WO2015014820A1

WO2015014820A1 - Immuntherapie von prostatakrebs

Info

Publication number: WO2015014820A1
Application number: PCT/EP2014/066241
Authority: WO
Inventors: Stefan Stevanovic; Christian Hotz; Hans-Georg Rammensee; Arnulf Stenzl; Joerg HENNENLOTTER; Felix Dingler
Original assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen Medizinische Fakultaet
Priority date: 2013-07-29
Filing date: 2014-07-29
Publication date: 2015-02-05
Also published as: DE102013012432A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Immun- therapie von Prostatakrebs, die Verwendung von Peptiden zur Immuntherapie von Prostatakrebs sowie ein im Rahmen der Immuntherapie verwendbares Peptid.

Description

Immuntherapie von Prostatakrebs

[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Immuntherapie von Prostatakrebs, die Verwendung von Peptiden zur Immuntherapie von Prostatakrebs sowie ein im Rahmen der Immuntherapie verwendbares Peptid.

[0002] Der Prostatakrebs bzw. das Prostatakarzinom ist eine bösartige Tumorerkrankung, die vom Drüsengewebe der Vorsteherdrüse (Prostata) ausgeht. In Deutschland sterben knapp 3 von 100 Männern an Prostatakrebs. Der Prostatakrebs gehört zu den häufigsten Krebserkrankungen des Mannes: Innerhalb der Gruppe der an Krebs verstorbenen Männer ist er für etwa 10 % der Todesfälle verantwortlich und stellt damit die dritthäufigste tödliche Krebserkrankung nach Lungen- und Darmkrebs dar.

[0003] Eine Behandlung mit Aussicht auf Heilung ist in der Regel nur möglich, wenn das entartete Gewebe die Organgrenzen noch nicht überschritten hat und keine Metastasen vorliegen.

[0004] Trotz der gut etablierten Therapiemöglichkeiten wie der Prostatektomie, Chemo-, Strahlen-, oder hormoneller Therapie, erleidet die Mehrheit der Patienten einen Rückfall der Krankheit. Anhand bestimmter Marker im Blut der Patienten, zum Beispiel dem prostataspezifischen Antigen (PSA), lässt sich ein Rückfall bzw. ein Rezidiv der Krankheit diagnostizieren, noch lange bevor die Tumorlast detektiert wird. Gerade an diesem Punkt sind neue Therapieformen, die den neuaufkeimenden Krebs in Schach halten, von großer Bedeutung.

[0005] Eine der vielversprechendsten Strategien im Kampf gegen Prostatakrebs bietet die Immuntherapie, die darauf abzielt, durch gezielte Stimulation des körpereigenen Immunsystems den Tumor zu bekämpfen.

[0006] Noguchi et. al (2003), Induction of Cellular and Humeral Immune Responses to Tumor Cells and Peptides in HLA-A^*24 Positive Hormone-Refractory Prostate Cancer Patients by Peptide Vaccination, The Prostate 57: 80-92, beschreiben die Induktion einer Immunantwort in Prostatakrebs-Patienten durch Verabreichung von maximal 4 HLA-A24-restringierten Peptiden.

[0007] Fuessel et. al (2006), Vaccination of Homone-Refractory Prostate Cancer Patients With Peptide Cocktail-Loaded Dendritic Cells: Results of a Phase I Clinical Trial, The Prostate 66: 81 1 -821 , beschreiben die Verabreichung eines Peptid-Cocktails bestehend aus HLA-A^*0201 -restringierten Peptiden in Prostatakrebs-Patienten.

[0008] Feyerabend et. al (2009), Novel Multi-Peptide Vaccination In Hla-A2+ Hormone Sensitive Patients With Biochemical Relapse of Prostate Cancer, The Prostate 69: 917-927, beschreiben die Verabreichung eines Cocktails bestehend aus 12 HLA-A^*02 und 2 HLA-Klasse-ll-restringierten Peptiden in Prostatakrebs-Patienten.

[0009] Keine der im Stand der Technik beschriebenen Immuntherapien konnte sich bislang in der Praxis bewähren.

[0010] Vor diesem Hintergrund ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine neue pharmazeutische Zusammensetzung bereitzustellen, mit der dem Prostatakrebs vorgebeugt bzw. dieser behandelt werden kann, wobei die Wirksamkeit gegenüber den im Stand der Technik beschriebenen Immuntherapien verbessert sein soll.

[0011] Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung gelöst, die zumindest 5 verschiedene Peptide mit jeweils unterschiedlichen Aminosäuresequenzen aufweist, wobei die Aminosäuresequenzen jeweils ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 bis 89.

[0012] Die Erfinder konnten überraschenderweise feststellen, dass die Verabreichung von zumindest 5 verschiedenen Peptiden mit jeweils verschiedenen Aminosäuresequenzen aus der von den Erfindern aufgefundenen bzw. definierten Gruppe bei nahezu allen Prostatakrebspatienten zu einer Stimulation der zellulären Immunantwort gegen das tumoröse Gewebe führt. [0013] Die Erfinder haben erkannt, dass mit der neuen pharmazeutischen Zusammensetzung eine Populationsabdeckung von über 90 % gegeben ist.

[0014] Den Erfindern ist es gelungen, Peptide zu identifizieren, mit denen eine spezifische CD8⁺- bzw. CD4⁺-T-Zellreaktion gegen die Tumorlast ausgelöst werden kann. Dabei erfolgte die Identifizierung der Peptide nicht allein aufgrund von theoretischen Überlegungen. Die Fähigkeit der identifizierten Peptide, eine spezifische T-Zellreaktion auszulösen, wurde mittels /n-v/^'iro-Stimulation von naiven CD8⁺-T-Zellen getestet, die aus peripherem Blut gesunder Spender isoliert wurden.

[0015] Die Erfinder konnten überraschenderweise feststellen, dass die Verabreichung von zumindest 5 verschiedenen Peptiden mit jeweils verschiedenen Aminosäuresequenzen aus der von den Erfindern definierten Gruppe, bei nahezu allen von Prostatakrebs betroffenen Individuen zu einer Stimulation der zellulären Immunantwort führt, die sich gegen das tumoröse Gewebe richtet. Es ist deshalb nicht zwingend erforderlich, vor der Verabreichung eine MHC- beziehungsweise HLA-Typisierung des betroffenen Individuums durchzuführen. Die Behandlung mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung ist deshalb besonders zeitsparend und kostengünstig.

[0016] Bei der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung kann es sich um ein Impfstoff bzw. ein Vakzin handeln, das direkt in einen Krebspatienten verabreicht wird.

[0017] Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann auch zur -Stimulation von Immunzellen ex vivo, bspw. T-Zellen bzw. CD8⁺-T-Zellen, verwendet werden. Nach der Stimulation können diese Immunzellen bedürftigen Patienten verabreicht werden.

[0018] Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung benötigt neben den erfindungsgemäßen Peptiden keine weiteren Wirkstoffe. Sie kann jedoch weitere Wirkstoffe oder Wirkverstärker enthalten. Im Falle eines Impfstoffes oder Vakzins sind beispielsweise sogenannte Adjuvantien bevorzugt, um die Immunantwort unspezi- fisch zu steigern. Derartige Adjuvantien umfassen bspw. Aluminiumhydrochlorid,

MF59AS03, Monophosphoryl-Lipid-A etc.

[0019] Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann neben den Peptiden ferner einen pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweisen. Derartige Träger sind im Stand der Technik allgemein bekannt. Sie umfassen beispielsweise Bindemittel, Sprengmittel, Füllmittel, Gleitmittel, sowie Pulver, Salze und sonstige zur Formulierung von Arzneimitteln geeignete Substanzen; vgl. Rowe et. al. (2006), Handbook of pharmaceutical excepience, 5th edition, pharmaceutical breath, oder Bauer et. al. (1999), Lehrbuch der pharmazeutischen Technologie, 6. Auflage, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart mbH.

[0020] Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird hiermit vollkommen gelöst.

[0021] Nach einer bevorzugten Weiterentwicklung der Erfindung weist die pharmazeutische Zusammensetzung zumindest 6, weiterbevorzugt zumindest 7, weiterbevorzugt zumindest 8, weiterbevorzugt zumindest 9 und höchstbevorzugt zumindest 10 verschiedene Peptide mit jeweils verschiedenen Aminosäuresequenzen auf.

[0022] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass mit noch größerer Zuverlässigkeit die weitgehend gesamte Population von Prostatakrebspatienten abgedeckt und in diesen eine gezielte Immunstimulation induziert wird. So weist jeder Mensch ein individuelles Set aus zwei HLA-A-Allelen und HLA-B-Allelen auf, beispielsweise HLA-A2, HLA-A3, HLA-B7 und HLA-B44. Die verschiedenen Allele sind unterschiedlich häufig in der Bevölkerung vertreten. MHC-Klasse-I-Epitome sind in ihrer Bindungsfähigkeit sehr restriktiv, binden also zum Beispiel nur auf HLA-A2 oder HLA-B7. Berechnet man die theoretische Populationsabdeckung eines Impfstoffes, der aus Peptiden besteht, die an die häufigsten HLA-Allele binden, dann ergibt sich, dass ab einer Menge von 5 Peptide über 95 Prozent der Bevölkerung abgedeckt wären: Anzahl Peptide Populationsabdeckung Restriktionen der verwendeten Peptide (%)

1 49,8736 A^*02

2 69,4191 A^*02 + A^*03

3 82,1916 A^*02 + A^*03 + B^*07

4 91 ,3564 A^*02 + A^*03 + B^*07 + B^*44

5 96,2364 A^*02 + A^*03 + B^*07 + B^*44 + B^*08

6 99,1 164 A^*02 + A^*03 + B^*07 + B^*44 + B^*08 + B^*35

Tabelle 1 : Theoretische Populationsabdeckung mit steigender Anzahl von Peptiden bei einer Erkennungsrate der Peptide von 100 %; Berechnung nach Schipper et al. (1996), Minimal phenotype panels. A method for achieving maximum population coverage with a minimum of HLA antigens, human immunology 51 (2), Seiten 95-98; Allelfrequenzen der deutschen Bevölkerung aus www.allelefrequencies.net

[0023] Das bedeutet, dass mit der Anzahl der Peptide mit jeweils verschiedenen Aminosäuresequenzen auch die Populationsabdeckung zunimmt, sodass mit noch höherer Zuverlässigkeit sämtliche von Prostatakrebs betroffenen Patienten erfasst werden.

[0024] Es versteht sich, dass die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung zumindest 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 verschiedene Peptide mit jeweils verschiedenen Aminosäuresequenzen aufweisen kann, wobei die Aminosäuresequenzen der verschiedenen Peptide jeweils ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 bis 89.

[0025] Nach einer bevorzugten Weiterentwicklung weist die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung zumindest zwei verschiedene Peptide pro Allel auf.

[0026] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die Wahrscheinlichkeit erhöht wird, eine immunogene Reaktion bei einem Patienten, dessen HLA-Typisierung bekannt ist, auszulösen. Dann ist es sinnvoll, nur die passenden Peptide zu seinen HLA-Allelen zu verabreichen. Je mehr Peptide pro Allel verabreicht werden, desto wahrscheinlicher ist eine immunoge Reaktion bei einem Patienten, der dieses Allel trägt. D.h. diese Maßnahme steigert die Wahrscheinlichkeit, dass ein immunogenes Peptid pro Allel verabreicht wird.

[0027] Nach einer bevorzugten Weiterentwicklung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung sind die Aminosäuresequenzen jeweils ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 bis 56.

[0028] Wie die Erfinder feststellen konnten, sind diese Aminosäuresequenzen besonders geeignet. Diese Erkenntnis war überraschend, da diese Sequenzen im Stand der Technik bislang nicht beschrieben sind.

[0029] Nach einer bevorzugten Weiterentwicklung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung erfolgt die Immuntherapie im Rahmen einer postoperativen Behandlung.

[0030] Mit dieser Maßnahme kann einem Rezidiv wirksam vorgebeugt werden.

[0031] Vor diesem Hintergrund betrifft ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung von zumindest 5, vorzugsweise zumindest 6, weiter bevorzugt zumindest 7, weiter bevorzugt zumindest 8, weiter bevorzugt zumindest 9, höchst bevorzugt zumindest 10 verschiedenen Peptiden mit jeweils unterschiedlichen Aminosäuresequenzen zur Immuntherapie von Prostatakrebs, wobei die Aminosäuresequenzen jeweils ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 bis 91 .

[0032] Die Merkmale, Vorteile und Weiterbildungen der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung gelten für die erfindungsgemäße Verwendung gleichermaßen.

[0033] Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Peptid zur Immuntherapie von Prostatakrebs, wobei das Peptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die ausgewählt ist, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 bis 91 . [0034] Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Peptid zur Immuntherapie von Prostatakrebs, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die ausgewählt ist, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 bis 56.

[0035] Die Merkmale, Vorteile und Weiterbildungen der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung geltend für das erfindungsgemäße Peptid gleichermaßen.

[0036] Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Nuklein- säuremolekül, bei dem es sich um DNA oder RNA bzw. einem genetischen Vektor oder Plasmid handeln kann, der für die erfindungsgemäßen Peptide kodiert.

[0037] Die Erfindung betrifft außerdem einen Wirt, beispielsweise einen Mikroorganismus wie ein Bakterium, das das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül enthält.

[0038] Die für die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung genannten Merkmale, Vorteile und Weiterbildungen gelten für das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül entsprechen.

[0039] Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur immuntherapeutischen Behandlung von Prostatakrebs, das folgende Schritte aufweist: (1 ) Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, (2) Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung in einen bedürftigen Patienten und (3) ggfs. Wiederholung der Schritte 1 und 2, wobei es sich bei der pharmazeutischen Zusammensetzung um die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung handelt.

[0040] Ein noch weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur immuntherapeutischen Behandlung von Prostatakrebs, das folgende Schritte aufweist: (1 ) Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, (2) Inkubation von Immunzellen, vorzugsweise T-Zellen, weiter bevorzugt CD8⁺-T-Zellen, mit der pharmazeutischen Zusammensetzung, (3) Verabreichung der Immunzellen aus Schritt (2) in einen bedürftigen Patienten und (4) ggfs. Wiederholung der Schritte 1 bis 3, wobei es sich bei der pharmazeutischen Zusammensetzung um die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung handelt.

[0041] Die Merkmale der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung gelten für die erfindungsgemäßen Behandlungsverfahren gleichermaßen.

[0042] Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

[0043] Die Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, aus denen sich weitere Merkmale und Vorteile ergeben. Die Ausführungsbeispiele sind rein illustrativ und schränken die Reichweite der vorliegenden Erfindung nicht ein. Dabei wird Bezug auf die beigefügten Figuren genommen.

[0044] Die Figuren zeigen Folgendes:

Fig. 1 zeigt den Arbeitsablauf zur der Identifizierung von immonogenen HLA- Klasse-I-Liganden von Prostatagewebe.

Fig. 2 zeigt den schematischen Ablauf der MHC-Peptid-Immunpräzipitation.

Auftrennung der Peptidmischung via Hochleistungsflüssigkeitschroma- tographie (HPLC) und anschließender Sequenzierung der Peptide durch Fragmentierung im Massenspektrometer.

Fig. 3 zeigt die Verifizierung der Kandidatenpeptide durch Vergleich mit dem entsprechenden synthetischen Peptid gleicher Sequenz.

Fig. 4 zeigt den schematischen Aufbau einer artifiziellen Antigen präsentierenden Zelle (aAPC). Fig. 5 zeigt den schematischen Aufbau eines biotinylierten MHC-Monomers mit Peptid.

Fig. 6 zeigt das Ablaufschema der /n-v/^'iro-Stimulation naiver CD8⁺-T-Zellen mit aAPCs.

Fig. 7 zeigt die tetramer-positive Reaktion einer /n-v/^'iro-Stimulation als Beispiel.

Ausführungsbeispiele

1 . Populationsabdeckung durch die identifizierten Peptide

[0045] Berechnet man die Populationsabdeckung anhand der MHC-Restriktion der tatsächlich von den Erfindern identifizierten Peptide, ergibt sich, dass ab einer Anzahl von 5 Peptiden eine Abdeckung der Bevölkerung von über 90 % gegebenen ist.

Tabelle 2: Theoretische Populationsabdeckung des erfindungsgemäßen Peptidgemisches mit steigender Anzahl an tatsächlich identifizierten MHC-Klassen-I-Epitopen, wenn die Erkennungsrate bei 100 % liegt. Berechnung nach Schipper et al. (1996); Allelfrequenzen der deutschen Bevölkerung aus

www.allelefrequencies.net. 2. Identifizierung von MHC-Klasse-I-Peptiden auf Prostatagewebe für die Herstellung eines Multi-Peptid-Impfstoffes gegen Prostatakrebs

[0046] Unter Verwendung der Massenspektrometrie gelang den Erfindern die Identifizierung einer Vielzahl von prostataassoziierten Peptiden aus Prostatanormalgewebe, Hyperplasien und Prostatatumoren. Zusätzlich wurde die Sequenz der natürlichen HLA-Liganden mit Hilfe synthetischer Peptide gleicher Sequenz bestätigt. Unter diesen HLA-präsentierten Peptiden befinden sich bekannte Differenzierungsantigene der Prostata, wie zum Beispiel PSA FOLHA 1 , KLK2, Proteine mit allgemeiner Krebsassoziation, wie zum Beispiel HDAC, IGF1 , CTNNB1 , sowie potenziell neue prostatakrebsassoziierte Proteine.

[0047] Die identifizierten Peptide werden dabei von verschiedenen HLA- Molekülen präsentiert, HLA-A1 , -A3, -A1 1 , -A68, HLA-B7, -B27, -B44, -B47, -B49, -B 51 , - B57. Die HLA-Restriktion der identifizierten Peptide zusammen mit HLA-A2 deckt mehr als 95 % der deutschen Bevölkerung ab.

[0048] Damit die aufgefundenen Peptide in einem Impfstoff wirksam eingesetzt werden können, müssen diese ihre Fähigkeit unter Beweis stellen, eine spezifische CD8⁺- T-Zellantwort auszulösen. Zu diesem Zweck wurden "/n-v/^'iro-Primings" mit naiven CD8⁺- T-Zellen, isoliert aus dem peripherem Blut gesunder Spender, durchgeführt.

[0049] In der Fig. 1 ist der Arbeitsablauf dargestellt, der zur Identifizierung der immonogenen HLA-Klasse-I-Liganden aus Prostatagewebe geführt hat.

[0050] In der Fig. 2 ist schematisch der Ablauf der MHC-Peptid-Immunpräzipi- tation dargestellt.

[0051] Die Peptide wurden synthetisiert, wie beschrieben in Meyer et. al.

(2009), Identification of natural MHC class II presented phosphopeptides and tumor- derived MHC class I phospholigands, J. Proteome Res. 8(7) Seiten 3666-3674. [0052] Für die Validierung der Peptide werden von jedem Kanditatenpeptid die entsprechenden synthetischen Peptide gleicher Sequenz hergestellt und erneut das Fragmentspektrum durch HPLC-MS/MS-Analyse aufgenommen.

[0053] Um zu belegen, dass es sich bei den identifizierten Peptiden tatsächlich um natürliche HLA-Liganden der Prostata handelt, muss das Fragmentspektrum des synthetischen Peptides mindestens zu 90 % identisch zu dem des natürlichen Peptides sein. Stimmen beide Fragmentspektren derart überein, ist das Kandidatenpeptid auf Sequenzebene verifiziert; vgl. Fig. 3.

[0054] Für den Einsatz der Peptide in der Immuntherapie ist es zuerst notwendig, deren Immunogenität experimentell zu belegen. Hierzu werden naive CD8⁺-T-Zellen aus dem peripheren Blut gesunder Spender isoliert und in vitro mit Peptiden stimuliert.

[0055] Die Stimulation der T-Zellen erfolgt hierbei nicht über peptidbeladene dendritische Zellen (DCs), sondern über artifizielle Polysterolkügelchen. Diese artifiziellen antigenpräsentierenden Zellen (aAPCs) werden mit Monomer-Peptidkomplexen und mit co-stimulierenden Antikörpern beladen, vgl. Fig. 4. Der Vorteil artifizieller antigenpräsen- tierender Zellen besteht in dem geringen Zeitaufwand der Produktion, der einfachen Lagerung und der guten Reproduzierbarkeit verglichen mit dendritischen Zellen. Jedes Kandidatenpeptid muss in ein passendes MHC-Monomer zurückgefaltet werden, bevor es auf die aAPCs mittels Streptavidin-Biotin-Bindung gekoppelt wird; vgl. Fig. 5.

[0056] Zusätzlich zu den Monomeren werden noch co-stimulierende Antikörper (aCD28-Antikörper) auf den aAPCs gebunden.

[0057] Sobald die Rückfaltung der Monomer-Peptid-Komplexe abgeschlossen ist, kann mit den Vorbereitungen für die Stimulation in vitro begonnen werden. Mittels des magnetischen aktivierten Zellsortierens (MACS-Technik) werden aus peripheren Mononuklearen Blutzellen (PBMCs) die CD8⁺-T-Zellen isoliert und unter Zugabe von Zytokinen über Nacht kultiviert. (IL-7: 10 μg pro Milliliter; IL-2: 10 U/ml). Am nächsten Tag werden die Zellen in einer Platte mit 96 Vertiefungen ausplattiert, über 3 Wochen insgesamt 3 mal mit Peptid beladenen aAPCs und IL-12 (IL-12: 25 ng pro Milliliter) stimuliert und zusätzlich unter Zugabe von IL-2 (IL-2: 40 U/ml) gefüttert. Die Auswertung der antigenspezifischen T-Zellen erfolgt über eine Tetramerfarbung mit anschließender Messung im Durchflusszy- tometer vgl. Fig. 6.

[0058] Für die Detektion peptidspezifischer T-Zellen werden die stimulierten Zellen mit fluoresenzmarkierten Tetrameren inkubiert, die entweder das getestete Peptid oder ein entsprechendes Kontrollpeptid tragen. Zusätzlich werden unstimulierte Zellen des gleichen Spenders für die Färbung frisch aufgetaut und als Kontrolle positiv-gefärbt.

[0059] Die Immunogenität eines Peptides gilt dann als erwiesen, wenn eine tet- ramerpositive Population >0,02 % detektierbar ist und gleichzeitig die Kontrollen keine bzw. eine sehr viel geringere tetramerpositive Population zeigen. Beispiele tetramerpositi- ver Populationen sind in der Fig. 7 zu sehen.

[0060] In der Fig. 7 ist eine FACS-Auswertung einer Stimulation in vitro von naiver CD8⁺-T-Zellen mit validierten prostataspezifischen Peptiden zu sehen. Auf der x- Achse zeigt der Graph die Intensität der Fluoressenz des Tetramers, auf der y-Achse die Fluoressenz für den Oberflächenmarker CD8. Für das Peptid 5 ist eine tetramerpositive Population zu erkennen (0,072 %), die auch für CD8 positiv ist. In der Negativkontrolle daneben wurden die Zellen auf gleiche Weise stimuliert aber mit einem unspezifischen Tetramer gefärbt. Die Negativkontrolle zeigt keine tetramerpositive Population. Für die Peptide 7 und 8 sind in der Negativkontrolle tetramerpositive Populationen zu erkennen. Allerdings ist die Größe der Population wesentlich geringer als in der korrespondierenden Färbung mit dem positiven Tetramer.

3. Identifizierte Peptide

Proteinidenti¬

SEQ

Sequenz fizierungsGensymbol Protein HLA-Allel

ID Nr. nummer

Prostataspezifische

AHDTTVSGL P 15309 ACPP B*39 1 saure Phosphatase Prostataspezifische

HDTTVSGL P 15309 ACPP B*37 2 saure Phosphatase

Prostataspezifische

LSLYGIHKQKE P 15309 ACPP n.a. 3 saure Phosphatase

Prostataspezifische

IDTFPTDPIKESSWPQG P 15309 ACPP Klasse II 4 saure Phosphatase

Adenosylmethioninde-

KPGKFVTTL P 17707 AMD1 B*07 5 carboxylase 1

Brust-Karzinom-

VYNENLVHml 075934 BCAS2 A*24 6 amplifizierte Sequenz 2

LQKMVALL P35222 CTNNB1 Catenin Beta-1 B*37 7

EYLEKIKQR Q 13547 HDAC1 Histondeacetylase 1 A*68 8

Q 13547 HDAC1 ;

EYSKQMQRF Histondeacetylase 1 ; 2 A*24 9

Q92769 HDAC2

Q 13547; HDAC1 ;

GEDPDKRISI Histondeacetylase 2 B*49 10

Q92769 HDAC2

Q 13547; HDAC1 ;

Histondeacetylase 1 ; 2;

TDRVMTVSF Q92769; HDAC2; B*47 1 1

3

015379 HDAC3

Hepatom-abgeleiteter

GEEKEAATL P51858 HDGF B*40 12

Wachstumsfaktor

Hypoxie-induzierbarer

KESEVFYEL Q61221 HIF1A B*37 13

Faktor 1 -alpha

Hypoxie-induzierbarer

YISDNVNKY Q61221 HIF1A B*15 14

Faktor 1 -alpha

Insulinähnlicher

ISSLPTQLFK P05019 IGF1 Wachstumsfaktor 1 A*1 1 15

(Somatomedin C)

Insulinähnlicher

KISSLPTQLFK P05019 IGF1 Wachstumsfaktor 1 A*03 16

(Somatomedin C)

Kallikrein-related

EPAKITDWK P20151 KLK2 A*68 17

Peptidase 2

Kallikrein-related

Ρ20 51 ;

GGVLVHPQW KLK2; KLK3 Peptidase 2; Kallikrein- B*57 18

P07288

related Peptidase 3

Kallikrein-related

HPEYNRPLL Q9Y5K2 KLK4 B*07 19

Peptidase 4

Kallikrein-related

SGVLVHPQW Q9Y5K2 KLK4 B*57 20

Peptidase 4

Myeloide Zellleukämie

VQRNHETAF Q07820 MCL1 Sequenz 1 (BCL2- B*15 21 related)

Myosin, schwere Kette

ERYFSGLIYT P35749 MYH1 1 (C) 22

1 1 , glatter Muskel

Myosin, schwere Kette

ESQRINANR P35749 MYH1 1 A*68 23

1 1 , glatter Muskel

Myosin, schwere Kette

ETSFVPSRR P35749 MYH1 1 A*68 24

1 1 , glatter Muskel

Myosin, schwere Kette

KHAQAVEEL P35749 MYH1 1 B*15 25

1 1 , glatter Muskel

Myosin, schwere Kette

KITDVImAF P35749 MYH1 1 A*32 26

1 1 , glatter Muskel

Myosin, schwere Kette

RPNNPPGVL P35749 MYH1 1 B*07 27

1 1 , glatter Muskel

Myosin, schwere Kette

SVLQLGNIVFK P35749 MYH1 1 A*1 1 28

1 1 , glatter Muskel

Myosin, schwere Kette

TEQGSHPKF P35749 MYH1 1 B*44 29

1 1 , glatter Muskel

Myosin, schwere Kette

Q4G140; MYH9; 1 1 , glatter Muskel;

ERTFHIFYY B*27 30

P35579 MYH1 1 Myosin, schwere Kette

9, Nicht-Muskel Myosin, schwere Kette

Q4G140; MYH9; 1 1 , glatter Muskel;

LQLGNIVFK A*03 31

P35579 MYH1 1 Myosin, schwere Kette

9, Nicht-Muskel

Myosin-Ieichte-Ketten-

DAFEEKANI Q 15746 MYLK B*51 32

Kinase

Myosin-Ieichte-Ketten-

EKANIVMVL Q 15746 MYLK B*39 33

Kinase

Myosin-Ieichte-Ketten-

EVINYEPIGY Q 15746 MYLK A*26 34

Kinase

Myosin-Ieichte-Ketten-

EWEGSAARF Q 15746 MYLK (A*68) 35

Kinase

Myosin-Ieichte-Ketten-

GTAPAFKQK Q 15746 MYLK A*1 1 36

Kinase

Myosin-Ieichte-Ketten-

GTQPWFISK Q 15746 MYLK A*1 1 37

Kinase

Myosin-Ieichte-Ketten-

RIIDEDFEL Q 15746 MYLK A*02 38

Kinase

Myosin-Ieichte-Ketten-

RPKSSLPPVL Q 15746 MYLK B*07 39

Kinase

Myosin-Ieichte-Ketten-

SENGSKLTI Q 15746 MYLK B*44 40

Kinase

Myosin-Ieichte-Ketten-

SPQQVDFRSVL Q 15746 MYLK B*07 41

Kinase

Neurofilament, schweres

DAKAPEKEI P 12036 NEFH B*51 42

Polypeptid

Neurofilament, schweres

EEKPQEVKV P 12036 NEFH B*44 43

Polypeptid

Neurofilament, schweres

GSSSGFHSW P 12036 NEFH B*57 44

Polypeptid

Neurofilament, schweres

GYIDKVRQL P 12036 NEFH C*? 45

Polypeptid

Neurofilament, schweres

QEAEAARVDL P 12036 NEFH B*40 46

Polypeptid

Neurofilament, schweres

SPEKAKSPL P 12036 NEFH n.a. 47

Polypeptid

Neurofilament, schweres

YIDKVRQL P 12036 NEFH C*04 48

Polypeptid

AAFSHTQVI Q99801 NKX3.1 NK3-Homöobox 1 n.a. 49

AETEPERHL Q99801 NKX3.1 NK3-Homöobox 1 B*40 50

FSHTQVIEL Q99801 NKX3.1 NK3-Homöobox 1 B*07 51

PRKC, Apoptose, WT1 ,

DAITQQNTI Q96IZ0 PAWR B*51 52

Regulator

DADGHFHLI 095394 PGM3 Phosphoglucomutase 3 B*51 53

AGGIGERPQPGF 095394 PGM3 Phosphoglucomutase 3 class II 54

SWI/SNF related,

Matrix-assoziierter,

P51532; SMARCA4; Actin-abhängiger

KELPEYYEL B*40 55

Q56A76 SMARCA2 Regulator von Chromatin, Subfamilie A, Mitglied 4; 2

Transienter Rezeptorpo¬

IMLQRMLI Q7Z2W7 TRPM8 tential-Kationenkanal, n.a. 56

Subfamilie M, Mitglied 8

Saure Phosphatase,

LSGLHGQDL P 15309 ACPP A*36/B*07 57

Prostata

Saure Phosphatase,

QHEPYPLML P 15309 ACPP B*39 58

Prostata Baculovirale ΙΑΡ repeat

ELTLGEFLKL 015392 BIRC5 A*02 59 containing 5

Baculovirale ΙΑΡ repeat

TLPPAWQPFL 015392 BIRC5 A*02 60 containing 5

Folathydrolase

ALFDIESKV Q04609 F0LH1 (Prostataspezifisches A*02 61

Membran-Antigen) 1

Folathydrolase

NYTLRVDCTPLMYSL Q04609 F0LH1 (Prostataspezifisches class II 62

Membran-Antigen) 1

Folathydrolase

KYADKIYSI Q04609 F0LH1 (Prostataspezifisches A*24 63

Membran-Antigen) 1

Folathydrolase

YFAPGVKSY Q04609 F0LH1 (Prostataspezifisches (A*01 ) 64

Membran-Antigen) 1

Q 13547; HDAC1 ;

YTTDRVMTV Histondeacetylase 1 ; 2 A*02 65

Q92769 HDAC2

Q 13547; HDAC1 ;

RmLPHAPGV Histondeacetylase 1 ; 2 A*02 66

Q92769 HDAC2

Hepatom-abgeleiteter

APGIRDHESL P51858 HDGF B*07 67

Wachstumsfaktor

GQRVPVSHSF P20151 KLK2 Kalikrein 2 B*15 68

QRVPVSHSF P20151 KLK2 Kalikrein 2 B*39 69

SQPWQVAVY P20151 KLK2 Kalikrein 2 B*15 70

AVYTKVVHY P20151 KLK2 Kalikrein 2 B*15 71

VPLIQSRI P20151 KLK2 Kalikrein 2 B*51 72

Prostatespezifisches

GQVFQVSHSF P07288 KLK3 B*15 73

Antigen

Prostatespezifisches

EEFLTPKKL P07288 KLK3 B*44 74

Antigen

Prostatespezifisches

QVFQVSHSF P07288 KLK3 A*32 75

Antigen

Prostatespezifisches

IRNKSVILL P07288 KLK3 (C*6) 76

Antigen

Prostatespezifisches

FLTPKKLQCV P07288 KLK3 A*02 77

Antigen Prostatespezifisches

KLQCVDLHV P07288 KLK3 A*02 78

Antigen

Myeloide

RPPPIGAEV Q07820 MCL1 Zellleukämiesequenz 1 B*07 79

(BCL2-related)

Prostata-

AI LALL PAL 043653 PSCA A*02 80

Stammzellantigen

SPYQNIKIL P52788 SMS Sperminsynthase B*07 81

RVPGVAPTL P 19544 WT1 Wilms-Tumor 1 B*07 82

Insulinähnlicher

SSLPTQLFK P05019 IGF1 Wachstumsfaktor 1 A*1 1 83

(Somatomedin C)

Kallikrein-related

SESDTIRSI Q9Y5K2 KLK4 B*49 84

Peptidase 4

Myosin, schwere Kette

YSEKIVDMY P35749 MYH1 1 A*01 85

1 1 , glatter Muskel

AQNAVRLHY P35222 CTNB1 Catenin Beta-1 B*15 86

Transienter Rezeptorpo¬

GLMKYIGEV Q7Z2W7 TRPM8 tential Kationenkanal, A*02 87

Subfamilie M, Mitglied 8

Solute Carrier, Familie

CLAAGITYV Q96JT2 SLC45A3 A*02 88

45, Mitglied 3

Baculovirale IAP repeat

TLGEFLKLDRERAKN 015392 BIRC5 Klasse II 89 containing 5

Tabelle 3: Erfindungsgemäß identifizierte HLA-Liganden

4. Immunogenitätstests

[0061] Im Rahmen des DKTK geförderten MultiPro Projekts wurden die

Peptidsequenzen an verschiedenen Standorten (LMU München, TU München, TU Dresden, Heidelberg, Tübingen) auf ihre Immunogenitat getestet. Am Standort Tübingen wurden ausschließlich in vitro Stimulationen naiver CD8⁺ T-Zellen über peptidbeladene aAPCs (aritificial antigen presenting cells) bzw. autologe dendritische Zellen (DC) durchgeführt. Die Ergebnisse der Immunogenitatsassays der verschiedenen Partnerstandorte sind in Tabelle 4 abgebildet. Positive Spender/Getestete Spender

HLA-Typ SEQ Peptid- GenTübinHeidelLMU TU Dresden Summe

ID sequenz symbol gen berg München München

Nr. Beckhove Subklewe Krackhardt

A*01 85 YSEKIVDMY MYH11 0/3 1/2 1/5

A*01 64 YFAPGVKSY FOLH1 0/2 0/2

A*02 66 RmLPHAPGV HDAC 17/27 1/2 0/4 2/3 20/36

A*02 65 YTTDRVMTV HDAC 1/7 1/7

A*03 16 KISSLPTQLFK IGF1 3/5 0/4 3/9

A*03 31 LQLGNIVFK MYH11/9 2/4 0/4 2/8

A*11 28 SVLQLGNIVFK MYH11 1/7 1/7

A*1 1 83 SSLPTQLFK IGF1 0/8 0/8

A*11 37 GTQPWFISK MYLK 5/5 5/5

A*24 63 KYADKIYSI FOLH1 0/7 0/2 0/9

A*24 9 EYSKQMQRF HDAC1 3/6 3/5 0/2 6/13

A*24 6 VYNENLVHML BCAS 4/5 0/2 4/7

A*36 54 LSGLHGQDL ACPP 1/1 1/1

A*36 81 SPYQNIKIL SMS 0/1 0/1

A*68 24 ETSFVPSRR MYH11 1/2 1/2

B*07 41 SPQQVDFRSVL MYLK 0/6 1/3 1/9

B*07 51 FSHTQVIEL NKX3-1 0/6 0/3 0/9

B*07 27 RPNNPPGVL MYH1 1 0/6 0/3 0/9

B*07 39 RPKSSLPPVL MYLK 0/6 1/3 1/9

B*07 5 KPGKFVTTL AMD1 0/5 0/3 0/8

B*07 67 APGIRDHESL HDGF 1/7 1/6 1/3 3/16

B*07 45 GYIDKVRQL NEFH 0/6 1/3 1/9

B*07 79 RPPPIGAEV MCL1 0/5 0/3 0/8

B*07 19 HPEYNRPLL KLK4 2/7 1/5 2/3 5/15

B*07 82 RVPGVAPTL WT1 0/6 0/3 0/9

B*07/ A*36? 57 LSGLHGQDL ACPP 0/3 1/1 1/4

B*07 81 SPYQNIKIL SMS 0/3 0/1 0/4

B*07 90 RPKLSSPAL EP300 2/6 2/6

B*15 86 AQNAVRLHY CTNNB1 1/3 1/3

B*15 14 YISDNVNKY HIF1A 0/3 0/3

B*15 68 GQRVPVSHSF KLK2 1/1 2/3 3/4

B*15 70 SQPWQVAVY KLK2 0/1 1/3 1/4

B*15 71 AVYTKWHY KLK2 1/1 0/1 1/2

B*15 73 GQVFQVSHSF KLK3 1/1 1/1

B*15 25 KHAQAVEEL MYH1 1/1 1/1

B*15 21 VQRNHETAF MCL1 1/1 1/1

B*15 73 GQVFQVSHSF KLK3 1/1 1/1 2/2

B*18 91 DEKALAQAL CTBP1 0/1 0/1

B*40 12 GEEKEAATL HDGF 1/2 1/2

B*40 55 KELPEYYEL SMARCA 2/2 2/2

B*40 50 AETEPERHL NKX3-1 0/1 0/1

B*44 74 EEFLTPKKL KLK3 0/3 1/4 1/4

B*44 40 SENGSLKTI MYLK 0/3 0/1 0/1

B*44 43 EEKPQEVKV NEFH 0/3 0/1 0/1

B*51 53 DADGHFHLI PGM3 0/2 1/4 1/6

B*51 72 VPLIQSRI KLK2 0/2 1/4 1/6

B*51 32 DAFEEKANI MYLK 0/2 0/2 0/4

B*51 42 DAKAPEKEI NEFH 0/3 1/2 1/5

B*51 52 DAITQQNTI PAWR 0/2 1/2 1/4

Tabelle 4: Ubersicht über das Ergebnis der Immunogenitätstests (positiv/getestet)

[0062] Die in den hinteren Spalten zuerst genannte Zahl bezeichnet die Anzahl der positiven Immunreaktionen, die zuletzt genannte Zahl bezeichnet die Anzahl der insgesamt getesteten Spender. 1/5 bedeutet, es wurden 5 Spender getestet und in einem Spender war die Reaktion auf dieses Peptid positiv. Sobald zumindest eine positive Reaktion ermittelt wurde, liegt die Bestätigung für ein immunogenes Peptid vor.

Entsprechende Peptide sind fett gedruckt.

[0063] Dabei zeigte sich, dass von den 49 getesteten Peptiden zumindest 33 positiv waren, also in zumindest einem Spender eine positive Immunantwort auslösten.

5. Fazit

[0064] Die Erfinder stellen Peptide bereit, mit denen unter einem Prostatakarzinom leidende Individuen durch eine Stimulation der zellulären Immunantwort behandelt werden können. In diesen Patienten kann dadurch einem Rezidiv vorgebeugt werden. Die Peptide können vorzugsweise in einem Impfstoff eingesetzt werden.

Claims

Patentansprüche

1 . Pharmazeutische Zusammensetzung zur Immuntherapie von Prostatakrebs, die zumindest fünf verschiedene Peptide mit jeweils unterschiedlichen Aminosäuresequenzen aufweist, wobei die Aminosäuresequenzen jeweils ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID Nr. 1 bis 91 .

2. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 , die zumindest sechs, vorzugsweise zumindest sieben, weiter bevorzugt zumindest acht, weiter bevorzugt zumindest neun, und höchst bevorzugt zumindest zehn verschiedene Peptide aufweist.

3. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, die zumindest zwei verschiedene Peptide pro Allel aufweist.

4. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenzen jeweils ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID Nr. 1 bis 56.

5. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Immuntherapie im Rahmen einer postoperativen Behandlung von Prostatakrebs erfolgt.

6. Verwendung von zumindest fünf verschiedenen Peptiden mit jeweils unterschiedlichen Aminosäuresequenzen zur Immuntherapie von Prostatakrebs, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenzen jeweils ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID Nr. 1 bis 91 .

7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest sechs, vorzugsweise zumindest sieben, weiter bevorzugt zumindest acht, weiter bevor- zugt zumindest neun, und höchst bevorzugt zumindest zehn verschiedene Peptide verwendet werden.

8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest zwei verschiedene Peptide pro Allel verwendet werden.

9. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenzen jeweils ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID Nr. 1 bis 56.

10. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Immuntherapie im Rahmen einer postoperativen Behandlung von Prostatakrebs erfolgt.

1 1 . Peptid zur Immuntherapie von Prostatakrebs, das eine Aminosäuresequenz

aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID Nr. 1 bis 91 .

12. Peptid zur Immuntherapie von Prostatakrebs, das eine Aminosäuresequenz

13. Verfahren zur immuntherapeutischen Behandlung von Prostatakrebs, das folgende Schritte ausweist:

1 ) Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung,

2) Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung in einen bedürftigen Patienten, und

3) Ggf. Wiederholung der Schritte 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um die pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 handelt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem bedürftigen Patienten um einen solchen handelt, der einer Prostatektomie, vorzugsweise einer radikalen Prostatektomie ( PE) unterzogen wurde.

15. Verfahren zur immuntherapeutischen Behandlung von Prostatakrebs, das folgende Schritte aufweist:

1 ) Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung,

2) Inkubation von Immunzellen, vorzugsweise T-Zellen, weiter bevorzugt CD8⁺-T- Zellen, mit der pharmazeutischen Zusammensetzung,

3) Verabreichung der Immunzellen aus Schritt 2 in einen bedürftigen Patienten und

4) Ggfs. Wiederholung der Schritte 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der pharmazeutischen Zusammensetzung um die pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 handelt.