KR20220163523A - 신생항원 및 이것의 사용 방법 - Google Patents

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KR20220163523A
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cancer
neoantigenic peptide
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마이클 스티븐 루니
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바이오엔테크 유에스 인크.
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Abstract

본 발명의 분야는, 예를 들어, 암의 면역요법에서의 면역치료 펩티드, 펩티드 결합 물질, 및 그 용도에 관한 것이다.

Description

신생항원 및 이것의 사용 방법{NEOANTIGENS AND METHODS OF THEIR USE}
[상호 참조]
본 출원은 2016년 3월 31일 출원된 미국 가출원 번호 62/316,530, 2016년 3월 31일 출원된 미국 가출원 번호 62/316,533, 2016년 3월 31일 출원된 미국 가출원 번호 62/316,547, 2016년 3월 31일 출원된 미국 가출원 번호 62/316,552, 2016년 4월 1일 출원된 미국 가출원 번호 62/316,567, 및 2016년 4월 1일 출원된 미국 가출원 번호 62/316,571(상기 가출원들은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 대한 우선권을 주장한다.
[발명의 분야]
본 발명의 분야는, 예를 들어, 암의 면역요법에서의 면역치료 펩티드, 펩티드를 코딩하는 핵산, 펩티드 결합 물질, 및 그의 용도에 관한 것이다. 한 측면에서, 본 발명은 단독으로 또는 다른 종양 연관 펩티드, 항암, 또는 면역조절제와 함께 조합하여 암을 치료하는 데 유용한 신생항원성 펩티드를 제공한다.
종양 백신은 전형적으로, 함께 작용하여, 종양 세포를 인식하고, 용해시키는 항원 특이적 세포독성 T 세포(CTL: cytotoxic T cell)를 유도하는 종양 항원 및 면역자극성 분자(예컨대, 애쥬번트, 사이토카인 또는 TLR 리간드)로 구성된다. 상기 백신은 전체 종양 세포 제제 형태로 공유 조직 제한 종양 항원, 또는 공유 및 환자 특이적 항원의 혼합물을 함유한다. 공유 조직 제한 종양 항원은 이상적으로는 다수의 개체 간에 종양에서 선택적 발현을 하는 면역원성 단백질이고, 이는 보편적으로는 합성 펩티드 또는 재조합 단백질로서 환자에게 전달된다. 그에 반해, 전체 종양 세포 제제는 자가 방사선 조사된 세포, 세포 용해물, 세포 융합물, 열 충격 단백질 제제 또는 전체 mRNA로서 환자에게 전달된다. 전체 종양 세포는 자가 환자로부터 단리된 것이기 때문에, 세포는 환자 특이적 종양 항원 뿐만 아니라, 공유 종양 항원도 포함할 수 있다. 마지막으로, 백신에서는 드물게 사용되는 것으로서, 아미노산 서열 변경을 초래하는 종양 특이적 돌연변이를 갖는 (환자 특이적이거나, 또는 공유일 수 있는) 항원으로 구성된, 제3 부류의 종양 항원인 신생항원이 있다. 상기 돌연변이화된 단백질은 (a) 돌연변이 및 그의 상응하는 단백질이 오직 종양에만 존재하는 바, 이에 종양 세포에 고유한 것이고; (c) 체액성 면역 및 세포성 면역, 둘 모두에 의한 것을 포함한는 면역 인식에 탁월한 표적을 제공한다. 그러나, 개인맞춤형 신생항원을 사용하기 위해서는 각 환자의 게놈의 시퀀싱, 및 이어서, 환자 특이적 신생항원 조성물 제조가 요구된다. 따라서, 추가의 암 치료제 개발이 여전히 요구되고 있다.
본원에서는 종양 특이적 네오에피토프를 포함하는 단리된 신생항원성 펩티드로서, 상기 단리된 신생항원성 펩티드는 천연 폴리펩티드가 아니고, 상기 네오에피토프는 AxByCz로 표시되는 아미노산 서열의 적어도 8개의 인접한 아미노산을 포함하며, 여기서, 각각의 A 및 C는 천연 폴리펩티드에 상응하는 아미노산을 나타내고, y는 1 이상이고, B는 천연 폴리펩티드의 아미노산 치환 또는 삽입체를 나타내고, x + y + z는 8 이상이고, 적어도 8개의 인접한 아미노산은 By를 포함하고, 상기 천연 폴리펩티드는 (a) ABL1, 여기서, AxByCz는 (i)
VADGLITTLHYPAPKRNKPTVYGVSPNYDKWEMERTDITMKHKLGGGQYGKVYEGVWKKYSLTVAVKTLKEDTMEVEEFLKEAAVMKEIKHPNLVQLLGVC, (ii) VADGLITTLHYPAPKRNKPTVYGVSPNYDKWEMERTDITMKHKLGGGQYGVVYEGVWKKYSLTVAVKTLKEDTMEVEEFLKEAAVMKEIKHPNLVQLLGVC, (iii) LLGVCTREPPFYIITEFMTYGNLLDYLRECNRQEVNAVVLLYMATQISSATEYLEKKNFIHRDLAARNCLVGENHLVKVADFGLSRLMTGDTYTAHAGAKF, (iv) SLTVAVKTLKEDTMEVEEFLKEAAVMKEIKHPNLVQLLGVCTREPPFYIIIEFMTYGNLLDYLRECNRQEVNAVVLLYMATQISSAMEYLEKKNFIHRDLA, 또는 (v) STVADGLITTLHYPAPKRNKPTVYGVSPNYDKWEMERTDITMKHKLGGGQHGEVYEGVWKKYSLTVAVKTLKEDTMEVEEFLKEAAVMKEIKHPNLVQLLG인 것; (b) ALK, 여기서, AxByCz는 (i) SSLAMLDLLHVARDIACGCQYLEENHFIHRDIAARNCLLTCPGPGRVAKIADFGMARDIYRASYYRKGGCAMLPVKWMPPEAFMEGIFTSKTDTWSFGVLL, 또는 (ii) QVAVKTLPEVCSEQDELDFLMEALIISKFNHQNIVRCIGVSLQSLPRFILMELMAGGDLKSFLRETRPRPSQPSSLAMLDLLHVARDIACGCQYLEENHFI인 것; (c) BRAF, 여기서, AxByCz는 MIKLIDIARQTAQGMDYLHAKSIIHRDLKSNNIFLHEDLTVKIGDFGLATEKSRWSGSHQFEQLSGSILWMAPEVIRMQDKNPYSFQSDVYAFGIVLYELM인 것; (d) BTK, 여기서, AxByCz는 MIKEGSMSEDEFIEEAKVMMNLSHEKLVQLYGVCTKQRPIFIITEYMANGSLLNYLREMRHRFQTQQLLEMCKDVCEAMEYLESKQFLHRDLAARNCLVND인 것; (e) EEF1B2, 여기서, AxByCz는 MGFGDLKSPAGLQVLNDYLADKSYIEGYVPSQADVAVFEAVSGPPPADLCHALRWYNHIKSYEKEKASLPGVKKALGKYGPADVEDTTGSGAT인 것; (f) EGFR, 여기서, AxByCz는 (i) SLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIIRNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLL, 또는 (ii) IPVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTSTVQLIMQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQIAKGMNYLEDRRLVHRDLAA인 것; (g) ERBB3, 여기서, AxByCz는 ERCEVVMGNLEIVLTGHNADLSFLQWIREVTGYVLVAMNEFSTLPLPNLRMVRGTQVYDGKFAIFVMLNYNTNSSHALRQLRLTQLTEILSGGVYIEKNDK인 것; (h) ESR1, 여기서, AxByCz는 (i) HLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEHLYSMKCKNVVPLYGLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEA, (ii) NQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLPSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSH, (iii) IHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEHLYSMKCKNVVPLCDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGE, (iv) IHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEHLYSMKCKNVVPLNDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGE, 또는 (v) IHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEHLYSMKCKNVVPLSDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGE인 것; (i) FGFR3, 여기서, AxByCz는 HRIGGIKLRHQQWSLVMESVVPSDRGNYTCVVENKFGSIRQTYTLDVLERCPHRPILQAGLPANQTAVLGSDVEFHCKVYSDAQPHIQWLKHVEVNGSKVG인 것; (j) FRG1B, 여기서, AxByCz는 AVKLSDSRIALKSGYGKYLGINSDELVGHSDAIGPREQWEPVFQNGKMALSASNSCFIRCNEAGDIEAKSKTAGEEEMIKIRSCAEKETKKKDDIPEEDKG인 것; (k) HER2, 여기서, AxByCz는 GSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAIKVLRENTSPKANKEILDEAYVMAGLGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLDHVRENRGRLGSQDLLNWCM인 것; (l) IDH1, 여기서, AxByCz는 (i) RVEEFKLKQMWKSPNGTIRNILGGTVFREAIICKNIPRLVSGWVKPIIIGHHAYGDQYRATDFVVPGPGKVEITYTPSDGTQKVTYLVHNFEEGGGVAMGM, (ii) RVEEFKLKQMWKSPNGTIRNILGGTVFREAIICKNIPRLVSGWVKPIIIGCHAYGDQYRATDFVVPGPGKVEITYTPSDGTQKVTYLVHNFEEGGGVAMGM, (iii) RVEEFKLKQMWKSPNGTIRNILGGTVFREAIICKNIPRLVSGWVKPIIIGGHAYGDQYRATDFVVPGPGKVEITYTPSDGTQKVTYLVHNFEEGGGVAMGM, 또는 (iv) RVEEFKLKQMWKSPNGTIRNILGGTVFREAIICKNIPRLVSGWVKPIIIGSHAYGDQYRATDFVVPGPGKVEITYTPSDGTQKVTYLVHNFEEGGGVAMGM인 것; (m) KIT, 여기서, AxByCz는 (i) VEATAYGLIKSDAAMTVAVKMLKPSAHLTEREALMSELKVLSYLGNHMNIANLLGACTIGGPTLVITEYCCYGDLLNFLRRKRDSFICSKQEDHAEAALYK, 또는 (ii) VEATAYGLIKSDAAMTVAVKMLKPSAHLTEREALMSELKVLSYLGNHMNIANLLGACTIGGPTLVITEYCCYGDLLNFLRRKRDSFICSKQEDHAEAALYK인 것; (n) MEK, 여기서, AxByCz는 (i) ISELGAGNGGVVFKVSHKPSGLVMARKLIHLEIKPAIRNQIIRELQVLHESNSPYIVGFYGAFYSDGEISICMEHMDGGSLDQVLKKAGRIPEQILGKVSI, 또는 (ii) LGAGNGGVVFKVSHKPSGLVMARKLIHLEIKPAIRNQIIRELQVLHECNSLYIVGFYGAFYSDGEISICMEHMDGGSLDQVLKKAGRIPEQILGKVSIAVI인 것; (o) MYC, 여기서, AxByCz는 (i) MPLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSDLQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGG, (ii) FTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLSTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTELLG, 또는 (iii) TNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPIPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTELLGG인 것; (p) PDGFRa, 여기서, AxByCz는 VAVKMLKPTARSSEKQALMSELKIMTHLGPHLNIVNLLGACTKSGPIYIIIEYCFYGDLVNYLHKNRDSFLSHHPEKPKKELDIFGLNPADESTRSYVILS인 것; (q) PIK3CA, 여기서, AxByCz는 (i) IEEHANWSVSREAGFSYSHAGLSNRLARDNELRENDKEQLKAISTRDPLSKITEQEKDFLWSHRHYCVTIPEILPKLLLSVKWNSRDEVAQMYCLVKDWPP, (ii) HANWSVSREAGFSYSHAGLSNRLARDNELRENDKEQLKAISTRDPLSEITKQEKDFLWSHRHYCVTIPEILPKLLLSVKWNSRDEVAQMYCLVKDWPPIKP, 또는 (iii) LFINLFSMMLGSGMPELQSFDDIAYIRKTLALDKTEQEALEYFMKQMNDARHGGWTTKMDWIFHTIKQHALN인 것; (r) POLE, 여기서, AxByCz는 QRGGVITDEEETSKKIADQLDNIVDMREYDVPYHIRLSIDIETTKLPLKFRDAETDQIMMISYMIDGQGYLITNREIVSEDIEDFEFTPKPEYEGPFCVFN인 것; (s) PTEN, 여기서, AxByCz는 KFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGQTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSY인 것; (t) RAC1, 여기서, AxByCz는 MQAIKCVVVGDGAVGKTCLLISYTTNAFSGEYIPTVFDNYSANVMVDGKPVNLGLWDTAGQEDYDRLRPLSYPQTVGET인 것; 및 (u) TP53, 여기서, AxByCz는 (i) IRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGSMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEP, (ii) TYSPALNKMFCQLAKTCPVQLWVDSTPPPGTRVRAMAIYKQSQHMTEVVRHCPHHERCSDSDGLAPPQHLIRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEV, (iii) EGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNQRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHE, (iv) EGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNWRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHE, 또는 (v) PEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVCVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPL인 것으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자에 의해 코딩되는 것인, 단리된 신생항원성 펩티드를 제공한다.
실시양태에서, 천연 폴리펩티드는 EGFR, ERBB3 또는 FGFR3 유전자에 의해 코딩되는 것이고, 적어도 하나의 By는 세포외에서 발현되는 것이다.
본원에서는 종양 특이적 네오에피토프를 포함하는 단리된 신생항원성 펩티드로서, 상기 단리된 신생항원성 펩티드는 천연 폴리펩티드가 아니고, 상기 네오에피토프는 AxByCz로 표시되는 아미노산 서열의 적어도 8개의 인접한 아미노산을 포함하며, 여기서, 각각의 A는 천연 폴리펩티드에 상응하는 아미노산이고; By는 존재하지 않고; 각각의 C는 천연 폴리펩티드를 코딩하는 서열의 프레임시프트에 의해 코딩되는 아미노산이고; x + y + z는 8 이상이고; 적어도 8개의 인접한 아미노산은 적어도 하나의 Cz를 포함하고; 상기 천연 폴리펩티드는 (a) APC, 여기서, Cz는 (i)
AKFQQCHSTLEPNPADCRVLVYLQNQPGTKLLNFLQERNLPPKVVLRHPKVHLNTMFRRPHSCLADVLLSVHLIVLRVVRLPAPFRVNHAVEW, (ii) APVIFQIALDKPCHQAEVKHLHHLLKQLKPSEKYLKIKHLLLKRERVDLSKLQ, 또는 (iii) MLQFRGSRFFQMLILYYILPRKVLQMDFLVHPA인 것; (b) ARID1A, 여기서, Cz는 (i) ALGPHSRISCLPTQTRGCILLAATPRSSSSSSSNDMIPMAISSPPKAPLLAAPSPASRLQCINSNSRITSGQWMAHMALLPSGTKGRCTACHTALGRGSLSSSSCPQPSPSLPASNKLPSLPLSKMYTTSMAMPILPLPQLLLSADQQAAPRTNFHSSLAETVSLHPLAPMPSKTCHHK, (ii) AHQGFPAAKESRVIQLSLLSLLIPPLTCLASEALPRPLLALPPVLLSLAQDHSRLLQCQATRCHLGHPVASRTASCILP, (iii) PILAATGTSVRTAARTWVPRAAIRVPDPAAVPDDHAGPGAECHGRPLLYTADSSLWTTRPQRVWSTGPDSILQPAKSSPSAAAATLLPATTVPDPSCPTFVSAAATVSTTTAPVLSASILPAAIPASTSAVPGSIPLPAVDDTAAPPEPAPLLTATGSVSLPAAATSAASTLDALPAGCVSSAPVSAVPANCLFPAALPSTAGAISRFIWVSGILSPLNDLQ, (iv) PCRAGRRVPWAASLIHSRFLLMDNKAPAGMVNRARLHITTSKVLTLSSSSHPTPSNHRPRPLMPNLRISSSHSLNHHSSSPLSLHTPSSHPSLHISSPRLHTPPSSRRHSSTPRASPPTHSHRLSLLTSSSNLSSQHPRRSPSRLRILSPSLSSPSKLPIPSSASLHRRSYLKIHLGLRHPQPPQ, (v) RTNPTVRMRPHCVPFWTGRILLPSAASVCPIPFEACHLCQAMTLRCPNTQGCCSSWAS, 또는 (vi) TNQALPKIEVICRGTPRCPSTVPPSPAQPYLRVSLPEDRYTQAWAPTSRTPWGAMVPRGVSMAHKVATPGSQTIMPCPMPTTPVQAWLEA인 것; (c) β2M, 여기서, Cz는 (i) RMERELKKWSIQTCLSARTGLSISCTTLNSPPLKKMSMPAV, 또는 (ii) LCSRYSLFLAWRLSSVLQRFRFTHVIQQRMESQIS인 것; (d) CDH1, 여기서, Cz는 (i) RSACVTVKGPLASVGRHSLSKQDCKFLPFWGFLEEFLLC, (ii) IQWGTTTAPRPIRPPFLESKQNCSHFPTPLLASEDRRETGLFLPSAAQKMKKAHFLKTWFRSNPTKTKKARFSTASLAKELTHPLLVSLLLKEKQDG, (iii) PTDPFLGLRLGLHLQKVFHQSHAEYSGAPPPPPAPSGLRFWNPSRIAHISQLLSWPQKTEERLGYSSHQLPRK, (iv) FCCSCCFFGGERWSKSPYCPQRMTPGTTFITMMKKEAEKRTRTLT, 또는 (v) WRRNCKAPVSLRKSVQTPARSSPARPDRTRRLPSLGVPGQPWALGAAASRRCCCCCRSPLGSARSRSPATLALTPRATRSRCPGATWREAASWAE인 것; (e) GATA3, 여기서, Cz는 (i) PGRPLQTHVLPEPHLALQPLQPHADHAHADAPAIQPVLWTTPPLQHGHRHGLEPCSMLTGPPARVPAVPFDLHFCRSSIMKPKRDGYMFLKAESKIMFATLQRSSLWCLCSNH; 또는 (ii) PRPRRCTRHPACPLDHTTPPAWSPPWVRALLDAHRAPSESPCSPFRLAFLQEQYHEA인 것; (f) MLL2, 여기서, Cz는 TRRCHCCPHLRSHPCPHHLRNHPRPHHLRHHACHHHLRNCPHPHFLRHCTCPGRWRNRPSLRRLRSLLCLPHLNHHLFLHWRSRPCLHRKSHPHLLHLRRLYPHHLKHRPCPHHLKNLLCPRHLRNCPLPRHLKHLACLHHLRSHPCPLHLKSHPCLHHRRHLVCSHHLKSLLCPLHLRSLPFPHHLRHHACPHHLRTRLCPHHLKNHLCPPHLRYRAYPPCLWCHACLHRLRNLPCPHRLRSLPRPLHLRLHASPHHLRTPPHPHHLRTHLLPHHRRTRSCPCRWRSHPCCHYLRSRNSAPGPRGRTCHPGLRSRTCPPGLRSHTYLRRLRSHTCPPSLRSHAYALCLRSHTCPPRLRDHICPLSLRNCTCPPRLRSRTCLLCLRSHACPPNLRNHTCPPSLRSHACPPGLRNRICPLSLRSHPCPLGLKSPLRSQANALHLRSCPCSLPLGNHPYLPCLESQPCLSLGNHLCPLCPRSCRCPHLGSHPCRLS인 것; (g) PTEN, 여기서, Cz는 (i) SWKGTNWCNDMCIFITSGQIFKGTRGPRFLWGSKDQRQKGSNYSQSEALCVLL, (ii) KRTKCFTFG, (iii) PIFIQTLLLWDFLQKDLKAYTGTILMM, (iv) QKMILTKQIKTKPTDTFLQILR, (v) GFWIQSIKTITRYTIFVLKDIMTPPNLIAELHNILLKTITHHS, (vi) NYSNVQWRNLQSSVCGLPAKGEDIFLQFRTHTTGRQVHVL, 또는 (vii) YQSRVLPQTEQDAKKGQNVSLLGKYILHTRTRGNLRKSRKWKSM인 것; (h) TP53, 여기서, Cz는 (i) SSQNARGCSPRGPCTSSSYTGGPCTSPLLAPVIFCPFPENLPGQLRFPSGLLAFWDSQVCDLHVLPCPQQDVLPTGQDLPCAAVG, (ii) GAAPTMSAAQIAMVWPLLSILSEWKEICVWSIWMTETLFDIVWWCPMSRLRLALTVPPSTTTTCVTVPAWAA, (iii) TGGPSSPSSHWKTPVVIYWDGTALRCVFVPVLGETGAQRKRISARKGSLTTSCPQGALSEHCPTTPAPLPSQRRNHWMENISPFRSVGVSASRCSES, (iv) FHTPARHPRPRHGHLQAVTAHDGGCEALPPP, (v) CCPRTILNNGSLKTQVQMKLPECQRLLPPWPLHQQLLHRRPLHQPPPGPCHLLSLPRKPTRAATVSVWASCILGQPSL, (vi) VRKHFQTYGNYFLKTTFCPPCRPKQWMI, 또는 (vii) LARTPLPSTRCFANWPRPALCSCGLIPHPRPAPASAPWPSTSSHST인 것; 또는 (i) VHL, 여기서, Cz는 (i) ELQETGHRQVALRRSGRPPKCAERPGAADTGAHCTSTDGRLKISVETYTVSSQLLMVLMSLDLDTGLVPSLVSKCLILRVK, (ii) KSDASRLSGA, (iii) RTAYFCQYHTASVYSERAMPPGCPEPSQA, (iv) TRASPPRSSSAIAVRASCCPYGSTSTASRSPTQRCRLARAAASTATEVTFGSSEMQGHTMGFWLTKLNYLCHLSMLTDSLFLPISHCQCIL, (v) SSLRITGDWTSSGRSTKIWKTTQMCRKTWSG, 또는 (vi) RRRRGGVGRRGVRPGRVRPGGTGRRGGDGGRAAAARAALGELARALPGHLLQSQSARRAARMAQLRRRAAALPNAAAWHGPPHPQLPRSPLALQRCRDTRWASG인 것; (j) ACVR2A, 여기서, AxByCz는 (i) GVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKRQP, 또는 (ii) GVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKTALKYIFVAVRAICVMKSFLIFRRWKSHSPLQIQLHLSHPITTSCSIPWCHLC인 것; (k) C15ORF40, 여기서, AxByCz는 TAEAVNVAIAAPPSEGEANAELCRYLSKVLELRKSDVVLDKVGLALFFFFFETKSCSVAQAGVQWRSLGSLQPPPPGFKLFSCLSFLSSWDYRRMPPCLANFCIFNRDGVSPCWSGWS인 것; (l) CNOT1, 여기서, AxByCz는 (i) LSVIIFFFVYIWHWALPLILNNHHICLMSSIILDCNSVRQSIMSVCFFFFSVIFSTRCLTDSRYPNICWFK, 또는 (ii) LSVIIFFFVYIWHWALPLILNNHHICLMSSIILDCNSVRQSIMSVCFFFFCYILNTMFDR인 것; (m) EIF2B3, 여기서, AxByCz 또는 Cz는VLVLSCDLITDVALHEVVDLFRAYDASLAMLMRKGQDSIEPVPGQKGKKKQWSSVTSLEWTAQERGCSSWLMKQTWMKSWSLRDPSYRSILEYVSTRVLWMPTSTV인 것; (n) EPHB2, 여기서, AxByCz 또는 Cz는 SIQVMRAQMNQIQSVEGQPLARRPRATGRTKRCQPRDVTKKTCNSNDGKKREWEKRKQILGGGGKYKEYFLKRILIRKAMTVLAGDKKGLGRFMRCVQSETKAVSLQLPLGR인 것; (o) ESRP1, 여기서, AxByCz는 (i) LDFLGEFATDIRTHGVHMVLNHQGRPSGDAFIQMKSADRAFMAAQKCHKKKHEGQIC, 또는 (ii) LDFLGEFATDIRTHGVHMVLNHQGRPSGDAFIQMKSADRAFMAAQKCHKKT인 것; (p) FAM11B, 여기서, AxByCz는 GALCKDGRFRSDIGEFEWKLKEGHKKIYGKQSMVDEVSGKVLEMDISKKKHYNRKISIKKLNRMKVPLMKLITRV인 것; (q) GBP3, 여기서, AxByCz는 RERAQLLEEQEKTLTSKLQEQARVLKERCQGESTQLQNEIQKLQKTLKKKPRDICRIS인 것; (r) JAK1, 여기서, AxByCz는 (i) VNTLKEGKRLPCPPNCPDEVYQLMRKCWEFQPSNRTSFQNLIEGFEALLKTSN 또는 (ii) CRPVTPSCKELADLMTRCMNYDPNQRPFFRAIMRDINKLEEQNPDIVSEKNQQLKWTPHILKSAS인 것; (s) LMAN1, 여기서, AxByCz는 (i) DDHDVLSFLTFQLTEPGKEPPTPDKEISEKEKEKYQEEFEHFQQELDKKKRGIPEGPPRPPRAACGGNI, 또는 (ii) DDHDVLSFLTFQLTEPGKEPPTPDKEISEKEKEKYQEEFEHFQQELDKKKRNSRRATPTSKGSLRRKYLRV인 것; (t) MSH3, 여기서, AxByCz는 (i) TKSTLIGEDVNPLIKLDDAVNVDEIMTDTSTSYLLCISENKENVRDKKKGQHFYWHCGSAACHRRGCV, 또는 (ii) LYTKSTLIGEDVNPLIKLDDAVNVDEIMTDTSTSYLLCISENKENVRDKKRATFLLALWECSLPQARLCLIVSRTLLLVQS인 것; (u) NDUFC2, 여기서, AxByCz는 (i) LPPPKLTDPRLLYIGFLGYCSGLIDNLIRRRPIATAGLHRQLLYITAFFFCWILSCKT, 또는 (ii) SLPPPKLTDPRLLYIGFLGYCSGLIDNLIRRRPIATAGLHRQLLYITAFFLLDIIL인 것; (v) RBM27, 여기서, AxByCz는 NQSGGAGEDCQIFSTPGHPKMIYSSSNLKTPSKLCSGSKSHDVQEVLKKKTGSNEVTTRYEEKKTGSVRKANRMPKDVNIQVRKKQKHETRRKSKYNEDFERAWREDLTIKR인 것; (w) RPL22, 여기서, AxByCz는 (i) MAPVKKLVVKGGKKKEASSEVHS, 또는 (ii) MAPVKKLVVKGGKKRSKF인 것; (x) SEC31A, 여기서, AxByCz는 (i) MPSHQGAEQQQQQHHVFISQVVTEKEFLSRSDQLQQAVQSQGFINYCQKKN, 또는 (ii) MPSHQGAEQQQQQHHVFISQVVTEKEFLSRSDQLQQAVQSQGFINYCQKKLMLLRLNLRKMCGPF인 것; (y) SEC63, 여기서, AxByCz는 (i) AEVFEKEQSICAAEEQPAEDGQGETNKNRTKGGWQQKSKGPKKTAKSKKKETFKKKTYTCAITTVKATETKAGKWSRWE, 또는 (ii) MAEVFEKEQSICAAEEQPAEDGQGETNKNRTKGGWQQKSKGPKKTAKSKKRNL인 것; (z) SLC35F5, 여기서, AxByCz는 NIMEIRQLPSSHALEAKLSRMSYPVKEQESILKTVGKLTATQVAKISFFFALCGFWQICHIKKHFQTHKLL인 것; (aa) SMAP1, 여기서, AxByCz는 (i) YEKKKYYDKNAIAITNISSSDAPLQPLVSSPSLQAAVDKNKLEKEKEKKKGREKERKGARKAGKTTYS, 또는 (ii) KYEKKKYYDKNAIAITNISSSDAPLQPLVSSPSLQAAVDKNKLEKEKEKKRKRKREKRSQKSRQNHLQLKSCRRKISNWSLKKVPALKKLRSPLWIF인 것; (bb) TFAM, 여기서, AxByCz는 (i) IYQDAYRAEWQVYKEEISRFKEQLTPSQIMSLEKEIMDKHLKRKAMTKKKRVNTAWKTKKTSFSL, 또는 (ii) IYQDAYRAEWQVYKEEISRFKEQLTPSQIMSLEKEIMDKHLKRKAMTKKKS인 것; (cc) TGFBR2, 여기서, AxByCz는 (i) KPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKAW, 또는 (ii) EKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKSLVRLSSCVPVALMSAMTTSSSQKNITPAILTCC인 것; (dd) THAP5, 여기서, AxByCz는 VPSKYQFLCSDHFTPDSLDIRWGIRYLKQTAVPTIFSLPEDNQGKDPSKKNPRRKTWKMRKKYAQKPSQKNHLY인 것; (ee) TTK, 여기서, AxByCz는 GTTEEMKYVLGQLVGLNSPNSILKAAKTLYEHYSGGESHNSSSSKTFEKKGEKNDLQLFVMSDTTYKIYWTVILLNPCGNLHLKTTSL인 것; 및 (ff) XPOT, 여기서, AxByCz는 QQLIRETLISWLQAQMLNPQPEKTFIRNKAAQVFALLFVTEYLTKWPKFFLTFSQ인 것으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자에 의해 코딩되는 것인, 단리된 신생항원성 펩티드를 제공한다.
본원에서는 종양 특이적 네오에피토프를 포함하는 단리된 신생항원성 펩티드로서, 상기 단리된 신생항원성 펩티드는 천연 폴리펩티드가 아니고, 상기 네오에피토프는 AxByCz로 표시되는 아미노산 서열의 적어도 8개의 인접한 아미노산을 포함하며, 여기서, 각각의 A는 제1 천연 폴리펩티드에 상응하는 아미노산이고; 각각의 C는 제2 천연 폴리펩티드, 또는 제1 천연 폴리펩티드의 제1 천연 폴리펩티드의 스플라이스 변이체의 크립틱(잠재적) 엑손 또는 엑손에 상응하는 아미노산이고, 각각의 B는 제1 천연 폴리펩티드, 제2 천연 폴리펩티드, 또는 제1 천연 폴리펩티드의 크립틱 엑손에 상응하는 아미노산이 아닌 아미노산이고, x + y + z는 8 이상이고, 여기서, y는 존재하지 않고, 적어도 8개의 인접한 아미노산은 적어도 하나의 Ax 및 적어도 하나의 Cz를 포함하거나, 또는 y는 1 이상이고, 적어도 8개의 인접한 아미노산은 적어도 하나의 By를 포함하며, 여기서, (a) 제1 천연 폴리펩티드는 BCR 유전자에 의해 코딩되고, 제2 천연 폴리펩티드는 ABL 유전자에 의해 코딩되고, (i) y는 0이고, AxByCz는 ERAEWRENIREQQKKCFRSFSLTSVELQMLTNSCVKLQTVHSIPLTINKEEALQRPVASDFEPQGLSEAARWNSKENLLAGPSENDPNLFVALYDFVASG이거나, 또는 (ii) y는 1이고, AxByCz는 ELQMLTNSCVKLQTVHSIPLTINKEDDESPGLYGFLNVIVHSATGFKQSSKALQRPVASDFEPQGLSEAARWNSKENLLAGPSENDPNLFVALYDFVASGD이거나; (b) 제1 천연 폴리펩티드는 C11orf95 유전자에 의해 코딩되고, 제2 천연 폴리펩티드는 RELA 유전자에 의해 코딩되고, y는 1이고, AxByCz는 ISNSWDAHLGLGACGEAEGLGVQGAEEEEEEEEEEEEEGAGVPACPPKGPELFPLIFPAEPAQASGPYVEIIEQPKQRGMRFRYKCEGRSAGSIPGERSTD이거나; (c) 제1 천연 폴리펩티드는 CBFB 유전자에 의해 코딩되고, 제2 천연 폴리펩티드는 MYH11 유전자에 의해 코딩되고, y는 0이고, AxByCz는 LQRLDGMGCLEFDEERAQQEDALAQQAFEEARRRTREFEDRDRSHREEMEVHELEKSKRALETQMEEMKTQLEELEDELQATEDAKLRLEVNMQALKGQF이거나; (d) 제1 천연 폴리펩티드는 CD74 유전자에 의해 코딩되고, 제2 천연 폴리펩티드는 ROS1 유전자에 의해 코딩되고, y는 0이고, AxByCz는 KGSFPENLRHLKNTMETIDWKVFESWMHHWLLFEMSRHSLEQKPTDAPPKAGVPNKPGIPKLLEGSKNSIQWEKAEDNGCRITYYILEIRKSTSNNLQNQ이거나; (e) 제1 천연 폴리펩티드는 EGFR 유전자에 의해 코딩되고, 제2 천연 폴리펩티드는 (i) SEPT14 유전자에 의해 코딩되고, y는 0이고, AxByCz는 LPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQLQDKFEHLKMIQQEEIRKLEEEKKQLEGEIIDFYKMKAASEALQTQLSTD이거나; 또는 (ii) EGFR 유전자에 의해 코딩되고, y는 1이고, AxByCz는 MRPSGTAGAALLALLAALCPASRALEEKKGNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKD이거나; (f) 제1 천연 폴리펩티드는 EML4 유전자에 의해 코딩되고, 제2 천연 폴리펩티드는 ALK 유전자에 의해 코딩되고, y는 1이고, AxByCz는 SWENSDDSRNKLSKIPSTPKLIPKVTKTADKHKDVIINQAKMSTREKNSQVYRRKHQELQAMQMELQSPEYKLSKLRTSTIMTDYNPNYCFAGKTSSISDL이거나, (g) 제1 천연 폴리펩티드는 FGFR3 유전자에 의해 코딩되고, 제2 천연 폴리펩티드는 TACC3 유전자에 의해 코딩되고, y는 0이고, AxByCz는 EGHRMDKPANCTHDLYMIMRECWHAAPSQRPTFKQLVEDLDRVLTVTSTDVKATQEENRELRSRCEELHGKNLELGKIMDRFEEVVYQAMEEVQKQKELS이거나, (h) 제1 천연 폴리펩티드는 NAB 유전자에 의해 코딩되고, 제2 천연 폴리펩티드는 STAT6 유전자에 의해 코딩되고, y는 0 이상이고, AxByCz는 RDNTLLLRRVELFSLSRQVARESTYLSSLKGSRLHPEELGGPPLKKLKQEATSKSQIMSLWGLVSKMPPEKVQRLYVDFPQHLRHLLGDWLESQPWEFLVGSDAFCC이거나; (i) 제2 천연 폴리펩티드는 ERG에 의해 코딩되고, y는 0이고, (i) 제1 천연 폴리펩티드는 NDRG1 유전자에 의해 코딩되고, AxByCz는 MSREMQDVDLAEVKPLVEKGETITGLLQEFDVQEALSVVSEDQSLFECAYGTPHLAKTEMTASSSSDYGQTSKMSPRVPQQDW이거나, 또는 (ii) 제1 천연 폴리펩티드는 TMPRSS2 유전자에 의해 코딩되고, AxByCz는 MALNSEALSVVSEDQSLFECAYGTPHLAKTEMTASSSSDYGQTSKMSPRVPQQDW이거나; (j) 제1 천연 폴리펩티드는 PML 유전자에 의해 코딩되고, 제2 천연 폴리펩티드는 RARA 유전자에 의해 코딩되고, y는 1이고, AxByCz는 (i) VLDMHGFLRQALCRLRQEEPQSLQAAVRTDGFDEFKVRLQDLSSCITQGKAIETQSSSSEEIVPSPPSPPPLPRIYKPCFVCQDKSSGYHYGVSACEGCKG, 또는 (ii) RSSPEQPRPSTSKAVSPPHLDGPPSPRSPVIGSEVFLPNSNHVASGAGEAAIETQSSSSEEIVPSPPSPPPLPRIYKPCFVCQDKSSGYHYGVSACEGCKG이거나; (k) 제1 천연 폴리펩티드는 RUNX1 유전자에 의해 코딩되고, 제2 천연 폴리펩티드는 CBFA2T1(RUNX1T1) 유전자에 의해 코딩되고, y는 1이고, AxByCz는 VARFNDLRFVGRSGRGKSFTLTITVFTNPPQVATYHRAIKITVDGPREPRNRTEKHSTMPDSPVDVKTQSRLTPPTMPPPPTTQGAPRTSSFTPTTLTNGT이거나; (l) 제1 천연 폴리펩티드는 AR-v7 유전자에 의해 코딩되고, 스플라이스 변이체의 크립틱 엑손 또는 엑손은 AR-v7 유전자에 의해 코딩되고, y는 0이고, AxByCz는 SCKVFFKRAAEGKQKYLCASRNDCTIDKFRRKNCPSCRLRKCYEAGMTLGEKFRVGNCKHLKMTRP인 것인, 단리된 신생항원성 펩티드를 제공한다.
본원에서는 종양 특이적 네오에피토프를 포함하는 단리된 신생항원성 펩티드로서, 상기 단리된 신생항원성 펩티드는 천연 폴리펩티드가 아니고, 상기 네오에피토프는 AxByCz로 표시되는 아미노산 서열의 적어도 8개의 인접한 아미노산을 포함하며, 여기서, 각각의 A는 제1 천연 폴리펩티드에 상응하는 아미노산이고; 각각의 B는 제1 천연 폴리펩티드 또는 제2 천연 폴리펩티드에 상응하는 아미노산이 아닌 아미노산이고, 각각의 C는 제2 천연 폴리펩티드를 코딩하는 서열의 프레임시프트에 의해 코딩되는 아미노산이고; x + y + z는 8 이상이고, 여기서, y는 존재하지 않고, 적어도 8개의 인접한 아미노산은 적어도 하나의 Cz를 포함하거나, 또는 y는 1 이상이고, 적어도 8개의 인접한 아미노산은 적어도 하나의 By 및/또는 적어도 하나의 Cz를 포함하고; (a) 제1 천연 폴리펩티드는 AC011997.1 유전자에 의해 코딩되고, 제2 천연 폴리펩티드는 LRRC69 유전자에 의해 코딩되고, y는 1이고, AxByCz는 MAGAPPPASLPPCSLISDCCASNQRDSVGVGPSEPGNNIKICNESASRK이거나, (b) 제1 천연 폴리펩티드는 EEF1DP3 유전자에 의해 코딩되고, 제2 천연 폴리펩티드는 FRY 유전자에 의해 코딩되고, y는 1이고, AxByCz는 HGWRPFLPVRARSRWNRRLDVTVANGRSWKYGWSLLRVPQVNGIQVLNVSLKSSSNVISY이거나, (c) 제1 천연 폴리펩티드는 MAD1L1 유전자에 의해 코딩되고, 제2 천연 폴리펩티드는 MAFK 유전자에 의해 코딩되고, y는 0이고, AxByCz는 RLKEVFQTKIQEFRKACYTLTGYQIDITTENQYRLTSLYAEHPGDCLIFKLRVPGSSVLVTVPGL이거나, 또는 (d) 제1 천연 폴리펩티드는 PPP1R1B 유전자에 의해 코딩되고, 제2 천연 폴리펩티드는 STARD3 유전자에 의해 코딩되고, y는 1이고, AxByCz는 AEVLKVIRQSAGQKTTCGQGLEGPWERPPPLDESERDGGSEDQVEDPALSALLLRPRPPRPEVGAHQDEQAAQGADPRLGAQPACRGLPGLLTVPQPEPLLAPPSAA인 것인, 단리된 신생항원성 펩티드를 제공한다.
실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 표 1에 따른 서열을 포함한다. 실시양태에서, x + y + z는 500 이하, 250 이하, 150 이하, 125 이하, 또는 100 이하이다. 실시양태에서, x + y + z는 8 이상, 50 이상, 100 이상, 200 이상, 또는 300 이상이다. 실시양태에서, z는 500 이하, 250 이하, 150 이하, 125 이하, 또는 100 이하이다. 실시양태에서, z는 8 이상, 50 이상, 100 이상, 200 이상, 또는 300 이상이다. 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드의 길이는 약 8 내지 약 500개의 아미노산 길이이다. 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드의 길이는 약 8 내지 약 100개의 아미노산 길이이다. 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드의 길이는 약 8 내지 약 50개의 아미노산 길이이다. 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드의 길이는 약 15 내지 약 35개의 아미노산 길이이다. 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드의 길이는 약 8 내지 약 15개의 아미노산 길이이다. 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드의 길이는 약 8 내지 약 11개의 아미노산 길이이다. 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드의 길이는 9 또는 10개의 아미노산 길이이다. 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 주조직 적합성 복합체(MHC: major histocompatibility complex) 클래스 I에 결합한다. 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 약 500 nM 이하의 결합 친화도로 MHC 클래스 I에 결합한다. 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 약 250 nM 이하의 결합 친화도로 MHC 클래스 I에 결합한다. 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 약 50 nM 이하의 결합 친화도로 MHC 클래스 I에 결합한다. 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드의 길이는 약 8 내지 약 30개의 아미노산 길이이다. 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드의 길이는 약 8 내지 약 25개의 아미노산 길이이다. 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드의 길이는 약 15 내지 약 24개의 아미노산 길이이다. 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드의 길이는 약 9 내지 약 15개의 아미노산 길이이다. 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 MHC 클래스 II에 결합한다. 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 1,000 nM 이하의 결합 친화도로 MHC 클래스 II에 결합한다. 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 약 500 nM 이하의 결합 친화도로 MHC 클래스 II에 결합한다. 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 측면(flanking) 아미노산을 추가로 포함한다. 실시양태에서, 측면 아미노산은 천연 측면 아미노산이 아니다. 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드의 총 길이는 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 또는 적어도 500개의 아미노산 길이이다. 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드의 총 길이는 최대 8, 최대 9, 최대 10, 최대 11, 최대 12, 최대 13, 최대 14, 최대 15, 최대 16, 최대 17, 최대 18, 최대 19, 최대 20, 최대 21, 최대 22, 최대 23, 최대 24, 최대 25, 최대 26, 최대 27, 최대 28, 최대 29, 최대 30, 최대 40, 최대 50, 최대 60, 최대 70, 최대 80, 최대 90, 최대 100, 최대 150, 최대 200, 최대 250, 최대 300, 최대 350, 최대 400, 최대 450, 또는 최대 500개의 아미노산 길이이다. 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 적어도 제2 신생항원성 펩티드에 연결된 제1 신생항원성 펩티드이다. 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 폴리글리신 또는 폴리세린 링커에 의해 적어도 제2 신생항원성 펩티드에 연결된다. 실시양태에서, 제2 신생항원성 펩티드는 1,000 nM 미만의 결합 친화도로 MHC 클래스 I 또는 클래스 II에 결합한다. 실시양태에서, 제2 신생항원성 펩티드는 약 500 nM 미만의 결합 친화도로 MHC 클래스 I 또는 클래스 II에 결합한다. 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드 및 제2 신생항원성 펩티드는 인간 백혈구 항원(HLA: human leukocyte antigen)-A, -B, -C, -DP, -DQ, 또는 -DR에 결합한다. 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 클래스 I HLA에 결합하고, 제2 신생항원성 펩티드는 클래스 II HLA에 결합한다. 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 클래스 II HLA에 결합하고, 제2 신생항원성 펩티드는 클래스 I HLA에 결합한다. 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 생체내 반감기, 세포 표적화, 항원 흡수, 항원 프로세싱, MHC 친화도, MHC 안정성, 항원 제시, 또는 이들의 조합을 증가시키는 변형을 추가로 포함한다. 실시양태에서, 변형은 캐리어 단백질에의 접합, 리간드에의 접합, 항체에의 접합, PEG화, 폴리시알릴화, HES화, 재조합 PEG 모방체, Fc 융합, 알부민 융합, 나노입자 부착, 나노미립자 캡슐화, 콜레스테롤 융합, 철 융합, 아실화, 아미드화, 글리코실화, 측쇄 산화, 인산화, 비오티닐화, 계면 활성 물질 첨가, 아미노산 모방체 첨가, 또는 비천연 아미노산 첨가이다. 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 항원 제시 세포로의 세포 표적화를 증가시키는 변형을 추가로 포함한다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 수지상 세포이다. 실시양태에서, 수지상 세포는 DEC205, XCR1, CD197, CD80, CD86, CD123, CD209, CD273, CD283, CD289, CD184, CD85h, CD85j, CD85k, CD85d, CD85g, CD85a, CD141, CD11c, CD83, TSLP 수용체, Clec9a, 또는 CD1a 마커를 사용하여 표적화된다. 실시양태에서, 수지상 세포는 CD141, DEC205, Clec9a, 또는 XCR1 마커를 사용하여 표적화된다. 실시양태에서, 수지상 세포는 자가 세포이다. 실시양태에서, 수지상 세포 중 하나 이상의 것이 T 세포에 결합된다. 실시양태에서, T 세포는 자가 T 세포이다. 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 표 2에 열거된 단리된 신생항원성 펩티드가 아니다. 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 표 1 또는 2에 열거된 적어도 하나의 추가의 신생항원성 펩티드에 연결된다.
본원에서는 본원에 기술된 단리된 신생항원성 펩티드를 포함하는 생체내 전달 시스템을 제공한다. 실시양태에서, 전달 시스템은 세포 투과 펩티드, 나노미립자 캡슐화, 바이러스 유사 입자, 리포솜, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 실시양태에서, 세포 투과 펩티드는 TAT 펩티드, 단순 허피스 바이러스 VP22, 트랜스포탄, Antp, 또는 이들의 임의의 조합이다.
본원에서는 본원에 기술된 단리된 신생항원성 펩티드를 포함하는 세포를 제공한다. 실시양태에서, 세포는 항원 제시 세포이다. 실시양태에서, 세포는 수지상 세포이다. 실시양태에서, 세포는 자가 세포이다. 실시양태에서, 세포는 T 세포에 결합된다. 실시양태에서, T 세포는 자가 T 세포이다.
본원에서는 본원에 기술된 단리된 신생항원성 펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다.
실시양태에서, 조성물은 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 또는 적어도 100개의, 표 1 또는 2에 따른, 종양 특이적 네오에피토프를 포함하는 단리된 신생항원성 펩티드를 포함한다. 실시양태에서, 조성물은 약 2 내지 약 20개의 신생항원성 펩티드, 또는 약 2 내지 약 30개의 신생항원성 펩티드를 포함한다. 실시양태에서, 신생항원은 개별 피험체의 종양에 특이적인 것이다. 실시양태에서, 조성물은 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 또는 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 또는 적어도 100종의 추가의 신생항원성 펩티드를 추가로 포함한다. 실시양태에서, 조성물은 약 4 내지 약 20종의 추가의 신생항원성 펩티드, 약 4 내지 약 30종의 추가의 신생항원성 펩티드를 포함한다. 실시양태에서, 추가의 신생항원성 펩티드 중 적어도 하나는 개별 피험체의 종양에 특이적인 것이다. 실시양태에서, 피험체 특이적 신생항원성 펩티드는 피험체의 종양 샘플의 게놈, 엑솜, 및/또는 트랜스크립톰과 비종양 샘플의 게놈, 엑솜, 및/또는 트랜스크립톰 사이의 서열 차이를 확인함으로써 선택된다. 실시양태에서, 샘플은 신선한 또는 포르말린 고정 파라핀 포매된 종양 조직, 새로 단리된 세포, 또는 순환 종양 세포이다. 실시양태에서, 서열 차이는 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing)에 의해 결정된다.
본원에서는 본원에 기술된 단리된 신생항원성 펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 DNA이다. 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 RNA이다. 실시양태에서, RNA는 자기 증폭 RNA이다. 실시양태에서, RNA는 안정성을 증가시키기 위해, 세포 표적화를 증가시키기 위해, 번역 효율, 애쥬번트성, 사이토졸 접근성을 증가시키기 위해, 및/또는 세포독성을 감소시키기 위해 변형된다. 실시양태에서, 변형은 캐리어 단백질에의 접합, 리간드에의 접합, 항체에의 접합, 코돈 최적화, GC 함량 증가, 변형된 뉴클레오시드 도입, 5' 캡 또는 캡 유사체 도입, 및/또는 비마스킹된 폴리A 서열 도입이다.
본원에서는 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 제공한다.
본원에서는 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 실시양태에서, 벡터는 자기 증폭 RNA 레플리콘, 플라스미드, 파지, 트랜스포손, 코스미드, 바이러스, 또는 비리온이다. 실시양태에서, 벡터는 아데노 연관 바이러스, 허피스바이러스, 렌티바이러스, 또는 이들의 슈도타입으로부터 유래된 것이다.
본원에서는 본원에 기술된 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 생체내 전달 시스템을 제공한다. 실시양태에서, 전달 시스템은 구형 핵산, 바이러스, 바이러스 유사 입자, 플라스미드, 박테리아 플라스미드, 또는 나노입자를 포함한다.
본원에서는 본원에 기술된 벡터 또는 전달 시스템을 포함하는 세포를 제공한다. 실시양태에서, 세포는 항원 제시 세포이다. 실시양태에서, 세포는 수지상 세포이다. 실시양태에서, 세포는 미성숙한 수지상 세포이다.
본원에서는 본원에 기술된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 실시양태에서, 조성물은 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 또는 적어도 100종의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 실시양태에서, 조성물은 약 2 내지 약 20종의 단리된 폴리뉴클레오티드, 또는 약 2 내지 약 30종의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 실시양태에서, 신생항원성 펩티드는 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 의해 코딩된다. 실시양태에서, 조성물은 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 또는 적어도 100개의, 추가의 신생항원성 펩티드를 코딩하는 추가의 신생항원성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 실시양태에서, 하나 이상의 추가의 신생항원성 펩티드는 하나 이상의 추가의 신생항원성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 의해 코딩된다. 실시양태에서, 조성물은 약 4 내지 약 20종의 추가의 신생항원성 폴리뉴클레오티드, 또는 약 4 내지 약 30종의 추가의 신생항원성 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 및 추가의 신생항원성 폴리뉴클레오티드는 연결되어 있다. 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 폴리글리신 또는 폴리세린 링커를 코딩하는 핵산을 사용하여 연결된다. 실시양태에서, 추가의 신생항원성 펩티드 중 적어도 하나는 개별 피험체의 종양에 특이적인 것이다. 실시양태에서, 피험체 특이적 신생항원성 펩티드는 피험체의 종양 샘플의 게놈, 엑솜, 및/또는 트랜스크립톰과 비종양 샘플의 게놈, 엑솜, 및/또는 트랜스크립톰 사이의 서열 차이를 확인함으로써 선택된다. 실시양태에서, 샘플은 신선한 또는 포르말린 고정 파라핀 포매된 종양 조직, 새로 단리된 세포, 또는 순환 종양 세포이다. 실시양태에서, 서열 차이는 차세대 시퀀싱에 의해 결정된다.
본원에서는 본원에 기술된 적어도 하나의 신생항원성 펩티드, 또는 본원에 기술된 적어도 하나의 신생항원성 펩티드를 포함하는 MHC-펩티드 복합체에 결합할 수 있는 T 세포 수용체(TCR: T cell receptor)를 제공한다. 실시양태에서, MHC-펩티드의 MHC는 MHC 클래스 I 또는 클래스 II이다. 실시양태에서, TCR은 항원에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 도메인을 추가로 포함하는 이중특이적 TCR이다. 실시양태에서, 항원은 T 세포 특이적 항원이다. 실시양태에서, 항원은 CD3이다. 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 항CD3 scFv이다.
본원에서는 (i) T 세포 활성화 분자; (ii) 막횡단 영역; 및 (iii) 본원에 기술된 적어도 하나의 신생항원성 펩티드, 또는 본원에 기술된 적어도 하나의 신생항원성 펩티드를 포함하는 MHC-펩티드 복합체에 결합할 수 있는 항원 인식 모이어티를 포함하는 키메라 항원 수용체를 제공한다. 실시양태에서, CD3-제타는 T 세포 활성화 분자이다. 실시양태에서, 키메라 항원 수용체는 적어도 하나의 공동자극성 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 실시양태에서, 신호전달 도메인은 CD28, 4-1BB, ICOS, OX40, ITAM, 또는 Fc 엡실론 RI 감마이다. 실시양태에서, 항원 인식 모이어티는 MHC 클래스 I 또는 클래스 II와 관련하여 단리된 신생항원성 펩티드에 결합할 수 있다. 실시양태에서, CD3-제타, CD28, CTLA-4, ICOS, BTLA, KIR, LAG3, CD137, OX40, CD27, CD40L, Tim-3, A2aR, 또는 PD-1 막횡단 영역. 실시양태에서, 신생항원성 펩티드는 종양 연관 폴리펩티드의 세포외 도메인에 위치한다. 실시양태에서, MHC-펩티드의 MHC는 MHC 클래스 I 또는 클래스 II이다.
본원에서는 본원에 기술된 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체를 포함하는 T 세포로서, 경우에 따라, 여기서, T 세포는 헬퍼 또는 세포독성 T 세포인 것인 T 세포를 제공한다. 실시양태에서, T 세포는 피험체의 T 세포이다.
본원에서는 본원에 기술된 적어도 하나의 신생항원성 펩티드, 또는 본원에 기술된 적어도 하나의 신생항원성 펩티드를 포함하는 MHC-펩티드 복합체에 결합할 수 있는 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 T 세포로서, 여기서, T 세포는, T 세포를 활성화시키는 데 충분한 시간 동안 항원 제시 세포, 및 본원에 기술된 적어도 하나의 신생항원성 펩티드 중 하나 이상의 것과 함께 인큐베이션된, 피험체로부터의 T 세포 집단으로부터 단리된 T 세포인 것인, T 세포를 제공한다. 실시양태에서, T 세포는 CD8+ T 세포, 헬퍼 T 세포, 또는 세포독성 T 세포이다. 실시양태에서, 피험체로부터의 T 세포 집단은 피험체로부터의 CD8+ T 세포 집단이다. 실시양태에서, 본원에 기술된 적어도 하나의 신생항원성 펩티드 중 하나 이상의 것은 피험체 특이적 신생항원성 펩티드이다. 실시양태에서, 피험체 특이적 신생항원성 펩티드는 피험체의 종양에 특이적인 에피토프인 상이한 종양 네오에피토프를 가진다. 실시양태에서, 피험체 특이적 신생항원성 펩티드는 피험체의 비종양 샘플 중에는 존재하지 않는 종양 특이적 비침묵 돌연변이의 발현 생성물이다. 실시양태에서, 피험체 특이적 신생항원성 펩티드는 피험체의 HLA 단백질에 결합한다. 실시양태에서, 피험체 특이적 신생항원성 펩티드는 500 nM 미만의 IC50으로 피험체의 HLA 단백질에 결합한다. 실시양태에서, 활성화된 CD8+ T 세포는 항원 제시 세포로부터 분리된 것이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 수지상 세포 또는 CD40L 확장된 B 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 비형질전환 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 비감염 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 자가 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 그의 표면으로부터 내인성 MHC 회합 펩티드를 스트리핑하기 위해 처리된 것이다. 실시양태에서, 내인성 MHC 회합 펩티드를 스트리핑하는 처리는 약 26℃에서 세포를 배양하는 것을 포함한다. 실시양태에서, 내인성 MHC 회합 펩티드를 스트리핑하는 처리는 세포를 약산 용액으로 처리하는 것을 포함한다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 본원에 기술된 적어도 하나의 신생항원성 펩티드로 펄싱된 것이다. 실시양태에서, 펄싱은 적어도 약 2 ㎍/ml씩의 각각의 본원에 기술된 적어도 하나의 신생항원성 펩티드의 존재하에서 항원 제시 세포를 인큐베이션하는 것을 포함한다. 실시양태에서, 단리된 T 세포 대 항원 제시 세포의 비는 약 30:1 내지 300:1이다. 실시양태에서, 단리된 T 세포 집단을 인큐베이션하는 것은 IL-2 및 IL-7의 존재하에서 이루어진다. 실시양태에서, MHC-펩티드의 MHC는 MHC 클래스 I 또는 클래스 II이다.
본원에서는 피험체로부터 T 세포 집단을 단리하는 단계; 및 T 세포를 활성화시키는 데 충분한 시간 동안 단리된 T 세포 집단을 항원 제시 세포, 및 본원에 기술된 적어도 하나의 신생항원성 펩티드와 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 종양 특이적 T 세포를 활성화시키는 방법을 제공한다. 실시양태에서, T 세포는 CD8+ T 세포, 헬퍼 T 세포, 또는 세포독성 T 세포이다. 실시양태에서, 피험체로부터의 T 세포 집단은 피험체로부터의 CD8+ T 세포 집단이다. 실시양태에서, 본원에 기술된 적어도 하나의 신생항원성 펩티드 중 하나 이상의 것은 피험체 특이적 신생항원성 펩티드이다. 실시양태에서, 피험체 특이적 신생항원성 펩티드는 피험체의 종양에 특이적인 에피토프인 상이한 종양 네오에피토프를 가진다. 실시양태에서, 피험체 특이적 신생항원성 펩티드는 피험체의 비종양 샘플 중에는 존재하지 않는 종양 특이적 비침묵 돌연변이의 발현 생성물이다. 실시양태에서, 피험체 특이적 신생항원성 펩티드는 피험체의 HLA 단백질에 결합한다. 실시양태에서, 피험체 특이적 신생항원성 펩티드는 500 nM 미만의 IC50으로 피험체의 HLA 단백질에 결합한다. 실시양태에서, 본 방법은 항원 제시 세포로부터 활성화된 T 세포를 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 실시양태에서, 본 방법은 본원에 기술된 신생항원성 펩티드 중 적어도 하나의 것에 대한 반응성 입증을 위해 활성화된 T 세포를 테스트하는 단계를 추가로 포함한다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 수지상 세포 또는 CD40L 확장된 B 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 비형질전환 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 비감염 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 자가 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 그의 표면으로부터 내인성 MHC 회합 펩티드를 스트리핑하기 위해 처리된 것이다. 실시양태에서, 내인성 MHC 회합 펩티드를 스트리핑하는 처리는 약 26℃에서 세포를 배양하는 것을 포함한다. 실시양태에서, 내인성 MHC 회합 펩티드를 스트리핑하는 처리는 세포를 약산 용액으로 처리하는 것을 포함한다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 본원에 기술된 적어도 하나의 신생항원성 펩티드로 펄싱된 것이다. 실시양태에서, 펄싱은 적어도 약 2 ㎍/ml씩의 각각의 본원에 기술된 적어도 하나의 신생항원성 펩티드의 존재하에서 항원 제시 세포를 인큐베이션하는 것을 포함한다. 실시양태에서, 단리된 T 세포 대 항원 제시 세포의 비는 약 30:1 내지 300:1이다. 실시양태에서, 단리된 T 세포 집단을 인큐베이션하는 것은 IL-2 및 IL-7의 존재하에서 이루어진다. 실시양태에서, MHC-펩티드의 MHC는 MHC 클래스 I 또는 클래스 II이다.
본원에서는 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 활성화된 종양 특이적 T 세포를 포함하는 조성물을 제공한다.
본원에서는 치료적 유효량의, 본원에 기술된, 또는 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 활성화된 종양 특이적 T 세포를 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 피험체의 암을 치료하는 방법을 제공한다. 실시양태에서, 투여는 약 106 내지 1012, 약 108 내지 1011, 또는 약 109 내지 1010개의 활성화된 종양 특이적 T 세포를 투여하는 것을 포함한다.
본원에서는 본원에 기술된 T 세포 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 핵산을 제공한다. 실시양태에서, TCR은 주조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 또는 클래스 II와 관련하여 적어도 하나의 신생항원성 펩티드에 결합할 수 있다.
본원에서는 본원에 기술된 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 핵산을 제공한다. 항원 인식 모이어티는 주조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 또는 클래스 II와 관련하여 적어도 하나의 신생항원성 펩티드에 결합할 수 있다. 실시양태에서, 신생항원성 펩티드는 종양 연관 폴리펩티드의 세포외 도메인에 위치한다. 실시양태에서, 핵산은 CD3-제타, CD28, CTLA-4, ICOS, BTLA, KIR, LAG3, CD137, OX40, CD27, CD40L, Tim-3, A2aR, 또는 PD-1 막횡단 영역을 포함한다.
본원에서는 본원에 기술된 적어도 하나의 신생항원성 펩티드, 또는 본원에 기술된 적어도 하나의 신생항원성 펩티드를 포함하는 MHC-펩티드 복합체에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 단편으로서, 경우에 따라, 여기서, 항체 단편은 이중특이적 T 세포 인게이저(BiTE: bi-specific T cell engager)인 것인, 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 적어도 하나의 신생항원성 펩티드의 세포외 부위에 결합한다. 실시양태에서, 천연 폴리펩티드는
β2M, 여기서, Cz는 RMERELKKWSIQTCLSARTGLSISCTTLNSPPLKKMSMPAV, 또는 LCSRYSLFLAWRLSSVLQRFRFTHVIQQRMESQIS인 것; EGFR, 여기서, AxByCz는 IPVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTSTVQLIMQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQIAKGMNYLEDRRLVHRDLAA인 것; BTK, 여기서, AxByCz는 MIKEGSMSEDEFIEEAKVMMNLSHEKLVQLYGVCTKQRPIFIITEYMANGSLLNYLREMRHRFQTQQLLEMCKDVCEAMEYLESKQFLHRDLAARNCLVND인 것; 또는 ESR1, 여기서, AxByCz는 HLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEHLYSMKCKNVVPLYGLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEA, NQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLPSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSH, IHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEHLYSMKCKNVVPLCDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGE, IHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEHLYSMKCKNVVPLNDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGE, 또는 IHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEHLYSMKCKNVVPLSDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGE인 것; 또는 HER2, 여기서, AxByCz는 GSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAIKVLRENTSPKANKEILDEAYVMAGLGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLDHVRENRGRLGSQDLLNWCM으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자에 의해 코딩되는 것이다. 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 이중특이적 항체 또는 항체 단편이다. 실시양태에서, 이중특이적 항체 또는 항체 단편의 한 항원 결합 도메인이다. 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 이중특이적 항체 또는 항체 단편이다. 실시양태에서, 이중특이적 항체 또는 항체 단편의 한 항원 결합 도메인은 항CD3 결합 도메인이다.
본원에서는 본원에 기술된 핵산으로 형질감염 또는 형질도입된 변형된 세포를 제공한다. 실시양태에서, 변형된 세포는 T 세포, 종양 침윤 림프구, NK-T 세포, TCR 발현 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 NK 세포이다.
본원에서는 본원에 기술된 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조성물을 제공한다.
본원에서는 본원에 기술된 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체를 함유하는 피험체의 자가 T 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 실시양태에서, 조성물은 면역 관문(immune checkpoint) 억제제를 추가로 포함한다. 실시양태에서, 조성물은 적어도 2종의 면역 관문 억제제를 추가로 포함한다. 실시양태에서, 각각의 면역 관문 억제제는 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR, 및 B-7 패밀리 리간드 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 관문 단백질을 억제시킨다. 실시양태에서, 각각의 면역 관문 억제제는 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR, 및 B-7 패밀리 리간드 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 관문 단백질의 리간드와 상호작용한다. 실시양태에서, T 세포는 PD-1 및/또는 CTLA4 넉아웃 T 세포이고, 경우에 따라, 여기서, PD-1 및/또는 CTLA4 넉아웃 T 세포는 CRISPR 시스템을 사용하여 생성된 것이다. 실시양태에서, 조성물은 면역 조절인자 또는 애쥬번트를 추가로 포함한다. 실시양태에서, 면역 조절인자는 공동자극성 리간드, TNF 리간드, Ig 슈퍼패밀리 리간드, CD28, CD80, CD86, ICOS, CD40L, OX40, CD27, GITR, CD30, DR3, CD69, 또는 4-1BB이다. 실시양태에서, 면역 조절인자는 적어도 하나의 암 세포 또는 암 세포 추출물이다. 실시양태에서, 암 세포는 조성물을 필요로 하는 피험체의 자가 세포이다. 실시양태에서, 암 세포는 용해된 것이거나, 또는 UV 방사선에 노출된 것이다. 실시양태에서, 조성물은 애쥬번트를 추가로 포함한다. 실시양태에서, 애쥬번트는 폴리(I:C), 폴리-ICLC, STING 작용제, 1018 ISS, 알루미늄 염, 암플리박스(Amplivax), AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, 이미퀴모드(Imiquimod), ImuFact IMP321, IS 패치(IS Patch), ISS, ISCOMATRIX, JuvImmune, LipoVac, MF59, 모노포스포릴 지질 A, 몬타나이드(Montanide) IMS 1312 VG, 몬타나이드 ISA 206 VG, 몬타나이드 ISA 50 V2, 몬타나이드 ISA 51 VG, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ISA-TLR2 작용제, ONTAK, 펩텔(PepTel)® 벡터 시스템, PLG 마이크로입자, 레시퀴모드, SRL172, 비로좀 및 다른 바이러스 유사 입자, YF-17D, VEGF 트랩, R848, 베타 글루칸, Pam3Cys, Pam3CSK4, 아크릴 또는 메타크릴 중합체, 말레산 무수물의 공중합체, 및 QS21 스티뮬론으로 구성된 군으로부터 선택된다. 실시양태에서, 조성물은 피험체에게 투여되었을 때, 체액성 반응을 유도한다. 실시양태에서, 조성물은 피험체에게 투여되었을 때, T 헬퍼 세포 타입 1을 유도한다.
본원에서는 종양 특이적 네오에피토프를 발현하는 종양 세포를 본원에 기술된 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 전달 시스템, 벡터, 조성물, 항체, 또는 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 종양 특이적 네오에피토프를 발현하는 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다.
본원에서는 피험체의 세포를 본원에 기술된 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 전달 시스템, 벡터, 조성물, 항체, 또는 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 피험체 예방 방법을 제공한다. 실시양태에서, 천연 폴리펩티드는 β2M, 여기서, Cz는 RMERELKKWSIQTCLSARTGLSISCTTLNSPPLKKMSMPAV, 또는 LCSRYSLFLAWRLSSVLQRFRFTHVIQQRMESQIS인 것; EGFR, 여기서, AxByCz는 EDRRLVHRDLAA인 것; BTK, 여기서, AxByCz는 MIKEGSMSEDEFIEEAKVMMNLSHEKLVQLYGVCTKQRPIFIITEYMANGSLLNYLREMRHRFQTQQLLEMCKDVCEAMEYLESKQFLHRDLAARNCLVND인 것; 또는 ESR1, 여기서, AxByCz는 HLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEHLYSMKCKNVVPLYGLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEA, NQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLPSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSH, IHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEHLYSMKCKNVVPLCDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGE, IHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEHLYSMKCKNVVPLNDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGE, 또는 IHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEHLYSMKCKNVVPLSDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGE인 것; 및 HER2, 여기서, AxByCz는 GSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAIKVLRENTSPKANKEILDEAYVMAGLGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLDHVRENRGRLGSQDLLNWCMIPVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTSTVQLIMQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQIAKGMNYL인 것으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자에 의해 코딩되는 것이다.
본원에서는 암 치료를 필요로 하거나, 또는 항종양 반응 개시, 증진, 또는 연장을 필요로 하는 피험체에게 본원에 기술된 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 항체, 또는 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료를 필요로 하거나, 또는 항종양 반응 개시, 증진, 또는 연장을 필요로 하는 피험체의 암을 치료하거나, 또는 항종양 반응을 개시, 증진 또는 연장시키는 방법을 제공한다. 실시양태에서, 피험체는 인간이다. 실시양태에서, 피험체는 암을 갖는 피험체이다. 실시양태에서, 암은 비뇨 생식기암, 부인과암, 폐암, 위장관암, 두경부암, 악성 교아세포종, 악성 중피종, 비전이성 또는 전이성 유방암, 악성 흑색종, 메르켈 세포 암종 또는 골 및 연조직 육종, 혈액 신생물, 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골수형성이상 증후군 및 급성 림프아구성 백혈병, 비소세포 폐암(NSCLC: non-small cell lung cancer), 유방암, 전이성 결장직장암, 호르몬 민감성 또는 호르몬 불응성 전립선암, 결장직장암, 난소암, 간세포 암, 신장 세포 암, 췌장암, 위암, 식도암, 간세포 암, 담관세포암, 두경부 편평세포암, 연조직 육종, 및 소세포 폐암으로 구성된 군으로부터 선택된다. 실시양태에서, 본원에 기술된 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 항체, 또는 세포는 표 1 또는 표 2에 따른 상응하는 암을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 실시양태에서, 본원에 기술된 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 항체, 또는 세포는 표 1 또는 표 2에 따른 상응하는 HLA 타입인 HLA 타입을 갖는 피험체를 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 실시양태에서, 피험체는 종양의 외과적 제거술을 받은 피험체이다. 실시양태에서, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 또는 세포는 정맥내, 복강내, 종양내, 피내, 또는 피하 투여를 통해 투여된다. 실시양태에서, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 또는 세포는 림프절 유역으로 배액되는 해부학적 부위 내로 투여된다. 실시양태에서, 투여는 다중의 림프절 유역으로 이루어진다. 실시양태에서, 투여는 피하 또는 피내 경로에 의해 이루어진다. 실시양태에서, 펩티드가 투여된다. 실시양태에서, 투여는 종양내로 이루어진다. 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드, 경우에 따라, RNA가 투여된다. 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 정맥내로 투여된다. 실시양태에서, 세포는 T 세포, 또는 수지상 세포이다. 실시양태에서, 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 항원 제시 세포 표적화 모이어티를 포함한다. 실시양태에서, 세포는 자가 세포이다. 실시양태에서, 본 방법은 피험체에게 적어도 하나의 면역 관문 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 실시양태에서, 관문 억제제는 생물학적 치료제 또는 소분자이다. 실시양태에서, 관문 억제제는 단일클론 항체, 인간화 항체, 완전 인간 항체 및 융합 단백질 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 실시양태에서, 관문 억제제는 PD-1 항체 또는 PD-L1 항체이다. 실시양태에서, 관문 억제제는 이필리무맙, 트레멜리무맙, 니볼루맙, 아벨루맙, 더발루맙, 아테졸리주맙, 펨브롤리주맙, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 실시양태에서, 관문 억제제는 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR, 및 B-7 패밀리 리간드, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 관문 단백질을 억제시킨다. 실시양태에서, 관문 억제제는 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR, 및 B-7 패밀리 리간드 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 관문 단백질의 리간드와 상호작용한다. 실시양태에서, 2개 이상의 관문 억제제가 투여된다. 실시양태에서, 2개 이상의 관문 억제제 중 적어도 하나는 PD-1 항체 또는 PD-L1 항체이다. 실시양태에서, 개 이상의 관문 억제제 중 적어도 하나는 이필리무맙, 트레멜리무맙, 니볼루맙, 아벨루맙, 더발루맙, 아테졸리주맙, 및 펨브롤리주맙으로 구성된 군으로부터 선택된다. 실시양태에서, 관문 억제제 및 조성물은 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여된다. 실시양태에서, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 또는 세포는 관문 억제제 전에 투여된다. 실시양태에서, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 또는 세포는 관문 억제제 후에 투여된다. 실시양태에서, 관문 억제제 투여는 신생항원 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 또는 세포 요법 전 기간에 걸쳐 계속 진행된다. 실시양태에서, 신생항원 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 또는 세포 요법은 관문 억제제 요법에 대하여 단지 부분적으로 반응하거나 또는 반응하지 않는 피험체에게 투여된다. 실시양태에서, 조성물은 정맥내로 또는 피하로 투여된다. 실시양태에서, 관문 억제제는 정맥내로 또는 피하로 투여된다. 실시양태에서, 관문 억제제는 조성물 투여 부위의 약 2 cm 이내에 피하로 투여된다. 실시양태에서, 조성물은 관문 억제제와 동일한 배액 림프절 내로 투여된다. 실시양태에서, 본 방법은 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 또는 세포로 치료하기 전, 그와 동시에, 또는 그 후에 피험체에게 추가의 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 실시양태에서, 추가의 작용제는 화학요법제, 면역조절약, 면역 대사 조절약, 표적화된 요법, 방사선, 항혈관신생제, 또는 면역 억제를 감소시키는 작용제이다. 실시양태에서, 화학요법제는 알킬화제, 토포이소머라제 억제제, 대사길항물질, 또는 항유사분열제이다. 실시양태에서, 추가의 작용제는 항글루코코르티코이드 유도 종양 괴사 인자 패밀리 수용체(GITR: glucocorticoid induced tumor necrosis factor family receptor) 작용성 항체 또는 항체 단편, 이브루티닙, 도세탁세올, 시스플라틴, CD40 작용성 항체 또는 항체 단편, IDO 억제제, 또는 사이클로포스파미드이다. 실시양태에서, 본 방법은 CD4+ T 세포 면역 반응 또는 CD8+ T 세포 면역 반응을 유도한다. 실시양태에서, 본 방법은 CD4+ T 세포 면역 반응 및 CD8+ T 세포 면역 반응을 유도한다.
본원에서는 유효량의, 본원에 기술된 변형된 세포 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 피험체에서 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 실시양태에서, 면역 반응은 세포독성 반응 및/또는 체액성 면역 반응이다. 실시양태에서, 본 방법은 피험체에서 T 세포 매개 면역 반응을 자극한다. 실시양태에서, T 세포 매개 면역 반응은 표적 세포에 대한 것이다. 실시양태에서, 표적 세포는 종양 세포이다. 실시양태에서, 변형된 세포는 생체내에서 형질감염 또는 형질도입된 것이다. 실시양태에서, 변형된 세포는 생체외에서 형질감염 또는 형질도입된 것이다. 실시양태에서, 변형된 세포는 피험체의 자가 T 세포이다. 실시양태에서, 피험체의 자가 T 세포는 신생항원 펩티드 또는 핵산 백신을 투여받은 피험체로부터 얻은 것이다. 실시양태에서, 신생항원 펩티드 또는 핵산 백신은 적어도 하나의 개인맞춤형 신생항원을 포함한다. 실시양태에서, 신생항원 펩티드 또는 핵산 백신은 표 1 또는 2에 열거된 적어도 하나의 추가의 신생항원성 펩티드를 포함한다. 실시양태에서, 피험체는 신생항원 펩티드 또는 핵산 백신을 투여받기 전에 및/또는 그 동안에 화학요법제, 면역조절약, 면역 대사 조절약, 표적화된 요법 또는 방사선을 투여받은 피험체이다. 실시양태에서, 피험체는 적어도 하나의 관문 억제제로 치료를 받은 피험체이다. 실시양태에서, 자가 T 세포는 신생항원을 함유하는 T 세포 요법을 적어도 1 라운드 이미 받은 피험체로부터 얻은 것이다. 실시양태에서, 본 방법은 입양 T 세포 요법을 추가로 포함한다. 실시양태에서, 입양 T 세포 요법은 자가 T 세포를 추가로 포함한다. 실시양태에서, 자가 T 세포는 종양 항원에 대하여 표적화된다. 실시양태에서, 입양 T 세포 요법은 동종이계 T 세포를 추가로 포함한다. 실시양태에서, 동종이계 T 세포는 종양 항원에 대하여 표적화된다. 실시양태에서, 입양 T 세포 요법은 관문 억제제 전, 관문 억제제 후, 또는 관문 억제제와 동시에 투여된다.
본원에서는 (i) 변형된 세포를 투여하기 전 피험체로부터 얻은 제1 샘플 중의 표적 세포의 개수 또는 농도를 측정하는 단계, (ii) 변형된 세포를 투여한 후 피험체로부터 얻은 제2 샘플 중의 표적 세포의 개수 또는 농도를 측정하는 단계, 및 (iii) 제1 샘플 중의 표적 세포의 개수 또는 농도와 비교하여 제2 샘플 중의 표적 세포의 개수 또는 농도의 증가 또는 감소를 측정하는 단계를 포함하는, 본원에 기술된 세포 중 임의의 것의 효능을 평가하는 방법을 제공한다. 실시양태에서, 치료 효능은 임상 결과; T 세포에 의한 항종양 활성의 증가, 증진 또는 연장; 치료 전의 개수와 비교하여 항종양 T 세포 또는 활성화된 T 세포 개수 증가; B 세포 활성; CD4+ T 세포 활성; 또는 이들의 조합을 모니터링함으로써 측정된다. 실시양태에서, 치료 효능은 바이오마커를 모니터링함으로써 측정된다. 실시양태에서, 바이오마커는 CEA, Her-2/neu, 방광 종양 항원, 티로글로불린, 알파-태아단백질, PSA, CA 125, CA19.9, CA 15.3, 렙틴, 프로락틴, 오스테오폰틴, IGF-II, CD98, 파신, sPIgR, 14-3-3 eta, 트로포닌 I, 순환 종양 세포 RNA 또는 DNA, 및 b형 나트륨이뇨 펩티드로 구성된 군으로부터 선택된다. 실시양태에서, 임상 결과는 종양 퇴행; 종양 수축; 종양 괴사; 면역계에 의한 항종양 반응; 종양 확장, 재발 또는 확산; 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 실시양태에서, 치료 효과는 T 세포의 존재에 의해 또는 T 세포 염증을 나타내는 유전자 시그니처의 존재에 의해, 또는 이들의 조합에 의해 예측된다.
본원에서는 암 치료를 필요로 하거나, 또는 항종양 반응 개시, 증진, 또는 연장을 필요로 하는 피험체에게 본원에 기술된 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 항체, 또는 세포; 및 적어도 하나의 관문 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료를 필요로 하거나, 또는 항종양 반응 개시, 증진, 또는 연장을 필요로 하는 피험체의 암을 치료하거나, 또는 항종양 반응을 개시, 증진 또는 연장시키는 방법을 제공한다. 실시양태에서, 본 방법은 면역 조절인자 또는 애쥬번트 투여를 추가로 포함한다. 실시양태에서, 면역 조절인자 또는 애쥬번트는 폴리(I:C), 폴리-ICLC, STING 작용제, 1018 ISS, 알루미늄 염, 암플리박스, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, 이미퀴모드, ImuFact IMP321, IS 패치, ISS, ISCOMATRIX, JuvImmune, LipoVac, MF59, 모노포스포릴 지질 A, 몬타나이드 IMS 1312 VG, 몬타나이드 ISA 206 VG, 몬타나이드 ISA 50 V2, 몬타나이드 ISA 51 VG, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ISA-TLR2 작용제, ONTAK, 펩텔® 벡터 시스템, PLG 마이크로입자, 레시퀴모드, SRL172, 비로좀 및 다른 바이러스 유사 입자, YF-17D, VEGF 트랩, R848, 베타 글루칸, Pam3Cys, Pam3CSK4, 아크릴 또는 메타크릴 중합체, 말레산 무수물의 공중합체, 및 QS21 스티뮬론, 공동자극성 리간드, TNF 리간드, Ig 슈퍼패밀리 리간드, CD28, CD80, CD86, ICOS, CD40L, OX40, CD27, GITR, CD30, DR3, CD69, 또는 4-1BB로 구성된 군으로부터 선택된다. 실시양태에서, 면역 조절인자 또는 애쥬번트는 폴리-ICLC이다. 실시양태에서, 관문 억제제는 항PD1 항체 또는 항체 단편이다. 실시양태에서, 항PD1 항체 또는 항체 단편은 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙이다. 실시양태에서, 관문 억제제는 항PD-L1 항체 또는 항체 단편이다. 실시양태에서, 항PD-L1 항체 또는 항체 단편은 아벨루맙, 더발루맙 또는 아테졸리주맙이다. 실시양태에서, 관문 억제제는 항CTLA4 항체 또는 항체 단편이다. 실시양태에서, 항CTLA4 항체는 이필리무맙 또는 트레멜리무맙이다. 실시양태에서, 본 방법은 항PD1 항체 및 항CTLA4 항체, 둘 모두를 투여하는 단계를 포함한다. 실시양태에서, 관문 억제제 투여는 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 항체, 또는 세포 투여 개시 전에 개시된다. 실시양태에서, 관문 억제제 투여는 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 항체, 또는 세포 투여 개시 후에 개시된다. 실시양태에서, 관문 억제제 투여는 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 항체, 또는 세포 투여 개시와 동시에 개시된다. 실시양태에서, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 항체, 또는 세포는 정맥내로 또는 피하로 투여된다. 실시양태에서, 관문 억제제는 정맥내로 또는 피하로 투여된다. 실시양태에서, 관문 억제제는 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 항체, 또는 세포 투여 부위의 약 2 cm 이내에 피하로 투여된다. 실시양태에서, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 항체, 또는 세포는 관문 억제제와 동일한 배액 림프절 내로 투여된다.
본원에서는 본원에 기술된 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 항체, 세포, 또는 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 실시양태에서, 암은 부신암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 교아세포종, 두경부암, 혐색소형 신세포암, 투명세포형 신세포암, 유두상 신장암, 간암, 폐 선암종, 폐 편평세포암, 난소암, 췌장암, 흑색종, 위암, 자궁체부 자궁내막암, 및 자궁 암육종으로 구성된 군으로부터 선택된다. 실시양태에서, 암은 전립선암, 방광암, 폐 편평세포암, NSCLC, 유방암, 두경부암, 폐 선암종, GBM, 신경교종, CML, AML, 천막상 뇌실막세포종, 급성 전골수구성 백혈병, 고립성 섬유성 종양, 및 크리조티닙 내성 암으로 구성된 군으로부터 선택된다. 실시양태에서, 암은 CRC, 두경부암, 위암, 폐 편평세포암, 폐 선암종, 전립선암, 방광암, 위암, 신세포 암종, 및 자궁암으로 구성된 군으로부터 선택된다. 실시양태에서, 암은 흑색종, 폐 편평세포암, DLBCL, 자궁암, 두경부암, 자궁암, 간암, 및 CRC로 구성된 군으로부터 선택된다. 실시양태에서, 암은 림프계 암; 버킷 림프종, 신경아세포종, 전립선 선암종, 결장직장 선암종; 자궁/자궁내막 선암종; MSI+; 자궁내막 장액성 암종; 자궁내막 암육종-악성 혼합성 중배엽 종양; 신경교종; 성상세포종; GBM, MDS와 연관된 급성 골수성 백혈병; 만성 림프구성 백혈병-소형 림프구성 림프종; 골수형성이상 증후군; 급성 골수성 백혈병; 유방의 루미날 NS 암종; 만성 골수성 백혈병; 췌관 암종; 만성 골수단핵구성 백혈병; 골수섬유증; 골수형성이상 증후군; 전립선 선암종; 본태성 혈소판증가증; 및 수아근아세포종으로 구성된 군으로부터 선택된다. 실시양태에서, 암은 결장직장암, 자궁암, 자궁내막암, 및 위암으로 구성된 군으로부터 선택된다. 실시양태에서, 암은 자궁경부암, 두경부암, 항문암, 위암, 버킷 림프종, 및 비인두 암종으로 구성된 군으로부터 선택된다. 실시양태에서, 암은 방광, 결장직장암, 및 위암으로 구성된 군으로부터 선택된다. 실시양태에서, 암은 폐암, CRC, 흑색종, 유방암, NSCLC, 및 CLL로 구성된 군으로부터 선택된다. 실시양태에서, 피험체는 관문 억제제 요법에 대한 부분 반응자 또는 비반응자이다. 실시양태에서, 암은 방광 요로상피 암종(BLCA: bladder urothelial carcinoma), 유방 침습 암종(BRCA: breast invasive carcinoma), 유방암, 자궁경부 편평세포암종 및 내자궁경부 선암종(CESC: cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma), 만성 림프구성 백혈병(CLL: chronic lymphocytic leukaemia), 결장직장암(CRC), 다형성 교아세포종(GBM: glioblastoma multiforme), 두경부 편평세포암종(HNSC: head and neck squamous cell carcinoma), 신장 유두상 신세포 암종(KIRP: kidney renal papillary cell carcinoma), 간 간세포 암종(LIHC: liver hepatocellular carcinoma), 폐 선암종(LUAD: lung adenocarcinoma), 폐 편평세포암 세포 암종(LUSC: lung squamous cell carcinoma), 췌장 선암종(PAAD: pancreatic adenocarcinoma), 전립선암, 피부 흑색종(SKCM: skin cutaneous melanoma), 위 선암종(STAD: stomach adenocarcinoma), 갑상선 선암종(THCA: thyroid adenocarcinoma), 및 자궁체부 자궁내막양 암종(UCEC: uterine corpus endometrioid carcinoma)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 실시양태에서, 암은 결장직장암, 자궁암, 자궁내막암, 위암, 및 린치 증후군으로 구성된 군으로부터 선택된다. 실시양태에서, 암은 MSI+ 암이다.
본 발명은 단리된 신생항원성 펩티드가 천연 폴리펩티드가 아닌 것인, 표 1에 정의된, 종양 특이적 네오에피토프를 포함하는 단리된 신생항원성 펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 종양 특이적 네오에피토프를 포함하고, 표 1에 정의된 단리된 신생항원성 펩티드에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드의 길이는 약 8 내지 약 50개의 아미노산 길이이다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드의 길이는 약 15 내지 약 35개의 아미노산 길이이다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드의 길이는 약 15개 이하의 아미노산 길이이다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드의 길이는 약 8 내지 약 11개의 아미노산 길이이다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드의 길이는 9 또는 10개의 아미노산 길이이다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 주조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 약 500 nM 미만의 결합 친화도로 MHC 클래스 I에 결합한다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드의 길이는 약 30개 이하의 아미노산 길이이다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드의 길이는 약 6 내지 약 25개의 아미노산 길이이다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드의 길이는 약 15 내지 약 24개의 아미노산 길이이다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드의 길이는 약 9 내지 약 15개의 아미노산 길이이다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 MHC 클래스 II에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 약 1,000 nM 미만의 결합 친화도로 MHC 클래스 II에 결합한다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 측면 아미노산을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 측면 아미노산은 천연 측면 아미노산이 아니다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 적어도 제2 신생항원성 펩티드에 연결된다. 또 다른 실시양태에서, 펩티드는 폴리글리신 또는 폴리세린 링커를 사용하여 연결된다. 또 다른 실시양태에서, 제2 신생항원성 펩티드는 약 1,000 nM 미만의 결합 친화도로 MHC 클래스 I 또는 클래스 II에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 제2 신생항원성 펩티드는 약 500 nM 미만의 결합 친화도로 MHC 클래스 I 또는 클래스 II에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 두 네오에피토프 모두 인간 백혈구 항원 (HLA)-A, -B, -C, -DP, -DQ, 또는 -DR에 결합한ㄷ. 또 다른 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 클래스 I HLA에 결합하고, 제2 신생항원성 펩티드는 클래스 II HLA에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 클래스 II HLA에 결합하고, 제2 신생항원성 펩티드는 클래스 I HLA에 결합한다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 생체내 반감기, 세포 표적화, 항원 흡수, 항원 프로세싱, MHC 친화도, MHC 안정성, 또는 항원 제시를 증가시키는 변형을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 변형은 캐리어 단백질에의 접합, 리간드에의 접합, 항체에의 접합, PEG화, 폴리시알릴화, HES화, 재조합 PEG 모방체, Fc 융합, 알부민 융합, 나노입자 부착, 나노미립자 캡슐화, 콜레스테롤 융합, 철 융합, 아실화, 아미드화, 글리코실화, 측쇄 산화, 인산화, 비오티닐화, 계면 활성 물질 첨가, 아미노산 모방체 첨가, 또는 비천연 아미노산 첨가이다. 또 다른 실시양태에서, 표적화되는 세포는 항원 제시 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 항원 제시 세포는 수지상 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 수지상 세포는 DEC205, XCR1, CD197, CD80, CD86, CD123, CD209, CD273, CD283, CD289, CD184, CD85h, CD85j, CD85k, CD85d, CD85g, CD85a, CD141, CD11c, CD83, TSLP 수용체, Clec9a 또는 CD1a 마커를 사용하여 표적화된다. 또 다른 실시양태에서, 수지상 세포는 CD141, DEC205, 또는 XCR1 마커를 사용하여 표적화된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 단리된 신생항원성 펩티드를 포함하는 생체내 전달 시스템을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 전달 시스템은 세포 투과 펩티드, 나노미립자 캡슐화, 바이러스 유사 입자, 또는 리포솜을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 세포 투과 펩티드는 TAT 펩티드, 단순 허피스 바이러스 VP22, 트랜스포탄, 또는 Antp이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 단리된 신생항원성 펩티드를 포함하는 세포에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 항원 제시 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 수지상 세포이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 단리된 신생항원성 펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 또는 적어도 30개의, 표 1 또는 2에 정의된, 종양 특이적 네오에피토프를 포함하는 단리된 신생항원성 펩티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 2 내지 20개의 신생항원성 펩티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 또는 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 또는 적어도 30종의 추가의 신생항원성 펩티드를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 약 4 내지 약 20종의 추가의 신생항원성 펩티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 추가의 신생항원성 펩티드는 개별 환자의 종양에 대하여 특이적인 것이다. 또 다른 실시양태에서, 환자 특이적 신생항원성 펩티드는 환자의 종양 샘플의 게놈, 엑솜, 및/또는 트랜스크립톰과 비종양 샘플의 게놈, 엑솜, 및/또는 트랜스크립톰 사이의 서열 차이를 확인함으로써 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 샘플은 신선한 또는 포르말린 고정 파라핀 포매된 종양 조직, 새로 단리된 세포, 또는 순환 종양 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 서열 차이는 차세대 시퀀싱에 의해 결정된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 단리된 신생항원성 펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 RNA, 경우에 따라, 자기 증폭 RNA이다. 또 다른 실시양태에서, RNA는 안정성을 증가시키기 위해, 세포 표적화를 증가시키기 위해, 번역 효율, 애쥬번트성, 사이토졸 접근성을 증가시키기 위해, 및/또는 세포독성을 감소시키기 위해 변형된다. 또 다른 실시양태에서, 변형은 캐리어 단백질에의 접합, 리간드에의 접합, 항체에의 접합, 코돈 최적화, GC 함량 증가, 변형된 뉴클레오시드 도입, 5' 캡 또는 캡 유사체 도입, 및/또는 비마스킹된 폴리A 서열 도입이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포에 관한 것이다
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 또 다른 실시양태에서, 벡터는 RNA 레플리콘, 플라스미드, 파지, 트랜스포손, 코스미드, 바이러스, 또는 비리온을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 벡터는 아데노 연관 바이러스, 허피스바이러스, 렌티바이러스, 또는 이들의 슈도타입이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 생체내 전달 시스템에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 전달 시스템은 구형 핵산, 바이러스, 바이러스 유사 입자, 플라스미드, 박테리아 플라스미드, 또는 나노입자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 벡터 또는 전달 시스템을 포함하는 세포에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 항원 제시 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 수지상 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 미성숙한 수지상 세포이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 또는 적어도 30종의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 신생항원성 펩티드를 코딩하는, 약 2 내지 약 20개의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 또는 적어도 30종의, 추가의 신생항원성 펩티드를 코딩하는 추가의 신생항원성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 약 4 내지 약 20종의 추가의 신생항원성 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 및 추가의 신생항원성 폴리뉴클레오티드는 연결되어 있다. 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 폴리글리신 또는 폴리세린 링커를 코딩하는 핵산을 사용하여 연결된다. 일부 실시양태에서, 추가의 신생항원성 펩티드 중 적어도 하나는 개별 환자의 종양에 특이적인 것이다. 일부 실시양태에서, 환자 특이적 신생항원성 펩티드는 피험체의 종양 샘플의 게놈, 엑솜, 및/또는 트랜스크립톰과 비종양 샘플의 게놈, 엑솜, 및/또는 트랜스크립톰 사이의 서열 차이를 확인함으로써 선택된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 신선한 또는 포르말린 고정 파라핀 포매된 종양 조직, 새로 단리된 세포, 또는 순환 종양 세포이다. 실시양태에서, 서열 차이는 차세대 시퀀싱에 의해 결정된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 적어도 하나의 신생항원성 펩티드에 결합할 수 있는 T 세포 수용체(TCR)에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, TCR은 MHC 클래스 I 또는 클래스 II와 관련하여 단리된 신생항원성 펩티드에 결합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (i) T 세포 활성화 분자; (ii) 막횡단 영역; 및 (iii) 본원에 기술된 단리된 신생항원성 펩티드에 결합할 수 있는 항원 인식 모이어티를 포함하는 키메라 항원 수용체에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 키메라 항원 수용체는 T 세포 활성화 분자로서 CD3-제타를 함유한다. 일부 실시양태에서, 키메라 항원 수용체는 적어도 하나의 공동자극성 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 신호전달 도메인은 CD28, 4-1BB, ICOS, OX40, ITAM, 또는 Fc 엡실론 RI-감마이다. 일부 실시양태에서, 항원 인식 모이어티는 MHC 클래스 I 또는 클래스 II와 관련하여 단리된 신생항원성 펩티드에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키메라 항원 수용체는 CD3-제타, CD28, CTLA-4, ICOS, BTLA, KIR, LAG3, CD137, OX40, CD27, CD40L, Tim-3, A2aR, 또는 PD-1 막횡단 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양 특이적 에피토프는 종양 연관 폴리펩티드의 세포외 도메인에 위치한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체를 포함하는 T 세포에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 헬퍼 또는 세포독성 T 세포이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 T 세포 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 핵산에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, TCR은 주조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 또는 클래스 II와 관련하여 적어도 하나의 신생항원성 펩티드에 결합할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 핵산은 본원에 기술된 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항원 인식 모이어티는 주조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 또는 클래스 II와 관련하여 적어도 하나의 신생항원성 펩티드에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양 특이적 에피토프는 종양 연관 폴리펩티드의 세포외 도메인에 위치한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 CD3-제타, CD28, CTLA-4, ICOS, BTLA, KIR, LAG3, CD137, OX40, CD27, CD40L, Tim-3, A2aR, 또는 PD-1 막횡단 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 적어도 하나의 신생항원성 펩티드에 결합할 수 있는 항체에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 핵산으로 형질감염 또는 형질도입된 변형된 세포에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변형된 세포는 T 세포, 종양 침윤 림프구, NK-T 세포, TCR 발현 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 NK 세포이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체를 함유하는 환자의 자가 T 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 면역 관문 억제제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 적어도 2개의 면역 관문 억제제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 면역 관문 억제제는 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR, 및 B-7 패밀리 리간드 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 관문 단백질을 억제시킨다. 일부 실시양태에서, 각각의 면역 관문 억제제는 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR, 및 B-7 패밀리 리간드 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 관문 단백질의 리간드와 상호작용한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 면역 조절인자 또는 애쥬번트를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 면역 조절인자는 공동자극성 리간드, TNF 리간드, Ig 슈퍼패밀리 리간드, CD28, CD80, CD86, ICOS, CD40L, OX40, CD27, GITR, CD30, DR3, CD69, 또는 4-1BB이다. 또 다른 실시양태에서, 면역 조절인자는 적어도 하나의 암 세포 또는 암 세포 추출물이다. 또 다른 실시양태에서, 암 세포는 조성물을 필요로 하는 피험체의 자가 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 암 세포는 용해된 것이거나, 또는 UV 방사선에 노출된 것이다. 또 다른 실시양태에서, 애쥬번트는 피험체에게 투여되었을 때, 체액성 반응을 유도한다. 또 다른 실시양태에서, 애쥬번트는 피험체에게 투여되었을 때, T 헬퍼 세포 타입 1을 유도한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 종양 특이적 네오에피토프를 발현하는 종양 세포를 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 전달 시스템, 벡터, 조성물, 항체, 또는 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 본원에 기술된 종양 특이적 네오에피토프를 발현하는 종양 세포의 성장을 억제하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하거나, 또는 항종양 반응 개시, 증진, 또는 연장을 필요로 하는 피험체에게 본원에 기술된 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 항체, 또는 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료를 필요로 하거나, 또는 항종양 반응 개시, 증진, 또는 연장을 필요로 하는 피험체의 암을 치료하거나, 또는 항종양 반응을 개시, 증진 또는 연장시키는 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 암은 부신암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 교아세포종, 두경부암, 혐색소형 신세포암, 투명세포형 신세포암, 유두상 신장암, 폐암, 폐 선암종, 폐 편평세포암, 난소암, 췌장암, 흑색종, 위암, 자궁체부 자궁내막암, 및 자궁 암육종으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 암은 전립선암, 방광암, 폐 편평세포암, NSCLC, 유방암, 두경부암, 폐 선암종, GBM, 신경교종, CML, AML, 천막상 뇌실막세포종, 급성 전골수구성 백혈병, 고립성 섬유성 종양, 및 크리조티닙 내성 암으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 암은 CRC, 두경부암, 위암, 폐 편평세포암, 폐 선암종, 전립선암, 방광암, 위암, 신세포 암종, 및 자궁암으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 암은 흑색종, 폐 편평세포암, DLBCL, 자궁암, 두경부암, 자궁암, 간암, 및 CRC로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 암은 림프계 암; 버킷 림프종, 신경아세포종, 전립선 선암종, 결장직장 선암종; 자궁/자궁내막 선암종; MSI+; 자궁내막 장액성 암종; 자궁내막 암육종-악성 혼합성 중배엽 종양; 신경교종; 성상세포종; GBM, MDS와 연관된 급성 골수성 백혈병; 만성 림프구성 백혈병-소형 림프구성 림프종; 골수형성이상 증후군; 급성 골수성 백혈병; 유방의 루미날 NS 암종; 만성 골수성 백혈병; 췌관 암종; 만성 골수단핵구성 백혈병; 골수섬유증; 골수형성이상 증후군; 전립선 선암종; 본태성 혈소판증가증; 및 수아근아세포종로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 암은 결장직장암, 자궁암, 자궁내막암, 및 위암으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 암은 자궁경부암, 두경부암, 항문암, 위암, 버킷 림프종, 및 비인두 암종으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 암은 방광, 결장직장암, 및 위암으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 암은 폐암, CRC, 흑색종, 유방암, NSCLC, 및 CLL로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 암은 부신피질 암종(ACC: adrenocortical carcinoma), 급성 전골수구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병(AML: acute myeloid leukemia), 골수형성이상 증후군(MDS: myelodysplastic syndrome)과 연관된 AML, 항문암, 성상세포종, 방광암, 방광 요로상피 암종(BLCA), 유방암, 유방 침습 암종(BRCA), 버킷 림프종, 거세 저항 전립선암, 자궁경부암, 자궁경부 편평세포암종 및 내자궁경부 선암종(CESC), 만성 림프구성 백혈병-소형 림프구성 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML: chronic myeloid leukaemia), 만성 골수단핵구성 백혈병, 결장직장 선암종, 결장직장암(CRC: colorectal cancer), 크리조티닙 내성 비소세포 폐암(NSCLC), 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL: diffuse large B-cell lymphoma), 췌관 암종, 자궁내막 암육종-악성 혼합성 중배엽 종양, 자궁내막 장액성 암종, 본태성 혈소판증가증, 다형성 교아세포종(GBM), 신경교종, 두경부암, 두경부 편평세포암종(HNSC), 침윤성 소엽 암종(ILC: invasive lobular carcinoma) LumA 유방암, 혐색소형 신세포암(KICH: kidney chromophobe), 신장 투명세포형 신세포 암종(KIRC: kidney renal clear cell carcinoma), 신장 유두상 신세포 암종(KIRP), 급성 골수성 백혈병(LAML: acute myeloid leukemia), 간 간세포 암종(LIHC), 간암, 폐 선암종(LUAD), 폐 편평세포암 세포 암종(LUSC), 유방의 루미날 NS 암종, 폐암, 림프계 암, 수아근아세포종, 흑색종, 현미부수체 불안정성(MSI: microsatellite instability)+ 결장직장암(CRC), MSI+ 자궁내막양 암종, MSI+ 위암, MSI+ 자궁/자궁내막암, 골수형성이상 증후군, 골수섬유증, 비인두 암종, 신경아세포종, 비소세포 폐암(NSCLC), 난소암 장액 낭선암종(OV: ovarian serous cystadenocarcinoma), 췌장 선암종(PAAD), 전립선 선암종(PRAD: prostate adenocarcinoma), 전립선암, 신세포 암종, 피부 흑색종(SKCM), 고립성 섬유성 종양, 위 선암종(STAD), 위암, 천막상 뇌실막세포종, 갑상선 선암종(THCA), 자궁체부 자궁내막양 암종(UCEC), 또는 자궁 암육종(UCS: uterine carcinosarcoma), 자궁암, 및 자궁/자궁내막 선암종으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 암은 방광 요로상피 암종(BLCA), 유방 침습 암종(BRCA), 유방암, 자궁경부 편평세포암종 및 내자궁경부 선암종(CESC), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 결장직장암(CRC), 다형성 교아세포종(GBM), 두경부 편평세포암종(HNSC), 신장 유두상 신세포 암종(KIRP), 간 간세포 암종(LIHC), 폐 선암종(LUAD), 폐 편평세포암 세포 암종(LUSC), 췌장 선암종(PAAD), 전립선암, 피부 흑색종(SKCM), 위 선암종(STAD), 갑상선 선암종(THCA), 및 자궁체부 자궁내막양 암종(UCEC)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 피험체는 인간이다. 또 다른 실시양태에서, 피험체는 암을 갖는 피험체이다. 또 다른 실시양태에서, 암은 비뇨 생식기암, 부인과암, 폐암, 위장관암, 두경부암, 악성 교아세포종, 악성 중피종, 비전이성 또는 전이성 유방암, 악성 흑색종, 메르켈 세포 암종 또는 골 및 연조직 육종, 혈액 신생물, 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골수형성이상 증후군 및 급성 림프아구성 백혈병, 비소세포 폐암(NSCLC), 유방암, 전이성 결장직장암, 호르몬 민감성 또는 호르몬 불응성 전립선암, 결장직장암, 난소암, 간세포 암, 신장 세포 암, 췌장암, 위암, 식도암, 간세포 암, 담관세포암, 두경부 편평세포암, 연조직 육종, 및 소세포 폐암으로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 피험체는 종양의 외과적 제거술을 받은 피험체이다. 또 다른 실시양태에서, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 또는 세포는 정맥내, 복강내, 종양내, 피내, 또는 피하 투여를 통해 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 또는 세포는 림프절 유역으로 배액되는 해부학적 부위 내로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 투여는 다중의 림프절 유역으로 이루어진다. 실시양태에서, 투여는 피하 또는 피내 경로에 의해 이루어진다.
본 방법의 일부 실시양태에서, 펩티드가 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 투여는 종양내로 이루어진다. 본 방법의 또 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드, 경우에 따라, RNA가 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 정맥내로 투여된다. 본 방법의 일부 실시양태에서, 세포가 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 T 세포, 또는 수지상 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 항원 제시 세포 표적화 모이어티를 포함한다.
본 방법의 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 면역 관문 억제제 또한 피험체에게 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 관문 억제제는 생물학적 치료제 또는 소분자이다. 또 다른 실시양태에서, 관문 억제제는 단일클론 항체, 인간화 항체, 완전 인간 항체 및 융합 단백질 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 관문 억제제는 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR, 및 B-7 패밀리 리간드 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 관문 단백질을 억제시킨다. 또 다른 실시양태에서, 관문 억제제는 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR, 및 B-7 패밀리 리간드 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 관문 단백질의 리간드와 상호작용한다. 또 다른 실시양태에서, 2개 이상의 관문 억제제가 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 관문 억제제는 (i) 이필리무맙 또는 트레멜리무맙, 및 (ii) 니볼루맙이다. 또 다른 실시양태에서, 관문 억제제 및 조성물은 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 신생항원성 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 또는 세포는 관문 억제제 전에 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 또는 세포는 관문 억제제 후에 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 관문 억제제는 신생항원 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 또는 세포 요법 전 기간에 걸쳐 계속 진행된다. 또 다른 실시양태에서, 신생항원 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 또는 세포 요법은 관문 억제제 요법에 대하여 단지 부분적으로 반응하거나 또는 반응하지 않는 피험체에게 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 정맥내로 또는 피하로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 관문 억제제는 정맥내로 또는 피하로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 관문 억제제는 조성물 투여 부위의 약 2 cm 이내에 피하로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 관문 억제제와 동일한 배액 림프절 내로 투여된다.
본 방법의 일부 실시양태에서, 추가의 작용제가 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 작용제는 화학요법제, 면역조절약, 면역 대사 조절약, 표적화된 요법, 방사선, 항혈관신생제, 또는 면역 억제를 감소시키는 작용제이다. 또 다른 실시양태에서, 화학요법제는 알킬화제, 토포이소머라제 억제제, 대사길항물질, 또는 항유사분열제이다. 또 다른 실시양태에서, 추가의 작용제는 항글루코코르티코이드 유도 종양 괴사 인자 패밀리 수용체(GITR) 작용성 항체 또는 항체 단편, 이브루티닙, 도세탁세올, 시스플라틴, 또는 사이클로포스파미드이다. 또 다른 실시양태에서, 투여는 CD4+ T 세포 면역 반응을 유도한다. 또 다른 실시양태에서, 투여는 CD4+ T 세포 면역 반응 및 CD8+ T 세포 면역 반응을 유도한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 유효량의, 본원에 기술된 변형된 세포 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 피험체에서 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 면역 반응은 세포독성 반응 및/또는 체액성 면역 반응이다. 또 다른 실시양태에서, 본 방법은 피험체에서 T 세포 매개 면역 반응을 자극한다. 또 다른 실시양태에서, T 세포 매개 면역 반응은 표적 세포에 대한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 표적 세포는 종양 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 변형된 세포는 생체내에서 형질감염 또는 형질도입된 것이다. 또 다른 실시양태에서, 변형된 세포는 생체외에서 형질감염 또는 형질도입된 것이다. 또 다른 실시양태에서, 변형된 세포는 환자의 자가 T 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 환자의 자가 T 세포는 신생항원 펩티드 또는 핵산 백신을 투여받은 환자로부터 수득되는 것이다. 또 다른 실시양태에서, 신생항원 펩티드 또는 핵산 백신은 적어도 하나의 개인맞춤형 신생항원을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 신생항원 펩티드 또는 핵산 백신은 본원에 기술된 적어도 하나의 추가의 신생항원성 펩티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 환자는 신생항원 펩티드 또는 핵산 백신을 투여받기 전에 및/또는 그 동안에 화학요법제, 면역조절약, 면역 대사 조절약, 표적화된 요법 또는 방사선을 투여받은 환자이다. 또 다른 실시양태에서, 환자는 적어도 하나의 관문 억제제로 치료를 받은 환자이다. 또 다른 실시양태에서, 자가 T 세포는 신생항원을 함유하는 T 세포 요법을 적어도 1 라운드 이미 받은 환자로부터 수득되는 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 방법은 입양 T 세포 요법을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 입양 T 세포 요법은 자가 T 세포를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 자가 T 세포는 종양 항원에 대하여 표적화된다. 또 다른 실시양태에서, 입양 T 세포 요법은 동종이계 T 세포를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 동종이계 T 세포는 종양 항원에 대하여 표적화된다. 또 다른 실시양태에서, 입양 T 세포 요법은 관문 억제제 전에 투여된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (i) 변형된 세포를 투여하기 전 피험체로부터 얻은 제1 샘플 중의 표적 세포의 개수 또는 농도를 측정하는 단계, (ii) 변형된 세포를 투여한 후 피험체로부터 얻은 제2 샘플 중의 표적 세포의 개수 또는 농도를 측정하는 단계, 및 (iii) 제1 샘플 중의 표적 세포의 개수 또는 농도와 비교하여 제2 샘플 중의 표적 세포의 개수 또는 농도의 증가 또는 감소를 측정하는 단계를 포함하는, 치료의 효능을 평가하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 치료 효능은 임상 결과; T 세포에 의한 항종양 활성의 증가, 증진 또는 연장; 치료 전의 개수와 비교하여 항종양 T 세포 또는 활성화된 T 세포 개수 증가; B 세포 활성; CD4 T 세포 활성; 또는 이들의 조합을 모니터링함으로써 측정된다. 또 다른 실시양태에서, 치료 효능은 바이오마커를 모니터링함으로써 측정된다. 또 다른 실시양태에서, 바이오마커는 CEA, Her-2/neu, 방광 종양 항원, 티로글로불린, 알파-태아단백질, PSA, CA 125, CA19.9, CA 15.3, 렙틴, 프로락틴, 오스테오폰틴, IGF-II, CD98, 파신, sPIgR, 14-3-3 eta, 트로포닌 I, 및 b형 나트륨이뇨 펩티드로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 임상 결과는 종양 퇴행; 종양 수축; 종양 괴사; 면역계에 의한 항종양 반응; 종양 확장, 재발 또는 확산; 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 치료 효과는 T 세포의 존재에 의해 또는 T 세포 염증을 나타내는 유전자 시그니처의 존재에 의해, 또는 이들의 조합에 의해 예측된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하거나, 또는 항종양 반응 개시, 증진, 또는 연장을 필요로 하는 피험체에게 (a) 본원에 기술된 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 항체, 또는 세포; 및 (b) 적어도 하나의 관문 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료를 필요로 하거나, 또는 항종양 반응 개시, 증진, 또는 연장을 필요로 하는 피험체의 암을 치료하거나, 또는 항종양 반응을 개시, 증진 또는 연장시키는 방법에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 방법은 면역 조절인자 또는 애쥬번트 투여를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 면역 조절인자 또는 애쥬번트는 폴리(I:C), 폴리-ICLC, STING 작용제, 1018 ISS, 알루미늄 염, 암플리박스, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, 이미퀴모드, ImuFact IMP321, IS 패치, ISS, ISCOMATRIX, JuvImmune, LipoVac, MF59, 모노포스포릴 지질 A, 몬타나이드 IMS 1312 VG, 몬타나이드 ISA 206 VG, 몬타나이드 ISA 50 V2, 몬타나이드 ISA 51 VG, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ISA-TLR2 작용제, ONTAK, 펩텔® 벡터 시스템, PLG 마이크로입자, 레시퀴모드, SRL172, 비로좀 및 다른 바이러스 유사 입자, YF-17D, VEGF 트랩, R848, 베타 글루칸, Pam3Cys, Pam3CSK4, 아크릴 또는 메타크릴 중합체, 말레산 무수물의 공중합체, 및 QS21 스티뮬론, 공동자극성 리간드, TNF 리간드, Ig 슈퍼패밀리 리간드, CD28, CD80, CD86, ICOS, CD40L, OX40, CD27, GITR, CD30, DR3, CD69, 또는 4-1BB로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 면역 조절인자 또는 애쥬번트는 폴리-ICLC이다. 또 다른 실시양태에서, 관문 억제제는 항PD1 항체 또는 항체 단편이다. 또 다른 실시양태에서, PD-1 경로의 억제제는 니볼루맙이다. 또 다른 실시양태에서, 관문 억제제는 항CTLA4 항체 또는 항체 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 항CTLA4 항체는 이필리무맙 또는 트레멜리무맙이다. 또 다른 실시양태에서, 본 방법은 항PD1 항체 및 항CTLA4 항체, 둘 모두를 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 관문 억제제 투여는 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 항체, 또는 세포 투여 개시 전에 개시된다. 또 다른 실시양태에서, 관문 억제제 투여는 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 항체, 또는 세포 투여 개시 후에 개시된다. 또 다른 실시양태에서, 관문 억제제 투여는 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 항체, 또는 세포 개시와 동시에 개시된다. 또 다른 실시양태에서, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 항체, 또는 세포는 정맥내로 또는 피하로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 관문 억제제는 정맥내로 또는 피하로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 관문 억제제는 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 항체, 또는 세포 투여 부위의 약 2 cm 이내에 피하로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 항체, 또는 세포는 관문 억제제와 동일한 배액 림프절 내로 투여된다.
치료 방법의 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 예를 들어, 화학요법제 또는 생물학적 치료제, 방사선, 또는 면역요법이다. 특정 암을 위한 임의의 적합한 치료적 처치가 투여될 수 있다. 화학요법제 및 생물학적 치료제의 예로는 혈관신생 억제제, 예컨대, 하이드록시 안지오스타틴 K1-3, DL-α-디플루오로메틸-오르니틴, 엔도스타틴, 푸마길린, 제니스테인, 미노사이클린, 스타우로스포린 및 탈리도미드; DNA 삽입제/가교제, 예컨대, 블레오마이신(Bleomycin), 카르보플라틴(Carboplatin), 카르무스틴(Carmustine), 클로람부실(Chlorambucil), 사이클로포스파미드(Cyclophosphamide), 시스-디아민백금(II) 디클로라이드(Cispiatin), 멜팔란(Melphalan), 미톡산트론(미톡산트론) 및 옥살리플라틴(Oxaliplatin); DNA 합성 억제제, 예컨대, (±)-아메톱테린((±)-Amethopterin)(메토트렉세이트(Methotrexate)), 3-아미노-1,2,4-벤조트리아진 1,4-디옥시드, 아미노프테린(Aminopterin), 시토신 β-D-아라비노푸라노시드, 5-플루오로-5'-데옥시우리딘, 5-플루오로우라실, 간시클로버(Ganciclovir), 하이드록시우레아 및 미토마이신(Mitomycin) C; DNA-RNA 전사 조절제, 예컨대, 악티노마이신(Actinomycin) D, 다우노루비신(Daunorubicin), 독소루비신(Doxorubicin), 호모해링토닌(Homoharringtonine) 및 이다루비신(Idarubicin); oη/.γηκ 억제제, 예컨대, S(+)-캄프토테신(Camptothecin), 커큐민(Curcumin), (-)-데구엘린(Deguelin), 5,6-디클로로벤즈이미다졸 1-β-D-리보푸라노시드, 에토포시드(Etoposide), 포르메스탄(Formestane), 포스트리에신(Fostriecin), 히스피딘(Hispidin), 2-이미노-1-이미다졸리-딘아세트산(사이클로크레아틴(Cyclocreatine)), 메비놀린(Mevinolin), 트리코스타틴(Trichostatin) A, 티르포스틴(Tyrphostin) AG 34 및 티르포스틴 AG 879; 유전자 조절제, 예컨대, 5-아자-2'-데옥시시티딘, 5-아자시티딘, 콜레칼시페롤(Cholecalciferol)(비타민 D3), 4-하이드록시타목시펜, 멜라토닌(Melatonin), 미페프리스톤(Mifepristone), 랄록시펜(Raloxifene), 전 트랜스-레티날(비타민 A 알데히드), 레티노산 전 트랜스(비타민 A 산), 9-시스-레티노산, 13-시스-레티노산, 레티놀(Retinol)(비타민 A), 타목시펜(Tamoxifen) 및 트로글리타존(Troglitazone); 미세소관 억제제, 예컨대, 콜히친(Colchicine), 도세탁셀, 돌라스타틴(Dolastatin) 15, 노코다졸(Nocodazole), 파클리탁셀(Paclitaxel), 포도필로톡신(Podophyllotoxin), 리족신(Rhizoxin), 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine), 빈데신(Vindesine) 및 비노렐빈(Vinorelbine)(나벨빈(Navelbine)); 및 비분류 치료제, 예컨대, 17-(알릴아미노)-17-데메톡시겔다나마이신, 4-아미노-1,8-나프탈리미드, 아피게닌(Apigenin), 브레펠딘(Brefeldin) A, 시메티딘(Cimetidine), 디클로로메틸렌-디포스폰산, 류프롤리드(Leuprolide)(류프로렐린(Leuprorelin)), 황체형성 호르몬 방출 호르몬, 피피트린(Pifithrin)-a, 라파마이신(Rapamycin), 성 호르몬 결합 글로불린, 탑시가르긴(Thapsigargin) 및 소변 트립신 억제제 단편(비쿠닌(Bikunin))을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 치료제는 알트레타민, 아미포스틴, 아스파라기나제, 카페시타빈, 클라드리빈, 시사프라이드, 시타라빈, 다카르바진(DTIC), 닥티노마이신, 드로나비놀, 에포에틴 알파, 필그라스팀, 플루다라빈, 젬시타빈, 그라니세트론, 이포스파미드, 이리노테칸, 란소프라졸, 레바미솔, 류코보린, 메게스트롤, 메스나, 메토클로프라미드, 미토탄, 오메프라졸, 온단세트론, 필로카르핀, 프로클로로페라진 또는 토포테칸 하이드로클로라이드일 수 있다. 치료제는 단일클론 항체, 예컨대, 리툭시맙(Rituxan®), 알렘투주맙(Campath®), 베바시주맙(Avastin®), 세툭시맙(세툭시맙)(Erbitux®), 파니투무맙(Vectibix®) 및 트라스투주맙(Herceptin®), 베무라페닙(Vemurafenib)(Zelboraf®) 이마티닙 메실레이트(Gleevec®), 에를로티닙(Tarceva®), 제피티닙(Iressa®), 비스모데집(Vismodegib)(Erivedge™), 90Y-이브리투모맙 티욱세탄, 131I-토시투모맙(tositumomab), 아도-트라스투주맙 엠탄신(ado-trastuzumabemtansine), 라파티닙(Tykerb®), 퍼투주맙(Perjeta™), 아도-트라스투주맙 엠탄신(Kadcyla™), 레고라페닙(Stivarga®), 수니티닙(Sutent®), 데노수맙(Denosumab)(Xgeva®), 소라페닙(sorafenib)(Nexavar®), 파조파닙(Votrient®), 악시티닙(Inita®), 다사티닙(Sprycel®), 닐로티닙(Tasigna®), 보수티닙(Bosulif®), 오파투무맙(Arzerra®), 오비누투주맙(Gazyva™), 이브루티닙 (Imbruvica™), 이델라리십(Zydelig®), 크리조티닙(Xalkori®), 에를로티닙(Tarceva®), 아파티닙 디말레이트(Gilotrif®), 세리티닙(ceritinib)(LDK378/Zykadia), 토시투모맙(Tositumomab) 및 131I-토시투모맙(Bexxar®), 이브리투모맙 티욱세탄(Zevalin®), 브렌툭시맙 베도틴(Adcetris®), 보르테조밉(Velcade®), 실툭시맙(Sylvant™), 트라메티닙(Mekinist®), 다브라페닙(Tafinlar®), 펨브롤리주맙(Keytruda®), 카르필조밉(Kyprolis®), 라무시루맙라무시루맙(Ramucirumab)(Cyramza™), 카보잔티닙(Cabozantinib)(Cometriq™), 반데타닙(Caprelsa®)일 수 있다. 경우에 따라, 치료제는 신생항원이다. 치료제는 사이토카인, 예컨대, 인터페론(INF), 인터류킨(IL) 또는 조혈 성장 인자일 수 있다. 치료제는 INF-α, IL-2, 알데스류킨(Aldesleukin), IL-2, 에리트로포이에틴(Erythropoietin), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF: Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) 또는 과립구 콜로니-자극 인자일 수 있다. 치료제는 표적화된 요법, 예컨대, 토레미펜(Fareston®), 풀베스트란트(Faslodex®), 아나스트로졸(Arimidex®), 엑세메스탄(Aromasin®), 레트로졸(Femara®), 지브-아플리베르셉트(Zaltrap®), 알리트레티노인(Alitretinoin)(Panretin®), 템시롤리무스(Torisel®), 트레티노인(Tretinoin)(Vesanoid®), 데닐류킨 디프티톡스(Ontak®), 보리노스타트(Zolinza®), 로미뎁신(Istodax®), 벡사로텐(Targretin®), 프랄라트렉세이트(Folotyn®), 레날리오미드(Revlimid®), 벨리노스타트(Beleodaq™), 레날리오마이드(Revlimid®), 포말리도미드(Pomalyst®), 카바지탁셀(Cabazitaxel)(Jevtana®), 엔잘루타미드(Xtandi®), 아비라테론 아세테이트(Zytiga®), 라듐 223 클로라이드(Xofigo®), 또는 에베롤리무스(Afinitor®)일 수 있다. 추가로, 치료제는 후성적 표적화된 약물, 예컨대, HDAC 억제제, 키나제 억제제, DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제, 히스톤 데메틸라제 억제제 또는 히스톤 메틸화 억제제일 수 있다. 후성적 약물은 아자시티딘(Azacitidine)(Vidaza), 데시타빈(Decitabine)(Dacogen), 보리노스타트(Vorinostat)(Zolinza), 로미뎁신(Romidepsin)(Istodax) 또는 룩솔리티닙(Ruxolitinib)(Jakafi)일 수 있다. 전립선암 치료를 위해, 항CTLA-4가 조합될 수 있는 바람직한 화학요법제는 파클리탁셀(TAXOL)이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 신생항원 치료제를 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명의 측면 또는 실시양태가 마쿠쉬 군 또는 대안의 다른 그룹화 방식으로 기술된 경우, 본 발명은 전체로서 열거된 전체 군 뿐만 아니라, 개별적으로 상기 군의 각 구성원들 및 주요 군의 모든 가능한 하위군, 및 또한 군 구성원 중 하나 이상의 것을 포함하지 않는 주요 군을 포함한다. 본 발명은 또한 청구된 본 발명에서 군의 구성원 중 임의의 것 중 하나 이상의 것을 명백하게 배제한 것을 구상한다.
[참조에 의한 포함 사항]
본 명세서에서 언급된 모든 공개 문헌, 특허, 및 특허 출원은, 마치 각각의 개별 공개 문헌, 특허 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 명시된 것과 같은 정도로 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에서 참조로 포함된다. 예를 들어, 본원에서 언급된 모든 공개 문헌 및 특허는 그 전문이, 본원에 기술된 방법, 키트, 및 조성물과 함께 관련하여 사용될 수 있는, 공개 문헌에 기술된 키트, 조성물, 및 방법을 기술하고, 개시하기 위한 목적으로 본원에서 참조로 포함된다. 본원에서 논의되는 문헌은 오직 본 출원의 출원일 이전의 그의 개시내용에 대해서만 제공된다. 본원의 어떤 것도 본원에 기술된 본 발명자들이 선행 발명에 의해 또는 임의의 다른 이유로 상기 개시내용을 앞서는 자격을 갖지 않음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
도 1은 합성된, (x축 상에 플롯팅된) 선택된 HLA 클래스 I 분자에 대하여 1 nM 내지 100,000 nM의 친화도 예측치를 갖는 562개의 펩티드의 예시적인 그래프를 도시한 것이다. 실제 친화도(IC50(nM))는 기술된 바와 같이 측정하였다(y 축). 굵은 수직선 및 수평선은 각각 약한 및 매우 약한 예측 결합제 및 관찰된 결합제 사이의 500 nM 컷오프를 나타낸다. 점선으로 표시된 대각선은 최적합선을 나타내고(Graphpad Prism), 여기서, R2는 0.45이다.
도 2는 그의 각 HLA 클래스 I 분자에서의 안정성(T1/2; hrs)에 대하여 테스트된, 도 1로부터의 275개의 펩티드의 예시적인 그래프를 도시한 것이다. 펩티드를 도 1로부터의 친화도 관측치에 따라 비닝하였다. 중앙값 및 사분위수 사이의 범위가 각 빈에 대해 제시되어 있다.
도 3a는 10일 동안 TMPRSS2::ERG 융합 네오에피토프(ALNSEALSV; HLA-A02:01)가 로딩된 단핵구 유래 수지상 세포와 함께 공동 배양된 HLA-A02:01+ T 세포의 예시적인 그래프를 도시한 것이다. 다량체(초기: BV421 및 PE)를 사용하여 TMPRSS2::ERG 융합 네오에피토프에 대한 항원 특이성에 관하여 CD8+ T 세포를 분석하였다.
도 3b는 10일 동안 TMPRSS2::ERG 융합 네오에피토프(ALNSEALSV; HLA-A02:01)가 로딩된 단핵구 유래 수지상 세포와 함께 공동 배양된 HLA-A02:01+ T 세포의 예시적인 그래프를 도시한 것이다. 다량체(확인: APC 및 BUV396)를 사용하여 TMPRSS2::ERG 융합 네오에피토프에 대한 항원 특이성에 관하여 CD8+ T 세포를 분석하였다.
도 4a는 10일 동안 GATA3 프레임시프트 네오에피토프(SMLTGPPARV; HLA-A02:01)가 로딩된 단핵구 유래 수지상 세포와 함께 공동 배양된 HLA-A02:01+ T 세포의 예시적인 그래프를 도시한 것이다. 다량체(초기: APC 및 BUV396)를 사용하여 GATA3 프레임시프트 네오에피토프에 대한 항원 특이성에 관하여 CD8+ T 세포를 분석하였다.
도 4b는 10일 동안 GATA3 프레임시프트 네오에피토프(SMLTGPPARV; HLA-A02:01)가 로딩된 단핵구 유래 수지상 세포와 함께 공동 배양된 HLA-A02:01+ T 세포의 예시적인 그래프를 도시한 것이다. 다량체(확인: PE 및 BV421)를 사용하여 GATA3 프레임시프트 네오에피토프에 대한 항원 특이성에 관하여 CD8+ T 세포를 분석하였다.
도 5a는 10일 동안 β2M 프레임시프트 네오에피토프(LLCVWVSSI; HLA-A02:01)가 로딩된 단핵구 유래 수지상 세포와 함께 공동 배양된 HLA-A02:01+ T 세포의 예시적인 그래프를 도시한 것이다. 다량체(초기: PE 및 APC)를 사용하여 β2M 프레임시프트 네오에피토프에 대한 항원 특이성에 관하여 CD8+ T 세포를 분석하였다.
도 5b는 10일 동안 β2M 프레임시프트 네오에피토프(LLCVWVSSI; HLA-A02:01)가 로딩된 단핵구 유래 수지상 세포와 함께 공동 배양된 HLA-A02:01+ T 세포의 예시적인 그래프를 도시한 것이다. 다량체(확인: PE 및 BV421)를 사용하여 β2M 프레임시프트 네오에피토프에 대한 항원 특이성에 관하여 CD8+ T 세포를 분석하였다.
도 6a는 10일 동안 KRAS G12C 네오에피토프(KLVVVGACGV; HLA-A02:01)가 로딩된 단핵구 유래 수지상 세포와 함께 공동 배양된 HLA-A02:01+ T 세포의 예시적인 그래프를 도시한 것이다. 다량체(초기: BUV396 및 BV421)를 사용하여 KRAS G12C 프레임시프트 네오에피토프에 대한 항원 특이성에 관하여 CD8+ T 세포를 분석하였다.
도 6b는 10일 동안 KRAS G12C 네오에피토프(KLVVVGACGV; HLA-A02:01)가 로딩된 단핵구 유래 수지상 세포와 함께 공동 배양된 HLA-A02:01+ T 세포의 예시적인 그래프를 도시한 것이다. 다량체(확인: APC 및 BUV396)를 사용하여 KRAS G12C 프레임시프트 네오에피토프에 대한 항원 특이성에 관하여 CD8+ T 세포를 분석하였다.
도 7은 20일 동안 β2M 프레임시프트 네오펩티드가 로딩된 단핵구 유래 수지상 세포와 함께 공동 배양된(20일째 신선한 단핵구 유래 수지상 세포로 재자극) T 세포의 예시적인 그래프를 도시한 것이다. 24시간 동안 β2M 프레임시프트 펩티드가 로딩된 단핵구 유래 수지상 세포로 재자극한 후(우측), 펩티드가 없는 대조군(좌측)과 비교하여 세포내 사이토카인 염색에 의해 항원 특이성에 관하여 CD4+ T 세포를 분석하였다.
도 8은 20일 동안 BTK C481S 네오펩티드가 로딩된 단핵구 유래 수지상 세포와 함께 공동 배양된(20일째 신선한 단핵구 유래 수지상 세포로 재자극) T 세포의 예시적인 그래프를 도시한 것이다. 24시간 동안 BTK C481S 펩티드가 로딩된 단핵구 유래 수지상 세포로 재자극한 후(우측), 대조군 야생형 BTK 펩티드(좌측)와 비교하여 세포내 사이토카인 염색에 의해 항원 특이성에 관하여 CD4+ T 세포를 분석하였다.
도 9는 20일 동안 GATA3 프레임시프트 네오펩티드가 로딩된 단핵구 유래 수지상 세포와 함께 공동 배양된(20일째 신선한 단핵구 유래 수지상 세포로 재자극) T 세포의 예시적인 그래프를 도시한 것이다. 24시간 동안 GATA3 프레임시프트 펩티드가 로딩된 단핵구 유래 수지상 세포로 재자극한 후(우측), 펩티드가 없는 대조군(좌측)과 비교하여 세포내 사이토카인 염색에 의해 항원 특이성에 관하여 CD4+ T 세포를 분석하였다.
본원에서는 개체의 종양에 고유한 돌연변이 이벤트로부터 발생한 신생항원의 발견에 기초한 신규한 면역요법제 및 그의 용도를 기술한다. 따라서, 본원에 기술된 본 발명은 예를 들어, 종양 연관 항원에 대한 면역 반응을 자극하거나, 질환 치료에서 사용하기 위한 면역원성 조성물 또는 암 백신을 생성하는 데 사용될 수 있는 펩티드, 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 펩티드 결합 물질을 제공한다.
I. 정의
본원에서 사용된 용어는 단지 특정 경우를 기술하기 위한 목적으로 사용된 것이며, 제한하고자 하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에서 사용되는 바, "하나"("a," "an") 및 "그"라는 단수 형태는 문맥상 달리 명백하게 명시되지 않는 한, 복수 형태도 또한 포함하는 것으로 의도된다. 추가로, "포함하는(including)," "포함하다(includes)," "가지는," "가지다," "~와 함께"라는 용어 또는 그의 파생어가 상세한 설명 및/또는 특허청구범위에서 사용되는 한, 상기 용어는 "포함하는(comprising)"이라는 용어와 유사한 방식으로 포괄적인 것으로 의도된다.
"약" 또는 "대략"이라는 용어는 당업계의 숙련가에 의해 결정되는 바와 같이, 특정 값에 대하여 허용되는 오차 범위 안에 있다는 것을 의미할 수 있으며, 상기 오차 범위는 부분적으로는 상기 값이 측정 또는 결정되는 방법, 즉, 측정 시스템의 한계에 의존할 것이다. 예를 들어, "약"이란, 당업계의 관행에 따라 1 또는 1 초과의 표준 편차 범위 내에 있음을 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"이란, 주어진 값의 최대 20%, 최대 10%, 최대 5%, 또는 최대 1% 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특별히 생물학적 시스템 또는 프로세스와 관련된 경우, 상기 용어는 값의 10배(an order of magnitude) 범위 내에, 5배 범위 내에, 및 더욱 바람직하게, 2배 범위 내에 있음을 의미할 수 있다. 본 출원 및 특허청구범위에서 특정 값이 기술되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 특정 값에 대하여 허용되는 오차 범위 안에 있다는 것을 의미하는 "약"이라는 용어는 추정되어야 한다.
본 발명의 이해를 돕기 위해, 다수의 용어 및 어구가 하기에서 정의된다.
"신생항원"이란, 단백질에서의 종양 특이적 변이로부터 발생하는 종양 항원 부류를 의미한다. 신생항원으로는 예를 들어, 단백질 서열에서의 치환, 프레임시프트 돌연변이, 융합 폴리펩티드, 인 프레임(in-frame) 결실, 삽입, 내인성 레트로바이러스 폴리펩티드의 발현, 및 폴리펩티드의 종양 특이적 과다발현으로부터 발생하는 종양 항원을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
"종양 특이적 네오에피토프"란, 참조, 예컨대, 정상적인 비암성 또는 생식세포주 세포에는 존재하지 않지만, 암 세포에서는 발견되는 에피토프를 지칭한다. 그러나, 이는 특히, 네오에피토프를 생성하기 위해 에피토프의 서열이 변이된 암 세포 중의 하나 이상의 돌연변이에 기인하여 정상적인 비암성 또는 생식세포주 세포에서 상응하는 에피토프가 발견되는 상황을 포함한다.
"참조"는 본 발명의 방법에서 종양 표본으로부터 얻은 결과 사이의 상관 관계를 입증하고, 비교하기 위해 사용될 수 있다. 전형적으로, "참조"는 환자로부터 또는 하나 이상의 상이한 개체로부터, 예를 들어, 건강한 개체, 특히, 동일한 종의 개체로부터 수득된, 하나 이상의 정상적인 표본, 특히, 암 질환에 걸리지 않은 표본에 기초하여 수득될 수 있다. "참조"는 충분히 많은 개수의 정상적인 표본을 테스트함으로써 실험적으로 측정될 수 있다.
"돌연변이"라는 용어는 참조와 비교하여 핵산 서열의 변이 또는 차이(뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결실)를 지칭한다. "체세포 돌연변이"는 생식 세포(정자 및 난자)를 제외한 체내 세포 중 임의의 것에서 발생할 수 있고, 그러므로, 자손에게로 전달되지 않는다. 이들 변경은 (항상 그러한 것은 아니지만) 암 또는 다른 질환을 유발할 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 비동의 돌연변이이다. "비동의 돌연변이"라는 용어는 예컨대, 번역 생성물에서의 아미노산 치환과 같은 아미노산 변이를 초래하는 돌연변이, 예를 들어, 뉴클레오티드 치환을 지칭한다. "프레임시프트"는 돌연변이가 ("리딩 프레임"으로도 공지된) 유전자의 코돈 주기성의 정상적인 단계를 파괴하여 비천연 단백질 서열의 번역을 초래할 때에 발생한다. 유전자 중의 상이한 돌연변이가 동일한 변경된 리딩 프레임을 달성할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "친화도"란, 결합쌍, 예를 들어, HLA 결합 펩티드 및 클래스 I 또는 II HLA의 두 구성원 사이의 결합 강도의 척도를 지칭한다. KD는 해리 상수이고, 몰 농도 단위를 가진다. 친화도 상수는 해리 상수의 역수이다. 친화도 상수는 종종 상기 화학적 엔티티를 기술하는 일반 용어로서 사용된다. 이는 결합 에너지의 직접적인 척도이다. 친화도는 예를 들어, 표면 플라스몬 공명(SPR: surface plasmon resonance)에 의해 상업적으로 이용가능한 비아코어(Biacore) SPR 장치를 사용하여 실험적으로 측정될 수 있다. 친화도는 또한 펩티드 중 50%가 치환된 농도인, 억제 농도(IC50)로서 표시될 수 있다. 유사하게, ln(IC50)이란, IC50의 자연 로그를 지칭한다. K오프란, 예를 들어, HLA 결합 펩?K드와 클래스 I 또는 II HLA의 해리에 대한 오프 속도 상수를 지칭한다.
본 개시내용 전역에 걸쳐, "결합 데이터" 결과는 "IC50"으로 표시될 수 있다. IC50은 결합 검정법에서 표지화된 참조 펩티드의 결합의 50% 억제가 관찰되는 테스트 펩티드의 농도이다. 검정법이 실행되는 조건(즉, 제한 HLA 단백질 및 표지화된 참조 펩티드 농도)을 고려해 보면, 상기 값은 KD 값에 가깝다. 결합 측정 검정법은 당업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, PCT 공개 WO 94/20127 및 WO 94/03205, 및 다른 공개 문헌, 예컨대, 문헌 [Sidney et al., Current Protocols in Immunology 18.3.1 (1998)]; [Sidney, et al., J. Immunol. 154:247 (1995)]; 및 [Sette, et al., Mol. Immunol. 31:813 (1994)]에 상세하게 기술되어 있다. 대안적으로, 결합은 참조 표준 펩티드에 의한 결합에 대한 상대적인 값으로 표시될 수 있고, 예를 들어, 참조 표준 펩티드의 IC50 대비 그의 IC50에 기초할 수 있다.
결합은 또한 살아있는 세포(예컨대, 문헌 [Ceppellini et al., Nature 339:392 (1989)]; [Christnick et al., Nature 352:67 (1991)]; [Busch et al., Int. Immunol. 2:443 (1990)]; [Hill et al., J. Immunol. 147:189 (1991)]; [del Guercio et al., J. Immunol. 154:685 (1995)]), 계면활성제 용해물을 이용하는 무세포 시스템(예컨대, 문헌 [Cerundolo et al., J. Immunol. 21:2069 (1991)]), 고정화된 정제된 MHC(예컨대, 문헌 [Hill et al., J. Immunol. 152, 2890 (1994)]; [Marshall et al., J. Immunol. 152:4946 (1994)]), ELISA 시스템(예컨대, 문헌 [Reay et al., EMBO J. 11:2829 (1992)]), 표면 플라스몬 공명(예컨대, 문헌 [Khilko et al., J. Biol. Chem. 268:15425 (1993)]); 고유속 가용성 상 검정법(문헌 [Hammer et al., J. Exp. Med. 180:2353 (1994)]), 및 클래스 I MHC 안정화 또는 어셈블리 측정(예컨대, 문헌 [Ljunggren et al., Nature 346:476 (1990)]; [Schumacher et al., Cell 62:563 (1990)]; [Townsend et al., Cell 62:285 (1990)]; [Parker et al., J. Immunol. 149:1896 (1992)])을 사용하는 것을 포함하는 다른 검정 시스템을 사용하여 측정될 수 있다.
"교차 반응성 결합"이란, 한 펩티드가 1개 초과의 HLA 분자에 의해 결합된다는 것을 나타내며; 동의어로는 축퇴 결합이 있다.
에피토프를 논의하기 위해 사용될 때 "유래된"이라는 용어는 "제조된"에 대한 동의어이다. 유래된 에피토프는 천연 공급원으로부터 단리된 것일 수 있거나, 또는 당업계의 표준 프로토콜에 따라 합성된 것일 수 있다. 합성 에피토프는 인공 아미노산 잔기, "아미노산 모방체," 예컨대, 자연적으로 발생된 L 아미노산 잔기의 D 이성질체, 또는 비천연 아미노산 잔기, 예컨대, 사이클로헥실알라닌을 포함할 수 있다. 유래된 또는 제조된 에피토프는 천연 에피토프의 유사체일 수 있다.
"희석제"로는 멸균 액체, 예컨대, 물, 및 페트롤륨, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일을 비롯한 오일, 예컨대, 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 등을 포함한다. 물은 또한 약학 조성물을 위한 희석제이다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액 또한 예를 들어, 주사액에서 희석제로서 사용될 수 있다.
"에피토프"는, 예를 들어, 면역글로불린, T 세포 수용체, HLA 분자, 또는 키메라 항원 수용체에 의해 인식되는 부위를 함께 형성하는 분자의 집합적 특징부, 예컨대, 1차, 2차, 및 3차 펩티드 구조, 및 전하이다. 대안적으로, 에피토프는 특정 면역글로불린에 의한 인식에 관여하는 아미노산 잔기 세트로서, 또는 T 세포와 관련하여, T 세포 수용체 단백질, 키메라 항원 수용체, 및/또는 주조직 적합성 복합체(MHC) 수용체에 의한 인식에 필요한 잔기로서 정의될 수 있다. 에피토프는 천연 공급원으로부터의 단리에 의해 제조될 수 있거나, 또는 당업계의 표준 프로토콜에 따라 합성될 수 있다. 합성 에피토프는 인공 아미노산 잔기, "아미노산 모방체," 예컨대, 자연적으로 발생된 L 아미노산 잔기의 D 이성질체, 또는 비자연적으로 발생된 아미노산 잔기, 예컨대, 사이클로헥실알라닌을 포함할 수 있다. 본 개시내용 전역에 걸쳐, 에피토프는 일부 경우에서는 펩티드 또는 펩티드 에피토프로서 지칭될 수 있다.
본원에 기술된 에피토프 또는 유사체 뿐만 아니라, 추가의 아미노산(들)을 포함하는 단백질 또는 펩티드도 여전히 본 발명의 범위 안에 포함된다는 것을 이해하여야 한다. 특정 실시양태에서, 펩티드는 항원의 단편을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 펩티드의 길이에는 제한이 있다. 길이 제한이 있는 실시양태는, 본원에 기술된 에피토프를 포함하는 단백질 또는 펩티드가 천연 서열과 100%의 동일성을 갖는 영역(즉, 인접한 일련의 아미노산 잔기)을 포함할 때에 이루어진다. 예컨대, 전체 천연 분자 상에서의 판독으로부터 에피토프가 정의되는 것을 막기 위해, 천연 펩티드 서열과 100%의 동일성을 갖는 임의 영역의 길이에는 제한이 있다. 따라서, 본원에 기술된 에피토프, 및 천연 펩티드 서열과 100%의 동일성을 갖는 영역을 포함하는 펩티드의 경우, 천연 서열과 100%의 동일성을 갖는 영역은 일반적으로 그 길이는 600개 이하의 아미노산 잔기, 500개 이하의 아미노산 잔기, 400개 이하의 아미노산 잔기, 250개 이하의 아미노산 잔기, 100개 이하의 아미노산 잔기, 85개 이하의 아미노산 잔기, 75개 이하의 아미노산 잔기, 65개 이하의 아미노산 잔기, 및 50개 이하의 아미노산 잔기 길이이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 "에피토프"는 5개의 아미노산 잔기에 이르기까지 임의의 증분량으로 천연 펩티드 서열과 100%의 동일성을 갖는 51개 미만의 아미노산 잔기; 예를 들어, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 잔기를 포함하는 영역을 갖는 펩티드로 구성된다.
"인간 백혈구 항원" 또는 "HLA"는 인간 클래스 I 또는 클래스 II 주조직 적합성 복합체(MHC) 단백질이다(예컨대, 문헌 [Stites, et al., IMMUNOLOGY, 8TH ED., Lange Publishing, Los Altos, Calif. (1994)]).
본원에서 사용되는 바, "HLA 슈퍼타입 또는 HLA 패밀리"란, 공유 펩티드 결합 특이성에 기초하여 한 군으로 분류된 HLA 분자 세트를 기술한다. 특정 아미노산 모티프를 보유하는 펩티드에 대하여 약간 유사한 결합 친화도를 공유하는 HLA 클래스 I 분자는 상기 HLA 슈퍼타입 군으로 분류된다. HLA 슈퍼패밀리, HLA 슈퍼타입 패밀리, HLA 패밀리, 및 HLA xx 유사 분자(여기서, "xx"는 특정 HLA 타입을 의미한다)라는 용어는 동의어이다.
2개 이상의 펩티드 서열 또는 항원 단편과 관련하여, "동일한" 또는 "동일성"(%)이라는 용어는 서열 비교 알고리즘을 사용하거나, 또는 수동 정렬 및 시각적 검사에 의해 측정된 바, 비교창에 걸쳐 비교하고, 최대로 일치하도록 정렬하였을 때, 2개 이상의 서열 또는 하위서열이 동일하거나, 또는 동일한 아미노산 잔기로 명시된 백분율(%)로 가지고 있다는 것을 지칭한다.
"면역원성" 펩티드 또는 "면역원성" 에피토프 또는 "펩티드 에피토프"란, 펩티드가 HLA 분자에 결합하여 세포 매개 반응 또는 체액성 반응, 예를 들어, 세포독성 T 림프구(CTL: cytotoxic T lymphocyte), 헬퍼 T 림프구(HTL: helper T lymphocyte) 및/또는 B 림프구 반응을 유도하도록 대립유전자 특이적 모티프를 포함하는 펩티드이다. 따라서, 본원에 기술된 면역원성 펩티드는 적절한 HLA 분자에 결합할 수 있고, 후, 상기 펩티드에 대하여 CTL(세포독성) 반응, 또는 HTL(및 체액성) 반응을 유도할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 면역글로불린 항원 결합 도메인(예컨대, 면역글로불린 가변 도메인) 및 T 세포 수용체(TCR) 불변 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, TCR 폴리펩티드의 "불변 도메인"은 막에 인접한 TCR 불변 도메인을 포함하고, 이는 또한 TCR 막횡단 도메인 및/또는 TCR 세포질 테일도 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, CAR은 TCR.베타. 불변 도메인에 연결된 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 TCRα 불변 도메인에 연결된 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(예컨대, κ 또는 λ 가변 도메인)을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 이량체이다. 일부 실시양태에서, CAR은 TCRα 불변 도메인에 연결된 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 TCRβ 불변 도메인에 연결된 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 (예컨대, κ 또는 λ 가변 도메인)을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 이량체이다.
"단리된" 또는 "생물학적으로 순수한"이라는 어구는 물질이 그가 그의 천연 상태에서 발견될 때와 같이 보통은 상기 물질을 동반하는 성분을 실질적으로 또는 본질적으로 함유하지 않는다는 것을 지칭한다. 따라서, 본원에 기술된 단리된 펩티드는 보통은 그의 계내 환경에서 펩티드와 회합되어 있는 물질 중 일부 또는 그들 모두를 함유하지 않는다. "단리된" 에피토프란, 에피토프의 유래 기점이 된 항원의 전체 서열을 포함하지 않는 에피토프를 지칭한다. 전형적으로, "단리된" 에피토프는 전장의 천연 서열에 걸쳐 100%의 동일성을 갖는 서열을 생성하는 추가의 아미노산 잔기가 그에 부착되어 있지 않는 것이다. 천연 서열은 예컨대, 에피토프의 유래 기점이 되는 종양 연관 항원과 같은 서열일 수 있다. 따라서, "단리된"이라는 용어는 물질이 그의 원래의 환경(예컨대, 그가 자연적으로 발생된 것이라면, 자연 환경)으로부터 제거되어 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 존재하는 자연적으로 발생된 폴리뉴클레오티드 또는 펩티드는 단리된 것이 아니지만, 자연계에서 공존하는 물질 중 일부 또는 그들 모두로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 펩티드는 단리된 것이다. 상기 폴리뉴클레오티드는 벡터의 일부일 수 있고/거나, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 펩티드는 조성물의 일부일 수 있고, 상기 벡터 또는 조성물은 그의 천연 환경의 일부가 아니라는 점에서 상기 폴리뉴클레오티드 또는 펩티드는 여전히 "단리된" 것일 수 있다. 단리된 RNA 분자는 본원에 기술된 DNA 분자의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체를 포함하고, 이는 합성적으로 제조된 상기 분자를 추가로 포함한다.
"주조직 적합성 복합체" 또는 "MHC"는 생리적 면역 반응을 담당하는 세포 상호작용 제어에서 중요한 역할을 하는 유전자 클러스터이다. 인간에서, MHC 복합체는 또한 인간 백혈구 항원(HLA) 복합체로도 알려져 있다. MHC 및 HLA 복합체에 관한 상세한 설명을 위해서는 문헌 [Paul, FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, 3.sup.RD ED., Raven Press, New York (1993)]을 참조한다.
"천연(native)" 또는 "야생형(wild type)" 서열이란, 자연에서 발견되는 서열을 지칭한다. 상기 서열은 자연에서는 더욱 긴 서열을 포함할 수 있다.
"T 세포 에피토프"란, 펩티드 제시 MHC 분자 또는 MHC 복합체 형태로 클래스 I 또는 II의 MHC 분자에 의해 결합된 후, 이어서, 상기 형태로 각각 세포독성 T 림프구 또는 T 헬퍼 세포에 의해 인식되고, 결합될 수 있는 펩티드 서열을 의미하는 것으로 이해하여야 한다.
"수용체"란, 리간드에 결합할 수 있는 생물학적 분자 또는 분자 그룹핑을 의미하는 것으로 이해하여야 한다. 수용체는 세포, 세포 형태 또는 유기체에서 정보를 전달하는 역할을 할 수 있다. 수용체는 예를 들어, 각 수용체 유니트가 단백질 분자로 구성될 수 있는 것인, 적어도 하나의 수용체 유니트를 포함한다. 수용체는 리간드의 것과 상보적인 구조를 가지고, 이는 결합 파트너로서 리간드와 복합체를 형성할 수 있다. 정보는 특히 세포 표면 상의 리간드의 복합체 형성 이후 수용체의 입체형태적 변화에 의해 전달된다. 일부 실시양태에서, 수용체는 특히, 리간드, 특히, 적합한 길이의 펩티드 또는 펩티드 단편과 수용체/리간드 복합체를 형성할 수 있는 MHC 클래스 I 및 II의 단백질을 의미하는 것으로 이해하여야 한다.
"리간드"는 수용체의 것과 상보적인 구조를 가지고, 상기 수용체와 복합체를 형성할 수 있는 분자를 의미하는 것으로 이해하여야 한다. 일부 실시양태에서, 리간드는 적합한 길이를 가지고, 그의 아미노산 서열내 적합한 결합 모티프를 가지며, 이로써, 펩티드 또는 펩티드 단편은 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II의 단백질과 복합체를 형성할 수 있는 것인 펩티드 또는 펩티드 단편을 의미하는 것으로 이해하여야 한다.
일부 실시양태에서, "수용체/리간드 복합체" 또한 펩티드 또는 펩티드 단편을 제시하는, 클래스 I 또는 MHC 클래스 II의 MHC 분자를 포함하는 "수용체/펩티드 복합체" 또는 "수용체/펩티드 단편 복합체"를 의미하는 것으로 이해하여야 한다.
"주조직 적합성 복합체(MHC)의 단백질 또는 분자," "MHC 분자," "MHC 단백질" 또는 "HLA 단백질"은 단백질 항원의 단백질분해 절단으로부터 생성된 펩티드에 결합할 수 있고, 그를 세포 표면으로 수송하고, 거기서 특이적 세포에, 특히, 세포독성 T-림프구, T 헬퍼 세포, 또는 B 세포에 제시하는 잠재적 림프구 에피토프(예컨대, T 세포 에피토프 및 B 세포 에피토프)를 나타내는 단백질을 의미하는 것으로 이해하여야 한다. 게놈 중의 주조직 적합성 복합체는, 그의 세포 표면 상에서 발현된 유전자 생성물이 내인성 및/또는 외래 항원에의 결합 및 제시에 중요하고, 따라서, 면역학적 프로세스를 조절하는 데 중요한 것인 유전자 영역을 포함한다. 주조직 적합성 복합체는 상이한 단백질을 코딩하는 2개의 유전자 군, 즉, MHC 클래스 I의 분자 및 MHC 클래스 II의 분자로 분류된다. 두 MHC 클래스의 세포 생물학적 성질 및 발현 패턴은 상기 상이한 역할에 맞게 적합화되어 있다.
"펩티드" 및 "펩티드 에피토프"란, 본 명세서에서 "올리고펩티드"와 상호교화적으로 사용되며, 이는 인접한 아미노산 잔기의 α-아미노와 카르복실 기 사이에, 전형적으로 펩티드 결합에 의해 서로 연결되어 있는 일련의 잔기를 의미한다.
"합성 펩티드"란 비천연 공급원으로부터 수득되는, 예컨대, 인공인 펩티드를 지칭한다. 상기 펩티드는 화학적 합성 또는 재조합 DNA 기술과 같은 방법을 사용하여 제조될 수 있다. "합성 펩티드"는 "융합 단백질"을 포함한다.
"PanDR 결합" 펩티드, "PanDR 결합 에피토프"는 1개 초과의 HLA 클래스 II DR 분자에 결합하는 분자로 이루어진 패밀리의 구성원이다.
"약학적으로 허용되는"이란, 일반적으로 비독성이고/거나, 불활성이고/거나, 생리적으로 화합성인 조성물 또는 조성물의 성분을 지칭한다.
"약학 부형제" 또는 "부형제"는 물질, 예컨대, 애쥬번트, 담체, pH 조절제 및 완충화제, 장성 조절제, 습윤화제, 보존제 등을 포함한다. "약학 부형제"는 약학적으로 허용되는 부형제이다.
"모티프"라는 용어는 특정 HLA 분자에 의해 인식되는, 예를 들어, 길이가 약 15개 미만의 아미노산 잔기 길이, 또는 길이가 약 13개 미만의 아미노산 잔기 길이, 예를 들어, 클래스 I HLA 모티프인 경우, 약 8 내지 약 13개의 아미노산 잔기(예컨대, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13개) 길이, 및 클래스 II HLA 모티프의 경우, 약 6 내지 약 25개의 아미노산 잔기(예컨대, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개) 길이인 펩티드와 같이, 정의된 길이의 아미노산 서열의 잔기 패턴을 지칭한다. 모티프는 전형적으로 주어진 인간 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 각 HLA 단백질마다 상이하다. 이들 모티프는 그의 1차 및 2차 앵커 잔기의 패턴이 상이하다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 I 모티프는 길이가 9, 10, 또는 11개의 아미노산 잔기 길이인 펩티드를 확인하다.
"슈퍼모티프"란, 2개 이상의 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 HLA 분자에 의해 공유되는 펩티드 결합 특이성이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 슈퍼모티프 보유 펩티드는 (본원에 정의된 바와 같이) 2개 이상의 HLA 항원에 의해 높은 또는 중간 정도의 친화도로 인식된다.
본원에서 사용되는 바, "자연적으로 발생된"이라는 용어는 객체가 자연상에서 발견될 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 유기체(바이러스 포함)에 존재하고, 자연상에서 공급원으로부터 단리될 수 있고, 실험실에서 인공으로 의도적으로 변형되지 않는 펩티드 또는 핵산은 자연적으로 발생된 것이다.
본 발명에 따라, "백신"이라는 용어는 투여시, 병원체, 또는 이환된 세포, 예컨대, 암 세포를 인식하고, 공격하는 면역 반응, 예를 들어, 세포성 또는 체액성 면역 반응을 유도하는 약학 제제(약학 조성물) 또는 생성물에 관한 것이다. 백신은 질환 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다. "개별화된 암 백신" 또는 "개인맞춤형 암 백신"이라는 용어는 특정 암 환자에 관련된 것이고, 이는 암 백신이 개별 암 환자의 필요 또는 특수한 환경에 맞게 적합화되어 있다는 것을 의미한다.
"방어 면역 반응" 또는 "치료적 면역 반응"이란, 어떤 방법으로든 질환 증상, 부작용 또는 진행을 예방하거나, 또는 적어도 부분적으로는 그를 정지시키는, 병원성 항원(예컨대, 종양 항원)으로부터 유래된 항원에 대한 CTL 및/또는 HTL 반응을 지칭한다. 면역 반응은 또한 헬퍼 T 세포의 자극에 의해 촉진된 항체 반응도 포함할 수 있다.
"항원 프로세싱" 또는 "프로세싱"이란, 폴리펩티드 또는 항원의, 상기 폴리펩티드 또는 항원의 단편인 프로세싱 생성물로의 분해(예컨대, 폴리펩티드의 펩티드로의 분해), 및 특이적 T 세포에의 세포, 예를 들어, 항원 제시 세포에 의한 제시를 위한, 상기 단편의 MHC 분자와의 (예컨대, 결합을 통한) 회합을 지칭한다.
"항원 제시 세포"(APC: Antigen presenting cell)는 그의 세포 표면 상의 MHC와 회합된 단백질 항원의 펩티드 단편을 제시하는 세포이다. 일부 APC는 항원 특이적 T 세포를 활성화시킬 수 있다. 전문 항원 제시 세포는 포식 작용에 의해 또는 수용체 매개 세포내 이입에 의해 항원을 내재화시키는 데, 및 이어서, 클래스 II MHC 분자에 결합된 항원 단편을 그의 막 상에 제시하는 데 있어서 매우 효율적이다. T 세포는 항원 제시 세포의 막 상의 항원-클래스 II MHC 분자 복합체를 인식하고, 그와 상호작용한다. 이어서, 항원 제시 세포에 의해 추가의 공동자극성 신호가 생산되고, 이는 T 세포를 활성화시킨다. 공동자극성 분자의 발현이 전문 항원 제시 세포의 정의된 특징이다.
전문 항원 제시 세포의 주요 유형은, 가장 광범위한 항원 제시를 보이는 수지상 세포이고, 가장 중요한 항원 제시 세포는 아마도 대식세포, B 세포 및 특정 활성화된 상피 세포가 된다.
수지상 세포(DC: dendritic cell)는 MHC 클래스 II 및 I 항원 제시 경로, 둘 모두를 통해 말초 조직에서 포획된 항원을 T 세포에 제시하는 백혈구 집단이다. 수지상 세포는 면역 반응의 강력한 유도자이고, 상기 세포의 활성화가 항종양 면역 유도에 중요한 단계라는 것이 널리 공지되어 있다.
수지상 세포는 편의상 "미성숙한" 및 "성숙한" 세포로 분류되는데, 이는 특징 규명이 잘 이루어진 두 표현형을 구별하는 간단한 방법으로 사용될 수 있다. 그러나, 상기 명명법은 분화의 모든 가능한 중간 단계를 배제하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
미성숙한 수지상 세포는 Fey 수용체 및 만노스 수용체의 높은 발현과 상관관계가 있는 항원 흡수 및 프로세싱에 대한 수행 능력이 높은 항원 제시 세포로서 특징화된다. 성숙한 표현형은 전형적으로 상기 마커의 발현은 더 낮지만, T 세포 활성화를 담당하는 세포 표면 분자, 예컨대, 클래스 I 및 클래스 II MHC, 부착 분자(예컨대, CD54 및 CD11) 및 공동자극성 분자(예컨대, CD40, CD80, CD86 및 4-1 BB)의 높은 발현을 특징으로 한다.
"잔기"라는 용어는 아미드 결합 또는 아미드 결합 모방체에 의해 펩티드 또는 단백질 내로 도입되는 아미노산 잔기 또는 아미노산 모방체 잔기, 또는 아미노산 또는 아미노산 모방체를 코딩하는 핵산(DNA 또는 RNA)을 지칭한다.
펩티드 또는 단백질을 기술하는 명명법은 아미노 기는 각 아미노산 잔기의 왼쪽(아미노 또는 N 말단)에, 및 카르복실 기는 오른쪽(카르복시 또는 C 말단)에 제시되는 관행을 따른다. 아미노산 잔기가 펩티드 에피토프를 지칭할 때, 아미노에서 카르복실 방햐으로 넘버링되고, 여기서, 에피토프, 또는 그의 일부일 수 있는 펩티드 또는 단백질의 아미노 말단 단부에 위치하는 잔기가 1번 위치이다.
본 발명의 선택된 구체적인 실시양태를 나타내는 식에서, 비록 구체적으로 제시되지는 않았지만, 아미노 및 카르복실 말단 기는 달리 언급되지 않는 한, 생리적 pH 값에서 그가 취할 수 있는 형태로 존재한다. 아미노산 구조식에서, 각 잔기는 일반적으로 표준 3문자 또는 단일 문자 명칭에 의해 표시된다. L 형태의 아미노산 잔기는 대문자의 단일 문자, 또는 3문자 기호에서 첫 번째 문자가 대문자인 것으로 표시되고, D 형태를 갖는 상기 아미노산 잔기에 대한 D 형태는 소문자의 단일 문자, 또는 소문자의 3문자 기호로 표시된다. 그러나, 3문자 기호 또는 전체 명칭이 대문자 표시없이 사용될 때, 이는 L 아미노산 잔기를 지칭할 수 있다. 글리신은 비대칭 탄소 원자가 없고, 간단하게 "Gly" 또는 "G"로 지칭된다. 본원에 기술된 펩티드의 아미노산 서열은 일반적으로 표준 단일 문자 기호를 사용하여 지칭된다(A, 알라닌; C, 시스테인; D, 아스파르트산; E, 글루탐산; F, 페닐알라닌; G, 글리신; H, 히스티딘; I, 이소류신; K, 리신; L, 류신; M, 메티오닌; N, 아스파라긴; P, 프롤린; Q, 글루타민; R, 아르기닌; S, 세린; T, 트레오닌; V, 발린; W, 트립토판; 및 Y, 티로신).
"폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 이는 임의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA, 예를 들어, mRNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 그의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 중합체 내로 도입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 및 핵산은 시험관내에서 전사된 mRNA일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 투여되는 폴리뉴클레오티드는 mRNA이다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드와 관련하여 "동일한" 또는 "동일성"(%)이라는 용어는 서열 동일성의 부분으로서 임의의 보존적 아미노산 치환을 고려하지 않고, 최대로 일치하도록 비교 및 정렬되었을 때(필요할 경우, 갭 도입), 2개 이상의 서열, 또는 하위서열이 동일하거나, 또는 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 명시된 백분율로 가진다는 것을 지칭한다. 동일성(%)은 서열 비교 소프트웨어 또는 알고리즘을 사용하여, 또는 시각적 검사에 의해 측정될 수 있다. 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 정렬을 수득하는 데 사용될 수 있는 다양한 알고리즘 및 소프트웨어가 당업계에 널리 공지되어 있다. 이는 BLAST, ALIGN, 멕얼라인(Megalign), 베스트핏(BestFit), GCG 위스콘신 패키지(GCG Wisconsin Package), 및 그의 변형법을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 두 핵산 또는 폴리펩티드는 실질적으로 동일한데, 이는 상기 두 핵산 또는 폴리펩티드가 서열 비교 알고리즘을 사용하여 또는 시각적 검사에 의해 측정되었을 때, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 및 일부 실시양태에서 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 동일성을 가진다는 것을 의미하는 것이다. 일부 실시양태에서, 동일성은 길이가 적어도 약 10, 적어도 약 20, 적어도 약 40-60개의 잔기, 적어도 약 60-80개의 잔기 길이, 또는 둘 사이의 임의의 정수값인 서열 영역에 걸쳐 존재한다. 일부 실시양태에서, 동일성은 60-80개의 잔기보다 더 긴 영역, 예컨대, 적어도 약 80-100개의 잔기로 이루어진 영역에 걸쳐 존재하고, 일부 실시양태에서, 서열은 비교되는 서열 전장에 걸쳐, 예컨대, 뉴클레오티드 서열의 코딩 영역에 걸쳐 실질적으로 동일하다.
"보존적 아미노산 치환"은 한 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 염기성 측쇄(예컨대, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄(예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타 분지형 측쇄(예컨대, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 비롯한, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 정의되어 있다. 예를 들어, 티로신을 대신하여 페닐알라닌으로 치환하는 것은 보존적 치환이다. 뉴클레오티드 확인 방법 및 펩티드 기능을 제거하지 않는 아미노산 보존적 치환 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 바, "벡터"라는 용어는 숙주 세포에서 관심의 대상이 되는 하나 이상의 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달할 수 있고, 보통은 발현할 수 있는 구성물을 의미한다. 벡터의 예로는 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드, 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 회합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 리포솜 내에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
"단리된" 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 또는 조성물은 자연상에서는 발견되지 않는 형태의 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 또는 조성물이다. 단리된 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 또는 조성물은 더이상은 자연상에서 발견되는 형태가 아닌 형태가 되는 정도로까지 정제된 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 또는 조성물은 실질적으로 순수한 것이다. 일부 실시양태에서, "단리된 폴리뉴클레오티드"는 PCR 또는 정량적 PCR 반응에서 증폭된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 PCR 또는 정량적 PCR 반응물을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "실질적으로 순수한"이라는 용어는 물질이 적어도 50% 순수(즉, 오염 물질이 없다는 것), 적어도 90% 순수, 적어도 95% 순수, 적어도 98% 순수, 또는 적어도 99% 순수하다는 것을 지칭한다.
"피험체"라는 용어는 특정 치료의 수혜자가 되는, 인간, 비인간 영장류, 개, 고양이, 설치류 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 임의의 동물(예컨대, 포유동물)을 지칭한다. 전형적으로, "피험체" 및 "환자"라는 용어는 본원에서 인간 피험체와 관련하여 상호교환적으로 사용된다.
"유효량" 또는 "치료적 유효량" 또는 "치료적 효과"라는 용어는 피험체 또는 포유동물에서 질환 또는 장애를 "치료"하는 데 효과적인 치료제의 양을 지칭한다. 치료적 유효량의 약물은 치료적 효과를 가지며, 이에, 질환 또는 장애의 발생을 예방할 수 있거나; 질환 또는 장애의 발생을 저속화시킬 수 있거나; 질환 또는 장애의 진행을 저속화시킬 수 있거나; 질환 또는 장애와 연관된 증상들 중 하나 이상 어느 정도 완화시킬 수 있거나; 이환률 및 사망률을 감소시킬 수 있거나; 삶의 질을 개선시킬 수 있거나; 또는 상기 효과의 조합을 이행할 수 있다.
"치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료하기 위해" 또는 "경감시키는" 또는 "경감시키기 위해"라는 용어는 1) 진단받은 병적 상태 또는 장애를 치유하고/거나, 저속화하고/거나, 그의 증상을 감소시키고/거나, 그의 진행을 정지시키는 치료적 조치, 및 2) 표적화된 병적 상태 또는 장애의 발생을 예방하거나, 또는 저속화시키는 예방 또는 방치 조치, 둘 모두를 지칭한다. 따라서, 치료를 필요로 하는 대상으로는 장애에 이미 걸린 대상; 장애에 걸리기 쉬운 대상; 및 장애를 예방하고자 하는 대상을 포함한다.
본 개시내용 및 특허청구범위에서 사용되는 바, "하나"("a," "an") 및 "그"라는 단수 형태는 문맥상 명백하게 달리 명시되지 않는 한, 복수 형태를 포함한다.
예컨대, "포함하다(comprises)," "포함된(comprised)," "포함하는(comprising)"이라는 용어 등은 미국 특허법에서 그에 귀속된다는 의미를 가질 수 있고; 예컨대, 이는 "포함하다(includes)," "포함된(included)," "포함하는(including)"이라는 용어 등을 의미할 수 있고; 예컨대, "~으로 본질적으로 구성된(consisting essentially of)" 및 ""~으로 본질적으로 구성되다(consists essentially of)"라는 용어는 미국 특허법에서 그에 속한다는 의미를 가지고, 예컨대, 이는 명백하게 언급되지 않은 요소는 허용하지만, 선행 기술에서 발견되거나, 또는 본 발명의 기본적 또는 신규한 특징에 영향을 미치는 요소는 배제한다는 것을 이해하여야 한다. 본원에서는 그 어느 것도 약속된 것으로 의도되지 않는다.
본원에서 예컨대, "A 및/또는 B"라는 어구에서 사용되는 "및/또는"이라는 용어는 A 및 B; A 또는 B; A(단독); 및 B(단독), 둘 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 유사하게, 본원에서 예컨대, "A, B, 및/또는 C"라는 어구에서 사용되는 "및/또는"이라는 용어는 하기 실시양태: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독), 각각을 포함하는 것으로 의도된다.
II. 신생항원
치유력이 있고, 종양 특이적인 면역요법을 개발함에 있어 중요한 장벽 중 하나는 자가면역을 회피하기 위해 고도로 특이적이고, 제한적인 종양 항원을 확인하고, 선별하는 것이다. 악성 세포 내의 유전적 변이(예컨대, 역전, 전좌, 결실, 미스센스 돌연변이, 스플라이스 부위 돌연변이 등)의 결과로서 발생된 종양 신생항원은 가장 종양 특이적인 부류의 항원을 나타낸다. 신생항원은 그를 확인하고, 최적화된 항원을 선별하고, 백신 또는 면역원성 조성물에서 사용하기 위한 신생항원을 제조함에 있어 기술적 어려움에 기인하여 암 백신 또는 면역원성 조성물에서 거의 사용되지 않고 있다. 이러한 문제들은 높은 비율의 암을 앓을 피험체로부터의 매칭되는 생식세포주 샘플이 아닌 종양에서 DNA 수준으로 존재하는 신생물/종양 중의 돌연변이를 확인하고; 확인된 돌연변이를 하나 이상의 펩티드-MHC 결합 예측 알고리즘을 이용하여 분석함으로써 신생물/종양 내에서 발현되고, 높은 비율의 환자 HLA 대립유전자에 결합하는 복수 개의 신생항원 T 세포 에피토프를 생성하고; 높은 비율의 암을 갖는 피험체를 치료하는 데 적합한 암 백신 또는 면역원성 조성물에서 사용하기 위한, 모든 신생항원 펩티드 및 예측된 결합 펩티드로 이루어진 세트로부터 선별된 복수 개의 신생항원성 펩티드를 합성함으로써 처리될 수 있다.
예를 들어, 펩티드 시퀀싱 정보를 치료적 백신으로 옮기는 것은 높은 비율의 개체의 HLA 분자에 결합할 수 있는 돌연변이화된 펩티드의 예측을 포함할 수 있다. 면역원으로서 어떤 특정 돌연변이를 사용할지를 효율적으로 선택하는 것은 어떤 돌연변이화된 펩티드가 높은 비율의 환자의 HLA 대립유전자에 효율적으로 결합할지를 예측하는 능력을 필요로 한다. 최근에, 입증된 결합 및 비결합 펩티드를 사용한 신경망 기반의 학습 접근법에 의해, 주요 HLA-A 및 -B 대립유전자에 대한 예측 알고리즘의 정확성이 진전되었다. 그러나, HLA-펩티드 결합 법칙을 코딩하기 위해 심지어 첨단 신경망 기반의 알고리즘을 사용한 경우에도, 여러 인자들이 HLA 대립유전자 상에 존재하는 펩티드를 예측하는 검정력을 제한하고 있다.
예를 들어, 펩티드 시퀀싱 정보를 치료적 백신으로 옮기는 것은 약물을 긴 펩티드의 다중 에피토프 백신으로서 제제화하는 것을 포함할 수 있다. 실제로 가능한 많은 돌연변이화된 에피토프를 표적화하는 것은 면역계의 막대한 능력을 이용하며, 면역 표적화된 유전자 생성물의 하향조절에 의해 면역학적 회피 기회를 방지하고, 알려져 있는 에피토프 예측 접근법의 부정확성을 보완한다. 합성 펩티드는 다중의 면역원을 효율적으로 제조하고, 돌연변이체 에피토프의 확인을 효과적인 백신으로 신속하게 옮기는 데 유용한 수단을 제공한다. 펩티드는 오염 박테리아 또는 동물 물질이 없는 시약을 사용하여 화학적으로 손쉽게 합성되고, 용이하게 정제될 수 있다. 크기가 작기 때문에 단백질의 돌연변이화된 영역에 대해 뚜렷이 주목할 수 있고, 또한 다른 성분(비돌연변이화된 단백질 또는 바이러스 벡터 항원)과의 관련없는 항원 경쟁은 감소될 수 있다.
예를 들어, 펩티드 시퀀싱 정보를 치료적 백신으로 옮기는 것은 강력한 백신 애쥬번트와의 조합을 포함할 수 있다. 효과적인 백신은 면역 반응을 개시하기 위하여 강력한 애쥬번트를 필요로 할 수 있다. 예를 들어, TLR3, 및 MDA5 및 RIG3의 RNA 헬리카제의 작용제인 폴리ICLC는 백신 애쥬번트에 바람직한 몇몇의 특성을 나타내었다. 이들 특성은 생체내에서의 면역 세포의 국소 및 전신 활성화의 유도, 자극성 케모카인 및 사이토카인의 생성 및 DC에 의한 항원 제시의 자극을 포함한다. 추가로, 폴리ICLC는 인간에서 지속적인 CD4+ 및 CD8+ 반응을 유도할 수 있다. 중요한 것은 폴리ICLC로 백신접종된 피험체에서, 및 고도로 효과적인 복제 가능 황열 백신을 투여받은 자원자에서 전사 및 신호 전달 경로의 상향조절에 있어서 두드러진 유사성이 관찰되었다는 점이다. 추가로, 최근 1상 연구에서, (몬타나이드 이외의) NYESO-1 펩티드 백신과 조합하여 폴리ICLC로 면역화된 난소 암종 환자 중 >90%에서, CD4+ 및 CD8+ T 세포의 유도 및 펩티드에 대한 항체 반응이 나타났다. 동시에, 폴리ICLC를 현재까지 25회 초과의 임상 시험에서 광범위하게 시험하였으며, 비교적 양성의 독성 프로파일을 나타내었다.
본 출원인은 하기 유전자에서 돌연변이 이벤트를 발견하였다:
ABL1, AC011997, ACVR2A, AFP, AKT1, ALK, ALPPL2, ANAPC1, APC, ARID1A, AR, AR-v7, ASCL2, β2M, BRAF, BTK, C15ORF40, CDH1, CLDN6, CNOT1, CT45A5, CTAG1B, DCT, DKK4, EEF1B2, EEF1DP3, EGFR, EIF2B3, env, EPHB2, ERBB3, ESR1, ESRP1, FAM111B, FGFR3, FRG1B, GAGE1, GAGE10, GATA3, GBP3, HER2, IDH1, JAK1, KIT, KRAS, LMAN1, MABEB16, MAGEA1, MAGEA10, MAGEA4, MAGEA8, MAGEB17, MAGEB4, MAGEC1, MEK, MLANA, MLL2, MMP13, MSH3, MSH6, MYC, NDUFC2, NRAS, PAGE2, PAGE5, PDGFRa, PIK3CA, PMEL, pol 단백질, POLE, PTEN, RAC1, RBM27, RNF43, RPL22, RUNX1, SEC31A, SEC63, SF3B1, SLC35F5, SLC45A2, SMAP1, SMAP1, SPOP, TFAM, TGFBR2, THAP5, TP53, TTK, TYR, UBR5, VHL, XPOT, EEF1DP3:FRY 융합 폴리펩티드, EGFR:SEPT14 융합 폴리펩티드, EGFRVIII 결실 폴리펩티드, EML4:ALK 융합 폴리펩티드, NDRG1:ERG 융합 폴리펩티드, AC011997.1:LRRC69 융합 폴리펩티드, RUNX1(ex5)-RUNX1T1융합 폴리펩티드, TMPRSS2:ERG 융합 폴리펩티드, NAB:STAT6 융합 폴리펩티드, NDRG1:ERG 융합 폴리펩티드, PML:RARA 융합 폴리펩티드, PPP1R1B:STARD3 융합 폴리펩티드, MAD1L1:MAFK 융합 폴리펩티드, FGFR3:TAC 융합 폴리펩티드, FGFR3:TACC3 융합 폴리펩티드, BCR:ABL 융합 폴리펩티드, C11orf95:RELA 융합 폴리펩티드, CBFB:MYH11 융합 폴리펩티드, CBFB:MYH11 융합 폴리펩티드, CD74:ROS1 융합 폴리펩티드, CD74:ROS1 융합 폴리펩티드, ERVE-4:프로테아제, ERVE-4:역전사효소, ERVE-4: 역전사효소, ERVE-4:비공지된, ERVH-2 기질 단백질, ERVH-2:gag, ERVH-2: 레트로바이러스 기질, ERVH48-1:코트 단백질, ERVH48-1:신시틴, ERVI-1 외피 단백질, ERVK-5 gag, ERVK-5 env, ERVK-5 pol, EBV A73, EBV BALF3, EBV BALF4, EBV BALF5, EBV BARF0, EBV LF2, EBV RPMS1, HPV-16, HPV-16 E7, 및 HPV-16 E6.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 신생항원은 β2M, BTK, EGFR, GATA3, KRAS, MLL2, TMPRSS2:ERG 융합 폴리펩티드, 또는 TP53에서의 돌연변이 이벤트에 기인하는 것이다.
신생항원 폴리펩티드
측면에서, 본 발명은 표 1 또는 2로부터의 종양 특이적 돌연변이를 포함하는 단리된 펩티드를 제공한다. 이들 펩티드 및 폴리펩티드는 본원에서 "신생항원성 펩티드" 또는 "신생항원성 폴리펩티드"로서 지칭된다. "펩티드"라는 용어는 본 명세서에서 "돌연변이체 펩티드" 및 "신생항원성 펩티드"와 상호교환적으로 사용되며, 이는 전형적으로 인접한 아미노산의 α-아미노 기와 카르복실 기 사이의 펩티드 결합에 의해 하나가 나머지 다른 하나에 연결된 일련의 잔기, 전형적으로, L-아미노산을 의미한다. 유사하게, "폴리펩티드"라는 용어는 본 명세서에서 "돌연변이체 폴리펩티드" 및 "신생항원성 폴리펩티드"와 상호교환적으로 사용되며, 이는 전형적으로 인접한 아미노산의 α-아미노 기와 카르복실 기 사이의 펩티드 결합에 의해 하나가 나머지 다른 하나에 연결된 일련의 잔기, 전형적으로, L-아미노산을 의미한다. 폴리펩티드 또는 펩티드는 그의 중성(비하전된) 형태, 또는 염이 형태로 다양한 길이를 가질 수 있고, 예컨대, 글리코실화, 측쇄 산화, 또는 인산화와 같은 변형이 이루어지지 않은 것이거나, 또는 변형이 본원에 기술된 바와 같은 폴리펩티드의 생물학적 활성을 파괴시키지 않는 것을 조건으로, 상기 변형을 함유하는 것일 수 있다.
일부 실시양태에서, 시퀀싱 방법은 종양 특이적 돌연변이를 확인하는 데 사용된다. 임의의 적합한 시퀀싱 방법, 예를 들어, 예를 들어, 차세대 시퀀싱(NGS: Next Generation Sequencing) 기술이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 제3 세대 시퀀싱(Third Generation Sequencing) 방법은 본 방법의 시퀀싱 단계의 속도를 가속화시키기 위해 추후에 NGS 기술 대신으로 대체될 수 있다. 명확하게 하기 위해, 본 발명과 관련하여 "차세대 시퀀싱" 또는 "NGS"는, "생어" 화학법으로서 공지된 "종래의" 시퀀싱 방법과 달리, 전체 게놈을 작은 조각으로 파단시킴으로써 전체 게놈을 따라 동시에 무작위로 핵산 주형을 판독하는 모든 신규의 고처리량 시퀀싱 기술을 의미한다. (로도 대규모 병렬 시퀀싱 기술로도 또한 공지되어 있는) 상기 NGS 기술은 전체 게놈, 엑솜, 트랜스크립톰(게놈의 모든 전사된 서열) 또는 메틸롬(서열의 모든 메틸화된 서열)의 핵산 서열 정보를 매우 단기간 내에, 예컨대, 1-2주 이내, 예를 들어, 1-7일 이내 또는 24시간 미만인 기간 내에 전달할 수 있고, 대체적으로 단일 세포 시퀀싱 접근법을 허용할 수 있다. 상업적으로 이용가능하거나, 또는 문헌에서 언급된 다중 NGS 플랫폼, 예컨대, WO 2012/159643에 상세하게 기술된 것이 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서 본원에 기술된 신생항원성 펩티드 분자는 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120개 이상의 아미노산 잔기, 및 그 안에서 추론가능한 임의 범위의 것을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 구체적인 실시양태에서, 신생항원성 펩티드 분자는 100개 이하의 아미노산이다.
일부 실시양태에서, MHC 클래스 I에 대한 본원에 기술된 신생항원성 펩티드 및 폴리펩티드의 길이는 13개 이하의 잔기 길이이고, 이는 일반적으로 약 8 내지 약 11개의 잔기, 특히, 9 또는 10개의 잔기로 구성된다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 II에 대한 본원에 기술된 신생항원성 펩티드 및 폴리펩티드의 길이는 9-24개의 잔기 길이이다.
더욱 긴 신생항원성 펩티드가 여러 방식으로 디자인될 수 있다. 일부 실시양태에서, HLA 결합 펩티드가 예측 또는 공지되어 있을 때, 더욱 긴 신생항원성 펩티드는 (1) 각각 상응하는 유전자 생성물의 N 및 C 말단으로 2-5개의 아미노산으로 이루어진 연장부를 포함하는 개별 결합 펩티드; 또는 (2) 각각에 대해 연장된 서열을 포함하는 결합 펩티드 중 일부 또는 그들 모두의 연결로 구성될 수 있다. 다른 실시양태에서, 시퀀싱 결과, (예컨대, 신규한 펩티드 서열을 유도하는 프레임시프트, 리드-쓰루(read-through) 또는 인트론 포함에 기인하는) 긴(>10개 잔기) 네오에피토프 서열이 종양에 존재하는 것으로 나타났을 때, 더욱 긴 신생항원성 펩티드는 단일의 더욱 긴 펩티드 또는 수개의 중첩된 더욱 긴 펩티드와 같이 전장의 신규한 종양 특이적 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 더욱 긴 펩티드를 사용하는 것이 환자 세포에 의한 내인성 프로세싱을 허용할 수 있을 것으로 추정되고, 더욱 효과적인 항원 제시 및 T 세포 반응 유도를 초래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드가 중복되고, 긴 신생항원성 펩티드 상에 걸쳐 타일화될 때, 2개 이상의 펩티드가 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 신생항원성 펩티드 및 폴리펩티드는 HLA 단백질(예컨대, HLA 클래스 I 또는 HLA 클래스 II)에 결합한다. 구체적인 실시양태에서, 신생항원성 펩티드 및 폴리펩티드는 상응하는 야생형 펩티드보다 더욱 큰 친화도로 HLA 단백질에 결합한다. 구체적인 실시양태에서, 신생항원성 펩티드 또는 폴리펩티드의 IC50은 적어도 5,000 nM 미만, 적어도 500 nM 미만, 적어도 100 nM 미만, 적어도 50 nM 미만, 또는 그 미만이다.
일부 실시양태에서, 신생항원성 펩티드의 길이는 약 8 내지 약 50개의 아미노산 잔기 길이, 또는 약 8 내지 약 30, 약 8 내지 약 20, 약 8 내지 약 18, 약 8 내지 약 15, 또는 약 8 내지 약 12개의 아미노산 잔기 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 신생항원성 펩티드의 길이는 약 8 내지 약 500개의 아미노산 잔기 길이, 또는 약 8 내지 약 450, 약 8 내지 약 400, 약 8 내지 약 350, 약 8 내지 약 300, 약 8 내지 약 250, 약 8 내지 약 200, 약 8 내지 약 150, 약 8 내지 약 100, 약 8 내지 약 50, 또는 약 8 내지 약 30개의 아미노산 잔기 길이일 수 있다.
일부 실시양태에서, 신생항원성 펩티드의 길이는 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 아미노산 잔기 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 신생항원성 펩티드이 길이는 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500개 이상의 아미노산 잔기 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 신생항원성 펩티드의 길이는 최대 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이하의 아미노산 잔기 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 신생항원성 펩티드의 길이는 최대 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500개 이하의 아미노산 잔기 길이일 수 있다.
일부 실시양태에서, 신생항원성 펩티드의 총 길이는 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 또는 적어도 500개의 아미노산 길이이다.
일부 실시양태에서, 신생항원성 펩티드의 총 길이는 최대 8, 최대 9, 최대 10, 최대 11, 최대 12, 최대 13, 최대 14, 최대 15, 최대 16, 최대 17, 최대 18, 최대 19, 최대 20, 최대 21, 최대 22, 최대 23, 최대 24, 최대 25, 최대 26, 최대 27, 최대 28, 최대 29, 최대 30, 최대 40, 최대 50, 최대 60, 최대 70, 최대 80, 최대 90, 최대 100, 최대 150, 최대 200, 최대 250, 최대 300, 최대 350, 최대 400, 최대 450, 또는 최대 500개의 아미노산 길이이다.
일부 실시양태에서, 신생항원성 펩티드는 약 0.5 내지 약 12, 약 2 내지 약 10, 또는 약 4 내지 약 8인 pI 값을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 신생항원성 펩티드는 적어도 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5 이상인 pI 값을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 신생항원성 펩티드는 최대 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5 이하인 pI 값을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 신생항원성 펩티드는 약 1 pM 내지 약 1 mM, 약 100 pM 내지 약 500 μM, 약 500 pM 내지 약 10 μM, 약 1 nM 내지 약 1 μM, 또는 약 10 nM 내지 약 1 μM인 HLA 결합 친화도를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 신생항원성 펩티드는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 μM 이상인 HLA 결합 친화도를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 신생항원성 펩티드는 최대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 μM인 HLA 결합 친화도를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 신생항원성 펩티드는 캐리어, 예컨대, 당업계에 널리 공지된 캐리어, 예컨대, 티로글로불린, 알부민, 예컨대, 인간 혈청 알부민, 파상풍 톡소이드, 폴리아미노산 잔기, 예컨대, 폴리 L-리신, 폴리 L-글루탐산, 인플루엔자 바이러스 단백질, B형 간염 바이러스 코어 단백질 등을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 신생항원성 펩티드는 말단-NH2 아실화에 의해, 예컨대, 알카노일(C1-C20) 또는 티오글리콜릴 아세틸화, 말단-카르복실 아미드화, 예컨대, 암모니아, 메틸아민 등에 의해 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이들 변형은 지지체 또는 다른 분자에의 연결을 위한 부위를 제공할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 신생항원성 펩티드는 변형, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 글리코실화, 측쇄 산화, 비오티닐화, 인산화, 계면 활성 물질, 예컨대, 지질 첨가를 함유할 수 있거나, 또는 예컨대, 아세틸화 등과 같이 화학적으로 변형될 수 있다. 더욱이, 펩티드 중의 결합은 펩티드 결합 이외의 것, 예컨대, 공유 결합, 에스테르 또는 에테르 결합, 이황화 결합, 수소 결합, 이온 결합 등일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 신생항원성 펩티드는 생성된 펩티드의 물리적 특성(예컨대, 안정성 또는 가용성)을 변형시키기 위해 치환을 함유할 수 있다. 예를 들어, 신생항원성 펩티드는 시스테인(C)의 α-아미노 부티르산("B")에 의해 치환에 의해 변형될 수 있다. 시스테인은 그의 화학적 성질에 기인하여, 이황화 브릿지를 형성하고, 결합능을 감소시키기 위해 펩티드를 구조적으로 충분히 변경시키는 성향을 가진다. C를 대신하여 α-아미노 부티르산으로 치환하는 것은 상기와 같은 문제를 경감시킬 뿐만 아니라, 실제로 특정 경우에는 결합 및 교차결합 능력을 개선시킨다. 시스테인의 α-아미노 부티르산으로의 치환은 신생항원성 펩티드의 임의의 잔기에서, 예컨대, 펩티드 내의 에피토프 또는 유사체의 앵커 또는 비앵커 위치에서, 또는 펩티드의 다른 위치에서 발생할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 신생항원성 펩티드는 아미노산 모방체 또는 비천연 아미노산 잔기, 예컨대, D- 또는 L-나프틸알라닌; D- 또는 L-페닐글리신; D- 또는 L-2-티에닐알라닌; D- 또는 L-1, -2, 3-, 또는 4-피리딜알라닌; D- 또는 L-3 티에닐알라닌; D- 또는 L-(2-피리디닐)-알라닌; D- 또는 L-(3-피리디닐)-알라닌; D- 또는 L-(2-피라지닐)-알라닌; D- 또는 L-(4-이소프로필)-페닐글리신; D-(트리플루오로메틸)-페닐글리신; D-(트리플루오로메틸)-페닐알라닌; D-로-플루오로페닐알라닌; D- 또는 L-로-비페닐-페닐알라닌; D- 또는 L-로-메톡시비페닐페닐알라닌; D- 또는 L-2-인돌(알릴)알라닌; 및 D- 또는 L-알킬알라닌(여기서, 알킬 기는 치환된 또는 비치환된 메틸, 에틸, 프로필, 헥실, 부틸, 펜틸, 이소프로필, 이소부틸, sec-이소틸, 이소펜틸일 수 있다) 또는 비산성 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 비천연 아미노산의 방향족 고리는 예컨대, 티아졸릴, 티오페닐, 피라졸릴, 벤즈이미다졸릴, 나프틸, 푸라닐, 피롤릴, 및 피리딜 방향족 고리를 포함한다. 다양한 아미노산 모방체 또는 비천연 아미노산 잔기를 갖는 변형된 펩티드는 생체내에서 증가된 안정성을 보이는 경향이 있는 바, 특히 유용하다. 상기 펩티드는 또한 개선된 저장 수명 또는 제조 특성을 가질 수 있다.
펩티드 안정성은 다수의 방식으로 검정될 수 있다. 예를 들어, 안정성을 테스트하는 데 펩티드 및 각종 생물학적 배지, 예컨대, 인간 혈장 및 혈청이 사용될 수 있다. 예컨대, 문헌 [Verhoef, et al., Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinetics 11:291 (1986)]을 참조한다. 본원에 기술된 펩티드의 반감기는 편의상 25% 인간 혈청 (v/v) 검정법을 이용하여 측정된다. 프로토콜은 하기와 같다: 사용 전, 풀링된 인간 혈청(AB형, 비열처리에 의해 불활성화된 것)을 원심분리에 의해 파손시킨다. 이어서, 혈청을 RPMI-1640 또는 또 다른 적합한 조직 배양 배지로 25%까지 희석시킨다. 미리 결정된 시간 간격으로, 소량의 반응 용액을 제거하고, 6% 수성 트리클로로아세트산(TCA) 또는 에탄올을 첨가한다. 탁한 반응 샘플을 (4℃에서) 15분 동안 냉각시킨 후, 회전시켜 침전된 혈청 단백질을 펠릿화한다. 이어서, 안정성 특이적 크로마토그래피 조건을 이용하여 역상 HPLC에 의해 펩티드의 존재를 측정한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 신생항원성 펩티드는 용액 중에 존재하거나, 동결 건조될 수 있거나, 또는 결정 형태일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 신생항원성 펩티드는 재조합 DNA 기술 또는 화학적 합성에 의해 합성 방식으로 제조될 수 있거나, 또는 천연 공급원, 예컨대, 천연 종양 또는 병원성 유기체로부터 단리될 수 있다. 에피토프는 개별적으로 합성될 수 있거나, 펩티드에서 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 비록 본원에 기술된 신생항원성 펩티드는 다른 자연적으로 발생된 숙주 세포 단백질 및 그의 단편을 실질적으로 함유하지 않겠지만, 일부 실시양태에서, 펩티드는 합성 방식으로 접합되어 천연 단편 또는 입자에 연결될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 신생항원성 펩티드는 매우 다양한 방식으로 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 종래 기술에 따라 용액 중에서 또는 고체 지지체 상에서 합성될 수 있다. 각종의 자동 합성 장치가 상업적으로 이용가능하고, 공지된 프로토콜에 따라 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Stewart & Young, SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS, 2D. ED., Pierce Chemical Co., 1984] 참조). 추가로, 개별 펩티드는 화학적 라이게이션을 사용하여 연결됨으로써 더욱 큰 펩티드를 제조할 수 있고, 이 역시 본 발명의 범위 내에 포함된다.
대안적으로, 재조합 DNA 기술이 사용될 수 있고, 여기서, 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 발현 벡터 내로 삽입되고, 적절한 숙주 세포 내로 형질전환 또는 형질감염되고, 발현에 적합한 조건하에서 배양된다. 상기 방법은 일반적으로 문헌 [Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]에 기술되어 있는 바와 같이, 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 본원에 기술된 하나 이상의 에피토프를 포함하거나, 또는 그로 구성된 재조합 펩티드가 적절한 T 세포 에피토프를 제공하는 데 사용될 수 있다.
한 측면에서, 본원에 기술된 본 발명은 또한 1개, 적어도 2개의, 또는 2개 초과의 신생항원성 펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 조성물은 적어도 2개의 독특한 펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 독특한 펩티드는 동일한 폴리펩티드로부터 유래된 것이다. 독특한 폴리펩티드란, 펩티드가 길이, 아미노산 서열, 또는 그 둘 모두에서 상이하다는 것을 의미한다. 펩티드는 종양 특이적 돌연변이를 함유하는 것으로 공지된, 또는 그러한 것으로 발견된 임의의 폴리펩티드로부터 유래된 것이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 천연 펩티드의 아미노산 치환을 일으키는 점 돌연변이를 갖는 유전자에 의해 코딩된다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 ABL 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 VADGLITTLHYPAPKRNKPTVYGVSPNYDKWEMERTDITMKHKLGGGQYGKVYEGVWKKYSLTVAVKTLKEDTMEVEEFLKEAAVMKEIKHPNLVQLLGVC, VADGLITTLHYPAPKRNKPTVYGVSPNYDKWEMERTDITMKHKLGGGQYGVVYEGVWKKYSLTVAVKTLKEDTMEVEEFLKEAAVMKEIKHPNLVQLLGVC, LLGVCTREPPFYIITEFMTYGNLLDYLRECNRQEVNAVVLLYMATQISSATEYLEKKNFIHRDLAARNCLVGENHLVKVADFGLSRLMTGDTYTAHAGAKF, SLTVAVKTLKEDTMEVEEFLKEAAVMKEIKHPNLVQLLGVCTREPPFYIIIEFMTYGNLLDYLRECNRQEVNAVVLLYMATQISSAMEYLEKKNFIHRDLA, 또는 STVADGLITTLHYPAPKRNKPTVYGVSPNYDKWEMERTDITMKHKLGGGQHGEVYEGVWKKYSLTVAVKTLKEDTMEVEEFLKEAAVMKEIKHPNLVQLLG이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 ALK 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 SSLAMLDLLHVARDIACGCQYLEENHFIHRDIAARNCLLTCPGPGRVAKIADFGMARDIYRASYYRKGGCAMLPVKWMPPEAFMEGIFTSKTDTWSFGVLL 또는 QVAVKTLPEVCSEQDELDFLMEALIISKFNHQNIVRCIGVSLQSLPRFILMELMAGGDLKSFLRETRPRPSQPSSLAMLDLLHVARDIACGCQYLEENHFI이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 BRAF 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 MIKLIDIARQTAQGMDYLHAKSIIHRDLKSNNIFLHEDLTVKIGDFGLATEKSRWSGSHQFEQLSGSILWMAPEVIRMQDKNPYSFQSDVYAFGIVLYELM이다. 일부 관련된 실시양태에서, 신생항원성 펩티드는 DFGLATEKSR 또는 FGLATEKSRW가 아니다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 BTK 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 MIKEGSMSEDEFIEEAKVMMNLSHEKLVQLYGVCTKQRPIFIITEYMANGSLLNYLREMRHRFQTQQLLEMCKDVCEAMEYLESKQFLHRDLAARNCLVND이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 EEF1B2 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 MGFGDLKSPAGLQVLNDYLADKSYIEGYVPSQADVAVFEAVSGPPPADLCHALRWYNHIKSYEKEKASLPGVKKALGKYGPADVEDTTGSGAT이다. 일부 관련된 실시양태에서, 신생항원성 펩티드는 EAVSGPPPA, FEAVSGPPP 또는 FEAVSGPPPA가 아니다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 EGFR 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 MSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIIRNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLL 또는 IPVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTSTVQLIMQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQIAKGMNYLEDRRLVHRDLAA이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 ERBB3 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 EFSTLPLPNLRMVRGTQVYDGKF이다. 일부 관련된 실시양태에서, 신생항원성 펩티드는 RMVRGTQVY, LPLPNLRMV, LRMVRGTQV, TLPLPNLRMV, NLRMVRGTQV, 또는 LRMVRGTQVY가 아니다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 ESR1 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 HLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEHLYSMKCKNVVPLYGLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEA, NQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLPSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSH, IHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEHLYSMKCKNVVPLCDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGE, IHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEHLYSMKCKNVVPLNDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGE, 또는 IHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEHLYSMKCKNVVPLSDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGE이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 FGFR3 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 HRIGGIKLRHQQWSLVMESVVPSDRGNYTCVVENKFGSIRQTYTLDVLERCPHRPILQAGLPANQTAVLGSDVEFHCKVYSDAQPHIQWLKHVEVNGSKVG이다. 일부 관련된 실시양태에서, 신생항원성 펩티드는 DVLERCPHR, LERCPHRPI, CPHRPILQA, 또는 LERCPHRPIL이 아니다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 FRG1B 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 AVKLSDSRIALKSGYGKYLGINSDELVGHSDAIGPREQWEPVFQNGKMALSASNSCFIRCNEAGDIEAKSKTAGEEEMIKIRSCAEKETKKKDDIPEEDKG이다. 일부 관련된 실시양태에서, 신생항원성 펩티드는 SASNSCFIR, LSASNSCFI, ALSASNSCF 또는 FQNGKMALSA가 아니다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 HER2 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 GSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAIKVLRENTSPKANKEILDEAYVMAGLGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLDHVRENRGRLGSQDLLNWCM이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 IDH1 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 RVEEFKLKQMWKSPNGTIRNILGGTVFREAIICKNIPRLVSGWVKPIIIGHHAYGDQYRATDFVVPGPGKVEITYTPSDGTQKVTYLVHNFEEGGGVAMGM, RVEEFKLKQMWKSPNGTIRNILGGTVFREAIICKNIPRLVSGWVKPIIIGCHAYGDQYRATDFVVPGPGKVEITYTPSDGTQKVTYLVHNFEEGGGVAMGM, RVEEFKLKQMWKSPNGTIRNILGGTVFREAIICKNIPRLVSGWVKPIIIGGHAYGDQYRATDFVVPGPGKVEITYTPSDGTQKVTYLVHNFEEGGGVAMGM, 또는 RVEEFKLKQMWKSPNGTIRNILGGTVFREAIICKNIPRLVSGWVKPIIIGSHAYGDQYRATDFVVPGPGKVEITYTPSDGTQKVTYLVHNFEEGGGVAMGM이다. 일부 관련된 실시양태에서, 신생항원성 펩티드는 PIIIGHHAY, GHHAYGDQY, KPIIIGHHAY, IGHHAYGDQY, PIIIGCHAY, GCHAYGDQY, KPIIIGCHAY, IGCHAYGDQY, PIIIGGHAY, GGHAYGDQY, KPIIIGGHAY, 또는 IGGHAYGDQY가 아니다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 KIT 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 VEATAYGLIKSDAAMTVAVKMLKPSAHLTEREALMSELKVLSYLGNHMNIANLLGACTIGGPTLVITEYCCYGDLLNFLRRKRDSFICSKQEDHAEAALYK 또는 VEATAYGLIKSDAAMTVAVKMLKPSAHLTEREALMSELKVLSYLGNHMNIANLLGACTIGGPTLVITEYCCYGDLLNFLRRKRDSFICSKQEDHAEAALYK이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 MEK 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 ISELGAGNGGVVFKVSHKPSGLVMARKLIHLEIKPAIRNQIIRELQVLHESNSPYIVGFYGAFYSDGEISICMEHMDGGSLDQVLKKAGRIPEQILGKVSI 또는 LGAGNGGVVFKVSHKPSGLVMARKLIHLEIKPAIRNQIIRELQVLHECNSLYIVGFYGAFYSDGEISICMEHMDGGSLDQVLKKAGRIPEQILGKVSIAVI이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 MYC 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 MPLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSDLQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGG, FTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLSTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTELLG, 또는 TNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPIPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTELLGG이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 PDGFRa 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 VAVKMLKPTARSSEKQALMSELKIMTHLGPHLNIVNLLGACTKSGPIYIIIEYCFYGDLVNYLHKNRDSFLSHHPEKPKKELDIFGLNPADESTRSYVILS이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 PIK3CA 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 IEEHANWSVSREAGFSYSHAGLSNRLARDNELRENDKEQLKAISTRDPLSKITEQEKDFLWSHRHYCVTIPEILPKLLLSVKWNSRDEVAQMYCLVKDWPP, HANWSVSREAGFSYSHAGLSNRLARDNELRENDKEQLKAISTRDPLSEITKQEKDFLWSHRHYCVTIPEILPKLLLSVKWNSRDEVAQMYCLVKDWPPIKP, 또는 LFINLFSMMLGSGMPELQSFDDIAYIRKTLALDKTEQEALEYFMKQMNDARHGGWTTKMDWIFHTIKQHALN이다. 일부 관련된 실시양태에서, 신생항원성 펩티드는 ISTRDPLSK, STRDPLSKI, LSKITEQEK, AISTRDPLSK, SKITEQEKDF, SEITKQEKDF, KQEKDFLWSH, FMKQMNDAR, KQMNDARHG, RHGGWTTKM, YFMKQMNDAR, FMKQMNDARH, KQMNDARHGG, QMNDARHGGW, 또는 ARHGGWTTKM이 아니다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 POLE 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 QRGGVITDEEETSKKIADQLDNIVDMREYDVPYHIRLSIDIETTKLPLKFRDAETDQIMMISYMIDGQGYLITNREIVSEDIEDFEFTPKPEYEGPFCVFN이다. 일부 관련된 실시양태에서, 신생항원성 펩티드는 TTKLPLKFR, RDAETDQIM, KFRDAETDQI, ETTKLPLKFR, 또는 RDAETDQIMM이 아니다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 PTEN 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 KFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGQTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSY이다. 일부 관련된 실시양태에서, 신생항원성 펩티드는 QTGVMICAY, GKGQTGVMI, GQTGVMICAY, 또는 KAGKGQTGVM이 아니다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 RAC1 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 MQAIKCVVVGDGAVGKTCLLISYTTNAFSGEYIPTVFDNYSANVMVDGKPVNLGLWDTAGQEDYDRLRPLSYPQTVGET이다. 일부 관련된 실시양태에서, 신생항원성 펩티드는 TTNAFSGEY, FSGEYIPTV, SGEYIPTVF, YTTNAFSGEY, TTNAFSGEYI, 또는 FSGEYIPTVF가 아니다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 TP53 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 IRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGSMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEP, TYSPALNKMFCQLAKTCPVQLWVDSTPPPGTRVRAMAIYKQSQHMTEVVRHCPHHERCSDSDGLAPPQHLIRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEV, EGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNQRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHE, EGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNWRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHE, 또는 PEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVCVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPL이다. 일부 관련된 실시양태에서, 신생항원성 펩티드는 SSCMGSMNR, GSMNRRPIL, MGSMNRRPI, CNSSCMGSM, SMNRRPILTI, SSCMGSMNRR, NSSCMGSMNR, MGSMNRRPIL, MCNSSCMGSM, CMGSMNRRPI, TEVVRHCPH, VVRHCPHHER, SQHMTEVVRH, MNQRPILTI, NQRPILTII, CMGGMNQRPI, GMNQRPILTI, SSCMGGMNQR, NQRPILTIIT, NWRPILTII, SSCMGGMNW, MGGMNWRPI, MNWRPILTI, CMGGMNWRPI, GMNWRPILTI, SSCMGGMNWR, MNWRPILTII, NSSCMGGMNW, NSFEVCVCA, EVCVCACPGR, 또는 FEVCVCACPG가 아니다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 프레임시프트 돌연변이를 갖는 유전자에 의해 코딩된다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 ACVR2A 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 GVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKRQP 또는 GVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKTALKYIFVAVRAICVMKSFLIFRRWKSHSPLQIQLHLSHPITTSCSIPWCHLC이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 C15ORF40 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 TAEAVNVAIAAPPSEGEANAELCRYLSKVLELRKSDVVLDKVGLALFFFFFETKSCSVAQAGVQWRSLGSLQPPPPGFKLFSCLSFLSSWDYRRMPPCLANFCIFNRDGVSPCWSGWS이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 CNOT1 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 LSVIIFFFVYIWHWALPLILNNHHICLMSSIILDCNSVRQSIMSVCFFFFSVIFSTRCLTDSRYPNICWFK 또는 LSVIIFFFVYIWHWALPLILNNHHICLMSSIILDCNSVRQSIMSVCFFFFCYILNTMFDR이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 EIF2B3 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 VLVLSCDLITDVALHEVVDLFRAYDASLAMLMRKGQDSIEPVPGQKGKKKQWSSVTSLEWTAQERGCSSWLMKQTWMKSWSLRDPSYRSILEYVSTRVLWMPTSTV이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 EPHB2 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 SIQVMRAQMNQIQSVEGQPLARRPRATGRTKRCQPRDVTKKTCNSNDGKKREWEKRKQILGGGGKYKEYFLKRILIRKAMTVLAGDKKGLGRFMRCVQSETKAVSLQLPLGR이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 ESRP1 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 LDFLGEFATDIRTHGVHMVLNHQGRPSGDAFIQMKSADRAFMAAQKCHKKKHEGQIC 또는 LDFLGEFATDIRTHGVHMVLNHQGRPSGDAFIQMKSADRAFMAAQKCHKKT이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 FAM11B 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 GALCKDGRFRSDIGEFEWKLKEGHKKIYGKQSMVDEVSGKVLEMDISKKKHYNRKISIKKLNRMKVPLMKLITRV이다. 일부 관련된 실시양태에서, 신생항원성 펩티드는 KLNRMKVPL, PLMKLITRV, RMKVPLMKL, ISKKKHYNR, SKKKHYNRK, KHYNRKISI, HYNRKISIK, YNRKISIKK, KISIKKLNR, SIKKLNRMK, LNRMKVPLM, ISIKKLNRM, MKVPLMKLI, KLNRMKVPLM, RMKVPLMKLI, ISIKKLNRMK, ISKKKHYNRK, KHYNRKISIK, HYNRKISIKK, KISIKKLNRM, SIKKLNRMKV, LNRMKVPLMK, KVPLMKLITR, DISKKKHYNR, KKHYNRKISI, KKLNRMKVPL, 또는 VPLMKLITRV가 아니다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 GBP3 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 RERAQLLEEQEKTLTSKLQEQARVLKERCQGESTQLQNEIQKLQKTLKKKPRDICRIS이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 JAK1 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 VNTLKEGKRLPCPPNCPDEVYQLMRKCWEFQPSNRTSFQNLIEGFEALLKTSN 또는 CRPVTPSCKELADLMTRCMNYDPNQRPFFRAIMRDINKLEEQNPDIVSEKNQQLKWTPHILKSAS이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 LMAN1 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 DDHDVLSFLTFQLTEPGKEPPTPDKEISEKEKEKYQEEFEHFQQELDKKKRGIPEGPPRPPRAACGGNI 또는 DDHDVLSFLTFQLTEPGKEPPTPDKEISEKEKEKYQEEFEHFQQELDKKKRNSRRATPTSKGSLRRKYLRV이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 MSH3 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 TKSTLIGEDVNPLIKLDDAVNVDEIMTDTSTSYLLCISENKENVRDKKKGQHFYWHCGSAACHRRGCV 또는 LYTKSTLIGEDVNPLIKLDDAVNVDEIMTDTSTSYLLCISENKENVRDKKRATFLLALWECSLPQARLCLIVSRTLLLVQS이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 NDUFC2 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 LPPPKLTDPRLLYIGFLGYCSGLIDNLIRRRPIATAGLHRQLLYITAFFFCWILSCKT, 또는 SLPPPKLTDPRLLYIGFLGYCSGLIDNLIRRRPIATAGLHRQLLYITAFFLLDIIL이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 RBM27 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 NQSGGAGEDCQIFSTPGHPKMIYSSSNLKTPSKLCSGSKSHDVQEVLKKKTGSNEVTTRYEEKKTGSVRKANRMPKDVNIQVRKKQKHETRRKSKYNEDFERAWREDLTIKR이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 RPL22 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 MAPVKKLVVKGGKKKEASSEVHS 또는 MAPVKKLVVKGGKKRSKF이다. 일부 관련된 실시양태에서, 신생항원성 펩티드는 VVKGGKKRSK 또는 VKGGKKRSK가 아니다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 SEC31A 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 MPSHQGAEQQQQQHHVFISQVVTEKEFLSRSDQLQQAVQSQGFINYCQKKN 또는 MPSHQGAEQQQQQHHVFISQVVTEKEFLSRSDQLQQAVQSQGFINYCQKKLMLLRLNLRKMCGPF이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 SEC63 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 AEVFEKEQSICAAEEQPAEDGQGETNKNRTKGGWQQKSKGPKKTAKSKKKETFKKKTYTCAITTVKATETKAGKWSRWE 또는 MAEVFEKEQSICAAEEQPAEDGQGETNKNRTKGGWQQKSKGPKKTAKSKKRNL이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 SLC35F5 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 NIMEIRQLPSSHALEAKLSRMSYPVKEQESILKTVGKLTATQVAKISFFFALCGFWQICHIKKHFQTHKLL이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 SMAP1 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 YEKKKYYDKNAIAITNISSSDAPLQPLVSSPSLQAAVDKNKLEKEKEKKKGREKERKGARKAGKTTYS 또는 KYEKKKYYDKNAIAITNISSSDAPLQPLVSSPSLQAAVDKNKLEKEKEKKRKRKREKRSQKSRQNHLQLKSCRRKISNWSLKKVPALKKLRSPLWIF이다. 일부 관련된 실시양태에서, 신생항원성 펩티드는 ALKKLRSPL, KISNWSLKK, SLKKVPALK, KLRSPLWIF, KKRKRKREK, RKREKRSQK, RSQKSRQNH, SQKSRQNHL, KSRQNHLQL, RRKISNWSL, RKISNWSLK, KVPALKKLR, HLQLKSCRR, WSLKKVPAL, RQNHLQLKS, KKVPALKKL, LKKLRSPLW, KKLRSPLWI, KISNWSLKKV, KSRQNHLQLK, SLKKVPALKK, WSLKKVPALK, KRKREKRSQK, RSQKSRQNHL, HLQLKSCRRK, RRKISNWSLK, CRRKISNWSL, NWSLKKVPAL, QKSRQNHLQL, RQNHLQLKSC, LQLKSCRRKI, ALKKLRSPLW, 또는 KKLRSPLWI가 아니다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 TFAM 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 IYQDAYRAEWQVYKEEISRFKEQLTPSQIMSLEKEIMDKHLKRKAMTKKKRVNTAWKTKKTSFSL 또는IYQDAYRAEWQVYKEEISRFKEQLTPSQIMSLEKEIMDKHLKRKAMTKKKS이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 TGFBR2 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 KPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKAW 또는 EKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKSLVRLSSCVPVALMSAMTTSSSQKNITPAILTCC이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 THAP5 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 VPSKYQFLCSDHFTPDSLDIRWGIRYLKQTAVPTIFSLPEDNQGKDPSKKNPRRKTWKMRKKYAQKPSQKNHLY이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 TTK 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 GTTEEMKYVLGQLVGLNSPNSILKAAKTLYEHYSGGESHNSSSSKTFEKKGEKNDLQLFVMSDTTYKIYWTVILLNPCGNLHLKTTSL이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 XPOT 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 QQLIRETLISWLQAQMLNPQPEKTFIRNKAAQVFALLFVTEYLTKWPKFFLTFSQ이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 APC 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, Cz는 AKFQQCHSTLEPNPADCRVLVYLQNQPGTKLLNFLQERNLPPKVVLRHPKVHLNTMFRRPHSCLADVLLSVHLIVLRVVRLPAPFRVNHAVEW, APVIFQIALDKPCHQAEVKHLHHLLKQLKPSEKYLKIKHLLLKRERVDLSKLQ, 또는 MLQFRGSRFFQMLILYYILPRKVLQMDFLVHPA이다. 일부 관련된 실시양태에서, 신생항원성 펩티드는 ADVLLSVHL, ADVLLSVHLI, APFRVNHAV, ARHKAVEFL, CLADVLLSV, CLADVLLSVH, DVLLSVHLI, DVLLSVHLIV, FLQERNLPPK, FRVNHAVEW, HLIVLRVVR, HLIVLRVVRL, HLNTMFRRPH, HPKVHLNTM, HPKVHLNTMF, KAVEFLQER, KVHLNTMFR, KVHLNTMFRR, KVVLRHPKV, LLSVHLIVL, LLSVHLIVLR, LPAPFRVNH, LPAPFRVNHA, LQERNLPPKV, LRVVRLPAPF, LSVHLIVLR, LSVHLIVLRV, MFRRPHSCL, MFRRPHSCLA, NLPPKVVLR, NTMFRRPHSC, QERNLPPKV, RHPKVHLNTM, RNLPPKVVL, RNLPPKVVLR, RPHSCLADV, RPHSCLADVL, RVVRLPAPF, RVVRLPAPFR, SARHKAVEFL, SVHLIVLRV, SVHLIVLRVV, TMFRRPHSC, TMFRRPHSCL, VEFLQERNL, VLLSVHLIV, VLLSVHLIVL, VLRHPKVHL, VLRVVRLPA, VVRLPAPFR, 또는 VVRLPAPFRV가 아니다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 ARID1A 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, Cz는ALGPHSRISCLPTQTRGCILLAATPRSSSSSSSNDMIPMAISSPPKAPLLAAPSPASRLQCINSNSRITSGQWMAHMALLPSGTKGRCTACHTALGRGSLSSSSCPQPSPSLPASNKLPSLPLSKMYTTSMAMPILPLPQLLLSADQQAAPRTNFHSSLAETVSLHPLAPMPSKTCHHK, AHQGFPAAKESRVIQLSLLSLLIPPLTCLASEALPRPLLALPPVLLSLAQDHSRLLQCQATRCHLGHPVASRTASCILP, PILAATGTSVRTAARTWVPRAAIRVPDPAAVPDDHAGPGAECHGRPLLYTADSSLWTTRPQRVWSTGPDSILQPAKSSPSAAAATLLPATTVPDPSCPTFVSAAATVSTTTAPVLSASILPAAIPASTSAVPGSIPLPAVDDTAAPPEPAPLLTATGSVSLPAAATSAASTLDALPAGCVSSAPVSAVPANCLFPAALPSTAGAISRFIWVSGILSPLNDLQ, PCRAGRRVPWAASLIHSRFLLMDNKAPAGMVNRARLHITTSKVLTLSSSSHPTPSNHRPRPLMPNLRISSSHSLNHHSSSPLSLHTPSSHPSLHISSPRLHTPPSSRRHSSTPRASPPTHSHRLSLLTSSSNLSSQHPRRSPSRLRILSPSLSSPSKLPIPSSASLHRRSYLKIHLGLRHPQPPQ, RTNPTVRMRPHCVPFWTGRILLPSAASVCPIPFEACHLCQAMTLRCPNTQGCCSSWAS, 또는 TNQALPKIEVICRGTPRCPSTVPPSPAQPYLRVSLPEDRYTQAWAPTSRTPWGAMVPRGVSMAHKVATPGSQTIMPCPMPTTPVQAWLEA이다. 일부 관련된 실시양태에서, 신생항원성 펩티드는 AAWRSCIAL, AAWRSCIALW, AETVSLHPL, AETVSLHPLA, AHMALLPSG, ALWCASSVT, AMPILPLPQL, APLLAAPSPA, APRTNFHSS, APRTNFHSSL, ASNKLPSLPL, AWRSCIALW, CAGRWLWYCW, CIALWCASSV, CPQPSPSLPA, CRRAVSATSW, CTACHTALGR, DQQAAPRTNF, ETVSLHPLA, FHSSLAETV, GMYSPSRYPR, GQWMAHMAL, GQWMAHMALL, GRCTACHTAL, GTAWQLVPL, HMALLPSGT, HMALLPSGTK, HPLAPMPSK, HSSLAETVSL, HTALGRGSL, IALWCASSV, ILATPPSAA, ILATPPSAAW, IPMAISSPP, IPMAISSPPK, ISSPPKAPL, ISSPPKAPLL, ITSGQWMAHM, KGRCTACHT, KGRCTACHTA, KLPSLPLSK, KLPSLPLSKM, KMYTTSMAM, KMYTTSMAMP, LAAPSPASR, LAAPSPASRL, LAETVSLHPL, LATPPSAAW, LATPPSAAWR, LLAAPSPASR, LLLSADQQAA, LLSADQQAA, LPASNKLPS, LPASNKLPSL, LPLPQLLLS, LPLPQLLLSA, LPSLPLSKM, LPSLPLSKMY, LQCINSNSRI, LQCRRAVSA, LQCRRAVSAT, LSADQQAAPR, LSKMYTTSM, LSKMYTTSMA, LWCASSVTER, LWYCWPTWL, LWYCWPTWLR, MAHMALLPS, MALLPSGTK, MPILPLPQL, MPILPLPQLL, MYSPSRYPR, MYTTSMAMPI, PMAISSPPK, QLVPLQCRR, QQAAPRTNF, QQAAPRTNFH, QWMAHMALL, RAVSATSWA, RAVSATSWAS, RCAGRWLWY, RCTACHTAL, RGTAWQLVPL, RLQCINSNSR, RRAVSATSW, RTNFHSSLA, RTNFHSSLAE, RTRCAGRWL, RTRCAGRWLW, RWLWYCWPT, RWLWYCWPTW, SAAWRSCIA, SAAWRSCIAL, SGQWMAHMAL, SKMYTTSMA, SKMYTTSMAM, SMAMPILPL, SNKLPSLPL, SPASRLQCI, SPPKAPLLAA, SPSLPASNKL, SRITSGQWM, SSCPQPSPSL, SSLAETVSL, SSNDMIPMAI, SSSNDMIPM, SSSSNDMIPM, SSSSSSNDM, SSSSSSSNDM, TACHTALGR, TERTRCAGRW, TSMAMPILPL, TTSMAMPIL, TVSLHPLAPM, TWLRGTAWQL, VPLQCRRAV, VSLHPLAPM, VTERTRCAGR, WLRGTAWQL, WLRGTAWQLV, WLWYCWPTW, WLWYCWPTWL, WMAHMALLPS, WPTWLRGTA, WPTWLRGTAW, WYCWPTWLR, YPRSSSSSS, YPRSSSSSSS, YTTSMAMPI, 또는 YTTSMAMPIL이 아니다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 β2M 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, Cz는 RMERELKKWSIQTCLSARTGLSISCTTLNSPPLKKMSMPAV, 또는 LCSRYSLFLAWRLSSVLQRFRFTHVIQQRMESQIS이다. 일부 관련된 실시양태에서, 신생항원성 펩티드는 ALAVLALLSF, ALLSFWPGGY, DSGLLTSSSR, ELLCVWVSSI, EWKVKFPEL, FPELLCVWV, FWPGGYPAY, GLLTSSSREW, KFPELLCVW, KFPELLCVWV, KVKFPELLC, KVKFPELLCV, LAVLALLSF, LAVLALLSFW, LLCVWVSSI, LLCVWVSSIR, LLSFWPGGY, LLTSSSREW, LLTSSSREWK, LSFWPGGYPA, LTSSSREWK, LTSSSREWKV, REWKVKFPE, REWKVKFPEL, SFWPGGYPA, SFWPGGYPAY, SSREWKVKF, SSSREWKVK, SSSREWKVKF, TSSSREWKV, TSSSREWKVK, VKFPELLCV, VKFPELLCVW, WKVKFPELL, 또는 YPAYSKDSGL이 아니다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 CDH1 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, Cz는 RSACVTVKGPLASVGRHSLSKQDCKFLPFWGFLEEFLLC, IQWGTTTAPRPIRPPFLESKQNCSHFPTPLLASEDRRETGLFLPSAAQKMKKAHFLKTWFRSNPTKTKKARFSTASLAKELTHPLLVSLLLKEKQDG, PTDPFLGLRLGLHLQKVFHQSHAEYSGAPPPPPAPSGLRFWNPSRIAHISQLLSWPQKTEERLGYSSHQLPRK, FCCSCCFFGGERWSKSPYCPQRMTPGTTFITMMKKEAEKRTRTLT, 또는 WRRNCKAPVSLRKSVQTPARSSPARPDRTRRLPSLGVPGQPWALGAAASRRCCCCCRSPLGSARSRSPATLALTPRATRSRCPGATWREAASWAE이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 GATA3 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, Cz는 PGRPLQTHVLPEPHLALQPLQPHADHAHADAPAIQPVLWTTPPLQHGHRHGLEPCSMLTGPPARVPAVPFDLHFCRSSIMKPKRDGYMFLKAESKIMFATLQRSSLWCLCSNH 또는 PRPRRCTRHPACPLDHTTPPAWSPPWVRALLDAHRAPSESPCSPFRLAFLQEQYHEA이다. 일부 관련된 실시양태에서, 신생항원성 펩티드는 AALSRHNVL, ADAPAIQPV, ADAPAIQPVL, AESKIMFAT, AESKIMFATL, AIQPVLWTT, ALQPLQPHA, APAIQPVLW, ARVPAVPFDL, ATLQRSSLW, AVPFDLHFCR, CSMLTGPPA, CSMLTGPPAR, DLHFCRSSI, DLHFCRSSIM, EPHLALQPL, ESKIMFATL, FATLQRSSL, FATLQRSSLW, FCRSSIMKPK, FDLHFCRSSI, FLKAESKIM, FLKAESKIMF, GPPARVPAV, GYMFLKAESK, HADAPAIQPV, HAHADAPAI, HFCRSSIMK, HLALQPLQPH, HMSSLSHISA, HPLQHGHRH, HPPSSLSFW, HRHGLEPCSM, IMFATLQRS, IMFATLQRSS, IMKPKRDGY, IMKPKRDGYM, KAESKIMFA, KIMFATLQR, KPKRDGYMF, KPKRDGYMFL, LALQPLQPH, LHFCRSSIM, LHFCRSSIMK, LKAESKIMF, LQHGHRHGL, LQPHADHAH, LQRSSLWCL, LQRSSLWCLC, LSFGPHHPL, LSFGPHPPL, LSFWTTPPL, LSHISALQPL, MFATLQRSSL, MFLKAESKI, MFLKAESKIM, MHPPSSLSFW, MKPKRDGYMF, MLTGPPARV, MSSLSHISA, MSSLSHISAL, NPAALSRHNV, PARVPAVPF, PAVPFDLHF, PEPHLALQPL, PPARVPAVPF, QPVLWTTPPL, RHGLEPCSM, RHNVLPEPHL, RSSIMKPKR, SALQPLQPH, SHISALQPL, SIMKPKRDGY, SLSFGPHHPL, SLSFGPHPPL, SLSFWTTPPL, SMLTGPPAR, SMLTGPPARV, SSLSHISAL, TLQRSSLWCL, TTPPLQHGHR, VLPEPHLAL, VPAVPFDLHF, VPFDLHFCR, YMFLKAESK 또는 YMFLKAESKI가 아니다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 MLL2 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, Cz는 TRRCHCCPHLRSHPCPHHLRNHPRPHHLRHHACHHHLRNCPHPHFLRHCTCPGRWRNRPSLRRLRSLLCLPHLNHHLFLHWRSRPCLHRKSHPHLLHLRRLYPHHLKHRPCPHHLKNLLCPRHLRNCPLPRHLKHLACLHHLRSHPCPLHLKSHPCLHHRRHLVCSHHLKSLLCPLHLRSLPFPHHLRHHACPHHLRTRLCPHHLKNHLCPPHLRYRAYPPCLWCHACLHRLRNLPCPHRLRSLPRPLHLRLHASPHHLRTPPHPHHLRTHLLPHHRRTRSCPCRWRSHPCCHYLRSRNSAPGPRGRTCHPGLRSRTCPPGLRSHTYLRRLRSHTCPPSLRSHAYALCLRSHTCPPRLRDHICPLSLRNCTCPPRLRSRTCLLCLRSHACPPNLRNHTCPPSLRSHACPPGLRNRICPLSLRSHPCPLGLKSPLRSQANALHLRSCPCSLPLGNHPYLPCLESQPCLSLGNHLCPLCPRSCRCPHLGSHPCRLS이다. 일부 관련된 실시양태에서, 신생항원성 펩티드는 APGPRGRTC, CHYLRSRNSA, CLRSHTCPPR, CLWCHACLHR, CPHLGSHPC, CPHRLRSLPR, CPLGLKSPL, CPPGLRNRI, CPPGLRSHTY, CPPRLRDHI, CPPSLRSHAY, CPRSCRCPH, CPRSCRCPHL, CSLPLGNHPY, CTCPPRLRSR, DHICPLSLR, EESPMSPHL, ESPMSPHLR, ESPMSPHLRY, EVSRLSPCL, GLKSPLRSQA, GLRNRICPL, GLRNRICPLS, GLRSHTYLR, GLRSHTYLRR, GLRSRTCPPG, HACPPGLRNR, HAYALCLRSH, HHLRTHLLPH, HLGSHPCRL, HLLPHHRRTR, HLRLHASPH, HLRLHASPHH, HLRSCPCSL, HLRTHLLPH, HLRTHLLPHH, HLRTPPHPH, HLRTPPHPHH, HLRYRAYPP, HLRYRAYPPC, HPCCHYLRSR, HPHHLRTHL, HPHHLRTHLL, HRLRSLPRPL, HTYLRRLRS, HTYLRRLRSH, HYLRSRNSA, KSPLRSQANA, LESQPCLSL, LHLRLHASPH, LHLRSCPCSL, LLPHHRRTR, LPCPHRLRSL, LPHHRRTRS, LPHHRRTRSC, LPLGNHPYL, LPRPLHLRL, LRLHASPHHL, LRNCTCPPRL, LRNHTCPPSL, LRNRICPLSL, LRSCPCSLPL, LRSHACPPGL, LRSHACPPNL, LRSHAYALCL, LRSHTCPPRL, LRSHTCPPSL, LRSHTYLRRL, LRSLPRPLHL, LRSQANALHL, LRTPPHPHHL, LRYRAYPPCL, LSLGNHLCPL, LSLRSHPCPL, LWCHACLHRL, MSPHLRYRA, MSPHLRYRAY, NLPCPHRLR, NLRNHTCPP, PMSPHLRYR, PPRLRSRTCL, PPSLRSHAY, RAYPPCLWCH, RDHICPLSL, RGRTCHPGL, RGRTCHPGLR, RLHASPHHL, RLHASPHHLR, RLRDHICPL, RLRDHICPLS, RLRNLPCPH, RLRNLPCPHR, RLRSHTCPP, RLRSHTCPPS, RLRSLPRPL, RLRSLPRPLH, RLRSRTCLL, RLRSRTCLLC, RLSPCLWCHA, RNHTCPPSL, RNHTCPPSLR, RNLPCPHRLR, RNRICPLSL, RNRICPLSLR, RPLHLRLHA, RPLHLRLHAS, RSCPCRWRSH, RSCPCSLPL, RSHACPPGL, RSHACPPGLR, RSHACPPNL, RSHACPPNLR, RSHAYALCL, RSHAYALCLR, RSHPCCHYL, RSHPCCHYLR, RSHPCPLGL, RSHPCPLGLK, RSHTCPPRL, RSHTCPPRLR, RSHTCPPSL, RSHTCPPSLR, RSHTYLRRL, RSHTYLRRLR, RSLPRPLHL, RSLPRPLHLR, RSQANALHL, RSQANALHLR, RSRNSAPGP, RSRNSAPGPR, RSRTCLLCL, RSRTCLLCLR, RSRTCPPGL, RSRTCPPGLR, RTCHPGLRSR, RTHLLPHHR, RTHLLPHHRR, RTPPHPHHL, RTPPHPHHLR, RTRSCPCRW, RTRSCPCRWR, RWRSHPCCH, RWRSHPCCHY, RYRAYPPCL, RYRAYPPCLW, SHAYALCLR, SLGNHLCPL, SLPLGNHPY, SLPLGNHPYL, SLPRPLHLR, SLPRPLHLRL, SLRNCTCPPR, SLRSHACPPG, SLRSHAYAL, SLRSHAYALC, SLRSHPCPL, SLRSHPCPLG, SPHHLRTPP, SPHHLRTPPH, SPHLRYRAY, SPLRSQANAL, SPMSPHLRY, SPMSPHLRYR, SQANALHLR, SQANALHLRS, VSRLSPCLW, WRSHPCCHY, WRSHPCCHYL, YLPCLESQPC, YLRRLRSHTC, YLRSRNSAP, 또는 YLRSRNSAPG가 아니다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 PTEN 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, Cz는SWKGTNWCNDMCIFITSGQIFKGTRGPRFLWGSKDQRQKGSNYSQSEALCVLL, KRTKCFTFG, PIFIQTLLLWDFLQKDLKAYTGTILMM, QKMILTKQIKTKPTDTFLQILR, GFWIQSIKTITRYTIFVLKDIMTPPNLIAELHNILLKTITHHS, NYSNVQWRNLQSSVCGLPAKGEDIFLQFRTHTTGRQVHVL, 또는 YQSRVLPQTEQDAKKGQNVSLLGKYILHTRTRGNLRKSRKWKSM이다. 일부 관련된 실시양태에서, 신생항원성 펩티드는 KMLKRTKCF, MLKRTKCFT, LKRTKCFTF, MLKRTKCFTF, KQNKMLKRTK, KMLKRTKCFT, 또는 NKMLKRTKCF가 아니다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 TP53 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, Cz는 SSQNARGCSPRGPCTSSSYTGGPCTSPLLAPVIFCPFPENLPGQLRFPSGLLAFWDSQVCDLHVLPCPQQDVLPTGQDLPCAAVG, GAAPTMSAAQIAMVWPLLSILSEWKEICVWSIWMTETLFDIVWWCPMSRLRLALTVPPSTTTTCVTVPAWAA, TGGPSSPSSHWKTPVVIYWDGTALRCVFVPVLGETGAQRKRISARKGSLTTSCPQGALSEHCPTTPAPLPSQRRNHWMENISPFRSVGVSASRCSES, FHTPARHPRPRHGHLQAVTAHDGGCEALPPP, CCPRTILNNGSLKTQVQMKLPECQRLLPPWPLHQQLLHRRPLHQPPPGPCHLLSLPRKPTRAATVSVWASCILGQPSL, VRKHFQTYGNYFLKTTFCPPCRPKQWMI, 또는 LARTPLPSTRCFANWPRPALCSCGLIPHPRPAPASAPWPSTSSHST이다. 일부 관련된 실시양태에서, 신생항원성 펩티드는 APASAPWPST, APPWPLHQQL, APWPSTSSH, ASCILGQPSL, ATVSVWASCI, CQRLLPPWPL, HQPPPGPCHL, HQQLLHRRPL, IEQWFTEDQV, KLPECQRLL, KPTRAATVSV, KTYQGSYGFV, KTYQGSYVS, KTYQGSYVSV, LLSLPRKPTR, LPPWPLHQQL, LPRKPTRAA, LPRKPTRAAT, LSLPRKPTR, MKLPECQRL, MKLPECQRLL, MPEAAPPWPL, PEAAPPWPL, PTRAATVSV, QMKLPECQR, QQLLHRRPL, QQLLHRRPLH, QRLLPPWPL, QWFTEDQVQM, RAATVSVWA, RLLPPWPLH, RMPEAAPPW, RPAPASAPW, SLPRKPTRA, SLPRKPTRAA, SQKTYQGSYV, STPRPAPASA, SYGFVWASC, SYGFVWASCI, SYVSVWASC, SYVSVWASCI, TEDQVQMKL, TPRPAPASA, TPRPAPASAP, TRAATVSVW, TVSVWASCI, TVSVWASCIL, TYQGSYGFV, TYQGSYGFVW, TYQGSYVSV, TYQGSYVSVW, VSVWASCIL, WPLHQQLLH, WPSTSSHST, YGFVWASCI, YGFVWASCIL, YQGSYGFVW, YQGSYGFVWA, YQGSYVSVW, YQGSYVSVWA, YVSVWASCI, 또는 YVSVWASCIL이 아니다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 VHL 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, Cz는 ELQETGHRQVALRRSGRPPKCAERPGAADTGAHCTSTDGRLKISVETYTVSSQLLMVLMSLDLDTGLVPSLVSKCLILRVK, KSDASRLSGA, RTAYFCQYHTASVYSERAMPPGCPEPSQA, TRASPPRSSSAIAVRASCCPYGSTSTASRSPTQRCRLARAAASTATEVTFGSSEMQGHTMGFWLTKLNYLCHLSMLTDSLFLPISHCQCIL, SSLRITGDWTSSGRSTKIWKTTQMCRKTWSG, 또는 RRRRGGVGRRGVRPGRVRPGGTGRRGGDGGRAAAARAALGELARALPGHLLQSQSARRAARMAQLRRRAAALPNAAAWHGPPHPQLPRSPLALQRCRDTRWASG이다. 일부 관련된 실시양태에서, 신생항원성 펩티드는 CHLSMLTDSL, EMQGHTMGF, FLPISHCQC, FLPISHCQCI, FRDAGHTMGF, FWLTKLNYL, GFWLTKLNY, GFWLTKLNYL, GSSEMQGHTM, HLSMLTDSL, HLSMLTDSLF, HSYRGHLGSS, HTMGFWLTK, HTMGFWLTKL, KERCLQLSGA, KLNYLCHLSM, LFRDAGHTM, LNYLCHLSM, LNYLCHLSML, LPISHCQCI, LPISHCQCIL, LSMLTDSLF, LSMLTDSLFL, LTDSLFLPI, LTKLNYLCHL, MGFWLTKLNY, MLTDSLFLPI, MQGHTMGFW, MQGHTMGFWL, NYLCHLSML, RDAGHTMGF, RDAGHTMGFW, RGHLGSSEM, RIHSYRGHLG, SEMQGHTMG, SEMQGHTMGF, SLFLPISHC, SMLTDSLFL, SSEMQGHTM, TKLNYLCHL, TLKERCLQL, TMGFWLTKL, WLFRDAGHT, WLFRDAGHTM, YLCHLSMLT, 또는 YRGHLGSSEM이 아니다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 제2 유전자와 제1 유전자의 융합에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 제2 유전자와 제1 유전자의 인 프레임 융합에 의해 코딩된다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 BCR 유전자 및 ABL 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 ERAEWRENIREQQKKCFRSFSLTSVELQMLTNSCVKLQTVHSIPLTINKEEALQRPVASDFEPQGLSEAARWNSKENLLAGPSENDPNLFVALYDFVASG 또는 ELQMLTNSCVKLQTVHSIPLTINKEDDESPGLYGFLNVIVHSATGFKQSSKALQRPVASDFEPQGLSEAARWNSKENLLAGPSENDPNLFVALYDFVASGD이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 C11orf95 유전자 및 RELA 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 ISNSWDAHLGLGACGEAEGLGVQGAEEEEEEEEEEEEEGAGVPACPPKGPELFPLIFPAEPAQASGPYVEIIEQPKQRGMRFRYKCEGRSAGSIPGERSTD이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 CBFB 유전자 및 MYH11 유전자에 의해 코딩된다. LQRLDGMGCLEFDEERAQQEDALAQQAFEEARRRTREFEDRDRSHREEMEVHELEKSKRALETQMEEMKTQLEELEDELQATEDAKLRLEVNMQALKGQF이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 CD74 유전자 및 ROS1 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 KGSFPENLRHLKNTMETIDWKVFESWMHHWLLFEMSRHSLEQKPTDAPPKAGVPNKPGIPKLLEGSKNSIQWEKAEDNGCRITYYILEIRKSTSNNLQNQ이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 EGFR 유전자 및 SEPT14 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 제1 천연 폴리펩티드는 한 유전자에 의해 코딩되고, 제2 천연 폴리펩티드는 LPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQLQDKFEHLKMIQQEEIRKLEEEKKQLEGEIIDFYKMKAASEALQTQLSTD에 의해 코딩된다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 EGFR 유전자 및 EGFR 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 MRPSGTAGAALLALLAALCPASRALEEKKGNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKD이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 EML4 유전자 및 ALK 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 SWENSDDSRNKLSKIPSTPKLIPKVTKTADKHKDVIINQAKMSTREKNSQVYRRKHQELQAMQMELQSPEYKLSKLRTSTIMTDYNPNYCFAGKTSSISDL이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 FGFR3 유전자 및 TACC3 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 EGHRMDKPANCTHDLYMIMRECWHAAPSQRPTFKQLVEDLDRVLTVTSTDVKATQEENRELRSRCEELHGKNLELGKIMDRFEEVVYQAMEEVQKQKELS이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 NAB 유전자 및 STAT6 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 RDNTLLLRRVELFSLSRQVARESTYLSSLKGSRLHPEELGGPPLKKLKQEATSKSQIMSLWGLVSKMPPEKVQRLYVDFPQHLRHLLGDWLESQPWEFLVGSDAFCC이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 NDRG1 유전자 및 ERG 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 MSREMQDVDLAEVKPLVEKGETITGLLQEFDVQEALSVVSEDQSLFECAYGTPHLAKTEMTASSSSDYGQTSKMSPRVPQQDW이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 TMPRSS2 유전자 및 ERG 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 MALNSEALSVVSEDQSLFECAYGTPHLAKTEMTASSSSDYGQTSKMSPRVPQQDW이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 PML 유전자 및 RARA 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 VLDMHGFLRQALCRLRQEEPQSLQAAVRTDGFDEFKVRLQDLSSCITQGKAIETQSSSSEEIVPSPPSPPPLPRIYKPCFVCQDKSSGYHYGVSACEGCKG 또는 RSSPEQPRPSTSKAVSPPHLDGPPSPRSPVIGSEVFLPNSNHVASGAGEAAIETQSSSSEEIVPSPPSPPPLPRIYKPCFVCQDKSSGYHYGVSACEGCKG이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 RUNX1 유전자 및 CBFA2T1(RUNX1T1) 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 VARFNDLRFVGRSGRGKSFTLTITVFTNPPQVATYHRAIKITVDGPREPRNRTEKHSTMPDSPVDVKTQSRLTPPTMPPPPTTQGAPRTSSFTPTTLTNGT이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 제1 유전자의 스플라이스 변이체의 엑손과 제1 유전자의 융합에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 제1 유전자의 크립틱 엑손과 제1 유전자의 융합에 의해 코딩된다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 AR-v7 유전자 및 AR-v7 유전자에 의해 코딩된 크립틱 엑손에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 AR 유전자의 스플라이스 변이체의 엑손을 포함하는 AR-v7 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 SCKVFFKRAAEGKQKYLCASRNDCTIDKFRRKNCPSCRLRKCYEAGMTLGEKFRVGNCKHLKMTRP이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 제2 유전자와 제1 유전자의 융합에 의해 코딩되고, 여기서, 펩티드는 융합으로부터 생성된 프레임 밖 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 AC011997.1 유전자 및 LRRC69 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, y는 1이다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 MAGAPPPASLPPCSLISDCCASNQRDSVGVGPSEPGNNIKICNESASRK이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 EEF1DP3 유전자 및 FRY 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, y는 1이다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 HGWRPFLPVRARSRWNRRLDVTVANGRSWKYGWSLLRVPQVNGIQVLNVSLKSSSNVISY이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 MAD1L1 유전자 및 MAFK 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, y는 0이다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 RLKEVFQTKIQEFRKACYTLTGYQIDITTENQYRLTSLYAEHPGDCLIFKLRVPGSSVLVTVPGL이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 PPP1R1B 유전자 및 STARD3 유전자에 의해 코딩된다. 관련된 실시양태에서, y는 1이다. 관련된 실시양태에서, AxByCz는 AEVLKVIRQSAGQKTTCGQGLEGPWERPPPLDESERDGGSEDQVEDPALSALLLRPRPPRPEVGAHQDEQAAQGADPRLGAQPACRGLPGLLTVPQPEPLLAPPSAA이다.
일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 표 1에 제시된 펩티드 서열 중 하나 이상의 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 표 1A, 표 1B, 표 1C, 표 1D, 표 1E, 및/또는 표 1F에 제시된 펩티드 서열 중 하나 이상의 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 표 2에 제시된 펩티드 서열 중 하나 이상의 것을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 단리된 신생항원성 펩티드는 표 2A, 표 2B, 표 2C, 및/또는 표 2D에 제시된 펩티드 서열 중 하나 이상의 것을 포함하지 않는다.
신생항원 폴리뉴클레오티드
본원에 기술된 각각의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또한 본 발명의 일부이다. 당업계의 숙련가가 이해하는 바와 같이, 다양한 핵산 서열은 유전자 코드의 중복에 기인하여 동일한 펩티드를 코딩할 수 있다. 각각의 이들 핵산은 본 발명의 범주 내에 포함된다. 펩티드를 코딩하는 핵산은 DNA 또는 RNA, 예를 들어, mRNA, 또는 DNA 및 RNA의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드를 코딩하는 핵산은 자기 증폭 mRNA이다(문헌 [Brito et al., Adv. Genet. 2015; 89:179-233]). 본원에 기술된 펩티드를 코딩하는 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 범주 내에 포함된다
"RNA"라는 용어는 "mRNA"를 포함하고, 일부 실시양태에서는 "mRNA"에 관한 것이다. "mRNA"라는 용어는 "메신저 RNA(messenger-RNA)"를 의미하고, DNA 주형을 사용하여 생성되고, 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 "전사체"에 관한 것이다. 전형적으로, mRNA는 5'-UTR, 단백질 코딩 영역, 및 3'-UTR을 포함한다. mRNA은 오직 세포내에서 및 시험관내에서 제한된 반감기를 가진다. 일부 실시양태에서, mRNA는 자기 증폭 mRNA이다. 본 발명과 관련하여, mRNA는 DNA 주형으로부터의 시험관내 전사에 의해 생성될 수 있다. 시험관내 전사 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 상업적으로 이용가능한 시험관내 전사용 키트가 다양하게 존재한다.
RNA의 안정성 및 번역 효율은 필요에 따라 변형될 수 있다. 예를 들어, RNA는 안정화 효과를 가지고/거나, RNA의 번역 효율을 증가시키는 하나 이상의 변형에 의해 안정화될 수 있고, 그의 번역은 증가될 수 있다. 상기 변형은 예를 들어, PCT/EP2006/009448(본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다. 본 발명에 따라 사용되는 RNA의 발현을 증가시키기 위해, GC-함량을 증가시켜 mRNA 안정성을 증가시키고, 코돈 최적화를 수행함으로써 세포내에서의 번역을 증진시키기 위해, 발현되는 펩티드 또는 단백질의 서열은 변경시키지 않으면서, 코딩 영역 내에서, 즉, 발현되는 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 서열 내에서 변형될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 RNA와 관련하여 "변형"이라는 용어는 상기 RNA에는 자연적으로 존재하지 않는 RNA의 임의 변형을 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용되는 RNA는 캡핑되지 않은 5'-트리포스페이트를 가지지 않는다. 상기 캡핑되지 않은 5'-트리포스페이트의 제거는 RNA를 포스파타제로 처리함으로써 달성될 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 RNA는 그의 안정성을 증가시키고/거나, 세포독성을 감소시키기 위해 변형된 리보뉴클레오티드를 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용되는 RNA에서, 시티딘을 대신하여 5-메틸시티딘으로 부분적으로 또는 완전히, 예를 들어, 완전히 치환된다. 대안적으로 또는 추가로, 일부 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용되는 RNA에서, 우리딘을 대신하여 슈도우리딘으로 부분적으로 또는 완전히, 예를 들어, 완전히 치환된다.
일부 실시양태에서 "변형"이라는 용어는 RNA에 5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 제공하는 것에 관한 것이다. "5'-캡"이라는 용어는 mRNA 분자의 5'-단부 상에서 발견되는 캡 구조를 지칭하며, 이는 일반적으로 특이 5'에서 5'로의 트리포스페이트 결합을 통해 mRNA에 연결된 구아노신 뉴클레오티드로 구성된다. 일부 실시양태에서, 상기 구아노신은 7번 위치에서 메틸화된다. "종래의 5'-캡"이라는 용어는 7-메틸구아노신 캡(m G)으로의 자연적으로 발생된 RNA 5'-캡을 지칭한다. 본 발명과 관련하여, "5'-캡"이라는 용어는 RNA 캡 구조와 유사하고, RNA에 부착되어 있다면, 생체내 및/또는 세포내에서 RNA를 안정화시키고/거나, RNA 번역을 증진시킬 수 있는 능력을 소지하도록 변형된 5'-캡 유사체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 신생항원 펩티드를 코딩하는 mRNA는 그를 필요로 하는 피험체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 RNA, 올리고리보뉴클레오티드, 및 폴리리보뉴클레오티드 분자, 상기를 포함하는 유전자 요법 벡터, 상기를 포함하는 유전자 요법 방법 및 유전자 전사 침묵화 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 투여되는 mRNA는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오시드를 포함한다.
본원에 기술된 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 화학 기술에 의해, 예를 들어, 문헌 [Matteucci, et al., J. Am. Chem. Soc. 103:3185 (1981)]의 포스포트리에스테르 방법에 의해 합성될 수 있다. 유사체를 포함하거나, 또는 그로 구성된 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 간단하게, 천연 에피토프를 코딩하는 핵산 염기(들)를 대신하여 적절하고, 원하는 핵산(들)으로 치환함으로써 제조될 수 있다.
본원에 기술된 신생항원성 펩티드를 제조하고, 투여하는 데 적합한 다수의 벡터 및 숙수 시스템은 당업자에게 공지되어 있고, 이는 상업적으로 이용가능하다. 하기 벡터가 예로서 제공된다. 박테리아성: pQE70, pQE60, pQE-9(Qiagen), pBS, pD10, 파지스크립트, psiX174, pBluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A(Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5(Pharmacia); pCR (Invitrogen). Eukaryotic: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG(Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL(Pharmacia); p75.6(Valentis); pCEP(Invitrogen); pCEI(Epimmune). 그러나, 숙주에서 복제가능하고, 생존가능한 한, 임의의 다른 플라스미드 또는 벡터가 사용될 수 있다.
적절한 숙주의 대표적인 예로서, 하기의 것이 언급될 수 있다: 박테리아 세포, 예컨대, E. 콜라이(E. coli), 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 및 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 속 내의 다양한 종; 진균 세포, 예컨대, 효모; 곤충 세포, 예컨대, 초파리 및 Sf9; 동물 세포, 예컨대, 문헌 [Gluzman, Cell 23:175 (1981)]에 기술된, 원숭이 신장 섬유아세포의 COS-7 세포주, 및 화합성 벡터를 발현할 수 있는 다른 세포주, 예를 들어, C127, 3T3, CHO, HeLa 및 BHK 세포주 또는 바우스 흑색종(Bowes melanoma); 식물 세포 등. 적절한 숙주를 선택하는 것은 본원의 교시로부터 당업자의 범주 내에 있는 것으로 간주된다.
따라서, 본 발명은 또한 벡터, 및 본원에 기술된 신생항원성 펩티드의 제조 및 투여에 유용한 발현 벡터, 및 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
숙주 세포는 예를 들어, 클로닝 벡터, 또는 발현 벡터일 수 있는 벡터로 유전적으로 조작된다(형질도입되거나, 형질전환되거나, 또는 형질감염된다). 벡터는 예를 들어, 플라스미드, 바이러스 입자, 파지 형태 등일 수 있다. 조작된 숙주 세포는 프로모터를 활성화시키기 위해, 형질전환체를 선별하기 위해 또는 폴리뉴클레오티드를 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 종래의 영양 배지 중에서 배양될 수 있다. 배양 조건, 예컨대, 온도, pH 등은 앞서 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 사용된 것이고, 이는 당업계의 숙련가에게 자명할 것이다.
본원에 기술된 신생항원성 펩티드 발현을 위해, 코딩 서열은 작동 가능하게 연결된 출발 및 정지 코돈, 프로모터 및 종결자 영역과 함께, 및 일부 실시양태에서, 복제 시스템과 제공됨으로써 원하는 세포 숙주에서의 발현을 위한 발현 벡터를 제공하게 될 것이다. 예를 들어, 원하는 코딩 서열의 삽입을 위해 편리한 제한 부위를 함유하는 플라스미드 중에 박테리아 숙주와 화합성을 띠는 프로모터 서열가 제공된다. 생성된 발현 벡터는 적합한 박테리아 숙주 내로 형질전환된다.
일반적으로, 재조합 발현 벡터는 복제 기점 및 숙주 세포의 형질전환을 허용하는 선별가능한 마커, 예컨대, E. 콜라이(E. coli)의 암피실린 내성 유전자 및 S. 세레비시아에(S. cerevisiae) TRP1 유전자, 및 하류 구조 서열의 전사를 지시하는 고도로 발현된 유전자로부터 유래된 프로모터를 포함할 것이다. 상기 프로모터는 그 중에서도 특히 해당 효소, 예컨대, 3-포스포글리세레이트 키나제(PGK: 3-phosphoglycerate kinase), 산성 포스파타제, 또는 열 쇼크 단백질을 코딩하는 오페론으로부터 유래된 것일 수 있다. 이종성 구조 서열은 적절한 상에서 번역 개시 및 종결 서열, 및 일부 실시양태에서, 번역된 단백질의 원형질막주위 공간 또는 세포외 배지 내로의 분비를 지시할 수 있는 리더 서열과 함께 어셈블리된다. 경우에 따라, 이종성 서열은 원하는 특징, 예컨대, 발현된 재조합 생성물의 안정화 또는 간소화된 정제를 부여하는, N-말단 확인 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 코딩할 수 있다.
적합한 벡터 및 제어 서열을 사용하는, 효모, 곤충 또는 포유동물 세포 숙주 또한 사용될 수 있다. 포유동물 발현 시스템의 예로는 [Gluzman, Cell 23:175 (1981)]에 기술된, 원숭이 신장 섬유아세포의 COS-7 세포주, 및 화합성 벡터를 발현할 수 있는 다른 세포주, 예를 들어, C127, 3T3, CHO, HeLa 및 BHK 세포주를 포함한다. 포유동물 발현 벡터는 복제 기점, 적합한 프로모터 및 인핸서, 및 또한 임의의 필요한 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여자 및 수여자 부위, 및 전사 종결 서열, 및 5' 측면 비전사 서열을 포함할 것이다. 상기 프로모터는 바이러스 공급원, 예를 들면, 예컨대, 예컨대, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV-IE 프로모터) 또는 단순 허피스 바이러스 타입-1(HSV TK 프로모터)로부터 유래된 것일 수 있다. SV40 스플라이스, 및 폴리아데닐화 부위로부터 유래된 핵산 서열은 필요한 비전사된 유전자 요소를 제공하는 데 사용될 수 있다.
본원에 기술된 신생항원성 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한 유비퀴틴화 신호 서열, 및/또는 표적화 서열, 예컨대, 생성된 펩티드의 소포체로의 이동을 촉진시키는 소포체(ER: endoplasmic reticulum) 신호 서열을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 폴리뉴클레오티드는 인간 세포(예컨대, 수지상 세포를 비롯한 면역 세포)에 투여되고, 상기 세포에서 발현될 수 있다. 인간 코돈 선호도 표는 각 아미노산에 대한 코돈 선택을 가이드하는 데 사용될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 예컨대, 상기 기술된 것과 같은, 에피토프 및/또는 유사체 사이에 스페이서 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 에피토프 및/또는 유사체(및/또는 CTL, HTL, B 세포 에피토프)에 인접한 자연적으로 발생된 측면 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 신생항원성 펩티드는 또한 바이러스 또는 박테리아 벡터에 의해 투여/발현될 수 있다. 발현 벡터의 예로는 약독화된 바이러스 숙주, 예컨대, 백시니아 또는 계두를 포함한다. 상기 접근법의 예로서, 백시니아 바이러스는 본원에 기술된 신생항원성 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현하기 위한 벡터로서 사용된다. 면역화 프로토콜에서 유용한 백시니아 벡터 및 방법은 예컨대, 미국 특허 번호 4,722,848에 기술되어 있다. 또 다른 벡터는 BCG(바실루스 칼메트 구에린: Bacille Calmette Guerin)이다. BCG 벡터는 문헌 [Stover et al., Nature 351:456-460 (1991)]에 기술되어 있다. 본원에 기술된 신생항원성 폴리펩티드의 치료적 투여 또는 면역화에 유용한 매우 다양한 다른 벡터, 예컨대, 아데노 및 아데노 연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 살모넬라 타이피(Salmonella typhi) 벡터, 해독된 탄저균 독소 벡터, 센다이 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 카나리아 두창 벡터, 및 계두 벡터 등은 본원의 기술내용으로부터 당업자에게 자명할 것이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 변형된 백시니아 안카라(VA: Modified Vaccinia Ankara)(예컨대, Bavarian Noridic (MVA-BN))이다.
인간 표적 세포에서의 발현이 확실히 이루어지도록 하기 위해 당업자에게 널리 알려져 있는 표준 조절 서열을 벡터에 포함시킬 수 있다. 하기의 여러 벡터 요소가 바람직할 수 있다: 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 미니유전자 삽입을 위한 하류 클로닝 부위를 포함하는 프로모터; 효율적인 전사 종결을 위한 폴리아데닐화 신호; E. 콜라이 복제 기점; 및 E. 콜라이 선별가능한 마커(예컨대, 암피실린 또는 카나마이신 내성). 예컨대, 인간 사이토메갈로바이러스(hCMV: human cytomegalovirus) 프로모터와 같은 다수의 프로모터가 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다. 다른 적합한 프로모터 서열에 대하여 미국 특허 번호 5,580,859 및 5,589,466을 참조한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 CMV-IE 프로모터이다.
본원에 기술된 폴리뉴클레오티드는 전사된 영역 중에 하나 이상의 합성 또는 자연적으로 발생된 인트론을 포함할 수 있다. 포유동물 세포에서 mRNA 안정화 서열 및 복제를 위한 서열을 포함하는 것 또한 폴리뉴클레오티드 발현을 증가시키기 위한 거승로 간주될 수 있다.
추가로, 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드는 면역자극성 서열(ISS 또는 CpG)을 포함할 수 있다. 이들 서열은 면역원성을 증진시키기 위해 벡터 중 폴리뉴클레오티드 코딩 서열 밖에 포함될 수 있다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 분자의 크기는 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120개 이상의 아미노 분자 잔기, 및 그 안에서 추론가능한 임의 범위의 것을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 항원성 펩티드 분자는 50개 이하의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 항원성 펩티드 분자는 내지 약 20 내지 약 30개의 아미노산이다. 더욱 긴 펩티드가 여러 방식으로 디자인될 수 있다. 예를 들어, HLA 결합 영역이 예측 또는 공지되어 있을 때, 더욱 긴 펩티드는 각각 상응하는 유전자 생성물의 N 및 C 말단으로 0-10개의 아미노산으로 이루어진 연장부를 포함하는 개별 결합 펩티드로 구성될 수 있다. 더욱 긴 펩티드는 또한 각각에 대해 연장된 서열을 포함하는 결합 펩티드 중 일부 또는 그들 모두의 연결로 구성될 수 있다. 또 다른 경우에서, 시퀀싱 결과, (예컨대, 신규한 펩티드 서열을 유도하는 프레임시프트, 리드-쓰루 또는 인트론 포함에 기인하는) 긴(>10개 잔기) 에피토프 서열이 이환된 조직에 존재하는 것으로 나타났을 때, 더욱 긴 펩티드는 전장의 신규한 질환 특이적 아미노산으로 구성될 수 있다. 두 경우 모두에서, 더욱 긴 펩티드를 사용하는 것이 항원 제시 세포, 예컨대, 수지상 세포에 의한 내인성 프로세싱을 필요로 하고, 더욱 효과적인 항원 제시 및 T 세포 반응 유도를 초래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 연장된 서열은 폴리펩티드의 생화학적 특성(특성, 예컨대, 가용성 또는 안정성)을 개선시키기 위해, 또는 펩티드의 효율적인 프로테아좀 프로세싱 가능성을 개선시키기 위해 변경된다.
항원성 펩티드 및 폴리펩티드는 HLA 단백질에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원성 펩티드는 상응하는 천연/야생형 펩티드보다 더욱 큰 친화도로 HLA 단백질에 결합할 수 있다. 항원성 펩티드는 약 1,000 nM 미만, 약 500 nM 미만, 약 250 nM 미만, 약 200 nM 미만, 약 150 nM 미만, 약 100 nM 미만, 또는 약 50 nM 미만인 IC50을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원성 펩티드는 피험체에게 투여되었을 때, 자가면역 반응을 유도하지 않고/거나, 면역학적 관용을 일으키지 않는다.
본 발명은 또한 복수 개의 항원성 펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 항원성 펩티드에 대한 언급은 펩티드를 피험체의 세포(예컨대, 핵산) 내로 도입시킬 수 있는 임의의 적합한 전달 방식을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 적어도 2개 이상의 항원성 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500개의 독특한 펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 표 1로부터의 적어도 하나의 펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 표 1로부터의 적어도 하나의 펩티드 및 표 1로부터의 적어도 하나의 다른 펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 표 1로부터의 적어도 하나의 펩티드 및 표 2로부터의 적어도 하나의 다른 펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 적어도 20개의 독특한 펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 최대 20개의 독특한 펩티드를 함유한다. 본 발명에 따라, 2개 이상의 독특한 펩티드는 동일한 폴리펩티드로부터 유래된 것일 수 있다. 예를 들어, 항원성 돌연변이가 폴리펩티드를 코딩할 경우, 2개 이상의 항원성 펩티드는 폴리펩티드로부터 유래된 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드로부터 유래된 2개 이상의 항원성 펩티드는 폴리펩티드에 걸쳐 있는 타일화된 어레이를 포함할 수 있다(예컨대, 항원성 펩티드는 폴리펩티드의 일부분 또는 그들 모두에 걸쳐 있는 일련의 중첩 항원성 펩티드를 포함할 수 있다). 항원성 펩티드는 임의의 단백질 코딩 유전자로부터 유래된 것일 수 있다. 항원성 펩티드는 인간 암에서의 돌연변이로부터, 또는 감염원 또는 자가면역 질환으로부터 유래된 것이다.
항원성 펩티드, 폴리펩티드, 및 유사체는 보통은 단백질의 일부분이 아닌 추가의 화학적 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 상기 유도체화된 모이어티는 가용성, 생물학적 반감기, 단백질의 흡착, 또는 결합 친화도를 개선시킬 수 있다. 모이어티는 또한 단백질의 임의의 바람직한 부작용 등을 감소시키거나, 또는 제거할 수 있다. 상기 모이어티에 관한 개요는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000)]에서 살펴볼 수 있다. 예를 들어, 원하는 활성을 갖는 항원성 펩티드 및 폴리펩티드는 원하는 MHC 분자에 결합하고, 적절한 T 세포를 활성화시키는, 비변형된 펩티드의 생물학적 활성을 실질적으로 모두 증가시키거나, 또는 적어도 유지시키면서, 예컨대, 개선된 약리학적 특징과 같은 특정의 원하는 속성을 제공하기 위해 필요에 따라 변형될 수 있다. 예를 들어, 항원성 펩티드 및 폴리펩티드는 예컨대, 보존적이든 또는 비보존적이든 치환과 같은 다양한 변이가 이루어질 수 있고, 여기서, 상기 변이는 예컨대, 개선된 MHC 결합과 같이, 그의 사용에 있어 특정의 이점을 제공할 수 있다. 상기 보존적 치환은 아미노산 잔기를, 생물학적 및/또는 화학적으로 유사한 또 다른 아미노산 잔기로 대체하는 것, 예컨대, 한 소수성 잔기를 또 다른 것 대신으로, 또는 한 극성 잔기를 또 다른 것 대신으로 대체하는 것을 포함한다. 단일 아미노산 치환의 효과는 또한 D-아미노산을 사용하여 프로빙될 수 있다. 상기 변형은 예컨대, 문헌 [Merrifield, Science 232:341-347 (1986)], [Barany & Merrifield, The Peptide, Gross & Meienhofer, eds. (N.Y., Academic Press), pp. 1-284 (1979)]; 및 [Stewart & Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (Rockford, III., Pierce), 2d Ed. (1984)]에 기술된 바와 같이, 널리 공지된 펩티드 합성 방법을 사용하여 이루어질 수 있다.
항원성 펩티드는 또한 화합물의 아미노산 서열을 연장시키거나, 또는 단축시킴으로써, 예컨대, 아미노산의 부가 또는 결실에 의해 변형될 수 있다. 항원성 펩티드, 폴리펩티드, 또는 유사체는 또한 특정 잔기의 순서 또는 조성을 변경시킴으로써 변형될 수 있다. 생물학적 활성에 필수적인 특정 아미노산 잔기, 예컨대, 중요한 접촉 부위에 있는 것 또는 보존적 잔기는 일반적으로 생물학적 활성에 대하여 유해한 효과를 미치지 않으면서 변경되지 않아야 함을 당업자는 이해할 것이다. 중요하지 않은 아미노산은 단백질에서 자연적으로 발생된 것, 예컨대, L-a-아미노산, 또는 그의 D-이성질체로 제한될 필요는 없지만, 이는 비천연 아미노산, 예컨대, β-γ-δ 아미노산 뿐만 아니라, L-a-아미노산의 다수의 유도체도 포함할 수 있다.
항원 펩티드는 정전하, 소수성 등인 MHC 결합에 미치는 효과를 측정하기 위해 단일 아미노산 치환과 함께 일련의 펩티드를 이용함으로써 항원 펩티드를 최적화할 수 있다. 예를 들어, 일련의 양으로 하전된 (예컨대, Lys 또는 Arg) 또는 음으로 하전된 (예컨대, Glu) 아미노산 치환은 펩티드의 길이를 따라 이루어질 수 있고, 이를 통해 다양한 MHC 분자 및 T 세포 수용체에 대하여 상이한 패턴의 감수성이 밝혀질 수 있다. 추가로, 작은, 상대적으로 중성인 모이어티, 예컨대, Ala, Gly, Pro, 또는 유사한 잔기를 이용한 다중 치환이 사용될 수 있다. 치환기는 동종올리고머 또는 이종올리고머일 수 있다. 치환되거나, 부가되는 잔기의 개수 및 유형은 필수 접촉 지점 사이에 필요한 간격, 및 추구되는 특정 기능적 속성(예컨대, 소수성 대 친수성)에 의존한다. 모체 펩티드의 친화도와 비교하여, MHC 분자 또는 T 세포 수용체에 대한 결합 친화도 증가 또한 상기 치환에 의해 달성될 수 있다. 어느 경우에서든, 상기 치환은 예를 들어, 결합을 방해할 수 있는 입체 및 전하 간섭을 회피하도록 선택된 아미노산 잔기 또는 다른 분자 단편을 사용하여야 한다. 아미노산 치환은 전형적으로 단일 잔기의 치환이다. 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 임의의 조합은 조합될 수 있고, 이로써, 최종 펩티드에 이르게 될 수 있다.
항원성 펩티드는 원하는 속성을 제공하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, CTL 활성을 유도할 수 있는 펩티드의 능력은, T 헬퍼 세포 반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 에피토프를 함유하는 서열에의 결합에 의해 증진될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역원성 펩티드/T 헬퍼 접합체는 스페이서 분자에 의해 연결된다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 생리적 조건하에서 실질적으로 하전되지 않는, 상대적으로 작고, 중성인 분자, 예컨대, 아미노산 또는 아미노산 모방체를 포함한다. 스페이서는 예컨대, Ala, Gly, 또는 비극성 아미노산 또는 중성 극성 아미노산의 다른 중성 스페이서로부터 선택될 수 있다. 경우에 따라, 본 스페이서는 동일한 잔기로 구성될 필요는 없고, 따라서, 이는 이종올리고머 또는 동종올리고머일 수 있다는 것을 이해할 것이다. 항원성 펩티드는 펩티드의 아미노 또는 카르복시 말단에서 직접 또는 스페이서를 통해 T 헬퍼 펩티드에 연결될 수 있다. 항원성 펩티드 또는 T 헬퍼 펩티드의 아미노 말단은 아실화될 수 있다. 예시적인 T 헬퍼 펩티드는 파상풍 톡소이드 830-843, 인플루엔자 307-319, 말라리아 포자소체 382-398 및 378- 389를 포함한다.
본 발명은 적어도 부분적으로는 환자의 면역계에 하나 이상의 질환 특이적 항원을 제시하는 능력에 기초한다. 당업자는 본 개시내용 및 당업계의 지식으로부터 상기 질환 특이적 항원을 제조하기 위한 다양한 방식이 존재한다는 것을 이해할 것이다. 일반적으로, 상기 질환 특이적 항원은 시험관내 또는 생체내에서 제조될 수 있다. 질환 특이적 항원은 펩티드 또는 폴리펩티드로서 시험관내에서 제조될 수 있으며, 이는 이어서 백신 또는 면역원성 조성물로 제제화되고, 피험체에게 투여될 수 있다. 본원에서 추가로 상세히 기술되는 바와 같이, 상기 시험관내 제조는 당업자에게 알려져 있는 다양한 방법, 예를 들어, 펩티드 합성, 또는 다양한 박테리아, 진핵 또는 바이러스 재조합 발현 시스템 중 임의의 것에서의 DNA 또는 RNA 분자로부터의 펩티드/폴리펩티드의 발현, 이어서, 발현된 펩티드/폴리펩티드의 정제에 의해 이루어질 수 있다. 대안적으로, 질환 특이적 항원은 질환 특이적 항원을 코딩하는 분자(예컨대, DNA, RNA, 바이러스 발현 시스템 등)를 피험체 내로 도입하여, 코딩된 질환 특이적 항원이 발현됨으로써 생체내에서 제조될 수 있다. 또한, 항원의 시험관내 및 생체내 제조 방법은 그가 약학 조성물 및 요법의 전달 방법에 관한 것임에 따라, 본원에서 추가로 기술된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 변형된 항원성 펩티드를 포함한다. 변형은 항원성 펩티드 그 자체의 1차 아미노산 서열을 변경시키지 않는 공유적 화학 변형을 포함할 수 있다. 변형을 통해 예를 들어, 생체내 반감기의 연장, 안정성의 증가, 제거 감소, 면역원성 또는 알레르기항원성의 변경, 특정 항체 유발능, 세포 표적화, 항원 흡수, 항원 프로세싱, MHC 친화성, MHC 안정성 또는 항원 제시와 같은 원하는 특성을 갖는 펩티드가 제조될 수 있다. 수행될 수 있는 항원성 펩티드에 대한 변이로는 캐리어 단백질에의 접합, 리간드에의 접합, 항체에의 접합, PEG화, 폴리시알릴화, HES화, 재조합 PEG 모방체, Fc 융합, 알부민 융합, 나노입자 부착, 나노미립자 캡슐화, 콜레스테롤 융합, 철 융합, 아실화, 아미드화, 글리코실화, 측쇄 산화, 인산화, 비오티닐화, 계면 활성 물질 첨가, 아미노산 모방체 첨가, 또는 비천연 아미노산 첨가를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
짧은 혈장 반감기 또는 프로테아제 분해에 대한 감수성과 연관된 문제는 폴리펩티드 서열을 임의의 다양한 비단백질성 중합체, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(PEG: polyethylene glycol), 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌(예를 들면, 전형적으로 단백질과 비단백질성 중합체, 예컨대, PEG, 둘 모두에 공유적으로 결합된 연결 모이어티를 통해)에 접합 또는 연결시키는 것을 포함하는 다양한 변형에 의해 극복될 수 있다. 상기 PEG 접합된 생체분자는 더욱 우수한 물리적 및 열적 안정성, 효소 분해에 대한 감수성에 대한 보호, 용해도 증가, 더 긴 생체내 순환 반감기 및 감소된 제거, 감소된 면역원성 및 항원성 및 감소된 독성을 포함하는 임상적으로 유용한 특성을 보유하는 것으로 나타났다.
폴리펩티드 서열에의 접합에 적합한 PEG는 일반적으로 실온에서 수용성이고, 일반식 R(0-CH2-CH2)nO-R을 가지며, 여기서, R은 수소 또는 보호기, 예를 들어, 알킬 또는 알카놀 기이고, n은 정수 1 내지 1,000이다. R이 보호기인 경우, 이는 일반적으로 1 내지 8개의 탄소를 가진다. 폴리펩티드 서열에 접합된 PEG는 선형 또는 분지형일 수 있다. 분지형 PEG 유도체, "스타-PEG" 및 다중의 아암이 있는 PEG가 본 개시내용에 의해 고려된다.
본 개시내용은 또한 PEG가 상이한 n 값을 가지고, 이로써, 각종의 상이한 PEG가 특정 비로 존재하는, 접합체의 조성물을 고려한다. 예를 들어, 일부 조성물은, n=1, 2, 3 및 4인, 접합체의 혼합물을 포함한다. 일부 조성물에서, n=1인 접합체의 백분율은 18-25%이고, n=2인 접합체의 백분율은 50-66%이고, n=3인 접합체의 백분율은 12-16%이고, n=4인 접합체의 백분율은 최대 5%이다. 상기 조성물은 당업계에 공지된 반응 조건 및 정제 방법에 의해 제조될 있다. 예를 들어, 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 접합체를 분리시킬 수 있고, 이어서, 예를 들어, 원하는 개수의 PEG가 부착된 접합체를 함유하는 분획을 확인하고, 비변형된 단백질 서열 및 다른 개수의 PEG가 부착된 접합체로부터 정제할 수 있다.
PEG는 말단 반응성 기("스페이서")를 통하여 본 개시내용의 폴리펩티드에 결합될 수 있다. 스페이서는 예를 들어, 폴리펩티드 서열 중 하나 이상의 유리 아미노 기 또는 카르복실 기와 폴리에틸렌 글리콜 사이의 결합을 매개하는 말단 반응성 기이다. 유리 아미노 기에 결합될 수 있는 스페이서를 갖는 PEG는, N-하이드록시 숙시닐이미드로 폴리에틸렌 글리콜의 숙신산 에스테르를 활성화시킴으로써 제조될 수 있는 N-하이드록시숙시닐이미드 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 유리 아미노 기에 결합될 수 있는 또 다른 활성화된 폴리에틸렌 글리콜은, 폴리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르를 시아누르산 염화물과 반응시킴으로써 제조될 수 있는 2,4-비스(0-메톡시폴리에틸렌글리콜)-6-클로로-s-트리아진이다. 유리 카르복실 기에 결합되는 활성화된 폴리에틸렌 글리콜은 폴리옥시 에틸렌디아민을 포함한다.
본 개시내용의 폴리펩티드 서열 중 하나 이상의 것의, 스페이스를 가진 PEG에의 접합은 다양한 종래 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 접합 반응은 pH 5 내지 10인 용액 중에서, 4℃ 내지 실온인 온도에서, 30분 내지 내지 20시간 동안 4:1 내지 30:1의 시약 대 단백질의 몰 비를 이용하여 수행될 수 있다. 반응 조건은 반응이 원하는 정도의 치환이 우세하게 진행되는 방향으로 진행되도록 선택될 수 있다. 일반적으로, 저온, 낮은 pH(예컨대, pH=5), 및 짧은 반응 시간은 부착되는 PEG의 수를 감소시키는 경향이 있는 반면, 고온, 중성 내지 높은 pH(예컨대, pH>7), 및 더욱 긴 반응 시간은 부착되는 PEG의 수를 증가시키는 경향이 있다. 당업계에 공지되어 있는 다양한 수단을 이용하여 상기 반응을 종결시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 반응은 반응 혼합물을 산성화시키고, 예컨대, -20℃에서 동결시킴으로써 종결된다.
본 개시내용은 또한 PEG 모방체의 사용을 고려한다. PEG의 속성(예컨대, 증진된 혈청 반감기)을 유지하는 한편, 수개의 추가적인 이로운 특성을 부여하는 재조합 PEG 모방체가 개발되었다. 예로서, PEG와 유사한 연장된 입체형태를 형성할 수 있는 간단한 폴리펩티드 쇄(예를 들어, Ala, Glu, Gly, Pro, Ser 및 Thr 포함)는 관심의 대상이 되는 펩티드 또는 단백질 약물(예컨대, Amunix' XTEN technology; 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)에 이미 융합되어 재조합적으로 제조될 수 있다. 이는 제조 프로세스 동안 추가적인 접합 단계의 필요성을 제거한다. 더욱이, 확립된 분자 생물학 기술은 폴리펩티드 쇄의 측쇄 조성의 조절을 가능하게 하여, 면역원성 및 제조 특성이 최적화되게 한다.
글리코실화는 단백질의 물리적 특성에 영향을 미칠 수 있고, 단백질 안정성, 분비 및 하위세포 국재화에도 또한 중요할 수 있다. 적절한 글리코실화는 생물학적 활성에 중요할 수 있다. 사실상, 단백질을 글리코실화시키기 위한 세포 프로세스가 결여된 박테리아(예컨대, E. 콜라이)에서 발현되는 경우, 진핵 유기체로부터의 일부 유전자는 그의 글리코실화의 결여로 인하여 활성이 거의 없거나, 활성이 없는 단백질이 회수된다. 글리코실화 부위의 부가는 아미노산 서열을 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 폴리펩티드에 대한 변경은 예를 들어, 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기(O 연결된 글리코실화 부위의 경우) 또는 아스파라긴 잔기(N 연결된 글리코실화 부위의 경우)의 부가 또는 그에 의한 치환에 의해 이루어질 수 있다. N 연결된 및 O 연결된 올리고당의 구조와 각 유형에서 관찰되는 당 잔기가 상이할 수 있다. 둘 모두에서 흔히 발견되는 당의 한가지 유형은 N-아세틸뉴라민산(이하 시알산으로 지칭된다)이다. 시알산은 보통 N 연결된 및 O 연결된 올리고당 둘 모두의 말단 잔기이며, 그의 음전하 때문에, 당단백질에 산성 성질을 부여할 수 있다. 본 개시내용의 실시양태는 N-글리코실화 변이체의 생성 및 이용을 포함한다.
본 개시내용의 폴리펩티드 서열은 경우에 따라 특히 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 미리 선택된 염기에서 돌연변이화함으로써 DNA 수준에서의 변이를 통하여 변경될 수 있고, 이로써, 원하는 아미노산으로 번역될 코돈이 생성되게 할 수 있다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 모이어티의 수를 증가시키는 또 다른 수단은 폴리펩티드에의 글리코시드의 화학적 또는 효소적 커플링에 의한 것이다. 탄수화물의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로, 또는 글리코실화되는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 치환에 의해 달성될 수 있다. 화학적 데글리코실화 기술이 공지되어 있고, 폴리펩티드 상의 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 다양한 엔도글리코시다제 및 엑소글리코시다제의 이용에 의해 달성될 수 있다.
접합을 위한 추가의 적합한 성분 및 분자는 예를 들어, 림프계로의 표적화를 위한 분자, 티로글로불린; 알부민, 예컨대, 인간 혈청 알부민(HAS: human serum albumin); 파상풍 톡소이드; 디프테리아 톡소이드; 폴리아미노산, 예컨대, 폴리(D-리신:D-글루탐산); 로타바이러스의 VP6 폴리펩티드; 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌, 인플루엔자 바이러스 핵단백질; 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH: keyhole limpet hemocyanin); 및 B형 간염 바이러스 코어 단백질 및 표면 항원; 또는 상기의 것의 임의 조합을 포함한다.
본 개시내용의 하나 이상의 폴리펩티드에의 알부민의 융합은 예를 들어, HSA를 코딩하는 DNA 또는 그의 단편이 하나 이상의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 DNA에 연결되도록 하는 유전자 조작에 의해 달성될 수 있다. 그 후에, 융합 폴리펩티드를 발현시키기 위해, 적합한 숙주를 예를 들어, 적합한 플라스미드 형태의 융합된 뉴클레오티드 서열로 형질전환시키거나, 또는 형질감염시킬 수 있다. 발현은 시험관내에서, 예를 들어, 원핵 또는 진핵 세포로부터, 또는 생체내에서, 예를 들어, 트랜스제닉 유기체로부터 수행될 수 있다. 본 개시내용의 일부 실시양태에서에서, 융합 단백질의 발현은 포유동물 세포주, 예를 들어, CHO 세포주에서 수행된다. 형질전환은 본원에서 광범위하게 사용되는 바, 그의 주변으로부터 외인성 유전 물질(외인성 DNA)의 직접적인 흡수, 도입 및 발현 및 세포 막(들)을 통한 흡수로부터 초래되는 세포의 유전적 변경을 지칭한다. 형질전환은 일부 박테리아 종에서 자연적으로 발생하지만, 이는 또한 다른 세포에서도 인공 수단에 의해 수행될 수 있다. 추가로, 알부민 그 자체는 그의 순환 반감기를 연장시키도록 변형될 수 있다. 하나 이상의 폴리펩티드에의 변형된 알부민의 융합은 상기 기술된 유전자 조작 기술에 의해, 또는 화학적 접합에 의해 달성될 수 있고; 생성되는 융합 분자는 비변형 알부민과의 융합의 반감기를 초과하는 반감기를 갖게 된다(WO2011/051489 참조). 접합된 지방산 쇄(아실화)를 통한 알부민 결합을 포함하는 수개의 알부민 결합 전략법이 직접적인 융합에 대한 대안으로서 개발되었다. 혈청 알부민이 지방산에 대한 수송 단백질이기 때문에, 알부민 결합 활성을 갖는 상기 천연 리간드는 작은 단백질 치료제의 반감기 연장을 위해 사용되었다. 예를 들어, 당뇨병에 대하여 승인된 제품인 인슐린 디터머(insulin determir)(LEVEMIR)는 유전자 변형 인슐린에 접합된 미리스틸 쇄를 포함하며, 이로써, 장기간 작용 인슐린 유사체가 생성된다.
또 다른 유형의 변형은 폴리펩티드 서열의 N 및/또는 C 말단에 하나 이상의 추가의 성분 또는 분자, 예를 들어, 또 다른 단백질(예를 들어, 피험체 단백질에 대해 이종성인 아미노산 서열을 갖는 단백질) 또는 캐리어 분자를 접합(예를 들어, 연결)시키는 것이다. 따라서, 예시적인 폴리펩티드 서열이 또 다른 성분 또는 분자와의 접합체로서 제공될 수 있다.
접합 변형으로 제2 분자의 추가의 또는 상보적인 기능 또는 활성과 함께 활성을 보유하는 폴리펩티드 서열이 생성될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 서열은 예컨대, 가용성, 보관, 생체내 또는 저장 반감기 또는 안정성, 면역원성의 감소, 생체내에서 방출 지연 또는 조절 등을 용이하게 하기 위하여 분자에 접합될 수 있다. 다른 기능 또는 활성으로는 비접합된 폴리펩티드 서열에 대비 독성을 감소시키는 접합, 비접합된 폴리펩티드 서열보다 더욱 효율적으로 한 유형의 세포 또는 기관을 표적화하는 접합, 또는 본원에 기술된 장애 또는 질환(예컨대, 당뇨병)과 연관된 원인 또는 효과에 대하여 추가로 반작용하는 약물을 포함한다.
폴리펩티드는 또한 크고 천천히 대사되는 거대분자, 예컨대, 단백질; 다당류, 예컨대, 세파로스, 아가로스, 셀룰로스, 셀룰로스 비드; 중합체 아미노산, 예컨대, 폴리글루탐산, 폴리리신; 아미노산 공중합체; 불활성화된 바이러스 입자; 불활성화된 박테리아 독소, 예컨대, 디프테리아, 파상풍, 콜레라로부터의 톡소이드, 류코톡신 분자; 불활성화된 박테리아; 및 수지상 세포에 접합될 수 있다.
접합을 위한 추가의 후보 성분 및 분자는 단리 또는 정제에 적합한 것을 포함한다. 특정의 비제한적인 예로는 결합 분자, 예컨대,비오틴(비오틴-아비딘 특이적 결합 쌍), 항체, 수용체, 리간드, 렉틴, 또는 예를 들어, 플라스틱 또는 폴리스티렌 비드, 플레이트 또는 비드, 자성 비드, 시험 스트립, 및 막을 포함하는 고체 지지체를 포함하는 분자를 포함한다. 정제 방법, 예컨대, 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 전하 차이에 의해 접합체를 분리시킬 수 있는데, 이는 접합체를 그의 다양한 분자량으로 효과적으로 분리한다. 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 얻은 분획 내용물은 종래 방법, 예를 들어, 질량분광법, SDS-PAGE, 또는 분자량에 의해 분자 엔터티를 분리시키기 위한 다른 공지된 방법을 이용하여 분자량에 의해 확인될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 폴리펩티드 서열의 아미노 또는 카르복실 말단을 면역글로불린 Fc 영역(예컨대, 인간 Fc)와 융합시켜 융합 접합체(또는 융합 분자)를 형성할 수 있다. Fc 융합 접합체는 생물약제의 전신 반감기를 증가시키는 것으로 나타났으며, 이에 따라, 생물약제 제품은 덜 빈번한 투여를 필요로 할 수 있다.
Fc는 혈관 막을 형성하는 내피 세포 내의 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 결합하고, 결합시, Fc 융합 분자는 분해로부터 보호되고, 순환계 내로 재방출되어, 분자가 순환계에서 더 길게 유지된다. 이러한 Fc 결합은 내인성 IgG가 그의 긴 혈장 반감기를 유지하게 하는 기전인 것으로 간주된다. 더욱 최근의 Fc 융합 기술은 종래의 Fc 융합 접합체 대비 생물약제의 약동학적 및 약력학적 특성을 최적화시키기 위해, 단일의 생물약제 카피를 항체의 Fc 영역에 연결시킨다.
본 개시내용은 하나 이상의 특성을 개선시키기 위하여 현재 공지된, 또는 추후 개발될 폴리펩티드의 다른 변형의 사용을 고려한다. 본 본 개시내용의 폴리펩티드의 순환 반감기를 연장시키거나, 안정성을 증가시키거나, 제거를 감소시키거나, 또는 면역원성 또는 알레르기항원성을 변경시키는 상기의 한 방법은 분자의 특징을 변형시키기 위하여 다른 분자에 연결된 하이드록시에틸 전분 유도체를 이용하는, 헤실화에 의한 폴리펩티드 서열의 변형을 포함한다. 헤실화의 다양한 측면은 예를 들어, 미국 특허 출원 번호 2007/0134197 및 2006/0258607에 기술되어 있다.
단백질 또는 펩티드는 표준 분자생물학적 기술을 통한 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 발현, 천연 공급원으로부터의 단백질 또는 펩티드의 단리, 단백질 또는 펩티드의 시험관내 번역 또는 화학적 합성을 포함하는, 당업자에게 공지되어 있는 임의의 기술에 의해 제조될 수 있다.
펩티드는 오염 박테리아 또는 동물 물질이 없는 시약을 사용하여 화학적으로 용이하게 합성될 수 있다(문헌 [Merrifield RB: Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc.85:2149-54, 1963]). 일부 실시양태에서, 항원성 펩티드는 (1) 균일한 합성 및 절단 조건을 사용하는 다중 채널 장치에서의 동시 고체상 합성; (2) 칼럼 스트립핑과 함께 RP-HPLC 칼럼 상에서의 정제; 및 펩티드 간의 대체가 아닌 재세척에 이어서; (3) 제한된 세트의 가장 유익한 검정을 사용한 분석에 의해 제조된다. 우수 제조 관리 기준(GMP: Good Manufacturing Practice) 풋프린트는 개별 환자에 대한 펩티드 세트에 관하여 정의될 수 있으며, 이에 따라 상이한 환자에 대한 펩티드 합성 사이에만 스위트 전환 절차를 필요로 한다.
대안적으로, 본 발명의 항원성 펩티드를 코딩하는 핵산(예컨대, 폴리뉴클레오티드)은 시험관내에서 항원성 펩티드를 제조하는 데 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 예컨대, DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA, 단일 및/또는 이중 가닥, 또는 천연 또는 안정화된 형태의 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 예컨대, 포스포로티오에이트 백본을 갖는 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합일 수 있고, 이는 펩티드를 코딩하는 한, 인트론을 함유하거나, 또는 함유하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 시험관내 번역은 펩티드를 제조하는 사용된다. 폴리펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터 또한 제조될 수 있다. 상이한 세포 유형에 대한 발현 벡터가 당업계에 널리 공지되어 있고, 이는 과도한 실험 없이 선택될 수 있다. 일반적으로 DNA는 발현 벡터, 예컨대, 플라스미드 내로 발현을 위해 적절한 배향으로 및 올바른 리딩프레임에 삽입된다. 비록 제어가 일반적으로는 발현 벡터 내에서 이용가능하지만, 필요할 경우, DNA는 원하는 숙주(예컨대, 박테리아)에 의해 인식되는 적절한 전사 및 번역 조절 제어 뉴클레오티드 서열에 연결될 수 있다. 이어서, 벡터는 클로닝을 위해 표준 기술을 사용하여 숙주 박테리아 내로 도입된다(예컨대, 문헌 Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.] 참조).
단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 뿐만 아니라, 상기 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포 또한 고려된다. 항원성 펩티드는 원하는 항원성 펩티드를 코딩하는 RNA 또는 cDNA 분자 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 항원성 펩티드는 단일 발현 벡터에 의해 코딩될 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 동일한 리딩 프레임 내에서, 예를 들어, 숙주 세포로부터의 폴리펩티드의 발현 및/또는 분비를 돕는 폴리뉴클레오티드(예컨대, 세포로부터 폴리펩티드의 수송을 제어하는 분비 서열로서 작용하는 리더 서열)에 융합된 질환 특이적 항원성 펩티드에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있다. 리더 서열을 갖는 폴리펩티드는 프리단백질(preprotein)이고, 이는 숙주 세포에 의해 절단되어 성숙한 형태의 폴리펩티드를 형성하는 리더 서열을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 동일한 리딩 프레임 내에서, 예를 들어, 후속하여 개인맞춤형 질환 백신 또는 면역원성 조성물로 도입될 수 있는 코딩된 폴리펩티드가 정제될 수 있게 하는 마커 서열에 융합된 질환 특이적 항원성 펩티드에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 마커 서열은 박테리아 숙주의 경우에 마커에 융합된 성숙산 폴리펩티드를 정제하기 위해 pQE-9 벡터에 의해 공급된 헥사-히스티딘 태그일 수 있거나, 또는 마커 서열은 포유동물 숙주(예컨대, COS-7 세포)를 사용하는 경우에 인플루엔자 헤마글루티딘 단백질로부터 유래된 헤마글루티닌(HA) 태그일 수 있다. 추가의 태그로는 칼모듈린 태그, FLAG 태그, Myc 태그, S 태그, SBP 태그, 소프태그(Softag) 1, 소프태그 3, V5 태그, X프레스(Xpress) 태그, 이소펩태그(Isopeptag), 스파이태그(SpyTag), 비오틴 카복실 운반 단백질(BCCP: Biotin Carboxyl Carrier Protein) 태그, GST 태그, 형광성 단백질 태그(예컨대, 녹색 형광성 단백질 태그), 말토스 결합 단백질 태그, 누스(Nus) 태그, 스트렙(Strep)-태그, 티오레독신 태그, TC 태그, Ty 태그 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 동일한 리딩 프레임 내에서 융합된 질환 특이적 항원성 펩티드 중 하나 이상에 대한 코딩 서열을 포함하여 다중의 항원성 펩티드를 제조할 수 있는 단일의 연쇄체화된 항원성 펩티드 구성물을 생성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 질환 특이적 항원성 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 또는 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 단리된 핵산 분자를 제공할 수 있다.
본원에 기술된 단리된 질환 특이적 항원성 펩티드는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 시험관내에서(예컨대, 실험실에서) 제조 수 있다. 상기 방법은 직접적인 단백질 합성 방법에서부터, 단리된 폴리펩티드 서열을 코딩하는 DNA 서열을 구성하고, 그의 서열을 적합한 형질전환된 숙주에서 발현시키는 것까지 다양하다. 일부 실시양태에서, 재조합 기술을 이용하여 관심의 대상이 되는 야생형 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 단리하거나, 또는 합성하여 DNA 서열을 구성한다. 경우에 따라, 서열을 위치 특이적 돌연변이유발에 의해 돌연변이유발시켜 그의 기능적 유사체를 제공할 수 있다. 예컨대, 문헌 [Zoeller et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:5662-5066 (1984)] 및 미국 특허 번호 4,588,585를 참조한다.
일부 실시양태에서, 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열은 올리고뉴클레오티드 합성 장치를 사용하여 화학적 합성에 의해 구성될 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 원하는 폴리펩티드의 아미노산 서열, 및 관심의 대상이 되는 재조합 폴리펩티드가 제조되는 숙주 세포가 선호하는 코돈을 선택하는 것에 기초하여 디자인될 수 있다. 관심의 대상이 되는 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열을 합성하는 데 표준 방법이 적용될 수 있다. 예를 들어, 완전한 아미노산 서열을 사용하여 역번역된 유전자를 구성할 수 있다. 추가로, 특정 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 올리고머를 합성할 수 있다. 예를 들어, 원하는 폴리펩티드의 부분을 코딩하는 수개의 작은 올리고뉴클레오티드를 합성한 다음 라이게이션시킬 수 있다. 개별 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 상보적 어셈블리를 위한 5' 또는 3' 오버행을 함유한다.
일단 (예컨대, 합성, 위치 지정 돌연변이유발 또는 또 다른 방법에 의해) 어셈블리되고 나면, 관심의 대상이 되는 특정 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 발현 벡터 내로 삽입하고, 경우에 따라, 원하는 숙주에서의 단백질의 발현에 적절한 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결시킨다. 적절한 어셈블리는 뉴클레오티드 시퀀싱, 제한 맵핑 및 적합한 숙주에서의 생물학적으로 활성인 폴리펩티드의 발현에 의해 확인될 수 있다. 당업계에 널리 공지된 바와 같이, 숙주에서 형질감염된 유전자를 높은 발현 수준으로 수득하기 위하여, 유전자를 선택된 발현 숙주에서 작용하는 전사 및 번역 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결할 수 있다.
재조합 발현 벡터는 질환 특이적 항원성 펩티드를 코딩하는 DNA를 증폭 및 발현시키는 데 사용될 수 있다. 재조합 발현 벡터는 포유동물, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래된 적합한 전사 또는 번역 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 질환 특이적 항원성 펩티드 또는 또는 생물학적 등가 유사체를 코딩하는 합성 또는 cDNA 유래 DNA 단편을 갖는 복제 가능한 DNA 구성물이다. 전사 단위는 일반적으로 본원에 상세히 기술된 바와 같이, (1) 유전자 발현에서 조절 역할을 하는 유전자 요소 또는 요소들, 예를 들어, 전사 프로모터 또는 인핸서, (2) mRNA로 전사되고, 단백질로 번역되는 구조적 또는 코딩 서열, 및 (3) 적절한 전사 및 번역 개시 및 종결 서열의 어셈블리를 포함한다. 상기 조절 요소로는 전사를 제어하는 오퍼레이터 서열을 포함할 수 있다. 보통 복제 기점에 의해 수여되는 숙주에서의 복제 능력, 및 형질전환체의 인식을 용이하게 하기 위한 선별 유전자가 추가로 도입될 수 있다. DNA 영역은 그들이 서로 기능적으로 관련이 있는 경우, 작동 가능하게 연결된 것이다. 예를 들어, 신호 펩티드에 대한 DNA(분비 리더)가 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구체로 발현되는 경우, 이는 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동 가능하게 연결된 것이거나; 프로모터가 서열의 전사를 제어하는 경우, 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 것이거나; 또는 리보솜 결합 부위가 번역이 이루어지도록 위치하는 경우, 리보솜 결합 부위가 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 것이다. 일반적으로 작동 가능하게 연결된이라는 것은 인접하다는 것을 의미하고, 분비 리더인 경우, 이는 인접하고, 리딩 프레임 내에 있다는 것을 의미한다. 효모 발현 시스템에서 사용하도록 의도된 구조적 요소로는 숙주 세포에 의한 번역된 단백질의 세포외 분비를 가능하게 하는 리더 서열을 포함한다. 대안적으로, 재조합 단백질이 리더 또는 수송 서열 없이 발현되는 경우, 이는 N-말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. 이 잔기는 경우에 따라 추후에, 발현되는 재조합 단백질로부터 절단되어 최종 생성물을 제공할 수 있다.
진핵성 숙주, 특히, 포유동물 또는 인간에 유용한 발현 벡터로는 예를 들어, SV40, 소 유두종 바이러스, 아데노바이러스 및 사이토메갈로바이러스로부터의 발현 제어 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 박테리아 숙주에 유용한 발현 벡터로는 공지된 박테리아 플라스미드, 예컨대, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 플라스미드(pCR1, pBR322, pMB9 및 그의 유도체 포함), 더욱 광범위한 숙주 범위의 플라스미드, 예컨대, M13 및 섬유상 단일 가닥 DNA 파지를 포함한다.
적절한 프로모터의 제어하에서 폴리펩티드를 발현하는 데 적합한 숙주 세포로는 원핵생물, 효모, 곤충 또는 고등 진핵 세포를 포함한다. 원핵생물로는 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어, E. 콜라이 또는 바실러스(bacillus)를 포함한다. 고등 진핵 세포로는 포유동물 기원의 확립된 세포주를 포함한다. 무세포 번역 시스템 또한 사용될 수 있다. 박테리아, 진균, 효모, 및 포유동물 세포 숙주와 함께 사용하기에 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 당업계에 널리 공지되어 있다(문헌 Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985] 참조).
또한, 다양한 포유동물 또는 곤충 세포 배양 시스템이 재조합 단백질의 발현에 유리하게 이용된다. 포유동물 세포에서의 재조합 단백질의 발현이 수행될 수 있는데, 그 이유는 상기 단백질이 일반적으로 올바르게 폴딩되고, 적절히 변형되고, 완전한 기능성을 띠기 때문이다. 적합한 포유동물 숙주 세포주의 예로는, 문헌 [Gluzman (Cell 23:175, 1981)]에 기재된 COS-7 원숭이 신장 세포주, 및 예를 들어, L 세포, C127, 3T3, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary), 293, HeLa 및 BHK 세포주를 비롯한, 적절한 벡터를 발현시킬 수 있는 다른 세포주를 포함한다. 포유동물 발현 벡터는 비전사 요소, 예컨대, 복제 기점, 발현되는 유전자에 연결된 적합한 프로모터 및 인핸서, 및 다른 5' 또는 3' 측면 비전사 서열, 및 5' 또는 3' 비번역 서열, 예컨대, 필요한 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여자 및 수여자 부위, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 곤충 세포에서의 이종성 단백질의 제조를 위한 배큘로바이러스 시스템은 문헌 [Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988)]에 리뷰되어 있다.
형질전환된 숙주에 의해 제조된 단백질은 임의의 적합한 방법에 따라 정제될 수 있다. 상기 표준 방법으로는 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환, 친화성 및 사이징(sizing) 칼럼 크로마토그래피 등), 원심분리, 차별적 용해도, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술을 포함한다. 친화성 태그, 예컨대, 헥사히스티딘, 말토스 결합 도메인, 인플루엔자 코트 서열 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제 등을 단백질에 부착하여, 적절한 친화성 칼럼을 통과시킴으로써 쉽게 정제를 수행하였다. 단리된 단백질은 또한 단백질분해, 핵 자기 공명 및 x선 결정법과 같은 기술을 이용하여 물리적으로 특징이 규명될 수도 있다. 예를 들어, 배양 배지 내로 재조합 단백질을 분비하는 시스템으로부터의 상청액을 먼저 상업적으로 입수 가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어, 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 장치를 이용하여 농축시킬 수 있다. 농축 단계 후, 농축물을 적합한 정제 매트릭스에 적용시킬 수 있다. 대안적으로, 음이온 교환 수지, 예를 들어, 펜던트 디에틸아미노에틸(DEAE) 기를 갖는 매트릭스 또는 기질을 이용할 수 있다. 매트릭스는 아크릴아미드, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로스 또는 단백질 정제에 보편적으로 이용되는 다른 유형일 수 있다. 대안적으로, 양이온 교환 단계를 이용할 수 있다. 적합한 양이온 교환체로는 술포프로필 또는 카복시메틸기를 포함하는 다양한 불용성 매트릭스가 포함된다. 마지막으로, 소수성 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC: reversed-phase high performance liquid chromatography) 매질, 예컨대, 펜던트 메틸 또는 기타 지방족 기를 갖는 실리카 겔을 이용하는 하나 이상의 RP-HPLC 단계를 이용하여 암 줄기 세포 단백질-Fc 조성물을 추가로 정제할 수 있다. 또한, 균질한 재조합 단백질을 제공하기 위해 상기 정제 단계의 일부 또는 전부를 다양한 조합으로 이용할 수도 있다.
박테리아 배양물에서 제조된 재조합 단백질은 예를 들어, 세포 펠릿으로부터의 초기 추출, 이어서, 1회 이상의 농축, 염석, 수성 이온 교환 또는 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 단리될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC: high performance liquid chromatography)는 최종 정제 단계를 위해 이용될 수 있다. 재조합 단백질의 발현에 이용되는 미생물 세포는, 동결-해동 사이클링, 초음파처리, 기계적 파괴, 또는 세포 용해제 이용을 비롯한 임의의 편리한 방법으로 파괴시킬 수 있다.
본 발명은 또한 생체내에서 항원성 펩티드/폴리펩티드를 그를 필요로 하는 피험체에 전달하기 위한 비히클로서, 예컨대, DNA/RNA 백신 형태의 핵산 분자의 용도를 고려한다(예컨대, WO2012/159643, 및 WO2012/159754(이들은 그의 전문이 본원에서 참조로 포함된다)).
일부 실시양태에서, 항원은 플라스미드의 사용으로 그를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다. 이들 플라스미드는 보통 관심의 대상이 되는 유전자(또는 상보성 DNA)의 생체내 전사 및 번역을 유도하는 강력한 바이러스 프로모터로 이루어진 플라스미드이다(문헌 [Mor, et al., (1995). The Journal of Immunology 155 (4): 2039-2046]). mRNA 안정성을 개선시키고, 이로써, 단백질 발현을 증가시키기 위해 종종 인트론 A를 포함할 수 있다(문헌 [Leitner et al. (1997). The Journal of Immunology 159 (12): 6112-6119]). 플라스미드는 또한 강력한 폴리아데닐화/전사 종결 신호, 예컨대, 소 성장 호르몬 또는 토끼 베타 글로불린 폴리아데닐화 서열을 포함한다(문헌 [Alarcon et al., (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410]; [Robinson et al., (2000). Adv. Virus Res. Advances in Virus Research 55: 1-74]; [Bohmet al., (1996). Journal of Immunological Methods 193 (1): 29-40]). 멀티시스트론성 벡터는 종종 1개 초과의 면역원을 발현하거나, 또는 면역원 및 면역자극성 단백질을 발현하도록 구성된다(문헌 [Lewis et al., (1999). Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88]).
플라스미드는 다수의 상이한 방법에 의해 동물 조직 내로 도입될 수 있다. 가장 일반적인 2가지 접근법은 표준 피하 주사용 바늘을 사용한 염수 중 DNA의 주사 및 유전자 총 전달이다. DNA 백신 플라스미드의 구성 및 그에 후속하여 상기 2가지 방법에 의한 숙주 내로의 그의 전달에 관한 개략적 요약은 사이언티픽 아메리칸(Scientific American)에 예시되어 있다(문헌 [Weiner et al., (1999) Scientific American 281 (1): 34-41]). 염수 중 주사는 보통 골격근에서 근육내로(IM) 또는 피내로(ID) 수행되며, 여기서, DNA는 세포외 공간으로 전달된다. 이는 일시적으로 근육 섬유를 미오톡신, 예컨대, 부피바카인을 사용하여 손상시킴으로써 전기천공법에 의해; 또는 염수 또는 수크로스의 고장성 용액을 사용함으로써 보조될 수 있다(문헌 [Alarcon et al., (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410]). 이러한 전달 방법에 대한 면역 반응은 주사 바늘 유형, 주사 바늘 정렬, 주사 속도, 주사 부피, 근육 유형 및 주사맞는 동물의 연령, 성별 및 생리적 조건을 비롯한 다수의 인자에 의해 영향을 받을 수 있다(문헌 [Alarcon et al., (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410]).
보편적으로 사용되는 다른 전달 방법인 유전자 총 전달은 추진제로서 압축된 헬륨을 사용하여 금 또는 텅스텐 마이크로입자 상에 흡착된 플라스미드 DNA(pDNA: plasmid DNA)를 표적 세포 내로 볼리스틱 방식으로(ballistically) 가속화시킨다(문헌 [Alarcon et al., (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410]; [Lewis et al., (1999). Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88]).
대안적인 전달 방법으로는 점막 표면, 예컨대, 비강 및 폐 점막과 같은 점막 표면 상의 네이키드 DNA의 에어로졸 점적 주입(문헌 [Lewis et al., (1999). Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88]) 및 눈 및 질 점막으로의 pDNA의 국소 투여(문헌 [Lewis et al., (1999) Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88])를 포함할 수 있다. 또한, 점막 표면 전달은 양이온성 리포솜-DNA 제제, 생분해성 미소구체, 장 점막으로의 경구 투여를 위한 약독화된 시겔라 또는 리스테리아 벡터, 및 재조합 아데노바이러스 벡터를 사용하여 달성되었다. 또한, DNA 또는 RNA는 세포막을 경미하게 기계적으로 파괴시켜, 일시적으로 세포를 투과화시킨 후에, 세포로 전달될 수 있다. 상기와 같은 막의 경미한 기계적 파괴는 세포가 작은 구멍을 통과하도록 온화하게 가압함으로써 달성될 수 있다(문헌 [Ex Vivo Cytosolic Delivery of Functional Macromolecules to Immune Cells, Sharei et al, PLOS ONE|DOI:10.1371/journal.pone.0118803 April 13, 2015]).
일부 실시양태에서, 질환 특이적 백신 또는 면역원성 조성물은 예를 들어, 하나 이상의 항원성 펩티드/폴리펩티드를 코딩하는 별개의 DNA 플라스미드를 포함할 수 있다. 본원에 논의되는 바와 같이, 발현 벡터의 정확한 선택은 발현시키고자 하는 펩티드/폴리펩티드에 따라 달라질 수 있으며, 당업계의 숙련가의 기술 포함 내에 잘 포함되어 있다. (예컨대, 근육 세포 내의 에피솜, 비복제, 비통합 형태의) DNA 구성물의 예상되는 지속성은 보호 지속 기간을 연장시킬 것으로 예상된다.
본 발명의 하나 이상의 항원성 펩티드는 바이러스 기반의 시스템(예컨대, 아데노바이러스 시스템, 아데노 연관 바이러스(AAV: adeno associated virus) 벡터, 폭스바이러스 또는 렌티바이러스)을 사용하여 생체내에서 코딩되고, 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 질환 백신 또는 면역원성 조성물은 그를 필요로 하는 인간 환자에서 사용하기 위한 바이러스 기반 벡터, 예컨대, 예를 들어, 아데노바이러스를 포함할 수 있다. 아데노 연관 바이러스, 아데노바이러스 및 렌티바이러스 전달을 위해 사용될 수 있는 플라스미드는 앞서 기술된 바 있다(예컨대, 미국 특허 번호 6,955,808 및 6,943,019, 및 미국 특허 출원 번호 20080254008(상기 특허는 본원에서 참조로 포함된다) 참조).
본 발명의 펩티드 및 폴리펩티드는 또한, 벡터, 예컨대, 본원에서 논의된 바와 같은 핵산 분자, 예컨대, RNA 또는 DNA 플라스미드, 바이러스 벡터, 예컨대, 폭스바이러스, 예컨대, 오르토폭스 바이러스, 조류폭스 바이러스 또는 아데노바이러스, AAV 또는 렌티바이러스에 의해 발현될 수 있다. 이러한 접근법은 본 발명의 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현시키기 위한 벡터의 이용을 포함한다. 급성 또는 만성 감염 숙주 내로의 또는 비감염 숙주 내로의 도입시에, 벡터는 면역원성 펩티드를 발현하며, 이로써, 숙주 CTL 반응을 유도한다.
본 발명의 실시에 사용될 수 있는 벡터 중에, 세포의 숙주 게놈 내의 통합은 레트로바이러스 유전자 전달 방법 사용으로 이루어질 수 있고, 대개는 이를 통해 삽입된 트랜스진이 장기간 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 레트로바이러스는 렌티바이러스이다. 추가로, 다수의 상이한 세포 유형 및 표적 조직에서 높은 형질도입 효율이 관찰되었다. 레트로바이러스의 향성은 외래 외피 단백질을 도입시켜, 표적 세포의 잠재적 표적 집단을 증량시킴으로써 변경될 수 있다. 레트로바이러스는 오직 특정의 세포 유형만이 렌티바이러스에 의해 감염되도록 삽입된 트랜스진이 조건부 방식으로 발현될 수 있도록 조작될 수 있다. 세포 유형 특이적 프로모터를 사용하여 특정 세포 유형에서의 발현을 표적화할 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다(그리고 그에 따라, 렌티바이러스 및 레트로바이러스 벡터 둘 모두가 본 발명의 실시에 사용될 수 있다). 더욱이, 렌티바이러스 벡터는 비분열 세포를 형질도입할 수 있거나, 감염시킬 수 있으며, 전형적으로 높은 바이러스 역가를 생성할 수 있다. 그러므로, 레트로바이러스 유전자 전달 시스템 선택은 표적 조직에 따라 달라질 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 최대 6-10 kb의 외래 서열에 대하여 패키징 능력을 갖는 시스 작용성 긴 말단 반복부로 구성된다. 최소 시스 작용성 LTR은 벡터의 복제 및 패키징에 충분하며, 이는 이어서, 원하는 핵산을 표적 세포로 통합시켜, 영구적인 발현을 제공하는데 사용된다. 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 널리 사용되는 레트로바이러스 벡터로는 뮤린 백혈병 바이러스(MuLV: murine leukemia virus), 긴팔원숭이 유인원 백혈병 바이러스(GaLV: gibbon ape leukemia virus), 원숭이 면역 결핍 바이러스(SIV: Simian Immuno deficiency virus), 인간 면역 결핍 바이러스(HIV: human immuno deficiency virus) 및 그들의 조합에 기초한 것들을 포함한다(예컨대, 문헌 [Buchscher et al., (1992) J. Virol. 66:2731-2739]; [Johann et al., (1992) J. Virol.66:1635-1640]; [Sommnerfelt et al., (1990) Virol.176:58-59]; [Wilson et al., (1998) J. Virol.63:2374-2378]; [Miller et al., (1991) J. Virol.65:2220-2224]; PCT/US94/05700 참조).
또한, 최소 비영장류 렌티바이러스 벡터, 예컨대, 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV: equine infectious anemia virus)에 기반한 렌티바이러스 벡터가 본 발명의 실시에 유용하다. 벡터는 표적 유전자의 발현을 유도하는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터를 가질 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 실시에 유용한 벡터(들) 중에 레트로바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 벡터를 고려한다.
본원의 한 실시양태에서, 전달은 렌티바이러스를 통해 이루어진다. 투여량, 예컨대, 1 x 109 형질도입 단위(TU: transducing unit)/mL의 역가를 갖는 재조합 렌티바이러스 10 ㎕는 본 발명에서 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터의 이용에 맞게 적합화되거나, 외삽될 수 있다. 조직, 예컨대, 뇌 내의 형질도입을 위하여, 극소량이 사용되어야 하며, 이에, 바이러스 제제는 초원심분리에 의해 농축된다. 다른 농축 방법, 예컨대, 한외여과 또는 매트릭스에의 결합 및 그로부터의 용리가 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 투여되는 렌티바이러스의 양은 평균 75 ㎏인 인간을 위한 총 단일 투여량으로서 1x105 또는 약 1x105 플라크 형성 단위(PFU: plaque forming unit), 5x105 또는 약 5x105 PFU, 1x106 또는 약 1.x106 PFU, 5x106 또는 약 5x106 PFU, 1x107 또는 약 1x107 PFU, 5x107 또는 약 5x107 PFU, 1x108 또는 약 1x108 PFU, 5x108 또는 약 5x108 PFU, 1x109 또는 약 1x109 PFU, 5x109 또는 약 5x109 PFU, 1x1010 또는 약 1x1010 PFU 또는 5x1010 또는 약 5x1010 PFU, 또는 피험체의 체중 및 크기 및 종에 대하여 조정될 수 있다. 당업자는 적합한 투여량을 결정할 수 있다. 바이러스에 적합한 투여량은 실험적으로 결정될 수 있다.
또한, 아데노바이러스 벡터가 본 발명의 실시에 유용하다. 한가지 이점은 시험관내 및 생체내에서 다양한 포유동물 세포 및 조직에서 재조합 유전자를 효율적으로 전달하고 발현하여, 전달된 핵산을 높게 발현시킬 수 있는 재조합 아데노바이러스의 능력이다. 추가로, 휴지 세포를 제조 방식으로 감염시킬 수 있는 능력은 재조합 아데노바이러스 벡터의 유용성을 확대시킨다. 추가로, 높은 발현 수준은 확실하게 핵산의 생성물이 면역 반응을 생성하는 데 충분한 수준으로 발현될 수 있게 한다(예컨대, 미국 특허 번호 7,029,848(이는 본원에서 참조로 포함된다)). 본 발명의 실시에 유용한 아데노바이러스 벡터에 관하여, 미국 특허 번호 6,955,808가 언급된다. 사용되는 아데노바이러스 벡터는 Ad5, Ad35, Ad11, C6 및 C7 벡터로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 아데노바이러스 5("Ad5") 게놈의 서열이 공개되어 있다(문헌 [Chroboczek, J., Bieber, F., and Jacrot, B. (1992) The Sequence of the Genome of Adenovirus Type 5 and Its Comparison with the Genome of Adenovirus Type 2, Virology 186, 280-285](상기 문헌의 내용은 본원에서 참조로 포함된다]). Ad35 벡터는 미국 특허 번호 6,974,695, 6,913,922, 및 6,869,794에 기술되어 있다. Ad11 벡터는 미국 특허 번호 6,913,922에 기술되어 있다. C6 아데노바이러스 벡터는 미국 특허 번호 6,780,407; 6,537,594; 6,309,647; 6,265,189; 6,156,567; 6,090,393; 5,942,235 및 5,833,975에 기술되어 있다. C7 벡터는 미국 특허 번호 6,277,558에 기술되어 있다. E1 결함 또는 결실, E3 결함 또는 결실 및/또는 E4 결함 또는 결실인 아데노바이러스 벡터 또한 사용될 수 있다. E1 영역에 돌연변이를 갖는 특정 아데노바이러스는 E1 결함 아데노바이러스 돌연변이체가 비허용 세포에서 복제 결함이 있거나 적어도 고도로 약독화되어 있기 때문에, 개선된 안전역을 가진다. E3 영역에 돌연변이를 갖는 아데노바이러스는 아데노바이러스가 MHC 클래스 I 분자를 하향조절하는 기전을 파괴시킴으로써 면역원성을 증진시킬 수 있다. E4 돌연변이를 갖는 아데노바이러스는 후기 유전자 발현의 억제 때문에, 아데노바이러스 벡터의 면역원성이 감소될 수 있다. 상기 벡터는 동일한 벡터를 사용한 반복된 재백신접종을 원하는 경우, 특히 유용할 수 있다. E1, E3, E4, E1 및 E3, 및 E1 및 E4에서 결실되거나 돌연변이된 아데노바이러스 벡터가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 추가로, 모든 바이러스 유전자가 결실된 "무기력(gutless)" 아데노바이러스 벡터도 또한 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 상기 벡터는 그의 복제를 위해 헬퍼 바이러스를 필요로 하며, 자연 환경에 존재하지 않는 조건, E1a 및 Cre 둘 모두를 발현하는 특수 인간 293 세포주를 필요로 한다. 상기 "무기력" 벡터는 비면역원성이며, 이에 따라, 벡터는 재백신접종을 위해 다회 접종될 수 있다. "무기력" 아데노바이러스 벡터는 이종 삽입체/유전자, 예를 들어, 본 발명의 트랜스의 삽입을 위해 사용될 수 있고, 심지어 다수의 이종 삽입체/유전자의 공동 전달을 위해 사용될 수 있다. 전달은 단일의 부스터 용량일 수 있는 아데노바이러스를 통해 이루어진다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스는 다회 용량을 통해 전달된다. 생체내 전달에 관하여, AAV는 그가 숙주 게놈 내로 통합되지 않기 때문에 삽입 돌연변이유발을 야기할 가능성이 낮고, 독성이 낮기 때문에, 다른 바이러스 벡터에 비하여 유리하다. AAV는 4.5 또는 4.75 Kb의 패키징 제한을 가진다. 4.5 또는 4.75 Kb보다 더 큰 구성물은 현저히 감소된 바이러스 생성을 야기한다. 핵산 분자 발현을 유도하기 위해 사용될 수 있는 프로모터가 다수 존재한다. AAV ITR은 프로모터로 제공될 수 있으며, 추가의 프로모터 요소를 필요로 하지 않게 하는 데 유리하다. 편재성 발현을 위하여, 하기의 프로모터가 사용될 수 있다: CMV, CAG, CBh, PGK, SV40, 페리틴 중쇄 또는 경쇄 등. 뇌 발현을 위하여, 하기의 프로모터가 사용될 수 있다: 모든 뉴런을 위한 시냅신(Synapsin)I, 흥분성 뉴런을 위한 CaMKII알파, GABAergic 뉴런을 위한 GAD67 또는 GAD65 또는 VGAT 등. RNA 합성을 유도하기 위해 사용되는 프로모터는 Pol III 프로모터, 예컨대, U6 또는 H1을 포함할 수 있다. Pol II 프로모터 및 인트론 카세트를 사용하여 가이드 RNA(gRNA: guide RNA)를 발현할 수 있다. 본 발명의 실시에서 유용한 AAV 벡터에 관하여, 미국 특허 번호 5658785, 7115391, 7172893, 6953690, 6936466, 6924128, 6893865, 6793926, 6537540, 6475769 및 6258595, 및 상기 문헌에서 인용된 문헌이 언급된다. AAV에 관하여, AAV는 AAV1, AAV2, AAV5 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 표적화하고자 하는 세포에 관하여 AAV를 선택할 수 있으며; 예컨대, 뇌 또는 뉴런 세포를 표적화하기 위하여 AAV 혈청형 1, 2, 5 또는 하이브리드 캡시드 AAV1, AAV2, AAV5 또는 이들의 임의의 조합을 선택할 수 있고; 심장 조직을 표적화하기 위하여 AAV4를 선택할 수 있다. AAV8은 간으로의 전달을 위해 유용하다. 일부 실시양태에서, 전달은 AAV를 통해 이루어진다. 일부 실시양태에서, 투여량은 임의의 부작용에 대하여 치료적 이익의 균형을 이루도록 조정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 질환 백신 또는 면역원성 조성물에 대한 세포 면역 반응을 효율적으로 활성화시키는 것은 비병원성 미생물에서 백신 또는 면역원성 조성물 내의 관련 신생항원을 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 널리 공지된 상기 미생물의 예로는 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) BCG, 살모넬라(Salmonella) 및 슈도모나(Pseudomona)가 있다(미국 특허 번호 6,991,797(상기 특허의 전문이 본원에서 참조로 포함된다) 참조).
일부 실시양태에서, 폭스바이러스는 질환 백신 또는 면역원성 조성물에 사용된다. 이들은 오소폭스바이러스, 조류폭스, 백시니아, MVA, NYVAC, 카나리아 두창, ALVAC, 계두, TROVAC 등을 포함한다(예컨대, 문헌 [Verardiet al., Hum Vaccin Immunother. 2012 Jul;8(7):961-70]; 및 [Moss, Vaccine. 2013; 31(39): 4220-4222] 참조). 폭스바이러스 발현 벡터는 1982년에 기술되었고, 수많은 분야에서 신속하게 백신 개발 및 연구를 위하여 광범위하게 사용되었다. 벡터의 이점으로는 간단한 구성, 다량의 외래 DNA를 수용할 수 있는 능력 및 높은 발현 수준을 포함한다. 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 폭스바이러스, 예컨대, 코르도폭스비리나에(Chordopoxvirinae) 아과 폭스바이러스(척추동물의 폭스바이러스), 예를 들어, 오르토폭스바이러스 및 조류폭스 바이러스, 예컨대, 백시니아 바이러스(예컨대, Wyeth 균주, WR 균주(예컨대, ATCC® VR-1354), 코펜하겐 균주, NYVAC, NYVACl, NYVAC2, MVA, MVA-BN), 카나리아 두창 바이러스(예컨대, Wheatley C93 균주, ALVAC), 계두 바이러스(예컨대, FP9 균주, Webster 균주, TROVAC), 도브폭스(dovepox), 구두(pigeonpox), 메추라기두(quailpox) 및 라쿤두(raccoon pox), 특히 그의 합성 또는 자연적으로 발생된 재조합체, 그의 용도 및 상기 재조합체의 제조 및 이용 방법에 관한 정보는 각각이 본원에 참조로 포함되는 과학 및 특허 문헌에서 찾아볼 수 있다.
일부 실시양태에서, 백시니아 바이러스는 항원을 발현하도록 질환 백신 또는 면역원성 조성물에 사용된다(문헌 [Rolph et al., Recombinant viruses as vaccines and immunological tools. Curr Opin Immunol 9:517-524, 1997]). 재조합 백시니아 바이러스는 감염된 숙주 세포의 세포질 내에서 복제할 수 있으며, 이로써, 관심의 대상이 되는 폴리펩티드는 면역 반응을 유도할 수 있다. 더욱이, 폭스바이러스는 면역 세포, 특히 항원 제시 세포를 직접 감염시킴으로써 주조직 적합성 복합체 클래스 I 경로에 의한 프로세싱을 위해 코딩된 항원을 표적화할 수 있는 그의 능력 때문만이 아니라, 자기 보조하는 그의 능력 때문에, 백신 또는 면역원성 조성물 벡터로서 광범위하게 사용되어 왔다.
일부 실시양태에서, ALVAC는 질환 백신 또는 면역원성 조성물에서 벡터로서 사용된다. ALVAC는 외래 트랜스진을 발현하도록 변형될 수 있는 카나리아두 바이러스이며, 원핵성 및 진핵성 항원, 둘 모두에 대한 백신접종 방법으로 사용되어 왔다(문헌 [Horig H, Lee DS, Conkright W, et al. Phase I clinical trial of a recombinant canarypoxvirus (ALVAC) vaccine expressing human carcinoembryonic antigen and the B7.1 co-stimulatory molecule. Cancer Immunol Immunother 2000;49:504-14]; [von Mehren M, Arlen P, Tsang KY, et al. Pilot study of a dual gene recombinant avipox vaccine containing both carcinoembryonic antigen (CEA) and B7.1 transgenes in patients with recurrent CEA-expressing adenocarcinomas. Clin Cancer Res 2000;6:2219-28]; [Musey L, Ding Y, Elizaga M, et al. HIV-1 vaccination administered intramuscularly can induce both systemic and mucosal T cell immunity in HIV-1-uninfected individuals. J Immunol 2003;171:1094-101]; [Paoletti E. Applications of pox virus vectors to vaccination: an update. Proc Natl Acad Sci U S A 1996;93:11349-53]; 미국 특허 번호 7,255,862). I상 임상 시험에서, 종양 항원 CEA를 발현하는 ALVAC 바이러스는 탁월한 안전성 프로파일을 보였으며, 선택된 환자에서 CEA 특이적 T 세포 반응을 증가시켰지만; 객관적인 임상 반응은 관찰되지 않았다(문헌 [Marshall JL, Hawkins MJ, Tsang KY, et al. Phase I study in cancer patients of a replication-defective avipox recombinant vaccine that expresses human carcinoembryonic antigen. J Clin Oncol 1999;17:332-7]).
일부 실시양태에서, 변형된 백시니아 안카라(MVA) 바이러스는 항원 백신 또는 면역원성 조성물을 위한 바이러스 벡터로 사용될 수 있다. MVA는 오르토폭스바이러스 과의 구성원이며, 백시니아 바이러스의 안카라 균주의 닭 배아 섬유아세포(CVA)에서 약 570회의 연속 계대접종에 의해 생성되었다(리뷰를 위하여, 문헌 [Mayr, A., et al., Infection 3, 6-14, 1975] 참조). 상기 계대접종의 결과로서, 생성된 MVA 바이러스는 CVA에 대비 31 킬로베이스 더 적은 게놈 정보를 함유하며, 고도의 숙주 세포성을 띤다(문헌 [Meyer, H. et al., J. Gen. Virol. 72, 1031-1038, 1991]). MVA는 그의 극도의 약독화, 즉, 감소된 병독성 또는 감염 능력을 특징으로 하지만, 여전히 뛰어난 면역원성은 유지한다. 다양한 동물 모델에서 테스트하는 경우, MVA는 심지어 면역 억제 개체에서도 무독성인 것으로 입증되었다. 더욱이, MVA-BN®-HER2는 HER-2 양성 유방암의 치료를 위하여 디자인된 후보 면역요법이며, 현재 임상 시험 중에 있다 (문헌 [Mandl et al., Cancer Immunol Immunother. Jan 2012; 61(1): 19-29]). 재조합 MVA를 제조하고 이용하는 방법이 기술되어 있다 (예컨대, 미국 특허 번호 8,309,098 및 5,185,146(상기 특허는 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)).
일부 실시양태에서, 백신 또는 면역원성 조성물의 재조합 바이러스 입자가 그를 필요로 하는 환자에게 투여된다.
신생항원 결합 펩티드
특정 실시양태에서, 본 발명은 신생항원 펩티드:인간 백혈구 항원(HLA) 복합체에 높은 친화도로 결합할 수 있는 결합 단백질(예컨대, 항체 또는 그의 항원 결합 단편), 또는 T 세포 수용체(TCR), 또는키메라 항원 수용체(CAR)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 단백질의 세포외 도메인으로부터 유래된 신생항원성 펩티트에 높은 친화도로 결합할 수 있는 CAR을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 신생항원 특이적 결합 단백질 또는 TCR 또는 CAR은, 결합 단백질이 그의 특이적 결합 기능을 유지 또는 실질적으로 유지한다면, 천연 아미노산 서열 중에 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 갖는 변이체 폴리펩티드 종을 포함한다. 아미노산의 보존적 치환은 널리 공지되어 있고, 이는 자연적으로 발생될 수 있거나, 결합 단백질 또는 TCR이 재조합적으로 제조될 때 도입될 수 있다. 아미노산 치환, 결실, 및 부가는 당업계에 공지된 돌연변이유발 방법을 사용하여 단백질 내로 도입될 수 있다(예컨대, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N Y, 2001] 참조). 올리고뉴클레오티드 지정 부위 특이적(분절 특이적) 돌연변이유발 방법을 사용하여 원하는 치환, 결실, 또는 삽입에 따라 변경된 특정 코돈을 갖는 변경된 폴리뉴클레오티드를 제공할 수 있다. 대안적으로, 무작위 또는 포화 돌연변이유발 기술, 예컨대, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발, 오류 빈발 중합효소 연쇄 반응 돌연변이유발, 및 올리고뉴클레오티드 지정 돌연변이유발이 면역원 폴리펩티드 변이체를 제조하는 데 사용될 수 있다(문헌 [Sambrook et al. 상기 문헌 동일] 참조).
당업자에게 공지된 다수의 기준은 펩티드 또는 폴리펩티드 중 특정 위치에 위치하는 아미노산이 보존적인지(또는 유사한지) 여부를 나타낸다. 예를 들어, 유사한 아미노산 또는 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 로 대체된 것이다. 유사한 아미노산은 하기 카테고리 안에 포함되어 있을 수 있다: 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대, 리신, 아르기닌, 히스티딘); 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대, 아스파르트산, 글루탐산); 비하전된 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 히스티딘); 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판); 베타 분지형 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대, 트레오닌, 발린, 이소류신), 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판). 분류하기가 더 어려운 것으로 간주되는 프롤린은 지방족 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대, 류신, 발린, 이소류신, 및 알라닌)과 특성을 공유한다. 특정 상황하에서, 글루탐산을 대신하여 글루타민으로, 또는 아스파르트산을 대신하여 아스파라긴으로 치환하는 것은 글루타민 및 아스파라긴이 각각 글루탐산 및 아스파르트산의 아미드 유도체라는 점에서 유사한 치환으로 간주될 수 있다. 당업계에서 이해되는 바와 같이, 두 폴리펩티드 사이의 "유사성"은 (예컨대, GENEWORKS, Align, BLAST 알고리즘, 또는 본원에 기술되고, 당업계에서 실시되는 다른 알고리즘을 사용하여) 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 그에 대한 보존되는 아미노산 치환기를 비교함으로써 측정된다
특정 실시양태에서, 신생항원 특이적 결합 단백질, TCR 또는 CAR은 (a) CD8과 독립적으로 또는 CD8의 부재하에서 세포 표면 상의 신생항원:HLA 복합체에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 신생항원 특이적 결합 단백질은 T 세포 수용체(TCR), 키메라 항원 수용체 또는 TCR의 항원 결합 단편이고, 이 중 임의의 것은 키메라, 인간화 또는 인간인 것일 수 있다. 추가 실시양태에서, TCR의 항원 결합 단편은 단일 쇄 TCR(scTCR: single chain TCR).
특정 실시양태에서, 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 신생항원 특이적 결합 단백질 또는 고친화성 재조합 TCR, 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다.
재조합적으로 제조된 가용성 TCR을 단리하고, 정제하는 데 유용한 방법으로는 예로서, 재조합 가용성 TCR을 배양 배지 내로 분비하는 적합한 숙주 세포/벡터 시스템으로부터 상청액을 수득한 후, 상업적으로 이용가능한 필터를 이용하여 배지를 농축시키는 것을 포함할 수 있다. 농축 후, 농축물을 단일 적합한 정제 매트릭스, 또는 일련의 적합한 매트릭, 예컨대, 친화성 매트릭스 또는 이온 교환 수지에 적용시킬 수 있다. 1회 이상의 역상 HPLC 단계를 사용하여 재조합 폴리펩티드를 추가로 정제할 수 있다. 상기 정제 방법은 또한 면역원을 그의 천연 환경으로부터 단리할 때에도 사용될 수 있다. 본원에 기술된 단리된/재조합 가용성 TCR 중 하나 이상의 것을 대량으로 제조하는 방법은 적절한 배양 조건을 유지하기 위해 모니터링 및 제어되는 배치식 세포 배양을 포함한다. 가용성 TCR의 정제는 본원에 기술되고, 당업계에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다.
III. 면역원성 조성물 및 백신 조성물
일부 실시양태에서 본 발명은 신생항원 특이적 반응(예컨대, 체액성 또는 세포 매개 면역 반응)을 일으킬 수 있는 면역원성 조성물, 예컨대, 백신 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 본원에서 확인된 종양 특이적 신생항원에 상응하는, 본원에 기술된 신생항원 치료제(예컨대, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, TCR, CAR, TCR 또는 CAR을 함유하는 세포, 폴리펩티드를 함유하는 수지상 세포, 폴리뉴클레오티드를 함유하는 수지상 세포, 항체 등)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 면역원성 펩티드는 질환 또는 병태를 앓는 하나 이상의 피험체로부터 확인된다. 일부 실시양태에서, 면역원성 펩티드는 질환 또는 병태를 앓는 하나 이상의 피험체에 대해 특이적이다. 일부 실시양태에서, 면역원성 펩티드는 질환 또는 병태를 앓는 하나 이상의 피험체의 HLA 하플로타입에 매칭되는 HLA에 결합한다.
당업자는 예를 들어, 시험관내에서의 T 세포 생성 뿐만 아니라, 그의 효율 및 전반적인 존재, 증식, 특정 펩티드에 대한 특정 T 세포의 친화성 및 확장, 및 T 세포의 관능성을 테스트함으로써, 예컨대, T 세포에 의한 IFNγ 생산 또는 종양 사멸을 분석함으로써 신생항원성 치료제를 선별할 수 있을 것이다. 이어서, 가장 효율적인 펩티드를 면역원성 조성물로서 조합할 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 한 면역원성 조성물이 상이한 MHC 분자, 예컨대, 상이한 MHC 클래스 I 분자와 회합할 수 있는 신생항원성 펩티드 및/또는 폴리펩티드를 포함하도록 상이한 신생항원성 펩티드 및/또는 폴리펩티드가 선별된다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 가장 빈번하게 발생하는 MHC 클래스 I 분자와 회합할 수 있는 신생항원성 펩티드 및/또는 폴리펩티드를 포함한다. 그러므로, 본원에 기술된 면역원성 조성물은 적어도 2, 적어도 3, 또는 적어도 4개의 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자와 회합할 수 있는 상이한 펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 면역원성 조성물은 특이적인 세포독성 T 세포 반응, 특이적 헬퍼 T 세포 반응, 또는 B 세포 반응을 일으킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 면역원성 조성물은 애쥬번트 및/또는 캐리어를 추가로 포함할 수 있다. 유용한 애쥬번트 및 캐리어의 예는 본원 하기에서 제공한다. 조성물 중의 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드는 캐리어, 예컨대, 예로서, 단백질, 또는 항원 제시 세포, 예컨대, 예로서, T 세포에 펩티드를 제시할 수 있다 수지상 세포(DC), 또는 B 세포와 회합될 수 있다. 추가의 실시양태에서, DC 결합 펩티드는 신생항원 펩티드를 코딩하는 신생항원성 펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 수지상 세포로 표적화하는 캐리어로서 사용된다(문헌 [Sioud et al. FASEB J 27: 3272-3283 (2013)]).
실시양태에서, 신생항원성 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 항원 제시 세포 (예컨대, 수지상 세포)로서 제공될 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 항원 제시 세포는 환자에서의 사용을 위해 T 세포를 자극하는 데 사용된다.
일부 실시양태에서, 항원 제시 세포는 수지상 세포이다. 관련된 실시양태에서, 수지상 세포는 신생항원성 펩티드 또는 핵산으로 펄싱된 자가 수지상 세포이다. 신생항원성 펩티드는 적절한 T 세포 반응을 일으키는 임의의 적합한 펩티드일 수 있다. 종양 연관 항원으로부터의 펩티드로 펄싱된 자가 수지상 세포를 사용하는 T 세포 요법은 [Murphy et al. (1996) The Prostate 29, 371-380] 및 [Tjua et al. (1997) The Prostate 32, 272-278]에 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CTL. 일부 실시양태에서, T 세포는 HTL이다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 본원에 기술된 하나 이상의 신생항원성 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드로 펄싱되거나, 또는 그가 로딩된 적어도 하나의 항원 제시 세포(예컨대, 수지상 세포)를 함유하는 면역원성 조성물이다. 실시양태에서, 상기 APC는 자가 세포(예컨대, 자가 수지상 세포)이다. 대안적으로, 생체외에서 신생항원성 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드가 환자로부터 단리된 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC: peripheral blood mononuclear cell)에 로딩될 수 있다. 관련된 실시양태에서, 상기 APC 또는 PBMC는 환자 내로 다시 주사된다.
폴리뉴클레오티드는 수지상 세포를 유도할 수 있고, 이로써, 신생항원성 펩티드를 제시할 수 있고, 면역을 유도할 수 있는, 적합한 적합한 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 수동적 로딩에 의해 세포에 의해 흡수되는 네이키드 DNA일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 전달 비히클, 예를 들어, 예를 들어, 리포솜, 바이러스 유사 입자, 플라스미드, 또는 발현 벡터의 일부분이다. 또 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 벡터 무함유 전달 시스템, 예를 들어, 고성능 전기천공 및 고속 세포 변형에 의해 전달된다. 실시양태에서, 상기 항원 제시 세포(APCs)(예컨대, 수지상 세포) 또는 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)는 T 세포(예컨대, 자가 T 세포)를 자극하는 데 사용된다. 관련된 실시양태에서, T 세포는 CTL이다. 다른 관련된 실시양태에서, T 세포는 HTL이다. 이어서, 상기 T 세포를 환자 내로 주사한다. 일부 실시양태에서, CTL이 환자 내로 주사된다. 일부 실시양태에서, HTL이 환자 내로 주사된다. 일부 실시양태에서, CTL 및 HTL, 둘 모두가 환자 내로 주사된다. 치료제 투여는 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 수행될 수 있다.
치료적 처치를 위한, 본원에 기술된 약학 조성물(예컨대, 면역원성 조성물)은 비경구적, 국소, 비강, 경구적 또는 국부 투여용으로 의도된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 약학 조성물은 비경구적으로, 예컨대, 정맥내로, 피하로, 피내로, 또는 근육내로 투여된다. 실시양태에서, 조성물은 종양내로 투여될 수 있다. 조성물은 종양에 대한 국부 면역 반응을 유도하기 위해 수술적 적출 부위에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 신생항원성 펩티드 용액을 포함하는 비경구적 투여용의 조성물을 기술하고, 면역원성 조성물은 허용되는 담체, 예를 들어, 수성 담체 중에 용해 또는 현탁되어 있다. 다양한 수성 담체, 예컨대, 예컨대, 물, 완충처리된 물, 0.9% 염수, 0.3% 글리신, 히알루론산 등이 사용될 수 있다. 상기 조성물은 종래의 널리 공지된 멸균 기술에 의해 멸균처리될 수 있거나, 멸균 여과될 수 있다. 생성된 수용액은 있는 그대로 사용을 위해 패키징되거나, 동결 건조될 수 있고, 여기서, 동결 건조된 제제는 투여 전에 멸균 용액과 조합된다. 조성물은 생리적 조건과 유사하도록 만들기 위해 필요에 따라 약학적으로 허용되는 보조 물질, 예컨대, pH 조정제 및 완충화제, 장성 조정제, 습윤화제 등, 예를 들어, 아세트산나트륨, 락트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레이트 등을 함유할 수 있다.
약학 제제 중 본원에 기술된 신생항원성 펩티드 및 폴리뉴클레오티드의 농도는 광범위하게, 즉, 약 0.1 중량% 미만에서부터, 보통 약 2 중량% 또는 적어도 약 2 중량% 내지 20 중량% 내지 50 중량% 이상 정도까지 많이 달라질 수 있고, 이는 선택된 특정 투여 모두에 따라 유체 부피, 점도 등에 의해 선택될 것이다.
본원에 기술된 신생항원성 펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 또한 펩티드가 특정 세포 조직, 예컨대, 림프계 조직을 표적화하는 리포솜을 통해 투여할 수 있다. 리포솜은 또한 펩티드의 반감기를 증가시키는 데 유용하다. 리포솜은 에멀젼, 폼, 미셀, 불용성 단일층, 액체 결정, 인지질 분산액, 층판층 등을 포함한다. 상기 제제에서, 전달하고자 하는 펩티드는 단독으로, 또는 예컨대, 림프성 세포 중에 우세하게 존재하는 수용체에 결합하는 분자, 예컨대, DEC205 항원에 결합하는 단일클론 항체와 함께, 또는 다른 치료제 또는 면역원성 조성물과 함께 리포솜의 일부로서 도입된다. 따라서, 원하는 본원에 기술된 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드로 충전된 리포솜은 림프성 세포 부위로 지시될 수 있고, 이어서, 여기서, 리포솜은 선택된 치료제/면역원성 폴리펩티드/폴리뉴클레오티드 조성물을 전달한다. 리포솜은, 일반적으로 중성 및 음으로 하전된 인지질 및 스테롤, 예를 들어, 콜레스테롤을 포함하는, 표준 소포체 형성 지질로부터 형성될 수 있다. 지질 선택은 일반적으로 예컨대, 리포솜 크기, 산 분해성 및 혈류 중 리포솜의 안정성을 고려하여 가이드된다. 예컨대, 문헌 [Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9; 467 (1980)], 미국 특허 번호 4,235,871, 4,501,728, 4,501,728, 4,837,028, 및 5,019,369에 기술되어 있는 바와 같이, 리포솜을 제조하는 데 다양한 방법이 이용가능하다.
면역 세포로의 표적화를 위해, 신생항원 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 원하는 면역계 세포의 세포 표면 결정기에 대하여 리포솜 내로 도입된다. 펩티드를 함유하는 리포솜 현탁액은 특히 투여 방식, 전달되는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드, 및 치료되는 질환의 병기에 따라 다른 용량으로 정맥내로, 국부적으로, 국소적으로, 기타 방식으로 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 신생항원 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 수지상 세포로 표적화된다. 일부 실시양태에서, 신생항원 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 마커 DEC205, XCR1, CD197, CD80, CD86, CD123, CD209, CD273, CD283, CD289, CD184, CD85h, CD85j, CD85k, CD85d, CD85g, CD85a, TSLP 수용체, Clec9a 또는 CD1a를 사용하여 수지상 세포로 표적화된다.
고체 조성물의 경우, 예를 들어, 약학 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 소듐 사카린, 활석, 셀룰로스, 글루코스, 수크로스, 탄산마그네슘 등을 포함하는 종래의 또는 나노입자 비독성 고체 담체가 사용될 수 있다. 경구적 투여를 위해, 약학적으로 허용되는 비독성 조성물은 일반적으로 사용되는 부형제, 예컨대, 앞서 열거된 상기 담체 중 임의의 것, 및 일반적으로 10-95%의 활성 성분, 즉, 25%-75% 농도의 본원에 기술된 하나 이상의 신생항원성 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 형성된다.
에어로졸 투여의 경우, 신생항원성 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 계면활성제 및 추진제와 함께 미분된 형태로 공급될 수 있다. 상기 작용제 중 대표적인 것으로 6 내지 22개의 탄소 원자를 함유하는 지방산의 에스테르 또는 부분 에스테르, 예컨대, 지방족 다가 알콜 또는 그의 사이클릭 무수물과 함께 카프로산, 옥탄산, 라우르산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레스테르산 및 올레산이 있다. 혼합된 에스테르, 예컨대, 혼합 또는 천연 글리세리드가 사용될 수 있다. 계면활성제는 조성물의 0.1 중량%-20 중량%, 또는 0.25-5 중량%를 구성할 수 있다. 조성의 나머지 부분은 추진제일 수 있다. 또한, 담체는 예를 들어, 비내 전달용 레시틴과 같이, 필요에 따라 포함될 수 있다.
본원에 기술된 신생항원성 폴리뉴클레오티드를 전달하는 추가 방법 또한 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 핵산은 "네이키드 DNA"로서 직접 전달될 수 있다. 상기 접근법은 예를 들어, 문헌 [Wolff et al., Science 247: 1465-1468 (1990)] 뿐만 아니라, 미국 특허 번호 5,580,859 및 5,589,466에 기술되어 있다. 핵산은 또한 예를 들어, 미국 특허 번호 5,204,253에 기술되어 있는 것과 같은 볼리스틱(ballistic) 전달을 사용하여 투여될 수 있다. 오직 DNA로만 구성된 입자가 투여될 수 있다. 대안적으로, DNA는 입자, 예컨대, 금 입자에 부착될 수 있다.
치료 목적 또는 면역화 목적을 위하여, 신생항원성 펩티드, 또는 펩티드 결합 물질을 코딩하는 mRNA 또한 환자에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, mRNA는 자기 증폭 RNA이다. 추가 실시양태에서, 자기 증폭 RNA는 합성 지질 나노입자 제제의 일부분이다(문헌 [Geall et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 109: 14604-14609 (2012)]).
핵산은 또한 양이온 화합물, 예컨대, 양이온성 지질과의 복합체 형태로 전달될 수 있다. 지질 매개의 유전자 전달 방법은 예를 들어, WO 96/18372, WO 93/24640; 문헌 [Mannino & Gould-Fogerite, BioTechniques 6(7): 682-691 (1988)]; 미국 특허 번호 5,279,833; WO 91/06309; 및 [Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7414 (1987)]에 기술되어 있다.
본원에 기술된 신생항원성 펩티드 및 폴리펩티드는 또한 약독화된 바이러스, 예컨대, 백시니아 또는 계두에 의해 발현될 수 있다. 상기 접근법은 본원에 기술된 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현하는 벡터로서 백시니아 바이러스를 사용하는 것을 포함한다. 급성 또는 만성적으로 감염된 숙주 내로, 또는 비감염된 숙주 내로의 도입시, 재조합 백시니아 바이러스는 면역원성 펩티드를 발현하고, 이로써, 숙주 CTL 반응을 유도한다. 면역화 프로토콜에서 유용한 백시니아 벡터 및 방법은 예컨대, 미국 특허 번호 4,722,848에 기술되어 있다. 또 다른 벡터는 BCG(바실루스 칼메트 구에린)이다. BCG 벡터는 문헌 [Stover et al. (Nature 351:456-460 (1991))]에 기술되어 있다. 본원에 기술된 펩티드의 치료적 투여 또는 면역화에 유용한 매우 다양한 다른 벡터는 본원의 설명으로부터 당업자에게 자명할 것이다.
애쥬번트는 면역원성 조성물 내로 혼합되어 치료제에 대한 면역 반응을 증가시키거나, 또는 다르게는 변형시키는 임의의 물질이다. 캐리어는 신생항원성 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드가 회합될 수 있는 스캐폴드 구조체, 예를 들어, 폴리펩티드 또는 다당류이다. 경우에 따라, 애쥬번트는 본원에 기술된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 공유적으로 또는 비공유적으로 접합된다.
항원에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있는 애쥬번트의 능력은 전형적으로 면역 매개 반응의 유의적인 증가, 또는 질환 증상의 감소에 의해 나타난다. 예를 들어, 체액성 면역의 증가는 항원에 대해 유도된 항체 역가의 유의적인 증가에 의해 나타날 수 있고, T 세포 활성의 증가는 증가된 세포 증식, 세포 독성 또는 사이토카인 분비에 의해 나타날 수 있다. 애쥬번트는 또한 예를 들어, 1차 체액성 또는 T 헬퍼 2 반응을 1차 세포성 또는 T 헬퍼 1 반응으로 변화시킴으로써 면역 반응을 변경시킬 수도 있다.
적합한 애쥬번트가 당업계에 공지되어 있고(WO 2015/095811 참조), 이는 폴리(I:C), 폴리ICLC, STING 작용제, 1018 ISS, 알루미늄 염, 암플리박스, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, 이미퀴모드, ImuFact IMP321, IS 패치, ISS, ISCOMATRIX, JuvImmune, LipoVac, MF59, 모노포스포릴 지질 A, 몬타나이드 IMS 1312, 몬타나이드 ISA 206, 몬타나이드 ISA 50V, 몬타나이드 ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, 펩텔® 벡터 시스템, PLG 마이크로입자, 레시퀴모드, SRL172, 비로좀 및 다른 바이러스 유사 입자, YF-17D, VEGF 트랩, R848, 베타 글루칸, Pam3Cys, Pam3CSK4, 사포닌, 마이코박테리아 추출물 및 합성 박테리아 세포벽 모방체로부터 유래된 아퀼라스(Aquila's) QS21 스티뮬론(Aquila Biotech: 미국 매사추세츠주 우스터 소재), 및 다른 전매특허 애쥬번트, 예컨대, 리비스 데톡스(Ribi's Detox), 퀼(Quil) 또는 슈퍼포스(Superfos)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 애쥬번트는 또한 불완전 프로인트(Freund) 또는 GM-CSF를 포함한다. 수지상 세포 및 그의 제제에 특이적인 수개의 면역학적 애쥬번트(예컨대, MF59)가 전에 기술되었다(문헌 [Dupuis M, et al., Cell Immunol. 1998; 186(1):18-27]; [Allison A C; Dev Biol Stand. 1998; 92:3-11])([Mosca et al. Frontiers in Bioscience, 2007; 12:4050-4060])([Gamvrellis et al. Immunol & Cell Biol. 2004; 82: 506-516]). 사이토카인도 사용될 수 있다. 수개의 사이토카인이 림프 조직으로의 수지상 세포 이동에 대한 영향(예컨대, TNF-알파), T 림프구를 위한 효율적인 항원 제시 세포로의 수지상 세포의 성숙의 가속화(예컨대, GM-CSF, PGE1, PGE2, IL-1, IL-1b, IL-4, IL-6 및 CD40L)(미국 특허 번호 5,849,589(상기 특허는 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)) 및 면역애쥬번트로서의 작용(예컨대, IL-12)(문헌 [Gabrilovich D I, et al., J Immunother Emphasis Tumor Immunol. 1996 (6):414-418])과 직접적으로 연관되어 있다.
CpG 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 또한 백신 환경에서 애쥬번트의 효과를 증진시키는 것으로 보고되어 있다. 이론에 의해 제한하지 않으면서, CpG 올리고뉴클레오티드는 톨-유사 수용체(TLR: Toll-like receptor), 주로 TLR9를 통해 선천성(비적응) 면역계를 활성화시킴으로써 작용한다. CpG 촉발된 TLR9 활성화는 펩티드 또는 단백질 항원, 생 또는 사멸 바이러스, 수지상 세포 면역원성 약학 조성물, 자가 세포 면역원성 약학 조성물 및 예방적 및 치료적 면역원성 약학 조성물 둘 모두의 다당류 접합체를 포함한 매우 다양한 항원에 대한 항원 특이적 체액성 및 세포성 반응을 증진시킨다. 중요하게는, 수지상 세포 성숙화 및 분화를 증진시켜, TH1 세포의 활성화를 증진시키고, 강한 세포독성 T 림프구(CTL) 생성을 심지어 CD4 T 세포의 도움이 없는 경우에도 증진시킨다. TLR9 자극에 의해 유도된 Th1 편향은 보통 Th2 편향을 촉진시키는 알룸(alum) 또는 불완전 프로인트 애쥬번트(IFA: incomplete Freund's adjuvant)와 같은 애쥬번트의 존재하에서도 유지된다. CpG 올리고뉴클레오티드는 다른 애쥬번트와 제제화되거나, 그와 함께 동시 투여되는 경우, 또는 특히 항원이 상대적으로 약한 경우에 강한 반응을 유도하는 데 필요한 제제, 예를 들어, 마이크로입자, 나노입자, 지질 에멀젼 또는 유사한 제제에서 훨씬 더 큰 애쥬번트 활성을 보인다. 일부 연구에서 이는 또한 면역 반응을 가속화시키고, 항원 용량을 감소시켜 CpG가 없는 전체 용량 면역원성 약학 조성물에 대하여 유사한 항체 반응을 가지게 할 수 있다(문헌 [Arthur M. Krieg, Nature Reviews, Drug Discovery, 5, June 2006, 471-484]). 미국 특허 번호 6,406,705 B1에는 항원 특이적 면역 반응을 유도하기 위한, CpG 올리고뉴클레오티드, 비핵산 애쥬번트 및 항원의 조합된 사용이 기술되어 있다. 상업적으로 이용가능한 CpG TLR9 길항제는 몰로젠(Mologen)(독일 베를린 소재)에 의한 dSLIM(double Stem Loop Immunomodulator: 이중 스템 루프 면역조절제)이며, 이는 본원에 기술된 약학 조성물의 성분이다. RNA 결합 TLR 7, TLR 8 및/또는 TLR 9와 같은 다른 TLR 결합 분자도 또한 이용될 수 있다.
유용한 애쥬번트의 다른 예로는 치료적으로 및/또는 애쥬번트로서 작용할 수 있는, 화학적으로 변형된 CpG(예컨대, CpR, Idera), 폴리(I:C)(예컨대, 폴리i:CI2U), 비CpG 박테리아 DNA 또는 RNA, TLR8에 대한 ssRNA40 뿐만 아니라, 면역활성 소분자 및 항체, 예컨대, 사이클로포스파미드, 수니티닙, 베바시주맙, 셀레브렉스, NCX-4016, 실데나필, 타달라필, 바르데나필, 소라피닙, XL-999, CP-547632, 파조파닙, ZD2171, AZD2171, 이필리무맙, 트레멜리무맙, 및 SC58175를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 맥락에서 유용한 애쥬번트 및 첨가제의 양 및 농도는 과도한 실험 없이 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 추가의 애쥬번트로는 콜로니 자극 인자, 예컨대, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF: Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor, 사그라모스팀(sargramostim))를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 면역원성 조성물은 1개 초과의 상이한 애쥬번트를 포함할 수 있다. 추가로, 본 발명은 상기 애쥬번트 중 임의의 것 또는 이들의 조합을 포함하는 임의의 애쥬번트 물질을 포함하는 치료 조성물을 포함한다. 신생항원성 치료제(예컨대, 체액성 또는 세포 매개 면역 반응) 또한 고려된다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 신생항원 치료제(예컨대, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, TCR, CAR, TCR 또는 CAR을 함유하는 세포, 폴리펩티드를 함유하는 수지상 세포, 폴리뉴클레오티드를 함유하는 수지상 세포, 항체 등)를 포함하고, 애쥬번트는 적절한 순서로 별개로 투여될 수 있다.
캐리어는 애쥬번트와 독립적으로 존재할 수 있다. 캐리어의 기능은 예를 들어, 돌연변이체의 활성 또는 면역원성을 증가시키거나, 안정성을 부여하거나, 생물학적 활성을 증가시키거나, 또는 혈청 반감기를 증가시키기 위해 특히 돌연변이체의 분자량을 증가시키는 것일 수 있다. 추가로, 캐리어는 T 세포로의 펩티드의 제시를 보조할 수 있다. 캐리어는 당업자에게 공지된 임의의 적합한 캐리어, 예를 들어, 단백질 또는 항원 제시 세포일 수 있다. 캐리어 단백질은 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 단백질, 예컨대, 트랜스페린, 소 혈청 알부민, 인간 혈청 알부민, 티로글로불린 또는 오브알부민, 면역글로불린 또는 호르몬, 예컨대, 인슐린 또는 팔미트산일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 캐리어는 인간 피브로넥틴 타입 III 도메인을 포함한다(문헌 [Koide et al. Methods Enzymol. 2012;503:135-56]). 인간의 면역화를 위하여, 캐리어는 인간에게 허용가능하고, 안전한, 생리적으로 허용되는 캐리어일 수 있다. 그러나, 본 발명의 일부 실시양태에서, 파상풍 톡소이드 및/또는 디프테리아 톡소이드는 적합한 캐리어이다. 대안적으로, 캐리어는 덱스트란, 예를 들어, 세파로스일 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 면역원성을 증가시키기 위해 폴리펩티드를 캐리어에 커플링시키는 것에 대한 대안으로 다중으로 연결된 펩티드로서 합성될 수 있다. 상기 분자는 또한 다중 항원성 펩티드(MAPS: multiple antigenic peptide)로도 공지되어 있다.
면역 반응을 유도하는 신생항원은 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 조합되었을 때 조성물로서 사용될 수 있다. 상기 조성물은 시험관내 또는 생체내 분석을 위해, 또는 질환을 앓는 피험체를 치료하기 위하여 생체내 또는 생체외에서 피험체에게 투여하는 데 유용하다.
따라서, 약학 조성물은 활성 성분 이외에도, 약학적으로 허용되는 부형제, 담체, 완충제, 안정제, 또는 당업자에게 널리 공지된 다른 물질을 포함할 수 있다. 상기 물질은 비독성이어야 하고, 활성 성분의 효능을 방해하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 성질은 투여 경로에 의존할 것이다.
관심의 대상이 되는 단백질, 예컨대, 본원에 기술된 신생항원을 포함하는 약학 제제는 보관을 위해 원하는 정도의 순도를 갖는 신생항원을 임의적인 생리적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제와 혼합함으로써 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Oslo, A. Ed. (1980)]) 동결 건조된 형태 또는 수용액 형태로 제조될 수 있다. 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성인 것이며, 이는 완충제, 예컨대, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 항산화제(아스코르브산 및 메티오닌 포함); 보존제(예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대, EDTA; 당, 예컨대, 수크로스, 만닛톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대 이온, 예컨대, 나트륨; 금속 복합체(예컨대, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대, TWEEN®, PLURONICS® 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
허용되는 담체는 투여받는 환자에게 생리적으로 허용되는 것이며, 이는 그와 함께/그 안에서 투여된 화합물의 치료적 특성을 유지시킨다. 허용되는 담체 및 그의 제제는 일반적으로 예를 들어, 문헌 [Remington' pharmaceutical Sciences (18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA 1990)]에 기술되어 있다. 한 예시적인 담체로는 생리 염수가 있다. 약학적으로 허용되는 담체는, 대상 화합물을 신체의 한 기관, 또는 신체 일부의 투여 부위로부터 또 다른 기관 또는 또 다른 신체 일부로, 또는 시험관내 검정 시스템에서 운반 또는 수송하는 데 관여하는 약학적으로 허용되는 물질, 조성물, 또는 비히클, 예컨대, 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질이다. 허용되는 담체는 제제의 다른 성분과 화합성을 띠고, 그를 투여받는 피험체에게 해롭지 않은 것이다. 허용되는 담체는 신신항원의 특이적 활성도 변경시키지 않아야 한다.
한 측면에서, 본원에서는 약제 투여와 화합성을 띠는, 용매(수성 또는 비수성), 용액, 에멀젼, 분산 매질, 코팅제, 등장성 및 흡수 촉진제 또는 지연제를 포함하는 약학적으로 허용되는 또는 생리적으로 허용되는 조성물을 제공한다. 그러므로, 약학 조성물 또는 약학 제제란, 피험체에서 약학적 용도로 적합한 조성물을 지칭한다. 약학 조성물 및 제제는 일정량의 신생항원(또는 신생항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드), 및 약학적으로 또는 생리적으로 허용되는 담체를 포함한다. 조성물은 특정 투여 경로(즉, 전신 또는 국부)와 화합성을 띠도록 제제화될 수 있다. 따라서, 조성물은 다양한 경로에 의한 투여에 적합한 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 조성물 중 신생항원의 안정성을 개선시키기 위해, 및/또는 조성물의 방출 속도를 조절하기 위해 허용되는 첨가제를 추가로 포함한다. 허용되는 첨가제는 신생항원의 특이적 활성을 변경시키지 않는다. 예시적인 허용되는 첨가제로는 당, 예컨대, 만닛톨, 소르비톨, 글루코스, 크실리톨, 트레할로스, 소르보스, 수크로스, 갈락토스, 덱스트란, 덱스트로스, 프럭토스, 락토스 및 그의 혼합물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 허용되는 첨가제는 허용되는 담체 및/또는 부형제, 예컨대, 덱스트로스와 조합될 수 있다. 대안적으로, 예시적인 허용되는 첨가제는 펩티드의 안정성을 증가시키기 위해, 및 용액의 겔화를 감소시키기 위해, 계면활성제, 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 계면활성제는 용액 0.01% 내지 5%인 양으로 조성물에 첨가될 수 있다. 상기 허용되는 첨가제의 첨가로 보관 중 조성물의 안정성 및 반감기는 증가된다.
약학 조성물은 예를 들어, 주사에 의해 투여될 수 있다. 주사용 조성물은 수수성 액제(수용성인 경우) 또는 분산제, 및 멸균 주사용 액제 또는 분산제를 즉석에서 제조하기 위한 멸균 분제를 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체로는 생리 염수, 정균 주사용 멸균수, 또는 포스페이트 완충처리된 염수(PBS: phosphate buffered saline)를 포함한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 유동성은 예를 들어, 코팅제, 예컨대, 레시틴 사용에 의해, 분산제인 경우, 원하는 입자 크기를 유지시킴으로써, 및 계면활성제 사용에 의해 유지될 수 있다. 항박테리아제 및 항진균제로는 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산 및 티메로살을 포함한다. 등장제, 예를 들어, 당, 폴리알콜, 예컨대, 만닛톨, 소르비톨, 및 염화나트륨이 조성물에 포함될 수 있다. 생성된 용액은 있는 그대로 사용을 위해 패키징되거나, 동결 건조될 수 있고; 여기서, 동결 건조된 제제는 추후 투여 전에 멸균 용액과 조합될 수 있다. 정맥내 주사, 또는 환부에의 주사를 위해, 활성 성분은 발열원을 함유하지 않고, pH, 등장성 및 안정성이 적합한 비경구적으로 허용되는 수용액 형태일 것이다. 당업자는 예를 들어, 등장성 비히클, 예컨대, 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 락테이트화된 링거 주사액을 이용하여 적합한 액제를 제조할 수 있다. 보존제, 안정제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 필요에 따라 포함될 수 있다. 멸균 주사액은 적절한 용매 중에 활성 성분을 필요한 양으로 필요에 따라 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 이들의 조합과 함께 도입한 후, 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산제는 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 활성 성분을 도입함으로써 제조된다. 멸균 주사액 제조를 위한 멸균 분제인 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조하여 활성 성분의 분말을 그의 이전 멸균 여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 바람직한 성분과 함께 수득하는 것이다.
조성물은 통상 예컨대, 단위 용량의 주사에 의해 정맥내로 투여될 수 있다. 주사를 위해, 활성 성분은 실질적으로 발열원을 함유하지 않고, pH, 등장성 및 안정성이 적합한 비경구적으로 허용되는 수용액 형태일 수 있다. 예를 들어, 등장성 비히클, 예컨대, 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 락테이트화된 링거 주사액을 이용하여 적합한 액제를 제조할 수 있다. 보존제, 안정제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 필요에 따라 포함될 수 있다. 추가로, 조성물은 에어로졸화를 통해 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 예를 들어, 보관시 저장 기간을 연장시키기 위해 동결 건조된다. 조성물이 본원에 제공된 의약 또는 방법 중 임의의 것에서의 사용을 위한 것으로 간주될 때, 조성물은 실질적으로 발열원을 함유할 수 없고, 이로써 조성물은 인간 환자에게 투여되었을 때, 염증성 반응 또는 불안전한 알레르기 반응을 유발하지 않을 것으로 예상된다. 발열원에 대하여 조성물을 테스트하고, 실질적으로 발열원을 함유하지 않는 조성물을 제조하는 것은 당업자 또는 당업자 또는 당업계의 숙련가에 의해 잘 이해되고 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 사용하여 달성될 수 있다.
허용되는 담체는 안정화시키거나, 흡수를 증가 또는 지연시키거나, 또는 제거를 증가 또는 지연시키는 화합물을 함유할 수 있다. 상기 화합물로는 예를 들어, 탄수화물, 예컨대, 글루코스, 수크로스, 또는 덱스트란; 저분자량 단백질; 펩티드의 제거 또는 가수분해를 감소시키는 조성물; 또는 부형제 또는 다른 안정제 및/또는 완충제를 포함한다. 흡수를 지연시키는 작용제로는 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함한다. 리포솜 담체를 비롯한, 계면활성제 또한 약학 조성물을 안정화시키기 위해, 또는 그의 흡수를 증가 또는 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 분해로부터 보호하기 위해, 화합물은 조성물과 복합체를 형성함으로써 산성 및 효소적 가수분해에 대해 내성을 가지게 할 수 있거나, 화합물은 적절하게 내성을 띠는 담체, 예컨대, 리포솜에서 복합체를 형성할 수 있다.
조성물은 투여 제제와 화합성을 띠는 방식으로 및 치료적 유효량으로 투여될 수 있다. 투여되는 정량은 치료하고자 하는 피험체, 활성 성분을 이용할 수 있는 피험체의 면역계의 능력, 및 원하는 결합능 정도에 의존한다. 투여되어야 하는 활성 성분의 정확한 양은 실무자의 판단에 의존하고, 각 개체마다 고유하다. 초기 투여 및 부스터 샷을 위해 적합한 요법 또한 가변적이지만, 초기 투여 후 1시간 이상의 간격을 두고 반복 투약된 후, 이어서, 주사하거나, 또는 다른 투여하는 것이 전형적이다. 대안적으로, 혈액 중 농도를 유지시키는 데 충분한 연속 정맥내 주입이 고려된다.
펩티드 기반 면역원성 약학 조성물은 적합하게 및 당업계에서 이해되는 바와 같이, 널리 공지된 기술, 담체, 및 부형제 중 임의의 것을 사용하여 제제화될 수 있다. 폴리펩티드는 동일한 서열을 함유하는 다중 폴리펩티드로 이루어진 칵테일, 또는 상이한 폴리펩티드의 다중 카피로 이루어진 칵테일일 수 있다. 펩티드는 예컨대, 예를 들어, 지질화, 또는 캐리어 단백질에의 부착에 의해 변형될 수 있다. 지질화는 지질 기의 폴리펩티드에의 부착일 수 있다. 지질화된 펩티드, 또는 지질화된 폴리펩티드는 구조를 안정화시킬 수 있고, 치료 효능을 증진시킬 수 있다.
지질화는 여러 상이한 유형, 예컨대, N-미리스토일화, 팔미토일화, GPI 앵커 부가, 프레닐화, 및 수개의 추가적인 변형 유형으로 분류될 수 있다. N-미리스토일화는 미리스테이트인 C14 포화 산의 글리신 잔기에의 공유 부착이다. 팔미토일화는 장쇄 지방산(C16)의 시스테인 잔기에의 티오에스테르 결합이다. GPI 앵커 부가는 아미드 결합을 통한 글리코실 포스파티딜이노시톨(GPI: glycosyl-phosphatidylinositol) 결합이다. 프레닐화는 이소프레노이드 지질(예컨대, 파르네실(C-15), 게라닐게라닐(C-20))의 시스테인 잔기에의 티오에스테르 결합이다. 추가 변형 유형으로는 시스테인의 황 원자에 의한 S-디아실글리세롤의 부착, 세린 또는 트레오닌 잔기를 통한 O-옥타노일 접합, 시스테인 잔기에의 S-알케이올 접합, 및 콜레스테롤 부착을 포함할 수 있다.
지질화된 펩티드를 생성하기 위한 지방산은 C2 내지 C30 포화, 단일불포화, 또는 다중불포화 지방 아실 기를 포함할 수 있다. 예시적인 지방산은 팔미토일, 미리스토일, 스테아로일 및 데카노일 기를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 외인성 애쥬번트의 부재하에서 면역원성을 유도하거나, 또는 증진시키기 위해 애쥬번트 특성을 갖는 지질 모이어티가 관심의 대상이 되는 폴리펩티드에 부착된다. 지질화된 펩티드 또는 지질펩티드는 자기 애쥬번트 지질펩티드로서 지칭될 수 있다. 상기 및 본원 다른 곳에 기술된 지방산 중 임의의 것은 관심의 대상이 되는 폴리펩티드의 면역원성을 유도하거나, 또는 증진시킬 수 있다. 면역원성을 유도하거나, 또는 증진시킬 수 있는 지방산은 팔미토일, 미리스토일, 스테아로일, 라우로일, 옥타노일, 및 데카노일 기를 포함할 수 있다.
폴리펩티드, 예컨대, 네이키드 펩티드 또는 지질화된 펩티드는 리포솜 내로 도입될 수 있다. 종종, 지질화된 펩티드는 리포솜 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 지질화된 펩티드의 지질부가 리포솜의 지질 이중층 내로 자발적으로 통합될 수 있다. 이로써, 지질펩티드가 리포솜의 "표면" 상에 제시될 수 있다.
제제에서의 도입을 위해 적합한 예시적인 리포솜으로는 다층막 소포체(MLV: multilamellar vesicle), 올리고층막 소포체(OLV: oligolamellar vesicle), 단층막 소포체(UV: unilamellar vesicle), 소형 단층막 소포체(SUV: small unilamellar vesicle), 중간 크기 단층막 소포체(MUV: medium-sized unilamellar vesicle), 대형 단층막 소포체(LUV: large unilamellar vesicle), 거대 단층막 소포체(GUV: giant unilamellar vesicle), 다중소포 소포체(MVV: multivesicular vesicle), 역상 증발 방법(REV)에 의해 제조된 단일 또는 올리고층막 소포체, 역상 증발 방법에 의해 제조된 다층막 소포체(MLV-REV: multilamellar vesicles made by the reverse-phase evaporation method), 안정형 다층막 소포체(SPLV: stable plurilamellar vesicle), 냉동 및 해동 MLV(FATMLV: frozen and thawed MLV), 압출 방법에 의해 제조된 소포체(VET: vesicle prepared by extrusion method), 프렌치 프레스에 의해 제조된 소포체(FPV: vesicle prepared by French press), 융합에 의해 제조된 소포체(FUV: vesicle prepared by fusion), 탈수-수화 소포체(DRV: dehydration-rehydration vesicle), 및 버블좀(BSV)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
제조 방법에 의존하여, 리포솜은 단층막 또는 다층막일 수 있고, 그 크기는 직경이 약 0.02 ㎛ 내지 약 10 ㎛ 초과 범위인 크기로 달라질 수 있다. 리포솜은 많은 유형의 세포를 흡수한 후, 도입된 작용제(예컨대, 본원에 기술된 펩티드)를 방출할 수 있다. 일부 경우에서, 리포솜은 표적 세포와 융합되고, 후, 그에 따라 리포솜의 내용물을 표적 세포 내로 옮긴다. 리포솜은 포식성 세포에 의해 세포내이입될 수 있다. 세포내이입 후, 리포솜 지질의 리소좀내 분해 및 캡슐화된 작용제의 방출이 진행될 수 있다.
본원에서 제공된 리포솜은 또한 캐리어 지질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 캐리어 지질은 인지질이다. 리포솜을 형성할 수 있는 캐리어 지질로는 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 포스파티딜콜린(PC; 레시틴), 포스파티드산(PA), 포스파티딜글리세롤(PG), 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜세린(PS)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다른 적합한 인지질로는 추가로 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디미리스토일포스파티딜글리세롤 (DMPG), 디팔미토일포스파티드산 (DPPA); 디미리스토일포스파티드산(DMPA), 디스테아로일포스파티드산(DSPA), 디팔미토일포스파티딜세린(DPPS), 디미리스토일포스파티딜세린(DMPS), 디스테아로일포스파티딜세린(DSPS), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민 (DPPE), 디미리스토일포스파티딜에탄올아민(DMPE), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE) 등, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리포솜은 리포솜 형성을 조절하는 스테롤(예컨대, 콜레스테롤)을 추가로 포함한다. 캐리어 지질은 임의의 공지된 비포스페이트 극성 지질일 수 있다.
약학 조성물은 널리 공지된 기술을 사용하여 리포솜 내로 캡슐화될 수 있다. 생분해성 미소구체 또한 본 발명의 약학 조성물을 위한 캐리어로서 사용될 수 있다.
약학 조성물은 리포솜 또는 미소구체(또는 마이크로입자)로 투여될 수 있다. 환자에게 투여하기 위한 리포솜 및 미소구체를 제조하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 본질적으로 물질을 수용액에 용해시키고, 요구시, 계면활성제와 함께, 적절한 인지질 및 지질을 첨가하고, 필요에 따라, 물질을 투석시키거나, 또는 초음파 처리한다.
중합체 또는 단백질로 형성된 미소구체는 당업자에게 널리 공지되어 있고, 이는 위장관을 통해 혈류 내로 직접 유입되도록 적합화될 수 있다. 대안적으로, 화합물이 도입될 수 있고, 수일 내지 수개월 범위의 기간 동안 저속 방출을 위해 미소구체, 또는 미소구체의 복합체가 이식될 수 있다.
폴리펩티드는 또한 전달을 위해 캐리어 단백질에 부착될 수 있다. 캐리어 단백질은 면역원성 캐리어 요소일 수 있고, 임의의 재조합 기술에 의해 부착될 수 있다. 예시적인 캐리어 단백질로는 매리컬처 키홀 림펫 헤모시아닌(mcKLH: Mariculture keyhole limpet hemocyanin), PEG화된 mcKLH, 블루 캐리어* 프로테인(Blue Carrier* Protein), 소 혈청 알부민(BSA: bovine serum albumin), 양이온화된 BSA, 오브알부민, 및 박테리아 단백질, 예컨대, 파상풍 톡소이드(TT: tetanus toxoid)를 포함한다.
폴리펩티드는 또한 다중 항원성 펩티드(MAP)로서 제조될 수 있다. 펩티드는 N 말단 또는 C 말단에서 소형 비면역원성 코어에 부착될 수 있다. 상기 코어 상에 구축된 펩티드는 고도로 국재화된 펩티드 밀도를 제공할 수 있다. 코어는 이작용성 유닛으로 구성된 수지상 코어 잔기 또는 매트릭스일 수 있다. MAP를 구성하는 데 적합한 코어 분자로는 암모니아, 에틸렌디아민, 아스파르트산, 글루탐산, 및 리신을 포함할 수 있다. 예를 들어, 리신 코어 분자는 펩티드 결합에 의해 그의 각 아미노 기를 통해 2개의 추가 리신에 부착될 수 있다.
폴리펩티드는 화학적으로 합성될 수 있거나, 또는 세포 시스템 또는 무세포 시스템에서 재조합적으로 발현될 수 있다. 펩티드는 예컨대, 액체상 합성, 고체상 합성에 의해, 또는 마이크로웨이브 지원 펩티드 합성에 의해 합성될 수 있다. 폴리펩티드는 예컨대, 예를 들어, 아실화, 알킬화, 아미드화, 아르기닐화, 폴리글루타밀화, 폴리글리실화(polyglycylation), 부티릴화, 감마-카르복실화, 글리코실화, 말로닐화, 하이드록실화, 아이오딘화, 뉴클레오티드 부가(예컨대, ADP-리보실화), 산화, 인산화, 아데닐화, 프로피오닐화, S-글루타티오닐화, S-니트로실화, 숙시닐화, 황산화, 당화, 팔미토일화, 미리스토일화, 이소프레닐화 또는 프레닐화(예컨대, 파르네실화 또는 게라닐게라닐화), GPI화(glypiation), 리포일화, 플라빈 모이어티(예컨대, FMN 또는 FAD) 부착, 헴 C 부착, 포스포판테테이닐화, 레티닐리덴 시프 염기 형성, 디프타미드 형성, 에탄올아민 포스포글리세롤 부착, 하이푸신 제조, 비오티닐화, 페길화, ISG화, SUMU화, 유비퀴틴화, 네딜화(Neddylation), 퍼필화(Pupylation), 시트룰린화, 탈아미드화, 엘리미닐화, 카바밀화, 또는 이들의 조합에 의해 변형될 수 있다.
폴리펩티드 생성 후, 폴리펩티드는 1 라운드 이상의 정제 단계를 거쳐 불순물이 제거될 수 있다. 정제 단계는 분리 방법을 이용하는 크로마토그래피 단계, 예컨대, 친화성 기반, 크기 배제 기반, 이온 교환 기반의 것일 수 있다. 일부 경우에서, 폴리펩티드는 최대 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 99.9%, 또는 100% 순수하거나, 또는 불순물이 존재하지 않을 수 있다. 일부 경우에서, 폴리펩티드는 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 99.9%, 또는 100% 순수하거나, 또는 불순물이 존재하지 않을 수 있다.
폴리펩티드는 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 아미노산 잔기는 아미노 기 및 카르복실 기, 둘 모두를 함유하는 분자를 지칭할 수 있다. 적합한 아미노산으로는 제한 없이, 자연적으로 발생된 아미노산의 D- 및 L-이성질체 뿐만 아니라, 유기 합성 또는 다른 대사 경로에 의해 제조된 비자연적으로 발생된 아미노산을 포함한다. 본원에서 사용되는 바, 아미노산이라는 용어는 제한 없이, α-아미노산, 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 및 아미노산 유사체를 포함한다.
"α-아미노산"이라는 용어는 α-탄소로 지정된 탄소에 결합된 카르복실 기 및 아미노 기, 둘 모두를 함유하는 분자를 지칭할 수 있다.
"β-아미노산"이라는 용어는 β 입체배열로 카르복실 기 및 아미노 기, 둘 모두를 함유하는 분자를 지칭할 수 있다.
"자연적으로 발생된 아미노산"이란, 자연상에서 합성된 펩티드에서 보편적으로 발견되고, 1문자 약어 A, R, N, C, D, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 및 V로 공지되어 있는 20종의 아미노산 중 어느 하나를 지칭할 수 있다. 천연 아미노산의 특성에 관한 요약을 보여주는 표는 예컨대, 미국 특허 출원 번호 20130123169(상기 특허는 본원에서 참조로 포함된다)에서 살펴볼 수 있다.
본원에 제공된 펩티드는 하나 이상의 소수성, 극성, 또는 하전된 아미노산을 포함할 수 있다. "소수성 아미노산"은 작은 소수성 아미노산 및 큰 소수성 아미노산을 포함한다. "작은 소수성 아미노산"은 글리신, 알라닌, 프롤린, 및 그의 유사체일 수 있다. "큰 소수성 아미노산"은 발린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판, 및 그의 유사체일 수 있다. "극성 아미노산"은 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 티로신, 및 그의 유사체일 수 있다. "하전된 아미노산"은 리신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르테이트, 글루타메이트, 및 그의 유사체일 수 있다.
본원에 제공된 펩티드는 하나 이상의 아미노산 유사체를 포함할 수 있다. "아미노산 유사체"는 아미노산과 구조상 유사하고, 펩티도미메틱 마크로사이클 형성에서 아미노산 대신으로 치환될 수 있는 분자일 수 있다. 아미노산 유사체로는 제한 없이, β-아미노산 및 아미노 또는 카르복시 기가 유사한 반응기로 치환된 아미노산을 포함한다(예컨대, 1급 아민의 2급 또는 3급 아민으로의 치환, 또는 카르복시 기의 에스테르로의 치환).
본원에 제공된 펩티드는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. "비천연 아미노산"은 자연상에서 합성된 펩티드에서 보편적으로 발견되고, 1문자 약어 A, R, N, C, D, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 및 V로 공지되어 있는 20종의 아미노산 중 하나가 아닌 아미노산일 수 있다. 비천연 아미노산 또는 아미노산 유사체는 예컨대, 미국 특허 출원 공개 번호 20130123169(상기 특허는 본원에서 참조로 포함된다)에 개시된 구조를 포함한다.
아미노산 유사체는 β-아미노산 유사체를 포함할 수 있다. β-아미노산 유사체 및 알라닌, 발린, 글리신, 류신, 아르기닌, 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 시스테인, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 및 트립토판의 유사체의 예는 예컨대, 미국 특허 출원 공개 번호 20130123169(상기 특허는 본원에서 참조로 포함된다)에 개시된 구조를 포함할 수 있다.
아미노산 유사체는 라세미체일 수 있다. 일부 경우에서, 아미노산 유사체의 D 이성질체가 사용된다. 일부 경우에서, 아미노산 유사체의 L 이성질체가 사용된다. 일부 경우에서, 아미노산 유사체는 R 또는 S 입체배열로 존재하는 키랄 중심을 포함한다. 종종, β-아미노산 유사체의 아미노 기(들)는 보호기, 예컨대, tert-부틸옥시카르보닐(BOC 기), 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(FMOC), 토실 등으로 치환된다. 종종, β-아미노산 유사체의 카르복실산 작용기는 예컨대, 그의 에스테르 유도체와 같이 보호된다. 일부 경우에서, 아미노산 유도체의 염이 사용된다.
"비필수" 아미노산 잔기는 폴리펩티드의 필수 생물학적 또는 생화학적 활성(예컨대, 수용체 결합 또는 활성화)를 파기하거나, 또는 실질적으로 변경시키지 않으면서, 폴리펩티드의 야생형 서열로부터 변경될 수 있는 잔기일 수 있다. "필수" 아미노산 잔기는 폴리펩티드의 야생형 서열로부터 변경되었을 때, 폴리펩티드의 필수적인 생물학적 또는 생화학적 활성을 파기하거나, 또는 실질적으로 변경시키는 잔기일 수 있다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것일 수 있다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리가 당업계에 정의되어 있다. 상기 패밀리는 염기성 측쇄(예컨대, K, R, H), 산성 측쇄(예컨대, D, E), 비하전된 극성 측쇄(예컨대, G, N, Q, S, T, Y, C), 비극성 측쇄(예컨대, A, V, L, I, P, F, M, W), 베타 분지형 측쇄(예컨대, T, V, I) 및 방향족 측쇄(예컨대, Y, F, W, H)를 갖는 아미노산을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 폴리펩티드 중 비필수 아미노산 잔기로 예측되는 것을 동일한 측쇄 패밀리로부터의 또 다른 아미노산 잔기로 대체할 수 있다. 허용되는 치환의 또 다른 예는 동배체성 고려 사항(예컨대, 메티오닌을 대신하여 노르류신으로), 또는 다른 특성(예컨대, 페닐알라닌을 대신하여 2-티에닐알라닌으로, 또는 트립토판을 대신하여 6-Cl-트립토판으로)에 기초한 치환일 수 있다.
핵산 기반 면역원성 약학 조성물 또한 피험체에게 투여될 수 있다. 핵산 기반 면역원성 약학 조성물은 적합하게 및 당업계에서 이해되는 바와 같이, 널리 공지된 기술, 담체, 및 부형제 중 임의의 것을 사용하여 제제화될 수 있다. 핵산은 DNA, 게놈 DNA 또는 cDNA, RNA, 또는 하이브리드일 수 있고, 여기서, 핵산은 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드의 조합, 및 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 크산틴, 히포크산틴, 이소시토신, 및 이소구아닌을 비롯한 염기의 조합을 함유할 수 있다. 핵산은 화학적 합성 방법에 의해 또는 재조합 방법에 의해 수득될 수 있다. 면역원성 약학 조성물은 DNA 기반 면역원성 약학 조성물, RNA 기반 면역원성 약학 조성물, 하이브리드 DNA/RNA 기반 면역원성 약학 조성물, 또는 하이브리드 핵산/펩티드 기반 면역원성 약학 조성물일 수 있다. 펩티드는 표 1 및 2 중의 펩티드로부터 유래된 펩티드, 표 1 및 2 중의 펩티드와 서열 상동성이 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상인 서열을 갖는 펩티드, 또는 표 1 및 2 중의 펩티드와 서열 상동성이 최대 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상인 서열을 갖는 펩티드일 수 있다.
본원에 기술된 핵산은, 비록 일부 경우에서는 하기에서 개요되는 바와 같이(예를 들어, 프라이머 및 프로브, 예컨대, 표지 프로브 구성에서) 예를 들어, 포스포라미드, 포스포로티오에이트, O-메틸포스포로아미다이트 연결부, 및 펩티드 핵산 백본 및 연결부를 포함하는, 대체 백본을 가질 수 있는 핵산 유사체가 포함되지만, 포스포디에스테르 결합을 함유할 수 있다. 다른 유사체 핵산으로는 잠금 핵산, 양의 골격 및 비리보스 백본을 포함하는 비사이클릭 구조를 갖는 것을 포함한다. 하나 이상의 카르보사이클릭 당을 함유하는 핵산 또한 핵산의 정의 내에 포함된다. 잠금 핵산(LNA: locked nucleic acid) 또한 핵산 유사체의 정의 내에 포함된다. LNA는 리보스 고리가 2'-O 원자를 4'-C 원자와 연결하는 메틸렌 브릿지에 의해 "잠금화된" 핵산 유사체 부류이다. 리보스-포스페이트 백본에 대한 상기 변형은 생리적 환경에서의 상기 분자의 안정성 및 반감기를 증가시키기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, PNA:DNA 및 LNA-DNA 하이브리드는 더 높은 안정성을 나타낼 수 있고, 이로써, 일부 실시양태에서 사용될 수 있다. 핵산은 명시된 바와 같이 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있거나, 이중 가닥 또는 단일 가닥, 둘 모두의 일부를 함유할 수 있다. 적용에 의존하여, 핵산은 DNA(예컨대, 게놈 DNA, 미토콘드리아 DNA, 및 cDNA 포함), RNA(예컨대, mRNA 및 rRNA 포함) 또는 하이브리드일 수 있고, 여기서, 핵산은 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드의 조합, 및 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 크산틴, 히포크산틴, 이소시토신, 이소구아닌 등을 비롯한 염기의 조합을 함유할 수 있다.
핵산 기반 면역원성 약학 조성물은 벡터 형태일 수 있다. 벡터는 환형 플라스미드 또는 선형 핵산일 수 있다. 환형 플라스미드 또는 선형 핵산은 적절한 피험체 세포에서 특정 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시할 수 있다. 벡터는, 종결 신호에 작동 가능하게 연결될 수 있는 폴리펩티드 코딩 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 가질 수 있다. 벡터는 뉴클레오티드 서열의 적절한 번역을 위해 필요한 서열을 함유할 수 있다. 관심의 대상이 되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터는 키메라일 수 있고, 이는 그의 성분 중 적어도 하나는 그의 다른 성분들 중 적어도 하나와 관련하여 이종성일 수 있다는 것을 의미한다. 발현 카세트 중의 뉴클레오티드 서열의 발현은 구성적 프로모터의 제어하에 있을 수 있거나, 또는 숙주 세포가 일부 특정 내부 또는 외부 자극에 노출되었을 때에만 전사를 개시할 수 있는 유도성 프로모터의 제어하에 있을 수 있다.
벡터는 플라스미드일 수 있다. 플라스미드는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산으로 세포를 형질감염시키는 데 유용할 수 있고, 형질전환된 숙주 세포는 폴리펩티드의 발현이 이루어지는 조건하에서 배양되고, 유지될 수 있다.
플라스미드는 본원에 개시된 다양한 폴리펩티드 중 하나 이상의 것을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 단일 플라스미드는 단일 폴리펩티드에 대한 코딩 서열, 또는 1개 초과의 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 함유할 수 있다. 종종, 플라스미드는 애쥬번트, 예컨대, 면역 자극 분자, 예컨대, 사이토카인을 코딩하는 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다.
플라스미드는 코딩 서열 상류에 존재할 수 있는 개시 코돈, 및 코딩 서열 하류에 존재할 수 있는 정지 코돈을 추가로 포함할 수 있다. 개시 및 종결 코돈은 코딩 서열과 인 프레임으로 위치할 수 있다. 플라스미드는 또한 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터, 및 코딩 서열 상류의 인핸서를 포함할 수 있다. 인핸서는 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 또는 바이러스 인핸서, 예컨대, CMV, FMDV, RSV 또는 EBV로부터의 것일 수 있다.
플라스미드는 또한 플라스미드를 염색체외에서 유지하기 위해, 및 세포에서 플라스미드의 다수 카피를 제조하기 위해 포유동물 복제 기점을 포함할 수 있다. 플라스미드는 또한 플라스미드가 투여되는 세포에서의 유전자 발현을 위해 잘 적합화될 수 있는 조절 서열을 포함할 수 있다. 코딩 서열은 숙주 세포에서 코딩 서열이 더욱 효율적으로 전사될 수 있게 할 수 있는 코돈을 포함할 수 있다.
핵산 기반 면역원성 약학 조성물은 전기천공을 통해 피험체에게 효율적으로 전달될 수 있고, 본원에 개시된 하나 이상의 폴리펩티드를 발현할 수 있는, 선형 핵산 면역원성 약학 조성물, 또는 선형 발현 카세트일 수 있다.
세포 기반 면역원성 약학 조성물 또한 피험체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 항원 제시 세포(APC) 기반 면역원성 약학 조성물은 적합하게 및 당업계에서 이해되는 바와 같이, 널리 공지된 기술, 담체, 및 부형제 중 임의의 것을 사용하여 제제화될 수 있다. APC는 단핵구, 단핵구 유래 세포, 대식세포, 및 수지상 세포를 포함한다. 종종, APC 기반 면역원성 약학 조성물은 수지상 세포 기반 면역원성 약학 조성물일 수 있다.
수지상 세포 기반 면역원성 약학 조성물은 당업계에 널리 공지된 임의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일부 경우에서, 수지상 세포 기반 면역원성 약학 조성물은 생체외 또는 생체내 방법을 통해 제조될 수 있다. 생체외 방법은 환자 내로 투여하기 전에 DC를 활성화시키기 위해, 또는 생체외 또는 생체내를 로딩하기 위해, 생체외에서 본원에 기술된 폴리펩티드로 펄싱된 자가 DC를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 생체내 방법은 본원에 기술된 폴리펩티드와 커플링된 항체를 사용하여 특이적인 DC 수용체를 표적화하는 것을 포함할 수 있다. DC 기반 면역원성 약학 조성물은 DC 활성인자, 예컨대, TLR3, TLR-7-8, 및 CD40 작용제를 추가로 포함할 수 있다. DC 기반 면역원성 약학 조성물은 애쥬번트, 및 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다.
애쥬번트는 면역원성 약학 조성물을 받은 환자에서 유도되는 면역 반응(체액성 및/또는 세포성)을 증진시키는 데 사용될 수 있다. 종종, 애쥬번트는 Th1 타입 반응을 유도할 수 있다. 다른 경우에서, 애쥬번트는 Th2 타입 반응을 유도할 수 있다. Th1 타입 반응은, 사이토카인, 예컨대, IL-4, IL-5 및 IL-10 생산을 특징으로 할 수 있는 Th2 타입 반응과 달리, 사이토카인, 예컨대, IFN-γ 생산을 특징으로 할 수 있다.
일부 측면에서, 지질 기반 애쥬번트, 예컨대, MPLA 및 MDP가 본원에 개시된 면역원성 약학 조성물과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 모노포스포릴 지질 A(MPLA: monophosphoryl lipid A)는 리포솜 항원의 특이적인 T 림프구로의 제시를 증가시키는 애쥬번트이다. 추가로, 무라밀 디펩티드(MDP: muramyl dipeptide) 또한 본원에 기술된 면역원성 약학 제제와 함께 적합한 애쥬번트로서 사용될 수 있다.
애쥬번트는 또한 자극성 분자, 예컨대, 사이토카인를 포함할 수 있다. 사이토카인의 비제한적인 예로는 CCL20, a-인터페론(IFN-a), β-인터페론 (IFN-β), γ-인터페론, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF: platelet derived growth factor), TNFa, TNFp, GM-CSF, 표피 성장 인자(EGF: epidermal growth factor), 피부 T 세포 유인 케모카인(CTACK: cutaneous T cell-attracting chemokine), 상피 흉선 발현 케모카인(TECK: epithelial thymus-expressed chemokine), 점막 연관 상피 케모카인(MEC: mucosae-associated epithelial chemokine), IL-12, IL-15, IL-28, MHC, CD80, CD86, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-18, MCP-1, MIP-1a, MIP-1-, IL-8, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-18의 돌연변이체 형태, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Fit, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DRS, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카스파제 ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 불활성 NIK, SAP K, SAP-I, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK 리간드, Ox40, Ox40 리간드, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, 및 TAP2를 포함한다.
추가의 애쥬번트로는 MCP-1, MIP-1a, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, 돌연변이체 forms of IL-18, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, IL-7, IL-22, 신경 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Fit, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카스파제 ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 불활성 NIK, SAP K, SAP-1, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK 리간드, Ox40, Ox40 리간드, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 및 그의 기능성 단편을 포함한다.
일부 측면에서, 애쥬번트는 톨 유사 수용체의 조절인자일 수 있다. 톨 유사 수용체의 조절인자의 예로는 TLR-9 작용제를 포함하고, 톨 유사 수용체의 소분자 조절인자, 예컨대, 이미퀴모드로 제한되지 않는다. 본원에 기술된 면역원성 약학 조성물과 함께 조합하여 사용되는 애쥬번트의 다른 예로는 사포닌, CpG ODN 등을 포함하고, 이에 제한되지 않는다. 종종, 애쥬번트는 박테리아 톡소이드, 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 중합체, 알루미늄 염, 리포솜, CpG 중합체, 수중유 에멀젼, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 종종, 애쥬번트는 수중유 에멀젼이다. 수중유 에멀젼은 적어도 하나의 오일 및 적어도 하나의 계면활성제를 포함할 수 있고, 여기서, 오일(들) 및 계면활성제(들)은 생분해성(대사가능)이고, 생체적합성일 수 있다. 에멀젼 중 유적의 직경은 5 ㎛ 미만일 수 있고, 심지어는 직경이 1 ㎛ 미만(sub-micron)일 수 있고, 이러한 작은 크기는 안정적인 에머졀을 제공하기 위해 마이크로플루이다이저로 달성될 수 있다. 크기가 220 nm 미만인 소적은 여과 멸균될 수 있다.
일부 경우에서, 면역원성 약학 조성물은 담체 및 부형제(제한하는 것은 아니지만, 완충제, 탄수화물, 만닛톨, 단백질, 폴리펩티드 또는 아미노산, 예컨대, 글리신, 항산화제, 정균제, 킬레이트화제, 현탁화제, 증점제 및/또는 보존제 포함), 물, 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것, 예컨대, 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 등을 비롯한, 오일, 염수 용액, 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액, 향미제, 착색제, 탈점착화제 및 다른 허용되는 첨가제, 애쥬번트, 또는 결합제, 필요에 따라, 생리적 조건과 유사하도록 만드는 다른 약학적으로 허용되는 보조 물질, 예컨대, pH 완충화제, 장성 조정제, 유화제, 습윤화제 등을 포함할 수 있다. 부형제의 예로는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 소맥분, 초크, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 탈지 분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 또 다른 경우에, 약학 제제는 실질적으로 보존제를 함유하지 않는다. 다른 경우에, 약학 제제는 적어도 하나의 보존제를 함유할 수 있다. 당업계의 숙련가에게 공지된 임의의 적합한 담체가 본원에 기술된 약학 조성물을 투여하는 데 사용될 수 있지만, 담체 유형은 투여 모드에 의존하여 달라질 수 있다는 것을 이해할 것이다.
면역원성 약학 조성물은 보존제, 예컨대, 티오메르살 또는 2-페녹시에탄올을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 면역원성 약학 조성물은 수은 함유 물질을 실질적으로 함유하지 않고(예컨대, <10 ㎍/ml), 예컨대, 티오메르살 무함유이다. α-토코페롤 숙시네이트가 수은 함유 물질에 대한 대안으로서 사용될 수 있다.
장성 조절을 위해, 생리적 염, 예컨대, 나트륨 염이 면역원성 약학 조성물 중에 포함될 수 있다. 다른 염으로는 염화칼륨, 인산이수소칼륨, 디소듐 포스페이트 및/또는 염화마그네슘 등을 포함할 수 있다.
면역원성 약학 조성물의 삼투질농도는 200 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 240-360 mOsm/kg이거나, 또는 290-310 mOsm/kg 범위 내일 수 있다.
면역원성 약학 조성물은 하나 이상의 완충제, 예컨대, 트리스 완충제; 보레이트 완충제; 숙시네이트 완충제; 히스티딘 완충제(특히, 수산화알루미늄 애쥬번트인 경우); 또는 시트레이트 완충제를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 완충제는 5-20 mM 범위로 포함된다.
면역원성 약학 조성물의 pH는 약 5.0 내지 약 8.5, 약 6.0 내지 약 8.0, 약 6.5 내지 약 7.5, 또는 약 7.0 내지 약 7.8일 수 있다.
면역원성 약학 조성물은 멸균성일 수 있다. 면역원성 약학 조성물은 발열원 무함유, 예컨대, 용량당 <1 EU(내독소 단위: endotoxin unit, 표준 척도)로 함유할 수 있고, 용량당 <0.1 EU일 수 있다. 조성물은 글루텐 무함유일 수 있다.
면역원성 약학 조성물은 계면활성제, 예컨대, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제('트윈스'로서 공지), 또는 옥옥톡시놀(예컨대, 옥톡시놀-9(트리톤 X-100) 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올)을 포함할 수 있다. 계면활성제는 단지 미량으로 존재할 수 있다. 면역원성 약학 조성물은 옥톡시놀-10 및 폴리소르베이트 80을 각각 1 mg/ml 미만으로 포함할 수 있다. 미량의 다른 나머지 성분은 항생제(예컨대, 네오마이신, 카나마이신, 폴리믹신 B)일 수 있다.
면역원성 약학 조성물은 당업계에 널리 공지된 적합한 비히클 중 멸균 액제 또는 현탁제로서 제제화될 수 있다. 약학 조성물은 종래의 널리 공지된 멸균 기술에 의해 멸균처리될 수 있거나, 멸균 여과될 수 있다. 생성된 수용액은 있는 그대로 사용을 위해 패키징되거나, 동결 건조될 수 있고, 여기서, 동결 건조된 제제는 투여 전에 멸균 용액과 조합된다.
면역원성 약학 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 염과 함께 제제화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염으로는 무기 이온, 예컨대, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 이온 등의 것을 포함할 수 있다. 상기 염은 무기산 또는 유기산, 예컨대, 염산, 브롬화수소산, 인산, 질산, 황산, 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 푸마르산, 숙신산, 락트산, 만델산, 말산, 시트르산, 타르타르산, 또는 말레산과의 염을 포함할 수 있다. 추가로, 작용제(들)가 카르복시 기 또는 다른 산성 기를 함유한다면, 이는 무기 또는 유기 염기와 약학적으로 허용되는 부가 염으로 전환될 수 있다. 적합한 염기의 예로는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아, 사이클로헥실아민, 디사이클로헥실-아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민을 포함한다.
하나 이상의 애쥬번트와 함께 조합하여 예를 들어, 활성제, 예컨대, 본원에 기술된 펩티드, 핵산, 항체 또는 그의 단편, 및/또는 APC를 포함하는 약학 조성물은 특정 몰비로 포함하도록 제제화될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 애쥬번트와 함께 조합되는 활성제, 예컨대, 본원에 기술된 펩티드, 핵산, 항체 또는 그의 단편, 및/또는 APC는 약 99:1 내지 약 1:99의 몰비로 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 하나 이상의 애쥬번트와 함께 조합되는 활성제, 예컨대, 본원에 기술된 펩티드, 핵산, 항체 또는 그의 단편, 및/또는 APC의 몰비 범위는 약 80:20 내지 약 20:80; 약 75:25 내지 약 25:75, 약 70:30 내지 약 30:70, 약 66:33 내지 약 33:66, 약 60:40 내지 약 40:60; 약 50:50; 내지 약 90:10 내지 약 10:90으로부터 선택될 수 있다. 하나 이상의 애쥬번트와 함께 조합되는 활성제, 예컨대, 본원에 기술된 펩티드, 핵산, 항체 또는 그의 단편, 및/또는 APC의 몰비는 약 1:9일 수 있고, 일부 경우에서, 약 1:1일 수 있다. 하나 이상의 애쥬번트와 함께 조합되는 활성제, 예컨대, 본원에 기술된 펩티드, 핵산, 항체 또는 그의 단편, 및/또는 APC는 함께 동일한 투여 단위로, 예컨대, 하나의 바이알, 좌제, 정제, 캡슐제, 에어로졸 스프레이로 제제화될 수 있거나; 또는 각각의 작용제, 형태 및/또는 화합물은 별개의 단위로, 예컨대, 2개의 바이알 좌제, 정제, 2개의 캡슐제, 1개의 정제 및 1개의 바이알, 에어로졸 스프레이 등으로 제제화될 수 있다.
일부 경우에서, 면역원성 약학 조성물은 추가의 작용제와 함께 투여될 수 있다. 추가의 작용제 선택은 적어도 부분적으로는 치료되는 병태에 의존할 수 있다. 추가의 작용제는 예를 들어, 병원체 감염(예컨대, 바이러스 감염)에 치료적 효과가 있는 임의의 작용제, 예컨대, 염증성 병태를 치료하는 데 사용되는 약물, 예컨대, NSAID, 예컨대, 이부프로펜, 나프록센 , 아세트아미노펜, 케토프로펜, 또는 아스피린을 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 제제는 하나 이상의 보충제, 예컨대, 비타민 C, E 또는 다른 항산화제를 함유할 수 있다.
하나 이상의 애쥬번트와 함께 조합하여 활성제, 예컨대, 본원에 기술된 펩티드, 핵산, 항체 또는 그의 단편, 및/또는 APC를 포함하는 약학 조성물은 예컨대, 활성제의 투여가능한 제제로의 프로세싱을 촉진시키는 것인, 부형제, 희석제 및/또는 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리적으로 허용되는 담체를 사용하여 종래 방식으로 제제화될 수 있다. 적절한 제제는 적어도 부분적으로 선택된 투여 경로에 의존할 수 있다. 본원에 기술된 작용제(들)은 다수의 경로 또는 투여 모드(경구적, 협측, 국소, 직장, 경피, 경점막, 피하, 정맥내, 및 근육내 적용 뿐만 아니라, 흡입에 의한 투여 포함)를 사용하여 환자에게 전달될 수 있다.
활성제를 비경구적 투여용(예컨대, 주사, 예를 들어, 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의해)으로 제제화할 수 있고, 이는 앰플, 미리 충전된 시린지, 소량의 주입액인 단위 투약 형태로 또는 보존제과 첨가된 다회 투약 용기 중의 단위 투약 형태로 제공될 수 있다. 조성물은 오일성 또는 수성 히비클 중의 현탁제, 액제, 또는 에멀젼, 예를 들어, 수성 폴리에틸렌 글리콜 중 액제와 같은 형태를 취할 수 있다.
주사용 제제를 위해, 비히클은, 참깨유, 옥수수유, 면실유, 또는 땅콩유 뿐만 아니라, 엘릭시르, 만닛톨, 덱스트로스 또는 멸균 수용액, 및 유사한 약학 비히클을 비롯한, 수용액 또는 오일 현탁액, 또는 에멀젼을 비롯한, 당업계에서 적합한 것으로 공지된 것으로부터 선택될 수 있다. 제제는 또한 생체적합성, 생분해성인 중합체 조성물, 예컨대, 폴리(락틱-코-글리콜릭)산을 포함할 수 있다. 이들 물질은 약물이 로딩된 미소구체 또는 나노스피어로 제조될 수 있고, 이는 추가로 더욱 우수한 지속적인 방출 성능을 제공하기 위해 추가로 코팅되거나, 또는 유도체화될 수 있다. 안구 주변 또는 안구내 주사를 위해 적합한 비히클로는 예를 들어, 주사 등급의 주사용수, 리포솜 및 친유성 물질에 적합한 비히클 중의 치료제 현탁액을 포함한다. 안구 주변 또는 안구내 주사를 위한 다른 비히클도 당업계에 널리 공지되어 있다.
일부 경우에서, 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 인간에게로의 정맥내 투여에 적합한 약학 조성물로서 제제화된다. 전형적으로, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충제 중의 액제이다. 필요할 경우, 조성물은 주사 부위의 통증 완화를 위해 국부 마취제, 예컨대, 리도카인 및 가용화제 또한 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은 별개로, 또는 단위 투여 형태로 함께 혼합되어, 예를 들어, 동결 건조된 분제 또는 밀봉 실리된 용기, 예컨대, 활성제의 양을 나타내는 앰플 또는 샤쉐 중의 무수 농축물로서 공급된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 이는 약학 등급의 멸균수 또는 멸균 염수를 함유하는 주입병으로 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록 하기 위해 주사용 멸균수 또는 멸균 염수의 앰플이 제공될 수 있다.
주사에 의해 투여할 때, 활성제는 특별히 생리적으로 화합성인 완충제, 예컨대, 행크스 용액, 링거액, 또는 생리 염수 완충제 중의 수성 액제로 제제화될 수 있다. 액제는 제법 작용제, 예컨대, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산화제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 화합물은 사용 전, 적합한 비히클, 예컨대, 발열원 무함유 멸균수로의 구성을 위한 분제 형태일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 약학 조성물은 애쥬번트, 또는 펩티드에 의해 자극받은 면역 반응을 증진시키기 위해 첨가되는 임의의 다른 물질을 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 약학 조성물은 펩티드에 대한 면역 반응을 억제하는 물질을 포함한다.
앞서 기술된 제제 이외에도, 활성제는 또한 데포 제제로 제제화될 수 있다. 상기와 같은 장기간 작용하는 제제는 이식 또는 경피 전달(예를 들어, 피하로 또는 근육내로), 근육내 주사, 또는 경피용 패치에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 작용제는 적합한 중합체 또는 소수성 물질을 이용하여(예를 들어, 허용되는 오일 중 에멀젼으로서), 또는 이온 교환 수지를 이용하여, 또는 난용성 유도체로서, 예를 들어, 난용성 염으로서 제제화될 수 있다.
본 경우에, 하나 이상의 작용제를 포함하는 약학 조성물은 특정 감염 부위에 또는 그 주변 부위에 주사되거나, 또는 국소적으로 투여될 때, 이는 국부적으로 및 국소적으로 영향을 미친다. 예컨대, 점성 액상 제제, 용액제, 현탁제, 디메틸술폭시드(DMSO) 기반 액제, 리포솜 제제, 겔, 젤리, 크림, 로션, 연고, 좌제, 폼, 또는 에어로졸 스프레이의 직접적인 국소 적용은 예를 들어, 국부적 및/또는 국소적인 영향을 제공하기 위해 국소 투여용으로 사용될 수 있다. 상기 제제용으로서 약학적으로 적절한 비히클로는 예를 들어, 저급 지방족 알콜, 폴리글리콜(예컨대, 글리세롤 또는 폴리에틸렌 글리콜), 지방산 에스테르, 오일, 지방, 실리콘 등을 포함한다. 상기 제제는 또한 보존제(예컨대, p-하이드록시벤조산 에스테르) 및/또는 항산화제(예컨대, 아스코르브산 및 토코페롤)를 포함할 수 있다. 문헌 [Dermatological Formulations: Percutaneous absorption, Barry (Ed.), Marcel Dekker Incl, 1983] 또한 참조한다. 또 다른 실시양태에서, 표피 또는 점막 바이러스 감염 치료를 위해 수송체, 캐리어 또는 이온 채널 억제제를 포함하는 국부/국소용 제제가 사용된다.
약학 조성물은 미용적으로 또는 피부과적으로 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 상기 담체는 피부, 손톱, 점막, 조직 및/또는 모발과 화합성을 띠고, 이는 상기 요건을 충족시키는, 통상 사용되는 임의의 미용적 또는 피부과적 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 당업계의 숙련가에 의해 쉽게 선택될 수 있다. 피부 연고를 제제화할 때, 작용제 또는 작용제들의 조합은 유지성 탄화수소 기제, 무수 흡수 기제, 유중수 흡수 기제, 수중유 수분 제거 기제 및/또는 수용성 기제 중에서 제제화될 수 있다. 상기 담체 및 부형제의 예로는 보습제(예컨대, 우레아), 글리콜(예컨대, 프로필렌 글리콜), 알콜(예컨대, 알콜), 지방산(예컨대, 올레산), 계면활성제 (예컨대, 이소프로필 미리스테이트 및 소듐 라우릴 술페이트), 피롤리돈, 글리세롤 모노라우레이트, 술폭시드, 테르펜(예컨대, 멘톨), 아민, 아미드, 알칸, 알카놀, 물, 탄산칼슘, 인산칼슘, 각종 당, 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 및 중합체, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
연고 및 크림은 예를 들어, 적합한 증점제 및/또는 겔화제 첨가와 함께 수성 또는 오일성 기제를 이용하여 제제화될 수 있다. 로션은 수성 또는 오일성 기제를 이용하여 제제화될 수 있고, 이는 일반적으로는 하나 이상의 유화제, 안정화제, 분산화제, 현탁화제, 증점제, 또는 착색제를 함유할 것이다. 약제 전달을 위한 경피용 패치의 구성 및 사용은 당업계에 널리 공지되어 있다. 상기 패치는 약제의 연속적, 맥동적, 요구시 전달용으로 구성될 수 있다.
약학 조성물 및 투여 형태를 형성하는 데 사용될 수 있는 윤활제로는 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘, 광유, 경 광유, 글리세린, 소르비톨, 만닛톨, 폴리에틸렌 글리콜, 다른 글리콜, 스테아르산, 소듐 라우릴 술페이트, 활석, 수소화된 식물성 오일(예컨대, 땅콩유, 면실유, 해바라기유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유, 및 대두유), 스테아르산아연, 에틸 올레이트, 에틸 라우레이트, 아가 또는 그의 혼합물을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 추가의 윤활제로는 예를 들어, 합성 실리카, 또는 그의 혼합물의 응집된 에어로졸인 실로이드 실리카겔을 포함한다. 윤활제은 경우에 따라 약학 조성물의 약 1 중량% 미만인 양으로 첨가될 수 있다.
약학 조성물은 수성, 수성-알콜성 또는 오일성 액제, 로션, 또는 세럼 분산제, 수성, 무수 또는 오일성 겔, 수성 상 중 지방 산의 분산에 의해 얻은 에멀젼(O/W 또는 수중유), 또는 반대로 (W/O 또는 유중수), 마이크로에멀젼, 또는 대안적으로, 마이크로캡슐, 마이크로입자, 또는 이온성 및/또는 비이온성 타입의 지질 소포체 분산제를 비롯한, 국소 적용에 적합한 임의 형태의 것일 수 있다. 이들 조성물은 종래 방법에 따라 제조될 수 있다. 조성물의 다양한 구성 요소의 양은 당업계에서 통상 사용되는 것이다. 이들 조성물은 특히 페이스용, 핸드용, 바디용 및/또는 점막용의, 또는 페이스 세정용의 보호, 치료 또는 케어 크림, 밀크, 로션, 겔 또는 폼을 구성한다. 조성물은 또한 피부 또는 클렌징 바를 구성하는 고체 제제로 구성될 수 있다.
약학 조성물은 애쥬번트, 예컨대, 친수성 또는 친유성 겔화제, 친수성 또는 친유성 활성제, 보존화제, 항산화제, 용매, 착향제, 충전제, 자외선 차단제, 악취 흡취제 및 색소를 함유할 수 있다. 이들 각종의 애쥬번트의 양은 고려되는 당업계에서 통상 사용되는 것이고, 이는 조성물의 총 중량의 약 0.01% 내지 약 20%이다. 그의 성질에 의존하여, 상기 애쥬번트는 지방 상 내로, 수성 상 내로 및/또는 지질 소포체 내로 도입될 수 있다.
국소/국부 적용에 관한 경우, 약학 조성물은 하나 이상의 투과 증진제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제제는 본 발명의 제제 또는 제제의 조합의 투과성 장벽, 예컨대, 피부로의 투과를 증가시키거나, 또는 그의 전달을 돕는, 적합한 고체 또는 겔 상 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 다수의 이러한 투과 증진 화합물 국소용 제제 분야에 공지되어 있고, 예컨대, 물, 알콜(예컨대, 테르펜, 예컨대, 메탄올, 에탄올, 2-프로판올), 술폭시드(예컨대, 디메틸 술폭시드, 데실메틸 술폭시드, 테트라데실메틸 술폭시드), 피롤리돈(예컨대, 2-피롤리돈, N-메틸-2-피롤리돈, N-(2-하이드록시에틸)피롤리돈), 라우로카프람, 아세톤, 디메틸아세트아미드, 디메틸포름아미드, 테트라하이드로푸르푸릴 알콜, L-α-아미노산, 음이온성, 양이온성, 양쪽성 또는 비이온성 계면활성제(예컨대, 이소프로필 미리스테이트 및 소듐 라우릴 술페이트), 지방산, 지방산 알콜(예컨대, 올레산), 아민, 아미드, 클로피브릭산 아미드, 헥사메틸렌 라우라미드, 단백질 분해 효소, α-비사보롤 , d-리모넨, 우레아 및 N,N-디에틸-m-톨루아미드 등을 포함한다. 추가 예로는 보습제(예컨대, 우레아), 글리콜(예컨대, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜), 글리세롤 모노라우레이트, 알칸, 알카놀, 오겔라제(ORGELASE), 탄산칼슘, 인산칼슘, 각종 당, 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 및/또는 다른 중합체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 약학 조성물은 하나 이상의 상기 투과 증진제를 포함할 것이다.
국부/국소 적용을 위한 약학 조성물은 하나 이상의 항미생물성 보존제, 예컨대, 4급 암모늄 화합물, 유기 수은제, p-하이드록시 벤조에이트, 방향족 알콜, 클로로부탄올 등을 포함할 수 있다.
약학 조성물은 에어로졸 액제, 현탁제, 또는 건조 분제로 제제화될 수 있다. 에어로졸은 호흡계 또는 비강 경로를 통해 투여될 수 있다. 예를 들어, 당업자는 본 발명의 조성물이 적절한 담체, 예컨대, 약학적으로 허용되는 추진제 중에 현탁되거나, 용해되고, 비강 스프레이 또는 흡입제를 사용하여 폐로 직접 투여될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 수송체, 캐리어 또는 이온 채널 억제제를 포함하는 에어로졸 제제는 예컨대, 비강 스프레이 또는 흡입제로서의 투여를 위해 추진제, 또는 용매와 추진제의 혼합물 중에 용해, 현탁, 또는 유화될 수 있다. 에어로졸 제제는 당업계에서 통상 사용되는 것과 같은, 임의의 허용되는 가압하의 추진제, 예컨대, 미용적으로 또는 피부과적으로 또는 약학적으로 허용되는 추진제를 함유할 수 있다.
비강 투여용 에어로졸 제제는 일반적으로 점적제 또는 스프레이로, 비강 경로로 투여되도록 디자인된 수성 액제이다. 비강용 액제는, 일반적으로 등장성이고, 비록 pH가 약 5.5 내지 약 6.5 범위를 벗어난 값으로 추가적으로 사용될 수는 있지만, pH를 약 5.5 내지 약 6.5로 유지하기 위해 경미하게 완충처리된다는 점에서 비강 분비물과 유사하다. 항미생물제 또는 보존제 또한 제제 중에 포함될 수 있다.
흡입용 에어로졸 제제 및 흡입제는 작용제 또는 작용제의 조합이 비강 또는 경구적 호흡 경로에 의해 투여되었을 때, 피험체의 호흡관 내로 운반되도록 디자인될 수 있다. 흡입용 액제는 예를 들어, 네블라이저에 의해 투여될 수 있다. 미분된 약물 또는 액상 약물을 포함하는 흡입제 또는 취입제는 예컨대, 분사되는 것을 돕기 위해 추진제 중 작용제 또는 작용제의 조합으로 이루어진 액제 또는 현탁제의 약학 에어로졸로서 호흡계로 전달될 수 있다. 추진제는 할로카본, 예를 들어, 플루오로카본, 예컨대, 예컨대, 플루오르화 염소화 탄화수소, 하이드로클로로플루오로카본, 및 하이드로클로로카본 뿐만 아니라, 탄화수소 및 탄화수소 에테르를 비롯한, 액화 가스일 수 있다.
할로카본 추진제로는, 모든 수소가 불소로 대체된 플루오로카본 추진제, 모든 수소가 염소 및 적어도 하나의 불소로 대체된 클로로플루오로카본 추진제, 수소 함유 플루오로카본 추진제, 및 수소 함유 클로로플루오로카본 추진제를 포함할 수 있다. 본 발명에서 유용한 탄화수소 추진제로는 예를 들어, 프로판, 이소부탄, n-부탄, 펜탄, 이소펜탄, 및 네오펜탄을 포함한다. 탄화수소의 블렌드 또한 추진제로서 사용될 수 있다. 에테르 추진제로는 예를 들어, 디메틸 에테르 뿐만 아니라, 에테르를 포함한다. 본 발명의 에어로졸 제제는 1개 초과의 추진제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 에어로졸 제제는 동일 부류로부터의 1개 초과의 추진제, 예컨대, 2개 이상의 플루오로카본; 또는 상이한 부류로부터의 1개 초과, 2개 초과, 3개 초과의 추진제, 예컨대, 플루오로탄화수소 및 탄화수소를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 압축 가스, 예컨대, 불활성 가스, 예컨대, 이산화탄소, 아산화질소 또는 질소와 함께 분배될 수 있다.
에어로졸 제제는 또한 다른 성분, 예를 들어, 에탄올, 이소프로판올, 프로필렌 글리콜 뿐만 아니라, 계면활성제 또는 다른 성분, 예컨대, 오일 및 계면활성제를 포함할 수 있다. 이들 성분은 제제를 안정화시키고/거나, 밸브 부품을 윤활시키는 역할을 할 수 있다.
에어로졸 제제는 가압하에 패키징될 수 있고, 액제, 현탁제, 에멀젼, 분제, 및 반고체 제제를 사용하여 에어로졸로서 제제화될 수 있다. 예를 들어, 액제 에어로졸 제제는 (실질적으로) 순수한 추진제 중, 또는 추진제 및 용매의 혼합물로서 본 발명의 작용제, 예컨대, 수송체, 캐리어 또는 이온 채널 억제제를 포함할 수 있다. 용매는 작용제를 용해시키고/거나, 추진제의 증발을 지연시키기 위해 사용될 수 있다. 용매는 예를 들어, 물, 에탄올, 및 글리콜을 포함할 수 있다. 적합한 용매의 임의 조합이 경우에 따라 보존제, 항산화제, 및/또는 다른 에어로졸 성분과 함께 조합되어 사용될 수 있다.
에어로졸 제제는 분산제 또는 현탁제일 수 있다. 현탁제 에어로졸 제제는 본 발명의 한 작용제 또는 작용제들의 조합, 예컨대, 수송체, 캐리어 또는 이온 채널 억제제, 및 분산화제로 이루어진 현탁제를 포함할 수 있다. 분산화제는 예를 들어, 소르비탄 트리올레이트, 올레일 알콜, 올레산, 레시틴 및 옥수수유를 포함할 수 있다. 에어로졸 제제는 또한 윤활제, 보존제, 항산화제, 및/또는 다른 에어로졸 성분을 포함할 수 있다.
에어로졸 제제는 유사하게 에멀젼으로서 제제화될 수 있다. 에멀젼 에어로졸 제제는 본 발명의 한 작용제 또는 작용제들의 조합, 예컨대, 수송체, 캐리어 또는 이온 채널 뿐만 아니라, 예를 들어, 알콜, 예컨대, 에탄올, 계면활성제, 물 및 추진제를 포함할 수 있다. 사용되는 계면활성제는 비이온성, 음이온성 또는 양이온성일 수 있다. 에멀젼 에어로졸 제제의 한 예는 예를 들어, 에탄올, 계면활성제, 물 및 추진제를 포함한다. 에멀젼 에어로졸 제제의 또 다른 예는 예를 들어, 식물성 오일, 글리세릴 모노스테아레이트 및 프로판을 포함한다.
제약 화합물은 좌제 투여용으로서 제제화될 수 있다. 저융점 왁스, 예컨대, 트리글리세리드, 지방산 글리세리드, 위텝솔 S55(Witepsol S55)(Nobel Chemical(독일 소재)의 등록 상표), 또는 코코아 버터의 혼합물을 먼저 용융시키고, 활성 성분을 예를 들어, 교반하여 균질하게 분산시킨다. 이어서, 용융된 균질 혼합물을 알맞은 크기의 몰드에 붓고, 냉각시키고, 고형화시킨다.
약학 조성물은 질 투여용으로 제제화될 수 있다. 활성 성분 이외에도 상기 캐리어를 함유하는 페서리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 폼 또는 스프레이가 적절한 것으로 당업계에 공지되어 있다.
약학 조성물은 국소, 안구내, 안구 주변, 또는 전신 투여용으로 인서트 상의, 그 안의, 또는 그에 부착된 지효성 제제에서 사용하기 위한 생체적합성 중합체에 탈착가능하게 부착될 수 있다. 또한, 수용성 중합체를 이용하여 생체적합성 중합체로부터의 조절형 방출을 사용함으로써 점적가능한 제제를 형성할 수 있다. 예컨대, 예를 들어, PLGA 미소구체 또는 나노스피어와 같은 생체적합성 중합체로부터의 조절형 방출은 또한 지효성 투여를 위해 안구내 이식 또는 주사에 적합한 제제에서 사용될 수 있다. 임의의 적합한 생분해성 생체적합성 중합체가 사용될 수 있다.
IV. CTL 펩티드 및 HTL 펩티드의 조합
본원에 기술된 신생항원성 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드, 또는 면역자극성 활성을 갖는 그의 유사체를 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신 조성물은 원하는 속성, 예컨대, 혈청 반감기 개선을 제공하기 위해, 또는 면역원성을 증진시키기 위해 변형될 수 있다.
예를 들어, CTL 활성을 유도시킬 수 있는 신생항원성 펩티드의 능력은 펩티드를, T 헬퍼 세포 반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 에피토프를 함유하는 서열에 연결시킴으로써 증진될 수 있다. 일부 실시양태에서, CTL 에피토프/HTL 에피토프 접합체는 스페이서 분자에 의해 연결된다. 스페이서는 전형적으로, 생리적 조건하에서 실질적으로 비하전된 상태인, 비교적 작은, 중성 분자, 예컨대, 아미노산 또는 아미노산 모방체로 구성된다. 스페이서는 전형적으로, 예컨대, Ala, Gly, 또는 비극성 아미노산 또는 중성 극성 아미노산의 다른 중성 스페이서로부터 선택된다. 경우에 따라, 존재하는 스페이서는 동일한 잔기로 구성될 필요는 없고, 따라서, 이종올리고머 또는 동종올리고머일 수 있다는 것을 이해할 것이다. 존재할 경우, 스페이서는 보통 적어도 하나 또는 2개의 잔기, 더욱 일반적으로는 3 내지 6개의 잔기가 될 것이다. 대안적으로, CTL 펩티드는 스페이서 없이 T 헬퍼 펩티드에 연결될 수 있다.
비록 CTL 펩티드 에피토프가 T 헬퍼 펩티드 에피토프에 직접 연결될 수는 있지만, CTL 에피토프/HTL 에피토프 접합체는 스페이서 분자에 의해 연결될 수 있다. 스페이서는 전형적으로, 생리적 조건하에서 실질적으로 비하전된 상태인, 비교적 작은, 중성 분자, 예컨대, 아미노산 또는 아미노산 모방체로 구성된다. 스페이서는 전형적으로, 예컨대, Ala, Gly, 또는 비극성 아미노산 또는 중성 극성 아미노산의 다른 중성 스페이서로부터 선택된다. 경우에 따라, 존재하는 스페이서는 동일한 잔기로 구성될 필요는 없고, 따라서, 이종올리고머 또는 동종올리고머일 수 있다는 것을 이해할 것이다. 존재할 경우, 스페이서는 보통 적어도 하나 또는 2개의 잔기, 더욱 일반적으로는 3 내지 6개의 잔기가 될 것이다. CTL 펩티드 에피토프는 CTL 펩티드의 아미노 또는 카르복시 말단에서 직접, 또는 스페이서를 통해 T 헬퍼 펩티드 에피토프에 연결될 수 있다. 면역원성 펩티드 또는 T 헬퍼 펩티드의 아미노 말단은 아실화될 수 있다.
HTL 펩티드 에피토프는 또한 그의 생물학적 특성을 변경시키기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, HTL 에피토프를 포함하는 펩티드는 프로테아제에 대한 그의 내성을 증가시키기 위해 D-아미노산을 함유할 수 있고, 이로써, 그의 혈청 반감기는 연장될 수 있다. 또한, 에피토프 펩티드는 그의 생물학적 활성을 증가시키기 위해 다른 분자, 예컨대, 지질, 단백질 또는 당, 또는 임의의 다른 합성 화합물에 접합될 수 있다. 예를 들어, T 헬퍼 펩티드는 아미노 또는 카르복실 말단에서 하나 이상의 팔미트산 쇄에 접합될 수 있다.
특정 실시양태에서, T 헬퍼 펩티드는 집단 대부분에 존재하는 T 헬퍼 세포에 의해 인식되는 것이다. 이는 HLA 클래스 II 분자 중 다수, 대부분, 또는 그들 모두에 결합하는 아미노산 서열을 선별함으로써 달성될 수 있다. 이는 "느슨하게 HLA 제한된" 또는 "무차별적 혼합성" T 헬퍼 서열로서 공지되어 있다. 무차별적 혼합성을 띠는 아미노산 서열의 예로는 항원, 예컨대, 파상풍 톡소이드 위치 830-843(QYIKANSKFIGITE), 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum) CS 단백질 위치 378-398(DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS), 및 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 18kD 단백질 위치 116(GAVDSILGGVATYGAA)으로부터의 서열을 포함한다. 다른 예로는 DR 1-4-7 슈퍼모티프를 보유하는 펩티드, 또는 DR3 모티프의 것을 포함한다.
대안적으로, 자연상에서는 발견되지 않는 아미노산 서열을 사용하여 T 헬퍼 림프구를 자극할 수 있는 합성 펩티드를 느슨하게 HLA 제한된 방식으로 제조할 수 있다(예컨대, 예컨대, PCT 공개 WO 95/07707 참조). Pan-DR-binding 에피토프(예컨대, PADRE, Epimmune, Inc.: 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)로 불리는 이들 합성 화합물은 대부분의 HLA-DR(인간 HLA 클래스 II) 분자에 결합하도록 디자인된 것이다. 예를 들어, 식 aKXVWANTLKAAa(여기서, "X"는 사이클로헥실알라닌, 페닐알라닌, 또는 티로신이고, a는 D-알라닌 또는 L-알라닌이다)를 갖는 pan-DR-binding 에피토프 펩티드는 대부분의 HLA-DR 대립유전자에 결합하고, 개체의 HLA 타입과 상관없이, 대부분의 개체로부터의 T 헬퍼 림프구의 반응을 자극하는 것으로 나타났다. pan-DR 결합 에피토프의 대안은 모든 "L" 천연 아미노산을 포함하고, 에피토프를 코딩하는 핵산 형태로 제공될 수 있다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물(예컨대, 면역원성 조성물)에서 신생항원 치료제(예컨대, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, TCR, CAR, TCR 또는 CAR을 함유하는 세포, 폴리펩티드를 함유하는 수지상 세포, 폴리뉴클레오티드를 함유하는 수지상 세포, 항체 등) 중에 세포독성 T 림프구를 프라이밍하는 적어도 하나의 성분을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 세포내에서 바이러스 항원에 대해 CTL을 프라이밍할 수 있는 작용제로서 리피드가 확인되었다. 예를 들어, 팔미트산 잔기는 리신 잔기의 ε 및 α 아미노 기에 부착될 수 있고, 이어서, 예컨대, 하나 이상의 연결 잔기, 예컨대, Gly, Gly-Gly-, Ser, Ser-Ser 등을 통해 면역원성 신생항원성 펩티드에 연결될 수 있다. 이어서, 지질화된 펩티드는 미셀 또는 입자로 직접 투여될 수 있거나, 리포솜 내로 도입될 수 있거나, 애쥬번트에서 유화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 특히 효과적인 면역원성 구성물은 연결부, 예컨대, Ser-Ser 을 통해 면역원성 펩티드의 아미노 말단에 부착되어 있는, Lys의 ε 및 α 아미노 기에 부착된 팔미트산을 포함한다.
CTL 반응을 프라이밍하는 지질의 또 다른 예로서, E. 콜라이 지질단백질, 예컨대, 트리팔미토일-S-글리세릴시스테이닐세릴-세린(P3CSS: tripalmitoyl-S-glycerylcysteinlyseryl-serine)은 적절한 펩티드에 공유적으로 부착되었을 때, 바이러스 특이적인 CTL을 프라이밍시키는 데 사용될 수 있다(예컨대, 문헌 [Deres, et al., Nature 342:561, 1989] 참조). 본원에 기술된 신생항원성 펩티드는 P3CSS에 커플링될 수 있고, 예를 들어, 지질펩티드는 표적 항원에 대한 CTL 반응을 특이적으로 프라이밍시키기 위해 개체에게 투여될 수 있다. 더욱이, 중합 항체 유도 또한 P3CSS 접합된 에피토프로 프라이밍될 수 있기 때문에, 상기 두 조성물은 감염에 대한 체액성 및 세포 매개 반응, 둘 모두를 더욱 효과적으로 유도하기 위해 조합될 수 있다.
본원에서 언급된 바와 같이, 추가의 아미노산은 한 펩티드를 또 다른 것에 용이하게 연결시키기 위해, 캐리어 지지체 또는 더욱 큰 펩티드에 커플링하기 위해, 펩티드 또는 올리고펩티드의 물리적 또는 화학적 특성을 변형시키기 위해, 또는 기타 목적을 위해 신생항원성 펩티드의 말단에 부가될 수 있다. 아미노산, 예컨대, 티로신, 시스테인, 리신, 글루탐산 또는 아스파르트산 등은 펩티드 또는 올리고펩티드의 C 또는 N 말단에서 도입될 수 있다. 그러나, 일부 경우에서, T 세포 에피토프의 카르복실 말단에서의 변형이 펩티드의 결합 특징을 변경시킬 수 있다는 점에 주의하여야 한다. 추가로, 펩티드 또는 올리고펩티드 서열은 말단-NH2 아실화에 의해, 예컨대, 알카노일 (C1-C20) 또는 티오글리콜릴 아세틸화, 말단-카르복실 아미드화, 예컨대, 암모니아, 메틸아민 등에 의해 변형됨으로써 천연 서열과 상이할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 변형은 지지체 또는 다른 분자에의 연결을 위한 부위를 제공할 수 있다.
본원에 기술된 면역원성 조성물의 실시양태는 환자의 혈액으로부터의 PBMC, 또는 그로부터 단리된 DC에 에피토프 보유 신생항원성 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 칵테일을 생체외 투여하는 것을 포함한다. GM-CSF, IL-4, IL-6, IL-1β 및 TNFα를 비롯한, 수지상 세포(DC)의 수확을 촉진시키는 약제가 사용될 수 있다. 펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 DC를 펄싱한 후, 및 환자 내로 재주입하기 전에, DC를 세척하여 비결합 펩티드를 제거한다. 본 실시양태에서, 백신 또는 면역원성 조성물은, HLA 분자와 복합체를 형성한 펄싱된 펩티드 에피토프를 그의 표면 상에 제시하는 펩티드로 펄싱된 DC를 포함한다. 이어서, 조성물을 환자에게 투여한다. 다른 실시양태에서, T 세포 요법에서 사용하기에 적합한 T 세포를 자극하기 위해 상기 펄싱된 DC를 사용한다.
V. 다중 에피토프 면역원성 조성물
다중 에피토프가 동시에 전달될 수 있도록 하는 다수의 상이한 접근법이 이용가능하다. 본원에 기술된 신생항원성 펩티드를 코딩하는 핵산은 본 발명의 특히 유용한 실시양태이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 RNA이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 하나 또는 다중 에피토프를 포함하는 신생항원성 펩티드를 코딩하는 미니유전자 구성물을 사용하여 본원에 기술된 용도의 신생항원성 펩티드를 코딩하는 핵산을 투여한다.
다중 에피토프 미니유전자의 사용은 문헌 [An, L. and Whitton, J. L., J. Virol. 71:2292, 1997]; [Thomson, S. A. et al., J. Immunol. 157:822, 1996]; [Whitton, J. L. et al., J. Virol. 67:348, 1993]; [Hanke, R. et al., Vaccine 16:426, 1998]에 기술되어 있다. 예를 들어, 슈퍼모티프 및/또는 모티프 보유 신생항원 펩티드, 범용 헬퍼 T 세포 에피토프(또는 다중 종양 연관 항원 HTL 에피토프), 및 소포체 전위 신호 서열을 코딩하는 다중 에피토프 DNA 플라스미드가 조작될 수 있다.
다중 에피토프 미니유전자의 면역원성은 트랜스제닉 마우스에서 테스트되는 에피토프에 대해 유도되는 면역 반응의 규모를 평가하여 시험될 수 있다. 추가로, 생체내에서의 DNA 코딩된 에피토프의 면역원성은 DNA 플라스미드로 형질감염된 표적 세포에 대한 특이적인 CTL 세포주의 시험관내 반응과 상관관계를 가질 수 있다. 따라서, 상기 실험은 미니유전자가 1.) 세포 매개성 및/또는 체액성 반응을 생성하는 역할을 하고, 2.) 유도된 면역 세포가 코딩된 에피토프를 발현하는 세포를 인식하였다는 것을 보여줄 수 있다.
예를 들어, 인간 세포에서의 발현을 위하여, 선택된 네오에피토프(미니유전자)를 코딩하는 DNA 서열(미니유전자)을 생성하기 위하여, 에피토프의 아미노산 서열은 역 번역될 수 있다. 인간 코돈 선호도 표를 사용하여 각 아미노산에 대한 코돈 선택을 가이드할 수 있다. 이들 네오에피토프 코딩 DNA 서열은 직접 연결될 수 있고, 이로써, 번역되었을 때, 연속 폴리펩티드 서열이 생성된다. 발현 및/또는 면역원성을 최적화시키기 위하여, 추가의 요소가 미니유전자 디자인 내로 도입될 수 있다. 역 번역될 수 있고, 미니유전자 서열에 포함될 수 있는 아미노산 서열의 예로는 HLA 클래스 I 에피토프, HLA 클래스 II 에피토프, 유비퀴틴화 신호 서열, 및/또는 소포체 표적화 신호를 포함한다. 추가로, CTL 및 HTL 에피토프의 HLA 제시는 합성(예컨대, 폴리알라닌), 또는 CTL 또는 HTL 에피토프에 인접한, 자연적으로 발생된 측면 서열을 포함함으로써 개선될 수 있고; 에피토프(들)를 포함하는 상기의 더욱 큰 펩티드는 본 발명의 범주 내에 포함된다.
미니유전자 서열은 미니유전자의 플러스 및 마이너스 가닥을 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 조립함으로써 DNA로 전환된다. 중첩 올리고뉴클레오티드(30 내지 100개 염기 길이)는 널리 공지된 기술을 사용하여 적절한 조건하에서 합성, 인산화, 정제 및 어닐링될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 단부는 예를 들어, T4 DNA 리가제를 사용하여 라이게이션된다. 이어서, 에피토프 폴리펩티드를 코딩하는 상기 합성 미니유전자는 원하는 발현 벡터로 클로닝될 수 있다.
표적 세포에서 확실히 발현이 이루어질 수 있도록 하기 위해, 당업자에게 널리 공지된 표준 조절 서열을 벡터에 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 미니유전자 삽입을 위한 하류 클로닝 부위가 있는 프로모터; 효율적인 전사 종결을 위한 폴리아데닐화 신호; E. 콜라이 복제 기점; 및 E. 콜라이 선별가능한 마커(예컨대, 암피실린 또는 카나마이신 내성). 다수의 프로모터, 예컨대, 인간 사이토메갈로바이러스(hCMV) 프로모터가 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다. 다른 적합한 프로모터 서열에 대해서는 예컨대, 미국 특허 번호 5,580,859 및 5,589,466을 참조한다.
미니유전자 발현 및 면역원성을 최적화하기 위하여, 추가의 벡터 변형이 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 효율적인 유전자 발현을 위해 인트론이 요구되고, 하나 이상의 합성 또는 자연적으로 발생된 인트론이 미니유전자의 전사되는 영역 내로 도입될 수 있다. 또한, mRNA 안정화 서열, 및 포유동물에서의 복제를 위한 서열을 포함하는 것 또한 미니유전자 발현을 증가시키는 것으로 간주될 수 있다.
일단 발현 벡터가 선택되고 나면, 미니유전자는 프로모터 하류의 폴리링커 영역으로 클로닝될 수 있다. 상기 플라스미드는 적절한 E. 콜라이 균주로 형질전환되고, DNA는 표준 기술을 사용하여 제조된다. 미니유전자 뿐만 아니라, 벡터 내에 포함된 다른 요소의 배향 및 DNA 서열은 제한 지도화 및 DNA 서열 분석을 사용하여 확인할 수 있다. 올바른 플라스미드를 보유하는 박테리아 세포는 마스터 세포 은행 및 작업용 세포 은행으로서 보관될 수 있다.
추가로, 면역조절 서열이 DNA 백신의 면역원성에서 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 이들 서열은 면역원성을 증진시키기 위해 필요할 경우, 벡터 중 미니유전자 코딩 서열 바깥 쪽에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열은 면역자극성이다. 또 다른 실시양태에서, 서열은 ISS 또는 CpG이다.
일부 실시양태에서, 미니유전자 코딩된 에피토프, 및 (면역원성을 증가 또는 감소시키기 위해 포함된) 제2 단백질이 제조될 수 있도록 하는 비시스트론 발현 벡터가 사용될 수 있다. 공동 발현되는 경우, 면역 반응을 유리하게 증가시킬 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드의 예로는 사이토카인(예컨대, IL-2, IL-12, GM-CSF), 사이토카인 유도 분자(예컨대, LeIF), 공동자극성 분자, 또는 HTL 반응을 위해, panDR 결합 단백질을 포함한다. 헬퍼(HTL) 에피토프는 세포내 표적화 신호에 연결될 수 있고, 발현된 CTL 에피토프와 별개로 발현될 수 있으며; 이로써, HTL 에피토프는 CTL 에피토프와 상이한 세포 구획으로의 지시될 수 있다. 원하는 경우, 이는 HLA 클래스 II 경로로의 HTL 에피토프의 더욱 효율적인 유입을 용이하게 하여, HTL 유도를 개선시킬 수 있다. HTL 또는 CTL 유도와 대조적으로, 면역억제 분자(예컨대, TGF-β)의 공동 발현에 의해 면역 반응을 특이적으로 감소시키는 것은 특정 질환에서 유리할 수 있다.
예를 들어, E. 콜라이에서 발효시킨 후, 정제하여 플라스미드 DNA를 치료적 정량으로 제조할 수 있다. 작업용 세포 은행으로부터의 분취물을 사용하여 성장 배지에 접종하고, 널리 공지된 기술에 따라 진탕기 플라스크 또는 생물반응장치에서 포화될 때까지 성장시킨다. 표준 생물분리 기술, 예컨대, 퀴아젠, 인크.(QIAGEN, Inc.: 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)에 의해 공급되는 고체상 음이온 교환 수지를 사용하여 플라스미드 DNA를 정제할 수 있다. 원하는 경우, 겔 전기영동 또는 다른 방법을 사용하여 슈퍼코일드 DNA를 개방 환형 및 선형 형태로부터 단리할 수 있다.
정제된 플라스미드 DNA를 다양한 제제를 사용하여 주사용으로 제조할 수 있다. 그중 가장 간단한 것은 동결건조된 DNA를 멸균 포스페이트 완충제 염수(PBS) 중에서 재구성하는 것이다. "네이키드 DNA"로서 공지된 상기 접근법은 현재 임상 시험에서 근육내(IM) 투여를 위해 사용되고 있다. 미니유전자 DNA 백신의 면역치료 효과를 최대화시키기 위해, 정제된 플라스미드 DNA를 제제화하는 대안적 방법이 사용될 수 있다. 다양한 방법이 기술되어 있으며, 새로운 기술도 이용가능할 수 있다. 양이온성 지질 또는 제제화에 사용될 수 있다(예컨대, WO 93/24640; 문헌 [Mannino & Gould-Fogerite, BioTechniques 6(7): 682 (1988)]; 미국 특허 번호 5,279,833; WO 91/06309; 및 [Felgner, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84:7413 (1987)]에 기술된 것 참조). 추가로, 보호성, 상호작용성, 비축합성 화합물(PINC: protective, interactive, non-condensing compound)로서 총칭되는, 당지질, 융합유도성 리포솜, 펩티드 및 화합물 또한 정제된 플라스미드 DNA로 복합체화되어, 예컨대, 안정성, 근육내 분산, 또는 특정 기관 또는 세포 유형으로의 이동과 같은 변수에 영향을 미칠 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 핵산은 고속 세포 변형 사용에 의해 세포 내로 도입된다. 고속 변형 동안, 세포는 스퀴징되고, 이로써, 세포막에서는 일시적인 파괴가 일어나고, 이를 통해 핵산이 세포 내로 유입될 수 있다. 대안적으로, 단백질은 예를 들어, 박테리아 발현 벡터에서 발현 벡터로로부터 제조될 수 있고, 후, 단백질은 세포로 전달될 수 있다.
미니유전자 코딩된 CTL 에피토프의 발현 및 HLA 클래스 I 제시를 위하여 기능성 검정법으로서 표적 세포 감작화가 사용될 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 DNA를, CTL 크롬 방출 검정법에 대한 표적으로서 적합한 포유동물 세포주 내로 도입한다. 사용된 형질감염 방법은 최종 제제에 의존하게 될 것이다. "네이키드" DNA에 대해서는 전기천공법이 사용될 수 있는 반면, 양이온성 지질은 직접적인 시험관내 형질감염을 가능하게 한다. 녹색 형광성 단백질(GFP: green fluorescent protein)을 발현하는 플라스미드를 공동 형질감염시켜 형광 활성화된 세포 분류(FACS: fluorescence activated cell sorting)를 이용하여 형질감염된 세포를 농축시킬 수 있다. 이어서, 이들 세포를 크롬-51(51Cr)로 표지화하고, 이를 에피토프 특이적 CTL 세포주에 대한 표적 세포로서 사용하고; 51Cr 방출에 의해 검출되는 세포용해는 미니유전자 코딩된 CTL 에피토프의 제조 및 HLA 제시, 둘 모두를 나타낸다. HTL 에피토프 발현은 HTL 활성을 사정하는 검정법을 사용하여 유사한 방식으로 평가될 수 있다.
생체내 면역원성은 미니유전자 DNA 제제를 기능적으로 시험하기 위한 제2의 접근법이다. 적절한 인간 HLA 단백질를 발현하는 트랜스제닉 마우스를 DNA 생성물로 면역화시킨다. 용량 및 투여 경로는 제제에 의존한다(예컨대, PBS 중의 DNA의 경우, 근육내이고, 지질 복합체화된 DNA의 경우, 복강내(IP)이다). 예시적인 프로토콜은, 면역화 21일 후, 비장 세포를 수집하고, 테스트되는 각각의 에피토프를 코딩하는 펩티드의 존재하에 1주 동안 재자극하는 것이다. 후, CTL 이펙터 세포의 경우, 표준 기술을 사용하여, 펩티드 로딩되고, 51Cr 표지화된 표적 세포의 세포용해에 대해 검정한다. 미니유전자 코딩된 에피토프에 상응하는 펩티드 에피토프가 로딩된 HLA에 의해 감작된 표적 세포의 용해는 생체내 CTL 유도를 위한 DNA 백신 기능을 입증해준다. HTL 에피토프의 면역원성은 트랜스제닉 마우스에서 유사한 방식으로 평가된다.
대안적으로, 핵산은 예를 들어, 미국 특허 번호 5,204,253에 기술된 바와 같이, 볼리스틱(ballistic) 전달을 사용하여 투여될 수 있다. 이 기술을 사용하여, 오직 DNA로만 구성된 입자가 투여될 수 있다. 추가의 대안적 실시양태에서, DNA는 입자, 예컨대, 금 입자에 부착될 수 있다.
VI. 본 발명에서 사용하기 위한 세포
한 측면에서, 본 발명은 또한 면역반응성 세포(예컨대, T 세포 수용체(TCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR))를 활성화시키는 신생항원 인식 수용체를 발현하는 세포, 및 증진된 면역 반응을 요구하는 질환 치료를 위한 상기 세포의 사용 방법을 제공한다.
상기 세포로는 본원에 기술된 신생항원성 펩티드 중 하나에 결합하는 항원 인식 수용체(예컨대, TCR 또는 CAR)를 발현하는 유전적으로 변형된 면역반응성 세포(예컨대, T 세포, 자연 살해(NK: Natural Killer) 세포, 세포독성 T 림프구(CTL) 세포, 헬퍼 T 림프구(HTL) 세포)를 포함하고, 따라서, 신생물 및 항원 특이적 면역 반응 증가가 요구되는 다른 병리 치료를 위한 사용 방법. T 세포 활성화는 항원으로 표적화된 TCR 또는 CAR에 의해 매개된다.
본 발명은 면역반응성 세포(예컨대, TCR, CAR)을 활성화시키는 항원 인식 수용체, 및 키메라 공동자극 수용체(CCR: chimeric co-stimulating receptor)의 조합을 발현하는 세포, 및 증진된 면역 반응을 요구하는 질환 치료를 위한 상기 세포의 사용 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 종양 항원 특이적 T 세포, NK 세포, CTL 세포 또는 다른 면역반응성 세포는 신생물 치료 또는 예방을 위해 하나 이상의 공동자극성 리간드의 선택적 농축을 위한 셔틀로서 사용된다. 상기 세포는 특정 암 치료 또는 예방을 위해 그를 필요로 하는 인간 피험체에게 투여된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 종양 항원 특이적 인간 림프구로는 제한 없이, 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 유전적으로 변형된 말초 공여자 림프구(문헌 [Sadelain, M., et al. 2003 Nat Rev Cancer 3:35-45]), a 및 p 이종이량체를 포함하는 전장의 종양 항원 인식 T 세포 수용체 복합체를 발현하도록 유전적으로 변형된 말초 공여자 림프구(문헌 [Morgan, R. A., et al. 2006 Science 314:126-129]), 종양 생검 중 종양 침윤 림프구(TIL: tumor infiltrating lymphocyte)로부터 유래된 림프구 배양물(문헌 [M(Panelli, M. C., et al. 2000 J Immunol 164:495-504]; [Panelli, M. C., et al. 2000 J Immunol 164:4382-4392]), 및 인공 항원 제시 세포(AAPC: artificial antigen-presenting cell) 또는 펄싱된 수지상 세포를 사용하여 선택적으로 시험관내에서 확장된 항원 특이적 말초 혈액 백혈구(문헌 [Dupont, J., et al. 2005 Cancer Res 65:5417-5427]; [Papanicolaou, G. A., et al. 2003 Blood 102:2498-2505])를 포함한다. T 세포는 자가 T 세포, 동종이계 T 세포, 또는 시험관내에서 조작된 전구세포 또는 줄기 세포로부터 유래된 T 세포일 수 있다.
일부 실시양태에서, 면역요법제는 조작된 수용체이다. 일부 실시양태에서, 조작된 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR), T 세포 수용체(TCR), 또는 B 세포 수용체(BCR: B-cell receptor), 입양 T 세포 요법(ACT: adoptive T cell therapy), 또는 그의 유도체이다. 다른 측면에서, 조작된 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 일부 측면에서, CAR은 제1 세대 CAR이다. 다른 측면에서, CAR은 제2 세대 CAR이다. 추가의 다른 측면에서, CAR은 제3 세대 CAR이다
일부 측면에서, CAR은 세포외 부위, 막횡단 부위, 및 세포내 부위를 포함한다. 일부 측면에서, 세포내 부위 적어도 하나의 T 세포 공동자극성 도메인을 포함한다. 일부 측면에서, T 세포 공동자극성 도메인은 CD27, CD28, TNFRS9(4-1BB), TNFRSF4(OX40), TNFRSF8(CD30), CD40LG (CD40L), ICOS, ITGB2(LFA-1), CD2, CD7, KLRC2(NKG2C), TNFRS18(GITR), TNFRSF14(HVEM), 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 측면에서, 조작된 수용체는 표적에 결합한다. 일부 측면에서, 결합은 질환 또는 병태를 앓는 하나 이상의 피험체에 특이적인 펩티드에 특이적이다.
일부 측면에서, 면역요법제는 본원에 상세하게 기술된 것과 같은 세포이다. 일부 측면에서, 면역요법제는 펩티드에 특이적으로 결합하는 수용체를 포함하는 세포이다. 일부 측면에서, 면역요법제는 본 발명의 펩티드/핵산과 함께 조합하여 사용되는 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 환자 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 종양 침윤 림프구이다.
일부 측면에서, 병태 또는 질환을 앓는 피험체는 피험체의 T 세포 수용체 레퍼토리에 기초하여 치료된다. 일부 실시양태에서, 항원 백신은 피험체의 T 세포 수용체 레퍼토리에 기초하여 선택된다. 일부 실시양태에서, 피험체는 항원 또는 펩티드에 특이적인 TCR을 발현하는 T 세포로 치료된다. 일부 실시양태에서, 피험체는 TCR, 예컨대, 피험체 특이적 TCR에 특이적인 항원 또는 펩티드로 치료된다. 일부 실시양태에서, 피험체는 TCR, 예컨대, 피험체 특이적 TCR을 발현하는 T 세포에 특이적인 항원 또는 펩티드로 치료된다. 일부 실시양태에서, 피험체는 피험체 특이적 TCR에 특이적인 항원 또는 펩티드로 치료된다.
일부 실시양태에서, 면역원성 항원 조성물 또는 백신은 하나 이상의 피험체에서 확인된 TCR에 기초하여 선택된다. 일부 실시양태에서, T 세포 레퍼토리 확인 및 기능성 검정법에서의 시험을 사용하여 병태 또는 질환을 앓는 하나 이상의 피험체에게 투여하고자 하는 면역원성 조성물 또는 백신을 결정한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 항원 백신이다. 일부 실시양태에서, 항원 백신은 피험체 특이적 항원 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 백신에 포함시키고자 하는 항원 펩티드는 항원에 결합하는 피험체 특이적 TCR의 정량화에 기초하여 선택된다. 일부 실시양태에서, 항원 펩티드는 펩티드의 TCR에의 결합 친화도에 기초하여 선택된다. 일부 실시양태에서, 선택은 정량 및 결합 치환도, 둘 모두의 조합에 기초한다. 예를 들어, TCR을 발현하는 T 세포는 유리하게는 증폭될 수 있기 때문에, 기능성 검정법에서는 항원에 강력하게 결합하지만, TCR 레퍼토리에는 높게 나타나지 않는 TCR이 항원 백신에 대하여 우수한 후보 물질이 될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항원은 TCR에의 결합에 기초하여 하나 이상의 피험체에게 투여하기 위해 선택된다. 일부 실시양태에서, T 세포, 예컨대, 질환 또는 병태를 앓는 피험체로부터의 T 세포는 확장될 수 있다. 면역원성 항원 펩티드에 특이적인 TCR을 발현하는 확장된 T 세포는 피험체에게 다시 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적합한 세포, 예컨대, PBMC는 면역원성 항원 펩티드에 특이적인 TCR 발현을 위해 폴리뉴클레오티드로 형질도입 또는 형질감염되고, 피험체에게 투여된다. 면역원성 항원 펩티드에 특이적인 TCR을 발현하는 T 세포는 확장될 수 있고, 피험체에게 다시 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역원성 항원 펩티드에 특이적인 TCR을 발현하여, 자가 질환 조직과 함께 인큐베이션하였을 때, 세포용해 활성을 초래하는 T 세포는 확장될 수 있고, 피험체에게 다시 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역원성 항원 펩티드에 결합하는, 기능성 검정법에서 사용되는 T 세포는 확장될 수 있고, 피험체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 피험체 특이적 면역원성 항원 펩티드에 결합하는 것으로 측정된 TCR은 T 세포에서 발현될 수 있고, 피험체에게 투여될 수 있다.
공동자극성 리간드
일부 실시양태에서, 본 발명의 세포는 면역 세포의 전체 활성화에 중요한 비항원 특이적 신호인 적어도 하나의 공동자극성 리간드와 함께 제공된다. 공동자극성 리간드로는 제한 없이, 종양 괴사 인자(TNF: tumor necrosis factor) 리간드, 사이토카인(예컨대, IL-2, IL-12, IL-15 또는 IL21), 및 면역글로불린(Ig) 슈퍼패밀리 리간드를 포함한다.
종양 괴사 인자(TNF)는 전신 염증에 관여하는 사이토카인이고, 급성기 반응을 자극한다. 그의 1차적인 역할은 면역 세포 조절에 있다. 종양 괴사 인자(TNF) 리간드는 다수의 공통된 특징을 공유하다. 대다수의 리간드는 짧은 세포질 분절 및 비교적 긴 세포외 영역을 함유하는 II형 막횡단 단백질로서 합성된다. TNF 리간드로는 제한 없이, 신경 성장 인자(NGF: nerve growth factor), CD4OL(CD4OL)/CD154, CD137L/4-1BBL, 종양 괴사 인자 알파(TNFα), CD134L/OX4OL/CD252, CD27L/CD70, Fas 리간드(FasL: Fas ligand), CD3OL/CD153, 종양 괴사 인자 β (TNF(3)/림포톡신-알파(LTa: lymphotoxin-alpha), 림포톡신-베타(ur(3), CD257/B 세포 활성화 인자(BAFF: B cell-activating factor)/Blys/THANK/Ta11-1, 항글루코코르티코이드 유도 TNF 수용체 리간드(GITRL: glucocorticoid-induced TNF Receptor ligand), 및 TNF 관련 아폽토시스 유도 리간드(TRAIL: TNF-related apoptosis-inducing ligand), LIGHT(TNFSF14)를 포함한다. 면역글로불린(Ig) 슈퍼패밀리는 세포의 인식, 결합, 또는 부착 프로세스에 관연하는 세포 표면 및 가용성 단백질로 이루어진 큰 군이다. 이들 단백질은 그들이 면역글로불린 도메인(폴드)을 가진다는 점에서 면역글로불린들과 구조적 특징을 공유한다. 면역글로불린 슈퍼패밀리 리간드는 제한 없이, 둘 모두 CD28에 대한 리간드인 CD80 및 CD86을 포함한다.
본 발명의 유전적으로 변형된 면역반응성 세포를 포함하는 조성물은 신생물 치료를 위해 피험체에게 전신으로 또는 직접적으로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 세포는 관심의 대상이 되는 기관 (예컨대, 종양이 발생한 기관)으로 직접 주사된다. 대안적으로, 유전적으로 변형된 면역반응성 세포를 포함하는 조성물은 예를 들어, 순환계(예컨대, 종양 혈관구조) 내로의 투여에 의해 관심의 대상이 되는 기관으로 간접적으로 제공된다. 확장제 및 분화제는 시험관내 또는 생체내에서 T 세포, NK 세포, 또는 CTL 세포 생산을 증가시키기 위해 세포 투여 전, 그와 동시에 또는 그 후에 제공될 수 있다.
변형된 세포는 비록 골 내로, 또는 세포가 재생 및 분화에 적절한 부위인 것으로 나타날 수 있는 다른 편리한 부위(예컨대, 흉선)로도 도입될 수 있지만, 보통은 정맥내로 임이의 생리적으로 허용되는 비히클 중에서 투여될 수 있다. 본 발명의 유전적으로 변형된 면역반응성 세포는 정제된 세포 집단을 포함할 수 있다. 당업자는 널리 공지된 다양한 방법, 예컨대, 형광 활성화된 세포 분류(FACS)을 이용하여 집단 중 유전적으로 변형된 면역반응성 세포의 백분율(%)을 쉽게 측정할 수 있다. 투여량은 당업자에 의해 쉽게 조정될 수 있다(예컨대, 순도 감소는 투여량 증가를 요구할 수 있다). 세포는 주사, 카테터 등에 의해 도입될 수 있다. 원하는 경우, 인터류킨, 예컨대, IL-2, IL-3, IL-6, 및 IL-11뿐만 아니라, 다른 인터류킨, 콜로니 자극 인자, 예컨대, G-, M- 및 GM-CSF, 인터페론, 예컨대, γ-인터페론 및 에리트로포이에틴을 포함하나, 이에 제한되지 않는 인자 또한 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 유전적으로 변형된 면역반응성 세포 또는 그의 전구세포, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 포함한다. 투여는 자가 또는 이종성 투여일 수 있다. 예를 들어, 면역반응성 세포, 또는 전구세포는 한 피험체로부터 수득되고, 이는 동일한 피험체, 또는 상이한 화합성 피험체에게 투여될 수 있다. 본 발명의 말초 혈액 유래 면역반응성 세포 또는 그의 자손(예컨대, 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 유래된 것)는 카테터 투여를 포함하는 국부화된 주사, 전신 주사, 국부화된 주사, 정맥내 주사, 또는 비경구적 투여를 통해 투여될 수 있다. 본 발명의 치료 조성물(예컨대, 유전적으로 변형된 면역반응성 세포를 함유하는 약학 조성물)을 투여할 때, 이는 일반적으로 단위 투여 주사용 제형(액제, 현탁제, 에멀젼)으로 제제화될 것이다.
VII. 사용 방법 및 약학 조성물
본원에 기술된 신생항원 치료제(예컨대, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, TCR, CAR, TCR 또는 CAR을 함유하는 세포, 폴리펩티드를 함유하는 수지상 세포, 폴리뉴클레오티드를 함유하는 수지상 세포, 항체 등)는 치료적 처치 방법, 예컨대, 암 치료를 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 적용에서 유용하다. 일부 실시양태에서, 치료적 처치 방법은 면역요법을 포함한다. 특정 실시양태에서, 신생항원 펩티드는 면역 반응을 활성화, 촉진, 증가 및/또는 증진시키는 데, 현존 면역 반응을 새 표적으로 재지시하는 데, 종양의 면역원성을 증가시키는 데, 종양 성장을 억제하는 데, 종양 부피를 축소시키는 데, 종양 세포 아폽토시스를 증가시키는 데, 및/또는 종양의 종양형성을 감소시키는 데 유용하다. 사용 방법은 시험관내, 생체외, 또는 생체내 방법일 수 있다.
일부 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 신생항원 치료제를 사용하여 피험체에서 면역 반응을 활성화시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 신생항원 치료제를 사용하여 피험체에서 면역 반응을 촉진시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 신생항원 펩티드를 사용하여 피험체에서 면역 반응을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 신생항원 펩티드를 사용하여 면역 반응을 증진시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응을 활성화, 촉진, 증가 및/또는 증진시키는 것은 세포 매개 면역을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응을 활성화, 촉진, 증가 및/또는 증진시키는 것은 T 세포 활성 또는 체액성 면역을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응을 활성화, 촉진, 증가 및/또는 증진시키는 것은 CTL 또는 HTL 활성을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응을 활성화, 촉진, 증가 및/또는 증진시키는 것은 NK 세포 활성을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응을 활성화, 촉진, 증가 및/또는 증진시키는 것은 T 세포 활성을 증가시키고, NK 세포 활성을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응을 활성화, 촉진, 증가 및/또는 증진시키는 것은 CTL 활성을 증가시키고, NK 세포 활성을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응을 활성화, 촉진, 증가 및/또는 증진시키는 것은 Treg의 억제 활성을 억제 또는 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 항원성 자극의 결과이다. 일부 실시양태에서, 항원성 자극은 종양 세포이다. 일부 실시양태에서, 항원성 자극은 암이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 신생항원 치료제를 사용하여 면역 반응을 활성화, 촉진, 증가 및/또는 증진시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 그를 필요로 하는 피험체에게 치료적 유효량의, 신생항원 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 종양 세포에 전달하는 신생항원 치료제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 그를 필요로 하는 피험체에게 치료적 유효량의, 종양 연관 항원에 결합하고, 종양 세포에 의해 내재화되는 신생항원 치료제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 그를 필요로 하는 피험체에게 치료적 유효량의, 종양 세포에 의해 내재화되고, 신생항원 펩티드는 세포에 의해 프로세싱된 것인 신생항원 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 그를 필요로 하는 피험체에게 치료적 유효량의, 종양 세포에 의해 내재화되고, 항원성 펩티드는 종양 세포의 표면 상에 제시되는 것인 신생항원 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 그를 필요로 하는 피험체에게 치료적 유효량의, 종양 세포에 의해 내재화되고, 세포에 의해 프로세싱되고, 항원성 펩티드는 종양 세포의 표면 상에 제시되는 것인 신생항원 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 그를 필요로 하는 피험체에게 치료적 유효량의, 적어도 하나의 항원성 펩티드를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 종양 세포에 전달하는 본원에 기술된 신생항원 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 항원성 펩티드는 종양 세포의 표면 상에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항원성 펩티드는 MHC 클래스 I 분자와의 복합체 형태로 종양 세포의 표면 상에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항원성 펩티드는 MHC 클래스 II 분자와의 복합체 형태로 종양 세포의 표면 상에 제시된다.
일부 실시양태에서, 종양 세포를 적어도 하나의 항원성 펩티드를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 종양 세포에 전달하는 본원에 기술된 신생항원 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서, 항원성 펩티드는 종양 세포의 표면 상에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항원성 펩티드는 MHC 클래스 I 분자와의 복합체 형태로 종양 세포의 표면 상에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항원성 펩티드는 MHC 클래스 II 분자와의 복합체 형태로 종양 세포의 표면 상에 제시된다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 그를 필요로 하는 피험체에게 치료적 유효량의, 적어도 하나의 항원성 펩티드를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 종양 세포에 전달하는 본원에 기술된 신생항원 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 항원성 펩티드는 종양 세포의 표면 상에 제시되고, 종양 세포에 대한 면역 반응이 유도된다. 일부 실시양태에서, 신생항원 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 항원성 펩티드를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 종양 세포에 전달하고, 여기서, 항원성 펩티드는 종양 세포의 표면 상에 제시되고, 종양 성장은 억제된다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 그를 필요로 하는 피험체에게 치료적 유효량의, 적어도 하나의 항원성 펩티드를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 종양 세포에 전달하는 본원에 기술된 신생항원 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 항원성 펩티드는 종양 세포의 표면 상에 제시되고, 종양 세포에 대한 T 세포 사멸이 유도된다. 일부 실시양태에서, 종양 세포에 대한 T 세포 사멸이 증진된다. 일부 실시양태에서, 종양 세포에 대한 T 세포 사멸이 증가된다.
일부 실시양태에서, 피험체에서 면역 반응을 증가시키는 방법은 피험체에게 치료적 유효량의, 본원에 기술된 신생항원 치료제를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 작용제는 본원에 기술된 신생항원에 특이적으르 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, 피험체에서 면역 반응을 증가시키는 방법은 피험체에게 치료적 유효량의 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 현존 면역 반응을 종양으로 재지시하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 현존 면역 반응을 종양으로 재지시하는 방법은 피험체에게 치료적 유효량의, 본원에 기술된 신생항원 치료제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 현존 면역 반응은 바이러스에 대한 것이다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 홍역 바이러스, 수두대상포진 바이러스(VZV: varicella-zoster virus; 수두 바이러스), 인플루엔자 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 폴리오바이러스, 루벨라 바이러스, 로타바이러스, A형 간염 바이러스(HAV: hepatitis A virus), B형 간염 바이러스(HBV: hepatitis B virus), 엡스타인 바 바이러스: Epstein Barr virus), 및 사이토메갈로바이러스(CMV: cytomegalovirus)로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 수두대상포진 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 사이토메갈로바이러스이다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 홍역 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 현존 면역 반응은 천연 바이러스 감염 후에 획득된다. 일부 실시양태에서, 현존 면역 반응은 바이러스에 대한 백신 접종 후에 획득된다. 일부 실시양태에서, 현존 면역 반응은 세포 매개 반응이다. 일부 실시양태에서, 현존 면역 반응은 세포독성 T 세포(CTL) 또는 HTL를 포함한다..
일부 실시양태에서, 피험체에서 현존 면역 반응을 종양으로 재지시하는 방법은 (i) 신생항원에 특이적으로 결합하는 항체, 및 (ii) 본원에 기술된 적어도 하나의 신생항원성 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, (a) 융합 단백질은 종양 연관 항원에의 결합 이후 종양 세포에 의해 내재화되고; (b) 신생항원성 펩티드는 프로세싱되고, MHC 클래스 I 분자와 회합된 세포 종양의 표면 상에 제시되고; (c) 신생항원성 펩티드/MHC 클래스 I 복합체는 세포독성 T 세포에 의해 인식된다. 일부 실시양태에서, 세포독성 T 세포는 기억 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 기억 T 세포는 신생항원성 펩티드를 이용한 백신 접종의 결과이다.
본 발명은 종양의 면역원성을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 종양의 면역원성을 증가시키는 방법은 종양 또는 종양 세포를 유효량의 본원에 기술된 신생항원 치료제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양의 면역원성을 증가시키는 방법은 피험체에게 치료적 유효량의 본원에 기술된 신생항원 치료제를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 신생항원 치료제를 사용하여 종양의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 종양의 성장을 억제하는 방법 시험관내에서 세포 혼합물을 신생항원 치료제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 면역 세포(예컨대, T 세포)와 혼합된 무한증식 세포주 또는 암 세포주는 신생항원성 펩티드가 첨가된 배지에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 종양 세포는 환자 샘플, 예를 들어, 조직 생검, 흉막 삼출액, 또는 혈액 샘플로부터 단리되고, 면역 세포(예컨대, T 세포)와 혼합되고, 신생항원성 펩티드가 첨가된 배지에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 신생항원 치료제는 면역 세포의 활성을 증가, 촉진, 및/또는 증진시킨다. 일부 실시양태에서, 신생항원 치료제는 종양 세포 성장을 억제시킨다. 일부 실시양태에서, 신생항원 치료제는 종양 세포의 사멸을 활성화시킨다.
특정 실시양태에서, 피험체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 피험체는 종양을 앓거나, 또는 피험체는 적어도 부분적으로 제거된 종양을 앓았던 피험체이다.
일부 실시양태에서, 종양 성장을 억제하는 방법은 피험체에게 치료적 유효량의, 신생항원 치료제를 투여하는 것을 포함하는 단계를 포함하는, 현존 면역 반응을 새 표적으로 재지시하는 것을 포함하며, 여기서, 현존 면역 반응은 신생항원성 펩티드에 의해 종양 세포에 전달된 항원성 펩티드에 대한 것이다.
특정 실시양태에서, 종양은 암 줄기 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 종양에서 암 줄기 세포의 빈도는 신생항원 치료제 투여에 의해 감소된다. 일부 실시양태에서, 피험체에게 치료적 유효량의 신생항원 치료제를 투여하는 단계를 포함하는, 피험체에서 종양에서 암 줄기 세포의 빈도를 감소시키는 방법을 제공한다.
추가로, 일부 측면에서, 본 발명은 피험체에게 치료적 유효량의 본원에 기술된 신생항원 치료제를 투여하는 단계를 포함하는, 피험체에서 종양의 종양형성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 종양은 암 줄기 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양의 종양형성은 종양에서 암 줄기 세포의 빈도를 감소시킴으로써 감소된다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 본원에 기술된 신생항원 치료제를 사용하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 종양에서 암 줄기 세포의 빈도는 본원에 기술된 신생항원 치료제의 투여에 의해 감소된다.
일부 실시양태에서, 종양은 고형 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 결장직장 종양, 췌장 종양, 폐 종양, 난소 종양, 간 종양, 유방 종양, 신장 종양, 전립선 종양, 신경내분비 종양, 위장관 종양, 흑색종, 자궁경부 종양, 방광 종양, 교아세포종, 및 두경부 종양으로 구성된 군으로부터 선택되는 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 결장직장 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 난소 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 유방 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 폐 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 췌장 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 흑색종 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 고형 종양이다.
본 발명은 피험체에게 치료적 유효량의 본원에 기술된 신생항원 치료제를 투여하는 단계를 포함하는, 피험체의 암을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 암을 치료하는 방법은 피험체에게 치료적 유효량의 본원에 기술된 신생항원 치료제를 투여하는 단계를 포함하는, 현존 면역 반응을 새 표적으로 재지시하는 것을 포함하며, 여기서, 현존 면역 반응은 신생항원성 펩티드에 의해 암 세포에 전달된 항원성 펩티드에 대한 것이다.
본 발명은 (예컨대, 치료를 필요로 하는 피험체에서) 피험체에게 치료적 유효량의, 본원에 기술된 신생항원 치료제를 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 피험체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 피험체는 암성 종양을 앓는 피험체이다. 특정 실시양태에서, 피험체는 적어도 부분적으로 제거된 종양을 앓았던 피험체이다.
특정 실시양태에서, 암은 결장직장암, 췌장암, 폐암, 난소암, 간암, 유방암, 신장암, 전립선암, 위장관암, 흑색종, 자궁경부암, 신경내분비암, 방광암, 교아세포종, 및 두경부암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암이다. 특정 실시양태에서, 암은 췌장암이다. 특정 실시양태에서, 암은 난소암이다. 특정 실시양태에서, 암은 결장직장암이다. 특정 실시양태에서, 암은 유방암이다. 특정 실시양태에서, 암은 전립선암이다. 특정 실시양태에서, 암은 폐암이다. 특정 실시양태에서, 암은 흑색종이다. 일부 실시양태에서, 암은 고형암이다. 일부 실시양태에서, 암은 고형 종양을 포함한다.
일부 실시양태에서, 암은 혈액암이다. 일부 실시양태에서, 암은 급성 골수성 백혈병(AML), 호지킨 림, 다발성 골수종, T 세포 급성 림프아구성 백혈병(T-ALL: T cell acute lymphoblastic leukemia), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 모발상 세포 백혈병, 만성 골수성 백혈병(CML), 비호지킨 림, 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 외투 세포 림프종(MCL: mantle cell lymphoma), 및 피부 T 세포 림프종(CTCL: cutaneous T cell lymphoma)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 신생항원 치료제는 조합 요법으로서 투여된다. 2개 이상의 치료제를 이용하는 조합 요법은, 비록 요구되는 것은 아니지만, 상이한 작용 기전으로 작용하는 작용제를 사용한다. 상이한 작용 기전을 갖는 작용제를 사용하는 조합 요법은 상가 또는시너지 효과를 가져올 수 있다. 조합 요법을 통해 각 작용제를 단일요법에서 사용되는 용량보다 더 적은 용량이 사용될 수 있고, 이로써, 독성 부작용은 감소되고/거나, 작용제(들)의 치료 지수는 증가될 수 있다. 조합 요법은 내성 암 세포가 발생할 수 있는 가능성을 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 면역 반응에 영향을 주는(예컨대, 반응을 증진 또는 활성화시키는) 치료제, 및 종양/암 세포에 영향을 주는(예컨대, 억제, 또는 사멸시키는) 치료제를 포함한다.
암으로는 B 세포 암, 예컨대, 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 중쇄병, 예컨대, 예를 들어, 알파 쇄 질환, 감마 쇄 질환, 및 뮤 쇄 질환, 양성 단일클론성 감마글로불린병증, 및 면역 세포 아밀로이드증, 흑색종, 유방암, 폐암, 기관지암, 결장직장암, 전립선암(예컨대, 전이성, 호르몬 불응성 전립선암), 췌장암, 위암, 난소암, 방광암, 뇌 또는 중추 신경계 암, 말초 신경계 암, 식도암, 자궁경부암, 자궁암 또는 자궁내막암, 구강 또는 인두 암, 간암, 신장암, 고환암, 담도암, 소장 또는 충수 암, 타액선암, 갑상선암, 부신암, 골육종, 연골육종, 혈액 조직 암 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 의해 포함되는 방법에 적용가능한 암 유형의 다른 비제한적인 예로는 인간 육종 및 암종, 예컨대, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 결장직장암, 췌장암, 유방암, 난소암, 편평세포암종, 기저 세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질 암종, 기관지원성 암종, 신세포 암종, 간암종, 담관 암종, 간암, 융모막암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름스 종양, 자궁경부암, 골암, 뇌 종양, 고환암, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수아세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈관아세포종, 청신경종, 희소돌기아교세포종, 수막종, 흑색종, 신경아세포종, 및 망막아세포종; 백혈병, 예컨대, 급성 림프구성 백혈병 및 급성 골수구성 백혈병(골수아구성, 전골수구성, 골수단핵구성, 단핵구성 및 적백혈병); 만성 백혈병(만성 골수구성(과립구성) 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병); 및 폴리진성 다혈증, 림프종(호지킨병 및 비호지킨병), 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 중쇄병을 포함한다. 일부 실시양태에서, 그의 표현형이 본 발명의 방법에 의해 결정되는 것인 암은 상피암, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 부인과암, 신장암, 후두암, 폐암, 구강암, 두경부암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 또는 피부암이다. 다른 실시양태에서, 암은 유방암, 전립선암, 폐암, 또는 결장암이다. 추가의 다른 실시양태에서, 상피암은 비소세포 폐암, 비유두상 신세포 암종, 자궁경부암 암종, 난소암 암종(예컨대, 장액 난소암 암종), 또는 유방 암종이다. 상피암은 장액, 자궁내막양, 점액소, 투명 세포, 브렌너, 또는 미분화를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 다양한 다른 방식으로 특징화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 외투 세포 림프종을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 림프종 또는 그의 서브타입의 치료, 진단 및/또는 예후에서 사용된다. 림파구증식성 장애 또한 증식성 질환인 것으로 간주된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 작용제 및 적어도 하나의 추가 치료제의 조합을 상가 또는 시너지 결과를 얻을 수 있다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 작용제의 치료 지수를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 추가 치료제(들)의 치료 지수를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 작용제의 독성 및/또는 부작용을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 추가 치료제(들)의 독성 및/또는 부작용을 감소시킨다.
특정 실시양태에서, 본원에 기술된 신생항원 치료제를 투여하는 것 이외에도, 방법 또는 치료는 적어도 하나의 추가 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가 치료제는 작용제 투여 전, 그와 동시에, 및/또는 그에 이어서 후속으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 추가 치료제는 1, 2, 3개 이상의 추가 치료제를 포함한다.
본원에 기술된 신생항원 치료제로는 화학요법제를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 방법 또는 치료는 화학요법제와 함께 조합하여 또는 화학요법제 칵테일과 함께 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 작용제를 이용하는 치료는 화학요법 투여 전, 그와 동시에, 및/또는 그에 이어서 후속으로 이루어질 수 있다. 조합된 투여는 단일 약학 제제로 이루어지거나, 또는 별개의 제제를 이용하는 공동 투여, 또는 임의의 순서로, 그러나, 일반적으로는 모든 활성제가 그의 생물학적 활성을 동시에 발휘할 수 있게 하는 시간 이내에 이루어지는 연속 투여를 포함할 수 있다. 상기 화학요법제에 대한 제조 및 투약 스케줄은 제조사의 설명서에 따라, 또는 숙련된 실무자에 의해 실험적으로 결정되는 바와 같이 사용될 수 있다. 상기 화학요법제에 대한 제조 및 투약 스케줄은 또한 문헌 [The Chemotherapy Source Book, 4th Edition, 2008, M. C. Perry, Editor, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA]에 기술되어 있다.
유용한 화학요법제 부류로는 예를 들어, 항튜불린제, 아우리스타틴, DNA 작은 홈(minor groove) 결합제, DNA 복제 억제제, 알킬화제(예컨대, 백금 착물, 예컨대, 시스플라틴, 모노(플래티넘), 비스(플래티넘) 및 삼핵 백금 착물, 및 카르보플라틴), 안트라시클린, 항생제, 항폴레이트제, 대사길항물질, 화학요법 감작제, 두오카르마이신, 에토포시드, 플루오르화 피리미딘, 이오노포어, 렉시트롭신, 니트로소우레아, 플라티놀, 퓨린 대사길항물질, 퓨로마이신, 방사선 감작제, 스테로이드, 탁산, 토포이소머라제 억제제, 빈카 알칼로이드 등을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 치료제는 알킬화제, 대사길항물질, 항유사분열제, 토포이소머라제 억제제, 또는 혈관신생 억제제이다.
본 발명에서 유용한 화학요법제로는 알킬화제, 예컨대, 티오테파 및 시클로포스파미드(CYTOXAN); 알킬 술포네이트, 예컨대, 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대, 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민(알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸올로멜라민 포함); 질소 머스타드, 예컨대, 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로소우레아, 예컨대, 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예컨대, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아미신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 대사길항물질, 예컨대, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 폴산 유사체, 예컨대, 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대, 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시토신 아라비노시드, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU; 안드로겐제, 예컨대, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제, 예컨대, 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제, 예컨대, 폴린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK; 라족산; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2''-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드(아라-C); 탁소이드, 예컨대, 파클리탁셀(TAXOL) 및 도세탁셀(TAXOTERE); 클로람부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 백금 유사체, 예컨대, 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; CPT11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노산; 에스페라미신; 카페시타빈(XELODA); 및 상기 것 중 임의의 것의 약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 화학요법제로는 또한 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하는 작용을 하는 항호르몬제, 예를 들어, 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제 4(5)-이미다졸, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜(FARESTON)을 포함하는 항에스트로겐; 및 항안드로겐제, 예컨대, 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드, 및 고세렐린; 및 및 상기 것 중 임의의 것의 약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 추가 치료제는 시스플라틴이다. 특정 실시양태에서, 추가 치료제는 카르보플라틴이다.
특정 실시양태에서, 화학요법제는 토포이소머라제 억제제이다. 토포이소머라제 억제제는 토포이소머라제 효소(예컨대, 토포이소머라제 I 또는 II)의 작용을 방해하는 화학요법제이다. 토포이소머라제 억제제로는 독소루비신 HCl, 다우노루비신 시트레이트, 미톡산트론 HCl, 악티노마이신 D, 에토포시드, 토포테칸 HCl, 테니포시드(VM-26), 및 이리노테칸 뿐만 아니라, 상기 것 중 임의의 것의 약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 이리노테칸이다.
특정 실시양태에서, 화학요법제는 대사길항물질이다. 대사길항물질은 정상적인 생화학적 반응을 위해 요구되는 대사물질과 유사하지만, 세포의 하나 이상의 정상적인 기능, 예컨대, 세포 분열을 방해할 만큼 충분히 상이한 구조를 갖는 화학물질이다. 대사길항물질은 겜시타빈, 플루오로우라실, 카페시타빈, 메토트렉세이트 소듐, 랄리트렉세드, 페메트렉세드, 테가푸르, 시토신 아라비노시드, 티오구아닌, 5-아자시티딘, 6-메르캅토퓨린, 아자티오프린, 6-티오구아닌, 펜토스타틴, 플루다라빈 포스페이트, 및 클라드리빈 뿐만 아니라, 상기 것 중 임의의 것의 약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 추가 치료제는 겜시타빈이다.
특정 실시양태에서, 화학요법제는 튜불린과 결합하는 작용제를 포함하나, 이에 제한되지 않는 항유사분열제이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 탁산이다. 특정 실시양태에서, 작용제는 파클리탁셀 또는 도세탁셀, 또는 파클리탁셀 또는 도세탁셀의 약학적으로 허용되는 염, 산, 또는 유도체이다. 특정 실시양태에서, 작용제는 파클리탁셀(TAXOL), 도세탁셀(TAXOTERE), 알부민 결합 파클리탁셀(ABRAXANE), DHA-파클리탁셀, 또는 PG-파클리탁셀이다. 특정 대안적 실시양태에서, 항유사분열제는 빈카 알칼로이드, 예컨대, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 또는 빈데신, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 산, 또는 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항유사분열제는 키네신 Eg5의 억제제 또는 유사분열 키나제, 예컨대, 오로라 A(Aurora A) 또는 Plk1의 억제제이다. 특정 실시양태에서, 추가 치료제는 파클리탁셀이다. 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 알부민 결합 파클리탁셀이다.
일부 실시양태에서, 추가 치료제는 작용제, 예컨대, 소분자를 포함한다. 예를 들어, 치료는 EGFR, HER2(ErbB2), 및/또는 VEGF를 포함하나, 이에 제한되지 않는 종양 연관 항원에 대한 억제제로서 작용하는 소분자와 본 발명의 작용제의 조합 투여를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 작용제는 게피티닙(IRESSA), 엘로티닙(TARCEVA), 수니티닙(SUTENT), 라파타닙, 반데타닙(ZACTIMA), AEE788, CI-1033, 세디라닙(RECENTIN), 소라페닙(NEXAVAR), 및 파조파닙(GW786034B)으로 구성된 단백질 키나제 억제제와 함께 조합하여 투여된다. 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 mTOR 억제제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 추가 치료제는 Treg 세포의 개수를 감소시키는 화학요법 또는 다른 억제제이다. 특정 실시양태에서, 치료제는 사이클로포스파미드 또는 항CTLA4 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 추가 치료제는 골수 유래 억제인자 세포의 존재를 감소시킨다. 추가 실시양태에서, 추가 치료제는 카르복탁솔이다. 또 다른 실시양태에서, 추가 치료제는 세포를 T 헬퍼 1 반응하도록 변화시킨다. 추가 실시양태에서, 추가 치료제는 이브루티닙이다.
일부 실시양태에서, 추가 치료제는 생물학적 분자, 예컨대, 항체를 포함한다. 예를 들어, 치료는 EGFR, HER2/ErbB2, 및/또는 VEGF에 결합하는 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 종양 연관 항원에 대한 항체와 함께 본 발명의 작용제의 조합 투여를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가 치료제는 암 줄기 세포 마커에 특이적인 항체이다. 특정 실시양태에서, 추가 치료제는 혈관신생 억제제인 항체(예컨대, 항VEGF 또는 VEGF 수용체 항체)이다. 특정 실시양태에서, 추가 치료제는 베바시주맙(AVASTIN), 라무시루맙, 트라스투주맙(HERCEPTIN), 퍼투주맙(OMNITARG), 파니투무맙(VECTIBIX), 니모투주맙, 잘루투무맙, 또는 세툭시맙(ERBITUX)이다.
본원에 제공된 작용제 및 조성물은 단독으로, 또는 종래의 치료 요법, 예컨대, 수술, 방사선 조사, 화학요법 및/또는 골수 이식(자가, 동계, 동종이계 또는 비혈연 이식)과 하께 조합하여 사용될 수 있다. 종양 항원 세트는 예컨대, 암 환자 중 다수에서 유용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 면역원성 백신을 포함하는 조성물 이외에, 적어도 하나 이상의 화학요법제가 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 화학요법제는 다른 부류의 화학요법제에 속하는 것일 수 있다.
화학요법제의 예로는 알킬화제, 예컨대, 질소 머스타드(예컨대, 메클로레타민(질소 머스타드), 클로람부실, 사이클로포스파미드(Cytoxan®), 이포스파미드, 및 멜팔란); 니트로소우레아(예컨대, N-니트로소-N-메틸우레아, 스트렙토조신, 카르무스틴(BCNU), 로무스틴, 및 세무스틴); 알킬 술포네이트(예컨대, 부술판); 테트라진(예컨대, 다카르바진(DTIC), 미토졸로마이드 및 테모졸로마이드(Temodar®)); 아지리딘(예컨대, 티오테파, 미토마이신 및 디아지쿠온); 및 백금 약물(예컨대, 시스플라틴, 카르보플라틴, 및 옥살리플라틴); 비고전적 알킬화제, 예컨대, 프로카르바진 및 알트레타민(헥사메틸멜라민); 대사길항물질 작용제, 예컨대, 5-플루오로우라실(5-FU), 6-메르캅토퓨린(6-MP), 카페시타빈(Xeloda®), 클라드리빈, 클로파라빈, 시타라빈 (Ara-C®), 데시타빈, 플록수리딘, 플루다라빈, 넬라라빈, 겜시타빈(Gemzar®), 하이드록시우레아, 메토트렉세이트, 페메트렉세드(Alimta®), 펜토스타틴, 티오구아닌, 비다자(Vidaza); 항미세소관제, 예컨대, 빈카 알칼로이드(예컨대, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈데신 및 빈플루닌); 탁산(예컨대, 파클리탁셀(Taxol®), 도세탁셀(Taxotere®)); 포도필로톡신(예컨대, 에토포시드 및 테니포시드); 에포틸론(예컨대, 익사베필론(Ixempra®)); 에스트라무스틴(Emcyt®); 항종양 항생제, 예컨대, 안트라시클린(예컨대, 다우노루비신, 독소루비신(Adriamycin®, 에피루비신, 이다루비신); 악티노마이신-D; 및 블레오마이신; 토포이소머라제 I 억제제, 예컨대, 토포테칸 및 이리노테칸(CPT-11); 토포이소머라제 II 억제제, 예컨대, 에토포시드(VP-16), 테니포시드, 미톡산트론, 노보비오신, 메르바론 및 아클라루비신; 코르티코스테로이드제, 예컨대, 프레드니손, 메틸프레드니솔론(Solumedrol®), 및 덱사메타손(Decadron®); L-아스파라기나제; 보르테조밉(Velcade®); 면역요법제, 예컨대, 리툭시맙(Rituxan®), 알렘투주맙(Campath®), 탈리도미드, 레날리도마이드(Revlimid®), BCG, 인터류킨-2, 인터페론-알파 및 암 백신, 예컨대, 프로벤지(Provenge)®; 호르몬 치료제, 예컨대, 풀베스트란트(Faslodex®), 타목시펜, 토레미펜(Fareston®), 아나스트로졸(Arimidex®), 엑세메스탄(Aromasin®), 레트로졸(Femara®), 메게스트롤 아세테이트(Megace®), 에스트로겐제, 비칼루타미드(Casodex®), 플루타미드(Eulexin®), 닐루타미드(Nilandron®), 류프롤리드(Lupron®) 및 고세렐린(Zoladex®); 분화제, 예컨대, 레티노이드, 트레티노인 (ATRA 또는 Atralin®), 벡사로텐(Targretin®) 및 삼산화 비소(Arsenox®); 및 표적화된 치료제, 예컨대, 이마티닙(Gleevec®), 게피티닙 (Iressa®) 및 수니티닙(Sutent®)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 화학요법은 칵테일 요법이다. 칵테일 요법의 예로는 CHOP/R-CHOP(리툭산, 사이클로포스파미드, 하이드록시독소루비신, 빈크리스틴, 및 프레드니손), EPOCH(에토포시드, 프레드니손, 빈크리스틴, 사이클로포스파미드, 하이드록시독소루비신), 하이퍼-CVAD(Hyper-CVAD)(사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 하이드록시독소루비신, 덱사메타손), FOLFOX(플루오로우라실 (5-FU), 류코보린, 옥살리플라틴), ICE (이포스파미드, 카르보플라틴, 에토포시드), DHAP(고용량 시타라빈[ara-C], 덱사메타손, 시스플라틴), ESHAP (에토포시드, 메틸프레드니솔론, 시타라빈[ara-C], 시스플라틴) 및 CMF(사이클로포스파미드, 메토트렉세이트, 플루오우라실)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
특정 실시양태에서, 추가 치료제는 제2 면역요법제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가 면역요법제로는 콜로니 자극 인자, 인터류킨, 면역억제 기능을 차단하는 항체(예컨대, 항CTLA-4 항체, 항CD28 항체, 항CD3 항체, 항PD-1 항체, 항PD-L1 항체, 항TIGIT 항체), 면역 세포 기능을 증진시키는 항체(예컨대, 항GITR 항체, 항OX-40 항체, 항CD40 항체, 또는 항4-1BB 항체), 톨 유사 수용체(예컨대, TLR4, TLR7, TLR9), 가용성 리간드(예컨대, GITRL, GITRL-Fc, OX-40L, OX-40L-Fc, CD40L, CD40L-Fc, 4-1BB 리간드, 또는 4-1BB 리간드-Fc), 또는 B7 패밀리의 구성원(예컨대, CD80, CD86)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 추가 면역요법제는 CTLA-4, CD28, CD3, PD-1, PD-L1, TIGIT, GITR, OX-40, CD-40, 또는 4-1BB를 표적화한다.
일부 실시양태에서, 추가 치료제는 면역 관문 억제제이다. 일부 실시양태에서, 면역 관문 억제제는 항PD-1 항체, 항PD-L1 항체, 항CTLA-4 항체, 항CD28 항체, 항TIGIT 항체, 항LAG3 항체, 항TIM3 항체, 항GITR 항체, 항4-1BB 항체, 또는 항OX-40 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 항TIGIT 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 니볼루맙(OPDIVO), 펨브롤리주맙(KEYTRUDA), 피딜리주맙, MEDI0680, REGN2810, BGB-A317, 및 PDR001로 구성된 군으로부터 선택되는 항PD-1 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 BMS935559(MDX-1105), 아테졸리주맙(MPDL3280A), 더발루맙(MEDI4736), 및 아벨루맙(MSB0010718C)으로 구성된 군으로부터 선택되는 항PD-L1 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 이필리무맙(YERVOY) 및 트레멜리무맙으로 구성된 군으로부터 선택되는 항CTLA-4 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 BMS-986016 및 LAG525으로 구성된 군으로부터 선택되는 항LAG-3 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 MEDI6469, MEDI0562, 및 MOXR0916으로 구성된 군으로부터 선택되는 항OX-40 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 PF-05082566으로 구성된 군으로부터 선택되는 항4-1BB 항체이다.
일부 실시양태에서, 신생항원 치료제는 아드레노메둘린(AM), 안지오포이에틴(Ang), BMP, BDNF, EGF, 에리트로포이에틴(EPO), FGF, GDNF, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF: Granulocyte Colony Stimulating Factor), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF: Macrophage Colony Stimulating Factor), 줄기 세포 인자(SCF: stem cell factor), GDF9, HGF, HDGF, IGF, 이동 자극 인자, 미오스타틴(GDF-8), NGF, 뉴로트로핀, PDGF, 트롬보포이에틴, TGF-α, TGF-β, TNF-α, VEGF, PlGF, 감마-IFN, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, 및 IL-18로 구성된 군으로부터 선택되는 생물 분자와 함께 조합하여 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 신생항원 치료제를 이용하는 치료는 종양의 외과적 절제, 암 세포의 절제, 또는 주치의에 의해 필요한 것으로 간주된 임의의 다른 외과적 요법을 동반할 수 있다.
특정 실시양태에서, 치료는 방사선 요법과 함께 조합하여 본원에 기술된 신생항원 치료제를 투여하는 것을 포함한다. 작용제를 이용하는 치료는 방사선 요법 투여 전, 그와 동시에 또는 그 후에 이루어질 수 있다. 상기 방사선 요법에 대한 투약 스케줄은 숙련된 의사에 의해 결정될 수 있다.
조합 투여는 단일 약학 제제로, 또는 별개의 제제를 사용하여 이루어지는 공동 투여, 임의의 순서로 진행되지만, 일반적으로 모든 활성제가 그의 생물학적 활성을 동시에 발휘할 수 있도록 하는 기간 내에 진행되는 연속 투여를 포함할 수 있다.
본원에 기술된 신생항원 치료제 및 적어도 하나의 추가 치료제의 조합은 임의의 순서로 또는 동시에 투여될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 앞서 제2 치료제로 치료를 받은 경험이 있는 환자에게 투여될 것이다. 특정의 다른 실시양태에서, 신생항원 치료제 및 제2 치료제는 실질적으로 동시에(simultaneously) 또는 동시에(concurrently) 투여될 것이다. 예를 들어, 피험체는 제2 치료제를 이용하는 치료(예컨대, 화학요법) 과정을 받는 동안 작용제를 제공받을 수 있다. 특정 실시양태에서, 신생항원 치료제는 제2 치료제를 이용하는 치료 1년 이내에 투여될 것이다. 2개(또는 그 초과의) 작용제 또는 치료가 수시간 또는 수분 이내에(즉, 실질적으로 동시에) 피험체에게 투여될 수 있다는 것도 추가로 이해하여야 할 것이다.
질환 치료를 위해, 본원에 기술된 신생항원 치료제의 적절한 투여량은 치료하고자 하는 질환의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 질환 반응성, 작용제가 치료 목적으로 또는 예방 목적으로 투여되는지 여부, 선형 요법, 환자의 병력 등에 의존하고, 이들은 모두 주치의의 재량에 따른다. 신생항원 치료제는 1회, 또는 수일 내지 수개월 지속되는 일련에 치료에 걸쳐, 또는 치유될 때까지 또는 질환 상태가 감소될 때까지(예컨대, 종양 크기 축소) 투여될 수 있다. 최적의 투약 스케줄은 환자 체내의 약물 축적량 측정으로부터 계산될 수 있고, 이는 개별 작용제의 상대적인 효능에 따라 달라질 것이다. 수행 의사는 최적의 투여량, 투약 방법 및 반복 속도를 결정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 신생항원 치료제는 초기에 더 높은 "로딩" 용량으로 투여된 후, 이어서, 하나 이상의 더 낮은 저용량으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여 빈도 또한 변경될 수 있다. 일부 실시양태에서, 투약 요법은 초기 용량을 투여한 후, 이어서, 추가 용량(또는 "유지" 용량)을 주 1회, 매 2주마다 1회, 매 3주마다 1회, 또는 월 1회 투여하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 투약 요법은 초기 로딩 용량을 투여한 후, 이어서, 예를 들어, 초기 용량의 절반인 유지 용량을 매주 투여하는 것을 포함할 수 있다. 또는, 투약 요법은 초기 로딩 용량을 투여한 후, 이어서, 예를 들어, 초기 용량의 절반인 유지 용량을 격주로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 또는, 투약 요법은 3주 동안 3회에 걸쳐 초기 용량을 투여한 후, 이어서, 예를 들어, 동일한 양의 유지 용량을 격주로 투여하는 것을 포함할 수 있다.
당업자에게 알려져 있는 바와 같이, 임의 치료에의 투여는 부작용 및/또는 독성을 일으킬 수 있다. 일부 경우에서, 부작용 및/또는 독성이 매우 심각하여 치료적 유효 용량의 특정 제제의 투여를 불가능하게 만든다. 일부 경우에서, 요법은 중단되어야 하고, 다른 작용제로 시도될 수 있다. 그러나, 동일한 치료제 부류 중의 다수의 작용제는 유사한 부작용 및/또는 독성을 나타내며, 이는 환자가 요법을 중단하거나, 또는 가능하다면, 치료제와 연관된 불편한 부작용으로 고생할 수 있다는 것을 의미한다.
일부 실시양태에서, 투약 스케줄은 특정 회수의 투여 또는 "사이클"로 제한될 수 있다. 일부 실시양태에서, 작용제는 3, 4, 5, 6, 7, 8회 이상의 사이클 동안 투여된다. 예를 들어, 작용제는 6 사이클 동안 매 2주마다 투여되거나, 작용제는 6 사이클 동안 매 3주마다 투여되거나, 작용제는 4 사이클 동안 매 2주마다 투여되거나, 작용제는 4 사이클 동안 매 3주마다 투여되는 등 그러한 방식으로 투여된다. 투약 스케줄은 당업자에 의해 결정될 수 있고, 그에 의해 추후 수정될 수 있다.
본 발명은 작용제, 화학요법제 등의 투여와 연관된 부작용 및/또는 독성을 감소시킬 수 있는 것인 하나 이상의 작용제를 투여하기 위한 간헐적 투약 전략법을 사용하는 것을 포함하는, 피험체에게 본원에 기술된 신생항원 치료제를 투여하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 피험체의 암을 치료하는 방법은 피험체에게 치료적 유효 용량의 화학요법제와 조합하여 치료적 유효 용량의 신생항원 치료제를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 작용제 중 하나 또는 그 둘 모두는 간헐적 투약 전략법에 따라 투여된다. 일부 실시양태에서, 인간 피험체의 암을 치료하는 방법은 피험체에게 치료적 유효 용량의 제2 면역요법제와 조합하여 치료적 유효 용량의 신생항원 치료제를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 작용제 중 하나 또는 그 둘 모두는 간헐적 투약 전략법에 따라 투여된다. 일부 실시양태에서, 간헐적 투약 전략법은 피험체에게 초기 용량의 신생항원 치료제를 투여하고, 약 매 2주마다 1회로 상기 작용제를 후속 용량으로 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 간헐적 투약 전략법은 피험체에게 초기 용량의 신생항원 치료제를 투여하고, 약 매 3주마다 1회로 상기 작용제를 후속 용량으로 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 간헐적 투약 전략법은 피험체에게 초기 용량의 신생항원 치료제를 투여하고, 약 매 4주마다 1회로 상기 작용제를 후속 용량으로 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 작용제는 간헐적 투약 전략법을 사용하여 투여되고, 추가 치료제는 매주 투여된다.
본 발명은 본원에 기술된 신생항원 치료제를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 본원에 기술된 신생항원 치료제 및 약학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 면역요법에서 사용될 수 있는 것으로 보인다. 일부 실시양태에서, 조성물은 종양 성장을 억제하는 데에서 사용될 수 있는 것으로 보인다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 피험체(예컨대, 인간 환자)에서 종양 성장을 억제하는 데에서 사용될 수 있는 것으로 보인다. 일부 실시양태에서, 조성물은 암을 치료하는 데에서 사용될 수 있는 것으로 보인다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 피험체(예컨대, 인간 환자)에서 암을 치료하는 데에서 사용될 수 있는 것으로 보인다.
제제는 본 발명의 신생항원 치료제를 약학적으로 허용되는 비히클(예컨대, 담체 또는 부형제)와 함께 조합함으로서 보관 및 사용을 위해 제조된다. 당업자는 일반적으로 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 및/또는 안정제는 제제 또는 약학 조성물의 불활성 성분인 것으로 간주된다. 예시적인 제제는 WO 2015/095811에 열거되어 있다.
적합한 약학적으로 허용되는 비히클로는 비독성 완충제, 예컨대, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 염, 예컨대, 염화나트륨; 항산화제(아스코르브산 및 메티오닌 포함); 보존제, 예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜, 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 사이클로헥사놀, 3-펜타놀, 및 m-크레졸; 저분자량 폴리펩티드(예컨대, 약 10개 미만의 아미노산 잔기); 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 탄수화물, 예컨대, 단당류, 이당류, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대, EDTA; 당, 예컨대, 수크로스, 만닛톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대 이온, 예컨대, 나트륨; 금속 복합체, 예컨대, Zn-단백질 복합체; 및 비이온성 계면활성제, 예컨대, TWEEN 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다(문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22st Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London.]). 일부 실시양태에서, 비히클은 물 중 5% 덱스트로스이다.
본원에 기술된 약학 조성물은 국부 또는 전치 치료를 위해 임의의 많은 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 표피용 또는 경피용 패치, 연구, 로션, 크림, 겔, 점적제, 좌제, 스프레이, 액상 제제 및 분제에 의한 국소 투여; 네블라이저, 기관내, 및 비내에 의한 것을 비롯한, 분제 또는 에어로졸의 흡입 또는 취입에 의한 폐 투여; 경구적 투여; 또는 정맥내, 동맥내, 종양내, 피하, 복강내, 근육내(예컨대, 주사 또는 주입) 또는 두개내(예컨대, 경막내 또는 뇌실내)인 것을 비롯한, 비경구적 투여일 수 있다.
치료적 제제는 단위 투여 형태일 수 있다. 상기 제제는 정제, 환제, 캡슐제, 분제, 과립제, 물 또는 비수성 매질 중 액제 또는 현탁제, 또는 좌제를 포함한다.
본원에 기술된 신생항원성 펩티드는 또한 마이크로캡슐에 포획될 수 있다. 예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐과 같은 상기 마이크로캡슐은 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22st Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London]에 기술된 바와 같이, 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 미소구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 중에서, 또는 마크로에멀젼 중에서 예를 들어, 코아세르베이션 기술에 의해, 또는 계면 중합체화에 의해 제조된다.
특정 실시양태에서, 약학 제제는 리포솜과 복합체를 형성한 본원에 기술된 신생항원 치료제를 포함한다. 리포솜 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 일부 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤, 및 PEG 유도체화된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 이용하는 역상 증발에 의해 생성될 수 있다. 공극 크기가 정의된 필터를 통해 리포솜을 압출시킴으로써 원하는 직경을 갖는 리포솜을 수득할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기술된 신생항원성 펩티드를 포함하는 지효성 제제를 제조할 수 있다. 지효성 제제의 적합한 예는 작용제를 함유하는 고체 소수성 중합체로 이루어진 반투과성 매트릭스를 포함하며, 여기서, 매트릭스는 성형화된 물품(예컨대, 필름 또는 마이크로캡슐) 형태이다. 지효성 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 하이드로겔, 예컨대, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐 알콜), 폴리락티드, L-글루탐산 및 7 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대, 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사용 미소구체), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트, 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다.
본 개시내용은 면역원성 백신을 포함하는 치료 방법을 제공한다. 질환(예컨대, 암 또는 바이러스 감염) 치료 방법을 제공한다. 방법은 피험체에게 유효량의, 면역원성 항원을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 바이러스 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 종양 항원을 포함한다.
제조될 수 있는 백신의 비제한적인 예로는 펩티드 기반 백신, 핵산 기반 백신, 항체 기반 백신, T 세포 기반 백신, 및 항원 제시 세포 기반 백신을 포함한다.
백신 조성물은, 부형제를 비롯한 하나 이상의 생리적으로 허용되는 담체, 및 약학적으로 사용될 수 있는 제제로의 활성제의 프로세싱을 촉진시키는 보조제를 사용하여 제제화될 수 있다. 적절한 제제는 선택된 투여 경로에 의존할 수 있다. 널리 공지된 기술, 담체, 및 부형제 중 임의의 것은 적합하게, 및 당업계에서 이해되는 바와 같이 사용될 수 있다.
일부 경우에서, 백신 조성물은 펩티드 기반 백신, 핵산 기반 백신, 항체 기반 백신, 또는 세포 기반 백신으로서 제제화된다. 예를 들어, 백신 조성물은 양이온성 지질 제제 중 네이키드 cDNA; 지질펩티드(예컨대, 문헌 [Vitiello, A. et al., J. Clin. Invest. 95:341, 1995]), 예컨대, 폴리(DL-락티드-코-글리콜리드)("PLG": poly(DL-lactide-co-glycolide)) 미소구체에 캡슐화된 네이키드 cDNA 또는 펩티드(예컨대, 문헌 [Eldridge, et al., Molec. Immunol. 28:287-294, 1991]: [Alonso et al, Vaccine 12:299-306, 1994]; [Jones et al, Vaccine 13:675-681, 1995] 참조); 면역 자극 복합체(ISCOMS: immune stimulating complex) 중에 함유되어 있는 펩티드 조성물(예컨대, 문헌 [Takahashi et al, Nature 344:873-875, 1990]; [Hu et al, Clin Exp Immunol. 113:235-243, 1998]); 또는 다중 항원 펩티드 시스템(MAP: multiple antigen peptide)(예컨대, 문헌 [Tam, J. P., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 85:5409-5413, 1988]; [Tarn, J.P., J. Immunol. Methods 196:17-32, 1996])을 포함할 수 있다. 종종, 백신은 펩티드 기반 백신, 또는 핵산이 폴리펩티드를 코딩하는 것인 핵산 기반 백신으로서 제제화된다. 종종, 백신은 항체 기반 백신으로서 제제화된다. 종종, 백신은 세포 기반 백신으로서 제제화된다.
확인된 질환 특이적 면역원성 신생항원 펩티드의 아미노산 서열은 약학적으로 허용되는 조성물을 개발하는 데 사용될 수 있다. 항원 공급원은 당단백질, 펩티드, 및 초항원을 비롯한, 천연 또는 합성 단백질; 항체/항원 복합체; 지질단백질; RNA 또는 그의 번역 생성물; 및 DNA 또는 DNA에 의해 코딩된 폴리펩티드일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 항원 공급원은 또한 비형질전환된, 형질전환된, 형질감염된 또는 형질도입된 세포 또는 세포주일 수 있다. 세포는 재조합 항원을 발현시키는 데 사용될 수 있는, 당업계의 숙련가에게 공지된 다양한 발현 또는 레트로바이러스 벡터 중 임의의 것을 사용하여 형질전환된, 형질감염된 또는 형질도입된 것일 수 있다. 발현은 또한 재조합 항원(들)을 코딩하는 DNA 분자를 함유하는 발현 또는 레트로바이러스 벡터로 형질전환된, 형질감염된 또는 형질도입된 임의의 적절한 숙주 세포에서 달성될 수 있다. 당업자에게 공지된 다수의 형질감염, 형질전환 및 형질도입 프로토콜이 사용될 수 있다. 재조합 백시니아 벡터 및 백시니아 벡터로 감염된 세포가 항원의 공급원으로서 사용될 수 있다.
조성물은 합성 질환 특이적 면역원성 신생항원 펩티드를 포함할 수 있다. 조성물은 2개 이상의 질환 특이적 면역원성 신생항원 펩티드를 포함할 수 있다. 조성물은 질환 특이적 면역원성 펩티드(예컨대, 단백질, 펩티드, DNA 및 RNA)에 대한 전구체를 포함할 수 있다. 질환 특이적 면역원성 펩티드에 대한 전구체는 확인된 질환 특이적 면역원성 신생항원 펩티드를 생성할 수 있거나, 확인된 질환 특이적 면역원성 신생항원 펩티드로 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료 조성물은 면역원성 펩티드의 전구체를 포함한다. 질환 특이적 면역원성 펩티드에 대한 전구체는 프로드럭일 수 있다. 일부 실시양태에서, 질환 특이적 면역원성 신생항원 펩티드를 포함하는 조성물은 애쥬번트를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 신생항원 펩티드는 백신으로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역원성 백신은 약학적으로 허용되는 면역원성 신생항원 펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역원성 백신은 면역원성 신생항원 펩티드(예컨대, 단백질, 펩티드, DNA 및 RNA)에 대한 약학적으로 허용되는 전구체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료 방법은 피험체에게 유효량의, 면역원성 신생항원 펩티드를 특이적으로 인식하는 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서,치료 방법은 피험체에게 유효량의, 면역원성 신생항원 펩티드를 특이적으로 인식하는 가용성 TCR 또는 TCR 유사체를 투여하는 단계를 포함한다.
본원에 기술된 방법은 특히, 면역원성 신생항원 펩티드가 동일 개체에 대한 치료제(예컨대, 백신 또는 치료 항체) 개발에 사용되는 개인맞춤형 의약과 관련하여 특히 유용하다. 따라서, 피험체에서 질환을 치료하는 방법은 본원에 기술된 방법에 따라 피험체에서 면역원성 신생항원 펩티드를 확인하는 단계; 및 펩티드(또는 그의 전구체)를 합성하는 단계; 및 피험체에게 펩티드 또는 펩티드를 특이적으로 인식하는 항체를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역원성 신생항원의 발현 패턴이 환자 특이적 백신 생성을 위한 필수적인 기본으로서 작용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역원성 신생항원의 발현 패턴이 특정 질환을 앓는 환자 군을 위한 백신 생성을 위한 필수적인 기본으로서 작용할 수 있다. 따라서, 특정 질환, 예컨대, 특정 유형의 종양은 환자 군에서 선택적으로 치료될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 펩티드는 큰 환자 군에서 자가 항질환 T 세포에 의해 인식될 수 있는 구조상 일반적인 ("공유") 항원이다. 일부 실시양태에서, 질환이 구조상 일반적인 ("공유") 신생항원을 발현하는 질환에 이환된 피험체 군의 항원 발현 패턴이 측정된다.
면역원성 신생항원을 제조하는 다양한 방법이 존재한다. 단백질 또는 펩티드는 표준 분자 생물학적 기술을 통한 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 발현, 천연 공급원으로부터의 단백질 또는 펩티드의 단리, 단백질 또는 펩티드의 시험관내 번역 또는 화학적 합성을 비롯한, 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 상기 질환 특이적 신생항원은 시험관내 또는 생체내에서 제조될 수 있다. 면역원성 신생항원은 시험관내에서 펩티드 또는 폴리펩티드로서 제조된 후, 개인맞춤형 백신 또는 면역원성 조성물로 제제화될 수 있고, 피험체에게 투여될 수 있다. 면역원성 신생항원의 시험관내 제조는 펩티드 합성, 또는 다양한 박테리아, 진핵 또는 바이러스 재조합 발현 시스템 중 임의의 것에서의 DNA 또는 RNA 분자로부터의 펩티드/폴리펩티드의 발현, 이어서, 발현된 펩티드/폴리펩티드의 정제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 면역원성 신생항원은 면역원성 신생항원을 코딩하는 분자(예컨대, DNA, RNA, 바이러스 발현 시스템 등)를 피험체 내로 도입하여, 코딩된 면역원성 신생항원이 발현됨으로써 생체내에서 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역원성 신생항원 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 시험관내에서 신생항원 펩티드를 제조하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 면역원성 신생항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 60%, 65%, 70%l, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
폴리뉴클레오티드는 예컨대, DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA, 단일 및/또는 이중 가닥, 천연 또는 안정화된 형태의 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합일 수 있다. 면역원성 신생항원 펩티드를 코딩하는 핵산은 그가 펩티드를 코딩하는 한, 인트론을 함유하거나, 또는 함유하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드를 제조하는 데 시험관내 번역이 사용된다.
신생항원을 코딩하는 서열을 포함하는 발현 벡터 뿐만 아니라, 상기 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포 또한 고려된다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 발현 벡터는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 발현 제어 요소를 포함할 수 있다. 발현 제어 요소는 핵산 서열의 발현을 제어 및 조절하기 위해 벡터 중에 삽입된다. 발현 제어 요소의 예는 당업계에 널리 공지되어 있고, 이는 폴리오마, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 또는 SV40으로부터 유래된 프로모터를 포함한다. 추가의 작동 요소로는 리더 서열, 종결 코돈, 폴리아데닐화 신호 및 숙주 시스템에서 핵산 서열의 적절한 전사 및 후속되는 번역에 필요하거나, 또는 바람직한 임의의 다른 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 발현 제어 요소의 올바른 조합은 선택된 숙주 시스템에 의존하게 된다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 발현 벡터는 숙주 시스템에서 핵산 서열을 함유하는 발현 벡터의 전달 및 후속되는 복제에 필요한 추가 요소를 함유하여야 한다는 것도 추가로 이해할 것이다. 상기 요소의 예로는 복제 기점 및 선별가능한 마커를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
신생항원 펩티드는 원하는 신생항원 펩티드를 코딩하는 RNA 또는 cDNA 분자 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 신생항원 펩티드는 단일 발현 벡터에 의해 코딩될 수 있다. 일반적으로, DNA는 발현 벡터, 예컨대, 플라스미드 내로 발현을 위해 적절한 배향으로 및 올바른 리딩프레임에 삽입되고, 비록 제어가 일반적으로는 발현 벡터 내에서 이용가능하지만, 필요할 경우, DNA는 원하는 숙주(예컨대, 박테리아)에 의해 인식되는 적절한 전사 및 번역 조절 제어 뉴클레오티드 서열에 연결될 수 있다. 이어서, 벡터는 클로닝을 위해 표준 기술을 사용하여 숙주 박테리아 내로 도입된다. 진핵성 숙주, 특히, 포유동물 또는 인간에 유용한 발현 벡터로는 예를 들어, SV40, 소 유두종 바이러스, 아데노바이러스 및 사이토메갈로바이러스로부터의 발현 제어 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 박테리아 숙주에 유용한 발현 벡터로는 공지된 박테리아 플라스미드, 예컨대, E. 콜라이로부터의 플라스미드(pCR1, pBR322, pMB9 및 그의 유도체 포함), 더욱 광범위한 숙주 범위의 플라스미드, 예컨대, M13 및 섬유상 단일 가닥 DNA 파지를 포함한다.
실시양태에서, 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열은 올리고뉴클레오티드 합성 장치를 사용하여 화학적 합성에 의해 구성될 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 원하는 폴리펩티드의 아미노산 서열, 및 관심의 대상이 되는 재조합 폴리펩티드가 제조되는 숙주 세포가 선호하는 코돈을 선택하는 것에 기초하여 디자인될 수 있다. 관심의 대상이 되는 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열을 합성하는 데 표준 방법이 적용될 수 있다.
적절한 프로모터의 제어하에서 폴리펩티드를 발현하는 데 적합한 숙주 세포로는 원핵생물, 효모, 곤충 또는 고등 진핵 세포를 포함한다. 원핵생물로는 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어, E. 콜라이 또는 바실러스를 포함한다. 고등 진핵 세포로는 포유동물 기원의 확립된 세포주를 포함한다. 무세포 번역 시스템 또한 사용될 수 있다. 박테리아, 진균, 효모, 및 포유동물 세포 숙주와 함께 사용하기에 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 당업계에 널리 공지되어 있다. 재조합 단백질을 발현시키는 데 각종의 포유동물 또는 곤충 세포 배양 시스템이 사용될 수 있다. 예시적인 포유동물 숙주 세포주로는 COS-7, L 세포, C127, 3T3, 차이니즈 햄스터 난소(CHO), 293, HeLa 및 BHK 세포주를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 포유동물 발현 벡터는 비전사 요소, 예컨대, 복제 기점, 발현되는 유전자에 연결된 적합한 프로모터 및 인핸서, 및 다른 5' 또는 3' 측면 비전사 서열, 및 5' 또는 3' 비번역 서열, 예컨대, 필요한 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여자 및 수여자 부위, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다.
형질전환된 숙주에 의해 제조된 단백질은 임의의 적합한 방법에 따라 정제될 수 있다. 상기 표준 방법으로는 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환, 친화성 및 사이징 칼럼 크로마토그래피 등), 원심분리, 차별적 용해도, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술을 포함한다. 친화성 태그, 예컨대, 헥사히스티딘, 말토스 결합 도메인, 인플루엔자 코트 서열 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제 등을 단백질에 부착하여, 적절한 친화성 칼럼을 통과시킴으로써 쉽게 정제를 수행하였다. 단리된 단백질은 또한 단백질분해, 핵 자기 공명 및 x선 결정법과 같은 기술을 이용하여 물리적으로 특징이 규명될 수도 있다.
백신은 본원에 기술된 폴리펩티드 서열에 결합하는 엔티티를 포함할 수 있다. 엔티티는 항체일 수 있다. 항체 기반 백신은 적합하게, 및 당업계에서 이해되는 바와 같이 널리 공지된 기술, 담체, 및 부형제 중 임의의 것을 사용하여 제제화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 펩티드는 신생항원 특이적 치료제, 예컨대, 항체 치료제를 제조하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 신생항원은 신생항원을 특이적으로 인식하는 항체를 일으키고 및/또는 확인하는 데 사용될 수 있다. 이들 항체는 치료제로서 사용될 수 있다. 항체는 천연 항체, 키메라 항체, 인간화 항체일 수 있거나, 또는 항체 단편일 수 있다. 항체는 본원에 기술된 폴리펩티드 중 하나 이상의 것을 인식할 수 있다. 항체는 본원에 기술된 폴리펩티드와 서열 상동성이 최대 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이하인 서열을 갖는 폴리펩티드를 인식할 수 있다. 항체는 본원에 기술된 폴리펩티드와 서열 상동성이 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상인 서열을 갖는 폴리펩티드를 인식할 수 있다. 항체는 또한 본원에 기술된 폴리펩티드와 비교하여 서열 길이가 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상인 서열 길이를 갖는 폴리펩티드를 인식할 수 있다. 항체는 본원에 기술된 폴리펩티드와 비교하여 서열 길이가 최대 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이하인 서열 길이를 갖는 폴리펩티드를 인식할 수 있다.
본 발명은 또한 생체내에서 신생항원 펩티드/폴리펩티드를 그를 필요로 하는 피험체에 전달하기 위한 비히클로서, 예컨대, DNA/RNA 백신 형태의 핵산 분자의 용도를 고려한다.
일부 실시양태에서, 백신은 핵산 백신이다. 일부 실시양태에서, 신생항원은 플라스미드 사용에 의해 피험체에게 투여될 수 있다. 플라스미드는 다수의 상이한 방법, 예컨대, 점막 표면, 예컨대, 코 및 폐 점막과 같은 점막 표면 상에의 네이키드 DNA의 주사 또는 에어로졸 점적 주입에 의해 동물 조직으로 내로 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예컨대, "유전자 총"을 이용하는 것과 같은 물리적 전달이 사용될 수 있다. 발현 벡터의 정확한 선택은 발현시키고자 하는 펩티드/폴리펩티드에 의존할 수 있고, 이는 당업계의 숙련가의 기술 범위 내에 잘 포함되어 있다.
일부 실시양태에서, 핵산은 면역원성 펩티드 또는 펩티드 전구체를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산 백신은 면역원성 펩티드 또는 펩티드 전구체를 코딩하는 서열 측면에 위치하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 백신은 1개 초과의 면역원성 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 백신은 DNA 기반 백신이다. 일부 실시양태에서, 핵산 백신은 RNA 기반 백신이다. 일부 실시양태에서, RNA 기반 백신은 mRNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, RNA 기반 백신은 네이키드 mRNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, RNA 기반 백신은 변형된 mRNA(예컨대, 프로타민을 이용하여 분해로부터 보호된 mRNA, 변형된 5' CAP 구조를 함유하는 mRNA 또는 변형된 뉴클레오티드를 함유하는 mRNA)를 포함한다. 일부 실시양태에서, RNA 기반 백신은 단일 가닥 mRNA를 포함한다.
폴리뉴클레오티드는 실질적으로 순수한 것일 수 있거나, 적합한 벡터 또는 전달 시스템에 함유되어 있을 수 있다. 적합한 벡터 및 전달 시스템으로는 바이러스, 예컨대, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 레트로바이러스, 허피스 바이러스, 아데노 연관 바이러스에 기반한 시스템, 또는 1개 초과의 바이러스의 요소를 함유하는 하이브리드를 포함한다. 비바이러스 전달 시스템으로는 양이온성 지질 및 양이온성 중합체(예컨대, 양이온성 리포솜)를 포함한다.
하나 이상의 신생항원 펩티드는 바이러스 기반 시스템을 사용하여 생체내에서 코딩되고, 발현될 수 있다. 바이러스의 감염성은 파괴시키지 않으면서, 새 유전자를 도입하기 위해 바이러스 게놈의 일부가 결실된 바이러스 벡터가 본 발명에서 재조합 벡터로서 사용될 수 있다. 본 발명의 바이러스 벡터는 비병원성 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 포유동물에서 특정 세포 유형에 대해 향성을 가진다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 바이러스 벡터는 전문 항원 제시 세포, 예컨대, 수지상 세포 및 대식세포를 감염시킬 수 있다. 본 발명의 추가의 또 다른 실시양태에서, 바이러스 벡터는 포유동물에서 임의의 세포를 감염시킬 수 있다. 바이러스 벡터는 또한 종양세포를 감염시킬 수 있다. 본 발명에서 사용되는 바이러스 벡터로는 폭스바이러스, 예컨대, 백시니아 바이러스, 조류폭스 바이러스, 계두 바이러스 및 고도로 약독화된 백시니아 바이러스(안카라 또는 MVA), 레트로바이러스, 아데노바이러스, 배큘로바이러스 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
백신은 다양한 경로를 통해 전달될 수 있다. 전달 경로로는 경구적(협측 및 설하 포함), 직장, 비강, 국소, 경피용 패치, 폐, 질, 좌제, 또는 비경구적(근육내, 동맥내, 경막내, 피내, 복강내, 피하 및 정맥내 포함) 투여, 또는 에어로졸화, 흡입 또는 취입에 의한 투여에 적합한 형태의 것을 포함할 수 있다. 약물 전달 시스템에 대한 일반 정보는 문헌 [Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Lippencott Williams & Wilkins, Baltimore Md. (1999)]에서 살펴볼 수 있다. 본원에 기술된 백신은 근육에 투여될 수 있거나, 또는 피내 또는 피하 주사를 통해, 경피적으로, 예컨대, 이온 도입법에 의해 투여될 수 있다. 백신의 표피 투여가 사용될 수 있다.
일부 경우에서, 백신은 또한 비강 경로를 통한 투여용으로 제제화될 수 있다. 담체가 고체인 비강 투여에 적합한 제제는 코담배(snuff)가 투여되는 방식, 즉, 코에 근접하게 유지된 분말의 용기로부터 비강 경로를 통한 빠른 흡입으로 투여되는 예를 들어, 약 0 내지 약 500 ㎛ 범위의 입자 크기를 갖는 조분말을 포함한다. 제제는 비강 스프레이, 비강 점적제일 수 있거나, 또는 네블라이저에 의한 에어로졸 투여에 의한 것일 수 있다. 제제는 백신의 수성 또는 유성 용액을 포함할 수 있다.
백신은 액체 제제, 예컨대, 현탁제, 시럽, 또는 엘릭시르일 수 있다. 백신은 또한 비경구적, 피하, 피내, 근육내 또는 정맥내 투여(예컨대, 주사 투여)용 제제, 예컨대, 멸균 현탁제, 에멀젼일 수 있다.
백신은 단일 면역화를 위한 물질을 포함할 수 있거나, 또는 다회 면역화를 위한 물질을 포함할 수 있다(즉, "다회 투약" 키트). 다회 투약 방식에서는 보존제를 포함하는 것이 바람직하다. 다회 투약 조성물 중에 보존제를 포함하는 것에 대한 대안적으로(또는 그 이외에), 조성물은 물질 제거용 무균 어댑터가 장착된 용기에 함유될 수 있다.
백신은, 비록 아동에게는 절반 용량(즉, 약 0.25 mL)이 투여될 수 있지만, 약 0.5 mL의 투여량 부피로 투여될 수 있다. 종종, 백신은 더 높은 용량으로, 예컨대, 약 1 ml로 투여될 수 있다.
백신은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 이상의 투약 과정의 요법으로 투여될 수 있다. 종종, 백신은 1, 2, 3, 또는 4회 투약 과정의 요법으로 투여된다. 종종, 백신은 1회 투약 과정의 요법으로 투여된다. 종종, 백신은 2회 투약 과정의 요법으로 투여된다.
제1 용량 및 제2 용량 투여는 약 0일, 1일, 2일, 5일, 7일, 14일, 21일, 30일, 2개월, 4개월, 6개월, 9개월, 1년, 1.5년, 2년, 3년, 4년 이상의 간격을 두고 이루어질 수 있다.
본원에 기술된 백신은 매 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 이상의 기간마다 투여될 수 있다. 종종, 본원에 기술된 백신은 매 2, 3, 4, 5, 6, 7년 이상의 기간마다 투여된다. 종종, 본원에 기술된 백신은 매 4, 5, 6, 7년 이상의 기간마다 투여된다. 종종, 본원에 기술된 백신은 1회 투여된다
투여량에 대한 예는 제한적인 것인 아니며, 이는 단지 본원에 기술된 백신 투여를 위한 특정의 투약 요법을 예시하기 위해 사용된다. 인간용으로서의 유효량은 동물 모델로부터 결정될 수 있다. 예를 들어, 인간용 용량은 동물에서 효과적인 것으로 밝혀진 순환, 간, 국소 및/또는 위장관암 농도를 달성하도록 제제화될 수 있다. 동물 데이터, 및 다른 유형의 유사한 데이터에 기초하여, 당업자는 인간용으로 적절한 백신 조성물의 유효량을 결정할 수 있다.
한 작용제, 또는 작용제들의 조합을 지칭할 때 유효량이란 일반적으로 의약 또는 약학 분야의 다양한 규제 기관 또는 자문 기관(예컨대, FDA, AMA)에 의해 권고되거나, 또는 승인받은 용량 범위, 투여 모드, 제제 등을 의미할 것이다.
일부 측면에서, 본원에 기술된 백신 및 키트는 2℃ 내지 8℃에서 보관될 수 있다. 일부 경우에서, 백신은 냉동 보관되지 않는다. 일부 경우에서, 백신은 예컨대, -20℃ 또는 -80℃ 온도에서 보관된다. 일부 경우에서, 백신은 직사광선을 피해 보관된다.
VIII. 키트
본원에 기술된 신생항원 치료제는 투여 설명서와 함께 키트 형태로 제공될 수 있다. 전형적으로, 키트는 용기내에 단위 제형 형태로 원하는 신생항원 치료제, 및 투여 설명서를 포함할 것이다. 추가 치료제, 예를 들어, 사이토카인, 림포카인, 관문 억제제, 항체 또한 키트에 포함될 수 있다. 이 또한 바람직할 수 있는 것인 다른 키트 성분으로는 예를 들어, 멸균 시린지, 부스터 투여량, 및 다른 원하는 부형제를 포함한다.
본원에 기술된 하나 이상의 방법과 함께 사용하기 위한 키트 및 제조 물품 또한 본원에서 제공한다. 키트는 하나 이상의 신생항원 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 키트는 본원에 기술된 폴리펩티드 중 하나 이상의 것을 코딩하는 핵산, 본원에 기술된 폴리펩티드 중 하나 이상의 것을 인식하는 항체, 또는 본원에 기술된 폴리펩티드 중 하나 이상의 것으로 활성화된 APC 기반 세포 또한 함유할 수 있다. 키트는 백신 구성 및 전달을 위해 필요한 애쥬번트, 시약, 및 완충제를 추가로 함유할 수 있다.
키트는 또한 각각의 용기(들)가 본원에 기술된 방법에서 사용되는 별개의 요소, 예컨대, 폴리펩티드 및 애쥬번트 중 하나를 포함하는 것인 하나 이상의 용기, 예컨대, 바이알, 튜브 등을 수용하도록 구획화된 캐리어, 패키지, 또는 용기를 포함할 수 있다. 적합한 용기로는 예를 들어, 병, 바이알, 시린지, 및 시험관을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대, 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다.
본원에서 제공된 제조 물품은 포장재를 함유한다. 약학 포장재의 예로는 블리스터 팩, 병, 튜브, 백, 용기, 병, 및 선택된 제제 및 의도된 투여 모드 및 치료에 적합한 임의의 포장재를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 키트는 전형적으로 내용물 및/또는 사용 설명이 열거되어 있는 라벨, 및 사용 설명이 있는 패키지 인서트를 포함한다. 전형적으로, 설명서 세트 또한 포함될 것이다.
본 발명은 구체적인 예에 의해 더욱 상세하게 기술될 것이다. 하기 실시예는 예시 목적으로 제공된 것이며, 본 발명을 어느 방식으로든 제한하고자 하지 않는다. 당업자는 다양한 중요하지 않은 파라미터를 변형 또는 수정하여 본 발명에 따른 대안적 실시양태를 수득할 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 본원에 열거된 모든 특허, 특허 출원, 및 인쇄된 공개 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1: 면역원성 잠재능을 가진 돌연변이체 서열 확인
본 출원인들은 암 환자에서 재발성을 띠는 돌연변이를 발견하였다. 표 1 및 2를 참조한다.
본원에 기술된 신생항원성 펩티드는 표 1 및 2에 열거된 돌연변이로부터 유래된 것일 수 있다. 예를 들어, 신생항원성 펩티드는 치환 돌연변이, 예컨대, KRAS G12V 돌연변이로부터 유래된 것일 수 있다. 신생항원성 펩티드는 단백질의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드, 예컨대, 치환(G12V)을 포함하는 KRAS일 수 있다. 치환은 신생항원성 펩티드 길이를 따라 어느 위치에나 위치할 수 있다. 예를 들어, 신생항원성 펩티드의 N 말단에서 3번째, 신생항원성 펩티드의 중앙에서 3번째, 또는 신생항원성 펩티드의 C 말단에서 3번째에 위치할 수 있다. 또 다른 예에서, 치환된 잔기는 N 말단 단부로부터 2-5개 잔기만큼 떨어진 위치에, 또는 C 말단 단부로부터 2-5개 잔기만큼 떨어진 위치에 위치한다. 신생항원성 펩티드는 유사하게 신생항원성 펩티드가 삽입된 잔기 중 하나 이상, 또는 그들 모두를 포함하는 것인 종양 특이적 삽입 돌연변이로부터 유래된 것일 수 있다.
신생항원성 펩티드는 또한 프레임시프트 돌연변이, 융합 폴리펩티드, 인 프레임 결실, 및 스플라이스 변이체로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 돌연변이를 생성하는 종양 특이적 폴리펩티드는 생식세포주에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열과, 종양 특이적 돌연변이에 의해 코딩된 종양 특이적 돌연변이체 폴리펩티드 사이에 전이점이 존재하는 것을 특징으로 할 수 있다. 신생항원성 펩티드는 생식세포주에 의해 코딩된 천연 서열과 종양 특이적 폴리펩티드 서열 사이에 전이점을 포함하는 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드일 수 있다. 전이점은 신생항원성 펩티드 길이를 따라 어느 위치에나 위치할 수 있다. 예를 들어, 신생항원성 펩티드의 N 말단에서 3번째, 신생항원성 펩티드의 중앙에서 3번째, 또는 신생항원성 펩티드의 C 말단에서 3번째에 위치할 수 있다. 또 다른 예에서, 전이점은 N 말단 단부로부터 2-5개 잔기만큼 떨어진 위치에, 또는 C 말단 단부로부터 2-5개 잔기만큼 떨어진 위치에 위치한다. 프레임시프트 돌연변이 및 스플라이스 변이체로부터 유래된 신생항원성 펩티드는 종양 특이적 돌연변이체 잔기로 구성된 펩티드일 수 있다.
표 1 및 2에 열거된 각 돌연변이 이벤트의 경우, 돌연변이체 단백질의 전장의 아미노산 서열이 도출되었다. 생식세포주 단백질 서열에서는 발견되지 않는 임의의 구성 요소 9mer 또는 10mer를 신생펩티드로서 표시하고, 이용가능한 알고리즘을 이용하여 6개의 공통 HLA 대립유전자(HLA-A01:01, HLA-A02:01. HLA-A03:01, HLA-A11:01, HLA-A24:02, HLA-B07:02, 및 HLA-B08:01)에서 결합 잠재능에 대해 점수화하였다. 점수가 1,000 nM보다 우수한 임의의 펩티드를 지명하였다. 지명된 펩티드는 표 1 및 2에 열거되어 있고, 그 다음으로 괄호 안에 점수가 높은 HLA 대립유전자가 기재되어 있다.
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상기 표에서, 예시적인 융합체 중 하나 이상의 것의 경우, 첫 번째 ":" 앞에 오는 서열은 제1 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드의 엑손 서열에 속하고, 두 번째 ":" 뒤에 오는 서열은 제2 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드의 엑손 서열에 속하고, ":" 기호 사이에 출현한 아미노산은 제1 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드의 엑손 서열과 제2 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드의 엑손 서열 사이에서 분할된 코돈에 의해 코딩된다.
그러나, 일부 실시양태에서, 예를 들어, NAB:STAT6의 경우, NAB 엑손은 STAT6의 5' UTR에 연결되고, 접합부 다음에 출현하는 제1 아미노산은 STAT6의 일반적인 출발 코돈이다((보통은 번역되지 않는 바) 상기 부위에 존재하는 프레임은 없다).
일부 실시양태에서, 상기 표에서 AR-V7은 또한 전장의 AR에서 발견되는 리간드 결합 도메인이 없는 단백질을 코딩하는 AR 유전자의 스플라이스 변이체인 것으로 간주될 수 있다.
실시예 2: HLA 클래스 I 및 클래스 II 결합 검정법
HLA 분자에의 펩티드 결합에 관한 하기의 실시예는 HLA 클래스 I 및 클래스 II 펩티드의 결합 친화도의 정량화를 보여주는 것이다. 모티프를 보유하거나, 또는 모티프를 보유하지 않는 펩티드를 이용하여 결합 검정법을 수행할 수 있다.
엡스타인 바 바이러스(EBV) 형질전환된 동형접합성 세포주, 섬유아세포, CIR, 또는 721.22 형질감염체를 HLA 클래스 I 분자의 공급원으로서 사용한다. 개시된 프로토콜에 따라 세포 용해물을 제조하고, HLA 분자를 정제한다(문헌 [Sidney et al., Current Protocols in Immunology 18.3.1 (1998)]; [Sidney, et al., J. Immunol. 154:247 (1995)]; [Sette, et al., Mol. Immunol. 31:813 (1994)]). HLA 분자를 친화성 크로마토그래피에 의해 용해물로부터 정제한다. 용해물을, 적절한 항체에 커플링된 세파로스 CL-4B 비드의 칼럼 상에서 통과시킨다. 이어서, 항HLA 칼럼을 1% NP-40, PBS, 및 0.4% n-옥틸글루코시드 함유 PBS 중 10 mM 트리스-HCL(pH 8.0)로 세척하고, HLA 분자 를 0.4% n-옥틸글루코시드 함유 0.15 M NaCl(pH 11.5) 중 50 mM 디에틸아민으로 용출시킨다. 1/25 부피의 2.0 M 트리스(pH 6.8)를 용출액에 첨가하여 pH를 pH ~8.0까지 하락시킨다. 이어서, 용출액을 센트리프렙 30(Centriprep 30) 농축기(Pierce Chemical Co.: 미국 일리노이주 록퍼드 소재)에서 원심분리하여 농축시킨다. BCA 단백질 검정법(Pierce Chemical Co.: 미국 일리노이주 록퍼드 소재)에 의해 단백질 함량을 평가하고, SDS-PAGE에 의해 확인한다.
클래스 I 및 클래스 II MHC에 대한 펩티드의 결합 친화도를 측정하는 데 사용된 프로토콜에 관한 상세한 설명은 공개되어 있다(문헌 [Sette et al., Mol. Immunol. 31:813, 1994]; [Sidney et al., in Current Protocols in Immunology, Margulies, Ed., John Wiley & Sons, New York, Section 18.3, 1998]). 간략하면, 정제된 MHC 분자(5 내지 500 nM)를 프로테아제 억제제 칵테일의 존재하에 0.05% 노니데트 P-40(NP40: Nonidet P-40)(또는 H-2 IA 검정법인 경우, 20% w/v 디기토닌)을 함유하는 PBS 중에서 48 h 동안 각종의 비표지화된 펩티드 억제제 및 1-10 nM 125I-방사성 표지된 프로브 펩티드와 함께 인큐베이션한다. 모든 검정법은 pH 7.0에서 수행되되, 단, 예외적으로, DRB1*0301은 pH 4.5에서 수행되었고, DRB1*1601(DR2w21β1) 및 DRB4*0101(DRw53)은 pH 5.0에서 수행되었다.
인큐베이션 후, MHC-펩티드 복합체를 7.8 mm x 15 cm TSK200 칼럼(TosoHaas 16215, 미국 펜실베니아주 몽고매리빌 소재) 상에서 겔 여과에 의해 유리 펩티드로부터 분리시킨다. DRB1*1501(DR2w2β1) 검정법에 사용된 방사성 표지된 펩티드의 큰 크기는 상기 조건하에서 비결합 피크로부터 결합 피크 분리를 더욱 어렵게 하기 때문에, 모든 DRB1*1501(DR2w2β1) 검정법은 0.6 mLs/min으로 용리되는 7.8 mm x 30 cm TSK2000 칼럼을 이용하여 수행하였다. TSK 칼럼으로부터의 용출액을 베크만 170(Beckman 170) 방사성 동위원소 검출기를 통해 통과시키고, 방사능을 플롯팅하고, 휴렛-팩커드 3396A(Hewlett-Packard 3396A) 적분기를 사용하여 적분하고, 결합된 펩티드의 분율을 측정한다.
클로라민-T 방법을 이용하여 방사성 표지된 펩티드를 아이오드화시킨다. 전형적으로, 예비 실험에서, 고정된 양의 방사성 표지된 펩티드의 존재하에서 각 MHC 제제를 적정하여 총 방사능 중 10-20%에의 결합에 필요한 HLA 분자의 농도를 측정한다. 후속되는 모든 억제 검정법 및 직접 결합 검정법은 상기 HLA 농도를 사용하여 수행된다.
상기 조건하에서, [표지] < [HLA] 및 IC50 ≥ [HLA]이기 때문에, 측정된 IC50 값은 실제 KD 값의 적정 근사치이다. 펩티드 억제제는 전형적으로 120 ㎍/ml 내지 1.2 ng/ml 범위의 농도에서 테스트하고, 2 내지 4개의 완전히 독립된 실험으로 테스트한다. 상이한 실험에서 수득한 데이터 비교를 허용하기 위해, 억제를 위한 양성 대조군의 IC50을 테스트된 각 펩티드(전형적으로 방사성 표지된 프로브 펩티드의 비표지화된 버전)에 대한 IC50으로 나눔으로써 각 펩티드에 대한 상대적인 결합 수치를 계산한다. 데이터베이스 목적으로 및 실험간 비교를 위해, 상대적인 결합 값을 컴파일링한다. 이어서, 상기 값을, 억제를 위한 양성 대조군의 IC50(nM)을 관심의 대상이 되는 펩티드의 상대적인 결합으로 나눔으로써 다시 IC50(nM) 값으로 변환시킬 수 있다. 상기 데이터 컴파일링 방법은 다른 날 테스트된 펩티드를 비교하는 데, 또는 상이한 로트의 정제된 MHC와 비교하는 데 가장 정확하고, 일관된 것으로 입증된 것이다.
HLA-DR 정제를 위해 사용된 항체(LB3.1)는 α 쇄 특이적이기 때문에, β1 분자는 β3(및/또는 β4 및 β5) 분자로부터 분리되지 못한다. DRB1*0101(DR1), DRB1*0802(DR8w2), 및 DRB1*0803(DR8w3)의 경우, 결합 검정법의 β1 특이성은 명백하지만, β3은 발현되지 않는다. DRB1*0301(DR3) 및 DRB3*0101(DR52a), DRB1*0401(DR4w4), DRB1*0404(DR4w14), DRB1*0405(DR4w15), DRB1*1101(DR5), DRB1*1201(DR5w12), DRB1*1302(DR6w19) 및 DRB1*0701(DR7)에 대해서도 또한 입증되었다. DRB1*1501(DR2w2β1), DRB5*0101(DR2w2β2), DRB1*1601(DR2w21β1), DRB5*0201(DR51Dw21), 및 DRB4*0101(DRw53) 검정법에 대한 β 쇄 특이성이 갖는 문제는 섬유아세포 사용으로 면할 수 있다. DRβ 분자 특이성에 관한 검정법의 개발 및 입증은 앞서 기술된 바 있다(예컨대, 문헌 [Southwood et al., J. Immunol. 160:3363-3373, 1998] 참조).
펩티드의 클래스 I MHC에 대한 결합 안정성을 측정하는 데 사용된 프로토콜에 관한 상세한 설명은 공개되어 있다(문헌 [Harndahl et al. J Immunol Methods. 374:5-12, 2011]). 간략하면, 비오티닐화된 MHC-I 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 합성 유전자를 표준 방법을 이용하여 E. 콜라이에서 발현시키고, 봉입체로부터 정제한다. 경쇄(β2m)를 아이오딘(125I)으로 방사성 표지하고, 정제된 MHC-I 중쇄 및 관심의 대상이 되는 펩티드와 18℃에서 조합하여 pMHC-I 복합체 형성을 개시시킨다. 상기 반응은 비오티닐화된 MHC-I 중쇄를 표면에 결합시키고, 방사성 표지된 경쇄를 측정하여 복합체 형성을 모니터링하기 위해 스트렙트아비딘 코팅된 마이크로플레이트에서 수행된다. 더 높은 농도의 비표지화된 경쇄를 첨가하고, 37℃에서 인큐베이션함으로써 해리를 개시시킨다. 안정성은 섬광 계수에 의해 측정된 바와 같이, 복합체 중 절반이 해리되는 데 서용되는 시간인 기간으로서 정의된다.
생 세포/유세포 측정법 기반 검정법, 예컨대, TAP 결핍 하이브리도마 세포주 T2(아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)(ATCC 수탁 번호 CRL-1992), 미국 버지니아주 마나사스 소재)를 사용하는 검정법 또한 사용될 수 있다. 상기 세포주에서의 TAP 결핍은 ER에서 MHCI의 비효율적인 로딩 및 과도한 빈 MHCI을 유도한다 (문헌 [Salter and Cresswell, EMBO J. 5:943-49 (1986)]; [Salter, Immunogenetics 21:235-46 (1985)]). 빈 MHCI은 고도로 불안정적이고, 수명이 짧다. T2 세포를 감온하에 배양하였을 때, 세포 표면상에서 빈 MHCI이 일시적으로 출현하였고, 이는 MHCI-결합 펩티드의 외인성 첨가에 의해 안정화될 수 있다. 상기 결합 검정법을 수행하기 위하여, 무혈청 AIM-V 배지 단독, 또는 농도가 증가하는 (0.1 내지 100 μM) 펩티드를 함유하는 배지 중에서 분취량의 107 T2 세포를 26℃에서 밤새도록 배양함으로써 펩티드 감수성 MHCI을 유도하였다. 이어서, 세포를 PBS로 세척한 후, 이어서, 형광성 태그부착된 HLA-A0201 특이적 단일클론 항체, BB7.2와 함께 인큐베이션하여 세포 표면 발현을 정량화하였다. FACS 캘리부르(FACS Calibur) 장치(Becton Dickinson)에서 샘플을 획득하고, 첨부된 셀퀘스트(Cellquest) 소프트웨어를 이용하여 평균 형관 강도(MFI: mean fluorescence intensity)를 측정하였다.
실시예 3: HLA 클래스 I 결합 친화성
HLA 결합 검정법을 사용하여 주어진 에피토프와 선별된 HLA 분자 사이의 상호작용의 친화성 또는 안정성을 평가하였다. 이들 측정값은 각각 예컨대, CD8+ T 세포 반응을 유도할 수 있는 에피토프의 능력을 나타내었다.
표 1로부터의 펩티드의 서브세트(n=562)를 합성하고, 그의 주어진 HLA 클래스 I 분자에 대한 그의 친화도를 기술된 바와 같이 측정하였다. 값은 표 3에 제시되어 있다. 도 1에서 측정값은 친화도 예측치에 대해 플롯팅되어 있다. 이들 데이터는 예측과 측정 사이에 강력한 상관관계가 존재한다는 것을 나타내고(점선은 최적합을 나타내고, R2 = 0.45), 이는 예측값을 입증한다. 그러나, 이상치는 상기 측정값의 중요성을 입증한다. 굵은 수직선 및 수평선은 각각 500 nM에서의 친화도 예측치, 및 친화도 관측치를 나타낸다. HLA 클래스 I에 대한 "약한 결합제"인 에피토프인 경우, 500 nM은 보편적으로 필드에서 최대 친화도인 것으로 허용된다. 그러므로, 우측 하단 사분면에 있는 점(예측치는 500 nM 초과, 관측치는 500 nM 미만)은 매우 약한 결합제인 것으로 간주되었지만, 허용되는 범위 내에서 결합한 것으로 관찰된 에피토프이다. 상기 사분면에 존재하는 에피토프(n=75)은 예측치에 의해(우측 하단 및 우측 상단 사분면의 조합에 의해, n=246) 결합제로 간주되지 못한 에피토프 중 30.5%를 차지한다.
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실시예 3: HLA 클래스 I 결합 안정성
친화도 측정을 위해 사용된 펩티드의 서브세트를 또한 기술된 검정법을 사용하여 안정성을 측정하는 데에도 사용하였다(n=275). 이들 데이터는 표 3에 제시되어 있다. 도 2에 4개의 빈에 따라 데이터가 플롯팅되어 있고, 사분위수 사이의 간격이 오버레이되어 있다. 50 nM 미만이 필드에 의해 강력한 결합제인 것으로 간주되었고, 50-150 nM은 중간 결합제인 것으로 간주되었고, 150-500 nM은 약한 결합제인 것으로 간주되었고, 500 nM 초과인 것은 매우 약한 결합제인 것으로 간주되었다. 상기 비닝된 안정성 간격 간의 안정성 중앙값의 감소에 의해 안정성 관측치와 친화도 관측치 사이의 연관성이 명백하게 입증되었다. 그러나, 빈 사이에 상당한 중복이 일어나고, 중요하게는, 매우 약한 결합제를 비롯하여, 안정성 관측치가 다중 시간 범위인 에피토프가 모든 빈에 존재한다.
실시예 4: 면역원성 검정법
면역원성 검정법을 사용하여 T 세포를 확장시킬 수 있는 각 테스트 펩티드의 능력을 테스트한다. 본 검정법을 위해 성숙한 전문 APC를 하기 방식으로 제조한다. 비드 기반 키트(Miltenyi)를 사용하여 건강한 인간 기증자의 PBMC로부터 단핵구를 농축시킨다. 농축된 세포를 GM-CSF 및 IL-4에 플레이팅하여 미성숙 DC를 유도한다. 5일 후, 사이토카인 성숙화 칵테일(GM-CSF, IL-1β, IL-4, IL-6, TNFα, PGE1β)을 첨가하기 1시간 전에 미성숙 DC를 37℃에서 1시간 동안 각 펩티드와 함께 인큐베이션한다. 세포를 37℃에서 인큐베이션켜 DC를 성숙화시킨다.
DC 성숙화 후, PBMC(벌크 또는 T 세포에 대하여 농축된 것)를 증식 사이토카인과 함께 성숙한 수지상 세포에 첨가한다. 기능성 검정법 및/또는 사량체 염색의 조합을 사용하여 펩티드 특이적 T 세포에 대하여 배양물을 모니터링한다. 변형된 펩티드 및 모체 펩티드를 이용한 동시 면역원성 검정법을 통해 펩티드가 펩티드 특이적 T 세포를 확장시킨 상대적 효율을 비교할 수 있었다.
사량체 염색. MHC 사량체를 구입하거나, 또는 현장에서 제조하고, 이를 사용하여 면역원성 검정법에서 펩티드 특이적 T 세포 확장을 측정한다. 사정을 위해, 사량체를 제조사의 설명서에 따라 1% FCS 및 0.1% 소듐 아지드를 함유하는 PBS(FACS 완충제) 중 1x105개의 세포에 첨가한다. 세포를 암실에서 실온에서 20분 동안 인큐베이션한다. 이어서, T 세포 마커, 예컨대, CD8에 특이적인 항체를 제조사가 제안한 최종 농도로 첨가하고, 세포를 암실에서 4℃에서 20분 동안 인큐베이션한다. 세포를 냉 FACS 완충제로 세척하고, 1% 포름알데히드를 함유하는 완충제 중에 재현탁시킨다. FACS 캘리부르(Becton Dickinson) 장치에서 세포를 획득하고, 셀퀘스트 소프트웨어(Becton Dickinson)를 이용하여 분석한다. 사량체 양성 세포 분석을 위해, 전방 및 측방 산점도로부터 림프구 게이트를 취한다. 데이터는 CD8+/사량체+인 세포의 백분율(%)로서 기록한다.
세포내 사이토카인 염색. 항원 특이적 T 세포 집단을 확인하는 잘 확립된 사량체 염색 부재하에서, 항원 특이성은 잘 확립된 유세포 측정 검정법을 사용하여 사이토카인 생산을 사정함으로써 추정될 수 있다. 간략하면, T 세포를 관심의 대상이 되는 펩티드로 자극하고, 대조군과 비교한다. 자극 후, 세포내 염색에 의해 CD4+ T 세포에 의한 사이토카인(예컨대, IFNγ 및 TNFα) 생산을 사정한다. 상기 사이토카인, 특히, IFNγ는 자극을 받은 세포를 확인하는 데 사용된다.
ELISPOT. 단일 세포 기준으로 T 세포로부터의 IFN감마 방출을 측정하는 것인 ELISPOT 검정법(BD Biosciences)을 사용하여 펩티드 특이적 T 세포를 기능적으로 열거한다. 표적 세포(T2 또는 HLA-A0201 형질감염된 C1R)를 37℃에서 1시간 동안 10 uM 펩티드로 펄싱하고, 3회에 걸쳐 세척하였다. 1x105개의 펩티드 펄싱된 표적을, 면역원성 배양물로부터 채취된, 다양한 농도의 T 세포(5x102 내지 2x103)와 함께 ELISPOT 플레이트 웰 중에서 공동 배양한다. 제조사의 프로토콜에 따라 플레이트를 현상하고, 첨부된 소프트웨어를 사용하여 ELISPOT 판독기(Cellular Technology Ltd.) 상에서 분석한다. IFN감마 생산 T 세포의 개수에 상응하는 스폿을 플레이팅된 T 세포 개수당 스폿의 절대 개수로서 기록한다. 변형된 펩티드 상에서 확장된 T 세포를 변형된 펩티드로 펄싱된 표적을 인식할 수 있는 그의 능력 뿐만 아니라, 모체 펩티드로 펄싱된 표적을 인식할 수 있는 그의 능력에 대해서도 테스트한다.
CD107 염색. CD107a 및 b는 동족 펩티드에 의한 활성화 후, CD8+ T 세포의 세포 표면 상에서 발현된다. T 세포의 용해 과립은, 분자 CD107a 및 b를 포함하는 리소좀 결합 막 당단백질("LAMP": lysosomal-associated membrane glycoprotein)을 함유하는 지질 이중층을 가진다. 세포독성 T 세포가 T 세포 수용체를 통해 활성화되었을 때, 상기 용해 과립의 막은 이동하여 T 세포의 원형질막과 융합된다. 과립 내용물이 방출되고, 이는 표적 세포을 사멸에 이르게 한다. 과립 막이 원형질막과 융합됨에 따라, CD107a 및 b가 세포 표면 상에 노출되고, 이에 CD107a 및 b는 탈과립화의 마커가 된다. CD107a 및 b 염색에 의해 측정된 바, 탈과립화는 단일 세포 기준으로 기록되었기 때문에, 본 검정법을 사용하여 펩티드 특이적 T 세포를 기능적으로 열거한다. 본 검정법을 수행하기 위해, 펩티드를 20 μM 최종 농도로 HLA-A0201 형질감염된 세포 C1R에 첨가하고, 세포를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 3회에 걸쳐 세척하였다. 1x105개의 펩티드 펄싱된 C1R 세포를 튜브 내로 분취하고, CD107a 및 b에 특이적인 항체를 제조사(Becton Dickinson)가 제안한 최종 농도로 첨가한다. CD107 분자는 검정 과정 동안 표면 상에 일시적으로 출현하기 때문에, CD107 분자를 "포획"하기 위해 T 세포 첨가 전에 항체를 첨가한다. 이어서, 면역원성 배양물로부터의 1x105개의 T 세포를 첨가하고, 샘플을 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. T 세포를 추가의 세포 표면 분자, 예컨대, CD8에 대하여 추가로 염색하고, FACS 캘리부르 장치(Becton Dickinson)에서 세포를 획득한다. 첨부된 셀퀘스트 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석하고, 결과는 CD8+ CD107a 및 b+ 세포의 백분율(%)로서 기록하였다.
세포독성 검정법. 크롬 방출 검정법을 사용하여 세포독성 활성을 측정한다. 표적 T2 세포를 37℃에서 1시간 동안 Na51Cr로 표지화하고, 세척한 후, 5x103개의 표적 T2 세포를 면역원성 배양물로부터의 다양한 개수의 T 세포에 첨가하였다. 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션한 후 수거된 상청액 중 크롬 방출을 측정한다.
특이적 용해의 백분율(%)은 하기와 같이 계산된다:
실험적 방출 - 자발적 방출/총 방출 - 자발적 방출 x 100.
면역원성 검정법을 수행하여 각 펩티드가 항원 특이적 확장에 의한 T 세포 반응을 유도할 수 있는지 여부를 사정하였다. 비록 현행 방법이 불완전하고, 따라서, 음성 결과가 펩티드는 반응을 유도할 수 없다는 것을 암시하지는 못하지만, 양성 결과는 펩티드가 T 세포 반응을 유도할 수 있다는 것을 입증한다. 기술된 바와 같이 다량체 판독값을 이용하여 표 3으로부터의 수개의 펩티드를 CD8+ T 세포 반응를 유도할 수 있는 그의 능력에 대해 테스트하였다. 제2 다량체 제제를 이용하여 각 양성 결과를 측정함으로써 임의 제제 편향을 방지하였다. 양성 다량체 염색의 여러 예가 도 3-6에 제시되어 있고, 여기서, 다량체 음선 세포(좌측) 및 항원 특이적(다량체 이중 양성) 세포(우측)도 제시되어 있다.
HLA-A02:01+ T 세포를 10일 동안 TMPRSS2::ERG 융합 네오에피토프(ALNSEALSV; HLA-A02:01)가 로딩된 단핵구 유래 수지상 세포와 함께 공동 배양하였다. 다량체(초기: BV421 및 PE; 확인: APC 및 BUV396)를 사용하여 TMPRSS2::ERG 융합 네오에피토프에 대한 항원 특이성에 관하여 CD8+ T 세포를 분석하였다(도 3).
HLA-A02:01+ T 세포를 10일 동안 GATA3 프레임시프트 네오에피토프(SMLTGPPARV; HLA-A02:01)가 로딩된 단핵구 유래 수지상 세포와 함께 공동 배양하였다. 다량체(초기: APC 및 BUV396; 확인: PE 및 BV421)를 사용하여 GATA3 프레임시프트 네오에피토프에 대한 항원 특이성에 관하여 CD8+ T 세포를 분석하였다(도 4).
HLA-A02:01+ T 세포를 10일 동안 β2M 프레임시프트 네오에피토프(LLCVWVSSI; HLA-A02:01)가 로딩된 단핵구 유래 수지상 세포와 함께 공동 배양하였다. 다량체(초기: PE 및 APC; 확인: PE 및 BV421)를 사용하여 β2M 프레임시프트 네오에피토프에 대한 항원 특이성에 관하여 CD8+ T 세포를 분석하였다(도 5).
HLA-A02:01+ T 세포를 10일 동안 KRAS G12C 네오에피토프(KLVVVGACGV; HLA-A02:01)가 로딩된 단핵구 유래 수지상 세포와 함께 공동 배양하였다. 다량체(초기: BUV396 및 BV421; 확인: APC 및 BUV396)를 사용하여 KRAS G12C 프레임시프트 네오에피토프에 대한 항원 특이성에 관하여 CD8+ T 세포를 분석하였다(도 6).
잘 확립된 HLA 클래스 I 다량체 기술을 이용하여 항원 특이적 CD8+ T 세포 반응을 쉽게 사정할 수 있는 반면, HLA 클래스 II 다량체 기술이 잘 확립되어 있지 않기 때문에, CD4+ T 세포 반응은 평가를 위해 별개의 검정법을 필요로 한다. CD4+ T 세포 반응을 사정하기 위하여, T 세포를 관심의 대상이 되는 펩티드로 재자극하고, 대조군과 비교하였다. 완전하게 신규인 서열(예컨대, 프레임시프트 또는 융합으로부터 생성된 것)인 경우, 대조군은 펩티드가 아니었다. 점 돌연변이인 경우, 대조군은 WT 펩티드였다. 자극 후, 세포내 염색에 의해 CD4+ T 세포에 의한 사이토카인(예컨대, IFNγ 및 TNFα) 생산을 사정하였다. 상기 사이토카인, 특히, IFNγ는 자극을 받은 세포를 확인하는 데 사용되었다. 항원 특이적 CD4+ T 세포 반응은 대조군과 비교하여 사이토카인 생산이 증가된 것으로 나타났다. 네오펩티드에 대하여 생성된 항원 특이적 CD4+ T 세포 반응의 예가 도 7-9에 제시되어 있다.
T 세포를 20일 동안 β2M 프레임시프트 네오펩티드가 로딩된 단핵구 유래 수지상 세포와 함께 공동 배양하였다(20일째 신선한 단핵구 유래 수지상 세포로 재자극). 24시간 동안 β2M 프레임시프트 펩티드가 로딩된 단핵구 유래 수지상 세포로 재자극한 후, 펩티드가 없는 대조군과 비교하여 세포내 사이토카인 염색에 의해 항원 특이성에 관하여 CD4+ T 세포를 분석하였다(도 7).
나이브 T 세포를 20일 동안 BTK C481S 네오펩티드가 로딩된 단핵구 유래 수지상 세포와 함께 공동 배양하였다(20일째 신선한 단핵구 유래 수지상 세포로 재자극). 24시간 동안 BTK C481S 펩티드가 로딩된 단핵구 유래 수지상 세포로 재자극한 후, 대조군 야생형 BTK 펩티드와 비교하여 세포내 사이토카인 염색에 의해 항원 특이성에 관하여 CD4+ T 세포를 분석하였다(도 8).
나이브 T 세포를 20일 동안 GATA3 프레임시프트 네오펩티드가 로딩된 단핵구 유래 수지상 세포와 함께 공동 배양하였다(20일째 신선한 단핵구 유래 수지상 세포로 재자극). 24시간 동안 GATA3 프레임시프트 펩티드가 로딩된 단핵구 유래 수지상 세포로 재자극한 후, 펩티드가 없는 대조군과 비교하여 세포내 사이토카인 염색에 의해 항원 특이성에 관하여 CD4+ T 세포를 분석하였다(도 9).
실시예 5: 종양 특이적 백신에 포함시키기 위한 CTL 및 HTL 에피토프의 선택
본 실시예는 본 발명의 백신 조성물을 위한 펩티드 에피토프 선별 방법을 예시한다. 조성물 중 펩티드는 펩티드(들)를 코딩하는 단일 또는 하나 이상의 서열(즉, 미니유전자)인 핵산 서열 형태일 수 있거나, 또는 단일 및/또는 폴리에피토프 펩티드일 수 있다.
투여시, 종양 제거와 연관된 것으로 관찰된 면역 반응을 모방하는 에피토프가 선택된다. 예를 들어, 백신은 적어도 하나의 종양 항원 영역으로부터 유래된 1-2개의 에피토프를 포함할 수 있다. 한 영역으로부터의 에피토프는 하나 이상의 추가의 종양 항원 영역으로부터의 에피토프와 함께 조합하여 사용될 수 있다.
예를 들어, 결합 친화도가 HLA 클래스 I 분자에 대해 IC50이 500 nM 이하이거나, 클래스 II에 대해 IC50이 1,000 nM 이하인 에피토프가 선택될 수 있다.
폴리에피토프 조성물, 예컨대, 미니유전자를 생성할 때, 관심의 대상이 되는 에피토프를 포함하는, 전형적으로는 가능한 한 가장 작은 펩티드를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 사용 원리는 내포된 에피토프를 포함하는 펩티드를 선택할 때 사용되는 것과 동일하지 않다면, 유사하다. 그러나, 추가로, 미니유전자로서 제공되어야 하는 핵산 서열 결정시, 그에 의해 코딩된 펩티드 서열을 분석하여 임의의 "접합 에피토프"가 생성되었는지 여부를 측정한다. 접합 에피토프는 예컨대, 모티프 분석에 의해 예측되는 바와 같이, 잠재적인 HLA 결합 에피토프이다. 수혜자는 HLA 분자에 결합할 수 있고, 천연 단백질 서열에는 존재하지 않는 상기 에피토프에 대한 면역 반응을 생성할 수 있기 때문에, 접합 에피토프는 일반적으로 회피되고 있다.
백신 조성물에 포함시키기 위한 펩티드 에피토프는 예를 들어, 표에 열거된 것들로부터 선택된다. 선택된 펩티드로 구성된 백신 조성물은 투여시, 안전하고, 효과가 있고, 종양 성장을 억제하는 면역 반응의 규모와 유사한 면역 반응을 유도한다.
실시예 6: 예방적 또는 치료적 사용을 위한 펩티드 조성물
본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신 조성물은 종양 성장을 억제하는 데 사용된다. 예를 들어, 다중 CTL 및 HTL 에피토프를 함유하는 폴리에피토프 조성물(또는 상기를 포함하는 핵산)을 종양을 앓는 개체에게 투여한다. 면역화를 위한 펩티드 용량은 70 kg 환자의 경우, 약 1 내지 약 50,000 ㎍, 일반적으로 100-5,000 ㎍이다. 초기 투여 후, 4주째에 부스터 투여량에 의해 진행된 후, 이어서, PBMC 샘플 중 에피토프 특이적 CTL 집단의 존재를 측정하는 기술에 의해 환자에서 면역 반응의 규모를 평가할 수 있다. 추가의 부스터 용량은 필요에 따라 투여된다. 조성물은 종양 성장을 억제하는 데 효과가 있고, 안전한 것, 이 둘 모두를 실행하는 것으로 보인다.
대안적으로, 에피토프 조성물은 당업계에 공지되고, 본원에 개시된 방법에 따라 핵산으로서, 예를 들어, RNA로서 투여될 수 있다.
신생항원 결합제, 예컨대, TCR 또는 CAR은 당업계에 공지되고, 본원에 개시된 방법에 따라 투여될 수 있다. 결합제는 세포 요법의 일부로서 결합제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, DNA 또는 RNA로서 투여될수 있다. 대안적으로, 결합제는 세포독성제, 또는 표에 열거된 에피토프를 발현하는 종양 세포로 환자 T 세포를 재지시할 수 있는 T 세포 결합제에 커플링된 특이적인 펩티드:MHC 복합체를 인식할 수 있는 항체 또는 그의 단편으로서 제조될 수 있다.
신생항원 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 결합제, 또는 이들 분자를 발현하는 세포는 당업계에 공지된 다수의 방법을 통해 동일 환자에게 전달될 수 있고, 이는 추가로 다른 암 요법(예컨대, 화학요법, 수술, 방사선, 관문 억제제 등)과 함께 조합될 수 있다.
실시예 7: 수지상 세포를 이용한 조성물의 투여
수지상 세포를 사용하여 본 발명의 에피토프를 포함하는 백신을 투여할 수 있다. 본 실시예에서, 펩티드 펄싱된 또는 핵산 펄싱된 수지상 세포를 환자에게 투여하여 생체내에서 CTL 반응을 자극할 수 있다. 본 방법에서, 수지상 세포를 단리하고, 확장시키고, 본 발명의 펩티드 또는 CTL 및 HTL 에피토프를 코딩하는 DNA 또는 RNA를 포함하는 백신으로 펄싱한다. 수지상 세포를 환자 내로 다시 주입하여 생체내에서 CTL 및 HTL 반응을 유도한다. 이어서, 유도된 CTL 및 HTL은 백신 중의 에피토프의 유래 기점이 되는 단백질을 보유하는 특이적인 표적 종양 세포를 파괴시키거나(CTL), 그의 파괴를 촉진시킨다(HTL).
대안적으로, 특정 종양 연관 항원에 대한 생체외 CTL 또는 HTL 반응은 조직 배양물 중에서 환자의, 또는 유전적으로 화합성을 띠는 CTL 또는 HTL 전구체 세포를 항원 제시 세포, 예컨대, 수지상 세포의 공급원, 및 적절한 면역원성 펩티드 또는 핵산과 함께 인큐베이션함으로써 유도할 수 있다. 전구체 세포가 활성화되고, 이펙터 세포로 확장되는 적절한 인큐베이션 시간 (전형적으로 약 7-28일)이 경과한 후, 세포를 세포 내로 주입하고, 여기서, 세포는 그의 특이적인 표적 세포, 즉, 종양 세포를 파괴시키거나(CTL), 그의 파괴를 촉진시킨다(HTL).
실시예 8: 네오에피토프 확인
아미노산 서열을 변경시키는 독특한 유전적 변이를 함유하는 암 세포는 예컨대, 표에 제시된 것과 같은, 잠재적인 신규의 T 세포 에피토프를 생성할 수 있다. 환자의 종양 어느 것이 표에서 확인된 종양 특이적 네오에피토프를 확인하는 것은 DN돌연변이 확인을 포함할 수 있다. 한 접근법으로서, 잘 확립된 기술을 사용하여 환자로부터의 매칭되는 생식세포주 샘플 기준 대비로 종양의 전체 게놈 또는 전체 엑솜 시퀀싱을 수행할 수 있다. 추가의 접근법으로서, 종양 및 적절하게 매칭되는 정상 샘플의 RNA 시퀀싱 또한 수행할 수 있다. 추가의 접근법으로서, 표적화된 서열, 차세대 시퀀싱 기술, 또는 잘 확립된 생어 시퀀싱에 기반한 특이적 검정법 또한 수행될 수 있다. 추가로, 고도로 특이적인 중합효소 연쇄 반응 기반 검정법이 개발될 수 있다.
실시예 9: CD8 + 또는 CD4 + 세포에 의한 신생항원 펩티드 인식의 특이성
다양한 실시양태에서, 본 교시내용은 백신 유도 CD8+ 세포에 의한 돌연변이화된 서열과 야생형 서열 사이의 구별에 관한 개시내용을 포함한다. 백신 유도 T 세포가 자연적으로 프로세싱된 항원을 인식할 수 있는지 여부를 측정하기 위해, 백신 내로 도입되는 펩티드의 돌연변이화된(MUT) 또는 야생형(WT: wild type) 서열을 코딩하는 다중 미니유전자 구성물을 종양 세포주에 형질도입시켰다. 각각의 미니유전자는 MUT 또는 WT 서열을 코딩하는 21 aa로 구성될 수 있다. 특정 돌연변이를 함유하는 단백질에 대해 특이적인 백신 유도 세포를 MUT 또는 WT 서열 발현 암 세포와 함께 인큐베이션할 수 있고, 인큐베이션 24 h 후에 상청액을 수집할 수 있고, 상청액 중의, 세포에 의해 생산된 IFN-y를 ELISA에 의해 측정할 수 있다.
돌연변이화된 펩티드 및 야생형 펩티드의 신생항원 특이적 세포 인식 또한 표준 4 h 51Cr-방출 검정법에서 측정할 수 있다.
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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 17 Ile His Leu Met Ala Lys Ala Gly Leu Thr Leu Gln Gln Gln His Gln 1 5 10 15 Arg Leu Ala Gln Leu Leu Leu Ile Leu Ser His Ile Arg His Met Ser 20 25 30 Asn Lys Gly Met Glu His Leu Tyr Ser Met Lys Cys Lys Asn Val Val 35 40 45 Pro Leu Asn Asp Leu Leu Leu Glu Met Leu Asp Ala His Arg Leu His 50 55 60 Ala Pro Thr Ser Arg Gly Gly Ala Ser Val Glu Glu Thr Asp Gln Ser 65 70 75 80 His Leu Ala Thr Ala Gly Ser Thr Ser Ser His Ser Leu Gln Lys Tyr 85 90 95 Tyr Ile Thr Gly Glu 100 <210> 18 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 18 Ile His Leu Met Ala Lys Ala Gly Leu Thr Leu Gln Gln Gln His Gln 1 5 10 15 Arg Leu Ala Gln Leu Leu Leu Ile Leu Ser His Ile Arg His Met Ser 20 25 30 Asn Lys Gly Met Glu His Leu Tyr Ser Met Lys Cys Lys Asn Val Val 35 40 45 Pro Leu Ser Asp Leu Leu Leu Glu Met Leu Asp Ala His Arg Leu His 50 55 60 Ala Pro Thr Ser Arg Gly Gly 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 22 Arg Val Glu Glu Phe Lys Leu Lys Gln Met Trp Lys Ser Pro Asn Gly 1 5 10 15 Thr Ile Arg Asn Ile Leu Gly Gly Thr Val Phe Arg Glu Ala Ile Ile 20 25 30 Cys Lys Asn Ile Pro Arg Leu Val Ser Gly Trp Val Lys Pro Ile Ile 35 40 45 Ile Gly His His Ala Tyr Gly Asp Gln Tyr Arg Ala Thr Asp Phe Val 50 55 60 Val Pro Gly Pro Gly Lys Val Glu Ile Thr Tyr Thr Pro Ser Asp Gly 65 70 75 80 Thr Gln Lys Val Thr Tyr Leu Val His Asn Phe Glu Glu Gly Gly Gly 85 90 95 Val Ala Met Gly Met 100 <210> 23 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 23 Arg Val Glu Glu Phe Lys Leu Lys Gln Met Trp Lys Ser Pro Asn Gly 1 5 10 15 Thr Ile Arg Asn Ile Leu Gly Gly Thr Val Phe Arg Glu Ala Ile Ile 20 25 30 Cys Lys Asn Ile Pro Arg Leu Val Ser Gly Trp Val Lys Pro Ile Ile 35 40 45 Ile Gly Cys His Ala Tyr Gly Asp Gln Tyr Arg Ala Thr Asp Phe Val 50 55 60 Val Pro Gly Pro Gly Lys Val 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 27 Ile Ser Glu Leu Gly Ala Gly Asn Gly Gly Val Val Phe Lys Val Ser 1 5 10 15 His Lys Pro Ser Gly Leu Val Met Ala Arg Lys Leu Ile His Leu Glu 20 25 30 Ile Lys Pro Ala Ile Arg Asn Gln Ile Ile Arg Glu Leu Gln Val Leu 35 40 45 His Glu Ser Asn Ser Pro Tyr Ile Val Gly Phe Tyr Gly Ala Phe Tyr 50 55 60 Ser Asp Gly Glu Ile Ser Ile Cys Met Glu His Met Asp Gly Gly Ser 65 70 75 80 Leu Asp Gln Val Leu Lys Lys Ala Gly Arg Ile Pro Glu Gln Ile Leu 85 90 95 Gly Lys Val Ser Ile 100 <210> 28 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 28 Leu Gly Ala Gly Asn Gly Gly Val Val Phe Lys Val Ser His Lys Pro 1 5 10 15 Ser Gly Leu Val Met Ala Arg Lys Leu Ile His Leu Glu Ile Lys Pro 20 25 30 Ala Ile Arg Asn Gln Ile Ile Arg Glu Leu Gln Val Leu His Glu Cys 35 40 45 Asn Ser Leu Tyr Ile Val Gly Phe Tyr Gly Ala Phe Tyr Ser Asp Gly 50 55 60 Glu Ile Ser Ile Cys Met Glu 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polypeptide <400> 32 Val Ala Val Lys Met Leu Lys Pro Thr Ala Arg Ser Ser Glu Lys Gln 1 5 10 15 Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Thr His Leu Gly Pro His Leu 20 25 30 Asn Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Ser Gly Pro Ile Tyr 35 40 45 Ile Ile Ile Glu Tyr Cys Phe Tyr Gly Asp Leu Val Asn Tyr Leu His 50 55 60 Lys Asn Arg Asp Ser Phe Leu Ser His His Pro Glu Lys Pro Lys Lys 65 70 75 80 Glu Leu Asp Ile Phe Gly Leu Asn Pro Ala Asp Glu Ser Thr Arg Ser 85 90 95 Tyr Val Ile Leu Ser 100 <210> 33 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 33 Ile Glu Glu His Ala Asn Trp Ser Val Ser Arg Glu Ala Gly Phe Ser 1 5 10 15 Tyr Ser His Ala Gly Leu Ser Asn Arg Leu Ala Arg Asp Asn Glu Leu 20 25 30 Arg Glu Asn Asp Lys Glu Gln Leu Lys Ala Ile Ser Thr Arg Asp Pro 35 40 45 Leu Ser Lys Ile Thr Glu Gln Glu Lys Asp Phe Leu Trp Ser His Arg 50 55 60 His Tyr Cys Val Thr Ile Pro Glu Ile Leu Pro Lys Leu Leu Leu Ser 65 70 75 80 Val Lys 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Synthetic peptide <400> 66 Gln Lys Met Ile Leu Thr Lys Gln Ile Lys Thr Lys Pro Thr Asp Thr 1 5 10 15 Phe Leu Gln Ile Leu Arg 20 <210> 67 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 67 Gly Phe Trp Ile Gln Ser Ile Lys Thr Ile Thr Arg Tyr Thr Ile Phe 1 5 10 15 Val Leu Lys Asp Ile Met Thr Pro Pro Asn Leu Ile Ala Glu Leu His 20 25 30 Asn Ile Leu Leu Lys Thr Ile Thr His His Ser 35 40 <210> 68 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 68 Asn Tyr Ser Asn Val Gln Trp Arg Asn Leu Gln Ser Ser Val Cys Gly 1 5 10 15 Leu Pro Ala Lys Gly Glu Asp Ile Phe Leu Gln Phe Arg Thr His Thr 20 25 30 Thr Gly Arg Gln Val His Val Leu 35 40 <210> 69 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 69 Tyr Gln Ser Arg Val Leu Pro Gln Thr Glu Gln Asp Ala Lys Lys Gly 1 5 10 15 Gln Asn Val Ser 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 88 Val Leu Val Leu Ser Cys Asp Leu Ile Thr Asp Val Ala Leu His Glu 1 5 10 15 Val Val Asp Leu Phe Arg Ala Tyr Asp Ala Ser Leu Ala Met Leu Met 20 25 30 Arg Lys Gly Gln Asp Ser Ile Glu Pro Val Pro Gly Gln Lys Gly Lys 35 40 45 Lys Lys Gln Trp Ser Ser Val Thr Ser Leu Glu Trp Thr Ala Gln Glu 50 55 60 Arg Gly Cys Ser Ser Trp Leu Met Lys Gln Thr Trp Met Lys Ser Trp 65 70 75 80 Ser Leu Arg Asp Pro Ser Tyr Arg Ser Ile Leu Glu Tyr Val Ser Thr 85 90 95 Arg Val Leu Trp Met Pro Thr Ser Thr Val 100 105 <210> 89 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 89 Ser Ile Gln Val Met Arg Ala Gln Met Asn Gln Ile Gln Ser Val Glu 1 5 10 15 Gly Gln Pro Leu Ala Arg Arg Pro Arg Ala Thr Gly Arg Thr Lys Arg 20 25 30 Cys Gln Pro Arg Asp Val Thr Lys Lys Thr Cys Asn Ser Asn Asp Gly 35 40 45 Lys Lys Arg Glu Trp Glu Lys Arg Lys Gln Ile Leu Gly Gly 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polypeptide <400> 94 Val Asn Thr Leu Lys Glu Gly Lys Arg Leu Pro Cys Pro Pro Asn Cys 1 5 10 15 Pro Asp Glu Val Tyr Gln Leu Met Arg Lys Cys Trp Glu Phe Gln Pro 20 25 30 Ser Asn Arg Thr Ser Phe Gln Asn Leu Ile Glu Gly Phe Glu Ala Leu 35 40 45 Leu Lys Thr Ser Asn 50 <210> 95 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 95 Cys Arg Pro Val Thr Pro Ser Cys Lys Glu Leu Ala Asp Leu Met Thr 1 5 10 15 Arg Cys Met Asn Tyr Asp Pro Asn Gln Arg Pro Phe Phe Arg Ala Ile 20 25 30 Met Arg Asp Ile Asn Lys Leu Glu Glu Gln Asn Pro Asp Ile Val Ser 35 40 45 Glu Lys Asn Gln Gln Leu Lys Trp Thr Pro His Ile Leu Lys Ser Ala 50 55 60 Ser 65 <210> 96 <211> 69 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 96 Asp Asp His Asp Val Leu Ser Phe Leu Thr Phe Gln Leu Thr Glu Pro 1 5 10 15 Gly Lys Glu Pro Pro Thr Pro Asp Lys Glu Ile Ser Glu Lys Glu Lys 20 25 30 Glu Lys Tyr Gln Glu Glu 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 101 Ser Leu Pro Pro Pro Lys Leu Thr Asp Pro Arg Leu Leu Tyr Ile Gly 1 5 10 15 Phe Leu Gly Tyr Cys Ser Gly Leu Ile Asp Asn Leu Ile Arg Arg Arg 20 25 30 Pro Ile Ala Thr Ala Gly Leu His Arg Gln Leu Leu Tyr Ile Thr Ala 35 40 45 Phe Phe Leu Leu Asp Ile Ile Leu 50 55 <210> 102 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 102 Asn Gln Ser Gly Gly Ala Gly Glu Asp Cys Gln Ile Phe Ser Thr Pro 1 5 10 15 Gly His Pro Lys Met Ile Tyr Ser Ser Ser Asn Leu Lys Thr Pro Ser 20 25 30 Lys Leu Cys Ser Gly Ser Lys Ser His Asp Val Gln Glu Val Leu Lys 35 40 45 Lys Lys Thr Gly Ser Asn Glu Val Thr Thr Arg Tyr Glu Glu Lys Lys 50 55 60 Thr Gly Ser Val Arg Lys Ala Asn Arg Met Pro Lys Asp Val Asn Ile 65 70 75 80 Gln Val Arg Lys Lys Gln Lys His Glu Thr Arg Arg Lys Ser Lys Tyr 85 90 95 Asn Glu Asp Phe Glu Arg Ala Trp Arg Glu Asp Leu Thr Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 103 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 103 Met Ala Pro Val Lys Lys Leu Val Val Lys Gly Gly Lys Lys Lys Glu 1 5 10 15 Ala Ser Ser Glu Val His Ser 20 <210> 104 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 104 Met Ala Pro Val Lys Lys Leu Val Val Lys Gly Gly Lys Lys Arg Ser 1 5 10 15 Lys Phe <210> 105 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 105 Met Pro Ser His Gln Gly Ala Glu Gln Gln Gln Gln Gln His His Val 1 5 10 15 Phe Ile Ser Gln Val Val Thr Glu Lys Glu Phe Leu Ser Arg Ser Asp 20 25 30 Gln Leu Gln Gln Ala Val Gln Ser Gln Gly Phe Ile Asn Tyr Cys Gln 35 40 45 Lys Lys Asn 50 <210> 106 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 106 Met Pro Ser His Gln Gly Ala Glu 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 121 Ile Ser Asn Ser Trp Asp Ala His Leu Gly Leu Gly Ala Cys Gly Glu 1 5 10 15 Ala Glu Gly Leu Gly Val Gln Gly Ala Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 20 25 30 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Ala Gly Val Pro Ala Cys Pro Pro Lys 35 40 45 Gly Pro Glu Leu Phe Pro Leu Ile Phe Pro Ala Glu Pro Ala Gln Ala 50 55 60 Ser Gly Pro Tyr Val Glu Ile Ile Glu Gln Pro Lys Gln Arg Gly Met 65 70 75 80 Arg Phe Arg Tyr Lys Cys Glu Gly Arg Ser Ala Gly Ser Ile Pro Gly 85 90 95 Glu Arg Ser Thr Asp 100 <210> 122 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 122 Leu Gln Arg Leu Asp Gly Met Gly Cys Leu Glu Phe Asp Glu Glu Arg 1 5 10 15 Ala Gln Gln Glu Asp Ala Leu Ala Gln Gln Ala Phe Glu Glu Ala Arg 20 25 30 Arg Arg Thr Arg Glu Phe Glu Asp Arg Asp Arg Ser His Arg Glu Glu 35 40 45 Met Glu Val His Glu Leu Glu Lys Ser Lys Arg Ala Leu Glu Thr Gln 50 55 60 Met Glu Glu Met Lys Thr 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Synthetic peptide <400> 158 Leu Glu Arg Cys Pro His Arg Pro Ile 1 5 <210> 159 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 159 Cys Pro His Arg Pro Ile Leu Gln Ala 1 5 <210> 160 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 160 Leu Glu Arg Cys Pro His Arg Pro Ile Leu 1 5 10 <210> 161 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 161 Ser Ala Ser Asn Ser Cys Phe Ile Arg 1 5 <210> 162 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 162 Leu Ser Ala Ser Asn Ser Cys Phe Ile 1 5 <210> 163 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 163 Ala Leu Ser Ala Ser Asn Ser Cys Phe 1 5 <210> 164 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 164 Phe Gln Asn Gly Lys Met Ala Leu Ser Ala 1 5 10 <210> 165 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 165 Pro Ile Ile Ile Gly His His Ala Tyr 1 5 <210> 166 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 166 Gly His His Ala Tyr Gly Asp Gln Tyr 1 5 <210> 167 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 167 Lys Pro Ile Ile Ile Gly His His Ala Tyr 1 5 10 <210> 168 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 168 Ile Gly His His Ala Tyr Gly Asp Gln Tyr 1 5 10 <210> 169 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 169 Pro Ile Ile Ile Gly Cys His Ala Tyr 1 5 <210> 170 <211> 9 <212> 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peptide <400> 181 Ser Lys Ile Thr Glu Gln Glu Lys Asp Phe 1 5 10 <210> 182 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 182 Ser Glu Ile Thr Lys Gln Glu Lys Asp Phe 1 5 10 <210> 183 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 183 Lys Gln Glu Lys Asp Phe Leu Trp Ser His 1 5 10 <210> 184 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 184 Phe Met Lys Gln Met Asn Asp Ala Arg 1 5 <210> 185 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 185 Lys Gln Met Asn Asp Ala Arg His Gly 1 5 <210> 186 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 186 Arg His Gly Gly Trp Thr Thr Lys Met 1 5 <210> 187 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 187 Tyr Phe Met Lys Gln Met Asn Asp Ala Arg 1 5 10 <210> 188 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 188 Phe Met Lys Gln Met Asn Asp Ala Arg His 1 5 10 <210> 189 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 189 Lys Gln Met Asn Asp Ala Arg His Gly Gly 1 5 10 <210> 190 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 190 Gln Met Asn Asp Ala Arg His Gly Gly Trp 1 5 10 <210> 191 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 191 Ala Arg His Gly Gly Trp Thr Thr Lys Met 1 5 10 <210> 192 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 192 Thr Thr Lys Leu Pro Leu Lys Phe Arg 1 5 <210> 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Sequence: Synthetic peptide <400> 204 Tyr Thr Thr Asn Ala Phe Ser Gly Glu Tyr 1 5 10 <210> 205 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 205 Thr Thr Asn Ala Phe Ser Gly Glu Tyr Ile 1 5 10 <210> 206 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 206 Phe Ser Gly Glu Tyr Ile Pro Thr Val Phe 1 5 10 <210> 207 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 207 Ser Ser Cys Met Gly Ser Met Asn Arg 1 5 <210> 208 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 208 Gly Ser Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu 1 5 <210> 209 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 209 Met Gly Ser Met Asn Arg Arg Pro Ile 1 5 <210> 210 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 313 His Pro Lys Val His Leu Asn Thr Met Phe 1 5 10 <210> 314 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 314 Lys Ala Val Glu Phe Leu Gln Glu Arg 1 5 <210> 315 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 315 Lys Val His Leu Asn Thr Met Phe Arg 1 5 <210> 316 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 316 Lys Val His Leu Asn Thr Met Phe Arg Arg 1 5 10 <210> 317 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 317 Lys Val Val Leu Arg His Pro Lys Val 1 5 <210> 318 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 318 Leu Leu Ser Val His Leu Ile Val Leu 1 5 <210> 319 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial 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Synthetic peptide <400> 840 Cys His Leu Ser Met Leu Thr Asp Ser Leu 1 5 10 <210> 841 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 841 Glu Met Gln Gly His Thr Met Gly Phe 1 5 <210> 842 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 842 Phe Leu Pro Ile Ser His Cys Gln Cys 1 5 <210> 843 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 843 Phe Leu Pro Ile Ser His Cys Gln Cys Ile 1 5 10 <210> 844 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 844 Phe Arg Asp Ala Gly His Thr Met Gly Phe 1 5 10 <210> 845 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 845 Phe Trp Leu Thr Lys Leu Asn Tyr Leu 1 5 <210> 846 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 863 Leu Thr Asp Ser Leu Phe Leu Pro Ile 1 5 <210> 864 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 864 Leu Thr Lys Leu Asn Tyr Leu Cys His Leu 1 5 10 <210> 865 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 865 Met Gly Phe Trp Leu Thr Lys Leu Asn Tyr 1 5 10 <210> 866 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 866 Met Leu Thr Asp Ser Leu Phe Leu Pro Ile 1 5 10 <210> 867 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 867 Met Gln Gly His Thr Met Gly Phe Trp 1 5 <210> 868 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 868 Met Gln Gly His Thr Met Gly Phe Trp Leu 1 5 10 <210> 869 <211> 9 <212> PRT 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Gly 1 5 <210> 875 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 875 Ser Glu Met Gln Gly His Thr Met Gly Phe 1 5 10 <210> 876 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 876 Ser Leu Phe Leu Pro Ile Ser His Cys 1 5 <210> 877 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 877 Ser Met Leu Thr Asp Ser Leu Phe Leu 1 5 <210> 878 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 878 Ser Ser Glu Met Gln Gly His Thr Met 1 5 <210> 879 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 879 Thr Lys Leu Asn Tyr Leu Cys His Leu 1 5 <210> 880 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 880 Thr Leu Lys Glu Arg Cys Leu Gln Leu 1 5 <210> 881 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 881 Thr Met Gly Phe Trp Leu Thr Lys Leu 1 5 <210> 882 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 882 Trp Leu Phe Arg Asp Ala Gly His Thr 1 5 <210> 883 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 883 Trp Leu Phe Arg Asp Ala Gly His Thr Met 1 5 10 <210> 884 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 884 Tyr Leu Cys His Leu Ser Met Leu Thr 1 5 <210> 885 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 885 Tyr Arg Gly His Leu Gly Ser Ser Glu Met 1 5 10 <210> 886 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 886 Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu 1 5 10 <210> 887 <211> 21 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 887 Asp Ile Glu Lys Lys Ile Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe 1 5 10 15 Asn Val Val Asn Ser 20 <210> 888 <211> 16 <212> PRT <213> Streptococcus sp. <400> 888 Gly Ala Val Asp Ser Ile Leu Gly Gly Val Ala Thr Tyr Gly Ala Ala 1 5 10 15 <210> 889 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> D-alanine or L-alanine <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Cyclohexylalanine, phenylalanine, or tyrosine <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> D-alanine or L-alanine <400> 889 Ala Lys Xaa Val Trp Ala Asn Thr Leu Lys Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 890 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 890 Val Ala Val Lys Met Leu Lys Pro Ser Ala His Leu Thr Glu 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898 Gln Tyr Gly Lys Val Tyr Glu Gly Val 1 5 <210> 899 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 899 Gln Tyr Gly Lys Val Tyr Glu Gly Val Trp 1 5 10 <210> 900 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 900 Gly Gln Tyr Gly Val Val Tyr Glu Gly 1 5 <210> 901 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 901 Gly Gln Tyr Gly Val Val Tyr Glu Gly Val 1 5 10 <210> 902 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 902 Lys Leu Gly Gly Gly Gln Tyr Gly Val 1 5 <210> 903 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 903 Lys Leu Gly Gly Gly Gln Tyr Gly Val Val 1 5 10 <210> 904 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 904 Gln Tyr Gly Val Val Tyr Glu Gly Val 1 5 <210> 905 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 905 Gln Tyr Gly Val Val Tyr Glu Gly Val Trp 1 5 10 <210> 906 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 906 Val Val Tyr Glu Gly Val Trp Lys Lys 1 5 <210> 907 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 907 Val Val Tyr Glu Gly Val Trp Lys Lys Tyr 1 5 10 <210> 908 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 908 Ala Thr Gln Ile Ser Ser Ala Thr Glu Tyr 1 5 10 <210> 909 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 909 Ile Ser Ser Ala Thr Glu Tyr Leu Glu Lys 1 5 10 <210> 910 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 910 Ser Ser Ala Thr Glu Tyr Leu Glu Lys 1 5 <210> 911 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 911 Thr Gln Ile Ser Ser Ala Thr Glu Tyr Leu 1 5 10 <210> 912 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 912 Tyr Met Ala Thr Gln Ile Ser Ser Ala Thr 1 5 10 <210> 913 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 913 Phe Tyr Ile Ile Ile Glu Phe Met Thr Tyr 1 5 10 <210> 914 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 914 Ile Ile Glu Phe Met Thr Tyr Gly Asn Leu 1 5 10 <210> 915 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 915 Ile Ile Ile Glu Phe Met Thr Tyr Gly 1 5 <210> 916 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 916 Ile Ile Ile Glu Phe Met Thr Tyr Gly Asn 1 5 10 <210> 917 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 917 Tyr Ile Ile Ile Glu Phe Met Thr Tyr Gly 1 5 10 <210> 918 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 918 Gly Gln His Gly Glu Val Tyr Glu Gly Val 1 5 10 <210> 919 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 919 Lys Leu Gly Gly Gly Gln His Gly Glu Val 1 5 10 <210> 920 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 920 Lys Ile Ala Asp Phe Gly Met Ala Arg 1 5 <210> 921 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 921 Arg Val Ala Lys Ile Ala Asp Phe Gly Met 1 5 10 <210> 922 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 922 Phe Ile Leu Met Glu Leu Met Ala Gly Gly 1 5 10 <210> 923 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 923 Ile Leu Met Glu Leu Met Ala Gly Gly 1 5 <210> 924 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 924 Ile Leu Met Glu Leu Met Ala Gly Gly Asp 1 5 10 <210> 925 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 925 Leu Met Glu Leu Met Ala Gly Gly Asp Leu 1 5 10 <210> 926 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 926 Leu Pro Arg Phe Ile Leu Met Glu Leu 1 5 <210> 927 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 927 Leu Pro Arg Phe Ile Leu Met Glu Leu Met 1 5 10 <210> 928 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 928 Leu Gln Ser Leu Pro Arg Phe Ile Leu Met 1 5 10 <210> 929 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 929 Ser Leu Pro Arg Phe Ile Leu Met Glu Leu 1 5 10 <210> 930 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 930 Leu Ala Thr Glu Lys Ser Arg Trp Ser 1 5 <210> 931 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 931 Leu Ala Thr Glu Lys Ser Arg Trp Ser Gly 1 5 10 <210> 932 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 932 Glu Tyr Met Ala Asn Gly 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Synthetic peptide <400> 961 Gly Val Tyr Thr Phe Leu Pro Ser Thr Leu 1 5 10 <210> 962 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 962 Thr Phe Leu Pro Ser Thr Leu Lys Ser Leu 1 5 10 <210> 963 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 963 Val Tyr Thr Phe Leu Pro Ser Thr Leu 1 5 <210> 964 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 964 Tyr Thr Phe Leu Pro Ser Thr Leu Lys 1 5 <210> 965 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 965 Asn Val Val Pro Leu Cys Asp Leu Leu 1 5 <210> 966 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 966 Asn Val Val Pro Leu Cys Asp Leu Leu Leu 1 5 10 <210> 967 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1007 Val Leu His Glu Cys Asn Ser Leu Tyr Ile 1 5 10 <210> 1008 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1008 Phe Tyr Gln Gln Gln Gln Gln Ser Asp Leu 1 5 10 <210> 1009 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1009 Gln Gln Gln Ser Asp Leu Gln Pro Pro Ala 1 5 10 <210> 1010 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1010 Gln Gln Ser Asp Leu Gln Pro Pro Ala 1 5 <210> 1011 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1011 Tyr Gln Gln Gln Gln Gln Ser Asp Leu 1 5 <210> 1012 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1012 Phe Glu Leu Leu Ser Thr Pro Pro Leu 1 5 <210> 1013 <211> 10 <212> 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1024 Ser Thr Arg Asp Pro Leu Ser Glu Ile Thr Lys 1 5 10 <210> 1025 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1025 Asp Pro Leu Ser Glu Ile Thr Lys 1 5 <210> 1026 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1026 Leu Pro Leu Lys Phe Arg Asp Ala Glu Thr 1 5 10 <210> 1027 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1027 Gln Thr Gly Val Met Ile Cys Ala Tyr Leu 1 5 10 <210> 1028 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1028 Ala Phe Ser Gly Glu Tyr Ile Pro Thr Val 1 5 10 <210> 1029 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1029 Ser Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr 1 5 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1103 Phe Leu Leu Ala Leu Trp Glu Cys Ser Leu 1 5 10 <210> 1104 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1104 Ile Val Ser Arg Thr Leu Leu Leu Val 1 5 <210> 1105 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1105 Leu Ile Val Ser Arg Thr Leu Leu Leu 1 5 <210> 1106 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1106 Leu Ile Val Ser Arg Thr Leu Leu Leu Val 1 5 10 <210> 1107 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1107 Leu Leu Ala Leu Trp Glu Cys Ser Leu 1 5 <210> 1108 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1108 Leu Pro Gln Ala Arg Leu Cys Leu Ile 1 5 <210> 1109 <211> 10 <212> PRT <213> 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1120 Leu Tyr Ile Thr Ala Phe Phe Leu Leu 1 5 <210> 1121 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1121 Leu Tyr Ile Thr Ala Phe Phe Leu Leu Asp 1 5 10 <210> 1122 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1122 Tyr Ile Thr Ala Phe Phe Leu Leu Asp Ile 1 5 10 <210> 1123 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1123 Gly Ser Asn Glu Val Thr Thr Arg Tyr 1 5 <210> 1124 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1124 Met Pro Lys Asp Val Asn Ile Gln Val 1 5 <210> 1125 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1125 Thr Gly Ser Asn Glu Val Thr Thr Arg Tyr 1 5 10 <210> 1126 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1126 Lys Lys Leu Met Leu Leu Arg Leu Asn Leu 1 5 10 <210> 1127 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1127 Lys Leu Met Leu Leu Arg Leu Asn Leu 1 5 <210> 1128 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1128 Lys Leu Met Leu Leu Arg Leu Asn Leu Arg 1 5 10 <210> 1129 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1129 Leu Leu Arg Leu Asn Leu Arg Lys Met 1 5 <210> 1130 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1130 Leu Met Leu Leu Arg Leu Asn Leu 1 5 <210> 1131 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1131 Leu Met Leu Leu Arg 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1137 Tyr Cys Gln Lys Lys Leu Met Leu Leu 1 5 <210> 1138 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1138 Phe Lys Lys Lys Thr Tyr Thr Cys Ala Ile 1 5 10 <210> 1139 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1139 Ile Thr Thr Val Lys Ala Thr Glu Thr Lys 1 5 10 <210> 1140 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1140 Lys Ser Lys Lys Lys Glu Thr Phe Lys 1 5 <210> 1141 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1141 Lys Ser Lys Lys Lys Glu Thr Phe Lys Lys 1 5 10 <210> 1142 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1142 Lys Thr Tyr Thr Cys Ala Ile Thr Thr Val 1 5 10 <210> 1143 <211> 9 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1160 Ala Met Thr Thr Ser Ser Ser Gln Lys 1 5 <210> 1161 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1161 Ala Met Thr Thr Ser Ser Ser Gln Lys Asn 1 5 10 <210> 1162 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1162 Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Ser Leu 1 5 <210> 1163 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1163 Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Ser Leu Val 1 5 10 <210> 1164 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1164 Ile Met Lys Glu Lys Lys Ser Leu 1 5 <210> 1165 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1165 Ile Met Lys Glu Lys Lys Ser Leu 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Sequence: Synthetic peptide <400> 1171 Ser Leu Val Arg Leu Ser Ser Cys Val 1 5 <210> 1172 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1172 Val Pro Val Ala Leu Met Ser Ala Met 1 5 <210> 1173 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1173 Val Arg Leu Ser Ser Cys Val Pro Val Ala 1 5 10 <210> 1174 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1174 Lys Met Arg Lys Lys Tyr Ala Gln Lys 1 5 <210> 1175 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1175 Phe Val Met Ser Asp Thr Thr Tyr Lys 1 5 <210> 1176 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1176 Phe Val Met Ser Asp Thr Thr Tyr Lys Ile 1 5 10 <210> 1177 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1194 Leu Leu Lys Arg Glu Arg Val Asp Leu 1 5 <210> 1195 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1195 Leu Leu Leu Lys Arg Glu Arg Val Asp Leu 1 5 10 <210> 1196 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1196 Gln Leu Lys Pro Ser Glu Lys Tyr Leu Lys 1 5 10 <210> 1197 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1197 Tyr Leu Lys Ile Lys His Leu Leu Leu 1 5 <210> 1198 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1198 Tyr Leu Lys Ile Lys His Leu Leu Leu Lys 1 5 10 <210> 1199 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1199 Ile Leu Pro Arg Lys Val Leu Gln Met 1 5 <210> 1200 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1211 Arg Ile Ser Cys Leu Pro Thr Gln Thr Arg 1 5 10 <210> 1212 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1212 Ser Leu Ala Glu Thr Val Ser Leu His 1 5 <210> 1213 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1213 Thr Pro Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser 1 5 <210> 1214 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1214 Thr Pro Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser 1 5 10 <210> 1215 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1215 Ala Leu Pro Pro Val Leu Leu Ser Leu 1 5 <210> 1216 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1216 Ala Leu Pro Pro Val Leu Leu Ser Leu Ala 1 5 10 <210> 1217 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Val Ala Ser Arg Thr Ala Ser Cys 1 5 10 <210> 1223 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1223 Ile Ile Gln Leu Ser Leu Leu Ser Leu Leu 1 5 10 <210> 1224 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1224 Ile Gln Leu Ser Leu Leu Ser Leu Leu 1 5 <210> 1225 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1225 Ile Gln Leu Ser Leu Leu Ser Leu Leu Ile 1 5 10 <210> 1226 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1226 Leu Leu Ala Leu Pro Pro Val Leu Leu 1 5 <210> 1227 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1227 Leu Leu Ile Pro Pro Leu Thr Cys Leu 1 5 <210> 1228 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1228 Leu Leu Ile Pro Pro Leu Thr Cys Leu Ala 1 5 10 <210> 1229 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1229 Leu Leu Ser Leu Leu Ile Pro Pro Leu 1 5 <210> 1230 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1230 Leu Leu Ser Leu Leu Ile Pro Pro Leu Thr 1 5 10 <210> 1231 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1231 Leu Pro Arg Pro Leu Leu Ala Leu Pro Pro 1 5 10 <210> 1232 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1232 Gln Leu Ser Leu Leu Ser Leu Leu Ile 1 5 <210> 1233 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1233 Arg Leu Leu Gln Cys Gln Ala Thr Arg 1 5 <210> 1234 <211> 9 <212> 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1245 Ala Pro Leu Leu Thr Ala Thr Gly Ser Val 1 5 10 <210> 1246 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1246 Ala Pro Val Leu Ser Ala Ser Ile Leu 1 5 <210> 1247 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1247 Ala Thr Leu Leu Pro Ala Thr Thr Val 1 5 <210> 1248 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1248 Ala Thr Val Ser Thr Thr Thr Ala Pro Val 1 5 10 <210> 1249 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1249 Ala Val Pro Ala Asn Cys Leu Phe Pro Ala 1 5 10 <210> 1250 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1250 Cys Leu Phe Pro Ala Ala Leu Pro Ser Thr 1 5 10 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1262 Leu Pro Ala Ala Ile Pro Ala Ser Thr 1 5 <210> 1263 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1263 Leu Pro Ala Gly Cys Val Ser Ser Ala 1 5 <210> 1264 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1264 Leu Pro Ala Gly Cys Val Ser Ser Ala Pro 1 5 10 <210> 1265 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1265 Leu Tyr Thr Ala Asp Ser Ser Leu Trp 1 5 <210> 1266 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1266 Gln Pro Ala Lys Ser Ser Pro Ser Ala 1 5 <210> 1267 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1267 Gln Pro Ala Lys Ser Ser Pro Ser Ala Ala 1 5 10 <210> 1268 <211> 9 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Sequence: Synthetic peptide <400> 1279 Thr Leu Asp Ala Leu Pro Ala Gly Cys Val 1 5 10 <210> 1280 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1280 Thr Val Ser Thr Thr Thr Ala Pro Val 1 5 <210> 1281 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1281 Val Leu Ser Ala Ser Ile Leu Pro Ala 1 5 <210> 1282 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1282 Val Leu Ser Ala Ser Ile Leu Pro Ala Ala 1 5 10 <210> 1283 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1283 Val Pro Ala Asn Cys Leu Phe Pro Ala 1 5 <210> 1284 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1284 Val Pro Ala Asn Cys Leu Phe Pro Ala Ala 1 5 10 <210> 1285 <211> 9 <212> PRT <213> 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Synthetic peptide <400> 1296 His Arg Arg Ser Tyr Leu Lys Ile His Leu 1 5 10 <210> 1297 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1297 His Ser Arg Phe Leu Leu Met Asp Asn Lys 1 5 10 <210> 1298 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1298 Lys Leu Pro Ile Pro Ser Ser Ala Ser Leu 1 5 10 <210> 1299 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1299 Lys Val Leu Thr Leu Ser Ser Ser Ser His 1 5 10 <210> 1300 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1300 Leu Ile His Ser Arg Phe Leu Leu Met 1 5 <210> 1301 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1301 Leu Leu Met Asp Asn Lys Ala Pro Ala 1 5 <210> 1302 <211> 10 <212> PRT <213> 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1313 Arg Leu Arg Ile Leu Ser Pro Ser Leu 1 5 <210> 1314 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1314 Arg Pro Leu Met Pro Asn Leu Arg Ile 1 5 <210> 1315 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1315 Arg Pro Arg Pro Leu Met Pro Asn Leu 1 5 <210> 1316 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1316 Ser Ala Ser Leu His Arg Arg Ser Tyr Leu 1 5 10 <210> 1317 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1317 Ser Leu His Ile Ser Ser Pro Arg Leu 1 5 <210> 1318 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1318 Ser Leu His Arg Arg Ser Tyr Leu Lys 1 5 <210> 1319 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1319 Ser Leu His Arg Arg Ser Tyr Leu Lys Ile 1 5 10 <210> 1320 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1320 Ser Leu Ile His Ser Arg Phe Leu Leu 1 5 <210> 1321 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1321 Ser Leu Ile His Ser Arg Phe Leu Leu Met 1 5 10 <210> 1322 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1322 Ser Leu Leu Thr Ser Ser Ser Asn Leu 1 5 <210> 1323 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1323 Ser Leu Asn His His Ser Ser Ser Pro Leu 1 5 10 <210> 1324 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1324 Ser Leu Ser Ser Pro 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1347 Thr Val Arg Met Arg Pro His Cys Val Pro Phe 1 5 10 <210> 1348 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1348 Val Pro Phe Trp Thr Gly Arg Ile Leu 1 5 <210> 1349 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1349 Val Pro Phe Trp Thr Gly Arg Ile Leu Leu 1 5 10 <210> 1350 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1350 Val Arg Met Arg Pro His Cys Val Pro Phe 1 5 10 <210> 1351 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1351 Ala Met Val Pro Arg Gly Val Ser Met 1 5 <210> 1352 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1352 Ala Met Val Pro Arg Gly Val Ser Met Ala 1 5 10 <210> 1353 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Synthetic peptide <400> 1358 Met Pro Thr Thr Pro Val Gln Ala Trp 1 5 <210> 1359 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1359 Met Pro Thr Thr Pro Val Gln Ala Trp Leu 1 5 10 <210> 1360 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1360 Ser Leu Pro Glu Asp Arg Tyr Thr Gln Ala 1 5 10 <210> 1361 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1361 Ser Pro Ala Gln Pro Tyr Leu Arg Val 1 5 <210> 1362 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1362 Ser Pro Ala Gln Pro Tyr Leu Arg Val Ser 1 5 10 <210> 1363 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1363 Thr Ile Met Pro Cys Pro Met Pro Thr 1 5 <210> 1364 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1398 Asn Pro Thr Lys Thr Lys Lys Ala Arg Phe 1 5 10 <210> 1399 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1399 Gln Lys Met Lys Lys Ala His Phe Leu 1 5 <210> 1400 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1400 Arg Phe Ser Thr Ala Ser Leu Ala Lys 1 5 <210> 1401 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1401 Arg Pro Ile Arg Pro Pro Phe Leu Glu Ser 1 5 10 <210> 1402 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1402 Arg Ser Asn Pro Thr Lys Thr Lys Lys 1 5 <210> 1403 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1403 Ser Leu Ala Lys Glu Leu Thr His Pro Leu 1 5 10 <210> 1404 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Synthetic peptide <400> 1415 Gly Thr Thr Phe Ile Thr Met Met Lys 1 5 <210> 1416 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1416 Gly Thr Thr Phe Ile Thr Met Met Lys Lys 1 5 10 <210> 1417 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1417 Ile Thr Met Met Lys Lys Glu Ala Glu Lys 1 5 10 <210> 1418 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1418 Arg Met Thr Pro Gly Thr Thr Phe Ile 1 5 <210> 1419 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1419 Ser Pro Tyr Cys Pro Gln Arg Met Thr 1 5 <210> 1420 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1420 Thr Met Met Lys Lys Glu Ala Glu Lys 1 5 <210> 1421 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1421 Thr Pro Gly Thr Thr Phe Ile Thr Met 1 5 <210> 1422 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1422 Thr Pro Gly Thr Thr Phe Ile Thr Met Met 1 5 10 <210> 1423 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1423 Thr Thr Phe Ile Thr Met Met Lys Lys 1 5 <210> 1424 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1424 Cys Pro Gly Ala Thr Trp Arg Glu Ala 1 5 <210> 1425 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1425 Cys Pro Gly Ala Thr Trp Arg Glu Ala Ala 1 5 10 <210> 1426 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1426 Arg Ser Arg Cys Pro Gly Ala Thr Trp Arg 1 5 10 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Synthetic peptide <400> 1432 Cys Pro Leu Asp His Thr Thr Pro Pro Ala 1 5 10 <210> 1433 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1433 Phe Leu Gln Glu Gln Tyr His Glu Ala 1 5 <210> 1434 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1434 Arg Leu Ala Phe Leu Gln Glu Gln Tyr His 1 5 10 <210> 1435 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1435 Ser Pro Cys Ser Pro Phe Arg Leu Ala Phe 1 5 10 <210> 1436 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1436 Ser Pro Pro Trp Val Arg Ala Leu Leu 1 5 <210> 1437 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1437 Tyr Pro Ala Cys Pro Leu Asp His Thr Thr 1 5 10 <210> 1438 <211> 9 <212> PRT <213> 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of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1489 Arg Leu Cys Pro His His Leu Lys Asn His 1 5 10 <210> 1490 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1490 Arg Leu Tyr Pro His His Leu Lys His 1 5 <210> 1491 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1491 Arg Leu Tyr Pro His His Leu Lys His Arg 1 5 10 <210> 1492 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1492 Arg Pro Cys Pro His His Leu Lys Asn Leu 1 5 10 <210> 1493 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1493 Arg Ser His Pro Cys Pro Leu His Leu Lys 1 5 10 <210> 1494 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1494 Arg Ser Leu Pro Phe Pro His His Leu Arg 1 5 10 <210> 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1506 Ala Tyr Thr Gly Thr Ile Leu Met Met 1 5 <210> 1507 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1507 Asp Leu Lys Ala Tyr Thr Gly Thr Ile Leu 1 5 10 <210> 1508 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1508 Ile Leu Thr Lys Gln Ile Lys Thr Lys 1 5 <210> 1509 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1509 Lys Met Ile Leu Thr Lys Gln Ile Lys 1 5 <210> 1510 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1510 Lys Pro Thr Asp Thr Phe Leu Gln Ile 1 5 <210> 1511 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1511 Lys Pro Thr Asp Thr Phe Leu Gln Ile Leu 1 5 10 <210> 1512 <211> 10 <212> PRT 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1574 Ala Leu Arg Cys Val Phe Val Pro Val 1 5 <210> 1575 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1575 Ala Leu Arg Cys Val Phe Val Pro Val Leu 1 5 10 <210> 1576 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1576 Ala Leu Ser Glu His Cys Pro Thr Thr 1 5 <210> 1577 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1577 Ala Gln Arg Lys Arg Ile Ser Ala Arg Lys 1 5 10 <210> 1578 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1578 Gly Ala Gln Arg Lys Arg Ile Ser Ala 1 5 <210> 1579 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1579 His Trp Met Glu Asn Ile Ser Pro Phe 1 5 <210> 1580 <211> 9 <212> PRT <213> 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1591 His Pro Arg Pro Arg His Gly His Leu Gln 1 5 10 <210> 1592 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1592 Arg Pro Arg His Gly His Leu Gln Ala 1 5 <210> 1593 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1593 Arg Pro Arg His Gly His Leu Gln Ala Val 1 5 10 <210> 1594 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1594 Gly Ser Leu Lys Thr Gln Val Gln Met Lys 1 5 10 <210> 1595 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1595 Pro Pro Gly Pro Cys His Leu Leu Ser Leu 1 5 10 <210> 1596 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1596 Arg Thr Ile Leu Asn Asn Gly Ser Leu Lys 1 5 10 <210> 1597 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1716 Met Ala Leu Asn Ser Glu Ala Leu Ser Val 1 5 10 <210> 1717 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1717 Met Ser Asp Val Ala Ile Val Lys Glu Gly Trp Leu His Lys Arg Gly 1 5 10 15 Lys Tyr Ile Lys Thr Trp Arg Pro Arg Tyr Phe Leu Leu Lys Asn Asp 20 25 30 Gly Thr Phe Ile Gly Tyr Lys Glu Arg Pro Gln Asp Val Asp Gln Arg 35 40 45 Glu Ala Pro Leu Asn Asn Phe Ser Val Ala Gln Cys Gln Leu Met Lys 50 55 60 Thr Glu Arg 65 <210> 1718 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1718 Thr Met Leu Val Leu Glu Gly Ser Gly Asn Leu Val Leu Tyr Thr Gly 1 5 10 15 Val Val Arg Val Gly Lys Val Phe Ile Pro Gly Leu Pro Ala Pro Ser 20 25 30 Leu Thr Met Ser Asn Thr Met Pro Arg Pro Ser Thr Pro Leu Asp Gly 35 40 45 Val Ser Ala Pro Lys Pro Leu Ser Lys Leu Leu Gly Ser Leu Asp Glu 50 55 60 Val Val Leu Leu Ser Pro Val Pro Glu Leu Arg Asp Ser Ser Lys Leu 65 70 75 80 His Asp Ser Leu Tyr Asn Glu Asp Cys Thr Phe Gln Gln Leu Gly Thr 85 90 95 Tyr Ile His Ser Ile 100 <210> 1719 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1719 Met Arg Glu Pro Ile Tyr Met His Ser Thr Met Val Phe Leu Pro Trp 1 5 10 15 Glu Leu His Thr Lys Lys Gly Pro Ser Pro Pro Glu Gln Phe Met Ala 20 25 30 Val Lys Leu Ser Asp Ser Arg Thr Ala Leu Lys Ser Gly Tyr Gly Lys 35 40 45 Tyr Leu Gly Ile Asn Ser Asp Glu Leu Val Gly His Ser Asp Ala Ile 50 55 60 Gly Pro Arg Glu Gln Trp Glu Pro Val Phe Gln Asn Gly Lys Met Ala 65 70 75 80 Leu Leu Ala Ser Asn Ser Cys Phe Ile Arg 85 90 <210> 1720 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1720 Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu 1 5 10 15 Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys 20 25 30 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100 <210> 1728 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1728 Ala Val Cys Lys Ser Lys Lys Ser Trp Gln Ala Arg His Thr Gly Ile 1 5 10 15 Lys Ile Val Gln Gln Ile Ala Ile Leu Met Gly Cys Ala Ile Leu Pro 20 25 30 His Leu Arg Ser Leu Val Glu Ile Ile Glu His Gly Leu Val Asp Glu 35 40 45 Gln Gln Glu Val Arg Thr Ile Ser Ala Leu Ala Ile Ala Ala Leu Ala 50 55 60 Glu Ala Ala Thr Pro Tyr Gly Ile Glu Ser Phe Asp Ser Val Leu Lys 65 70 75 80 Pro Leu Trp Lys Gly Ile Arg Gln His Arg Gly Lys Gly Leu Ala Ala 85 90 95 Phe Leu Lys Ala Ile 100 <210> 1729 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1729 Tyr Leu Ser Leu Tyr Leu Leu Leu Val Ser Cys Pro Lys Ser Glu Val 1 5 10 15 Arg Ala Lys Phe Lys Phe Ser Ile Leu Asn Ala Lys Gly Glu Glu Thr 20 25 30 Lys Ala Met Glu Ser Gln Arg Ala Tyr Arg Phe Val Gln Gly Lys Asp 35 40 45 Trp Gly Leu Lys Lys Phe Ile Arg 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Ser Gly Arg Asp Val Ser Leu Arg Gly Leu Ser Cys Ala Arg 1 5 10 15 Ala Thr Leu Ser Phe Trp Pro Gly Gly Tyr Pro Ala Tyr Ser Lys Asp 20 25 30 Ser Gly Leu Leu Thr Ser Ser Ser Arg Glu Trp Lys Val Lys Phe Pro 35 40 45 Glu Leu Leu Cys Val Trp Val Ser Ser Ile Arg His 50 55 60 <210> 1736 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1736 Ala Gln Ala Lys Ala Val Cys Ser Gln Glu Ser Arg Asp Val Leu Cys 1 5 10 15 Glu Leu Ser Asp His His Asn His Thr Leu Glu Glu Glu Cys Gln Trp 20 25 30 Gly Pro Cys Leu Gln Cys Leu Trp Ala Leu Leu Gln Ala Ser Gln Tyr 35 40 45 <210> 1737 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1737 Gly Pro Arg Ser His Pro Leu Pro Arg Leu Trp His Leu Leu Leu Gln 1 5 10 15 Val Thr Gln Thr Ser Phe Ala Leu Ala Pro Thr Leu Thr His Met Leu 20 25 30 Ser Pro His 35 <210> 1738 <211> 172 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1738 Pro Leu Gly Leu Val Pro Trp Thr Arg Trp Cys Pro Gln Gly Lys Pro 1 5 10 15 Arg Phe Pro Ala Met Ser Thr Thr Thr Ala Thr Gly Thr Thr Thr Thr 20 25 30 Lys Ser Gly Ser Ser Gly Met Ala Gly Ser Leu Ala Gln Lys Pro Glu 35 40 45 Ser Pro Ser Pro Gly Leu Leu Phe Leu Gly His Ser Pro Ser Gln Ser 50 55 60 His Leu Leu Leu Ile Ser Lys Ser Pro Asp Pro Thr Gln Gln Pro Leu 65 70 75 80 Arg Gly Gly Ser Leu Thr His Ser Ala Pro Gly Pro Ser Leu Ser Gln 85 90 95 Pro Leu Ala Gln Leu Thr Pro Pro Ala Ser Ala Pro Val Pro Ala Val 100 105 110 Cys Ser Thr Cys Lys Asn Pro Ala Ser Leu Pro Asp Thr His Arg Gly 115 120 125 Lys Gly Gly Gly Val Pro Pro Ser Pro Pro Leu Ala Leu Gly Pro Arg 130 135 140 Met Gln Leu Cys Thr Gln Leu Ala Arg Phe Phe Pro Ile Thr Pro Pro 145 150 155 160 Val Trp His Ile Leu Gly Pro Gln Arg His Thr Pro 165 170 <210> 1739 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1739 Ser Gln Gly Leu Tyr Ser Ser Ser Ala Ser Ser Gly Lys Cys Leu Met 1 5 10 15 Glu Val Thr Val Asp Arg Asn Cys Leu Glu Val Leu Pro Thr Lys Met 20 25 30 Ser Tyr Ala Ala Asn Leu Lys Asn Val Met Asn Met Gln Asn Arg Gln 35 40 45 Lys Lys Lys Gly Lys Asn Ser Pro Cys Cys Gln Lys Lys Leu Arg Val 50 55 60 Gln Asn Gln Gly His Leu Leu Met Ile Leu Leu His Asn 65 70 75 <210> 1740 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1740 Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Ile Trp Ile Pro 1 5 10 15 Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Val Leu Arg Glu 20 25 30 Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val 35 40 45 Met Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg Leu 50 55 60 Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu Met 65 70 75 80 Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg Leu 85 90 95 Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp 100 <210> 1741 <211> 10 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1752 Ala Leu Ser Ala Ser Asn Ser Cys Phe Ile 1 5 10 <210> 1753 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1753 Lys Val Ser Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys 1 5 10 <210> 1754 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1754 Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val 1 5 <210> 1755 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1755 Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys 1 5 <210> 1756 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1756 Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys 1 5 10 <210> 1757 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1757 Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys 1 5 <210> 1758 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1758 Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys 1 5 10 <210> 1759 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1759 Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val 1 5 10 <210> 1760 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1760 Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val 1 5 <210> 1761 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1761 Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val 1 5 10 <210> 1762 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1762 Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val 1 5 <210> 1763 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1763 Val Val 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1769 Ile Leu Asp Thr Ala Gly Arg Glu Glu Tyr 1 5 10 <210> 1770 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1770 Gly Leu Val Asp Glu Gln Gln Glu Val 1 5 <210> 1771 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1771 Phe Val Gln Gly Lys Asp Trp Gly Leu 1 5 <210> 1772 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1772 Phe Val Gln Gly Lys Asp Trp Gly Val 1 5 <210> 1773 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1773 Asn Ser Phe Glu Val His Val Cys Ala 1 5 <210> 1774 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1774 Val Val Pro Cys Glu Pro Pro Glu Val 1 5 <210> 1775 <211> 10 <212> 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1786 Cys Gln Trp Gly Pro Cys Leu Gln Cys Leu 1 5 10 <210> 1787 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1787 Gln Trp Gly Pro Cys Leu Gln Cys Leu 1 5 <210> 1788 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1788 Gln Trp Gly Pro Cys Leu Gln Cys Leu Trp 1 5 10 <210> 1789 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1789 Gly Pro Arg Gly Arg Thr Cys His Pro Gly 1 5 10 <210> 1790 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1790 Ala Leu Ala Pro Thr Leu Thr His Met 1 5 <210> 1791 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1791 Ala Leu Ala Pro Thr Leu Thr His Met Leu 1 5 10 <210> 1792 <211> 10 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Val Glu Trp 1 <210> 1815 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1815 Val His Pro Ala 1 <210> 1816 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1816 Met Pro Ala Val 1 <210> 1817 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1817 Ser Ile Arg His 1 <210> 1818 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1818 Ser Gln Ile Ser 1 <210> 1819 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1819 Cys Ser Asn His 1 <210> 1820 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1820 Tyr His Glu Ala 1 <210> 1821 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 1834 His His His His His His 1 5

Claims (294)

  1. 종양 특이적 네오에피토프를 포함하는 단리된 신생항원성 펩티드로서, 상기 단리된 신생항원성 펩티드는 천연 폴리펩티드가 아니고, 상기 네오에피토프는
    AxByCz로 표시되는 아미노산 서열의 적어도 8개의 인접한 아미노산을 포함하며, 여기서,
    각각의 A 및 C는 천연 폴리펩티드에 상응하는 아미노산을 나타내고,
    y는 1 이상이고, B는 천연 폴리펩티드의 아미노산 치환 또는 삽입체를 나타내고,
    x + y + z는 8 이상이고,
    적어도 8개의 인접한 아미노산은 By를 포함하고,
    상기 천연 폴리펩티드는
    Figure pat00047

    Figure pat00048

    Figure pat00049

    Figure pat00050

    으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자에 의해 코딩되는 것인, 단리된 신생항원성 펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 천연 폴리펩티드가 EGFR, ERBB3 또는 FGFR3 유전자에 의해 코딩되고, 적어도 하나의 By는 세포외에서 발현되는 것인, 단리된 신생항원성 펩티드.
  3. 종양 특이적 네오에피토프를 포함하는 단리된 신생항원성 펩티드로서, 상기 단리된 신생항원성 펩티드는 천연 폴리펩티드가 아니고, 상기 네오에피토프는
    AxByCz로 표시되는 아미노산 서열의 적어도 8개의 인접한 아미노산을 포함하며, 여기서,
    각각의 A는 천연 폴리펩티드에 상응하는 아미노산이고;
    By는 존재하지 않고;
    각각의 C는 천연 폴리펩티드를 코딩하는 서열의 프레임시프트에 의해 코딩되는 아미노산이고;
    x + y + z는 8 이상이고;
    적어도 8개의 인접한 아미노산은 적어도 하나의 Cz를 포함하고;
    상기 천연 폴리펩티드는
    Figure pat00051

    Figure pat00052

    Figure pat00053

    Figure pat00054

    Figure pat00055

    Figure pat00056

    으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자에 의해 코딩되는 것인, 단리된 신생항원성 펩티드.
  4. 종양 특이적 네오에피토프를 포함하는 단리된 신생항원성 펩티드로서, 상기 단리된 신생항원성 펩티드는 천연 폴리펩티드가 아니고, 상기 네오에피토프는
    AxByCz로 표시되는 아미노산 서열의 적어도 8개의 인접한 아미노산을 포함하며, 여기서,
    각각의 A는 제1 천연 폴리펩티드에 상응하는 아미노산이고;
    각각의 C는 제2 천연 폴리펩티드, 또는 제1 천연 폴리펩티드의 제1 천연 폴리펩티드의 스플라이스 변이체의 크립틱 엑손 또는 엑손에 상응하는 아미노산이고,
    각각의 B는 제1 천연 폴리펩티드, 제2 천연 폴리펩티드, 또는 제1 천연 폴리펩티드의 크립틱 엑손에 상응하는 아미노산이 아닌 아미노산이고,
    x + y + z는 8 이상이고, 여기서,
    y는 존재하지 않고, 적어도 8개의 인접한 아미노산은 적어도 하나의 Ax 및 적어도 하나의 Cz를 포함하거나, 또는
    y는 1 이상이고, 적어도 8개의 인접한 아미노산은 적어도 하나의 By를 포함하고,
    여기서,
    (a) 제1 천연 폴리펩티드는 BCR 유전자에 의해 코딩되고, 제2 천연 폴리펩티드는 ABL 유전자에 의해 코딩되고,
    (i) y는 0이고, AxByCz는
    Figure pat00057

    (ii) y는 1이고, AxByCz는
    Figure pat00058

    (b) 제1 천연 폴리펩티드는 C11orf95 유전자에 의해 코딩되고, 제2 천연 폴리펩티드는 RELA 유전자에 의해 코딩되고, y는 1이고, AxByCz는
    Figure pat00059

    (c) 제1 천연 폴리펩티드는 CBFB 유전자에 의해 코딩되고, 제2 천연 폴리펩티드는 MYH11 유전자에 의해 코딩되고, y는 0이고, AxByCz는
    Figure pat00060

    (d) 제1 천연 폴리펩티드는 CD74 유전자에 의해 코딩되고, 제2 천연 폴리펩티드는 ROS1 유전자에 의해 코딩되고, y는 0이고, AxByCz는
    Figure pat00061

    (e) 제1 천연 폴리펩티드는 EGFR 유전자에 의해 코딩되고, 제2 천연 폴리펩티드는
    (i) SEPT14 유전자에 의해 코딩되고, y는 0이고, AxByCz는
    Figure pat00062

    (ii) EGFR 유전자에 의해 코딩되고, y는 1이고, AxByCz는
    Figure pat00063

    (f) 제1 천연 폴리펩티드는 EML4 유전자에 의해 코딩되고, 제2 천연 폴리펩티드는 ALK 유전자에 의해 코딩되고, y는 1이고, AxByCz는
    Figure pat00064

    (g) 제1 천연 폴리펩티드는 FGFR3 유전자에 의해 코딩되고, 제2 천연 폴리펩티드는 TACC3 유전자에 의해 코딩되고, y는 0이고, AxByCz는
    Figure pat00065

    (h) 제1 천연 폴리펩티드는 NAB 유전자에 의해 코딩되고, 제2 천연 폴리펩티드는 STAT6 유전자에 의해 코딩되고, y는 0 이상이고, AxByCz는
    Figure pat00066

    (i) 제2 천연 폴리펩티드는 ERG에 의해 코딩되고, y는 0이고,
    (i) 제1 천연 폴리펩티드는 NDRG1 유전자에 의해 코딩되고, AxByCz는
    Figure pat00067

    (ii) 제1 천연 폴리펩티드는 TMPRSS2 유전자에 의해 코딩되고, AxByCz는
    Figure pat00068

    (j) 제1 천연 폴리펩티드는 PML 유전자에 의해 코딩되고, 제2 천연 폴리펩티드는 RARA 유전자에 의해 코딩되고, y는 1이고, AxByCz는
    Figure pat00069

    Figure pat00070

    (k) 제1 천연 폴리펩티드는 RUNX1 유전자에 의해 코딩되고, 제2 천연 폴리펩티드는 CBFA2T1(RUNX1T1) 유전자에 의해 코딩되고, y는 1이고, AxByCz는
    Figure pat00071

    (l) 제1 천연 폴리펩티드는 AR-v7 유전자에 의해 코딩되고, 스플라이스 변이체의 크립틱 엑손 또는 엑손은 AR-v7 유전자에 의해 코딩되고, y는 0이고, AxByCz는
    Figure pat00072

    인 단리된 신생항원성 펩티드.
  5. 종양 특이적 네오에피토프를 포함하는 단리된 신생항원성 펩티드로서, 상기 단리된 신생항원성 펩티드는 천연 폴리펩티드가 아니고, 상기 네오에피토프는
    AxByCz로 표시되는 아미노산 서열의 적어도 8개의 인접한 아미노산을 포함하며, 여기서,
    각각의 A는 제1 천연 폴리펩티드에 상응하는 아미노산이고;
    각각의 B는 제1 천연 폴리펩티드 또는 제2 천연 폴리펩티드에 상응하는 아미노산이 아닌 아미노산이고,
    각각의 C는 제2 천연 폴리펩티드를 코딩하는 서열의 프레임시프트에 의해 코딩되는 아미노산이고;
    x + y + z는 8 이상이고, 여기서,
    y는 존재하지 않고, 적어도 8개의 인접한 아미노산은 적어도 하나의 Cz를 포함하거나, 또는
    y는 1 이상이고, 적어도 8개의 인접한 아미노산은 적어도 하나의 By 및/또는 적어도 하나의 Cz를 포함하고;
    (a) 제1 천연 폴리펩티드는 AC011997.1 유전자에 의해 코딩되고, 제2 천연 폴리펩티드는 LRRC69 유전자에 의해 코딩되고, y는 1이고, AxByCz는
    Figure pat00073

    (b) 제1 천연 폴리펩티드는 EEF1DP3 유전자에 의해 코딩되고, 제2 천연 폴리펩티드는 FRY 유전자에 의해 코딩되고, y는 1이고, AxByCz는
    Figure pat00074

    (c) 제1 천연 폴리펩티드는 MAD1L1 유전자에 의해 코딩되고, 제2 천연 폴리펩티드는 MAFK 유전자에 의해 코딩되고, y는 0이고, AxByCz는
    Figure pat00075

    (d) 제1 천연 폴리펩티드는 PPP1R1B 유전자에 의해 코딩되고, 제2 천연 폴리펩티드는 STARD3 유전자에 의해 코딩되고, y는 1이고, AxByCz는
    Figure pat00076

    인 단리된 신생항원성 펩티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 신생항원성 펩티드가 표 1에 따른 서열을 포함하는 것인 단리된 신생항원성 펩티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, x + y + z가 500 이하, 250 이하, 150 이하, 125 이하, 또는 100 이하인 단리된 신생항원성 펩티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, x + y + z가 8 이상, 50 이상, 100 이상, 200 이상, 또는 300 이상인 단리된 신생항원성 펩티드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, z가 500 이하, 250 이하, 150 이하, 125 이하, 또는 100 이하인 단리된 신생항원성 펩티드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, z가 8 이상, 50 이상, 100 이상, 200 이상, 또는 300 이상인 단리된 신생항원성 펩티드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 신생항원성 펩티드의 길이가 약 8 내지 약 500개의 아미노산 길이인 단리된 신생항원성 펩티드.
  12. 제11항에 있어서, 단리된 신생항원성 펩티드의 길이가 약 8 내지 약 100개의 아미노산 길이인 단리된 신생항원성 펩티드.
  13. 제12항에 있어서, 단리된 신생항원성 펩티드의 길이가 약 8 내지 약 50개의 아미노산 길이인 단리된 신생항원성 펩티드.
  14. 제13항에 있어서, 단리된 신생항원성 펩티드의 길이가 약 15 내지 약 35개의 아미노산 길이인 단리된 신생항원성 펩티드.
  15. 제13항에 있어서, 단리된 신생항원성 펩티드의 길이가 약 8 내지 약 15개의 아미노산 길이인 단리된 신생항원성 펩티드.
  16. 제13항에 있어서, 단리된 신생항원성 펩티드의 길이가 약 8 내지 약 11개의 아미노산 길이인 단리된 신생항원성 펩티드.
  17. 제13항에 있어서, 단리된 신생항원성 펩티드의 길이가 9 또는 10개의 아미노산 길이인 단리된 신생항원성 펩티드.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 신생항원성 펩티드가 주조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I에 결합하는 것인 단리된 신생항원성 펩티드.
  19. 제18항에 있어서, 단리된 신생항원성 펩티드가 약 500 nM 이하의 결합 친화도로 MHC 클래스 I에 결합하는 것인 단리된 신생항원성 펩티드.
  20. 제19항에 있어서, 단리된 신생항원성 펩티드가 약 250 nM 이하의 결합 친화도로 MHC 클래스 I에 결합하는 것인 단리된 신생항원성 펩티드.
  21. 제19항에 있어서, 단리된 신생항원성 펩티드가 약 50 nM 이하의 결합 친화도로 MHC 클래스 I에 결합하는 것인 단리된 신생항원성 펩티드.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 신생항원성 펩티드의 길이가 약 8 내지 약 30개의 아미노산 길이인 단리된 신생항원성 펩티드.
  23. 제22항에 있어서, 단리된 신생항원성 펩티드의 길이가 약 8 내지 약 25개의 아미노산 길이인 단리된 신생항원성 펩티드.
  24. 제23항에 있어서, 단리된 신생항원성 펩티드의 길이가 약 15 내지 약 24개의 아미노산 길이인 단리된 신생항원성 펩티드.
  25. 제23항에 있어서, 단리된 신생항원성 펩티드의 길이가 약 9 내지 약 15개의 아미노산 길이인 단리된 신생항원성 펩티드.
  26. 제1항 내지 제17항 및 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 신생항원성 펩티드가 MHC 클래스 II에 결합하는 것인 단리된 신생항원성 펩티드.
  27. 제26항에 있어서, 단리된 신생항원성 펩티드가 1,000 nM 이하의 결합 친화도로 MHC 클래스 II에 결합하는 것인 단리된 신생항원성 펩티드.
  28. 제27항에 있어서, 단리된 신생항원성 펩티드가 약 500 nM 이하의 결합 친화도로 MHC 클래스 I에 결합하는 것인 단리된 신생항원성 펩티드.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 신생항원성 펩티드가 측면(flanking) 아미노산을 추가로 포함하는 것인 단리된 신생항원성 펩티드.
  30. 제29항에 있어서, 측면 아미노산이 천연 측면 아미노산이 아닌 것인 단리된 신생항원성 펩티드.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 신생항원성 펩티드의 총 길이가 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 또는 적어도 500개의 아미노산 길이인 단리된 신생항원성 펩티드.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 신생항원성 펩티드의 총 길이가 최대 8, 최대 9, 최대 10, 최대 11, 최대 12, 최대 13, 최대 14, 최대 15, 최대 16, 최대 17, 최대 18, 최대 19, 최대 20, 최대 21, 최대 22, 최대 23, 최대 24, 최대 25, 최대 26, 최대 27, 최대 28, 최대 29, 최대 30, 최대 40, 최대 50, 최대 60, 최대 70, 최대 80, 최대 90, 최대 100, 최대 150, 최대 200, 최대 250, 최대 300, 최대 350, 최대 400, 최대 450, 또는 최대 500개의 아미노산 길이인 단리된 신생항원성 펩티드.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 신생항원성 펩티드가 적어도 제2 신생항원성 펩티드에 연결된 제1 신생항원성 펩티드인 단리된 신생항원성 펩티드.
  34. 제33항에 있어서, 단리된 신생항원성 펩티드가 폴리글리신 또는 폴리세린 링커에 의해 적어도 제2 신생항원성 펩티드에 연결된 것인 단리된 신생항원성 펩티드.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 제2 신생항원성 펩티드가 약 1,000 nM 미만의 결합 친화도로 MHC 클래스 I 또는 클래스 II에 결합하는 것인 단리된 신생항원성 펩티드.
  36. 제35항에 있어서, 제2 신생항원성 펩티드가 약 500 nM 미만의 결합 친화도로 MHC 클래스 I 또는 클래스 II에 결합하는 것인 단리된 신생항원성 펩티드.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 단리된 신생항원성 펩티드 및 제2 신생항원성 펩티드가 인간 백혈구 항원(HLA)-A, -B, -C, -DP, -DQ, 또는 -DR에 결합하는 것인 단리된 신생항원성 펩티드.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 신생항원성 펩티드가 클래스 I HLA에 결합하고, 제2 신생항원성 펩티드가 클래스 II HLA에 결합하는 것인 단리된 신생항원성 펩티드.
  39. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 신생항원성 펩티드가 클래스 II HLA에 결합하고, 제2 신생항원성 펩티드가 클래스 I HLA에 결합하는 것인 단리된 신생항원성 펩티드.
  40. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 신생항원성 펩티드가 생체내 반감기, 세포 표적화, 항원 흡수, 항원 프로세싱, MHC 친화도, MHC 안정성, 항원 제시, 또는 이들의 조합을 증가시키는 변형을 추가로 포함하는 것인 단리된 신생항원성 펩티드.
  41. 제40항에 있어서, 변형이 캐리어 단백질에의 접합, 리간드에의 접합, 항체에의 접합, PEG화, 폴리시알릴화, HES화, 재조합 PEG 모방체, Fc 융합, 알부민 융합, 나노입자 부착, 나노미립자 캡슐화, 콜레스테롤 융합, 철 융합, 아실화, 아미드화, 글리코실화, 측쇄 산화, 인산화, 비오티닐화, 계면 활성 물질 첨가, 아미노산 모방체 첨가, 또는 비천연 아미노산 첨가인 단리된 신생항원성 펩티드.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 단리된 신생항원성 펩티드가 항원 제시 세포로의 세포 표적화를 증가시키는 변형을 추가로 포함하는 것인 단리된 신생항원성 펩티드.
  43. 제42항에 있어서, 항원 제시 세포가 수지상 세포인 단리된 신생항원성 펩티드.
  44. 제43항에 있어서, 수지상 세포가 DEC205, XCR1, CD197, CD80, CD86, CD123, CD209, CD273, CD283, CD289, CD184, CD85h, CD85j, CD85k, CD85d, CD85g, CD85a, CD141, CD11c, CD83, TSLP 수용체, Clec9a, 또는 CD1a 마커를 사용하여 표적화되는 것인 단리된 신생항원성 펩티드.
  45. 제44항에 있어서, 수지상 세포가 CD141, DEC205, Clec9a, 또는 XCR1 마커를 사용하여 표적화되는 것인 단리된 신생항원성 펩티드.
  46. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 수지상 세포가 자가 세포인 단리된 신생항원성 펩티드.
  47. 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 수지상 세포 중 하나 이상의 것이 T 세포에 결합되는 것인 단리된 신생항원성 펩티드.
  48. 제47항에 있어서, T 세포가 자가 T 세포인 단리된 신생항원성 펩티드.
  49. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 신생항원성 펩티드가 표 2에 열거된 단리된 신생항원성 펩티드가 아닌 것인 단리된 신생항원성 펩티드.
  50. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 신생항원성 펩티드가 표 1 또는 2에 열거된 적어도 하나의 추가의 신생항원성 펩티드에 연결된 것인 단리된 신생항원성 펩티드.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 단리된 신생항원성 펩티드를 포함하는 생체내 전달 시스템.
  52. 제51항에 있어서, 전달 시스템이 세포 투과 펩티드, 나노미립자 캡슐화, 바이러스 유사 입자, 리포솜, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 전달 시스템.
  53. 제52항에 있어서, 세포 투과 펩티드가 TAT 펩티드, 단순 허피스 바이러스 VP22, 트랜스포탄, Antp, 또는 이들의 임의의 조합인 전달 시스템.
  54. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 단리된 신생항원성 펩티드를 포함하는 세포.
  55. 제54항에 있어서, 세포가 항원 제시 세포인 세포.
  56. 제55항에 있어서, 세포가 수지상 세포인 세포.
  57. 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 자가 세포인 세포.
  58. 제54항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 T 세포에 결합되는 것인 세포.
  59. 제58항에 있어서, T 세포가 자가 T 세포인 세포.
  60. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 단리된 신생항원성 펩티드를 포함하는 조성물.
  61. 제60항에 있어서, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 또는 적어도 100개의, 표 1 또는 2에 따른, 종양 특이적 네오에피토프를 포함하는 단리된 신생항원성 펩티드를 포함하는 조성물.
  62. 제61항에 있어서, 약 2 내지 약 20종의 신생항원성 펩티드, 또는 약 2 내지 약 30종의 신생항원성 펩티드를 포함하는 조성물.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서, 신생항원이 개별 피험체의 종양에 특이적인 조성물.
  64. 제60항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 또는 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 또는 적어도 100종의 추가의 신생항원성 펩티드를 추가로 포함하는 조성물.
  65. 제64항에 있어서, 약 4 내지 약 20종의 추가의 신생항원성 펩티드, 약 4 내지 약 30종의 추가의 신생항원성 펩티드를 포함하는 조성물.
  66. 제60항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 추가의 신생항원성 펩티드 중 적어도 하나가 개별 피험체의 종양에 특이적인 조성물.
  67. 제66항에 있어서, 피험체 특이적 신생항원성 펩티드가 피험체의 종양 샘플의 게놈, 엑솜, 및/또는 트랜스크립톰과 비종양 샘플의 게놈, 엑솜, 및/또는 트랜스크립톰 사이의 서열 차이를 확인함으로써 선택되는 것인 조성물.
  68. 제67항에 있어서, 샘플이 신선한 또는 포르말린 고정 파라핀 포매된 종양 조직, 새로 단리된 세포, 또는 순환 종양 세포인 조성물.
  69. 제67항 또는 제68항에 있어서, 서열 차이가 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing)에 의해 결정되는 것인 조성물.
  70. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 단리된 신생항원성 펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  71. 제70항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 DNA인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  72. 제70항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 RNA인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  73. 제72항에 있어서, RNA가 자기 증폭 RNA인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  74. 제72항 또는 제73항에 있어서, RNA가 안정성을 증가시키기 위해, 세포 표적화를 증가시키기 위해, 번역 효율, 애쥬번트성, 사이토졸 접근성을 증가시키기 위해, 및/또는 세포독성을 감소시키기 위해 변형된 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  75. 제74항에 있어서, 변형이 캐리어 단백질에의 접합, 리간드에의 접합, 항체에의 접합, 코돈 최적화, GC 함량 증가, 변형된 뉴클레오시드 도입, 5' 캡 또는 캡 유사체 도입, 및/또는 비마스킹된 폴리A 서열 도입인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  76. 제70항 내지 제75항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포.
  77. 제70항 내지 제75항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  78. 제77항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있는 것인 벡터.
  79. 제77항 또는 제78항에 있어서, 벡터가 자기 증폭 RNA 레플리콘, 플라스미드, 파지, 트랜스포손, 코스미드, 바이러스, 또는 비리온인 벡터.
  80. 제79항에 있어서, 벡터가 아데노 연관 바이러스, 허피스바이러스, 렌티바이러스, 또는 이들의 슈도타입으로부터 유래된 것인 벡터.
  81. 제70항 내지 제75항 중 어느 한 항의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 생체내 전달 시스템.
  82. 제81항에 있어서, 전달 시스템이 구형 핵산, 바이러스, 바이러스 유사 입자, 플라스미드, 박테리아 플라스미드, 또는 나노입자를 포함하는 것인 전달 시스템.
  83. 제77항 내지 제82항 중 어느 한 항의 벡터 또는 전달 시스템을 포함하는 세포.
  84. 제83항에 있어서, 세포가 항원 제시 세포인 세포.
  85. 제84항에 있어서, 세포가 수지상 세포인 세포.
  86. 제85항에 있어서, 세포가 미성숙한 수지상 세포인 세포.
  87. 제70항 내지 제75항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
  88. 제87항에 있어서, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 또는 적어도 100종의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
  89. 제88항에 있어서, 약 2 내지 약 20종의 단리된 폴리뉴클레오티드, 또는 약 2 내지 약 30종의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
  90. 제87항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 신생항원성 펩티드가 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 의해 코딩되는 것인 조성물.
  91. 제87항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 또는 적어도 100종의, 추가의 신생항원성 펩티드를 코딩하는 추가의 신생항원성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 조성물.
  92. 제88항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가의 신생항원성 펩티드가 하나 이상의 추가의 신생항원성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 의해 코딩되는 것인 조성물.
  93. 제91항 또는 제92항에 있어서, 약 4 내지 약 20종의 추가의 신생항원성 폴리뉴클레오티드, 또는 약 4 내지 약 30종의 추가의 신생항원성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
  94. 제91항 또는 제92항에 있어서, 단리된 폴리뉴클레오티드와 추가의 신생항원성 폴리뉴클레오티드가 연결되어 있는 것인 조성물.
  95. 제94항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 폴리글리신 또는 폴리세린 링커를 코딩하는 핵산을 사용하여 연결된 것인 조성물.
  96. 제87항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 추가의 신생항원성 펩티드 중 적어도 하나가 개별 피험체의 종양에 특이적인 조성물.
  97. 제96항에 있어서, 피험체 특이적 신생항원성 펩티드가 피험체의 종양 샘플의 게놈, 엑솜, 및/또는 트랜스크립톰과 비종양 샘플의 게놈, 엑솜, 및/또는 트랜스크립톰 사이의 서열 차이를 확인함으로써 선택되는 것인 조성물.
  98. 제97항에 있어서, 샘플이 신선한 또는 포르말린 고정 파라핀 포매된 종양 조직, 새로 단리된 세포, 또는 순환 종양 세포인 조성물.
  99. 제97항 또는 제98항에 있어서, 서열 차이가 차세대 시퀀싱에 의해 결정되는 것인 조성물.
  100. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 기재된 적어도 하나의 신생항원성 펩티드, 또는 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 기재된 적어도 하나의 신생항원성 펩티드를 포함하는 MHC-펩티드 복합체에 결합할 수 있는 T 세포 수용체(TCR).
  101. 제100항에 있어서, MHC-펩티드의 MHC가 MHC 클래스 I 또는 클래스 II인 TCR.
  102. 제100항 또는 제101항에 있어서, TCR이 항원에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 도메인을 추가로 포함하는 이중특이적 TCR인 TCR.
  103. 제102항에 있어서, 항원이 T 세포 특이적 항원인 TCR.
  104. 제102항 또는 제103항에 있어서, 항원이 CD3인 TCR.
  105. 제104항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 항CD3 scFv인 TCR.
  106. (i) T 세포 활성화 분자; (ii) 막횡단 영역; 및 (iii) 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 기재된 적어도 하나의 신생항원성 펩티드, 또는 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 기재된 적어도 하나의 신생항원성 펩티드를 포함하는 MHC-펩티드 복합체에 결합할 수 있는 항원 인식 모이어티를 포함하는 키메라 항원 수용체.
  107. 제106항에 있어서, CD3-제타가 T 세포 활성화 분자인 키메라 항원 수용체.
  108. 제106항 또는 제107항에 있어서, 적어도 하나의 공동자극성 신호전달 도메인을 추가로 포함하는 키메라 항원 수용체.
  109. 제106항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 신호전달 도메인이 CD28, 4-1BB, ICOS, OX40, ITAM, 또는 Fc 엡실론 RI-감마인 키메라 항원 수용체.
  110. 제106항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 인식 모이어티가 MHC 클래스 I 또는 클래스 II와 관련하여 단리된 신생항원성 펩티드에 결합할 수 있는 것인 키메라 항원 수용체.
  111. 제106항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, CD3-제타, CD28, CTLA-4, ICOS, BTLA, KIR, LAG3, CD137, OX40, CD27, CD40L, Tim-3, A2aR, 또는 PD-1 막횡단 영역을 포함하는 것인 키메라 항원 수용체.
  112. 제106항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 신생항원성 펩티드가 종양 연관 폴리펩티드의 세포외 도메인에 위치하는 것인 키메라 항원 수용체.
  113. 제106항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, MHC-펩티드의 MHC가 MHC 클래스 I 또는 클래스 II인 키메라 항원 수용체.
  114. 제100항 내지 제113항 중 어느 한 항의 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체를 포함하는 T 세포로서, 경우에 따라, 상기 T 세포는 헬퍼 또는 세포독성 T 세포인 T 세포.
  115. 제114항에 있어서, T 세포가 피험체의 T 세포인 T 세포.
  116. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 신생항원성 펩티드, 또는 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 신생항원성 펩티드를 포함하는 MHC-펩티드 복합체에 결합할 수 있는 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 T 세포로서, 여기서, T 세포는, T 세포를 활성화시키는 데 충분한 시간 동안 항원 제시 세포, 및 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 신생항원성 펩티드 중 하나 이상의 것과 함께 인큐베이션된, 피험체로부터의 T 세포 집단으로부터 단리된 T 세포인, T 세포.
  117. 제116항에 있어서, T 세포가 CD8+ T 세포, 헬퍼 T 세포, 또는 세포독성 T 세포인 T 세포.
  118. 제116항 또는 제117항에 있어서, 피험체로부터의 T 세포 집단이 피험체로부터의 CD8+ T 세포 집단인 T 세포.
  119. 제116항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 신생항원성 펩티드 중 하나 이상의 것이 피험체 특이적 신생항원성 펩티드인 T 세포.
  120. 제116항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 피험체 특이적 신생항원성 펩티드가 피험체의 종양에 특이적인 에피토프인 상이한 종양 네오에피토프를 갖는 것인 T 세포.
  121. 제116항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 피험체 특이적 신생항원성 펩티드가 피험체의 비종양 샘플 중에는 존재하지 않는 종양 특이적 비침묵 돌연변이의 발현 생성물인 T 세포.
  122. 제116항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 피험체 특이적 신생항원성 펩티드가 피험체의 HLA 단백질에 결합하는 것인 T 세포.
  123. 제116항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 피험체 특이적 신생항원성 펩티드가 500 nM 미만의 IC50으로 피험체의 HLA 단백질에 결합하는 것인 T 세포.
  124. 제116항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화된 CD8+ T 세포가 항원 제시 세포로부터 분리된 것인 T 세포.
  125. 제116항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 제시 세포가 수지상 세포 또는 CD40L 확장된 B 세포인 T 세포.
  126. 제116항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 제시 세포가 비형질전환 세포인 T 세포.
  127. 제116항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 제시 세포가 비감염 세포인 T 세포.
  128. 제116항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 제시 세포가 자가 세포인 T 세포.
  129. 제116항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 제시 세포가 그의 표면으로부터 내인성 MHC 회합 펩티드를 스트리핑하기 위해 처리된 것인 T 세포.
  130. 제129항에 있어서, 내인성 MHC 회합 펩티드를 스트리핑하는 처리가 약 26℃에서 세포를 배양하는 것을 포함하는 것인 T 세포.
  131. 제129항에 있어서, 내인성 MHC 회합 펩티드를 스트리핑하는 처리가 세포를 약산 용액으로 처리하는 것을 포함하는 것인 T 세포.
  132. 제116항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 제시 세포가 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 신생항원성 펩티드로 펄싱된 것인 T 세포.
  133. 제132항에 있어서, 펄싱이 적어도 약 2 ㎍/ml씩의 각각의 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 신생항원성 펩티드의 존재하에서 항원 제시 세포를 인큐베이션하는 것을 포함하는 것인 T 세포.
  134. 제116항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 T 세포 대 항원 제시 세포의 비가 약 30:1 내지 300:1인 T 세포.
  135. 제116항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 T 세포 집단을 인큐베이션하는 것이 IL-2 및 IL-7의 존재하에서 이루어지는 것인 T 세포.
  136. 제116항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, MHC-펩티드의 MHC가 MHC 클래스 I 또는 클래스 II인 T 세포.
  137. (a) 피험체로부터 T 세포 집단을 단리하는 단계; 및
    (b) T 세포를 활성화시키는 데 충분한 시간 동안 상기 단리된 T 세포 집단을 항원 제시 세포, 및 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 신생항원성 펩티드와 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 종양 특이적 T 세포를 활성화시키는 방법.
  138. 제137항에 있어서, T 세포가 CD8+ T 세포, 헬퍼 T 세포, 또는 세포독성 T 세포인 방법.
  139. 제137항 또는 제138항에 있어서, 피험체로부터의 T 세포 집단이 피험체로부터의 CD8+ T 세포 집단인 방법.
  140. 제137항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 신생항원성 펩티드 중 하나 이상의 것이 피험체 특이적 신생항원성 펩티드인 방법.
  141. 제137항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 피험체 특이적 신생항원성 펩티드가 피험체의 종양에 특이적인 에피토프인 상이한 종양 네오에피토프를 갖는 것인 방법.
  142. 제137항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 피험체 특이적 신생항원성 펩티드가 피험체의 비종양 샘플 중에는 존재하지 않는 종양 특이적 비침묵 돌연변이의 발현 생성물인 방법.
  143. 제137항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 피험체 특이적 신생항원성 펩티드가 피험체의 HLA 단백질에 결합하는 것인 방법.
  144. 제137항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 피험체 특이적 신생항원성 펩티드가 500 nM 미만의 IC50으로 피험체의 HLA 단백질에 결합하는 것인 방법.
  145. 제137항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 제시 세포로부터 활성화된 T 세포를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  146. 제137항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 신생항원성 펩티드 중 적어도 하나의 것에 대한 반응성 입증을 위해 활성화된 T 세포를 테스트하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  147. 제137항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 제시 세포가 수지상 세포 또는 CD40L 확장된 B 세포인 방법.
  148. 제137항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 제시 세포가 비형질전환 세포인 방법.
  149. 제137항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 제시 세포가 비감염 세포인 방법.
  150. 제137항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 제시 세포가 자가 세포인 방법.
  151. 제137항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 제시 세포가 그의 표면으로부터 내인성 MHC 회합 펩티드를 스트리핑하기 위해 처리된 것인 방법.
  152. 제151항에 있어서, 내인성 MHC 회합 펩티드를 스트리핑하는 처리가 약 26℃에서 세포를 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
  153. 제151항에 있어서, 내인성 MHC 회합 펩티드를 스트리핑하는 처리가 세포를 약산 용액으로 처리하는 것을 포함하는 것인 방법.
  154. 제137항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 제시 세포가 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 신생항원성 펩티드로 펄싱된 것인 방법.
  155. 제154항에 있어서, 펄싱이 적어도 약 2 ㎍/ml씩의 각각의 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 신생항원성 펩티드의 존재하에서 항원 제시 세포를 인큐베이션하는 것을 포함하는 것인 방법.
  156. 제137항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 T 세포 대 항원 제시 세포의 비가 약 30:1 내지 300:1인 방법.
  157. 제137항 내지 제156항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 T 세포 집단을 인큐베이션하는 것이 IL-2 및 IL-7의 존재하에서 이루어지는 것인 방법.
  158. 제137항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, MHC-펩티드의 MHC가 MHC 클래스 I 또는 클래스 II인 방법.
  159. 제137항 내지 제158항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 활성화된 종양 특이적 T 세포를 포함하는 조성물.
  160. 치료적 유효량의, 제116항 내지 제136항 중 어느 한 항의, 또는 제137항 내지 제158항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 활성화된 종양 특이적 T 세포를 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 피험체의 암을 치료하는 방법.
  161. 제160항에 있어서, 투여가 약 106 내지 1012, 약 108 내지 1011, 또는 약 109 내지 1010개의 활성화된 종양 특이적 T 세포를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  162. 제114항 내지 제161항 중 어느 한 항의 T 세포 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 핵산.
  163. 제162항에 있어서, TCR이 주조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 또는 클래스 II와 관련하여 적어도 하나의 신생항원성 펩티드에 결합할 수 있는 것인 핵산.
  164. 제106항 내지 제113항 중 어느 한 항의 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 핵산.
  165. 제164항에 있어서, 항원 인식 모이어티가 주조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 또는 클래스 II와 관련하여 적어도 하나의 신생항원성 펩티드에 결합할 수 있는 것인 핵산.
  166. 제164항에 있어서, 신생항원성 펩티드가 종양 연관 폴리펩티드의 세포외 도메인에 위치하는 것인 핵산.
  167. 제164항 내지 제166항 중 어느 한 항에 있어서, CD3-제타, CD28, CTLA-4, ICOS, BTLA, KIR, LAG3, CD137, OX40, CD27, CD40L, Tim-3, A2aR, 또는 PD-1 막횡단 영역을 포함하는 것인 핵산.
  168. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 신생항원성 펩티드, 또는 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 신생항원성 펩티드를 포함하는 MHC-펩티드 복합체에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 단편으로서, 경우에 따라, 상기 항체 단편은 이중특이적 T 세포 인게이저(BiTE)인, 항체 또는 항체 단편.
  169. 제168항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 적어도 하나의 신생항원성 펩티드의 세포외 부위에 결합하는 것인 항체 또는 항체 단편.
  170. 제168항 또는 제169항에 있어서,
    (a) 천연 폴리펩티드는 β2M 유전자에 의해 코딩되고, 여기서, Cz는
    Figure pat00077

    (b) 천연 폴리펩티드는 EGFR 유전자에 의해 코딩되고, 여기서, AxByCz는
    Figure pat00078

    (c) 천연 폴리펩티드는 BTK 유전자에 의해 코딩되고, 여기서, AxByCz는
    Figure pat00079

    (d) 천연 폴리펩티드는 ESR1 유전자에 의해 코딩되고, 여기서, AxByCz는
    Figure pat00080

    Figure pat00081

    (e) 천연 폴리펩티드는 HER2 유전자에 의해 코딩되고, 여기서, AxByCz는
    Figure pat00082

    (f) 천연 폴리펩티드는 GATA3 유전자에 의해 코딩되고, 여기서, Cz는
    Figure pat00083

    (g) 제1 천연 폴리펩티드는 TMPRSS2 유전자에 의해 코딩되고, 제2 천연 폴리펩티드는 ERG에 의해 코딩되고, y는 0이고, AxByCz는
    Figure pat00084

    인 항체 또는 항체 단편.
  171. 제168항 내지 제170항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 이중특이적 항체 또는 항체 단편인 항체 또는 항체 단편.
  172. 제171항에 있어서, 이중특이적 항체 또는 항체 단편의 한 항원 결합 도메인이 항CD3 결합 도메인인 항체 또는 항체 단편.
  173. 제162항 내지 제172항 중 어느 한 항의 핵산으로 형질감염 또는 형질도입된 변형된 세포.
  174. 제173항에 있어서, 변형된 세포가 T 세포, 종양 침윤 림프구, NK-T 세포, TCR 발현 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 NK 세포인 변형된 세포.
  175. 제100항 내지 제113항 중 어느 한 항의 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조성물.
  176. 제100항 내지 제113항 중 어느 한 항의 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체를 함유하는 피험체의 자가 T 세포를 포함하는 조성물.
  177. 제175항 또는 제176항에 있어서, 면역 관문 억제제를 추가로 포함하는 조성물.
  178. 제177항에 있어서, 적어도 2종의 면역 관문 억제제를 추가로 포함하는 조성물.
  179. 제177항 또는 제178항에 있어서, 각각의 면역 관문 억제제가 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR, 및 B-7 패밀리 리간드 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 관문 단백질을 억제하는 것인 조성물.
  180. 제177항 또는 제178항에 있어서, 각각의 면역 관문 억제제가 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR, 및 B-7 패밀리 리간드 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 관문 단백질의 리간드와 상호작용하는 것인 조성물.
  181. 제176항 내지 제180항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 PD-1 및/또는 CTLA4 넉아웃 T 세포이고, 경우에 따라, 상기 PD-1 및/또는 CTLA4 넉아웃 T 세포는 CRISPR 시스템을 사용하여 생성된 것인 조성물.
  182. 제175항 내지 제181항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 조절인자 또는 애쥬번트를 추가로 포함하는 조성물.
  183. 제182항에 있어서, 면역 조절인자가 공동자극성 리간드, TNF 리간드, Ig 슈퍼패밀리 리간드, CD28, CD80, CD86, ICOS, CD40L, OX40, CD27, GITR, CD30, DR3, CD69, 또는 4-1BB인 조성물.
  184. 제182항에 있어서, 면역 조절인자가 적어도 하나의 암 세포 또는 암 세포 추출물인 조성물.
  185. 제184항에 있어서, 암 세포가 조성물을 필요로 하는 피험체의 자가 세포인 조성물.
  186. 제185항에 있어서, 암 세포가 용해된 것이거나, 또는 UV 방사선에 노출된 것인 조성물.
  187. 제182항에 있어서, 애쥬번트를 추가로 포함하는 조성물.
  188. 제187항에 있어서, 애쥬번트가 폴리(I:C), 폴리-ICLC, STING 작용제, 1018 ISS, 알루미늄 염, 암플리박스(Amplivax), AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, 이미퀴모드(Imiquimod), ImuFact IMP321, IS 패치, ISS, ISCOMATRIX, JuvImmune, LipoVac, MF59, 모노포스포릴 지질 A, 몬타나이드(Montanide) IMS 1312 VG, 몬타나이드 ISA 206 VG, 몬타나이드 ISA 50 V2, 몬타나이드 ISA 51 VG, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ISA-TLR2 작용제, ONTAK, 펩텔(PepTel)® 벡터 시스템, PLG 마이크로입자, 레시퀴모드, SRL172, 비로좀 및 다른 바이러스 유사 입자, YF-17D, VEGF 트랩, R848, 베타 글루칸, Pam3Cys, Pam3CSK4, 아크릴 또는 메타크릴 중합체, 말레산 무수물의 공중합체, 및 QS21 스티뮬론으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  189. 제187항 또는 제188항에 있어서, 피험체에게 투여되었을 때, 체액성 반응을 유도하는 조성물.
  190. 제189항에 있어서, 피험체에게 투여되었을 때, T 헬퍼 세포 타입 1을 유도하는 조성물.
  191. 종양 특이적 네오에피토프를 발현하는 종양 세포를 제1항 내지 제190항 중 어느 한 항의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 전달 시스템, 벡터, 조성물, 항체, 또는 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 종양 특이적 네오에피토프를 발현하는 종양 세포의 성장을 억제하는 방법.
  192. 피험체의 세포를 제1항 내지 제190항 중 어느 한 항의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 전달 시스템, 벡터, 조성물, 항체, 또는 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 피험체 예방 방법.
  193. 제192항에 있어서,
    (a) 천연 폴리펩티드는 β2M 유전자에 의해 코딩되고, 여기서, Cz는
    Figure pat00085

    (b) 천연 폴리펩티드는 EGFR 유전자에 의해 코딩되고, 여기서, AxByCz는
    Figure pat00086

    (c) 천연 폴리펩티드는 BTK 유전자에 의해 코딩되고, 여기서, AxByCz는
    Figure pat00087

    (d) 천연 폴리펩티드는 ESR1 유전자에 의해 코딩되고, 여기서, AxByCz는
    Figure pat00088

    (e) 천연 폴리펩티드는 HER2 유전자에 의해 코딩되고, 여기서, AxByCz는
    Figure pat00089

    (f) 천연 폴리펩티드는 GATA3 유전자에 의해 코딩되고, 여기서, Cz는
    Figure pat00090

    (g) 제1 천연 폴리펩티드는 TMPRSS2 유전자에 의해 코딩되고, 제2 천연 폴리펩티드는 ERG에 의해 코딩되고, y는 0이고, AxByCz는
    Figure pat00091
    인 방법.
  194. 암 치료를 필요로 하거나, 또는 항종양 반응 개시, 증진, 또는 연장을 필요로 하는 피험체에게 제1항 내지 제190항 중 어느 한 항의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 항체, 또는 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 피험체의 암을 치료하거나, 또는 항종양 반응을 개시, 증진 또는 연장시키는 방법.
  195. 제191항 내지 제194항 중 어느 한 항에 있어서, 피험체가 인간인 방법.
  196. 제195항에 있어서, 피험체가 암을 갖는 것인 방법.
  197. 제196항에 있어서, 암이 비뇨 생식기암, 부인과암, 폐암, 위장관암, 두경부암, 악성 교아세포종, 악성 중피종, 비전이성 또는 전이성 유방암, 악성 흑색종, 메르켈 세포 암종 또는 골 및 연조직 육종, 혈액 신생물, 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골수형성이상 증후군 및 급성 림프아구성 백혈병, 비소세포 폐암(NSCLC), 유방암, 전이성 결장직장암, 호르몬 민감성 또는 호르몬 불응성 전립선암, 결장직장암, 난소암, 간세포 암, 신장 세포 암, 췌장암, 위암, 식도암, 간세포 암, 담관세포암, 두경부 편평세포암, 연조직 육종, 및 소세포 폐암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  198. 제191항 내지 제197항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제190항 중 어느 한 항의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 항체, 또는 세포가 표 1 또는 표 2에 따른 상응하는 암을 치료하는 데 사용하기 위한 것인 방법.
  199. 제191항 내지 제198항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제190항 중 어느 한 항의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 항체, 또는 세포가 표 1 또는 표 2에 따른 상응하는 HLA 타입인 HLA 타입을 갖는 피험체를 치료하는 데 사용하기 위한 것인 방법.
  200. 제191항 내지 제199항 중 어느 한 항에 있어서, 피험체가 종양의 외과적 제거술을 받은 피험체인 방법.
  201. 제191항 내지 제200항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 또는 세포가 정맥내, 복강내, 종양내, 피내, 또는 피하 투여를 통해 투여되는 것인 방법.
  202. 제201항에 있어서, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 또는 세포가 림프절 유역으로 배액되는 해부학적 부위 내로 투여되는 것인 방법.
  203. 제202항에 있어서, 투여가 다중의 림프절 유역으로 이루어지는 것인 방법.
  204. 제191항 내지 제203항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 피하 또는 피내 경로에 의해 이루어지는 것인 방법.
  205. 제201항에 있어서, 펩티드가 투여되는 것인 방법.
  206. 제205항에 있어서, 투여가 종양내로 이루어지는 것인 방법.
  207. 제201항에 있어서, 폴리뉴클레오티드, 경우에 따라, RNA가 투여되는 것인 방법.
  208. 제201항 또는 제207항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 정맥내로 투여되는 것인 방법.
  209. 제201항에 있어서, 세포가 T 세포, 또는 수지상 세포인 방법.
  210. 제201항 또는 제209항에 있어서, 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드가 항원 제시 세포 표적화 모이어티를 포함하는 것인 방법.
  211. 제201항 또는 제209항 또는 제210항에 있어서, 세포가 자가 세포인 방법.
  212. 제191항 내지 제211항 중 어느 한 항에 있어서, 피험체에게 적어도 하나의 면역 관문 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  213. 제212항에 있어서, 관문 억제제가 생물학적 치료제 또는 소분자인 방법.
  214. 제212항 또는 제213항에 있어서, 관문 억제제가 단일클론 항체, 인간화 항체, 완전 인간 항체 및 융합 단백질 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  215. 제212항 내지 제214항 중 어느 한 항에 있어서, 관문 억제제가 PD-1 항체 또는 PD-L1 항체인 방법.
  216. 제212항 내지 제214항 중 어느 한 항에 있어서, 관문 억제제가 이필리무맙, 트레멜리무맙, 니볼루맙, 아벨루맙, 더발루맙, 아테졸리주맙, 펨브롤리주맙, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  217. 제212항 내지 제216항 중 어느 한 항에 있어서, 관문 억제제가 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR, 및 B-7 패밀리 리간드, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 관문 단백질을 억제하는 것인 방법.
  218. 제212항 내지 제217항 중 어느 한 항에 있어서, 관문 억제제가 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR, 및 B-7 패밀리 리간드 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 관문 단백질의 리간드와 상호작용하는 것인 방법.
  219. 제212항 내지 제218항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 관문 억제제가 투여되는 것인 방법.
  220. 제219항에 있어서, 2개 이상의 관문 억제제 중 적어도 하나가 PD-1 항체 또는 PD-L1 항체인 방법.
  221. 제219항에 있어서, 2개 이상의 관문 억제제 중 적어도 하나가 이필리무맙, 트레멜리무맙, 니볼루맙, 아벨루맙, 더발루맙, 아테졸리주맙, 및 펨브롤리주맙으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  222. 제212항 내지 제221항 중 어느 한 항에 있어서, 관문 억제제 및 조성물이 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여되는 것인 방법.
  223. 제222항에 있어서, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 또는 세포가 관문 억제제보다 먼저 투여되는 것인 방법.
  224. 제222항에 있어서, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 또는 세포가 관문 억제제보다 뒤에 투여되는 것인 방법.
  225. 제222항에 있어서, 관문 억제제 투여가 신생항원 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 또는 세포 요법 전 기간에 걸쳐 계속되는 것인 방법.
  226. 제212항 내지 제225항 중 어느 한 항에 있어서, 신생항원 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 또는 세포 요법이, 관문 억제제 요법에 대하여 단지 부분적으로 반응하거나 또는 반응하지 않는 피험체에게 투여되는 것인 방법.
  227. 제191항 내지 제226항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 정맥내로 또는 피하로 투여되는 것인 방법.
  228. 제212항 내지 제227항 중 어느 한 항에 있어서, 관문 억제제가 정맥내로 또는 피하로 투여되는 것인 방법.
  229. 제212항 내지 제228항 중 어느 한 항에 있어서, 관문 억제제가 조성물 투여 부위의 약 2 cm 이내에 피하로 투여되는 것인 방법.
  230. 제229항에 있어서, 조성물이 관문 억제제와 동일한 배액 림프절 내로 투여되는 것인 방법.
  231. 제191항 내지 제230항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 또는 세포로 치료하기 전, 그와 동시에, 또는 그 후에 피험체에게 추가의 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  232. 제231항에 있어서, 추가의 작용제가 화학요법제, 면역조절약, 면역 대사 조절약, 표적화된 요법, 방사선, 항혈관신생제, 또는 면역 억제를 감소시키는 작용제인 방법.
  233. 제232항에 있어서, 화학요법제가 알킬화제, 토포이소머라제 억제제, 대사길항물질, 또는 항유사분열제인 방법.
  234. 제231항에 있어서, 추가의 작용제가 항글루코코르티코이드 유도 종양 괴사 인자 패밀리 수용체(GITR) 작용성 항체 또는 항체 단편, 이브루티닙, 도세탁세올, 시스플라틴, CD40 작용성 항체 또는 항체 단편, IDO 억제제, 또는 사이클로포스파미드인 방법.
  235. 제191항 내지 제234항 중 어느 한 항에 있어서, CD4+ T 세포 면역 반응 또는 CD8+ T 세포 면역 반응을 유도하는 방법.
  236. 제191항 내지 제235항 중 어느 한 항에 있어서, CD4+ T 세포 면역 반응 및 CD8+ T 세포 면역 반응을 유도하는 방법.
  237. 유효량의, 제173항 내지 제190항 중 어느 한 항의 변형된 세포 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 피험체의 면역 반응을 자극하는 방법.
  238. 제237항에 있어서, 면역 반응이 세포독성 및/또는 체액성 면역 반응인 방법.
  239. 제237항에 있어서, 피험체의 T 세포 매개 면역 반응을 자극하는 것인 방법.
  240. 제239항에 있어서, T 세포 매개 면역 반응이 표적 세포에 대한 것인 방법.
  241. 제240항에 있어서, 표적 세포가 종양 세포인 방법.
  242. 제237항 내지 제241항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 세포가 생체내에서 형질감염 또는 형질도입된 것인 방법.
  243. 제237항 내지 제242항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 세포가 생체외에서 형질감염 또는 형질도입된 것인 방법.
  244. 제237항 내지 제243항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 세포가 피험체의 자가 T 세포인 방법.
  245. 제244항에 있어서, 피험체의 자가 T 세포가 신생항원 펩티드 또는 핵산 백신을 투여받은 피험체로부터 얻은 것인 방법.
  246. 제245항에 있어서, 신생항원 펩티드 또는 핵산 백신이 적어도 하나의 개인맞춤형 신생항원을 포함하는 것인 방법.
  247. 제246항에 있어서, 신생항원 펩티드 또는 핵산 백신이 표 1 또는 2에 열거된 적어도 하나의 추가의 신생항원성 펩티드를 포함하는 것인 방법.
  248. 제247항에 있어서, 피험체가 신생항원 펩티드 또는 핵산 백신을 투여받기 전에 및/또는 그 동안에 화학요법제, 면역조절약, 면역 대사 조절약, 표적화된 요법 또는 방사선을 투여받은 것인 방법.
  249. 제237항 내지 제248항 중 어느 한 항에 있어서, 피험체가 적어도 하나의 관문 억제제로 치료를 받는 것인 방법.
  250. 제237항 내지 제249항 중 어느 한 항에 있어서, 자가 T 세포가 신생항원을 함유하는 T 세포 요법을 적어도 1 라운드 이미 받은 피험체로부터 얻은 것인 방법.
  251. 제237항 내지 제250항 중 어느 한 항에 있어서, 입양 T 세포 요법을 추가로 포함하는 방법.
  252. 제251항에 있어서, 입양 T 세포 요법이 자가 T 세포를 포함하는 것인 방법.
  253. 제252항에 있어서, 자가 T 세포가 종양 항원에 대하여 표적화되는 것인 방법.
  254. 제251항 또는 제252항에 있어서, 입양 T 세포 요법이 동종이계 T 세포를 추가로 포함하는 것인 방법.
  255. 제254항에 있어서, 동종이계 T 세포가 종양 항원에 대하여 표적화되는 것인 방법.
  256. 제251항 내지 제255항 중 어느 한 항에 있어서, 입양 T 세포 요법이 관문 억제제보다 먼저, 관문 억제제보다 뒤에, 또는 관문 억제제와 동시에 투여되는 것인 방법.
  257. (i) 변형된 세포를 투여하기 전 피험체로부터 얻은 제1 샘플 중의 표적 세포의 개수 또는 농도를 측정하는 단계, (ii) 변형된 세포를 투여한 후 피험체로부터 얻은 제2 샘플 중의 표적 세포의 개수 또는 농도를 측정하는 단계, 및 (iii) 제1 샘플 중의 표적 세포의 개수 또는 농도와 비교하여 제2 샘플 중의 표적 세포의 개수 또는 농도의 증가 또는 감소를 측정하는 단계를 포함하는, 제173항 내지 제190항 중 어느 한 항의 효능을 평가하는 방법.
  258. 제257항에 있어서, 치료 효능이 임상 결과; T 세포에 의한 항종양 활성의 증가, 증진 또는 연장; 치료 전의 개수와 비교하여 항종양 T 세포 또는 활성화된 T 세포 개수 증가; B 세포 활성; CD4+ T 세포 활성; 또는 이들의 조합을 모니터링함으로써 측정되는 것인 방법.
  259. 제258항에 있어서, 치료 효능이 바이오마커를 모니터링함으로써 측정되는 것인 방법.
  260. 제259항에 있어서, 바이오마커가 CEA, Her-2/neu, 방광 종양 항원, 티로글로불린, 알파-태아단백질, PSA, CA 125, CA19.9, CA 15.3, 렙틴, 프로락틴, 오스테오폰틴, IGF-II, CD98, 파신, sPIgR, 14-3-3 eta, 트로포닌 I, 순환 종양 세포 RNA 또는 DNA, 및 b형 나트륨이뇨 펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  261. 제258항에 있어서, 임상 결과가 종양 퇴행; 종양 수축; 종양 괴사; 면역계에 의한 항종양 반응; 종양 확장, 재발 또는 확산; 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  262. 제258항에 있어서, 치료 효과가 T 세포의 존재에 의해 또는 T 세포 염증을 나타내는 유전자 시그니처의 존재에 의해, 또는 이들의 조합에 의해 예측되는 것인 방법.
  263. 암 치료를 필요로 하거나, 또는 항종양 반응 개시, 증진, 또는 연장을 필요로 하는 피험체에게
    (a) 제1항 내지 제106항 중 어느 한 항의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 항체, 또는 세포; 및
    (b) 적어도 하나의 관문 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 피험체의 암을 치료하거나, 또는 항종양 반응을 개시, 증진 또는 연장시키는 방법.
  264. 제263항에 있어서, 면역 조절인자 또는 애쥬번트 투여를 추가로 포함하는 방법.
  265. 제264항에 있어서, 면역 조절인자 또는 애쥬번트가 폴리(I:C), 폴리-ICLC, STING 작용제, 1018 ISS, 알루미늄 염, 암플리박스, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, 이미퀴모드, ImuFact IMP321, IS 패치, ISS, ISCOMATRIX, JuvImmune, LipoVac, MF59, 모노포스포릴 지질 A, 몬타나이드 IMS 1312 VG, 몬타나이드 ISA 206 VG, 몬타나이드 ISA 50 V2, 몬타나이드 ISA 51 VG, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ISA-TLR2 작용제, ONTAK, 펩텔® 벡터 시스템, PLG 마이크로입자, 레시퀴모드, SRL172, 비로좀 및 다른 바이러스 유사 입자, YF-17D, VEGF 트랩, R848, 베타 글루칸, Pam3Cys, Pam3CSK4, 아크릴 또는 메타크릴 중합체, 말레산 무수물의 공중합체, 및 QS21 스티뮬론, 공동자극성 리간드, TNF 리간드, Ig 슈퍼패밀리 리간드, CD28, CD80, CD86, ICOS, CD40L, OX40, CD27, GITR, CD30, DR3, CD69, 또는 4-1BB로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  266. 제265항에 있어서, 면역 조절인자 또는 애쥬번트가 폴리-ICLC인 방법.
  267. 제263항 내지 제266항 중 어느 한 항에 있어서, 관문 억제제가 항PD1 항체 또는 항체 단편인 방법.
  268. 제267항에 있어서, 항PD1 항체 또는 항체 단편이 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙인 방법.
  269. 제263항 내지 제266항 중 어느 한 항에 있어서, 관문 억제제가 항PD-L1 항체 또는 항체 단편인 방법.
  270. 제267항에 있어서, 항PD-L1 항체 또는 항체 단편이 아벨루맙, 더발루맙 또는 아테졸리주맙인 방법.
  271. 제263항 내지 제266항 중 어느 한 항에 있어서, 관문 억제제가 항CTLA4 항체 또는 항체 단편인 방법.
  272. 제271항에 있어서, 항CTLA4 항체가 이필리무맙 또는 트레멜리무맙인 방법.
  273. 제263항 내지 제272항 중 어느 한 항에 있어서, 항PD1 항체와 항CTLA4 항체 둘 모두를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  274. 제263항 내지 제272항 중 어느 한 항에 있어서, 관문 억제제 투여가 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 항체, 또는 세포 투여 개시 전에 개시되는 것인 방법.
  275. 제263항 내지 제272항 중 어느 한 항에 있어서, 관문 억제제 투여가 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 항체, 또는 세포 투여 개시 후에 개시되는 것인 방법.
  276. 제263항 내지 제272항 중 어느 한 항에 있어서, 관문 억제제 투여가 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 항체, 또는 세포 투여 개시와 동시에 개시되는 것인 방법.
  277. 제263항 내지 제276항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 항체, 또는 세포가 정맥내로 또는 피하로 투여되는 것인 방법.
  278. 제263항 내지 제276항 중 어느 한 항에 있어서, 관문 억제제가 정맥내로 또는 피하로 투여되는 것인 방법.
  279. 제263항 내지 제278항 중 어느 한 항에 있어서, 관문 억제제가 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 항체, 또는 세포 투여 부위의 약 2 cm 이내에 피하로 투여되는 것인 방법.
  280. 제279항에 있어서, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 항체, 또는 세포가 관문 억제제와 동일한 배액 림프절 내로 투여되는 것인 방법.
  281. 제1항 내지 제136항, 제159항, 또는 제168항 내지 제190항 중 어느 한 항의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 항체, 세포, 또는 조성물을 포함하는 키트.
  282. 제191항 내지 제256항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 부신암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 교아세포종, 두경부암, 혐색소형 신세포암, 투명세포형 신세포암, 유두상 신장암, 간암, 폐 선암종, 폐 편평세포암, 난소암, 췌장암, 흑색종, 위암, 자궁체부 자궁내막암, 및 자궁 암육종으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  283. 제191항 내지 제256항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 전립선암, 방광암, 폐 편평세포암, NSCLC, 유방암, 두경부암, 폐 선암종, GBM, 신경교종, CML, AML, 천막상 뇌실막세포종, 급성 전골수구성 백혈병, 고립성 섬유성 종양, 및 크리조티닙 내성 암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  284. 제108항에 있어서, 암이 CRC, 두경부암, 위암, 폐 편평세포암, 폐 선암종, 전립선암, 방광암, 위암, 신세포 암종, 및 자궁암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  285. 제191항 내지 제256항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 흑색종, 폐 편평세포암, DLBCL, 자궁암, 두경부암, 자궁암, 간암, 및 CRC로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  286. 제191항 내지 제256항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 림프계 암; 버킷 림프종, 신경아세포종, 전립선 선암종, 결장직장 선암종; 자궁/자궁내막 선암종; MSI+; 자궁내막 장액성 암종; 자궁내막 암육종-악성 혼합성 중배엽 종양; 신경교종; 성상세포종; GBM, MDS와 연관된 급성 골수성 백혈병; 만성 림프구성 백혈병-소형 림프구성 림프종; 골수형성이상 증후군; 급성 골수성 백혈병; 유방의 루미날 NS 암종; 만성 골수성 백혈병; 췌관 암종; 만성 골수단핵구성 백혈병; 골수섬유증; 골수형성이상 증후군; 전립선 선암종; 본태성 혈소판증가증; 및 수아근아세포종으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  287. 제191항 내지 제256항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 결장직장암, 자궁암, 자궁내막암, 및 위암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  288. 제191항 내지 제256항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 자궁경부암, 두경부암, 항문암, 위암, 버킷 림프종, 및 비인두 암종으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  289. 제191항 내지 제256항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 방광암, 결장직장암, 및 위암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  290. 제191항 내지 제256항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 폐암, CRC, 흑색종, 유방암, NSCLC, 및 CLL로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  291. 제191항 내지 제256항 중 어느 한 항에 있어서, 피험체가 관문 억제제 요법에 대한 부분 반응자 또는 비반응자인 방법.
  292. 제191항 내지 제256항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 방광 요로상피 암종(BLCA), 유방 침습 암종(BRCA), 유방암, 자궁경부 편평세포암종 및 내자궁경부 선암종(CESC), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 결장직장암(CRC), 다형성 교아세포종(GBM), 두경부 편평세포암종(HNSC), 신장 유두상 신세포 암종(KIRP), 간 간세포 암종(LIHC), 폐 선암종(LUAD), 폐 편평세포암 세포 암종(LUSC), 췌장 선암종(PAAD), 전립선암, 피부 흑색종(SKCM), 위 선암종(STAD), 갑상선 선암종(THCA), 및 자궁체부 자궁내막양 암종(UCEC)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  293. 제191항 내지 제256항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 결장직장암, 자궁암, 자궁내막암, 위암, 및 린치 증후군으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  294. 제293항에 있어서, 암이 MSI+ 암인 방법.
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