CN114222583A - 用于治疗乳癌/乳腺癌的i类和ii类hla肿瘤抗原肽 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于治疗或预防患有或怀疑患有乳腺癌的患者或患者组中的乳癌/乳腺癌，特别是局部复发或转移性乳腺癌的药物组合物，其包括：至少4至8种对应于MHC I类复合物的HLA‑A肿瘤抗原肽和至少2种对应于MHC II类复合物的肿瘤抗原肽，其中所述HLA肿瘤抗原肽是肿瘤专有或肿瘤相关HLA抗原肽并且针对至少一种MHC复合物，包括其组合；药物组合物、试剂盒(或其部分)；确定I类和/或II类HLA肽的方法；制备根据本发明的药物组合物的方法；以及根据本发明的药物组合物在制备用于治疗恶性肿瘤、白血病和肿瘤的药物组合物中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及用于治疗或预防患有或怀疑患有乳癌/乳腺癌的患者或患者组的乳癌/乳腺癌，特别是局部复发性或转移性乳癌/乳腺癌的药物组合物，根据本发明的药物组合物的制备方法，以及用于确定乳癌/乳腺癌疾病的消退、进程或发生的方法，所述药物组合物包含至少4至8种对应于MHC I类复合物的人白细胞抗原(HLA)-A肿瘤抗原肽(本文也称为“HLA-A限制性肿瘤抗原肽”)和至少2种对应于MHC II类复合物的肿瘤抗原肽(在本文中也分别称为“HLA限制性肿瘤抗原肽”、“HLA”、“本发明的氨基酸序列”、“本发明的化合物”和“本发明的多肽”)，其中HLA肿瘤抗原肽是肿瘤专有的或肿瘤相关的HLA抗原肽，并且其针对相应的MHC复合物，包括其组合(即与这些复合物结合或对其具有亲和性)、组合制剂(或其部分)，用于确定/鉴定用于药物组合物的对应于MHC I类复合物和/或MHC II类复合物的至少一种HLA抗原肽的方法。
背景技术
尽管跨学科方法和传统疗法的穷尽，癌症仍然是导致死亡的主要原因之一。一般而言，癌症通过已建立的方法治疗，例如手术肿瘤去除(切除)、化学疗法和/或放射疗法。
特别是，在化疗和/或放疗期间癌细胞产生的耐药性很大程度上阻止了从受试者体内完全去除所有癌细胞。
较新的治疗概念旨在通过使用特定措施，例如针对免疫抑制剂的抗体治疗和重组免疫信息学(即使用信息载体进行治疗)，将患者自身的免疫系统纳入整体治疗概念。这种策略成功的先决条件是受试者的免疫系统识别肿瘤特异性或肿瘤相关抗原或表位，其效应子功能(通过免疫细胞)将得到增强。肿瘤细胞在生物学上与其来源的非恶性细胞显著不同。这些差异是由于在肿瘤发展过程中获得的遗传改变，除其他外，还导致在肿瘤细胞中形成定性或定量改变的分子结构。如果这种肿瘤相关结构被荷瘤宿主的特定免疫系统识别，则将其称为肿瘤相关表位。
癌症/睾丸抗原(CTA)是指一组肿瘤相关蛋白，其例如由各种组织学起源的肿瘤表达(Fratta et al.,Molecular Oncology,5(2),April 2011,164-182)。在健康的成年脊椎动物中，这些蛋白质的表达限于雄性生殖细胞。然而，在癌症中，这些发育抗原的表达经常被重新激活，因此可以作为免疫激活的位点。许多CTA是致癌基因，参与细胞生长和分裂、抑制细胞凋亡和转移等细胞过程。它们通常是肿瘤发生和恶性转化的原因，因此被归类为肿瘤抗原。CTA在不同恶性肿瘤中的表达是异质的，通常与肿瘤进展相关，这就是为什么它们也可作为肿瘤疾病进展的生物标志物。这种CTA的HLA抗原肽通常作为降解产物被呈递在肿瘤细胞表面。众所周知，CTA衍生的HLA抗原肽的这种呈递可用于开发药物治疗与抗CTA靶向免疫治疗结合的新的治疗方式。
人类白细胞抗原(也称为HLA系统、HL抗原、组织相容性抗原、人类白细胞抗原)是一组对免疫系统功能至关重要的人类基因。HLA系统被称为主要组织相容性复合物(MHC)，存在于所有脊椎动物中。
MHC有两种类型，即I类MHC分子(本文中也称为“I类MHC复合物”或“I类HLA复合物”)和II类MHC分子(本文中也称为“II类MHC复合物”或“II类HLA复合物”)。两者都存在于下颌脊椎动物体内所有有核细胞的细胞表面。MHC分子由两条多肽链组成，一条重α链和一条轻β链(另请参见图1和2)。
I类MHC分子在所有有核细胞的细胞表面表达，并被CD8+T细胞(也称为T杀伤细胞或细胞毒性T细胞)识别。II类MHC分子主要暴露在抗原呈递细胞的细胞表面，被CD4+T细胞(也称为T辅助细胞)识别。
在血细胞中，I类MHC分子暴露在血小板(也是凝血细胞(thrombocytes))的细胞表面上，但不暴露在红细胞上。它们的功能是在其细胞表面呈递非自身蛋白的肽片段，并将它们从细胞中转移到杀伤性T细胞(也是细胞毒性T细胞)中，以触发针对借助于MHC I类蛋白呈递的特定非自身抗原的即时免疫系统反应。由于I类MHC分子呈递源自胞质蛋白的肽，因此I类MHC分子的呈递途径通常称为胞质或内源性途径。
在此，HLA抗原肽充当细胞表面呈递的对应MHC复合物与T细胞受体之间的介质。
I类HLA复合物(HLA-A、B和C)将细胞内抗原肽片段(本文中“对应于MHC I类复合物的HLA抗原肽”或“1型HLA抗原肽”在其序列中包含7至11个，主要为9个氨基酸，所谓的九聚体)呈递给T杀伤细胞(也是细胞毒性T细胞)，而HLA II类复合物(HLA-DR、DQ和DP)将外源性抗原肽(此处为“对应于MHC II类复合物的HLA抗原肽”或“2型HLA抗原肽”，在其序列中包含超过11个氨基酸，优选12至17个氨基酸)呈递给T辅助细胞。在人类中，对应于MHC I类的I类HLA抗原肽细分为HLA-A、HLA-B和HLA-C抗原肽。
从现有技术中已知，对应于MHC II类复合物的HLA抗原肽与对应的II类HLA复合物的肽结合口袋的结合主要通过HLA抗原肽的氨基酸第1、4、6/7、和9位的离散锚定残基发生(参见，例如Sinigaglia and Hammer(1995),J.Exp.Med.,181,449-451)。根据现有技术，特别优选的是II类HLA复合物的肽结合口袋基序与对应于MHC II类复合物的HLA抗原肽的氨基酸第6和9位的离散锚定残基之间的相互作用。各个HLA抗原肽的氨基酸第2、3、5、7和8位的氨基酸残基可用于与T细胞受体相互作用(Sant'Angelo et al.(2002),Recognition ofcore and flanking amino acids of MHC class II-bound peptides by the T-cellreceptor,Eur J Immunol,32(9),2510-20)。
相比之下，对于对应于MHC I类复合物的HLA抗原肽，氨基酸第1、2和9位已被假定为与对应的I类HLA复合物相关的主要锚定残基(参见，例如，Binkowski et al.(2012),PLoS ONE,7(8),e41710；Yamada(1999),Tissue Antigens,54(4),325-32)。
美国的一项新研究目前正在调查仅一种HLA抗原肽在治疗癌症方面的具体功效(参见WO 2013/135266,Inderberg-Suso et al.(2012),Oncoimmunology.,1(5),670-686and Slingluff(2011),Cancer J.,17(5),343-350)。因此，治疗范围非常有限，并且仅应用一种HLA抗原肽，疗效值得怀疑。
在诸如乳癌/乳腺癌之类的肿瘤实体中尤其如此，与其他肿瘤实体相比，乳癌/乳腺癌的特征在于低同质性(即高异质性)和缺乏初始免疫原性。因此，临床有效的靶向免疫信息和刺激疗法依赖于多因素信息方法。
因此，癌症免疫疗法的一个主要缺点是它们基于这样一个事实，即必须对每个癌症患者的肿瘤的个体突变模式(特征)进行解码。然后生产合成疫苗，例如基于RNA的疫苗，以匹配每个个体患者的突变模式的确定特征(所谓的疫苗生产)。以这种方式获得的疫苗只能用于该特定患者的个体治疗。
因此，原则上，这些用于癌症免疫治疗的新型疫苗不适用于患有相同肿瘤的其他患者，而只能用于为疫苗生产而先前分析过其突变组的单个患者。
发明内容
因此，与完全个体化的癌症免疫疗法相反，本发明的任务是为不同的受试者或特定预定的患者组(即，为具有至少一个相同HLA等位基因的特定患者组)提供药物组合物，所述患者在恶性或赘生性组织(乳癌/乳腺癌)的突变组中有重叠(衍生的患者组)。
因此，本发明的一个目的是提供药理活性剂以及包含此类活性剂的药物组合物，其可用于诊断、预防和/或治疗乳癌/乳腺癌和本文所列的其他疾病和病症；以及提供诊断、预防和/或治疗此类癌症的方法，包括施用和/或使用此类药剂和组合物。
特别地，本发明的一个目的是提供，与当前使用的和/或现有技术中已知的活性剂、组合物和/或方法相比，具有某些优点的此类药理学活性剂、药物组合物和/或方法。这些优点将在下文进一步描述。
特别地，本发明的一个目的是提供可用作药理学活性HLA抗原肽或用作药理学活性剂的具有治疗活性的HLA抗原肽，并提供用于诊断、预防和/或治疗乳癌/乳腺癌和其他疾病和病症，特别是如本文所述癌症的含有所述HLA抗原肽的药物组合物，以及提供诊断、预防和/或治疗此类疾病和病症的方法，所述方法包括施用和/或使用此类具有治疗活性的HLA抗原肽和组合物。
特别地，本发明的具体任务是提供适用于温血动物，特别是哺乳动物，最特别是人的预防、治疗和/或诊断用途的此类HLA抗原肽。
根据本发明，这些任务通过用于在患有或怀疑患有乳癌/乳腺癌的患者或患者组中治疗或预防乳癌/乳腺癌，特别是局部复发性或转移性乳癌/乳腺癌的根据权利要求1的药物组合物完成，所述药物组合物包含药理学有效量的4至8种，优选4、5、6、7或8种对应于MHC I类复合物的HLA-A肿瘤抗原肽和至少2种，优选1、2、3或4种对应于MHC II类复合物的肿瘤抗原肽，其特征在于所述HLA肿瘤抗原肽是肿瘤专有的或肿瘤相关的HLA抗原肽，其中所述HLA肿瘤抗原肽特别地，包括，包含在序列SEQ ID NO.13至SEQ ID No.26、SEQ IDNo.28、SEQ ID No.29和SEQ ID No.32至SEQ ID No.48中的序列。
在从属权利要求中给出了进一步的有利实施方式。
根据本发明的一个特别优选的实施方案，所述药物组合物仅由以下成分构成：载液(优选水、药学上可接受的盐水溶液和/或药学上的DMSO，这样的载液组合物是技术人员已知的，并且例如，在大约30％DMSO和70％水的范围内)，药理学有效量的4至8种对应于MHCI类复合物的HLA-A肿瘤抗原肽和2种对应于MHC II类复合物的肿瘤抗原肽溶解或悬浮于所述载液中，以及佐剂。
用于应用具有药学活性的HLA肿瘤抗原肽的药物组合物和合适的剂型根据现有技术中已知的标准程序制备，并且易于适用于其任何新的或改进的制备方法。
特别有利的是，向患有乳癌/乳腺癌的患者或患者组施用药理学有效量的HLA肿瘤抗原肽的上述组合有效地降低CA 15-3水平。CA 15-3(癌症抗原15-3)是一种所谓的用作乳腺癌中的特定肿瘤标志物的糖蛋白。CA 15-3值是实验室值，其在某些癌症，尤其是乳癌/乳腺癌中显著高于阈值。在健康个体中，CA15-3阈值低于每毫升31个酶单位(<31U/ml)。优选地，向患有乳癌/乳腺癌的患者或患者组施用药理学有效量的肿瘤抗原肽将CA 15-3值降低至低于60U/ml，更优选低于50U/ml，最优选降低至低于40U/ml的范围以及正常值(<31U/ml)。
特别优选地，向患者或患者组施用药理学有效量的HLA肿瘤抗原肽从而有效地延长个体的无进展生存期，优选延长至少2至5年。
与常规方法相反，本发明的一个令人惊讶的发现是，KD值在50至500nM范围内的肿瘤抗原肽会触发效应细胞(即细胞毒性T细胞)，这与常规的计算机模拟(in silico)结合预测模型中所认为的它们具有低结合性相反。相反，对于肿瘤抗原肽的功效，患者或具有至少一个相同HLA等位基因的患者组中用于治疗的HLA肿瘤抗原肽是免疫原性的是特别有利的，其可以用免疫原性测试预先确定(例如，通过蛋白质印迹、ELISA技术，尤其是通过ELISPOT，优选通过干扰素-γ、干扰素-α或白细胞介素(IL-2)，或使用显微镜分析进行免疫检测)。
如本文所述，但不限于本发明中的任何解释、作用机制或假设，基于分别增强I类MHC复合物和II类MHC复合物与至少一种T细胞受体相互作用的能力，确定了本发明的两类不同的氨基酸序列(特别是在下文实施例3中描述的检测方法中)。本发明的这两类氨基酸序列是(如下所述)：
-“对应于MHC I类复合物的HLA肿瘤抗原肽”：(参见表1-3中特别优选的实例)。
-“对应于MHC II类复合物的HLA肿瘤抗原肽”：(参见表4中特别优选的实例)。
有利地，根据本发明的药物组合物或其中包含的对应于MHC I类复合物和MHC II类复合物的肿瘤抗原肽的特定组合对患者或具有至少一个相同HLA等位基因的患者组的用途/应用不仅仅是被动免疫(如用抗体(例如赫赛汀治疗)的情况)，而是主动免疫(即通过信息载体特异性激活T细胞或B辅助细胞)。由于通过与MHC II类复合物相对应的肿瘤抗原肽特异性激活主要暴露在抗原呈递细胞的细胞表面的II类MHC分子，CD4+T细胞(也称为T辅助细胞)和B细胞被特异性激活。
为了结合T细胞受体，本发明的HLA肿瘤抗原肽通常在其氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸残基或一个或多个氨基酸残基片段(即，每个“片段”包含两个或更多个彼此相邻或非常接近的氨基酸残基，即在氨基酸序列的一级或三级结构中)，本发明的氨基酸序列可以通过其与T细胞受体(特别是其结合口袋)结合，氨基酸残基或氨基酸残基的部分因此形成用于结合T细胞受体的“锚”(在本文中也称为“锚氨基酸”)。
例如，可以通过计算机模拟方法(例如，在公开可用的NetMHC-4.0中使用的人工神经网络NNAlign)或通过靶向突变(HLA肿瘤抗原肽的氨基酸序列中的插入或替换)来评估该“锚”的确定。
本发明提供的HLA肿瘤抗原肽优选为基本上分离的形式(如本文所定义)或形成蛋白质或多肽的一部分，其可包含本发明的一种或多种HLA肿瘤抗原肽或基本上由本发明的一种或多种HLA肿瘤抗原肽组成，并且其可任选地进一步包含一种或多种药学活性HLA肿瘤抗原肽(所有任选地通过一个或多个接头连接在所谓的寡肽中)。例如但不限于，本发明的肿瘤抗原肽可用作此类蛋白质或多肽中的结合部分，其可任选地包括一个或多个可用作结合部分的另外的氨基酸序列(即，针对除T细胞受体之外的一个或多个靶标)以分别提供如本文所述的本发明的单价、多价或多特异性多肽。这种蛋白质或多肽也可以是基本上分离的形式(如本文所定义)。
如本文公开的，包含对应于MHC I类复合物的HLA肿瘤抗原肽和对应于MHC II类复合物的HLA肿瘤抗原肽的特定组合的药物组合物已被证明是特别有利的，因为它能够特异性激活T细胞以及特异性激活B细胞。
在其他实施方案中，本发明还涉及确定/鉴定对应于I类和/或II类MHC复合物的药理活性HLA抗原肽的药物组合物、试剂盒(或其部分)、方法、根据本发明的制剂的制备方法，以及根据本发明的制剂在制备用于治疗癌症，特别是乳癌/乳腺癌的药物组合物中的用途。
特别地，本发明的多肽和药物组合物可用于预防和治疗癌症，特别是乳癌/乳腺癌，其特征在于对应于MHC I类复合物和/或对应于MHC II类复合物的突变(在此称为“氨基酸取代”)改变的野生型HLA抗原肽(所谓的HLA肿瘤抗原肽，如本文所定义)。
一般而言，在本发明之前，通过传统方法例如化学疗法、放射疗法和/或癌症免疫疗法对患者或患者组的癌症进行治疗。
用于治疗本发明癌症的传统方法是例如手术肿瘤去除(切除)、化学疗法和/或放射疗法，其中两种或甚至所有三种治疗方法经常同时应用于受试者。在癌症免疫治疗方法中，主动免疫和被动免疫是有区别的。在主动免疫中，受试者被给予旨在在其免疫系统中触发免疫反应的物质。在被动免疫中，使用抗体或抗体片段。在过继免疫疗法(即被动免疫疗法，与没有直接免疫调节的抗体治疗相比)中，从受试者中取出白细胞，离体培养，然后重新注射到受试者体内。如果治疗不破坏肿瘤及其转移灶的所有细胞，则耐药性的发展会严重阻碍癌症的进一步治疗。
因此，本发明还包括用于治疗癌症的药物组合物，如上所述，其在传统的癌症治疗方法之后，即在手术切除(切除)、化学疗法和/或放射疗法不成功之后施行。
发明人的一项特别成就是发现为了有效治疗，根据本发明使用的HLA-A抗原肽实际上在待治疗的个体的待治疗的恶性组织(特别是乳癌/乳腺癌)的细胞的细胞表面上呈递。因此，在应用和组装药物组合物之前，如通过超高效液相色谱(UHPCL)结合ESI质谱(MS)所测定的，所应用的药物组合物包含呈递于患者或患者组的乳癌/乳腺癌的肿瘤细胞表面的HLA抗原肽。通过这样的配体分析，与常规癌症免疫疗法不同，已经预先证明本发明的HLA-A抗原肽对对应的I类或II类MHC复合物的结合能力。
根据本发明的优选实施方案，如通过如本文所述的方法所确定的，待施用的药物组合物中包含的至少60％、优选至少80％、最优选90％、理想地所有HLA肿瘤抗原肽呈递于患者或患者组的乳癌/乳腺癌的肿瘤细胞表面上。
根据本发明的一个特别优选的实施方案，对应于MHC I类复合物的HLA抗原肽选自SEQ ID No.1至35中给出的氨基酸序列或与这些氨基酸序列具有至少85％的氨基酸同一性。
根据本发明的一个特别优选的实施方案，对应于MHC II类复合物的HLA抗原肽选自SEQ ID No.36至48所示的氨基酸序列。
本发明的发明人已经发现，本文明确公开的对应于MHC I类的HLA-A抗原肽特别适用于治疗具有至少一个表现出A*01和/或A*02亚型的相同HLA等位基因的受试者或患者中的乳癌/乳腺癌。即，本文所用的HLA-A肿瘤抗原肽优选与A*01和/或A*02亚型的对应MHC I类复合物结合。
根据一个特别优选的实施方案，个体(受试者或患者组)具有亚组A*01:01和/或A*02:01的单倍型。
或者，个体(受试者或患者组)特别优选具有亚组B*44:01和/或A*18:01的单倍型。
确实，根据本发明的药物组合物可用于恶性肿瘤、肿瘤和/或白血病的组织独立治疗(即，与常规制剂不同，癌症亚型最初不发挥作用)，因此药物组合物可以跨组织施用以用作抗癌药物。然而，发现根据本发明的对应于MHC I类复合物的4至8种HLA-A肿瘤抗原肽和至少2种HLA肿瘤抗原肽的特定组合的施用/应用可特别有利地用于治疗乳腺癌。
可以通过向药物组合物中进一步加入药理学有效量的至少一种HLA-B肿瘤抗原肽，优选1、2、3、4或5种对应于MHC I类复合物的HLA-B肿瘤抗原肽和/或至少一种HLA-C肿瘤抗原肽，优选1、2、3、4或5种对应于MHC I类复合物的HLA-C肿瘤抗原肽，使用该药物组合物治疗患者或具有至少一个相同HLA等位基因的患者组，可以实现进一步临床益处。应理解，还选择对应于患者或具有至少一个相同HLA等位基因的患者组的特定单倍型的HLA-B肿瘤抗原肽或HLA-C肿瘤抗原肽用于治疗或预防。
根据本发明的一个优选实施方案，根据本发明的药物组合物包含至少6、7、8、9、10、11或12种对应于MHC I类复合物和/或MHC II类复合物的HLA抗原肽，和/或至少一种如下的HLA抗原肽，其类似于暴露在来自待治疗个体的恶性和/或赘生性组织(特别是乳癌/乳腺癌)的细胞的细胞表面上的至少一种HLA抗原肽，在其氨基酸序列中具有相对于该HLA抗原肽的野生型的至少一个氨基酸交换(所谓的新抗原肽)，并且其对内源性T细胞的T细胞受体的特异性亲和力增加了至少3倍(相应地测量和/或表示为KD值)。具有至少10、11或12种对应于MHC I类复合物和/或MHC II类复合物的HLA抗原肽的药物组合物取得了特别好的成功。
在这方面，已经表明，由药理学有效量的4至8种，优选4、5、6、7或8种对应于MHC I类复合物的HLA-A和/或HLA-B肿瘤抗原肽(特别是其新抗原肽)和1、2、3或4种对应于MHC II类复合物的肿瘤抗原肽(特别是其新抗原肽)组成的药物组合物是特别优选的。
根据本发明的一个特别优选的实施方案，组合物中的至少一种HLA-A抗原肽是肿瘤专有的HLA-A抗原肽(即，癌症-睾丸抗原(CTA)，其不(不再)在患者/患者组的健康/正常组织中免疫豁免的精母细胞以外出现，或所谓的新抗原肽)，并且其中肿瘤专有的HLA-A抗原肽的特异性结合的特异性解离(KD)在10到50nM的范围内，这由表面等离子体共振确定。
发明人发现基于HLA抗原肽的药物组合物在T淋巴细胞(简称T细胞)和B淋巴细胞(简称B细胞)均被它们激活时特别有效，这也是本发明人的一项杰出成就。
T细胞属于淋巴细胞细胞群，在人体免疫系统中发挥着重要作用。T细胞通过特定受体识别抗原，即所谓的T细胞受体(TCR)。然而，要使其发生，抗原必须由抗原呈递细胞(APC)提供。
T细胞与抗原呈递细胞的稳定结合需要所谓的辅助蛋白的参与。这些包括CD4和CD8(CD＝“分化簇”)。
携带CD4特征的T细胞也称为CD4阳性T细胞或T辅助细胞。在正常成人血液中，CD4+T细胞占淋巴细胞的27-57％，或大约310-1570个细胞/微升。
CD8阳性(CD8+)T细胞组(也包括调节性T细胞)包含细胞毒性T细胞或T杀伤细胞。它们在杀死被病毒感染的人体自身细胞方面发挥着特殊作用。
细胞免疫防御的这一特征在本发明中至关重要，因为肿瘤细胞的分子生物学和遗传改变可以被该T细胞群识别和裂解。
相比之下，B细胞是唯一能够产生抗体的细胞，与T细胞一起构成适应性免疫系统的关键组成部分。虽然T细胞参与细胞介导的免疫反应，但B细胞是体液免疫反应的载体(并负责形成抗体)。
一种药物组合物已显示包含肿瘤相关HLA抗原肽，如通过qPCR确定的，所述肿瘤相关HLA抗原肽在肿瘤细胞中的表达水平比在患者或具有至少一个相同HLA等位基因的特别确定的患者组的健康细胞中的表达水平高至少三倍，并且其中，肿瘤相关HLA抗原肽与乳癌/乳腺癌的增殖、侵袭、血管生成和细胞角蛋白产生的增加相关，在治疗乳癌/乳腺癌中具有特别有效的药理作用。
特别优选地，本文用于治疗乳腺癌的每种单独的HLA抗原肽以至少100至600μg，优选300至600μg的绝对浓度(即给药剂量)包含在药物组合物中。
同时，在进一步的实验中已经表明，特别优选的是含有>600μg/HLA肿瘤抗原肽，即至少700至1,200μg，优选800至1,200μg的绝对浓度的药物组合物，因为这极大强化信息(免疫系统的激活和/或训练)。如果待治疗对象的免疫系统已经通过标准治疗程序(例如至少一次手术、放射、化学疗法和/或激素疗法)预处理而减弱，则这是特别有利的。此外，每种HLA肿瘤抗原肽的绝对浓度是优选的，因为在将HLA肿瘤抗原肽应用于受试者后，该绝对浓度显著降低了HLA肿瘤抗原肽降解(例如，通过连接酶)的影响。
当将组合物施用于患者时，药物组合物包含能够在施用部位形成肉芽肿的佐剂，这是非常方便的。肉芽肿形成的优点是因此可以实现贮库效应，由此HLA肿瘤抗原肽有利地以储库的方式储存在施用部位，并且可以更长的时间地递送至受试者的生物体。因此，特别有利地，省略了根据本发明的药物组合物的每周施用。优选地，当使用较长时间时，本发明含义内的用于治疗癌症疾病的药物组合物的施用，因此仅需每2周进行一次，特别优选仅每月进行一次。
在这点上，药物组合物优选皮下或皮内施用，优选基本上同时在至少2个，更优选至少3个，通常3至4个远离肿瘤病灶和/或癌性淋巴结区域的施用部位施用。
在多个施用部位基本上同时(连续)施用的优点是，特别是在施用>600μg范围内的高绝对浓度的单个HLA抗原肽(即给药剂量)的情况下，这需要更大的应用量(>1mL)以便使单个HLA抗原肽完全溶解，尽可能同时施用应用溶液，因为该应用溶液在打开后只有有限的保质期。
优选地，组合物中包含绝对浓度(即给药剂量)为300至600μg的每种单个HLA抗原肽的药物组合物仅需每2周一次皮内或皮下给药，优选每4周一次，对患者或具有至少一个相同HLA等位基因的特定鉴定的患者组持续至少一年。
已经发现，其中至少一种HLA肿瘤抗原肽相对于野生型HLA肿瘤抗原肽具有至少一个突变(如下详述)的药物组合物导致与野生型HLA抗原肽相比，用该HLA肿瘤抗原肽治疗的个体对T细胞受体的特异性结合亲和力(KD值)增加，优选地<500nM，更优选<50nM，显示在治疗乳癌/乳腺癌中特别有益的效果。
根据本发明的优选实施方案，所述药物组合物作为单一疗法或与其他已知疗法和/或用于治疗乳腺癌的化合物组合用于治疗乳腺癌。在这点上，药物组合物将作为一线疗法施用于患者或具有至少一个相同HLA等位基因的患者组(所谓的辅助单一疗法)。
或者，可以规定，待用所述药物组合物治疗的患者或具有至少一个相同HLA等位基因的患者组已经提前接受了至少一种标准治疗程序(例如，至少一种手术、放疗、化疗和/或激素治疗)。
特别优选地，待治疗的乳癌/乳腺癌是激素阳性、HER2/neu或三阴性乳腺癌。
HLA肿瘤抗原肽
本发明还包括对应于MHC I类复合物或MHC II类复合物的HLA肿瘤抗原肽，尤其用于治疗或预防患有或怀疑患有乳癌/乳腺癌的患者或患者组的乳癌/乳腺癌，分别用于根据本发明的药物组合物，其中HLA肿瘤抗原肽包含选自SEQ ID No.13至35和SEQ ID No.36至48中给出的氨基酸序列，尤其是SEQ ID No.13至SEQ ID No.26、SEQ ID No.28、SEQ IDNo.29和SEQ ID No.32至SEQ ID No.48中给出的氨基酸序列，或HLA肿瘤抗原肽相对于这些氨基酸序列中的1个具有至少1个突变、优选氨基酸取代。
在这方面特别优选的是在治疗患者或具有至少一个相同HLA等位基因的患者组的乳腺癌，尤其是局部复发或转移性乳腺癌的方法中使用前述HLA肿瘤抗原肽，该方法包括向患者或患者组施用/应用包含药理学有效量的至少一种前述HLA肿瘤抗原肽的治疗方案。
为了使被施用根据本发明的HLA肿瘤抗原肽或药物组合物的个体的免疫系统仍然是完全功能性的并且因此更容易训练，如果个体尚未接受针对乳腺癌，尤其是局部复发或转移性乳腺癌的辐射、化疗和/或激素治疗，和/或自最后一剂化疗药物使用后12个月或更短时间内复发中尚未接受先前的辅助化疗，则是有利的。
特别优选地，本文所述的治疗方案，特别是使用至少一种上述根据本发明的HLA肿瘤抗原肽，有效地延长个体的无进展生存期。
A)HLA-A抗原肽和HLA-A新抗原肽
“对应于MHC I类复合物的HLA-A肿瘤抗原肽”在本文中定义为“本发明的HLA抗原肽”或“本发明的氨基酸序列”(如本文所定义)，包括：
a)由7至11个氨基酸组成的氨基酸序列；和/或
b)具有由7至11个氨基酸组成的氨基酸序列的新抗原肽，其
i)类似于暴露在来自待治疗个体的恶性和/或赘生性组织(特别是乳癌/乳腺癌)的细胞的细胞表面上的至少一种HLA-A抗原肽，并且
ii)与该HLA-A新抗原肽的野生型相比，在其氨基酸序列中至少有一处氨基酸交换(所谓的“HLA-A新抗原肽”)，并且
iii)对内源性T细胞的T细胞受体的特异性亲和力至少增加3倍
本发明人的一项杰出成就是认识到，HLA-A新抗原肽，与该HLA-A抗原肽的野生型相比，在其氨基酸序列中，在氨基酸位置1(N-末端)、2、7/8和/或C-末端具有至少一个氨基酸交换，其对内源性T细胞的T细胞受体的特异性亲和力(KD)增加至少4倍，特别优选至少5倍，最优选至少8倍，因此特别优选用于根据本发明的组合物中。
特别优选地，HLA-A抗原肽的氨基酸序列中的氨基酸交换是在氨基酸位置1(N-末端)、2、7/8或C-末端的单一氨基酸交换。
优选地，HLA-A新抗原相对于该HLA-A抗原肽的野生型的氨基酸序列中的氨基酸交换为C/Y、A/V、D/Y、E/K、P/L、N/D或T/M交换。
优选地，通过本领域技术人员已知的任何合适的检测方法测定，HLA-A肽或HLA-A新抗原对T细胞受体的特异性活性(KD)小于100nM，更优选小于75nM或最优选小于50nM，例如小于40nM、35nM、30nM、25nM或20nM。
优选地，HLA-A肿瘤抗原肽或HLA-A新抗原以如上定义的至少100至600μg的浓度，或者优选地以相对于待施用的药物组合物的体积>600μg的绝对浓度存在于根据本发明的药物组合物中。
优选地，HLA-A肿瘤抗原肽或HLA-A新抗原如上文(b)点中定义进行选择。
根据一个特别优选的实施方案，“HLA-A新抗原肽”是优选的，其包含以下支架序列：
(a)选自SEQ ID No:13至19和27至34的氨基酸序列；和/或
(b)具有选自SEQ ID No:13至19和27至34的氨基酸序列的新抗原；和/或
(c)具有以下氨基酸序列的氨基酸序列：与天然HLA-A抗原肽具有小于100％的序列同一性或相似性的氨基酸序列，例如与选自SEQ ID No.:1至5、13至19和27至34的氨基酸序列具有至少85％，更优选至少90％的序列同一性(如本文所定义)；和/或
(d)具有以下氨基酸序列的氨基酸序列：相对于选自SEQ ID NO:1至5、13至19和27至34的氨基酸序列，包含仅一个氨基酸取代或基本上仅由一个氨基酸取代组成的氨基酸序列；和/或
(e)由至少一种HLA-A肿瘤抗原肽和一种HLA-A、HLA-B和/或HLA-C肿瘤抗原肽和/或其对应的新抗原的至少两个相同或不同的肽序列组成的化合物、构建体、蛋白质或多肽，其中所述HLA抗原肽任选地通过合适的接头(所谓的寡肽)彼此连接。
非常优选地，HLA-A肿瘤抗原肽分别如(b)、(d)和(e)中所定义。同样在根据(e)的实施方案中，HLA-A肿瘤抗原肽优选地分别如(a)或(d)所述定义。在(e)中定义的HLA-A肿瘤抗原肽和/或新抗原通过接头彼此连接的情况下，合适的接头是现有技术的技术人员已知的。
由HLA肿瘤抗原肽和/或HLA新抗原的至少两个相同或不同的肽序列组成的根据本发明的(e)所定义的化合物、构建体、蛋白质或多肽的应用具有进一步的优点：化合物、构建体、蛋白质或多肽的更长的氨基酸序列在施用后在受试者的组织中的保留时间更长，由此，化合物、构建体、蛋白质或多肽在被施用于受试者后可以分解，例如通过身体自身的酶分解成更小的片段(包含至少7至11个氨基酸的药学活性形式)，在本发明的意义上，这些更小的片段具有生物学所需的功能。也就是说，寡肽的单个片段表现出作为HLA-A、HLA-B或HLA-C肿瘤抗原肽的活性，从而有助于T细胞的活化。
在一个特定的实施方案中，任何HLA-A肽序列可以是如本文进一步描述的人源化和/或序列优化的序列。
B)HLA-B抗原肽和HLA-B新抗原肽
“HLA-B抗原肽”在本文中定义为“本发明的HLA-B抗原肽”或“本发明的氨基酸序列”(如本文所定义)，包括：
a)由12至17个氨基酸组成的氨基酸序列；和/或
b)具有由12到17个氨基酸组成的氨基酸序列的新抗原肽，它
i)类似于暴露在来自待治疗个体的恶性和/或赘生性组织(特别是乳癌/乳腺癌)的细胞的细胞表面上的至少一种HLA-B抗原肽，以及
ii)相对于该HLA-B抗原肽的野生型，在其氨基酸序列中具有至少一个氨基酸交换(所谓的“HLA-B新抗原肽”)，以及
iii)对内源性T细胞的T细胞受体的特异性亲和力至少增加3倍。
此外，发明人已经认识到，与该HLA-B抗原肽的野生型相比，在其氨基酸序列中在第3、8和/或10位氨基酸中具有至少一个氨基酸交换的HLA-B新抗原肽对身体自身T细胞的T细胞受体的特异性亲和力增加至少4倍，特别优选至少7倍，因此特别优选用于根据本发明的制剂中。
特别优选地，HLA-B抗原肽的氨基酸序列中的氨基酸交换是在第3、8或10位氨基酸的单一氨基酸交换。
优选地，相对于该HLA-B抗原肽的野生型，HLA-B新抗原的氨基酸序列中的氨基酸交换是E/A、E/K、R/W或D/A交换。
优选地，如通过本领域技术人员已知的任何合适的检测方法测定的，HLA-B抗原肽或HLA-B新抗原肽对T细胞受体的特异性活性(KD)小于100nM，更优选小于75nM或最优选小于50nM，例如小于40nM、35nM、30nM、25nM或20nM。
优选地，HLA-B肿瘤抗原肽或HLA-B新抗原以如上定义的至少100至600μg的浓度存在于根据本发明的药物组合物中，或者优选地以相对于待施用的药物组合物的体积>600μg的绝对浓度存在于根据本发明的药物组合物中。
优选地，HLA-B肽或HLA-B新抗原如上文b)点定义进行选择。
根据一个特别优选的实施方案，“HLA-B新抗原”是优选的，其包含以下支架序列：
(a)选自SEQ ID NO:20、21、22和35的氨基酸序列；和/或
(b)具有以下氨基酸序列的氨基酸序列：与选自SEQ ID No:6、7、8、20、21、22和35的氨基酸序列具有至少80％，例如至少85％，更优选至少90％的序列同一性的氨基酸序列(如本文所定义)；和/或
(c)具有以下氨基酸序列的氨基酸序列：相对于选自SEQ ID NO:6、7、8、20、21、22和35的氨基酸序列，包含仅一个氨基酸取代或基本上仅由一个氨基酸取代组成的氨基酸序列；和/或
(d)由至少一种HLA-B肿瘤抗原肽和一种HLA-A、HLA-B和/或HLA-C肿瘤抗原肽和/或其相应的新抗原的至少两个相同或不同的肽序列组成的化合物、构建体、蛋白质或多肽，其中HLA抗原肽任选地通过合适的接头(所谓的寡肽)彼此连接。
非常优选地，HLA-B肽分别如(a)、(c)和(d)中所定义。同样在根据(d)的实施方案中，HLA-B肽优选地如(a)或(c)所述定义。如在(e)中定义的HLA-B肿瘤抗原肽和/或HLA-B新抗原通过接头彼此连接的情况下，合适的接头是本领域技术人员从现有技术中已知的。
由HLA肿瘤抗原肽和/或HLA新抗原的至少两个相同或不同的肽序列组成的根据本发明的(d)定义的化合物、构建体、蛋白质或多肽的应用具有进一步的优点：化合物、构建体、蛋白质或多肽的更长的氨基酸序列在施用后在受试者的组织中的保留时间更长，由此，化合物、构建体、蛋白质或多肽在被施用于受试者后可以分解，例如通过身体自身的酶分解成更小的片段(包含至少7至11个氨基酸的药学活性形式)，在本发明的意义上，这些更小的片段具有生物学所需的功能，也就是说，寡肽的单个片段表现出作为HLA-A、HLA-B或HLA-C肿瘤抗原肽的活性，从而有助于T细胞的活化。
在一个特定的实施方案中，任何HLA-B肽序列可以是如本文进一步描述的人源化和/或序列优化的序列。
C)HLA-C抗原肽和HLA-C新抗原肽
“HLA-C抗原肽”在本文中定义为“本发明的HLA抗原肽”或“本发明的氨基酸序列”(如本文所定义)，包括：
a)由8至11个氨基酸组成的氨基酸序列；和/或
b)具有由8到11个氨基酸组成的氨基酸序列的新抗原肽，它
i)类似于暴露在来自待治疗个体的恶性和/或赘生性组织(特别是乳癌
/乳腺癌)的细胞的细胞表面上的至少一种HLA-C抗原肽，以及
ii)相对于该HLA-C肽的野生型，在其氨基酸序列中具有至少一个氨基酸交换(所谓的“HLA-C新抗原肽”)，以及
iii)对内源性T细胞的T细胞受体的特异性亲和力至少增加3倍
此外，本发明人已经认识到，与该HLA-C抗原肽的野生型相比，HLA-C新抗原肽在其氨基酸序列中在氨基酸位置1(N-末端)、4和/或C末端具有至少一个氨基酸交换，对身体自身T细胞的T细胞受体的特异性亲和力增加至少4倍，特别优选至少5倍，非常特别优选至少7倍，因此特别优选用于根据本发明的制剂。
特别优选地，HLA-C抗原肽的氨基酸序列中的氨基酸交换是氨基酸位置1(N-末端)、4或C-末端的单一氨基酸交换。
优选地，HLA-C新抗原肽相对于该HLA-C抗原肽的野生型的氨基酸序列中的氨基酸交换为C/Y、A/P、L/F或T/M交换。
优选地，如通过本领域技术人员已知的任何合适的检测方法测定的，HLA-C抗原肽或HLA-C新抗原肽对T细胞受体的特异性活性(KD)小于100nM，更优选小于75nM或最优选小于50nM，例如小于40nM、35nM、30nM、25nM或20nM。
优选地，HLA-C肿瘤抗原肽或HLA-C新抗原以如上定义的至少100至600μg的浓度，或者优选地相对于待施用的药物组合物的体积>600μg的绝对浓度存在于根据本发明的药物组合物中。
优选地，HLA-C抗原肽或HLA-C新抗原肽如上文b)点定义进行选择。
根据一个特别优选的实施方案，“HLA-C新抗原肽”是优选的，其包含以下支架序列：
(a)选自SEQ ID NO:23至26的氨基酸序列；和/或
(b)与选自SEQ ID No:9至12和23至26的氨基酸序列具有至少80％，例如至少85％，更优选至少90％的序列同一性的氨基酸序列(如本文所定义)；和/或
(c)相对于选自SEQ ID No:9至12和23至26的氨基酸序列，包含仅一个氨基酸取代或基本上仅由一个氨基酸取代组成的氨基酸序列；和/或
(d)由至少一种HLA-C肿瘤抗原肽和一种HLA-A、HLA-B和/或HLA-C肿瘤抗原肽和/或其相应的新抗原的至少两个相同或不同的肽序列组成的化合物、构建体、蛋白质或多肽，其中HLA抗原肽任选地通过合适的接头(所谓的寡肽)彼此连接。
非常优选地，HLA-C肽分别如(a)、(c)和(d)中所定义。同样在根据(d)的实施方案中，HLA-C抗原肽优选地分别如(a)和(c)所述定义。在(d)中定义的HLA-C肿瘤抗原肽和/或HLA-C新抗原通过接头彼此连接的情况下，合适的接头是本领域技术人员从现有技术中已知的。
由HLA肿瘤抗原肽和/或HLA新抗原的至少两个相同或不同的肽序列组成的根据本发明的如(d)定义的化合物、构建体、蛋白质或多肽的应用具有进一步的优点：化合物、构建体、蛋白质或多肽的更长的氨基酸序列在施用后在受试者的组织中的保留时间更长，由此，化合物、构建体、蛋白质或多肽在被施用于受试者后可以分解，例如通过身体自身的酶分解成更小的片段(包含至少7至11个氨基酸的药学活性形式)，在本发明的意义上，这些更小的片段具有生物学所需的功能，也就是说，寡肽的单个片段表现出作为HLA-A、HLA-B或HLA-C肿瘤抗原肽的活性，从而有助于T细胞的活化。
在一个特定的实施方案中，任何HLA-C抗原肽序列可以是如本文进一步描述的人源化和/或序列优化的序列。
D)HLA II类抗原肽和HLA-II新抗原肽
“HLA II类抗原肽”在本文中定义为“本发明的HLA肽”或“本发明的氨基酸序列”(如本文所定义)，包括：
a)由13至20个氨基酸，特别优选13至17个氨基酸组成的氨基酸序列，和/或
b)具有由13至20个氨基酸，特别优选13至17个氨基酸组成的氨基酸序列的新抗原，其
i)类似于暴露于来自待治疗个体的恶性和/或赘生性组织(特别是乳癌/乳腺癌)的细胞的细胞表面上的至少一种II类HLA肽，以及
ii)与该II类HLA肽的野生型相比，在其氨基酸序列中，至少有一个氨基酸交换(所谓的“II类HLA新抗原”)，以及
iii)对内源性T细胞的T细胞受体的特异性亲和力至少增加3倍
此外，发明人已经认识到，II类HLA新抗原与该II类HLA肽的野生型相比在其氨基酸序列中在氨基酸第3、6、10、12、13和/或14位，特别优选在氨基酸第12和/或14位具有至少一个氨基酸交换，其对内源性T细胞的T细胞受体的特异性亲和力增加至少4倍，因此特别优选用于根据本发明的制剂中。
特别优选地，II类HLA肽的氨基酸序列中的氨基酸取代是在氨基酸第12或14位的单个氨基酸取代。
优选地，相对于该II类HLA肽的野生型，II类HLA新抗原的氨基酸序列中的氨基酸交换是E/K、E/A、D/Y或T/M交换。
优选地，如通过本领域技术人员已知的任何合适的检测方法测定的，II类HLA肽或II类HLA新抗原对T细胞受体的特异性活性(KD)小于100nM，更优选地小于75nM，或最优选小于50nM，例如小于40nM、35nM、30nM、25nM或20nM。
优选地，对应于II类MHC复合物的HLA肿瘤抗原肽或对应于II类MHC复合物的HLA新抗原以如上定义的至少100至600μg的浓度存在于根据本发明的药物组合物中，或者优选地，以相对于待施用的药物组合物的体积>600μg的绝对浓度存在于根据本发明的药物组合物中。
优选地，如上文b)点定义，选择II类HLA肽或II类HLA新抗原。
根据一个特别优选的实施方案，“HLA II类新抗原”是优选的，包括以下支架序列：
(a)选自SEQ ID NO:36、37、38、41、42、43、44、45、46、47、48的氨基酸序列；和/或
(b)一种新抗原，其氨基酸序列与选自SEQ ID NO:36至48的氨基酸序列具有至少80％，例如至少85％，更优选至少90％的序列同一性(如本文所定义)；和/或
(c)一种新抗原，相对于选自SEQ ID NO:36至48的氨基酸序列，其氨基酸序列包含仅一个氨基酸取代或基本上仅由一个氨基酸取代组成；和/或
(d)由至少两个相同或不同的II类HLA肽序列组成的化合物、构建体、蛋白质或多肽，其中II类HLA抗原肽通过合适的接头(所谓的寡肽)连接在一起。
(e)由至少一种II类HLA抗原肽序列和一种II类HLA抗原肽序列、HLA-A、HLA-B和/或HLA-C抗原肽序列和/或其相应的新抗原的至少两个相同或不同的肽序列组成的化合物、构建体、蛋白质或多肽，
其中HLA抗原肽任选地通过合适的接头(所谓的寡肽)彼此连接。
非常优选地，II类HLA抗原肽分别如(a)、(c)和(d)中所定义。同样在根据(d)的实施方案中，HLA II类抗原肽优选地分别如(a)或(c)所述定义。在如(d)中定义的II类HLA肿瘤抗原肽和/或相应的新抗原通过接头彼此连接的情况下，合适的接头是本领域技术人员从现有技术已知的。
由HLA肿瘤抗原肽和/或HLA新抗原的至少两个相同或不同肽序列组成的根据本发明的(d)定义的化合物、构建体、蛋白质或多肽的应用，具有进一步优点：化合物、构建体、蛋白质或多肽的更长的氨基酸序列在施用后在受试者的组织中的保留时间更长，由此，化合物、构建体、蛋白质或多肽在被施用于受试者后可以分解，例如通过身体自身的酶分解成更小的片段(包含至少7至11个氨基酸的药学活性形式)，在本发明的意义上，这些更小的片段具有生物学所需的功能，也就是说，寡肽的单个片段表现出作为HLA-A、HLA-B或HLA-C肿瘤抗原肽的活性，从而有助于T细胞的活化。
在一个特定的实施方案中，任何II类HLA抗原肽序列可以是如本文进一步描述的人源化和/或序列优化的序列。
根据本发明，使用至少2种II类HLA肿瘤抗原肽治疗乳腺癌具有显著优势，即B细胞也在待治疗的受试者中以靶向方式被激活。
根据本发明的II类HLA肿瘤抗原肽的应用具有进一步的优点，即具有比I类HLA肿瘤抗原肽更长的氨基酸序列的HLA抗原肽在应用于测试者后可以被分解，例如，通过身体自身的酶，分解成更小的片段(至少包含7到11个氨基酸)，这些片段具有HLA-A、HLA-B或HLA-C抗原肽的活性，从而有助于T细胞的活化。
“片段”是指多肽的一部分，其优选包含参考多肽全长的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。一个片段可以包含7、8、9、10、11个或更多个氨基酸。
特别地，本发明的氨基酸序列和多肽是优选的，如权利要求中所定义，其中：
至少一种HLA肿瘤抗原肽类似于暴露在来自待治疗个体的恶性和/或赘生性组织的细胞的细胞表面上的至少一种HLA肿瘤抗原肽，该肽与所述HLA肿瘤抗原肽的野生型相比在其氨基酸序列中具有至少一个氨基酸交换(即，HLA新抗原肽)，其对于身体自身的T细胞的T细胞受体的特异性亲和力增加至少3倍。
发明人的杰出成就是发现包含超过3种这样的HLA肿瘤抗原肽的药物组合物特别有效。因此，根据本发明的药物组合物优选包含至少六种，非常优选至少八种，非常特别优选十种上述对应于I类和/或II类MHC复合物的HLA肿瘤抗原肽。
优选地，本发明中使用的单价氨基酸序列(或仅包含本发明的一个氨基酸序列的多肽)是这样一种序列，即与对应的野生型HLA肽序列相比，其与内源性T细胞的T细胞受体结合的特异性亲和力增加3倍。
应注意，“可特异性结合”和“特异性结合到”在本文中可互换使用，是指特异性结合相应指定实体的能力。
就本发明而言，重要的是由主治医师预先进行癌症的诊断。
可以在本发明的单个多肽中组合属于本发明中使用的不同类别的氨基酸序列。特别是，已经证明HLA-A、HLA-B和/或HLA-C肿瘤抗原肽和/或相应的新抗原肽在本发明的单个多肽中的组合具有独特的结合特性(参见图3)。
根据本领域技术人员所知，包含对应于I类或II类MHC复合物的HLA-A、HLA-B和/或HLA-C肿瘤抗原肽和/或新抗原肽的氨基酸序列的多于一种组分的本发明的多肽的特异性活性(KD)可根据上文/下文描述的检测方法之一确定，其中本发明的化合物、构建体、蛋白质或多肽优选具有与它们的每一个组分的特异性活性相似的特异性活性，即与包含在本发明的化合物、构建体、蛋白质或多肽中的I类或II类氨基酸序列的每一个(的单独组分)的特异性活性相似的特异性活性。上述优选的化合物、构建体、蛋白质或多肽的一些具体但非限制性的实例是包括下述各项之一的化合物、构建体、蛋白质或多肽：
i)对应于I类MHC复合物(分别为HLA-A、HLA-B或HLA-C肽)和/或II类MHC复合物的野生型HLA肿瘤抗原肽；或
ii)对应于I类MHC复合物(分别为HLA-A、HLA-B和HLA-C新抗原)和/或II类MHC复合物的新抗原，其具有选自SEQ ID NO:1至48的氨基酸序列；或
iii)对应于I类MHC复合物(分别为HLA-A、HLA-B和HLA-C新抗原)和/或II类MHC复合物的新抗原，其氨基酸序列与选自SEQ ID NO:1至48的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性(如本文所定义)；或
iv)相对于选自SEQ ID No:1至48的氨基酸序列，包含仅一个氨基酸取代或基本上仅由一个氨基酸取代组成的氨基酸序列；或
v)由至少两个相同或不同的HLA抗原肽序列组成的化合物、构建体、蛋白质或多肽，其中HLA肽任选地通过合适的接头彼此连接；
或包含其合适的组合。
请注意，最后的前述段落通常也适用于本发明的所有氨基酸序列，其包含分别根据A)、B)、C)和D)的HLA肿瘤抗原肽和/或HLA新抗原肽的一个或多个氨基酸序列。
当然，所有上述对应于I类和II类MHC复合物的HLA肿瘤抗原肽均可用于且有效地治疗本文公开的癌症，特别是治疗乳癌/乳腺癌。
本发明的此类化合物、构建体、蛋白质或多肽的一些具体但非限制性实例例如在表1-4中阐述，或者基于本公开内容对本领域技术人员而言是显而易见的。
根据本发明的另一个优选实施方案，HLA肿瘤抗原肽(在每种情况下)作为单成员氨基酸序列存在，即不是作为由HLA肿瘤抗原肽/新抗原的至少两个相同或不同的氨基酸序列组成的化合物、构建体、蛋白质或多肽的成员存在，其中所述HLA肿瘤抗原肽/新抗原通过合适的接头彼此连接。
优选地，本发明的HLA肿瘤抗原肽表现出对T细胞受体的特异性活性(T细胞用于此目的)，这可以使用本领域技术人员已知的任何合适的检测方法确定，例如EliSpotAlphaScreen检测方法(如本文所述)或基于细胞的检测方法(如本文所述)。优选地，使用基于细胞的检测方法来确定阻断活性，例如在实施例3和4中描述的。
特别地，包含本发明的HLA抗原肽的氨基酸序列并属于MHC I类(如本文定义)的本发明的化合物、构建体、蛋白质或多肽对相应的T细胞受体的特异性亲和力优选为10至50nM。
本发明的氨基酸序列可以结合两个或多个I类或II类MHC复合物、I类或II类MHC复合物的表位、组分、结构域或亚基也在本发明的范围内。在这种情况下，与本发明的氨基酸序列和/或多肽结合的MHC复合物、MHC复合物的表位、组分、结构域或亚基可以基本相同或不同(在后一种情况下，本发明的氨基酸序列和多肽可以以相同或不同的亲和力和/或特异性结合此类不同复合物、I类或II类MHC复合物的表位、组分、结构域或亚基，包括其组合)。
还预期本发明的多肽通常将分别结合I类或II类MHC复合物的所有天然存在的或合成的类似物、变体、突变体、组分和片段。同样在这种情况下，本发明的氨基酸序列和多肽可以与此类类似物、变体、突变体、等位基因、组分和片段结合，其亲和力和/或特异性分别等于或不同于本发明的氨基酸序列与I类或II类MHC复合物的野生型结合的亲和力和特异性。
本发明的氨基酸序列和多肽分别与I类或II类MHC复合物的一些类似物、变体或突变体结合，但不与其他类似物、变体或突变体结合也在本发明的范围内。
在本发明的一个具体但非限制性的实施方案中，包含本发明的HLA肿瘤抗原肽的化合物、构建体、蛋白质或多肽与它们所源自的氨基酸序列相比可具有增加的血清半衰期。例如，本发明的氨基酸序列可以(化学地或以其他方式)连接到一个或多个延长半衰期的基团或部分(例如PEG)，使得它们是本发明的氨基酸序列半衰期增加的衍生物。
一般而言，本发明的具有增加的半衰期的化合物或多肽的半衰期比本发明的相应氨基酸序列本身的半衰期长至少1.5倍，优选至少2倍，例如至少5倍，例如至少10倍或超过20倍。例如，本发明的具有增加的半衰期的化合物或多肽的半衰期比本发明的相应氨基酸序列本身的半衰期长超过1小时，优选超过2小时，更优选超过6小时，例如超过12小时或甚至超过24、48或72小时。
一般而言，当本发明的HLA肿瘤抗原肽(或包含其的化合物、构建体或多肽)在施用于患者时(例如，用于治疗和/或诊断目的，如本文所定义)，优选地，其不是在患者体内天然存在的氨基酸序列；或者，如果天然存在于患者中，则以基本上分离且同时浓缩的形式存在(如本文所定义)。
此外，对于本领域技术人员来说也显而易见的是，对于药物用途，本发明的HLA肿瘤抗原肽(以及包含它们的化合物、构建体和多肽)将针对如权利要求中所定义的包括其组合的人类T细胞受体；其中，出于兽医目的，本发明的多肽优先针对来自待治疗物种包括其组合的T细胞受体(如权利要求中所定义)，或至少对来自待治疗的物种的包括其组合的T细胞受体具有交叉反应性。
待治疗的乳癌/乳腺癌优选为激素阳性、HER2/neu或三阴性乳腺癌。
HLA抗原肽的确定/鉴定方法
本发明还包括用于治疗或预防乳腺癌的或在根据本发明的药物组合物中的药学活性HLA肿瘤抗原肽的确定方法，所述方法包括监测患有或怀疑患有乳腺癌的患者或患者组的组织切除，所述方法包括以下步骤：
(a)提供来自组织切除的组织样本(优选来自患者或患者组的乳癌/乳腺癌)，其中组织样本的细胞表达I类和/或II类MHC复合物，并且这些复合物在细胞表面上呈递，其中提供组织样本本身的所述方法步骤(a)不包括分别对患者或患者组中的一个患者进行手术干预；
(b)使用步骤(a)中提供的组织切除的组织样本确定以下参数：
i)提供的组织样本的转录组，以确定转录成mRNA序列的所有DNA序列并定量mRNA序列，以及
将测定的转录组与患者或患者组的健康组织样本的转录组进行比较，以确定与健康组织样本中的阈值相差3因子(factor)的上调和/或下调的mRNA序列；
ii)特定的HLA单倍型，优选包括患者或患者组的HLA单倍亚型，最优选关于MHC I类复合物，以及
如果适用，得出MHC I类复合物的优选锚定位置(如本文所定义)；
iii)提供的组织样本的外显子组序列，以用于识别所有可能编码蛋白质的DNA序列，以及
将提供的组织样本的外显子组与健康组织样本的外显子组或与患者或患者组的基因数据库(文库)进行比较，以确定体细胞突变，
从而有利地排除健康组织中的种系突变，从而在将确定的HLA抗原肽应用于患者或患者组时/之后防止自身免疫反应(例如通过采集有核细胞的血液样本，可以从患者或患者组获得健康组织样本)；以及确定与乳癌/乳腺癌的增殖、侵袭、血管生成和角蛋白生成增加相关的HLA肿瘤抗原肽；和
确定与乳癌/乳腺癌的增殖、侵袭、血管生成和角蛋白生成增加相关的HLA肿瘤抗原肽；
iv)用于确定在乳癌/乳腺癌的细胞表面呈递的步骤(iii)中确定的HLA肿瘤抗原肽的配体组，
任选地还确定在患者或患者组的健康组织样本的细胞表面上呈递的HLA抗原肽；
v)通过数据库和/或排名算法确定在步骤(iv)中确定的HLA肿瘤抗原肽对在组织样本(优选为乳癌/乳腺癌)细胞中表达并在这些细胞的表面上呈递的对应I类和/或II类MHC复合物的特异性结合亲和力；
和/或
vi)任选地，通过免疫原性测试，特别是通过蛋白质印迹、ELISA技术，特别是通过带有显微镜分析的ELISPOT、AFM或免疫检测，测定在步骤(iv)中确定的HLA肿瘤抗原肽的免疫原性；
(c)HLA肿瘤抗原肽的选择，优选至少4至8种对应于MHC I类复合物的HLA-A肿瘤抗原肽和至少2种对应于MHC II类复合物的抗原肽，它们满足根据步骤(b)定义的参数的标准并且它们在提供的组织样本的细胞中表达并被呈递到这些细胞的表面上。
根据确定药学活性HLA肿瘤抗原肽的方法的一个优选实施方案，在步骤(a)中提供患者或患者组的组织样本后立即检查BRCA1和BRCA2基因是否存在突变。
特别优选地，通过超高效液相色谱(UHPCL)结合ESI质谱(MC)来确定HLA肿瘤抗原肽是否在步骤a)中提供的患者或患者组的组织样本的细胞表面呈递。
根据优选的实施方案，步骤(b)中确定I类和/或II类HLA肽的方法包括生成步骤(a)中提供的组织样本的转录组。
优选地，转录组通过RT-PCR生成，然后是DNA微阵列或DNA测序。
特别优选地，步骤(b)中用于确定I类和/或II类HLA抗原肽的方法包括为步骤(a)中提供的所述组织样本生成外显子组测序。
还希望步骤(b)中确定药学活性的I类和/或II类HLA肿瘤抗原肽的方法包括将对应于I类和/或II类MHC复合物的HLA抗原肽的确定氨基酸序列与一组氨基酸序列、氨基酸序列的集合或氨基酸序列文库匹配，以对蛋白质数量(即与乳癌/乳腺癌增殖、侵袭、血管生成和/或细胞角蛋白生成增加相关的因素)和对内源性T细胞的T细胞受体的特异性亲和力(肿瘤进展的内容因素，如侵袭性、血管生成，以及肿瘤对免疫攻击的逃避机制)进行排名。
所述方法还包括将HLA肿瘤抗原肽的氨基酸序列的确定的参数与如步骤(i)中所确定的可以结合MHC I类复合物或MHC II类复合物(包括其组合)或者对MHC I类复合物或MHC II类复合物(包括其组合)具有亲和力的氨基酸序列的健康表达数据的氨基酸序列系列、集合或文库进行匹配。
在这样的方法中，氨基酸序列的系列、集合或文库可以是适当的氨基酸序列系列、集合或文库。例如，氨基酸序列的系列、集合或文库可以是I类和II类HLA肿瘤抗原肽和/或MHC复合物的系列、集合或文库(如本文所述)，例如I类和II类HLA肿瘤抗原肽和/或MHC复合物的天然系列、集合或文库；是I类和II类HLA肿瘤抗原肽和/或MHC复合物和/或系列的合成或半合成系列、集合或文库；是经过亲和力成熟的I类和II类HLA肿瘤抗原肽和/或MHC复合物的集合或文库。
为了指定由得到的排名确定的HLA肿瘤抗原肽的药学功效，并为了预防或最小化受试者施用确定的HLA肿瘤抗原肽带来的自身免疫反应的风险，用根据本发明的确定方法(预)确定的HLA肿瘤抗原肽进行免疫原性测试，特别是通过蛋白质印迹、ELISA技术，特别是借助具有显微镜分析的ELISPOT、AFM或免疫检测。有利地，在确定至少一种药学活性HLA肿瘤抗原肽的方法的这方面中，可以省去耗时且昂贵地制备针对该组织样本的转录组和外显子组测序。
本发明还包括用于确定乳癌/乳腺癌疾病的消退、进展或发生的方法，包括监测患有或怀疑患有乳腺癌的患者的组织切除，特别是乳房/乳腺组织，该方法包括以下步骤：
(a)提供来自受试者的组织样本，其中该组织样本的细胞表达HLA I类和/或II类复合物并将它们呈递到它们的细胞表面；
(b)从所提供的组织样本中确定多个参数，该参数选自：
i)在提供的组织样本的细胞中表达并在这些细胞的细胞表面上呈递的至少4至8种对应于MHC I类复合物的HLA-A抗原肽和至少2种对应于MHC II类复合物的抗原肽的浓度(表达水平)；以及
ii)在所提供的组织样本的细胞中表达并在所述细胞的细胞表面上呈递的至少所述4至8种HLA-A抗原肽和至少所述2种II类抗原肽的氨基酸序列；以及
iii)在步骤ii)中确定的HLA-A抗原肽和II类抗原肽对内源性T细胞的T细胞受体的特异性结合亲和力；以及
iv)确定的HLA-A抗原肽和II类抗原肽的任选的免疫原性，通过免疫原性测试(例如通过蛋白质印迹、ELISA技术，特别是通过具有显微镜分析的ELISPOT或免疫检测)确定该免疫原性；
(c)将确定的HLA抗原肽的氨基酸序列分别与能够结合在步骤(i)中确定的MHC I类复合物或MHC II类复合物(包括其组合)或对其具有亲和力的氨基酸序列的氨基酸序列的系列、集合或文库匹配。
根据本发明的用于确定用于根据本发明的药物组合物的至少一种对应于I类和/或II类MHC复合物的HLA肿瘤抗原肽的方法进一步的，特别是降低成本的实施方案提供了，排他性地(即无需事先准备转录组、外显子组测序)确定暴露在来自待治疗个体的恶性和/或赘生性组织的细胞的细胞表面上的I类和/或II类HLA肿瘤抗原肽(所谓的配体组确定)。
这里，所述过程包括以下步骤：
a)提供来自优选患有或怀疑患有局部复发性乳癌/乳腺癌的受试者的组织切除术的组织样本；以及
b)根据上述用于确定药学活性HLA肿瘤抗原肽(如上定义)的方法的步骤(b)，根据基于来自步骤(a)的提供的组织样本的参数的确定，确定/选择暴露在取样组织的细胞的细胞表面上的HLA肿瘤抗原肽；以及
c)确定暴露在收获组织细胞的细胞表面上的HLA肿瘤抗原肽对内源性T细胞的T细胞受体的亲和力；以及
d)根据蛋白质数量(如本文所述)和对内源性T细胞的T细胞受体的特异性亲和力(KD)得出排名；
其中所述序列和/或序列的组合是对应于MHC I类复合物和/或MHC II类复合物的HLA肿瘤抗原肽或其HLA肿瘤抗原肽的组合，并且其中单个序列选自核酸数据库的序列。
详细说明和定义
在本说明书和权利要求中，下列术语定义如下：
在本发明的上下文中，被指定为“包括”的本发明的特征旨在被理解为包括对“由……组成”或“基本上由……组成”的本发明相同特征的更有限的描述。
术语“和/或”用于一起或单独特定公开两个特征或组件。因此，例如在本公开的短语“I和/或II”中使用的术语“和/或”包括“I和II”、“I或II”、“I”和“II”。
药物组合物在本文中被理解为所谓的信息制剂(informatic)，其可以施用于患者或具有至少一个相同HLA等位基因的患者组，并且包含本文公开浓度的根据本发明的HLA肿瘤抗原肽的组合，其中HLA肿瘤抗原肽代表信息载体。这意味着HLA肿瘤抗原肽(“代码”)的氨基酸序列中氨基酸的排列会诱导免疫系统(尤其是T细胞(通过对应于MHC I类复合物的HLA肿瘤抗原肽)和/或B细胞(通过对应于MHC II类复合物的HLA肿瘤抗原肽))的序列特异性激活。因此，肿瘤细胞的MHC I类复合物或MHC II类复合物与本发明药物组合物的HLA肿瘤抗原肽(其具有与HLA肿瘤抗原肽相同或略微修饰的氨基酸序列)的体外或体内负载，或将T细胞与所述HLA肿瘤抗原肽接触，使得由于特异性细胞毒性或特异性活化的T淋巴细胞，肿瘤细胞对组织或组织切除的肿瘤细胞裂解敏感。
然而，本发明的主要目的不是在体外或体内用HLA肿瘤抗原肽加载肿瘤细胞，而是诱导免疫系统，特别是针对肿瘤细胞的T细胞和B细胞的特异性激活和训练。为此，根据本发明的药物组合物优选以皮下或皮内施用，优选基本上同时(即相继)在至少2个、特别优选至少3个远离肿瘤病变和/或癌性淋巴结区域的施用部位施用。这具有特别的优势，即识别应用的HLA肿瘤抗原肽的免疫系统或T细胞处理以肿瘤抗原肽形式应用的信息，从而特异性识别和裂解在肿瘤细胞表面呈递这些HLA肿瘤抗原肽的肿瘤细胞。
因此，根据本发明的方法具有以下优点：在肿瘤向免疫系统发射的信号太弱(被动)或肿瘤主动分泌促进其生长的物质(刺激巨噬细胞)(活性的，例如TREX或BD1上升)的情况下，即使肿瘤发出的信号太弱，免疫系统，特别是T细胞也可以被训练到肿瘤的存在。当响应于已发生的细胞毒性T细胞攻击，HLA抗原肽在肿瘤细胞的细胞表面上呈递低或降低时，肿瘤发出的信号太弱(逃避机制)。
出于本发明的目的，如果HLA抗原肽是肿瘤专有的HLA抗原肽(即，仅由肿瘤细胞表达和/或暴露；癌症睾丸抗原(CTA)不再发生在成年患者/患者组的健康/正常组织中，或所谓的新抗原肽)或肿瘤相关的HLA抗原肽，则HLA抗原肽是HLA肿瘤抗原肽。
“肿瘤专有的HLA抗原肽”是突变的HLA抗原肽，例如由基因突变产生，其中基因突变是肿瘤生长的诱因和/或与肿瘤发生有关。肿瘤中的突变基因产物对个体患者或具有至少一个相同HLA等位基因的某一组患者具有特异性。
“肿瘤相关HLA抗原肽”包括仅在患者或具有至少一个相同HLA等位基因的特定患者组的一些组织中以及在肿瘤细胞中在成年期表达的非突变HLA抗原肽。肿瘤相关HLA抗原肽的免疫原性通常较低，因为它们存在于健康细胞中可产生免疫耐受(免疫耐受性)。然而，诱导针对仅与肿瘤相关的HLA抗原肽的强免疫反应存在自身免疫反应的风险。
免疫原性HLA肿瘤抗原肽在本文中也称为“表位”。
根据本发明的一个优选实施方案，对应于肿瘤相关HLA抗原肽的MHC复合物与乳癌/乳腺癌的增殖、侵袭、血管生成和细胞角蛋白产生的增加有关。技术人员熟悉列出这些影响的相关数据库和文献(例如，国家生物技术信息中心(NCBI)数据库)。
本发明范围内的至少一种HLA肿瘤抗原肽特别地被配制为用于皮下给药。因此，表述/术语“组合物”是指在药物制剂中提供至少一种HLA肿瘤抗原肽和佐剂，该药物制剂具有良好的适用性，包括溶液，特别是注射液和输注液，用于制备注射剂和输液制剂的浓缩物，用于制备注射剂和输液制剂以及皮下植入物的粉剂。
药物组合物通过如下方法制备：将确定的HLA肿瘤抗原肽溶解或悬浮在载液(即药理学上可接受的载体)中，任选加入其他赋形剂，例如润湿剂、染料、渗透促进剂、再吸收促进剂、防腐剂、抗氧化剂、光稳定剂。
载液优选选自用于局部注射的氯化钠注射液、林格注射液、等渗葡萄糖、无菌水、葡萄糖溶液、乳酸林格注射液、蒸馏水或其混合物。
如果确定的HLA肿瘤抗原肽的氨基酸序列具有尽可能少数目的疏水性氨基酸，则其良好的溶解性特别有利。
优选地，二甲亚砜(DMSO)、乙氧基乙二醇、乙醇、磷脂酰胆碱、丙二醇二壬酸酯(DPPG)或糖酵解乙氧基化甘油酯是合适的渗透促进剂。
根据本发明的优选实施方案，药物组合物包含水、药学上可接受的盐水溶液和/或DMSO。例如，适合应用的药物组合物包括约30％DMSO和70％水的混合物。
如本文所用，术语“I类HLA肿瘤抗原肽(对应于MHC复合物)”是指与I类MHC复合物(人类中的HLA复合物)结合或对I类MHC复合物具有免疫原性的肽序列。I类HLA蛋白复合物用于在细胞表面呈递抗原，包含具有3个结构域(α1、α2和α3)的重链和β2-微球蛋白(β2M)。
术语“II类HLA肿瘤抗原肽(对应于MHC复合物)”是指与II类MHC复合物(在人类中，HLA复合物)结合或具有免疫原性的多肽序列。II类HLA蛋白复合物用于在细胞表面呈递抗原，由两条大小几乎相等的链组成，一条α链和一条非共价结合的β链，每条链都有两个细胞外结构域(α1和α2和β1和β2)。
因此，本发明的多肽和药物组合物(如本文所定义)可用于预防和治疗乳腺癌(本文也称为“本发明的癌症”)。一般而言，“本发明的癌症”可以定义为，可以通过将本发明的肿瘤抗原肽或药物组合物(并且更具体地，其药学有效量)适当地施用于受试者(即，患有该疾病或病症或其至少一种症状的人，和/或有感染或发展此类疾病或病症的风险的人)来适当地预防和/或治疗的疾病和病症。
出于本发明的目的，具有“天然序列”的“肽序列”(例如，HLA抗原肽)包括患者中具有与天然存在的肽序列相同(即，未修饰的)的氨基酸序列的肽序列。这种具有“天然序列”的肽序列可以从自然界分离或重组或合成产生。特别地，术语具有“天然序列”的肽序列包括肽序列的天然存在的截短或分泌形式(例如，胞外结构域序列)、肽序列的天然存在的变体(例如，选择性剪接形式)和天然存在的等位基因变体。
如本文进一步描述的，本发明中使用的氨基酸序列是单个可变HLA抗原肽结构域(“HLA”或“HLA复合物”)。单个可变HLA抗原肽结构域是(如本文进一步定义的)蛋白质氨基酸序列内的可以根据定义的特性与周围序列区分开的区域。
作为HLA的本发明蛋白质的氨基酸序列内的氨基酸序列或区域在本文中也称为“本发明的HLA”。适用于本发明的单个可变HLA抗原肽结构域的一些优选实例从本文的进一步描述中变得显而易见，并且特别包括对应于MHC I类复合物的HLA-A、HLA-B和HLA-C抗原肽和对应于MHC II类复合物的HLA-DR、DQ和DP抗原肽。
优选地，根据本发明，与天然HLA抗原肽具有小于100％的序列同一性或相似性的此类新抗原肽(即，仅由肿瘤细胞表达和/或暴露的HLA抗原肽)的特征在于氨基酸序列中的氨基酸取代。
以下术语用于描述两个或更多个氨基酸序列或多肽序列之间的序列关系：“参考序列”、“氨基酸交换”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“基本同一性”。
在本发明的上下文中，术语“氨基酸取代”是指相对于待合成的HLA抗原肽的野生型(即，天然HLA抗原肽)，在该待合成的HLA抗原肽的氨基酸序列中一个氨基酸被另一个氨基酸取代。“序列同一性”、“序列同一性百分比”或关于此类氨基酸序列的同一性或相似性在本文中定义为，多肽的氨基酸序列中与野生型的氨基酸序列相比相同(即相同残基)或相似(即，基于共同侧链特征来自同一组的氨基酸残基，见下文)的氨基酸残基的百分比。
根据本发明的一个优选实施方案，对应于I类和/或II类MHC复合物的HLA抗原肽的氨基酸交换包含在相对于所述HLA肽的野生型在氨基酸序列内的任何位置处的D/Y、C/Y、A/V、T/M、E/A或D/A交换的至少一个。
本文使用的氨基酸是根据IUPAC命名委员会普遍接受的单字母代码的缩写形式。当两个氨基酸被连字符(/)分隔时，这表明在相关氨基酸序列中的特定氨基酸位置处，野生型氨基酸(连字符的左侧)已被另一个氨基酸(连字符的右侧)替换。
为了确定/得到在HLA肿瘤抗原肽的氨基酸序列中优选的锚定位置和优选的特定氨基酸交换，计算机建模方法是特别合适的，例如基于Andreatta和Nielsen的出版物(Bioinformatics(2016)Feb 15；32(4):511-7)以及Nielsen等人的出版物(Protein Sci.,(2003)12:1007-17)，通过算法NetMHC 4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)。
出于比较两个或更多个氨基酸序列的目的，第一氨基酸序列和第二氨基酸序列之间的“序列同一性”的百分比可以通过以下方式计算或确定：用与第二氨基酸序列中相应位置的氨基酸相同的第一氨基酸序列中氨基酸的数目除以[第一氨基酸序列中的氨基酸总数]并乘以[100％]，其中与第一个氨基酸序列相比在第二个氨基酸序列中的每个氨基酸的缺失、插入、取代或添加被视为与单个氨基酸(位置)的差异。
如果肿瘤细胞在其细胞表面暴露识别并结合HLA肿瘤抗原肽的至少一种对应的MHC I类复合物和/或至少一种对应的MHC II类复合物，则HLA肿瘤抗原肽是“免疫原性的”，即HLA肿瘤抗原肽对该MHC I类复合物和/或MHC II类复合物表现出高特异性活性。HLA肿瘤抗原肽的免疫原性可以通过蛋白质印迹、ELISA技术，特别是通过具有显微镜分析的ELISPOT或免疫检测来确定。
本发明的HLA肿瘤抗原肽优先具有免疫原性，因此也被称为免疫原性HLA肿瘤抗原肽(“表位”)。HLA肿瘤抗原肽的免疫原性可以通过合适的检测方法来确定。这样的方法是技术人员已知的和/或如本文中所描述。
术语HLA抗原肽对T细胞受体(TCR)的“特异性亲和力”或“特异性结合亲和力”是指HLA肽与内源性T细胞的TCR的特异性和可逆结合。根据本发明的这种“特异性亲和力”通过配体结合试验确定的解离常数(KD)表示，单位摩尔。
或者，HLA抗原肽的“特异性亲和力”也可以通过计算机方法确定。
根据本发明的一个优选实施方案，至少一种HLA-A肿瘤抗原肽是肿瘤专有的HLA-A肿瘤抗原肽(即不再存在于患者/患者组的健康/正常组织中的癌症睾丸抗原(CTA)或所谓的新抗原肽)，并且其中肿瘤专有的HLA-A肿瘤抗原肽的特异性结合亲和力是针对对应的MHC I类复合物以KD确定的，如表面等离子共振确定的，KD范围为10到50nM。
基于传统的计算机结合预测模型(建模)，KD<50nM的肿瘤抗原肽通常被认为是强结合，而那些KD在50和500nM之间的肿瘤抗原肽被认为是弱结合的肿瘤抗原肽。然而，在根据本发明的体内测定中，现已表明KD值不一定重要。令人惊讶的是，发现具有在50至500nM范围内的KD值的肿瘤抗原肽触发效应细胞(即细胞毒性T细胞)，这与认为它们具有低结合的常规计算机模拟结合预测模型相反。因此，对于肿瘤抗原肽的功效，肿瘤抗原肽具有免疫原性是必不可少的。
术语“活性物质增强剂/佐剂”是指在第一时间触发和/或增强HLA肽作用的佐剂。原则上，技术人员已知的所有常用佐剂都适用于生产根据本发明的制剂。
然而，Montanide ISA 51VG的使用已被证明是特别合适的。在将(药物)制剂施用于受试人后，这形成了所谓的肉芽肿，其有利地在施用部位以储库的形式储存HLA肽，并在更长时间内将它们释放到受试人的机体中。因此，特别有利地，根据本发明的(药物)制剂不需要每周施用。优选地，本发明意义上的用于治疗癌症疾病的(药物)制剂在较长时间时使用，因此仅需每2周施用一次，特别优选仅每月施用一次。
术语“个体”(在本文中也称为“受试者”或“患者”)与术语“受试者”可互换使用，意指因异常生理状况而正在接受治疗或已被诊断患有疾病的任何哺乳动物。
本发明中使用的术语“个体”和“受试者”包括哺乳动物，例如啮齿动物、食肉动物、偶蹄动物、奇趾有蹄类动物或灵长类动物。在特别优选的实施方案中，受试者是人。
当本文提及“患者组”时，总是提及个体组，优选人，他们都具有至少一个、优选至少两个、最优选至少三个相同的HLA等位基因。
允许用药物组合物治疗的患者已经接受标准治疗程序(例如，至少一种手术、放射、化学疗法和/或激素疗法)。
然而，药物组合物也可以作为一线疗法给予患者或具有至少一个相同HLA等位基因的特定鉴定的患者组。
根据本发明的一个优选实施方案，个体尚未接受用于局部复发或转移乳腺癌的化疗和/或自上次给药后12个月或更短时间复发中未曾接受先前辅助化疗。
特别优选地，个体具有亚群A*01或A*02的单倍型。
“单倍型”(“单倍体基因型”的缩写)是受试者所有特定等位基因(＝特定指纹)的组成总和，表示生命体基因组中一条相同染色体上核苷酸序列的变体。特定的单倍型可以是个体、群体，甚至物种特异性的。
出于本发明的目的，转录组包含在给定时间在细胞中转录(即从DNA序列转录为mRNA序列)的所有基因的总和，即在细胞中所产生的单个mRNA分子的所有的和量化总和。然而，转录组的创建还不允许任何关于转录的mRNA序列“正确性”的声明。
在此上下文中，本公开中使用的术语“构建转录组”是指优选通过定量实时(RT)-PCR随后是DNA微阵列或随后的DNA测序，分析转录组为在给定时间点在细胞中转录的所有基因的总和。通常，构建在本发明的测定程序的步骤(a)中提供的组织样本的转录组包括获取超过40,000个编码DNA序列(原始数据)。
在遗传学中，外显子组是生物体外显子的总和，即所有可能编码蛋白质的部分。在人类中，外显子组包含大约23,000个基因，大约有5000万个核碱基。全外显子测序(WES)检查所有外显子，即组织切片(即测试人的健康组织或肿瘤组织)基因组中编码蛋白质的部分。基因诊断集中在人类基因组的1-2％，其中发现了85％的已知致病突变。
因此，外显子组分析涉及对患者(和其他亲属，如果适用)的外显子组进行测序、评估序列数据以及在医学报告中总结结果。这种诊断程序是寻找疾病原因的首选方法，特别是对于症状复杂或非特异性以及通常多年来无法解释诊断的患者。
与全外显子组测序(WES)相比，其中大约23,000个已知基因的所有蛋白质编码区都被富集和测序，临床外显子组测序(CES)富集了外显子组的一个子集。在WES中，重点是确定人类基因突变数据库(HGMD)中描述的疾病相关基因。
出于本发明的目的，蛋白质组是指在精确限定的条件下和特定时间，恶性或赘生性组织/组织切片或其细胞区室中至少一个细胞的所有蛋白质的总和。细胞的蛋白质组可以通过蛋白质组测序确定，并通过转录组与该细胞的基因组相关联。
免疫疗法基于破译每个癌症患者肿瘤的个体突变模式(特征)。基于突变模式的概况，根据常规治疗方法(即疫苗生产或根据本发明的信息制剂的生产)为每个个体患者生产合成疫苗，例如基于RNA的疫苗。这些随后用于患者的个体化治疗。
基本上，这些新型疫苗不适用于具有相同肿瘤的其他患者，而只能用于其突变瘤先前已被分析用于疫苗生产或本发明的信息制剂生产的相应患者。因此，认识到不同患者在其恶性或赘生性组织/组织切除的突变瘤中存在重叠是本发明人的杰出成就。有利地，可以将不同的患者分成统一的患者组，使得根据本发明的制剂的至少50％的HLA肽与患者组的突变瘤相容。
出于本发明的目的，通过MHC分子在细胞表面呈递的所有HLA抗原肽的总和被称为(HLA)配体组。据信，在细胞表面表达了超过105种HLA分子，并且所呈递的相同HLA肽的数量可以从每个细胞的几个拷贝到高达10,000个拷贝不等。因此，大约10,000种不同的HLA肽以不同的比例在细胞上呈递。
配体组受各种生理、内在和病理(例如癌症或坏死)因素的影响，例如细胞类型或组织类型、细胞的感染或转化，或者仅仅是细胞的当前状态，这取决于营养状况或外部压力因素，导致呈递的HLA肽发生变化。
例如，在开始分析HLA配体组时，Edman降解可用于初步了解所呈递的肽。在一方面，可以通过这种方式通过池测序确定等位基因的一般肽基序，另一方面，已经可以通过分析单个反相高效液相色谱(RP-HPLC)组分确定单个肽序列。
作为替代或补充，在蛋白质组学中，配体组的分析可以通过使用的现代质谱仪进行，通过它可以明确确定许多单个配体的序列。为此目的所需的肽或蛋白质的电离有两种方法：电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解吸/电离(MALDI)。在ESI中，与RP-HPLC系统耦合很常见。然而，随着质谱仪灵敏度的提高，毛细管电泳(CE)也被用作分析分离方法。
为了在配体组分析中实现更高的样品通量和更高的灵敏度，可以使用所谓的UHPLC系统(超高效液相色谱)。这些HPLC系统仅使用2μm直径的材料作为分离柱的填料，从而提高了速度、效率和色谱分离。
在ESI质谱分析中，HPLC和ESI接口的直接耦合允许在线分离样品，结合自动进样器，实现全自动测量程序。由于来自HPLC的连续溶剂流，可以在相对较短的时间内测量样品。ESI质谱使用范围广泛的仪器进行分析，例如四极杆飞行时间质谱仪、线性四极杆离子阱、三重四极杆或离子阱-轨道阱混合系统。这有利地允许在一次测量中鉴定数百个HLA肽。
在本发明的上下文中，术语“得出排名”是指确定/选择暴露在收获的组织(或其组织切片)的细胞的细胞表面上的HLA肽的数量和亲和力。
使用之前的分析，得出HLA抗原肽在蛋白质质量和对内源性T细胞的T细胞受体的特异性亲和力(KD)方面的累积排名。因此，关于蛋白质质量，评估特别是与肿瘤进展的内容相关的因素，如侵袭性、血管生成，以及肿瘤对抗免疫攻击的逃避机制。
算法使用累积排名系统。
累积(预测)排名用于消除序列。
在另一个实施方案中，最高排名的序列可能性可以通过从序列数据(特别是仅限于从中获得HLA抗原肽的生物体/测试人)预测它们在对内源性T细胞受体(如本文定义的)具有高特异性亲和力的可能的HLA抗原肽的数据库中的存在来进一步确认。在另一个实施方案中，最高排名的序列可能性可以通过HLA抗原肽和/或其单体组成的分离坐标(例如，蛋白质的等电点和分子量)进一步确认。
为了提供(肿瘤)抗原肽，来自累积排名的合成或分离的HLA肿瘤抗原肽原则上可用于制备本发明的(药物)制剂和用于制备药物组合物(如所谓的信息制剂)。
然而，使用合成HLA肽是个好选择。合成肽的生产方法是技术人员已知的。这种生产方法的例子是Merrifield固相肽合成法、Bailey肽合成法和N-羧酸酐法。
本发明的另一个目的也是不同剂型的(药物)制剂，其包含根据本发明的活性成分和任选的其他活性成分和/或赋形剂的组合。
优选的药物制剂是片剂、咀嚼片、口香糖、包衣片、胶囊、滴剂、果汁、糖浆、栓剂、透粘膜治疗系统、透皮治疗系统、溶液、注射剂、乳剂、混悬剂、易于复溶的干制剂、粉剂或喷雾剂。特别优选的药物制剂是注射剂或溶液。
或者，药物制剂存在于合适的施用装置中，优选作为注射器中的冻干物，其允许用药学上可接受的溶液(例如盐水)原位重构。
优选地，根据本发明的(药物)制剂适用于口服、静脉内、肌肉内、皮下、鞘内、硬膜外、口腔、舌下、肺、直肠、透皮、鼻腔或脑室内给药，用于皮下或静脉内给药的(药物)制剂是特别优选的。
现有技术中已知的用于制备药物组合物或剂型的方法可见于例如“Remington'sPharmaceutical Sciences”。肠胃外给药的药物组合物可包含例如赋形剂、无菌水或盐水、聚亚烷基二醇(如聚乙二醇)、植物来源的油或氢化萘。生物相容的、可生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可用于控制化合物的释放。用于治疗性抗朊病毒化合物的其他潜在有用的肠胃外递送系统包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入输注系统和脂质体。
肿瘤进展的内容因素
确定排名的另一个重要因素是鉴定在肿瘤进展中起重要作用的因素(即肿瘤大小增加和/或转移)。肿瘤进展的特征是增加的生长速率，以及肿瘤增加的侵袭性。
侵袭性是指恶性肿瘤从其起源部位进入邻近组织结构的组织穿透性生长的程度。
血管生成描述了从已经存在的血管系统中出现的新血管，并且是生理过程(例如胚胎发生、伤口愈合)和病理过程(例如糖尿病视网膜病变、慢性多发性关节炎、肿瘤生长)的组成部分。长期以来，人们就知道癌症中会发生新的血管形成(血管生成)，称为肿瘤血管生成。肿瘤由细胞组成，这些细胞与体内所有其他细胞一样，需要营养和氧气。事实上，由于癌细胞分裂频繁，它们的需求特别高。这就是为什么肿瘤需要自己的血管。
当肿瘤发展时，它最初还没有自己的血管。因此，它的增长受到严重限制。没有自己的血管，肿瘤不会长到超过1到2mm。转移的形成也与肿瘤血管生成相互作用，因为肿瘤细胞必须到达周围的血管才能转移。只有这样它们才能被运送到身体的遥远区域并在那里形成转移。
例如，已知I类HLA和整合素β之间存在相互依赖性以刺激信号转导和细胞增殖。在这方面，整合素β介导的细胞迁移取决于其与I类HLA分子的相互作用(Zhang and Reed,HumImmunol.2012Dec,73(12),1239-1244)。
本发明的HLA肽或包含其的组合物或制剂在体外(例如，在体外或细胞检测方法中)或体内(例如在单细胞生物体或多细胞生物体中，特别是在哺乳动物中，更特别是在人类中，例如处于发展或患有本发明癌症风险的人类)，可用于调节I类或II类HLA复合物，包括其组合。
在本发明的上下文中，“调节”基本上是指，如通过适当的体外、细胞或体内检测方法(例如本文提及的那些)所测量，增加T细胞分别对恶性肿瘤和/或赘生性组织的肿瘤专有的或肿瘤相关的MHC I类复合物或MHC II类复合物的特异性亲和性。特别地，“调节”是指以相同的检测方法，在相同条件下，与不存在或不先前应用本发明药物组合物(如本文所定义)的HLA肿瘤抗原肽的情况下，与T细胞对恶性和/或赘生性组织的肿瘤专有或肿瘤相关MHC I类复合物或MHC II类复合物的亲和力相比，患者或患者组的内源性T细胞对恶性和/或赘生性组织的肿瘤专有或肿瘤相关MHC I类复合物或MHC II类复合物的特异性亲和力增加至少1％，优选至少5％，例如10％或至少25％，例如增加至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或90％以上。
在一个具体实施方案中，本发明包括上述方法，其中确定了如SEQ ID NO：1至SEQID NO：48所示的至少5个、优选至少6个、最优选至少6个标记基因的表达谱。如上所述，标记基因也由变体定义，再次显示在表2至4中。优选地，将该表达谱与“参考”的表达谱进行比较。例如，参考可以是健康组织(例如，肠组织或肝、肺等组织)的表达谱。在该背景下，受影响个体(先证者)的组织可以用作“健康组织”，据此已知该组织不会发生增殖性改变或甚至不会发生转移。在本发明的实验部分中示出了适当的例子。然而，来自外部个体(最好是健康个体)组织的数据也可以用作“参考”或“参考值”。
如本文所述，根据本发明，在用于检测癌的方法中，至少6种，但优选至少8种，最优选至少10种本文所示的对应于MHC I类复合物或MHC I类复合物的HLA抗原肽(选自如SEQID No：1至48中所示的多肽/多肽片段组)将被确定。对于进一步的实施方案，请参考实验部分。
本发明还包括制备根据本发明的药物组合物或(药物)制剂的方法，其中该方法包括以下步骤：
(a)如上所述，通过根据本发明的确定方法确定至少4至8种对应于MHC I类复合物的HLA-A肿瘤抗原肽和至少2种对应于MHC II类复合物的肿瘤抗原肽，其暴露在待治疗的患者或具有相同单倍型的患者组的乳癌/乳腺癌的细胞的细胞表面上；
(b)合成步骤(a)中确定的4至8种对应于MHC I类复合物的HLA-A肿瘤抗原肽和至少2种对应于MHC II类复合物的肿瘤抗原肽，其中每种HLA肿瘤抗原肽的定义如上所定义；以及
(c)制备根据本发明的药物组合物，其包含步骤(b)中合成的至少4至8种对应于MHC I类复合物的HLA-A肿瘤抗原肽，至少2种对应于MHC II类复合物的肿瘤抗原肽，以及本文定义的佐剂。
本发明还包括根据本发明的药物组合物或(药物)制剂在制备用于治疗恶性肿瘤、白血病和肿瘤，特别是乳腺癌的药物或组合制剂中的用途。
本发明还包括药物组合物，其包含如本发明中定义的HLA肽和药学上可接受的赋形剂。
本发明还涉及本发明的HLA抗原肽或新抗原肽，无论是在体外(例如在体外或细胞检测方法中)或体内(例如在单细胞或多细胞生物中，特别是在哺乳动物中，更特别是在人类中，例如，有发展或患有本发明癌症风险的人类)，用于制备用于治疗癌症的制剂(例如但不限于，如本文进一步描述的药物制剂)。
本发明还包括用于治疗乳癌/乳腺癌的组合制剂，其同时、分开或依次给药，
所述组合制剂包括以下两种单独的制剂(a)和(b)：
(a)第一制剂，与药学上可接受的载体或稀释剂一起，其包含，如本文所述以及任选地由本发明的方法确定的4至8种对应于MHC I类复合物的HLA-A肿瘤抗原肽和至少2种对应于MHC II类复合物的肿瘤抗原肽，以及
(b)第二制剂，与药学上可接受的载体或稀释剂一起，其包含，选自抗癌烷化剂、抗癌抗代谢物、抗癌抗生素、草药抗癌药、铂配位抗癌络合物、抗癌喜树碱衍生物、抗癌酪氨酸激酶抑制剂、单克隆抗体、干扰素、白介素、生物反应调节剂和其他抗癌剂的抗癌剂，或它们药学上可接受的盐。
根据本发明的组合制剂特别适用于治疗或预防患有或疑似患有乳腺癌的患者或患者组的乳腺癌，特别是局部复发或转移性乳腺癌。
特别优选地，根据本发明的组合制剂的第一制剂由此皮下给药。
根据本发明的药物组合物(第一制剂)的给药联合作为第二制剂的草药抗癌药物(特别是青蒿琥酯和/或姜黄素)的给药已经取得了特别好的经验。
然而，优选的是根据本发明的药物组合物(第一制剂)联合单克隆抗体的组合给药，所述单克隆抗体特别是针对选自CTLA4(本文例如
)、PDL1(本文例如Nivolumab-Opdivo)、PD1-L，还有EpCam、IDO、MIC、Fas和TRAIL的免疫抑制蛋白质；具体来说：来自芳香酶抑制剂组的用于激素阳性患者的雌激素抑制剂-(在此例如来曲唑和/或雌激素阻滞剂氟维司群)；针对HER2阳性患者的抗体：赫赛汀(TDM-1)，作为第二制剂。
还公开了一种商业方法，包括销售4至7种HLA-A抗原肽和至少2种对应于MHC II类复合物的抗原肽，用于治疗人的乳腺癌，以有效降低患者或具有至少一个相同HLA等位基因的患者组的CA 15-3评分，特别是增加无进展生存期或降低癌症复发的可能性或增加患者存活率。在一些实施方案中，销售之后是用HLA抗原肽的组合治疗患者。
附图说明
这里显示：
图1：T细胞受体与I类MHC分子的HLA-A介导的结合示意图，显示了HLA-A抗原肽(长度为7-11个氨基酸)的锚定(氨基酸)残基。
图2：T细胞受体与MHC分子的HLA-B介导的结合示意图，显示了HLA-B抗原肽(长度为12-17个氨基酸)的锚定(氨基酸)残基。
图3：在根据实施例3的肿瘤抗原肽(其代表原发性肿瘤MC-HER2/Neu的表位)的本发明组合物的特异性免疫信息后(INC 14/1713；星号)，特异性肿瘤标志物CA 15-3的发展。所描述的过程为期26周。
图4：在应用根据实施例3的肿瘤抗原肽(其代表分散的MC-HER2/Neu肝转移的特定转移表位)的组合物的特异性免疫信息后(INC 14/1713；垂直线)，特异性肿瘤标志物CA15-3与肝脏标志物γGT组合的发展。所示过程为期34周。
图5：实施例4应用的药物组合物的临床疗效。
具体实施方式
借助以下附图和实施例，将更详细地解释本发明，而不将本发明限制于此。
下表列出了HLA肿瘤抗原肽，所有这些肽都经过测试并具有免疫原性。SEQ ID No：13至48列出了本发明的肿瘤抗原肽的氨基酸序列的一些优选的但非限制性的实例，其中的每一个都是本发明的另一个实施方案。
表1【比较例】：
表2
表3
表4
实施例1：转录组分析[mRNA表达]
使用安捷伦科技公司的PANTHER芯片分析(44K芯片)对所有患者进行转录组分析(测序)。使用的44K芯片包含44,000个基因探针，因此在每种情况下，每个患者都可以使用该芯片分析超过34,000个基因表达标记的活性。在每种情况下，确定了1000个相关性增加10倍的基因。
评估基于专家已知的已发表基因特征。
实施例2：EXOM测序
外显子组测序是由提取肿瘤DNA的患者的标准冷冻标本中进行。外显子组的下一代测序是从肿瘤样本中进行的，覆盖率超过95％的整个人类编码外显子区域。为此，除其他外，超过290,000个DNA相关部分通过半导体测序技术进行选择性扩增和测序。
分析的目的是确定可能的突变以便设计单个肿瘤抗原肽免疫。为了排除生殖系的非肿瘤相关变异(SNP，单核苷酸多态性)，同时从患者的有核血细胞中分离DNA，并使用相同的方法进行比较测序。潜在新抗原候选者的分化通过以下六个步骤进行：
1)通过排除非肿瘤特异性多态性，减少了肿瘤/体细胞突变的选择。
2)体细胞突变的预定义选择进一步限制为质量参数、读取覆盖率和对蛋白质序列的影响。比单个氨基酸取代SNP更复杂的突变，以及非蛋白质编码区的突变被排除在外。静默突变也被排除在外。
3)使用已知的蛋白质序列(RefGene数据库)将以这种方式定义的突变扩展到侧翼的20s寡肽。从这些中，依次形成12x9个寡肽，并确定了对预知的、患者特异性高变HLA-I互补位的亲和力(程序NetMHC-4.0)。选择了对互补位具有高亲和力的九肽，与野生型序列相比，由于突变(SNP)，其亲和力进一步增加。
4)排除在同一位置的外显子池中携带这种突变作为种系突变的候选者(NIH-NHLBI 6500外显子组数据库第2版程序ANNOVAR-Tool2。)
5)基于表达分析的结果(参见实施例1的发现)，可以排除在肿瘤中具有低表达相关性的肽。
6)最后，我们将详细检查单碱基交换附近是否可能存在进一步的多态性，从而进一步代表来自hg19定义的基因组序列的患者特异性偏差。
以下是对一名患者的所述突变分析和过滤步骤的结果进行评估的示例：
1)肿瘤DNA与正常DNA的比较
a.“Exome_single_sample_Somatic”使用该IonReporter产生：
-正常DNA中的37494个变体，以及
-肿瘤DNA中的37299个变体。
b.使用Ion AmpliSeq Exome Panel(Ion Reporter软件4.6。工作流程版本：1.0)中的统计分析，配对分析“AmpliSeq Exome tumor-normal pair”检测和注释罕见的体细胞变体(SNP、InDels、CNV)。这导致：肿瘤中有1477个突变，同时伴有正常DNA中的野生型分类。
这1477个变体是进一步限制的起点。
2)将变体限制为具有氨基酸取代的蛋白质编码SNP(单核苷酸多态性)。
-对SNP的限制
-至少50x的肿瘤测序和min.20x血液测序
-在任何一次运行中都不得出现在血液中
-必须位于外显子中
-必须导致氨基酸交换(错义突变)
3)从这些变体中，定义20s肽并将其馈送到HLA互补位亲和分析NetMHC。
对约25*12个九肽对(每个突变型和野生型)进行亲和力分析，以对9个HLA基因座每个进行分析。在这些当中，分析了5814个亲和性(2907对)。在40对中，检测到突变肽的亲和力比野生型肽高至少2倍。
HLA亲和力增加的变体总结
4)排除在外显子池(NIH-NHLBI 6500 exome database version-2)中相同位置携带这种突变作为种系突变的候选者(Programm ANNOVAR-Tool3。)
使用的数据库过滤器：hg19_esp6500siv2_all
5)从与转录组对齐的剩余25个具有显著mRNA表达(与正常组织相比>3倍)的变体中进行选择
实施例3：患有mMC(转移性乳腺癌)的患者，type_HER2-neu
1)患者的临床病史
患者，女性
初步临床发现：浸润性导管双灶性乳腺癌(乳腺CA)，右侧，肿瘤最大2cm至5cm(pT2)，pN1sn pN1(3/5)G2，NO，ER-，PR-，HER-2neu:3+,Ki-67:55％。
治疗程序：
■2周后：新辅助化疗(TCH w3)6个周期，曲妥珠单抗；
■6个月后：照射右乳房+淋巴引流区(LAG)。
肿瘤因肿瘤放疗或化疗完全破坏(CR＝完全缓解)，结果：患者治愈出院。
复发：在初步诊断后24个月出现局部复发并伴有额外的肝转移(4个病灶)；结果：ER-、PR+(60％)、HER-2neu：3+、Ki-67：80％。
这种复发性乳房/乳腺CA伴随肝转移，并且具有显著更大的侵袭性(Ki-67：80％vs.55％(最初发现))。
临床医生的预后：患者出院，预期OS(总生存期)预后/平均为6个月。
众所周知，在乳腺CA中，第二原发性恶性肿瘤(SPM)再次发作与较差的预后和较差的OS相关(参见"Breast cancer survivors face excess risk for second primarycancer in SEER analysis,"Wei JL&al,Int J Clin Oncol,Mar 19,2019)，可能由先前的化疗引发，
治疗程序：
■诊断后2个月：由于发生局部复发，手术切除了右乳的乳腺和邻近组织(乳房切除术)。
■诊断后4个月：出现骨转移(骨转移(脊柱))和支气管癌(疑似LK肺门)；
■诊断后9个月：手术切除左乳的乳腺和邻近组织。
尽管曲妥珠单抗或T-DM1持续治疗，肿瘤进展
2)个体化免疫信息疗法：分析
在第1点下的治疗/处理程序进行而没有成功后，将通过应用以合成肽的形式的肿瘤相关和肿瘤特异性HLA抗原肽来使用患者自身免疫系统的信息的免疫治疗方法用作治疗性试验的一部分。
重点是细胞免疫防御，即内源性细胞毒性CD8+T细胞的激活，作为初始T细胞，内源性细胞毒性CD8+T细胞通过高度分化的受体系统能够识别几乎所有可能的致病和恶性氨基酸序列(所谓的“靶标”)，从而发育成效应细胞。这些效应T细胞可以通过分泌颗粒酶和穿孔素来破坏通过HLA呈递抗原识别的肿瘤细胞。
为此，通过“下一代测序”(NGS)和“液相色谱耦合串联质谱”(LC-MS/MS)使用以下三个步骤从患者的活检肿瘤组织中收集数据
■所有编码基因区域的mRNA表达(转录组-步骤(a))，
■肿瘤特异性体细胞错义突变以及通过(外显子组测序-步骤(b))
■肿瘤细胞呈递的HLA I+II类HLA限制性配体(HLA配体组-步骤(c))
步骤(a)：将mRNA表达数据(约40,000)与健康组织的表达水平进行比较，并针对以下过滤
■表达值的显著(>3倍)偏差，以及进一步
■关于与肿瘤发展有关的基因的重要性
■根据这些基因在其他组织类型中可能不表达或仅轻微表达的标准
■此外，关于通常不在成人健康乳腺组织中表达的癌症-睾丸抗原组，记录了在肿瘤中的显著表达，因为这些可能具有肿瘤特异性抗原的性质
这导致了可能的HLA肿瘤抗原肽(数目86)的单独数据集，根据它们的表达异常/偏离正常以及它们对肿瘤增殖->因子3vs.正常的已知重要性进行加权；对肿瘤发展的重要性：生长因子、血管生成因子、转移因子。
步骤(b)：将体细胞错义突变(具有一个氨基酸交换的单核苷酸变体(SNV)以及移码突变)(数目：57)组合到另一个数据集中，因为它们特征上可能是重要的(新)抗原，因此具有高度的肿瘤特异性。
步骤(c)：对于以下，使用来自专门数据库的信息筛选HLA限制性配体(9-10AS的氨基酸序列(对应于MHC I类复合物)(数目：1100)和12-15AS的序列(对应于MHC II类复合物)(数目:730)
■已经出现在健康组织中的(＝阴性)
■与来自转录组和外显子组的希望的序列的蛋白质匹配，确定的肿瘤相关HLA抗原肽的序列是否与乳癌/乳腺癌的增殖、侵袭性、血管生成和/或细胞角蛋白产生的增加有关。
在这些描述的肿瘤组织检查的同时，确定了与患者的MHC I类复合物相对应的HLA抗原肽的遗传单倍型和等位基因。患者个体结果导致以下分配：
HLA-A*02:01、A*24:02、B*18:01、B*51:01、C*07:01、C*15:02；HLA-DRB1*09:01；DRB1*16:01、DQB1*03:03、DQB1*05:02。
(在与B*18:01相关的HLA-A*02:01的支持下，该患者约占欧洲(高加索人)人口的40％)。
3)个体化免疫信息疗法：靶点选择
步骤(a)：从转录组的数据集中，首先使用各个蛋白质的氨基酸序列选择具有最高等位基因亲和力(对T细胞受体的特异性活性[nM])的对应于MHC复合物的HLA肿瘤抗原肽(九聚体)的氨基酸序列。该选择标准用于通过算法确定相应的HLA肿瘤抗原肽在体内呈递在对应的MHC复合物上的概率(可能的细胞免疫反应的第一个先决条件)。
步骤(b)：从突变测试的数据集中，根据患者的等位基因，相对于最高亲和力(对T细胞受体的特异性活性[nM])，确定涉及氨基酸交换的九聚变体。此外，为此目的，在亲和力标准下测定了17个氨基酸的聚合物(寡肽)。该选择标准通过算法确定对应于MHC复合物的相应肿瘤抗原肽在体内呈递在对应MHC复合物上的概率(可能的细胞免疫反应的第二个先决条件)。
步骤(c)：基于步骤(a)和(b)中确定的新数据集，添加HLA限制性配体(配体组的数据集)，对对应于MHC I类复合物和对应于MHC II类复合物的HLA肿瘤抗原肽进行选择，它们是(无论单独和特别是组合地)引发细胞免疫反应的最有希望的表位候选者。
4)个体化免疫信息疗法：肽合成与递送方案
步骤(a)：将为定制应用解决方案选择的肽概念合成为化学肽。
步骤(b)：将以下7种对应于MHC I类复合物的HLA-A肿瘤抗原肽和2种对应于MHCII类复合物的HLA-A肿瘤抗原肽混合于33％DMSO/H2O应用溶液中，并分成24个小瓶单位，每瓶1ml。
九种肿瘤抗原肽序列
每种肿瘤抗原肽的剂量：500μg
5)个体化免疫信息疗法：应用协议
预处理：300mg/m2环磷酰胺(单次输注)；首次注射前3天
给药方式：皮内(i.d.)
给药部位：左右上臂
给药计划：在第1、2、3、8、15、22、36、50、71天，接着每3周，直到第365天，接种23次。
每次应用添加的佐剂：在注射部位局部使用其中含有12.5mg咪喹莫特的250mg乳膏(Aldara)；200μg ipilimumab(Yervoy)，因为CTLA4升高，与300μg nivolumab(Opdivo)交替，因为PD1或PD-L1升高，邻近应用部位直接皮下(s.c.)给药。
6)个体化免疫信息疗法：临床效果的2个证据。
基于两个重要的例子，在本案例1中应用免疫疗法的临床疗效如下所示：
图3显示了在特定应用(id)BITAP肽(为分散的mmC-HER2/Neu(INC14/1713)肝转移的特定转移性表位)的免疫信息的特定药物组合物后(星线)，特异性肿瘤标志物CA 15-3与肝脏标志物γGT的发展。
所示过程为期34周。
绘制了在根据本发明的肿瘤抗原肽(原发性肿瘤MC-HER2/Neu(INC14/1713)的表位)的组合物在特异性免疫信息后(星)特异性肿瘤标志物CA15-3的发展。所示过程为期26周。
实施例4：mIBC伴癌性淋巴管瘤病(转移性炎性乳腺癌)患者
1)患者的临床病史
患者，女性(46岁)
初步临床发现：炎性乳腺癌右伴广泛的癌性淋巴管瘤；初始肿瘤阶段pT4、pn3a(24/29)(Level II:14/19,Level III:10/10)、M0、L1、V0、G2。HR+,PR+,Androgenr.+,HER2/neu-
复发：术后3个月后首次复发：右下四分之一区域的乳房内发现进展，乳房组织的一致性显著增加。跨过胸壁区域中线皮肤浸润以及右侧腋窝脂肪组织和胸外侧壁沿右侧胸大肌的局部区域肿瘤浸润。
5个月后局部区域肿瘤复发，并延伸至腋窝。
从第6个月到第11个月进行化疗，如果化疗期间肿瘤进展，则在5个周期后停止。沿腹外侧胸壁7x11cm，局部区域肿瘤复发。皮肤和皮下组织广泛浸润和增厚。
使用芳香酶抑制剂进行激素治疗，并对右侧乳房、胸壁和锁骨上/颈椎右侧进行照射。
临床医生的预后：预计总生存期为3-4个月。(炎性乳腺癌是一种相对罕见的，特别具有侵袭性的乳腺癌，在这个案例2中，已经扩散到淋巴管(29个淋巴结中有24个在最初诊断时已经受到影响))。
根据本发明的治疗过程：在肿瘤医学的标准和常规规范中可用的所有治疗实施均未成功后，将应用合成肽形式的肿瘤相关和肿瘤特异性抗原来通知患者自身免疫系统的免疫治疗方法用于治疗性试验。
重点是细胞免疫防御，即激活内源性细胞毒性CD8+T细胞，作为初始T细胞，内源性细胞毒性CD8+T细胞通过高度分化的受体系统能够识别几乎所有可能的致病和恶性氨基酸序列(以下称为“靶标”)，并进而发展成效应细胞。这些效应T细胞可以通过分泌颗粒酶和穿孔素来破坏由HLA呈递抗原识别的肿瘤细胞。
这些免疫细胞的激活通过HLA I类配体(即以8-10个氨基酸序列的形式限制性地呈递在I类HLA分子上的抗原)发生。
在个体化免疫信息学治疗开始后的14-84个月内，发生了额外的局部复发(淋巴结)，每一个都通过手术切除。然而，阻止了远处转移。
2)个体化免疫信息疗法：分析
为了鉴定肿瘤相关和肿瘤特异性抗原肽，使用下一代测序(NGS)和液相色谱耦合串联质谱(LC-MS/MS)采用以下三个步骤从患者的活检肿瘤组织中确定数据：
■所有编码基因区域的mRNA表达(转录组-步骤(a))，
■肿瘤特异性体细胞错义突变以及通过(外显子组测序-步骤(b))
■肿瘤细胞呈递的HLA I+II类HLA限制性配体(HLA配体组-步骤(c))
步骤(a)：将mRNA表达数据(约40,000)与健康组织的表达水平进行比较，并针对以下过滤：
■表达值的显著(>3倍)偏差，以及进一步
■与肿瘤发展相关的基因的重要性
■这些基因在其他组织类型中可能不表达或仅轻微表达的标准
■此外，关于通常不在成人健康乳腺组织中表达的癌症-睾丸抗原组，记录了在肿瘤中的显著表达，因为它们可能具有肿瘤特异性抗原的性质
这导致了可能的HLA肿瘤抗原肽(数目86)的单独数据集，根据它们的表达异常/偏离正常值以及它们在肿瘤增殖中的已知重要性对其进行加权。
步骤(b)：将体细胞错义突变(具有一个氨基酸交换的单核苷酸变体(SNV)以及移码突变)(数目：41)组合到另一个数据集中，因为它们性质上可能是重要的(新)抗原，因此具有高度的肿瘤特异性。
步骤(c)：对于以下，使用来自专门数据库的信息筛选HLA限制性配体(9-10AS的氨基酸序列(对应于MHC I类复合物)(数目：1321)和12-15AS的序列(对应于MHC II类复合物)(数目：863)
■已经出现在健康组织中的(＝阴性)
■与来自转录组和外显子组的希望的序列的蛋白质匹配，鉴定的肿瘤相关HLA抗原肽的序列是否与乳癌/乳腺癌的增殖、侵袭性、血管生成和/或细胞角蛋白产生的增加有关。
在这些描述的肿瘤组织检查的同时，确定了与患者的MHC I类复合物相对应的HLA抗原肽的遗传单倍型和等位基因。患者个体结果导致以下分配：
HLA-A*01:01、A*29:02、B*08:01、B*44:03、C*07:01、C*16:01；HLA-DRB1*03:01；DRB1*07:01、DRB3*01:01、DRB1*03:01、DRB4*01:01、DQB1*02:01、DPB1*01:01
(在与B*08:01相关的HLA-A*01:01的支持下，这种患者约占欧洲(高加索人)人口的25％)。
3)个体化免疫信息疗法：靶点选择
步骤(a)：从转录组的数据集中，首先使用各个蛋白质的氨基酸序列选择具有最高等位基因亲和力(对T细胞受体的特异性活性[nM])的对应于MHC复合物的HLA肿瘤抗原肽(九聚体)的氨基酸序列。该选择标准用于通过算法确定相应的HLA肿瘤抗原肽在体内呈递在对应的MHC复合物上的概率(可能的细胞免疫反应的第一个先决条件)。
步骤(b)：从突变测试的数据集中，根据患者的等位基因，相对于最高亲和力(对T细胞受体的特异性活性[nM])，确定涉及氨基酸交换的九聚变体。此外，为此目的，在亲和力标准下测定了17个氨基酸的聚合物。该选择标准通过算法确定对应于MHC复合物的相应肿瘤抗原肽在体内呈递在对应MHC复合物上的概率(可能的细胞免疫反应的第二个先决条件)。
步骤(c)：基于步骤(a)和(b)中确定的新数据集，添加HLA限制性配体(配体组的数据集)，对对应于MHC I类复合物和对应于MHC II类复合物的HLA肿瘤抗原肽进行选择，它们是(无论单独和特别是组合地)引发细胞免疫反应的最有希望的表位候选者。
4)个体化免疫信息疗法：肽合成与递送方案
步骤(a)：将为定制应用解决方案所选择的肽概念合成为化学肽。
步骤(b)：将以下9种对应于MHC I类复合物的HLA-A肿瘤抗原肽和2种对应于MHCII类复合物的HLA肿瘤抗原肽混合于33％DMSO/H2O应用溶液中，并分成6个小瓶单元，每瓶1.5ml。
九种肿瘤抗原肽序列
每种肽的剂量：300μg
每个应用剂量(小瓶)的总肽含量：3.3mg
5)个体化免疫信息疗法：应用协议
预处理：300万单位IFN alpha 2b(Roferon)，第一次注射前4天
给药方式：皮下(s.c.)
给药部位：左右上臂、左右臀部
给药计划：第1、8、22、50、180和360天，6次注射
每次给药添加的佐剂：Montanide ISA 51VG(1.5ml)，与肽瓶(1.5ml)按1:1混合；300μg nivolumab(Opdivo)，当PD1或PD-L1升高时，在肽/Montanide注射前30分钟，邻近注射部位直接皮下(s.c.)注射。
6)个体化免疫信息疗法：临床效果的证据
示出的实施例4中应用的免疫疗法的临床疗效如图5所示。
该图表示在应用根据实施例4的药物组合物后的8个月期间肿瘤标志物CEA(柱1)和CA15-3(柱2)以及肝脏值γ-GT(柱3)和白细胞计数(柱4)的发展。在这之前是侵袭性肿瘤进展-基本上基于炎性淋巴管病癌病。使用Montanide ISA 51 VG与混合肽(peptidecocktail)的1:1混合物进行给药。体积为3ml并在4个不同的给药位点皮下给药。(见第5部分)。在该肽组合物中，是初始给药(随后是4次进一步给药；参见图5中的箭头)。
实施例4的药物组合物中所含的10种肽为肿瘤抗原肽(或新抗原)。根据信息，第1-4号和10号抗原已成为表位，即成功激活对应的T细胞受体(TCR)并产生效应细胞和记忆细胞。
序列表
<110> PMCR有限责任公司
<120> 用于治疗乳癌/乳腺癌的I类和II类HLA肿瘤抗原肽
<130> PMC-0001-P-DE
<140> DE 10 2019 114 735.2
<141> 2019-06-02
<160> 48
<170> PatentIn version 3.5
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<220>
<223> II类HLA新抗原肽
<400> 42
HGSSFFLLIL KRDSAFI 17
<210> 43
<211> 17
<212> AA
<213> 合成构建体
<220>
<223> II类HLA新抗原肽
<400> 43
YSMKCKNVVP LNDLLLE 17
<210> 44
<211> 15
<212> AA
<213> 合成构建体
<220>
<223> II类HLA新抗原肽
<400> 44
PLQIILMPQV QPGLP 15
<210> 45
<211> 15
<212> AA
<213> 合成构建体
<220>
<223> II类HLA新抗原肽
<400> 45
LLHTEYSLLS LLHMQ 15
<210> 46
<211> 15
<212> AA
<213> 合成构建体
<220>
<223> II类HLA新抗原肽
<400> 46
NYLAEEITVD VRDEF 15
<210> 47
<211> 15
<212> AA
<213> 合成构建体
<220>
<223> II类HLA新抗原肽
<400> 47
REIDVLEREL NVLIF 15
<210> 48
<211> 15
<212> AA
<213> 合成构建体
<220>
<223> II类HLA新抗原肽
<400> 48
PSNYQPHQAC RITFL 15
Claims (36)
1.用于治疗或预防患有或怀疑患有乳癌/乳腺癌的患者或患者组中的乳癌/乳腺癌，尤其是局部复发或转移性乳腺癌的药物组合物，其包含药理学有效量的包括4至8种对应于MHC I类复合物的HLA肿瘤抗原肽和至少2种对应于MHC II类复合物的肿瘤抗原肽，其特征在于，所述HLA肿瘤抗原肽是肿瘤专有的或肿瘤相关HLA抗原肽，特别是与乳癌/乳腺癌相关的那些，其中所述HLA肿瘤抗原肽包含在序列SEQ ID No.13-SEQ ID No.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29和SEQ ID No.32-SEQ ID No.48中包含的序列。
2.根据权利要求1所述的用于权利要求1所述用途的药物组合物，其中，向患有乳腺癌的患者或患者组施用药理学有效量的所述肿瘤抗原肽以有效地降低CA 15-3水平。
3.根据权利要求1或2所述的用于权利要求1所述用途的药物组合物，其中，分别对应于MHC I类和II类复合物的HLA肿瘤抗原肽是通过免疫原性分析，特别是通过蛋白质印迹、ELISA技术、具有显微镜分析的ELISPOT或免疫检测所确定的免疫原性HLA肿瘤抗原肽。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的用于权利要求1所述用途的药物组合物，其中，所述HLA-A肿瘤抗原肽与亚型A*01和/或A*02的对应MHC I类复合物结合。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的用于权利要求1所述用途的药物组合物，进一步包含至少一种对应于MHC I类复合物的HLA-B肿瘤抗原肽和/或至少一种对应于MHC I类复合物的HLA-C肿瘤抗原肽。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的用于权利要求1所述用途的药物组合物，其中，对应于MHC I类复合物的各个亚型的HLA肿瘤抗原肽选自在SEQ ID No.13至35中给定的氨基酸序列或与这些氨基酸序列具有至少一个氨基酸交换。
7.根据前述权利要求中任一项所述的用于权利要求1所述用途的药物组合物，其中，所述对应于MHC II类复合物的HLA肿瘤抗原肽选自SEQ ID No.36至48中列出的氨基酸序列。
8.根据前述权利要求中任一项所述的用于权利要求1所述用途的药物组合物，其中，如通过超高效液相色谱(UHPCL)结合ESI质谱(MS)所确定的，所述HLA肿瘤抗原肽在所述患者或患者组的乳癌/乳腺癌肿瘤细胞的表面上呈递。
9.根据前述权利要求中任一项所述的用于权利要求1所述用途的药物组合物，
其中，如通过qPCR所测定的，肿瘤细胞中肿瘤相关的HLA肿瘤抗原肽的表达水平比患者或具有至少一个相同HLA等位基因的患者组的健康细胞中的表达水平至少高三倍，以及
其中，肿瘤相关的HLA抗原肽与乳癌/乳腺癌的增殖、侵袭性、血管生成和细胞角蛋白产生增加有关。
10.根据前述权利要求中任一项所述的用于权利要求1所述用途的药物组合物，其中：
-至少一种HLA-A肿瘤抗原肽是肿瘤专有的HLA-A肿瘤抗原肽，并且
-如由表面等离子共振所确定的，确定的肿瘤专有HLA-A肿瘤抗原肽与对应的MHC I类复合物的特异性结合KD在10至50nM范围内。
11.根据前述权利要求中任一项所述的用于权利要求1所述用途的药物组合物，其中，所述组合物中每种单独HLA抗原肽的药理学有效量的绝对浓度(即给药剂量)在100至600μg的范围内。
12.根据前述权利要求中任一项所述的用于权利要求1所述用途的药物组合物，其中，所述组合物包含能够在所述组合物施用于患者的部位处形成肉芽肿的佐剂。
13.根据前述权利要求中任一项所述的用于权利要求1所述用途的药物组合物，其中，所述药物组合物皮下或皮内施用，并且优选基本上在远离肿瘤病灶和/或癌性淋巴结区域的至少2个施用部位，优选至少4个施用部位同时施用。
14.根据前述权利要求中任一项所述的用于权利要求1所述用途的药物组合物，其中，至少一种HLA肿瘤抗原肽相对于野生型HLA肿瘤抗原肽具有至少一种突变(突变组)，该突变导致与野生型HLA抗原肽相比，用HLA肿瘤抗原肽治疗的个体对T细胞受体的亲和力增加。
15.根据前述权利要求中任一项所述的用于权利要求1所述用途的药物组合物，其中，所述药物组合物作为单一疗法或与其他已知疗法和/或用于治疗乳癌/乳腺癌的化合物联合用于治疗乳癌/乳腺癌。
16.根据前述权利要求中任一项所述的用于权利要求1所述用途的药物组合物，其中，用所述药物组合物治疗的患者已经接受了标准治疗程序(例如，至少一种手术、放射、化学疗法和/或激素疗法)。
17.根据前述权利要求中任一项所述的用于权利要求1所述用途的药物组合物，其中，所述药物组合物作为一线疗法施用于患者或具有至少一个相同HLA等位基因的患者组。
18.根据前述权利要求中任一项所述的用于权利要求1所述用途的药物组合物，其中，将在药物组合物中以100-600μg的绝对浓度(即，施用剂量)包含每种单独的HLA肿瘤抗原肽的药物组合物皮内或皮下注射施用于患者或具有至少一个相同HLA等位基因的患者组，施用频率为每2周一次，持续至少一年。
19.根据前述权利要求中任一项所述的用于权利要求1所述用途的药物组合物，其中，所述乳癌/乳腺癌是激素阳性、HER2/neu或三阴性乳腺癌。
20.对应于MHC I类复合物或MHC II类复合物的HLA肿瘤抗原肽，特别用于治疗乳癌/乳腺癌或用于根据权利要求1至19中任一项所述的药物组合物，其选自分别在Seq ID No.13-Seq ID No.26、Seq ID No.28、Seq ID No.29和Seq ID No.32-Seq ID No.48中给出的氨基酸序列。
21.根据权利要求20所述的HLA肿瘤抗原肽，其用在治疗个体的乳癌/乳腺癌，特别是局部复发或转移性乳癌/乳腺癌的方法中，该方法包括向个体施用包含药理学有效量的HLA肿瘤抗原肽的治疗方案。
22.根据权利要求20或21所述的HLA肿瘤抗原肽，其中所述个体尚未接受针对乳腺癌，特别是局部复发或转移性乳腺癌的放射、化学疗法和/或激素疗法，和/或自最后一剂化疗药物，复发12个月或更短时间尚未接受先前的佐剂化疗。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的HLA肿瘤抗原肽，其中，所述治疗方案有效地将个体的无进展生存期延长至少2至5年。
24.根据权利要求20至23中任一项所述的HLA肿瘤抗原肽，如通过免疫原性测试，特别是通过蛋白质印迹、ELISA技术，特别是通过具有显微镜分析的ELISPOT、AFM或免疫检测所测定的，其在所述患者或患者组中具有免疫原性。
25.前述权利要求中任一项所述的HLA肿瘤抗原肽，其中，所述个体具有带有亚型A*01:01和/或A*02:01的单倍型。
26.根据权利要求25所述的HLA肿瘤抗原肽，其中，所述个体具有带有亚组B*44:01和/或A*18:01的单倍型。
27.用于确定用于治疗或预防乳癌/乳腺癌或用于根据前述权利要求中任一项的组合物的药学活性HLA肿瘤抗原肽的方法，包括监测患有或怀疑患有乳癌/乳腺癌的患者或患者组的组织切除，该方法包括以下步骤：
(a)提供患者或患者组的组织样本，其中所述组织样本的细胞表达I类和/或II类MHC复合物并将它们呈递在细胞表面上，其中提供组织样本的方法的步骤(a)本身不包括对所述患者或患者组中的一名患者的任何手术干预；
(b)使用步骤(a)中提供的组织样本确定以下参数：
i)提供的组织样本的转录组，以及
与来自所述患者或患者组的健康组织样本的转录组进行比较，以确定与健康组织样本中的阈值相差3因子的上调和/或下调的mRNA序列；以及
ii)所述患者或患者组的特定HLA单倍型；以及
iii)提供的组织样本的外显子组序列，以及
将提供的组织样本的外显子组与健康组织样本的外显子组或与患者或患者组的基因数据库进行比较以确定体细胞突变，以及
确定具有体细胞突变并且相对于在步骤(i)中确定的健康组织样本上调或下调的HLA肿瘤抗原肽；以及
确定与乳癌/乳腺癌的增殖、侵袭性、血管生成和细胞角蛋白产生增加相关的HLA肿瘤抗原肽；以及
iv)用以确定在步骤(iii)中确定的乳癌/乳腺癌细胞表面上呈递的肿瘤抗原肽的配体组；以及
v)通过数据库和/或排序算法在步骤(iv)中确定的HLA肿瘤抗原肽对乳腺癌细胞的对应MHC复合物的特异性结合亲和力，以及
vi)通过免疫原性测试，特别是通过蛋白质印迹、ELISA技术，特别是通过具有显微镜分析的ELISPOT、AFM或免疫检测，在步骤(iv)中确定的HLA肿瘤抗原肽的免疫原性；
(c)选择符合根据步骤(b)中定义的参数的标准的HLA肿瘤抗原肽，这些肽在提供的组织样本的细胞中表达并在这些细胞的表面上呈递。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，在步骤(a)中提供来自患者或患者组的组织样本后，分析BRCA1和BRCA2基因中是否存在突变。
29.根据权利要求27或28所述的方法，其中，步骤(a)中提供的组织样本是乳癌/乳腺癌的组织样本。
30.根据权利要求27至29中任一项所述的方法，其中，通过超高效液相色谱(UHPCL)结合ESI质谱(MS)确定所述HLA抗原肽是否在步骤(a)中提供的患者或患者组的组织样本的细胞表面上呈递。
31.根据权利要求27至30中任一项所述的方法，其中，根据步骤(b)确定多个参数包括生成在步骤(a)中提供的组织样本的转录组。
32.根据权利要求27至31中任一项所述的方法，其中，根据步骤(b)确定多个参数包括为步骤(a)中提供的所述组织样本生成外显子组测序。
33.根据权利要求1至19中任一项所述的药物组合物的制备方法，包括以下步骤：
(a)通过权利要求27至32中任一项所述的确定方法，确定暴露在待治疗的患者或具有至少一个相同HLA等位基因的患者组的乳癌/乳腺癌细胞的细胞表面上的至少4至8种对应于MHCI类复合物的HLA-A肿瘤抗原肽和至少2种对应于MHC II类复合物的肿瘤抗原肽；
(b)合成步骤(a)中确定的4至8种对应于MHC I类复合物的HLA-A肿瘤抗原肽和至少2种对应于MHC II类复合物的肿瘤抗原肽；以及
(c)制备根据本发明的药物组合物，其至少包含步骤(b)中合成的4至8种对应于MHC I类复合物的HLA-A肿瘤抗原肽、至少2种对应于MHC II类复合物的肿瘤抗原肽以及如本文定义的佐剂。
34.用于治疗乳癌/乳腺癌的组合制剂，其同时、分开或依次给药，
所述组合制剂包括以下两种单独的制剂(a)和(b)：
(a)第一制剂，与药学上可接受的载体或稀释剂一起，其包含权利要求1至19的任一项所述以及任选地通过权利要求27至32中任一项的方法确定的4至8种对应于MHC I类复合物的HLA-A肿瘤抗原肽和至少2种对应于MHC II类复合物的肿瘤抗原肽，以及
(b)第二制剂，与药学上可接受的载体或稀释剂一起，其包含选自抗癌烷化剂、抗癌抗代谢物、抗癌抗生素、草药抗癌剂、铂配位抗癌络合物、抗癌喜树碱衍生物、抗癌酪氨酸激酶抑制剂、单克隆抗体、干扰素、白介素、生物反应调节剂的抗癌剂，和其他抗癌剂，或它们药学上可接受的盐。
35.根据权利要求34所述的组合制剂，其中，所述第二制剂是单克隆抗体，特别是针对选自CTLA4、GM-CFS、TReg、EpCam、IDO、MIC、PDL1、Fas和PD1-L、TRAIL的免疫抑制蛋白的单克隆抗体。
36.根据权利要求34或35所述的组合制剂，所述第二制剂是用于激素阳性患者的雌激素抑制剂。
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