EA046410B1 - Иммуногенетическая скрининговая проба на рак - Google Patents

Иммуногенетическая скрининговая проба на рак Download PDF

Info

Publication number
EA046410B1
EA046410B1 EA202190671 EA046410B1 EA 046410 B1 EA046410 B1 EA 046410B1 EA 202190671 EA202190671 EA 202190671 EA 046410 B1 EA046410 B1 EA 046410B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cancer
subject
hla
taa
risk
Prior art date
Application number
EA202190671
Other languages
English (en)
Inventor
Юлианна Лисёиц
Левенте Мольнар
Энико Токе
Йожеф ТОТ
Оршойа Лоринц
Жольт Чисовски
Эстер Шомодьи
Каталин Пантья
Петер Палеш
Иштван Миклош
Моника Медьеши
Original Assignee
Треош Био Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Треош Био Лимитед filed Critical Треош Био Лимитед
Publication of EA046410B1 publication Critical patent/EA046410B1/ru

Links

Description

Область техники
В настоящем документе представлены способы определения риска развития рака у субъекта на основе его генотипа HLA класса I. Кроме того, в настоящем документе представлены способы лечения рака, в частности профилактические меры для субъектов, у которых определен повышенный риск развития рака.
Уровень техники
Скрининг, при наличии возможности, и ранняя диагностика особенно важны для предотвращения метастазов и улучшения прогноза многих видов рака.
Наследственные мутации могут увеличить риск развития рака, но известные генетические факторы не полностью учитывают генетический вклад в риск развития рака. Например, мутации BRCA1, BRCA2 были выявлены в 5% случаев рака молочной железы в общей популяции, но почти в 50% этих случаев развился рак молочной железы. За последнее десятилетие усилия по объяснению отсутствующей наследственности развивающегося рака были сосредоточены на обнаружении генов высокого риска и идентификации общих генетических вариантов.
Тем не менее, в данной области по-прежнему существует потребность в лучшей идентификации людей, имеющих повышенный генетический риск развития рака.
Сущность изобретения
В настоящем документе представлены способы, относящиеся к генотипу класса I лейкоцитарного антигена (HLA, human leukocyte antigen) субъекта-человека в качестве предиктора развития рака.
В антиген-презентирующих клетках (АРС, antigen presenting cells) белковые антигены, включая антигены, ассоциированные с опухолью (ТАА, tumour associated antigens), процессируются в пептиды. Эти пептиды связываются с молекулами HLA и презентируются на поверхности клетки в виде комплексов пептид-HLA с Т-клетками. Разные люди экспрессируют разные молекулы HLA, а разные молекулы HLA презентируют разные пептиды. Эпитоп ТАА, который связывается с одним аллелем HLA класса I, экспрессируемым у субъекта, необходим, но недостаточен для стимулирования опухолеспецифических Тклеточных ответов. Вместо этого опухолеспецифические Т-клеточные ответы оптимально активируются, когда эпитоп ТАА распознается и презентируется молекулами HLA, кодируемыми по меньшей мере тремя генами HLA класса I (называемыми в настоящем документе триплетом HLA или HLAT) индивидуума (РСТ/ЕР 2018/055231, РСТ/ЕР 2018/055232, РСТ/ЕР 2018/055230, ЕР 3370065 и ЕР 3369431).
Авторы изобретения разработали бинарный классификатор, который может отделить субъектов, больных раком, от фоновой популяции. Используя этот классификатор, изобретатели смогли продемонстрировать четкую связь между генотипом HLA и риском рака. Эти результаты подтверждают центральную роль опухолеспецифических Т-клеточных ответов в регулировании роста опухоли, и означают, что анализ генотипа HLA может использоваться для улучшения диагностических тестов для ранней идентификации субъектов с высоким риском развития рака.
Соответственно, в первом аспекте в изобретении предложен способ определения риска развития рака у субъекта-человека, причем способ включает в себя количественное определение триплетов HLA (HLAT) субъекта, способных связываться с Т-клеточными эпитопами в аминокислотной последовательности ассоциированных с опухолью антигенов (ТАА, tumor associated antigen), причем каждый HLA из HLAT способен связываться с тем же Т-клеточным эпитопом, и определение риска развития рака у субъекта, при этом по сравнению с ТАА меньшее количество HLAT, способных связываться с Т-клеточными эпитопами ТАА, соответствуют более высокому риску развития рака у субъекта. Результаты, описанные в настоящем документе, также предполагают, что риск рака может быть снижен с помощью вакцины, которая персонализирована для эффективной активации иммунной системы субъекта с уничтожением опухолевых клеток.
Соответственно, в дополнительном аспекте изобретение обеспечивает способ лечения рака у субъекта, причем у субъекта был определен повышенный риск развития рака с использованием указанного выше способа, и при этом способ лечения включает введение субъекту одного или более пептидов или одной или более полинуклеиновых кислот или векторов, кодирующих один или более пептидов, содержащих аминокислотную последовательность, которая (i) представляет собой фрагмент ТАА и (ii) содержит Т-клеточный эпитоп, способный связываться с HLAT субъекта. В дополнительных аспектах изобретение обеспечивает пептид или полинуклеиновые кислоты, или векторы, кодирующие пептид, для использования в способе лечения рака у конкретного субъекта-человека, при этом пептиды содержат аминокислотную последовательность, которая (i) представляет собой фрагмент ТАА и (ii) содержит Тклеточный эпитоп, способный связываться с HLAT субъекта; и пептид, или полинуклеиновые кислоты, или векторы, кодирующие пептид, используемые при получении лекарственного средства для лечения рака у конкретного субъекта-человека, при этом пептиды содержат аминокислотную последовательность, которая (i) представляет собой фрагмент ТАА и (ii) содержит Т-клеточный эпитоп, способный связываться с HLAT субъекта.
В дополнительном аспекте изобретение обеспечивает систему для определения риска развития рака у человека, содержащую:
(i) модуль хранения, выполненный с возможностью хранения данных, содержащих генотип HLA
- 1 046410 класса I субъекта и аминокислотные последовательности ТАА;
(ii) вычислительный модуль, выполненный с возможностью количественной оценки HLAT субъекта, способных связываться с Т-клеточными эпитопами в аминокислотной последовательности ТАА, причем каждый HLA из HLAT способен связываться с тем же Т-клеточным эпитопом; и (iii) модуль вывода, выполненный с возможностью отображения показателей риска того, что у субъекта разовьется рак, и/или рекомендованное лечение для субъекта.
Далее способы и композиции по настоящему изобретению будут описаны более подробно, в качестве примера, а не ограничения, и со ссылкой на прилагаемые графические материалы.
Многие эквивалентные модификации и варианты будут очевидны для специалистов в данной области техники после ознакомления с настоящим изобретением. Соответственно, иллюстративные варианты реализации описанного изобретения считаются иллюстративными, а не ограничивающими. В описанные варианты реализации могут быть внесены различные изменения, не выходящие за рамки объема изобретения. Все документы, цитируемые в данном документе, выше или ниже, непосредственно включены посредством ссылки в полном объеме.
Настоящее изобретение включает в себя комбинацию описанных аспектов и предпочтительных особенностей, за исключением случаев, когда такая комбинация явно недопустима, или указано, что ее явно следует избегать. Используемые в данном описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если содержание явно не указывает иное. Таким образом, например, ссылка на пептид включает два или более таких пептида.
Заголовки разделов используются в настоящем документе только для удобства, и никоим образом не должны рассматриваться как ограничивающие.
Описание графических материалов
Фиг. 1: ROC-кривая (зависимость количества верно классифицированных положительных объектов от количества неверно классифицированных отрицательных объектов) для HLA-ограниченных биомаркеров PEPI.
Фиг. 2: ROC-кривая для теста > 1 PEPI3+ для определения диагностической точности. AUC (Area Under Curve, площадь под кривой, описывающей зависимость концентрация/время) = 0,73 классифицирует справедливое диагностическое значение биомаркера PEPI.
Фиг. 3: Средняя величина общего показателя HLAT 48 TSA (tumor specific antigen, опухолеспецифический антиген) в различных этнических популяциях. Этнические группы на Дальнем Востоке и Азии и в Тихоокеанском регионе явно имеют более высокие показатели HLAT, чем остальная часть мира. Этнические группы, которые могут быть связаны со странами, выделены черным. Кодировка по оси у: 1: Ирландцы, 2: Североамериканцы (Eu), 3: Чехи, 4: Финны, 5: Грузины, 6: Мексиканцы, 7: Угандийцы, 8: Североамериканцы (Hi), 9: Нью Дели, 10: Курды, 11: Болгары, 12: Бразильцы (Af, Eu), 13: Арабские друзы, 14: Североамериканцы (Af), 15: Тамилы, 16: Американские индейцы, 17: Замбийцы, 18: Кенийцы, 19: Тувинцы, 20: Гуарани-Нандева, 21: Жители низин Кении, 22: Шона, 23: Гуарани-Кайова, 24: Зулу, 25: Догоны, 26: Сайсиаты, 27: Израильские евреи, 28: Канончито, 29: Североамериканцы (As), 30: Корейцы, 31: Население Грут Эйландт, 32: Тороко, 33: Сирая, 34: Народность Кейп-Йорк, 35: Жители Окинавы, 36: Бари, 37: Жители высокогорья Кении, 38: Хакка, 39: Народ атаял, 40: Китайцы, 41: Филиппинцы, 42: Народ миньнань, 43: Юпик, 44: Жители Кимберли, 45: Индонезийцы о. Ява, 46: Народ Иватан, 47: Тайцы, 48: Малайцы, 49: Цзоу, 50: Ами, 51: Бунун, 52: Юэндуму, 53: Пазех, 54: Тао, 55: Американский Самоа, 56: Рукаи, 57: Пайвань, 58: Пуюма, 59: Ями
Фиг. 4: Уровень заболеваемости в странах с низким показателем HLAT (s<75) и высоким показателем HLAT (s>75). Средние значения обозначены горизонтальной черной полосой. Стандартные ошибки обозначены вертикальными полосами. Разница между показателями заболеваемости очень значительна (р<0,0001).
Фиг. 5: ROC-кривая иммунологического предиктора (показатель HLAT), классифицирующая пациентов с меланомой по сравнению с общей популяцией. AUC=0,645; сплошная черная линия - ROCкривая, линия х=у обозначена серым пунктиром для сравнения.
Фиг. 6: Относительный иммунологический риск развития меланомы у пяти одинаково больших субпопуляций. Диапазоны показателя HLAT, определяющие субпопуляции, представлены на горизонтальной оси. Черные полосы указывают 95% доверительный интервал. Разница между первой и последней подгруппами значительна (р=0,001).
Фиг. 7: Относительный иммунологический риск развития рака у пяти одинаково больших субпопуляций. Диапазоны показателя HLAT, определяющие субпопуляции, представлены на горизонтальной оси. Черные полосы указывают 95% доверительный интервал. А. Немелкоклеточный рак легких; В. Почечно-клеточная карцинома; С. Колоректальный рак.
Фиг. 8: Относительный риск (RR) развития меланомы у пяти подгрупп одинакового размера.
Диапазоны показателя (показателей) HLA, определяющие подгруппы, показаны на оси х.
Черные полосы указывают 95% доверительный интервал. Разница между первой и последней подгруппами значительна (р<0,05).
- 2 046410
Фиг. 9: Положительная корреляция между количеством антигенов (n=7), приводящим к вакциноспецифическим Т-клеточным ответам (у 10 пациентов), и показателем HLAT, вычисленным для панели из 48 TSA.
Фиг. 10: Средний показатель HLA в 59 разных странах и этнических популяциях. Этнические группы, которые могут быть связаны со странами как доминирующая этническая принадлежность страны, выделены черным цветом. На оси у закодированы этнические группы: 1: Ирландцы; 2: Североамериканцы (Eu); 3: Чехи; 4: Финны; 5: Бразильцы (Af, Eu); 6: Грузины; 7: Арабские друзы; 8: Гуарани-Кайова; 9: Угандийцы; 10: Североамериканцы (Hi); 11: Нью Дели; 12: Болгары; 13: Североамериканцы (Af); 14: Гуарани-Нандева; 15: Курды; 16: Израильские евреи; 17: Мексиканцы; 18: Тамилы; 19: Кенийцы; 20: Жители низин Кении; 21: Замбийцы; 22: Догоны; 23: Американские индейцы; 24: Шона; 25: Жители высокогорья Кении; 26: Зулу; 27: Канончито; 28: Тувинцы; 29: Сайсиаты; 30: Индонезийцы о. Ява; 31: Филиппинцы; 32: Североамериканцы (As); 33: Народность Кейп-Йорк; 34: Малайцы; 35: Корейцы; 36: Тайцы; 37: Хакка; 38: Жители Окинавы; 39: Китайцы; 40: Население Грут Эйландт; 41: Народ миньнань; 42: Народ Иватан; 43: Бари; 44: Жители Кимберли (Австралия); 45: Тороко; 46: Юэндуму; 47: Народ атаял; 48: Сирая; 49: Американский Самоа; 50: Юпик; 51: Пазех; 52: Бунун; 53: Ями; 54: Цзоу; 55: Ами; 56: Тао; 57: Рукаи; 58: Пайвань; 59: Пуюма. Здесь Eu означает европейский, не испаноязычный, Hs означает латиноамериканский, Af означает африканский, a As означает азиатский.
Фиг. 11: Корреляция между заболеваемостью меланомой и средними показателями HLA среди этнических популяций. Корреляция значима (р < 0,001, преобразованный t-показатель составляет 4,25, df=18). ASRW: стандартизованный по возрасту показатель в мировом стандартном населении.
Фиг. 12: Единичный аллель HLA или неполный генотип HLA имеет ограничение в отношении разделения на основе генотипов популяции UNPC от популяции не-UNPC. A*02:0I/B*I8:0I AUC=0,556 (не значимо).
Фиг. 13: Схема испытания OBERTO (NCT 03391232)
Фиг. 14: Экспрессия антигена в когорте CRC исследования OBERTO (n=10). А: Частоты экспрессии исходных антигенов PolyPEPI1018, определенные на основе 2391 биопсии. В: Образец вакцины PolyPEPI1018, определенный как 3 из 7 TSA, экспрессируется в опухолях CRC с вероятностью более 95%. С: В среднем у 4 из 10 пациентов был ранее существовавший иммунный ответ против каждого целевого антигена, что указывает на реальную экспрессию TSA в опухолях пациентов. D: 7 из 10 пациентов имели ранее существовавший иммунный ответ против минимум 1 TSA, в среднем против 3 различных TSA.
Фиг. 15: Иммуногенность PolyPEPI1018 у пациентов с CRC подтверждает правильный выбор целевого антигена и целевого пептида. Верхняя часть: выбор целевого пептида и образца пептида композиции вакцины PolyPEPI1018. Два 15-мера из CRC-специфического СТА (TSA), выбранные для включения 9-мерного PEPI3+, преобладающего в репрезентативной модельной популяции. Таблица: Вакцина PolyPEPI1018 была ретроспективно протестирована в ходе доклинического исследования в когорте CRC и подтвердила свою иммуногенность у всех испытуемых по меньшей мере в отношении одного антигена за счет образования PEPI3+. Клинические иммунные ответы были измерены специфически по меньшей мере для одного антигена у 90% пациентов, и мультиантигенные иммунные ответы были также обнаружены у 90% пациентов по меньшей мере против 2 и у 80% пациентов по меньшей мере против 3 антигенов при тестировании методом анализа в присутствии fluorospot на fFNy (интерферон гамма), со специфическим измерением для пептидов, содержащихся в вакцине.
Фиг. 16: Клинический ответ на терапию PolyPEPI1018. А: Диаграмма в виде дорожек бассейна для клинических ответов испытания OBERTO (NCT03391232). В: Сопоставление выживаемости без прогрессирования заболевания (PFS, progression free survival) и количества AGP. С: Сопоставление объема опухоли и количества AGP.
Фиг. 17: Вероятность экспрессии вакцинного антигена в опухолевых клетках пациента А. Вероятность того, что 5 из 13 целевых антигенов в схеме вакцинации экспрессируются в опухоли пациента, превышает 95%. Следовательно, 13 пептидных вакцин совместно могут вызывать иммунные ответы против по меньшей мере 5 антигенов рака яичников с вероятностью 95% (AGP95). Вероятность того, что каждый пептид будет стимулировать иммунный ответ у пациента А, составляет 84%. AGP50 - это среднее значение (ожидаемое значение)=7,9 (это показатель эффективности вакцины в борьбе с опухолью пациента А).
Фиг. 18: Схема лечения пациента А.
Фиг. 19: Т-клеточные ответы пациента А. А. Слева: Т-клеточные ответы, специфические для вакцинных пептидов (20-меры). Справа: Ответы цитотоксических CD8+ Т-клеток (9-меры).
Прогнозируемые Т-клеточные ответы подтверждаются биологическим анализом.
Фиг. 20: Результаты MPT (MRI, Magnetic Resonance Imaging, магниторезонансная томография) пациента А, получавшего персонализированную вакцину (PIT). Пациентка с раком яичников на поздней стадии, ранее проходившая терапию, имела неожиданный объективный ответ после лечения вакциной PIT. Эти результаты МРТ предполагают, что вакцина PIT в сочетании с химиотерапией значительно
- 3 046410 уменьшила ее опухолевую нагрузку.
Фиг. 21: Вероятность экспрессии вакцинного антигена в опухолевых клетках пациента В и схема лечения пациента В. А: Вероятность того, что 4 из 13 целевых антигенов при вакцинации экспрессируются в опухоли пациента, превышает 95%. В: Следовательно, 12 пептидных вакцин совместно могут вызывать иммунные ответы против по меньшей мере 4 антигенов рака молочной железы с вероятностью 95% (AGP95). Вероятность того, что каждый пептид будет стимулировать иммунный ответ у пациента В, составляет 84%. AGP50=6,45; это показатель эффективности вакцины в борьбе с опухолью пациента В. С: Схема лечения пациента В.
Фиг. 22: Т-клеточные ответы пациента А. Слева: Т-клеточные ответы, специфические для вакцинных пептидов (20-меры) пациента. Справа: Кинетика ответов вакцино-специфических цитотоксических CD8+ Т-клеток (9-меров). Прогнозируемые Т-клеточные ответы подтверждаются биологическим анализом.
Фиг. 23: Схема лечения пациента С.
Фиг. 24: Т-клеточные ответы пациента С. А: Т-клеточные ответы, специфические для вакцинных пептидов (20-меры). В: CD8+ Т-клеточные ответы, специфические для вакцинных пептидов (9-меры). CD: Кинетика вакцино-специфических CD4+ Т-клеточных и цитотоксических CD8+ Т-клеточных ответов (9-меры), соответственно. Продолжительный иммунный ответ, специфический как для CD4, так и CD8 Т-клеток, проявляется через 14 месяцев.
Фиг. 25: Схема лечения пациента D.
Фиг. 26: Иммунные ответы пациента D на терапию PIT. А: Ответы, специфические для CD4+ Тклеток, (20-мер) и В: ответы Т-клеток, специфические для CD8+ Т-клеток (9-мер). 0,5-4 месяца относятся к периоду времени после последней вакцинации до сбора образцов РВМС (peripheral blood mononuclear cells, мононуклеарные клетки периферической крови).
Описание последовательностей
Последовательности SEQ ID NO: 1-13 представляют последовательности персонализированной вакцины пациента А и описаны в табл. 23.
Последовательности SEQ ID NO: 14-25 представляют последовательности персонализированной вакцины пациента В и описаны в табл. 25.
Последовательность SEQ ID NO: 26 представляет пептид CRC_P3 из 30 аминокислот, фиг. 15.
Раскрытие сущности изобретения
Генотипы HLA
HLA кодируются наиболее полиморфными генами генома человека. У каждого человека имеется материнский и отцовский аллели для трех молекул HLA класса I (HLA-A*, HLA-B*, HLA-C*) и четырех молекул HLA класса II (HLA-DP*, HLA-DQ*, HLA -DRB1*, HLA-DRB3*/4*/5*). Фактически, каждый человек экспрессирует различную комбинацию 6 молекул HLA класса I и 8 молекул HLA класса II, которые презентируют разные эпитопы того же белкового антигена.
Для обозначения аминокислотной последовательности молекулы HLA используется следующая номенклатура: название гена*номер аллеля:белка, который, например, может выглядеть так: HLAA*02:25. В этом примере 02 относится к аллелю. В большинстве случаев аллели определяются серотипами - это означает, что белки данного аллеля не будут реагировать друг с другом в серологических анализах. Номера белков (25 в приведенном выше примере) присваиваются последовательно по мере обнаружения белка. Новый номер белка присваивается любому белку с другой аминокислотной последовательностью, определяющей специфичность связывания с чужеродными антигенными пептидами (например, даже изменение одной аминокислоты в последовательности считается другим номером белка). Дополнительная информация о последовательности нуклеиновой кислоты данного локуса может быть добавлена к номенклатуре HLA, но такая информация не требуется для описанных в настоящем документе способов.
Генотип HLA класса I или генотип HLA класса II индивидуума может относиться к фактической аминокислотной последовательности каждого HLA класса I или класса II индивидуума, или может относиться к номенклатуре, как описано выше, которая обозначает, как минимум, номер аллеля и белка каждого гена HLA. В некоторых вариантах реализации генотип HLA индивидуума получают или определяют путем анализа биологического образца от индивидуума. Биологический образец обычно содержит исследуемую ДНК.
Биологический образец может представлять собой, например, образец крови, сыворотки, плазмы, слюны, мочи, выдоха, клеток или ткани. В некоторых вариантах реализации биологический образец представляет собой образец слюны. В некоторых вариантах реализации биологический образец представляет собой образец буккального мазка. Генотип HLA можно получить или определить с помощью любого подходящего способа. Например, последовательность может быть определена путем секвенирования локусов гена HLA с использованием способов и протоколов, известных в данной области. В некоторых вариантах реализации генотип HLA определяют с использованием способов, специфических для последовательности праймеров (SSP, sequence specific primer). В некоторых вариантах реализации генотип HLA определяют с использованием способов, специфических для последовательности олигонуклео
- 4 046410 тидов (SSO, sequence specific oligonucleotide). В некоторых вариантах реализации генотип HLA определяют с использованием способов типирования на основе последовательности (SBT, sequence based typing). В некоторых вариантах реализации генотип HLA определяют с использованием секвенирования следующего поколения. В качестве альтернативы, набор HLA индивидуума может храниться в базе данных, и к нему можно получить доступ с помощью способов, известных в данной области. Связывание HLA-эпитопа
Данный HLA субъекта будет презентировать Т-клеткам только ограниченное количество различных пептидов, продуцируемых за счет процессинга белковых антигенов в АРС. В контексте данного описания термины отображать или презентировать, когда они используются в отношении HLA, относятся к связыванию между пептидом (эпитопом) и HLA. В этом отношении отображать или презентировать пептид является синонимом связывания пептида.
Используемый в настоящем документе термин эпитоп или Т-клеточный эпитоп относится к последовательности заменимых аминокислот, содержащейся в белковом антигене, который обладает аффинностью связывания (способен связываться) с одним или более HLA. Эпитоп является HLA- и антиген-специфическим (пары HLA-эпитоп, прогнозируемые известными методами), но не специфическим для субъекта. Используемый в настоящем документе термин индивидуальный эпитоп или PEPI отличает индивидуальный эпитоп от HLA-специфического эпитопа. PEPI представляет собой фрагмент полипептида, состоящий из последовательности заменимых аминокислот полипептида, который представляет собой Т-клеточный эпитоп, способный связываться с одной или более молекул HLA класса I конкретного субъекта-человека. Другими словами, PEPI представляет собой Т-клеточный эпитоп, который распознается набором HLA класса I конкретного индивидуума. В отличие от эпитопа, PEPI являются специфическими для индивидуума, поскольку разные индивидуумы имеют разные молекулы HLA, каждая из которых связывается с разными Т-клеточными эпитопами. В соответствующих случаях PEPI также может относиться к фрагменту полипептида, состоящему из последовательности заменимых аминокислот полипептида, который представляет собой Т-клеточный эпитоп, способный связываться с одной или более молекул HLA класса II конкретного субъекта-человека.
Термин PEPI1 в контексте настоящего описания относится к пептиду или фрагменту полипептида, который может связываться с одной молекулой HLA класса I (или, в определенных контекстах, молекулой HLA класса II) индивидуума. Термин PEPI1+ относится к пептиду или фрагменту полипептида, который может связываться с одной или более молекул HLA класса I индивидуума.
Термин PEPI2 относится к пептиду или фрагменту полипептида, который может связываться с двумя молекулами HLA класса I (или II) индивидуума. Термин PEPI2+ относится к пептиду или фрагменту полипептида, который может связываться с двумя или более молекулами HLA класса I (или II) индивидуума, то есть с фрагментом, идентифицированным в соответствии со способом, раскрытым в настоящем документе.
Термин PEPI3 относится к пептиду или фрагменту полипептида, который может связываться с тремя молекулами HLA класса I (или II) индивидуума. Термин PEPI3+ относится к пептиду или фрагменту полипептида, который может связываться с тремя или более молекулами HLA класса I (или II) индивидуума.
Термин PEPI4 относится к пептиду или фрагменту полипептида, который может связываться с четырьмя молекулами HLA класса I (или II) индивидуума. Термин PEPI4+ относится к пептиду или фрагменту полипептида, который может связываться с четырьмя или более молекулами HLA класса I (или II) индивидуума.
Термин PEPI5 относится к пептиду или фрагменту полипептида, который может связываться с пятью молекулами HLA класса I (или II) индивидуума. Термин PEPI5+ относится к пептиду или фрагменту полипептида, который может связываться с пятью или более молекулами HLA класса I (или II) индивидуума.
Термин PEPI6 относится к пептиду или фрагменту полипептида, который может связываться с шестью молекулами HLA класса I (или II) индивидуума.
Вообще говоря, эпитопы, презентированные молекулами HLA класса I, имеют длину около девяти аминокислот. Однако для целей настоящего изобретения эпитоп может состоять из более или менее девяти аминокислот, если эпитоп способен связываться с HLA. Например, эпитоп, способный быть презентированным (связанным) одним или более HLA класса I, может иметь длину между 7, или 8, или 9, и 9, или 10, или 11 аминокислот.
Используя способы, известные в данной области, можно определять эпитопы, которые будут связываться с известным HLA. Может быть использован любой подходящий способ при условии, что тот же способ используется для определения множества связывающихся пар HLA-эпитоп, которые сравниваются напрямую. Например, может быть использован биохимический анализ. Также могут быть использованы списки эпитопов, которые, как известно, связаны с данным HLA. Также, чтобы определить, какие эпитопы могут быть связаны с данным HLA, может быть использовано программное обеспечение для прогнозирования или моделирования. Примеры представлены в табл. 1. В некоторых случаях Тклеточный эпитоп способен связываться с заданным HLA, если он имеет IC50 или прогнозируемый IC50
- 5 046410 менее 5000 нМ, менее 2000 нМ, менее 1000 нМ или менее 500 нМ.
Таблица 1. Пример программного обеспечения для определения связывания эпитопа-HLA
СРЕДСТВА ПРОГНОЗИРОВАН ИЯ ЭПИТОПА BIMAS, NIH PPAPROC, Тюбингенский унив. MHCPred, Инет. ВЕБ-АДРЕСА www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/
исследования вакцин им. Эдварда Дженнера EpiJen, Инет.
исследования http://www.ddg-pharmfac.net/epijen/EpiJen/EpiJen.htm вакцин им.
Эдварда Дженнера
NetMHC, Центр анализа биологических http://www. ebs. dtu. dk/services/NetM H С/ последовательност ей
SVMHC, http://abi.inf.uni-tuebingen.de/Services/SVMHC/
Тюбингенский унив.
SYFPEITHI, Медикобиологическая http://www. syf peithi. de/bin/M H CServer. dl 1/EpitopePrediction. htm информатика,
Гейдельберг
ETK EPITOOLKIT, http://etk.informatik.uni-tuebingen.de/epipred/
Тюбингенский унив.
PREDEP,
Еврейский http://margalit.huji.ac.il/Teppred/mhc-bind/index.html университет в
Иерусалиме
RANKPEP, http://bio.dfci.harvard.edu/RANKPEP/
- 6 046410
Факультет математики, информатики, биоинформатики IEDB, База данных
по иммунным эпитопам http://tools.immuneepitope.org/main/html/tcell_tools.htm1
БАЗЫ ДАННЫХ ПО ЭПИТОПАМ MHCBN, Институт микробиологическо й технологии, Чандигарх, ИНДИЯ SYFPEITHI, Медикобиологическая ВЕБ-АДРЕСА http://www. imtech. res. in/raghava/mhebn/
информатика, Гейдельберг AntiJen, Инет. http://www.syfpeithi.de/
исследования вакцин им. Эдварда Дженнера http://www.ddg-pharmfac.net/antijen/AntiJen/antijenhomepage.htm
EPIMHC база
данных лигандов МНС, Факультет математики, информатики, биоинформатики IEDB, База данных http://immunax.dfci.harvard.edu/epimhc/
по иммунным http://www.iedb.org/
эпитопам
Молекулы HLA регулируют Т-клеточные ответы. До недавнего времени считалось, что стимулирование иммунного ответа на индивидуальные эпитопы образуется за счет распознавания эпитопа продуктом одного аллеля HLA, то есть HLA-ограниченными эпитопами. Тем не менее, HLA-ограниченные эпитопы стимулируют Т-клеточные ответы лишь у части людей. Пептиды, которые активируют Тклеточный ответ у одного человека, неактивны у других, несмотря на совпадение аллелей HLA. Таким образом, ранее было неизвестно, как молекулы HLA индивидуума презентируют производные от антигена эпитопы, которые положительно активируют Т-клеточные ответы.
Описанные в настоящем документе множественные HLA, экспрессируемые индивидуумом, нуждаются в презентировании одного и того же пептида, чтобы вызвать Т-клеточный ответ. Следовательно, фрагменты полипептидного антигена (эпитопы), которые являются иммуногенными для конкретного индивидуума (PEPI), - это те, которые могут связываться с множеством HLA класса I (активируют цитотоксические Т-клетки) или класса II (активируют хелперные Т-клетки), экспрессируемых этим индивидуумом. Это открытие описано в документах РСТ/ЕР 2018/055231, РСТ/ЕР 2018/055232, РСТ/ЕР 2018/055230, ЕР 3370065 и ЕР 3369431.
Термин триплет HLA, или HLAT, или любая комбинация HLAT, упоминаемый в настоящем документе, представляет собой любую комбинацию трех из шести аллелей HLA класса I, которые экспрессируются человеком. HLAT способен связываться со специфическим PEPI, если все три аллеля HLA триплета способны связываться с PEPI. Количество HLAT представляет собой общее количество HLAT, состоящих из любой комбинации трех аллелей HLA субъекта, которые способны связываться с одним или более определенными полипептидами или фрагментами полипептидов, например, одним или более антигенами или PEPI. Например, если три из шести аллелей HLA класса I у субъекта способны связываться с конкретным PEPI, то количество HLAT равно одному. Если четыре из шести аллелей HLA класса I субъекта способны связываться с конкретным PEPI, то количество HLAT равно четырем (четыре комбинации любых трех из четырех связывающихся аллелей HLA). Если пять из шести аллелей HLA класса I субъекта способны связываться с конкретным PEPI, то количество HLAT равно десяти (десять комбинаций любых трех из пяти связывающихся аллелей HLA). Если три из шести аллелей HLA класса I
- 7 046410 субъекта способны связываться с первым PEPI в полипептиде, и такая же или другая комбинация трех из шести аллелей HLA класса I субъекта способны связываться со вторым PEPI в полипептиде, то количество HLAT равно двум и т.д.
Некоторые субъекты могут иметь два аллеля HLA, которые кодируют ту же молекулу HLA (например, две копии HLA-A*02:25 в случае гомозиготности). Молекулы HLA, кодируемые этими аллелями, связывают все из одинаковых Т-клеточных эпитопов. Для целей настоящего описания, HLA, которые кодируются разными аллелями, представляют собой разные HLA, даже если эти два аллеля одинаковы. Другими словами, связывание по меньшей мере с тремя молекулами HLA субъекта и т.п. иначе можно было бы выразить как связывание с молекулами HLA, кодируемыми по меньшей мере тремя аллелями HLA субъекта.
Определение риска возникновения рака
В настоящем документе представлены способы определения риска развития рака у субъекта на основе его генотипа HLA класса I и способности распознавания ассоциированных с опухолью антигенов. Вследствие способа, которым HLAT регулирует Т-клеточные ответы, генотип HLA класса I субъекта может представлять врожденный генетический фактор, определяющий риск рака: некоторые субъекты, унаследовавшие определенные гены HLA от родителей, могут создавать обширные Т-клеточные ответы, которые эффективно уничтожают опухолевые клетки; другие с генами HLA, которые могут распознавать только немногие опухолевые антигены, имеют слабую защиту от опухолевых клеток. Исходя из 6 унаследованных аллелей HLA, родители и потомки имеют разный набор аллелей HLA. Поскольку HLATсвязывающие PEPI стимулируют Т-клеточные ответы у субъекта, опухолеспецифические Т-клеточные ответы родителей не передаются напрямую потомству.
Согласно настоящему изобретению наличие в ТАА аминокислотной последовательности, которая представляет собой Т-клеточный эпитоп (PEPI), способный связываться с HLAT субъекта, указывает на то, что экспрессия ТАА у субъекта будет вызывать Т-клеточный ответ. Чем большее количество HLAT способно связываться с эпитопами ТАА, тем более эффективен Т-клеточный ответ субъекта на экспрессию ТАА, и тем более эффективно будет уничтожение раковых клеток, экспрессирующих ТАА, у субъекта. И напротив, чем меньшее количество HLAT способно связываться с эпитопами ТАА, тем менее эффективен Т-клеточный ответ субъекта на экспрессию ТАА, и тем менее эффективно будет уничтожение раковых клеток, экспрессирующих ТАА, у субъекта. Опухоли возникают у субъекта только тогда, когда раковые клетки, экспрессирующие ТАА, не обнаруживаются и не уничтожаются иммунными ответами субъекта. Соответственно, генотип HLA может представлять либо генетический риск, либо защитный фактор развития рака у субъекта. Более высокое количество HLAT, способных связываться с Тклеточными эпитопами ТАА, может соответствовать более низкому риску того, что у субъекта разовьется опухоль (рак), которая экспрессирует ТАА. Меньшее количество HLAT, способных связываться с Тклеточными эпитопами ТАА, может соответствовать более высокому риску того, что у субъекта разовьется опухоль (рак), которая экспрессирует ТАА.
В некоторых случаях рак представляет собой конкретный тип рака или рак ткани определенного клеточного типа. В некоторых случаях рак представляет собой солидную опухоль. В некоторых случаях рак представляет собой карциному, саркому, лимфому, лейкоз, опухоль зародышевых клеток или бластому. Рак может быть гормонально-связанным или зависимым раком (например, раком, связанным с эстрогеном или андрогеном) или не гормонально связанным или зависимым раком. Опухоль может быть злокачественной или доброкачественной. Рак может быть метастатическим или не метастатическим. Рак может быть связан с вирусной инфекцией или вирусными онкогенами или не связан с ними. В некоторых случаях рак представляет собой один или более видов рака, выбранных из меланомы, рака легких, почечно-клеточного рака, колоректального рака, рака мочевого пузыря, глиомы, рака головы и шеи, рака яичников, немеланомного рака кожи, рака простаты, рака почки, рака желудка, рака печени, рака шейки матки, рака пищевода, неходжкинской лимфомы, лейкемии, рака поджелудочной железы, рака тела матки, рака губы, рака полости рта, рака щитовидной железы, рака мозга, рака нервной системы, рака желчного пузыря, рака гортани, рака глотки , миеломы, рака носоглотки, лимфомы Ходжкина, тестикулярного рака, рака молочной железы, рака желудка, рака мочевого пузыря, колоректального рака, почечноклеточного рака, гепатоцеллюлярного рака, детского онкологического заболевания и саркомы Капоши.
В других случаях способ можно использовать для определения риска того, что у субъекта разовьется какой-либо рак или любая комбинация онкологических заболеваний, описанных в настоящем документе.
В других случаях способ может быть использован для определения риска развития у субъекта рака, который экспрессирует один или более специфических ТАА. Подходящие ТАА могут быть выбраны для использования в способах согласно изобретению, как дополнительно описано ниже.
Термины Т-клеточный ответ и иммунный ответ используются в данном контексте взаимозаменяемо и относятся к активации Т-клеток и/или стимулированию одной или более эффекторных функций после распознавания одной или более связывающихся пар HLA-эпитоп. В некоторых случаях иммунный ответ включает ответ антител, поскольку молекулы HLA класса II стимулируют ответы хелперов, которые участвуют в стимулировании как продолжительных ответов CTL, так и ответов антител. Эффек
- 8 046410 торные функции включают в себя цитотоксичность, продуцирование цитокинов и пролиферацию. Способы согласно настоящему изобретению могут быть использованы для определения иммунологического риска развития рака. В частности, описанные в настоящем документе способы могут быть использованы для определения способности субъекта распознавать и создавать иммунный ответ против ТАА или раковых клеток, которые экспрессируют эти ТАА. Многие другие факторы могут способствовать общему риску развития рака у субъекта. Соответственно, в некоторых случаях способы, раскрытые в настоящем документе, могут быть объединены с другими определяющими факторами риска или включены в более широкие модели для прогнозирования риска рака. Например, способ согласно настоящему изобретению дополнительно включает в себя, в некоторых вариантах осуществления, определение других факторов риска рака, таких как факторы окружающей среды, факторы образа жизни, другие генетические факторы риска и любые другие факторы, которые вносят вклад в общий риск развития рака у субъекта.
Не все HLAT субъекта и/или не все ТАА могут играть одинаково важную роль в иммунологическом контроле рака. Следовательно, в некоторых случаях, в соответствии с настоящим изобретением, разные взвешенные значения могут применяться к разным аллелям HLA (например, с использованием способа на основе HLA-показателя, описанного в примерах с 7 по 9 в настоящем документе), к разным HLAT и/или HLAT, которые способны связываться с Т-клеточными эпитопами различных ТАА (например, с использованием способа на основе HLAT-показателя, описанного в примерах 5 и 6 в настоящем документе). Способы на основе оценки HLAT и оценки HLA, иллюстрирующие изобретение, различаются техническими вычислениями, но в обоих случаях субъект имеет более высокий показатель, если его/ее прогнозируемая способность создания иммунного ответа против TSA лучше. Оба способа используют алгоритм статистического обучения. В случае показателей HLAT алгоритм обучения присваивает взвешенные значения TSA в зависимости от того, насколько важны иммунные ответы против них для борьбы с определенными видами рака. Тогда конечный показатель HLAT - это взвешенные суммы триплетов HLA, которые субъект может создавать против TSA. В случае показателя HLA алгоритм обучения присваивает показатели отдельным аллелям HLA в зависимости от того, насколько хорошо могут быть созданы HLAT против TSA у субъекта, обладающего этим аллелем HLA. Тогда конечный показатель HLA субъекта представляет собой сумму взвешенных значений аллелей HLA, которыми он обладает.
В некоторых случаях применяемые взвешенные значения могут быть определены эмпирически. Например, в некоторых случаях взвешенное значение, применяемое к HLAT, способному связываться с Т-клеточным эпитопом конкретного ТАА, может быть определено, основано или коррелирует со способностью каждого ТАА независимо отделять субъектов, страдающих (этим) раком, от субъектов, не страдающих (этим) раком, или от фоновой популяции субъектов, включающей субъектов, страдающих (этим) раком, с использованием описанных в настоящем документе способов.
В качестве альтернативы или в дополнение, взвешенное значение, применяемое к HLAT, способному связываться с Т-клеточным эпитопом конкретного ТАА, может быть определено, основано или коррелирует с частотой, с которой ТАА экспрессируется при раке или типе рака. Частоты экспрессии ТАА при различных онкологических заболеваниях можно определить из опубликованных данных и научных публикаций.
В некоторых случаях взвешенное значение, применяемое к конкретному HLAT, может быть определено, основано или коррелирует с частотой, с которой HLAT презентируется у субъектов, страдающих раком, или у субъекта, и/или отобранной по заболеванию подгруппы субъектов, страдающих раком.
В некоторых случаях взвешенное значение, применяемое к HLAT, способному связываться с Тклеточным эпитопом каждого ТАА, определяют по формуле или с использованием следующего взвешенного значения (w(c)):
= nwx log J -- log(t(c))J где t(c) обозначает р-значение одностороннего t-теста по показателю HLAT для с ТАА для популяций с раком и без рака, а В - поправка Бонферрони (количество ТАА). Это взвешенное значение используют для описанного в настоящем документе способа, основанного на показателе HLAT.
В некоторых случаях показатель значимости (взвешенное значение) аллеля HLA (h) определяют, как
где u(h) - р-значение двустороннего u-теста для аллеля h, определяющего, отличается или нет количество HLAT у двух подмножеств индивидуумов: одного подмножества, в котором индивидуумы имеют h HLA, и одного подмножества в котором индивидуумы не имеют h HLA. В - поправка Бонферрони, a sign(h) равно +1, если среднее количество HLAT больше в субпопуляции, имеющей аллель h, чем в субпопуляции, не имеющей h, и в противном случае равно -1. Это взвешенное значение используют для описанного в настоящем документе способа, основанного на показателе HLA.
В некоторых случаях начальное взвешенное значение может быть дополнительно оптимизировано с использованием любого подходящего метода, известного специалистам в данной области. В некоторых
- 9 046410 случаях сумму этих показателей значимости используют для определения того, что риск, с которым у субъекта будет развиваться рак, коррелирует с риском того, что у субъекта будет развиваться рак.
Например, в некоторых случаях то, что риска того, что у субъекта разовьется рак, коррелирует, или риск того, что у субъекта разовьется рак, определяют с использованием следующего показателя HLAT (s(x)):
где С - набор ТАА, с - конкретный ТАА, w(c) - взвешенное значение с ТАА, а р(х,с) -количество HLAT для с ТАА у субъекта х.
Способ, основанный на показателе HLAT, и способ, основанный на оценке HLA, описанные в приведенных в настоящем документе примерах, являются двумя примерами способов в соответствии с изобретением. Дополнительные схемы показателей могут быть разработаны с использованием данных о генотипе HLA класса I индивидуумов. Используемая конкретная оценка зависит от показаний и априорных данных. В некоторых случаях выбор будет сделан на основе характеристик различных вычислений с доступными тестовыми наборами данных. Рабочие характеристики можно оценивать по значению AUC (площадь под ROC-кривой) или по любому другому показателю характеристики, известному специалистам в данной области.
Ассоциированные с опухолью антигены (ТАА)
Ассоциированные с раком или опухолью антигены (ТАА) представляют собой белки, экспрессируемые в раковых или опухолевых клетках. Примеры ТАА включают новые антигены (неоантигены, которые экспрессируются во время онкогенеза, и изменяются по сравнению с аналогичным белком в нормальной или здоровой клетке), продукты онкогенов и гены-супрессоры опухоли, сверхэкспрессированные или аберрантно экспрессируемые клеточные белки (например, HER2, MUC1), антигены, продуцируемые онкогенными вирусами (например, EBV, HPV, HCV, HBV, HTLV), раково-тестикулярными антигенами (СТА (cancer testis antigens), например, семейство MAGE, NY-ESO), клеточнотипоспецифическими дифференцировочными антигенами (например, MART-1) и опухолеспецифическими антигенами (TSA). TSA представляет собой антиген, продуцируемый опухолью определенного типа, который не проявляется на нормальных клетках ткани, в которой развивалась опухоль. TSA включают общие антигены, неоантигены и уникальные антигены. Последовательности ТАА можно найти экспериментально, в опубликованных научных статьях или в общедоступных базах данных, таких как база данных Института исследований рака Людвига (www.cta.lncc.br/), база данных по иммунитету к раку (Cancerimmunity.org/peptide/) и база данных TANTIGEN по опухолевым Т-клеточным антигенам (cvc.dfci.harvard.edu/tadb/). Иллюстративные ТАА приведены в табл. 2 и 11.
Таблица 2. Список поименованных опухолевых антигенов с соответствующими номерами доступа TSA/CTA = жирный шрифт и *
ί - > , . ' Ш J ;
νл:: : - . ., J AM /ilStl Wt2t
\ mis слгда ι МЫ P-M519 1 ABL-BCR 1 ABLIM3 OWM 1
АВЫ. · AHTR? a . лл . 3 . , 5 . » >
f Λύϋΐ P21J7 ι . MIDP V ижлл чко'гю artis, twsFi л
/ ДОТ4 Οί .<20? . L ; мж ^77.1...1 ACTF1B РЯИЫ КЖ? Й117А5. 1
ί Агдал a® 20 se«®e j . 1 MW T.5 012444 Л
ί РЛВ53С.1 WJWQ QSiSfii *ВИЙ еюп-М’ ftD>17 1
\ AO Pl ЙЭ X A. 41 :i ЙГДРЙ! СЭТМ1&Л № F L ОВД £
J M&fe . 1 Жиге! saiSwi.i aS сит .
{ iJPl ' ' P51«5. L..... AFF1 СЧИИВ1 3 ' ' AFP ' №11,1 A.GH-2 ¢444,1 ' j
j СВД. < . - j « «к f
ΛΪΜ2 ймйе:. .. iuSf-il αΪ3β« .1' м»-з ота?й.1*
1 4UUSi-4l QSJQC9 1* i AM Pl ι Am pm 74« i
j АЭ1ТЛ Q9Y2 4 3 1 a: r ,i - r-r , . ALK8HL .
QiiOFi.l......... »кй' даж л............ affi 015123/1 .......... 'wtmiS'gSsngw ..........
{ Д№1 (pw I адред Ro-on i pent’s· 1
l I ‘ X APOA2 PCJ2SS u I . m
, S Hfera.i jyi-L , 11ЩЦ............................ «№.........awai.i....................... ftSjfemmO'H.i
- 10 046410
С«Й56 . 1 АЙ1Й4Д P25774Л AStelP^ Й7591&Л ШСЗ BOS3.1*
Г A8MC8 QBIUP7,L ARTCI ‘ P52^6J 1 ARX ' g96QS3A* ATAD3 QGP1.18.1
ДПС _j аддаг ς«ξχ?Β4 । ЙДПЛ ..- . AXC F3O63n ]
В ДАТ G14«2 A SAW W24 Л вйде-ϊ ШэоЧгЛ* дМУЗЙ , 1*
BATE-J gy£Y2y 1* НАЗЕ-4 Qt&XM.l ГЛ 4 514 1
J BAL BALFZ :: ’ 4 мала : a... ЗАЛ ” i' . ’ .
'1 BWL раздел йт Κ®11ί ВОШ GlCTTA semi F51572.1
t FOLK тем в ИСГЛ pons 17 1
βοή Pl 1274.1 BCRFJ FQ313C.1 BDLF3 РОЗ224 A B<3LF4 S132BB.1
SMLFl P03181·L SMS Fl Р-ЗМЙ2 Л BILF1 Р5М&Л BILK .1
BINI О SING 4 а2.5213.1 B1RC7 Q*3SCA&.1 Fl.Z.f 1 4 - К - . .
ЙЫЛ РОЙ49.1 artu Р3й22в .1 HFLiO SWFRlH DMJ2 3& . 1
smiFi P03191. L BHLF23 РОСТ S Л BWLF2fc QSAaJ3,l ВЖГ1 ₽ΚΚ9,1
ERA Fl p. t -· < .: BFD4 ОЕСВЗЕ.1 MRDT Q58b*21 1’ E-RT3BF QBMY22.1
ЙШЙ 0604 Л . 1 йкУ i РОЙОЭ Л ЙЖ2 QSBXr^A В-1Щ1Й ОЁО^&б.1
BW2 PQ3O4 .1 8XLF1 Р-33177 Л DZLF1 Р032<!«Л ClSorf^O Q7Z4JK3.1·
СЛ 12-iWXl ?.l CA 19-9 Q9«9X2 Л QVXXJ9 2 A ГДм gierna . ί
CftJBYR 075952,1* сиж Q*»ZI1 1 CALCA TOI 2 56.1
силл QWU I ИК Р35&.=>® л CASO 016234 Л eases Q9WQ31.1*
CMS» ж«Я. Ϊ CASHS С147ЙС,1 CWFA2T2ζΜ CBF&2T3 стой.. i
COL P22tiei. 1 CDLB Q131M1 1 CC3 Q^hUPSA СС0С11Й QSTBZO . 1*
,( CCDC33 QSIS5R.S 1· CCBC3S дема 1* CCPCS 01G2Q4A CCDC62 QSP9P0.1·
CCIX’fe» Q9H2F9.1 кя! Q8IWS 1* CCL13 Q9*»61b . 1 CCL2 Fi-isea . i
СГГЛ peoc·? CfKAl F7a33t.1* . J A « ram 1..- .
CCKfll ' ; * · CLW ССШ ¢14094 1 CCNLl ЛЛ ’
ГЖ W1547. 1 emos PVi513 1 CD12J Р2ЙМ51Л СШл Ρ151Ή . 1
C i.. · ’ . > - s * . .
Сб1ЬЛ p CtM 70 CD194. > .
...... Р1МКЛ 1 CD2 0 Р1183* 1 CD21 P20023 1 СПК 1^213 Λ
Ж 29 Й9Н&37.1 СШ1 РаСТ4.1 .Л ... A . , ешэ Г107Л.1
<Έ30 ₽2§§П®Л LT-3 17 QlC5sH 1 CE'33 ₽2i)13au CTH5I) Q9ULW2.1
erne Р1БЙ73 1 • да pcs 17 3 &. i 0349 1F25«47 1
C&8OL P2956S.1 :: a MS7S A E&O Q0S722.1 Ж1 ^oe7S&л
! CD5J РИМ A m 'm i CKi :a CD70 P32970Л
ч CUM ₽ erm ₽2 ЯФТ7 3 Г '?. j . P3IW 1
f ewi Ffcm,i ®h PS1732Л ™E pi&*«6.i аж K5O5 Л
ГТКВ poaw j ΠΧΊ 2 1 C7RTQ4 1 дал pogwa грг? Ύ Ρ3Π2ΚΟ 1
c:„™ . Q6P1J9. 1 CDCA1 asbiiusi i* CDCFl α·9Η&ν&-1 спнз F2I2Z3.1
CDK2AF1 O1451S Л Mt М1Й2 Л ΦΚ7 i50G13/l СТЕН ХА ™ j&»1
i СП№^ W post3i 3 ΓΒΑΓ&Μ1 Q8GUF.4-1 гкнгк QWSlfi )
CEF162 QSTBBQ.1 СЕ₽Ж Ο1ΞΟ70 I* CBP55 &53Е24Л* CFL1 3 ,
CH3L2 CHEK1 014757Л CK2 P197S4A CLCA2 Л< ..
сж£ CZLPF· Q1«^4CA τ’, :' ·. a . CMLSS „ ».i 7. .
Р1ЛГП . 1 СЙШ <514 01’’A ГОХ2 РЙМ4Л ёадЖ WO -1*
( CFS Fl gigr^A . O?XCR1 дэкиол* CTSSL3 CKEQ1 , 4
CliptQ CRISPS Ρ165Ϊ2.1* * 7; : » > . . CHKL Ie-. *.,
€1U#± Очйёй. i СЙЙ/ΐ’ί дайм a ct4§ eirali* ев Q^DJW . 1*
СЗМ8ЛЗ. Q8&HtXLl· СГ4 5А4 ?ук7к M* CT4oAi ifeNSHJA* C245AG ₽0D№ Л*
i CH 6 дакш.Р CT4 7 1* efrai ^«ίτ,ϊΛ ежи QMRM . Ϊ*
cTW83 OU520 1* CTCFt QSHtSl 1* CTDSP2 014595.1 CTGF Р2927-Э Л
<ГВД4 i .: CTHNM P26232 1* . . . . P5Q716 - 1
CTcH Р09Й&Й. 1 CWl ΪΜΜ . 1* cfffl Q3 ГХСРЛ Ffiicm ,1
CJEbr«SQ8WtW5 1* Qtorffil QSR943 1* Cyclin-E P24d€4.1 СУР1В1 ¢16^76.1
P23-284.1 CYR^l QQC&22A CS1 Р2Й29&Л CSM1 G6&B30.1*
CSDEL cm* j.4. ϊ CHFl РО86ОЫ CKF1R H07JJ1A СНОЙ
€ J . f t ’A ,- fWi ОЗДСЛЗ 1
ПГДГ12 i* - * ’ ». ί Ί . . ь ’ -
DCUKD3 Q^IWE4 x to i 0СЮ-15 1 ЮХ C0&571.1 DDX&
s t O?W Я 1 г * t - t i OEiWt Л *
j___ 0604-3 3 . I 1ШЧ2 &КМ . ·
ШКЗ Q«₽4 . L HKKUl $9<Ж85 1* DMBT1 $№15, . 1
D№T1 emai.i* №>i аиим 11* GKJUCS О755П7Л EWT3A West. 1
ww ! $7ϊ7·Τ£ Ϊ*' ' ' BR4 ' О*31Л2С 1 DR5 ' onremi..... 0¥2'95.l* '
DgrRa Q96T75 1 ОТ 0007 Jfi з ' Л » Й2ЕЯ АОЙ-Л'б 1
ЁЙКЛ1 POKLl . Ϊ ЕЙКА2 P1297BЛ ЕРЛ’ : .A . EBWU PB72G3.1
J Е8ЙЖ ! Р0Й04.1' ϊ ...... ' P12B3S > Ϊ ¢9^72.1
RCTL2 urjaasa г ЕШ QffiKLS.l· да? Р11&ЛЛ KFHA1 ??СЮ7 Л
EFS О432Й1.L ЁУТ1ЖЙ Q1S029Л Ё мга Й6531.1
RLM -. 4 . .· i . RJF4KJiPl QI 3641 1 E ELF4 Q9^&7.1
ЕШ¥Ы дЗЫН<5 EKPI 1-. Л. ·ί 1 EUAH ,:’A . . Endosialin QSHCUOK
; «1 ЖШ.1 EW&2 Л 075356Л
- 11 046410
ЕрСДК P16422.1 em: £25317Л £2952 0.1 ГРЙЙ2 Τ2θ?25.1
P51?S0Л EPK96 0151*7 1 EPSg ЕЙВ83 Р218ГЛ.1
ERW4 gmcn.i RRRG 034344 1 WG Pi 1 здв.-1
ERVK.-1* О7ЮТЛ Ml mi72 л KtMl cwm. i rrsi Ш«1Д
КТГД Piscie i ЕТЛ РЧСМ1Л ГГ/5 Р41И1Л FTV6 P412U ]
Е . 01 » ♦ j EWSR1 eva: <' > ~.. E2H2 QIS-ЭЮ . 1
J гада otasO л рмишззнзй л* wkS ежи. ϊ*
РАМ^ЙЙРPQC7Q1-ί FWOG «Л’Л»’’ Л ίΤΑΪΉΙ S96W0-1* ГВКО39 QBK4H5 1*
FSXW11 хгв..: FCHSDG а<э4вбв. 1 FEE FES F07312.1
FEV ¢$5511.1 FGF10 O1352C.1 FSF23 QSG2V9.1 F»
FUF4 poassa. i FGF5 £12034.1 F Fl1162.1 FC3FH2 I .. . · . .
FSFRJ 1л2«о7. i mm тк«л M £097®9.1 Fbl 1 сонм»·. 1
РЖ P36888.L FWLl 09546« 1 FNOD ^0682&Л М.Ш 08N-J-W/ 1*
FW1 ρ· Fnl4 в ;. - FHIFG <. ь . FOLR1 Flb32S.1
l№ P011C0.1 Гтй P515jy/1 FUSL] тай QO0O5O.1
ΕΌΧ01 012770,1 F№ 043524Л FEAT1 0-92837,1 r i MP ·< ΜΑ2Ύ4 .1
5 ГУ1Р1 УвИДСЛ . 1 Oiicacx. i гатО .1 FTHL17 ответа Л*
: FCbTH-2 R» , I fus P35637 1 FQTL P1952S 1 FOT3 Р2 1217 Л
TO P0624JЛ C3AB2 ОЖХЗОЗ 1 j; : r j · . GASE-l 013065 Л
®rai^c/D/s ИЫ2?Д SMSEISF PQCM0 . 1 GJWE12S₽aCML.l WbGE12KASt«>E8 >1
GAGE12J »QCX32 1 GAGE12J MRER3 1 SA.XK 2 Q£NT46.1 0ΑΠΣ 1 013067 1
SAbi- Ί yl?€5S _ a®E-s iiliOSS 1 SfeSE-6 Ц13070Л ая-7 ОТбСв? 1
Г ββ-« SJWiU Ж1ЙТ2 да'тл GAS7 w&Ki.i GM£ Шй™ »ϊ
gata-л P21771 I сжм - 4 QSS7.17 1 GCDFp- Рп;тл iJFAP Р14Л6 1
G Q‘ □HSR , >». 4 . SI PCI D1490B . 1
GXTR 0^¥3US,l αχΑΡί iswrc 4 Ϊ ail BMISS л 0LppiSan-3 Р51&54Л
QKT, Qis·-** . GN АД J P2QQQ2 2 GtiAQ P«5P14ft.l □ЭДЭМ pew-i 1
ecisMil ОЙТАв . 1 gpioo Р44Ч67 3 ЯР» P17&4S Л Gp96 ί·:
W2 S«wtH3.i· аемскг 29HK75.1· Ж-3 . -»e - 3PNHS 21Л
ОЖ143 rsisio.1 OFE8’4A BPZAQfi.1 GEB2 ;». »·· ,« GRP7S ί.;·.:.:
etfC'tiAj ΰοΐιαϊ l НИДА ЙЙ2« 1 HASE δΜΟΒέ.ί* 1АЙР t'ii. i no . i
1WSGF §5?9С?5Л hCG-b^ta Р0ЖЗЛ HPA01 QI3547Л НИС2
ЖйН oisr^. i HDAC4 P56 524.1 HDAC5 O41X2L6 -1 HDACfi Q0USM7. I
нжч Свичи . 1 Нййхз 09&T41- 1 ЙРАС5 OiWO&.l ЙЕАТЙ1 .1
Нервна ра-лях л H-5^2/1-- ЗШ £046-26-1 HHRC2 005714Л hit*. :-:.-4 mm.l
не» P0 Й1Й . 1 H&X 1 K] cm 93 j л ИиЖзй Q-ч ΪΜ19.1 нГйл QMX6.1
И»Р ЙЙШПВ.1 №GB1 ММ2·» 1 НЙХЧ1 Р0960Ы HWPL Г14666 , I
ЙОМ-ЖЙ S-85 СЭР127.1· OJiMilfl8SX24 1· HORMRU 3 $8N?bl 1* ъ:. i Q9Y25LЛ
s ЙШ fi ЙШЙ1 ЙГ/16 £ί £03129-1 НР71Й Й FG&4O.1 ЙРЛИ » .7 Ραβ7ΒΪ.ι
ί Μ РОЛЛ .. H HSP1C5 W598.1 HS^O - !
HSPAlA 3S₽B9 1* HTOO] Q.rrSW . 1
ЬТЖ 0141*16. 1 HUSL «MW J 1 ICA5i-l P05562 Л I UH) О75Й74 .1
тгхл Pl 4402 1 , . WF1R • u . ISES11 Я51Ж21 2’
IL13RM 214627,1* -PP Ί jnsvil Ί* ι&υ J5i№Ll
ints* QWLOJ , 1 - 01510« 1 л-.-ί 014654Л I ТОЙ 5 И6»4в , 1
’ тусжа PI6C12 I ТТРД ow^ a ΪΤΡΡ2 0H571 л ЛДК2 ОЙЛ6 74 1
dARl РЬ231Л1 JWREDlBSSWtl .1* ' ' Ж И 2· 1 ..... JMK1 ' ЙИ83Л
1 JNK5 Р454Й4 1 JKO ,ΤΤΒ 0760^5.1 □UN 50^412 1
£14525.1 K15 SUSi ‘3$УЙЕ-&Л Kallxkretn 14 Q9FCC3.1
Kallikrrin 4 . 1 ктя лэут. i 066341.1 KDM5.A .1
KIWI 100 О146Г? 1* КХ^ОЗЗб оеьшл KIAA1199 Л .
KlFll tx 4 .: OFLH дашз Ji os a-2 ь л F10 Л1.1
MLR 043474,1 ШЫ. 1 060662 Л KLK10 O432<I> ,1 »ΤΤ2δ OH0S6,1
KOCl 000425.1 К rag £01116.1 KglTl OOQbJ2_1 KN 12 Г62915Л
КЙЛ Q9OS0.1 КМ- & f 5Ё&141 ^нахч. 1 KW-7 076476.1 11 CAP! 1Л20 04.1
ί. U53 OWL! L-0 Q9BTT4 1 LAG3 Р1&627Л Ь»д»-1 oisiaa л*
»TCl ОЭ5835.1 WTS2 O^KRHO-1 LCMTi C&0294 -1 ЮР1 Г12796 . 1
ЫЖС P07864 1* LDLR P0113G.1 TEMPI &S8G75 Л* Lengs 3 n Q&twe . 1
ГЖМР1 Qi ixjalb w сждяй . ι «АргиД 1 ·
ЫР1 UW * LIV-1 ;: u : LU3L1 0153m л
LEOS Р257<?1Л LFP1 PO.U30 1 LNP2 P13?S5.1 LQC647107 Q8TAIS 1*
ыжгл < r^Pl . - r^ERW2
LTK 1 L2TS1 T 1I7R¥* 1* ЬГЫ P0734 8.1
1 хдаед g»i« i· МЙЖ , m· < ^9fiJYd-1* MAF 1ЛМИ Л
Г HAFF Q9LXX9.1 4 MAPS 01S52S Л MAFK 060675.1 MASB-Al EI335S Л*
мвд-ма мзэвз ι· WUSE-адД P43364.1* MWS-Λ U B43-HSS.1* we-Ki sojie.i*
( И*га-Л2В Ο*ϊ**4·1· MAGE-AJ P4132/.1‘ HAuK-A4BiJJhB.l· M*SK-A±
иячиажг »«щмяя л* НАЗЕ АЭР43Э62Л* MAGE DIP43365.1*
ww-saoiMii 1* жи-и ojiiao 1« 1вви-м O1MS1.1* ИМЖ-В4 2»В1Й1.1·»
- 12 046410
MAGE E6S3SHX4 1* JOiSE“Cl ««732 >1* HfcSM2 ймпл* иитоз gsmi. i*
i «-nr 1 · > . MHSF марго i.· ' ЖР2К7 '/Si'
ШЛИ. 1
’•Ui. Л !.,· L· - . . Ч.Л + : 1 , ‘Ί «. . . Mill·. TOTO . !'ΛΙ.-; . V/’l·· '. .
Βϋί ^04201.1 «I ИГЙ.К Q44sf; it ВСИ TO -41.:
l· . О1.5<Ш0 s 1. MCL1. йтааел истш . B^P osora, (ί
м/г : u... тол . , . '111· ‘ TO l· . . :ч/. TO . .
ЙЙ&1 йийл «2® ”0 -1:.: i •-!Ь I J л :·. 0002«. 1
НЕЖГЖ eiaa«roi МВТ ИЖ561.. 1 MM8 CHW4TO1 OTO , 1
ИИ2 PO0S82.1 «ΜΪΙ makiiw Fl'· TO 4 t
4 .. ₽«ИМЗ,1 ЖЖ m«to HLL „1 MLEffl 0G3111,1
( . . u ; 1 > , &УИ i . TO
мыж PSS19I MM? 14 41· i 1 1
Pbtoeo . 1 0®«ТА1Л ЖЖС1 waowHi дэеда^л*
Μ : > «.. '. . ч: .. -.- - ’ « l· I . MRP3 L·. 4 ..- . .
”ТО. ' gis«4.1 «·’: 1 TO 1 > . ’ Ί v: -4.::
?*. ·. \. > f , . <- 4. t Mi..· . -Ю * HTCFl. i ·
toto c,:;::.: : . to ‘ u л mu: l TOC . .-
ей* . ' > 2.1 '* >· -... - И J ЙПМ . . 111 1' TO ,
’ iai «':» . I -bl· ....4. . ИК FSIITO,! mm ► .
:;»· то : MM.L n- -: ί то: л. i TOTO дайм TOUT
ΜΪΟ1Β 04379S.1 МАЯВ A POCSKfi P MAil Й1Ж< Л H «1» · '. -A 09§09.1
: /л ·. QS3O1S. 1 ffi&S ЙЗИШ .. 1 i:i4 :.. д r;._« . ноэи . ’··. ..
TOl· 514777.1 ito: |l·,’· ' . n ί \ >·.;ι.’' a Hl , - TO TO . .
:> £№05 -34 Л I'iWF , ' -a * . ЖЖ1 OW0TO1 .» f ·' . ·
V? Fr , ,<·.-·. . . W’Xl , 1. ’ ъ - :ΐίϊ ,. ’ .. HGAib t . ..
;!<! : '-.ο : , toto ; !Г1Л J ,’ΨΊ·’.,.
Ί fflSJ. 1 W8QI Л ::i . ’ KURT 4 Q94MN2.1*
υκκ;· = ч .:· ί : Ш V Ί L· l· :r.L· .:
s ‘.i- №V MfSl 4 ( KRfaAl VlsflOfa.l*
p i л.. .: HHCAM , -11·, i . ; ”» пь ..
. ’ , .Ί
WXS'i Q9GifTJ.L* МХ2Г2Н 5iJRH6 1· . i . TOl· < TO λ'Η .
Μί-ЬЪТО ЫМЗ* Л KMEl· 1 ₽5772>..l ОИ671.1 Qi.4940 Л*
« Й5ВЖ1* ODF3 W® -1* OOF4 ®2й2езл* »Й, eiBSTO. ί
• ’7 u; . ;. i Uli'S 042482 1- ..· -. s . * *' * ОГСА дозы?? Л'
So РО4Й9.1 OOOL TO till·! gsi :то> ., rl· 1,Л то л;
' -.l· ЙЖЖ , 1 ΡΑΒΕΙ 1* ΡΑΠΕ2 •ОЖЗЖЗЛ ₽Afil2B OS.7RK9 Л*
PAUE3 Q5JUK9 1* PACE4 U«823 1- PAUE5 V9€UVL.l* TO.. 1 TO . .
Ч./.л; iMiixi αοΐΐϊϊл : ; GOWTOi . ! 1 . «Ж0246.Ϊ
РАЖ7 & asiisjTO ΡΑ5Γ1 ;arv-»6 i* РЖЗ siowe s ί
&axB Q02B4S.1 rer PfcK g»6®5.1* Г40424.1
’> p.\ 015116,1 PCM1 Й15.Ш .: 1 шшьЗ: » < F‘ . . !;»> rei.lTO < 1
PIX3FBA - s PKPP2 3№A’J3 1* IW ’ ί « 1
uru - QSfSJS.1 PHIiFPl P1AS1 ©7&92*Л PIAS3 SW2B . 1
' л n - РЙЖ.1 MOOD o»o PIOIU »0.1 FIM1 P113GB .1
!'TO ‘ * · . -Л ; = 4 - L· > SlHiLl ¢9 GJ 94 Л’
Γ7Κ77 J 2ЯТСЙ? 7* ; l· ’/ < l ; /.·;., 4 rr ;><{ -l· .;
PLA21 2JHHJ3 1* Ml ί H i-
r: r -: ·!!ΡΡ . I :=:* : v *· - ЙЖ .WTO . гл::: г-ι O431S7.1
' , to ‘· TO’TO Γ3ΊΧΛ 26sa.r?.:*
I? СТЕН QiS5H4.1« PCTEC В2Я.ил.1* ΡΟΓΕΣ iUOYHO 1· Qoafljj л»
PCTEG 5Й5ЕЛ* PCTEH W5&1* РЙ31В 1,..1
PPFIA1 βίΒΙΜ.Ι Q13427.1 РГРЖ1В РЭЭ1ТО.»1 FRAME ₽73395 Л*
WJ3XS F3QO44.L frkaai 013131.1 ::- r : ?4 4 . I?KM1 104553 Л”
ΪΡΜ2 'fwm 3* »T3 υύ-'ίτ : if« WMl·! KJ . л
Ml cm^stoi PRESS4 2&Σ?ΕΉΰ 1* PRSSib G6ims4.i* ЖИИ P.M13B . 1
PROHE j < i· 4.; x : /a г1 Л : .l· . r : ;д l :/:·“..
P’M Οδίϊδΐл M!« «sis л L iTO. 0Й2ВД SlLfiOi., 1
MIX ₽fiO4B< л. и t игке 013003.1 ₽rrK2UA Q4JZLJ.1·
втйж QiS2eLl Й® !l· --4 ’Ί I .то: : НТО . г: to: δ®Η! . 1
POS3 §«M4.1 л.л MOTOI s Л ‘ ΠΊ 5 . : · TO . i шел K1«L1
HADI ut ’ ·>,·!.; fud: ,’ Q7S 943 ..1 НЖПБ1С 043502.1 Р.'.г .
SSai-i QMfial·. i Й1М1 e. -1 l· . •
BD1. POMOO Л :R0L3 gOOTOl ςΉΓΒϊΰ.ι* RIPi ί -. ··: .
HC'ASl 000559.1 1 . ! E TO « TO . . RET 3?@7«U® . 1
fVWi! ssubojj* ЫТО CM5BTO1 НТОГ .. . PL· » 5- ' : ч ..
: j! ...-. ; ; } 2 I TOTO X :: TOE?. ' ί TO . Σ TO s 14.-1.-. .:
Siii ofoii.i R·/. ют Q4HATf) 1 T ififti soim. ί
1ША Л 1.PL1A ЕООД 1 Fl.58-.ao > 1.
TO. 1' --.. . h. ... HPL-Dl V92SC0 1< } i .7./2 i < „ ..
- 13 046410
КЛК! С--£С21.1 ял.·:: ;'-F7T-.: =r_n:o :iv7o.i
1ΪΚ М4Й5 , 1 SKEl 2ЭШ1.1* Л·*’ \ ” шиз ё«об, i
. > 1: r . s Ql.2755,1 IDCi-f W05W , 1
да-ι ΐίΐίϋ,ΐ жж BslILi I ю v-.io?...:
¢92454.1 8ИЕ1 P04279.1· ж Р31947Л ШОК 0144 , 1
.и b. . . ·Υ <_ .Нг Id л. ·..
fiiSfe йй»л. ЙО. Й1ТИД
SLC35A4 QSi'OTKl f . *
ПЯЖК1Ж> QSBWOS..1 ί· SLITS» ^Βϊλΐ - -
SMfcDS Q95717.1 MD5 O43S41.1 SMO £0835.1 ·.< ·>. 1 >··
, . . . . . . . . . 1 . .
SOX-11 ..1 ЯРЛТ7 1* ЧРАГА^ ΊΠΤΧΛ^ ί* spm;; дай:·? ?*
я?«и дйво* StWiS WWW* жшзв даивал·*
SPftCS 053271.1* SPAJNXAi. 39XS26.1* asAKxa ς9№25.ι* ОЛЖ 29ΜΪΒ7.1·
ΚΡΑΝΧΓ: T* ЛРАЧХУ 2ЯТЛГ.1 Ί * SPKNXWl QSVP.B? 1Л 5PAXXN7 QWT1 Л ?*
SPANXSli QOM.TIJS. 1* SPANK»* 2±=MJUU 1* SFAKXN3ChKJU/ 1* 2PATA19 O‘»2hL4.i·
SPET2 1* . ::: :ч- л SfINLWlC35325 1* spoil QilfKl.l*
I?·· » » SSX 1 Q1&3IH4..1* 55ХЛ Q-.SIEOl*
SSX-3 Q39?09 1* SSX-4 3δϋ224 2* 35Χ-Ϊ SC022b.l’ SSX-6 О'ГВТГВ.!’
ззк-7 ς»7ρ.ττ5.ι* SSX ? 27ЯГТЗ 1* .77:' t mil Й2224.1
SW1 03ЖВ8.1 S®5 (ШМЛ 1 »
- · . : ι;« « j, . it. . . . , b .
syq?; ; SYCPl 2U4 Л 1 ЖИ ΰϊϊδ®,ΐ IS?T ЙШ2Л
B4 ТЖХ1 075-ое л «од. Q§ima :->i Ue .
♦‘АГ, 1 да 24 £ 1« ιλ: i : . · 4. ..
oIbsSsA :>,г. ’--л·1 I \ - · . ж! im.i
tsm Piwsg.1 талж TCMl QOtt-1 TSH₽ WK-l
ТПЯТч <2=6xT4 1* ΓΠΪϊΓι* 5^X715 1* TTRCfi ОЙ0572 1’ TEKT^ Q95M79 '*
TEKlUl Q№?14.1* 2EXL4 7Ы1№6.1* ТЕХН С9НКТЙ.1* TEK2B tem/.i*
t? ; : . i 1Ψ1Ρ3 25М910 1* :гк ί·. ·:... :. . i it .
вил ϊ ..: ГНЕ^ 3=1? 7ТЯ Ί* 1 . . j * . л ; Ж : ' - :. -.
i парь'1 oaiiHfe.i* тавьта ζ9ϋΐκυ.ι* TMEMLiJii 06UXP1.1*
тЙ»27 Ш 5.2 ей . 1 Ώ®Κ&!£12 28cNiS5.1· π ' i-„. <.. i . ; ... · .
:::ι: л , : WK2 Q07912.1 «Ш3< filSWS.l . ‘ . ί ’ .
r i. : : ' д , -ъ . · . Ίί · .= . . ir 4 ..
л -. , . . · : . ТЙЛ BilSWA :r-; л > ь.
ί ‘' -= ’ 7PFP2 Р5Л292 1* TPR трта гьйтво.:*
TiL-.“ ^..:4-. = .: 7КА2-3 23Ϊ5Ρ2.1* IHC. : . . .-
ТЙЮ7 OsAm.i тшйй Шйл 1У!3' > -. ТЯЯА’.Л Q9RXW7 т*
ano * TSPAK« 043657,1 TFTYi 1* Τ«ΤΥ2 ДЬККП7 1*
-'ςργΊ 2«5Γ·.γΑ л та«л даио®.1 I* . * , '.
7TS №33». 1* »»,.!* ' · - т».ж шшо
1 ' ’ ’ = - ( > s . V - ·
ПИВ 015205.1 ЦВ12Д Н5Ш.1
ШШ.1 U8E4& <»5155· Л t®S5 0^5071.,1 □Ж» ¢51114 Л.
: -,--11=-.1 . ,'F:.. , ., о··'. , 10 7. --Л s .
Л.Л n-'.„ л . : - ’ :·. 4='”-. ‘,'Τ.ο ;*!лх.-.
, t . . M.. --4-- . . ί ... к > ,
.i.-j.x ·;<: · ;i:r о , -.г-11.1 · . т?:л ;л'т: .
ifwi ообзмл WF!i Pi ΪΟ21A . ‘ 1 vP,.s
- n . . <1 V . XAGE-1 2^HD{14.1* AiUfc. i „ί: л с* XAul-J QBMTPJ.L*
XAGE 4 1 XAGE 5 aswwei 1* xf:·. о
жоез СШЗБ42.1 5 ’ ’ * - ' * - YES1 ИВО . 1.
γ-.·;. i j 1..: 7-1». i
?* л· : ' ; ·!. : KKFISi Р4997А 1* „'С.гл1 ·;θ:.ι . .. 0 л,.. .:
zwia® MRRse, i ЙИТЭ95 д9ИШО,1 ZKFiiib ςΗΝ?Κ2 1» 1WR1 1
..., u« .. ; ίί:ι:: >·>τ·ι..' : : -;i in .λ .1
Табл. 2 необязательно исключает Ropporin-1A Q9HAT0 и/или WBP2NL Q6ICG8.1.
В некоторых случаях описанный в настоящем документе способ может быть использован для определения риска развития у субъекта рака, который экспрессирует один или более специфических ТАА. В других случаях способ используют для определения риска того, что у субъекта разовьется какое-либо онкологическое заболевание или конкретный тип рака. В некоторых случаях разные ТАА могут быть связаны с разными типами рака, но не каждый определенный тип рака будет экспрессировать одинаковую комбинацию ТАА. Поэтому в некоторых случаях HLAT, связывающийся с эпитопом, количественно определяется во множестве ТАА, в некоторых случаях по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или более ТАА. В общем, может быть использовано меньше ТАА, если ТАА экспрессированы в большей доле онкологических заболеваний или больных раком, или онкологических заболеваний выбранного типа. Может быть использовано больше ТАА, если ТАА экспрессированы в меньшей доле онкологических заболеваний или больных раком, или онкологических заболеваний выбранного типа. В некоторых случаях может быть использован набор ТАА, которые вместе экспрессированы или сверхэкспрессированы в минимальной доле онкологических заболеваний или больных раком, или онкологических заболеваний выбранного типа, например, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или более. Частоты экспрессии ТАА при различных онкологических заболеваниях можно определить из опубликованных данных и научных публикаций. ТАА, выбранный для использования в соответствии с настоящим изобретением, обычно представляет собой такой, который экспрессируется или сверхэкспрессируется в высокой доле онкологических заболеваний или онкологических заболеваний
- 14 046410 конкретного типа. В некоторых случаях один или более, или каждый из ТАА может быть экспрессирован или сверхэкспрессирован по меньшей мере в 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% онкологических заболеваний, или при онкологических заболеваниях, и/или в соответствующей субъекту человеческой популяции. Например, субъект может соответствовать этнической принадлежности, географическому положению, полу, возрасту, заболеванию, типу или стадии заболевания, генотипу, экспрессии одного или более биомаркеров или т. п., или любой их комбинации.
В некоторых случаях один или более, или каждый из ТАА представляет собой опухолеспецифический антиген (TSA) или раково-тестикулярный антиген (СТА). Обычно СТА не экспрессируются по окончании эмбрионального развития в здоровых клетках. У здоровых взрослых экспрессия СТА ограничена мужскими половыми клетками, которые не экспрессируют HLA и не могут презентировать антигены Т-клеткам. Следовательно, СТА считаются экспрессирующими неоантигенами, когда они экспрессируются в раковых клетках. Экспрессия СТА является (i) специфической для опухолевых клеток, (ii) чаще встречается в метастазах, чем в первичных опухолях, и (iii) сохраняется среди метастазов одного пациента (Gajewski ed. Targeted Therapeutics in Melanoma. Springer New York. 2012). В некоторых случаях способ включает в себя стадию выбора и/или идентификации подходящих ТАА или подходящего набора ТАА для использования в способе, раскрытом в настоящем документе.
Способы лечения
В некоторых случаях описанные в настоящем документе способы включают выбор, получение и/или назначение лечения рака субъекту. С использованием описанного в настоящем документе способа субъект может быть определен, как имеющий повышенный риск развития рака. Термин лечение, используемый в настоящем документе, означает любое действие, предпринимаемое для предотвращения или отсрочки возникновения рака, для облегчения одного или более симптомов или осложнений, для стимулирования или продления ремиссии, для отсрочки рецидива, повтора проявления или ухудшения, или иным образом для улучшения или стабилизации статуса заболевания или риска рака для субъекта. Обычно лечение представляет собой профилактическое лечение, предназначенное для отсрочки или предотвращения возникновения рака или любого симптома или осложнения, связанного с раком. Лечение может представлять собой иммунотерапию или вакцинацию.
Используемый в настоящем документе термин лечение может в некоторых случаях охватывать рекомендации, касающиеся поведения, воздействия окружающей среды или образа жизни субъекта, которые предназначены для снижения риска того, что у субъекта разовьется рак или какой-либо симптом, или осложнение, связанное с раком. Например, для субъекта, у которого определен повышенный риск развития меланомы, лечение может включать рекомендацию уменьшения воздействия на субъект ультрафиолетового излучения. Рекомендации могут, например, включать избегание искусственных источников ультрафиолетового излучения, уменьшение воздействия солнца или избегание пребывания на солнце в определенное время дня, применение солнцезащитного крема, обеспечивающего подходящую защиту, ношение защитной одежды, предотвращение ожогов и/или прием витамина D. В другом примере лечение может включать рекомендации, связанные с диетой, включая использование пищевых добавок (например, антиоксидантные добавки или повышенное потребление кальция), отказ от употребления наркотиков (в том числе снижение потребления табака и/или алкоголя), упражнения, или недопущение воздействия потенциальных канцерогенов, инфекционных агентов и/или радиации. В других случаях лечение может включать дополнительные или более частые проверки или обследования, предназначенные для ранней диагностики рака. В других случаях лечение может включать введение противовоспалительных препаратов, таких как аспирин или нестероидные противовоспалительные препараты, или отказ, или сокращение приема иммунодепрессантов. В некоторых случаях лечение может включать повышенное внимание к лечению других состояний, которые являются потенциальными факторами риска, таких как ожирение, или состояний, связанных с хроническим воспалением, таких как язвенный колит и болезнь Крона.
В других случаях лечение может быть любым известным терапевтическим или профилактическим лечением рака, таким как хирургическое вмешательство, химиотерапия, цитотоксическая или не цитотоксическая химиотерапия, лучевая терапия, таргетная терапия, гормональная терапия или введение целевых низкомолекулярных лекарств или антител, например моноклональных антител или костимулирующих антител, включая любое лечение рака, описанное в настоящем документе.
Лечение, которое предназначено для усиления иммунного ответа субъекта на раковые клетки, вероятно, будет особенно эффективным в предотвращении или задержке развития рака у субъекта, у которого определен повышенный риск рака, с использованием описанного в настоящем документе способа. Соответственно, в некоторых случаях лечение может представлять собой иммунотерапию или терапию посредством блокады контрольных точек или терапию посредством ингибиторов контрольных точек. В некоторых случаях способ включает введение субъекту одного или более пептидов, или одной или более полинуклеиновых кислот или векторов, кодирующих один или более пептидов, как описано ниже, которые содержат аминокислотную последовательность, представляющую собой (i) фрагмент антигена, связанного с экспрессией при раке; и (ii) Т-клеточный эпитоп, способный связываться с HLAT субъекта.
- 15 046410
Индивидуальные способы лечения
Согласно настоящему изобретению способность HLAT субъекта распознавать ТАА позволяет прогнозировать риск развития рака у субъекта. Отсюда следует, что риск развития рака у субъекта может быть снижен за счет стимулирования иммунных ответов субъекта с использованием пептидов, соответствующих эпитопам ТАА, которые распознаются HLAT субъекта.
Соответственно, в некоторых случаях изобретение относится к способу профилактического лечения рака, причем способ включает введение субъекту одного или более пептидов или одной или более полинуклеиновых кислот, или векторов, кодирующих один или более пептидов, которые содержат аминокислотную последовательность, то есть (i) фрагмент ТАА и (ii) Т-клеточный эпитоп, способный связываться с HLAT субъекта (т.е. PEPI3+). В некоторых случаях с использованием описанного в настоящем документе способа было определено, что субъект имеет повышенный риск развития рака.
Могут быть выбраны один или более подходящих ТАА и подходящих эпитопов в ТАА, которые связываются с HLAT субъекта, как описано в настоящем документе. В некоторых случаях способ может включать в себя стадию идентификации и/или выбора подходящих ТАА, эпитопов и/или пептидов. Обычно один или более из каждого ТАА будут представлять собой ТАА, который часто экспрессируется в раковых клетках.
В некоторых случаях определяют, что субъект имеет повышенный риск развития рака, при котором раковые клетки экспрессируют специфический ТАА. Это может иметь место, если ТАА содержит незначительное число эпитопов, которые представляют собой PEPI3+ для конкретного субъекта, или эпитопы ТАА распознаются незначительным числом HLAT субъекта. Лечение субъекта может включать в себя введение пептида, содержащего аминокислотную последовательность, которая (i) представляет собой фрагмент этого ТАА и (ii) содержит Т-клеточный эпитоп, способный связываться с одним или более HLAT субъекта.
В других случаях определяют, что субъект находится в группе повышенного риска развития одного или более отдельных типов рака, например, любого из типов рака, описанных в настоящем документе. Лечение субъекта может включать в себя введение пептида, содержащего аминокислотную последовательность, которая (i) представляет собой фрагмент ТАА, связанный с экспрессией при данном типе рака, и (ii) содержит Т-клеточный эпитоп, способный связываться с одним или более HLAT субъекта.
В некоторых случаях ТАА представляет собой тот, который распознается незначительным числом HLAT субъекта. Такое лечение усилит Т-клеточный ответ против ТАА. В других случаях ТАА может представлять собой тот, который распознается множеством HLAT. Субъект, как правило, уже способен создавать обширный Т-клеточный ответ против такого ТАА. Это может, в частности, помочь уничтожению раковых клеток, которые часто совместно экспрессируют целевой ТАА с другими ТАА, которые могут быть хуже распознаваемыми HLAT субъекта.
Пептиды могут быть разработанными или не встречающимися в природе. Фрагмент и/или пептид могут иметь длину до 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10 или 9 аминокислот. Обычно пептид может иметь длину от 15 или 20 до 30 или 35 аминокислот. В некоторых случаях аминокислотная последовательность, соответствующая фрагменту ТАА, фланкируется на N- и/или С-конце дополнительными аминокислотами, которые не составляют часть последовательной последовательности ТАА. В некоторых случаях последовательность фланкируется до 41 или 35, или 30, или 25, или 20, или 15, или 10, или 9, или 8, или 7, или 6, или 5, или 4, или 3, или 2, или 1 дополнительной аминокислотой на N и/или С-конце. В других случаях каждый пептид может состоять либо из фрагмента ТАА, либо из двух или более таких фрагментов, расположенных конец-в-конец (расположенных последовательно в пептиде конец-в-конец) или перекрывающихся в одном пептиде. В некоторых случаях способ лечения включает в себя введение субъекту одного или более пептидов или одной или более нуклеиновых кислот, или векторов, кодирующих один или более пептидов, которые содержат по меньшей мере 2, или 3, или 4, или 5, или 6, или 7, или 8, или 9, или 10, или 11, или 12, или 13, или 14, или 15, или 20, или 25, или 30, или 35, или 40, или 45, или 50 или более разных Т-клеточных эпитопов (PEPI), каждый из которых (i) содержится во фрагменте ТАА и (ii) способен связываться с HLAT субъекта. В некоторых случаях два или более PEPI содержатся во фрагментах по меньшей мере 2, или 3, или 4, или 5, или 6, или 7, или 8, или 9, или 10, или 11, или 12 или более различных ТАА. В некоторых случаях один или более, или каждый из ТАА представляет собой TSA и/или СТА. В некоторых случаях один или более фрагментов пептидов содержат аминокислотную последовательность, которая представляет собой Т-клеточный эпитоп, способный связываться по меньшей мере с тремя или по меньшей мере четырьмя аллелями HLA класса II субъекта. Такое лечение может вызывать как CD8+ Т-клеточный ответ, так и CD4+ Т-клеточный ответ у субъекта, получающего лечение.
В некоторых случаях способ лечения включает в себя введение субъекту одного или более пептидов или одной или более нуклеиновых кислот, или векторов, кодирующих один или более пептидов, или введение любой из фармацевтических композиций, как описано в любом из документов, РСТ/ЕР 2018/055231, РСТ/ЕР 2018/055232, РСТ/ЕР 2018/055230, ЕР 3370065 и ЕР 3369431. В некоторых конкретных случаях лечение предназначено для предотвращения рака молочной железы, рака яичников или колоректального рака, и включает в себя введение композиций, описанных в документах РСТ/ЕР
- 16 046410
2018/055230 и/или ЕР 3369431.
Используемый в настоящем документе термин полипептид относится к полноразмерному белку, части белка или пептиду, характеризуемому как цепь аминокислот. Термин пептид относится к короткому полипептиду. Термины фрагмент или фрагмент полипептида, используемые в настоящем документе, относятся к цепи аминокислот или аминокислотной последовательности, как правило, уменьшенной длины по сравнению с полипептидом или эталонным полипептидом и включающей, сверх общей части, аминокислотную последовательность, идентичную эталонному полипептиду. Такой фрагмент в соответствии с описанием может быть, при необходимости, включен в более крупный полипептид, часть которого он составляет. В некоторых случаях фрагмент может включать всю длину полипептида, например, когда весь полипептид, такой как пептид из 9 аминокислот, представляет собой единственный Тклеточный эпитоп. В некоторых случаях пептид или фрагмент полипептида может быть длиной между 7, или 8, или 9, или 10, или 11, или 12, или 13, или 14, или 15 и 10, или 11, или 12, или 13 или 14, или 15, или 20, или 25, или 30, или 35, или 40, или 45, или 50 аминокислот.
Фармацевтические композиции и схемы введения
В некоторых случаях изобретение относится к способу лечения, включающему в себя введение субъекту одного или более пептидов, как описано в настоящем документе. Один или более пептидов могут быть введены субъекту совместно или последовательно. Например, лечение может включать в себя введение ряда пептидов в течение определенного периода, например года. В некоторых случаях цикл лечения также может быть повторен для усиления иммунного ответа.
В дополнение к одному или более пептидам, фармацевтическая композиция для введения субъекту может содержать фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель, разбавитель, буфер, стабилизатор, консервант, адъювант или другие материалы, хорошо известные специалистам в данной области. Такие материалы предпочтительно являются нетоксичными и предпочтительно не влияют на фармацевтическую активность активного ингредиента (ингредиентов). Фармацевтический носитель или разбавитель может представлять собой, например, растворы, содержащие воду. Точный характер носителя или другого материала может зависеть от пути введения, например пероральный, внутривенный, кожный или подкожный, назальный, внутримышечный, внутрикожный и внутрибрюшинный пути.
Чтобы повысить иммуногенность композиции, фармакологические композиции могут содержать один или более адъювантов и/или цитокинов.
Подходящие адъюванты включают соль алюминия, такую как гидроксид алюминия или фосфат алюминия, но также могут представлять собой соль кальция, железа или цинка, или могут представлять собой нерастворимую суспензию ацилированного тирозина или ацилированных Сахаров, или могут представлять собой катионные или анионные производные сахаридов, полифосфазены, биоразлагаемые микросферы, монофосфориллипид A (MPL), производные липида А (например, с пониженной токсичностью), 3-О-деацилированный MPL [3D-MPL] (monophosphoryl lipid, монофосфорил липид), квил А, сапонин, QS21, неполный адъювант Фройнда (Difco Laboratories, Detroit, Мичиган), Мерк адъювант 65 (Merck and Company, Inc., Рэуэй, Нью-Джерси), AS-2 (Smith-Kline Beecham, Филадельфия, Пенсильвания), олигонуклеотиды CpG, биоадгезивы и мукоадгезивы, микрочастицы, липосомы, составы полиоксиэтиленового эфира, составы сложного эфира полиоксиэтилена, мурамиловые пептиды или соединения имидазохинолона (например, имиквамод и его гомологи). Человеческие иммуномодуляторы, подходящие для использования в качестве адъювантов в описании, включают цитокины, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 и т.д.), макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF, macrophage colony stimulating factor), фактор некроза опухоли (TNF, tumour necrosis factor), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF, granulocyte-macrophage colony stimulating factor), также могут быть использованы в качестве адъювантов.
В некоторых вариантах реализации композиции содержат адъювант, выбранный из группы, состоящей из Montanide ISA-51 (Seppic, Inc., Fairfield, NJ, Соединенные Штаты Америки), QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Lexington, Mass., Соединенные Штаты Америки), GM-CSF, циклофосамид, бацилла Кальметта-Герена (BCG, bacillus Calmette-Guerin), коринебактерии парвум, левамизол, азимезон, изопринизон, динитрохлорбензол (DNCB), гемоцианины лимфы улитки (KLH), адъювант Фройнда (полный и неполный), минеральные гели, гидроксид алюминия (квасцы), лизолецитин, плюроновые полиолы, полианионы, масляные эмульсии, динитрофенол, дифтерийный токсин (DT).
Примеры подходящих композиций полипептидных фрагментов и способов введения приведены в документе Esseku and Adeyeye (2011) и Van den Mooter G. (2006). Получение вакцин и иммунотерапевтических композиций в общем описано в Vaccine Design (The subunit and adjuvant approach (eds Powell MF & Newman MJ (1995) Plenum Press New York). Инкапсуляция в липосомы, которая также предусмотрена, описана Fullerton, патент США 4235877.
Способ лечения может включать в себя введение субъекту фармацевтической композиции, содержащей один или более пептидов, как описано в настоящем документе, в качестве активных ингредиентов. Используемый в настоящем документе термин активный ингредиент относится к пептиду, который предназначен для стимулирования иммунного ответа у субъекта, которому может быть введена фармацевтическая композиция. Пептид активного ингредиента может в некоторых случаях представлять
- 17 046410 собой пептидный продукт вакцины или иммунотерапевтической композиции, который продуцируется in vivo после введения субъекту. Для иммунотерапевтической композиции на основе ДНК или РНК пептид может продуцироваться in vivo клетками субъекта, которому вводится композиция. Для композиции на основе клеток полипептид может быть процессирован и/или презентирован клетками композиции, например, аутологичными дендритными клетками или антиген-презентирующими клетками, нагруженными полипептидом, или содержащими экспрессирующую конструкцию, кодирующую полипептид.
В некоторых вариантах реализации раскрытые в настоящем документе композиции могут быть получены в виде вакцины на основе нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации вакцина из нуклеиновой кислоты представляет собой ДНК-вакцину. В некоторых вариантах реализации ДНКвакцины или генные вакцины содержат плазмиду с промотором и соответствующими элементами регулирования транскрипции и трансляции, а также последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую один или более полипептидов согласно изобретению. В некоторых вариантах реализации плазмиды также включают последовательности для повышения, например, уровней экспрессии, внутриклеточного нацеливания или протеасомного процессинга. В некоторых вариантах реализации ДНК-вакцины содержат вирусный вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую один или более полипептидов согласно настоящему изобретению. В дополнительных аспектах раскрытые в настоящем документе композиции содержат одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих пептиды, которые, как определено, обладают иммунореактивностью с биологическим образцом. Например, в некоторых вариантах реализации композиции содержат одну или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более пептидов, содержащих фрагмент, который представляет собой Т-клеточный эпитоп, способный связываться по меньшей мере с тремя молекулами HLA класса I пациента. В некоторых вариантах реализации ДНК или генная вакцина также кодирует иммуномодулирующие молекулы для манипулирования результирующими иммунными ответами, такими как усиление эффективности вакцины, стимулирование иммунной системы или снижение иммуносупрессии. Стратегии повышения иммуногенности ДНК или генных вакцин включают кодирование ксеногенных версий антигенов, слияние антигенов с молекулами, которые активируют Т-клетки или стимулируют ассоциативное распознавание, прайминг с помощью ДНКвекторов с последующей повторной вакцинацией вирусным вектором и использование иммуномодулирующих молекул. В некоторых вариантах реализации ДНК-вакцину вводят с помощью иглы, генного пистолета, аэрозольного инжектора, пластыря, микроигл, абразивным способом, среди прочих форм. В некоторых формах ДНК-вакцина включена в липосомы или другие формы нанотел. В некоторых вариантах реализации ДНК-вакцина включает систему доставки, выбранную из группы, состоящей из агента трансфекции; протамина; липосомы протамина; частицы полисахарида; катионной наноэмульсии; катионного полимера; липосомы катионного полимера; катионных наночастиц; наночастиц катионных липидов и холестерина; катионного липида, холестерина и наночастицы ПЭГ (polyethyleneglycol, полиэтиленгликоль); дендримерной наночастицы. В некоторых вариантах реализации ДНК-вакцины вводят путем ингаляции или приема внутрь. В некоторых вариантах реализации ДНК-вакцину вводят в кровь, тимус, поджелудочную железу, кожу, мышцы, опухоль или другие участки. В некоторых вариантах реализации раскрытые в настоящем документе композиции получают в виде вакцины на основе РНК. В некоторых вариантах реализации РНК представляет собой нереплицирующуюся мРНК или самоамплифицирующуюся РНК вирусного происхождения. В некоторых вариантах реализации нереплицирующаяся мРНК кодирует описанные в настоящем документе пептиды и содержит 5'и 3' нетранслируемые области (UTR, untranslated regions). В некоторых вариантах реализации самоамплифицирующаяся РНК вирусного происхождения кодирует не только пептиды, раскрытые в настоящем документе, но также вирусный репликационный аппарат, который обеспечивает внутриклеточную амплификацию РНК и обильную экспрессию белка. В некоторых вариантах реализации РНК вводят непосредственно человеку. В некоторых вариантах реализации РНК химически синтезируется или транскрибируется in vitro. В некоторых вариантах реализации мРНК продуцируется из линейной ДНК-матрицы с использованием РНК-полимеразы фага Т7, Т3 или Sp6, и полученный продукт содержит открытую рамку считывания, которая кодирует описанные в настоящем документе пептиды, фланкируя UTR, 5'-кэп, и поли(А) хвост. В некоторых вариантах реализации различные варианты 5'-кэпов добавляют во время или после реакции транскрипции с использованием копирующего фермента вируса вакцины или путем включения синтетических кэпов или антиреверсных аналогов кэпа. В некоторых вариантах реализации оптимальная длина поли(А)-хвоста добавляется к мРНК либо непосредственно из кодирующей матрицы ДНК, либо с использованием поли(А) полимеразы. РНК кодирует один или более пептидов, содержащих фрагмент, который представляет собой Т-клеточный эпитоп, способный связываться по меньшей мере с тремя молекулами HLA класса I пациента. В некоторых вариантах реализации РНК включает сигналы для повышения стабильности и трансляции. В некоторых вариантах реализации РНК также включает неприродные нуклеотиды для увеличения периода полувыведения или модифицированные нуклеозиды для изменения иммуностимулирующего профиля. В некоторых вариантах реализации РНК вводят с помощью иглы, генного пистолета, аэрозольного инжектора, пластыря, микроигл, абразивным способом, среди прочих форм. В некоторых формах РНК-вакцина включена в липосомы или другие формы нанотел, которые способствуют погло
- 18 046410 щению РНК клетками и защищают ее от деградации. В некоторых вариантах реализации РНК-вакцина включает систему доставки, выбранную из группы, состоящей из агента трансфекции; протамина; липосомы протамина; частиц полисахарида; катионной наноэмульсии; катионного полимера; липосомы катионного полимера; катионных наночастиц; наночастиц катионных липидов и холестерина; катионного липида, холестерина и наночастиц PEG; дендримерных наночастиц; и/или депротеинизированной мРНК; депротеинизированной мРНК с электропорацией in vivo; мРНК в комплексе с протамином; мРНК, связанной с положительно заряженной катионной наноэмульсией масло-в-воде; мРНК, связанной с химически модифицированным дендримером и комплексной с полиэтиленгликоль (ПЭГ)-липидом; мРНК в комплексе с протамином в наночастице ПЭГ-липида; мРНК, связанной с катионным полимером, таким как полиэтиленимин (PEI); мРНК, связанной с катионным полимером, таким как PEI, и липидным компонентом; мРНК, связанная с частицей или гелем полисахарида (например, хитозана); мРНК в катионных липидных наночастицах (например, липидах 1,2-диолеоилокси-3-триметиламмонийпропана (DOTAP) или диолеоилфосфатидилэтаноламина (DOPE)); мРНК в комплексе с катионными липидами и холестерином; или мРНК в комплексе с катионными липидами, холестерином и ПЭГ-липидом. В некоторых вариантах реализации РНК-вакцины вводят путем ингаляции или приема внутрь. В некоторых вариантах реализации РНК вводят в кровь, тимус, поджелудочную железу, кожу, мышцу, опухоль или другие участки и/или внутрикожно, внутримышечно, подкожно, интраназально, интранодально, внутривенно, внутрь селезенки, внутрь опухоли или другим путем доставки.
Полинуклеотидные или олигонуклеотидные компоненты могут быть депротеинизированными нуклеотидными последовательностями или находиться в комбинации с катионными липидами, полимерами или системами нацеливания. Они могут быть доставлены любым доступным способом. Например, полинуклеотид или олигонуклеотид вводят с помощью иглы, предпочтительно внутрикожно, подкожно или внутримышечно.
В качестве альтернативы, полинуклеотид или олигонуклеотид доставляется непосредственно через кожу с использованием механизма доставки, такого как опосредованный частицами перенос гена. Полинуклеотид или олигонуклеотид может быть введен местно на кожу или на поверхности слизистой оболочки, например, путем интраназального, перорального или интраректального введения.
Поглощение полинуклеотидных или олигонуклеотидных конструкций может быть усилено несколькими известными методами трансфекции, например такими, которые включают использование агентов трансфекции. Примеры этих агентов включают катионные агенты, например, фосфат кальция и DEAE-декстран, и липофектанты, например, липофектам и трансфектам. Дозировка вводимого полинуклеотида или олигонуклеотида может быть изменена.
Введение обычно осуществляют в профилактически эффективном количестве или терапевтически эффективном количестве (в зависимости от случая, хотя профилактика может считаться терапией), этого достаточно, чтобы привести к клиническому ответу или продемонстрировать клиническую пользу для человека, например эффективное количество для предотвращения или отсрочки начала заболевания или состояния, для облегчения одного или более симптомов, для стимулирования или продления ремиссии или для отсрочки рецидива или повторного проявления. В некоторых случаях способы лечения в соответствии с настоящим изобретением могут быть выполнены для профилактики рецидива рака или метастазирования у людей с излеченным первичным онкологическим заболеванием.
Доза может быть определена по различным параметрам, особенно в зависимости от используемого вещества; возраста, веса и состояния пациента, проходящего терапию; способа введения; и необходимого режима. Количество антигена в каждой дозе выбирают как количество, которое вызывает иммунный ответ. Врач сможет определить требуемый способ введения и дозировку для каждого конкретного человека. Доза может быть предоставлена в виде разовой дозы или может быть предоставлена в виде множеств доз, например, принимаемых через равные промежутки времени, например, 2, 3 или 4 дозы, вводимые каждый час. Обычно пептиды, полинуклеотиды или олигонуклеотиды вводят в пределах от 1 пг до 1 мг, более типично от 1 до 10 пг для доставки, опосредованной частицами, и от 1 пг до 1 мг, чаще 1-100 пг, чаще 5-50 пг для других путей. Обычно ожидается, что каждая доза будет содержать 0,01-3 мг антигена. Оптимальное количество для конкретной вакцины может быть установлено исследованиями, включающими наблюдение иммунных ответов у субъектов.
Примеры упомянутых выше методик и протоколов приведены в документе Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins. Пути введения включают, помимо прочего, интраназальный, пероральный, подкожный, внутрикожный и внутримышечный. Обычно введение выполняют подкожно. Подкожное введение может представлять собой, например, инъекцию в брюшную полость, боковые и передние стороны плеча или бедра, лопатку спины или верхнюю вентродорсальную ягодичную область.
Специалисту в данной области будет понятно, что композицию можно также вводить в одной или более дозах, а также другими путями введения. Например, такие другие пути включают внутрикожный, внутривенный, внутрисосудистый, внутриартериальный, внутрибрюшинный, интратекальный, интратрахеальный, интракардиальный, внутрилобулярный, интрамедуллярный, внутрилегочный и интравагинальный. В зависимости от желаемой продолжительности терапии, композиции в соответствии с на
- 19 046410 стоящим изобретением можно вводить один или более раз, а также периодически, например, ежемесячно в течение нескольких месяцев или лет и в различных дозировках.
Способы лечения в соответствии с настоящим изобретением могут выполняться отдельно или в комбинации с другими фармакологическими композициями или видами лечения, например изменениями поведения или образа жизни, химиотерапией, иммунотерапией и/или вакциной. Другие терапевтические композиции или способы лечения могут, например, представлять собой одну или более из тех, что описаны в настоящем документе, и могут вводиться либо одновременно, либо последовательно (до или после) с композицией или лечением согласно изобретению.
В некоторых случаях лечение может проводиться в сочетании с хирургией, химиотерапией, цитотоксической или не цитотоксической химиотерапией, лучевой терапией, таргетной терапией, гормональной терапией или введением целевых низкомолекулярных препаратов или антител, например, моноклональных антител или костимулирующих антител. Было продемонстрировано, что химиотерапия повышает чувствительность опухолей к уничтожению опухолеспецифических цитотоксических Т-клеток, стимулированных вакцинацией (Ramakrishnan et al. J Clin Invest. 2010; 120 (4): 1111-1124). Примеры химиотерапевтических агентов включают алкилирующие агенты, включающие азотистые иприты, такие как мехлорэтамин (HN2), циклофосфамид, ифосфамид, мелфалан (L-сарколизин) и хлорамбуцил; антрациклины; эпотилоны; нитрозомочевины, такие как кармустин (BCNU), ломустин (CCNU), семустин (метилCCNU) и стрептозоцин (стрептозотоцин); триазены, такие как декарбазин (DTIC; диметилтриазеноимидазолкарбоксамид; этиленимины/метилмеламины, такие как гексаметилмеламин, тиотепа; алкилсульфонаты, такие как бусульфан; антиметаболиты, в том числе аналоги фолиевой кислоты, такие как метотрексат (аметоптерин), алкилирующие агенты,антиметаболиты, аналоги пиримедина, такие как фторурацил (5-фторурацил; 5-FU), флоксуридин (фтордезоксиуридин; FUdR) и цитарабин (цитозинарабинозид); аналоги пурина и родственные ингибиторы, такие как меркаптопурин (6-меркаптопурин; 6-МП), тиогуанин (6-тиогуанин; ТГ) и пентостатин (2'-дезоксикоформицин); эпиподофилотоксины; ферменты, такие как Lаспарагиназа; модификаторы биологического ответа, такие как IFNa, IL-2, G-CSF и GM-CSF; координационные комплексы платины, такие как цисплатин (цис-DDP), оксалиплатин и карбоплатин; антрацендионы, такие как митоксантрон и антрациклин, замещенная мочевина, такая как гидроксимочевина, производные метилгидразина, включая прокарбазин (N-метилгидразин, MIH) и прокарбазин; адренокортикальные супрессоры, такие как митотан (о, r'-DDD) и аминоглутетимид; таксол и аналоги/производные; гормоны/гормональная терапия и агонисты/антагонисты, включая антагонисты адренокортикостероидов, такие как преднизон и его эквиваленты, дексаметазон и аминоглутетимид, прогестин, такой как гидроксипрогестерона капроат, медроксипрогестерона ацетат и мегестрола ацетат, эстроген, такой как диэтилстилбэстроген, и эквиваленты этинилэстрада, антиэстроген, такой как тамоксифен, андрогены, включая пропионат тестостерона и флуоксиместерон/эквиваленты, антиандрогены, такие как флутамид, аналоги гонадотропин-рилизинг гормона и лейпролид, и нестероидные антиандрогены, такие как флутамид; натуральные продукты, в том числе алкалоиды барвинка, такие как винбластин (VLB) и винкристин, эпиподофиллотоксины, такие как этопозид и тенипозид, антибиотики, такие как дактиномицин (актиномицин D), даунорубицин (дауномицин; рубидомицин), доксорубицин блеомицин, пликамицин (митрамицин) и митомицин (митомицин С), ферменты, такие как L-аспарагиназа, и модификаторы биологического ответа, такие как альфеномы интерферона.
Системы
Изобретение обеспечивает систему. Система может содержать модуль хранения, выполненный с возможностью хранения данных, содержащих генотип HLA класса I субъекта и аминокислотные последовательности ТАА; Система может содержать вычислительный модуль, выполненный с возможностью количественной оценки HLAT субъекта, способных связываться с Т-клеточными эпитопами в аминокислотной последовательности ТАА, причем каждый HLA HLAT способен связываться с тем же Тклеточным эпитопом. Система может содержать модуль для приема по меньшей мере одного образца по меньшей мере от одного субъекта. Система может содержать модуль генотипирования HLA для определения генотипа HLA класса I и/или класса II субъекта. Модуль для хранения может быть выполнен с возможностью хранения данных, выводимых из модуля генотипирования. Модуль генотипирования HLA может получать биологический образец, полученный от субъекта, и определять генотип HLA класса I и/или класса II. Образец обычно содержит исследуемую ДНК. Образец может представлять собой, например, образец крови, сыворотки, плазмы, слюны, мочи, выдоха, образца клеток или ткани. Система может дополнительно содержать модуль вывода, выполненный с возможностью отображения показателей риска того, что у субъекта разовьется рак, и/или рекомендованное лечение для субъекта.
Дополнительные варианты реализации изобретения
1. Способ лечения субъекта-человека с риском развития рака, включающий в себя:
a) количественное определение триплетов HLA (HLAT) субъекта, которые способны связываться с Т-клеточными эпитопами в аминокислотной последовательности антигенов, ассоциированных с опухолью (ТАА), причем каждый HLA из HLAT способен связываться с тем же Т-клеточным эпитопом;
b) определение риска развития рака у субъекта, причем применительно к ТАА меньшее количество HLAT, способных связываться с Т-клеточными эпитопами ТАА, соответствует более высокому риску
- 20 046410 развития рака у субъекта; и
с) введение субъекту пептида или полинуклеиновой кислоты, или вектора, кодирующего пептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая:
i) представляет собой фрагмент ТАА и ii ) содержит Т-клеточный эпитоп, способный связываться с HLAT субъекта.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что фрагмент ТАА фланкирован на N- и/или С-конце дополнительными аминокислотами, которые не составляют часть последовательности ТАА.
3. Способ по любому из пп.1, 2, отличающийся тем, что рак выбран из меланомы, рака легких, почечно-клеточного рака, колоректального рака, рака мочевого пузыря, глиомы, рака головы и шеи, рака яичников, немеланомного рака кожи, рак простаты, рак почки, рака желудка, рака печени, рака шейки матки, рака пищевода, неходжкинской лимфомы, лейкемии, рака поджелудочной железы, рака тела матки, рака губы, рака полости рта, рака щитовидной железы, рака мозга, рака нервной системы, рака желчного пузыря, рака гортани, рака глотки, миеломы, рака носоглотки, лимфомы Ходжкина, тестикулярного рака, рака молочной железы и саркомы Капоши.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что ТАА выбирают из любого из перечисленных в табл. 2 или табл. 11.
5. Способ лечения рака у индивидуума, нуждающегося в лечении рака, включающий в себя: определение того, подвержен ли человек более высокому риску развития рака, путем выполнения количественного анализа биологического образца от индивидуума для определения триплетов HLA (HLAT) субъекта, которые способны связываться с Т-клеточными эпитопами в аминокислотной последовательности антигенов, ассоциированных с опухолью (ТАА), причем каждый HLA из HLAT способен связываться с тем же Т-клеточным эпитопом; и если человек имеет меньшее количество HLAT, способных связываться с Т-клеточными эпитопами ТАА, чем пороговое значение, полученное для группы контрольных лиц, то ему назначают лечение рака.
6. Способ по п.5, дополнительно включающий в себя получение биологического образца от индивидуума.
7. Способ по п.5, отличающийся тем, что рак выбран из меланомы, рака легких, почечноклеточного рака, колоректального рака, рака мочевого пузыря, глиомы, рака головы и шеи, рака яичников, немеланомного рака кожи, рак простаты, рак почки, рака желудка, рака печени, рака шейки матки, рака пищевода, неходжкинской лимфомы, лейкемии, рака поджелудочной железы, рака тела матки, рака губы, рака полости рта, рака щитовидной железы, рака мозга, рака нервной системы, рака желчного пузыря, рака гортани, рака глотки, миеломы, рака носоглотки, лимфомы Ходжкина, тестикулярного рака, рака молочной железы и саркомы Капоши.
8. Способ по п.5, отличающийся тем, что лечение рака включает в себя введение человеку пептида, полинуклеиновой кислоты или вектора, кодирующего пептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая:
(i) представляет собой фрагмент ТАА и (ii) содержит Т-клеточный эпитоп, способный связываться с HLAT человека.
9. Способ по п.8, отличающийся тем, что фрагмент ТАА фланкирован на N- и/или С-конце дополнительными аминокислотами, которые не составляют часть последовательности ТАА.
10. Способ по п.5, отличающийся тем, что ТАА выбирают из любого из перечисленных в табл. 2 или 11.
11. Способ по п.5, отличающийся тем, что биологический образец включает кровь, сыворотку, плазму, слюну, мочу, выдох, клетку или ткань.
12. Способ лечения рака у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий в себя: назначение лечения рака человеку, имеющему меньшее количество триплетов HLA (HLAT), способных связываться с Т-клеточными эпитопами ассоциированных с опухолью (ТАА) антигенов, чем пороговое значение, полученное для когорты контрольных лиц.
13. Способ по п.12, отличающийся тем, что лечение рака включает в себя введение человеку пептида, полинуклеиновой кислоты или вектора, кодирующего пептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая (i) представляет собой фрагмент ТАА и (ii) содержит Т-клеточный эпитоп, способный связываться с HLAT индивидуума; причем необязательно фрагмент ТАА фланкирован на N- и/или С-конце дополнительными аминокислотами, которые не составляют часть последовательности ТАА.
14. Способ по п.12, отличающийся тем, что ТАА выбирают из любого из перечисленных в табл. 2 или табл. 11.
15. Способ по п.12, отличающийся тем, что рак выбран из меланомы, рака легких, почечноклеточного рака, колоректального рака, рака мочевого пузыря, глиомы, рака головы и шеи, рака яичников, немеланомного рака кожи, рак простаты, рак почки, рака желудка, рака печени, рака шейки матки, рака пищевода, неходжкинской лимфомы, лейкемии, рака поджелудочной железы, рака тела матки, рака губы, рака полости рта, рака щитовидной железы, рака мозга, рака нервной системы, рака желчного пу
- 21 046410 зыря, рака гортани, рака глотки, миеломы, рака носоглотки, лимфомы Ходжкина, тестикулярного рака, рака молочной железы и саркомы Капоши.
16. Система для определения риска развития рака у человека, содержащая:
(i) модуль хранения, выполненный с возможностью хранения данных, содержащих генотип HLA класса I субъекта и аминокислотные последовательности ТАА;
(ii) вычислительный модуль, выполненный с возможностью количественной оценки HLAT субъекта, способных связываться с Т-клеточными эпитопами в аминокислотной последовательности ТАА, причем каждый HLA из HLAT способен связываться с тем же Т-клеточным эпитопом; и (iii) модуль вывода, выполненный с возможностью отображения показателей риска того, что у субъекта разовьется рак, и/или рекомендованного лечения для субъекта.
Примеры
Пример 1. Процесс и валидация прогнозирования связывания HLA-эпитопа
Прогнозируемое связывание между конкретным HLA и эпитопами (9-мерные пептиды) было основано на инструменте Immune Epitope Database (База данных по иммунным эпитопам) для прогнозирования эпитопов (www.iedb.org).
Процесс прогнозирования связывания HLA I-эпитопа был подтвержден путем сравнения с парами эпитопов HLA I класса, определенными в лабораторных экспериментах. Был составлен набор данных из пар HLA I-эпитоп, представленных в авторитетных публикациях или общедоступных иммунологических базах данных.
Была определена степень согласования с экспериментально определенным набором данных (Табл. 3). Связывание пар HLA I-эпитоп в наборе данных было правильно спрогнозировано с вероятностью 93%. По совпадению отсутствие связывания пар HLA I-эпитоп также было правильно спрогнозировано с вероятностью 93%.
Таблица 3. Аналитическая специфичность и чувствительность процесса прогнозирования связывания HLA-эпитопа.
Пары HLA-эпитоп Истинные эпитопы (п=327) (соответствие связывания) Ложные эпитопы (п= 100) (соответствие отсутствия связывания)
ВИЧ 91 %(32) 82 % (14)
Вирусный 100% (35) 100% (11)
Опухоль 90 % (172) 94 % (32)
Прочие (грибки, бактерии, и т. п.) 100% (65) 95 % (36)
Всего 93 % (304) 93 % (93)
Также была определена точность прогнозирования множественного связывания HLA с эпитопами (Табл. 4). На основании аналитической специфичности и чувствительности с использованием вероятности 93% как для истинно положительного, так и для истинно отрицательного прогноза, и вероятности 7% (=100%-93%) для ложноположительного и ложноотрицательного прогноза, можно вычислить вероятность существования множественного связывания HLA с эпитопом у человека. Вероятность множественного связывания HLA с эпитопом показывает взаимосвязь между количеством HLA, связывающих эпитоп, и ожидаемым минимальным количеством реального связывания. Согласно определению PEPI, три - это ожидаемое минимальное количество HLA для связывания эпитопа (жирный шрифт).
Таблица 4. Точность прогнозирования множественных связываний HLA с эпитопами
Ожидаемое минимальное количество реальных связываний HLA Прогнозируемое количество связываний HLA с эпитопом
0 1 2 3 4 5 6
1 35 % 95% 100% 100 % 100% 100 % 100 %
2 6% 29% 90 % 99% 100% 100 % 100 %
3 1 % 4 % 22 % 84% 98 % 100 % 100 %
4 0% 0 % 2 % 16% 78 % 96% 99%
5 0% 0 % 0% 1 % 10 % 71 % 94%
6 0% 0 % 0% 0 % 0% 5 % 65%
Подтвержденный процесс прогнозирования связывания HLA-эпитопа, использованный для определения всех связывающихся пар HLA-эпитоп, описан в примерах ниже.
- 22 046410
Пример 2. Презентирование эпитопа множественными HLA прогнозирует ответ цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL)
В этом исследовании изучали, является ли презентирование одного или более эпитопов полипептидного антигена одной или более молекулами HLA класса I индивидуума прогнозирующим для ответа CTL.
Исследование проводили путем ретроспективного анализа шести клинических испытаний, проведенных на 71 онкологических и 9 ВИЧ-инфицированных пациентах (табл. 5). Пациенты из этих исследований получали лечение вакциной против HPV, тремя различными специфическими вакцинами против рака NY-ESO-1, одной вакциной против HIV-1 и специфическим моноклональным антителом CTLA-4 (ипилимумаб), которое, как было показано, реактивировало CTL против антигена NY-ESO-1 у больных меланомой. Во всех этих клинических испытаниях измеряли антиген-специфические CD8+ CTL ответы (иммуногенность) у исследуемых субъектов после вакцинации. В некоторых случаях сообщалось о корреляции между ответами CTL и клиническими ответами. Ни один пациент не был исключен из ретроспективного исследования по какой-либо причине, кроме доступности данных. 157 наборов данных пациентов (табл. 5) были рандомизированы с помощью стандартного генератора случайных чисел для создания двух независимых когорт для обучающих и оценочных исследований. В некоторых случаях когорты содержали множество наборов данных от одного и того же пациента, что привело к обучающей когорте из 76 наборов данных от 48 пациентов и когорте тестирования/валидации из 81 набора данных от 51 пациента.
Таблица 5. Сводка наборов данных о пациентах
Клиничес кие испытани я Иммуноте рапия Целевой антиген Заболева ние Кол. пациентов* Кол. наборов данных (кол. антигенов х кол пациентов) Иммуноанализ, проведенный в ходе клинических испытаний ** Метод генотипиро вания HLA
1 VGX-3100 HPV16- Е6 HPV16- Е7 HPV18- Е6 HPV18- Е7 HPV16/1 8 Рак шейки матки 17/18 5х 17 IFN-γ ELISPOT SBT высокого разрешен ия
2 Вакцина HIVIS HIV-1 Gag HIV-1 RT СПИД 9/12 2x9 IFN-γ ELISPOT SSO низкогосреднего разрешен ия
3 rNY-ESO- 1 NY- ESO-1 Рак молочной железы и яичников, меланом а и саркома 18/18 1 х 18 In vitro и Ex vivo IFN-γ ELISPOT SBT высокого разрешен ия
4 Ипилимум аб NY- ESO-1 Метастат ическая меланом а 19/20 1 х 19 ICS после стимулировани я Т-клеток Типирован ие с низким и средним разрешен ием, SSP геномной
- 23 046410
ДНК, секвениро вание с высоким разрешен ием
5 NY-ESO- 1f NY- ESO-1 (91-110) Рак пищевод а, немелкок неточный рак легких и желудка 10/10 1 х 10 ICS после стимулировани я Т-клеток Исследова ние SSO и SSP геномной ДНК
6 Перекрыв ающиеся пептиды NY-ESO-1 NY- ESO- 1 (79-173) Рак пищевод а и легких, злокачест венная меланом а 7/9 1x7 ICS после стимулировани я Т-клеток Исследова ние SSO и SSP геномной ДНК
Всего 6 7 80 157
Представленные CD8+ Т-клеточные ответы обучающего набора данных сравнивали с профилем рестрикции HLA класса I эпитопов (9-мерных) вакцинных антигенов. Последовательности антигенов и генотип HLA класса I каждого пациента были получены из общедоступных баз данных последовательностей белков или из авторитетных публикаций, а процесс прогнозирования связывания HLA I-эпитопа был слепым к данным клинического CD8+ Т-клеточного ответа пациентов, причем CD8+ Т-клетки пред ставляют собой IFN-γ продуцирующие CTL, специфические для вакцинных пептидов (9 меров). Было определено количество эпитопов от каждого антигена, которые, по прогнозам, связываются по меньшей мере с 1 (PEPI1+), или по меньшей мере с 2 (PEPI2+), или по меньшей мере с 3 (PEPI3+), или по меньшей мере с 4 (PEPI4+), или по меньшей мере с 5 (PEPI5+), или всеми 6 (PEPI6) молекулами HLA класса I каждого пациента, и количество связанных HLA использовали в качестве классификаторов для представленных ответов CTL. Частота истинно положительных (чувствительность) и истинно отрицательных (специфичность) определялась из обучающего набора данных для каждого классификатора (количество связанных HLA) отдельно.
Для каждого классификатора выполняли анализ ROC. На ROC-кривой был построен график частоты истинноположительных результатов (чувствительность) как функция частоты ложноположительных результатов (1-специфичность) для различных точек отсечки (Фиг. 1). Каждая точка на ROC-кривой представляет пару чувствительность/специфичность, соответствующую определенному пороговому значению для принятия решения (количество эпитопов (PEPI)). Площадь под ROC-кривой (AUC) является мерой того, насколько хорошо классификатор может различать две диагностические группы (CTLреспондер или не респондер).
Анализ неожиданно показал, что прогнозируемое презентирование эпитопа множеством HLA класса I субъекта (PEPI2+, PEPI3+, PEPI4+, PEPI5+ или PEPI6) в каждом случае было лучшим предиктором CD8+ Т-клеточного ответа или ответа CTL, чем презентирование эпитопа только одним или более HLA класса I (PEPI1+, AUC=0,48, табл. 6).
Таблица 6. Определение диагностического значения биомаркера PEPI с помощью анализа ROC-кривой
Ответ CTL индивидуума лучше всего прогнозировать, рассматривая эпитопы антигена, которые могут быть представлены по меньшей мере 3 аллелями HLA класса I индивидуума (PEPI3+, AUC=0,65,
- 24 046410 табл. 7). Пороговое количество PEPI3+ (количество антиген-специфических эпитопов, презентированных 3 или более HLA индивидуума), которое наилучшим образом прогнозировало положительный ответ CTL, было равно 1 (табл. 7). Другими словами, по меньшей мере один эпитоп, производный антигена, презентирован по меньшей мере 3 HLA класса I субъекта (>1 PEPI3+), тогда антиген может запускать по меньшей мере один клон CTL, и субъект является вероятным CTL-респондером. Использование порогового значения >1 PEPI3+ для прогнозирования вероятных CTL-респондеров (тест >1 PEPI3+) обеспечило 76% истинноположительных результатов (диагностическая чувствительность) (табл. 7).
Таблица 7. Определение порогового значения >1 PEPI3+ для прогнозирования вероятных
В ретроспективном анализе тестовую когорту из 81 набора данных от 51 пациента использовали для валидации порогового значения >1 PEPI3+ для прогнозирования антиген-специфического CD8+ Тклеточного ответа или ответа CTL. Для каждого набора данных в тестовой когорте определяли, было ли достигнуто пороговое значение >1 PEPI3+ (по меньшей мере один антиген-производный эпитоп, презентированный по меньшей мере тремя HLA класса I индивидуума). Результаты сравнивали с экспериментально определенными ответами Т-клеток CD8+ (ответами CTL), полученными в ходе клинических испытаний (табл. 8).
Ретроспективная валидация показала, что пептид PEPI3+ стимулирует CD8+ Т-клеточный ответ (CTL-ответ) у человека с вероятностью 84%. 84% - это то же значение, которое было определено при аналитической валидации прогнозирования PEPI3+ эпитопов, которые связываются по меньшей мере с 3 HLA индивидуума (табл. 4). Эти данные представляют убедительные доказательства того, что иммунные ответы у людей стимулируются PEPI.
Таблица 8. Диагностические рабочие характеристики теста >1 PEPI3+ (n=81)
Рабочие характеристики Описание Результат
Положительная прогностическая ценность (PPV) 100 % [А/(А + В)] Вероятность того, что у человека, который соответствует пороговому значению > 1 PEPI3+, будут иметься антиген- специфические ответы CTL после лечения посредством иммунотерапии. 84 %
- 25 046410
Чувствительность 100 % [А/(А+С)] Доля субъектов с антигенспецифическими ответами CTL после лечения посредством иммунотерапии, которые соответствуют пороговому значению > 1 PEPI3+. 75 %
Специфичность 100 %[D/(B + D)] Доля субъектов с антигенспецифическими ответами CTL после лечения посредством иммунотерапии, которые соответствуют пороговому значению > 1 PEPI3+. 55 %
Отрицательное прогностическое значение (NPV) 100 %[D/(C +D)J Вероятность того, что у человека, который не соответствует пороговому значению > 1 PEPI3+, не будут иметься антиген- специфические ответы CTL после лечения посредством иммунотерапии. 42 %
Общий процент согласования (ОРА) I00 %[(A + D)/ N] Процент прогнозов, основанных на пороговом значении > 1 PEPI3+, которые соответствуют экспериментально определенному результату, положительному или 70 %
| | отрицательному.
Точное значение Фишера (р) 0,01
Анализ ROC-кривой определил диагностическую точность с использованием количества PEPI3+ в качестве пороговых значений (фиг. 2). Значение AUC=0,73. Для анализа ROC-кривой AUC от 0,7 до 0,8 обычно считается справедливым диагностическим значением. Количество PEPI3+ по меньшей мере 1 (>1 PEPI3+) лучше всего прогнозировало ответ CTL в тестовом наборе данных (табл. 9). Этот результат подтвердил пороговое значение, определенное во время обучения (табл. 6).
Таблица 9. Подтверждение порогового значения >1 PEPI3+ для прогнозирования вероятных CTL-респондеров в тестовом/валидационном наборе данных
Количество PEPI3+
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2
Чувствительность: 0,7 5 0,5 2 0,2 6 0,2 3 0,1 5 0,1 3 0,0 8 0,0 5 0 0 0 0
1-специфичность 0,4 5 0,1 5 0,0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 26 046410
Пример 4. Клиническая валидация порогового значения > 1 PEPI3+ в качестве нового биомаркера для теста PEPI
Образец вакцины на основе биомаркера PEPI3+ был впервые протестирован в клиническом испытании фазы I у пациентов с метастатическим колоректальным раком (mCRC, metastatic colorectal cancer) в клиническом испытании фазы I/II OBERTO (NCT03391232). В этом исследовании мы оценили безопасность, переносимость и иммуногенность однократной или многократной дозы PolyPEPI1018 в качестве дополнения к поддерживающей терапии пациентов с mCRC. PolyPEPI1018 представляет собой пептидную вакцину, содержащую 12 уникальных эпитопов, полученных из 7 консервативных TSA, часто экспрессируемых в mCRC (WO 2018158455 А1). Эти эпитопы были разработаны для связывания по меньшей мере с тремя аутологичными аллелями HLA, которые с большей вероятностью вызывают ответы Тклеток, чем эпитопы, презентированные одним HLA (см. примеры 2 и 3). Пациенты с mCRC в наборе первой линии получали вакцину (доза: 0,2 мг/пептид) сразу после перехода на поддерживающую терапию с помощью фторпиримидина и бевацизумаба. Вакцино-специфические Т-клеточные ответы были сначала спрогнозированы путем идентификации PEPI3+ in silico (компьютерное моделирование) (с использованием полного генотипа HLA пациента и частоты экспрессии антигена, специфической для CRC), а затем измерены с помощью ELISpot после одного цикла вакцинации (часть I фазы испытания).
Семьдесят наборов данных от 10 пациентов (когорта фазы 1 и набор данных испытания OBERTO) использовались для проспективного подтверждения того, что биомаркер PEPI3+ прогнозирует антигенспецифические ответы CTL. Для каждого набора данных прогнозируемые PEPI3+ определяли in silico и сравнивали с вакцино-специфическими иммунными ответами, измеренными с помощью анализа ELISPOT в крови пациентов. Диагностические характеристики (положительное прогностическое значение, отрицательное прогностическое значение, общий процент согласования), определенные таким образом, затем сравнивали с результатами ретроспективной валидации, описанными в примере 3. Общий процент совпадения составил 64% с высоким прогностическим значением положительного результата 79%, что соответствует вероятности 79% того, что пациент с прогнозируемым PEPI3+ будет иметь специфический иммунный CD8 Т-клеточный ответ против анализируемого антигена. Данные клинических испытаний в значительной степени коррелировали с результатами ретроспективных испытаний (р=0,01) и представляют доказательства для вычисления PEPI3+ при тесте PEPI для прогнозирования антигенспецифических Т-клеточных ответов на основе полного HLA-генотипа пациентов (табл. 10).
Таблица 10. Проспективная валидация 1 теста >PEPI3+ и PEPI
Параметр Определение Ретроспекти вная валидация η = 81* Проспекти вная валидация (OBERTO) η = 70**
PPV Положительное прогнозируемое значение Вероятность того, что человек с положительным результатом теста PEPI будет иметь антиген- специфические Т-клеточные ответы 84 % 79 %
NPV Отрицательное прогнозируемое значение Вероятность того, что человек с отрицательным результатом теста PEPI не будет иметь антигенспецифических Т-клеточных ответов 42 % 51 %
ОРА Общей процент согласования Процент результатов, которые являются истинными результатами, будь то положительные или отрицательные 70 % 64 %
Критерий точной 0,01 0,01
вероятности Фишера (р)
*51 пациент; 6 клинических испытаний; 81 набор данных ** 10 пациентов; клинические испытания Treos, фаза I (OBERTO); 70 наборов данных
Пример 5. Генотип HLA класса I позволяет прогнозировать риск меланомы (способ на основе показателя HLAT)
Выбор предполагаемых иммунозащитных опухолевых антигенов
Предполагается, что опухолеспецифические антигены (TSA) представляют собой иммунозащитные антигены, поскольку больные раком со спонтанными TSA-специфическими Т-клеточными ответами имеют благоприятное клиническое течение. 48 TSA, экспрессируемых в различных типах опухолей, были отобраны для изучения защитных опухолеспецифических Т-клеточных ответов (табл. 11). Эти TSA были изучены при меланоме и других видах рака и показали, что они вызывают спонтанные Т-клеточные ответы.
- 27 046410
Таблица 11. Выбранные TSA для анализа риска
Антиген -4 Показаны
ЛК.МЧ C1« 1
BORIS Меланома , CRC, HNSCC _ Меланома, Легкие 1 NSCLC 1. CRC Мочевой ПУ зырь. Глиома. RCC Меланома, Легкие !| NSCLC 1. CRC, Мочевой ПУ зырь. Глиома. HNSCC. RCC ______ Меланома, Легкие '1 NSC IX’h Мочевой пузырь. HNSCC. RCC 1
Survivin
.MAGE Λ 1
FRAME
CT45 Меланома, Легкие 1 NSCLC 1. CRC. Глиома. HNSCC
NY-SAR-35 Меланома, Легкие L N SC--LiC^Мочевой пузырь i
Ϊ SIP» Мочевой пузырь ι
iioM-rhS-85 JlerKnefNSCLC) , HNSCC
NY BR 1 Рак молочной железы s
MAGEA9 Меланома,Мочевой пузырь RCC. 1 IN'SCC
SCP 1 Меланома, Легкие 1 NSCLC t. CRC, Мочевой пузырь, Глиома, HNSCC
MAGE A12 Меланома, Мочевой пузырь, Глиома , HNSCC··^ RCC--
MAGE A 10 Меланома 5 CJR.C,, Мочевой пузырь, Глиома, HNSCC
CAI X-3 RCC. HNSCC
GAGE-7 Меланома , X КС
SSX-4 Меланома, Легкие ί N S( ‘ 1 С i CRC Мочевой пузырь, Глиома, HNSCC
SPANXC Меланома, Легкие i NSCLCk CRC, Мочевой пу Зырь, HNSC
Cl 46 Мочевой пузырь |
MAGE-A3 Меланома Легкие 1 N SCLC Л. С RC. Мочевой пузырь, ГлиОМЭ, HNSCC, RCC
MAGEt’2 Меланома, Легкие { NSCLC'X CRC^ Мочевой пузырь, Глиома, HNSCC |
TSP?' · JIerKHe(NSCLC) $ CRC |
EpCAM JlenuieCNSCLC) CRC Мочевой пузырь, RCC
CAGI. RerKne(NSCLC) . С R С. 1 1N SCC
MAGI -AS Меланома СКСХ Мочевой пузырь
1 ВХОЛ9 JlerKne(NSCLC) CRC. RCC
CAGE. .4 ' MAGE A6 ' BAGE 4 JIerKHe(NSCLC)
Меланома , СЖС, Мочевой пузырь, RCC
CRCX Мочевой пузырь, Глиома, HNSCC
.MAGE Cl Меланома, Легкие iXSt 1Х 1. С RC , Мочевой пузырь, HNSCC Меланома, Легкие '(NSCLC). CRC. Мочевой пузырь, Глиома, HNSCC, RCC Меланома СЖС Мочевой пузырь, Глиома, HNSCC, RCC
NY-ESO-1
MAGE-A2
\ XGE-I Меланома, Легкие (NSCLCУ, Глиома HNSCC Меланома, Глиома ( HNSCC Меланома, Легкие (NSCLC), CRC,. Молвой пузырь, Глиома, HNSCC Меланома, Легкие 1 NSCLC t.CRC, Мочевой пузырь, Глиома, HNSCC Меланома, Легкие 1 N SCLC К CRC. Мочевой пузырь, Глиома, HNSCC, RCC
MAGE- \ 11
SXX-2
LAGE 1
MAGE A4
MAGE A5 Меланома, Легкие | NSCLC 1. CRC. I IN SCO
MAGE B2 Меланома, Легкие | NSCLC 1. HNSCC
.MAGE Bl Меланома, Легкие
HAGI: Меланома, Легкие 1 NSd С К СRC< Мочевой пузырь, HNSCC, RCC
SSX-1 Меланома, Легкие | \ SC IX 1- С RX < Мочевой пузырь, Глиома, HNSCC
N .M 2 Меланома, Легкие 1 XSCI .( ‘ 1. CRC Мочевой пузырь, HNSCC
SAGE Меланома, Легкие ί NSCLC 1. Мочевой пузырь, Глиома, HNSCC
LE.MDl CRC Глиома
(A IES 1 Легкие(Н5СГС) . CRC, Мочевой пузырь
l.DHC Меланома, Легкие (NSCLC), Глиома
CRC: колоректальный рак,
NSCLC: Немелкоклеточный рак легких,
HNSCC: плоскоклеточная карцинома головы и шеи, RCC: почечно-клеточная карцинома
Уровень заболеваемости меланомой коррелирует с количеством HLAT, показывающим размах специфических для меланомы Т-клеточных ответов.
Предполагается, что количество HLAT для 48 TSA в популяции, в которой меланома имеет высокий уровень заболеваемости, будет ниже, чем в популяции с высоким уровнем заболеваемости. Чтобы продемонстрировать это, было определено число HLAT для 48 TSA в различных этнических популяциях, для которых доступны данные о заболеваемости меланомой (фиг. 3).
Было обнаружено, что у субъектов из дальневосточного азиатско-тихоокеанского региона были гораздо более высокие количества HLAT, чем у субъектов европейского или американского происхождения (фиг. 3). Например, уровень заболеваемости меланомой составляет 1,5 на 100 000 человек как на Тайване, так и на островах азиатско-тихоокеанского региона в США, что значительно ниже, чем в целом в США (21,1 на 100 000 в год).
Показатель (показатели) HLAT соответствуют уровню заболеваемости меланомой в разных странах (фиг. 4). Было получено 20 точек данных для вычисления среднего показателя HLAT и частот заболевае
- 28 046410 мости (частоты заболеваемости были доступны по странам, данные HLA были доступны по этническим группам, поэтому парные наблюдения могли быть получены только для тех стран, которые имеют доминирующую этническую принадлежность). На фиг. 4 показана значительная разница между частотами заболеваемости в странах, где средний показатель HLAT меньше 75, и частотами заболеваемости в странах, где средний показатель HLAT выше 75. Эти результаты предполагают, что генотипы HLA субъектов влияют на заболеваемость меланомой в различных этнических группах, и показывают, что количества HLAT могут оценивать специфические для меланомы Т-клеточные ответы субъекта.
Показатель HLAT субъекта представляет собой фактор риска развития меланомы, связанный с генотипом HLA.
Количества HLAT прогнозировали размах Т-клеточных ответов против 48 выбранных TSA. Предполагается, что не все HLAT у субъекта играют одинаково важную роль в иммунологическом контроле меланомы. Таким образом, HLAT (для 48 TSA) были взвешены на основе способности отделения пациентов с меланомой от общей популяции. Как правило, чем больше взвешенное значение, тем важнее соответствующий TSA. Действительно, AUC уже была выше 0,6 с использованием начальных взвешенных значений (усеченные значения log p).
Характеристики бинарного классификатора при отделении пациентов с меланомой от фона
В данном исследовании сравнивалась субпопуляция США (n=1400) из набора данных dbMHC (когорта 7189 пациентов) с субъектами с меланомой, также с американским происхождением (n=513), с использованием бинарного классификатора (см. Способы). На фиг. 5 показана ROC-кривая, полученная с использованием показателя HLAT в качестве бинарного классификатора. Показатель HLAT прогнозирует, к какой из двух возможных групп принадлежит субъект: группа рака меланомы или фоновая популяция. ROC-кривая представлена путем построения графика зависимости частоты истинноположительных результатов (TPR) от частоты ложноположительных результатов (FPR) при различных настройках порогового значения показателя HLAT.
Полученное значение AUC составляло 0,645. Это значение указывает на значительное разделение между двумя группами, в частности, вследствие того, что в случае заболевания меланомой/раком существует не только одна причина (например, HLAT) дискриминации. Примечательно, что солнце и загар в помещении представляют собой значительные детерминанты риска меланомы, как и фенотипы, такие как светлые или рыжие волосы, голубые глаза и веснушки, и генетические факторы, такие как высокая пенетрантность, 3 гена средней пенетрантности и 16 генов низкой пенетрантности, связанных с меланомой, описанной Read et al. (J. Med. Genet. 2016; 53(1): 1-14). Действительно, преобразованный zпоказатель 10,065, достигнутый в настоящем исследовании, является весьма значимым (р 0,001).
Показатель HLAT субъекта представляет собой фактор риска развития меланомы, связанный с генотипом HLA.
Общая тестовая популяция (фоновая популяция, смешанная с раковой популяцией) была разделена на пять одинаково больших групп на основе показателя HLAT. Относительный иммунологический риск (RiR, Relative Immunological Risk) в каждой группе определяли в сравнении с риском в средней популяции США (фиг. 6). Например, риск развития меланомы в первой подгруппе составляет 4,4%, в то время как в среднем по США - 2,6%, следовательно, эта подгруппа имеет относительный иммунологический риск 1,7. Группа с самым низким показателем HLAT представляет популяцию с самым высоким иммунологическим риском развития рака. Группа с самым высоким показателем HLAT представляет популяцию с самым низким иммунологическим риском развития рака. Самая рискованная субпопуляция состоит из субъектов, у которых показатель HLAT меньше 26. Показатель HLAT изменяется от 29 до 51 во второй по степени риска субпопуляции. Среди 20% находятся те субъекты, у которых показатель HLAT больше или равен 51, и ниже 88, а RiR<1, и это позволяет предположить, что определенные показатели HLAT связаны со снижением риска меланомы. Показательно, что этот диапазон показателя HLAT от 51 до 88 аналогичен показателю HLAT (75), который может разделять популяции с низким и высоким уровнем заболеваемости меланомой (фиг. 6). Во второй наиболее защищенной субпопуляции показатель HLAT составляет от 88 до 164. Наконец, в наиболее защищенной субпопуляции каждый субъект имеет показатель HLAT не менее 164. В этих субпопуляциях относительный иммунологический риск развития меланомы монотонно снижается, как показано на фиг. 6. Хотя между последовательными группами нет значительных изменений, разница между первой и последней группами значима (р=0,001).
Пример 6. Генотип HLA класса I позволяет прогнозировать риск различных типов рака (способ, основанный на показателе HLAT)
Аналогичный анализ был проведен для шести других показателей рака. Результаты сведены в табл. 12. Значения AUC были значимыми для меланомы, рака легких, почечно-клеточного рака, колоректального рака и рака мочевого пузыря. Значение р не значимо для рака головы и шеи. Однако рак головы и шеи связан с вирусной инфекцией HPV. В настоящем исследовании использовались только TSA, вирусные белки не включены. Возможно, риск развития определенных видов рака, таких как рак головы и шеи, которые могут быть связаны с вирусными инфекциями, лучше определять, включив в анализ вирусные антигены.
- 29 046410
Таблица 12. Сводка прогноза иммунологического риска для различных типов рака
Тип рака по сравнению со средней популяцией P
Размер когорты Кен । 1 руина риска” .: За 1 НИ 1 НС 1II 111Я J IDVIlllir .J Ol inline i пне KiK M t
Меланома - SB у В ! 0.3' 0 6> < 0,11()( '
и». ::::»::.ц-дтаациаааааишам. и ..:.:· :im........:::1.444 :.:::.....mm»»»»—»»» □................. — — . - : .....................-—.......... ——me»™»»»»,»»»™ ,.-::.....::: : :: -r.^44—.
s Легкие (немелкоклеточный) 370 1.46 • гв-х 2 72 : 1. ori < 0 11()1
Почечно -клеточный вч ’ sy • :,-7Х 2 /4 ! '.Μ; <0,11(1’ !
Колоректальный 121 83 > пл'1 1 i 0,62 < 0 11()(
Мочевой пузырь Н7 ’ 77 ! и.Ьэ _X-,.— ...... ' so , 0/4 <0 11(0 '
® Г лиома ( 82 * :ι.7θ 1.71 0.57 noil? ;
s Голова и шея В hi.17 0.5 J- i:.i? ’
Разделив исследуемую популяцию (фоновая популяция, смешанная с раковой популяцией) на пять одинаково больших подгрупп на основе показателей HLAT, мы смогли вычислить относительный иммунологический риск, связанный с определенными показателями HLAT, в случае немелкоклеточного рака легкого, почечно-клеточного рака и колоректального рака (фиг. 7А-С). Для других симптомов количество больных раком в субпопуляции было слишком мало для проведения подобного анализа.
Относительный иммунологический риск был вычислен между подгруппой риска (20% тестируемой популяции с самым низким показателем HLAT) и защищенной подгруппой (20% тестируемой популяции с самым высоким показателем HLAT) по сравнению с риском в средней популяции США. Например, риск развития меланомы в наиболее подверженной риску группе населения составляет 4,4%. Среднее значение для США составляет 2,4%, следовательно, группа риска имеет относительный иммунологический риск 1,7. Риск развития меланомы в защищенной группе составляет 0,7%. То есть относительный иммунологический риск наиболее защищенной группы составляет 0,31. Другими словами, в этой группе риск развития меланомы более чем в три раза ниже, чем в среднем по популяции. Коэффициент риска меланомы составляет 5,53 (табл. 12).
Способы для примеров 5, 6 и 10
Данные генотипа HLA субъектов в общей популяции 7189 подходящих субъектов с полным 4значным генотипом HLA были идентифицированы из базы данных dbMHC. Была указана этническая принадлежность каждого субъекта. Наш анализ показал, что фон HLA субпопуляций из разных географических регионов значительно различается. Чтобы устранить это влияние географического положения, мы выбрали американскую субпопуляцию (1400 человек) в качестве фоновой (здоровой) популяции, и наборы HLA этой подгруппы сравнивали с наборами HLA географически/этнически сопоставимых онкологических пациентов. Американская субпопуляция состоит из представителей кавказской, латиноамериканской, азиатско-американской, афроамериканской и коренных национальностей.
Данные HLA-генотипа онкологических больных
Подходящие пациенты имели полный 4-значный генотип HLA класса I. Данные о 513 пациентах с меланомой были получены из следующих источников:
Данные 429 пациентов с меланомой были доступны с полным 4-значным генотипом HLA класса I из 3 авторитетных публикаций (Snyder et al. N Engl J Med. 2014; 371(23):2189-99; Van Allen et al. Science. 2015; 350(6257):207-11; Chowell et al. Science. 2018; 359(6375):582-7). Пациенты получали терапию ингибиторами анти-CTLA-4 и/или PD-1/PD-L1 в Мемориальном онкологическом центре им. Слоуна Кеттеринга, Нью-Йорк (MSKCC). Генотипирование HLA класса I с высоким разрешением на основе нормальной ДНК выполняли с использованием данных секвенирования ДНК или клинически подтвержденного анализа HLA-типирования от LabCorp. Генотип HLA у 17 пациентов с меланомой стадии III/IV был любезно предоставлен MSKCC. Эти пациенты получали терапию ипилимумаб в MSKCC, Нью-Йорк (Yuan et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2011; 108(40): 16723-8). 65 пациентов с меланомой из рандомизированного двойного слепого многоцентрового исследования фазы 3 (СА184007, NCT 00135408) и фазы 2 (СА184002, NCT 00094653) у пациентов с неоперабельной злокачественной меланомой III или IV стадии и ранее получавших лечение с неоперабельной меланомой III или IV стадии; соответственно. У этих 65 пациентов, проходивших лечение в MSKCC, Нью-Йорк, были образцы для тестирования HLA, любезно предоставленные Bristol-Myers-Squibb. Образцы были ретроспективно протестированы с групповым разрешением NGS G, а интерпретация аллелей HLA была основана на базе данных IMGT/HLA версии 3.15. Результаты HLA были получены с использованием типирования на основе последовательности (SBT, sequence based typing) специфичных к последовательности олигонуклеотидных зондов (SSOP, sequence specific oligonucleotide probes) и/или праймеров, специфичных к последовательности (SSP, sequence specific primers), по необходимости, для получения требуемого разрешения. HLA-тестирование проводилось компанией LabCorp, США.
Данные генотипа HLA 370 пациентов с немелкоклеточным раком легких, 129 почечно-клеточной карциномой, 87 раком мочевого пузыря, 82 глиомой и 58 пациентов с раком головы и шеи были собраны из авторитетной публикации (Chowell et al.). Данные генотипа HLA 37 пациентов с колоректальным раком (CRC) были получены из архива считывания последовательностей Национального центра биотехно
- 30 046410 логии (NCBI), энциклопедии элементов дезоксирибонуклеиновой кислоты (Boegel et al. Oncoimmunology. 2014; 3 (8):e954893). Образцы крови 211 вьетнамцев и 84 белых пациентов не испанского происхождения с CRC были получены от Asterand Bioscience, а генотип HLA был идентифицирован LabCorp (Burlington NC).
Данные последовательности TSA
Было отобрано 48 TSA. Данные об аминокислотной последовательности этих антигенов были получены из UniProt.
Коэффициенты заболеваемости
Коэффициенты заболеваемости были получены из http://globocan.iarc.fr/Pages/online.aspx.
Триплеты человеческих лейкоцитарных антигенов (HLAT)
Гены HLA класса I экспрессируются в большинстве клеток и связываются с эпитопами, которые распознаются рецепторами Т-клеток. Эпитопы, которые связываются по меньшей мере с тремя HLA (триплет HLA или HLAT) из шести аллелей HLA человека, могут вызывать Т-клеточные ответы. Для каждого j=1, 2, ... 6 мы создали систему подсчета показателей для оценки иммунной системы субъектов в зависимости от того, насколько хорошо они могут связывать эпитопы. С позиции комбинаторики существует _ id j) ~ (fc-W возможных j-наборов аллелей HLA для каждого конкретного эпитопа, где k-количество аутологичных аллелей HLA, которые могут связываться с эпитопом.
Когда нас интересуют триплеты HLA, j=3. Следовательно, количество HLAT субъекта для антигена определяется как полная сумма HLAT.
HLAT субъектов определяют с помощью теста PEPI, подтвержденного для идентификации связывающихся HLA-эпитопов с точностью 93%.
Иммуногенетический предиктор: Показатель HLAT
Показатель HLAT субъекта х определяется как:
где С - набор TSA, с - конкретный TSA, w(c)-взвешенное значение с TSA, а р(х,с) - количество HLAT с TSA у субъекта х.
Оптимизация взвешенного значения показателя HLAT
Начальное взвешенное значение составляло 0 для каждого TSA, чьи показатели HLAT незначительно отделялись для больных раком от фоновой популяции. Поскольку предполагалось, что наличие HLAT не увеличивает шанс развития рака, учитывались только неотрицательные взвешенные значения. Начальные взвешенные значения определяли как
где t(c) обозначает р-значение одностороннего t-теста по показателю HLAT для с TSA раковой популяции и фоновой популяции, а 48-поправка Бонферрони.
Начальные взвешенные значения были дополнительно оптимизированы с помощью параллельного выравнивания. Были применены шесть параллельных цепей Маркова с температурами RT=0,001, 0,01, 0,02, 0,04, 0,1, 0,2. Гипотетическая энергия была определена как -1, умноженная на сумму RiRR (Relative immunological risk ratio, отношение относительного иммунологического риска, см. ниже) и AUC. Были зарегистрированы взвешенные значения, обеспечивающие наибольший относительный риск.
Относительный иммунологический риск (RiR)
RiR вычисляли как отношение рисков между субпопуляцией и всей тестируемой популяцией (популяция рака и фоновая популяция) с 95% доверительными интервалами (CI, confidence intervals). С этой целью общая популяция была собрана таким образом, чтобы быть похожей на процент различных раковых больных в общей популяции США с учетом пожизненного риска. Информация о пожизненных рисках развития различных типов рака была получена с веб-сайта Американского онкологического общества. Как правило, пожизненный риск для мужчин и женщин различается, поэтому мы взяли (гармоническое) среднее из них. Полученные таким образом риски составляют: 1:38 для меланомы, 1:16 для рака легких, 1:61 для почечно-клеточного рака, 1:23 для колоректального рака, 1:41 для рака мочевого пузыря, 1:55 для рака головы и шеи и 1:161 для глиомы. RiR>1 указывает на то, что субъекты имеют более высокий риск развития определенного вида рака по сравнению с субъектами в средней популяции.
Коэффициент RiR (RiRR)
Коэффициент RiR вычисляли как отношение между группами с самым высоким и самым низким показателями HLAT.
Пример 7. Показатель HLA на основе триплетов HLA обеспечивает лучшее разделение между больными раком и фоновыми субъектами
При разработке скринингового теста мы рассмотрели несколько схем оценки. Возможные схемы
- 31 046410 оценки отличаются минимальным размером наборов аллелей HLA, связывающихся с одним конкретным эпитопом, который, как считается, вносит вклад в показатель субъекта. Для каждого размера подмножеств аллелей HLA j=1, 2, ..., 6 мы вычисляли показатели значимости для каждого аллеля в зависимости от того, как часто он участвует в j'-кортежах обучения HLA субъектов, связывающихся с конкретным эпитопом. Вкратце, мы считали показатель значимости положительным, если у субъектов с данным аллелем HLA было значительно больше эпитопов с HLA j-мерами, чем у субъектов без данного аллеля HLA. Показатель значимости был отрицательным, если у субъектов сданным аллелем HLA было значительно меньше эпитопов с HLA j-мерами, чем у субъектов без данного аллеля HLA. Затем для каждого субъекта мы суммировали показатели значимости аллелей HLA. Затем мы проверили, насколько хорошо эти суммарные показатели могут различать меланому и фоновых субъектов, вычислив площадь под рабочей характеристической кривой (ROC-AUC, AUC). Согласно табл. 13 наилучшее разделение меланомы и фоновой популяции было достигнуто одинаково для j=2 и j=3. Существенная разница между значениями AUC для разных показателей, основанных на I-наборе по сравнению с у-наборами, j> 1, предполагает, что презентирование эпитопа множественными аллелями HLA может играть важную роль в развитии эффективного противоопухолевого иммунного ответа. Кроме того, эти результаты предполагают, что разделение раковых и фоновых (здоровых) субъектов на основе единственного аллеля их генотипа HLA будет сложной задачей. Падение значений AUC при j=6 можно объяснить тем фактом, что существует лишь очень ограниченное количество комбинаций эпитоп - аллель HLA, где все 6 аллелей HLA субъекта могут связываться с эпитопом.
Таблица 13. Значения AUC, вычисленные для меланомы с различными j-наборами HLA
j Л1 ( ' J V с
1- набор ’ <1,01! ? 4-набор ' Ιί.άκ
2-набор !1.0Ч i 5-набор к.ед
3-набор !!.6Ч 6-набор __
Пример 8. Показатель HLA - индикатор риска или защиты от меланомы, с пояснениями RiR и RiRR Значение AUC (0,69) при сравнении меланомы и фоновых субъектов в США указывает на значительное разделение между двумя группами с использованием показателя HLA. Действительно, преобразованный z-показатель составил 12,57, что было весьма значимым (р<0,001). Эти результаты демонстрируют, что генотип HLA субъектов влияет на генетический риск развития меланомы.
На основании показателя HLA, фоновая популяция и популяция меланомы были разделены на пять подгрупп равного размера на основе их показателя (показателей) HLA; s<34, 34<s<55, 55<s<76, 76<s<96 и 96<s. Был вычислен относительный риск (RR, Relative Risk) каждой подгруппы (фиг. 8). Было обнаружено, что субъекты с самым высоким иммунологическим риском развития меланомы (6,1%) относятся к подгруппе с самым низким показателем HLA (s<34). Поскольку средний риск меланомы в США составляет 2,6%, субъект в подгруппе s<34 имеет в 2,3 раза более высокий риск развития меланомы, чем средний субъект в США. Напротив, подгруппа с самым высоким показателем HLA (96<s) представляет субъектов с наименьшим иммунологическим риском развития меланомы (1,1%). Субъект этой подгруппы имеет риск в 0,42 раза ниже, чем средний субъект в США. Разница между первой и последней подгруппами была значительной (р<0,05).
Было вычислено соотношение рисков между наиболее защищенными и наиболее подверженными риску группами (RRextremities). Было обнаружено, что RRextremities для меланомы составляет 5,69, а это указывает на то, что субъекты с показателем HLA менее 34 имеют примерно в 6 раз более высокий риск развития меланомы по сравнению с субъектами с показателем HLA выше 96 (табл. 14).
Пример 9. Характеристика показателя HLA как предиктор риска развития различных типов рака
В некоторых случаях показатель значимости аллеля HLA (h) определяют, как
где u(h) - р-значение двустороннего u-теста для аллеля h, определяющее, отличается или не отличается количество HLAT у двух подмножеств людей: одного подмножества, в котором индивидуумы имеют h HLA, и одного подмножества в котором индивидуумы не имеют h HLA. В - поправка Бонферрони, a sign(h) равно +1, если среднее количество HLAT больше в субпопуляции, имеющей аллель h, чем в субпопуляции, не имеющей h, и в противном случае равно -1. В некоторых случаях указанное начальное взвешенное значение может быть дополнительно оптимизировано с использованием любого подходящего метода, известного специалистам в данной области. В некоторых случаях сумму этих показателей значимости используют для определения того, что риск, с которым у субъекта будет развиваться рак, коррелирует с риском того, что у субъекта будет развиваться рак.
Используемая конкретная оценка зависит от показаний и априорных данных. В некоторых случаях
- 32 046410 выбор будет сделан на основе характеристик различных вычислений с доступными тестовыми наборами данных. Рабочие характеристики можно оценивать по значению AUC (площадь под ROC-кривой) или по любому другому показателю характеристики, известному специалистам в данной области.
Мы определили ROC-кривую, RR и RRextremities для немелкоклеточного рака легких, почечноклеточного, колоректального рака, рака мочевого пузыря, головы и шеи и глиомы, используя те же способы, которые описаны для меланомы (табл. 14). Значения ROC-AUC были значительными для всех типов рака, кроме колоректального рака.
Был получен диапазон RRextremities 2,35-5,69 для исследуемых симптомов рака, что позволяет предположить различные уровни иммунной защиты против разных типов рака (табл. 14). Однако RRextremities >2 для всех симптомов рака демонстрирует, что генотип HLA представляет значительный генетический риск развития рака.
Таблица 14. Прогнозирование иммунологического риска при различных типах рака
Гии рака Ϊ I’aivup 1 когорты KR 1 руина рискаΛ iaiiiHiiici11iaii i pvinup H R -4 и< J V ( P |
Меланома —--- Г р 2 14 (J il 11 <I|IHI ’ 1 ί
; (немелкоклеточнъти ι * *7; । ж l.S-i <141 4 44 11 Ml <11 1,11 1 ·
•s Почечно- 1- клеточный 1 12·! 1 Μ ΟΛΙ . 3 И II M
« Колоректальный !р| ' 1 ’Ί ' (1 * ? * II <3 пион '
। Мочевой j пузырь 1 XJ U4h 4 1; 11 Ml <11 1 11! ; 1
Глиома 1 j 02 О ь i hi 11 1 I
: Голова и шея и Sx 1 21 ¢1' i 2 II '12 ШИН '
*Группа риска, 20% населения с самым низким показателем HLA; Защищенная группа, 20 % населения с наивысшим баллом по HLA. Каждый симптом рака классифицировался относительно одной фоновой популяции. RRextremities - коэффициент риска наиболее уязвимых и наиболее защищенных групп; AUC, площадь под ROC-кривой. Значение р с учетом поправки Бонферрони, меньшее, чем 0,007, демонстрирует значимость.
Пример 10. Скрининг риска для пациента D на предмет CRC и составления вакцины
В этом примере показано, как вычислить показатель HLAT пациента D, описанный в примере 20. Пациенту D был поставлен диагноз метастатический колоректальный рак. С использованием генотипа HLA пациента D, было определено прогнозируемое количество эпитопов PEPI3, PEPI4, PEPI5 и PEPI6 на 48 выбранных TSA (табл. 15). На базе статистики было вычислено общее количество HLAT для каждого TSA (строки 6, 14 и 22 табл. 15) и взвешенные показатели для каждого TSA (строки 8, 16 и 24 табл. 15). Этот взвешенный показатель является просто произведением общего количества HLAT и взвешенных значений TSA (строки 7, 15 и 23 табл. 15). Взвешенные значения были получены с помощью способа, описанного в разделе Оптимизация взвешенного показателя HLAT согласно примеру 6. Суммарный взвешенный показатель (как описано в уравнении (1)) составляет 43,09. Основываясь на сравнении американского CRC и американского фонового населения, пациент D имеет 1,26-кратный риск развития колоректального рака по сравнению со средним человеком в США. Поскольку риск развития CRC в США составляет 4,2%, риск для пациента D, основанный на нашем результате, составляет 5,3%.
- 33 046410
Таблица 15
?hM4 ROKIS Sitruiin phvui C i 15 5AH v- fSH'i 1ЮТ1li> S5 NA-RR. ϊ M Mil.- V- ΜΊ4 MU.I·u m«;i- ЛЮ
г. 1· L - - ii · t I : .
»?НЧ4 ., • 1 0 4 u- 0 ft 0 fl II :
5»-МЧ? i & 0 0 0 0 I) 0 0 0 0 &
*t ΡΙή · г ν· 1 g f> • -· 0 II 1 .1 ft 0 H ft
н 3 - 5 16 € 0 3 42 c 2 0 0 J 2 1 2 3 25
ГР ’семи Ο.ΰΟΟΒί» ι ltj.3 Z.ZZi.C 2.02242 OJ®»3 aiaii 0 CBJti· £Ш®Й1 2.288Й O'JZiJZ М24Ж I..-1.., 2O‘b.' ο C 3217?
аад.ю 5 0 .I.<4 146«3 0 О.ООП© 0 :i у ад S.MS41 ·./ : .11 I. MCW l ,-/.1
° Я * SSX i SFAXX С CT« Μ п;К. A3 «U.K <2 ISPS- 1 pt AM 1 K.l M И.1. AR 1Е1АОЛ 9 1’ «.· * MO- Л6 ii U > 4 w. 1 Ml 1 μ A>
*ίΉ4.’ ϊ π ft : J 1 3 'Ϊ 1 0 3 J
4 ft № 0 ¢- 0 0 1 ft G 0 Й 0 J
1} ft 0 0 il I! a I! 0 I I
алНЧЛ U ft 0 -1 ft n · И Й Ί M fl II 0
? 0 0 2 1 2 1 8 2 2 9 1 .: 0 a _L 5
> ч i,7 ·- Н-Ч Ii -4'JS > . ’i;?-' .114411 1 1 -·.,·· ‘J--’i4 :· 54 • · J Ii· IXi II.-I 775 A. 1
0 I-.-,. 1! ·?.*! ' Л _ ' ' III', -. z · °* Ί ,'l : ·ι:ι -1 -J·- P i:iss η ΐυ>ν . к .--
„ =я XAOfr : ι V M.l UJ I «;f-i « K4 54 νμ.ι к M M.S.lij mac» ill H U.l ss A- IIVIH ОТ- TF.S-1 1 Dili
«Г 1.Г 1Л 1 0 ί 0 ® 0 0 π о : 1 0 1
Й 0 0 0 0 1 0 i 0 1 0 -> о 1
ft 0 0 • D (1 1 0 a ft 0 (1 II
« Ί 1' ί. и : · II 1. 0 0 1 e Ί 0 0 e H
О 0 1 0 Э 1 0 14 c 8 5 0 у 3
Г 1 ж . 14 00 UUB1 1.5//5 О.О/Зэ 0.4303 1 ад/ t.lbyj UWlb 0.0/53 υιο’-ΐ 1 1551 3 01Ы 1.1ЯУ/ 0 0445 0.049b
В SB 5 й Si? 1------------- 0 0731 0.0/73 :::,//6 0.3614 10.341 3.082 1 0.4459
Пример 11. Результаты исследования фазы I CRC: PEPI по сравнению с HLAT по сравнению с иммуногенностью
В испытании OBERTO был спрогнозирован иммунный ответ для 7 антигенов и 11 субъектов, а также измерены иммунные ответы в образцах 10 пациентов. 7 антигенов вакцины составляют часть 48 TSA. Прогнозы и результаты измерений приведены в таблице 16. Общий процент согласования равен 64%.
Таблица 16. Результаты измерений и PEPI-тесты прогнозировали иммунные ответы для содержащихся в вакцине пептидов, специфичных для перечисленных TSA
Мы сравнили показатели HLAT и количество антигенов с результатами измерений иммунных ответов (фиг. 9). Была обнаружена положительная корреляция между показателем HLAT и количеством антигенов с иммунными ответами. Однако не ожидается существенной корреляции при таком небольшом количестве измерений (n=10) и вследствие того, что показатель HLAT учитывает прогнозируемые связывания эпитопа для 48 антигенов, тогда как иммунные ответы были измерены только для 7 антигенов из 48. Таким образом, этот анализ позволяет показать корреляцию, но обеспечивает низкую статистическую мощность).
Пример 12. Сравнение классификации на основе показателя HLAT и классификации на основе показателя HLA
- 34 046410
Таблица 17. Классификация на основе показателя HLAT
Тип рака Меланома I Размер * si когорты г 1руин я.· KR RK·, . I-UI. ,15- 5J3 Ui > P
1 риска' {ащищсппая ι pvinia’* ι./з А '1 i:.3I '
11.65 , <0,11111
'! (немелкоклеточный) 3711 1.46 1.51 > /! ll/i* i <ϋ.ΊΙΙΙ|
г Почечно- >! клеточный -4— 1.5'< ' C.y 2 И il.ftl ' I). Illi
Колоректальный 121 I.S3 li.hl 2. lJ7 11.62 Ί 0,1 II II
ι Мочевой Ϊ пузырь ί К? 1.77 Im!,’ 2.5() 11.61 ’ <4llll|
Глиома JL ч· 1,36 ii, -'9 1 /’> U.S. : 0.017 * .4
t Голова и шея ||'-2 ’ 1Ш 5.4() 11.51 Till
Таблица 18. Классификация на основе показателя HLA
Тип рака , ItR Размер 1----------------- когорты 8 j 1 руина pucia ί: ϊηιιιπιιιοιιιη}ΐ ι pviiua’· j Я »3 г.·- j * is I P
Меланома < _ 2.34 ί 0.41 5 .119 1 :.ii9 сии π
| (немелкоклеточныи) | '(UI 4 14 ι <: i.! и 11
। ючешо-кпеточный ’ 1 ·.' <.5I .UI । LU ij nil
I Колоректальный Ml “ ин * (1.55 ι ?5 ' :.55 ; i.t н is
1 мочевой f пузырь _____ Глиома \ι I.SS 1 и ' O.4h ύ 4 ———f—— J'l , 4 ~~~~~~|~3 >4 1 SI ’ 1 ————-+- l.lTb : u спин CHHII
в Голова и шея ‘ 5 Я I ' I Π8 1 fp 1 ι 1 II 1 1
Как видно, классификация на основе показателя HLAT лучше в случае колоректального рака, тогда как классификация на основе показателя HLA лучше работает в случае рака головы и шеи.
Пример 13. Генетические различия в этнических популяциях и их связь с риском рака
Чтобы дополнительно продемонстрировать, что генотип HLA влияет на риск развития рака также на уровне популяции, мы исследовали его взаимосвязь с уровнем заболеваемости в конкретной стране. Мы предположили, что средний показатель HLA, то есть специфические для рака Т-клеточные ответы в популяции с высоким уровнем заболеваемости меланомой, будет значительно ниже, чем показатель HLA у популяции с низким уровнем заболеваемости. Поэтому мы определили показатели HLA для субъектов, репрезентативных для 59 различных стран. Было обнаружено, что у субъектов из дальневосточного азиатско-тихоокеанского региона были значительно более высокие показатели HLA (диапазон 75-140) и более низкие уровни заболеваемости (диапазон 0,4-3,4), чем у субъектов европейского или американского происхождения (диапазон 50 и 90), где уровень заболеваемости самый высокий (диапазон 12,6-13,8) (фиг. 10). Если рассматривать население США, уровень заболеваемости 1,5 на 100 000 человек, как для Тайваня, так и для жителей островов азиатско-тихоокеанского региона в США заметно меньший, чем для населения США в целом (21,1 на 100 000 в год), что подтверждает наши результаты. Были доступны уровни заболеваемости по странам, в то время как данные о генотипах HLA были доступны по этнической принадлежности. Таким образом, мы могли получить пары наблюдений только для тех стран, у которых есть доминирующая этническая принадлежность. Были определены 20 стран с данными о генотипе HLA от доминирующих этнических групп (выделены черным на фиг. 10), для которых были определены средние показатели HLA, и их сравнили с уровнем заболеваемости меланомой. Была обнаружена заметная корреляция между уровнем заболеваемости меланомой и средними показателями HLA (фиг. 11). Коэффициент корреляции R2=0,5005 является высоко значимым (р<0,001) с заданным количеством точек (n=20; степень свободы, df=18). Страны с низким и высоким уровнем заболеваемости меланомой хорошо разделены очевидным показателем порогового значения HLA>80, что согласуется с пороговыми значениями, разделяющими субъектов с низким и высоким риском в США (показатель HLA>96, фиг. 11). Эти результаты предполагают, что генотипы HLA субъектов влияют на уровень возникновения меланомы в различных этнических популяциях, и последовательно предполагают, что показатель HLA может быть использован для определения иммуногенетического риска меланомы.
Пример 14. Показатель HLA для CLL, ассоциированных с HLA
А*02:01, С*05:01, С*07:01 представляют собой аллели HLA, которые связаны с CLL (chronic lymphocytic leukemia, хронический лимфоцитарный лейкоз) (Gragert et al, 2014), а это означает, что субъекты, имеющие любой из этих аллелей HLA класса I, имеют повышенный риск развития CLL. Во время обучения с показателем HLA наблюдалось, что субъекты обучающей популяции, имеющие любой из этих HLA, имеют значительно меньше HLAT для проанализированных 48 TSA, чем субъекты, не имеющие этих HLA. В табл. 19 показаны средние значения HLAT для 48 TSA в случае 9 наиболее часто встречающихся аллелей HLA. Однако эти немногие аллели HLA могут быть обнаружены только у небольшой части популяции, и, таким образом, информация, которую можно получить из связи между раком и этими немногими аллелями, не может быть использована для субъектов, не имеющих ни одного из
- 35 046410 этих аллелей. С другой стороны, способ оценки HLA присваивает информативный показатель всем субъектам и, следовательно, может быть использован для классификации всей популяции. Таким образом, способ оценки HLA обеспечивает лучшую классификацию, чем способ с использованием исключительно информации о связи между отдельными аллелями HLA и раком.
Таблица 19. Анализ HLAT лиц с одним из HLA, повышающих риск CLL.
Аллели А*02:01 или С*05:01, или С*07:01.
Среднее количество HLAT
Название 1 HLA III Λ-Λ*ιΗ:ΙII Субъекты, имеющие HLAK02:01 или C*05:01, или C*07:ll 1 Субъект· HLA 41 -I; >i, нс имеющих ши о ί p значении t-i
,IH H1_____________________________ _.J ί:Μ
HI Л-Л'-:П?:1 И 5.5 ft__________________________ ДР h __
Hl А А НАШ 14? 5 1' X -Μ
III A-A-miil l!il 5_________________________________ __________________C,72lif54lS7
HI A Η'·ϋ'.'·ι j? 1:λ5 T ’.Ш 4 11. <5
HI.Λ В'ЖН) 1155 . I 9511.41,5(-
Ш.А-В' -Ы i;2 1^2-2________________________ -
HLA Г---()5:ili 15(.1.2 _______________________ 5-
III .A-('!!()7JH 1Щ............................................................................................................................ 1' -7.- ,.5 47 4.
Пример 15. Один аллель или неполный генотип HLA не подходят для определения генетического риска
Известно, что инфекция вирусом Эпштейна-Барра (EBV) может вызывать недифференцированную карциному носоглотки (UNPC, undifferentiated nasopharyngeal carcinoma). Пасини и др. проанализировали 82 итальянских пациентов с UNPC и 286 доноров костного мозга из той же популяции и обнаружили, что некоторые консервативные аллели HLA, А*0201, В*1801 и В*3501, способные связываться с некоторыми эпитопами EBV в данном регионе, недостаточно презентированы у пациентов с UNPC (Pasini E et al. Int. J. Cancer: 125, 1358-1364 (2009)). Однако исследование частых аллелей в популяции представляет собой подход, совершенно отличный от исследования иммунного ответа, вызывающего реальные целевые HLA-комбинации, как, например, анализ пула HLAT отдельных людей. Поскольку последнее предполагает способность человека продуцировать репертуар Т-клеток, уничтожающих больные клетки, механизм, объясняет иммуногенетический прогресс или риск. Кроме того, было обнаружено аддитивное воздействие на защитные аллели HLA. Однако не был сделан вывод, могут ли эти аллели HLA связываться с одним и тем же эпитопом или разными эпитопами на разных антигенах EBV. Также были обнаружены аллели HLA, которые положительно связаны с UNPC, однако они не смогли измерить снижение способности этих аллелей HLA связывать эпитопы EBV. Они рассматривали только антигены EBV, поэтому их методы нельзя распространять на другие виды рака. Поскольку даже самые частые аллели HLA охватывают лишь ограниченную часть всей популяции, диагностические механизмы не могут быть построены только на их основе. Например, механизм, основанный только на аллеле А*02:01, может иметь значение AUC всего 0,573 (фиг. 12). Комбинированный гаплотип А*02:01/В*18:01 встречается еще реже, и, несмотря на высокое значение OR, механизм, основанный на анализе этого единственного гаплотипа, будет иметь значение AUC всего 0,556. Это означает, что он не может достоверно отделять популяцию, состоящую из 82 пациентов с UNPC, от фона из 286 субъектов, преобразованное значение Z составляет 1,65, соответствующее значение р (для одностороннего тестирования) составляет 0,06.
Пример 16. Схема клинического испытания OBERTO фазы I/II и предварительные данные о безопасности
Испытание OBERTO представляет собой испытание фазы I/II вакцины PolyPEPI1018 и CDx для лечения метастатического колоректального рака (NCT03391232). Схема исследования показана на фиг. 13.
Критерии зачисления
Гистологически подтвержденная метастатическая аденокарцинома, берущая начало из толстой или прямой кишки.
Наличие по меньшей мере 1 измеримого эталонного патологического изменения в соответствии с RECIST (Response Evaluation Criteria in Solid Tumors, Критерии оценки объективного ответа при солидных опухолях) 1.1.
PR или стабильное заболевание во время терапии первой линии с использованием схемы системной химиотерапии и 1 схемы биологической терапии.
- 36 046410
Поддерживающая терапия фторпиримидином (5-фторурацил или капецитабин) с дополнением того же биологического агента (бевацизумаб, цетуксимаб или панитумумаб), использованного во время стимулирования, которую планируется начать до первого дня лечения исследуемым препаратом.
Последняя компьютерная томография за 3 недели до первого дня лечения. Досрочное исключение и досрочное прекращение терапии
В течение начального периода исследования (12 недель), если у пациента наблюдается прогрессирование заболевания, и ему необходимо начать терапию второй линии, пациент будет исключен из исследования.
Во время второй части исследования (после 2-й дозы), если у пациента наблюдается прогрессирование заболевания, и ему необходимо начать терапию второй линии, пациент останется в исследовании, получит третью вакцинацию в соответствии со схемой, и полное последующее наблюдение.
Как и ожидалось, наблюдалась временная местная эритема и отек в месте вакцинации, а также гриппоподобный синдром с незначительной лихорадкой и усталостью. Эти реакции уже хорошо известны для пептидной вакцинации и обычно связаны с механизмом действия, поскольку лихорадка и гриппоподобный синдром могут быть следствием и признаком стимулирования иммунных ответов (это известно как типичные реакции на вакцины при детских вакцинациях).
Было зарегистрировано только одно серьезное нежелательное явление (SAE, serious adverse event), возможно связанное с вакциной (табл. 20).
Имел место один случай дозолимитирующей токсичности (DLT, dose limiting toxicity), не связанной с вакциной (обморок).
Результаты по безопасности сведены в табл. 19.
Таблица 20. Серьезные нежелательные явления, зарегистрированные в клиническом исследовании
OBERTO. Ни одного связанного SAE не было (только 1 возможно связанное)
Идентифика тор пациента SAE Связь
010001 Смерть вследствие прогрессирования болезни Не связано
010004 Эмболия Маловероятно связано
010004 Боль в животе Не связано
010007 Непроходимость кишечника Не связано
020004 Острый неинфекционный энцефалит Возможно, связано
Пример 17. Выбор антигена-мишени на основе частоты экспрессии при разработке вакцины и его клиническая валидация для mCRC
Общие опухолевые антигены обеспечивают точное нацеливание на все типы опухолей, включая опухоли с низкой мутационной нагрузкой. Данные об экспрессии в популяции, собранные ранее из 2391 биоптатов CRC, представляют изменчивость экспрессии антигена у пациентов с CRC во всем мире (Фиг. 14А).
PolyPEPI1018 - это пептидная вакцина, разработанная нами, содержащая 12 уникальных эпитопов, производных 7 консервативных тестикулярно-специфических антигенов (TSA), часто экспрессируемых в mCRC. В нашей модели мы предположили, что путем выбора TSA, часто экспрессируемых в CRC, идентификация мишени будет правильной и устранит необходимость в биопсии опухоли. Было вычислено, что вероятность экспрессии 3 из 7 TSA в каждой опухоли превышает 95% (фиг. 14В).
В исследовании фазы I оценивалась безопасность, переносимость и иммуногенность PolyPEPI1018 в качестве дополнения к поддерживающей терапии у субъектов с метастатическим колоректальным раком (mCRC) (NCT 03391232) (см. также в примере 4). Измерения иммуногенности подтвердили ранее существовавшие иммунные ответы и косвенно подтвердили экспрессию целевого антигена у пациентов. Иммуногенность измеряли с помощью анализа в присутствии Fluorospot (ELISPOT) из образцов РВМС, выделенных до вакцинации и в различные моменты времени после последующей однократной иммунизации PolyPEPI1018 для подтверждения стимулированных вакциной ответов Т-клеток; образцы РВМС стимулировали in vitro вакцино-специфическими пептидами (9-мерными и 30-мерными) для определения стимулированных вакциной Т-клеточных ответов выше базового уровня. В среднем 4, по меньшей мере 2 пациента имели ранее существовавшие CD8 Т-клеточные ответы против каждого антигена-мишени (фиг. 14С). 7 из 10 пациентов имели ранее существовавший иммунный ответ против по меньшей мере 1 антигена (в среднем 3) (фиг. 14D). Эти результаты подтверждают правильность выбора мишени, поскольку CD8+ Т-клеточный ответ на CRC-специфический целевой TSA до вакцинации вакциной PolyPEPI1018 подтверждает экспрессию этого целевого антигена у анализируемого пациента. Таргетирова
- 37 046410 ние реальных (экспрессированных) TSA является предпосылкой для эффективной противоопухолевой вакцины.
Пример 18. Доклиническая и клиническая иммуногенность вакцины PolyPEPI1018 подтверждает правильный выбор пептида
Вакцина PolyPEPI1018 содержит шесть 30-мерных пептидов, каждый из которых разработан путем объединения двух иммуногенных 15-мерных фрагментов (каждый из которых включает 9-мерный PEPI, следовательно, по конструкции имеется 2 PEPI в каждом 30-мере), полученных из 7 TSA (фиг. 15). Эти антигены часто экспрессируются в опухолях CRC на основании анализа 2391 биоптатов (фиг. 14).
Результаты доклинической иммуногенности, вычисленные для модельной популяции (n= 433) и для когорты CRC (n=37), дали прогнозируемую иммуногенность 98 и 100% на основе прогнозов теста PEPI, и это было клинически доказано в испытании OBERTO (n=10) с иммунными ответами, измеренными по меньшей мере для одного антигена у 90% пациентов. Что еще более интересно, 90% пациентов имели иммунный ответ, специфический для вакцинного пептида, по меньшей мере против 2 антигенов, и 80% имели CD8+ Т-клеточный ответ против 3 или более различных вакцинных антигенов, что свидетельствует о соответствующем выборе целевого антигена во время разработки PolyPEPI1018. Клиническая иммуногенность, специфическая для CD4+ Т-клеток и CD8+ Т-клеток, подробно описана в табл. 21. Высокие частоты иммунного ответа были обнаружены как для эффекторных Т-клеток, так и для эффекторных Тклеток памяти, как для CD4+, так и для CD8+ Т-клеток, и 9 из 10 иммунных ответов пациентов были усилены или повторно стимулированы вакциной. Кроме того, доли CRC-реактивных, полифункциональных CD8+ и CD4+ Т-клеток были увеличены в РВМС пациента после вакцинации в 2,5 и 13 раз соответственно.
Таблица 21. Результаты клинической иммуногенности для PolyPEPI1018 в mCRC
Иммунологические ответы % пациентов (п)
СО4+Т-клеточные ответы 100% (10/10)
CD8+ Т-клеточные ответы против > 3 антигенов 80% (8/10)
Как CD8+, так и CD4+ Т-клеточные ответы 90% (9/10)
Обнаруженный ex vivo CD8+ Т-клеточный ответ 71 % (5/7)
Обнаруженный ex vivo CD4+ Т-клеточный ответ 86 % (6/7)
Среднее увеличение доли полифункциональных (IFN-γ’ TNF-a положительных) CD8+ Т-клеток по сравнению с показателями до вакцинации 0,39 %
Среднее увеличение доли полифункциональных (IL-2 и TNF-a положительных) CD4+ Т-клеток по сравнению с показателями до вакцинации 0,066 %
Пример 19. Клинический ответ на терапию PolyPEPI1018
Клиническое испытание OBERTO (NCT03391232), которое было дополнительно описано в примерах 4, 16, 17 и 18, было проанализировано на предмет предварительных объективных частот ответа опухоли (RECIST 1.1) (фиг. 16). Из одиннадцати вакцинированных пациентов, получающих поддерживающую терапию, у 5 было стабильное заболевание (SD, stable disease) на момент предварительного анализа (12 недель), у 3 наблюдался неожиданный ответ опухоли (частичный ответ, PR, partial response), наблюдаемый при лечении (поддерживающая терапия + вакцинация) и 3 имели прогрессирующее заболевание (PD, progressed disease) в соответствии с критериями RECIST 1.1. Стабильное заболевание как лучший ответ было достигнуто у 69% пациентов на поддерживающей терапии (капецитабин и бевацизумаб). Пациент 020004 продемонстрировал стойкий терапевтический эффект через 12 недель, а пациент 010004 имел длительный терапевтически эффект, пригодный для операции с лечебной целью. После 3-й вакцинации у этого пациента не было признаков заболевания, поэтому он считался полным респондером, как показано на диаграмме на фиг. 16.
После одной вакцинации ORR составил 27%, DCR - 63%, а у пациентов, получивших по меньшей мере 2 дозы (из 3 доз), у 2 из 5 составил ORR (40%), a DCR составил 80% (SD + PR + CR у 4 из 5 пациентов) (табл. 22).
Таблица 22. Клинический ответ на терапию PolyPEPI1018 после >1 и >2 доз вакцины
Количество доз вакцины Частота объективного ответа (CR + PR) Уровень контроля заболевания (SD + PR + CR)
> 1 27 % (3/11) 63 % (7/11)
>2 40 % (2/5) 80 % (4/5)
На основании данных 5 пациентов, получавших несколько доз вакцины PolyPEPI1018 в клиническом испытании OBERTO-101, предварительные данные свидетельствуют о том, что более высокое количество AGP (>2) связано с более длительным PFS и повышенным уменьшением размера опухоли (фиг.
- 38 046410
14В и С).
Пример 20. Разработка и лечение посредством индивидуализированной иммунотерапии (PIT) для рака яичников, молочной железы и колоректального рака
В данном примере представлены доказательства концептуальных данных от 4 пациентов с метастатическим раком, получавших персонализированные иммунотерапевтические вакцинные композиции, для подтверждения принципов связывания эпитопов множеством HLA субъекта для стимулирования цитотоксических Т-клеточных ответов, на которых частично основано настоящее изобретение.
Композиция для лечения рака яичников с помощью РОС01 - PIT (пациент А)
В данном примере описано лечение пациента с раком яичников персонализированной иммунотерапевтической композицией, причем композиция была специально разработана для пациента на основе ее генотипа HLA на основе изобретения, описанного в настоящем документе.
Г енотип HLA класса I и класса II у пациентки с метастатической аденокарциномой яичников (пациент А) был определен на основе образца слюны.
Для получения персонализированной фармацевтической композиции для пациента А, были отобраны тринадцать пептидов, каждый из которых отвечал следующим двум критериям: (i) происходил из антигена, который экспрессируется при раке яичников, как сообщается в авторитетных научных публикациях; и (ii) содержит фрагмент, который представляет собой Т-клеточный эпитоп, способный связываться по меньшей мере с тремя HLA класса I пациента А (табл. 23). Кроме того, каждый пептид оптимизирован для связывания максимального количества HLA класса II пациента.
Таблица 23. Персонализированная вакцина для пациента А с раком яичников
Вакцина РОС01 дая пациента А Антигенмишень Экспрессия антигенов Пептиды 20-мер МАКС МАКС HLA HLA класса! класса П 5eq ID NO
Р0С01, Р1 ШМ LQKQLQA7LQWIAASQFN 3 5 1
РОС01 Р2 eoftis 8K. EGDSRSDEI7LT70HF1Γ7ΞΕ 4 2 2
POCG1_P3 SPAG9 76% .V .РС» л 3 3 3
РОС01_Р4 ОЛТЕ5-1 75¾. 3 i 4
pomi_ps 7 А¥ ПЖ ,Ι.ΚΚΗ HF.'I’NFDPaKW 3 1 5
poreij'f, wn MW. Р. ЗАЖ ГЩАЖРРЫ ΑΡΎΙ.Ρ Г, 4 1 Ь
POCOIJ’Z PW Я5 Π ТAGF7AF ТМЕGMTTWFF. 3 4 2
РОСО]__Р8 РЧАМЬ βδ* MQDIraCLKMVQLLSIEDLE 3 4 8
Р0СС1 РЧ АКЛРЗ 58 ·.. AM S77S DHZ7SIMKTLKIQ V 3 4 9
IUM PIC MAGE-A4 3/'Ά КВАЬдЫКТОЕЬАНЕЬЬНК!» 3 2 W
POOH PH MAGE-A9 ETSiEK¥IH¥b1MJ®REPI .3 * И
РОССИ РШ ΜΑΘΕ-Α10 □' > .Е’шртсзнакть.’.’ташь 3 4 12
POCOl P12b BAGE 30% С A OLLQ ARLMKE ES PT7S WF, 3 2 13
Одиннадцать пептидов PEPI3 в этой иммунотерапевтической композиции могут стимулировать Тклеточные ответы у пациента А с вероятностью 84%, а два пептида PEPI4 (РОС01-Р2 и РОС01-Р5) с вероятностью 98%, согласно валидации теста PEPI, показанной в табл. 4. Т-клеточные ответы нацелены на 13 антигенов, экспрессируемых при раке яичников. Экспрессия этих раковых антигенов у пациента А не тестировалась. Вместо этого определялась вероятность успешного уничтожения раковых клеток на основе вероятности экспрессии антигена в раковых клетках пациента и положительного прогностического значения теста >1 PEPI3+ (количество AGP). Количество AGP прогнозирует эффективность вакцины для субъекта: Количество вакцинных антигенов, экспрессируемых в опухоли пациента (аденокарцинома яичников) с помощью PEPI. Количество AGP показывает количество опухолевых антигенов, которые вакцина распознает и стимулирует Т-клеточный ответ против опухоли пациента (поражает цель). Количество AGP зависит от частоты экспрессии вакцинных антигенов в опухоли субъекта и генотипа HLA субъекта. Соответствующее значение находится между 0 (отсутствие PEPI, презентированных какимлибо экспрессируемым антигеном) и максимальным количеством антигенов (все антигены экспрессированы и презентируют PEPI).
Вероятность того, что пациент А будет экспрессировать один или более из 13 антигенов, показана на фиг. 17. AGP95 (AGP с вероятностью 95%)=5, AGP50 (среднее - ожидаемое значение - дискретного распределения вероятностей)=7,9, mAGP (вероятность того, что AGP равно по меньшей мере 2)=100%, АР=13.
Поскольку фармацевтическая композиция для пациента А может содержать по меньшей мере из 2 из 13 пептидов (табл. 23), вследствие присутствия в вакцине или иммунотерапевтической композиции по меньшей мере двух фрагментов полипептида (эпитопов), которые могут связываться по меньшей мере с тремя HLA у индивидуума (>2 PEPI3+), был определен прогноз клинического ответа. Пептиды синтезировали, растворяли в фармацевтически приемлемом растворителе и смешивали с адъювантом перед инъ
- 39 046410 екцией. Желательно, чтобы пациент получал индивидуальную иммунотерапию с использованием по меньшей мере двух пептидных вакцин, но предпочтительно больше, чтобы повысить вероятность уничтожения раковых клеток и снизить вероятность рецидива. Для лечения пациента А 13 пептидов были составлены в виде 4x3 или 4 пептидов (РОС01/1, РОС01/2, РОС01/3, РОС01/4). Один цикл терапии определяется как введение всех 13 пептидов в течение 30 дней.
История болезни пациента:
Диагноз: Метастатическая аденокарцинома яичников
Возраст: 51 год
Семейный анамнез: рак толстой кишки и яичников (мать), рак молочной железы (бабушка) Опухолевая патология:
2011 г.: первый диагноз аденокарциномы яичников; операция Вертхайма и химиотерапия; удаление лимфатических узлов
2015 г.: метастазы в жировую ткань перикарда, иссечены
2016 г.: метастазы в печени
2017 г.: прогрессируют забрюшинные и брыжеечные лимфатические узлы; начальный рак брюшины с небольшим сопутствующим асцитом
Предшествующая терапия:
2012 г.: Паклитаксел-карбоплатин (6x)
2014 г.: Целикс-карбоплатин (1x)
2016-2017 гг.(9 месяцев): Лимпарза (Олапариб) 2x400 мг/день, перорально
2017 г.: Hycamtin inf. 5x2,5 мг (3x одна серия в месяц) Лечение вакциной PIT началось 21 апреля 2017 года; фиг. 18.
2017-2018 гг.: Пациент А прошел 8 циклов вакцинации в качестве дополнительной терапии и прожил 17 месяцев (528 дней) после начала лечения. В течение этого периода после 3-й и 4-й вакцинации она испытала частичный ответ как лучший ответ. Она скончалась в октябре 2018 г.
Биоанализ ELISPOT на интерферон (ZFN)-y подтвердил прогнозированные Т-клеточные ответы пациента А на 13 пептидов. Положительные Т-клеточные ответы (определяемые как >5 раз большие контроля или >3 раза большие контроля и >50 областей локализации) были обнаружены для всех 13 20мерных пептидов и всех 13 9-мерных пептидов, имеющих последовательность PEPI каждого пептида, способного связываться с максимальным количеством аллелей HLA класса I пациента А (фиг. 19).
Результаты МРТ опухоли пациента (базовый уровень 15 апреля 2016 г.) (BL: базовый уровень для оценки ответа опухоли на фиг. 20).
Заболевание ограничивалось в первую очередь печенью и лимфатическими узлами.
Использование МРТ ограничивает обнаружение легочных (пульмональных) метастазов.
Май 2016 г. - январь 2017 г.: Лечение олапарибом (FU1: последующее наблюдение 1 на фиг. 20) декабря 2016 г. (до лечения вакциной PIT). Наблюдалось резкое снижение опухолевой нагрузки с подтверждением ответа, полученного в (FU2: последующее наблюдение 2 на фиг. 20)
Январь - март 2017 г. - протокол ТОРО (топоизомераза) апреля 2017 г. (FU3 на фиг. 20) продемонстрировано возобновление роста существующих патологических изменений и появление новых патологических изменений, что привело к прогрессированию заболевания. Карциноматоз брюшины с повышенным асцитом.
Прогрессирующая опухоль печени и лимфатического узла апреля 2017 г. Начало применения PIT июля 2017 г (после 2-го цикла PIT): (FU4 на фиг. 20)
Быстрое прогрессирование лимфатических узлов, печени, забрюшинного и грудного отделов, значительное количество плевральной жидкости и асцита. Начало приема карбоплатина, гемцитабина, авастина.
сентября 2017 г. (после 3 циклов PIT): (FU5 на фиг. 20) частичный ответ
Полная ремиссия в плевральной области/жидкость и асцит
Ремиссия в печени, забрюшинной области и лимфатических узлах
Полученные данные предполагают псевдопрогрессирование.
ноября 2017 г. (после 4 циклов PIT): (FU6 на фиг. 20) частичный ответ
Полная ремиссия в грудном отделе. Ремиссия в печени, забрюшинной области и лимфатических узлах апреля 2018 г.: прогрессирование
Полная ремиссия в грудном и забрюшинном отделах Прогрессирование в печеночных центрах и лимфатических узлах июня 2018 г.: стабильное заболевание
Полная ремиссия в грудном и забрюшинном отделах Минимальная регрессия в печеночных центрах и лимфатических узлах
Июль 2018 г.: Прогрессирование
- 40 046410
Октябрь 2018 г.: Пациент А скончался.
Частичные данные МРТ для пациента А показаны в табл. 24 и на фиг. 20.
Таблица 24. Сводная таблица ответов на патологические изменения
PBRC01 для лечения метастатического рака молочной железы (пациент В)
Г енотип HLA класса I и класса II у пациентки с метастатическим раком молочной железы (пациент В) был определен на основе образца слюны. Для получения персонализированной фармацевтической композиции для пациента В, были отобраны двенадцать пептидов, каждый из которых отвечал следующим двум критериям: (i) происходил из антигена, который экспрессируется при раке молочной железы, как сообщается в авторитетных научных публикациях; и (ii) содержит фрагмент, который представляет собой Т-клеточный эпитоп, способный связываться по меньшей мере с тремя HLA класса I пациента В (табл. 25). Кроме того, каждый пептид оптимизирован для связывания максимального количества HLA класса II пациента. Двенадцать пептидов нацелены на двенадцать антигенов рака молочной железы. Вероятность того, что пациент В будет экспрессировать один или более из 12 антигенов, показана на фиг. 21.
Таблица 25. 12 пептидов для пациента В с раком молочной железы
Пептиды 1ЗДКЦИНЫ BRC01 AhiiiichMiniieiib Экспрессия Шиит СНОВ MAKC Пептиды 20-меры ^^.aI MAKC Keqll) ИА NO класса Π
I'WOI :-Н ‘ 4ldl 1» : i; гi y.4·;·. --. 3 h 1 1
I’BRUH d'l SPU?.- s.', . . .:..-,.-2. ....» ,-. . : 2 |S
I’HRi'IH d’.< ЛАЛ1Ч г rJ·..·'. ..-,1. 3 fi lb
РЖ11Я d'M· 4d|< S 71¾ iii.·,» ч.;д :.,- 3 β 1 .·'
iw< οι Lps M.«.l 41, ST . «А. = Λ» 3 4 IS
l’BR(Όί .а> NY-SARAS 4'?’ . . ,-, .· .-’4 , >. 2 1'5
I’BRflSl d’·.· ΙΙΓΙΜ-ΉΑ· 47» 3 5 20
ЖНЧИ d'X ΥΪ Ж 1 47» < ’ > ·,, f, 21
PBRt’lH d-1 м.у it.- чи H· .· »·..’ < · <·.»- 4 Λ 22
l”lRi Ы vP'.H 38» 3 3 2'
IMR< <JI . P 1 MMil 41 V .газ1· ж : i» 3 24
IWd d”,2 MAiiL-C '2 21·» -51^5п,.¥йу.у.,.. 4 2 24
Прогнозируемая эффективность: AGP95=4; 95% вероятности того, что вакцина PIT стимулирует CTL-ответы против 4 TSA, экспрессированных в клетках рака молочной железы пациента В. Дополнительные параметры эффективности: AGP50=6,45, mAGP=100%, АР=12.
Для лечения пациента В 12 пептидов были составлены в виде 4x3 пептидов (PBR01/1, PBR01/2, PBR01/3, PBR01/4). Один цикл терапии определяется как введение всех 12 пептидов в течение 30 дней (фиг. 21С).
История болезни пациента:
2013 г.: Диагноз: диагноз карциномы молочной железы; компьютерная томография и сканирование костей исключили метастатическое заболевание.
2014 г.: двусторонняя мастэктомия, послеоперационная химиотерапия
2016 г.: обширное метастатическое заболевание с поражением узлов как выше, так и ниже диафрагмы. Множественные метастазы в печень и легкие.
Терапия:
- 41 046410
2013-2014 гг.: Адриамицин-циклофосфамид и паклитаксел
2017 г.: Летрозол, палбоциклиб и госорелин и вакцина PIT
2018 г.: Состояние ухудшилось, пациент скончался в январе
Лечение вакциной PIT началось 7 апреля 2017 г. Схема лечения пациента В и основные характеристики заболевания представлены в табл. 26.
Таблица 26. Лечение и ответ пациента В
Дата (2017 г.) Март Май Июнь Сентябрь Ноябрь Декабрь
Схема лечения Вакцина PIT
Палбоциклиб летрозол госорелин Прерывание противоопухолевого лечения
Нейтрофилы (1,73,5/мм3) Нет данных 1.1 4.5 3.4 2.4 3
СЕА (< 5,0 нг/мл) 99 65 23 32 128 430
СА 15-3 (< 31,3 ед/мл) 322 333 138 76 272 230
Т1: Правый подмышечный лимфатический узел 15 мм и 11,6 suvmax 9 мм и 2,0 SUV^x Нет данных* Нет данных Нет данных бммиО suvmax
Т2: метастазы в правом легком 10 мм и 4,8 suvmax 7мми0 SUV^x Нет данных Нет данных Нет данных 4мми0 suvmax
Метастазы в левой подвздошной кости Не поддаете я измерени ю и 4,0 suvmax Регрессия иО suv^x Нет данных Нет данных Нет данных Регрессия и 0 suvmax
Множественные метастазы в печень Не поддается измерени ю и 11,5 suvmax Частична я регрессия и 6,1 suv^x Нет данных Нет данных Нет данных Прогрессиро ваниеи 16,8 suvmax
*нет данных
Было спрогнозировано с 95% достоверностью, что 8-12 вакцинных пептидов будут стимулировать Т-клеточные ответы у пациента В. Пептид-специфические Т-клеточные ответы измеряли во всех доступных образцах РВМС с использованием биоанализа ELISPOT на интерферон (IFN)-y (фиг. 22). Результаты подтвердили прогноз: Девять пептидов прореагировали положительно, демонстрируя, что Т-клетки могут распознавать опухолевые клетки пациента В, экспрессирующие антигены FISP1, BORIS, MAGE-A11, HOM-TES-85, NY-BR-1, MAGE-A9, SCP1, MAGE-A1 и MAGE-C2. Некоторые опухолеспецифические Тклетки присутствовали после 1-й вакцинации, и были усилены дополнительной терапией (например, MAGE-A1), другие стимулировались после повторной вакцинации (например, MAGE-A9). Такие обширные опухолеспецифические Т-клеточные ответы заметны у больных раком на поздней стадии.
История болезни и результаты пациента В:
марта 2017 г.: Перед лечением вакциной PIT
Мультиметастатическое заболевание печени с истинно внешней компрессией начальной части желчного протока и массивной дилатацией всего внутрипеченочного желчного тракта.
Глютеновая, печеночная и забрюшинная аденопатия
Март 2017 г.: Начало лечения - Летрозол, палбоциклиб, госорелин и вакцина PIT
Май 2017 г.: Прекращение приема лекарств мая 2017 г.: После 1 цикла PIT
Снижение метаболической активности опухоли (PET CT) печени, лимфатических узлов легких и других метастазов на 83%.
Июнь 2017 г.: Нормализованные значения нейтрофилов указывают на прерывание приема палбоциклиба, подтвержденное пациентом.
4-месячный запаздывающий синдром отмены опухолевых маркеров
Март-май 2017 г.: СЕА и СА оставались повышенными в соответствии с результатами противоракового лечения пациента (Ban, Future Oncol 2018)
Июнь-сентябрь 2017 г.: СЕА и СА постоянно снижались при задержке ответа на иммунотерапию.
Качество жизни:
- 42 046410
Февраль-март 2017 г.: Плохое, госпитализация с желтухой
Апрель-октябрь 2017 г.: Отличное
Ноябрь 2017 г.: Ухудшение состояния (просачивание опухоли?)
Январь 2018 г.: Пациент В скончался.
Иммунологические результаты сведены на фиг. 22.
Измерение клинических исходов пациента: За месяц до начала лечения вакциной PIT при PET CT задокументировано обширное заболевание, вызванное DFG, с поражением узлов, как выше, так и ниже диафрагмы (Табл. 26). У пациента были прогрессирующие множественные метастазы в печени, мультифокальные костные и легочные метастазы и забрюшинная аденопатия. Содержание внутрипеченочных ферментов было повышено, что соответствовало патологии, вызванной метастазами в печень с повышенным билирубином и желтухой. Пациентка принимала летрозол, палбоциклиб и госорелин в качестве противораковой терапии. Через два месяца после начала вакцинации PIT пациентка почувствовала себя хорошо, качество жизни нормализовалось. Фактически, ее PET CT показала значительную морфометаболическую регрессию метастазов в печень, легкие, кости и лимфатические узлы. Метаболической аденопатии на наддиафрагмальной стадии не выявлено.
Комбинация палбоциклиба и персонализированной вакцины, вероятно, была ответственной за замечательный ранний ответ, наблюдаемый после введения вакцины. Было показано, что палбоциклиб улучшает активность иммунотерапии за счет увеличения презентирования TSA HLA и уменьшения пролиферации Tregs (регуляторные Т-клетки): (Goel et al. Nature. 2017:471-475). Результаты лечения пациента В позволяют предположить, что вакцину PIT можно использовать в качестве дополнения к современной терапии для достижения максимальной эффективности.
Опухолевые биомаркеры пациента В отслеживались, чтобы отделить эффекты современной терапии от эффектов вакцины PIT. Уровень онкомаркеров не изменялся в течение первых 2-3 месяцев лечения, затем резко упал, что свидетельствует об отсроченном эффекте, типичном для иммунотерапии (т абл. 26). Кроме того, в то время, когда уровень биомаркеров опухоли упал, пациент уже добровольно прервал лечение, что подтверждается увеличением количества нейтрофилов.
После 5-го курса лечения PIT у пациента появились симптомы. Снова повысились уровни онкомаркеров и ферментов печени. Через 33 дня после последней вакцинации PIT PET CT пациента показала значительное метаболическое прогрессирование в печени, брюшине, скелете и левом надпочечнике, что подтвердили лабораторные данные. Дискретный рецидив отдаленных метастазов может быть вызван потенциальной иммунной резистентностью; возможно, вызванной подавлением экспрессии обоих HLA, что ухудшает распознавание опухоли стимулированными PIT Т-клетками. Однако PET CT выявила полную регрессию метаболической активности всех подмышечных и средостенных подмышечных наддиафрагмальных мишеней (табл. 26). Эти локализованные ответы опухоли можно отнести к известным отсроченным и продолжительным ответам на иммунотерапию, поскольку маловероятно, что после прекращения лечения противораковыми препаратами эти участки опухоли не рецидивируют.
Персонализированная иммунотерапевтическая композиция для лечения пациента с метастатической карциномой молочной железы (пациент С)
Вакцина PIT, аналогичная по конструкции описанной для пациента А и пациента В, была получена для лечения пациента (пациент С) с метастатической карциномой молочной железы. Вакцина PIT содержала 12 PEPI. Прогнозируемая эффективность вакцины PIT составляет AGP=4. Схема лечения пациента показана на фиг. 23. Опухолевая патология 2011 г. Исходная опухоль: HER2-, ER+, сторожевой лимфатический узел отрицательный 2017 г. Множественные метастазы в кости: ER+, цитокератин 7+, цитокератин 20-, СА125-, TTF1-, CDX2Терапия
2011 г. Обширная местная резекция, сторожевые лимфатические узлы отрицательны; лучевая терапия
2017 г. - Противораковая терапия (Тх): Летрозол (2,5 мг/сут.), деносумаб;
Лучевая терапия (Rx): одна кость
Вакцина PIT (3 цикла) в качестве дополнения к стандарту лечения
Биоанализ подтвердил положительные Т-клеточные ответы (определяемые как в >5 раз большие контроля или в >3 раза большие контроля и >50 областей локализации) для 11 из 12 20-мерных пептидов вакцины PIT и 11 из 12 9-мерных пептидов, имеющих последовательность PEPI каждого пептида, способного связываться с максимальным количеством аллелей HLA класса I пациента (Фиг. 24). Долгосрочные ответы Т-клеток памяти были обнаружены через 14 месяцев после последней вакцинации (Фиг. 24CD).
Результат лечения
Клинические результаты лечения пациента С показаны в табл. 27. Пациент С имеет частичный ответ и признаки заживления метастазов в кости.
- 43 046410
Таблица 27. Клинические результаты лечения рака молочной железы пациента С
Перед применением PIT +70 дней * (10 недель) +150 дней * (21 неделя) +388 дней * (55 недель)
Биопсия кости Мет. рака молочной железы DCIS Не выполнялось RIB5 негативный Не выполнялось
РЕТ СТ Множеств енные метастазы Только RIB5 является DFG- авидным Не выполнялось Не выполнялось
СТ Множеств енные метастазы Не выполнялось Не выполнялось Заживление костных образований (склеротическ ие очаги)
СА-15-3 87 50 32 24
После 3-го цикла вакцинации PIT
Иммунные ответы показаны на фиг. 24. Прогнозируемая иммуногенность, PEPI = 12 (CI95% [8,12]
Обнаруженная иммуногенность: специфические к 11 (20-мер) и 11 (9-мер) антигенам Т-клеточные ответы после 3 вакцинаций PIT (фиг. 24А, В). Через 4, 5, 11 или 14 месяцев после последней вакцинации иммунный ответ, специфический для вакцины PIT, все еще может быть обнаружен (фиг. 24С, D).
Персонализированная иммунотерапевтическая композиция для лечения пациента с метастатическим колоректальным раком (пациент D)
Опухолевая патология
2017 г. (февраль) mCRC (MSS) с метастазами в печень, операция первичной опухоли (сигмовидной кишки). рТЗ pN2b (8/16) М1. Мутации KRAS G12D, TP53-C135Y, KDR-Q472H, MET-T1010I. Экспрессия SATB2. EGFRwt, PIK3CA-I391M (без драйвера).
2017 г. (июнь) Частичная резекция печени: KRAS-G12D (35G>A) NRAS wt,
2018 г. (май) 2-я резекция: экспрессия SATB2, метастазы в легких 3^21
Терапия:
2017 г. FOLFOX-4 (оксалиплатин, Са-фолинат, 5-FU) ^ аллергическая реакция во время 2-го курса лечения DeGramont (5-FU + Са-фолинат)
2018 (июнь) ^ FOLFIRI плюс рамуцирумаб, каждые две недели; химиоэмболизация
2018 (октябрь) Вакцинация PIT (13 специфических для пациента пептидов, 4 дозы) в качестве дополнения к стандарту лечения.
Схема лечения пациента показана на фиг. 25.
Результат лечения
Состояние пациента хорошее, прогрессирование заболевания легких через 8 месяцев подтверждено СТ.
Как стимулированные PIT, так и ранее существовавшие Т-клеточные ответы измеряли в присутствии Fluorospot из РВМС с использованием 9-мерных и 20-мерных пептидов для стимулирования (Фиг. 26).
Сводные данные о частоте иммунного ответа и результатах иммуногенности подтверждают правильную схему для выбора целевого антигена, а также для стимулирования иммунных ответов, нацеленных на несколько пептидов, как CD4+, так и CD8+ специфических.
Таблица 28. Сводная таблица иммунологического анализа пациентов A-D
Идентификатор пациента Измеренная иммуногенность различных пептидов вакцины *
CD4+ Т клетки CD8+ Т клетки
Пациент А 13/13(100%) 13/13(100%)
Пациент В 9/12 (75 %) 1/12(8%)
Пациент С 11/12(92%) 11/12(92%)
Пациент D 7/13(54%) 13/13(100%)
IRR (соотношение пациентов с иммунным ответом) 4/4 4/4
Соотношение иммуногенных пептидов (медианное) 10/12-13 10/12-13
* После 1-3 циклов вакцинации

Claims (10)

1. Способ определения риска развития рака у субъекта-человека, включающий в себя количественное определение триплетов HLA (HLAT) субъекта, способных связываться с Т-клеточными эпитопами в аминокислотной последовательности ассоциированных с опухолью антигенов (ТАА), причем каждый HLA из HLAT способен связываться с тем же Т-клеточным эпитопом, и определение риска развития рака у субъекта, при этом по сравнению с ТАА меньшее количество HLAT, способных связываться с Тклеточными эпитопами ТАА, соответствуют более высокому риску развития рака у субъекта.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что рак выбран из меланомы, рака легких, почечноклеточного рака, колоректального рака, рака мочевого пузыря, глиомы, рака головы и шеи, рака яичников, немеланомного рака кожи, рака простаты, рака почки, рака желудка, рака печени, рака шейки матки, рака пищевода, неходжкинской лимфомы, лейкемии, рака поджелудочной железы, рака тела матки, рака губы, рака полости рта, рака щитовидной железы, рака мозга, рака нервной системы, рака желчного пузыря, рака гортани, рака глотки, миеломы, рака носоглотки, лимфомы Ходжкина, тестикулярного рака, рака молочной железы, рака желудка, рака мочевого пузыря, колоректального рака, почечно-клеточного рака, гепатоцеллюлярного рака, детского онкологического заболевания и саркомы Капоши.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что у субъекта определен повышенный риск развития рака, причем способ дополнительно включает в себя выбор лечения рака для субъекта.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что лечение включает в себя введение субъекту пептида, или полинуклеиновой кислоты, или вектора, кодирующего пептид, который содержит аминокислотную по следовательность, которая:
(a) представляет собой фрагмент ТАА и (b) содержит Т-клеточный эпитоп, способный связываться с HLAT субъекта; причем необязательно фрагмент ТАА фланкирован на N- и/или С-конце дополнительными аминокислотами, которые не составляют часть последовательности ТАА.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что ТАА выбирают из тех, которые перечислены в табл. 2 или 11.
6. Способ по п.4 или 5, дополнительно включающий в себя введение субъекту одного или более пептидов, полинуклеиновых кислот или векторов.
7. Способ лечения рака у субъекта, отличающийся тем, что у субъекта был определен повышенный риск развития рака с использованием способа по п. 1 или 2 и при этом способ лечения включает в себя введение субъекту одного или более пептидов или одной или более полинуклеиновых кислот, или векторов, которые кодируют один или более пептидов, содержащих аминокислотную последовательность, которая:
(i) представляет собой фрагмент ТАА и (ii) содержит Т-клеточный эпитоп, способный связываться с HLAT субъекта.
8. Способ по п.7, где фрагмент ТАА фланкирован на N- и/или С-конце дополнительными аминокислотами, которые не составляют часть последовательности ТАА.
9. Способ по п.7, отличающийся тем, что ТАА выбирают из тех, которые перечислены в табл. 2 или 11.
10. Система для определения риска развития рака у человека, содержащая:
(a) модуль хранения, выполненный с возможностью хранения данных, содержащих генотип HLA класса I субъекта и аминокислотные последовательности ТАА;
(b) вычислительный модуль, выполненный с возможностью количественной оценки HLAT субъекта, способных связываться с Т-клеточными эпитопами в аминокислотной последовательности ТАА, причем каждый HLA HLAT способен связываться с тем же Т-клеточным эпитопом; и (c) модуль вывода, выполненный с возможностью отображения показателей риска того, что у субъекта разовьется рак, и/или рекомендованное лечение для субъекта.
EA202190671 2018-09-04 2019-09-03 Иммуногенетическая скрининговая проба на рак EA046410B1 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1814361.0 2018-09-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EA046410B1 true EA046410B1 (ru) 2024-03-11

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11628211B2 (en) Vaccine
US20220160854A1 (en) Composition and process for preparing vaccine
JP2024037890A (ja) Ｔ細胞エピトープの免疫原性の予測
JP2015533473A (ja) 個別のがんワクチン及び適応免疫細胞療法
US11666644B2 (en) Peptide vaccines
JP7419351B2 (ja) 免疫原性がん検診検査
EA046410B1 (ru) Иммуногенетическая скрининговая проба на рак
JP2024508677A (ja) 個別化がんワクチン用ネオアンチゲンのランク付け