EP3976081A1 - Hla-tumorantigenpeptiden der klasse i und ii zur behandlung von mamma-/brustkarzinomen - Google Patents

Hla-tumorantigenpeptiden der klasse i und ii zur behandlung von mamma-/brustkarzinomen

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EP3976081A1
EP3976081A1 EP20734836.8A EP20734836A EP3976081A1 EP 3976081 A1 EP3976081 A1 EP 3976081A1 EP 20734836 A EP20734836 A EP 20734836A EP 3976081 A1 EP3976081 A1 EP 3976081A1
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EP
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hla
tumor antigen
antigen peptides
tumor
patient
Prior art date
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Application number
EP20734836.8A
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English (en)
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Wolfgang Schönharting
Sybille Urban
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Original Assignee
Pmcr GmbH
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Publication date
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    • A61K2039/812—Breast

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for
  • HLA human leukocyte antigen
  • HLA-A tumor antigen peptides corresponding to the MHC class I complexes
  • HLA-A restricted tumor antigen peptides at least 2 tumor antigen peptides corresponding to the MHC class II complexes
  • HLA restricted tumor antigen peptides being tumor-exclusive or tumor-associated HLA antigen peptides and against the corresponding MHC complexes
  • Combinations thereof are directed to (i.e. bind to or have an affinity for them), a combination preparation (or parts thereof), a method for
  • Cancers continue to be the leading causes of death. In general, cancer is treated using established methods such as surgery
  • Tumor removal (resection), chemotherapy and / or radiation therapy.
  • Newer therapeutic concepts aim to incorporate the patient's own immune system into the overall therapeutic concept through the use of specific measures such as antibody therapy against immunosuppressors and recombinant immunoinformatics (ie treatment with information carriers).
  • the prerequisite for the success of such a strategy is the recognition of tumor-specific or tumor-associated antigens or epitopes by the immune system of the test person, whose effector functions (by the immune cells) are to be strengthened.
  • tumor cells differ significantly from their non-malignant cells of origin.
  • tumor-associated structures are recognized by the specific immune system of the tumor-bearing host, one speaks of tumor-associated epitopes.
  • Cancer / testis antigens denote a group of tumor-associated proteins that are expressed, among other things, by tumors of different histological origins (Fratta et al., Molecular Oncology, 5 (2), April 2011, 164-182). In healthy adult vertebrates, expression of these proteins is restricted to male germ cells. In cancer, however, the expression of these developmental antigens is often reactivated and can thus serve as a site for immune activation. Many of the CTAs are oncogenes and are involved in cellular processes such as cell growth and division, in the inhibition of apoptosis and in metastasis. They are often the cause of
  • CTAs Oncogenesis and malignant transformation and are therefore classified as tumor antigens.
  • the expression of CTAs in different malignancies is heterogeneous and often correlates with tumor progression, which is why they are also used as biomarkers for the course of a
  • HLA antigen peptides of such CTAs are often presented as degradation products on the surface of the tumor cells. It is known that such
  • Treatment methods can be used that combine drug treatment with anti-CTA-directed immunotherapy.
  • Human leukocyte antigens also known as HLA system, HL antigens, histocompatibility antigens, English human leukocyte antigens
  • HLA system occurs under the name Major Histocompatibility Complex (MHC) in all vertebrates.
  • MHC Major Histocompatibility Complex
  • MHCs There are two types of MHCs, namely MHC class I molecules (also referred to herein as “MHC complexes of the class or” HLA complexes of class I ') and MHC molecules of class II (herein also “MHC complexes of the class / or“ HLA complexes of the class /). Both are found on the cell surface of all cells with a nucleus in the bodies of the MHCs.
  • MHC molecules consist of two polypeptide chains, a heavy ⁇ chain and a light ⁇ chain (see also FIGS. 1 and 2).
  • Class I MHC molecules are expressed on the cell surface of all nucleated cells and recognized by CD8 + T cells (also known as killer T cells or cytotoxic T cells). MHC class II molecules are mainly based on the
  • T helper cells Cell surface exposed by antigen-presenting cells and recognized by CD4 + T cells (also known as T helper cells).
  • MHC class I molecules are on the cell surface of
  • T-killer cells also cytotoxic T-cells
  • MHC class I protein present peptides derived from cytosolic proteins
  • the route of presentation of class I MHC molecules is often referred to as the cytosolic or endogenous route.
  • HLA antigen peptides serve as mediators between the corresponding MHC complex, which is presented on the cell surface, and the T cell receptor.
  • HLA complexes of class I present intracellular antigen peptide fragments on the cell surface of the host cells (herein “HLA antigen peptides corresponding to the MHC class I complexes” or “HLA antigen peptides of type G, the 7 to 1 1, mainly comprising 9 amino acids - so-called nonamers - in their sequence) compared to T killer cells (also cytotoxic T cells), whereas HLA complexes of class II (HLA-DR, DQ and DP) exogenously derived antigen peptides (herein " HLA antigen peptides
  • HLA antigen peptides which correspond to the MHC class II complexes ”or“ HLA antigen peptides of the type 2 ”, which comprise more than 11 amino acids, preferably 12 to 17 amino acids in their sequence) to T helper cells.
  • the class I HLA antigen peptides which correspond to the MHC class I, are divided into HLA-A, HLA-B and HLA-C antigen peptides.
  • HLA complexes of class II primarily via the discrete anchor residues in the Amino acid positions 1, 4, 6/7 and 9 of the HLA antigen peptides take place (see, for example, Sinigaglia and Hammer (1995), J. Exp. Med., 181, 449-451).
  • the interaction between the peptide binding pocket motif of the HLA complex of class II and the discrete anchor residues in amino acid positions 6 and 9 of the HLA antigen peptides corresponding to the MHC class II complexes is particularly preferred.
  • HLA antigen peptides corresponding to the MHC class I complexes the amino acid positions 1, 2 and 9 are postulated as the primary anchor residues compared to the corresponding HLA complex of class I (see, for example, Binkowski et al. (2012), PLoS ONE , 7 (8), e41710; Yamada (1999), Tissue Antigens, 54 (4), 325-32).
  • cancer immunotherapies are based on the fact that the individual mutation pattern (signature) of the tumor of each individual cancer patient has to be deciphered. Based on the determined profile of the mutation pattern, synthetic vaccines, for example based on RNA, are produced for each individual patient (so-called vaccine production). The vaccines obtained in this way can then only be used for the individual treatment of this particular patient.
  • HLA antigen peptides which can be used as pharmacologically effective HLA antigen peptides or as pharmacologically active ingredients, as well as to provide pharmaceutical compositions containing them for diagnosis, prevention and / or Treatment of breast cancer and other diseases and
  • Disorders, particularly cancers, listed herein can be used; and methods for the diagnosis, prevention and / or treatment of such
  • HLA antigen peptides which are suitable for prophylactic, therapeutic and / or diagnostic use in warm-blooded animals, in particular in a mammal and very particularly in a human.
  • a pharmaceutical composition for use in the treatment or for profiling of breast / breast carcinoma, in particular locally recurring or metastatic breast carcinoma in a patient or group of patients who has or is suspected of having a breast / breast carcinoma to suffer from a breast cancer comprising a pharmacologically effective amount of 4 to 8, preferably 4, 5, 6, 7 or 8 HLA-A
  • the pharmaceutical composition consists exclusively of a carrier liquid
  • compositions of carrier liquids are known to the person skilled in the art and are, for example, in the range of 30% DMSO and 70% water), in which a pharmacologically effective amount of 4 to 8 HLA A tumor antigen peptides
  • compositions and suitable dosage forms for administering the pharmaceutically active HLA tumor antigen peptides are prepared according to standard methods known in the art and are easily applicable to any new or improved method for their preparation.
  • CA 15-3 is particularly advantageously reduced.
  • CA 15-3 (Cancer-Antigen 15-3) is a so-called glycoprotein that is used as a specific tumor marker in breast cancer.
  • the CA 15-3 value is a laboratory value that increases significantly above the threshold value in the case of certain types of cancer, especially breast cancer. In healthy people, the CA is 15-3
  • the CA 15-3 value is preferably determined by administering the pharmacologically effective amount of Tumor antigen peptides to the patient or the patient group suffering from breast cancer, below 60 U / ml, particularly preferably below 50 U / ml, very particularly preferably to a range below 40 U / ml and a normal value ( ⁇ 31 U / ml).
  • the progression-free survival of the individual is particularly preferably extended effectively, preferably by at least 2 to 5 years.
  • tumor antigen peptides which have a K D value in the range between 50 and 500 nM, contrary to conventional // is / 7 / co binding prediction models, which have viewed these as low binding, trigger effector cells (ie cytotoxic T cells) .
  • the HLA tumor antigen peptides used for the treatment are immunogenic in the patient or the patient group with at least one identical HLA allele, which is done in advance with an immunogenicity test (e.g. using Western blot, ELISA techniques , in particular by means of ELISPOT, preferably by means of interferon-gamma, interferon-alpha or interleukin (IL-2), or immunodetection with microscopic analysis).
  • HLA tumor antigen peptides corresponding to the MHC class I complexes (see particularly preferred examples in Tables 1-3)
  • HLA tumor antigen peptides corresponding to the MHC class II complexes (see particularly preferred examples in Table 4)
  • HLA Allele is not just about passive immunization (as in treatment with antibodies, eg Herceptin) but about active immunization (ie specific activation of T cells or B helper cells via information carriers). Since the specific activation of MHC class II molecules, which are mainly exposed on the cell surface of antigen-presenting cells, by means of the tumor antigen peptides corresponding to the MHC class II complexes, specifically CD4 + T cells (also known as T helper cells) and B cells are activated.
  • an HLA tumor antigen peptide of the invention usually has one or more amino acid residues or one or more stretches of amino acid residues in its amino acid sequence (ie, with each "segment” comprising two or more amino acid residues that are adjacent or are in close proximity to one another, ie in the primary or tertiary structure of the amino acid sequence), via which the amino acid sequence of the invention can bind to a T cell receptor (in particular a binding pocket thereof), the amino acid residues or sections of the
  • anchor amino acids are amino acids that form the “anchor” for binding to a T cell receptor (also referred to herein as “anchor amino acids”).
  • This “anchor” can be determined, for example, with in silico methods (e.g. the artificial neural network NNAIign, which is used in the publicly accessible NetMHC-4.0) or by targeted mutation (insertions or substitutions in the
  • the HLA tumor antigen peptides provided by this invention are preferably in substantially isolated form (as defined herein) or form part of a protein or polypeptide, which can comprise one or more HLA tumor antigen peptides of the invention or consist essentially thereof and which optionally further can comprise one or more pharmaceutically active HLA tumor antigen peptide (s) (all of which are optionally linked via one or more linkers in a so-called oligopeptide).
  • the tumor antigen peptides of the invention can be used as a binding moiety in such a protein or polypeptide, which may optionally contain one or more additional amino acid sequences that can serve as a binding moiety (i.e., against one or more targets other than a T- Cell receptor) to provide a monovalent, multivalent, or multispecific polypeptide of the invention as described herein.
  • a protein or polypeptide can also be in substantially isolated form (as defined herein).
  • a pharmaceutical composition comprising a specific combination disclosed herein of HLA tumor antigen peptides corresponding to the MHC class I complexes and HLA tumor antigen peptides corresponding to the MHC class II complexes is particularly advantageous because it on the one hand it is suitable for activating specifically T cells as well as specifically B cells.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition, a kit (or parts thereof), a method for
  • polypeptides and pharmaceutical compositions of the present invention can be used in particular for the prevention and treatment of cancer diseases,
  • breast / breast carcinomas which are characterized by mutation (s) (herein “amino acid exchange”), modified wild-type HLA antigen peptides corresponding to the MHC class I complexes and / or corresponding to the MHC class II complexes ( so-called HLA tumor antigen peptides, as defined herein).
  • amino acid exchange modified wild-type HLA antigen peptides corresponding to the MHC class I complexes and / or corresponding to the MHC class II complexes
  • HLA tumor antigen peptides as defined herein.
  • cancer diseases of the invention of a patient or a group of patients are treated in advance by classical methods such as
  • Chemotherapy radiation therapy and / or cancer immunotherapy.
  • Classic methods of treating cancer of the invention are, for example, surgical removal of tumors (resection), chemotherapy and / or radiation therapy, with two or even all three treatment methods being used simultaneously in one
  • lymphocytes are taken from the test person, cultivated ex vivo and then injected back into the test person. Not all cells are treated during treatment of the tumor and its metastases are destroyed, the further treatment of cancer diseases is made significantly more difficult by the formation of resistance.
  • the present invention therefore also comprises a pharmaceutical composition for the treatment of cancer diseases, as previously described, which follows the classic methods for the treatment of cancer diseases, namely after unsuccessful surgical tumor removal (resection), chemotherapy and / or radiation therapy.
  • the pharmaceutical composition to be administered comprises HLA antigen peptides which are presented on the surface of the tumor cells of the breast cancer of the patient or of the patient group, which is prior to application and
  • Ultra high performance liquid chromatography in conjunction with ESI
  • MS Mass spectrometry
  • At least 60%, preferably at least 80%, very particularly preferably 90%, ideally all HLA tumor antigen peptides that are contained in the pharmaceutical composition to be administered, are on the surface of the tumor cells of the breast carcinoma of the patient or group of patients presented as determined by methods as described herein.
  • the HLA antigen peptides corresponding to the MHC class I complexes are selected from the group consisting of the amino acid sequences given in SEQ ID No. 1 to 35 or have an amino acid identity of at least 85% with respect to these amino acid sequences. on.
  • the HLA antigen peptides corresponding to the MHC class II complexes are selected from the group consisting of the amino acid sequences given in SEQ ID Nos. 36 to 48. It has been found by the inventors of the present invention that the HLA-A antigen peptides explicitly disclosed herein are suitable in accordance with MHC class I in particular for use in the treatment of breast carcinomas in test subjects or a patient group with at least one identical HLA allele that have the subtype A * 01 and / or A * 02. This means that the HLA-A
  • Tumor antigen peptides preferentially bind to the corresponding MHC class I complex of subtype A * 01 and / or A * 02.
  • the individuals have the haplotype with the subgroup A * 01: 01 and / or A * 02:01.
  • the individuals particularly preferably have the haplotype with the subgroup B * 44:01 and / or A * 18:01.
  • Tumor antigen peptides corresponding to the MHC class I complexes can be used particularly advantageously for the treatment of breast cancer.
  • Composition in the treatment of a patient or a group of patients with at least one identical HLA allele can be achieved by adding a pharmacologically effective amount of at least one HLA-B tumor antigen peptide, preferably 1, 2, 3, 4 or 5 HLA- B tumor antigen peptide (s) corresponding to the MHC class I complexes and / or at least one HLA-C
  • HLA-B tumor antigen peptides or HLA-C tumor antigen peptides are also selected according to the specific haplotype of the patient or patient group with at least one identical HLA allele for treatment or profiling.
  • composition according to the invention at least 6, 7, 8, 9, 10, 11 or 12 HLA antigen peptides corresponding to the MHC class I complexes and / or MHC class II complexes and / or at least one HLA antigen peptide that is analogous to at least one on the cell surface of cells from malignant and / or neoplastic tissue
  • HLA antigen peptide which, in its amino acid sequence, has at least one
  • Neoantigen peptide and at least a 3-fold increased specific affinity for the T cell receptor of the body's own T cells (measured accordingly and / or expressed as K D value). Particularly good results could be achieved with pharmaceutical
  • compositions are achieved which had at least 10, 11 or 12 HLA antigen peptides corresponding to the MHC class I complexes and / or MHC class II complexes.
  • compositions are particularly preferred which are composed of a pharmacologically effective amount of 4 to 8, preferably 4, 5, 6, 7 or 8 HLA-A and / or HLA-B tumor antigen peptides corresponding to MHC class I - Complexes, in particular neoantigen peptides thereof and 1, 2, 3 or 4
  • Tumor antigen peptides corresponding to the MHC class II complexes in particular
  • Neoantigen peptides consist thereof.
  • At least one HLA-A antigen peptide of the composition is a tumor-exclusive HLA-A antigen peptide (ie a cancer testis antigen (CTA) that is found in healthy / normal tissue of the patient / patient group beyond the immunoprivileged spermatocytes (no longer) appears or a so-called neoantigen peptide), and the specific binding of the tumor-exclusive HLA-A antigen peptide with a specific dissociation (KD) in the range of 10 to 50 nM, as determined by surface plasmon resonance.
  • CTA cancer testis antigen
  • KD specific dissociation
  • a pharmaceutical composition based on HLA antigen peptides is particularly effective if both T lymphocytes (T cells for short) and B lymphocytes (B cells for short) ) to be activated.
  • T cells belong to the cell group of lymphocytes and play an important role in the human immune system. T cells recognize antigens through a specific receptor, the so-called T cell receptor (TCR). To do this, however, the antigen must be offered by an antigen-presenting cell (APC).
  • APC antigen-presenting cell
  • T cells that carry the CD4 trait are also referred to as CD4 positive T cells or T helper cells.
  • CD4 + T cells make up 27-57% of the lymphocytes, i.e. about 310-1570 cells / mI.
  • CD8-positive (CD8 +) T cells which also includes regulatory T cells, includes cytotoxic T cells or T killer cells. They play a special role in killing the body's own cells that are infected by viruses. This property of the cellular immune defense is of crucial importance in the present invention, since the molecular biological and genetic engineering
  • B cells are the only cells capable of producing antibodies and, together with T cells, make up the decisive component of the adaptive immune system. While T cells are involved in the cell-mediated immune response, the B cells are the carriers of the humoral immune response (and for the formation of
  • a pharmaceutical composition comprises the tumor-associated HLA antigen peptides whose expression level in the tumor cells is at least three times higher than in the healthy cells of the patient or the specifically determined patient group with at least one identical HLA allele, as determined for example with qPCR, and wherein the tumor-associated HLA antigen peptides are associated with the proliferation, invasiveness, angiogenesis and an increase in cytokeratin production of the breast / breast carcinoma, have particularly effective pharmacological effects in the treatment of breast / breast carcinomas.
  • Composition in an absolute concentration i.e. administration dose of at least 100 to 600 mg, preferably from 300 to 600 mg.
  • composition which per HLA tumor antigen peptide has an absolute concentration of>
  • 600 mg i.e. contain at least 700 to 1,200 mg, preferably from 800 to 1,200 mg, is very particularly preferred, since this greatly intensifies the information (the activation and / or training of the immune system). This is particularly advantageous if the immune system of the subject to be treated has been pretreated with a
  • Standard therapy e.g. at least one operation, radiation, chemotherapy and / or hormone therapy
  • the absolute concentration is pro HLA tumor antigen peptide is preferred, since this substantially minimizes the influence of the degradation of the HLA tumor antigen peptides (for example by ligases) after their application to the test subject.
  • the pharmaceutical composition comprises an adjuvant which, when the composition is applied to a patient, is suitable for forming a granuloma at the site of application.
  • the advantage of forming a granuloma is that a depot effect can be achieved, with the HLA tumor antigen peptides being advantageously stored in the form of a reservoir at the point of application and being able to be released to the subject's organism over a longer period of time.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is not administered weekly.
  • the application of the pharmaceutical composition for the treatment of cancer within the meaning of the invention therefore only has to be carried out every 2 weeks, particularly preferably only once a month, when used over a longer period of time.
  • the pharmaceutical composition is preferably applied subcutaneously or intradermally and, preferably essentially simultaneously, to at least 2, particularly preferably to at least 3 application sites, usually to 3 to 4 application sites away from a tumor lesion and / or the cancerous lymph node area.
  • the essentially simultaneous (successive) application to several application sites has the advantage that, especially when applying high absolute concentrations of the individual HLA antigen peptides (ie administration dose) in the range of> 600 ⁇ g, which means that larger application volumes are required to completely dissolve the individual HLA antigen peptides ( >
  • the application solution which has only a limited shelf life after opening, is applied at the same time as possible.
  • the pharmaceutical composition containing each individual HLA antigen peptide in the composition in an absolute concentration i.e.
  • Administration dose of 300 to 600 yug, only once every 2 weeks, preferably once every 4 weeks over a period of at least one year intradermally or subcutaneously to a patient or a specifically determined group of patients with at least one identical HLA allele.
  • a pharmaceutical composition in which at least one HLA tumor antigen peptide has at least one mutation with respect to the wild type of the HLA tumor antigen peptide which leads to an increase in the affinity, preferably to ⁇ 500 nm, very particularly preferably ⁇ 50 nm of the specific binding affinity for the T cell receptor (K D value) of the HLA tumor antigen peptide treated individual compared to the wild type of the HLA antigen peptide, show particularly advantageous effects in the treatment of breast cancer.
  • the pharmaceutical composition is used for the treatment of breast / breast carcinomas as monotherapy or in combination with other known therapies and / or compounds for the treatment of breast / breast carcinomas.
  • the pharmaceutical composition is administered as a first-line therapy to the patient or group of patients with at least one identical HLA allele (so-called adjuvant monotherapy).
  • the patient or patient group to be treated with the pharmaceutical composition with at least one identical HLA allele has already received at least one standard therapy method (e.g. at least one operation, radiation, chemotherapy and / or hormone therapy) in advance.
  • at least one standard therapy method e.g. at least one operation, radiation, chemotherapy and / or hormone therapy
  • the breast cancer to be treated is particularly preferably a hormone-positive, HER2 / neu or triple negative breast cancer.
  • the present invention also includes HLA tumor antigen peptides corresponding to the MHC class I complexes or MHC class II complexes, in particular for use in the treatment or profiling of breast carcinomas in a patient or a group of patients who / who has or is suspected of having a breast / breast cancer or for a
  • HLA tumor antigen peptides from the group consisting of the in SEQ ID No. 13 to 35 and SEQ ID No. 36 to 48, in particular those in SEQ ID No. 13 to SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 29 and SEQ ID No. 32 to SEQ ID No. 48 or which have at least one mutation, preferably an amino acid exchange, compared to one of these amino acid sequences.
  • HLA tumor antigen peptides in a method for the treatment of breast carcinomas, in particular locally recurring or metastatic breast carcinomas in a patient or a group of patients with at least one identical HLA allele, is particularly preferred, the method comprising administering / applying a treatment regime to the Patient or the patient group comprises a pharmacologically effective amount of at least one of the aforementioned HLA tumor antigen peptides.
  • the immune system of the individual to whom the HLA tumor antigen peptides or the pharmaceutical composition is administered is still fully functional and thus easier to train, it is advantageous if the individual has not yet received any radiation, chemotherapy and / or hormone therapy against the Has received breast cancer, particularly locally recurrent or metastatic breast cancer and / or has not received previous adjuvant chemotherapy in recurrence for 12 months or less since the last dose of a chemotherapeutic agent.
  • HLA-A antigen peptides and HLA-A neoantigen peptides A) HLA-A antigen peptides and HLA-A neoantigen peptides
  • HLA-A tumor antigen peptide corresponding to the MHC class I complexes is defined herein as an "HLA antigen peptide of the invention or" amino acid sequence of the invention (as defined herein), which comprises: a) an amino acid sequence consisting of 7 up to 1 1 amino acids; and / or b) a neoantigen peptide with an amino acid sequence consisting of 7 to 11
  • Amino acids that i) analogously to at least one on the cell surface of cells from malignant
  • HLA-A antigen peptide a polypeptide having at least one amino acid substitution in its amino acid sequence compared to the wild type of this HLA-A neoantigen peptide (so-called "HLA-A neoantigen peptide" ) and iii) has at least a 3-fold increased specific affinity for the T cell receptor of the body's own T cells
  • Neoantigen peptides which in their amino acid sequence have at least one amino acid exchange in amino acid positions 1 (N-terminus), 2, 7/8 and / or the C-terminus compared to the wild type of this HLA-A antigen peptide, at least 4-fold, especially preferably at least 5-fold, very particularly preferably at least 8-fold increased specific affinity (K D ) for the T cell receptor of the body's own T cells and are therefore particularly preferably used for the composition according to the invention.
  • the amino acid exchange in the amino acid sequence of the HLA-A antigen peptide is particularly preferably a single amino acid exchange in the amino acid position 1 (N terminus), 2, 7/8 or the C terminus.
  • the amino acid exchange in the amino acid sequence of the HLA-A neoantigen compared to the wild type of this HLA-A antigen peptide is preferably a C / Y, A / V, D / Y, E / K, P / L, N / D or T / M exchange.
  • the HLA-A peptide or the HLA-A neoantigen preferably has a specific activity (K D ) against the T cell receptor which, by any suitable detection method known to the person skilled in the art, is less than 100 nM, particularly preferably less than 75 nM or very particularly preferably less than 50 nM, such as, for example, less than 40 nM, 35 nM, 30 nM, 25 nM or 20 nM.
  • the HLA-A tumor antigen peptide or the HLA-A neoantigen is preferred in the pharmaceutical composition according to the invention with a concentration, as defined above, of at least 100 to 600 pg, alternatively preferably in absolute
  • HLA-A tumor antigen peptides or HLA-A neoantigens are preferably selected as defined above under point (b).
  • an “HLA-A neoantigen peptide” is preferred which comprises the following framework sequence:
  • Has sequence identity or similarity to the native HLA-A antigen peptide such as at least 85%, particularly preferably at least 90% sequence identity (as defined herein) with an amino acid sequence selected from the group of SEQ ID NO:
  • HLA-A tumor antigen peptide and one HLA-A, HLA-B and / or HLA-C tumor antigen peptide and / or corresponding neoantigens consist of these, in which the HLA
  • Antigen peptides are optionally connected to one another by suitable linkers (so-called oligopeptides).
  • HLA-A tumor antigen peptides as defined under (b), (d) and (e) are very particularly preferred.
  • the HLA-A tumor antigen peptides are preferably defined as described under (a) or (d). In the event that the HLA-A
  • Tumor antigen peptides and / or neoantigens, as defined under (e), are connected to one another via a linker, suitable linkers are known to the person skilled in the art from the prior art.
  • Peptide sequences consisting of HLA tumor antigen peptides and / or HLA neoantigens have the further advantage that the longer amino acid sequences of the compounds, constructs, proteins or polypeptides cause a longer residence time in the tissue of the test subject after application, the compounds, constructs, proteins or polypeptides after application to the test person, for example by endogenous enzymes in smaller fragments (pharmaceutically active form, comprising at least 7 to 1 1
  • Amino acids which have a biologically desired function within the meaning of the invention can be broken down. This means that the individual fragments of the oligopeptide have an activity as HLA-A, HLA-B or HLA-C tumor antigen peptides and thus contribute to the activation of T cells.
  • any HLA-A peptide sequence can be a humanized and / or sequence-optimized sequence, as further described herein.
  • HLA-B antigen peptide is defined herein as an "HLA-B antigen peptide of the invention or" amino acid sequence of the invention (as defined herein) that comprises: a) an amino acid sequence consisting of 12 to 17 amino acids; and / or b) a neoantigen peptide with an amino acid sequence consisting of 12 to 17
  • HLA-B antigen peptide a polypeptide having at least one amino acid replacement in its amino acid sequence compared to the wild type of this HLA-B antigen peptide (so-called "HLA-B neoantigen peptide" ) and iii) has at least a 3-fold increased specific affinity for the T cell receptor of the body's own T cells
  • HLA-B neoantigen peptides which have at least one amino acid exchange in amino acid positions 3, 8 and / or 10 in their amino acid sequence compared to the wild type of this HLA-B antigen peptide, at least 4-fold, particularly preferably at least 7 -fold increased specific affinity for the T cell receptor of the body's own T cells and are therefore particularly preferably used for the formulation according to the invention.
  • the amino acid exchange in the amino acid sequence of the HLA-B antigen peptide is particularly preferably a single amino acid exchange in the amino acid position 3, 8 or 10.
  • the amino acid exchange in the amino acid sequence of the HLA-B neoantigen compared to the wild type of this HLA-B antigen peptide is preferably an E / A, E / K, R / W or D / A
  • the HLA-B antigen peptide or the HLA-B neoantigen peptide preferably has a specific activity (K D ) with respect to the T cell receptor, which is achieved by any suitable
  • Detection methods known to the person skilled in the art from less than 100 nM, particularly preferably less than 75 nM or very particularly preferably less than 50 nM, such as less than 40 nM, 35 nM, 30 nM,
  • composition according to the invention with a concentration, as defined above, of at least 100 to 600 pg, alternatively preferably in absolute
  • HLA-B peptides or HLA-B neoantigens are preferably selected as defined above under point b).
  • an “HLA-B neoantigen” is preferred, which comprises the following framework sequence:
  • amino acid sequence with an amino acid sequence which is at least 80%, such as at least 85%, particularly preferably at least 90% sequence identity (as defined herein) with an amino acid sequence selected from the group of SEQ ID NO: 6, 7, 8, 20 , 21, 22 and 35; and or
  • Amino acid substitution with respect to the amino acid sequence (s) selected from the group of SEQ ID Nos .: 6, 7, 8, 20, 21, 22 and 35 comprises or consists essentially thereof; and or
  • HLA-B tumor antigen peptide and one HLA-A, HLA-B and / or HLA-C tumor antigen peptide and / or corresponding neoantigens consist of these, in which the HLA
  • Antigen peptides are optionally connected to one another by suitable linkers (so-called oligopeptides).
  • HLA-B peptides as defined under (a), (c) and (d) are very particularly preferred.
  • the HLA-B peptides are preferably defined as described under (a) or (c).
  • suitable linkers are known to the person skilled in the art from the prior art.
  • Peptide sequences consisting of HLA tumor antigen peptides and / or HLA neoantigens have the further advantage that the longer amino acid sequences of the compounds, constructs, proteins or polypeptides cause a longer residence time in the tissue of the test subject after application, the compounds, constructs, proteins or polypeptides after application to the test person, for example by endogenous enzymes in smaller fragments (pharmaceutically active form, comprising at least 7 to 1 1
  • Amino acids which have a biologically desired function within the meaning of the invention can be broken down. That is, the individual fragments of the oligopeptide have an activity as HLA-A, HLA-B or HLA-C tumor antigen peptides and thus contribute to the activation of T cells.
  • any HLA-B peptide sequence can be a humanized and / or sequence-optimized sequence, as further described herein.
  • HLA-C antigen peptides and HLA-C neoantigen peptides
  • HLA-C antigen peptide is defined herein as an“ HLA antigen peptide of the invention or “amino acid sequence of the invention (as defined herein), which comprises: a) an amino acid sequence consisting of 8 to 11 amino acids; and / or b) a neoantigen peptide with an amino acid sequence consisting of 8 to 11
  • Amino acids that i) analogously to at least one on the cell surface of cells from malignant
  • HLA-C antigen peptide a protein derived from human cells
  • neoplastic tissue in particular of breast / breast carcinoma
  • HLA-C antigen peptide at least one amino acid exchange in its amino acid sequence compared to the wild type of this HLA-C peptide (so-called "HLA-C neoantigen peptide” ) and iii) has at least a 3-fold increased specific affinity for the T cell receptor of the body's own T cells
  • HLA-C neoantigen peptides which in their amino acid sequence compared to the wild type of this HLA-C antigen peptide have at least one amino acid exchange in amino acid positions 1 (N-terminus), 4 and / or the C-terminus, at least one Have 4-fold, particularly preferably at least 5-fold, very particularly preferably at least 7-fold increased specific affinity for the T cell receptor of the body's own T cells and are therefore used with particular preference for the formulation according to the invention.
  • the amino acid exchange in the amino acid sequence of the HLA-C antigen peptide is particularly preferably a single amino acid exchange in amino acid position 1 (N terminus), 4 or the C terminus.
  • amino acid exchange in the amino acid sequence of the HLA-C is preferred
  • Neoantigen peptide versus the wild type of this HLA-C antigen peptide has a C / Y, A / P, L / F or T / M exchange.
  • the HLA-C antigen peptide or the HLA-C neoantigen peptide preferably has a specific activity (K D ) with respect to the T cell receptor, which is achieved by any suitable
  • Detection methods known to the person skilled in the art from less than 100 nM, particularly preferably less than 75 nM or very particularly preferably less than 50 nM, such as less than 40 nM, 35 nM, 30 nM,
  • the HLA-C tumor antigen peptide or the HLA-C neoantigen is preferred in the pharmaceutical composition according to the invention with a concentration, as defined above, of at least 100 to 600 pg, alternatively preferably in absolute terms
  • HLA-C antigen peptides or HLA-C neoantigen peptides are preferably selected as defined above under point b).
  • an “HLA-C neoantigen peptide” is preferred, which comprises the following framework sequence:
  • Amino acid substitution with respect to the amino acid sequence (s) selected from the group of SEQ ID NOS: 9 to 12 and 23 to 26 comprises or consists essentially thereof; and or
  • HLA-C tumor antigen peptide identical or different peptide sequences of at least one HLA-C tumor antigen peptide and one HLA-A, HLA-B and / or HLA-C tumor antigen peptide and / or corresponding neoantigens consist of these, in which the HLA
  • Antigen peptides are optionally connected to one another by suitable linkers (so-called oligopeptides).
  • HLA-C peptides as defined under (a), (c) and (d) are very particularly preferred.
  • the HLA-C antigen peptides are preferably defined as described under (a) or (c).
  • suitable linkers are known to the person skilled in the art from the prior art.
  • Peptide sequences consisting of HLA tumor antigen peptides and / or HLA neoantigens have the further advantage that the longer amino acid sequences of the compounds, constructs, proteins or polypeptides cause a longer residence time in the tissue of the test subject after application, the compounds, constructs, proteins or polypeptides after application to the test person, for example by endogenous enzymes in smaller fragments (pharmaceutically active form, comprising at least 7 to 1 1
  • Amino acids which have a biologically desired function within the meaning of the invention can be broken down. This means that the individual fragments of the oligopeptide have an activity as HLA-A, HLA-B or HLA-C tumor antigen peptides and thus contribute to the activation of T cells.
  • any HLA-C antigen peptide sequence can be a humanized and / or sequence-optimized sequence, as further described herein.
  • HLA antigen peptide of class lt ' is defined herein as an“ HLA peptide of the invention ”or“ amino acid sequence of the invention (as defined herein), which comprises the following: a) an amino acid sequence consisting of 13 to 20 amino acids, particularly preferably 13 up to 17 amino acids; and / or b) a neoantigen with an amino acid sequence consisting of 13 to 20 amino acids, particularly preferably 13 to 17 amino acids, the following: a) an amino acid sequence consisting of 13 to 20 amino acids, particularly preferably 13 up to 17 amino acids; and / or b) a neoantigen with an amino acid sequence consisting of 13 to 20 amino acids, particularly preferably 13 to 17 amino acids, the
  • HLA neoplastic tissue in particular of breast / breast carcinoma
  • / or neoplastic tissue in particular of breast / breast carcinoma
  • the exposed HLA peptide of class II is the exposed HLA peptide of class II, and ii) at least one amino acid substitution in its amino acid sequence compared to the wild type of this HLA peptide of class II (so-called "HLA neoantigen of Class lf ') and
  • HLA neoantigens of class II which in their amino acid sequence compared to the wild type of this HLA peptide of class II, are particularly preferred in amino acid positions 3, 6, 10, 12, 13 and / or 14 the amino acid positions 12 and / or 14, have an at least 4-fold increased specific affinity for the T cell receptor of the body's own T cells and are therefore used with particular preference for the formulation according to the invention.
  • amino acid exchange in the amino acid sequence of the HLA peptide of class II is particularly preferably a single amino acid exchange in amino acid position 12 or 14.
  • the amino acid exchange in the amino acid sequence of the HLA neoantigen of class II compared to the wild type of this HLA peptide of class II is an E / K, E / A, D / Y or T / M exchange.
  • the HLA peptide of class II or the HLA neoantigen of class II preferably has a specific activity (K D ) against the T cell receptor, which can be determined by any suitable detection method known to the person skilled in the art from the prior art less than 100 nM, particularly preferably less than 75 nM or very particularly preferably less than 50 nM, such as less than 40 nM, 35 nM, 30 nM,
  • composition according to the invention with a concentration, as defined above, of at least 100 to 600 gg, alternatively preferably in absolute
  • HLA peptide (s) of class II or HLA neoantigen (s) of class II are preferably selected as defined above under point b).
  • an “HLA neoantigen of class II” is preferred, which comprises the following framework sequence:
  • a neoantigen having an amino acid sequence which has at least 80%, such as at least 85%, particularly preferably at least 90% sequence identity (as defined herein) an amino acid sequence selected from the group of SEQ ID NO: 36 to 48; exhibit; and or
  • HLA peptide sequences of class II exist, in which the HLA antigen peptides of class II are connected to one another by suitable linkers (so-called oligopeptides).
  • Class II antigen peptide sequence and an HLA class II antigen peptide sequence, HLA-A, HLA-B and / or HLA-C antigen peptide sequence and / or corresponding neoantigens consist of these, in which the HLA antigen peptides are optionally linked by suitable linkers (so-called oligopeptides ).
  • HLA antigen peptides of class II as defined under (a), (c) and (d) are very particularly preferred.
  • the HLA antigen peptides of class II are preferably defined as described under (a) or (c). In the event that the HLA
  • Class II tumor antigen peptides and / or corresponding neoantigens, as defined under (d), are linked to one another via a linker, then suitable linkers are known to the person skilled in the art from the prior art.
  • Peptide sequences consisting of HLA tumor antigen peptides and / or HLA neoantigens have the further advantage that the longer amino acid sequences of the compounds, constructs, proteins or polypeptides cause a longer residence time in the tissue of the test subject after application, the compounds, constructs, proteins or polypeptides after application to the test person, for example by endogenous enzymes in smaller fragments (pharmaceutically active form, comprising at least 7 to 1 1
  • Amino acids which have a biologically desired function within the meaning of the invention can be broken down. That is, the individual fragments of the oligopeptide have an activity as HLA-A, HLA-B or HLA-C tumor antigen peptides and thus contribute to the activation of T cells.
  • any HLA peptide sequence of class II can be a humanized and / or sequence-optimized sequence, as further described herein.
  • HLA tumor antigen peptides of class II for the treatment of breast cancer has the significant advantage that B cells are also activated in a targeted manner in the test subject to be treated.
  • HLA tumor antigen peptides of class II has the further advantage that HLA antigen peptides, which have a longer amino acid sequence compared to HLA tumor antigen peptides of class I, are broken down into smaller fragments (comprising at least 7 to 1 fragments) after application to the test subject, for example by endogenous enzymes 1 amino acids), which have an activity as HLA-A, HLA-B or HLA-C antigen peptides and thus contribute to the activation of T cells.
  • fragment is meant a portion of a polypeptide that is preferably at least 10%, 20%, 30%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% or more of the total Contains length of the reference polypeptide.
  • a fragment can contain 7, 8, 9, 10, 11 or more amino acids.
  • amino acid sequences and polypeptides of the invention are preferred as defined in the claims and those in which: at least one HLA tumor antigen peptide analogous to at least one on the cell surface of cells from malignant and / or neoplastic tissue of the tissue to be treated
  • Amino acid sequence has at least one amino acid exchange compared to the wild type of this HLA tumor antigen peptide (i.e. HLA neoantigen peptide) and compared to the wild type of this HLA tumor antigen peptide has at least a 3-fold increased specific affinity for the T cell receptor of the body's own T cells.
  • HLA neoantigen peptide i.e. HLA neoantigen peptide
  • the pharmaceutical composition according to the invention therefore preferably comprises at least six, very particularly preferably at least eight, very particularly preferably ten of the aforementioned HLA tumor antigen peptides corresponding to the MHC complexes of class I and / or II.
  • a monovalent amino acid sequence (or a polypeptide which comprises only one amino acid sequence of the invention) which is used in the invention is preferably such that it binds to a T cell receptor of the body's own T cells with a compared to the corresponding wild-type Binding HLA peptide sequence 3-fold increased specific affinity.
  • HLA-A, HLA-B and / or HLA-C tumor antigen peptides and / or corresponding neoantigen peptides in a single polypeptide of the invention have unique binding properties (cf. FIG. 3).
  • KD specific activity of the polypeptides of the invention which contain more than one component of the amino acid sequence of HLA-A, HLA-B and / or HLA-C
  • Tumor antigen peptides and / or neoantigen peptides corresponding to the MHC complexes of class I or II are determined by one of the detection methods described above / below, the compounds, constructs, proteins or polypeptides of the invention preferably having a specific activity that corresponds to the specific activity of each of their constituents, ie a specific activity that is similar to the specific activity of each of the (individual components of) Class I or II amino acid sequences contained in the compounds, constructs, proteins or polypeptides of the invention.
  • Some specific, but non-limiting examples of the preferred compounds, constructs, proteins or polypeptides mentioned above are compounds, constructs, proteins or polypeptides which either i) a wild-type HLA tumor antigen peptide corresponding to the MHC complexes of class I (HLA-A, HLA -B or HLA-C peptide) and / or II; or ii) a neoantigen corresponding to the MHC complexes of class I (HLA-A, HLA-B or HLA-C neoantigen) and / or II with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 48 are selected; or
  • neoantigen corresponding to the MHC complexes of class I HLA-A, HLA-B or
  • HLA-C neoantigen HLA-C neoantigen
  • / or II with an amino acid sequence which has at least 80% sequence identity (as defined herein) with an amino acid sequence selected from the group of SEQ ID NO: 1 to 48; or
  • Amino acid sequence selected from the group of SEQ ID NO: 1 to 48 comprises or consists essentially thereof; or
  • HLA antigen peptide sequences exist, in which the HLA peptides are optionally connected to one another by suitable linkers; or a suitable combination thereof.
  • HLA tumor antigen peptides corresponding to the MHC complexes of class I and II can be used and are effective for the treatment of a cancer disease, as disclosed herein, in particular for the treatment of breast carcinomas.
  • the HLA tumor antigen peptide (in each case) is in the form of a single-membered amino acid sequence, i. not as an element of compounds, constructs, proteins or polypeptides which consist of at least two identical or different amino acid sequences for HLA tumor antigen peptides / neoantigens, in which the HLA tumor antigen peptides / neoantigens are connected to one another by suitable linkers.
  • the HLA tumor antigen peptides of the invention have specific activity against T cell receptors (T cells are used for this) which can be determined by any suitable detection method known to those skilled in the art is known, as can be determined, for example, using EliSpot AlphaScreen detection methods (as described herein) or cell-based detection methods (as described herein).
  • the blocking activity is preferably determined using a cell-based detection method, as described, for example, in exemplary embodiments 3 and 4.
  • Invention which comprise an amino acid sequence of an HLA antigen peptide of the invention and belong to MHC class I (as defined herein), preferably having a specific affinity of 10 to 50 nM for the corresponding T cell receptor.
  • amino acid sequence of the invention is attached to two or more MHC complexes of class I or II, epitopes,
  • MHC complexes, epitopes, components, domains or subunits of an MHC complex to which the amino acid sequences and / or polypeptides of the invention bind can be substantially the same or different (and in the latter case the amino acid sequences and polypeptides can of the invention to such different complexes, epitopes, components, domains or subunits of an MHC complex of class I or II including combinations thereof with an affinity and / or specificity which may be the same or different).
  • polypeptides of the invention will generally bind to any naturally occurring or synthetic analogs, variants, mutants, components and fragments of an MHC complex of Class I or II, respectively. Even in such a case, the amino acid sequences and polypeptides of the invention can bind to such analogs, variants, mutants, alleles, components and fragments with an affinity and / or specificity that corresponds to the affinity and specificity with which the amino acid sequences of the invention are bound to the wild types of MHC complexes of class I or II bind the same or different.
  • amino acid sequences and polypeptides of the invention bind to some analogs, variants or mutants of an MHC complex of class I or II, but not to others.
  • compounds, constructs, proteins or polypeptides comprising an HLA tumor antigen peptide of the invention may have an increased half-life in serum compared to the amino acid sequence from which they were derived.
  • an amino acid sequence of this invention can (chemically or otherwise) with one or more groups or units which extend the half-life (such as for example PEG), so that they are a derivative of an amino acid sequence of the invention with an increased half-life.
  • the compounds or polypeptides of the invention with increased half-life preferably have a half-life that is at least 1.5 times, preferably at least 2 times, such as at least 5 times, for example at least 10 times or more than 20 times higher is called the half-life of the corresponding
  • the compounds or polypeptides of the invention with increased half-life have a half-life that is more than 1 hour, preferably more than 2 hours, more preferably more than 6 hours, such as more than 12 hours or even more than 24, 48 or 72 hours is higher compared to the corresponding amino acid sequence of the invention per se.
  • an HLA tumor antigen peptide of the invention (or a compound, construct, or polypeptide comprising the same) is intended for administration to a patient (e.g., for therapeutic and / or diagnostic purposes, as defined herein)
  • a patient e.g., for therapeutic and / or diagnostic purposes, as defined herein
  • this is preferred either an amino acid sequence that is not naturally occurring in the patient; or, if this occurs naturally in the patient, it is in a substantially isolated and at the same time concentrated form (as defined herein).
  • Constructs and polypeptides comprising the same) directed against a human T cell receptor including combinations thereof as defined in the claims; wherein, for veterinary purposes, the polypeptides of the invention are preferably directed against a T cell receptor including combinations thereof (as defined in the claims) from the species to be treated or at least cross reactive with a T cell receptor including combinations thereof of those to be treated Species are.
  • the breast carcinoma to be treated is preferably a hormone-positive,
  • the present invention also includes a method for determining pharmaceutically effective HLA tumor antigen peptides for use in the treatment or for profiling of breast / breast carcinomas or in a pharmaceutical according to the invention
  • a composition comprising the method monitoring a tissue section of a patient or a group of patients who is suffering from a breast / breast cancer or is suspected of having a breast / breast cancer, the method comprising the following steps:
  • tissue sample from a tissue section, preferably a breast carcinoma of the patient or group of patients, wherein the cells of the tissue sample express MHC complexes of class I and / or II and these are presented on their surface, the said
  • Method step (a) of providing the tissue sample itself does not involve any surgical intervention in the patient or one of the patients
  • Patient group includes;
  • transcriptome of the tissue sample provided for determining all DNA sequences transcribed in mRNA sequences and for
  • the specific HLA haplotype preferably including the HLA haplosubtypes of the patient or the patient group, and very particularly preferably in relation to the MHC class I complexes, and optionally deriving the preferred anchor positions of the MHC class I complexes (as defined herein);
  • HLA antigen peptides to the patient or the patient group is prevented (obtaining a healthy Tissue sample of the patient or the patient group can take place, for example, by taking a blood sample with nucleated cells);
  • step (iii) the ligandome for determining the HLA tumor antigen peptides determined in step (iii) that are presented on the surface of the cells of the breast carcinoma
  • HLA antigen peptides which are presented on the surface of cells of a healthy tissue sample of the patient or the patient group;
  • Tumor antigen peptides compared to the corresponding MHC complex of class I and / or II, which is expressed in the cells of the tissue sample, preferably a breast carcinoma, and presented on the surface of these cells, using a database and / or a ranking algorithm; and or
  • step (iv) optionally the immunogenicity of the HLA tumor antigen peptides determined in step (iv) by means of an immunogenicity test, in particular by means of Western blot, ELISA techniques, in particular by means of ELISPOT, AFM or immunodetection with microscopic analysis;
  • HLA tumor antigen peptides preferably at least 4 to 8 HLA-A tumor antigen peptides corresponding to the MHC class I complexes and at least 2 antigen peptides corresponding to the MHC class II complexes which meet the criteria according to the in step (b ) meet defined parameters and which are expressed in the cells of the tissue sample provided and presented on the surface of these cells.
  • the method for determining pharmaceutically active HLA tumor antigen peptides takes place immediately after the provision of the Tissue sample of the patient or the patient group in step (a) the examination of the genes BRCA1 and BRCA2 for the presence of mutations.
  • the determination of whether the HLA tumor antigen peptides are presented on the surface of the cells of the tissue sample provided in step a) of the patient or of the patient group takes place by means of ultra-high-performance liquid chromatography (UHPCL) in conjunction with ESI mass spectrometry (MS).
  • UHPCL ultra-high-performance liquid chromatography
  • MS ESI mass spectrometry
  • the method for determining an HLA peptide of class I and / or II in step (b) comprises creating a transcriptome of the
  • the transcriptome is preferably created by means of RT-PCR, with a DNA microarray or DNA sequencing subsequently being carried out.
  • the method for determining an HLA antigen peptide of class I and / or II in step (b) particularly preferably comprises the creation of an exome sequencing for this
  • the method for determining a pharmaceutically active HLA tumor antigen peptide of class I and / or II in step (b) includes the alignment of the determined amino acid sequences of the HLA antigen peptides corresponding to the MHC complexes of class I and / or II a series, collection or library of
  • T-cell receptor of the body's own T-cells
  • content factors for tumor progression such as invasiveness, Angiogenesis, but also the escape mechanisms of the tumor against the immune attack.
  • the method also includes comparing the determined parameters
  • Amino acid sequences an appropriate set, collection or library of
  • the range, collection, or library of Amino acid sequences a series, collection or library of HLA tumor antigen peptides and / or MHC complexes of class I and class II (as described herein), such as, for example, a native series, collection or library of HLA tumor antigen peptides and / or MHC complexes Be class I and class II; a synthetic or semisynthetic series, collection or library of HLA tumor antigen peptides and / or MHC complexes of Class I and Class II and / or a series; a collection or library of HLA tumor antigen peptides and / or MHC class I and class II complexes that have undergone affinity maturation.
  • the determination method according to the invention determines an immunogenicity test, in particular by means of Western blot, ELISA techniques, in particular by means of ELISPOT, AFM or immunodetection with microscopic analysis.
  • the present invention also comprises a method for determining the regression, the course or the occurrence of a disease of a breast / breast carcinoma, comprising the monitoring of a tissue section, in particular a breast tissue of a patient who is sick with or is suspected of having a breast / breast carcinoma stands to develop breast cancer, the method comprising the following steps:
  • Tissue sample express HLA complexes of class I and / or II and present on their cell surface;
  • immunogenicity of the determined HLA-A antigen peptides and the class II antigen peptides by means of an immunogenicity test (e.g. by means of Western blot, ELISA techniques, in particular by means of ELISPOT or immunodetection with microscopic analysis);
  • step (c) Matching the determined amino acid sequences of the HLA antigen peptides with a series, collection or library of amino acid sequences on amino acid sequences which are linked to MHC class I complexes or MHC class II complexes, including combinations thereof, determined in step (i) , bind or have an affinity for it.
  • Another, in particular, cost-reduced aspect of the method according to the invention for determining at least one HLA tumor antigen peptide corresponding to the MHC complexes of class I and / or II for a pharmaceutical composition according to the invention provides that only (ie without prior creation of a transcriptome, exome sequencing) the HLA -Tumor antigen peptides of the class I and / or II are determined, which are on the cell surface of cells from malignant and / or
  • neoplastic tissue of the individual to be treated are exposed to neoplastic tissue of the individual to be treated (so-called determination of the ligandome).
  • the procedure consists of the following steps:
  • sequence and / or the sequence combination is an HLA tumor antigen peptide corresponding to the MHC class I complexes and / or MHC class II complexes or a combination of HLA tumor antigen peptides thereof, and the individual sequences from the sequences of a database with nucleic acids can be selected.
  • a pharmaceutical composition is to be understood here as a so-called informatics that can be administered to a patient or a group of patients with at least one identical HLA allele and that contains the inventive combination of HLA tumor antigen peptides in the concentration disclosed herein, an HLA tumor antigen peptide having a Represents information carrier.
  • the in vitro or in vivo loading of MHC class I complexes or MHC class II complexes of the tumor cells with the HLA tumor antigen peptides of the pharmaceutical composition according to the invention which have an identical or slightly modified amino acid sequence with HLA tumor antigen peptides , or the contacting of T cells with these HLA tumor antigen peptides, tumor cells sensitive to the lysis of the tumor cells of the tissue or the tissue section by specific cytotoxic or specifically activated T lymphocytes.
  • the primary aim of the present invention is not the in vitro or in vivo loading of tumor cells with HLA tumor antigen peptides, but the targeted activation and training of the immune system, in particular of T cells and B cells
  • the pharmaceutical composition according to the invention is preferably subcutaneous or intradermal and, preferably im
  • Tumor cells that present these HLA tumor antigen peptides on their surface, recognize and lyse.
  • the method according to the invention therefore has the advantage that in the event that the signals that the tumor sends out to the immune system are too weak (passive) or that the tumor actively releases substances that promote its growth (stimulate macrophages) (active e.g. TREX or BD1 start up), the immune system, especially the T cells, can be trained for the presence of the tumor, even if the signals sent by the tumor are too weak.
  • the signals that are sent out by the tumor are too weak when the HLA antigen peptides are presented on the
  • the cell surface of the tumor cells is small or decreases in response to cytotoxic T cell attacks (escape mechanism).
  • an HLA antigen peptide is an HLA tumor antigen peptide if it is a tumor-exclusive (i.e. HLA antigen peptide that is exclusively expressed and / or exposed by tumor cells; a cancer testis antigen (CTA), which in the
  • Tumor-exclusive H LA antigen peptides are mutated HLA antigen peptides that arise, for example, from a mutation of a gene, the mutation of the gene for the
  • Tumor growth is causative and / or related to oncogenesis.
  • the mutated gene product in the tumor is specific for the individual patient or a certain group of patients with at least one identical HLA allele.
  • Tumor-associated HLA antigen peptides include non-mutated HLA antigen peptides that, in the adult stage, only occur in some tissues of the patient or a specific tissue
  • Tolerance immune tolerance
  • HLA antigen peptides that are only associated with tumors.
  • An immunogenic HLA tumor antigen peptide is also referred to herein as an “epitope”.
  • the MHC complexes corresponding to the tumor-associated HLA antigen peptides are associated with the proliferation, invasiveness, angiogenesis and an increase in the cytokeratin production of the breast carcinoma.
  • the person skilled in the art is familiar with corresponding databases and literature in which these effects are listed (e.g. the databases of the National Center for Biotechnology Information (NCBI)).
  • the at least one HLA tumor antigen peptide in the context of the present invention is especially formulated for subcutaneous administration.
  • composition therefore denotes the provision of at least one HLA tumor antigen peptide and an adjuvant in a pharmaceutical formulation that enables good applicability and includes solutions, in particular injection solutions and infusion solutions, concentrates for the production of injection and infusion preparations, powder for the production of injection and infusion preparations Infusion preparations and subcutaneous implants.
  • compositions are prepared by adding the determined HLA tumor antigen peptides in a carrier liquid (i.e. a pharmacologically acceptable vehicle), optionally with the addition of other auxiliaries such as wetting agents, dyes,
  • Permeation promoters are dissolved or suspended.
  • the carrier liquid is preferably from the group consisting of sodium chloride injection solution, Ringier's injection solution, isotonic dextrose, sterile water, Dextrose solution, Lactated Ringer's solution for injection, distilled water, or mixtures thereof, selected for local injection.
  • Preferred permeation promoters are dimethyl sulfoxide (DMSO),
  • composition water a pharmaceutically acceptable one
  • Saline and / or DMSO are suitable for application
  • compositions containing a mixture of about 30% DMSO and 70% water.
  • HLA tumor antigen peptide (corresponding to the MHC complexes) of the class, as used here, denotes a peptide sequence which is bound to the MHC complex (in humans to the HLA complex) of class I or is immunogenic.
  • the HLA protein complex of class I is used to present the antigen on the cell surface and comprises a heavy chain with 3 domains (a1, a2 and a3) and ß2-microglobulin (ß2M).
  • HLA tumor antigen peptide (corresponding to the MHC complexes) of class it‘ denotes a polypeptide sequence which is bound or immunogenic to the MHC complex (in humans to the HLA complex) of class II.
  • the HLA protein complex of class II is used for the antigen presentation on the cell surface and consists of two chains of almost the same size, an ⁇ -chain and a non-covalently bound ß-chain, each chain having two extracellular domains (a1 and a2 as well as ß1 and ß2 ).
  • polypeptides and pharmaceutical compositions of the present invention can be used in prevention and/or
  • cancer Treatment of breast cancer (also referred to herein as “cancer”).
  • cancer of the invention can be considered
  • Tumor antigen peptide or a pharmaceutical composition of the invention (and in particular a pharmaceutically effective amount thereof) to a subject (ie a person with the disease or disorder or at least one symptom thereof and / or who are at risk of contracting or developing such a disease or disorder).
  • a “peptide sequence” (e.g. an HLA antigen peptide) with a “native sequence” comprises in the sense of the present invention a peptide sequence with the same (i.e. unmodified) amino acid sequence as a peptide sequence naturally occurring in the patient.
  • Such a peptide sequence with a “native sequence” can be isolated from nature or produced recombinantly or synthetically.
  • the term peptide sequence having a "native sequence” specifically includes naturally occurring truncated or secreted forms of the peptide sequence (e.g., an extracellular domain sequence), natural
  • amino acid sequences used in the invention are individual variable FILA antigen peptide domains (“FILAs” or “FILA complex”).
  • FILAs individual variable FILA antigen peptide domains
  • FILA complex individual variable FILA antigen peptide domains
  • HLAs of the invention Amino acid sequences or regions within the amino acid sequence of a protein of the invention that are FILAs are also referred to herein as "HLAs of the invention.
  • neoantigen peptides i.e. FILA antigen peptides expressed and / or exposed exclusively by tumor cells
  • FILA antigen peptides which have less than 100% sequence identity or similarity to the native FILA antigen peptide
  • FILA antigen peptides which have less than 100% sequence identity or similarity to the native FILA antigen peptide are preferably distinguished in the context of the present invention by an amino acid exchange in the amino acid sequence.
  • amino acid exchange denotes the exchange of an amino acid for another amino acid within the
  • Percentage of sequence identity or identity or similarity with respect to this amino acid sequence is defined herein as the percentage of amino acid residues in the amino acid sequence of the polypeptide that are identical (i.e., same residue) or similar (i.e., amino acid residues from the same group based on common
  • the amino acid exchange for the HLA antigen peptide corresponding to the MHC complexes of class I and / or II comprises at least one D / Y, one C / Y, one A / V, one T / M , an I / O or a D / O exchange at any position within the amino acid sequence to the wild type of this HLA peptide.
  • amino acids used herein are generally accepted
  • the percentage of "sequence identity" between a first amino acid sequence and a second amino acid sequence can be calculated or determined by dividing the number of amino acids in the first amino acid sequence that correspond to the amino acids in the corresponding positions in the second Amino acid sequence are identical by dividing [the total number of amino acids in the first amino acid sequence] and multiplying by [100%], with any deletion, insertion, substitution or addition of an amino acid in the second amino acid sequence - compared to the first amino acid sequence - is considered to be a difference from a single amino acid (position).
  • An HLA tumor antigen peptide is "immunogenic" if the tumor cells expose on their cell surface at least one corresponding MHC class I complex and / or at least one corresponding MHC class II complex that recognizes and binds the HLA tumor antigen peptide, i.e. the HLA tumor antigen peptide has a high specific activity towards this MHC class I complex and / or MHC class II complex.
  • the immunogenicity of the HLA tumor antigen peptide can take place by means of Western blot, ELISA techniques, in particular by means of ELISPOT or immunodetection with microscopic analysis.
  • the HLA tumor antigen peptides of the present invention are preferably immunogenic and are therefore also referred to as immunogenic HLA tumor antigen peptides (“epitopes”).
  • the immunogenicity of the HLA tumor antigen peptides can be determined by suitable detection methods. Such methods are known to the person skilled in the art and / or are described herein.
  • TCR T cell receptor
  • the “specific affinity” of the HLA antigen peptide can also be determined via in silico
  • At least one HLA-A tumor antigen peptide is a tumor-exclusive HLA-A tumor antigen peptide (i.e. a cancer testis antigen (CTA) that is present in the healthy / normal tissue of the patient / the tumor-exclusive HLA-A tumor antigen peptide (i.e. a cancer testis antigen (CTA) that is present in the healthy / normal tissue of the patient / the tumor-exclusive HLA-A tumor antigen peptide (i.e. a cancer testis antigen (CTA) that is present in the healthy / normal tissue of the patient / the tumor-exclusive HLA-A tumor antigen peptide (i.e. a cancer testis antigen (CTA) that is present in the healthy / normal tissue of the patient / the tumor-exclusive HLA-A tumor antigen peptide (i.e. a cancer testis antigen (CTA) that is present in the healthy / normal tissue of the patient / the tumor-exclusive HLA-A tumor antigen peptide
  • Patient group no longer occurs or a so-called neoantigen peptide), and the specific binding affinity of the tumor-exclusive HLA-A tumor antigen peptide is determined compared to the corresponding MHC class I complex with a K D in the range of 10 to 50 nM, as determined with surface plasmon resonance .
  • tumor antigen peptides with a K D of ⁇ 50 nM are generally regarded as strongly binding and those with a K D between 50 and 500 nM as weakly binding tumor antigen peptides.
  • K D the K D value
  • Tumor antigen peptides that had a KD value in the range between 50 and 500 nM triggered effector cells (i.e. cytotoxic T cells), contrary to conventional / n-s /// co-binding prediction models, which considered them to be low-binding. It is therefore essential for the effectiveness of the tumor antigen peptides that the tumor antigen peptides are immunogenic.
  • active ingredient enhancer / adjuvant refers to an auxiliary substance that triggers and / or enhances the effect of the HLA peptides in the first place.
  • all conventional adjuvants known to the person skilled in the art are for the production of an inventive one
  • Montanide ISA 51 VG has proven to be particularly suitable.
  • this forms a so-called granuloma that advantageously stores the HLA peptides in the form of a reservoir at the site of application and releases them to the test subject's organism over a longer period of time. Therefore, weekly applications of the (medicament) formulation according to the invention are particularly advantageously dispensed with.
  • the (pharmaceutical) formulation for the treatment of cancer within the meaning of the invention must therefore preferably be applied only every 2 weeks, particularly preferably only once a month, when used over a longer period of time.
  • subject also referred to herein as “subject” or “patient”
  • subject refers to any mammal that is being treated for an abnormal physiological condition or has been diagnosed with a disease.
  • test person in the context of the present invention include mammals such as, for example, a rodent, a carnivore, an even-toed ungulate, an odd-toed ungulate or a primate.
  • the test subject is a human.
  • a “patient group” a group of individuals, preferably people, is always in question, who all have at least one, preferably at least two, very particularly preferably at least three identical HLA allele (s). It is permissible for the patients to be treated with the pharmaceutical composition to have received a standard therapeutic procedure (for example at least one operation, radiation, chemotherapy and / or hormone therapy).
  • the pharmaceutical composition can also be administered as a first-line therapy to the patient or the specifically determined patient group with at least one identical HLA allele.
  • the individual has not yet received chemotherapy for locally recurring or metastatic breast cancer and / or has not received any previous adjuvant chemotherapy in recurrence for 12 months or less since the last dose.
  • the individual particularly preferably has the haplotype with the subgroup A * 01 or A * 02.
  • a “haplotype” (an abbreviation for “haploid genotype”) is the sum of the
  • a certain haplotype can be individual, population or species-specific.
  • the transcriptome comprises the sum of all genes transcribed in a cell at a certain point in time, i.e. transcribed from the DNA sequence into mRNA sequences, i.e. the totality of all and the quantification of the individual mRNA molecules produced in a cell .
  • the creation of the transcriptome does not yet permit any statement about the “correctness” of the rewritten mRNA sequences.
  • the term “creating a transcriptome” in the present disclosure denotes the analysis of the transcriptome as the sum of all genes transcribed in a cell at a certain point in time, preferably using quantitative real-time (RT) PCR and a subsequent DNA microarray or subsequent DNA Sequencing.
  • the creation of the transcriptome of the tissue sample which is provided in step (a) of the determination method according to the invention, usually comprises the acquisition of more than 40,000 coding DNA sequences (raw data).
  • the exome is the entirety of the exons of an organism, i.e. all sections that potentially encode proteins. In humans, the exome comprises around 23,000 genes with around 50 million nucleobases. In Whole Exome Sequencing (WES), all exons, ie the sections in the genome that code for proteins, become one
  • Tissue section i.e. healthy tissue or tumor tissue of a subject
  • the genetic diagnosis focuses on this 1 -2% of the
  • the exome analysis accordingly includes the sequencing of the exome of the patient (and possibly other relatives), the evaluation of the sequence data and the
  • the proteome denotes the entirety of all proteins of at least one cell in a malignant or neoplastic tissue / tissue section or a cell compartment thereof, under exactly defined conditions and at a specific point in time.
  • the proteome of a cell can be determined by proteome sequencing and is linked to the genome of this cell via the transcriptome.
  • Immunotherapies are based on the fact that the individual mutation pattern (signature) of the tumor of each cancer patient is deciphered. On the profile of the individual mutation pattern (signature) of the tumor of each cancer patient is deciphered. On the profile of the individual mutation pattern (signature) of the tumor of each cancer patient is deciphered. On the profile of the individual mutation pattern (signature) of the tumor of each cancer patient is deciphered.
  • Mutation patterns are produced according to conventional treatment approaches for each individual patient, synthetic vaccines, for example on an RNA basis (i.e. vaccine production or production of the computer science according to the invention). These are then used for the individual treatment of the patient.
  • these novel vaccines are not suitable for other patients with the same tumor, but can only be used for the patient whose mutanom was previously used for the vaccine production or the production of the computer science according to the invention was analyzed. Therefore, it is an outstanding achievement of the inventors to have recognized that different patients have overlaps in the mutanoma of the malignant or neoplastic tissue / tissue section thereof. Different patients can advantageously be divided into uniform patient groups so that at least 50% of the HLA peptides of the formulation according to the invention have the mutanoma of
  • Patient group is compatible.
  • HLA HLA antigen peptides that are presented on the cell surface via MHC molecules. It is assumed that more than 10 5 HLA molecules are expressed on the cell surface and the number of identical HLA peptides presented can vary between a few and up to 10,000 copies per cell. As a result, approximately 10,000 different HLA peptides are presented in different proportions on a cell.
  • the ligandome is influenced by various physiological, intrinsic and pathological (e.g. cancer or necrosis) factors such as the cell type or tissue type, infection or transformation of the cell or simply the current state of the cell, which depends on the nutrient situation or external stress factors leads to changes in the HLA peptides presented.
  • physiological, intrinsic and pathological factors e.g. cancer or necrosis
  • pathological factors such as the cell type or tissue type, infection or transformation of the cell or simply the current state of the cell, which depends on the nutrient situation or external stress factors leads to changes in the HLA peptides presented.
  • the Edman degradation can be used to gain initial knowledge about the presented peptides.
  • the ligandome can be analyzed by using modern mass spectrometers in proteomics, with which it is possible to clearly determine the sequences of many individual ligands.
  • Two methods are used for the ionization of the peptides or proteins required here: electrospray ionization (ESI) and matrix-assisted laser desorption / ionization (MALDI). Coupling with an RP-HPLC system is common with ESI.
  • capillary electrophoresis (CE) was also used as an analytical separation method.
  • ESI mass spectrometry In ESI mass spectrometry, the direct coupling of HPLC and ESI interface enables the sample to be separated online, which in combination with an autosampler enables the measurement procedure to be fully automated. Because of the continuous flow of solvent from the HPLC, the samples can be measured in a relatively short time.
  • ESI mass spectrometry uses a wide range of instruments for analysis, such as quadrupole time-of-flight mass spectrometers, linear quadrupole ion traps, triple quadrupoles or ion trap-Orbitrap hybrid systems. This advantageously allows hundreds of HLA peptides to be identified in one measurement.
  • the expression “deriving a ranking” relates to the determination / selection of the quantity and the affinity of the HLA peptides which are exposed on the cell surface of the cells of the removed tissue (or a tissue section thereof).
  • a cumulative ranking for the HLA antigen peptides with regard to protein quality and specific affinity (K D ) for the T cell receptor of the body's own T cells is derived.
  • Protein quality especially content-related factors for tumor progress, such as invasiveness, angiogenesis, but also the escape mechanisms of the tumor in relation to the
  • a cumulative ranking system is used by the algorithm
  • a cumulative (predictive) ranking is used to eliminate sequences that
  • the highest-ranking sequence possibilities can be further qualified by their existence in a database of possible HLA antigen peptides with a high specific affinity for the endogenous T-cell receptors (as defined herein), which are predicted from sequence data, in particular one which is restricted to the organism / test person from which the HLA antigen peptide was obtained.
  • the highest ranking can be further qualified by their existence in a database of possible HLA antigen peptides with a high specific affinity for the endogenous T-cell receptors (as defined herein), which are predicted from sequence data, in particular one which is restricted to the organism / test person from which the HLA antigen peptide was obtained.
  • Sequence options through the separation coordinates of the HLA antigen peptide e.g. isoelectric point and molecular weight of a protein
  • Sequence options through the separation coordinates of the HLA antigen peptide e.g. isoelectric point and molecular weight of a protein
  • sequence options through the separation coordinates of the HLA antigen peptide e.g. isoelectric point and molecular weight of a protein
  • monomer composition can be further qualified.
  • HLA tumor antigen peptides synthetic or isolated HLA tumor antigen peptides, which were derived from the cumulative ranking for the production of the (drug) formulations of the present invention and for the production of the pharmaceutical composition (as so-called informatics), can in principle be used .
  • Another object of the present invention are also
  • Preferred pharmaceutical formulations are tablets, chewable tablets, chewing gum, coated tablets, capsules, drops, juices, syrups, suppositories, transmucal therapeutic systems, transdermal therapeutic systems, solutions, injections, emulsions, suspensions, easily reconstitutable dry preparations, powders or sprays.
  • Particularly preferred pharmaceutical formulations are injections or solutions.
  • the drug formulation is in a suitable application device, preferably as a lyophilisate in a syringe, which allows an in s / fu reconstitution with a pharmaceutically acceptable solution (e.g. saline solution).
  • a pharmaceutically acceptable solution e.g. saline solution
  • the (drug) formulations according to the invention are preferably suitable for oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrathecal, epidural, buccal,
  • compositions for parenteral administration can include, for example, excipients, sterile water, or
  • polyalkylene glycols such as polyethylene glycols, oils of vegetable origin, or hydrogenated naphthalenes.
  • Biocompatible, biodegradable lactide polymers, lactide / glycolide copolymers, or polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymers can be used to control the release of the compounds.
  • Other potentially useful parenteral delivery systems for the anti-prion therapeutic compounds include ethylene vinyl acetate copolymer particles, osmotic pumps, implantable infusion systems, and liposomes.
  • Invasiveness is the extent of the growth of a malignant tumor that penetrates tissue from its place of origin into adjacent tissue structures.
  • Angiogenesis describes the emergence of new blood vessels from an existing blood vessel system and is part of both physiological processes (e.g. embryogenesis, wound healing) and pathological processes (e.g. diabetic retinopathy, chronic polyarthritis, tumor growth). It has long been known that new blood vessels (angiogenesis) occur in cancer, which is known as tumor angiogenesis. Tumors are made up of cells that, like all other cells in the body, provide nutrients and
  • metastases When a tumor develops, it does not initially have its own blood vessels. Its growth is therefore severely restricted. Without its own blood vessels, it will not be larger than 1 to 2 millimeters. The formation of metastases also interacts with tumor angiogenesis, because tumor cells have to get into the surrounding blood vessels for this. Only then can they be transported to distant body regions and form metastases there.
  • HLA peptide of the invention or a composition or formulation containing the same can be used for modulating an HLA complex of Class I or II, including combinations thereof, either in vitro (e.g. in an in vitro or cellular
  • Detection method or in vivo (e.g. in a unicellular or in a multicellular organism and in particular in a mammal and very particularly in one
  • human beings such as in a human being at risk of or suffering from a cancer of the invention.
  • Modulating essentially the increase in the specific affinity of T cells towards a tumor-exclusive or tumor-associated MHC class I complex or MHC class II complex of the malignant and / or neoplastic tissue, such as on the basis of a suitable in vitro -, cellular or / nv / Vo detection methods measured (such as those mentioned herein).
  • modulating means increasing the specific affinity of the patient's or patient group's own T cells compared to a tumor-exclusive or tumor-associated MHC class I complex or MHC class II complex of the malignant and / or or neoplastic tissue, by at least 1%, preferably at least 5%, such as 10% or at least 25%, for example by at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80% or 90% or more compared to the affinity of T cells versus a tumor-exclusive or tumor-associated MHC class I complex or MHC class II complex of the malignant and / or neoplastic tissue in the same detection method among the same
  • Tumor antigen peptides of the pharmaceutical composition according to the invention (as defined herein).
  • the invention comprises the above-mentioned method, the expression profile of at least five, preferably at least six, very particularly of at least 6 marker genes, as shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 48, being determined.
  • the marker genes are also defined by variants, which in turn are shown in Tables 2 to 4.
  • This expression profile is preferably compared with the expression profile of a “reference”.
  • a reference can, for example, be the expression profile of healthy tissue (for example intestinal tissue or tissue of the liver, lungs, etc.) Individuals (test subjects) can be used, whereby it is known of this tissue that it is not proliferatively changed or even metastatic. Corresponding examples are shown in the experimental part of the invention. However, data from tissues from foreign individuals, preferably healthy people, can also be used as “reference” or “reference value”.
  • At least 6, but preferably at least 8, very particularly preferably at least 10 of the HLA antigen peptides shown here corresponding to the MHC class I complexes or MHC class I complexes should be used in the method for detecting a carcinoma (selected from the group of the polypeptides / polypeptide segments, as shown in SEQ ID Nos .: 1 to 48). Further embodiments can be found in the experimental section.
  • the present invention also includes a method of making a
  • composition according to the invention or a
  • Tumor antigen peptides corresponding to the MHC class II complexes the definition of each HLA tumor antigen peptide being the same as defined above;
  • the present invention also includes the use of the pharmaceutical composition according to the invention or the (medicament) formulation for the production of a medicament or a combination preparation for the treatment of malignancies, leukemia and neoplasms, in particular breast cancer.
  • the invention also encompasses a pharmaceutical composition which comprises an HLA peptide within the meaning of the invention and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • the invention also relates to an HLA antigen peptide or a neoantigen peptide of the invention for use in the preparation of a formulation (such as, for example, without limitation to a pharmaceutical formulation, as further described herein) for the treatment of cancer diseases, either in vitro (e.g. B. in an in vitro or cellular detection method) or in vivo (z. B. in a unicellular or multicellular organism and in particular in a mammal and especially in one
  • a formulation such as, for example, without limitation to a pharmaceutical formulation, as further described herein
  • human beings such as a human being at risk of or suffering from cancer of the inventions.
  • the present invention furthermore also comprises a combination preparation for use in the treatment of breast cancer with simultaneous, separate or sequential administration,
  • the combination preparation comprises the following two separate preparations (a) and (b):
  • a second preparation which, together with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent, an anti-cancer agent selected from the group consisting of anti-cancer alkylating agents, anti-cancer anti-metabolites, anti-cancer antibiotics, herbal anti-cancer drugs, platinum-coordinated anti-cancer complexes, anti-cancer camptothecin derivatives, anti-cancer tyrosine kinase inhibitors, Interleukins, biological response modifiers and other anti-cancer agents or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • an anti-cancer agent selected from the group consisting of anti-cancer alkylating agents, anti-cancer anti-metabolites, anti-cancer antibiotics, herbal anti-cancer drugs, platinum-coordinated anti-cancer complexes, anti-cancer camptothecin derivatives, anti-cancer tyrosine kinase inhibitors, Interleukins, biological response modifiers and other anti-cancer agents or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the combination preparation according to the invention is particularly suitable for use in the treatment or profiling of breast / breast carcinomas, in particular locally recurring or metastatic breast carcinomas in a patient or a group of patients who is ill with or is suspected of having a breast / breast carcinoma, to suffer from breast cancer.
  • the first preparation of the invention is particularly preferred
  • composition in combination with a
  • monoclonal antibodies in particular against immunosuppressive proteins selected from the group consisting of CTLA4 (here e.g. Ipilimumab - Yervoy®), PDL1 (here e.g. Nivolumab - Opdivo), PD1 -L, also EpCam, IDO, MIC, Fas and TRAIL; specifically: as an estrogen inhibitor for hormone-positive patients from the group of aromatase inhibitors - (herein e.g. letrozole and / or the estrogen blocker fulvestrant); as antibodies against HER2-positive patients: Herceptin (TDM-1) as the second preparation.
  • CTLA4 here e.g. Ipilimumab - Yervoy®
  • PDL1 here e.g. Nivolumab - Opdivo
  • PD1 -L also EpCam
  • IDO MIC
  • Fas and TRAIL specifically: as an estrogen inhibitor for hormone-positive patients from the group of aromata
  • Fig. 1 Schematic representation of an HLA-A-mediated connection of a T-
  • Fig. 2 Schematic representation of an HLA-B-mediated connection of a T-
  • Tumor antigen peptides according to embodiment 3 (INC 14/1713; Stern) which map the epitopes of the primary tumor MC-HER2 / Neu.
  • the illustrated course spans 26 weeks.
  • Liver marker Gamma GT after application of specific immune information through the composition of tumor antigen peptides according to embodiment 3 (INC 14/1713; vertical line), which map the specific metastatic epitopes of the liver metastases of the scattered MC-HER2 / Neu.
  • the illustrated course spans 34 weeks.
  • HLA tumor antigen peptides all of which have been tested and are immunogenic.
  • SEQ ID NOs: 13 to 48 list some preferred but non-limiting examples of amino acid sequences of tumor antigen peptides of the invention, each of these examples representing a further aspect of the present invention.
  • table 1 [comparative example]:
  • the transcriptome analysis was carried out in all patients using the
  • PANTHER chip analysis (44K chip) from Agilent Technologies.
  • the 44K chip used contains 44,000 gene probes, so that the activity of> 34,000 gene expression markers per patient could be analyzed with this chip. 1,000 genes with increased relevance were determined ten times.
  • Exome sequencing is carried out from the patient's standard frozen preparation from which the tumor DNA is extracted.
  • Next-generation sequencing of the exome is carried out from the tumor sample with coverage of over 95% of the entire coding exon area of humans. For this purpose, i.a. > 290,000 relevant
  • Sections of DNA are selectively amplified and sequenced by semiconductor sequencing technology.
  • the aim of the analysis is to define possible mutations for the design of an individual tumor antigen peptide immunization.
  • SNPs Single Nucleotide Polymorphism
  • the DNA is simultaneously isolated from the patient's blood cells containing nuclei and sequenced using the same method. The differentiation of possible neoantigen candidates took place in the following six steps:
  • Embodiment 1 peptides with a low expression relevance in the tumor can be excluded.
  • peptides 20 are defined and submitted to the HLA paratope affinity analysis NetMHC. -25 * 12 nonapeptide pairs (each mutated and wild type) are submitted to the affinity analysis for analysis in 9 HLA loci each. From this, 5814 affinities (2907 pairs) are examined. In 40 pairs, an affinity at least twice as high in the mutated peptide than in the wild-type peptide is detected.
  • Example 3 Patients with mMC (metastatic breast cancer), Type_HER2-new
  • invasive ductal bifocal breast carcinoma (Mamma-CA), right, tumor 2 cm to 5 cm in the largest extent (pT2), pN1 sn pN1 (3/5) G2, NO, ER-, PR-, HER-2 new: 3+, Ki-67: 55%
  • neoadjuvant chemotherapy (TCH w3) 6 cycles, trastuzumab;
  • Proonosis of the clinicians The patient was discharged from the clinic with a prognosis of an OS (overall survival) of probably / average 6 months.
  • tumor-specific HLA antigen peptides in the form of synthesized peptides are used.
  • targets cytotoxic CD8 + T cells
  • These effector T cells can destroy the tumor cells recognized by the HLA-presented antigens by secreting granzyme and perforin.
  • NGS next generation sequencing
  • LC-MS / MS liquid chromatography-coupled tandem mass spectrometry
  • HLA tumor antigen peptides (number 86), which were weighted with regard to their expression abnormalities / deviations from normal and their known significance for tumor proliferation -> factor 3 against normal; Significance for tumor development: growth factors, angiogenesis factors, metastasis factors.
  • Cytokeratin production of breast / breast cancer are associated.
  • Target selection for step (a) From the data records of the transcriptome, first, using the amino acid sequences of the respective proteins, amino acid sequences of the HLA tumor antigen peptides corresponding to the MHC complexes (nonamers) with the highest allele affinities (specific activity against T cell receptor [nM]). This selection criterion is used to algorithmically determine the probability with which the respective HLA tumor antigen peptide is presented in vivo on the corresponding MHC complexes (a first prerequisite for a possible cellular immune response).
  • step (b) Using the patient's alleles, nonameric variants containing the amino acid exchange were determined from the data sets of the mutation studies with regard to the highest affinities (specific activity towards T cell receptor [nM]). Polymers of 17 amino acids (oligopeptides) under the
  • Peptide concepts were produced synthetically as chemical peptides.
  • Application site left and right upper arm Administration schedule: 23 vaccinations on days 1, 2, 3, 8, 15, 22, 36, 50, 71 and further every 3 weeks up to day 365
  • Adjuvants added per application 12.5 mg imiquimod in 250 mg cream (Aldara) topically at the injection site; 200 pg ipilimumab (Yervoy), as CTLA4 increased, alternating with 300 pg nivolumab (Opdivo), as PD1 or PD-L1 increased, subcutaneously (s.c.) directly next to the application site
  • Fig. 3 shows the development of the specific tumor marker CA 15-3 in connection with the liver marker Gamma GT after specific application (id) specific pharmaceutical composition of the immune information by BITAP peptides (star line), which the specific metastatic epitopes of the liver metastases of the scattered mMC -HER2 / remap (INC 14/1713).
  • the illustrated course spans 34 weeks. the development of the specific tumor marker CA 15-3 after specific
  • Tumor antigen peptides that map the epitopes of the primary tumor MC-HER2 / Neu (INC 14/1713).
  • the illustrated course spans 26 weeks.
  • Example 4 Patients with mIBC with lymphangosis carinomatosis (metastatic inflammatory breast cancer)
  • Recurrence A first recurrence after only 3 months postoperatively:
  • Chemotherapy was canceled after 5 cycles. Locoregional tumor recurrence, 7x1 1cm along the ventrolateral chest wall. Skin and subcutaneous tissue are infiltrated and thickened over a large area.
  • Treatment method according to the invention After all the therapies available in the standard and rule canon of oncological medicine had been carried out without success, the immunological therapy approach of informing the patient's own immune system by applying tumor-associated and
  • tumor-specific antigens in the form of synthesized peptides are used.
  • targets cytotoxic CD8 + T cells
  • These effector T cells can destroy the tumor cells recognized by the FILA-presented antigens by secreting granzyme and perforin.
  • FILA class I The activation of these immune cells takes place via the ligands of FILA class I, i.e. the antigens presented as sequences of 8-10 amino acids on FILA class I molecules.
  • NGS next generation sequencing
  • LC-MS / MS liquid chromatography-coupled tandem mass spectrometry
  • Target selection for step (a) From the data records of the transcriptome, first, using the amino acid sequences of the respective proteins, amino acid sequences of the HLA tumor antigen peptides corresponding to the MHC complexes (nonamers) with the highest allele affinities (specific activity against T cell receptor [nM]). This selection criterion is used to algorithmically determine the probability with which the respective HLA tumor antigen peptide is presented in vivo on the corresponding MHC complexes (a first prerequisite for a possible cellular immune response).
  • step (b) Using the patient's alleles, nonameric variants containing the amino acid exchange were determined from the data sets of the mutation studies with regard to the highest affinities (specific activity towards T cell receptor [nM]). For this purpose, polymers of 17 amino acids were also specified under the affinity criterion. This selection criterion is used to algorithmically determine the probability with which the respective tumor antigen peptide corresponding to the MHC complexes is presented in vivo on the corresponding MHC complexes (a second prerequisite for a possible cellular immune response).
  • Peptide concepts were produced synthetically as chemical peptides.
  • Adjuvants added per application Montanide ISA 51 VG (1.5 ml), mixture 1: 1 with peptide vial (1.5 ml); 300 pg nivolumab (Opdivo), as PD1 or PD-L1 increased, subcutaneously (sc) directly next to the injection site, 30 min before the peptide / montanide injection.
  • Embodiment 4 is shown in FIG.
  • the graph shows the development of the tumor markers CEA (bar 1) and CA15-3 (bar 2) as well as the liver value Gamma-GT (bar 3) and the leukocyte count (bar 4) during a period of 8 months after the application of the pharmaceutical
  • Lymphangiosis Carcinomatosis The application was carried out with a 1: 1 mixture of
  • the peptide composition is the initial application (followed by 4 further applications; see arrows in FIG. 5).
  • the 10 peptides contained in the pharmaceutical composition according to embodiment 4 are tumor antigen peptides (or also neoantigens).
  • antigens nos. 1-4 and 10 have become epitopes, i.e. it was possible to activate the corresponding T cell receptors (TCR) and to develop effector and memory cells.
  • TCR T cell receptors

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung oder zur Profilaxe von Mamma-ZBrustkarzinomen, insbesondere lokal wiederkehrenden oder metastasierenden Mammakarzinomen bei einem Patienten oder einer Patientengruppe, der/die an einem Mamma-ZBrustkarzinom erkrankt ist oder im Verdacht steht, an einem Mamma-ZBrustkarzinom zu erkranken, umfassend zumindest 4 bis 8 HLA-A Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und zumindest 2 Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-Il-Komplexe, wobei die HLA Tumorantigenpeptide tumorexklusive oder tumorassoziierte HLA Antigenpeptide sind und gegen zumindest ein MHC-Komplex einschließlich Kombinationen davon gerichtet sind, eine pharmazeutische Zusammensetzung, ein Kit (oder Teile davon), ein Verfahren zum Ermitteln eines HLA- Peptids der Klasse I undZoder II, ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Formulierung und die Verwendung einer erfindungsgemäßen Formulierung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Malignomen, Leukämie und Neoplasien.

Description

HLA-Tumorantigenpeptiden der Klasse I und II zur Behandlung von Mamma-
/Brustkarzinomen
Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung zur
Verwendung bei der Behandlung oder zur Profilaxe von Mamma-/Brustkarzinomen, insbesondere lokal wiederkehrenden oder metastasierenden Mammakarzinomen bei einem Patienten oder einer Patientengruppe, der/die an einem Mamma-/Brustkarzinom erkrankt ist oder im Verdacht steht, an einem Mamma-/Brustkarzinom zu erkranken, umfassend zumindest 4 bis 8 humane Leukozytenantigen-(HLA)-A Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe (hierin auch als„HLA-A restringierte Tumorantigenpeptide“ bezeichnet) und zumindest 2 Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-Il- Komplexe (hierin auch bezeichnet als„HLA restringierte Tumorantigenpeptide“,„HLAs“, „Aminosäuresequenzen der Erfindung“,„Verbindungen der Erfindung bzw.„Polypeptide der Erfindung), wobei die HLA Tumorantigenpeptide tumorexklusive oder tumorassoziierte HLA Antigenpeptide sind und gegen die entsprechenden MHC-Komplexe einschließlich
Kombinationen davon gerichtet sind (d.h. an diese binden oder eine Affinität dafür aufweisen), ein Kombinationspräparat (oder Teile davon), ein Verfahren zum
Bestimmen/Identifizieren zumindest eines HLA-Antigenpeptids entsprechend der MHC- Klasse-I-Komplexe und/oder MHC-Klasse-Il-Komplexe zur Verwendung in der
pharmazeutischen Zusammensetzung, ein Verfahren zur Herstellung einer
erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung und ein Verfahren zum
Bestimmen der Regression, des Verlaufs oder des Auftretens einer Erkrankung an einem Mamma-/Brustkarzinom.
Stand der Technik
Trotz interdisziplinärer Ansätze und Ausreizung klassischer Therapien gehören
Krebserkrankungen weiterhin zu den Haupttodesursachen. Im Allgemeinen erfolgt die Behandlung von Krebserkrankungen durch etablierte Methoden wie die operative
Tumorentfernung (Resektion), Chemotherapie und/oder Strahlentherapie.
Insbesondere die Resistenzbildung von Krebszellen während einer Chemotherapie und/oder Strahlentherapie unterbindet zumeist die vollständige Entfernung aller Krebszellen aus dem Körper eines Probanden. Neuere therapeutische Konzepte zielen darauf ab, das patienteneigene Immunsystem durch Einsatz von spezifischen Maßnahmen wie Antikörpertherapie gegen Immunsuppressoren und rekombinanten Immuninformatika (d.h. Behandlung mit Informationsträgern) in das therapeutische Gesamtkonzept mit einzubeziehen. Voraussetzung für den Erfolg einer solchen Strategie ist die Erkennung von tumorspezifischen oder tumorassoziierten Antigenen bzw. Epitopen durch das Immunsystem des Probanden, dessen Effektorfunktionen (durch die Immunzellen) verstärkt werden sollen. Tumorzellen unterscheiden sich biologisch wesentlich von ihren nichtmalignen Ursprungszellen. Diese Unterschiede sind durch genetische Veränderungen bedingt, die während der Tumorentwicklung erworben werden, und u.a. auch zur Bildung qualitativ oder quantitativ veränderter molekularer Strukturen in den Tumorzellen führen. Werden solche tumorassoziierten Strukturen vom spezifischen Immunsystem des tumortragenden Wirtes erkannt, spricht man von tumorassoziierten Epitopen.
Cancer/Testis Antigene (CTAs) bezeichnen eine Gruppe von tumorassoziierten Proteinen, die unter anderem von Tumoren unterschiedlicher histologischer Herkunft exprimiert werden (Fratta et al., Molecular Oncology, 5(2), April 201 1 , 164-182). Bei gesunden erwachsenen Wirbeltieren ist die Expression dieser Proteine auf männliche Keimzellen beschränkt. Bei Krebserkrankungen wird die Expression dieser Entwicklungsantigene jedoch häufig reaktiviert und können somit als Ort der Immunaktivierung dienen. Viele der CTAs sind Onkogene und an zellulären Prozessen wie Zellwachstum und Zellteilung, an der Hemmung der Apoptose und an der Metastasierung beteiligt. Sie sind oftmals ursächlich für
Onkogenese und malignen Transformation und werden daher als Tumorantigene eingestuft. Die Expression von CTAs bei verschiedenen Malignomen ist heterogen und korreliert häufig mit der Tumorprogression, weshalb sie auch als Biomarker für den Verlauf einer
Tumorerkrankung dienen. HLA-Antigenpeptide solcher CTAs werden oft als Abbauprodukte auf der Oberfläche der Tumorzellen präsentiert. Es ist bekannt, dass eine solche
Präsentation von CTA-abgeleiteten HLA-Antigenpeptiden für die Entwicklung neuer
Behandlungsmethoden genutzt werden kann, die eine medikamentöse Behandlung mit einer anti-CTA-gerichteten Immuntherapie kombinieren.
Humane Leukozytenantigene (auch HLA-System, HL-Antigene, Histokompatibilitätsantigene genannt, engl human leukocyte antigen) sind eine Gruppe menschlicher Gene, die für die Funktion des Immunsystems zentral sind. Das HLA-System kommt unter dem Namen Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC von engl. Major Histocompatibility Complex) bei allen Wirbeltieren vor.
Es gibt zwei Arten von MHCs, nämlich MHC-Moleküle der Klasse I (hierin auch„MHC- Komplexe der Klasse oder„HLA-Komplexe der Klasse l‘) und MHC-Moleküle der Klasse II (hierin auch„MHC-Komplexe der Klasse / oder„HLA-Komplexe der Klasse / ). Beide befinden sich auf der Zelloberfläche aller Zellen mit Zellkern in den Körpern der
Kieferwirbeltiere. MHC-Moleküle bestehen aus zwei Polypeptidketten, einer schweren a- Kette und einer leichten ß-Kette (siehe auch Fig. 1 und 2).
MHC-Moleküle der Klasse I werden auf der Zelloberfläche aller kernhaltigen Zellen exprimiert und von CD8+ T-Zellen (auch als T-Killerzellen oder zytotoxische T-Zellen bezeichnet) erkannt. MHC-Moleküle der Klasse II werden hauptsächlich auf der
Zelloberfläche von Antigen-präsentierenden Zellen exponiert und von CD4+ T-Zellen (auch als T-Helferzellen bezeichnet) erkannt.
Bei den Blutzellen werden MHC-Moleküle der Klasse I auf der Zelloberfläche von
Thrombozyten exponiert, nicht aber auf roten Blutkörperchen. Ihre Aufgabe ist es,
Peptidfragmente von Nicht-Selbst-Proteinen auf ihrer Zelloberfläche zu präsentieren und aus der Zelle heraus in T-Killerzellen (auch zytotoxische T-Zellen) zu übertragen, um eine sofortige Reaktion des Immunsystems gegen ein bestimmtes Nicht-Selbst-Antigen auszulösen, das mit Hilfe eines MHC-Klasse-I-Proteins dargestellt wird. Da MHC-Moleküle der Klasse I Peptide präsentieren, die von zytosolischen Proteinen abgeleitet sind, wird der Weg der Präsentation von MHC-Molekülen der Klasse I oft als zytosolischer oder endogener Weg bezeichnet.
HLA-Antigenpeptide dienen hierbei als Vermittler zwischen dem entsprechenden MHC- Komplex, der auf der Zelloberfläche präsentiert ist, und dem T-Zell-Rezeptor.
HLA-Komplexe der Klasse I (HLA-A, B und C) präsentieren auf der Zelloberfläche der Wirtszellen intrazelluläre Antigenpeptidfragmente (hierin„HLA-Antigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe“ oder„HLA Antigenpeptide des Typs G, die 7 bis 1 1 , vorwiegend 9 Aminosäuren - sog. Nonamere - in ihrer Sequenz umfassen) gegenüber T- Killerzellen (auch zytotoxischen T-Zellen), wohingegen HLA-Komplexe der Klasse II (HLA- DR, DQ und DP) exogen abgeleitete Antigenpeptide (hierin„HLA-Antigenpeptide
entsprechend der MHC-Klasse-Il-Komplexe“ oder„HLA Antigenpeptide des Typs 2‘, die mehr als 1 1 Aminosäuren, vorzugsweise 12 bis 17 Aminosäuren in ihrer Sequenz umfassen) gegenüber T-Helferzellen präsentieren. Beim Menschen werden die HLA-Antigenpeptide der Klasse I, die der MHC-Klasse I entsprechen, in HLA-A, HLA-B und HLA-C Antigenpeptide unterteilt.
Aus dem Stand der Technik ist bekannt, dass die Bindung von HLA-Antigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-Il-Komplexe an die Peptidbindungstasche der
entsprechenden HLA-Komplexe der Klasse II primär über die diskreten Ankerreste in den Aminosäurepositionen 1 , 4, 6/7 und 9 der HLA-Antigenpeptide erfolgt (siehe hierzu bspw. Sinigaglia und Hammer (1995), J. Exp. Med., 181 , 449-451 ). Besonders bevorzugt ist gemäß dem Stand der Technik die Wechselwirkung zwischen dem Peptidbindetaschenmotiv des HLA-Komplexes der Klasse II und den diskreten Ankerresten in den Aminosäurepositionen 6 und 9 der HLA-Antigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-Il-Komplexe. Die
Aminosäurereste in den Aminosäurepositionen 2, 3, 5, 7 und 8 der jeweiligen HLA- Antigenpeptide stehen dabei zur Interaktion mit dem T-Zell-Rezeptor zur Verfügung (Sant’ Angelo et al. (2002), Recognition of core and flanking amino acids of MHC dass ll-bound peptides by the T-cell receptor, Eur J Immunol, 32(9), 2510-20)
Demgegenüber sind für HLA Antigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe als die primären Ankerreste gegenüber dem entsprechenden HLA-Komplex der Klasse I die Aminosäurepositionen 1 , 2 und 9 postuliert (siehe hierzu bspw. Binkowski et al. (2012), PLoS ONE, 7(8), e41710; Yamada (1999), Tissue Antigens, 54(4), 325-32).
Eine neue Studie in den USA untersucht derzeit die spezifische Wirksamkeit ausschließlich eines HLA-Antigenpeptids bei der Behandlung von Krebserkrankungen (siehe hierzu WO 2013/135266, Inderberg-Suso et al. (2012), Oncoimmunology., 1 (5), 670-686 und Slingluff (201 1 ), Cancer J., 17(5), 343-350). Das Therapiespektrum ist daher nur sehr beschränkt und durch die Applikation lediglich eines HLA-Antigenpeptids ist die Wirksamkeit fraglich.
Dies gilt insbesondere bei einer Tumorentität wie dem Mammakarzinom, die sich von anderen Tumorentitäten durch eine geringe Homogenität (d.h. hohe Heterogenität) sowie dem Mangel an initialer Immunogenität auszeichnet. Klinisch wirksame zielgerichtete („targeted“) Immuninformations- und Stimulationstherapien sind von daher auf einen multifaktoreilen Informationsansatz angewiesen.
Ein wesentlicher Nachteil von Krebsimmunotherapien besteht also darin, dass diese darauf basieren, dass das individuelle Mutationsmuster (Signaturen) des Tumors jedes einzelnen Krebspatienten entschlüsselt werden muss. Auf das ermittelte Profil des Mutationsmusters werden anschließend für jeden einzelnen Patienten passgenau synthetische Impfstoffe, beispielsweise auf RNA-Basis hergestellt (sog. Vakzinherstellung). Die so erhaltenen Impfstoffe können im Anschluss nur für die individuelle Behandlung dieses bestimmten Patienten eingesetzt werden.
Grundsätzlich taugen diese neuartigen Impfstoffe in der Krebsimmunotherapie daher nicht für andere Patienten mit dem gleichen T umor, sondern sind nur jeweils für einen einzelnen Patienten einsetzbar, dessen Mutanom für die Vakzinherstellung zuvor analysiert wurde. Es ist somit eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung - im Unterschied zur
vollindividualisierten Krebsimmuntherapie eine pharmazeutische Zusammensetzung für unterschiedliche Probanden bzw. eine spezifisch vorbestimmte Patientengruppe (d.h. für eine bestimmte Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel) bereitzustellen, die Überschneidungen in dem Mutanom des malignen oder neoplastischen Gewebes (MammaVBrustkarzinom) aufweisen (Ableiten von Patientengruppen).
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, pharmakologisch wirksame Wirkstoffe sowie pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Wirkstoffe umfassen,
bereitzustellen, die für die Diagnose, Prävention und/oder Behandlung von Mamma- /Brustkarzinom und weiterer Krankheiten und Störungen, die hierin aufgeführt sind, verwendet werden können; und Verfahren zur Diagnose, Prävention und/oder Behandlung solcher Krebserkrankungen, die die Verabreichung und/oder Verwendung solcher Wirkstoffe und Zusammensetzungen beinhaltet, bereitzustellen.
Insbesondere ist es eine Aufgabe der Erfindung, solche pharmakologisch wirksamen Wirkstoffe, pharmazeutischen Zusammensetzungen und/oder Verfahren bereitzustellen, die bestimmte Vorteile gegenüber den Wirkstoffen, Zusammensetzungen und/oder Verfahren aufweisen, die aktuell verwendet werden und/oder im Stand der Technik bekannt sind. Diese Vorteile ergeben sich aus der nachfolgenden weiteren Beschreibung.
Ganz besonders ist es eine Aufgabe der Erfindung, therapeutisch wirksame HLA- Antigenpeptide bereitzustellen, die als pharmakologisch wirksame HLA-Antigenpeptide bzw. als pharmakologisch aktive Wirkstoffe verwendet werden können, sowie pharmazeutische Zusammensetzungen bereitzustellen, die diese enthalten, für die Diagnose, Prävention und/oder Behandlung von Mamma-/Brustkarzinomen und weiterer Krankheiten und
Störungen, insbesondere Krebserkrankungen die hierin aufgeführt sind, verwendet werden können; und Verfahren für die Diagnose, Prävention und/oder Behandlung solcher
Krankheiten und Störungen bereitzustellen, die die Verabreichung und/oder Verwendung solcher therapeutisch wirksamen HLA-Antigenpeptide und Zusammensetzungen beinhalten.
Insbesondere ist es eine spezielle Aufgabe der vorliegenden Erfindung, solche HLA- Antigenpeptide bereitzustellen, die für die prophylaktische, therapeutische und/oder diagnostische Verwendung bei warmblütigen Tieren, insbesondere bei einem Säugetier und ganz besonders bei einem Menschen geeignet sind. Erfindungsgemäß werden diese Aufgaben durch eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung oder zur Profilaxe von Mamma-/Brustkarzinomen, insbesondere lokal wiederkehrenden oder metastasierenden Mammakarzinomen bei einem Patienten oder einer Patientengruppe, der/die an einem Mamma-/Brustkarzinom erkrankt ist oder im Verdacht steht, an einem Mamma-/Brustkarzinom zu erkranken, umfassend eine pharmakologisch wirksame Menge aus 4 bis 8, vorzugsweise 4, 5, 6, 7 oder 8 HLA-A
Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und zumindest 2, vorzugsweise 1 , 2, 3 oder 4 Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-Il- Komplexe, dadurch gekennzeichnet, dass die HLA Tumorantigenpeptide tumorexklusive oder tumorassoziierte HLA Antigenpeptide sind, gemäß Anspruch 1 gelöst, wobei die HLA Tumorantigenpeptide insbesondere Sequenzen umfassen, die in den Sequenzen SEQ ID Nr. 13 - SEQ ID Nr. 26, SEQ ID Nr. 28, SEQ ID Nr. 29 und SEQ ID Nr. 32 - SEQ ID Nr. 48 wiedergegeben sind.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen angegeben.
Nach einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung besteht die pharmazeutische Zusammensetzung ausschließlich aus einer Trägerflüssigkeit
(vorzugsweise Wasser, eine pharmazeutisch verträgliche Kochsalzlösung und/oder pharmazeutisch DMSO - derartige Zusammensetzungen von Trägerflüssigkeiten sind dem Fachmann bekannt und liegen bspw. im Bereich um 30% DMSO und 70% Wasser), in der eine pharmakologisch wirksame Menge von 4 bis 8 HLA-A Tumorantigenpeptiden
entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und 2 Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-Il-Komplexe gelöst bzw. suspendiert sind und einem Adjuvans.
Pharmazeutische Zusammensetzung und geeignete Darreichungsformen zur Applikation der pharmazeutisch wirksamen HLA-Tumorantigenpeptide werden gemäß Standardverfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, hergestellt und sind leicht auf jedes neue oder verbesserte Verfahren für deren Herstellung anwendbar.
Besonders vorteilhaft wird durch das Verabreichen der vorgenannten Kombination einer pharmakologisch wirksamen Menge der HLA-Tumorantigenpeptide an den Patienten oder die Patientengruppe, der/die an einem Mamma-/Brustkarzinom erkrankt ist, der CA 15-3 Wert wirksam reduziert. CA 15-3 (Cancer-Antigen 15-3) ist ein sogenanntes Glycoprotein, das als spezifischer Tumormarker bei Mammakarzinomen verwendet wird. Der CA 15-3 Wert ist ein Laborwert, der bei bestimmten Krebserkrankungen, insbesondere Mammakarzinomen signifikant über den Schwellwert ansteigt. Bei gesunden Menschen liegt der CA 15-3
Schwellwert unter 31 Enzymeinheiten pro Milliliter (< 31 U/ml). Vorzugsweise wird der CA 15-3 Wert durch das Verabreichen der pharmakologisch wirksamen Menge der Tumorantigenpeptide an den Patienten oder die Patientengruppe, der/die an einem Mamma- /Brustkarzinom erkrankt ist, unter 60 U/ml, besonders bevorzugt unter 50 U/ml, ganz besonders bevorzugt auf einen Bereich unter 40 U/ml und einen Normalwert (< 31 U/ml) reduziert.
Besonders bevorzugt wird durch das Verabreichen der pharmakologisch wirksamen Menge der HLA-Tumorantigenpeptide an den Patienten oder die Patientengruppe somit das progressionsfreie Überleben des Individuums wirksam, vorzugsweise um zumindest 2 bis 5 Jahre verlängert.
Entgegen der konventionellen Ansätze ist es eine überraschende Erkenntnis der
vorliegenden Erfindung, dass Tumorantigenpeptide, die einen KD-Wert im Bereich zwischen 50 und 500 nM aufweisen, entgegen konventioneller //i-s/7/co-Bindungsvorhersagemodellen, die diese als niedrig bindend angesehen haben, Effektorzellen (d.h. zytotoxische T-Zellen) auslösen. Für die Wirksamkeit der Tumorantigenpeptide ist es vielmehr von besonderem Vorteil, dass die zur Behandlung verwendeten HLA-Tumorantigenpeptide beim Patienten bzw. der Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel immunogen sind, was im Vorfeld mit einem Immunogenitätstests (z.B. mittels Westernblot, ELISA-Techniken, insbesondere mittels ELISPOT, vorzugsweise über Interferon-Gamma, Interferon-Alpha oder Interleukin (IL-2), oder Immunodetektion mit mikroskopischer Analyse) bestimmbar ist.
Wie hierin beschrieben, jedoch ohne Beschränkung auf eine Erläuterung, einen
Wirkungsmechanismus oder eine Hypothese in der vorliegenden Erfindung, wurden zwei unterschiedliche Klassen von Aminosäuresequenzen der Erfindung bestimmt auf Grundlage ihrer Fähigkeit, die Interaktion von MHC-Komplexen der Klasse I bzw. MHC-Komplexen der Klasse II mit zumindest einem T-Zell-Rezeptor zu erhöhen (insbesondere im
Nachweisverfahren, das unten im Ausführungsbeispiel 3 beschrieben wird). Diese zwei Klassen von Aminosäuresequenzen der Erfindung sind (wie nachfolgend beschrieben):
„HLA-Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe“: (siehe besonders bevorzugte Beispiele in den Tabellen 1 -3)
„HLA-Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-Il-Komplexe“: (siehe besonders bevorzugte Beispiele in der Tabelle 4)
Vorteilhaft handelt es sich bei der Verwendung/Applikation der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung bzw. der darin enthaltenen spezifischen Kombination an Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und MHC-Klasse-Il- Komplexe an den Patienten bzw. die Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA- Allel nicht lediglich um eine passive Immunisierung (wie bei der Behandlung mit Antikörpern, z.B. Herceptin) sondern um eine aktive Immunisierung (d.h. spezifische Aktivierung der T- Zellen bzw. B-Helferzellen über Informationsträger). Da durch die spezifische Aktivierung von MHC-Molekülen der Klasse II, die hauptsächlich auf der Zelloberfläche von Antigen präsentierenden Zellen exponiert werden, mittels der Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-Il-Komplexe spezifisch CD4+ T-Zellen (auch als T-Helferzellen bezeichnet) und B-Zellen aktiviert werden.
Zum Binden an einen T-Zell-Rezeptor weist ein HLA-Tumorantigenpeptid der Erfindung üblicherweise in seiner Aminosäuresequenz einen oder mehrere Aminosäurereste oder einen oder mehrere Abschnitte von Aminosäureresten (d.h. mit jedem„Abschnitt“, der zwei oder mehr Aminosäurereste umfasst, die sich nebeneinander oder in unmittelbarer Nähe zueinander befinden, d.h. in der Primär- oder Tertiärstruktur der Aminosäuresequenz) auf, über die die Aminosäuresequenz der Erfindung an einen T-Zell-Rezeptor (insbesondere eine Bindetasche davon) binden kann, wobei die Aminosäurereste oder Abschnitte der
Aminosäurereste somit den„Anker“ zum Binden an einen T-Zell-Rezeptor bilden (hierin auch als„Anker-Aminosäuren“ bezeichnet).
Die Bestimmung dieses„Ankers“ kann beispielsweise mit in silico Verfahren (bspw. das artificial neural network NNAIign, das in dem öffentlich zugängigen NetMHC-4.0 eingesetzt wird) oder durch gezielte Mutation (Insertionen oder Substitutionen in der
Aminosäuresequenz der HLA-Tumorantigenpeptide) ermittelt werden.
Die durch diese Erfindung bereitgestellten HLA-Tumorantigenpeptide liegen bevorzugt in im Wesentlichen isolierter Form vor (wie hierin definiert) oder bilden einen Teil eines Proteins oder Polypeptids, die eine oder mehrere HLA-Tumorantigenpeptide der Erfindung umfassen können oder im Wesentlichen daraus bestehen und die optional ferner ein oder mehrere pharmazeutisch wirksame HLA-Tumorantigenpeptid(e) umfassen können (die in einem sog. Oligopeptide alle optional über einen oder mehrere Linker verbunden sind). Zum Beispiel, und ohne Beschränkung, können die Tumorantigenpeptide der Erfindung als Bindeeinheit in solch einem Protein oder Polypeptid verwendet werden, die optional einen oder mehrere weitere Aminosäuresequenzen enthalten können, die als Bindeeinheit dienen können (d.h. gegen ein oder mehrere andere Ziele als einen T-Zell-Rezeptor), um ein monovalentes, multivalentes bzw. multispezifisches Polypeptid der Erfindung, wie hierin beschrieben, bereitzustellen. Solch ein Protein oder Polypeptid kann auch in im Wesentlichen isolierter Form vorliegen (wie hierin definiert). Es hat sich gezeigt, dass eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine hierin offenbarte spezifische Kombination aus HLA-Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC- Klasse-I-Komplexe und HLA-Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-Il- Komplexe umfasst, besonders vorteilhaft ist, da sie einerseits geeignet ist, spezifisch T- Zellen als auch spezifisch B-Zellen zu aktivieren.
In anderen Erscheinungsformen bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, ein Kit (oder Teile davon), ein Verfahren zum
Bestimmen/Identifizieren eines pharmakologisch aktiven HLA-Antigenpeptids entsprechend der MHC-Komplexe der Klasse I und/oder II, ein Verfahren zur Herstellung einer
erfindungsgemäßen Formulierung und die Verwendung einer erfindungsgemäßen
Formulierung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krebserkrankungen, insbesondere Mamma-/Brustkarzinomen.
Die Polypeptide und pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können insbesondere zur Prävention und Behandlung von Krebserkrankungen,
insbesondere Mamma-/Brustkarzinomen verwendet werden, die gekennzeichnet sind durch Mutation(en) (hierin„Aminosäureaustausch“) veränderte Wildtyp-HLA-Antigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und/oder entsprechend der MHC-Klasse-Il- Komplexe (sog. HLA Tumorantigenpeptide, wie hierin definiert).
Im Allgemeinen erfolgt(e) im Vorfeld die Behandlung von Krebserkrankungen der Erfindung eines Patienten oder einer Patientengruppe durch klassische Methoden wie die
Chemotherapie, Strahlentherapie und/oder Krebsimmuntherapie.
Klassische Methoden zur Behandlung von Krebserkrankungen der Erfindung sind bspw. die operative Tumorentfernung (Resektion), die Chemotherapie und/oder die Strahlentherapie, wobei häufig zwei oder gar alle drei Behandlungsmethoden gleichzeitig bei einem
Probanden angewendet werden. Bei den Krebsimmuntherapiemethoden unterscheidet man zwischen der aktiven und der passiven Immunisierung. Bei der aktiven Immunisierung bekommt der Proband Substanzen verabreicht, die in seinem Immunsystem eine
Immunantwort auslösen sollen. Bei der passiven Immunisierung kommen Antikörper oder Antikörper-Fragmente zum Einsatz. Bei der adoptiven Immuntherapie (d.h. passive
Immuntherapie, da vergleichbar mit der Behandlung mit Antikörpern ohne direkte
Immunmodulation) werden dem Probanden Leukozyten entnommen, ex vivo kultiviert und anschließend wieder dem Probanden injiziert. Werden bei der Behandlung nicht alle Zellen des Tumors und seiner Metastasen vernichtet, so ist die weitere Behandlung von Krebserkrankungen durch Resistenzbildung deutlich erschwert.
Die vorliegende Erfindung umfasst daher auch eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Krebserkrankungen, wie vorweg beschrieben, die im Anschluss an die klassischen Methoden zur Behandlung von Krebserkrankungen, nämlich nach erfolgloser operativer Tumorentfernung (Resektion), Chemotherapie und/oder Strahlentherapie erfolgt.
Es ist eine besondere Leistung der Erfinder, herausgefunden zu haben, dass für eine wirkungsvolle Behandlung die erfindungsgemäß verwendeten HLA-A Antigenpeptide bei dem zu behandelnden Individuum auch tatsächlich auf der Zelloberfläche von Zellen des zu behandelnden malignen Gewebes (insbesondere des MammaVBrustkarzinoms) präsentiert werden. Daher umfasst die zu applizierende pharmazeutische Zusammensetzung HLA- Antigenpeptide, die auf der Oberfläche der Tumorzellen des MammaVBrustkarzinoms des Patienten oder der Patientengruppe präsentiert werden, was vor Applikation und
Zusammenstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung mittels
Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie (UHPCL) in Verbindung mit ESI
Massenspektrometrie (MS) bestimmt wird. Durch eine solche Ligandomuntersuchung wurde - anders als bei konventionellen Krebsimmuntherapien - bereits im Vorfeld die
Bindungsfähigkeit der erfindungsgemäßen HLA-A Antigenpeptide gegenüber dem
entsprechenden MHC-Komplex der Klasse I bzw. II bewiesen.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung werden zumindest 60%, bevorzugt zumindest 80%, ganz besonders bevorzugt 90%, idealerweise alle HLA- Tumorantigenpeptide, die in der zu applizierenden pharmazeutischen Zusammensetzung enthalten sind, auf der Oberfläche der Tumorzellen des MammaVBrustkarzinoms des Patienten oder der Patientengruppe präsentiert, wie durch Verfahren, wie hierin beschrieben, bestimmt.
Nach einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung sind die HLA- Antigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe aus der Gruppe bestehend aus den in SEQ ID Nr. 1 bis 35 angegebenen Aminosäuresequenzen ausgewählt oder weisen gegenüber diesen Aminosäuresequenzen eine Aminosäureidentität von zumindest 85% auf.
Nach einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung sind die HLA- Antigenpeptid entsprechend der MHC-Klasse-Il-Komplexe aus der Gruppe bestehend aus den in SEQ ID Nr. 36 bis 48 angegebenen Aminosäuresequenzen ausgewählt. Es wurde von den Erfindern der vorliegenden Erfindung gefunden, dass sich die hierin explizit offenbarten HLA-A Antigenpeptide entsprechend der MHC Klasse I insbesondere zur Verwendung bei der Behandlung von Mamma-/Brustkarzinomen bei Probanden bzw. einer Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel eignen, die den Subtyp A*01 und/oder A*02 aufweisen. Das bedeutet, dass die hierin verwendeten HLA-A
Tumorantigenpeptide vorzugsweise an den entsprechenden MHC-Klasse-I-Komplex des Subtyps A*01 und/oder A*02 binden.
Nach einer besonders bevorzugten Ausgestaltung weisen die Individuen (Probanden bzw. einer Patientengruppe) den Haplotyp mit der Subgruppe A*01 :01 und/oder A*02:01 auf.
Alternativ dazu weisen die Individuen (Probanden bzw. einer Patientengruppe) besonders bevorzugt den Haplotyp mit der Subgruppe B*44:01 und/oder A*18:01 auf.
Zwar könnte die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung zur
gewebeunabhängigen Behandlung von Malignomen, Neoplasien und/oder Leukämien (d.h. anders als bei herkömmlichen Präparaten spielen die Krebssubtypen zunächst keine Rolle) verwendet werden, sodass die pharmazeutische Zusammensetzung gewebeübergreifend für die Verwendung als Antikrebsmedikament eingesetzt werden kann. Allerdings wurde gefunden, dass die erfindungsgemäße Verabreichung/Applikation der spezifischen
Kombination von 4 bis 8 HLA-A Tumorantigenpeptiden und zumindest 2 HLA
Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe besonders vorteilhaft zur Behandlung von Brustkrebs verwendet werden kann.
Ein weiterer klinischer Zugewinn bei der Verwendung der pharmazeutischen
Zusammensetzung bei der Behandlung eines Patienten bzw. einer Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel kann erreicht werden, indem der pharmazeutischen Zusammensetzung, ferner eine pharmakologisch wirksame Menge zumindest eines HLA-B Tumorantigenpeptids, vorzugsweise 1 , 2, 3, 4 oder 5 HLA-B Tumorantigenpeptid(e) entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und/oder zumindest eines HLA-C
Tumorantigenpeptids, vorzugsweise 1 , 2, 3, 4 oder 5 HLA-C Tumorantigenpeptid(e) entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe zugesetzt ist. Es versteht sich, dass auch die HLA-B Tumorantigenpeptide bzw. HLA-C Tumorantigenpeptide entsprechend dem spezifischen Haplotyp des Patienten bzw. der Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel zur Behandlung oder Profilaxe ausgewählt sind.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung weist die
erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung zumindest 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 oder 12 HLA-Antigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und/oder MHC-Klasse-Il- Komplexe und/oder zumindest ein HLA-Antigenpeptid auf, das analog zu zumindest einem auf der Zelloberfläche von Zellen aus malignem und/oder neoplastischem Gewebe
(insbesondere des MammaVBrustkarzinoms) des zu behandelnden Individuums exponiertem HLA-Antigenpeptid ist, welches in seiner Aminosäuresequenz zumindest einen
Aminosäureaustausch gegenüber dem Wildtyp dieses HLA-Antigenpeptids (sog.
Neoantigenpeptid) und zumindest eine 3-fach erhöhte spezifische Affinität gegenüber dem T- Zell-Rezeptor der körpereigenen T-Zellen (entsprechend gemessen und/oder ausgedrückt als KD-Wert) aufweist. Besonders gute Erfolge konnten mit pharmazeutischen
Zusammensetzungen erzielt werden, die zumindest 10, 1 1 oder 12 HLA-Antigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und/oder MHC-Klasse-Il-Komplexe aufwiesen.
Hierbei hat sich gezeigt, dass pharmazeutische Zusammensetzungen besonders bevorzugt sind, die aus einer pharmakologisch wirksamen Menge aus 4 bis 8, vorzugsweise 4, 5, 6, 7 oder 8 HLA-A und/oder HLA-B Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-I- Komplexe, insbesondere Neoantigenpeptiden davon und 1 , 2, 3 oder 4
Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-Il-Komplexe, insbesondere
Neoantigenpeptiden davon bestehen.
Nach einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung ist zumindest ein HLA-A Antigenpeptide der Zusammensetzung ein tumorexklusives HLA-A Antigenpeptid (d.h. ein Cancer-Testis-Antigen (CTA), das jenseits der immunprivilegierten Spermatozyten im gesunden/normalen Gewebe des Patienten/der Patientengruppe nicht (mehr) auftaucht oder ein sog. Neoantigenpeptid), und wobei die spezifische Bindung des tumorexklusiven HLA-A Antigenpeptids mit einer spezifischen Dissoziation (KD) im Bereich von 10 bis 50 nM erfolgt, wie mit Oberflächenplasmonresonanz bestimmt.
Es ist ebenfalls eine herausragende Leistung der Erfinder, herausgefunden zu haben, dass eine pharmazeutische Zusammensetzung auf Basis von HLA-Antigenpeptiden besonders wirksam ist, wenn durch diese sowohl T-Lymphozyten (kurz T-Zellen) als auch B- Lymphozyten (kurz B-Zellen) aktiviert werden.
T-Zellen gehören zur Zellgruppe der Lymphozyten und spielen eine wichtige Rolle im menschlichen Immunsystem. T-Zellen erkennen Antigene über einen spezifischen Rezeptor, den sogenannten T-Zell-Rezeptor (TCR). Dafür muss das Antigen allerdings von einer Antigen-präsentierenden Zelle (APC) angeboten werden.
Die stabile Bindung der T-Zelle an die Antigen-präsentierende Zelle erfordert die Beteiligung sog. Auxilliärproteine. Zu diesen gehören CD4 und CD8 (CD = "Cluster of Differentiation"). T-Zellen, die das Merkmal CD4 tragen, werden auch als CD4-positive T-Zellen oder T- Helferzellen bezeichnet. Im normalen Blut eines Erwachsenen machen die CD4+ T-Zellen 27-57% der Lymphozyten, also etwa 310-1570 Zellen/mI aus.
In der Gruppe der CD8-positiven (CD8+) T-Zellen, zu der auch regulatorische T-Zellen gehören, finden sich die zytotoxischen T-Zellen bzw. T-Killerzellen. Sie spielen eine besondere Rolle bei der Abtötung von körpereigenen Zellen, die von Viren befallen sind. Diese Eigenschaft der zellulären Immunabwehr ist bei der vorliegenden Erfindung von entscheidender Bedeutung, da die molekularbiologischen und-gentechnischen
Veränderungen von Tumorzellen durch diese T-Zell-Population erkannt und lysiert werden kann.
Demgegenüber sind B-Zellen als einzige Zellen in der Lage, Antikörper zu bilden, und machen zusammen mit den T-Zellen den entscheidenden Bestandteil des adaptiven Immunsystems aus. Während T-Zellen an der zellvermittelten Immunantwort beteiligt sind, sind die B-Zellen die Träger der humoralen Immunantwort (und für die Bildung von
Antikörpern verantwortlich).
Es hat sich gezeigt, dass eine pharmazeutische Zusammensetzung die tumorassoziierten HLA Antigenpeptide umfasst, deren Expressionsniveau in den Tumorzellen mindestens dreimal höher ist als in den gesunden Zellen des Patienten oder der spezifisch bestimmten Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel, wie beispielsweise mit qPCR bestimmt, und wobei die tumorassoziierten HLA-Antigenpeptide mit der Proliferation, Invasivität, Angiogenese und einer Erhöhung der Zytokeratinproduktion des Mamma- /Brustkarzinoms assoziiert sind, besonders wirksame pharmakologische Effekte bei der Behandlung von Mamma-/Brustkarzinomen aufweisen.
Besonders bevorzugt ist jedes einzelne hierin für die Behandlung von Mamma- /Brustkarzinomen verwendete HLA-Antigenpeptid in der pharmazeutischen
Zusammensetzung in einer absoluten Konzentration (d.h. Verabreichungsdosis) von zumindest 100 bis 600 mg, bevorzugt von 300 bis 600 mg enthalten.
Es hat sich in weiteren Versuchen mittlerweile gezeigt, dass pharmazeutische
Zusammensetzung, die pro HLA-Tumorantigenpeptid eine absolute Konzentration von >
600 mg, d.h. zumindest 700 bis 1 .200 mg, bevorzugt von 800 bis 1 .200 mg enthalten, ganz besonders bevorzugt ist, da dadurch die Information (die Aktivierung und/oder das Training des Immunsystems) stark intensiviert ist. Dies ist insbesondere von Vorteil, wenn das Immunsystem des zu behandelnden Probanden durch Vorbehandlung mit einem
Standardtherapieverfahren (z.B. mindestens eine Operation, Bestrahlung, Chemotherapie und/oder Hormontherapie) bereits geschwächt ist. Zudem ist die absolute Konzentration pro HLA-Tumorantigenpeptid bevorzugt, da dadurch der Einfluss der Degradation der HLA- Tumorantigenpeptide (bspw. durch Ligasen) nach deren Applikation an den Probanden wesentlich minimiert wird.
Es ist sehr zweckdienlich, dass die pharmazeutische Zusammensetzung ein Adjuvans umfasst, das bei Applikation der Zusammensetzung an einen Patienten dazu geeignet ist, am Ort der Applikation ein Granulom auszubilden. Der Vorteil in der Ausbildung eines Granuloms besteht darin, dass somit eine Depotwirkung erzielt werden kann, wobei die HLA- Tumorantigenpeptide am Ort der Applikation vorteilhaft in Art eines Reservoirs gespeichert werden und über einen längeren Zeitraum an den Organismus des Probanden abgegeben werden können. Besonders vorteilhaft entfallen daher wöchentliche Applikationen der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung. Bevorzugt muss die Applikation der pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krebserkrankungen im Sinne der Erfindung bei Anwendung über einen längeren Zeitraum daher lediglich alle 2 Wochen, besonders bevorzugt nur einmal monatlich erfolgen.
Dabei wird die pharmazeutische Zusammensetzung vorzugsweise subkutan oder intradermal und, vorzugsweise im Wesentlichen gleichzeitig an zumindest 2, besonders bevorzugt an zumindest 3 Applikationsorten, in der Regel an 3 bis 4 Applikationsorten entfernt von einer Tumorläsion und/oder dem krebsartigen Lymphknotenbereich appliziert.
Die im Wesentlichen gleichzeitige (sukzessive) Applikation an mehreren Applikationsorten hat den Vorteil, dass insbesondere bei Applikation hoher absoluter Konzentrationen der einzelnen HLA-Antigenpeptide (d.h. Verabreichungsdosis) im Bereich von > 600 yug, die zum vollständigen Lösen der einzelnen HLA-Antigenpeptide größere Applikationsvolumina (>
1 mL) bedingen, die Applikation der Applikationslösung, die nach dem Öffnen nur eine begrenzte Haltbarkeit aufweist, möglichst gleichzeitig erfolgt.
Vorzugsweise muss die pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend jedes einzelne HLA-Antigenpeptid in der Zusammensetzung in einer absoluten Konzentration (d.h.
Verabreichungsdosis) von 300 bis 600 yug, lediglich einmal alle 2 Wochen, vorzugsweise einmal alle 4 Wochen über einen Zeitraum von zumindest einem Jahr intradermal oder subkutan einem Patienten oder einer spezifisch bestimmten Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel verabreicht werden.
Es wurde gefunden, dass eine pharmazeutische Zusammensetzung, bei der zumindest ein HLA-Tumorantigenpeptid zumindest eine Mutation in Bezug auf den Wildtypen des HLA- Tumorantigenpeptids (wie unten im Detail ausgeführt) aufweist, die zu einer Erhöhung der Affinität, vorzugsweise auf < 500 nm, ganz besonders bevorzugt < 50 nm der spezifischen Bindungsaffinität zum T-Zell-Rezeptor (KD-Wert) des mit HLA-Tumorantigenpeptids behandelten Individuums im Vergleich zu den Wildtyp des HLA-Antigenpeptids führt, besonders vorteilhafte Effekte bei der Behandlung von Mamma-/Brustkarzinomen zeigen.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung wird die pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Mamma-/Brustkarzinomen als Monotherapie oder in Kombination mit anderen bekannten Therapien und/oder Verbindungen zur Behandlung von Mamma-/Brustkarzinomen eingesetzt. Dabei wird die pharmazeutische Zusammensetzung als eine Erstlinientherapie dem Patienten oder der Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel verabreicht werden (sog. adjuvante Monotherapie).
Alternativ kann vorgesehen sein, dass der/die mit der pharmazeutischen Zusammensetzung zu behandelnden Patienten bzw. behandelnde Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel im Vorfeld bereits zumindest ein Standardtherapieverfahren (z.B. mindestens eine Operation, Bestrahlung, Chemotherapie und/oder Hormontherapie) erhalten hat.
Besonders bevorzugt ist das zu behandelnde Mamma-/Brustkarzinom ein hormonpositiver, HER2/neu oder tripple negativer Brustkrebs.
HLA-T umorantigenpeptid
Von der vorliegenden Erfindung sind auch HLA-Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe oder MHC-Klasse-Il-Komplexe, insbesondere zur Verwendung bei der Behandlung oder zur Profilaxe von Mamma-/Brustkarzinomen bei einem Patienten oder einer Patientengruppe, der/die an einem Mamma-/Brustkarzinom erkrankt ist oder im Verdacht steht, an einem Mamma-/Brustkarzinom zu erkranken bzw. für eine
erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung mitumfasst, wobei die HLA- Tumorantigenpeptide die aus der Gruppe bestehend aus den in SEQ ID Nr. 13 bis 35 und SEQ ID Nr. 36 bis 48, insbesondere die in SEQ ID Nr. 13 bis SEQ ID Nr. 26, SEQ ID Nr. 28, SEQ ID Nr. 29 und SEQ ID Nr. 32 bis SEQ ID Nr. 48 angegebenen Aminosäuresequenzen oder die gegenüber einer dieser Aminosäuresequenzen zumindest eine Mutation, vorzugsweise einen Aminosäureaustausch aufweisen.
Besonders bevorzugt ist hierbei die Verwendung der vorgenannten HLA- Tumorantigenpeptide in einem Verfahren zur Behandlung von Mammakarzinomen, insbesondere lokal wiederkehrenden oder metastasierenden Mammakarzinomen bei einem Patienten oder einer Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel, wobei das Verfahren das Verabreichen/Applizieren eines Behandlungsregimes an den Patienten oder die Patientengruppe umfasst, das eine pharmakologisch wirksame Menge zumindest eines der vorgenannten HLA-Tumorantigenpeptide umfasst.
Damit das Immunsystem des Individuums, an das die erfindungsgemäßen HLA- Tumorantigenpeptide bzw. die pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht wird, noch voll funktionsfähig und somit leichter zu trainieren ist, ist es von Vorteil, wenn das Individuum noch keine Bestrahlung, Chemotherapie und/oder Hormontherapie gegen den Brustkrebs, insbesondere bei lokal wiederkehrendem oder metastasierendem Brustkrebs erhalten hat und/oder 12 Monate oder weniger seit der letzten Dosis eines Chemotherapeutikums keine vorhergehende adjuvante Chemotherapie in Rekurrenz mehr erhalten hat.
Besonders bevorzugt, verlängert das hierin beschriebene Behandlungsregime, insbesondere unter Verwendung zumindest eines vorgenannten erfindungsgemäßen HLA- Tumorantigenpeptids das progressionsfreie Überleben des Individuums wirksam.
A) HLA-A Antigenpeptide und HLA-A Neoantigenpeptide
Ein„HLA-A Tumorantigenpeptid entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe“ ist hierin definiert als ein„HLA-Antigenpeptid der Erfindung bzw.„Aminosäuresequenz der Erfindung (wie hierin definiert), das folgendes umfasst: a) eine Aminosäuresequenz bestehend aus 7 bis 1 1 Aminosäuren; und/oder b) ein Neoantigenpeptid mit einer Aminosäuresequenz bestehend aus 7 bis 1 1
Aminosäuren, das i) analog zu zumindest einem auf der Zelloberfläche von Zellen aus malignem
und/oder neoplastischem Gewebe (insbesondere des Mamma-/Brustkarzinoms) des zu behandelnden Individuums exponiertem HLA-A Antigenpeptid ist, und ii) in seiner Aminosäuresequenz zumindest einen Aminosäureaustausch gegenüber dem Wildtyp dieses HLA-A Neoantigenpeptids (sog.„HLA-A Neoantigenpeptid ') und iii) zumindest eine 3-fach erhöhte spezifische Affinität gegenüber dem T-Zell-Rezeptor der körpereigenen T-Zellen aufweist
Es ist eine herausragende Leistung der Erfinder, erkannt zu haben, dass HLA-A
Neoantigenpeptide, die in ihrer Aminosäuresequenz gegenüber dem Wildtyp dieses HLA-A Antigenpeptids zumindest einen Aminosäureaustausch in den Aminosäurepositionen 1 (N- Terminus), 2, 7/8 und/oder dem C-Terminus aufweisen, eine zumindest 4-fach, besonders bevorzugt zumindest 5-fach, ganz besonders bevorzugt zumindest 8-fach erhöhte spezifische Affinität (KD) gegenüber dem T-Zell-Rezeptor der körpereigenen T-Zellen aufweisen und daher besonders bevorzugt für die erfindungsgemäße Zusammensetzung eingesetzt werden.
Besonders bevorzugt ist der Aminosäureaustausch in der Aminosäuresequenz des HLA-A Antigenpeptids ein einzelner Aminosäureaustausch in der Aminosäureposition 1 (N- Terminus), 2, 7/8 oder dem C-Terminus.
Bevorzugt ist der Aminosäureaustausch in der Aminosäuresequenz des HLA-A Neoantigens gegenüber dem Wildtyp dieses HLA-A Antigenpeptids ein C/Y, A/V, D/Y, E/K, P/L, N/D oder T/M Austausch.
Bevorzugt weist das HLA-A Peptid bzw. das HLA-A-Neoantigen gegenüber dem T-Zell- Rezeptor eine spezifische Aktivität (KD), die durch jedes geeignete Nachweisverfahren, das dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt ist, von weniger als 100 nM, besonders bevorzugt weniger als 75 nM oder ganz besonders bevorzugt von weniger als 50 nM, wie beispielsweise weniger als 40 nM, 35 nM, 30 nM, 25 nM oder 20 nM auf.
Bevorzugt ist das HLA-A Tumorantigenpeptid bzw. das HLA-A-Neoantigen in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung mit einer Konzentration, wie oben definiert, von zumindest 100 bis 600 pg, alternativ bevorzugt in absoluter
Konzentration von > 600 pg bezogen auf das zu applizierende Volumen der
pharmazeutischen Zusammensetzung enthalten.
Bevorzugt sind die HLA-A Tumorantigenpeptide bzw. HLA-A-Neoantigene wie oben unter Punkt (b) definiert ausgewählt.
Nach einer besonders bevorzugten Ausgestaltung ist ein„HLA-A-Neoantigenpeptid‘ , bevorzugt, das folgende Gerüstsequenz umfasst:
(a) eine Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr.: 13 bis 19 und 27 bis 34 ausgewählt ist; und/oder
(b) ein Neoantigen mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID Nr.: 13 bis 19 und 27 bis 34; und/oder
(c) eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenz, die weniger als 100%
Sequenzidentität oder Ähnlichkeit mit dem nativen HLA-A-Antigenpeptid aufweist, wie mindestens 85 %, besonders bevorzugt zumindest 90 % Sequenzidentität (wie hierin definiert) mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID Nr.:
1 bis 5, 13 bis 19 und 27 bis 34 aufweisen; und/oder (d) eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenz, die nur einen Aminosäureaustausch gegenüber der Aminosäuresequenz(en) ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID Nr.: 1 bis 5, 13 bis 19 und 27 bis 34 umfasst bzw. im
Wesentlichen daraus besteht; und/oder
(e) Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide, die aus zumindest zwei
gleichen oder unterschiedlichen Peptidsequenzen von zumindest einem HLA-A Tumorantigenpeptid und einem HLA-A, HLA-B und/oder HLA-C Tumorantigenpeptid und/oder entsprechenden Neoantigenen daraus bestehen, in denen die HLA
Antigenpeptide gegebenenfalls durch geeignete Linker miteinander verbunden sind (sog. Oligopeptide).
Ganz besonders bevorzugt sind HLA-A Tumorantigenpeptide wie unter (b), (d) bzw. (e) definiert. Auch in der Ausführungsform gemäß (e) sind die HLA-A Tumorantigenpeptide bevorzugt wie unter (a) bzw. (d) beschrieben definiert. Im Falle, dass die HLA-A
Tumorantigenpeptide und/oder Neoantigene, wie unter (e) definiert, über einen Linker miteinander verbunden sind, so sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik geeignete Linker bekannt.
Der erfindungsgemäße Einsatz von Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide wie unter (e) definiert, die aus zumindest zwei gleichen oder unterschiedlichen
Peptidsequenzen von HLA Tumorantigenpeptiden und/oder HLA Neoantigenen bestehen, hat den weiteren Vorteil, dass die längere Aminosäuresequenzen der Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide eine längere Verweildauer in dem Gewebe des Probanden nach der Applikation bewirkt, wobei die Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide nach der Applikation an den Probanden bspw. durch körpereigene Enzyme in kleinere Fragmente (pharmazeutisch aktive Form, umfassend zumindest 7 bis 1 1
Aminosäuren), die eine biologisch gewünschte Funktion im Sinne der Erfindung aufweisen, zerlegt werden können. D.h., die einzelnen Fragmente des Oligopeptids weisen eine Aktivität als HLA-A, HLA-B oder HLA-C Tumorantigenpeptide auf und tragen somit zur Aktivierung von T-Zellen bei.
In einer besonderen Erscheinungsform kann jede beliebige HLA-A Peptidsequenz eine humanisierte und/oder sequenzoptimierte Sequenz, wie weiter hierin beschrieben, sein.
B) HLA-B Antigenpeptide und HLA-B Neoantigenpeptide
Ein„HLA-B Antigenpeptid' ist hierin definiert als ein„HLA-B Antigenpeptid der Erfindung bzw.„Aminosäuresequenz der Erfindung (wie hierin definiert), das folgendes umfasst: a) eine Aminosäuresequenz bestehend aus 12 bis 17 Aminosäuren; und/oder b) ein Neoantigenpeptide mit einer Aminosäuresequenz bestehend aus 12 bis 17
Aminosäuren, das
i) analog zu zumindest einem auf der Zelloberfläche von Zellen aus malignem
und/oder neoplastischem Gewebe (insbesondere des Mamma-/Brustkarzinoms) des zu behandelnden Individuums exponiertem HLA-B Antigenpeptid ist, und ii) in seiner Aminosäuresequenz zumindest einen Aminosäureaustausch gegenüber dem Wildtyp dieses HLA-B Antigenpeptids (sog.„HLA-B Neoantigenpeptid ') und iii) zumindest eine 3-fach erhöhte spezifische Affinität gegenüber dem T-Zell-Rezeptor der körpereigenen T-Zellen aufweist
Des Weiteren haben die Erfinder erkannt, dass HLA-B Neoantigenpeptide, die in ihrer Aminosäuresequenz gegenüber dem Wildtyp dieses HLA-B Antigenpeptids zumindest einen Aminosäureaustausch in den Aminosäurepositionen 3, 8 und/oder 10 aufweisen, eine zumindest 4-fach, besonders bevorzugt zumindest 7-fach erhöhte spezifische Affinität gegenüber dem T-Zell-Rezeptor der körpereigenen T-Zellen aufweisen und daher besonders bevorzugt für die erfindungsgemäße Formulierung eingesetzt werden.
Besonders bevorzugt ist der Aminosäureaustausch in der Aminosäuresequenz des HLA-B Antigenpeptids ein einzelner Aminosäureaustausch in der Aminosäureposition 3, 8 oder 10.
Bevorzugt ist der Aminosäureaustausch in der Aminosäuresequenz des HLA-B Neoantigens gegenüber dem Wildtyp dieses HLA-B-Antigenpeptids ein E/A, E/K, R/W oder D/A
Austausch.
Bevorzugt weist das HLA-B Antigenpeptid bzw. das HLA-B-Neoantigenpeptid gegenüber dem T-Zell-Rezeptor eine spezifische Aktivität (KD), die durch jedes geeignete
Nachweisverfahren, das dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt ist, von weniger als 100 nM, besonders bevorzugt weniger als 75 nM oder ganz besonders bevorzugt von weniger als 50 nM, wie beispielsweise weniger als 40 nM, 35 nM, 30 nM,
25 nM oder 20 nM auf.
Bevorzugt ist das HLA-B Tumorantigenpeptid bzw. das HLA-B-Neoantigen in der
erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung mit einer Konzentration, wie oben definiert, von zumindest 100 bis 600 pg, alternativ bevorzugt in absoluter
Konzentration von > 600 pg bezogen auf das zu applizierende Volumen der
pharmazeutischen Zusammensetzung enthalten. Bevorzugt sind die HLA-B Peptide bzw. HLA-B-Neoantigene wie oben unter Punkt b) definiert ausgewählt.
Nach einer besonders bevorzugten Erscheinungsform ist ein„ HLA-B- Neoantigen“ , bevorzugt, das folgende Gerüstsequenz umfasst:
(a) eine Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID Nr.: 20, 21 , 22 und 35 ausgewählt ist; und/oder
(b) eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenz, die zumindest 80 %, wie mindestens 85 %, besonders bevorzugt zumindest 90 % Sequenzidentität (wie hierin definiert) mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID Nr.: 6, 7, 8, 20, 21 , 22 und 35 aufweisen; und/oder
(c) eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenz, die nur einen
Aminosäureaustausch gegenüber der Aminosäuresequenz(en) ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID Nr.: 6, 7, 8, 20, 21 , 22 und 35 umfasst bzw. im Wesentlichen daraus besteht; und/oder
(d) Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide, die aus zumindest zwei
gleichen oder unterschiedlichen Peptidsequenzen von zumindest einem HLA-B Tumorantigenpeptid und einem HLA-A, HLA-B und/oder HLA-C Tumorantigenpeptid und/oder entsprechenden Neoantigenen daraus bestehen, in denen die HLA
Antigenpeptide gegebenenfalls durch geeignete Linker miteinander verbunden sind (sog. Oligopeptide).
Ganz besonders bevorzugt, sind HLA-B Peptide wie unter (a), (c) bzw. (d) definiert. Auch in der Ausführungsform gemäß (d) sind die HLA-B Peptide bevorzugt wie unter (a) bzw. (c) beschrieben definiert. Im Falle, dass die HLA-B Tumorantigenpeptide und/oder HLA-B Neoantigene, wie unter (e) definiert, über einen Linker miteinander verbunden sind, so sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik geeignete Linker bekannt.
Der erfindungsgemäße Einsatz von Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide wie unter (d) definiert, die aus zumindest zwei gleichen oder unterschiedlichen
Peptidsequenzen von HLA Tumorantigenpeptiden und/oder HLA Neoantigenen bestehen, hat den weiteren Vorteil, dass die längere Aminosäuresequenzen der Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide eine längere Verweildauer in dem Gewebe des Probanden nach der Applikation bewirkt, wobei die Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide nach der Applikation an den Probanden bspw. durch körpereigene Enzyme in kleinere Fragmente (pharmazeutisch aktive Form, umfassend zumindest 7 bis 1 1
Aminosäuren), die eine biologisch gewünschte Funktion im Sinne der Erfindung aufweisen, zerlegt werden können. D.h., die einzelnen Fragmente des Oligopeptids weisen eine Aktivität als HLA-A, HLA-B oder HLA-C Tumorantigenpeptide auf und tragen somit zur Aktivierung von T-Zellen bei.
In einer besonderen Erscheinungsform kann jede beliebige HLA-B Peptidsequenz eine humanisierte und/oder sequenzoptimierte Sequenz, wie weiter hierin beschrieben, sein.
C) HLA-C Antigenpeptide und HLA-C Neoantigenpeptide
Ein„HLA-C Antigenpeptid ist hierin definiert als ein„HLA-Antigenpeptid der Erfindung bzw. „Aminosäuresequenz der Erfindung (wie hierin definiert), das folgendes umfasst: a) eine Aminosäuresequenz bestehend aus 8 bis 1 1 Aminosäuren; und/oder b) ein Neoantigenpeptid mit einer Aminosäuresequenz bestehend aus 8 bis 1 1
Aminosäuren, das i) analog zu zumindest einem auf der Zelloberfläche von Zellen aus malignem
und/oder neoplastischem Gewebe (insbesondere des Mamma-/Brustkarzinoms) des zu behandelnden Individuums exponiertem HLA-C Antigenpeptid ist, und ii) in seiner Aminosäuresequenz zumindest einen Aminosäureaustausch gegenüber dem Wildtyp dieses HLA-C Peptids (sog.„HLA-C Neoantigenpeptid ') und iii) zumindest eine 3-fach erhöhte spezifische Affinität gegenüber dem T-Zell-Rezeptor der körpereigenen T-Zellen aufweist
Des Weiteren haben die Erfinder erkannt, dass HLA-C Neoantigenpeptide, die in ihrer Aminosäuresequenz gegenüber dem Wildtyp dieses HLA-C Antigenpeptids zumindest einen Aminosäureaustausch in den Aminosäurepositionen 1 (N-Terminus), 4 und/oder dem C- Terminus aufweisen, eine zumindest 4-fach, besonders bevorzugt zumindest 5-fach, ganz besonders bevorzugt zumindest 7-fach erhöhte spezifische Affinität gegenüber dem T-Zell- Rezeptor der körpereigenen T-Zellen aufweisen und daher besonders bevorzugt für die erfindungsgemäße Formulierung eingesetzt werden.
Besonders bevorzugt ist der Aminosäureaustausch in der Aminosäuresequenz des HLA-C Antigenpeptids ein einzelner Aminosäureaustausch in der Aminosäureposition 1 (N- Terminus), 4 oder dem C-Terminus.
Bevorzugt ist der Aminosäureaustausch in der Aminosäuresequenz des HLA-C
Neoantigenpeptids gegenüber dem Wildtyp dieses HLA-C Antigenpeptids ein C/Y, A/P, L/F oder T/M Austausch. Bevorzugt weist das HLA-C Antigenpeptid bzw. das HLA-C-Neoantigenpeptid gegenüber dem T-Zell-Rezeptor eine spezifische Aktivität (KD), die durch jedes geeignete
Nachweisverfahren, das dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt ist, von weniger als 100 nM, besonders bevorzugt weniger als 75 nM oder ganz besonders bevorzugt von weniger als 50 nM, wie beispielsweise weniger als 40 nM, 35 nM, 30 nM,
25 nM oder 20 nM auf.
Bevorzugt ist das HLA-C Tumorantigenpeptid bzw. das HLA-C-Neoantigen in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung mit einer Konzentration, wie oben definiert, von zumindest 100 bis 600 pg, alternativ bevorzugt in absoluter
Konzentration von > 600 pg bezogen auf das zu applizierende Volumen der
pharmazeutischen Zusammensetzung enthalten.
Bevorzugt sind die HLA-C Antigenpeptide bzw. HLA-C-Neoantigenpeptide wie oben unter Punkt b) definiert ausgewählt.
Nach einer besonders bevorzugten Erscheinungsform ist ein„HLA-C-Neoantigenpeptid‘ , bevorzugt, das folgende Gerüstsequenz umfasst:
(a) eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID Nr.: 23 bis 26; und/oder
(b) eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenz, die zumindest 80 %, wie mindestens 85 %, besonders bevorzugt zumindest 90 % Sequenzidentität (wie hierin definiert) mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID Nr.:
9 bis 12 und 23 bis 26 aufweisen; und/oder
(c) eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenz, die nur einen
Aminosäureaustausch gegenüber der Aminosäuresequenz(en) ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID Nr.: 9 bis 12 und 23 bis 26 umfasst bzw. im Wesentlichen daraus besteht; und/oder
(d) Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide, die aus zumindest zwei
gleichen oder unterschiedlichen Peptidsequenzen von zumindest einem HLA-C Tumorantigenpeptid und einem HLA-A, HLA-B und/oder HLA-C Tumorantigenpeptid und/oder entsprechenden Neoantigenen daraus bestehen, in denen die HLA
Antigenpeptide gegebenenfalls durch geeignete Linker miteinander verbunden sind (sog. Oligopeptide).
Ganz besonders bevorzugt, sind HLA-C Peptide wie unter (a), (c) bzw. (d) definiert. Auch in der Ausführungsform gemäß (d) sind die HLA-C Antigenpeptide bevorzugt wie unter (a) bzw. (c) beschrieben definiert. Im Falle, dass die HLA-C Tumorantigenpeptide und/oder HLA-C Neoantigene, wie unter (d) definiert, über einen Linker miteinander verbunden sind, so sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik geeignete Linker bekannt.
Der erfindungsgemäße Einsatz von Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide wie unter (d) definiert, die aus zumindest zwei gleichen oder unterschiedlichen
Peptidsequenzen von HLA Tumorantigenpeptiden und/oder HLA Neoantigenen bestehen, hat den weiteren Vorteil, dass die längere Aminosäuresequenzen der Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide eine längere Verweildauer in dem Gewebe des Probanden nach der Applikation bewirkt, wobei die Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide nach der Applikation an den Probanden bspw. durch körpereigene Enzyme in kleinere Fragmente (pharmazeutisch aktive Form, umfassend zumindest 7 bis 1 1
Aminosäuren), die eine biologisch gewünschte Funktion im Sinne der Erfindung aufweisen, zerlegt werden können. D.h., die einzelnen Fragmente des Oligopeptids weisen eine Aktivität als HLA-A, HLA-B oder HLA-C Tumorantigenpeptide auf und tragen somit zur Aktivierung von T-Zellen bei.
In einer besonderen Erscheinungsform kann jede beliebige HLA-C Antigenpeptidsequenz eine humanisierte und/oder sequenzoptimierte Sequenz, wie weiter hierin beschrieben, sein.
D) HLA Antigenpeptide der Klasse II und HLA-II Neoantigenpeptide
Ein„HLA Antigenpeptid der Klasse lt‘ ist hierin definiert als ein„HLA-Peptid der Erfindung“ bzw.„Aminosäuresequenz der Erfindung (wie hierin definiert), die folgendes umfasst: a) eine Aminosäuresequenz bestehend aus 13 bis 20 Aminosäuren, besonders bevorzugt 13 bis 17 Aminosäuren; und/oder b) ein Neoantigen mit einer Aminosäuresequenz bestehend aus 13 bis 20 Aminosäuren, besonders bevorzugt 13 bis 17 Aminosäuren, das
i) analog zu zumindest einem auf der Zelloberfläche von Zellen aus malignem
und/oder neoplastischem Gewebe (insbesondere des Mamma-/Brustkarzinoms) des zu behandelnden Individuums exponiertem HLA Peptid der Klasse II ist, und ii) in seiner Aminosäuresequenz zumindest einen Aminosäureaustausch gegenüber dem Wildtyp dieses HLA Peptids der Klasse II (sog.„HLA Neoantigen der Klasse lf‘) und
iii) zumindest eine 3-fach erhöhte spezifische Affinität gegenüber dem T-Zell-Rezeptor der körpereigenen T-Zellen aufweist Des Weiteren haben die Erfinder erkannt, dass HLA Neoantigene der Klasse II, die in ihrer Aminosäuresequenz gegenüber dem Wildtyp dieses HLA Peptids der Klasse II zumindest einen Aminosäureaustausch in den Aminosäurepositionen 3, 6, 10, 12, 13 und/oder 14, besonders bevorzugt in den Aminosäurepositionen 12 und/oder 14 aufweisen, eine zumindest 4-fach erhöhte spezifische Affinität gegenüber dem T-Zell-Rezeptor der körpereigenen T-Zellen aufweisen und daher besonders bevorzugt für die erfindungsgemäße Formulierung eingesetzt werden.
Besonders bevorzugt ist der Aminosäureaustausch in der Aminosäuresequenz des HLA Peptids der Klasse II ein einzelner Aminosäureaustausch in der Aminosäureposition 12 oder 14.
Bevorzugt ist der Aminosäureaustausch in der Aminosäuresequenz des HLA Neoantigens der Klasse II gegenüber dem Wildtyp dieses HLA Peptids der Klasse II ein E/K, E/A, D/Y oder T/M Austausch.
Bevorzugt weist das HLA Peptid der Klasse II bzw. das HLA-Neoantigen der Klasse II gegenüber dem T-Zell-Rezeptor eine spezifische Aktivität (KD), die durch jedes geeignete Nachweisverfahren, das dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt ist, von weniger als 100 nM, besonders bevorzugt weniger als 75 nM oder ganz besonders bevorzugt von weniger als 50 nM, wie beispielsweise weniger als 40 nM, 35 nM, 30 nM,
25 nM oder 20 nM auf.
Bevorzugt ist das HLA Tumorantigenpeptid entsprechend der MHC-Komplexe der Klasse II bzw. das HLA-Neoantigen entsprechend der MHC-Komplexe der Klasse II in der
erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung mit einer Konzentration, wie oben definiert, von zumindest 100 bis 600 gg, alternativ bevorzugt in absoluten
Konzentration von > 600 gg bezogen auf das zu applizierende Volumen der
pharmazeutischen Zusammensetzung enthalten.
Bevorzugt sind das/die HLA Peptid(e) der Klasse II bzw. HLA-Neoantigen(e) der Klasse II wie oben unter Punkt b) definiert ausgewählt.
Nach einer besonders bevorzugten Erscheinungsform ist ein„HLA-Neoantigen der Klasse II“, bevorzugt, das folgende Gerüstsequenz umfasst:
(a) eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID Nr.: 36, 37, 38,
41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48; und/oder
(b) ein Neoantigen mit einer Aminosäuresequenz, die zumindest 80 %, wie mindestens 85 %, besonders bevorzugt zumindest 90 % Sequenzidentität (wie hierin definiert) mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID Nr.: 36 bis 48; aufweisen; und/oder
(c) ein Neoantigen mit einer Aminosäuresequenz, die nur einen Aminosäureaustausch gegenüber der Aminosäuresequenz(en) ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID Nr.: 36 bis 48; umfasst bzw. im Wesentlichen daraus besteht; und/oder
(d) Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide, die aus zumindest zwei
gleichen oder unterschiedlichen HLA Peptidsequenzen der Klasse II bestehen, in denen die HLA Antigenpeptide der Klasse II durch geeignete Linker miteinander verbunden sind (sog. Oligopeptide).
(e) Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide, die aus zumindest zwei
gleichen oder unterschiedlichen Peptidsequenzen von zumindest einer HLA
Antigenpeptidsequenz der Klasse II und einer HLA Antigenpeptidsequenz der Klasse II, HLA-A, HLA-B und/oder HLA-C Antigenpeptidsequenz und/oder entsprechenden Neoantigenen daraus bestehen, in denen die HLA Antigenpeptide gegebenenfalls durch geeignete Linker miteinander verbunden sind (sog. Oligopeptide).
Ganz besonders bevorzugt, sind HLA Antigenpeptide der Klasse II wie unter (a), (c) bzw. (d) definiert. Auch in der Ausführungsform gemäß (d) sind die HLA Antigenpeptide der Klasse II bevorzugt wie unter (a) bzw. (c) beschrieben definiert. Im Falle, dass die HLA
Tumorantigenpeptide der Klasse II und/oder entsprechende Neoantigene, wie unter (d) definiert, über einen Linker miteinander verbunden sind, so sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik geeignete Linker bekannt.
Der erfindungsgemäße Einsatz von Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide wie unter (d) definiert, die aus zumindest zwei gleichen oder unterschiedlichen
Peptidsequenzen von HLA Tumorantigenpeptiden und/oder HLA Neoantigenen bestehen, hat den weiteren Vorteil, dass die längere Aminosäuresequenzen der Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide eine längere Verweildauer in dem Gewebe des Probanden nach der Applikation bewirkt, wobei die Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide nach der Applikation an den Probanden bspw. durch körpereigene Enzyme in kleinere Fragmente (pharmazeutisch aktive Form, umfassend zumindest 7 bis 1 1
Aminosäuren), die eine biologisch gewünschte Funktion im Sinne der Erfindung aufweisen, zerlegt werden können. D.h., die einzelnen Fragmente des Oligopeptids weisen eine Aktivität als HLA-A, HLA-B oder HLA-C Tumorantigenpeptide auf und tragen somit zur Aktivierung von T-Zellen bei. In einer besonderen Erscheinungsform kann jede beliebige HLA Peptidsequenz der Klasse II eine humanisierte und/oder sequenzoptimierte Sequenz, wie weiter hierin beschrieben, sein.
Der erfindungsgemäße Einsatz von zumindest 2 HLA Tumorantigenpeptide der Klasse II zur Behandlung von Brustkrebs hat den signifikanten Vorteil, dass zielgerichtet auch B-Zellen beim zu behandelnden Probanden aktiviert werden.
Der erfindungsgemäße Einsatz von HLA Tumorantigenpeptide der Klasse II hat den weiteren Vorteil, dass HLA Antigenpeptide, die gegenüber HLA Tumorantigenpeptide der Klasse I eine längere Aminosäuresequenzen aufweisen, nach der Applikation an den Probanden bspw. durch körpereigene Enzyme in kleinere Fragmente (umfassend zumindest 7 bis 1 1 Aminosäuren) zerlegt werden können, die eine Aktivität als HLA-A, HLA-B oder HLA-C Antigenpeptide aufweisen und somit zur Aktivierung von T-Zellen beitragen.
Unter "Fragment" versteht man einen Teil eines Polypeptids, das vorzugsweise mindestens 10%, 20%, 30%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% oder mehr der gesamten Länge des Referenz-Polypeptids enthält. Ein Fragment kann 7, 8, 9, 10, 1 1 oder mehr Aminosäuren enthalten.
Insbesondere sind Aminosäuresequenzen und Polypeptide der Erfindung bevorzugt wie diese in den Ansprüchen definiert sind und solche, bei denen: zumindest ein HLA-Tumorantigenpeptid analog zu zumindest einem auf der Zelloberfläche von Zellen aus malignem und/oder neoplastischem Gewebe des zu behandelnden
Individuums exponiertem HLA-Tumorantigenpeptid ist, welches in seiner
Aminosäuresequenz zumindest einen Aminosäureaustausch gegenüber dem Wildtyp dieses HLA-Tumorantigenpeptids (d.h. HLA Neoantigenpeptid) und im Vergleich zum Wildtyp dieses HLA-Tumorantigenpeptids zumindest eine 3-fach erhöhte spezifische Affinität gegenüber dem T-Zell-Rezeptor der körpereigenen T-Zellen aufweist.
Es ist eine herausragende Leistung der Erfinder, herausgefunden zu haben, dass eine pharmazeutische Zusammensetzung die mehr als 3 derartige HLA-Tumorantigenpeptide umfasst, besonders wirksam ist. Daher umfasst die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung bevorzugt zumindest sechs, ganz besonders bevorzugt zumindest acht, ganz besonders bevorzugt zehn der vorgenannten HLA-Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC-Komplexe der Klasse I und/oder II umfasst. Bevorzugt ist eine monovalente Aminosäuresequenz (oder ein Polypeptid, das nur eine Aminosäuresequenz der Erfindung umfasst), die in der Erfindung verwendet wird, solch eine, dass sie an einen T-Zell-Rezeptor der körpereigenen T-Zellen mit einer gegenüber der entsprechenden Wildtyp-HLA-Peptidsequenz 3-fach erhöhten spezifische Affinität binden.
Es wird darauf hingewiesen, dass„kann spezifisch binden an“ und„bindet spezifisch an“ hierin synonym verwendet werden und sich auf die Fähigkeit beziehen, speziell an die entsprechend angegebene Einheit zu binden.
Wichtig in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist, dass die Diagnose der Krebserkrankung(en) bereits im Vorfeld durch den behandelnden Arzt erfolgt.
Es ist möglich, die in der Erfindung verwendeten Aminosäuresequenzen, die zu
unterschiedlichen Klassen gehören, in einem einzelnen Polypeptid der Erfindung zu kombinieren. Insbesondere wurde nachgewiesen, dass die Kombination von HLA-A, HLA-B und/oder HLA-C Tumorantigenpeptiden und/oder entsprechenden Neoantigenpeptiden in einem einzelnen Polypeptid der Erfindung einzigartige Bindungseigenschaften aufweisen (vgl. Fig. 3).
Vom Fachmann kann die spezifische Aktivität (KD) der Polypeptide der Erfindung, die mehr als eine Komponente der Aminosäuresequenz der HLA-A, HLA-B und/oder HLA-C
Tumorantigenpeptide und/oder Neoantigenpeptide entsprechend der MHC-Komplexe der Klasse I oder II umfassen, nach einem der oben/unten beschriebenen Nachweisverfahren bestimmt werden, wobei die Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide der Erfindung vorzugsweise eine spezifische Aktivität aufweisen, die der spezifischen Aktivität jedes ihrer Bestandteile ähnelt, d.h. eine spezifische Aktivität, die der spezifischen Aktivität jeder der (Einzelkomponenten der) Aminosäuresequenzen der Klasse I oder II ähnelt, die in den Verbindungen, Konstrukten, Proteinen oder Polypeptiden der Erfindung enthalten sind. Einige spezifische, jedoch nicht einschränkende Beispiele der oben genannten bevorzugten Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide sind Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide, die entweder i) ein Wildtyp HLA-Tumorantigenpeptid entsprechend der MHC-Komplexe der Klasse I (HLA-A, HLA-B bzw. HLA-C Peptid) und/oder II; oder ii) ein Neoantigen entsprechend der MHC-Komplexe der Klasse I (HLA-A, HLA-B bzw. HLA-C Neoantigen) und/oder II mit einer Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID Nr.: 1 bis 48 ausgewählt sind; oder
iii) ein Neoantigen entsprechend der MHC-Komplexe der Klasse I (HLA-A, HLA-B bzw.
HLA-C Neoantigen) und/oder II mit einer Aminosäuresequenz, die zumindest 80 % Sequenzidentität (wie hierin definiert) mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID Nr.: 1 bis 48 aufweisen; oder
iv) eine Aminosäuresequenz, die nur einen Aminosäureaustausch gegenüber der
Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID Nr.: 1 bis 48 umfasst bzw. im Wesentlichen daraus besteht; oder
v) Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide, die aus zumindest zwei
gleichen oder unterschiedlichen HLA-Antigenpeptidsequenzen bestehen, in denen die HLA-Peptide gegebenenfalls durch geeignete Linker miteinander verbunden sind; oder einer geeigneten Kombination daraus umfassen.
Es ist zu beachten, dass die letzten vorherigen Abschnitte auch im Allgemeinen für alle Aminosäuresequenzen der Erfindung gelten, die eine oder mehrere Aminosäuresequenzen für HLA-Tumorantigenpeptide und/oder HLA-Neoantigenpeptide nach A), B), C) bzw. D) umfassen.
Selbstverständlich können alle oben genannten HLA Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC-Komplexe der Klasse I und II verwendet werden und sind zur Behandlung einer Krebserkrankung, wie hierin offenbart, insbesondere zur Behandlung von Mamma- /Brustkarzinomen wirksam.
Einige spezielle, jedoch nicht einschränkende Beispiele solcher Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide der Erfindung sind beispielsweise in den Tabellen 1 -4 aufgeführt oder ergeben sich für den Fachmann auf Grundlage der vorliegenden Offenbarung.
Nach einer anderen bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung liegt das HLA- Tumorantigenpeptid (jeweils) als einzelgliedrige Aminosäuresequenz vor, d.h. nicht als Element von Verbindungen, Konstrukten, Proteinen oder Polypeptiden, die aus zumindest zwei gleichen oder unterschiedlichen Aminosäuresequenzen für HLA- Tumorantigenpeptiden/Neoantigenen bestehen, in denen die HLA- Tumorantigenpeptide/Neoantigene durch geeignete Linker miteinander verbunden.
Vorzugsweise weisen die HLA-Tumorantigenpeptide der Erfindung eine spezifische Aktivität gegenüber T-Zell-Rezeptoren (T-Zellen werden dafür benutzt) auf, die anhand eines beliebigen geeigneten Nachweisverfahrens, das dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt ist, wie beispielsweise anhand von EliSpot AlphaScreen-Nachweisverfahren (wie hierin beschrieben) oder zellbasierten Nachweisverfahren (wie hierin beschrieben) bestimmt werden können. Vorzugsweise wird die blockierende Aktivität anhand eines zellbasierten Nachweisverfahrens bestimmt, wie beispielsweise in den Ausführungsbeispielen 3 und 4 beschrieben.
Insbesondere weisen die Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide der
Erfindung, die eine Aminosäuresequenz eines HLA-Antigenpeptids der Erfindung umfassen und zur MHC Klasse I gehören (wie hierin definiert), vorzugsweise gegenüber dem entsprechenden T-Zell-Rezeptor eine spezifische Affinität von 10 bis 50 nM auf.
Auch ist es Bestandteil der vorliegenden Erfindung, dass eine Aminosäuresequenz der Erfindung an zwei oder mehrere MHC-Komplexe der Klasse I bzw. II, Epitope,
Komponenten, Domänen oder Untereinheiten eines MHC-Komplexes der Klasse I bzw. II binden können. In solch einem Fall können die MHC-Komplexe, Epitope, Komponenten, Domänen oder Untereinheiten eines MHC-Komplexes, an die die Aminosäuresequenzen und/oder Polypeptide der Erfindung binden, im Wesentlichen gleich oder unterschiedlich sein (und im letzteren Falle können die Aminosäuresequenzen und Polypeptide der Erfindung an solche unterschiedlichen Komplexe, Epitope, Komponenten, Domänen oder Untereinheiten eines MHC-Komplexes der Klasse I bzw. II einschließlich Kombinationen davon mit einer Affinität und/oder Spezifität binden, die gleich oder unterschiedlich sein kann).
Es wird außerdem erwartet, dass die Polypeptide der Erfindung im Allgemeinen an alle natürlich vorkommenden oder synthetischen Analoga, Varianten, Mutanten, Komponenten und Fragmente eines MHC-Komplexes der Klasse I bzw. II binden. Auch in solch einem Fall können die Aminosäuresequenzen und Polypeptide der Erfindung an solche Analoga, Varianten, Mutanten, Allelen, Komponenten und Fragmente mit einer Affinität und/oder Spezifität binden, die der Affinität und Spezifität, mit der die Aminosäuresequenzen der Erfindung an den Wildtypen des MHC-Komplexes der Klasse I bzw. II binden gleich oder verschieden sein.
Auch ist es Bestandteil dieser Erfindung, dass die Aminosäuresequenzen und Polypeptide der Erfindung an einige Analoga, Varianten oder Mutanten eines MHC-Komplexes der Klasse I bzw. II binden, jedoch nicht an andere.
In einer spezifischen, jedoch nicht einschränkenden Erscheinungsform dieser Erfindung können Verbindungen, Konstrukte, Proteine oder Polypeptide, die ein HLA- Tumorantigenpeptid der Erfindung umfassen, eine erhöhte Halbwertszeit im Serum im Vergleich zu der Aminosäuresequenz aufweisen, von der sie abgeleitet wurden. Zum Beispiel kann eine Aminosäuresequenz dieser Erfindung (chemisch oder anderweitig) mit einer oder mehrerer Gruppen oder Einheiten verbunden sein, die die Halbwertszeit (wie beispielsweise PEG) verlängern, sodass sie ein Derivat einer Aminosäuresequenz der Erfindung mit erhöhter Halbwertszeit darstellen.
Im Allgemeinen haben die Verbindungen oder Polypeptide der Erfindung mit erhöhter Halbwertszeit vorzugsweise eine Halbwertszeit, die mindestens 1 ,5-mal, vorzugsweise mindestens 2-mal, wie beispielsweise mindestens 5-mal, zum Beispiel mindestens 10-mal oder mehr als 20-mal höher ist als die Halbwertszeit der entsprechenden
Aminosäuresequenz der Erfindung an sich. Zum Beispiel haben die Verbindungen oder Polypeptide der Erfindung mit erhöhter Halbwertszeit eine Halbwertszeit, die mehr als 1 Stunde, vorzugsweise mehr als 2 Stunden, besonders bevorzugt mehr als 6 Stunden, wie beispielsweise mehr als 12 Stunden oder sogar mehr als 24, 48 oder 72 Stunden höher ist im Vergleich zur entsprechenden Aminosäuresequenz der Erfindung an sich.
Im Allgemeinen, wenn ein HLA-Tumorantigenpeptid der Erfindung (oder eine Verbindung, ein Konstrukt oder Polypeptid, die dasselbe umfassen) für die Verabreichung an einen Patienten vorgesehen ist (zum Beispiel für therapeutische und/oder diagnostische Zwecke, wie hierin definiert) ist dieses bevorzugt entweder eine Aminosäuresequenz, die nicht natürlich im Patienten vorkommt; oder, wenn diese natürlich im Patienten vorkommt, liegt diese in wesentlich isolierter und zugleich konzentrierter Form vor (wie hierin definiert).
Außerdem wird es für den Fachmann auch klar sein, dass bei pharmazeutischer
Verwendung die HLA-Tumorantigenpeptide der Erfindung (sowie die Verbindungen,
Konstrukte und Polypeptide, die dasselbe umfassen) gegen einen menschlichen T -Zell- Rezeptor einschließlich Kombinationen davon wie in den Ansprüchen definiert, gerichtet werden; wobei zu veterinären Zwecken die Polypeptide der Erfindung bevorzugt gegen einen T-Zell-Rezeptor einschließlich Kombinationen davon (wie in den Ansprüchen festgelegt) von der zu behandelnden Spezies gerichtet sind oder zumindest kreuzreaktiv gegenüber einem T-Zell-Rezeptor einschließlich Kombinationen davon von den zu behandelnden Spezies sind.
Das zu behandelnde Mamma-/Brustkarzinom ist vorzugsweise ein hormonpositiver,
HER2/neu oder tripple negativer Brustkrebs.
Verfahren zum Ermitteln/Identifizieren der HLA-Antigenpeptide
Von der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zum Bestimmen pharmazeutisch wirksamer HLA-Tumorantigenpeptide zur Verwendung bei der Behandlung oder zur Profilaxe von Mamma-/Brustkarzinomen bzw. in einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzung umfasst, wobei das Verfahren das Überwachen einer Gewebesektion eines Patienten bzw. einer Patientengruppe umfasst, der/die an einem Mamma- /Brustkarzinom erkrankt ist oder im Verdacht steht, an einem Mamma-/Brustkarzinom zu erkranken, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:
(a) Bereitstellen einer Gewebeprobe aus einer Gewebesektion, vorzugsweise eines Mamma-/Brustkarzinoms des Patienten bzw. der Patientengruppe, wobei die Zellen der Gewebeprobe MHC-Komplexe der Klasse I und/oder II exprimieren und diese auf ihrer Oberfläche präsentiert werden, wobei der genannte
Verfahrensschritt (a) des Bereitstellens der Gewebeprobe selbst keinen chirurgischen Eingriff in den Patienten bzw. einen der Patienten der
Patientengruppe umfasst;
(b) Bestimmen folgender Parameter anhand der bereitgestellten Gewebeprobe der Gewebesektion aus Schritt (a):
i) dem Transkriptom der bereitgestellten Gewebeprobe zum Ermitteln aller in mRNA-Sequenzen umgeschriebener DNA-Sequenzen und zum
Quantifizieren der mRNA-Sequenzen, und
Vergleichen des ermittelten Transkriptoms mit dem Transkriptom einer gesunden Gewebeprobe des Patienten bzw. der Patientengruppe zum Bestimmen hoch- und/oder runterregulierter mRNA-Sequenzen, die um den Faktor 3 zum Schwellwert in der gesunden Gewebeprobe abweichen; ii) dem spezifischen HLA Haplotyp, vorzugsweise einschließlich der HLA- Haplosubtypen des Patienten bzw. der Patientengruppe, und ganz besonders bevorzugt in Bezug auf die MHC-Klasse-I-Komplexe, und gegebenenfalls Ableiten der präferierten Ankerpositionen der MHC-Klasse- I-Komplexe (wie hierin definiert);
iii) der Exomsequenz der bereitgestellten Gewebeprobe zum Ermitteln aller DNA-Sequenzen, die potenziell für Proteine codieren, und
Vergleichen des Exoms der bereitgestellten Gewebeprobe mit dem Exom einer gesunden Gewebeprobe oder mit einer Gendatenbank (Bibliothek) des Patienten bzw. der Patientengruppe zur Bestimmung somatischer Mutationen,
wodurch vorteilhaft Keimbahnmutationen im gesunden Gewebe
ausgeschlossen werden, sodass eine Autoimmunantwort bei/nach
Applikation der ermittelten HLA-Antigenpeptide an den Patienten bzw. die Patientengruppe verhindert wird (die Gewinnung einer gesunden Gewebeprobe des Patienten bzw. die Patientengruppe kann bspw. durch Entnahme einer Blutprobe mit kernhaltigen Zellen erfolgen); und
Ermitteln der HLA-Tumorantigenpeptide, mit der Proliferation, Invasivität, Angiogenese und einer Erhöhung der Zytokeratinproduktion des Mamma- /Brustkarzinoms assoziiert sind; und
Ermitteln der HLA-Tumorantigenpeptide, die mit der Proliferation,
Invasivität, Angiogenese und einer Erhöhung der Zytokeratinproduktion eines MammaVBrustkarzinoms assoziiert sind;
iv) des Ligandoms zum Bestimmen der in Schritt (iii) ermittelten HLA- Tumorantigenpeptide, die auf der Oberfläche der Zellen des Mamma- /Brustkarzinoms präsentiert sind,
wobei optional auch die HLA-Antigenpeptide bestimmt werden, die auf der Oberfläche von Zellen einer gesunden Gewebeprobe des Patienten bzw. der Patientengruppe präsentiert sind;
v) der spezifischen Bindungsaffinität der in Schritt (iv) ermittelten HLA
Tumorantigenpeptide gegenüber dem entsprechenden MHC-Komplex der Klasse I und/oder II, der in den Zellen der Gewebeprobe, vorzugsweise eines MammaVBrustkarzinoms exprimiert und auf der Oberfläche dieser Zellen präsentiert wird, mittels Datenbank und/oder eines Rankingalgoritmus; und/oder
vi) optional der Immunogenität der in Schritt (iv) ermittelten HLA- Tumorantigenpeptide mittels eines Immunogenitätstests insbesondere mittels Westernblot, ELISA-Techniken, insbesondere mittels ELISPOT, AFM oder Immunodetektion mit mikroskopischer Analyse;
(c) Auswahl von HLA-Tumorantigenpeptiden, vorzugsweise zumindest 4 bis 8 HLA-A Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und zumindest 2 Antigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-Il-Komplexe, die die Kriterien gemäß der in Schritt (b) definierten Parameter erfüllen und die in den Zellen der bereitgestellten Gewebeprobe exprimiert und auf der Oberfläche dieser Zellen präsentiert werden.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens zum Bestimmen pharmazeutisch wirksamer HLA-Tumorantigenpeptide erfolgt unmittelbar nach dem Bereitstellen der Gewebeprobe des Patienten oder der Patientengruppe in Schritt (a) die Untersuchung der Gene BRCA1 und BRCA2 auf das Vorliegen von Mutationen.
Besonders bevorzugt erfolgt das Bestimmen, ob die HLA-Tumorantigenpeptide auf der Oberfläche der Zellen der in Schritt a) bereitgestellten Gewebeprobe des Patienten oder der Patientengruppe präsentiert werden, mittels Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie (UHPCL) in Verbindung mit ESI Massenspektrometrie (MS) erfolgt.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung umfasst das Verfahren zum Ermitteln eines HLA- Peptids der Klasse I und/oder II in Schritt (b) das Erstellen eines Transkriptoms der
Gewebeprobe, die in Schritt (a) bereitgestellt wird.
Bevorzugt erfolgt das Erstellen des Transkriptoms mittels RT-PCR, wobei im Anschluss ein DNA-Microarray oder eine DNA-Sequenzierung durchgeführt wird.
Besonders bevorzugt umfasst das Verfahren zum Ermitteln eines HLA-Antigenpeptids der Klasse I und/oder II in Schritt (b) das Erstellen einer Exomsequenzierung für diese
Gewebeprobe, die in Schritt (a) bereitgestellt wird.
Es ist auch wünschenswert, dass das Verfahren zum Ermitteln eines pharmazeutisch aktiven HLA-Tumorantigenpeptids der Klasse I und/oder II in Schritt (b) das Abgleichen der ermittelten Aminosäuresequenzen der HLA-Antigenpeptide entsprechend der MHC- Komplexe der Klasse I und/oder II mit einer Reihe, Sammlung oder Bibliothek von
Aminosäuresequenzen umfasst, umso ein Ranking hinsichtlich Proteinquantität (d.h.
Faktoren, die mit der Proliferation, Invasivität, Angiogenese und/oder einer Erhöhung der Zytokeratinproduktion des Mamma-/Brustkarzinoms assoziiert sind) und der spezifischen Affinität gegenüber dem T-Zell-Rezeptor der körpereigenen T-Zellen (inhaltliche Faktoren für Tumorprogress, wie Invasivität, Angiogenese, aber auch die Escape Mechanismen des Tumors gegenüber dem Immunangriff) abzuleiten.
Das Verfahren umfasst auch das Abgleichen der ermittelten Parameter mit
Aminosäuresequenzen der HLA Tumorantigenpeptide mit einer Reihe, Sammlung oder Bibliothek von Aminosäuresequenzen gesunder Expressionsdaten auf
Aminosäuresequenzen, die an MHC-Klasse-I-Komplexe bzw. MHC-Klasse-Il-Komplexe einschließlich Kombinationen davon, ermittelt in Schritt (i), binden können oder eine Affinität dafür aufweisen.
In solch einem Verfahren kann die Reihe, Sammlung oder Bibliothek von
Aminosäuresequenzen eine geeignete Reihe, Sammlung oder Bibliothek von
Aminosäuresequenzen sein. Zum Beispiel kann die Reihe, Sammlung oder Bibliothek von Aminosäuresequenzen eine Reihe, Sammlung oder Bibliothek von HLA- Tumorantigenpeptiden und/oder MHC-Komplexen der Klasse I und Klasse II (wie hierin beschrieben sein), wie beispielsweise eine native Reihe, Sammlung oder Bibliothek von HLA-Tumorantigenpeptiden und/oder MHC-Komplexen der Klasse I und Klasse II sein; eine synthetische oder halbsynthetische Reihe, Sammlung oder Bibliothek von HLA- Tumorantigenpeptiden und/oder MHC-Komplexen der Klasse I und Klasse II und/oder eine Reihe sein; eine Sammlung oder Bibliothek von HLA-Tumorantigenpeptiden und/oder MHC- Komplexen der Klasse I und Klasse II, die einer Affinitätsreifung unterzogen wurden.
Um die pharmazeutische Wirksamkeit der durch das abgeleitete Ranking ermittelten HLA- Tumorantigenpeptide zu spezifizieren und um das Risiko einer Autoimmunantwort in dem Probanden durch die Verabreichung der ermittelten HLA-Tumorantigenpeptide zu verhindern bzw. zu minimieren, wird mit den, durch das erfindungsgemäße Ermittlungsverfahren (vor-)ermittelten HLA-Tumorantigenpeptiden ein Immunogenitätstest, insbesondere mittels Westernblot, ELISA-Techniken, insbesondere mittels ELISPOT, AFM oder Immunodetektion mit mikroskopischer Analyse durchgeführt. Vorteilhaft kann bei dieser Erscheinungsform des Verfahrens zum Ermitteln zumindest eines pharmazeutisch wirksamen HLA- Tumorantigenpeptids auf das zeit- und kostenaufwändige Erstellen eines Transkriptoms und die Exomsequenzierung für diese Gewebeprobe verzichtet werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Verfahren zum Bestimmen der Regression, des Verlaufs oder des Auftretens einer Erkrankung an einem Mamma-/Brustkarzinom, umfassend das Überwachen einer Gewebesektion, insbesondere eines Brustgewebes eines Patienten, der an einem Mamma-/Brustkarzinom erkrankt ist oder im Verdacht steht, an einem Mamma-/Brustkarzinom zu erkranken, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:
(a) Bereitstellen einer Gewebeprobe eines Probanden, wobei die Zellen der
Gewebeprobe HLA-Komplexe der Klasse I und/oder II exprimieren und auf ihrer Zelloberfläche präsentieren;
(b) Bestimmen mehrere Parameter anhand der bereitgestellten Gewebeprobe,
ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
i) der Konzentration (dem Expressionsniveau) von zumindest 4 bis 8 HLA-A Antigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und zumindest 2 Antigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-Il-Komplexe, die in den Zellen der bereitgestellten Gewebeprobe exprimiert und auf der
Zelloberfläche dieser Zellen präsentiert werden; und ii) der Aminosäuresequenz zumindest dieser 4 bis 8 HLA-A Antigenpeptide und zumindest dieser 2 Klasse-Il-Antigenpeptiden, die in den Zellen der bereitgestellten Gewebeprobe exprimiert und auf der Zelloberfläche dieser Zellen präsentiert werden; und
iii) der spezifischen Bindungsaffinität der in Schritt ii) ermittelten HLA-A
Antigenpeptide und der Klasse-Il-Antigenpeptide gegenüber dem T-Zell- Rezeptor der körpereigenen T-Zellen; und
iv) optional der Immunogenität der ermittelten HLA-A Antigenpeptide und der Klasse-Il-Antigenpeptide mittels eines Immunogenitätstests (z.B. mittels Westernblot, ELISA-Techniken, insbesondere mittels ELISPOT oder Immunodetektion mit mikroskopischer Analyse);
(c) Abgleichen der ermittelten Aminosäuresequenzen der HLA Antigenpeptide mit einer Reihe, Sammlung oder Bibliothek von Aminosäuresequenzen auf Aminosäuresequenzen, die an MHC-Klasse-I-Komplexe bzw. MHC-Klasse-Il- Komplexe einschließlich Kombinationen davon, ermittelt in Schritt (i), binden können oder eine Affinität dafür aufweisen.
Eine weitere, insbesondere kostenreduzierte Erscheinungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Ermitteln zumindest eines HLA-Tumorantigenpeptids entsprechend der MHC-Komplexe der Klasse I und/oder II für eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung sieht vor, dass ausschließlich (d.h. ohne vorangehendes Erstellen eines Transkriptoms, Exomsequenzierung) die HLA-Tumorantigenpeptide der Klasse I und/oder II ermittelt werden, die auf der Zelloberfläche von Zellen aus malignem und/oder
neoplastischem Gewebe des zu behandelnden Individuums exponiert sind (sog. Bestimmen des Ligandoms).
Das Verfahren besteht hierbei aus den folgenden Schritten:
a) Bereitstellen einer Gewebeprobe aus einer Gewebesektion eines Probanden, der vorzugsweise ein lokal wiederkehrenden Mamma-/Brustkarzinom aufweist oder im Verdacht steht, an einem Mamma-/Brustkarzinom zu erkranken; und b) Ermitteln/Auswahl der HLA-Tumorantigenpeptide, die auf der Zelloberfläche der Zellen des entnommenen Gewebes exponiert sind entsprechend des Bestimmens der Parameter anhand der bereitgestellten Gewebeprobe aus Schritt (a) gemäß Schritt (b) des vorgenannten Verfahrens zum Bestimmen pharmazeutisch wirksamer HLA-Tumorantigenpeptide (wie oben definiert); und c) Bestimmen der Affinität der HLA-Tumorantigenpeptide, die auf der Zelloberfläche der Zellen des entnommenen Gewebes exponiert sind, gegenüber dem T -Zell- Rezeptor der körpereigenen T-Zellen; und
d) Ableiten eines Rankings hinsichtlich Proteinquantität (wie hierin spezifiziert) und spezifischer Affinität (KD) gegenüber den T-Zell-Rezeptoren der körpereigenen T- Zellen;
wobei die Sequenz und/oder die Sequenzkombination ein HLA-Tumorantigenpeptid entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und/oder MHC-Klasse-Il-Komplexe oder eine Kombination von HLA-Tumorantigenpeptiden davon ist und wobei die einzelnen Sequenzen aus den Sequenzen einer Datenbank mit Nukleinsäuren ausgewählt werden.
Ausführliche Beschreibung und Definitionen
In der vorliegenden Beschreibung und den vorliegenden Ansprüchen werden folgende Begriffe wie folgt definiert:
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sollen die mit„umfassend” bestimmten Merkmale der Erfindung so verstanden werden, dass sie die stärker beschränkte Beschreibung von "bestehend aus” oder”im Wesentlichen bestehend aus” der gleichen Merkmale der vorliegenden Erfindung enthalten.
Der Begriff„und/oder“ dient der spezifischen Offenbarung der beiden Merkmale oder Komponenten miteinander oder getrennt voneinander. Daher schließt der Begriff„und/oder“ wie beispielsweise bei der Formulierung„I und/oder II“ verwendet in der vorliegenden Offenbarung„I und II“,„I oder II“,„I“ und„II“ ein.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung ist hierin als sog. Informatikum zu verstehen, dass einem Patienten oder einer Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel verabreicht werden kann und die die erfindungsgemäße Kombination an HLA- Tumorantigenpeptide in der hierin offenbarten Konzentration enthält, wobei ein HLA- Tumorantigenpeptid einen Informationsträger darstellt. Dies bedeutet, dass durch die Anordnung der Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der HLA-Tumorantigenpeptide („Code“) eine sequenzspezifische Aktivierung des Immunsystems, insbesondere von T- Zellen (durch HLA-Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe) und/oder B-Zellen (durch HLA-Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-Il- Komplexe) induziert wird. Somit macht die in vitro oder in vivo Beladung von MHC-Klasse-I- Komplexe bzw. MHC-Klasse-Il-Komplexe der Tumorzellen mit den HLA- Tumorantigenpeptiden der erfindungsgemäßen pharmazeutische Zusammensetzung, die eine gleiche oder geringfügig modifizierte Aminosäuresequenz mit HLA- Tumorantigenpeptiden aufweisen, bzw. das Kontaktieren von T-Zellen mit diesen HLA- Tumorantigenpeptiden Tumorzellen sensitiv für die Lyse der Tumorzellen des Gewebes bzw. der Gewebesektion durch spezifische zytotoxische oder spezifisch aktivierte T-Lymphozyten.
Primäres Ziel der vorliegenden Erfindung ist allerdings nicht die in vitro oder in vivo Beladung von Tumorzellen mit HLA-Tumorantigenpeptiden, sondern die gezielte Aktivierung und das Trainieren des Immunsystems, insbesondere von T-Zellen und B-Zellen gegenüber
Tumorzellen zu induzieren. Aus diesem Grund wird die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung vorzugsweise subkutan oder intradermal und, vorzugsweise im
Wesentlichen gleichzeitig (d.h. sukzessive) an zumindest 2, besonders bevorzugt an zumindest 3 Applikationsorten, entfernt von einer Tumorläsion und/oder dem krebsartigen Lymphknotenbereich appliziert. Dies hat den besonderen Vorteil, dass das Immunsystem bzw. die T-Zellen, die die applizierten HLA-Tumorantigenpeptiden erkennen, diese in Form von Tumorantigenpeptiden applizierte Information verarbeiten und folglich gezielt
Tumorzellen, die diese HLA-Tumorantigenpeptide auf ihrer Oberfläche präsentieren, erkennen und lysieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat daher den Vorteil, dass im Falle, dass die Signale, die der Tumor gegenüber dem Immunsystem aussendet zu schwach (passive) sind oder dass der Tumor aktiv Substanzen ausschüttet, die dessen Wachstum befördern (Makrophagen anregen) (aktive z.B. TREX oder BD1 hochfahren), das Immunsystem, insbesondere die T- Zellen auf die Anwesenheit des Tumors trainiert werden kann, auch wenn die Signale, die vom Tumor ausgesendet werden zu schwach sind. Die Signale, die vom Tumor ausgesendet werden, sind zu schwach, wenn die Präsentation der HLA-Antigenpeptide auf der
Zelloberfläche der Tumorzellen gering ist oder als Reaktion auf erfolgte zytotoxische T- Zellenangriffe abnimmt (Escapemechanismus).
Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist ein HLA-Antigenpeptid ein HLA-Tumorantigenpeptid, wenn dieses ein tumorexklusives (d.h. ausschließlich von Tumorzellen exprimiertes und/oder exponiertes HLA-Antigenpeptid; ein Cancer-Testis-Antigen (CTA), das im
gesunden/normalen Gewebe des erwachsenen Patienten/der Patientengruppe nicht mehr vorkommt oder ein sog. Neoantigenpeptid) oder ein tumorassoziiertes HLA-Antigenpeptid ist. „Tumorexklusive H LA- Antigenpeptide“ sind mutierte HLA-Antigenpeptide, die beispielsweise durch eine Mutation eines Gens entstehen, wobei die Mutation des Gens für das
Tumorwachstum ursächlich ist und/oder mit der Onkogenese zusammenhängt. Das mutierte Genprodukt im Tumor ist für den einzelnen Patienten oder eine bestimmte Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel spezifisch.
„Tumorassoziierte HLA-Antigenpeptide“ umfassen nicht mutierte HLA-Antigenpeptide, die im adulten Stadium nur in einigen Geweben des Patienten oder einer bestimmten
Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel, aber auch in den Tumorzellen exprimiert werden. Die Immunogenität tumorassoziierter HLA-Antigenpeptide ist
normalerweise gering, da deren Vorhandensein in gesunden Zellen immunologische
Toleranz (Immuntoleranz) erzeugen kann. Gleichwohl besteht in der Induktion einer starken Immunantwort gegen HLA-Antigenpeptide, die lediglich tumorassoziiert sind, die Gefahr einer Autoimmunantwort.
Ein immunogenes HLA Tumorantigenpeptid wird hierin auch als„Epitop“ bezeichnet.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung sind die mit den tumorassoziierten HLA- Antigenpeptiden korrespondierenden MHC-Komplexe mit der Proliferation, Invasivität, Angiogenese und einer Erhöhung der Cytokeratinproduktion des Mamma-/Brustkarzinoms assoziiert. Der Fachmann kennt entsprechende Datenbanken und Literatur, in der diese Auswirkungen aufgeführt sind (bspw. die Datenbanken der National Center for Biotechnology Information (NCBI)).
Das mindestens eine HLA-Tumorantigenpeptid im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist insbesondere zur subkutanen Verabreichung formuliert. Der Ausdruck/Begriff
„Zusammensetzung“ bezeichnet daher die Bereitstellung zumindest eines HLA- Tumorantigenpeptides und eines Adjuvans in einer pharmazeutischen Formulierung, die eine gute Anwendbarkeit ermöglicht und umfasst Lösungen, insbesondere Injektionslösungen und Infusionslösungen, Konzentrate zur Herstellung von Injektions- und Infusionszubereitungen, Pulver zur Herstellung von Injektions- und Infusionszubereitungen und subkutane Implantate.
Pharmazeutische Zusammensetzungen werden hergestellt, indem die ermittelten HLA- Tumorantigenpeptide in einer Trägerflüssigkeit (d.h. einem pharmakologisch verträglichem Vehikel) gegebenenfalls unter Zusatz weiterer Hilfsstoffe wie Netzmittel, Farbstoffe,
Permeationsförderer, resorptionsfördernde Stoffe, Konservierungsstoffe, Antioxidantien, Lichtschutzmittel gelöst bzw. suspendiert werden.
Die Trägerflüssigkeit ist vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus Natriumchlorid- Injektionslösung, Ringiers Injektionslösung, isotonische Dextrose, steriles Wasser, Dextroselösung, Laktierte Ringers Injektionslösung, destilliertes Wasser oder Mischungen davon, zur lokalen Injektion ausgewählt.
Besonders von Vorteil für eine gute Löslichkeit der ermittelten HLA-Tumorantigenpeptide ist, wenn deren Aminosäuresequenz eine möglichst geringe Anzahl hydrophober Aminosäuren aufweist.
Als Permeationsförderer eignen sich vorzugsweise Dimethylsulfoxid (DMSO),
Ethoxyethylendiglycol, Ethanol, Phosphatidylcholine, Propylenglykoldipelargonate (DPPG), oder glycolysierte ethoxylierte Glyceride enthalten.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung umfasst die
pharmazeutische Zusammensetzung Wasser, eine pharmazeutisch verträgliche
Kochsalzlösung und/oder DMSO. Beispielsweise eignen sich zur Applikation
pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein Gemisch aus etwa 30% DMSO und 70% Wasser enthalten.
Der hier verwendete Ausdruck„HLA-Tumorantigenpeptid (entsprechend der MHC- Komplexe) der Klasse bezeichnet eine Peptidsequenz, die an den MHC-Komplex (beim Menschen an den HLA-Komplex) der Klasse I gebunden bzw. immunogen ist. Der HLA- Proteinkomplex der Klasse I dient der Antigenpräsentation auf der Zelloberfläche und umfasst eine schwere Kette (heavy Chain) mit 3 Domänen (a1 , a2 und a3) und das ß2- Mikroglobulin (ß2M).
Der Ausdruck„HLA-Tumorantigenpeptid (entsprechend der MHC-Komplexe) der Klasse it‘ bezeichnet eine Polypeptidsequenz, die an den MHC-Komplex (beim Menschen an den HLA-Komplex) der Klasse II gebunden bzw. immunogen ist. Der HLA-Proteinkomplex der Klasse II dient der Antigenpräsentation auf der Zelloberfläche und besteht aus zwei nahezu gleich großen Ketten, einer a-Kette und einer nicht kovalent gebundenen ß-Kette, wobei jede Kette zwei extrazelluläre Domänen besitzt (a1 und a2 sowie ß1 und ß2).
Als solches können die Polypeptide und pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung (wie hierin definiert) zur Verwendung bei der Prävention und
Behandlung von Mamma-/Brustkarzinomen (hierin auch als„Krebserkrankung“ bezeichnet) verwendet werden. Allgemeinen können die„Krebserkrankung der Erfindung“ als
Krankheiten und Störungen definiert werden, die entsprechend verhindert und/oder behandelt werden können durch angemessene Verabreichung entweder eines
Tumorantigenpeptids oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung (und insbesondere einer pharmazeutisch wirksamen Menge davon) an einen Probanden (d.h. eine Person mit der Krankheit oder Störung oder mindestens einem Symptom davon und/oder, bei der die Gefahr besteht, dass sich diese eine derartige Krankheit oder Störung zuzieht oder diese entwickelt).
Eine„Peptidsequenz“ (z.B. ein HLA-Antigenpeptid) mit einer "nativen Sequenz" umfasst im Sinne der vorliegenden Erfindung eine Peptidsequenz mit der gleichen (d.h. unmodifizierten) Aminosäuresequenz wie eine natürlich im Patienten vorkommende Peptidsequenz. Eine solche Peptidsequenz mit einer "nativen Sequenz" kann aus der Natur isoliert oder rekombinant bzw. synthetisch hergestellt werden. Der Begriff Peptidsequenz mit einer "nativen Sequenz" umfasst insbesondere natürlich vorkommende verkürzte oder sekretierte Formen der Peptidsequenz (z.B. eine extrazelluläre Domänensequenz), natürlich
vorkommende Varianten (z.B. alternativ gespleißte Formen) und natürlich vorkommende allelische Varianten der Peptidsequenz.
Wie ferner hierin beschrieben, sind die in der Erfindung verwendeten Aminosäuresequenzen einzelne variable FILA-Antigenpeptiddomänen („FILAs“ bzw.„FILA-Komplex“). Eine einzelne variable FILA-Antigenpeptiddomäne ist (wie ferner hierin definiert) ein Bereich innerhalb der Aminosäuresequenz eines Proteins, der aufgrund definierter Eigenschaften von seiner Umgebungssequenz unterschieden werden kann.
Aminosäuresequenzen bzw. Bereiche innerhalb der Aminosäuresequenz eines Proteins der Erfindung, die FILAs sind, werden hierin auch als„HLAs der Erfindung bezeichnet. Einige bevorzugte Beispiele für einzelne variable FILA-Antigenpeptiddomänen, die für die
Verwendung der Erfindung geeignet sind, ergeben sich aus der weiteren Beschreibung hierin und umfassen insbesondere FILA-A, FILA-B und FILA-C Antigenpeptide entsprechend der MFIC-Klasse-I-Komplexe und FILA-DR, DQ und DP Antigenpeptide entsprechend der MFIC- Klasse-Il-Komplexe.
Solche Neoantigenpeptide (d.h. ausschließlich von Tumorzellen exprimierte und/oder exponierte FILA-Antigenpeptide), die weniger als 100% Sequenzidentität oder Ähnlichkeit mit dem nativen FILA-Antigenpeptid aufweisen, zeichnen sich im Sinne der vorliegenden Erfindung vorzugsweise durch einen Aminosäureaustausch in der Aminosäuresequenz aus.
Die folgenden Begriffe werden verwendet, um die Sequenzbeziehungen zwischen zwei oder mehreren Aminosäuresequenzen bzw. Polypeptidsequenzen zu beschreiben:
"Referenzsequenz", "Aminosäureaustausch", "Sequenzidentität", "Prozentsatz der
Sequenzidentität" und "substanzielle Identität". Der Begriff„Aminosäureaustausch“ bezeichnet im Rahmen der vorliegenden Erfindung den Austausch einer Aminosäure gegen eine andere Aminosäure innerhalb der
Aminosäuresequenz des zu synthetisierenden HLA-Antigenpeptids gegenüber dem Wildtyp dieses HLA-Antigenpeptids (d.h. natives HLA Antigenpeptid).„Sequenzidentität“,
"Prozentsatz der Sequenzidentität" bzw. Identität oder Ähnlichkeit in Bezug auf diese Aminosäuresequenz ist hierin definiert als der Prozentsatz der Aminosäurereste in der Aminosäuresequenz des Polypeptids, die identisch (d.h. gleiche Rest) oder ähnlich (d.h. Aminosäurerest aus derselben Gruppe basierend auf gemeinsamen
Seitenketteneigenschaften, siehe unten) zur Aminosäuresequenz des Wildtyps ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst der Aminosäureaustausch für das HLA-Antigenpeptid entsprechend der MHC-Komplexe der Klasse I und/oder II zumindest einen D/Y-, einen C/Y-, einen A/V-, einen T/M, einen E/A- oder einen D/A-Austausch an einer beliebigen Position innerhalb der Aminosäuresequenz gegenüber dem Wildtyp dieses HLA-Peptids.
Die hierin verwendeten Aminosäuren sind nach dem allgemein anerkannten
Einbuchstabencode der lUPAC-Nomenklaturkommission abgekürzt. Sind zwei Aminosäuren durch einen Trennstrich (/) voneinander getrennt, so bedeutet dies, dass an einer spezifischen Aminosäureposition in der betreffenden Aminosäuresequenz die Aminosäure des Wildtyps (linke Seite des Trennstrichs) durch eine andere Aminosäure ausgetauscht ist (rechte Seite des Trennstrichs).
Zum Bestimmen/Ableiten bevorzugter Ankerpositionen und eines bevorzugten spezifischen Aminosäureaustauschs in der Aminosäuresequenz der HLA-Tumorantigenpeptide eignen sich insbesondere in silico Modellierungsverfahren, wie bspw. mittels des Algorithmus NetMHC 4.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/) basierend auf den Veröffentlichungen von Andreatta und Nielsen (Bioinformatics (2016) Feb 15;32(4):51 1 -7) und Nielsen et al. (Protein Sei., (2003) 12:1007-17).
Zum Zwecke des Vergleichs von zwei oder mehreren Aminosäuresequenzen kann der Prozentsatz der„Sequenzidentität“ zwischen einer ersten Aminosäuresequenz und einer zweiten Aminosäuresequenz berechnet oder bestimmt werden, indem die Anzahl der Aminosäuren in der ersten Aminosäuresequenz, die mit den Aminosäuren an den entsprechenden Positionen in der zweiten Aminosäuresequenz identisch sind, durch [die Gesamtzahl der Aminosäuren in der ersten Aminosäuresequenz] teilt und mit [100%] multipliziert, wobei jede Deletion, Insertion, Substitution oder Addition einer Aminosäure in der zweiten Aminosäuresequenz - verglichen mit der ersten Aminosäuresequenz - als eine Differenz zu einer einzelnen Aminosäure (Position) betrachtet wird.
Ein HLA-Tumorantigenpeptid ist„immunogen“, wenn die Tumorzellen auf ihrer Zelloberfläche zumindest einen entsprechenden MHC-Klasse-I-Komplex und/oder zumindest einen entsprechend MHC-Klasse-Il-Komplex exponieren, der das HLA-Tumorantigenpeptid erkennt und anbindet, d.h. das HLA-Tumorantigenpeptid weist eine hohe spezifische Aktivität gegenüber diesem MHC-Klasse-I-Komplex und/oder MHC-Klasse-Il-Komplex auf. Die Immunogenität des HLA-Tumorantigenpeptids kann dabei mittels Westernblot, ELISA- Techniken, insbesondere mittels ELISPOT oder Immunodetektion mit mikroskopischer Analyse erfolgen.
Die HLA-Tumorantigenpeptide der vorliegenden Erfindung sind bevorzugt immunogen und werden daher auch als immunogene HLA-Tumorantigenpeptide („Epitope“) bezeichnet. Die Immunogenität der HLA-Tumorantigenpeptide kann durch geeignete Nachweisverfahren bestimmt werden. Derartige Verfahren sind dem Fachmann bekannt und/oder hierin beschrieben.
Der Begriff„spezifische Affinität“ oder„spezifische Bindungsaffinität“ des HLA-Antigenpeptids gegenüber dem T-Zell-Rezeptor (TCR) bezeichnet die spezifische und reversible Bindung des HLA-Peptids an den TCR der körpereigenen T-Zellen. Diese„spezifische Affinität“ gemäß der vorliegenden Erfindung wird über die durch Ligandenbindungstests ermittelte Dissoziationskonstante (KD) in Mol ausgedrückt.
Alternativ kann die„spezifische Affinität“ des HLA-Antigenpeptids auch über in silico
Methoden bestimmt werden.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung ist zumindest ein HLA-A Tumorantigenpeptide ein tumorexklusives HLA-A Tumorantigenpeptid (d.h. ein Cancer- Testis-Antigen (CTA), das im gesunden/normalen Gewebe des Patienten/der
Patientengruppe nicht mehr vorkommt oder ein sog. Neoantigenpeptid), und wobei die spezifische Bindungsaffinität des tumorexklusiven HLA-A Tumorantigenpeptids bestimmt gegenüber den entsprechenden MHC-Klasse-I-Komplex mit einer KD im Bereich von 10 bis 50 nM erfolgt, wie mit Oberflächenplasmonresonanz bestimmt.
Basierend auf konventionellen /n-s/7/co-Bindungsvorhersagemodellen (Modelling) gelten grundsätzlich Tumorantigenpeptide mit einem KD von <50 nM als stark-bindende und solche mit einem KD zwischen 50 und 500 nM als schwach-bindende Tumorantigenpeptide. In den erfindungsgemäßen /n-v/Vo-Bestimmungen hat sich nun allerdings gezeigt, dass es nicht zwingend auf den KD-Wert ankommt. Überraschenderweise wurde gefunden, dass
Tumorantigenpeptide, die einen KD-Wert im Bereich zwischen 50 und 500 nM aufwiesen, entgegen konventioneller /n-s///co-Bindungsvorhersagemodellen, die diese als niedrig bindend angesehen haben, Effektorzellen (d.h. zytotoxische T-Zellen) ausgelöst. Für die Wirksamkeit der Tumorantigenpeptide ist es somit wesentlich, dass die Tumorantigenpeptide immunogen sind.
Der Begriff„Wirkstoffverstärker/Adjuvans“ bezeichnet einen Hilfsstoff, der die Wirkung der HLA-Peptide überhaupt erst auslöst und/oder verstärkt. Grundsätzlich sind alle gängigen dem Fachmann bekannten Adjuvanzien zur Herstellung einer erfindungsgemäßen
Formulierung geeignet.
Als besonders geeignet hat sich allerdings die Verwendung von Montanide ISA 51 VG herausgestellt. Dieser bildet nach Applikation der (Arzneimittel-)Formulierung an den Probanden ein sogenanntes Granulom aus, dass die HLA-Peptide vorteilhaft in Art eines Reservoirs am Ort der Applikation speichert und über einen längeren Zeitraum an den Organismus des Probanden abgibt. Besonders vorteilhaft entfallen daher wöchentliche Applikationen der erfindungsgemäßen (Arzneimittel-)Formulierung. Bevorzugt muss die Applikation der (Arzneimittel-)Formulierung zur Behandlung von Krebserkrankungen im Sinne der Erfindung bei Anwendung über einen längeren Zeitraum daher lediglich alle 2 Wochen, besonders bevorzugt nur einmal monatlich erfolgen.
Der Ausdruck„Individuum“ (hierin auch als„Proband“ oder„Patient“ benannt) wird synonym verwendet mit dem Ausdruck„Proband“ und bezeichnet jedes Säugetier, das gegen eine abnormale physiologische Bedingung behandelt wird oder bei dem eine Krankheit diagnostiziert wurde.
Die Begriffe„Individuum“ und„Proband“ im Sinne der vorliegenden Erfindung schließen Säugetiere, wie beispielsweise ein Nagetier, einen Carnivore, einen Paarhufer, einen Unpaarhufer oder einen Primat ein. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der Proband ein Mensch.
Sofern hierin von einer„Patientengruppe“ gesprochen wird, ist stets eine Gruppe von Individuen, vorzugsweise Menschen die Rede, die alle zumindest ein, vorzugsweise zumindest zwei, ganz besonders bevorzugt zumindest drei identische(s) HLA-Allel(e) aufweisen. Es ist zulässig, dass die mit der pharmazeutischen Zusammensetzung zu behandelnden Patienten ein Standardtherapieverfahren (z.B. mindestens eine Operation, Bestrahlung, Chemotherapie und/oder Hormontherapie) erhalten haben.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann allerdings auch als eine Erstlinientherapie dem Patienten oder der spezifisch bestimmten Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel verabreicht werden.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung hat das Individuum noch keine Chemotherapie gegen lokal wiederkehrenden oder metastasierenden Brustkrebs erhalten hat und/oder 12 Monate oder weniger seit der letzten Dosis keine vorhergehende adjuvante Chemotherapie in Rekurrenz mehr erhalten hat.
Besonders bevorzugt weist das Individuum den Haplotyp mit der Subgruppe A*01 oder A*02 auf.
Ein„Haplotyp“ (eine Abkürzung für„haploider Genotyp“) ist die Summe der
Zusammensetzung aller spezifischen Allelle (= spezifischer Fingerabdruck) eines Probanden und bezeichnet eine Variante einer Nukleotidsequenz auf ein und demselben Chromosom im Genom eines Lebewesens. Ein bestimmter Haplotyp kann Individuen-, populations- oder auch artspezifisch sein.
Das Transkriptom umfasst im Sinne dieser Erfindung die Summe aller zu einem bestimmten Zeitpunkt in einer Zelle transkribierten, das heißt von der DNA-Sequenz in mRNA- Sequenzen umgeschriebenen Gene, also die Gesamtheit aller als auch die Quantifizierung der einzelnen in einer Zelle hergestellten mRNA-Moleküle. Allerdings erlaubt die Erstellung des Transkriptoms noch keine Aussage über die„Richtigkeit“ der umgeschriebenen mRNA- Sequenzen.
In diesem Zusammenhang bezeichnet der Begriff„Erstellen eines Transkriptoms“ in der vorliegenden Offenbarung die Analyse des Transkriptoms als Summe aller zu einem bestimmten Zeitpunkt in einer Zelle transkribierten Gene vorzugsweise mittels quantitativer Echtzeit-(RT)-PCR und anschließendem DNA-Microarray oder anschließender DNA- Sequenzierung. Üblicherweise umfasst das Erstellen des Transkriptoms der Gewebeprobe, die in Schritt (a) des erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahrens bereitgestellt wird, das Erfassen von mehr als 40.000 kodierenden DNA-Sequenz (Rohdaten). Als Exom bezeichnet man in der Genetik die Gesamtheit der Exons eines Organismus, also alle Abschnitte, die potenziell Proteine codieren. Beim Menschen umfasst das Exom etwa 23.000 Gene mit ca. 50 Millionen Nukleobasen. Beim Whole Exome Sequencing (WES) werden alle Exons, d.h. die für Proteine kodierenden Abschnitte im Genom eines
Gewebeabschnitts (d.h. gesundes Gewebe oder Tumorgewebe eines Probanden), untersucht. Die genetische Diagnostik fokussiert sich dabei auf diese 1 -2% des
menschlichen Genoms, in dem 85 % der bekannten krankheitsverursachenden Mutationen zu finden sind.
Die Exom-Analyse umfasst entsprechend die Sequenzierung des Exoms des Patienten (und gegebenenfalls weiterer Angehöriger), der Auswertung der Sequenzdaten und der
Zusammenfassung der Ergebnisse in einem medizinischen Befund. Diese Diagnostik stellt, insbesondere bei Patienten mit komplexer oder unspezifischer Symptomatik und oft jahrelang ungeklärter Diagnose, die Methode der Wahl dar, um die Ursache der Erkrankung zu finden.
Im Vergleich zum Whole Exome Sequencing (WES), bei der alle proteincodierenden Bereiche der etwa 23.000 bekannten Gene angereichert und sequenziert werden, wird beim Clinical Exome Sequencing (CES) ein Subset des Exoms angereichert. Bei der WES wird der Fokus auf die Bestimmung krankheitsassoziierter Gene gelegt, die in der Human Gene Mutation Database (HGMD) beschrieben sind.
Das Proteom bezeichnet im Sinne der vorliegenden Erfindung die Gesamtheit aller Proteine zumindest einer Zelle in einem malignen oder neoplastischen Gewebe/einer Gewebesektion oder einem Zellkompartiment davon, unter exakt definierten Bedingungen und zu einem bestimmten Zeitpunkt. Das Proteom einer Zelle kann durch eine Proteomsequenzierung bestimmt werden und ist über das Transkriptom mit dem Genom dieser Zelle verbunden.
Immuntherapien basieren darauf, dass das individuelle Mutationsmuster (Signatur) des Tumors jedes einzelnen Krebspatienten entschlüsselt wird. Auf das Profil des
Mutationsmusters werden nach konventionellen Behandlungsansätzen für jeden einzelnen Patienten passgenau synthetische Impfstoffe, beispielsweise auf RNA-Basis hergestellt (d.h. Vakzinherstellung bzw. Herstellung des erfindungsgemäßen Informatikums). Diese werden im Anschluss für die individuelle Behandlung des Patienten eingesetzt.
Grundsätzlich taugen diese neuartigen Impfstoffe nichts für andere Patienten mit dem gleichen Tumor, sondern sind nur jeweils für den Patienten einsetzbar, dessen Mutanom für die Vakzineherstellung bzw. Herstellung des erfindungsgemäßen Informatikums zuvor analysiert wurde. Daher ist es eine herausragende Leistung der Erfinder, erkannt zu haben, dass verschiedene Patienten Überschneidungen in dem Mutanom des malignen oder neoplastischen Gewebes/der Gewebesektion davon aufweisen. Vorteilhaft lassen sich verschiedene Patienten in einheitliche Patientengruppen unterteilen, sodass zumindest 50 % der HLA-Peptide der erfindungsgemäßen Formulierung mit dem Mutanom der
Patientengruppe kompatibel ist.
Die Gesamtheit aller HLA-Antigenpeptide, die über MHC-Moleküle auf der Zelloberfläche präsentiert werden, wird im Sinne der Erfindung als das (HLA-)Ligandom bezeichnet. Es wird angenommen, dass mehr als 105 HLA-Moleküle auf der Zelloberfläche exprimiert werden und die Anzahl der identischen präsentierten HLA-Peptide zwischen einigen wenigen und bis zu 10.000 Kopien pro Zelle variieren kann. Folglich werden auf einer Zelle ungefähr 10.000 verschiedene HLA-Peptide in unterschiedlichen Mengenanteilen präsentiert.
Das Ligandom wird durch verschiedene physiologische, intrinsische sowie pathologische (bspw. Krebs oder Nekrose) Faktoren wie beispielsweise den Zelltyp oder die Gewebeart, Infektion oder Transformation der Zelle oder einfach den aktuellen Zustand der Zelle, der von Nährstoffsituation oder äußeren Stressfaktoren abhängt, beeinflusst, was zu Veränderungen der präsentierten HLA-Peptide führt.
Zu Beginn der Analyse des HLA-Ligandoms kann beispielsweise der Edman-Abbau verwendet werden, um erste Erkenntnisse über die präsentierten Peptide zu gewinnen. Zum einen ist es auf diese Weise möglich, über Poolsequenzierungen das allgemeine Peptidmotiv eines Allels zu ermitteln, zum anderen können über die Analyse einzelner reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC)-Fraktionen bereits einzelne
Peptidsequenzen ermitteln werden.
Alternativ oder ergänzend kann die Analyse des Ligandoms durch den Einsatz moderner Massenspektrometer in der Proteomik erfolgen, mit der es möglich ist, die Sequenzen vieler einzelner Liganden eindeutig zu ermitteln. Für die hierbei erforderliche Ionisierung der Peptide oder Proteine finden zwei Methoden Verwendung: Die Elektrospray-Ionisation (ESI) und die matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI). Bei der ESI ist die Kopplung mit einem RP-HPLC-System üblich. Mit zunehmender Sensitivität der Massenspektrometer wurde jedoch auch die Kapillarelektrophorese (capillary eletrophoresis, CE) als analytische Trennmethode verwendet.
Um einen höheren Probendurchsatz und eine gesteigerte Sensitivität bei der
Ligandomanalyse zu erreichen können die sogenannten UHPLC-Systeme ( ultra high performance liquid chromatography) verwendet werden. Diese HPLC-Systeme verwenden als Packmaterial für Trennsäulen lediglich Materialien mit 2 pm Durchmesser, was zu einer verbesserten Geschwindigkeit, Effizienz und chromatographischen Auftrennung führt.
Bei der ESI-Massenspektrometrie ermöglicht die direkte Kopplung von HPLC und ESI- Interface eine online-Trennung der Probe, was in Kombination mit einem Autosampler einen vollständig automatisierten Ablauf der Messprozedur ermöglicht. Wegen des kontinuierlichen Lösungsmittelflusses von der HPLC können die Proben in verhältnismäßig kurzer Zeit gemessen werden. Die ESI-Massenspektrometrie verwendet ein breites Spektrum von Instrumenten zur Analytik wie beispielsweise Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometer, lineare Quadrupol-Ionenfallen, Tripelquadrupole oder lonenfallen-Orbitrap-Hybridsysteme. Dies erlaubt vorteilhaft die Identifikation von hunderten HLA-Peptiden in einer Messung.
Der Ausdruck„Ableiten eines Rankings“ bezieht sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung auf das Ermitteln/die Auswahl der Quantität und der Affinität der HLA-Peptide, die auf der Zelloberfläche der Zellen des entnommenen Gewebes (bzw. einer Gewebesektion davon) exponiert sind.
Mit Hilfe der vorangegangenen Analysen wird ein kumulatives Ranking für die HLA- Antigenpeptide hinsichtlich Proteinqualität und spezifischer Affinität (KD) gegenüber dem T- Zell-Rezeptor der körpereigenen T-Zellen abgeleitet. Dabei werden hinsichtlich der
Proteinqualität insbesondere inhaltliche Faktoren für den Tumorprogress, wie Invasivität, Angiogenese, aber auch die Escape Mechanismen des Tumors gegenüber dem
Immunangriff bewertet.
Ein kumulatives Ranking-System wird vom Algorithmus verwendet
Eine kumulative (vorausschauende) Rangfolge wird verwendet, um Sequenzen zu eliminieren,
In einer anderen Verkörperung können die höchstrangigen Sequenzmöglichkeiten durch ihre Existenz in einer Datenbank von möglichen HLA-Antigenpeptiden mit einer hohen spezifischen Affinität gegenüber den körpereigenen T-Zell-Rezeptoren (wie hierin definiert), die aus Sequenzdaten vorhergesagt werden, weiter qualifiziert werden, insbesondere eine, die auf den Organismus/Probanden beschränkt ist, aus dem das HLA-Antigenpeptid gewonnen wurde. In einer anderen Ausführungsform können die höchstrangigen
Sequenzmöglichkeiten durch die Trennkoordinaten des HLA-Antigenpeptids (z.B. isoelektrischer Punkt und Molekulargewicht eines Proteins) und/oder dessen Monomerzusammensetzung weiter qualifiziert werden.
Zum Bereitstellen von (Tumor-)Antigenpeptiden können grundsätzlich synthetische oder isolierte HLA-Tumorantigenpeptide, die aus dem kumulativen Ranking abgeleitet wurden für die Herstellung der (Arzneimittel-)Formulierungen der vorliegenden Erfindung und zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung (als sog. Informatikum) verwendet werden.
Es bietet sich jedoch an, synthetische HLA-Peptide zu verwenden. Verfahren zur synthetischen Herstellung von Peptiden sind dem Fachmann bekannt. Beispiele derartiger Herstellungsverfahren sind die Merrifield-Festphasen-Peptidsynthese, die Bailey-Peptid- Synthese und die /V-Carbonsäureanhydrid-Methode.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch
(Arzneimittel-)Formulierungen in unterschiedlichen Darreichungsformen, die die
erfindungsgemäße Wirkstoffkombination und gegebenenfalls weitere Wirkstoffe und/oder Hilfsstoffe enthalten.
Bevorzugte Arzneimittelformulierungen sind Tabletten, Kautabletten, Kaugummis, Dragees, Kapseln, Tropfen, Säfte, Sirupe, Suppositorien, transmucale therapeutische Systeme, transdermale therapeutische Systeme, Lösungen, Injektionen, Emulsionen, Suspensionen, leicht rekonstituierbare Trockenzubereitungen, Pulver oder Sprays. Besonders bevorzugte Arzneimittelformulierungen sind Injektionen oder Lösungen.
Alternativ liegt die Arzneimittelformulierung in einer geeigneten Applikationsvorrichtung vor, vorzugsweise als Lyophilisat in einer Spritze, welche eine in s/fu-Rekonstitution mit einer pharmazeutisch akzeptablen Lösung (z.B. Kochsalzlösung) erlaubt.
Vorzugsweise eignen sich die erfindungsgemäßen (Arzneimittel-)Formulierungen zur oralen, intravenösen, intramuskulären, subkutanen, intrathekalen, epiduralen, bukkalen,
sublingualen, pulmonalen, rektalen, transdermalen, nasalen oder intracerebroventrikularen Applikation, wobei (Arzneimittel-)Formulierungen zur subkutanen oder intravenösen
Applikation besonders bevorzugt sind.
Im Stand der Technik für das Herstellen von pharmazeutischen Zusammensetzungen bzw. Darreichungsformen bekannte Verfahren werden in zum Beispiel„Remington's Pharmaceutical Sciences" gefunden. Pharmazeutischen Zusammensetzungen für die parenterale Verabreichung können zum Beispiel Exzipienten, steriles Wasser, oder
Salzlösung, Polyalkylenglycole, wie Polyethylenglycole, Öle von pflanzlichem Ursprung, oder hydrierte Naphtalene enthalten. Biokompatible, biologisch-abbaubare Lactid-Polymer, Lactid/Glycolid-Copolymere, oder Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Copolymere können verwendet werden, um die Freisetzung der Verbindungen zu steuern. Andere potentiell nützliche parenterale Abgabesysteme für die therapeutischen Anti-Prion-Verbindungen umfassen Ethylenvinylacetat-Copolymer-Partikel, osmotische Pumpen, implantierbare Infusionssysteme und Liposomen.
Inhaltliche Faktoren für Tumorprogress
Wichtig für das Erstellen des Rankings ist auch das Ermitteln von Faktoren, die für den Tumorprogress (d.h. die Größenzunahme und/oder Metastasierung von Tumoren) eine wesentliche Rolle spielen. Charakteristisch für den Tumorprogress sind eine erhöhte
Wachstumsgeschwindigkeit, sowie eine gesteigerte Invasivität des Tumors.
Als Invasivität bezeichnet man den Umfang des gewebedurchsetzenden Wachstums eines malignen Tumors von seinem Ursprungsort in angrenzende Gewebestrukturen.
Angiogenese beschreibt das Entstehen neuer Blutgefäße aus einem bereits vorhandenen Blutgefäßsystem und ist Bestandteil sowohl physiologischer Prozesse (z.B. Embryogenese, Wundheilung), als auch pathologischer Prozesse (z.B. diabetische Retinopathie, chronische Polyarthritis, Tumorwachstum). Seit langem ist bekannt, dass es bei Krebserkrankungen zu einer Gefäßneubildung (Angiogenese) kommt, die als Tumor-Angiogenese bezeichnet wird. Tumore bestehen aus Zellen, die, wie alle anderen Zellen im Körper, Nährstoffe und
Sauerstoff benötigen. Weil sich Krebszellen häufig teilen, ist ihr Bedarf sogar besonders hoch. Und deshalb benötigt ein Tumor eigene Blutgefäße.
Wenn ein Tumor entsteht, hat er zunächst noch keine eigenen Blutgefäße. Sein Wachstum ist deshalb stark eingeschränkt. Ohne eigene Blutgefäße wird er nicht größer als 1 bis 2 Millimeter. Auch die Bildung von Metastasen steht in Wechselwirkung mit der Tumor- Angiogenese, denn dazu müssen Tumorzellen in umliegende Blutgefäße gelangen. Erst dann können sie in ferne Körperregionen transportiert werden und dort Metastasen bilden.
Beispielsweise ist bekannt, dass eine gegenseitige Abhängigkeit zwischen Klasse I HLA und Integrin ß besteht, um die Signaltransduktion und Zellproliferation zu stimulieren. Dabei hängt die Integrin ß-vermittelte Zellmigration von ihrer Wechselwirkung mit dem Klasse I HLA-Molekülen ab (Zhang und Reed, Hum Immunol. 2012 Dec, 73(12), 1239-1244). Ein HLA-Peptid der Erfindung oder eine Zusammensetzung bzw. Formulierung, die selbige enthält, kann für das Modulieren eines HLA-Komplexes der Klasse I bzw. II einschließlich Kombinationen davon, entweder in vitro (z. B. in einem in-vitro- oder zellulären
Nachweisverfahren) oder in vivo (z. B. in einem einzelligen oder in einem mehrzelligen Organismus und insbesondere in einem Säugetier und ganz besonders in einem
menschlichen Lebewesen, wie beispielsweise in einem menschlichen Lebewesen, bei dem das Risiko besteht, an einer Krebserkrankung der Erfindung zu erkranken, oder die darunter leiden) verwendet werden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeuten„Modulierung“ oder
„Modulieren“ im Wesentlichen das Erhöhen der spezifischen Affinität von T-Zell gegenüber einem tumorexklusiven oder tumorassoziierten MHC-Klasse-I-Komplex bzw. MHC-Klasse-Il- Komplex des malignen und/oder neoplastischen Gewebes, wie anhand eines geeigneten in- vitro-, zellulären oder /n-v/Vo-Nachweisverfahrens gemessen (wie beispielsweise den hierin genannten). Insbesondere bedeutet„Modulieren“ oder„modulieren“ das Erhöhen der spezifischen Affinität von körpereigenen T-Zellen des Patienten bzw. der Patientengruppe gegenüber einem tumorexklusiven oder tumorassoziierten MHC-Klasse-I-Komplex bzw. MHC-Klasse-Il-Komplex des malignen und/oder neoplastischen Gewebes, um mindestens 1 %, vorzugsweise mindestens 5 %, wie beispielsweise 10 % oder mindestens 25 %, zum Beispiel um mindestens 50 %, mindestens 60 %, mindestens 70 %, mindestens 80 % oder 90 % oder mehr im Vergleich zur Affinität von T-Zellen gegenüber einem tumorexklusiven oder tumorassoziierten MHC-Klasse-I-Komplex bzw. MHC-Klasse-Il-Komplex des malignen und/oder neoplastischen Gewebes im selben Nachweisverfahren unter denselben
Bedingungen, jedoch ohne Vorhandensein bzw. vorherige Applikation der HLA
Tumorantigenpeptide der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung (wie hierin definiert).
In einer besonderen Ausführungsform umfasst die Erfindung das oben genannte Verfahren, wobei das Expressionsprofil von mindestens fünf, vorzugsweise mindestens sechs, ganz besonders von mindestens 6 Markergene, wie in SEQ ID Nr.: 1 bis SEQ ID Nr.: 48 dargestellt, bestimmt wird. Wie oben erwähnt, sind die Markergene auch durch Varianten definiert, die wiederum in den Tabelle 2 bis 4 dargestellt sind. Vorzugsweise wird dieses Expressionsprofil mit dem Expressionsprofil einer„Referenz" verglichen. Eine Referenz kann zum Beispiel das Expressionsprofil von gesundem Gewebe (z.B. Darmgewebe oder Gewebe der Leber, Lunge etc.) sein. Als„gesundes Gewebe" kann hierbei Gewebe des betroffenen Individuums (Proband) verwendet werden, wobei von diesem Gewebe bekannt ist, dass es nicht proliferativ verändert oder gar metastatisch ist. Entsprechende Beispiele sind im experimentellen Teil der Erfindung dargestellt. Allerdings können als„Referenz" oder „Referenzwert" auch Daten von Geweben von fremden Individuen, vorzugsweise Gesunden herangezogen werden.
Wie hierin dargelegt wird, sollen erfindungsgemäß im Verfahren zur Erkennung eines Karzinoms mindestens 6, vorzugsweise jedoch mindestens 8, ganz besonders bevorzugt mindestens 10 der hier dargestellten HLA-Antigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-I- Komplexe bzw. MHC-Klasse-I-Komplexe (ausgewählt aus der Gruppe der Polypeptide/ Polypeptidabschnitte, wie in den SEQ ID Nrn.: 1 bis 48 gezeigt) bestimmt werden. Weitere Ausführungsformen sind dem experimentellen Teil zu entnehmen.
Die vorliegende Erfindung umfasst ferner ein Verfahren zur Herstellung einer
erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung bzw. einer
(Arzneimittel-)Formulierung, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:
(a) Bestimmen von zumindest 4 bis 8 HLA-A Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und zumindest 2 Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-Il-Komplexe, die auf der Zelloberfläche von Zellen aus einem Mamma-/Brustkarzinom des zu behandelnden Patienten oder Patientengruppe mit gleichem Haplotyp exponiert sind, mit dem
erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahren, wie oben beschrieben;
(b) Synthese der in Schritt (a) ermittelten 4 bis 8 HLA-A Tumorantigenpeptide
entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und zumindest 2
Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-Il-Komplexe, wobei die Definition jedes HLA Tumorantigenpeptids die gleiche ist, wie oben definiert; und
(c) Herstellen der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung
umfassend zumindest die in Schritt (b) synthetisierten 4 bis 8 HLA-A Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe, der zumindest 2 Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-Il-Komplexe und ein Adjuvans, wie hierin definiert. Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung bzw. der (Arzneimittel-)Formulierung zur Herstellung eines Arzneimittels oder eines Kombinationspräparats zur Behandlung von Malignomen, Leukämie und Neoplasien, insbesondere von Brustkrebs.
Von der Erfindung ist auch eine pharmazeutische Zusammensetzung umfasst, die ein HLA- Peptid im Sinne der Erfindung und einen pharmazeutisch unbedenklichen Hilfsstoff umfasst.
Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf ein HLA Antigenpeptid bzw. ein Neoantigenpeptid der Erfindung zur Verwendung bei der Herstellung einer Formulierung (wie beispielsweise, ohne Beschränkung auf eine pharmazeutische Formulierung, wie ferner hierin beschrieben) für die Behandlung von Krebserkrankungen, entweder in vitro (z. B. in einem in-vitro- oder zellulären Nachweisverfahren) oder in vivo (z. B. in einem einzelligen oder mehrzelligen Organismus und insbesondere in einem Säugetier und ganz besonders in einem
menschlichen Lebewesen, wie beispielsweise in einem menschlichen Lebewesen, bei dem das Risiko besteht, an einer Krebserkrankung der Erfindungen zu erkranken, oder die darunter leiden).
Die vorliegende Erfindung umfasst ferner auch ein Kombinationspräparat zur Verwendung bei der Behandlung von Mamma-/Brustkarzinomen mit gleichzeitiger, getrennter, oder aufeinanderfolgender Verabreichung,
das Kombinationspräparat umfasst dabei die folgenden zwei getrennten Präparate (a) und (b):
(a) ein erstes Präparat, das zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel, 4 bis 8 HLA-A Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und zumindest 2
Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-Il-Komplexe wie hierin beschrieben umfasst, und die optional mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt wurden, und
(b) ein zweites Präparat, das zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel, ein Antikrebsmittel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antikrebsalkylierungsmitteln, Antikrebs-Antimetaboliten, Antikrebsantibiotika, pflanzlichen Antikrebsmedikamenten, platinkoordinierten Antikrebskomplexverbindungen, Antikrebscamptothecinderivate, Antikrebstyrosinkinaseinhibitoren, monoklonalen Antikörpern, Interferonen, Interleukinen, biologischen Reaktionsmodifikatoren und anderen Antikrebsmitteln oder einem pharmazeutisch verträgliches Salz davon, umfasst.
Das erfindungsgemäße Kombinationspräparat eignet sich insbesondere zur Verwendung bei der Behandlung bzw. zur Profilaxe von Mamma-/Brustkarzinomen, insbesondere lokal wiederkehrenden oder metastasierenden Mammakarzinomen bei einem Patienten oder einer Patientengruppe, der/die an einem Mamma-/Brustkarzinom erkrankt ist oder im Verdacht steht, an einem Mamma-/Brustkarzinom zu erkranken.
Besonders bevorzugt wird das erste Präparat des erfindungsgemäßen
Kombinationspräparats dabei subkutan verabreicht.
Besonders gute Erfahrungen wurden bei der Verabreichung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung (erstes Präparat) in Kombination mit der Gabe von pflanzlichen Antikrebsmedikamenten, insbesondere Artesunate und/oder Curcumin als zweites Präparat gemacht.
Gleichwohl bevorzugt ist die kombinierte Verabreichung der erfindungsgemäßen
pharmazeutischen Zusammensetzung (erstes Präparat) in Kombination mit einem
monoklonalen Antikörper, insbesondere gegen immunsuppressive Proteine ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus CTLA4 (hierin z.B. Ipilimumab - Yervoy®), PDL1 (hierin z.B. Nivolumab - Opdivo) , PD1 -L, auch EpCam, IDO, MIC, Fas und TRAIL; spezifisch: als Östrogenhemmer für hormonpositive Patienten aus der Gruppe der Aromatasehemmer - (hierin z.B. Letrozol und/oder der Östrogenblocker Fulvestrant); als Antikörper gegen HER2- positive Patienten: Herceptin (TDM-1 ) als zweites Präparat.
Ebenfalls offenbart ist eine Geschäftsmethode, die die Vermarktung von 4 bis 7 HLA-A Antigenpeptiden und zumindest 2 Antigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-Il- Komplexe zur Behandlung von Brustkrebs bei einem Menschen umfasst, um den CA 15-3 Wert eines Patienten oder einer Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel wirksam zu reduzieren, insbesondere das progressionsfreie Überleben zu erhöhen oder die Wahrscheinlichkeit eines Wiederauftretens von Krebs zu verringern oder die
Überlebenschancen des Patienten zu erhöhen. In einigen Ausführungsformen folgt auf die Vermarktung die Behandlung des Patienten mit der Kombination der HLA Antigenpeptide. Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Hierin zeigt:
Fig. 1 : schematische Darstellung einer HLA-A-vermittelten Anbindung eines T-
Zellrezeptors an ein MHC-Molekül der Klasse I, wobei die Anker(aminosäure)reste des HLA-A-Antigenpeptids (7-1 1 Aminosäuren in der Länge) dargestellt sind.
Fig. 2: schematische Darstellung einer HLA-B-vermittelten Anbindung eines T-
Zellrezeptors an ein MHC-Molekül, wobei die Anker(aminosäure)reste des HLA-B- Antigenpeptids (12-17 Aminosäuren in der Länge) dargestellt sind.
Fig. 3: die Entwicklung des Spezifischen Tumormarkers CA 15-3 nach spezifischer
Immuninformation durch die erfindungsgemäße Zusammensetzung an
Tumorantigenpeptiden gemäß dem Ausführungsbeispiel 3 (INC 14/1713; Stern), die die Epitope des Primärtumors MC-HER2/Neu abbilden. Der abgebildete Verlauf umfasst 26 Wochen.
Fig. 4: die Entwicklung des Spezifischen Tumormarkers CA 15-3 in Verbindung mit dem
Lebermarker Gamma GT nach Applikation spezifischer Immuninformation durch die Zusammensetzung an Tumorantigenpeptiden gemäß dem Ausführungsbeispiel 3 (INC 14/1713; senkrechte Linie), die die spezifischen Metastasen-Epitope der Lebermetastasen des gestreuten MC-HER2/Neu abbilden. Der abgebildete Verlauf umfasst 34 Wochen.
Fig. 5: die klinische Wirksamkeit der applizierten pharmazeutischen Zusammensetzung von Ausführungsbeispiel 4.
Ausführungsbeispiele
Anhand nachfolgender Figuren und Ausführungsbeispiele soll die vorliegende Erfindung näher erläutert werden, ohne die Erfindung auf diese zu beschränken.
Die nachfolgenden Tabellen führen HLA-Tumorantigenpeptide auf, die alle getestet wurden und immunogen sind. Die SEQ ID Nrn.: 13 bis 48 listen einige bevorzugte, jedoch nicht einschränkende Beispiele für Aminosäuresequenzen von Tumorantigenpeptiden der Erfindung, wobei jedes dieser Beispiele eine weitere Erscheinungsform der vorliegenden Erfindung darstellt. abelle 1 [Vergleichsbeispiel]:
abelle 2:
abelle 3:
abelle 4:
Beispiel 1 : Transkriptom-Analyse [mRNA-Expression]
Die Transkriptom-Analyse (Sequenzierung) erfolgte bei allen Patienten mit Hilfe der
PANTHER-Chipanalyse (44K-Chip) von Agilent Technologies. Der verwendete 44K-Chip enthält 44.000 Gensonden, so dass mit diesem Chip pro Patientin jeweils die Aktivität von >34.000 Genexpressionsmarkern analysiert werden konnten. Dabei wurden jeweils 1.000 Gene mit erhöhter Relevanz 10-fach bestimmt.
Die Auswertung erfolgt auf der Basis publizierter Gensignaturen, die dem Fachmann bekannt sind.
Beispiel 2: EXOM-Sequenzierung
Die Exom-Sequenzierung erfolgt aus dem Standard Gefrierpräparat der Patienten bei den die Tumor DNA extrahiert wird. Aus der Tumorprobe wird eine Next-Generation- Sequenzierung des Exoms mit Abdeckung von über 95% des gesamten codierenden Exonbereiches des Menschen durchgeführt. Dazu werden u.a. >290.000 relevante
Abschnitte der DNA selektiv amplifiziert und durch Halbleiter Sequenztechnik sequenziert.
Ziel der Analyse ist die Definition möglicher Mutationen für das Design einer individuellen Tumorantigenpeptid-Immunisierung. Zum Ausschluss von nicht tumorassoziierten Varianten (SNPs, Single Nucleotide Polymorphism) der Keimbahn, wird gleichzeitig die DNA aus kernhaltigen Blutzellen der Patienten isoliert und mit derselben Methodik vergleichend sequenziert. Die Differenzierung möglicher Neoantigenkandidaten erfolgte dabei in den folgenden sechs Schritten:
1 ) Die Selektion tumor/somatischer Mutationen wird reduziert durch den Ausschluss von nicht tumorspezifischen Polymorphismen.
2) Die so vordefinierte Auswahl von somatischen Mutationen wird weiter auf
Qualitätsparameter, Leseabdeckung und Einfluss auf die Proteinsequenz
eingeschränkt. Komplexere Mutationen als Einzelaminosäuresubstitutionen SNPs, und Mutationen in nicht proteincodierenden Bereichen werden dabei ausgeschlossen. Ebenso werden stille Mutationen ausgeschlossen.
3) Die so definierten Mutationen werden anhand der bekannten Proteinsequenzen
(RefGene-Datenbank) auf flankierende 20er Oligopeptide erweitert. Aus diesen wurden sequenziell je 12 x 9er Oligopeptide gebildet und die Affinität zu den vorbekannten, patientenspezifischen hypervariablen HLA-I Paratopen bestimmt (Programm NetMHC-4.0). Ausgewählt werden Nonapeptide mit hoher Affinität zu den Paratopen, welche durch die Mutation (SNP) einen weiteren Zugewinn an Affinität gegenüber der Wildtypsequenz aufweisen.
4) Kandidaten die in einen Exompool an gleicher Stelle diese Mutation als
Keimbahnmutation tragen werden ausgeschlossen (NIH-NHLBI 6500 exome database version-2 Programm ANNOVAR-Tool2.)
5) Anhand der Ergebnisse der Expressionsanalyse (siehe Befund unter
Ausführungsbeispiel 1 ) können Peptide mit einer geringen Expressionsrelevanz im Tumor ausgeschlossen werden.
6) Abschließend wird im Einzelnen überprüft, ob evtl weitere Polymorphismen in der Umgebung des Einzelbasenaustausches vorliegen und sich somit weitere, patientenspezifische Abweichungen von der hg 19 definierter Genomsequenz darstellen.
Nachstehend ist beispielhaft die Auswertung der Ergebnisse der beschriebenen
Mutationsanalyse und Filtrationsschritte für einen Patienten aufgeführt:
1 ) Vergleich T umor-DNA gegenüber Normal-DNA
a. Die Einzelanlyse„Exome_single_sample_Somatic“ mittels des lonReporter ergibt:
37494 Varianten in der Normal-DNA, und
37299 Varianten in der Tumor-DNA.
b. Die gepaarte Analyse„AmpliSeq Exome tumor-normal pair“ detektiert und annotiert seltene somatische Varianten (SNPs, InDels, CNVs) mittels statistischer Analysen im Ion AmpliSeq Exome Panel (Ion Reporter Software 4.6. Workflow Version: 1.0). Diese ergibt: 1477 Mutationen im Tumor mit gleichzeitiger Wildtyp Kategorisierung in der Normal-DNA.
Diese 1477 Varianten sind Ausgangspunkt, der weiteren Einschränkungen.
2) Einschränkung der Varianten auf proteincodierende SNP (Single Nucleotide
Polymorphisms) mit Aminosäure-Substitution.
Einschränkung auf SNPs
Mindestens 50x im Tumor und min. 20x im Blut sequenziert
Darf im Blut in keinem einzigen Run aufgetreten sein
Muss in einem Exon positioniert sein
Muss zu einem Aminosäureaustausch führen (missense Mutation)
3) Von diesen Varianten werden 20er Peptide definiert und der HLA-Paratop- Affinitätsanalyse NetMHC zugeführt. Es werden -25*12 Nonapeptidpaare (Je mutiert und wildtyp) der Affinitätsanalyse zu Analyse in jeweils 9 HLA Loci übergeben. Daraus werden von 5814 Affinitäten (2907 Paare) untersucht. Bei 40 Paaren wird eine mind. 2-fach höhere Affinität im mutierten Peptid als im Wildtyp- Peptid nachgewiesen.
Zusammenfassung der Varianten mit erhöhter HLA Affinität ) Kandidaten die in einen Exompool (NIH-NHLBI 6500 exome database version-2) an gleicher Stelle diese Mutation als Keimbahnmutation tragen, werden ausgeschlossen
(Programm ANNOVAR - Tool3.)
Verwendete Datenbankfilter: hg19_esp6500siv2_all ) Auswahl aus verbleibenden 25 Varianten mit signifikanter mRNA Expression (> 3 fold versus Normalgewebe) in Abgleich mit Transkriptom
Beispiel 3: Patienten mit mMC (metastasiertem MammaCarcinom), Typ_HER2-neu
1) Klinische Vorgeschichte der Patienten
Patient, weiblich
Der klinische Erstbefund: invasiv duktales bifokales Mammakarzinom (Mamma-CA), rechts, Tumor 2 cm bis 5 cm in größter Ausdehnung (pT2), pN1 sn pN1 (3/5) G2, NO, ER-, PR-, HER-2 neu: 3+, Ki-67: 55%
Behandlunqsverfahren:
■ 2 Wochen später: Neoadjuvante Chemotherapie (TCH w3) 6 Zyklen, Trastuzumab;
■ 6 Monate später: Bestrahlung der rechten Brust + Lymphabflußgebiet (LAG)
Tumor durch Strahlen- oder Chemotherapie vollständig zerstört (CR = Vollremission) des Tumors, Befund: Patienten als geheilt aus der Klinik entlassen.
Wiederauftreten: 24 Monate nach dem Erstbefund tritt ein Lokalrezidiv mit zusätzlichen Lebermetastasen (4 Herde) auf; Befund: ER-, PR+ (60%), HER-2 neu: 3+, Ki-67: 80%
Dieses erneut aufgetretene Mamma-CA trat mit Lebermetastasen auf und wies zudem eine erheblich größere Aggressivität auf (Ki-67: 80% versus 55% (Erstbefund)).
Proonose der Klinikärzte: Die Patientin wurde aus der Klinik entlassen mit der Prognose eines OS (overall survival) von voraussichtlich/durchschnittlich 6 Monaten.
Das bekannte Faktum, dass beim Mamma-CA ein erneut aufgeflammter zweiter Primärtumor (second primary malignancy (SPM)) mit schlechterer Prognose und mit schlechterer OS versehen ist (siehe“Breast cancer survivors face excess risk for second primary cancer in SEER analysis”, Wei JL & al. , Int J Clin Oncol, 19.03.2019), voraussichtlich durch
vorhergehende Chemotherapie ausgelöst,
Behandlunqsverfahren:
■ 2 Monate nach Diagnose: operative Entfernung der Brustdrüse und angrenzender Gewebe der rechten Brust (Brustamputation) wegen eines dort aufgetretenen Lokalrezidivs.
■ 4 Monate nach Diagnose: Auftauchen von Knochenmetastasen (ossäre Metastasen (Wirbelsäule)) und eines Bronchialkarzinoms (suspekte LK Lungenhilus);
■ 9 Monate nach Diagnose: operative Entfernung der Brustdrüse und angrenzender Gewebe der linken Brust. Tumor Progress trotz Trastuzumab bzw. T-DM1 Dauertherapie
2) Individualisierte Immun-Informations-Therapie: Analytik
Nachdem TherapieVBehandlungsverfahren unter Punkt 1 ohne Erfolg durchgeführt worden, kam im Rahmen eines Heilversuches der immunologische Therapieansatz der Information des patienteneigenen Immunsystems mittels Applikation tumor-assoziierter und
tumorspezifischer HLA Antigenpeptide in Form synthetisierter Peptide zum Einsatz.
Der Schwerpunkt wurde dabei auf die zelluläre Immunabwehr, d.h. die Aktivierung der körpereigenen zytotoxischen CD8+T-Zellen gelegt, die als naive T-Zellen durch ein hochdifferenziertes Rezeptorsystem in der Lage sind, quasi alle denkbaren pathogenen wie auch malignen Aminosäuresequenzen (die sogenannten„targets“) zu erkennen und sich so zu Effektorzellen zu entwickeln. Diese Effektor-T-Zellen können die über die HLA- präsentierten Antigene erkannten Tumorzellen per Sekretion von Granzym und Perforin zerstören.
Hierzu wurden aus biopsiertem Tumorgewebe der Patienten labortechnisch über„next generation sequenzing“ (NGS) und„liquid chromatography-coupled tandem mass spectrometry“ (LC-MS/MS) über nachfolgende drei Schritte Daten erhoben
■ die mRNA-Expression sämtlicher codierender Genbereiche (Transkriptom - Schritt
(a)),
■ die tumorspezifischen somatischen miss-sense Mutationen sowie über (Exom- Sequenzierung - Schritt (b))
■ die von den Tumorzellen präsentierten HLA-restringierten Liganden der HLA-Klassen l+ll (HLA-Ligandom - Schritt (c))
zu Schritt (a): Die mRNA-Expressionsdaten (ca. 40.000) wurden mit den Expressionswerten von gesundem Gewebe verglichen und gefiltert hinsichtlich
■ signifikanter (>3-fach) Abweichung der Expressionswerte, und weiter
■ hinsichtlich der Bedeutung für betreffenden Gene für die Tumorentwicklung
■ nach dem Kriterium, dass diese Gene in anderen Gewebearten nicht oder nur
geringfügig exprimiert werden dürfen
■ ferner wurde hinsichtlich der Gruppe der cancer-testis-antigene, die grundsätzlich nicht in gesunden mamma-geweben von Erwachsenen exprimiert werden, nennenswerte Expressionen im Tumor festgehalten, da diese die Qualität eines tumorspezifischen Antigens besitzen können
Hieraus ergab sich ein gesonderter Datensatz von möglichen HLA-Tumorantigenpeptiden (Anzahl 86), die hinsichtlich ihrer Expressionsauffälligkeiten/-abweichungen von normal und ihrer bekannten Bedeutung für die Tumor-Proliferation gewichtet wurden - > Faktor 3 gegen Normal; Bedeutung für Tumorentwicklung: Wachstumsfaktoren, Angiogenesefaktoren, Metastasierungsfaktoren.
zu Schritt (b): Die somatischen miss-sense Mutationen (single nucleotid Varianten (SNV) mit einem Austausch von einer Aminosäure wie auch frame-shift-Mutationen) (Anzahl: 57) wurden in einem weiteren Datensatz zusammengefasst, da sie dem Charakter nach potentiell bedeutsame (Neo-)-Antigene und damit in höchstem Maße tumor-spezifisch sind.
zu Schritt (c): Die HLA-restringierten Liganden (Aminosäurensequenzen von 9-10 AS (entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe) (Anzahl:1 100) und Sequenzen von 12-15 AS (entsprechend der MHC-Klasse-Il-Komplexe) (Anzahl:730) wurden mittels Informationen aus spezialisierten Datenbanken überprüft auf
■ im gesunden Gewebe bereits aufgetaucht (=negativ)
■ in Proteinübereinstimmung mit aussichtsreichen Sequenzen aus Transkriptom und Exom, ob Sequenzen der ermittelten tumorassoziierten HLA-Antigenpeptide mit der Proliferation, Invasivität, Angiogenese und/oder einer Erhöhung der
Zytokeratinproduktion des Mamma-/Brustkarzinoms assoziiert sind.
Parallel zu diesen beschriebenen Tumor-Gewebeuntersuchungen wurde der genetische Haplotyp, die Allele der HLA-Antigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe der Patientin bestimmt. Das patienten-individuelle Ergebnis ergab folgende Zuordnung:
HLA-A*02:01 , A*24:02, BΊ 8:01 , B*51 :01 , C*07:01 , C*15:02; HLA-DRB1 *09:01 ;
DRB1 *16:01 , DQB1 *03:03, DQB1 *05:02.
(Mit der Trägerschaft von HLA-A*02:01 i.V.m. B*18:01 repräsentiert diese Patientin ca. 40% der in Europa lebenden Bevölkerung (kaukasisch)). 3) Individualisierte Immun-Informations-Therapie: Target-Auswahl zu Schritt (a): Aus den Datensätzen des Transkriptoms wurden zunächst anhand der Aminosäurensequenzen der jeweiligen Proteine Aminosäuresequenzen der HLA- Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Komplexe (Nonamere) mit den höchsten Allele-Affinitäten (spezifische Aktivität gegenüber T-Zell-Rezeptor [nM]) ausgewählt. Mit diesem Auswahlkriterium wird algorithmisch die Wahrscheinlichkeit bestimmt, mit der das jeweilige HLA-Tumorantigenpeptid in vivo auf den entsprechenden MHC-Komplexen präsentiert wird (eine erste Voraussetzung für eine mögliche zelluläre Immunantwort). zu Schritt (b): Aus den Datensätzen der Mutationsuntersuchungen wurde anhand der Allele des Patienten Nonamere-Varianten, die den Aminosäureaustausch beinhalten, hinsichtlich der höchsten Affinitäten (spezifische Aktivität gegenüber T-Zell-Rezeptor [nM]) bestimmt. Auch wurden hierzu Polymere von 17 Aminosäuren (Oligopeptide) unter dem
Affinitätskriterium festgelegt. Mit diesem Auswahlkriterium wird algorithmisch die
Wahrscheinlichkeit bestimmt, mit der das jeweilige Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Komplexe in vivo auf den entsprechenden MHC-Komplexen präsentiert wird (eine zweite Voraussetzung für eine mögliche zelluläre Immunantwort).
Schritt (c): Auf Grundlage der unter Schritt (a) und (b) ermittelten neuen Datensätze wurden unter Hinzunahme der HLA-restringierten Liganden (dem Datensatz des Ligandoms) eine Auswahl von HLA-Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und entsprechend der MHC-Klasse-Il-Komplexe getroffen, die sowohl einzeln als auch und vor allem in ihrer Kombination die aussichtsreichsten Epitopkandidaten zur Auslösung einer zellulären Immunantwort waren.
4) Individualisierte Immun-Informations-Therapie: Peptidsynthese und Applikationslösung
Schritt (a): Die für die auf maßgeschneiderten Applikationslösung ausgewählten
Peptidkonzepte wurden als chemische Peptide synthetisch hergestellt.
Schritt (b): die nachfolgenden 7 HLA-A Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC- Klasse-I-Komplexe und 2 HLA Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-Il- Komplexe wurden in einer 33%ige DMSO/H2O Applikationslösung gemischt und in 24 vial- Einheiten ä 1 ml aufgeteilt. Sequenzen der neun Tumorantigenpeptide
Dosis pro Tumorantiaenpeptid: 500 pg
5) Individualisierte Immun-Informations-Therapie: Applikations-Protokoll
Vorbehandlung: 300 mg/m2 Cyclophosphamid (einmalige Infusion); 3 Tage vor erster Injektion
Applikation: intra-dermal (i.d.)
Applikationsort: linker und rechter Oberarm Verabreichungsplan: 23 Vakzinierungen an den Tagen 1 , 2, 3, 8, 15, 22, 36, 50, 71 und weiter alle 3 Wochen bis Tag 365
Zugesetzte Adjuvanzien pro Applikation: 12.5 mg Imiquimod in 250 mg Creme (Aldara) topisch an Injektionsort; 200 pg Ipilimumab (Yervoy), da CTLA4 erhöht, abwechselnd mit 300 pg Nivolumab (Opdivo), da PD1 bzw PD-L1 erhöht, subkutan (s.c.) direkt neben Applikationsort
6) Individualisierte Immun-Informations-Therapie: 2 Belege der klinischen Effekte
Anhand zweier signifikanter Beispiele kann nachfolgend die klinische Wirksamkeit der angewendeten Immuntherapie im dargestellten Fall 1 aufgezeigt werden: Fig. 3 zeigt die Entwicklung des Spezifischen Tumormarkers CA 15-3 in Verbindung mit dem Lebermarker Gamma GT nach spezifischer Applikation (i.d.) spezifischen pharmazeutischen Zusammensetzung der Immuninformation durch BITAP-Peptide (Sternlinie), die die spezifischen Metastasen-Epitope der Lebermetastasen des gestreuten mMC-HER2/Neu abbilden (INC 14/1713).
Der abgebildete Verlauf umfasst 34 Wochen. die Entwicklung des Spezifischen Tumormarkers CA 15-3 nach spezifischer
Immuninformation durch die erfindungsgemäße Zusammensetzung an
Tumorantigenpeptiden (Stern), die die Epitope des Primärtumors MC-HER2/Neu abbilden (INC 14/1713). Der abgebildete Verlauf umfasst 26 Wochen.
Beispiel 4: Patienten mit mIBC mit Lymphangosis Carinomatose (metastasierter inflammatorischer Brustkrebs)
1) Klinische Vorgeschichte der Patienten
Patient, weiblich (46 Jahre)
Der klinische Erstbefund: i Inflammatorisches Mammakarzinom rechts mit ausgedehnter Lymphangiosis carcinomatose; Initiales Tumorstadium pT4, pn3a (24/29)(Level 11:14/19, Level III: 10/10), MO, L1 , V0, G2. HR+, PR+, Androgenr.+, HER2/neu -
Wiederauftreten: Postoperativ bereits nach 3 Monaten ein erstes Rezidiv:
Befundprogredienz intramammär im Bereich der rechts unteren Quadranten mit signifikanter Konsistenzvermehrung des Brustgewebes. Die Mittellinie überschreitende Hautinfiltration im Bereich der Thoraxwand sowie lokoregionäre Tumorinfiltration des axillären Fettgewebes und der lateralen Thoraxwand entlang des Musculus pectoralis major rechts.
Nach 5 Monaten lokoregionäres Tumorrezidiv, mit Ausdehnung in die Achselhöhle.
Von Monat 6 bis Monat 1 1 Chemotherapie, die bei Tumorprogredienz während der
Chemotherapie nach 5 Zyklen abgebrochen wurde. Lokoregionäres Tumorrezidiv, 7x1 1cm entlang der ventrolateralen Thoraxwand. Haut und Unterhautgewebe großflächig infiltriert und verdickt.
Hormontherapie mit Aromatasehemmer und Bestrahlung der rechten Brust, Brustwand und supraclaviculär/cervical rechts. Prognose der Klinikärzte: OS für voraussichtlich 3-4 Monate. (Das inflammatorische Mammakarzinom ist eine relativ seltene, besonders aggressive Form des Mammakarzinoms, das in diesem Fall 2 bereits in die Lymphbahnen gestreut hatte (24 von 29 Lymphknoten waren bereits bei Erstdiagnose befallen)).
Erfindungsgemäßes Behandlungsverfahren: Nachdem alle im Standard- und Regelkanon der onkologischen Medizin verfügbaren Therapien ohne Erfolg durchgeführt worden waren, kam im Rahmen eines Fleilversuches der immunologische Therapieansatz der Information des patienteneigenen Immunsystems mittels Applikation tumor-assozierter und
tumorspezifischer Antigene in Form synthetisierter Peptide zum Einsatz.
Der Schwerpunkt wurde dabei auf die zelluläre Immunabwehr, d.h. die Aktivierung der körpereigenen zytotoxischen CD8+T-Zellen gelegt, die als naive T-Zellen durch ein hochdifferenziertes Rezeptorensystem in der Lage sind, quasi alle denkbaren pathogenen wie auch malignen Aminosäuresequenzen (im Folgenden die„targets“) zu erkennen und sich so zu Effektorzellen zu entwickeln. Diese Effektor-T-Zellen können die über die FILA- präsentierten Antigene erkannten Tumorzellen per Sekretion von Granzym und Perforin zerstören.
Die Aktivierung dieser Immunzellen erfolgt über die Liganden der FILA-Klasse I, d.h. die Antigene, die als Sequenzen von 8-10 Aminosäuren auf FILA-Molekülen der Klasse I restringiert präsentiert werden.
In den Monaten 14-84 nach Beginn der individualisierten Immun-Informatikum-Therapie ereigneten sich noch weitere lokale Rezidive (Lymphknoten), die jeweils operativ entfernt wurden. Eine Fern-Metastasierung konnte jedoch verhindert werden.
2) Individualisierte Immun-Informations-Therapie: Analytik
Um die tumorassoziierten und -spezifischen Antigenpeptide zu identifizieren, wurden aus biopsiertem Tumorgewebe der Patienten labortechnisch über„next generation sequenzing“ (NGS) und„liquid chromatography-coupled tandem mass spectrometry“ (LC-MS/MS) über nachfolgende drei Schritte Daten bestimmt:
■ die mRNA-Expression sämtlicher codierender Genbereiche (Transkriptom - Schritt
(a)),
■ die tumorspezifischen somatischen miss-sense Mutationen sowie über (Exom- Sequenzierung - Schritt (b)) ■ die von den Tumorzellen präsentierten HLA-restringierten Liganden der HLA-Klassen l+ll (HLA-Ligandom - Schritt (c))
zu Schritt (a): Die mRNA-Expressionsdaten (ca. 40.000) wurden mit den Expressionswerten von gesundem Gewebe verglichen und gefiltert hinsichtlich
■ signifikanter (>3-fach) Abweichung der Expressionswerte, und weiter
■ hinsichtlich der Bedeutung für betreffenden Gene für die Tumorentwicklung
■ nach dem Kriterium, dass diese Gene in anderen Gewebearten nicht oder nur
geringfügig exprimiert werden dürfen
■ ferner wurde hinsichtlich der Gruppe der cancer-testis-antigene, die grundsätzlich nicht in gesunden mamma-geweben von Erwachsenen exprimiert werden, nennenswerte Expressionen im Tumor festgehalten, da diese die Qualität eines tumorspezifischen Antigens besitzen können
Hieraus ergab sich ein gesonderter Datensatz von möglichen HLA-Tumorantigenpeptiden (Anzahl 86), die hinsichtlich ihrer Expressionsauffälligkeiten/-abweichungen von normal und ihrer bekannten Bedeutung für die Tumor-Proliferation gewichtet wurden.
zu Schritt (b): Die somatischen miss-sense Mutationen (single nucleotid Varianten (SNV) mit einem Austausch von einer Aminosäure wie auch frame-shift-Mutationen) (Anzahl: 41 ) wurden in einem weiteren Datensatz zusammengefasst, da sie dem Charakter nach potentiell bedeutsame (Neo-)-Antigene und damit in höchstem Maße tumor-spezifisch sind.
zu Schritt (c): Die HLA-restringierten Liganden (Aminosäurensequenzen von 9-10 AS (entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe) (Anzahl:1321 ) und Sequenzen von 12-15 AS (entsprechend der MHC-Klasse-Il-Komplexe) (Anzahl:863) wurden mittels Informationen aus spezialisierten Datenbanken überprüft auf
■ im gesunden Gewebe bereits aufgetaucht (=negativ)
■ in Proteinübereinstimmung mit aussichtsreichen Sequenzen aus Transkriptom und Exom, ob Sequenzen der ermittelten tumorassoziierten HLA-Antigenpeptide mit der Proliferation, Invasivität, Angiogenese und/oder einer Erhöhung der
Zytokeratinproduktion des Mamma-/Brustkarzinoms assoziiert sind. Parallel zu diesen beschriebenen Tumor-Gewebeuntersuchungen wurde der genetische Haplotyp, die Allele der HLA-Antigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe der Patientin bestimmt. Das patienten-individuelle Ergebnis ergab folgende Zuordnung:
HLA-A*01 :01 , A*29:02, B*08:01 , B*44:03, C*07:01 , C*16:01 ; HLA-DRB1 *03:01 ;
DRB1 *07:01 , DRB3*01 :01 , DRB1 *03:01 , DRB4*01 :01 , DQB1 *02:01 , DPB1 *01 :01
(Mit der Trägerschaft von HLA-A*01 :01 i.V.m. B*08:01 repräsentiert diese Patientin ca. 25% der in Europa lebenden Bevölkerung (kaukasisch)).
3) Individualisierte Immun-Informations-Therapie: Target-Auswahl zu Schritt (a): Aus den Datensätzen des Transkriptoms wurden zunächst anhand der Aminosäurensequenzen der jeweiligen Proteine Aminosäuresequenzen der HLA- Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Komplexe (Nonamere) mit den höchsten Allele-Affinitäten (spezifische Aktivität gegenüber T-Zell-Rezeptor [nM]) ausgewählt. Mit diesem Auswahlkriterium wird algorithmisch die Wahrscheinlichkeit bestimmt, mit der das jeweilige HLA-Tumorantigenpeptid in vivo auf den entsprechenden MHC-Komplexen präsentiert wird (eine erste Voraussetzung für eine mögliche zelluläre Immunantwort). zu Schritt (b): Aus den Datensätzen der Mutationsuntersuchungen wurde anhand der Allele des Patienten Nonamere-Varianten, die den Aminosäureaustausch beinhalten, hinsichtlich der höchsten Affinitäten (spezifische Aktivität gegenüber T-Zell-Rezeptor [nM]) bestimmt. Auch wurden hierzu Polymere von 17 Aminosäuren unter dem Affinitätskriterium festgelegt. Mit diesem Auswahlkriterium wird algorithmisch die Wahrscheinlichkeit bestimmt, mit der das jeweilige Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Komplexe in vivo auf den entsprechenden MHC-Komplexen präsentiert wird (eine zweite Voraussetzung für eine mögliche zelluläre Immunantwort).
Schritt (c): Auf Grundlage der unter Schritt (a) und (b) ermittelten neuen Datensätze wurden unter Hinzunahme der HLA-restringierten Liganden (dem Datensatz des Ligandoms) eine Auswahl von HLA-Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und entsprechend der MHC-Klasse-Il-Komplexe getroffen, die sowohl einzeln als auch und vor allem in ihrer Kombination die aussichtsreichsten Epitopkandidaten zur Auslösung einer zellulären Immunantwort waren. 4) Individualisierte Immun-Informations-Therapie: Peptidsynthese und Applikationslösung
Schritt (a): Die für die auf maßgeschneiderten Applikationslösung ausgewählten
Peptidkonzepte wurden als chemische Peptide synthetisch hergestellt.
Schritt (b): die nachfolgenden 9 HLA-A Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC- Klasse-I-Komplexe und 2 HLA Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-Il- Komplexe wurden in einer 33%ige DMSO/H2O Applikationslösung gemischt und in 6 vial- Einheiten ä 1 ,5 ml aufgeteilt.
Sequenzen der neun Tumorantigenpeptide
Dosis pro Peptid: 300 pg
Gesamtpeptidgehalt pro Applikationsdosis (vial): 3,3 mg
5) Individualisierte Immun-Informations-Therapie: Applikations-Protokoll Vorbehandlung: 3 Mio Einheiten IFN alpha 2b (Roferon), 4 Tage vor erster Injektion Applikation: subkutan (s.c.)
Applikationsort: linker und rechter Oberarm, linke und rechte Hüfte
Verabreichungsplan: 6 Injektionen an den Tagen 1 , 8, 22, 50, 180 und 360 Zugesetzte Adjuvanzien pro Applikation: Montanide ISA 51 VG (1.5 ml), Mischung 1 :1 mit Peptid-vial (1.5ml); 300 pg Nivolumab (Opdivo), da PD1 bzw PD-L1 erhöht, sub-cutan (s.c.) direkt neben Injektionsort, 30 min vor Peptid/Montanide-Injektion.
6) Individualisierte Immun-Informations-Therapie: Belege der klinischen Effekte Die klinische Wirksamkeit der angewendeten Immuntherapie im dargestellten
Ausführungsbeispiel 4 ist in Fig. 5 aufgezeigt.
Die Graphik stellt die Entwicklung der T umormarker CEA (Balken 1 ) und CA15-3 (Balken 2) sowie des Leberwertes Gamma-GT (Balken 3) und der Leukozytenzahl (Balken 4) während eines Zeitraums von 8 Monaten nach der Applikation der pharmazeutischen
Zusammensetzung gemäß dem Ausführungsbeispiel 4 dar. Vorausgegangen war eine aggressive Tumorprogredienz - im Wesentlichen auf Basis der inflammatorischen
Lymphangiosis Carcinomatose. Die Applikation erfolgte mit einer 1 :1 Mischung von
Montanide ISA 51 VG mit dem Peptid-Cocktail. Das Volumen betrug 3 ml und wurde s.c. an den 4 unterschiedlichen Applikationsloci (siehe Pkt 5) appliziert. In dieser
Peptidzusammensetzung handelt es sich um die initiale Applikation (gefolgt von 4 weiteren Applikationen; siehe Pfeile in Fig. 5).
Die in der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß dem Ausführungsbeispiel 4 enthaltenen 10 Peptide sind Tumorantigenpeptide (oder auch Neoantigene). Durch
Information sind die Antigene Nr 1 -4 und 10 zu Epitopen geworden, d.h. es gelang, die entsprechenden T-Zell-Rezeptoren (TCR) zu aktivieren und Effektor- und Gedächtniszellen zu entwickeln.

Claims

Patentansprüche
1. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung oder zur Profilaxe von Mamma-/Brustkarzinomen, insbesondere lokal wiederkehrenden oder metastasierenden Mammakarzinomen bei einem Patienten oder einer Patientengruppe, der/die an einem Mamma-/Brustkarzinom erkrankt ist oder im Verdacht steht, an einem Mamma-/Brustkarzinom zu erkranken, umfassend eine pharmakologisch wirksame Menge umfassend 4 bis 8 HLA-A Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse- I-Komplexe und zumindest 2 Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-Il- Komplexe, dadurch gekennzeichnet, dass die HLA Tumorantigenpeptide tumorexklusive oder tumorassoziierte HLA Antigenpeptide sind, insbesondere solche, welche mit Mamma-/Brustkarzinomen assoziiert sind, wobei die HLA Tumorantigenpeptide
Sequenzen umfassen, die in den Sequenzen SEQ ID Nr. 13 - SEQ ID Nr. 26, SEQ ID Nr. 28, SEQ ID Nr. 29 und SEQ ID Nr. 32 - SEQ ID Nr. 48 wiedergegeben sind.
2. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 zu der im Anspruch 1
angeführten Verwendung, wobei das Verabreichen der pharmakologisch wirksamen Menge der Tumorantigenpeptide an den Patienten oder die Patientengruppe, der/die an einem Mamma-/Brustkarzinom erkrankt ist, den CA 15-3 Wert wirksam reduziert.
3. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2 zu der im Anspruch 1 angeführten Verwendung, wobei die HLA Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC- Klasse-I- bzw. Klasse-Il-Komplexe immunogene HLA Tumorantigenpeptide sind, bestimmt mittels eines Immunogenitätstests, insbesondere mittels Westernblot, ELISA- Techniken, ELISPOT oder Immunodetektion mit mikroskopischer Analyse.
4. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zu der im
Anspruch 1 angeführten Verwendung, wobei die HLA-A Tumorantigenpeptide an den entsprechenden MHC-Klasse-I-Komplex des Subtyps A*01 und/oder A*02 binden.
5. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zu der im
Anspruch 1 angeführten Verwendung, ferner umfassend zumindest ein HLA-B
Tumorantigenpeptid entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und/oder zumindest ein HLA-C Tumorantigenpeptid entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe.
6. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zu der im Anspruch 1 angeführten Verwendung, wobei die HLA-Tumorantigenpeptide
entsprechend des jeweiligen Subtyps der MHC-Klasse-I-Komplexe ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus den in SEQ ID Nr. 13 bis 35 angegebenen
Aminosäuresequenzen oder gegenüber diesen Aminosäuresequenzen zumindest einen Aminosäureaustausch aufweisen.
7. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorgenannten Ansprüche zu der im Anspruch 1 angeführten Verwendung, wobei die HLA-Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-Il-Komplexe ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus den in SEQ ID Nr. 36 bis 48 angegebenen Aminosäuresequenzen.
8. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorgenannten Ansprüche zu der im Anspruch 1 angeführten Verwendung, wobei die HLA-Tumorantigenpeptide auf der Oberfläche der Tumorzellen des Mamma-/Brustkarzinoms des Patienten oder der Patientengruppe präsentiert werden, bestimmt mittels
Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie (UHPCL) in Verbindung mit ESI Massenspektrometrie (MS).
9. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorgenannten Ansprüche zu der im Anspruch 1 angeführten Verwendung,
wobei das Expressionsniveau der tumorassoziierten HLA-Tumorantigenpeptide in den Tumorzellen mindestens dreimal höher ist als in den gesunden Zellen des Patienten oder der Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel, wie mit qPCR bestimmt, und
wobei die tumorassoziierten HLA-Antigenpeptide mit der Proliferation, Invasivität, Angiogenese und einer Erhöhung der Zytokeratinproduktion des Mamma- /Brustkarzinoms assoziiert sind.
10. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorgenannten Ansprüche zu der im Anspruch 1 angeführten Verwendung, wobei:
zumindest ein HLA-A Tumorantigenpeptid ein tumorexklusives HLA-A
Tumorantigenpeptid ist, und die spezifische Bindung des tumorexklusiven HLA-A Tumorantigenpeptids bestimmt gegenüber den entsprechenden MHC-Klasse-I-Komplex mit einer KD im Bereich von 10 bis 50 nM erfolgt, wie mit Oberflächenplasmonresonanz bestimmt.
1 1 . Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorgenannten Ansprüche zu der im Anspruch 1 angeführten Verwendung, wobei die pharmakologisch wirksame Menge jedes einzelnen H LA- Antigenpeptids in der Zusammensetzung in einer absoluten Konzentration (d.h. Verabreichungsdosis) im Bereich von 100 bis 600 yug liegt.
12. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorgenannten Ansprüche zu der im Anspruch 1 angeführten Verwendung, wobei die Zusammensetzung ein Adjuvans umfasst, das bei Applikation der Zusammensetzung an einen Patienten dazu geeignet ist, am Ort der Applikation ein Granulom auszubilden.
13. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorgenannten Ansprüche zu der im Anspruch 1 angeführten Verwendung, wobei die pharmazeutische
Zusammensetzung subkutan oder intradermal und, vorzugsweise im Wesentlichen gleichzeitig an zumindest 2 Applikationsorten, bevorzugt an zumindest 4
Applikationsorten, entfernt von einer Tumorläsion und/oder dem krebsartigen
Lymphknotenbereich appliziert wird.
14. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorgenannten Ansprüche zu der im Anspruch 1 angeführten Verwendung, wobei zumindest ein HLA-Tumorantigenpeptid zumindest eine Mutation in Bezug auf den Wildtypen des HLA-Tumorantigenpeptids (das Mutanom) aufweist, die zu einer Erhöhung der Affinität zum T-Zell-Rezeptor des mit HLA-Tumorantigenpeptids behandelten Individuums im Vergleich zu dem Wildtyp des HLA-Antigenpeptids führt.
15. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorgenannten Ansprüche zu der im Anspruch 1 angeführten Verwendung, wobei die pharmazeutische
Zusammensetzung zur Behandlung von Mamma-/Brustkarzinomen als Monotherapie oder in Kombination mit anderen bekannten Therapien und/oder Verbindungen zur Behandlung von Mamma-/Brustkarzinomen eingesetzt wird.
16. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorgenannten Ansprüche zu der im Anspruch 1 angeführten Verwendung, wobei die mit der pharmazeutischen
Zusammensetzung zu behandelnden Patienten ein Standardtherapieverfahren (z.B. mindestens eine Operation, Bestrahlung, Chemotherapie und/oder Hormontherapie) erhalten haben.
17. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorgenannten Ansprüche zu der im Anspruch 1 angeführten Verwendung, wobei die pharmazeutische
Zusammensetzung als eine Erstlinientherapie dem Patienten oder der Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel verabreicht werden.
18. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorgenannten Ansprüche zu der im Anspruch 1 angeführten Verwendung, wobei die pharmazeutische
Zusammensetzung, enthaltend jedes einzelne HLA-Tumorantigenpeptid in der pharmazeutischen Zusammensetzung in einer absoluten Konzentration (d.h.
Verabreichungsdosis) von 100 bis 600 pg, einmal alle 2 Wochen über einen Zeitraum von zumindest einem Jahr intradermal oder subkutan einem Patienten oder einer Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel verabreicht wird.
19. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorgenannten Ansprüche zu der im Anspruch 1 angeführten Verwendung, wobei das Mamma-/Brustkarzinom ein hormonpositiver, HER2/neu oder tripple negativer Brustkrebs ist.
20. HLA-Tumorantigenpeptid entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe oder MHC- Klasse-Il-Komplexe, insbesondere zur Verwendung bei der Behandlung von Mamma- /Brustkarzinomen bzw. für eine pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 19 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den in SEQ ID Nr. 13 - SEQ ID Nr. 26, SEQ ID Nr. 28, SEQ ID Nr. 29 und SEQ ID Nr. 32 - SEQ ID Nr. 48 angegebenen Aminosäuresequenzen.
21 . HLA-Tumorantigenpeptid nach Anspruch 20 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von Mammakarzinomen, insbesondere lokal wiederkehrenden oder metastasierenden Mammakarzinomen bei einem Individuum, wobei das Verfahren das Verabreichen eines Behandlungsregimes an das Individuum umfasst, das eine pharmakologisch wirksame Menge des HLA-Tumorantigenpeptids umfasst.
22. HLA-Tumorantigenpeptid nach Anspruch 20 oder 21 , wobei das Individuum noch keine Bestrahlung, Chemotherapie und/oder Hormontherapie gegen den Brustkrebs, insbesondere lokal wiederkehrenden oder metastasierenden Brustkrebs erhalten hat und/oder 12 Monate oder weniger seit der letzten Dosis eines Chemotherapeutikums keine vorhergehende adjuvante Chemotherapie in Rekurrenz mehr erhalten hat.
23. HLA-Tumorantigenpeptid nach einem der Ansprüche 20 bis 22, wobei das
Behandlungsregime das progressionsfreie Überleben des Individuums wirksam um zumindest 2 bis 5 Jahre verlängert.
24. HLA-Tumorantigenpeptid nach einem der Ansprüche 20 bis 23, die bei dem Patienten bzw. der Patientengruppe immunogen sind, bestimmt mittels eines Immunogenitätstests, insbesondere mittels Westernblot, ELISA-Techniken, insbesondere mittels ELISPOT, AFM oder Immunodetektion mit mikroskopischer Analyse.
25. HLA-Tumorantigenpeptid nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das
Individuum den Haplotyp mit der Subgruppe A*01 :01 und/oder A*02:01 aufweist.
26. HLA-Tumorantigenpeptid nach Anspruch 25, wobei das Individuum den Haplotyp mit der Subgruppe B*44:01 und/oder A*18:01 aufweist.
27. Verfahren zum Bestimmen pharmazeutisch wirksamer HLA-Tumorantigenpeptide zur Verwendung bei der Behandlung oder zur Profilaxe von MammaVBrustkarzinomen bzw. in einer Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, umfassend das Überwachen einer Gewebesektion eines Patienten bzw. einer Patientengruppe, der/die an einem MammaVBrustkarzinom erkrankt ist oder im Verdacht steht, an einem MammaVBrustkarzinom zu erkranken, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:
(a) Bereitstellen einer Gewebeprobe des Patienten bzw. der Patientengruppe, wobei die Zellen der Gewebeprobe MHC-Komplexe der Klasse I und/oder II exprimieren und diese auf ihrer Oberfläche präsentieren, wobei der genannte Verfahrensschritt (a) des Bereitstellens der Gewebeprobe selbst keinen chirurgischen Eingriff in den Patienten bzw. einen der Patienten der Patientengruppe umfasst;
(b) Bestimmen folgender Parameter anhand der bereitgestellten Gewebeprobe aus Schritt (a):
i) dem Transkriptom der bereitgestellten Gewebeprobe, und
Vergleichen mit dem Transkriptom einer gesunden Gewebeprobe des Patienten bzw. der Patientengruppe zum Bestimmen hoch- und/oder runterregulierter mRNA-Sequenzen, die um den Faktor 3 zum Schwellwert in der gesunden Gewebeprobe abweichen; sowie
ii) dem spezifischen HLA Haplotyp des Patienten bzw. der Patientengruppe; sowie
iii) der Exomsequenz der bereitgestellten Gewebeprobe, und
Vergleichen des Exoms der bereitgestellten Gewebeprobe mit dem Exom einer gesunden Gewebeprobe oder mit einer Gendatenbank des Patienten bzw. der Patientengruppe zur Bestimmung somatischer Mutationen, und
Ermitteln der HLA-Tumorantigenpeptide, die somatische Mutationen aufweisen und die gegenüber der gesunden Gewebeprobe hoch- bzw. runterreguliert sind, bestimmt in Schritt (i) und
Ermitteln der HLA-Tumorantigenpeptide, die mit der Proliferation,
Invasivität, Angiogenese und einer Erhöhung der Zytokeratinproduktion eines Mamma-/Brustkarzinoms assoziiert sind; sowie
iv) des Ligandoms zum Bestimmen der in Schritt (iii) ermittelten
Tumorantigenpeptide, die auf der Oberfläche der Zellen des Mamma- /Brustkarzinoms präsentiert sind; sowie
v) der spezifischen Bindungsaffinität der in Schritt (iv) ermittelten HLA Tumorantigenpeptide gegenüber dem entsprechenden MHC-Komplex der Zelle des Mamma-/Brustkarzinoms mittels Datenbank und/oder eines Rankingalgoritmus, sowie
vi) der Immunogenität der in Schritt (iv) ermittelten HLA-Tumorantigenpeptide mittels eines Immunogenitätstests insbesondere mittels Westernblot, ELISA-Techniken, insbesondere mittels ELISPOT, AFM oder
Immunodetektion mit mikroskopischer Analyse;
(c) Auswahl von HLA-Tumorantigenpeptiden, die die Kriterien gemäß der in Schritt (b) definierten Parameter erfüllen und die in den Zellen der bereitgestellten Gewebeprobe exprimiert und auf der Oberfläche dieser Zellen präsentiert werden.
28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei nach dem Bereitstellen der Gewebeprobe des
Patienten oder der Patientengruppe in Schritt (a) die Gene BRCA1 und BRCA2 auf das Vorliegen von Mutationen untersucht werden.
29. Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, wobei die in Schritt (a) bereitgestellte Gewebeprobe die Gewebeprobe eines Mamma-/Brustkarzinoms ist.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 29, wobei das Bestimmen, ob die HLA- Antigenpeptide auf der Oberfläche der Zellen der in Schritt (a) bereitgestellten
Gewebeprobe des Patienten oder der Patientengruppe präsentiert werden, mittels Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie (UHPCL) in Verbindung mit ESI
Massenspektrometrie (MS) erfolgt.
31 . Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 30, wobei das Bestimmen mehrere
Parameter gemäß Schritt (b) das Erstellen eines Transkriptoms der Gewebeprobe, die in Schritt (a) bereitgestellt wird, umfasst.
32. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 31 , wobei das Bestimmen mehrere
Parameter gemäß Schritt (b) das Erstellen einer Exomsequenzierung für diese
Gewebeprobe, die in Schritt (a) bereitgestellt wird, umfasst.
33. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 19, umfassend die folgenden Schritte:
(a) Bestimmen von zumindest 4 bis 8 HLA-A Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und zumindest 2 Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-Il-Komplexe, die auf der Zelloberfläche von Zellen aus einem Mamma-/Brustkarzinom des zu behandelnden Patienten oder Patientengruppe mit zumindest einem identischen HLA-Allel exponiert sind, mit dem
Bestimmungsverfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 32;
(b) Synthese der in Schritt (a) ermittelten 4 bis 8 HLA-A Tumorantigenpeptide
entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und zumindest 2
Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-Il-Komplexe; und
(c) Herstellen der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung
umfassend zumindest die in Schritt (b) synthetisierten 4 bis 8 HLA-A
Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe, der zumindest 2 Tumorantigenpeptide entsprechend der MHC-Klasse-Il-Komplexe und ein Adjuvans, wie hierin definiert.
34. Kombinationspräparat zur Verwendung bei der Behandlung von Mamma-
/Brustkarzinomen mit gleichzeitiger, getrennter, oder aufeinanderfolgender
Verabreichung,
umfassend die folgenden zwei getrennten Präparate (a) und (b):
(a) ein erstes Präparat, das zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel, 4 bis 8 HLA-A Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-I-Komplexe und zumindest 2
Tumorantigenpeptiden entsprechend der MHC-Klasse-Il-Komplexe nach einem der Ansprüche 1 bis 19 umfasst, und die optional mit dem Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 32 bestimmt wurden, und
(b) ein zweites Präparat, das zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel, ein Antikrebsmittel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antikrebsalkylierungsmitteln, Antikrebs-Antimetaboliten, Antikrebsantibiotika, pflanzlichen Antikrebsmitteln, platinkoordinierten Antikrebskomplexverbindungen, Antikrebscamptothecinderivate,
Antikrebstyrosinkinaseinhibitoren, monoklonalen Antikörpern, Interferonen, Interleukinen, biologischen Reaktionsmodifikatoren und anderen Antikrebsmitteln oder einem pharmazeutisch verträgliches Salz davon, umfasst.
35. Kombinationspräparat nach Anspruch 34, wobei das zweite Präparat ein monoklonaler Antikörper, insbesondere gegen ein immunsuppressives Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus CTLA4, GM-CFS, TReg, EpCam, IDO, MIC, PDL1 , Fas und PD1 -L, TRAIL ist.
36. Kombinationspräparat nach Anspruch 34 oder 35, wobei das zweite Präparat ein
Östrogenhemmer für hormonpositive Patienten ist.
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