JP2022521792A - 癌を治療するための免疫療法的併用 - Google Patents

Abstract

対象に個別化新抗原ＤＮＡ癌ワクチンをＴ細胞拡大化合物（「Ｔ細胞拡大剤」）、即ちワクチンエピトープに対する特異的クローンＴ細胞拡大をドライブし得る化合物との併用で、任意選択でさらにチェックポイント阻害剤との併用で投与することにより癌を有する対象を治療するための方法、併用、及び組成物が本明細書に提供される。

Description

関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）のもと、２０１９年２月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／８１１，４５９号明細書；２０１９年３月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／８２５，４８７号明細書；２０１９年４月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／８３８，１８０号明細書及び２０１９年８月１日に出願された米国仮特許出願第６２／８８１，８３２号明細書の優先権の利益を主張するものであり、これらの仮特許出願の内容は参照により本明細書にそれぞれ援用される。

本願は、（特に）免疫療法の分野、特定の態様において癌免疫療法の分野に関し、個体に抗癌ワクチン、例えばＤＮＡ新抗原ワクチンをＴ細胞拡大剤（Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｐａｎｄｅｒ）との併用で、任意選択でさらにチェックポイント阻害剤との併用で投与することによる、癌を有する個体の治療を含む。

癌は、体細胞における遺伝子又はエピジェネティック変更から生じる遺伝障害であり、先進国世界において最も致命的な疾患の１つを表す。ヒトにおける腫瘍発生は、最終的に正常細胞の悪性形質転換をドライブする様々な遺伝子又はエピジェネティック変化を含む多段階プロセスである。悪性腫瘍をもたらす機序の理解は急激な進歩を遂げ続ける一方、癌の発生、成長及び拡散をドライブするプロセスの複雑性により新たな有効な治療の開発が特に困難になる。

癌治療への慣用のアプローチには手術、放射線療法及び慣習的な化学療法が含まれ、それらの各々はそれ自体の周知の利点及び欠点を有する。近年では、癌治療のための代替アプローチとして治療癌ワクチンが探索されている。治療癌ワクチンは、感染及び疾患と闘う対象の免疫系の能力を刺激し、又は回復させることにより機能する物質のクラスを表す。治療ワクチンは、予防（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）又は予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）ワクチンとは対照的に、癌に対する身体の自然免疫応答をブーストすることにより既存の癌を治療するために使用され、免疫療法の１つの種類を表す。癌治療ワクチンは、細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させ、それらを特異的種類の癌を認識し、それに対して作用するように指向し、又は癌細胞の表面上の分子に結合する抗体の産生を誘導するように設計される。このような分子のあるタイプは、腫瘍関連抗原と称され、正常組織中では低レベルで発現されるが、腫瘍組織中ではかなり高いレベルで発現される抗原である。しかしながら、腫瘍関連抗原に結合する有効な治療ワクチンの産生は困難な試みであることが証明されている。それというのも、少なくとも部分的には、ワクチン介入は、癌を持続するように機能する機序により抑止される身体の免疫系を撲滅しなければならないためである。さらに、腫瘍関連抗原ベースワクチンをベースとする治療アプローチは、正常細胞破壊に起因する毒性ももたらし得る。治療癌ワクチンは、有効であるために、意図される標的に対する特異的免疫応答を刺激しなければならないだけでなく、癌細胞がそれら自体をキラーＴ細胞による攻撃から保護するために利用するバリアを克服するために十分に強力でなければならない。直近の数年間にわたり、様々なプラットフォームを包含する治療癌ワクチンの開発における多大な試行が存在している。治療ワクチンは、例えば乳癌、肺癌、黒色腫、膵癌、結腸直腸癌、及び腎癌を有する患者において評価されている（Ｍｅｌｅｒｏ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２０１４，１１（９），５０９－５２４）が、そのような治療抗癌ワクチンの成功は限定されている。

近年、癌を治療するための免疫療法的アプローチは、腫瘍中のランダムな体細胞変異に由来する腫瘍特異的新抗原に対するワクチン接種に拡大している。腫瘍特異的新抗原に対するワクチン接種は、中枢及び末梢性トレランスの潜在的誘導並びに自己免疫のリスクを最小化し得る。

免疫媒介腫瘍制御に関与する機序の知識は急激なペースで成長し続ける一方、免疫療法の診療所への良好な移行は困難なままである。今日まで様々なプラットフォームを包含する治療ワクチンの開発における多大な試行が存在しているが、腫瘍特異的抗原を有効に標的化し、強力でロバストな抗腫瘍応答を提供し得る新たなより有効な免疫療法的アプローチ、例えばワクチン関連治療モダリティを特定及び提供することが依然として必要とされている。従って、本開示はこれらの及び他の必要性に対処しようとするものである。

本開示は、癌を有する対象を治療するための新たな驚くべき有益な免疫療法的アプローチを提供する。より特定すると、癌を有する対象を治療する方法であって、対象に、（ｉ）「新抗原」と称される患者自身の腫瘍特異的抗原からの複数の新エピトープに指向される抗癌ＤＮＡワクチン（「新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチン」）、及び（ｉｉ）Ｔ細胞の産生を刺激／拡大するために有効な化合物（即ちエフェクターＴ細胞、「Ｔ細胞拡大剤」）を投与することを含む方法が本明細書に提供される。

さらにさらなる態様において、本開示は、癌を有する対象を治療する方法であって、対象に、（ｉ）患者自身の腫瘍新抗原からの複数の新エピトープに指向される抗癌ＤＮＡワクチン、（ｉｉ）Ｔ細胞の産生を刺激／拡大するために有効な化合物、及び任意選択で（ｉｉｉ）チェックポイント阻害剤を投与することを含む方法を提供する。

１つ以上の実施形態において、ＤＮＡワクチン中に含まれる新エピトープは免疫系にワクシボディ（本明細書により詳細に記載される）と呼ばれる二量体タンパク質として提示され、即ちそのような実施形態において、ワクチンはワクシボディＤＮＡワクチンと称される。国際公開第２００４／０７６４８９号パンフレットは、ワクシボディと呼ばれる二量体タンパク質を詳細に記載している。標的化ユニット（ワクチン内に含まれ、以下に記載される）は、国際公開第２０１１／１６１２４４号パンフレットに詳細に記載されている。

さらに１つ以上の別の実施形態において、新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチンは（ｉ）標的化ユニット、（ｉｉ）二量体化ユニット、（ｉｉｉ）第１のリンカー及び（ｉｖ）抗原性ユニットをコードするヌクレオチド配列を含む免疫学的有効量のＤＮＡポリヌクレオチドを含み、抗原性ユニットはｎ－１個の抗原性サブユニット（ｎは、約３～５０の整数である）を含み、各々のサブユニットは癌新エピトープ配列の少なくとも一部及び第２のリンカーを含み、最終癌新エピトープ配列をさらに含む。代表的な新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチン、及びそのようなワクチンを作製し、即ち構築し、発現させ、使用する方法は、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１９／００２２２０２号明細書に記載されている。

一部の別の実施形態において、新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチンは、抗原性ユニットをコードするヌクレオチド配列を含む免疫学的有効量のＤＮＡポリヌクレオチドを含む。抗原性ユニットはｎ－１個の抗原性サブユニットを含み、各々のサブユニットは癌新エピトープ配列の少なくとも一部及びリンカーを含み、最終癌新エピトープ配列をさらに含み、ｎは３～５０の整数である。

一部の別の実施形態において、ワクチンは、１０～５０個の新エピトープ、又は１５～４０個の新エピトープ、又は１０～３０個の新エピトープ、又は１０～２０個の新エピトープを含むワクシボディＤＮＡワクチンである。

さらに一部のさらなる実施形態において、ワクチンは、上記の抗原性ユニットをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡポリヌクレオチドを含み、リンカーはアミノ酸リンカーである。例示的なリンカーには、例えばグリシン／セリンリッチリンカーが含まれる。別の例示的なリンカーには、例えば配列番号６７～７６として特定されるリンカーが含まれる。

ＶＢ１０．ＮＥＯ ｐＤＮＡ構築物を含む例示的なマウス新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチンＶＢ４０１１及びＶＢ４０６１が、裏付けの実施例に記載される。

一部のさらなる実施形態において、ワクチンは、ヒトであるＤＮＡポリヌクレオチド配列を含む。さらに一部の別の実施形態において、ワクチンは、図１２に提供されるＤＮＡ ｐＶＢ１０．ＮＥＯプラスミド骨格配列を含む。

さらに一部の別の実施形態において、Ｔ細胞拡大剤は、新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチンとの併用で投与される場合、Ｔ細胞拡大剤の不存在下で新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチンの投与時に達成されるものと比べてワクチンエピトープに対する特異的クローンＴ細胞拡大を添加剤よりも大きい程度に増強するために有効である。

１つ以上の特定の実施形態において、Ｔ細胞拡大剤は、インターロイキン－２（例えばアルデスロイキン、デス－アラニル－１，セリン－１２５ヒトインターロイキン－２）のプロドラッグであり、インターロイキン－２は複数のポリエチレングリコール部分の放出可能な共有結合により修飾されている。さらに１つ以上のさらなる実施形態において、Ｔ細胞拡大剤は、インターロイキン－２受容体ベータ（ＩＬ－２Ｒβ）選択的作動薬である。

さらに一部のさらなる実施形態において、Ｔ細胞拡大剤は、式（Ｉ）

［式中、ＩＬ－２はインターロイキン－２（例えばアルデスロイキンなど）であり、「－ＮＨ－ＩＬ－２」はインターロイキン－２のアミノ基を表し、各々の整数（ｎ）は約２００～３００の値を有する］の化合物又は薬学的に許容可能なその塩形態を含む、ＩＬ－２Ｒβ選択的作動薬組成物、マルチ（２，７－（ビス－メトキシＰＥＧ－カルボキサミド）（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチルＮ－カルバメート）インターロイキン－２（本明細書において「ＲＳＬＡＩＬ－２」とも称される）である。ある実施形態において、ポリエチレングリコール鎖の各々の「ｎ」は約２２７である（即ち中央フルオレニル核から延在する各々のポリエチレングリコール鎖は約１０，０００ダルトンの重量平均分子量を有し、その結果、各々の全体の分枝ＰＥＧ部分の重量平均分子量は約２０，０００ダルトンである）。

さらに一部の別の実施形態において、Ｔ細胞拡大剤は、（２，７－（ビス－メトキシＰＥＧ_10kd－カルボキサミド）（９ｈ－フルオレン－９－イル）メチルＮ－カルバメート）_6avgインターロイキン－２である。

癌が癌性腫瘍を含む方法の１つ以上の実施形態において、腫瘍中の新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチン誘導Ｔ細胞、例えばワクチンコード新抗原の各々に反応性のＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の数は、臨床又は前臨床背景のいずれかにおいて評価する場合、１回以上の用量の新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチン単独の後続の投与時に決定されるそのようなＴ細胞と比べて数において増加する。

一部の実施形態において、癌は固形癌である。

方法のさらに一部の別の実施形態において、癌は例えば特に乳癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、骨癌、結腸直腸癌、胃癌、リンパ腫、悪性黒色腫、肝癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膵癌、甲状腺癌、腎癌、例えば腎細胞癌、胆管の癌、頭頸部の癌、（例えば頭頸部の扁平上皮癌）、脳癌、子宮頸癌、上顎洞癌、膀胱癌（例えば尿路上皮癌）、食道癌、ホジキン病及び副腎皮質癌からなる群から選択される。

一部の別の実施形態において、癌は局所進行又は転移性黒色腫、非小細胞肺癌、淡明腎細胞癌、尿路上皮癌、及び頭頸部の扁平上皮癌から選択される。

１つ以上の別の実施形態において、癌は黒色腫又は結腸癌である。

明確にしておくと、投与順序に関して、新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチン及びＴ細胞拡大剤、並びに任意選択でチェックポイント阻害剤は、同時に又は連続的に、並びに任意の順序で、並びに同一及び／又は異なる投与経路により投与することができる。より特定すると、併用療法の治療成分は、同日、異なる日、又は両方の混合（２つの免疫療法成分を同日に投与し、１つの免疫療法成分を異なる日に投与する）でそれぞれ投与することができる。さらに、治療は単一の治療サイクルを含み得、又は複数のサイクル、例として、新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチン、Ｔ細胞拡大剤、及び任意選択のチェックポイント阻害剤の各々の１回以上の用量を含み得る。治療は単一のサイクル及び複数のサイクルの混合を含み得ることが認識され、例えば新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチン、Ｔ細胞拡大剤、及び任意選択のチェックポイント阻害剤の少なくとも１つを単一のサイクルで投与し、新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチン、Ｔ細胞拡大剤、及び任意選択のチェックポイント阻害剤の１つ以上を複数のサイクルで投与する、などである。

一部の実施形態において、Ｔ細胞拡大剤を新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチンの投与後に投与する。

一部のより特定の実施形態において、Ｔ細胞拡大剤を新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチン誘導期後に投与し、そのような誘導期はワクチンの１回以上の投与、例えば所与の期間にわたる１、２、３、４回以上のワクチン接種に及び得る。一部の実施形態において、誘導期後の時間は１回以上のワクチン接種後の時間であり、その時点で新エピトープ特異的Ｔ細胞応答は実質的に平らになっており、即ち有意に増加していない。例えば１つ以上の実施形態において、そのような時間は新エピトープ特異的Ｔ細胞応答がその最大に達しており、又はその最大の±２５％以内であり、又はその最大の±１５％以内であり、又はその最大の約±１０％以内である時間枠内である。例えばＴ細胞拡大剤は、誘導期間の最後のワクチン接種後の約３～２０日以内、又は誘導期間の最後のワクチン接種後の約３～１５日以内、又は誘導期間の最後のワクチン接種後の約７～２０日以内、例えば約７～１５日以内又は７～１２日以内に投与することができる。さらなる範囲も企図される。一部の実施形態において、Ｔ細胞拡大剤を誘導期間の最後のワクチン投与の少なくとも３日後に投与する。代替様式で計測して、Ｔ細胞拡大剤は、例えば最初に、（１回以上の）ワクチン接種の開始後（即ち誘導期間の１回目のワクチン接種後）の約４～２０週間以内、又は誘導期間の１回目のワクチン接種後の約６～１６週間以内、又は誘導期間の１回目のワクチン接種後の約８～１２週間以内、例えば誘導期間の１回目のワクチン接種の約１１週間後などに投与することができる。

さらに一部の別の実施形態において、投与は、新エピトープ特異的ＤＮＡベース癌ワクチン及びＴ細胞拡大剤の両方のピークＴ細胞応答を整合し、又は実質的に整合し、それにより最適化（好ましくは相乗作用）Ｔ細胞応答を達成するための新エピトープ特異的ＤＮＡベース癌ワクチン及びＴ細胞拡大剤の各々の投与を含む。

一部の別の実施形態において、Ｔ細胞拡大剤を１回以上の用量の新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチンの投与後の一定期間において、例えば１～５回の用量（即ちワクチン接種）後、又は１～４回の用量（ワクチン接種）後、又は１～３回の用量（ワクチン接種）後、又は１～２回の用量（ワクチン接種）後に投与し、例えばそれにより特異的Ｔ細胞応答の増強をもたらす。一部の特定の実施形態において、Ｔ細胞拡大剤を２若しくは３回のワクチン接種又は４回のワクチン接種後に投与する。さらに一部の他の実施形態において、Ｔ細胞拡大剤を４回のワクチン接種後に投与する。さらに一部のより特定の実施形態において、Ｔ細胞拡大剤を誘導期間の最後のワクチン接種の１～２０日後に投与する。例えばＴ細胞を誘導期間の最後のワクチン接種の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０日後に最初に投与する。一部の例において、ワクチン接種期間は４回のワクチン接種を含み、１回目の用量のＴ細胞拡大剤を４回目のワクチン接種の５～１０日後、例えば例えば４回目のワクチン接種の５、６、７、８、９、又は１０日後、例えば７日後に投与する。さらに一部の別の実施形態において、初回用量のＴ細胞拡大剤後、ワクチン及びＴ細胞拡大剤を同日又は異なる日のいずれかで投与する。一部の特定の実施形態において、初回用量のＴ細胞拡大剤後、ワクチン及びＴ細胞拡大剤を同日に投与する。

さらに一部のさらなる実施形態において、上記のワクチン誘導期間は２回以上のワクチン接種を含み、各々の後続のワクチン接種は１回目の投与後１週間、２週間、３週間、又は４週間以上だけ離隔される。一部の別の実施形態において、ワクチン接種誘導期間は４回の別個のワクチン接種を含み、それぞれ１～８週間、又は２～８週間、又は２～６週間、又は３～８週間、又は４～８週間、又は４～６週間だけ離隔される。例えば一部の特定の実施形態において、ワクチンを最初の１、２又は３又は４回の用量については３週間ごとに投与し、次いでより長いワクチン接種間の間隔で、例えば４週間ごと、又は５週間ごと又は６週間ごと、又はそれよりも長い間隔で投与する。

上記に関する一部の実施形態において、チェックポイント阻害剤は、併用療法に含まれる場合、１回又は複数のラウンドで、（ｉ）新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチンを投与する同日、（ｉｉ）Ｔ細胞拡大剤を投与する同日、（ｉｉｉ）新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチンの投与後、（ｉｖ）Ｔ細胞拡大剤の投与後、（ｖ）新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチンの投与後であるが、Ｔ細胞拡大剤の投与前に投与する。治療成分を全て同日に投与する一部の実施形態において、投与の例示的順序は新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチン、Ｔ細胞拡大剤とそれに続くチェックポイント阻害剤である。

さらに一部のさらなる実施形態において、チェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）、例えば抗ＰＤ－１抗体又は他の好適なＣＰＩを治療過程にわたり２回以上投与する。さらに一部の他の別の実施形態において、チェックポイント阻害剤を初回ワクチン接種後及びＴ細胞拡大剤の投与後に初回投与する。さらに一部の他の別の実施形態において、チェックポイント阻害剤を初回ワクチン接種後であるがＴ細胞拡大剤の投与前に初回投与する。

さらに一部の別の実施形態において、チェックポイント阻害剤は、併用療法に含まれる場合、新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチンの１回目のワクチン接種（即ち投与）前及びＴ細胞拡大剤の１回目の投与前に投与する。

例示的なチェックポイント阻害剤には、例えば抗ＰＤ－１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体が含まれる。

さらにさらなる実施形態において、癌は癌性腫瘍を含み、本方法は治療前の腫瘍のサイズと比較する場合、癌性腫瘍のサイズを低下させるために有効である。一部のより特定の実施形態において、癌は癌性腫瘍を含み、本方法は癌性腫瘍のサイズを投与前の腫瘍のサイズと比較する場合、少なくとも３０％だけ（部分奏効）、若しくは少なくとも約４０％だけ、若しくは少なくとも約５０％だけ、若しくは少なくとも約６０％だけ、若しくは少なくとも７０％だけ、若しくは少なくとも約８０％だけ、又は少なくとも９０％だけ低下させ、又は完全腫瘍退縮をもたらすために有効である。方法のさらに一部の別の実施形態において、癌は癌性腫瘍を含み、本方法は完全腫瘍退縮をもたらすために有効である。

さらなる態様及び実施形態は、実施例を含む以下の詳細な説明、及び特許請求の範囲に記載される。

図１は、Ｂ１６からの１０個の新エピトープをコードする例示的なＶＢ１０．ＮＥＯ ｐＤＮＡマウス構築物ＶＢ４０１１（配列番号１）のアミノ酸配列を提供し、各々のペプチドは表２に記載の１０アミノ酸リンカー（ＧＧＧＧＳ）₂（配列番号３３）により離隔される。 図２Ａ～２Ｄは、実施例１に記載のとおり、Ｔ細胞拡大剤、例えばＲＳＬＡＩＬ－２の投与が、Ｂ１６マウス黒色腫モデルにおいて例示的な免疫療法ＤＮＡベース新抗原ワクチンＶＢ１０．ＮＥＯとの併用で投与した場合、新エピトープ特異的ＩＦＮ－γＴ細胞応答をブーストすることを例示する。図２Ａは、対照（ＶＢ１０２６）、ワクチン単独（ＶＢ４０１１）又はＴ細胞拡大剤とワクチンとの併用（ＶＢ４０１１＋ＲＳＬＡＩＬ－２）による治療後のＢ１６腫瘍モデルにおける総Ｔ細胞応答（ＩＦＮ－γ＋スポットの数／１０⁶個の脾細胞）のグラフである。図２Ｂは、対照（ＶＢ１０２６）、ワクチン単独（ＶＢ４０１１）又はＴ細胞拡大剤とワクチンとの併用（ＶＢ４０１１＋ＲＳＬＡＩＬ－２）による治療後のＩＦＮ－γ＋スポットの数／脾臓である脾臓当たりの総Ｔ細胞応答のグラフである。図２Ｃは、対照（ＶＢ１０２６）、ワクチン単独（ＶＢ４０１１）又はＴ細胞拡大剤とワクチンとの併用（ＶＢ４０１１＋ＲＳＬＡＩＬ－２）による治療後のＩＦＮ－γ＋スポットの数／脾臓としての総ＣＤ８＋Ｔ細胞応答（抗ＣＤ４ＡｂコートＤｙｎａｂｅａｄｓを使用してＣＤ４＋Ｔ細胞を枯渇させた脾細胞）のグラフである。図２Ｄは、対照（ＶＢ１０２６）、ワクチン単独（ＶＢ４０１１）又はＴ細胞拡大剤とワクチンとの併用（ＶＢ４０１１＋ＲＳＬＡＩＬ－２）による治療後のＩＦＮ－γ＋スポットの数／脾臓としての総ＣＤ４＋Ｔ細胞応答（抗ＣＤ８ＡｂコートＤｙｎａｂｅａｄｓを使用してＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させた脾細胞）のグラフである。示されるとおり、Ｔ細胞拡大剤はマウス黒色腫モデルにおいてワクチン誘導新エピトープ特異的ＩＦＮ－γＴ細胞応答に相乗作用する。 図３Ａ～３Ｄは、実施例２に記載のとおり、Ｔ細胞拡大剤の投与が、ＣＴ２６マウス結腸癌モデルにおいて例示的な免疫療法ＤＮＡベース新抗原ワクチン、ＶＢ１０．ＮＥＯとの併用で投与した場合、新エピトープ特異的ＩＦＮ－γＴ細胞応答をブーストすることを例示する。図３Ａは、対照（ＶＢ１０２６）、ワクチン単独（ＶＢ４０６１）、Ｔ細胞拡大剤単独（ＲＳＬＡＩＬ－２）、又はＴ細胞拡大剤とワクチンとの併用（ＶＢ４０１１＋ＲＳＬＡＩＬ－２）による治療後のＣＴ２６腫瘍モデルにおける総Ｔ細胞応答（ＩＦＮ－γ＋スポットの数／１０⁶個の脾細胞）のグラフである。図３Ｂは、対照（ＶＢ１０２６）、ワクチン単独（ＶＢ４０６１）、Ｔ細胞拡大剤単独（ＲＳＬＡＩＬ－２）、並びにＴ細胞拡大剤とワクチンとの併用（ＶＢ４０１１＋ＲＳＬＡＩＬ－２）による治療後のＩＦＮ－γ＋スポットの数／脾臓である脾臓当たりの総Ｔ細胞応答のグラフである。図３Ｃは、ＩＦＮ－γ＋スポットの数／脾臓としての対照（ＶＢ１０２６）、ワクチン単独（ＶＢ４０６１）、Ｔ細胞拡大剤単独（ＲＳＬＡＩＬ－２）、又はＴ細胞拡大剤とワクチンとの併用（ＶＢ４０１１＋ＲＳＬＡＩＬ－２）による治療後の総ＣＤ８＋Ｔ細胞応答（抗ＣＤ４ＡｂコートＤｙｎａｂｅａｄｓを使用してＣＤ４＋Ｔ細胞を枯渇させた脾細胞）のグラフである。図３Ｄは、ＩＦＮ－γ＋スポットの数／脾臓としての対照（ＶＢ１０２６）、ワクチン単独（ＶＢ４０６１）、Ｔ細胞拡大剤単独（ＲＳＬＡＩＬ－２）、又はＴ細胞拡大剤とワクチンとの併用（ＶＢ４０１１＋ＲＳＬＡＩＬ－２）による治療後の総ＣＤ４＋Ｔ細胞応答（抗ＣＤ８ＡｂコートＤｙｎａｂｅａｄｓを使用してＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させた脾細胞）のグラフである。示されるとおり、Ｔ細胞拡大剤はマウス結腸癌モデルにおいてワクチン誘導新エピトープ特異的ＩＦＮ－γＴ細胞応答に相乗作用する。 図４Ａ～４Ｄは、実施例３に記載のとおり、Ｔ細胞拡大剤の投与が、ＣＴ２６マウス結腸癌モデルにおいて例示的な免疫療法ＤＮＡベース新抗原ワクチン、ＶＢ４０６１、及び抗ＰＤ－１抗体との併用で投与した場合、新エピトープ特異的ＩＦＮ－γＴ細胞応答をブーストすることを例示する。図４Ａは、ＣＴ２６マウス結腸癌モデルにおけるワクチン単独（ＶＢ４０６１）、ワクチンと抗ＰＤ－１抗体との併用（ＶＢ４０６１＋抗ＰＤ１Ａｂ）、又はワクチンと抗ＰＤ－１抗体とＴ細胞拡大剤との併用（ＶＢ４０６１＋抗ＰＤ１Ａｂ＋ＲＳＬＡＩＬ－２）の投与後のＣＴ２６腫瘍細胞の注射の５～２５日後についての腫瘍容積（ｃｍ³）として示される腫瘍成長のグラフである。図４Ｂは、ワクチン単独（ＶＢ４０６１）、ワクチンと抗ＰＤ－１抗体との併用（ＶＢ４０６１＋抗ＰＤ１Ａｂ）、又はワクチンと抗ＰＤ－１抗体とＴ細胞拡大剤との併用（ＶＢ４０６１＋抗ＰＤ１Ａｂ＋ＲＳＬＡＩＬ－２）の投与後のＣＴ２６腫瘍細胞の注射の０～４９日後についての腫瘍排除マウス（即ち腫瘍を全く樹立しなかったマウス）の割合のグラフである。「腫瘍生着」は、次いで後に退縮し又は排除される腫瘍を樹立したマウスと異なる、腫瘍を全く樹立しなかったマウスを指す。図４Ｃは、ワクチン単独（ＶＢ４０６１）、ワクチンと抗ＰＤ－１抗体との併用（ＶＢ４０６１＋抗ＰＤ１Ａｂ）、又はワクチンと抗ＰＤ－１抗体とＴ細胞拡大剤との併用（ＶＢ４０６１＋抗ＰＤ１Ａｂ＋ＲＳＬＡＩＬ－２）の投与後のＣＴ２６腫瘍細胞の注射の０～８０日後についてのマウスの％生存のグラフである。図４Ｄは、再治療なしの５×１０⁴個のＣＴ２６腫瘍細胞による再チャレンジ後のワクチン単独（ＶＢ４０６１）、ワクチンと抗ＰＤ－１抗体との併用（ＶＢ４０６１＋抗ＰＤ１Ａｂ）、又はワクチンと抗ＰＤ－１抗体とＴ細胞拡大剤との併用（ＶＢ４０６１＋抗ＰＤ１Ａｂ＋ＲＳＬＡＩＬ－２）の投与後のＣＴ２６腫瘍細胞の注射の０～７０日後についての腫瘍排除マウスの割合のグラフである。示されるとおり、個別化されたＤＮＡ抗癌ワクチン及び抗ＰＤ１抗体によりワクチン接種されたマウスにおける腫瘍保護はＴ細胞拡大剤の投与によりさらに強化される。 図５Ａ～５Ｃは、実施例１にさらに記載される抗癌ワクチンの１回以上の投与後に延期されたＴ細胞拡大剤の投与の結果を提供する。図５Ａは、１日目に投与された対照（ＶＢ１０２６）、ワクチン単独（ＶＢ４０１１）、又は抗癌ワクチンの１１日後若しくは１４日後に投与されたＴ細胞拡大剤とワクチンとの併用（ＶＢ４０１１＋ＲＳＬＡＩＬ－２）による治療後のＢ１６腫瘍モデルにおける総Ｔ細胞応答（ＩＦＮ－γ＋のスポットの数／脾臓）のグラフである。Ｔ細胞応答を、抗癌ワクチンの１４、１８又は２１日後、及びＴ細胞拡大剤の投与の７日後に分析した。最適な応答は、Ｔ細胞拡大剤を抗癌ワクチンの１１日後に投与した場合に観察された（最大Ｔ細胞応答を矢印により示す）。 図５Ａ～５Ｃは、実施例１にさらに記載される抗癌ワクチンの１回以上の投与後に延期されたＴ細胞拡大剤の投与の結果を提供する。図５Ｂは、１及び２１日目の対照（ＶＢ１０２６）、ワクチン単独（ＶＢ４０６１）並びに２１日目（２回目のワクチン接種と同日）又は２４日目（２回目のワクチン接種の３日後）に投与されたＴ細胞拡大剤とワクチンとの併用（ＶＢ４０６１＋ＲＳＬＡＩＬ－２）による治療後のＣＴ２６腫瘍モデルにおける総Ｔ細胞応答（ＩＦＮ－γ＋スポットの数／脾臓）のグラフである。ＥＬＩＳｐｏｔをＲＳＬＡＩＬ－２の投与の７日後に実施した（例えば２１＋７又は２４＋７）。図中の日数は、脾細胞をＥＬＩＳｐｏｔにおいて分析した日を指す。（ワクチンを１日目に投与する）。ＶＢ４０６１＋ＲＳＬＡＩＬ－２ ２１日目については、ワクチン及びＲＳＬＡＩＬ－２（２回目の用量）の両方の投与を同日に行った。ＶＢ４０６１＋ＲＳＬＡＩＬ－２ ２８日目については、ＲＳＬＡＩＬ－２をワクチンの２回目の投与（２１日目）の３日後（２４日目）に投与した。 図５Ａ～５Ｃは、実施例１にさらに記載される抗癌ワクチンの１回以上の投与後に延期されたＴ細胞拡大剤の投与の結果を提供する。図５Ｃは、対照の３回の投与（３×ＶＢ１０２６）、ワクチン単独の３回の投与（３×Ｖａｃ）、ワクチンの３回の投与と３回目のワクチンと同日のＴ細胞拡大剤の投与（３×ＶＡＣ＋ＲＳＬＡＩＬ－２ ３５日目）、及びワクチンの３回の投与と３回目のワクチン用量の３日後のＴ細胞拡大剤の投与（３×ＶＡＣ＋ＲＳＬＡＩＬ－２）による治療後のＢ１６腫瘍モデルにおける総Ｔ細胞応答（ＩＦＮ－γ＋スポットの数／脾臓）のグラフである。この図面は、ＲＳＬＡＩＬ－２を３回目のワクチン接種と同程度に遅く投与する場合、同日と延期された３日間との間の差が存在しないことを示す。Ｔ細胞拡大剤の延期投与は、特異的Ｔ細胞応答に相乗作用すると考えられる。 図６Ａ～６Ｃは、実施例３に記載のとおり、Ｔ細胞拡大剤の１回目の投与時の腫瘍負荷が応答（腫瘍成長の低下）を予測すると考えられることを示す。図６Ａ～６Ｃは腫瘍長さ（ｍｍ）のグラフを提供し、ＣＴ２６マウス結腸癌モデルにおいて１回目の投与における腫瘍負荷が１～５ｍｍ（図６Ａ）、６～１０ｍｍ（図６Ｂ）、又は＞１０ｍｍ（図６Ｃ）である時から開始してＴ細胞拡大剤を０、９、１８、２７日目（点線）に投与した。マウスをさらにワクチンＶＢ４０６１＋抗ＰＤ－１抗体（赤色、緑色及び青色凡例）、又はＶＢ４０６１＋抗ＰＤ－１単独（黒色凡例）により治療した。図６Ａ及び６Ｃの桃色線は３２日目のＲＳＬＡＩＬ－２に対応する。完全奏効は、Ｔ細胞拡大剤の１回目の投与時に腫瘍サイズが＜６ｍｍであったマウスにおいてより多数観察された。 図６Ａ～６Ｃは、実施例３に記載のとおり、Ｔ細胞拡大剤の１回目の投与時の腫瘍負荷が応答（腫瘍成長の低下）を予測すると考えられることを示す。図６Ａ～６Ｃは腫瘍長さ（ｍｍ）のグラフを提供し、ＣＴ２６マウス結腸癌モデルにおいて１回目の投与における腫瘍負荷が１～５ｍｍ（図６Ａ）、６～１０ｍｍ（図６Ｂ）、又は＞１０ｍｍ（図６Ｃ）である時から開始してＴ細胞拡大剤を０、９、１８、２７日目（点線）に投与した。マウスをさらにワクチンＶＢ４０６１＋抗ＰＤ－１抗体（赤色、緑色及び青色凡例）、又はＶＢ４０６１＋抗ＰＤ－１単独（黒色凡例）により治療した。図６Ａ及び６Ｃの桃色線は３２日目のＲＳＬＡＩＬ－２に対応する。完全奏効は、Ｔ細胞拡大剤の１回目の投与時に腫瘍サイズが＜６ｍｍであったマウスにおいてより多数観察された。 図６Ａ～６Ｃは、実施例３に記載のとおり、Ｔ細胞拡大剤の１回目の投与時の腫瘍負荷が応答（腫瘍成長の低下）を予測すると考えられることを示す。図６Ａ～６Ｃは腫瘍長さ（ｍｍ）のグラフを提供し、ＣＴ２６マウス結腸癌モデルにおいて１回目の投与における腫瘍負荷が１～５ｍｍ（図６Ａ）、６～１０ｍｍ（図６Ｂ）、又は＞１０ｍｍ（図６Ｃ）である時から開始してＴ細胞拡大剤を０、９、１８、２７日目（点線）に投与した。マウスをさらにワクチンＶＢ４０６１＋抗ＰＤ－１抗体（赤色、緑色及び青色凡例）、又はＶＢ４０６１＋抗ＰＤ－１単独（黒色凡例）により治療した。図６Ａ及び６Ｃの桃色線は３２日目のＲＳＬＡＩＬ－２に対応する。完全奏効は、Ｔ細胞拡大剤の１回目の投与時に腫瘍サイズが＜６ｍｍであったマウスにおいてより多数観察された。 図７Ａ～７Ｂは、実施例３に記載のとおり、Ｔ細胞拡大剤の投与が、ＣＴ２６マウス結腸癌モデルにおいて例示的な免疫療法ＤＮＡベース新抗原ワクチン、ＶＢ４０６１、及び抗ＰＤ－１抗体との併用で投与した場合、比較的小さい腫瘍の急速な完全及び長時間持続退縮並びにより大きい腫瘍の長時間持続安定化を提供することを例示する。図７Ａは、対照としてのＣＴ２６腫瘍細胞の注射の０～４２日後についての腫瘍長さ（ｍｍ）として示される腫瘍成長のグラフである。図７Ｂは、ＣＴ２６マウス結腸癌モデルにおけるワクチン（ＶＢ４０６１）、抗ＰＤ－１抗体、及びＴ細胞拡大剤の併用の投与後のＣＴ２６腫瘍細胞の注射の０～５６日後についての腫瘍長さ（ｍｍ）として示される腫瘍成長のグラフである。各々のグラフの線１～１０は期間にわたる個々のマウス（ｎ＝１０）の腫瘍長さを表す。 図８は、ＣＴ２６からの２０個の新エピトープをコードするＶＢ１０．ＮＥＯ ｐＤＮＡマウス構築物、ＶＢ４０６１（配列番号２）のアミノ酸配列を提供し、各々のペプチドは表２に記載の１０アミノ酸グリシン／セリンリッチリンカー（ＧＧＧＧＳ）₂により離隔される。 図９は、ＶＢ４０６１マウス構築物中に含まれるＣＴ２６からの個々の新エピトープのアミノ酸配列（配列番号３～２２）を提供する。 図１０は、ＶＢ４０１１マウス構築物中に含まれるＢ１６からの個々の新エピトープのアミノ酸配列（配列番号２３～３２）を提供する。 図１１Ａ～Ｄは、実施例４に記載の臨床試験全体にわたり実施される投与及び評価の概要を提供する。 図１１Ａ～Ｄは、実施例４に記載の臨床試験全体にわたり実施される投与及び評価の概要を提供する。 図１１Ａ～Ｄは、実施例４に記載の臨床試験全体にわたり実施される投与及び評価の概要を提供する。 図１１Ａ～Ｄは、実施例４に記載の臨床試験全体にわたり実施される投与及び評価の概要を提供する。 図１２は、発現産物（配列番号７７）の標的化モジュール（ｈＭＩＰ－１α、ヌクレオチド１１４３～１４２１）及び二量体化モジュール（ｈＩｇＧ３のｈ１及びｈ４並びにＣ_H３ドメイン、ヌクレオチド１４２２～１８５３）のコード配列を含む完全ｐＶＢ１０．ＮＥＯプラスミド骨格配列を提供する。灰色ブロックは、内部ＳｆｉＩクローニング部位（ヌクレオチド１８５４～１８６６及び１８６９～１８８１）である。イタリック配列は、フランキングＮｏｔＩ／ＢｇｌＩＩ制限部位（ヌクレオチド１８８４～１８８９）である。下線が付された配列は、グリシン／セリンリッチリンカー（ヌクレオチド１５０３～１５３２及び１８５４～１８６８）である。ヌクレオチドナンバリングは、新抗原性モジュールヌクレオチドを含まない）。 図１３は、ｐＶＢ１０．ＮＥＯプラスミドマップを提供する。

本開示は、（特に）免疫療法の分野、特定の態様において癌免疫療法の分野に関し、一般に、患者に個別化新抗原ＤＮＡ癌ワクチンをＴ細胞拡大化合物（「Ｔ細胞拡大剤」）、即ちワクチンエピトープに対する特異的クローンＴ細胞拡大をドライブし得る化合物との併用で、任意選択でさらにチェックポイント阻害剤との併用で投与することによる、癌を有する患者の治療を含む。

定義
本開示のある特徴を記載し、及び特許請求するにあたり、特に記載のない限り以下に記載する定義に従い以下の用語を使用する。

本明細書で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈上特に明確に指示されない限り複数の指示対象が含まれる。

範囲又は下位範囲の参照は、開示範囲の任意の２つのメンバーにより形成される下位範囲を明示的に引用することを意味する。例えば２０～５０、又は１０～３０と記載される範囲は、それにより１０～２０、２０～３０、１０～５０、３０～５０などの範囲を明示的に含む。

「実質的に」又は「本質的に」とは、ほぼ全体的に又は完全に、例えばある所与の分量の約９５％以上を意味する。

同様に、「約」又は「ほぼ」は、本明細書で使用されるとき、所与の分量のプラス又はマイナス５％を意味する。

語「～を含む」を用いて本明細書に記載されるどの態様についても、「～からなる」及び／又は「本質的に～からなる」に関して記載される他の類似の態様も提供されることを理解すべきである。

「ＰＥＧ」又は「ポリエチレングリコール」は、本明細書で使用されるとき、任意の水溶性ポリ（エチレンオキシド）を包含することが意図される。特に指示されない限り、「ＰＥＧポリマー」又はポリエチレングリコールは、実質的に全ての（好ましくは全ての）単量体サブユニットがエチレンオキシドサブユニットであるものであり、しかしながらポリマーは、例えばコンジュゲーション用に、個別のエンドキャッピング部分又は官能基を含有してもよい。本明細書に記載される部分で使用されるＰＥＧポリマーは、１つ以上の末端酸素が例えば合成変換中に置換されたか否かに応じて、典型的に以下の２つの構造のうちの一方を含み得る：「－（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n－」又は「－（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n-1ＣＨ₂ＣＨ₂－」。前述のとおり、ＰＥＧベースポリマー又はＰＥＧベースポリマーコンジュゲートについては、変量（ｎ）は典型的には約３～４０００の範囲内に収まり、末端基及びＰＥＧ全体の構造は様々であり得る。Ｔ細胞拡大剤、例えば式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）に関するＲＳＬＡＩＬ－２（以下により詳細に記載）についての（ｎ）の好ましい範囲／値には、約２００～３００が含まれ、約２２７である。（ｎ）についてのさらなる例示的な範囲は、約２５０ダルトン～約９０，０００ダルトンの範囲の全体重量平均分子量を有する分枝状ポリマー、例えば式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）に提供されるものを提供するために好適なものである。（ｎ）についてのさらなる例示的な範囲は、約１，０００ダルトン～約６０，０００ダルトンから選択される範囲、約５，０００ダルトン～約６０，０００ダルトンの範囲、約１０，０００ダルトン～約５５，０００ダルトンの範囲、約１５，０００ダルトン～約５０，０００ダルトンの範囲、及び約２０，０００ダルトン～約５０，０００ダルトンの範囲の全体重量平均分子量を有する分枝状ポリマー、例えば式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）に提供されるものを提供するために好適なものである。

ポリマー－コンジュゲートの一部を任意選択で形成するポリマーの幾何学的配置又は全体構造に関して「分枝状」は、分岐点又は中央構造特徴部から延在する２つ以上のポリマー「アーム」又は「鎖」を有するポリマーを指す。一部の実施形態において、分枝状ポリマーは、中央構造特徴部から出る２つのポリマーアーム又は鎖を含む。

例えば活性部分、例えばインターロイキン－２（例えばアルデスロイキン）に共有結合しているポリエチレングリコールの文脈における「放出可能な」共有結合は、生理学的条件下で、任意の好適な放出機序により放出し、それにより活性部分からポリエチレングリコールポリマーを放出し、又は脱離させるものである。

水溶性ポリマー、例えばＰＥＧに関する分子量は、数平均分子量又は重量平均分子量のいずれかとして表現することができる。特に示されない限り、本明細書の分子量への全ての言及は重量平均分子量を指す。分子量決定の両方、数平均及び重量平均は、ゲル浸透クロマトグラフィー又は他の液体クロマトグラフィー技術を使用して計測することができる。分子量値を計測する他の方法、例えば数平均分子量を決定するための末端基分析の使用若しくは束一性特性（例えば凝固点降下、沸点上昇、又は浸透圧）の計測又は重量平均分子量を決定するための光散乱技術、超遠心、若しくは粘度測定を使用することもできる。ＰＥＧポリマーは、典型的には、多分散性（即ちポリマーの数平均分子量及び重量平均分子量は等しくない）であり、好ましくは約１．２未満、より好ましくは約１．１５未満、いっそうより好ましくは約１．１０未満、さらによりいっそうより好ましくは約１．０５未満、最も好ましくは約１．０３未満の低多分散性値を有する。

用語「タンパク質」、「ポリペプチド」及び「ペプチド」は、本明細書において互換的に使用され、長さ、同時翻訳、又は翻訳後修飾にかかわらずアミノ酸の任意のペプチド結合鎖を指す。

「薬学的に許容可能な賦形剤」又は「薬学的に許容可能な担体」は、本明細書に記載される組成物中に含まれ得る成分であって、対象に重大な有害毒性効果を引き起こさない成分を指す。

用語「患者」、又は「対象」は、本明細書で使用されるとき、本明細書に提供されるとおりの化合物又は組成物又は併用の投与により予防又は治療することのできる病態、例えば癌に罹患している又はそれに罹り易い生物を指し、ヒト及び動物の両方が含まれる。対象には、限定されるものではないが、哺乳動物（例えばマウス、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）が含まれ、好ましくはヒトである。

「投与」は、当業者に公知の様々な方法及び送達系のいずれかを使用する対象への治療剤の送達を指す。例示的な投与経路には、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、脊髄又は、例えば注射若しくは点滴による他の非経口投与経路が含まれる。語句「非経口投与」は、本明細書で使用されるとき、通常、注射による腸内及び局所投与以外の投与方式を意味し、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、リンパ管内、病変内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外及び胸骨内注射及び点滴、同様にインビボエレクトロポレーションが含まれる。治療剤は、非経口でない経路、又は経口経路により投与することができる。他の非経口でない経路には、局所、表皮又は粘膜投与経路、例えば鼻腔内、経膣、経直腸、舌下又は局所投与経路が含まれる。１つ以上の治療剤の投与は、治療剤の各々について例えば１回、複数回、及び／又は１つ以上の延長期間にわたり実施することもできる。

「癌」は、体内の異常細胞の制御されない成長により特徴付けられる様々な疾患の広範なグループを指す。「癌」又は「癌組織」には腫瘍が含まれ、本明細書で使用されるとき、固形腫瘍及び体液、例えば血液中に見出される腫瘍細胞の両方が包含され、転移性癌が含まれる。調節されない細胞分裂及び成長は悪性腫瘍の形成をもたらし、それは隣接組織に進入し得、さらにリンパ系又は血流を通じて身体の遠位部分に転移し得る。転移後、遠位腫瘍は転移前腫瘍「に由来する」と言うことができる。

用語「免疫療法」は、免疫応答を誘導し、増強し、抑制し、又はそうでなければ改変することを含む方法による対象の治療を指す。

用語「腫瘍新抗原」は、宿主のエキソームと比較して１つ以上の突然変異を含む任意の腫瘍特異的抗原を記載するために使用され、本明細書において用語「癌新抗原」と同義的に使用される。

用語「腫瘍新エピトープ」は、腫瘍抗原中の任意の免疫原性突然変異について使用され、本明細書において用語「癌新エピトープ」と同義的に使用される。

「腫瘍新エピトープ配列」は、本明細書で使用されるとき、抗原性サブユニット中の新エピトープを含む配列であり、用語「癌新エピトープ配列」と同義的に使用される。

本明細書で使用されるとき、「複数」は、所与の項目の３つ以上を指す。

用語「治療抗癌ワクチン」及び「治療癌ワクチン」は、患者中に既に存在する腫瘍細胞の破壊又はその数の低下に使用されるワクチンを記載するために同義的に使用される。

治療剤の「治療有効量」又は「治療有効投与量」は、単独で、又は別の治療剤との併用で使用する場合、例えば、癌などの疾患の発症から対象を保護する、又は病状の重症度の減少、無症状期間の頻度及び持続期間の増加、若しくは疾患の苦痛に起因する障害若しくは不能の予防により証明される疾患退縮を促進することなどに効果的な、薬剤の任意の量である。例えば疾患退縮を促進する治療剤の能力は、例えば臨床試験中のヒト対象における、ヒトにおける有効性を予測する動物モデル系における当業者に公知の種々の方法を使用して、又はインビトロアッセイにおける薬剤の活性をアッセイすることにより評価することができる。例えば、関連する実施例を参照されたい。

用語「実質的に相同」又は「実質的に同一」は、特定の対象配列、例えば突然変異配列が参照配列から１つ以上の置換、欠失、又は付加だけ異なり、その正味効果は参照配列と対象配列との間の有害な機能的非類似性をもたらさないことを意味する。本明細書における目的上、所与の配列に対して９５パーセントより高い相同性（同一性）、等価な生物学的活性（必須ではないが等価な生物学的活性強度）、及び等価な発現特性を有する配列が、実質的に相同（同一）と見なされる。相同性の決定の目的上、成熟配列のトランケーションは無視しなければならない。

ポリペプチド及びポリヌクレオチド配列比較に関して、語句「少なくとも８０％の配列同一性」を本明細書において使用することができる。この表現は、各々の参照ポリペプチドに対して又は各々の参照ポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を指す。好ましくは、当該ポリペプチド及び参照ポリペプチドは、２０、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００以上のアミノ酸の連続ストレッチにわたり又は参照ポリペプチドの全長にわたり示される配列同一性を示す。好ましくは、当該ポリヌクレオチド及び参照ポリヌクレオチドは、６０、９０、１２０、１３５、１５０、１８０、２１０、２４０、２７０、３００以上のヌクレオチドの連続ストレッチにわたり又は参照ポリペプチドの全長にわたり示される配列同一性を示す。

概要
現在の抗癌ワクチン方針に伴う欠点の少なくとも一部、例えば癌性腫瘍自体によるＴ細胞成長能の抑制に起因する弱い免疫応答などに対処する試行において、個別化新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチン及びＴ細胞拡大剤、即ちワクチンエピトープに対する特異的クローンＴ細胞拡大をドライブするために有効な実体の投与をベースとする併用免疫療法的方法が本明細書に提供される。

ＩＬ－２は、アルファ（ＩＬ２Ｒα、ＣＤ２５）、ベータ（ＩＬ２Ｒβ、ＣＤ１２２）及び共通のガンマ鎖受容体（γ_c’ＣＤ１３２）を含有する受容体シグナリング複合体を通じて免疫細胞増殖及び活性化を刺激する。高用量において、ＩＬ－２はヘテロ二量体ＩＬ２Ｒβγ受容体に結合し、腫瘍殺傷ＣＤ８＋メモリーエフェクターＴ（ＣＤ８Ｔ）細胞の所望の拡大をもたらす。しかしながら、ＩＬ－２はそのヘテロ三量体ＩＬ２Ｒαβγにもより大きい親和性で結合し、それが免疫抑制ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を拡大し、それが癌免疫療法についての不所望の効果をもたらし得る。従って、ＩＬ－２ベース抗癌ワクチン接種方針に関連する１つ以上の欠点を克服するために試みにおいて、腫瘍特異的抗原に対する新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチンと、Ｔ細胞拡大剤の投与とを併用する治療モダリティが本明細書に提供される。１つ以上の好ましい実施形態において、Ｔ細胞拡大剤は、ＩＬ－２Ｒαβバイアス作動薬である。理論により拘束されるものではないが、免疫抑制Ｔｒｅｇの活性化を担うＩＬ２Ｒαサブユニットと相互作用する領域をマスクする（即ちその活性を抑制し、又は減衰させる）長時間作用型ＩＬ－２化合物、例えばＲＳＬＡＩＬ－２を任意選択でさらにチェックポイント阻害剤との併用で利用することにより、ワクチン接種誘導エピトープ特異的Ｔ細胞応答を拡大して優れた治療有効性を達成することができることが発見され、それは本開示及び裏付けの実施例から明らかになる。

ワクチン
本明細書に提供される治療方法は、癌を有する患者を治療するために（ｉ）ワクチン、即ち腫瘍新抗原からの複数の新エピトープに指向される抗癌ＤＮＡワクチン（「新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチン」）、及び（ｉｉ）Ｔ細胞の産生を刺激／拡大するために有効な化合物（即ちエフェクターＴ細胞、「Ｔ細胞拡大剤」）を、任意選択でチェックポイント阻害剤との併用で投与することを含む。

本明細書に提供される組成物、併用、及び方法は、特に臨床及び前臨床用途の両方において使用される。癌の樹立インビボモデルにおいて実施された裏付けの前臨床実施例において実証されるとおり、新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチンとの併用での、任意選択でさらにチェックポイント阻害剤との併用でのＴ細胞拡大剤、例えばＲＳＬＡＩＬ－２の投与は、対象におけるワクチンコード新抗原に対するＴ細胞応答を有意に拡大／増強するために有効であり、それにより癌の撲滅のための強力な新抗原にフォーカスする免疫応答を提供する。

より特定すると、添付の実施例に記載の前臨床試験は、例示的なＴ細胞拡大剤、ＲＳＬＡＩＬ－２との併用で投与される例示的な新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチン、ＶＢ１０．ＮＥＯの併用が、新エピトープ特異的Ｔ細胞応答を相乗作用的にブーストし、ＶＢ１０．ＮＥＯ単独と比較して新エピトープ特異的Ｔ細胞応答の数の５倍増加をもたらすと考えられることを例示する。Ｔ細胞拡大剤、ＲＳＬＡＩＬ－２との併用のＶＢ１０．ＮＥＯにより治療されたマウスは、各々の新エピトープに対する及び増加した新エピトープの数に対するより強力な応答の両方を示し、併用療法の結果として免疫応答の幅及び深さの両方が上昇することを実証した。ＶＢ１０．ＮＥＯ及びＲＳＬＡＩＬ－２の併用は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答に対するかなり大きい効果を産生した。それというのも、その併用が単独で投与される場合の免疫療法剤のいずれかと比較して多くの新エピトープに対する新エピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発し、強力な新エピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導する併用の能力をさらに強化したためである。治療腫瘍モデルにおいて、ＶＢ１０．ＮＥＯ、ＲＳＬＡＩＬ－２及び抗ＰＤ－１抗体の例示的な３剤免疫療法的併用（個別化新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチン、Ｔ細胞拡大剤、及び任意選択でチェックポイント阻害剤の投与を含む併用療法の代表例として）により治療されたマウスにおいて完全レスポンダーの数の増加が観察され、そのような試薬を併用し、それにより免疫療法の非重複機序を活性化させ、樹立腫瘍の有効な治療を作出する利点をさらに実証した。

本明細書に提供される方法における使用に好適な治療抗癌新エピトープワクチンは、その調製及び使用を記載する方法とともに、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１９／００２２２０２号明細書に記載されている。簡潔に述べると、治療新エピトープワクチンは、腫瘍新抗原からの複数の新エピトープに指向される抗癌ＤＮＡワクチンである。個別化ＤＮＡワクチン中に含まれる新エピトープは、免疫系にワクシボディと呼ばれる二量体タンパク質として提示される。ワクシボディと呼ばれる二量体タンパク質は、参照により本明細書に援用される国際公開第２００４／０７６４８９号パンフレットに詳細に記載されている。

例えば新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチンは、少なくとも（ｉ）標的化ユニット（標的化モジュールとも称される）、（ｉｉ）二量体化ユニット（二量体化モジュールとも称される）、（ｉｉｉ）第１のリンカー及び（ｉｖ）抗原性ユニット（抗原性モジュールとも称される）をコードするヌクレオチド配列を含む免疫学的有効量のＤＮＡポリヌクレオチドを含み得、抗原性ユニットはｎ－１個の抗原性サブユニットを含み；ｎは３～５０の整数である。各々の抗原性サブユニットは、癌新エピトープ配列の少なくとも一部及び第２のリンカーを含む。さらに、抗原性ユニットは最終癌新エピトープ配列をさらに含む。

本方法における使用に好適なワクチンは、新抗原に対するＴ細胞の活性化を通じて細胞媒介免疫応答を誘発するように設計される。Ｔ細胞は、それらがプロセシングされ、ＭＨＣ分子に複合体化されて提示された場合に新エピトープを認識する。

好ましくは、新抗原ワクチンは、３つのユニット、即ち標的化ユニット（又はモジュール）、二量体化ユニット（又はモジュール）及び抗原性ユニット（又はモジュール）を含むポリペプチドをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを含む。二量体化ユニットに起因して、ポリペプチドはワクシボディと呼ばれる二量体タンパク質を形成する。３つのユニットをコードする遺伝子は、１つの遺伝子として発現されるように遺伝子操作される。ポリペプチド／二量体タンパク質は、インビボ発現される場合、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を標的化し、それは同一の非標的化抗原と比較して増強したワクチン有効性をもたらす。例えば異なる機能エレメントを例示する例示的なプラスミドマップを提供する図１３参照。

本明細書に記載のワクチンにおいて、抗原性ユニットは抗原性サブユニットを含み、各々のサブユニットは癌新エピトープ配列又は癌新エピトープ配列の少なくとも一部を含む。新エピトープ配列は、腫瘍ＤＮＡ（又はＲＮＡ）をシーケンシングし、新抗原を表す腫瘍特異的突然変異を同定することにより得られる。結果として、同定された腫瘍抗原を特異的に標的化する個別化新抗原ワクチンが得られる。

一部の実施形態において、治療抗癌新エピトープワクチンは、（ｉ）標的化ユニット、（ｉｉ）二量体化ユニット、（ｉｉｉ）第１のリンカー、（ｉｖ）抗原性ユニットをコードするヌクレオチド配列を含む免疫学的有効量のポリヌクレオチドを含み、抗原性ユニットはｎ－１個の抗原性サブユニットを含み、各々のサブユニットは癌新エピトープ配列の少なくとも一部及び第２のリンカーを含み、抗原性ユニットは最終癌新エピトープ配列をさらに含み、ｎは３～５０の整数である。従って、この実施形態において、ワクチンはｎ個の新エピトープ又は新エピトープ配列及びｎ－１個の第２のリンカーを含み、ｎは３～５０の整数である（さらなる例示的な下位範囲が以下に提供される）。

抗原性ユニットは複数の腫瘍新エピトープを含み、各々の新エピトープは規定の患者における腫瘍新抗原中で同定される突然変異に対応する。即ち全ての選択される新抗原は個々の患者についてユニーク且つ特異的である。突然変異は、少なくとも１つのアミノ酸の変化をもたらす任意の突然変異であり得る。例えば突然変異は、以下の１つであり得る：アミノ酸の変化をもたらす非同義突然変異、フレームシフトをもたらし、それにより突然変異後に方向の完全に異なるオープンリーディングフレームをもたらす突然変異、終止コドンが改変又は欠失され、腫瘍特異的新エピトープを有するより長いタンパク質をもたらすリードスルー突然変異、ユニーク腫瘍特異的タンパク質配列をもたらすスプライス突然変異、２つのタンパク質の接合部における腫瘍特異的新エピトープを有するキメラタンパク質を生じさせる染色体再配列。

抗原性ユニットにおいて、最後の腫瘍新エピトープを除く全てが抗原性サブユニット中で配列され、各々のサブユニットは腫瘍新エピトープ配列及び第２のリンカーからなる一方、最後のサブユニットは新エピトープのみを含み、即ち第２のリンカーを含まない。第２のリンカーによる腫瘍新エピトープ配列の離隔に起因して、各々の新エピトープは免疫系に最適な方式で提示される。

癌新エピトープ配列は、好ましくは、ＭＨＣ分子による提示に好適な長さを有する。従って、好ましい実施形態において、癌新エピトープは７～３０アミノ酸長である。７～１０アミノ酸の長さを有する癌新エピトープ配列又は１３～３０アミノ酸、例えば２０～３０アミノ酸の長さを有する、例えば２７アミノ酸を含む癌新エピトープ配列がより好ましい。好ましくは、複数の異なる新エピトープが抗原性ユニット中に含まれる。従って、好ましいアプローチは、ワクチン中に可能な限り多くの新エピトープを含め、それにより腫瘍を効率的に攻撃する一方、所望のＴ細胞効果の希釈に起因して新エピトープに対するＴ細胞を活性化させるワクチンの能力を減衰させないことである。さらに、全ての新エピトープが同一の抗原提示細胞に効率的に負荷されることを確保するため、新エピトープは区別されるペプチドではなく１つのアミノ酸鎖として配列される。

ワクチンを調製するため、腫瘍エキソームを分析して新抗原を同定し、最も抗原性の新エピトープを選択する。一般に、少なくとも３つの新エピトープ、好ましくは少なくとも５つの新エピトープ、より好ましくは少なくとも７つの新エピトープ、例えば少なくとも１０個の新エピトープなどをワクチン中に取り込んで実質的に全ての腫瘍細胞を効率的に標的化することができる。

より好ましくは、ワクチンは、少なくとも１０個の新エピトープを含む。別の好ましい実施形態において、ワクチンは、少なくとも１５個の新エピトープ、例えば少なくとも２０個の新エピトープを含む。例えばワクチンは、３～５０個の新エピトープ、又は３～３０個の新エピトープ、又は３～２０個の新エピトープ、又は３～１５個の新エピトープ、例えば３～１０個の新エピトープを含み得、結果的に、ｎは、好ましくは３～５０、例えば３～３０、例えば５～２５、例えば３～２０、例えば３～１５、例えば３～１０の整数である。一部の好ましい実施形態において、ワクチンは、１０～２０個の新エピトープを含む。

抗原性ユニットは、例えば各々の癌新エピトープの１つのコピーを含み得、その結果、１０個の新エピトープがワクチン中に含まれる場合、１０個の異なる新エピトープに対する細胞媒介免疫応答が誘発され得る。或いは、しかしながら数個の関連抗原性突然変異が同定されるに過ぎない場合、抗原性ユニットは新エピトープに対する免疫応答を強化するために少なくとも１つの新エピトープの少なくとも２つのコピーを含み得る。

抗原性ユニットの長さは、主に、抗原性ユニット中に配列される新エピトープの長さ及び新エピトープの数により決定され、例えば約２１～１５００、好ましくは約３０アミノ酸～約１０００アミノ酸、より好ましくは約５０～約５００アミノ酸、例えば約１００～約４００アミノ酸、約１００～約３００アミノ酸である。

新エピトープは、免疫応答を増強するために下記のとおり抗原性ユニット中で並べることができる。例えば選択される新エピトープに応じて、抗原性サブユニットは、第１のリンカーから最終新エピトープに向かう方向で大きい抗原性から小さい抗原性の順序で配列することができる。或いは、特に親水性／疎水性が新エピトープ間で大幅に異なる場合、最も疎水性の抗原性サブユニットは抗原性ユニットの中央に実質的に位置され、最も親水性の抗原性サブユニットは抗原性ユニットの開始及び／又は終了時に位置されることが好ましい。或いは、新エピトープは、親水性及び疎水性新エピトープ間で交互に配列することができる。好ましくは、ＧＣリッチ新エピトープは間隔が空いており、その結果、ＧＣクラスタが回避され、好ましくは、ＧＣリッチ新エピトープは少なくとも１つのサブユニットにより間隔が空いている。

第２のリンカーは非免疫原性であるように設計され、好ましくはフレキシブルリンカーでもあり、それにより腫瘍新エピトープは、抗原性ユニット中に存在する多数の抗原性サブユニットにかかわらず、Ｔ細胞に最適な様式で提示される。好ましくは、第２のリンカーの長さは、フレキシビリティを確保するために４～２０アミノ酸である。別の好ましい実施形態において、第２のリンカーの長さは８～２０アミノ酸、例えば８～１５アミノ酸、例えば８～１２アミノ酸又は例えば１０～１５アミノ酸などである。特定の実施形態において、第２のリンカーの長さは１０アミノ酸である。

例えば具体的な実施形態において、ワクチンは、１０個の新エピトープを含む新エピトープ抗原性ユニットを含むタンパク質をコードし、第２のリンカーは、８～２０アミノ酸、８～１５アミノ酸、例えば８～１２アミノ酸又は例えば１０～１５アミノ酸などの長さを有する。特定の実施形態において、ワクチンは、１０個の新エピトープを含む新エピトープ抗原性ユニットを含むタンパク質をコードし、第２のリンカーは、１０アミノ酸の長さを有する。

さらにさらなる例示的な例において、ＤＮＡワクチンは、各々２７アミノ酸の１０～２０個の新エピトープを含む新エピトープ抗原性ユニットを含むタンパク質をコードし、第２のリンカーは１０アミノ酸の長さを有する。

第２のリンカーは、好ましくは、全ての抗原性ユニットにおいて同一である。しかしながら、新エピトープの１つ以上がリンカーに類似するアミノ酸モチーフを含む場合、隣接する第２のリンカーを異なる配列の第２のリンカーにより置換することが有利であり得る。さらに、新エピトープ－第２のリンカー接合部がそれ自体でエピトープを構成することが予測される場合、異なる配列の第２のリンカーを使用することができる。第２のリンカーは、好ましくは、セリン－グリシンリッチリンカー、例えばフレキシブルＧＧＧＧＳ（配列番号３４）リンカー、例えばＧＧＧＳＳ（配列番号３５）、ＧＧＧＳＧ（配列番号３６）、ＧＧＧＧＳ（配列番号３４）など又はその複数のバリアント、例えばＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３３）又は（ＧＧＧＧＳ）_m、（ＧＧＧＳＳ）_m、（ＧＧＧＳＧ）_mであり、ｍは１～５（例えば１、２、３、４、又は５）、１～４又は１～３の整数である。一部の好ましい実施形態において、ｍは２である。一部の他の好ましい実施形態において、セリン－グリシンリンカーは、少なくとも１つのロイシン（Ｌ）、例えば少なくとも２つ又は少なくとも３つのロイシンをさらに含む。セリン－グリシンリンカーは、例えば１、２、３又は４つのロイシンを含み得る。一部の例において、セリン－グリシンリンカーは、１つのロイシン又は２つのロイシンを含む。

第２のリンカーの例には以下が含まれる：例えば第２のリンカーは配列ＬＧＧＧＳ（配列番号３７）、ＧＬＧＧＳ（配列番号３８）、ＧＧＬＧＳ（配列番号３９）、ＧＧＧＬＳ（配列番号４０）若しくはＧＧＧＧＬ（配列番号４１）を含み、若しくはそれからなり得；或いは、第２のリンカーは配列ＬＧＧＳＧ（配列番号４２）、ＧＬＧＳＧ（配列番号４３）、ＧＧＬＳＧ（配列番号４４）、ＧＧＧＬＧ（配列番号４５）若しくはＧＧＧＳＬ（配列番号４６）を含み、若しくはそれからなり得；又は第２のリンカーは配列ＬＧＧＳＳ（配列番号４７）、ＧＬＧＳＳ（配列番号４８）、ＧＧＬＳＳ（配列番号４９）、ＧＧＧＬＳ（配列番号５０）若しくはＧＧＧＳＬ（配列番号５１）を含み、若しくはそれからなり得る。別の例として、第２のリンカーは配列ＬＧＬＧＳ（配列番号５２）、ＧＬＧＬＳ（配列番号５３）、ＧＬＬＧＳ（配列番号５４）、ＬＧＧＬＳ（配列番号５５）若しくはＧＬＧＧＬ（配列番号５６）を含み、若しくはそれからなり得、又は配列ＬＧＬＳＧ（配列番号５７）、ＧＬＬＳＧ（配列番号５８）、ＧＧＬＳＬ（配列番号５９）、ＧＧＬＬＧ（配列番号６０）若しくはＧＬＧＳＬ（配列番号６１）を含み、若しくはそれからなり得、又は配列ＬＧＬＳＳ（配列番号６２）、ＧＬＧＬＳ（配列番号６３）、ＧＧＬＬＳ（配列番号６４）、若しくはＧＬＧＳＬ（配列番号６５）を含み、若しくはそれからなり得る。

新エピトープを離隔する新エピトープ抗原性ユニットにおける使用のためのさらなる例示的な第２のリンカーには、セリン－グリシンリッチリンカー、例えば以下のものが含まれる：ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号６７）、ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号６８）、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号６９）、ＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号７０）、ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＳ（配列番号７１）、ＳＧＧＧＳＳＧＧＧＳ（配列番号７２）、ＳＳＧＧＧＳＳＧＧＧ（配列番号７３）、ＧＳＳＧＧＧＳＳＧＧ（配列番号７４）、ＧＧＳＳＧＧＧＳＳＧ（配列番号７５）、及びＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ（配列番号７６）。一部の好ましい実施形態において、第２のリンカーは、配列番号６７～配列番号７６のリンカーから選択される。一部の他の実施形態において、第２のリンカーは、配列番号６７～配列番号７６のリンカーから選択され、優先順序は配列番号６７のリンカーが配列番号６８のリンカーよりも好ましい、などである。上記のとおり、リンカーは、様々な個別化ワクチンのための構築物ごとに変化し得る。それというのも、構築物のための新エピトープ抗原性ユニットのアセンブルにおいて、接合配列が評価されるためである。結果として、第１の好ましいリンカーは、ヒトプロテオーム中に見出される配列に類似する接合エピトープを除外する別の候補リンカーにより置き換えることができる。好ましいセリン／グリシン－リッチリンカー、例えば１０アミノ酸リンカーは、６～９つのグリシン（例えば６、７、８又は９つ）、又は６～８つのグリシンを含有する。一部の好ましい実施形態において、リンカー中に含有される残りの非グリシンアミノ酸は、セリンである。

第２のリンカーについての別の例示的な配列は、米国特許出願公開第２０１９／００２２２０２号明細書に記載されている。

好ましいワクチンの例には、１０アミノ酸リンカーにより離隔される少なくとも１０個の新エピトープを含むもの、又は１０アミノ酸リンカーにより離隔される少なくとも１５個の新エピトープ、例えば１０アミノ酸リンカーにより離隔される少なくとも２０個の新エピトープを含むものが含まれる。

用語「標的化ユニット」は、本明細書で使用されるとき、ポリペプチド／タンパク質をその抗原とともに、ＣＤ４＋Ｔ細胞へのＭＨＣクラスＩＩ拘束提示のために、又はＭＨＣクラスＩ拘束によるＣＤ８＋Ｔ細胞への交差提示を提供するために抗原提示細胞に送達するユニットを指す。標的化ユニットは二量体化タンパク質を通じて抗原性ユニットにつながれており、抗原性ユニットはポリペプチド／二量体タンパク質のＣＯＯＨ末端又はＮＨ₂末端のいずれかに存在する。抗原性ユニットは、ポリペプチド／二量体タンパク質のＣＯＯＨ末端に存在することが好ましい。標的化ユニットは、ポリペプチド／二量体化タンパク質を、関連抗原提示細胞上で発現される表面分子、例えば樹状細胞（ＤＣ）のサブセット上でもっぱら発現される分子に標的化するように設計される。

ＡＰＣ上のこのような標的表面分子の例は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、分化抗原群１４（ＣＤ１４）、分化抗原群４０（ＣＤ４０）、ケモカイン受容体及びＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）である。ＨＬＡは、ヒトにおける主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）である。Ｔｏｌｌ様受容体には、例えばＴＬＲ－２、ＴＬＲ－４及び／又はＴＬＲ－５が含まれ得る。ポリペプチド／二量体タンパク質は、ＣＤ１４、ＣＤ４０、若しくはＴｏｌｌ様受容体；リガンド、例えば可溶性ＣＤ４０リガンド；天然リガンド、例えばケモカイン、例えばＲＡＮＴＥＳ若しくはＭＩＰ－１ａ；又は細菌抗原、例えばフラジェリンなどについての特異性を有する例えば抗体結合領域を含む標的化ユニットによりそのような表面分子に標的化させることができる。

例示的な標的化ユニットは、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質についての親和性を有する。従って、一実施形態において、標的化ユニットをコードするヌクレオチド配列は、抗ＨＬＡ－ＤＰ、抗ＨＬＡ－ＤＲ及び抗ＨＬＡ－ＩＩからなる群から選択されるＭＨＣクラスＩＩタンパク質についての特異性を有する抗体可変ドメイン（ＶＬ及びＶＨ）をコードする。或いは、標的化ユニットは、ＣＤ４０、ＴＬＲ－２、ＴＬＲ－４及びＴＬＲ－５からなる群から選択される表面分子についての親和性を有する。従って、一実施形態において、標的化ユニットをコードするヌクレオチド配列は、抗ＣＤ４０、抗ＴＬＲ－２、抗ＴＬＲ－４及び抗ＴＬＲ－５についての特異性を有する抗体可変ドメイン（ＶＬ及びＶＨ）をコードする。一実施形態において、標的化ユニットをコードするヌクレオチド配列は、ＴＬＲ－５についての親和性を有するフラジェリンをコードする。好ましくは、標的化ユニットは、ＣＣＲ１、ＣＣＲ３及びＣＣＲ５から選択されるケモカイン受容体についての親和性を有する。より好ましくは、標的化ユニットをコードするヌクレオチド配列は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の細胞表面上で発現される同族受容体、ＣＣＲ１、ＣＣＲ３及びＣＣＲ５に結合するヒトケモカインマクロファージ炎症性タンパク質－１アルファ、ｈＭＩＰ－１α（ＬＤ７８ベータ）をコードする。例えば図１２参照、それはそこで特定される標的化ユニットを有するＶＢ１０．ＮＥＯタンパク質をコードするヌクレオチド配列（例えばヌクレオチド１１４３～１４２１参照）を含む。

用語「二量体化ユニット」は、本明細書において使用されるとき、抗原性ユニットと標的化ユニットとの間のアミノ酸の配列を指す。従って、二量体化ユニットは、抗原性ユニット及び標的化ユニットをつなぐように機能し、２つの単量体ポリペプチドの二量体タンパク質への二量体化を容易にする。さらに、二量体化ユニットは、それらが変動距離において局在する場合でも、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の表面分子への標的化ユニットの最適な結合を可能とするためのポリペプチド／二量体タンパク質におけるフレキシビリティも提供する。二量体化ユニットは、それらの要求を満たす任意のユニットであり得る。

用語「ヒンジ領域」は、二量体化を容易にする二量体タンパク質のペプチド配列を指す。ヒンジ領域は、それらが変動距離で発現される場合でも、２つの標的化ユニットがＡＰＣ上の２つの標的分子に同時に結合するのを可能とするユニット間のフレキシブルスペーサーとして機能する。ヒンジ領域は、Ｉｇ由来、例えばＩｇＧ３由来であり得る。ヒンジ領域は、共有結合、例えばジスルフィド架橋の形成を通じて二量体化に寄与し得る。従って、一実施形態において、ヒンジ領域は、１つ以上の共有結合を形成する能力を有する。共有結合は、例えばジスルフィド架橋であり得る。

好ましい実施形態において、二量体化ユニットは、第３のリンカーを通じてヒトＩｇＧ３のＣＨ３ドメインに連結されたヒンジエキソンｈ１及びｈ４からなる。例えば図１２、及びそれにおいて特定される例示的な二量体化ユニット（ｈＩｇＧ３のｈ１及びｈ４並びにＣ_H３ドメイン、ヌクレオチド１４２２～１８５３）参照。

二量体化ユニットは、抗原性ユニット及び標的化ユニットに関して任意の配向性を有し得る。一実施形態において、抗原性ユニットは二量体化ユニットのＣＯＯＨ末端に存在し、標的化ユニットは二量体化ユニットのＮ末端に存在する。別の実施形態において、抗原性ユニットは二量体化ユニットのＮ末端に存在し、標的化ユニットは二量体化ユニットのＣＯＯＨ末端に存在する。抗原性ユニットは、二量体化ユニットのＣＯＯＨ末端に存在することが好ましい。

抗原性ユニット及び二量体化ユニットは、好ましくは、第１のリンカーを通じて連結している。第１のリンカーは、ポリヌクレオチドの構築を容易にするための制限部位を含み得る。一部の例において、第１のリンカーは、ＧＬＧＧＬ（配列番号５６）リンカー又はＧＬＳＧＬ（配列番号６６）リンカーであることが好ましい。

ポリヌクレオチドは、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含み得る。シグナルペプチドは、ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの分泌を前記ポリヌクレオチドにより形質移入された細胞中で可能とするように構築される。任意の好適なシグナルペプチドを使用することができる。好適なペプチドの例は、ＩｇＶＨシグナルペプチド、ヒトＴＰＡシグナルペプチド、及びシグナルペプチドである。

ポリヌクレオチド配列に関して、ポリヌクレオチドは、典型的にはＤＮＡヌクレオチド配列を二本鎖又は一本鎖のいずれかで含む。好ましくは、ポリヌクレオチドは、所望の種がポリペプチドを発現するように最適化され、即ちポリヌクレオチド配列は、ヒトコドン最適化されていることが好ましい。

ＶＢ１０．ＮＥＯ ｐＤＮＡ構築物を含む例示的なマウス新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチン、ＶＢ４０１１及びＶＢ４０６１は、裏付けの実施例に記載される。さらに、例示的なヒト新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチンは、実施例４に記載される。例示的なｐＶＢ１０．ＮＥＯプラスミドマップは、図１３に示される。

ワクチンは、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、アジュバント又は緩衝液をさらに含み得る。薬学的に許容可能な担体、希釈剤、及び緩衝液には、限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、無菌等張水性緩衝剤及びそれらの組み合わせが含まれる。

特に、ポリヌクレオチドを含むワクチンについて、担体は、細胞の形質移入を容易にする分子及びアジュバントを含み得、免疫応答を増強するためのケモカイン又はサイトカインをコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドを含み得る。

ワクチンは、任意の好適な製剤、例えば皮内又は筋肉内注射のための液体製剤に製剤化することができる。ワクチンは、ポリペプチド／タンパク質ワクチン又はポリヌクレオチドワクチンのいずれかのための任意の好適な方式で投与することができ、例えば皮内、筋肉内、皮下注射により、又は粘膜若しくは上皮適用により、例えば鼻腔内、経口、経腸若しくは膀胱に投与することができる。ワクチンがポリヌクレオチドワクチンである場合、ワクチンは、好ましくは筋肉内又は皮内投与される。一部の実施形態において、ワクチンは、節内注射により投与される。本明細書で使用されるとき、用語「節内注射」は、ワクチンをリンパ節中に注射することを意味する。

Ｔ細胞拡大剤
本明細書に記載の治療併用、方法などは、Ｔ細胞拡大剤を含む。上記のとおり、Ｔ細胞拡大剤は、Ｔ細胞の産生を刺激／拡大するために有効な化合物又は組成物である。好ましくは、Ｔ細胞拡大剤は、新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチンとの併用で投与される場合、ワクチンエピトープに対する特異的クローンＴ細胞拡大を増強するために有効である。好ましくは、Ｔ細胞拡大剤は、Ｔ細胞拡大剤の不存在下で新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチンの投与時に達成されるものと比べてワクチンエピトープに対する特異的クローンＴ細胞拡大を添加剤よりも大きい程度に増強するために有効であり、併用はこれに関して限定されない。いっそうより好ましくは、Ｔ細胞拡大剤は、Ｔ細胞拡大剤の不存在下で新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチンの投与時に達成されるものと比べて相乗作用様式でワクチンエピトープに対する特異的クローンＴ細胞拡大を増強するために有効である。

例示的なＴ細胞拡大剤には、インターロイキン－２（例えばアルデスロイキン）、インターロイキン－１５、及びインターフェロン－α、及び抗ＣＤ３抗体、例えばＯＫＴ３などが含まれる。１つ以上の特定の実施形態において、Ｔ細胞拡大剤は、インターロイキン－２（例えばアルデスロイキン、化学名、デス－アラニル－１，セリン－１２５ヒトインターロイキン－２）のプロドラッグであり、インターロイキン－２は複数のポリエチレングリコール部分の放出可能な共有結合により修飾されている。一部の特定の実施形態において、プロドラッグは、本質的には投与時に不活性であり、投与後、ポリエチレングリコール部分がゆっくりと放出されて生物活性種が提供され、それにより免疫系の過剰刺激が回避される。１つ以上のポリエチレングリコール部分の共有結合により修飾されているインターロイキン－２部分のコンジュゲートは、例えば米国特許第９，８６１，７０５号明細書に記載されている。

さらに１つ以上の特定の実施形態において、Ｔ細胞拡大剤は、例えば米国特許第１０，１０１，５８７号明細書に記載され、それにおいてＲＳＬＡＩＬ－２と一般に称されるインターロイキン－２受容体ベータ（ＩＬ－２Ｒβ）選択的作動薬である。

ＲＳＬＡＩＬ－２中に含まれる放出可能ＰＥＧは、下記のとおりの２，７，９置換フルオレンをベースとし、ポリ（エチレングリコール）鎖は、フルオレン環上の２及び７位からアミド結合（フルオレン－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－）、及びフルオレン環の９位にメチレン基（－ＣＨ₂－）により結合しているカルバメート窒素原子への結合によるインターロイキン－２への放出可能な共有結合により延在している。これに関連して、一部の実施形態において、Ｔ細胞拡大剤は、以下の式：

［式中、ＩＬ－２はインターロイキン－２であり、各々の「ｎ」は約３～約４０００の整数であり、又はより好ましくは約２００～３００の整数である］により包含される化合物、又は薬学的に許容可能なその塩を含む組成物である。上記組成物は、一般にＲＳＬＡＩＬ－２又はマルチ（２，７－（ビス－メトキシＰＥＧ－カルボキサミド）（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチルＮ－カルバメート）インターロイキン－２と称される。上記式に関して、ＲＳＬＡＩＬ－２は、ＩＬ－２のアミノ基に放出可能に共有結合している上記のとおりの４、５又は６つの分枝状ＰＥＧ部分、即ち２，７－（ビス－メトキシＰＥＧ－カルボキサミド）（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチルＮ－カルバメート部分を有する式（Ｉ）により包含される化合物を含む組成物である。ある好ましい実施形態において、ポリエチレングリコール鎖の各々の「ｎ」は平均約２２７の値を有し（即ち中央フルオレニル核から延在する各々のポリエチレングリコール鎖は約１０，０００ダルトンの重量平均分子量を有し、その結果、分枝状ＰＥＧ部分全体の重量平均分子量は約２０，０００ダルトンである）、即ちより特定すると本明細書においてマルチ（２，７－（ビス－メトキシＰＥＧ_10kD－カルボキサミド）（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチルＮ－カルバメート）インターロイキン－２又は（２，７－（ビス－メトキシＰＥＧ_10kD－カルボキサミド）（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチルＮ－カルバメート）_4-6インターロイキン－２と称される。１つ以上の実施形態において、ポリエチレングリコール鎖の各々の「ｎ」の値は実質的に同一であり、即ち例えば中央フルオレニル核から延在する２つのＰＥＧ鎖は実質的に同一の重量平均分子量を有する。

上記の実施形態に関して、マルチ（２，７－（ビス－メトキシＰＥＧ－カルボキサミド）（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチルＮ－カルバメート）インターロイキン－２は、以下の式：

により包含される化合物を含み、分枝状ＰＥＧ部分中に含まれる各々のポリエチレン鎖の平均分子量は約１０，０００ダルトンであり、その結果、各々の分枝状ＰＥＧ部分の全分子量は約２０，０００ダルトンである。

他の関連実施形態において、マルチ（２，７－（ビス－メトキシＰＥＧ－カルボキサミド）（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチルＮ－カルバメート）インターロイキン－２は、以下の式：

により包含される化合物を含み、示されるとおりのＩＬ－２部分に放出可能に共有結合している構造を有する分枝状ＰＥＧ部分の平均数は６であり、即ち（２，７－（ビス－メトキシＰＥＧ_10kd－カルボキサミド）（９ｈ－フルオレン－９－イル）メチルＮ－カルバメート）_6avgインターロイキン－２であり、一部の例において名称「ＲＳＬＡＩＬ－２」（放出可能ＩＬ－２）内に収まるとしても言及される。式（Ｉ）、（ＩＩ）、及び（ＩＩＩ）により包含されるＴ細胞拡大剤化合物及び組成物は、一般に「ＲＳＬＡＩＬ－２」と命名される。

ＲＳＬＡＩＬ－２に含まれる１つ又は複数の放出可能ＰＥＧ部分は、２，７，９置換フルオレンをベースとし、ポリ（エチレングリコール）鎖は、フルオレン環の２及び７位アミド結合（フルオレン－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－）により延在して分枝状ＰＥＧを提供する。フルオレニルベース分枝状ＰＥＧ部分は、インターロイキン－２部分のアミノ基に放出可能に共有結合している。インターロイキン－２アミノ基とフルオレニルベース分枝状ＰＥＧ部分との間の結合は、フルオレン環の９位にメチレン基（－ＣＨ₂－）により結合しているカルバメート結合である。この一般構造を有する放出可能なＰＥＧは、典型的には生理学的条件下でβ脱離反応を受けてＩＬ－２に共有結合しているＰＥＧ部分をゆっくりと放出する。ＰＥＧ部分は投与後に連続的に放出することが考えられる。

１つ以上の実施形態において、ＩＬ－２Ｒβバイアス作動薬組成物、ＲＳＬＡＩＬ－２は、以下の式：

［式中、ＩＬ－２はインターロイキン－２（例えばアルデスロイキン）であり、「ｍ」（ＩＬ－２に結合している分枝状ポリエチレングリコール部分の数を指す］は１、２、３、７及び＞７からなる群から選択される整数である）により包含される化合物；又は薬学的に許容可能なその塩を１０％以下（モル量基準）、好ましくは５％以下（モル量基準）含有する。

一部の実施形態において、例えば式（Ｉ）又は式（ＩＩ）に関して、ＩＬ－２Ｒβバイアス作動薬は、放出可能に結合している平均約６つの分枝状ポリエチレングリコール部分を有する。例えば式（ＩＩＩ）参照。一部の別の特定の実施形態において、例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）に関して、ＩＬ－２Ｒβ選択的作動薬は、一般に、不活性プロドラッグ、即ち投与時に不活性であると見なされ、投与後のインビボでのポリエチレングリコール部分の徐放により、最初に投与されるコンジュゲートよりも少数の結合ＰＥＧ部分を有するインターロイキン－２の活性コンジュゲート形態を提供する。

本明細書に提供されるとき、「マルチ（２，７－（ビス－メトキシＰＥＧ－カルボキサミド）（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチルＮ－カルバメート）インターロイキン－２」又は「ＲＳＬＡＩＬ－２」への言及は、式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）のいずれか１つ以上に関して式（ＩＶ）により包含される組成物を含め、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、及び／又は式（ＩＩＩ）に記載の化合物及び組成物の包含を明示的に意図する。

本明細書に記載されるとき、ＲＳＬＡＩＬ－２は、ＩＬ－２Ｒβバイアス（即ち選択的）作動薬であると見なされる。例えば添付の実施例に言及されるＲＳＬＡＩＬ－２は、ＩＬ－２と比べてＩＬ－２Ｒαβへの親和性の約６０倍の低下を呈するが、ＩＬ－２Ｒβへの親和性はＩＬ－２と比べて約５倍の低下に過ぎない。例えばＩＬ－２Ｒα及びＩＬ－２ＲβへのＲＳＬＡＩＬ－２の結合親和性を記載する国際公開第２０１８／１３２４９６号パンフレットの実施例２０参照。

例えば上記の式に記載される組成物についての平均ＰＥＧ化度を決定するため、典型的には、タンパク質をビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイのような方法により又はＵＶ分析により定量して試料中のタンパク質のモル数を決定する。次にＰＥＧ部分を放出させる条件に試料を曝露してＰＥＧ部分を放出させ、次に放出されたＰＥＧを定量し（例えばＢＣＡ又はＵＶによる）、タンパク質モル数と相関させて平均ＰＥＧ化度を決定する。

一部の別の実施形態において、ＲＳＬＡＩＬ－２は、不活性プロドラッグ、即ち投与時に不活性であると見なすことができ、インビボでのポリエチレングリコール部分の徐放により、腫瘍部位における持続濃度を達成するために有効なインターロイキン－２の活性コンジュゲート形態を提供する。

ＲＳＬＡＩＬ－２のさらなる例示的な組成物は、分子の全てのポリマー部分が約２５０ダルトン～約９０，０００ダルトンの範囲の重量平均分子量を有する上記の式に係る化合物を含む。さらなる好適な範囲としては、約１，０００ダルトン～約６０，０００ダルトンから選択される範囲、約５，０００ダルトン～約６０，０００ダルトンの範囲、約１０，０００ダルトン～約５５，０００ダルトンの範囲、約１５，０００ダルトン～約５０，０００ダルトンの範囲、及び約２０，０００ダルトン～約５０，０００ダルトンの範囲の重量平均分子量が挙げられる。

ポリエチレングリコールポリマー部分のさらなる例示的な重量平均分子量としては、約２００ダルトン、約３００ダルトン、約４００ダルトン、約５００ダルトン、約６００ダルトン、約７００ダルトン、約７５０ダルトン、約８００ダルトン、約９００ダルトン、約１，０００ダルトン、約１，５００ダルトン、約２，０００ダルトン、約２，２００ダルトン、約２，５００ダルトン、約３，０００ダルトン、約４，０００ダルトン、約４，４００ダルトン、約４，５００ダルトン、約５，０００ダルトン、約５，５００ダルトン、約６，０００ダルトン、約７，０００ダルトン、約７，５００ダルトン、約８，０００ダルトン、約９，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン、約１１，０００ダルトン、約１２，０００ダルトン、約１３，０００ダルトン、約１４，０００ダルトン、約１５，０００ダルトン、約２０，０００ダルトン、約２２，５００ダルトン、約２５，０００ダルトン、約３０，０００ダルトン、約３５，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン、約４５，０００ダルトン、約５０，０００ダルトン、約５５，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン、約６５，０００ダルトン、約７０，０００ダルトン、及び約７５，０００ダルトンが挙げられる。一部の実施形態において、分岐ポリエチレングリコールポリマーの重量平均分子量は約２０，０００ダルトンである。

上記のとおり、ＲＳＬＡＩＬ－２は薬学的に許容可能な塩の形態であり得る。典型的には、かかる塩は薬学的に許容可能な酸又は酸等価物との反応によって形成される。これに関連して用語「薬学的に許容可能な塩」は、概して、比較的非毒性の無機酸及び有機酸付加塩を指し得る。これらの塩は、投与媒体又は剤形製造過程においてインサイチューで、又は別途本明細書に記載されるとおりの長時間作用型インターロイキン－２を好適な有機酸又は無機酸と反応させて、そのようにして形成された塩を単離することにより調製し得る。代表的な塩としては、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩（ｎａｐｔｈｙｌａｔｅ）、シュウ酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、及びラウリルスルホン酸塩などが挙げられる。（例えば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９７７）「薬学的塩（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ）」，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１－１９を参照のこと）。従って、記載されるとおりの塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸に由来してもよく；又は酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸（ｓａｌｉｃｙｃｌｉｃ）、スルファニル酸、２－アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸（ｉｓｏｔｈｉｏｎｉｃ）などの有機酸から調製されてもよい。

ＲＳＬＡＩＬ－２に関して、用語「ＩＬ－２」は、本明細書で使用されるとき、ヒトＩＬ－２活性を有する部分を指す。用語、「残基」は、ＩＬ－２の残基の文脈では、上記の式に示されるとおり、ＩＬ－２分子のうち１つ以上の共有結合部位においてポリエチレングリコールなどのポリマー剤との共有結合後に残る部分を意味する。非修飾ＩＬ－２がポリエチレングリコールなどのポリマーに結合すると、その１つ以上のポリマーとの連結に付随する１つ以上の共有結合の存在によってＩＬ－２は僅かに変化することが理解されるであろう。この僅かに変化した形態の、別の分子に結合したＩＬ－２が、ＩＬ－２の「残基」と称されることもある。

国際公開第２０１２／０６５０８６号パンフレットに記載される配列番号１～４のいずれか一つに対応するアミノ酸配列を有するタンパク質が、例示的ＩＬ－２タンパク質である。用語の実質的に相同とは、特定の対象配列、例えば突然変異配列が１つ以上の置換、欠失、又は付加だけ参照配列と異なるが、その正味の効果は参照配列と対象配列との間に有害な機能的相違をもたらさないものであることを意味する。本明細書の目的上、９５パーセントより高い相同性、等価な生物学的活性（必須ではないが等価な生物学的活性強度）、及び等価な発現特性を有する配列が、実質的に相同と見なされる。相同性を決定する目的上、成熟配列のトランケーションは無視しなければならない。ＩＬ－２は天然存在であり得、又は組換え産生することができる。さらに、ＩＬ－２はヒト供給源、動物供給源、及び植物供給源に由来し得る。最も好ましくは、ＩＬ－２はアルデスロイキンである。

ＲＳＬＡＩＬ－２は、一般に長時間作用型と称される。本明細書における目的上、ＩＬ－２Ｒβバイアス作動薬の長時間作用性質は、典型的には、マウスにおいて評価しようとする作動薬の投与後の様々な時点でフローサイトメトリーを用いてリンパ球のＳＴＡＴ５リン酸化を計測することにより決定される。参考として、ＩＬ－２では約２４時間までにシグナルが失われるが、長時間作用型ＩＬ－２Ｒβバイアス作動薬についてはそれより長い期間持続する。例示として、（２，７－（ビス－メトキシＰＥＧ_10kD－カルボキサミド）（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチルＮ－カルバメート）_6avgインターロイキン－２についてシグナルは数日間持続する。

ＲＳＬＡＩＬ－２は腫瘍環境中で免疫調節特性を有し、ＲＳＬＡＩＬ－２は、癌撲滅細胞の表面上で見出されるＣＤ１２２受容体を標的化することにより抑制制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、例えばＣＤ４＋Ｔｒｅｇと比べてＣＤ８＋エフェクターＴ及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を優先的に活性化させる。例えばＲＳＬＡＩＬ－２のある免疫療法的特性も記載している国際公開第２０１８／１３２４９６号パンフレットの実施例２０参照。特に、ＲＳＬＡＩＬ－２はＣＤ４＋Ｔ細胞活性化も誘導し、末梢血中でＣＤ４＋、ＣＤ８＋及びＮＫ細胞の増殖を促進する。従って、ＲＳＬＡＩＬ－２はＴｒｅｇと比べてエフェクターＣＤ８＋Ｔ及びＮＫ細胞を優先的に活性化させ、拡大するために有効であるため、これは本明細書に記載のＴ細胞拡大剤としての使用に好適である。

本明細書に記載の方法、組成物、及び併用によれば、ＲＬＳＡＩＬ－２をＩＬ－２Ｒβ活性化量で提供し、それによりＴ細胞拡大活性をもたらす。当業者は、どのくらいのＲＳＬＡＩＬ－２がＩＬ－２Ｒβにおける臨床的に関連する作動薬活性を提供するために十分であるかを決定することができる。

しかしながら、１つ以上の例において、ＲＳＬＡＩＬ－２のＩＬ－２Ｒβ活性化量は、タンパク質の量で表現される以下の範囲の１つ以上により包含される量である：約０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ；約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約７５ｍｇ／ｋｇ；約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約６０ｍｇ／ｋｇ；約０．０３ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ；約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約４０ｍｇ／ｋｇ；約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ；約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約２５ｍｇ／ｋｇ；約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１５ｍｇ／ｋｇ；約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ；約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ；約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ。特定の例示的な投与量範囲には、例えば約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、又は約０．２ｍｇ／ｋｇ～約７ｍｇ／ｋｇ又は約０．２ｍｇ／ｋｇ～約０．７ｍｇ／ｋｇ未満が含まれる。

一部の好ましい実施形態において、ＲＳＬＡＩＬ－２のＩＬ－２Ｒβ活性化量は、約０．０００５～０．３ｍｇ／ｋｇ；約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．３ｍｇ／ｋｇ；約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．２５ｍｇ／ｋｇ；約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．１５ｍｇ／ｋｇ；約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．０５ｍｇ／ｋｇ；約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．０１ｍｇ／ｋｇ；約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．００８ｍｇ／ｋｇ；約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．００５ｍｇ／ｋｇ；約０．００２ｍｇ／ｋｇ～約０．００５ｍｇ／ｋｇ；約０．００２ｍｇ／ｋｇ～約０．００４ｍｇ／ｋｇ、又は約０．００３ｍｇ／ｋｇ～約０．００６ｍｇ／ｋｇである。一部の特定の実施形態において、ＲＳＬＡＩＬ－２を約０．００６ｍｇ／ｋｇの用量において投与する。

確認のために言えば、ＲＳＬＡＩＬ－２に関して、活性化の量及び程度は大きく異なり得、新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチンと任意選択でチェックポイント阻害剤、例えば抗ＰＤ－１抗体の投与と合わせた場合、新エピトープ特異的Ｔ細胞の拡大を有効にドライブするためになおも有効であり得る。

チェックポイント阻害剤
併用療法は、さらなる免疫療法剤、例えばチェックポイント阻害剤の投与も含み得る。本明細書に提供される方法における使用に好適なチェックポイント阻害剤には、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＣＴＬＡ－４を標的化する抗体、例えばモノクローナル抗体などが含まれる。本明細書に提供されるある治療併用において、チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。例えば例示的なＰＤ－１阻害剤には、限定されるものではないが、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、及びセミプリマブが含まれる。代表的ＰＤ－Ｌ１阻害剤には、例えばアテゾリズマブ、アベルマブ、及びデュルバルマブが含まれる。

或いは、イピリムマブ又はトレメリムマブの抗ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体を治療方法において使用することもできる。両方とも、それぞれＩｇＧ１及びＩｇＧ２の完全ヒト化抗ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体である。

一例として、ＰＤ－１経路阻害量の抗ＰＤ－１抗体、例えばニボルマブを投与することができる。当業者は、どのくらいの抗ＰＤ－１抗体、例えばニボルマブ、又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体がそれぞれＰＤ－１経路又はＰＤ－Ｌ１経路の臨床的に関連する阻害を提供するために十分であるかを決定することができる。例えば、当業者は文献を参照してもよく、及び／又は一連の漸増量のニボルマブ又は別の抗ＰＤ－１又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体を投与して、どの１つ以上の量がＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１経路の臨床的に関連する阻害を提供するかを決定してもよい。同様に、ＣＴＬＡ－４経路阻害量の抗ＣＴＬＡ－４抗体を投与することができる。

しかしながら、１つ以上の例において、抗ＰＤ－１抗体、例えばニボルマブ、又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＰＤ－１経路阻害量は、以下の範囲の１つ以上により包含される：約１ｍｇ／ｋｇ～約１０００ｍｇ／ｋｇ；約２ｍｇ／ｋｇ～約９００ｍｇ／ｋｇ；約３ｍｇ／ｋｇ～約８００ｍｇ／ｋｇ；約４ｍｇ／ｋｇ～約７００ｍｇ／ｋｇ；約５ｍｇ／ｋｇ～約６００ｍｇ／ｋｇ；約６ｍｇ／ｋｇ～約５５０ｍｇ／ｋｇ；約７ｍｇ／ｋｇ～約５００ｍｇ／ｋｇ；約８ｍｇ／ｋｇ～約４５０ｍｇ／ｋｇ；約９ｍｇ／ｋｇ～約４００ｍｇ／ｋｇ；約５ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇ；約２ｍｇ／ｋｇ～約１５０ｍｇ／ｋｇ；約５ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ；約１０ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ；及び約１０ｍｇ／ｋｇ～約６０ｍｇ／ｋｇ。さらなる指針は、癌療法における免疫チェックポイント阻害剤の投与についての現在の標準治療に基づき提供することができる。

治療
確認のために言えば、ＰＤ－１経路阻害量の抗ＰＤ－１抗体、例えばニボルマブ、又は他の好適なチェックポイント阻害剤に関して本明細書に使用されるとおり、Ｔ細胞拡大剤及びネオ抗体ベースＤＮＡ癌ワクチンの投与と併用した場合でも、阻害の量及び程度は大きく異なり得、なおも有効であり得る。例えば抗ＰＤ－１抗体、即ちニボルマブのＰＤ－１経路を最小に阻害するに過ぎないある量は、方法が臨床的に有意義な応答をもたらす限り、なおも本明細書において使用される阻害量であり得る。免疫療法成分の各々について投与すべき実際の用量は、対象の年齢、体重、及び全身状態並びに治療下の癌の重症度、医療専門家の判断、並びに免疫療法成分の各々の特定のアイデンティティ及び特性に応じて異なる。

併用療法のある実施形態において、対象は１、２、３、４、５つ以上の事前の癌治療を受けている。他の実施形態において、対象は治療未経験である。一部の実施形態において、対象は他の癌治療に進行している。ある実施形態において、事前の癌治療は免疫療法を含んだ。他の実施形態において、事前の癌治療は化学療法を含んだ。他の実施形態において、腫瘍は再発している。一部の実施形態において、腫瘍は転移性である。さらに他の実施形態において、腫瘍は転移性でない。

一部の実施形態において、対象は腫瘍を治療するための事前の治療法を受けており、腫瘍は再発又は難治性である。一部の実施形態において、対象は腫瘍を治療するための事前のイムノオンコロジー療法を受けており、腫瘍は再発又は難治性である。一部の実施形態において、対象は腫瘍を治療するための２つ以上の事前の治療法を受けており、対象は再発又は難治性である。

一部の治療モダリティにおいて、新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチンを最初に投与して対象において新抗原特異的免疫応答を生成し、次いで新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチンの１つ以上の後続の投与を行う（誘導期間）。新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチンの後続の投与は、１回目の投与後の１週間、２週間、３週間又は４週間以上以内に投与することができる。

本明細書に記載される治療方法は、患者ケアを監督する臨床医がその治療方法を有効であると見なす限り継続され得る。治療方法が有効であることの指標となる非限定的パラメータには、以下のいずれか１つ以上が含まれる：腫瘍縮小（重量及び／又は容積の点で）；個別の腫瘍コロニーの数の減少；腫瘍消失；及び無進行生存。腫瘍サイズの変化は、任意の好適な方法、例えばイメージングにより決定することができる。様々な診断イメージングモダリティ、例えばコンピュータ断層撮影（ＣＴスキャン）、二重エネルギーＣＤＴ、陽電子放出断層撮影及びＭＲＩを用いることができる。

任意選択でチェックポイント阻害剤との併用の新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチン及びＴ細胞拡大剤の投与頻度及びスケジュールに関して、当業者は、併用の成分の各々について適切な頻度を決定することが可能であろう。例えば治療サイクルにおいて、臨床医は新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチンを単一用量として又は例えば数日間若しくは数週間の過程にわたる一連の用量で投与することを決定することができる。Ｔ細胞拡大剤は、新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチンと同時に、ワクチン接種前、又は癌ワクチンの投与後のいずれかで投与する。好ましくは、一部の治療モダリティにおいて、Ｔ細胞拡大剤、例えばＲＳＬＡＩＬ－２は、ワクチン接種誘導期間後に投与する。例示的なＴ細胞拡大剤、ＲＳＬＡＩＬ－２の長時間作用性質に基づき、このような組成物は、比較的低頻度で（例えば４週間に１回、３週間に１回、２週間に１回、８～１０日間に１回、週に１回など）投与することができる。

好ましい投与レジメンにおいて、新エピトープ特異的ＤＮＡベース癌ワクチン及びＴ細胞拡大剤の投与は、両方の治療剤のピークＴ細胞応答を整合し、又は実質的に整合し、それにより最適化（好ましくは、相乗作用）応答を達成するようにスケジュールされる。

例えば１つ以上の実施形態において、Ｔ細胞拡大剤、例えばＲＳＬＡＩＬ－２の初回投与は、新エピトープ特異的ＤＮＡベース癌ワクチンの１回以上の投与に後続し、好ましくは、特にワクチン接種の初回若しくは早期ラウンド及び／又はＴ細胞拡大剤の投与後に各々の免疫療法剤の投与に起因するピークＴ細胞応答が実質的に合致する様式である。

一部の実施形態において、治療プロトコルは、腫瘍特異的新抗原に対する治療新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチンのスクリーニング及び製造の期間、抗癌ワクチンを投与するワクチン接種誘導期間、並びにＴ細胞拡大剤を投与するワクチン接種維持期間を含む。ワクチン接種維持期間の間、抗癌ワクチンは好ましくはＴ細胞拡大剤と同時に又は別個に１回以上投与する。投与前、抗癌ワクチンは当該技術分野において公知の任意の手段により調製することができる。一部の実施形態において、腫瘍特異的新抗原に対する抗癌ワクチンは、腫瘍のゲノム、又はエキソームをシーケンシングすること；腫瘍からの新エピトープを含む腫瘍新抗原を同定すること；及び予測される抗原性に基づき新エピトープを選択することにより調製される。このような抗癌ワクチンを調製する例示的な方法は、米国特許出願公開第２０１９／００２２２０２号明細書に記載されており、その調製方法は参照により本明細書に援用される。腫瘍のスクリーニング及び抗癌ワクチンの製造後、例えば約１２～１６週間、より好ましくは約６～１０週間、又は６～８週間後、腫瘍特異的新抗原に対する新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチン及び／又はＴ細胞拡大剤を、抗癌ワクチン及びＴ細胞拡大剤の一方又は両方についてピーク応答を提供する投与スケジュール又はプロトコルに従って投与する。新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチンは、最初にワクチン接種誘導として一定期間（例えば４～８週間以上）投与することができる。患者に、誘導期間の間、新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチンを１回以上ワクチン接種することができる。誘導期間後、Ｔ細胞拡大剤をさらなる又は維持抗癌ワクチンの投与あり又はなしで１回以上投与する。Ｔ細胞拡大剤及び／又は新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチンは、治療のために必要とされる一定期間（例えば１～１２ヵ月以上）投与することができる。例示的な治療投与スケジュールは、以下に提供される：

治療過程に関連する例示的な時間の長さには、約１週間；約２週間；約３週間；約４週間；約５週間；約６週間；約７週間；約８週間；約９週間；約１０週間；約１１週間；約１２週間；約１３週間；約１４週間；約１５週間；約１６週間；約１７週間；約１８週間；約１９週間；約２０週間；約２１週間；約２２週間；約２３週間；約２４週間；約７ヵ月；約８ヵ月；約９ヵ月；約１０ヵ月；約１１ヵ月；約１２ヵ月；約１３ヵ月；約１４ヵ月；約１５ヵ月；約１６ヵ月；約１７ヵ月；約１８ヵ月；約１９ヵ月；約２０ヵ月；約２１ヵ月；約２２ヵ月；約２３ヵ月；約２４ヵ月；約３０ヵ月；約３年；約４年；約５年が含まれる。

本明細書に記載される治療方法は、典型的には、患者ケアを監督する臨床医がその治療方法を有効である、即ち患者が治療に応答していると見なす限り継続され、例えば癌などの疾患の更なる進行しないことを含む。治療方法が有効であることの指標となる非限定的なパラメータには、以下の１つ以上が含まれ得る：腫瘍縮小（重量及び／又は容積及び／又は外観の点で）；個別の腫瘍コロニーの数の減少；腫瘍消失；無進行生存；好適な腫瘍マーカーによる適切な応答（該当する場合）、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞数の増加、Ｔ細胞数の増加、メモリーＴ細胞数の増加、セントラルメモリーＴ細胞数の増加、制御性Ｔ細胞、例えばＣＤ４＋Ｔｒｅｇ、ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ、及びＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの数の低下。

本明細書に提供される方法は、（特に）癌を有する患者を治療するために有用である。例えば患者は、新抗原ベースＤＮＡ単独、及びＴ細胞拡大剤、任意選択でチェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）との併用に対して応答性であり得るが、併用の投与に対してより応答性である。別の例として、患者は、新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチン、又はＴ細胞拡大剤、又はチェックポイント阻害剤に対して非応答性であってもよく又はほんのわずかに応答性であり得るが、併用に対してより応答性である。さらに別の例として、患者は、新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチン又はＴ細胞拡大剤又はチェックポイント阻害剤単独に対して非応答性であり得るが、併用に対して応答性である。

例えば新抗原ベースのＤＮＡ癌ワクチン及び／又はＴ細胞拡大剤（例えば、ＲＳＬＡＩＬ－２）及び／又はチェックポイント阻害剤の投与は、典型的には注射によるものである。肺内、鼻内、頬側、直腸、舌下及び経皮など、他の投与方法もまた企図される。本明細書で使用されるとき、用語「非経口」には、皮下、静脈内、動脈内、腫瘍内、リンパ管内、腹腔内、心臓内、くも膜下腔内、及び筋肉内注射、並びに点滴注射が含まれる。

ここに記載した方法、併用、組成物などは、本明細書に提供される方法により治癒又は防止し得る任意の病態、例えば癌に罹患している患者を治療するために使用することができる。例示的病態は、癌、例えば線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、脳癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、脳癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、及び白血病である。

一部の特定の実施形態において、治療すべき癌は、固形癌、例えば乳癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、骨癌、結腸直腸癌、胃癌、リンパ腫、悪性黒色腫、肝癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膵癌、甲状腺癌、腎癌、胆管癌、脳癌、子宮頸癌、上顎洞癌、膀胱癌、食道癌、ホジキン病及び副腎皮質癌などである。

本方法、併用及び組成物は、例えば新抗原ベースのＤＮＡ癌ワクチン組成物に対する対象の免疫応答を改善することによる新抗原ベースのＤＮＡ癌ワクチンの治療効力の増強に有用である。増強された応答は、治療の間、単一の治療ラウンド後、２～３つの治療サイクル後など任意の好適な時点において、及び多数の好適な方法のいずれか、例として、腫瘍の縮小（部分奏効）、即ち腫瘍サイズ又は容積の評価、腫瘍の消失、疾患進行の低下（癌は進行していない）、及び１つ以上の腫瘍試験マーカーの分析により適宜評価することができる。本明細書に提供される方法、キット、組成物などは、治療を受ける対象における腫瘍成長又はサイズ（又は容積）の低下にも有用である。本明細書に記載の併用を治療有効量で投与することによる治療は、１つ以上の実施形態において、対象における腫瘍成長又はサイズを低下させるために有効である。例えば一部の実施形態において、１つ以上の治療サイクルは、腫瘍サイズを治療前の腫瘍サイズと比較する場合に約２５％だけ、又は約３０％だけ、又は約４０％だけ、又は約５０％だけ、又はさらには約６０％だけ、又は約７０％以上だけ低下させるために有効である。

さらに一部の別の実施形態において、本明細書に提供される方法、組成物などは、癌の治療を受ける対象における制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の蓄積を阻害するために有効である。さらに一部の別の実施形態において、本明細書に提供される方法、組成物などは、対象におけるＴ細胞及び／又はＮＫ細胞活性及び／又は増殖を刺激するために有効である。一部の実施形態において、本方法は、例えば対応する癌の癌マウスモデルにおいて評価する場合、新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチン単独によるワクチン接種と比較する場合、対象においてＣＤ８＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ４Ｔ細胞の数を増加させるために有効である。例えば対象のＣＤ８＋Ｔ細胞は、新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチン単独による治療と比較する場合、２倍以上、又は３倍以上、又はさらには４倍以上だけ増加させることができる。治療は、一部の実施形態において、非治療対象と比較する場合、新抗原に対する対象のＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ４Ｔ細胞を少なくとも２倍以上、又は３倍以上、又はさらには４倍以上、又は５倍以上、又は６倍以上だけ増加させるために有効であり得る。

実施例について見ると、裏付けの前臨床試験は、例示的なＴ細胞拡大剤、ＲＳＬＡＩＬ－２及び任意選択でチェックポイント阻害剤の投与を伴う場合、新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチンの投与から生じる相乗作用効果の指標を提供する。

実施例１に例示されるとおり、腫瘍新抗原からの複数の新エピトープに指向される例示的な個別化抗癌ＤＮＡワクチン、例えばＶＢ４０１１との併用の例示的なＴ細胞拡大剤、ＲＳＬＡＩＬ－２の投与は、マウスの前臨床黒色腫モデルにおいて評価する場合、頻度を増加させるためだけでなく、新エピトープ特異的Ｔ細胞の総数も増加させるためにも有効であることが発見された。

従って、治療新エピトープ特異的ＤＮＡベース癌ワクチンによるワクチン接種は、新エピトープ特異的Ｔ細胞応答を誘導するために有効であり、次いでそれは既存のＴ細胞集団を非特異的にさらに拡大するために有効なＴ細胞拡大剤、例えばＲＳＬＡＩＬ－２の投与により拡大される。両方の治療剤、即ち新エピトープ特異的ＤＮＡベース癌ワクチン及びＴ細胞拡大剤のピークＴ細胞応答を整合し、又は実質的に整合することにより、最適化（好ましくは、相乗作用）応答を達成することができた。例えば図５Ａ及び５Ｂに示される結果参照、それらは、この前臨床癌モデルに基づく好ましいアプローチとして、新エピトープ特異的ＤＮＡベース癌ワクチンの１回以上の投与に後続するＴ細胞拡大剤、例えばＲＳＬＡＩＬ－２の投与を、好ましくは特にワクチン接種の初回若しくは早期ラウンド及び／又はＴ細胞拡大剤の投与後に各々の免疫療法剤の投与に起因するピークＴ細胞応答が実質的に合致する様式で裏付ける。例えば２剤併用において、及びワクチンの単一の初回投与のみに基づき、Ｔ細胞拡大剤、ＲＳＬＡＩＬ－２の投与をワクチンの投与の１１日後に行った場合、最適応答が観察された。従ってこれらの結果は、各々の治療剤の投与の、投与後のそのピークＴ細胞応答に基づく方針的整合により最適化応答を達成することができることを示す。図５Ｂに例示されるとおり、Ｔ細胞拡大剤、ＲＳＬＡＩＬ－２の投与タイミングは、２回目の用量の新エピトープ特異的ＤＮＡベース癌ワクチンの投与のタイミングと比べてＴ細胞応答に影響した。即ち図５Ｂに示されるとおり、２回目の用量のワクチンの投与の一定期間後、この場合、３日後のＲＳＬＡＩＬ－２の投与は、特異的Ｔ細胞応答の顕著な増強をもたらした。

図５Ｃは、例示的なワクチン接種スケジュールの様々な段階におけるＲＳＬＡＩＬ－２の投与、例えば３回目のワクチン用量及びＲＳＬＡＩＬ－２の同日投与、並びに３回目のワクチン用量の投与とＲＳＬＡＩＬ－２の遅延投与の結果を提供する。２回以上のワクチン接種の場合、ＲＳＬＡＩＬ－２投与を３日間だけ遅らせ；単一ワクチン接種の場合、ＲＳＬＡＩＬ－２の投与を７、１１又は１４日間遅らせた。この前臨床Ｂ１６モデルにおけるこれらの結果に基づき、Ｔ細胞拡大剤、ＲＳＬＡＩＬ－２と２回目の用量の新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチンとの投与は特異的Ｔ細胞応答に穏やかに相乗作用することが考えられ、この同一モデルにおいて、ＲＳＬＡＩＬ－２と３回目の用量のワクチンの投与は、同日投与されるか遅れて投与されるかにかかわらず類似の程度に特異的Ｔ細胞応答を相乗作用的に生じさせることが考えられる。これらの結果に基づき、Ｔ細胞拡大剤、例えばＲＳＬＡＩＬ－２を新エピトープ特異的ＤＮＡベース癌ワクチン誘導期後（例えば２回以上のワクチン接種後、例えば２又は３又は４回以上のワクチン接種後）に投与し、それにより好ましくはＴ細胞拡大剤の投与のタイミングに対する感受性の低下を伴って特異的Ｔ細胞応答に相乗作用し又はそれを少なくとも最大化することが好ましいことがあることが考えられる。

実施例２に記載のとおり、Ｔ細胞拡大剤、（２，７－（ビス－メトキシＰＥＧ_10kD－カルボキサミド）（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチルＮ－カルバメート）_6avgインターロイキン－２（「ＲＬＳＡＩＬ－２」）が、結腸癌ＣＴ２６マウス腫瘍モデルにおいて実施されたワクチン接種試験において例示的な免疫療法ＤＮＡベース新抗原ワクチン、ＶＢ１０．ＮＥＯとの併用で投与した場合、新エピトープ特異的ＩＦＮ－γＴ細胞応答をブーストし得るか否かを調査するため、及び任意の新エピトープ特異的Ｔ細胞応答の増強の程度を評価するための試験も実施した。これらのデータは、さらに別の異なる前臨床マウスモデルにおいて、ＲＳＬＡＩＬ－２がＶＢ４０６１ワクチン接種マウスにおいて新エピトープ特異的ＩＦＮ－γＴ細胞応答に強力に相乗作用することを明確に実証し、裏付け、従ってＴ細胞増強剤、例えばＲＳＬＡＩＬ－２との併用の個別化ＤＮＡベース新抗原ワクチンの併用の投与により強力な新抗原にフォーカスする免疫応答を誘発することによる患者における臨床アウトカムの改善における本明細書に提供されるアプローチをさらに検証する。より特定すると、結腸癌ＣＴ２６マウス腫瘍モデルにおいて評価する場合、例示的な新エピトープ癌ワクチン、ＶＢ１０．ＮＥＯ、及びＴ細胞拡大剤、ＲＳＬＡＩＬ－２の併用は有意に相乗作用して新エピトープ特異的Ｔ細胞応答をブーストし、ＶＢ１０．ＮＥＯ単剤療法と比較して新エピトープ特異的Ｔ細胞応答の数の最大５倍増加をもたらす。さらにこれらの実験において、マウスに腫瘍細胞を注射して腫瘍担持臨床背景を模倣した。ＶＢ４０６１＋ＲＳＬＡＩＬ－２の併用は新エピトープ特異的Ｔ細胞応答の幅（より多くの新エピトープ）及び深さ（各々の新エピトープに対するより強力な応答）の両方を増加させるために有効であることが観察された。

併用療法の予測されない利点は実施例３においてさらに実証され、それは、Ｔ細胞拡大剤、ＲＳＬＡＩＬ－２がＣＴ２６腫瘍モデルにおけるＶＢ４０６１及び抗ＰＤ－１抗体ワクチン接種マウス（個別化新抗原ベースＤＮＡ癌ワクチンの投与とさらに併用してチェックポイント阻害剤による癌治療を受けている対象の例示として）における腫瘍保護免疫応答を増加させ得たか否かを探索する。ＶＢ４０６１単独及び抗ＰＤ－１との併用による治療は、腫瘍保護応答を誘導する（データ示さず）。しかしながら、実施例３に記載の試験において、ワクチン接種は腫瘍保護免疫応答を誘導し得たことが確認された（図４Ａ～４Ｄ）。さらに結果は、ＶＢ４０６１及び抗ＰＤ－１によりワクチン接種されたマウスにおける腫瘍保護が、Ｔ細胞拡大剤、ＲＳＬＡＩＬ－２との併用で投与された場合にさらに顕著にブーストされたことをさらに例示する。腫瘍成長の低下は、３剤療法ＶＢ４０６１＋抗ＰＤ－１抗体＋ＲＳＬＡＩＬ－２治療群において観察され、３剤治療マウスの５０％が腫瘍排除のままであり、腫瘍を全く樹立しなかった。対照的に、ＲＳＬＡＩＬ－２なしでＶＢ４０６１＋抗ＰＤ－１抗体を受容したマウス（図４Ｂ）は２０％のみが保護された。両方の治療アームにおいて樹立腫瘍の腫瘍退縮が観察され、全生存率はＶＢ４０６１＋抗ＰＤ－１、及びＶＢ４０６１＋抗ＰＤ－１＋ＲＳＬＡＩＬ－２治療群の各々においてそれぞれ７０％及び８０％であった（図４Ｃ）。再チャレンジ実験において、両方の治療群は致死用量のＣＴ２６細胞に対して完全に保護性であり、両方の群は腫瘍成長及び全生存率の両方で対照群と統計的に異なった。

ＶＢ４０６１＋抗ＰＤ１によりワクチン接種されたマウスにおいて観察された腫瘍保護は、Ｔ細胞拡大剤、即ちＲＳＬＡＩＬ－２と併用された場合、さらに強化された。これらの結果は、これらのユニーク且つ非重複機序の統合を使用して樹立腫瘍の有効な治療を作出することができることを実証する。致死用量の腫瘍細胞により再チャレンジされたマウスにおいて、両方の治療群は完全に保護され、治療法が長時間持続及び腫瘍保護メモリー免疫応答を誘導することを実証した。

非治療マウス（対照）及びｈＶＢ４０６１＋抗ＰＤ－１＋ＲＳＬＡＩＬ－２により治療されたマウスの群についての腫瘍長さを、電子測径器を使用して腫瘍長さサイズ（ｍｍ）を計測することにより定期的にさらにモニタリングした。この試験において、ワクチン接種がＣＴ２６結腸癌腫マウスモデルにおいて腫瘍退縮及び安定化を誘導し得ることが確認された（図７Ａ～７Ｂ）。この実験の結果は、ＶＢ４０６１及び抗ＰＤ－１によりワクチン接種されたマウスにおける腫瘍保護が、ＲＳＬＡＩＬ－２との併用で投与された場合にさらにブーストされたことを例示する。図７Ｂに示されるとおり、ＲＳＬＡＩＬ－２の投与との併用のＶＢ４０６１及びチェックポイント阻害剤、抗ＰＤ－１によるマウスのワクチン接種は、比較的小さい腫瘍（例えば約５～６ｍｍ未満の腫瘍）を有するマウスにおける急速で完全な長時間持続の腫瘍退縮及びより大きい腫瘍（例えば約５～６ｍｍよりも大きく、さらには約１０ｍｍよりも大きい腫瘍）の長時間持続の安定化をもたらした。

本明細書において参照される全ての論文、書籍、特許、特許公報及び他の刊行物は、全体として参照により本明細書に明示的に援用される。本明細書の教示と参照によって援用される技術との間に不一致が生じた場合、その教示の意味及び本明細書の定義が（特に本明細書に添付される特許請求の範囲で用いられる用語に関して）優先するものとする。例えば、本願及び参照によって援用される刊行物が同じ用語を別様に定義する場合、定義が載せられている文書の教示の範囲内でその用語の定義が維持されるものとする。

前述の説明並びに以下の例は例示を意図するもので、本明細書で提供される本発明の範囲を限定する意図はないことが理解されるべきである。本発明が関係する技術分野の当業者には、本発明の範囲内の他の態様、利点及び変形例が明らかであろう。

材料及び方法
（２，７－（ビス－メトキシＰＥＧ_10kd－カルボキサミド）（９ｈ－フルオレン－９－イル）メチルＮ－カルバメート）_6avgインターロイキン－２：アルデスロイキン（デス－アラニル－１，セリン－１２５ヒトインターロイキン－２）のものと同一のアミノ酸配列を有する組換えヒトＩＬ－２をクローニングし、発現させ、それを使用して例示的なＴ細胞拡大剤、ベンペガルデスロイキンとも称され、又はより一般にはこれらの実施例において「ＲＳＬＡＩＬ－２」と称される（２，７－（ビス－メトキシＰＥＧ_10kD－カルボキサミド）（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチルＮ－カルバメート）_6avgインターロイキン－２（ＣＡＳ番号１９３９１２６－７４－５）を調製した。（２，７－（ビス－メトキシＰＥＧ_10kD－カルボキサミド）（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチルＮ－カルバメート）_6avgインターロイキン－２の調製は、例えば国際公開第２０１８／１３２４９６号パンフレット（実施例１９）に記載されており；実施例２０は、分子の受容体バイアス／選択性を記載している。前臨床試験のため、ＲＳＬＡＩＬ－２を希釈緩衝液中で０．１ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈し、マウスの重量に基づき０．８ｍｇ／ｋｇの最終用量に達するように容量を決定し、マウスの尾静脈中に注射した。臨床試験のため、ＲＳＬＡＩＬ－２を実施例４に記載のとおり再構成のための無菌白色～黄色凍結乾燥粉末として提供する。

ＶＢ１０．ＮＥＯ（前臨床試験のための新抗原ベース治療ＤＮＡワクチン）。下記の前臨床試験において、対照プラスミドＶＢ１０２６、及び２つのＶＢ１０．ＮＥＯ ｐＤＮＡ構築物、ＶＢ４０１１及びＶＢ４０６１を例示的な新抗原ベースＤＮＡ抗癌ワクチンとして使用した。ｐＤＮＡ構築物、ＶＢ４０１１及びＶＢ４０６１は、以下の表２に記載のとおりＢ１６からの１０個の新エピトープ及びＣＴ２６からの２０個の新エピトープをそれぞれコードする。マウスのワクチン接種は、エレクトロポレーションとの併用で実施した。ｐＶＢ１０．ＮＥＯプラスミドの異なる機能エレメントを図１３に示す。

抗ＰＤ－１抗体（前臨床実験）：インビボＭＡｂ抗マウスＰＤ－１、クローンＲＭＰ１－１４、カタログ番号：ＢＥ０１４６（Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ（登録商標））。

ＶＢ４０１１のアミノ酸配列は、配列番号１（図１）に対応する。ＶＢ４０６１のアミノ酸配列は、配列番号２（図８）に対応する。ＶＢ４０６１マウス構築物中に含まれる２０個の新エピトープの一覧を図９に示し、それらは配列番号３～２２に対応する。ＶＢ４０１１構築物中に含まれる個々の新エピトープの一覧を図１０に示し、それらは配列番号２３～３２に対応する。上記の例示的なワクシボディワクチンの構築及び発現方法は、内容が全体として明示的に本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１９／００２２２０２号明細書に記載されている。

脾臓の回収、脾細胞、及びＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇脾細胞の単離：マウスを犠死させ、脾臓を無菌的に回収した。個々のマウスからの脾臓を７０μＭ組織フィルタに通してメッシュ処理して単一脾細胞を単離した。脾細胞を培養培地中で１回洗浄し、１×ＡＣＫ緩衝液中で再懸濁させて赤血球を溶解させた。洗浄後、細胞を培養培地中で再懸濁させ、計数した。ＣＤ４＋又はＣＤ８＋脾細胞のいずれかの枯渇のため、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）マウスＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）又はＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）マウスＣＤ８（Ｌｙｔ２）を製造業者の指示書に従って使用した。

ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ：簡潔に述べると、脾細胞、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇脾細胞を６×１０⁵個の細胞の細胞濃度に再懸濁させた。細胞を３つ組でプレーティングし（限定数の細胞の場合、２つ組を使用した）、ワクチン接種の間に使用された元のＶＢ１０．ＮＥＯ構築物（表２）中の新エピトープに対応する２μｇ／ｍｌの個々のペプチドにより２４時間再刺激した。免疫原性をＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔ Ｐｌｕｓキット（Ｍａｂｔｅｃｈ ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）により製造業者の指示書に従って分析した。スポット形成単位（ＳＰＵ）をＣｅｌｌｕｌａｒ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙからＣＴＬ ＥＬＩＳｐｏｔリーダー、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ ５．０．３中で計数した。結果をＩＦＮ－γ＋スポットの数／１０⁶個の脾細胞として又はＩＦＮ－γ＋スポット／脾臓として示す。

ＣＴ２６結腸癌細胞系による皮下腫瘍チャレンジ：簡潔に述べると、培養培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％非必須アミノ酸溶液、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１０％ＦＢＳ）を有する瓶中でＣＴ２６腫瘍細胞（＃ＣＲＬ－２６３８，ＡＴＣＣ）を培養した。注射前、細胞を１×ＰＢＳ中で２回洗浄した一方、細胞はなおもフラスコに接着しており、次いでそれをトリプシン処理し、洗浄し、１×ＰＢＳ中で５×１０⁵個の細胞／ｍｌの最終濃度に再懸濁させた。ＢＡＬＢ／ｃＪＲｊマウスに、左大腿部中で１００μｌの５×１０⁴個のＣＴ２６細胞を皮下注射した。

ＶＢ１０．ＮＥＯ（臨床試験用新抗原ベース治療ＤＮＡワクチン）。個別化新抗原ワクチン、ｐＶＢ１０．ＮＥＯは、個別化ヒトワクチン中に含まれる新エピトープの数に依存性の６２９７～７４０７塩基対の非複製、非統合、遺伝子安定及び非病原性でネイキッドの共有結合閉環及びスーパーコイル二本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）プラスミドである。ＤＮＡプラスミドは、３つのモジュール：標的化、二量体化及び新エピトープ抗原性モジュールを含む単一組換えホモ二量体タンパク質をコードするｐＵＭＶＣ４ａベクター骨格をベースとする。標的化モジュールは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の細胞表面上の同族受容体に結合するヒトケモカインマクロファージ炎症性タンパク質－１アルファ（ｈＭＩＰ－１α）をコードする一方、二量体化モジュールは、ヒトＩｇＧ３からの上方及び下方ヒンジ領域並びに定常重鎖３（Ｃ_H３）ドメインをコードする。下方ヒンジ領域は２つのワクシボディ単量体をジスルフィド架橋により結合させ、Ｃ_H３ドメインは疎水性相互作用による二量体化に寄与する。上方ヒンジ領域は、標的化モジュールのその同族受容体へのフレキシブルな二価結合を容易にし、それによりワクチンの免疫原性を増強する。

新エピトープ抗原性モジュールは、新エピトープ配列を形成するための数個（１４～２７個）のアミノ酸の全長に及ぶ体細胞突然変異／変更を含み、１０アミノ酸フレキシブルグリシン／セリンリッチリンカーにより一緒に結合される複数（１０～２０個）の患者特異的新エピトープからなる。グリシン／セリンリッチリンカーは、典型的には接合配列の評価に基づき個別化ワクチンについて構築物ごとに変化し、その結果、選択リンカーは、典型的にはヒトプロテオーム中に見出される配列に類似する接合エピトープを除外する。新エピトープ抗原性モジュールは、上記のヒトＩｇＧ３に由来する二量体化モジュールにより天然ヒトケモカインマクロファージ炎症性タンパク質－１α（標的化モジュール）に結合している。転写産物はほぼ１００ｋＤａの６０３～９７３アミノ酸含有タンパク質に翻訳され、それはほぼ２００ｋＤａの二量体タンパク質を形成する。

ｐＶＢ１０．ＮＥＯは、患者への筋肉内投与により送達されたら、細胞により取り込まれ、ＶＢ１０．ＮＥＯタンパク質の局所的及び一過性の産生、並びに分泌をもたらす。コードされるタンパク質の構造は、患者特異的新抗原に対する強力な細胞免疫応答の誘導を支持するように設計及び選択される。

ｐＶＢ１０．ＮＥＯ ＤＮＡ骨格配列（新エピトープ抗原性モジュールについての一般的指標を有する）を図１２に示し、配列番号７７として提供する。ｐＶＢ１０．ＮＥＯプラスミドの異なる機能エレメントを図１３に示す。

実施例１
黒色腫のマウスモデル（Ｂ１６）におけるＶＢ１０．ＮＥＯ新抗原ＤＮＡワクチンと（２，７－（ビス－メトキシＰＥＧ_10KD－カルボキサミド）（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチルＮ－カルバメート）_6AVGインターロイキン－２とを用いる併用療法
Ｔ細胞拡大剤、（２，７－（ビス－メトキシＰＥＧ_10kD－カルボキサミド）（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチルＮ－カルバメート）_6avgインターロイキン－２が、黒色腫Ｂ１６マウス腫瘍モデルにおいて実施されたワクチン接種試験において例示的な免疫療法ＤＮＡベース新抗原ワクチン、ＶＢ１０．ＮＥＯとの併用で投与された場合、新エピトープ特異的ＩＦＮ－γＴ細胞応答をブーストし得るか否かを調査するため、及び任意の新エピトープ特異的Ｔ細胞応答の増強の程度を評価するための試験を行った。

１５匹の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＪａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。試験設計及びワクチン接種スケジュールの概要を表３に示す。

Ｂ１６モデル：Ｃ５６Ｂｌ／６マウスに０、２１及び３５日目、２０μｇの対照ｐＤＮＡ ＶＢ１０２６又は２０μｇのＶＢ４０１１のいずれかを３回ワクチン接種した。ＲＳＬＡＩＬ－２（０．８ｍｇ／ｋｇ）を３回目のＶＢ４０１１ワクチン接種と同日に静脈内投与した。免疫原性を１回目のＶＢ４０１１ワクチン接種の４２日後（３回目のワクチン接種の７日後）にＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔにより計測した。

本明細書にさらに記載のとおり、他のワクチン接種／投与スケジュールも探索した。

Ｂ１６黒色腫マウスモデルにおけるＥＬＩＳｐｏｔ結果：ＶＢ４０１１との併用のＲＳＬＡＩＬ－２の投与は、図２Ａ及び表４）に示されるとおり新エピトープ特異的ＩＦＮ－γＴ細胞応答をブーストするために有効であった。ＶＢ４０１１ワクチン接種マウスにおいて、新エピトープＭ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ７、Ｍ９及びＭ１０が免疫原性であった（表４（免疫原性応答を灰色枠で示す）及び図２Ａ）。ＶＢ４０１１＋ＲＳＬＡＩＬ－２治療マウスから単離された脾細胞について、新エピトープＭ２、Ｍ４、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ９及びＭ１０が免疫原性であった。両方の治療アームにおいて免疫原性であった新エピトープについて、ＶＢ４０１１単剤療法と比較してＶＢ４０１１＋ＲＳＬＡＩＬ－２併用療法により治療されたマウスにおいてより強力な免疫応答が観察された。

免疫原性エピトープについての基準を、≧２５個のＩＦＮ－γ＋スポット／１０⁶個の細胞及び平均陰性対照（ｐＤＮＡ ＶＢ１０２６）＋２×ＳＤよりも＞ＩＦＮ－γ＋スポット／１０⁶個の細胞と定義した。しかしながら、この実験において脾細胞をプールしたため（５匹のマウス）、２×ＳＤを使用することはできなかった。

数字はＥＬＩＳｐｏｔにおける３つ組の平均を表し、ＳＰＵ／１０⁶個の脾細胞として提示する。培地対照中のＳＰＵの平均数を、各々の新エピトープに対して誘発された平均ＳＰＵから差し引いた。スポットカウント＜０を有するウェルを０として報告する。免疫原性エピトープの基準を≧２５個のＳＰＵ／１０⁶個の細胞と定義した。免疫原性であることが決定されたエピトープを灰色枠で示す。

ＩＦＮ－γ＋スポット／１０⁶個の細胞の報告は、ＲＳＬＡＩＬ－２＋ＶＢ４０１１（２剤）により治療されたマウスにおいて新エピトープ特異的Ｔ細胞の頻度が増加したことを実証する。２剤治療マウスにおいて、ＶＢ４０１１ワクチン接種マウスと比較した場合、脾臓が典型的には２～３倍肥大したことが観察された（表５）。従って、ＶＢ４０１１－ＲＳＬＡＩＬ－２併用により治療されたマウスにおいて、新エピトープ特異的Ｔ細胞の総数も増加した。この増加を調整するため、脾臓当たりのＩＦＮ－γ＋分泌Ｔ細胞の総数（ＳＰＵ）を計算し（表５）、結果として、新エピトープ特異的Ｔ細胞の３．７倍増加が決定された（図２Ｂも参照）。この増加は、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞の両方について明らかだった（それぞれ図２Ｃ及び２Ｄ）。この知見は、ＶＢ４０１１との併用のＲＳＬＡＩＬ－２の投与がマウスの前臨床黒色腫モデルにおいて頻度を増加させるためだけでなく、新エピトープ特異的Ｔ細胞の総数も増加させるためにも有効であることを実証する。

さらなる試験：上記の試験プロトコルに至る前後、代替の投与スケジュールを探索した。対象併用療法の結果として特に強力で持続性のＴ細胞応答を達成するため、ＲＳＬＡＩＬ－２の投与は好ましくは新エピトープ特異的Ｔワクチン誘導Ｔ細胞応答の樹立後、即ちワクチン接種後（即ち１回目、２回目、又は後続の用量のワクチンの）に行うことが仮定された。従って、治療新エピトープ特異的ＤＮＡベース癌ワクチンによるワクチン接種は、新エピトープ特異的Ｔ細胞応答を誘導するために有効であり、次いでそれは既存のＴ細胞集団を非特異的にさらに拡大するために有効なＴ細胞拡大剤、例えばＲＳＬＡＩＬ－２の投与によりさらに拡大される。試験は、両方の治療剤、即ち新エピトープ特異的ＤＮＡベース癌ワクチン及びＴ細胞拡大剤のピークＴ細胞応答を整合し、又は実質的に整合することにより、最適化（好ましくは相乗作用）応答を達成することができることを明らかにした。例えば図５Ａ及び５Ｂに示される結果参照、それらは、この前臨床癌モデルに基づき、新エピトープ特異的ＤＮＡベース癌ワクチンの１回以上の投与に後続するＴ細胞拡大剤、例えばＲＳＬＡＩＬ－２の投与を、好ましくは特にワクチン接種の初回若しくは早期ラウンド及び／又はＴ細胞拡大剤の投与後に各々の免疫療法剤の投与に起因するピークＴ細胞応答が実質的に合致する様式で裏付ける。例えば２剤併用において、及びワクチンの単一の初回投与のみに基づき、Ｔ細胞拡大剤、ＲＳＬＡＩＬ－２の投与をワクチンの投与の１１日後に行った場合、最適応答が観察された。従ってこれらの結果は、各々の治療剤の投与の、投与後のそのピークＴ細胞応答に基づく方針的整合により最適化応答を達成することができることを示す。図５Ｂに例示されるとおり、Ｔ細胞拡大剤、ＲＳＬＡＩＬ－２の投与のタイミングは、２回目の用量の新エピトープ特異的ＤＮＡベース癌ワクチンの投与のタイミングと比べてＴ細胞応答に影響した。即ち図５Ｂに示されるとおり、２回目の用量のワクチンの投与の一定期間後、この場合、３日後のＲＳＬＡＩＬ－２の投与は、特異的Ｔ細胞応答の顕著な増強をもたらした。

投与スケジュールの別の探索において、図５Ｃは、ワクチン接種スケジュールの様々な段階におけるＲＳＬＡＩＬ－２の投与、例えば３回目のワクチン用量及びＲＳＬＡＩＬ－２の同日投与、並びに３回目のワクチン用量の投与とＲＳＬＡＩＬ－２の遅延投与の結果を提供する。２回以上のワクチン接種の場合、ＲＳＬＡＩＬ－２投与を３日間だけ遅らせた場合；単一ワクチン接種の場合、ＲＳＬＡＩＬ－２の投与を７、１１又は１４日間遅らせた。Ｂ１６モデルにおけるこれらの結果に基づき、Ｔ細胞拡大剤、ＲＳＬＡＩＬ－２と、２回目の用量のワクチンとの投与は特異的Ｔ細胞応答に穏やかに相乗作用すること、及びこの同一モデルにおいて、ＲＳＬＡＩＬ－２と３回目の用量のワクチンとの投与は、同日投与されるか遅れて投与されるかにかかわらず類似の程度に特異的Ｔ細胞応答を相乗作用的に生じさせることが考えられる。これらの結果に基づき、Ｔ細胞拡大剤、例えばＲＳＬＡＩＬ－２を新エピトープ特異的ＤＮＡベース癌ワクチン誘導期後（例えば２回以上のワクチン接種後、例えば２又は３又は４回以上のワクチン接種後）に投与し、それにより好ましくはＴ細胞拡大剤の投与のタイミングに対する感受性の低下を伴って特異的Ｔ細胞応答に相乗作用することが好ましいことがあることが考えられる。

実施例２
結腸癌のマウスモデル（ＣＴ２６）におけるＶＢ１０．ＮＥＯ新抗原ＤＮＡワクチンと（２，７－（ビス－メトキシＰＥＧ_10KD－カルボキサミド）（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチルＮ－カルバメート）_6AVGインターロイキン－２とを用いる併用療法
Ｔ細胞拡大剤、（２，７－（ビス－メトキシＰＥＧ_10kD－カルボキサミド）（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチルＮ－カルバメート）_6avgインターロイキン－２が、結腸癌ＣＴ２６マウス腫瘍モデルにおいて実施されたワクチン接種試験において例示的な免疫療法ＤＮＡベース新抗原ワクチン、ＶＢ１０．ＮＥＯとの併用で投与された場合、新エピトープ特異的ＩＦＮ－γＴ細胞応答をブーストし得るか否かを調査するため、及び任意の新エピトープ特異的Ｔ細胞応答の増強の程度を評価するための試験を行った。

２０匹の雌ＢＡＬＢ／ｃＪＲｊマウスをＪａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。試験設計及びワクチン接種スケジュールの概要を表５に示す。

ＣＴ２６モデル：ＣＴ２６モデルにおいて、ＢＡＬＢ／ｃマウスに５０μｇの対照ｐＤＮＡ ＶＢ１０２６又は５０μｇのＶＢ４０６１のいずれかを１回ワクチン接種した。ＲＳＬＡＩＬ－２（０．８ｍｇ／ｋｇ）をＶＢ４０６１ワクチン接種の７日後に静脈内投与した。ワクチン接種の間に腫瘍背景を模倣するため、５×１０⁴個のＣＴ２６腫瘍細胞をｐＤＮＡ（ＶＢ１０２６又はＶＢ４０６１）ワクチン接種の７日前に注射した。免疫原性をＶＢ４０６１ワクチン接種の１４日後にＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔにより計測した。

他のワクチン接種／投与スケジュールも探索した。

ＣＴ２６結腸癌モデルにおけるＥＬＩＳｐｏｔ：上記実施例１に記載の例示的なＢ１６黒色腫モデルにおいて観察された強力な相乗作用と一致して、新エピトープ特異的ＩＦＮ－γＴ細胞応答は、ＣＴ２６マウス腫瘍モデルにおけるＶＢ４０６１及びＲＳＬＡＩＬ－２の併用についても有意に上昇した（図３Ａ～３Ｄ及び表７）。

ＶＢ４０６１によりワクチン接種されたマウスにおいて、新エピトープＭ１、Ｍ３０、Ｍ１０３及びＭ１０６に対する免疫応答が誘発された（図３Ａ及び表７、免疫原性エピトープを灰色枠中で示す）。対照的に、ＶＢ４０６１＋ＲＳＬＡＩＬ－２により治療されたマウスにおいて、さらに６つの新エピトープが免疫応答を誘導した（Ｍ２、Ｍ８、Ｍ６５、Ｍ１１２及びＭ１２５）。ＲＳＬＡＩＬ－２単剤療法治療マウスから単離された脾細胞は、新エピトープＭ１１２に対する免疫応答のみを誘発した。

これらのデータは、さらに別の異なる前臨床マウスモデルにおいて、ＲＳＬＡＩＬ－２がＶＢ４０６１ワクチン接種マウスにおいて新エピトープ特異的ＩＦＮ－γＴ細胞応答に強力に相乗作用することを明確に実証し、裏付け、従ってＴ細胞増強剤、例えばＲＳＬＡＩＬ－２との併用の個別化ＤＮＡベース新抗原ワクチンの併用の投与により強力な新抗原にフォーカスする免疫応答を誘発することによる患者における臨床アウトカムの改善において本明細書に提供されるアプローチをさらに検証する。さらにこれらの実験において、マウスに腫瘍細胞を注射して腫瘍担持臨床背景を模倣した。ＶＢ４０６１＋ＲＳＬＡＩＬ－２の併用は新エピトープ特異的Ｔ細胞応答の幅（より多くの新エピトープ）及び深さ（各々の新エピトープに対するより強力な応答）の両方を増加させるために有効であることが観察された。

個々のマウスの脾細胞をＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて分析し、免疫原性エピトープについての基準を≧２５個のＩＦＮ－γ＋スポット／１０⁶個の細胞及び＞平均陰性対照（ＶＢ１０２６）＋２×ＳＤと定義した（表７、平均陰性対照の数（ＶＢ１０２６＋２×ＳＤ）を第２列に陰影を付す。

数字はＥＬＩＳｐｏｔにおける個々のマウスの２つ組を表し、ＳＰＵ／１０⁶個の脾細胞として提示する。培地対照中のＳＰＵの平均数を、各々の試料についての新エピトープに対して誘発されたＳＰＵの平均から差し引いた。スポットカウント＜０を有する試料を０として報告する。免疫原性エピトープを≧２５個のＳＰＵ／１０⁶個の脾細胞及び＞平均陰性対照（ＶＢ１０２６）＋２×ＳＤと定義する。免疫原性と考えられるエピトープを灰色枠により示す。

Ｂ１６マウスモデルにおいて観察されるとおり、ＲＳＬＡＩＬ－２により治療されたマウスはＶＢ４０６１によりワクチン接種されたマウスと比較した場合、約２～３倍肥大した脾臓を有することが観察された（表８）。Ｂ１６モデルの場合と同様、脾臓当たりのＩＦＮ－γ分泌Ｔ細胞の総数を計算した。ＲＳＬＡＩＬ－２＋ＶＢ４０６１治療マウスにおいて新エピトープ特異的Ｔ細胞の総数の４倍増加が観察された（図３Ｂ）。

ＶＢ４０６１との併用のＲＳＬＡＩＬ－２の相乗作用効果はＣＤ８＋Ｔ細胞拘束新エピトープに対していっそうより大規模であり、それは併用治療群において６倍増加した（図３Ｃ及び３Ｄ参照）。エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化の誘導はＲＳＬＡＩＬ－２の機序と協調し、それはＩＬ－２Ｒβγを通じて特異的にシグナリングすると示されており、それは、ＣＤ４＋Ｔ細胞を上回る腫瘍殺傷リンパ球、例えばＮＫ及びエフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大及び活性化をＩＬ－２Ｒ鎖のそれらの異なる発現に起因して促進することが示されている。総ＣＤ４＋Ｔ細胞応答に対するＣＴ２６腫瘍モデル試験群の各々についての結果を図３Ｄに示し、それは併用治療群において２．５倍増加を示した。

少なくとも上記の結果に基づき、例示的な新エピトープ癌ワクチン、ＶＢ１０．ＮＥＯ、及びＲＳＬＡＩＬ－２の併用は有意に相乗作用して新エピトープ特異的Ｔ細胞応答をブーストし、ＶＢ１０．ＮＥＯ単剤療法と比較して新エピトープ特異的Ｔ細胞応答の数の最大５倍増加をもたらす。ＲＳＬＡＩＬ－２との併用のＶＢ１０．ＮＥＯにより治療されたマウスは、各々の新エピトープに対する、さらにはより多い新エピトープに対するより強力な応答を呈し、併用が免疫応答の幅及び深さの両方を増加させることを実証した。さらに、新エピトープ特異的Ｔ細胞の頻度及び総数の両方が上昇した。さらに、相乗作用効果は、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答と比較してＣＤ８＋Ｔ細胞応答に対していっそうより大規模であり、強力な新エピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導する併用の能力を裏付けた。

実施例３
ＣＴ２６結腸癌マウスモデルにおけるＶＢ１０．ＮＥＯ新抗原ＤＮＡワクチンと（２，７－（ビス－メトキシＰＥＧ_10KD－カルボキサミド）（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチルＮ－カルバメート）_6AVGインターロイキン－２と抗ＰＤ－１抗体とを用いる併用療法
ＲＳＬＡＩＬ－２がＣＴ２６腫瘍モデルのＶＢ４０６１及び抗ＰＤ－１抗体ワクチン接種マウスにおいて腫瘍保護免疫応答を増加させ得るか否かを探索するためにこの実験を実施した。用いられる例示的な治療新抗原ＤＮＡワクチン、ＶＢ４０６１は、上記表２に上記で示され、並びに図７及び８に示されるＣＴ２６からの２０個の新エピトープをコードする。

この試験において、３６匹の雌ＢＡＬＢ／ｃＪＲｊマウスをＪａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。全てのＢａｌｂ／ｃマウスに０日目に致死用量の５×１０⁴個のＣＴ２６腫瘍細胞をチャレンジした。５０μｇのＶＢ４０６１を０、３、７、１０、１４、２７及び６４日目にエレクトロポレーションにより筋肉内投与（ｉ．ｍ．）した。２００μｇの抗ＰＤ－１抗体を７日目から開始して７日ごとに腹腔内注射（ｉ．ｐ．）し、０．８ｍｇ／ｋｇのＲＳＬＡＩＬ－２を１８日目から開始して９日ごとに静脈内注射（ｉ．ｖ．）した。ＶＢ１０２６（表２に記載）を陰性対照として使用し、ＶＢ４０６１と同日に投与した。この試験において使用されたｐＤＮＡプラスミドを表２に示し、ワクチン接種プロトコルを表９に示す。

腫瘍細胞注射の５６日後、ＶＢ４０６１＋抗ＰＤ－１ Ａｂ（ｎ＝６）により又は３剤併用ＶＢ４０６１＋抗ＰＤ－１ Ａｂ＋ＲＳＬＡＩＬ－２（ｎ＝７）により治療された腫瘍排除マウスに２回目の致死用量の５×１０⁴個のＣＴ２６腫瘍細胞を再チャレンジした。インビボ腫瘍細胞の成長についての対照としてナイーブＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝６）を含めた。別のワクチン接種は実施しなかった。

ＣＴ２６細胞の腫瘍成長を、体重及び電子測径器を使用して腫瘍容積サイズを計測することにより定期的にモニタリングした。マウスの健常状態は、スコアシートに従って厳密に追跡した。腫瘍が体重の＞１０％が達する前にマウスを犠死させた。

ＶＢ４０６１単独及び抗ＰＤ－１との併用は、腫瘍保護応答を誘導する（データ示さず）。この試験において、ワクチン接種は腫瘍保護免疫応答を誘導し得ることが確認された（図４Ａ～４Ｄ）。さらにこの実験の結果は、ＶＢ４０６１及び抗ＰＤ－１によりワクチン接種されたマウスにおける腫瘍保護が、Ｔ細胞拡大剤、ＲＳＬＡＩＬ－２との併用で投与された場合にさらにブーストされることを例示する。腫瘍成長、腫瘍生着及び全生存率を図４Ａ～４Ｃに示す。

再チャレンジ：５６日目に腫瘍排除であった両方の治療アームにおけるＢａｌｂ／ｃマウスに、２回目の致死用量の５×１０⁴個のＣＴ２６腫瘍細胞を別の治療なしで再チャレンジした。腫瘍成長をモニタリングするための対照としてナイーブＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝６）を含めた。マウスを腫瘍成長について再チャレンジの７１日後まで観察した。全ての６匹の対照マウスは急速に腫瘍を発症し、それらを犠死させた。対照的に、ＶＢ４０６１＋抗ＰＤ－１又はＶＢ４０６１＋抗ＰＤ－１＋ＲＳＬＡＩＬ－２により前治療された全てのマウスは２回目の致死用量のＣＴ２６腫瘍細胞に対して完全に保護され、保護メモリー免疫応答の誘導を実証した（図４Ｄ）。

統計的分析：両方の治療群における腫瘍成長曲線（図４Ａ）は対照群と統計的に異なったが、２つの治療群は統計的に異なることはなかった（表１０）。

３剤療法ＶＢ４０６１＋抗ＰＤ－１ Ａｂ＋ＲＳＬＡＩＬ－２治療群において腫瘍成長の低下が観察され、３剤治療マウスの５０％が腫瘍排除のままであり、腫瘍を全く樹立しなかった。対照的に、ＲＳＬＡＩＬ－２なしでＶＢ４０６１＋抗ＰＤ－１抗体を受容したマウス（図４Ｂ）は２０％のみが保護された。治療群間の数値の差にかかわらず、マンテル・コックス検定を使用する統計的分析はＰ＝０．２０８３のＰ値をもたらした（表１１）。

両方の治療アームにおいて樹立腫瘍の腫瘍退縮が観察され、全生存率はＶＢ４０６１＋抗ＰＤ－１、及びＶＢ４０６１＋抗ＰＤ－１＋ＲＳＬＡＩＬ－２治療群の各々においてそれぞれ７０％及び８０％であった（図４Ｃ）。２つの治療アームについての生存曲線のマンテル・コックス検定を使用する統計的分析はそれら２つの群において統計的に有意な差を示さなかったが、両方の治療アームは、対照群と比較した場合、有意性に達した（表１１）。

再チャレンジ実験において、両方の治療群は致死用量のＣＴ２６細胞に対して完全に保護され、両方の群は腫瘍成長及び全生存率の両方で対照群と統計的に異なった（表１２）。

ＶＢ４０６１＋抗ＰＤ１によりワクチン接種されたマウスにおいて観察された腫瘍保護は、Ｔ細胞拡大剤、即ちＲＳＬＡＩＬ－２と併用された場合、さらに強化された。これらの結果は、これらのユニーク且つ非重複機序の統合を使用して樹立腫瘍の有効な治療を作出することができることを実証する。致死用量の腫瘍細胞により再チャレンジされたマウスにおいて、両方の治療群は完全に保護され、治療法が長時間持続及び腫瘍保護メモリー免疫応答を誘導することを実証した。

マウスにおける進行中の腫瘍チャレンジ実験において、ＲＳＬＡＩＬ－２による治療の開始時の腫瘍負荷は応答を予測し得ることが考えられ、例えば完全奏効は１回目の用量のＲＳＬＡＩＬ－２の投与時に腫瘍サイズが６ｍｍ未満であったマウスについてより多数観察された。

非治療マウス（対照）及びｈＶＢ４０６１＋抗ＰＤ－１＋ＲＳＬＡＩＬ－２により治療されたマウスの群についての腫瘍長さを、電子測径器を使用して腫瘍長さサイズ（ｍｍ）を計測することにより定期的にさらにモニタリングした。この試験において、ワクチン接種がＣＴ２６結腸癌腫マウスモデルにおいて腫瘍退縮及び安定化を誘導し得ることが確認された（図７Ａ～７Ｂ）。この実験の結果は、ＶＢ４０６１及び抗ＰＤ－１によりワクチン接種されたマウスにおける腫瘍保護が、ＲＳＬＡＩＬ－２との併用で投与された場合にさらにブーストされたことを例示する。図７Ｂに示されるとおり、ＲＳＬＡＩＬ－２の投与との併用のＶＢ４０６１及び抗ＰＤ－１によるマウスのワクチン接種は、比較的小さい腫瘍（例えば約５～６ｍｍ未満の腫瘍）を有するマウスにおける急速で完全な長時間持続の腫瘍退縮及びより大きい腫瘍（例えば約５～６ｍｍよりも大きく、さらには約１０ｍｍよりも大きい腫瘍）の長時間持続の安定化をもたらした。

実施例４
現在の標準治療の免疫チェックポイント遮断により完全奏効に達しなかった局所進行又は転移性黒色腫、ＮＳＣＬＣ、淡明腎細胞癌、尿路上皮癌又は頭頸部の扁平上皮癌を有する患者における個別化ＶＢ１０．ＮＥＯ新抗原ＤＮＡワクチン単独又は（２，７－（ビス－メトキシＰＥＧ_10KD－カルボキサミド）（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチルＮ－カルバメート）_6AVGインターロイキン－２を用いるヒトにおける第１／２Ａ相試験
目的：この第１／２ａ相試験の主要目的は、（ｉ）複数用量の３ｍｇのＶＢ１０．ＮＥＯ免疫療法及び（ｉｉ）０．００６ｍｇ／ｋｇのＲＳＬＡＩＬ－２との併用の複数用量の３ｍｇのＶＢ１０．ＮＥＯ免疫療法の安全性／忍容性を評価することである。副次目的には、（ｉ）複数用量の３ｍｇのＶＢ１０．ＮＥＯ免疫療法及び０．００６ｍｇ／ｋｇのＲＳＬＡＩＬ－２との併用の複数用量の３ｍｇＶＢ１０．ＮＥＯ免疫療法の免疫原性の評価、並びに（ｉｉ）複数用量の３ｍｇのＶＢ１０．ＮＥＯ免疫療法及び０．００６ｍｇ／ｋｇのＲＳＬＡＩＬ－２との併用の複数用量の３ｍｇのＶＢ１０．ＮＥＯ免疫療法の有効性のさらなる予備評価が含まれる。さらなる探索目的には、例えば治療法の間の免疫シグネチャー変更の調査、及びＶＢ１０．ＮＥＯ免疫療法単独又はＲＳＬＡＩＬ－２との併用の後の免疫学的応答と臨床有効性との間の相関の探索が含まれる。

論拠：前臨床試験（上記）は、ＶＢ１０．ＮＥＯ及びＲＳＬＡＩＬ－２の併用が相乗作用して新エピトープ特異的Ｔ細胞応答をブーストし、ＶＢ１０．ＮＥＯ単独と比較して新エピトープ特異的Ｔ細胞応答の数の５倍増加をもたらすことを示した。ＲＳＬＡＩＬ－２との併用のＶＢ１０．ＮＥＯにより治療されたマウスは、各々の新エピトープに対する及び増加した新エピトープの数に対するより強力な応答の両方を示し、免疫応答の幅及び深さの両方が上昇することを示した。併用は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答に対するいっそうより明らかな効果を示した。それというのも、その併用が単独で投与される場合の薬物のいずれかと比較して多くの新エピトープに対する新エピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発し、強力な新エピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導する併用の能力をさらに強化したためである。治療腫瘍モデルにおいて、ＶＢ１０．ＮＥＯ、ＲＳＬＡＩＬ－２及びチェックポイント阻害剤、抗ＰＤ－１抗体の３剤併用により治療されたマウスにおいて完全レスポンダーの数の増加が観察され、前臨床モデルにおいて示されたそれらのユニーク且つ非重複機序を一緒にまとめて樹立腫瘍の有効な治療を作出することについての強力な論拠を実証した。

この試験は、局所進行又は転移性固形腫瘍を有する患者におけるチェックポイント阻害の背景でＲＳＬＡＩＬ－２との併用の複数用量のＶＢ１０．ＮＥＯの安全性、免疫原性及び有効性を調査する。併用アームにおいて、患者はＶＢ１０．ＮＥＯワクチン接種及び０．００６ｍｇ／ｋｇ ＩＶのＲＳＬＡＩＬ－２を受容し、１回目の用量をＶＢ１０．ＮＥＯワクチン接種の開始の１１週間後に投与する。より特定すると、このオープンラベルファーストインヒューマン第１／２ａ相試験は、現在の標準治療（即ちチェックポイント阻害剤療法、ＣＰＩ）により完全奏効に達しなかった局所進行又は転移性固形腫瘍、例として黒色腫、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）、淡明細胞ＲＣＣ（腎細胞癌）、尿路上皮癌又はＳＣＣＨＮ（頭頸部の扁平上皮癌）を有する患者における個別化ＶＢ１０．ＮＥＯ又はＶＢ１０．ＮＥＯ及びＲＳＬＡＩＬ－２免疫療法の併用を用いる複数投与の安全性及び有効性を評価するように設計する。ＣＰＩ標準治療には、例えばニボルマブ、ペムブロリズマブ又はアテゾリズマブが含まれる。この試験プロトコルは、試験過程の間に修正することができる。

試験のパートＡは、５つの異なる腫瘍実体の６つのアームからなる。全ての患者にＣＰＩ療法の背景でＶＢ１０．ＮＥＯを投与する。患者は、少なくともワクチン製造の開始（アーム１、５Ａ及び５Ｂ）から、又はさらなる≧１２週間（アーム２～４）、ＣＰＩを受容する。アーム５（ＳＣＣＨＮ）をアーム５Ａ及びアーム５Ｂに分ける。アーム５ＡにＶＢ１０．ＮＥＯを投与する一方、アーム５ＢはＶＢ１０．ＮＥＯ及びＲＳＬＡＩＬ－２の併用を受容する。
・アーム１ 黒色腫 ＶＢ１０．ＮＥＯ
・アーム２ ＮＳＣＬＣ ＶＢ１０．ＮＥＯ
・アーム３ ＲＣＣ ＶＢ１０．ＮＥＯ
・アーム４ 尿路上皮癌 ＶＢ１０．ＮＥＯ
・アーム５Ａ ＳＣＣＨＮ ＶＢ１０．ＮＥＯ
・アーム５Ｂ ＳＣＣＨＮ ＶＢ１０．ＮＥＯ＋ＲＳＬＡＩＬ－２（併用）

最大１０人の患者を各々のアームにおいて試験の第１相（パートＡ）において治療する。

試験のパートＢは、ある数の患者が登録され、パートＡにおいて分析された後にオープンする。拡大パートＢは、最大３つの腫瘍特異的拡大コホートを含む。

試験を３つの期間：スクリーニング及び製造期間、治療期間、並びに長期フォローアップ期間に分ける。

新抗原性ワクチン、ｐＶＢ１０．ＮＥＯは、個別化ヒトワクチン中に含まれる新エピトープの数に依存性の６２９７～７４０７塩基対の非複製、非統合、遺伝子安定及び非病原性でネイキッドの共有結合閉環及びスーパーコイル二本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）プラスミドである。これは、３つのモジュール：標的化、二量体化及び新エピトープ抗原性モジュールからなる単一組換えホモ二量体タンパク質をコードする。新エピトープ抗原性モジュールは、新エピトープ配列を形成するための数個（１４～２７個）のアミノ酸の全長に及ぶ体細胞突然変異／変更を含み、１０アミノ酸フレキシブルグリシン／セリンリッチリンカーにより一緒に結合される複数（１０～２０個）の患者特異的新エピトープからなる。新エピトープ抗原性モジュールは、ヒトＩｇＧ３に由来する二量体化モジュールにより天然ヒトケモカインマクロファージ炎症性タンパク質－１α（標的化モジュール）に結合している。転写産物はほぼ１００ｋＤａの６０３～９７３アミノ酸含有タンパク質に翻訳され、それはほぼ２００ｋＤａの二量体タンパク質を形成する。図１２参照。

新エピトープ間に使用されるグリシン／セリンリッチリンカーは、典型的には接合配列の評価に基づき異なる患者ワクチンについて構築物ごとに変化し、その結果、好ましいリンカーは、ヒトゲノム中に見出される配列に類似する接合エピトープを除外するものである。新エピトープ間に使用することができる例示的なリンカーには、配列番号６７～７６に提供されるものが含まれる。

ＶＢ１０．ＮＥＯワクチンのスクリーニング、製造、及び送達：ＶＢ１０．ＮＥＯを２ｍＬの無菌シクロオレフィンコポリマーバイアル中でリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４中３ｍｇ／ｍＬの濃度において無菌調製済み溶液として供給する。バイアルを－２０℃（±５℃）において貯蔵する。無針注射システム、ＰＨＡＲＭＡＪＥＴ（登録商標）Ｓｔｒａｔｉｓ ０．５ｍＬ Ｎｅｅｄｌｅ Ｆｒｅｅ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用してワクチンを投与する。

個別化ワクチンを調製するため、自己免疫を誘導するリスクが低い免疫原性新エピトープを同定する承認アルゴリズムに基づき新エピトープを選択する。次いで、個々のＶＢ１０．ＮＥＯワクチンを合成し；腫瘍サンプリングから投与までのプロセスはほぼ１２から１６週間、好ましくは６～１０週間、より好ましくは４～６週間を要することが推定される。ワクチン接種は筋肉内注射により行う。

全ての適格基準（例えば平均余命≧６ヵ月及び進行中の良好なパフォーマンスステータス（Ｅａｓｔｅｒｎ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ［ＥＣＯＧ］パフォーマンスステータス≦１を有する）を満たす患者が、試験登録のために許容可能である。

アーム１～４：スクリーニングされた患者は、患者の標準治療として現在承認される適応に従ってチェックポイント阻害剤（抗ＰＤ－１又は抗ＰＤ－Ｌ１）を少なくとも１２週間受容していなければならない。

アーム５Ａ及び５Ｂ：患者は、ＣＰＩ治療がＳＣＣＨＮについての患者の標準治療として開始されている限りスクリーニングすることができる。

スクリーニング来院時、適格患者は血液試料及び少なくとも１つの腫瘍標本を提供する。血液試料及び腫瘍標本は必須である。適切な腫瘍標本が利用可能であれば、患者を登録し、個別化新抗原ワクチン製造期間が開始する（ほぼ１２～１６週間）。

血液及び組織試料をエキソームシーケンシングプログラムに含め、血液及び（複数の）腫瘍試料からシーケンシングされたエキソームを比較して患者の個々の体細胞腫瘍特異的突然変異（新エピトープ）を同定する。血液及び組織試料をエキソームシーケンシングプログラムに含め、血液及び（複数の）スクリーニング腫瘍試料からシーケンシングされたエキソームを比較して患者の個々の体細胞腫瘍特異的突然変異（新エピトープ）を同定する。ＶＢ１０．ＮＥＯワクチンを設計／アセンブルする場合、２つ以上の試料（新鮮生検物、利用可能な保管腫瘍標本及び血液からの無細胞（ｃｆ）ＤＮＡ）中に見出された新エピトープを優先的に選択する。

腫瘍試料をＲＮＡシーケンシングに供して腫瘍中で発現されたタンパク質中に見出された新エピトープを選択する。さらに、血液試料をＨＬＡタイピングに使用して個々の患者のＨＬＡ分子に結合する新エピトープを選択する。個別化ＶＢ１０．ＮＥＯ免疫療法によるワクチン接種は、患者特異的ＶＢ１０．ＮＥＯワクチンが利用可能になり次第、及び患者特異的ワクチンが製造後に全ての事前に規定された製品リリース基準を満たす場合、開始する。

凍結乾燥粉末として提供されるＲＳＬＡＩＬ－２は投与前に臨床医により再構成され、各々の患者の用量は患者のキログラム体重により決定される。ＲＳＬＡＩＬ－２を投与スケジュールに従って０．００６ｍｇ／ｋｇの開始用量において３０（±５）分間にわたり静脈内投与する。１回目の用量を除き、ＲＳＬＡＩＬ－２はＶＢ１０．ＮＥＯと同日に投与する。ワクチン接種を最初に行い、ＲＳＬＡＩＬ－２投与を２時間後に行う。ＣＰＩによる治療を同日に行う場合、投与は以下の順序と時間間隔である：（１）ＶＢ１０．ＮＥＯ（２時間待機）；（２）ＲＳＬＡＩＬ－２（３０分間待機）（３）ＣＰＩ。

ＲＳＬＡＩＬ－２について用量遅延及び低下が許容される。観察される薬物関連毒性に基づきＲＳＬＡＩＬ－２の投与を遅らせ、又は用量を０．００３ｍｇ／ｋｇに低下させることができる。ＲＳＬＡＩＬ－２用量を０．００３ｍｇ／ｋｇに低下させる場合、用量レベルは残りの試験全体にわたりこのレベルのままであるべきである。

個別化ワクチン製造期間の間、イメージング手順（コンピュータ断層撮影／磁気共鳴イメージング、例えばＣＴ／ＭＲＩを標準患者ケアの一部として実施し、最新のイメージング手順が有効性評価についてのベースラインとして機能する。完全奏効を有する患者又は治療期間の開始前にＣＰＩ治療を中断した患者又はさらなる抗癌治療を開始した患者は、ワクチンの製造が完了すると、担当医及び依頼者の同意時にＶＢ１０．ＮＥＯ（及びアーム５ＢについてはＲＳＬＡＩＬ－２）を受容する見込みをなおも有する。

ＶＢ１０．ＮＥＯ（全てのアーム）：ワクチン接種を第１回来院時に開始する。患者は、少なくとも製造の開始から（アーム５Ａ及び５Ｂ）又はさらなる≧１２週間（アーム１～４）、ＣＰＩを受容している。患者は、ＣＰＩに加えて１回目のワクチン接種から最大１年間、事前に規定された時点においてそれぞれ３ｍｇのＶＢ１０．ＮＥＯの最大１４回のワクチン接種を受容する。ＶＢ１０．ＮＥＯワクチンをこの継続ＣＰＩ治療に加え、標準療法を置き換えず、省略せず、延期せず、終結させない。ワクチン接種誘導期間において、患者は、それらのＣＰＩに加えて３週間ごとに３ｍｇのＶＢ１０．ＮＥＯの３回のワクチン接種を受容する。１０週目から、患者はそれらのＣＰＩに加えて１回目のワクチン接種から最大１年間、４週間ごとのワクチン接種による維持治療を受容する。

ＲＳＬＡＩＬ－２（アーム５Ｂ）：ＲＳＬＡＩＬ－２による投与を１１週目（第８Ａ回来院）、４回目のＶＢ１０．ＮＥＯワクチン接種の１週間後及びＶＢ１０．ＮＥＯがロバストな新抗原特異的Ｔ細胞応答を作出したと予測される場合、開始する。アーム５Ａに登録されたＳＣＣＨＮを有する患者は、意思があり、且つアーム５Ｂについての全ての選択基準を満たす場合、アーム５Ｂに移行することができ（担当医及び依頼者の同意時）、１１週目又は３４週目までの維持期間における任意の後のＶＢ１０．ＮＥＯワクチン接種来院の１週間後（即ち１０回目のＶＢ１０．ＮＥＯ用量、１８週目＋１週間）にＲＳＬＡＩＬ－２による治療を開始することができる。少なくとも１回の用量のＶＢ１０．ＮＥＯワクチン接種を受容した患者が、ＲＳＬＡＩＬ－２投与に適格である。

アーム５Ｂの患者は、ＶＢ１０．ＮＥＯ及びＣＰＩに加えて０．００６ｍｇ／ｋｇ ＩＶのＲＳＬＡＩＬ－２を受容する。最初の２回の用量のＲＳＬＡＩＬ－２ ４を３週間ごとの間隔及び後続の用量を４週間ごとの間隔で投与する。治療は、第１８回来院（５０週目）における治療終了（ＥｏＴ）まで継続する。ＲＳＬＡＩＬ－２開始の時点に応じて、患者は最大１１回の用量のＲＳＬＡＩＬ－２を受容する。１回目のＲＳＬＡＩＬ－２用量を除き、全ての後続の用量はＶＢ１０．ＮＥＯと同日に投与する。

生検及び血液手順：
アーム１～４：スクリーニングと１回目のＶＢ１０．ＮＥＯワクチン接種との間の、及びＶＢ１０．ＮＥＯワクチン接種に応答する変化を捕捉するため、最大３回の生検を第１回来院（１回目のＶＢ１０．ＮＥＯワクチン接種）時に行い、１回の生検を第１０回来院時（１８週目）に行う。これは合計最大１０回の生検をもたらす（スクリーニング時に３回、第１回来院時に３回、第１０回来院時に１回、及び１回目のワクチン接種後の任意の時点における最大３回のさらなる生検）。

アーム５Ａ及び５Ｂ：ＲＳＬＡＩＬ－２投与前後の変化を特徴付けするため、ＲＳＬＡＩＬ－２の１回目の投与の７日前及び１５～２１日後以内に任意選択の生検を提供することを患者に依頼する。さらに、生検は第１回来院時に行うことができる。これらの時点の各々において、最大３回の生検を行う。これは合計最大１３回の生検をもたらす（スクリーニング時に３回、第１回来院時に３回、１回目のＲＳＬＡＩＬ－２用量の１週間前に３回、１回目の投与の１５～２１日後に３回、及び１回目のワクチン接種後の任意の時点における１回のさらなる生検）。

試験の間、患者が任意の原因のために切除を受ける場合、さらなる分析のために腫瘍材料を確保すべきである。

上記の全ての生検は任意選択であり、患者の同意があり、試験担当医の意見で患者に不当なリスクを負わせない安全にアクセス可能な病変の場合にのみ行うべきである。試験担当医は、どの腫瘍病変が好ましいか、及び十分な腫瘍細胞含有率を有する高品質試料を確保するためにＣＴガイド生検が必要とされるか否かを決定する。患者への放射線負荷を最小化するため、ＣＴガイド生検はこの試験過程の間、最大５回の生検に制限される。

全てのアーム：治療の間の血漿中の患者特異的腫瘍突然変異のエキソームシーケンシング及びモニタリングのためのｃｆＤＮＡの単離のため、血液試料をスクリーニング、第２回、第８回、第１０回、第１３回及び第１８回来院時に採取する。

全てのアーム：血液試料（末梢血単球細胞［ＰＢＭＣ］）を、第１回来院（ベースライン）、第８Ａ回来院（１１週目）、第１１回来院（２２週目）、第１４回来院（３４週目）、及び第１９回来院（最後のワクチン接種の３０日後）時に採取して末梢新エピトープ特異的Ｔ細胞応答を定量する。参加を終了し、又は５０週目前に治療を中断する患者については、ＰＢＭＣのための血液試料を最後のワクチン接種の３０日後のフォローアップ来院時に採取する。

アーム５Ａ及び５Ｂにおいて、さらなる血液試料（ＰＢＭＣ）を第８Ｂ回来院／１２週目において採取する。この試料を使用してＴ細胞拡大剤、ＲＳＬＡＩＬ－２により誘導される末梢新エピトープ特異的Ｔ細胞応答を定量する。

アーム５Ａ及び５Ｂにおいて、血液試料を３回目のＶＢ１０．ＮＥＯワクチン接種（第７Ａ回来院／７週目）の７～１４日後及び１回目のＲＳＬＡＩＬ－２投与（第８Ｂ回来院／１２週目）の７日後に採取して新エピトープ特異的Ｔ細胞を詳細に特徴付けする。機能的分析には、例えばフローサイトメトリー、ＥＬＩＳｐｏｔ、酵素結合免疫吸着アッセイ、及び細胞毒性アッセイが含まれ得、それを腫瘍組織／標本から単離されたＴ細胞クローンと比較する。

治療に対する有効性を以下のとおり評価する。ＶＢ１０．ＮＥＯ及びＲＳＬＡＩＬ－２に対する腫瘍応答を、ｉＲＥＣＩＳＴにより定期的間隔において標準実務に従って評価する。イメージング手順を標準患者ケアの一部として実施し、患者はこの試験の参加に起因していかなる別の放射線にも曝露されない。

１２～１６週間のＶＢ１０．ＮＥＯの製造期間に起因して、標準実務として実施される少なくとも２回のイメージング手順が治療開始前に利用可能であるべきであり、２つのうちの後者は第１回来院の４週間以内である。

第１回来院の４週間以内に実施されるイメージングは、ｉＲＥＣＩＳＴに従う腫瘍評価についてのベースラインである。アーム５Ｂについて、イメージング評価は好ましくは１回目の用量のＲＳＬＡＩＬ－２の可能な限り直前に実施すべきである。

理想的には、同一の評価方法（イメージングモダリティ、例えばＭＲＩ又はＣＴ）を使用して標準治療の個々の施設の実務に従って個々の患者についてベースラインにおいて及び全てのフォローアップ実験の間にそれぞれ同定及び報告された病変を特徴付けする。

有効性分析：ＶＢ１０．ＮＥＯ免疫療法単独又はＲＳＬＡＩＬ－２との併用の有効性の早期兆候は、全奏効率（ＯＲＲ）、奏効期間（ＤＯＲ）、無進行生存（ＰＦＳ）、全生存率（ＯＳ）に基づく。有効性分析は、パートＡ及びパートＢにおける各々の腫瘍実体特異的コホートについて別個に行う。有効性エンドポイントを、適用可能である場合、割合についての９５％信頼区間を含め、記述的に分析する。カプラン・マイヤー積極限法を使用してＤＯＲ、ＰＦＳ及びＯＳを分析する。

実施すべきさらなる評価には、バイタルサイン（体温、酸素化、脈拍数、並びに最高及び最低血圧、血圧のモニタリング、脈拍及びＥＣＧ並びに血液評価が含まれる。血液分析には、以下が含まれる：示差的な白血球分析、ヘモグロビン、ヘマトクリット、赤血球数、血小板数、尿素、カルシウム、塩化物、無機リン、カリウム、ナトリウム、クレアチニン、尿酸、Ｃ反応性タンパク質、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ、ビリルビン、リパーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、遊離トリヨードサイロニン（ｆＴ３）、遊離チロキシン（ｆＴ４）、グルコース、タンパク質、アルブミン、部分トロンボプラスチン時間、国際標準比、コレステロール、トリグリセリド、コリンエステラーゼ、クレアチンキナーゼ。必要により、血清も回収及び冷凍して評価する。尿検査も実施する。ＰＢＭＣの単離及び凍結保存のために血液試料も回収する。

個別化ＶＢ１０．ＮＥＯワクチン方針の末梢免疫応答を、Ｔ細胞活性についての代理のＩＦＮ－γ酵素結合免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳｐｏｔ）により計測する。ワクチン中に含まれる各々の新エピトープに対する免疫応答を個々に評価する。十分なＰＢＭＣを有する患者については、別の分析を細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析、四量体分析及び細胞内サイトカイン染色により実施してＴ細胞プロファイルを特徴付けすることができる。さらに、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）レパトアの別の分析をＴＣＲシーケンシングにより実施することができる。

Claims (57)

1. 癌を有する対象を治療する方法であって、
   前記対象に、（ｉ）腫瘍新抗原からの複数の新エピトープに指向される抗癌ＤＮＡワクチン、及び（ｉｉ）Ｔ細胞の産生を刺激／拡大するために有効な化合物を投与すること
   を含む方法。
2. 癌を有する対象を治療する方法であって、
   前記対象に、（ｉ）腫瘍新抗原からの複数の新エピトープに指向される抗癌ＤＮＡワクチン、（ｉｉ）Ｔ細胞の産生を刺激／拡大するために有効な化合物、及び（ｉｉｉ）チェックポイント阻害剤を投与すること
   を含む方法。
3. 前記ワクチン中に含まれる前記新エピトープが免疫系にワクシボディ二量体タンパク質として提示される、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記抗癌ＤＮＡワクチンが、（ｉ）標的化ユニット、例えばｈＭＩＰ－１αなど、（ｉｉ）二量体化ユニット、例えばｈＩｇＧ３のｈ１及びｈ４並びにＣ_H３ドメインなど、（ｉｉｉ）第１のリンカー、及び（ｉｖ）抗原性ユニットをコードするヌクレオチド配列を含む免疫学的有効量のＤＮＡポリヌクレオチドを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記抗原性ユニットがｎ－１個の抗原性サブユニットを含む、請求項４に記載の方法。
6. 各々のサブユニットが癌新エピトープ配列の少なくとも一部及び第２のリンカーを含み、前記抗原性ユニットが最終癌新エピトープ配列をさらに含む、請求項５に記載の方法。
7. ｎが３～５０の整数である、請求項５又は６に記載の方法。
8. 前記抗癌ＤＮＡワクチンが、抗原性ユニットをコードするヌクレオチド配列を含む免疫学的有効量のＤＮＡポリヌクレオチドを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記抗原性ユニットがｎ－１個の抗原性サブユニットを含む、請求項８に記載の方法。
10. 各々のサブユニットが癌新エピトープ配列の少なくとも一部及びリンカーを含み、前記抗原性ユニットが最終癌新エピトープ配列をさらに含む、請求項８又は９に記載の方法。
11. ｎが３～５０の整数である、請求項９又は１０に記載の方法。
12. 前記抗癌ＤＮＡワクチンが、１０～５０個の新エピトープを含むワクシボディＤＮＡワクチンである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記抗癌ＤＮＡワクチンが、１５～４０個の新エピトープを含むワクシボディＤＮＡワクチンである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記第１及び／又は第２のリンカーが、アミノ酸リンカー、例えばグリシン／セリンリッチリンカー及び／又は配列番号６７～７６から選択されるリンカーである、請求項４～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記抗癌ＤＮＡワクチンが、ヒトであるＤＮＡポリヌクレオチド配列（例えば前記抗癌性ユニットを除く配列番号７７の又はそれと９５パーセント以上の配列同一性を有するプラスミド骨格配列など）を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記投与が、添加剤よりも大きいＴ細胞の産生を刺激／拡大するために有効な前記化合物の不存在下で前記抗癌ＤＮＡワクチンの投与時に達成されるものと比べてワクチン新エピトープに対する特異的クローンＴ細胞拡大を増強するために有効である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. Ｔ細胞の産生を刺激／拡大するために有効な前記化合物がインターロイキン－２（ＩＬ－２）のプロドラッグであり、前記ＩＬ－２が複数のポリエチレングリコール部分の放出可能な共有結合により修飾されている、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記ＩＬ－２がインターロイキン－２受容体ベータ（ＩＬ－２Ｒβ）選択的作動薬である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記ＩＬ－２がアルデスロイキンである、請求項１７又は１８に記載の方法。
20. Ｔ細胞の産生を刺激／拡大するために有効な前記化合物が式（Ｉ）
    

    

    ［式中、ＩＬ－２はインターロイキン－２であり、
    －ＮＨ－ＩＬ－２はインターロイキン－２のアミノ基であり、
    各々の整数（ｎ）は約２００～３００の値を有する］
    のＩＬ－２Ｒβ選択的作動薬
    又は薬学的に許容可能なその塩形態である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
21. Ｔ細胞の産生を刺激／拡大するために有効な前記化合物が（２，７－（ビス－メトキシＰＥＧ_10kd－カルボキサミド）（９ｈ－フルオレン－９－イル）メチルＮ－カルバメート）_6avgインターロイキン－２である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記癌が癌性腫瘍を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記抗癌ＤＮＡワクチン及びＴ細胞の産生を刺激／拡大するために有効な前記化合物の投与が、臨床又は前臨床背景のいずれかで評価する場合、前記腫瘍中のワクチン誘導Ｔ細胞の数を、１回以上の用量の抗癌ＤＮＡワクチン単独の後続の投与時に決定されるそのようなＴ細胞と比べて増加させるために有効である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記癌が固形癌である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記癌が乳癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、骨癌、結腸直腸癌、胃癌、リンパ腫、悪性黒色腫、肝癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膵癌、甲状腺癌、腎癌、腎細胞癌、胆管の癌、頭頸部の癌、頭頸部の扁平上皮癌、脳癌、子宮頸癌、上顎洞癌、膀胱癌、尿路上皮癌、食道癌、ホジキン病及び副腎皮質癌からなる群から選択される、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記癌が黒色腫又は結腸癌である、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記抗癌ＤＮＡワクチン及び前記Ｔ細胞拡大剤を同時に又は連続的に投与する、請求項１又は３～２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記抗癌ＤＮＡワクチン及び前記Ｔ細胞拡大剤を同一又は異なる投与経路により投与する、請求項１又は３～２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記抗癌ＤＮＡワクチン及び前記Ｔ細胞拡大剤を同日に、異なる日に、又は同日及び異なる日の両方の混合で投与する、請求項１又は３～２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記抗癌ＤＮＡワクチン、前記Ｔ細胞拡大剤及び／又は前記チェックポイント阻害剤を同時に、連続的に又は同時及び連続の組み合わせで投与する、請求項２～２６のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記抗癌ＤＮＡワクチン、前記Ｔ細胞拡大剤及び／又は前記チェックポイント阻害剤を同一又は異なる投与経路により投与する、請求項２～２６又は３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 前記抗癌ＤＮＡワクチン、前記Ｔ細胞拡大剤及び／又は前記チェックポイント阻害剤を同日に、異なる日に、又は同日及び異なる日の両方の混合で投与する、請求項２～２６又は３０～３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記投与が単一サイクルの投与又は複数サイクルの投与を含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記投与が、１回以上の用量の前記抗癌ＤＮＡワクチン及びＴ細胞の産生を刺激／拡大するために有効な前記化合物の各々又は両方を投与することを含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記投与が、１回以上の用量の前記抗癌ＤＮＡワクチン、Ｔ細胞の産生を刺激／拡大するために有効な前記化合物、及び／又は前記チェックポイント阻害剤の各々、その併用、又はその全てを投与することを含む、請求項２～２６又は３０～３４のいずれか一項に記載の方法。
36. Ｔ細胞の産生を刺激／拡大するために有効な前記化合物を前記抗癌ＤＮＡワクチンの投与後に投与する、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
37. Ｔ細胞の産生を刺激／拡大するために有効な前記化合物を抗癌ＤＮＡワクチン誘導期後に投与し、そのような誘導期が前記抗癌ＤＮＡワクチンの１回以上の投与に及び得る、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記誘導期は所与の期間にわたる前記抗癌ＤＮＡワクチンの１、２、３回以上の投与を含む、請求項３７に記載の方法。
39. Ｔ細胞の産生を刺激／拡大するために有効な前記化合物を１回以上のワクチン接種後に投与し、その時点で新エピトープ特異的Ｔ細胞応答は実質的に平らになっており、即ち有意に増加していない、請求項３７又は３８に記載の方法。
40. Ｔ細胞の産生を刺激／拡大するために有効な前記化合物を新エピトープ特異的Ｔ細胞応答が最大に達した後に投与する、請求項３７～３９のいずれか一項に記載の方法。
41. Ｔ細胞の産生を刺激／拡大するために有効な前記化合物を、新エピトープ特異的Ｔ細胞応答がその最大の±２５％に達し、又はその最大の±１５％以内になり、又はその最大の約±１０％以内になった後に投与する、請求項４０に記載の方法。
42. 投与が、前記抗癌ＤＮＡワクチン及びＴ細胞の産生を刺激／拡大するために有効な前記化合物の各々を投与して前記抗癌ＤＮＡワクチン及びＴ細胞の産生を刺激／拡大するために有効な前記化合物の両方のピークＴ細胞応答を整合し、又は実質的に整合し、それにより最適化Ｔ細胞応答を提供することを含む、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。
43. Ｔ細胞の産生を刺激／拡大するために有効な前記化合物を１回以上の用量の前記抗癌ＤＮＡワクチンの投与後の一定期間投与する、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。
44. Ｔ細胞の産生を刺激／拡大するために有効な前記化合物を１～５回の用量の前記抗癌ＤＮＡワクチン後に投与する、請求項４３に記載の方法。
45. 投与が、Ｔ細胞の産生を刺激／拡大するために有効な前記化合物を１～５回の用量の前記抗癌ＤＮＡワクチンの５～１０日後に、及び又は１～４回の用量の前記抗癌ＤＮＡワクチン後に、又は１～３回の用量の前記抗癌ＤＮＡワクチン後に投与することを含む、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。
46. 前記抗癌ＤＮＡワクチン及び前記抗癌ＤＮＡワクチンの投与が前記特異的Ｔ細胞応答の増強を提供するために有効である、請求項４４又は４５に記載の方法。
47. Ｔ細胞の産生を刺激／拡大するために有効な前記化合物を２又は３回の用量の前記抗癌ＤＮＡワクチン後に投与する、請求項４４～４６のいずれか一項に記載の方法。
48. 前記ワクチン誘導期間が２回以上のワクチン接種を含み、各々の後続のワクチン接種を前記抗癌ＤＮＡワクチンの１回目の投与後１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間以上だけ離隔する、請求項３７～４７のいずれか一項に記載の方法。
49. 各々の後続のワクチン接種を前記抗癌ＤＮＡワクチンの１回目の投与後３又は４週間だけ離隔する、請求項４８に記載の方法。
50. 前記ワクチン誘導期間がそれぞれ１～６週間だけ離隔される３回のワクチン接種を含む、請求項３７～４９のいずれか一項に記載の方法。
51. 前記チェックポイント阻害剤が抗ＰＤ－１抗体である、請求項２～２６又は３０～５０のいずれか一項に記載の方法。
52. 前記チェックポイント阻害剤を１回又は複数のラウンドで、（ｉ）前記抗癌ＤＮＡワクチンと同日に、（ｉｉ）Ｔ細胞の産生を刺激／拡大するために有効な前記化合物と同日に、（ｉｉｉ）前記抗癌ＤＮＡワクチンの投与後に、（ｉｖ）Ｔ細胞の産生を刺激／拡大するために有効な前記化合物の投与後に、（ｖ）前記抗癌ＤＮＡワクチンの投与後であるが、Ｔ細胞の産生を刺激／拡大するために有効な前記化合物の投与前に、又は（ｖｉ）前記抗癌ＤＮＡワクチン及びＴ細胞の産生を刺激／拡大するために有効な前記化合物の投与後に前記抗癌ＤＮＡワクチン及びＴ細胞の産生を刺激／拡大するために有効な前記化合物と同日に投与し、前記化合物を前記ワクチン後に投与する、請求項２～２６又は３０～５１のいずれか一項に記載の方法。
53. 前記チェックポイント阻害剤の投与が、前記チェックポイント阻害剤を治療過程にわたり２回以上投与することを含む、請求項２～２６又は３０～５２のいずれか一項に記載の方法。
54. 投与が、前記ワクチン、前記化合物及び前記チェックポイント阻害剤を同日に、前記ワクチン、前記化合物及び前記チェックポイント阻害剤の順序で投与することを含む、請求項２～２６又は３０～５０のいずれか一項に記載の方法。
55. 前記癌が癌性腫瘍を含み、前記投与が前記癌性腫瘍のサイズを治療前の前記腫瘍のサイズと比較して低下させるために有効である、請求項１～５４のいずれか一項に記載の方法。
56. 前記癌が癌性腫瘍を含み、前記投与が前記癌性腫瘍のサイズを前記投与前の前記腫瘍のサイズと比較して少なくとも約３０％だけ、少なくとも約４０％だけ、少なくとも約５０％だけ、少なくとも約６０％だけ、少なくとも約７０％だけ、少なくとも約８０％だけ、少なくとも約９０％だけ低下させ、又は完全腫瘍退縮をもたらすために有効である、請求項１～５５のいずれか一項に記載の方法。
57. 前記癌が癌性腫瘍を含み、前記投与が完全腫瘍退縮をもたらすために有効である、請求項１～５６のいずれか一項に記載の方法。

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