zusammensetzung in einer absoluten Konzentration (d.h. Verabreichungsdosis) im Bereich von 100 bis 600 µg, bevorzugt im Bereich von 300 bis 600 µg liegt.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorgenannten Ansprüche, wobei die Zusammensetzung ein Adjuvans umfasst, das bei Applikation der Zusammensetzung an einen Patienten dazu geeignet ist, am Ort der Applikation ein Granulom auszubilden.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorgenannten Ansprüche, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung subkutan oder intradermal und, vorzugsweise im Wesentlichen gleichzeitig an zumindest 2 Applikationsorten, bevorzugt an zumindest 4 Applikationsorten, entfernt von einer Tumorläsion und/oder dem krebsartigen Lymphknotenbereich appliziert wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorgenannten Ansprüche, wobei zumindest ein HLA-Tumorantigenpeptid zumindest eine Mutation, bevorzugt einen Aminosäureaustausch in Bezug auf den Wildtypen des HLA-Tumorantigenpeptids (das Mutanom) aufweist, die zu einer Erhöhung der Affinität, vorzugsweise auf < 500 nM der spezifischen Affinität zum T-Zell-Rezeptor des mit HLA-Tumorantigenpeptids behandelten Individuums im Vergleich zu dem Wildtyp des HLA-Antigenpeptids führt.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorgenannten Ansprüche, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Mamma-/Brustkarzinomen als Monotherapie oder in Kombination mit anderen bekannten Therapien und/oder Verbindungen zur Behandlung von Mamma-/Brustkarzinomen eingesetzt wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorgenannten Ansprüche, wobei die mit der pharmazeutischen Zusammensetzung zu behandelnden Patienten ein Standardtherapieverfahren (z.B. mindestens eine Operation, Bestrahlung, Chemotherapie und/oder Hormontherapie) erhalten haben.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorgenannten Ansprüche, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung als eine Erstlinientherapie dem Patienten oder der Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel verabreicht werden.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorgenannten Ansprüche zur Verwendung bei der Behandlung von Mamma-/Brustkarzinomen, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend jedes einzelne HLA-Tumorantigenpeptid in der pharmazeutischen Zusammensetzung in einer absoluten Konzentration (d.h. Verabreichungsdosis) von 100 bis 600 µg, einmal alle 2 Wochen, vorzugsweise einmal alle 4 Wochen über einen Zeitraum von zumindest einem Jahr intradermal oder subkutan einem Patienten oder einer Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel verabreicht wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorgenannten Ansprüche, wobei das Mamma-/Brustkarzinom ein hormonpositiver, HER2/neu oder tripple negativer Brustkrebs ist.
HLA-Tumorantigenpeptid entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe oder MHC-Klasse-II-Komplexe, insbesondere zur Verwendung bei der Behandlung von Mamma-/Brustkarzinomen bzw. für eine pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 19 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den in SEQ ID Nr. 13 bis 35 und SEQ ID Nr. 36 bis 48 angegebenen Aminosäuresequenzen oder die gegenüber einer dieser Aminosäuresequenzen zumindest eine Mutation, vorzugsweise einen Aminosäureaustausch aufweist.
HLA-Tumorantigenpeptid nach Anspruch 20 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von Mammakarzinomen, insbesondere lokal wiederkehrenden oder metastasierenden Mammakarzinomen bei einem Individuum, wobei das Verfahren das Verabreichen eines Behandlungsregimes an das Individuum umfasst, das eine pharmakologisch wirksame Menge zumindest eines HLA-Tumorantigenpeptids nach Anspruch 19 umfasst.
HLA-Tumorantigenpeptid nach Anspruch 20 oder 21, wobei das Individuum noch keine Bestrahlung, Chemotherapie und/oder Hormontherapie gegen den Brustkrebs, insbesondere lokal wiederkehrenden oder metastasierenden Brustkrebs erhalten hat und/oder 12 Monate oder weniger seit der letzten Dosis eines Chemotherapeutikums keine vorhergehende adjuvante Chemotherapie in Rekurrenz mehr erhalten hat.
HLA-Tumorantigenpeptid nach einem der Ansprüche 20 bis 22, wobei das Behandlungsregime das progressionsfreie Überleben des Individuums wirksam um zumindest 2 bis 5 Jahre verlängert.
HLA-Tumorantigenpeptid nach einem der Ansprüche 20 bis 23, die bei dem Patienten bzw. der Patientengruppe immunogen sind, bestimmt mittels eines Immunogenitätstests, insbesondere mittels Westernblot, ELISA-Techniken, insbesondere mittels ELISPOT, AFM oder Immunodetektion mit mikroskopischer Analyse.
HLA-Tumorantigenpeptid nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Individuum den Haplotyp mit der Subgruppe A*01:01 und/oder A*02:01 aufweist.
HLA-Tumorantigenpeptid nach Anspruch 25, wobei das Individuum den Haplotyp mit der Subgruppe B*44:01 und/oder A*18:01 aufweist.
Verfahren zum Bestimmen pharmazeutisch wirksamer HLA-Tumorantigenpeptide zur Verwendung bei der Behandlung oder zur Profilaxe von Mamma-/Brustkarzinomen bzw. in einer Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, umfassend das Überwachen einer Gewebesektion eines Patienten bzw. einer Patientengruppe, der/die an einem Mamma-/Brustkarzinom erkrankt ist oder im Verdacht steht, an einem Mamma-/Brustkarzinom zu erkranken, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: (a) Bereitstellen einer Gewebeprobe des Patienten bzw. der Patientengruppe, wobei die Zellen der Gewebeprobe MHC-Komplexe der Klasse I und/oder II exprimieren und diese auf ihrer Oberfläche präsentieren; (b) Bestimmen folgender Parameter anhand der bereitgestellten Gewebeprobe aus Schritt (a): i) dem Transkriptom der bereitgestellten Gewebeprobe, und Vergleichen mit dem Transkriptom einer gesunden Gewebeprobe des Patienten bzw. der Patientengruppe zum Bestimmen hoch- und/oder runterregulierter mRNA-Sequenzen, die um den Faktor 3 zum Schwellwert in der gesunden Gewebeprobe abweichen; ii) dem spezifischen HLA Haplotyp des Patienten bzw. der Patientengruppe; iii) der Exomsequenz der bereitgestellten Gewebeprobe, und Vergleichen des Exoms der bereitgestellten Gewebeprobe mit dem Exom einer gesunden Gewebeprobe oder mit einer Gendatenbank des Patienten bzw. der Patientengruppe zur Bestimmung somatischer Mutationen, und Ermitteln der HLA-Tumorantigenpeptide, die somatische Mutationen aufweisen und die gegenüber der gesunden Gewebeprobe hoch- bzw. runterreguliert sind, bestimmt in Schritt (i) und Ermitteln der HLA-Tumorantigenpeptide, die mit der Proliferation, Invasivität, Angiogenese und einer Erhöhung der Zytokeratinproduktion eines Mamma-/Brustkarzinoms assoziiert sind; iv) des Ligandoms zum Bestimmen der in Schritt (iii) ermittelten Tumorantigenpeptide, die auf der Oberfläche der Zellen des Mamma-/Brustkarzinoms präsentiert sind; v) der spezifischen Bindungsaffinität der in Schritt (iv) ermittelten HLA Tumorantigenpeptide gegenüber dem entsprechenden MHC-Komplex der Zelle des Mamma-/Brustkarzinoms mittels Datenbank und/oder eines Rankingalgoritmus, und/oder vi) der Immunogenität der in Schritt (iv) ermittelten HLA-Tumorantigenpeptide mittels eines Immunogenitätstests insbesondere mittels Westernblot, ELISA-Techniken, insbesondere mittels ELISPOT, AFM oder Immunodetektion mit mikroskopischer Analyse; (c) Auswahl von HLA-Tumorantigenpeptiden, die die Kriterien gemäß der in Schritt (b) definierten Parameter erfüllen und die in den Zellen der bereitgestellten Gewebeprobe exprimiert und auf der Oberfläche dieser Zellen präsentiert werden.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei nach dem Bereitstellen der Gewebeprobe des Patienten oder der Patientengruppe in Schritt (a) die Gene BRCA1 und BRCA2 auf das Vorliegen von Mutationen untersucht werden.
Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, wobei die in Schritt (a) bereitgestellte Gewebeprobe die Gewebeprobe eines Mamma-/Brustkarzinoms ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 29, wobei das Bestimmen, ob die HLA-Antigenpeptide auf der Oberfläche der Zellen der in Schritt (a) bereitgestellten Gewebeprobe des Patienten oder der Patientengruppe präsentiert werden, mittels Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie (UHPCL) in Verbindung mit ESI Massenspektrometrie (MS) erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 30, wobei das Bestimmen mehrere Parameter gemäß Schritt (b) das Erstellen eines Transkriptoms der Gewebeprobe, die in Schritt (a) bereitgestellt wird, umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 31, wobei das Bestimmen mehrere Parameter gemäß Schritt (b) das Erstellen einer Exomsequenzierung für diese Gewebeprobe, die in Schritt (a) bereitgestellt wird, umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 19, umfassend die folgenden Schritte: (a) Bestimmen von zumindest 4 bis 8 HLA-A Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und zumindest 2 Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-II-Komplexe, die auf der Zelloberfläche von Zellen aus einem Mamma-/Brustkarzinom des zu behandelnden Patienten oder Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel exponiert sind, mit dem Bestimmungsverfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 32; (b) Synthese der in Schritt (a) ermittelten 4 bis 8 HLA-A Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und zumindest 2 Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-II-Komplexe; und (c) Herstellen der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung umfassend zumindest die in Schritt (b) synthetisierten 4 bis 8 HLA-A Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe, der zumindest 2 Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-II-Komplexe und ein Adjuvans, wie hierin definiert.
Kombinationspräparat zur Verwendung bei der Behandlung von Mamma-/Brustkarzinomen mit gleichzeitiger, getrennter, oder aufeinanderfolgender Verabreichung, umfassend die folgenden zwei getrennten Präparate (a) und (b): (a) ein erstes Präparat, das zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel, 4 bis 8 HLA-A Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und zumindest 2 Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-II-Komplexe nach einem der Ansprüche 1 bis 19 umfasst, und die optional mit dem Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 32 bestimmt wurden, und (b) ein zweites Präparat, das zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel, ein Antikrebsmittel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antikrebsalkylierungsmitteln, Antikrebs-Antimetaboliten, Antikrebsantibiotika, pflanzlichen Antikrebsmitteln, platinkoordinierten Antikrebskomplexverbindungen, Antikrebscamptothecinderivate, Antikrebstyrosinkinaseinhibitoren, monoklonalen Antikörpern, Interferonen, Interleukinen, biologischen Reaktionsmodifikatoren und anderen Antikrebsmitteln oder einem pharmazeutisch verträgliches Salz davon, umfasst.
Kombinationspräparat nach Anspruch 34, wobei das zweite Präparat ein monoklonaler Antikörper, insbesondere gegen ein immunsuppressives Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus CTLA4, GM-CFS, TReg, EpCam, IDO, MIC, PDL1, Fas und PD1-L, TRAIL ist.
Kombinationspräparat nach Anspruch 34 oder 35, wobei das zweite Präparat ein Östrogenhemmer für hormonpositive Patienten ist.