JP2024518463A - 構築物及び免疫阻害化合物の共発現 - Google Patents

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Abstract

本発明は、別個の分子として共発現されるように操作された複数の核酸配列を含む、ＤＮＡプラスミドなどのベクターに関する。このような別個の分子は、第１のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を標的とする標的化ユニット、二量体化ユニットなどの多量体化ユニット、並びに自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む抗原性ユニット、及び１つ以上の免疫阻害化合物を含む。

Description

本発明は、別個の分子として共発現されるように操作された複数の目的の核酸配列を含むＤＮＡプラスミドなどのベクター、このようなベクターを含む医薬組成物、並びに疾患の治療又は予防におけるこのようなベクター及びこのような医薬組成物の使用に関する。
免疫応答は、ウイルス、細菌、寄生虫などの病原体によって引き起こされる疾患などから身を守るために必要である。しかし、望ましくない免疫活性化は、自分自身の組織の損傷又は破壊につながるプロセスを引き起こす可能性がある。望ましくない免疫活性化は、例えば、自己免疫疾患において、抗体及び／又はＴリンパ球が自己抗原と反応し、その結果、例えば、組織損傷及び病変が引き起こされる。望ましくない免疫活性化は、環境中の典型的に無害な物質に対する過剰な免疫応答を特徴とし、組織破壊につながる炎症応答を引き起こすことがある、アレルギー反応でも起こる。更に、移植片拒絶反応、例えば移植された臓器や組織の拒絶反応では、望ましくない免疫活性化が起こり、これは、宿主に存在する同種反応性Ｔ細胞によって著しく媒介され、ドナーの同種抗原又は異種抗原を認識し、移植された臓器又は組織の破壊につながる。
免疫寛容とは、特定の生物において免疫応答を誘発する能力を持つ物質又は組織に対する特異的な免疫応答が、後天的に欠如することである。
通常、特異的抗原に対する寛容を誘導するためには、活性化シグナルがない状態で、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって抗原が他の免疫細胞に提示される必要があり、その結果、抗原特異的リンパ球が死滅するか機能的に不活性化されるか、又は寛容を維持する抗原特異的細胞が生成される。このプロセスは、概ね、自己抗原に対する寛容、すなわち自己寛容を説明する。免疫抑制薬は、例えば自己免疫疾患患者又は同種移植患者の治療など、望ましくない免疫応答の予防又は低減に有用である。望ましくない免疫応答を免疫抑制するための従来の戦略は、広範に作用する免疫抑制薬に基づいている。更に、免疫抑制を維持するために、免疫抑制薬療法が生涯にわたって必要となることがよくある。残念ながら、広範に作用する免疫抑制薬の使用には、免疫不全などの重篤な副作用のリスクを伴い、その理由は、それらの大部分が非選択的に作用し、感染症に対する感受性が高まり、がんの免疫監視が低下するからである。したがって、抗原特異的寛容を誘導する新しい化合物及び組成物が有益であろう。
樹状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、免疫応答の調節において重要な役割を果たし、ＡＰＣの活性化状態及び微小環境（サイトカイン及び成長因子）に応じて、抗原特異的Ｔ細胞にシグナルを与えて、提示された抗原（推定される病原体）と闘うか、又は提示された抗原（推定される非病原性抗原）に対する反応を沈黙させ、末梢寛容を誘導する。寛容原性免疫療法の開発における課題は、炎症性免疫応答を誘発しない様式で、抗原をＡＰＣに効率的に送達することである。
本発明は、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む抗原ユニットと、非炎症性又は寛容原性様式でＡＰＣ上の表面分子と相互作用し、炎症性活性化状態の非存在下で抗原の提示をもたらす標的化ユニットと、を含む構築物に関する。
ワクシボディ（Ｖａｃｃｉｂｏｄｙ）構築物は、２つのポリペプチドからなる二量体融合タンパク質であり、それぞれが、抗原提示細胞を標的とする標的化ユニット、二量体化ユニット、及び１つ以上の疾患関連抗原又はその一部を含む抗原性ユニットを含む。別の実施形態では、ワクシボディ構築物は、複数のポリペプチドからなる多量体融合タンパク質であり、それぞれが、ＡＰＣを標的とする標的化ユニット、多量体化ユニット、及び１つ以上の疾患関連抗原又はその一部を含む抗原性ユニットを含む－例えば、国際公開第２００４／０７６４８９（Ａ１）号、同第２０１１／１６１２４４（Ａ１）号、同第２０１３／０９２８７５（Ａ１）号又は同第２０１７／１１８６９５（Ａ１）号を参照されたい。これらの構築物は、抗原性ユニットに含まれる抗原又はその一部、例えば、エピトープに対する免疫応答を生成するのに効率的であることが示されている。
ワクシボディ構築物は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡプラスミドなどのベクターに含まれるポリヌクレオチドの形態で対象に投与することができる。宿主細胞への投与、例えば対象、例えばヒトの筋細胞への投与の後、ポリペプチドは発現され、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットにより、二量体タンパク質などの多量体融合タンパク質を形成する。
本発明者らは、驚くべきことに、改変されたワクシボディプラットフォームを使用して、構築物を内在化し、その中に含まれる抗原を寛容誘導様式で提示するＡＰＣ上の選択された表面受容体に結合し、それを介してシグナル伝達することにより、選択された抗原特異的寛容応答を誘導するために最適な方法で、疾患関連抗原をＡＰＣに送達できることを見出した。
本発明は、構築物及び１つ以上の免疫阻害化合物を共発現させるためのベクター、例えば、ＤＮＡプラスミドを提供する。ベクター及びこのようなベクターを含む医薬組成物は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶反応の予防的治療又は療法的治療などの、望ましくない免疫反応を伴う状態の治療において使用するためのものである。
このような構築物及び免疫阻害化合物は、一旦ベクターが対象に投与されると、抗原性ユニット中のエピトープを寛容誘導様式で提示することを可能にするため、本発明のベクターは、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶反応などの、免疫疾患の予防的治療又は療法的治療における使用に適切である。
構築物及び免疫阻害化合物は、問題の免疫疾患を引き起こす免疫系の疾患特異的細胞のダウンレギュレーションを引き起こすため、一般的な免疫系を抑制することはない。したがって、本発明のベクターで問題の免疫疾患を治療しても、感染に対する感受性が高まったり、がんの免疫監視が低下したりすることはない。
１つ以上の免疫阻害化合物は、寛容を誘導する様式で、又は例えば寛容維持細胞の誘導を促進する、あるいはこのような細胞の維持に有利に働くことによって、抗原性ユニット中のエピトープの提示に有利に働く環境を生成又は促進するのに役立つ。
第１の態様において、本発明は、
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドが、抗原提示細胞を標的とする標的化ユニット、二量体化ユニットなどの多量体化ユニット、及び抗原性ユニットを含み、抗原性ユニットが、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、第１の核酸配列と、
（ｂ）１つ以上の免疫阻害化合物をコードする１つ以上の更なる核酸配列と、
を含み、
第１のポリペプチド及び１つ以上の免疫阻害化合物を別個の分子として共発現させることを可能にする、ベクターに関する。
一実施形態では、本発明のベクターは、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列を含み、第１のポリペプチドは、抗原提示細胞を活性化することなく標的化する標的化ユニットを含む。
本発明のベクターは、例えば、医薬組成物、すなわち、ベクター及び薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む組成物の形態で、このような予防的治療又は療法的治療を必要とする対象にベクター／医薬組成物を投与することによる、免疫疾患の予防的治療又は療法的治療のために使用することができる。
２つのコード領域の間に挿入される、本発明のベクターにおいて使用するためのＩＲＥＳ共発現エレメントを示す。ｍＲＮＡが形成されると、２つのリボソーム（Ｔ）がｍＲＮＡ上の２つの別個の部位で翻訳を開始することができ、２つのタンパク質（Ａ及びＢ）が形成される。Ａ及びＢは、例えば、第１のポリペプチド及び免疫阻害化合物であり得る。 ２つの遺伝子の間に挿入される、本発明のベクターにおいて使用するための２Ａ自己切断ペプチド共発現エレメントを示す。転写後、１つのリボソームがｍＲＮＡを翻訳し、２つのタンパク質（Ａ及びＢ）が形成される。図の上段は、２Ａ配列がコード配列の一部ではない場合に融合タンパク質がどのように形成されるかを示す。Ａ及びＢは、例えば、第１のポリペプチド及び免疫阻害化合物であり得る。 ２つのコード領域の間に位置する、本発明のベクターにおいて使用するための双方向プロモーター（Ｐ）共発現エレメントを示す。１つのｍＲＮＡが形成され、２つのリボソーム（Ｔ）が２つの異なるｍＲＮＡで翻訳を開始することができ、２つのタンパク質（Ａ及びＢ）が形成される。Ａ及びＢは、例えば、第１のポリペプチド及び免疫阻害化合物であり得る。 ２つのプロモーター（Ｐ）、すなわち、２つのコード領域の前に位置する、本発明のベクターにおいて使用するための共発現エレメントを示す。２つのｍＲＮＡが形成され、２つのリボソーム（Ｔ）が２つの異なるｍＲＮＡで翻訳を開始することができ、２つのタンパク質（Ａ及びＢ）が形成される。Ａ及びＢは、例えば、第１のポリペプチド及び免疫阻害化合物であり得る。 第１のポリペプチドに基づく本発明のベクターによってコードされる構築物の実施形態を例示する。 第１のポリペプチドに基づく本発明のベクターによってコードされる構築物の実施形態を例示する。 ＤＮＡベクターＶＢ５０４９＊（本発明によるベクター）又はＶＢ５０５２＊によるＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクション後に得られたＥＬＩＳＡ結果（タンパク質の発現及び分泌）を示す。 ＤＮＡベクターＶＢ５０４９＊（本発明によるベクター）又はＶＢ５０５２＊によるＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクション後に得られたＥＬＩＳＡ結果（タンパク質の発現及び分泌）を示す。 ＤＮＡベクターＶＢ５０４９＊（本発明によるベクター）又はＶＢ５０５２＊によるＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクション後に得られたＥＬＩＳＡ結果（タンパク質の発現及び分泌）を示す。 ＤＮＡベクターＶＢ５０４９＊（本発明によるベクター）又はＶＢ５０５２＊によるＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクション後に得られたＥＬＩＳＡ結果（タンパク質の発現及び分泌）を示す。 ＤＮＡベクターＶＢ５０４９＊（本発明によるベクター）又はＶＢ５０５２＊でトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清のウェスタンブロット分析の結果を示す。 ＤＮＡベクターＶＢ５０４９＊（本発明によるベクター）又はＶＢ５０５２＊でトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清のウェスタンブロット分析の結果を示す。 ＤＮＡベクターＶＢ５０４９＊又はＶＢ５０５２＊のいずれかを単回投与し、ＭＯＧ（３５－５５）ペプチドで再刺激した後にマウスから得られた脾細胞についてのＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイ（ＩＬ－１０／ＩＦＮ－γ比）の結果を示す。 フローサイトメトリーにより評価し、ＭＯＧ（３５－５５）ペプチドによる１６時間の再刺激で測定された、全ＣＤ４＋Ｔ細胞集団中の脾臓ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞（９Ａ）及びＩＬ－１７＋Ｔ細胞（９Ｂ）の割合を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＤＮＡベクターＶＢ５０４９＊、ＶＢ５０５１＊又はＶＢ５０５２＊のいずれかを１回筋肉内投与し、７日後に脾臓を採取した。データは５例／群のマウスから作製し、解析前にマウスの脾臓をプールした。 フローサイトメトリーにより評価し、ＭＯＧ（３５－５５）ペプチドによる１６時間の再刺激で測定された、全ＣＤ４＋Ｔ細胞集団中の脾臓ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞（９Ａ）及びＩＬ－１７＋Ｔ細胞（９Ｂ）の割合を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＤＮＡベクターＶＢ５０４９＊、ＶＢ５０５１＊又はＶＢ５０５２＊のいずれかを１回筋肉内投与し、７日後に脾臓を採取した。データは５例／群のマウスから作製し、解析前にマウスの脾臓をプールした。 ＭＯＧ四量体染色及びＭＯＧ特異的Ｔ細胞の検出の結果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに０日目にＤＮＡベクターＶＢ５０４９＊、ＶＢ５０５１＊、又はＶＢ５０５２＊のいずれかを筋肉内投与し、その後エレクトロポレーションを行い、投与後７日目に脾臓を採取した。ＣＤ４＋ＭＯＧ（３５－５５）ｔｅｔ＋Ｔ細胞集団中の脾臓Ｆｏｘｐ３＋細胞の割合を、Ｈ－２ ＩＡｂ／ＭＯＧ（３５－５５）四量体によって検出した。四量体染色はｅｘ ｖｉｖｏで行われ、脾細胞はＭＯＧ（３５－５５）ペプチドで再刺激されなかった。データは５例／群のマウスから作製し、分析前にマウスの脾臓をプールした。 当該ＤＮＡベクターを一過性にトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の上清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ（捕捉抗体：抗ＭＯＧ抗体、検出抗体：抗ｈＩｇＧ ＣＨ３ドメイン抗体）により検出された、示されたＤＮＡベクターによりコードされる第１のポリペプチドのタンパク質発現及び分泌レベルを示す。陰性対照（Ｎｅｇ ｃｔｒｌ）：トランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅのみで処理したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清。 当該ＤＮＡベクターで一過性にトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の上清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより検出された、示されたＤＮＡベクターによりコードされる免疫阻害化合物の発現及び分泌レベルを示す。陰性対照（Ｎｅｇ ｃｔｒｌ）：トランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅのみで処理したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清。以下の抗体を使用した：（Ａ）捕捉抗体：１μｇ／ｍＬラット抗マウスＩＬ－１０抗体、１００μＬ／ウェル、ＭＡＢ４１７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ。検出抗体：０．２μｇ／ｍＬ、ヤギ抗マウスＩＬ－１０ビオチン化抗体、１００μＬ／ウェル、ＢＡＦ４１７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ。 当該ＤＮＡベクターで一過性にトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の上清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより検出された、示されたＤＮＡベクターによりコードされる免疫阻害化合物の発現及び分泌レベルを示す。陰性対照（Ｎｅｇ ｃｔｒｌ）：トランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅのみで処理したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清。以下の抗体を使用した：（Ｂ）捕捉抗体：２μｇ／ｍＬ ＴＧＦ－β１抗体、１００μＬ／ウェル、ＭＡＢ２４０２、ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ。検出抗体：０．８μｇ／ｍＬニワトリ抗ヒトＴＧＦ－β１ビオチン化抗体、１００μＬ／ウェル、ＢＡＦ２４０、ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ。 当該ＤＮＡベクターで一過性にトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の上清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより検出された、示されたＤＮＡベクターによりコードされる免疫阻害化合物の発現及び分泌レベルを示す。陰性対照（Ｎｅｇ ｃｔｒｌ）：トランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅのみで処理したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清。以下の抗体を使用した：（Ｃ）捕捉抗体：０．８μｇ／ｍＬヤギ抗マウスＣＴＬＡ－４抗体、１００μＬ／ウェル、ＡＦ４７６、ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ。検出抗体：０．８μｇ／ｍＬヤギ抗マウスＣＴＬＡ－４ビオチン化抗体、１００μＬ／ウェル、ＢＡＦ４７６、ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ。 当該ＤＮＡベクターで一過性にトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の上清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより検出された、示されたＤＮＡベクターによりコードされる免疫阻害化合物の発現及び分泌レベルを示す。陰性対照（Ｎｅｇ ｃｔｒｌ）：トランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅのみで処理したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清。以下の抗体を使用した：（Ｄ）捕捉抗体：２μｇ／ｍＬラット抗マウスＩＬ－２抗体、１００μＬ／ウェル、５０３７０１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ。検出抗体：２μｇ／ｍＬラット抗マウスＩＬ－２ビオチン化抗体、１００μＬ／ウェル、５０３８０３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ。 当該ＤＮＡベクターで一過性にトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の上清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより検出された、示されたＤＮＡベクターによりコードされる免疫阻害化合物の発現及び分泌レベルを示す。陰性対照（Ｎｅｇ ｃｔｒｌ）：トランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅのみで処理したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清。以下の抗体を使用した：（Ｅ）捕捉抗体：２μｇ／ｍＬラット抗マウスＩＦＮ－γ抗体、１００μＬ／ウェル、５０５８０２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ。検出抗体：２μｇ／ｍＬラット抗マウスＩＦＮ－γビオチン化抗体、１００μＬ／ウェル、５０５７０４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ。 当該ＤＮＡベクターで一過性にトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の上清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより検出された、示されたＤＮＡベクターによりコードされる第１のポリペプチド及び免疫阻害化合物の別個の発現及び分泌を示す。陰性対照（Ｎｅｇ ｃｔｒｌ）：トランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅのみで処理したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清。以下の抗体を使用した：捕捉抗体：マウス抗ＭＯＧ抗体、０．２５μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル、ｓｃ－７３３３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。検出抗体：（Ａ）０．２μｇ／ｍＬヤギ抗マウス抗ＩＬ－１０ビオチン化抗体、１００μＬ／ウェル、ＢＡＦ４１７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ。 当該ＤＮＡベクターで一過性にトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の上清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより検出された、示されたＤＮＡベクターによりコードされる第１のポリペプチド及び免疫阻害化合物の別個の発現及び分泌を示す。陰性対照（Ｎｅｇ ｃｔｒｌ）：トランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅのみで処理したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清。以下の抗体を使用した：捕捉抗体：マウス抗ＭＯＧ抗体、０．２５μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル、ｓｃ－７３３３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。検出抗体：（Ｂ）０．８μｇ／ｍＬニワトリ抗ヒトＴＧＦβ１ビオチン化抗体、１００μＬ／ウェル、ＢＡＦ２４０、ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ。 当該ＤＮＡベクターで一過性にトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の上清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより検出された、示されたＤＮＡベクターによりコードされる第１のポリペプチド及び免疫阻害化合物の別個の発現及び分泌を示す。陰性対照（Ｎｅｇ ｃｔｒｌ）：トランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅのみで処理したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清。以下の抗体を使用した：捕捉抗体：マウス抗ＭＯＧ抗体、０．２５μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル、ｓｃ－７３３３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。検出抗体：（Ｃ）０．８μｇ／ｍＬヤギ抗マウスＣＴＬＡ－４ビオチン化抗体、１００μＬ／ウェル、ＢＡＦ４７６、ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ。 当該ＤＮＡベクターで一過性にトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の上清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより検出された、示されたＤＮＡベクターによりコードされる第１のポリペプチド及び免疫阻害化合物の別個の発現及び分泌を示す。陰性対照（Ｎｅｇ ｃｔｒｌ）：トランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅのみで処理したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清。以下の抗体を使用した：捕捉抗体：マウス抗ＭＯＧ抗体、０．２５μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル、ｓｃ－７３３３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。検出抗体：（Ｄ）２μｇ／ｍＬラット抗マウスＩＦＮ－γビオチン化抗体、１００μＬ／ウェル、５０５７０４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ。 示されたＤＮＡベクターでトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清のウェスタンブロット分析結果を示す。Ａ：還元上清サンプル（３５μＬ負荷）。一次抗体：マウス抗ＭＯＧ（ｓｃ－７３３３０）。二次抗体：ロバ抗マウス、Ｄｙｌｉｇｈｔ ８００（ＳＡ５－１０１７２）。タンパク質標準をＣｈｅｍｉｄｏｃチャネルＤｙｌｉｇｈｔ ６５０において検出した（シグナルは図示せず）。ＣｈｅｍｉｄｏｃチャネルＤｙｌｉｇｈｔ ８００。黒い矢印は、別個のタンパク質としてそれぞれのＤＮＡベクターから発現され、トランスフェクトされた細胞から分泌された第１のポリペプチドを示す。 示されたＤＮＡベクターでトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清のウェスタンブロット分析結果を示す。Ｂ：非還元上清サンプル（３５μＬ負荷）。一次抗体：マウス抗ＭＯＧ（ｓｃ－７３３３０）。二次抗体：ロバ抗マウス、Ｄｙｌｉｇｈｔ ８００（ＳＡ５－１０１７２）。ＣｈｅｍｉｄｏｃチャネルＤｙｌｉｇｈｔ ６５０（タンパク質標準用）及び８００。黒い矢印は、それぞれのＤＮＡベクターから発現され、トランスフェクトされた細胞から分泌された２つの第１のポリペプチド分子によって形成される二量体タンパク質を示す。 示されたＤＮＡベクターでトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清のウェスタンブロット分析結果を示す。Ｃ：還元上清サンプル（３５μＬ負荷）。一次抗体：ラット抗ＩＬ１０（ＭＡＢ４１７）。二次抗体：ロバ抗ラット、Ｄｙｌｉｇｈｔ ４８８（ＳＡ５－１００２６）。ＣｈｅｍｉｄｏｃチャネルＤｙｌｉｇｈｔ ６５０（タンパク質標準用）及び４８８。黒い矢印は、それぞれのＤＮＡベクターから別個のタンパク質として発現され、トランスフェクトされた細胞から分泌されるＩＬ－１０を示す。 示されたＤＮＡベクターでトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清のウェスタンブロット分析結果を示す。Ｄ：還元上清サンプル（３５μＬ負荷）。一次抗体：ヤギ抗ＣＴＬＡ－４（ＡＦ４７６）。二次抗体：ロバ抗ヤギ、Ｄｙｌｉｇｈｔ ８００（ＳＡ５－１００９２）。ＣｈｅｍｉｄｏｃチャネルＤｙｌｉｇｈｔ ６５０（タンパク質標準用）及び８００。黒い矢印は、それぞれのＤＮＡベクターから別個のタンパク質として発現され、トランスフェクトされた細胞から分泌されるＣＬＴＡ－４を示す。 示されたＤＮＡベクターでトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清のウェスタンブロット分析結果を示す。Ｅ：還元上清サンプル（３５μＬ負荷）。一次抗体：ラット抗ＩＬ２（５０３７０２）。二次抗体：ロバ抗ラット、Ｄｙｌｉｇｈｔ ６５０（ＳＡ５－１００２９）。ＣｈｅｍｉｄｏｃチャネルＤｙｌｉｇｈｔ ６５０。黒い矢印は、それぞれのＤＮＡベクターから別個のタンパク質として発現され、トランスフェクトされた細胞から分泌されるＩＬ－２を示す。 当該ＤＮＡベクターで一過性にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによって検出された、ＤＮＡベクターＶＢ５０５１によってコードされるＭＯＧ（２７－６３）の発現及び分泌を示す。陰性対照（Ｎｅｇ ｃｔｒｌ）：トランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅのみで処理したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清。検出抗体：マウス抗ＭＯＧ抗体、３．３μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル、ｓｃ－７３３３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。 二色ＩＬ－１０／ＩＦＮ－γＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイの結果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、示されたＤＮＡベクターを４回（０日目、３日目、７日目及び１０日目）筋肉内投与し、続いてエレクトロポレーションを行い、初回投与後１４日目に脾臓を採取した。ＩＬ－１０及びＩＦＮ－γ分泌（ＳＦＵ／１０６脾細胞）について、二色ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイにおいて、再刺激していないもの（Ａ）又はＭＯＧ（３５－５５）ペプチドで４４時間再刺激したもの（Ｂ）で、脾細胞を試験した。個々のマウス及び平均±ＳＥＭを示す（５例のマウス／群、＊（ｐ＜０．０５）、両側Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。 二色ＩＬ－１０／ＩＦＮ－γＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイの結果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、示されたＤＮＡベクターを４回（０日目、３日目、７日目及び１０日目）筋肉内投与し、続いてエレクトロポレーションを行い、初回投与後１４日目に脾臓を採取した。ＩＬ－１０及びＩＦＮ－γ分泌（ＳＦＵ／１０６脾細胞）について、二色ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイにおいて、再刺激していないもの（Ａ）又はＭＯＧ（３５－５５）ペプチドで４４時間再刺激したもの（Ｂ）で、脾細胞を試験した。個々のマウス及び平均±ＳＥＭを示す（５例のマウス／群、＊（ｐ＜０．０５）、両側Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。 図１６Ｂに示されるデータから算出されたＩＬ－１０／ＩＦＮ－γ比を示す。個々のマウス及び平均±ＳＥＭを示す（５例のマウス／群、＊（ｐ＜０．０５）、両側Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。 フローサイトメトリーによるＦｏｘｐ３＋産生ＣＤ４＋Ｔ細胞の検出の結果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、示されたＤＮＡベクターを投与し、続いてエレクトロポレーションを０、３、７及び１０日目に４回行い、初回投与後１４日目に脾臓を採取した。脾臓ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の割合を、ＭＯＧ（３５－５５）ペプチドによる１６時間の再刺激の際に求めた。データは５例／群のマウスから作製し、分析前にマウスの脾臓をプールした。 フローサイトメトリーによるＩＦＮ－γ及びＩＬ－１７の検出結果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、示されたＤＮＡベクターを４回投与し、続いて０、３、７及び１０日目にエレクトロポレーションを行い、初回投与後１４日目に脾臓を採取した。全ＣＤ４＋Ｔ細胞集団中の（Ａ）ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞及び（Ｂ）ＩＬ－１７＋Ｔ細胞の割合を、ＭＯＧ（３５－５５）ペプチドによる１６時間の再刺激の際に求めた。データは５例／群のマウスから作製し、分析前にマウスの脾臓をプールした。 フローサイトメトリーによるＩＦＮ－γ及びＩＬ－１７の検出結果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、示されたＤＮＡベクターを４回投与し、続いて０、３、７及び１０日目にエレクトロポレーションを行い、初回投与後１４日目に脾臓を採取した。全ＣＤ４＋Ｔ細胞集団中の（Ａ）ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞及び（Ｂ）ＩＬ－１７＋Ｔ細胞の割合を、ＭＯＧ（３５－５５）ペプチドによる１６時間の再刺激の際に求めた。データは５例／群のマウスから作製し、分析前にマウスの脾臓をプールした。 二色ＩＬ－１０／ＩＦＮ－γＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイの結果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、示されたＤＮＡベクターを０日目に筋肉内投与し、続いてエレクトロポレーションを行い、脾臓を投与後７日目に採取した。ＩＬ－１０及びＩＦＮ－γ分泌（ＳＦＵ／１０６脾細胞）について、二色ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔを用いて、再刺激していないもの（Ａ）又はＭＯＧ（３５－５５）ペプチドで４４時間再刺激したもの（Ｂ）で、脾細胞を試験した。個々のマウス及び平均±ＳＥＭを示す（５例のマウス／群、＊＊（ｐ＜０．０１）、両側Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。 二色ＩＬ－１０／ＩＦＮ－γＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイの結果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、示されたＤＮＡベクターを０日目に筋肉内投与し、続いてエレクトロポレーションを行い、脾臓を投与後７日目に採取した。ＩＬ－１０及びＩＦＮ－γ分泌（ＳＦＵ／１０６脾細胞）について、二色ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔを用いて、再刺激していないもの（Ａ）又はＭＯＧ（３５－５５）ペプチドで４４時間再刺激したもの（Ｂ）で、脾細胞を試験した。個々のマウス及び平均±ＳＥＭを示す（５例のマウス／群、＊＊（ｐ＜０．０１）、両側Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。 図２０Ｂに示すデータから算出されたＩＬ－１０／ＩＦＮ－γ比を示す。個々のマウス及び平均±ＳＥＭを示す（５例のマウス／群、＊（ｐ＜０．０５）、両側Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。 ＭＯＧ四量体染色及びＭＯＧ特異的Ｔ細胞の検出の結果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、示されたＤＮＡベクターを０日目に筋肉内投与し、続いてエレクトロポレーションを行い、脾臓を投与後７日目に採取した。ＣＤ４＋ＭＯＧ（３８－４９）ｔｅｔ＋Ｔ細胞集団中の脾臓Ｆｏｘｐ３＋細胞の割合を、Ｈ－２ ＩＡｂ／ＭＯＧ（３８－４９）四量体によって検出した。四量体染色はｅｘ ｖｉｖｏで行われ、脾細胞はＭＯＧ（３５－５５）ペプチドで再刺激されなかった。データは５例／群のマウスから作製し、分析前にマウスの脾臓をプールした。 二色ＩＬ－１０／ＩＦＮ－γＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイの結果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、示されたＤＮＡベクターを０日目に筋肉内投与し、続いてエレクトロポレーションを行い、脾臓を投与後７日目に採取した。ＩＬ－１０及びＩＦＮ－γ分泌（ＳＦＵ／１０６脾細胞）について、二色ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔを用いて、再刺激していないもの（対照、Ａ）又はＭＯＧ（３５－５５）ペプチドで４４時間再刺激したもの（Ｂ）で、脾細胞を試験した。個々のマウス及び平均±ＳＥＭを示す（５例のマウス／群、＊＊（ｐ＜０．０１）、両側Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。 二色ＩＬ－１０／ＩＦＮ－γＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイの結果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、示されたＤＮＡベクターを０日目に筋肉内投与し、続いてエレクトロポレーションを行い、脾臓を投与後７日目に採取した。ＩＬ－１０及びＩＦＮ－γ分泌（ＳＦＵ／１０６脾細胞）について、二色ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔを用いて、再刺激していないもの（対照、Ａ）又はＭＯＧ（３５－５５）ペプチドで４４時間再刺激したもの（Ｂ）で、脾細胞を試験した。個々のマウス及び平均±ＳＥＭを示す（５例のマウス／群、＊＊（ｐ＜０．０１）、両側Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。 図２３Ｂに示されるデータから算出されたＩＬ－１０／ＩＦＮ－γ比を示す。個々のマウス及び平均±ＳＥＭを示す（５例のマウス／群、＊（ｐ＜０．０１）、両側Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。 ＭＯＧ四量体染色及びＭＯＧ特異的Ｔ細胞の検出の結果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、示されたＤＮＡベクターを０日目に筋肉内投与し、続いてエレクトロポレーションを行い、脾臓を投与後７日目に採取した。ＣＤ４＋ＭＯＧ（３８－４９）ｔｅｔ＋Ｔ細胞集団中の脾臓Ｆｏｘｐ３＋細胞の割合を、Ｈ－２ ＩＡｂ／ＭＯＧ（３８－４９）四量体によって検出した。四量体染色はｅｘ ｖｉｖｏで行われ、脾細胞はＭＯＧ（３５－５５）ペプチドで再刺激されなかった。データは５例／群のマウスから作製し、分析前にマウスの脾臓をプールした。 増殖Ｔｒｅｇの検出結果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、示されたＤＮＡベクターを０日目に筋肉内投与し、続いてエレクトロポレーションを行い、脾臓を投与後７日目に採取した。Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）細胞集団のうち、Ｋｉ６７＋細胞の割合をｅｘ ｖｉｖｏで検出した。データは５例／群のマウスから作製し、分析前にマウスの脾臓をプールした。 二色ＩＬ－１０／ＩＦＮ－γＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイの結果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、示されたＤＮＡベクターを０日目に筋肉内投与し、続いてエレクトロポレーションを行い、脾臓を投与後７日目に採取した。ＩＬ－１０及びＩＦＮ－γ分泌（ＳＦＵ／１０６脾細胞）について、二色ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔを用いて、再刺激していないもの（対照、Ａ）又はＭＯＧ（３５－５５）ペプチドで４４時間再刺激したもの（Ｂ）で、脾細胞を試験した。個々のマウス及び平均±ＳＥＭを示す（５例のマウス／群、＊＊（ｐ＜０．０１）、両側Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。 二色ＩＬ－１０／ＩＦＮ－γＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイの結果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、示されたＤＮＡベクターを０日目に筋肉内投与し、続いてエレクトロポレーションを行い、脾臓を投与後７日目に採取した。ＩＬ－１０及びＩＦＮ－γ分泌（ＳＦＵ／１０６脾細胞）について、二色ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔを用いて、再刺激していないもの（対照、Ａ）又はＭＯＧ（３５－５５）ペプチドで４４時間再刺激したもの（Ｂ）で、脾細胞を試験した。個々のマウス及び平均±ＳＥＭを示す（５例のマウス／群、＊＊（ｐ＜０．０１）、両側Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。 図２７Ｂに示されるデータから算出されたＩＬ－１０／ＩＦＮ－γ比を示す。個々のマウス及び平均±ＳＥＭを示す（５例のマウス／群、＊（ｐ＜０．０１）、両側Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。 ＭＯＧ四量体染色及びＭＯＧ特異的Ｔ細胞の検出の結果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、示されたＤＮＡベクターを０日目に筋肉内投与し、続いてエレクトロポレーションを行い、脾臓を投与後７日目に採取した。ＣＤ４＋ＭＯＧ（３８－４９）ｔｅｔ＋Ｔ細胞集団中の脾臓Ｆｏｘｐ３＋細胞の割合を、Ｈ－２ ＩＡｂ／ＭＯＧ（３８－４９）四量体によって検出した。四量体染色はｅｘ ｖｉｖｏで行われ、脾細胞はＭＯＧ（３５－５５）ペプチドで再刺激されなかった。データは５例／群のマウスから作製し、分析前にマウスの脾臓をプールした。 増殖Ｔｒｅｇの検出結果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、示されたＤＮＡベクターを０日目に筋肉内投与し、続いてエレクトロポレーションを行い、脾臓を投与後７日目に採取した。Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）細胞集団のうち、Ｋｉ６７＋細胞の割合をｅｘ ｖｉｖｏで検出した。データは５例／群のマウスから作製し、分析前にマウスの脾臓をプールした。 当該ＤＮＡベクターで一過性にトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の上清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより検出された、示されたＤＮＡベクターによりコードされる第１のポリペプチドの発現及び分泌を示す。陰性対照（Ｎｅｇ ｃｔｒｌ）：トランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅのみで処理したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清。捕捉抗体：マウス抗ＭＯＧ抗体、検出抗体：抗ｈＩｇＧ ＣＨ３ドメイン抗体。 当該ＤＮＡベクターで一過性にトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の上清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより検出された、示されたＤＮＡベクターによりコードされる免疫阻害化合物の発現及び分泌レベルを示す。陰性対照（Ｎｅｇ ｃｔｒｌ）：トランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅのみで処理したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清。以下の条件及び抗体を使用した：Ａ）１：１００に希釈した上清。捕捉抗体：マウスＩＬ－１０抗体、０．４μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル、ＭＡＢ４１７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ。検出抗体：マウスＩＬ－１０ビオチン化抗体、０．２μｇ／ｍＬ、ＢＡＦ４１７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ。 当該ＤＮＡベクターで一過性にトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の上清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより検出された、示されたＤＮＡベクターによりコードされる免疫阻害化合物の発現及び分泌レベルを示す。陰性対照（Ｎｅｇ ｃｔｒｌ）：トランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅのみで処理したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清。以下の条件及び抗体を使用した：Ｂ）捕捉抗体：ＴＧＦβ１抗体、２μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル、ＭＡＢ２４０２、ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ。検出抗体：ニワトリ抗ＴＧＦβ１ビオチン化抗体、０．８μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル、ＢＡＦ２４０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ。 当該ＤＮＡベクターで一過性にトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の上清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより検出された、示されたＤＮＡベクターによりコードされる免疫阻害化合物の発現及び分泌レベルを示す。陰性対照（Ｎｅｇ ｃｔｒｌ）：トランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅのみで処理したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清。以下の条件及び抗体を使用したＣ）捕捉抗体：マウスＧＭ－ＣＳＦ抗体、２μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル、ＭＡＢ４１５、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ。検出抗体：抗ＧＭ－ＣＳＦビオチン化抗体、０．８μｇ／ｍＬ、ＢＡＦ４１５、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ。 当該ＤＮＡベクターで一過性にトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の上清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより検出された、示されたＤＮＡベクターによりコードされるタンパク質の別個の発現及び分泌を示す。陰性対照（Ｎｅｇ ｃｔｒｌ）：トランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅのみで処理したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清。捕捉抗体：マウス抗ＭＯＧ抗体、０．２５μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル、ｓｃ－７３３３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。以下の検出抗体を使用した：Ａ）マウス抗ＩＬ－１０ビオチン化抗体、０．２μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル、ＢＡＦ４１７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ。 当該ＤＮＡベクターで一過性にトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の上清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより検出された、示されたＤＮＡベクターによりコードされるタンパク質の別個の発現及び分泌を示す。陰性対照（Ｎｅｇ ｃｔｒｌ）：トランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅのみで処理したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清。捕捉抗体：マウス抗ＭＯＧ抗体、０．２５μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル、ｓｃ－７３３３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。以下の検出抗体を使用した：Ｂ）ニワトリ抗ＴＧＦβ１ビオチン化抗体、０．８μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル、ＢＡＦ２４０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ。 当該ＤＮＡベクターで一過性にトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の上清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより検出された、示されたＤＮＡベクターによりコードされるタンパク質の別個の発現及び分泌を示す。陰性対照（Ｎｅｇ ｃｔｒｌ）：トランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅのみで処理したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清。捕捉抗体：マウス抗ＭＯＧ抗体、０．２５μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル、ｓｃ－７３３３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。以下の検出抗体を使用した：Ｃ）抗ＧＭ－ＣＳＦビオチン化抗体、０．８μｇ／ｍＬ、ＢＡＦ４１５、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ。 示されたＤＮＡベクターでトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清のウェスタンブロット分析結果を示す。Ａ：還元上清サンプル（３５μＬ負荷）。一次抗体：マウス抗ＭＯＧ（ｓｃ－７３３３０）。二次抗体：ロバ抗マウス、Ｄｙｌｉｇｈｔ ８００（ＳＡ５－１０１７２）。タンパク質標準をＣｈｅｍｉｄｏｃチャネルＤｙｌｉｇｈｔ ６５０において検出した（シグナルは図示せず）。ＣｈｅｍｉｄｏｃチャネルＤｙｌｉｇｈｔ ８００。黒い矢印は、別個のタンパク質としてそれぞれのＤＮＡベクターから発現され、トランスフェクトされた細胞から分泌された第１のポリペプチドを示す。 示されたＤＮＡベクターでトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清のウェスタンブロット分析結果を示す。Ｂ：非還元上清サンプル（３５μＬ負荷）。一次抗体：マウス抗ＭＯＧ（ｓｃ－７３３３０）。二次抗体：ロバ抗マウス、Ｄｙｌｉｇｈｔ ８００（ＳＡ５－１０１７２）。ＣｈｅｍｉｄｏｃチャネルＤｙｌｉｇｈｔ ６５０（タンパク質標準用）及び８００。黒い矢印は、示されたＤＮＡベクターから発現され、トランスフェクトされた細胞から分泌された２つの第１のポリペプチド分子によって形成される二量体タンパク質を示す。 示されたＤＮＡベクターでトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清のウェスタンブロット分析結果を示す。Ｃ：還元上清サンプル（３５μＬ負荷）。一次抗体：ラット抗ＩＬ１０（ＭＡＢ４１７）。二次抗体：ロバ抗ラット、Ｄｙｌｉｇｈｔ ４８８（ＳＡ５－１００２６）。ＣｈｅｍｉｄｏｃチャネルＤｙｌｉｇｈｔ ６５０（タンパク質標準用）及び４８８。黒い矢印は、それぞれのＤＮＡベクターから別個のタンパク質として発現され、トランスフェクトされた細胞から分泌されるＩＬ－１０を示す。ＶＢ５０４４とＶＢ５０５４では、ＩＬ－１０のサイズが増大したのは、リボソームスキッピングの結果、Ｐ２ＡテールがＩＬ－１０に融合したためである。 示されたＤＮＡベクターでトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清のウェスタンブロット分析結果を示す。Ｄ：還元上清サンプル（３５μＬ負荷）。一次抗体：ウサギ抗ＴＧＦ－β１抗体（ＵＳＢ １０４２７７７－ビオチン）。二次抗体：ロバ抗ウサギ、Ｄｙｌｉｇｈｔ ６５０（ＳＡ５－１００４１）。ＣｈｅｍｉｄｏｃチャネルＤｙｌｉｇｈｔ ６５０。黒い矢印は、それぞれのＤＮＡベクターから別個のタンパク質として発現され、トランスフェクトされた細胞から分泌されるＴＧＦ－β１を示す。 示されたＤＮＡベクターでトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清のウェスタンブロット分析結果を示す。Ｅ：還元上清サンプル（３５μＬ負荷）。一次抗体：ヤギ抗マウスＧＭ－ＣＳＦ（ＢＡＦ４１５）。二次抗体：ロバ抗ヤギ、Ｄｙｌｉｇｈｔ ８００（ＳＡ５－１００９２）。ＣｈｅｍｉｄｏｃチャネルＤｙｌｉｇｈｔ ６５０（タンパク質標準用）及び８００。黒い矢印は、それぞれのＤＮＡベクターから別個のタンパク質として発現され、トランスフェクトされた細胞から分泌されるＧＭ－ＣＳＦを示す。 ＤＮＡベクターＶＢ５０６８、ＶＢ５０６９又はＶＢ５０７０で一過性にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ（捕捉抗体：抗ＭＯＧ抗体、検出抗体：抗ｈＩｇＧ ＣＨ３ドメイン抗体）によって検出された第１のポリペプチドのタンパク質発現及び分泌レベルを示す。陰性対照（Ｎｅｇ ｃｔｒｌ）：トランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅのみで処理したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清。 当該ＤＮＡベクターで一過性にトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の上清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ（捕捉抗体：抗ＭＯＧ抗体、検出抗体：抗ｈＩｇＧ ＣＨ３ドメイン抗体）により検出された、示されたＤＮＡベクターによりコードされる第１のポリペプチドの発現及び分泌を示す。陰性対照（Ｎｅｇ ｃｔｒｌ）：トランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅのみで処理したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清。以下の検出抗体を使用した：Ａ）抗マウスＳＣＢＧ３Ａ２ビオチン化抗体、０．８３μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル、ＢＡＦ３４６５、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ。 当該ＤＮＡベクターで一過性にトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の上清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ（捕捉抗体：抗ＭＯＧ抗体、検出抗体：抗ｈＩｇＧ ＣＨ３ドメイン抗体）により検出された、示されたＤＮＡベクターによりコードされる第１のポリペプチドの発現及び分泌を示す。陰性対照（Ｎｅｇ ｃｔｒｌ）：トランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅのみで処理したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清。以下の検出抗体を使用した：Ｂ）抗マウスＰＤ－１ビオチン化抗体、０．７２μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ｍＬ、ＤＹ１０２１、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。 当該ＤＮＡベクターで一過性にトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の上清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより検出された、示されたＤＮＡベクターによりコードされるＩＬ－１０の発現及び分泌レベルを示す。陰性対照（Ｎｅｇ ｃｔｒｌ）：トランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅのみで処理したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清。捕捉抗体：マウスＩＬ－１０抗体、０．４μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル、ＭＡＢ４１７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、検出抗体：マウス抗ＩＬ－１０ビオチン化抗体、０．２μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル、ＢＡＦ４１７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ。 当該ＤＮＡベクターで一過性にトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の上清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより検出された、示されたＤＮＡベクターによりコードされる免疫阻害化合物の別個の発現及び分泌を示す。陰性対照（Ｎｅｇ ｃｔｒｌ）：トランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅのみで処理したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清。上清希釈１：１００。捕捉抗体：マウス抗ＭＯＧ抗体、０．２５μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル、ｓｃ－７３３３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、検出抗体：マウス抗ＩＬ－１０ビオチン化抗体、０．２μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル、ＢＡＦ４１７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ。 示されたＤＮＡベクターでトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清のウェスタンブロット分析結果を示す。Ａ：還元上清サンプル（３５μＬ負荷）。一次抗体：マウス抗ＭＯＧ（ｓｃ－７３３３０）。二次抗体：ロバ抗マウス、Ｄｙｌｉｇｈｔ ８００（ＳＡ５－１０１７２）。ＣｈｅｍｉｄｏｃチャネルＤｙｌｉｇｈｔ ８００。黒い矢印は、別個のタンパク質としてそれぞれのＤＮＡベクターから発現され、トランスフェクトされた細胞から分泌されたインタクトな第１のポリペプチドを示す。 示されたＤＮＡベクターでトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清のウェスタンブロット分析結果を示す。Ｂ：還元上清サンプル（３５μＬ負荷）。一次抗体：ラット抗ＩＬ１０（ＭＡＢ４１７）。二次抗体：ロバ抗ラット、Ｄｙｌｉｇｈｔ ４８８（ＳＡ５－１００２６）。ＣｈｅｍｉｄｏｃチャネルＤｙｌｉｇｈｔ ６５０（タンパク質標準用）及び４８８。黒い矢印は、それぞれのＤＮＡベクターから別個のタンパク質として発現され、トランスフェクトされた細胞から分泌されるＩＬ－１０を示す。 二色ＩＬ－１０／ＩＦＮ－γＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイの結果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、示されたＤＮＡベクターを０日目に筋肉内投与し、続いてエレクトロポレーションを行い、脾臓を投与後７日目に採取した。ＩＬ－１０及びＩＦＮ－γ分泌（ＳＦＵ／１０６脾細胞）について、二色ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔを用いて、再刺激していないもの（対照、Ａ）又はＭＯＧ（３５－５５）ペプチドで４４時間再刺激したもの（Ｂ）で、脾細胞を試験した。個々のマウス及び平均±ＳＥＭを示す（５例のマウス／群）。 二色ＩＬ－１０／ＩＦＮ－γＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイの結果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、示されたＤＮＡベクターを０日目に筋肉内投与し、続いてエレクトロポレーションを行い、脾臓を投与後７日目に採取した。ＩＬ－１０及びＩＦＮ－γ分泌（ＳＦＵ／１０６脾細胞）について、二色ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔを用いて、再刺激していないもの（対照、Ａ）又はＭＯＧ（３５－５５）ペプチドで４４時間再刺激したもの（Ｂ）で、脾細胞を試験した。個々のマウス及び平均±ＳＥＭを示す（５例のマウス／群）。 ＭＯＧ四量体染色及びＭＯＧ特異的Ｔ細胞の検出の結果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、示されたＤＮＡベクターを０日目に筋肉内投与し、続いてエレクトロポレーションを行い、脾臓を投与後７日目に採取した。ＣＤ４＋ＭＯＧ（３８－４９）ｔｅｔ＋脾細胞中のＦｏｘｐ３＋脾細胞の割合を、Ｈ－２ ＩＡｂ／ＭＯＧ（３８－４９）四量体によって検出された。四量体染色はｅｘ ｖｉｖｏで行われ、脾細胞はＭＯＧ（３５－５５）ペプチドで再刺激されなかった。データは５例／群のマウスから作製し、分析前にマウスの脾臓をプールした。 ＭＯＧ四量体染色及びＭＯＧ特異的Ｔ細胞の検出の結果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、示されたＤＮＡベクターを０日目に筋肉内投与し、続いてエレクトロポレーションを行い、脾臓を投与後７日目に採取した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋脾細胞中のＭＯＧ（３８－４９）ｔｅｔ＋脾細胞の割合を、Ｈ－２ ＩＡｂ／ＭＯＧ（３８－４９）四量体によって検出した。四量体染色はｅｘ ｖｉｖｏで行われ、脾細胞はＭＯＧ（３５－５５）ペプチドで再刺激されなかった。データは５例／群のマウスから作製し、分析前にマウスの脾臓をプールした。 増殖Ｔｒｅｇの検出結果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、示されたＤＮＡベクターを０日目に筋肉内投与し、続いてエレクトロポレーションを行い、脾臓を投与後７日目に採取した。Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）細胞集団のうち、Ｋｉ６７＋脾細胞の割合をｅｘ ｖｉｖｏで検出した。データは５例／群のマウスから作製し、分析前にマウスの脾臓をプールした。 フローサイトメトリーによるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞の検出の結果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、示されたＤＮＡベクターを０日目に投与し、続いてエレクトロポレーションを行い、脾臓を投与後７日目に採取した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋脾細胞の割合を、ＭＯＧ（３５－５５）ペプチドによる１６時間の再刺激時に求めた。データは５例／群のマウスから作製し、分析前にマウスの脾臓をプールした。 当該ＤＮＡベクターで一過性にトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の上清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ（捕捉抗体：マウス抗ヒトＩｇＧ（ＣＨ３ドメイン）、１ｕｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル、ＭＣＡ８７８Ｇ、ＢｉｏＲａｄ、検出抗体：ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ビオチン抗ＩｇＧ－Ｆｃ（ヒト）Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、１μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル、７１０３２６２１００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によって検出された、示されたＤＮＡベクターによってコードされる第１のポリペプチドの発現及び分泌を示す。陰性対照（Ｎｅｇ ｃｔｒｌ）：トランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅのみで処理したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清。 当該ＤＮＡベクターで一過性にトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の上清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより検出された、示されたＤＮＡベクターによりコードされるＩＬ－１０の発現及び分泌レベルを示す。陰性対照（Ｎｅｇ ｃｔｒｌ）：トランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅのみで処理したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清。捕捉抗体：マウスＩＬ－１０抗体、０．４μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル、ＭＡＢ４１７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ。検出抗体：マウスＩＬ－１０ビオチン化抗体、０．２μｇ／ｍＬ、ＢＡＦ４１７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ。 示されたＤＮＡベクターでトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清のウェスタンブロット分析結果を示す。還元上清サンプル（３５μＬ負荷）。一次抗体：ラット抗ＩＬ－１０（ＭＡＢ４１７）。二次抗体：ロバ抗ラット、Ｄｙｌｉｇｈｔ ６５０（ＳＡ５－１００２９）。ＣｈｅｍｉｄｏｃチャネルＤｙｌｉｇｈｔ ６５０。黒い矢印は、示されたＤＮＡベクターから別個のタンパク質として発現され、トランスフェクトされた細胞から分泌されるＩＬ－１０を示す。
第１のポリペプチド及び／又は多量体タンパク質は、本明細書では構築物とも呼ばれる。
一実施形態において、構築物は寛容誘導構築物である。
「寛容誘導構築物」とは、投与に適した形態で、寛容を誘導するのに有効な量（すなわち、有効量）で対象に投与された場合に、炎症性免疫応答を誘発せず、むしろ抗原性ユニットに含まれるＴ細胞エピトープに対する寛容を誘導するものである。
本明細書で使用される「寛容」という用語は、炎症性免疫応答のレベルの低下、炎症性免疫応答の発症若しくは進行の遅延、及び／又は自己抗原、アレルゲン若しくは同種抗原若しくは異種抗原のような抗原に対する炎症性免疫応答の発症若しくは進行のリスクの低下を指す。
「対象」とは、動物、例えばマウス、又はヒト、好ましくはヒトである。「マウス（ｍｏｕｓｅ／ｍｕｒｉｎｅ）」及び「ｍ」という用語は、本明細書において、マウスを示すため、又はマウスを指すために互換的に使用される。ヒト及び「ｈ」という用語は、本明細書では、ヒトを示すため、又はヒトを指すために互換的に使用される。対象は、療法的治療を必要とする患者、すなわち自己免疫疾患、アレルギー、若しくは移植片拒絶反応のような免疫疾患に罹患しているヒトであり得、又は予防的治療を必要とする対象若しくは免疫疾患を有することが疑われる対象であり得る。「対象」及び「個体」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
「疾患」とは、通常、疾患に罹患している対象における特定の徴候及び症状を伴う異常な医学的状態である。本明細書で使用される「免疫疾患」とは、自己免疫疾患、アレルギー又は移植片拒絶反応、すなわち、宿主に移植された同じ（同種）又は異なる（異種）種由来の細胞、組織又は器官の宿主による拒絶反応などの同種移植片又は異種移植片の拒絶反応を含む、望ましくない免疫反応を伴う状態を指す。
「治療」とは、予防的治療又は療法的治療である。
「予防的治療」とは、免疫疾患の徴候若しくは症状を示さない対象、又は免疫疾患の初期の徴候若しくは症状しか示さない対象に施される治療であり、そのため、免疫疾患を発症するリスクを予防又は減少させる目的で治療が施される。予防的治療は、免疫疾患に対する予防的治療として、又は免疫疾患及び／若しくはその関連症状の更なる発症若しくは増強を阻害若しくは低減する治療として機能する。予防的治療、予防及び防止という用語は、本明細書において互換的に使用される。
「療法的治療」とは、免疫疾患の症状又は徴候を示す対象に施される治療であり、この治療は、それらの徴候若しくは症状を軽減若しくは排除する目的で、又は疾患の進行を遅延若しくは停止させる目的で対象に施される。
本明細書で使用される「Ｔ細胞エピトープ」とは、離散的な単一Ｔ細胞エピトープ、又は複数のＴ細胞エピトープ、例えば、ホットスポットなどの複数の最小Ｔ細胞エピトープを含有する抗原の一部若しくは領域を指す。
「ヌクレオチド配列」とは、ヌクレオチドからなる配列である。「ヌクレオチド配列」及び「核酸配列」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
本明細書で使用される節の見出しは、整理のみを目的としており、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
ベクター
本発明のベクターは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの外来核酸配列を細胞内に運び、そこで発現させるのに適した任意の分子、すなわち発現ベクターであり得る。
一実施形態において、ベクターは、ＤＮＡプラスミドなどのＤＮＡベクター、又はアデノウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、サイトメガロウイルス及びセンダイウイルスからなる群から選択されるＤＮＡウイルスベクターなどのＤＮＡウイルスベクターである。
別の実施形態において、ベクターは、ＲＮＡプラスミドなどのＲＮＡベクター、又はレトロウイルスベクターなどのＲＮＡウイルスベクター、例えばアルファウイルス、レンチウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス及びラブドウイルスからなる群から選択されるレトロウイルスベクターである。
好ましい実施形態において、ベクターはＤＮＡベクターであり、より好ましくはＤＮＡプラスミドである。
ＤＮＡプラスミド
プラスミドとは、細胞内の小さな染色体外ＤＮＡ分子のことで、染色体ＤＮＡとは物理的に分離されており、独立して複製することができる。プラスミドはほとんどの場合、小さな環状の二本鎖ＤＮＡ分子として細菌内に存在する。しかし、プラスミドは、古細菌及び真核生物に存在することもある。人工プラスミドは、分子クローニングにおけるベクターとして広く使用されており、宿主生物内で組換えＤＮＡ配列を送達し、確実に高発現させる役割を果たしている。プラスミドは、例えば、抗生物質耐性のための遺伝子、複製起点、多重クローニング部位（ＭＣＳ）及び挿入された目的の遺伝子の発現を駆動するためのプロモーターなどの、プラスミドを含む細胞の選択のための特徴を含むいくつかの重要な特徴を含む。
概ね、プロモーターとは、遺伝子が転写されるように、開始因子及びポリメラーゼをプロモーターに誘引することができる配列のことである。プロモーターは、遺伝子の転写開始部位付近、ＤＮＡの上流に位置する。プロモーターは、約１００～１０００塩基対の長さであり得る。プロモーターの性質は、通常、遺伝子及び転写産物並びに部位に動員されるＲＮＡポリメラーゼのタイプ又はクラスに依存する。ＲＮＡポリメラーゼがプラスミドのＤＮＡを読み取ると、ＲＮＡ分子が転写される。プロセス後、ｍＲＮＡは何度も翻訳されるため、リボソームがｍＲＮＡをタンパク質に翻訳するときに、目的の遺伝子によってコードされるタンパク質のコピーが多数生成される。概ね、リボソームは、ｍＲＮＡのコドンに相補的なｔＲＮＡアンチコドン配列の結合を誘導することで解読を促進する。ｔＲＮＡは、ｍＲＮＡがリボソームを通過し、リボソームによって「読み取られる」際に一緒に連鎖してポリペプチドになる特定のアミノ酸を保有する。翻訳は、開始、伸長及び終結の３つの段階で進行する。翻訳プロセスに続いて、ポリペプチドは、フォールディングされて活性タンパク質になり、細胞内でその機能を果たすか、又は細胞から輸送され、時にはかなりの数の翻訳後修飾の後に、他の場所でその機能を果たす。
タンパク質が細胞外へ輸送される場合、シグナルペプチドによってタンパク質は小胞体へと導かれ、そこでシグナルペプチドが切断され、翻訳が終了した後、タンパク質は、細胞周辺へと輸送される。
ＤＮＡプラスミドは、いかなる特定のプラスミドにも限定されず、当業者は、適切な骨格を有する任意のプラスミドが、本開示のエレメント及びユニットを含むように、当技術分野で公知の方法によって選択及び操作され得ることを理解するであろう。
共発現
本開示のベクターは、いくつかのタンパク質を共発現する。このようなベクター（及びプラスミド）は、マルチシストロン性又はポリシストロン性ベクター（及びマルチシストロン性又はポリシストロン性プラスミド）とも呼ばれる。当業者は、これらのいくつかのタンパク質をコードする配列を含むようにベクターを操作する方法を知っており、これらのタンパク質が別個のタンパク質として１つのベクターから共発現されるように異なる技術を選択することができる。
したがって、当業者は、異なるタンパク質、すなわち第１のポリペプチド及び１つ以上の免疫阻害化合物を共発現する本発明のベクターを構築することができる。
好ましい実施形態において、本発明のベクターは、１つ以上の共発現エレメント、すなわち、同じベクターからの第１のポリペプチド及び１つ以上の免疫阻害化合物の共発現を可能にする核酸配列を含む。
本開示の一実施形態において、ベクターは、共発現エレメント（又は２つ以上の共発現エレメント）を含み、これにより、第１のポリペプチド及び１つ以上の免疫阻害化合物は、単一の転写物上に転写されるが、第１のポリペプチド及び１つ以上の免疫阻害化合物に独立して翻訳される。したがって、共発現エレメントの存在により、最終的に別個の翻訳産物が生成される。
ＩＲＥＳ
本開示の一実施形態において、共発現エレメントは、ＩＲＥＳエレメントであり、その概念を図１に示す。ＩＲＥＳと略される内部リボソーム進入部位は、タンパク質合成のより大きなプロセスの一部として、キャップ非依存的な様式で翻訳開始を可能にするＲＮＡエレメントである。真核生物の翻訳において、開始複合体の構築には５’キャップの認識が必要であるため、開始は典型的にはｍＲＮＡ分子の５’末端で起こる。２つのコード領域の間にＩＲＥＳエレメントを配置することによって、この部位で開始複合体が構築され、下流のコード領域の翻訳が可能になる。したがって、本開示の一実施形態において、ベクターはＩＲＥＳを含み、１つの転写物がベクターから産生され、その後、別個のタンパク質に翻訳される。
ＩＲＥＳエレメントは、同じプロモーターの制御下で、第１のポリペプチド及び１つ以上の免疫阻害化合物の共発現を可能にする。プロモーターは、第１のポリペプチドをコードする核酸配列及び１つ以上の免疫阻害化合物をコードする核酸配列のコード領域を含有する単一のｍＲＮＡの転写を指示する。２つ以上の免疫阻害化合物が本発明のベクターから発現される場合、本発明のベクターには、免疫阻害化合物をコードする各核酸配列の上流にＩＲＥＳエレメントが存在する必要がある。あるいは、本発明のベクターから２つ以上の免疫阻害化合物を発現させる場合には、別のタイプの共発現エレメントを使用することもできる。
本発明のベクターで使用するＩＲＥＳエレメントは、ウイルスゲノム由来でも細胞ｍＲＮＡ由来でもよい。ＤＮＡプラスミドなどのＩＲＥＳエレメントを含むベクターは、市販されている。
２Ａ自己切断ペプチド
本開示の別の実施形態において、共発現エレメントは、２Ａ自己切断ペプチド（又は略称「２Ａペプチド」）をコードする核酸配列であり、その概念を図２に示す。
本出願の文脈において、「２Ａ自己切断ペプチド」及び「２Ａペプチド」という用語は、２つのコード領域の間に位置する場合、２つのコード領域を単一の転写物として転写させるが、２つの別個のペプチド鎖に翻訳させる核酸配列によってコードされるペプチドに対して使用される。概ね、リボソームがｍＲＮＡを翻訳する場合、アミノ酸は、Ｎ末端からＣ末端へと共有結合する。２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸配列が存在すると、リボソームが２ＡペプチドのＣ末端のペプチド結合の合成をスキップするため、２つの別個のペプチド鎖になる。２Ａ自己切断ペプチドは、典型的には１８～２２アミノ酸長であり、コンセンサス配列ＤＸＥＸＮＰＧＰ（配列番号６８）を含むことが多く、Ｘは任意のアミノ酸であり得る。
本発明の一実施形態において、リボソームは、２Ａ自己切断ペプチドのＣ末端に見出されるグリシン残基とプロリン残基との間のペプチド結合をスキップし、これは、上流の遺伝子産物は末端にアミノ酸残基が数個付加されるが、下流の遺伝子産物はプロリンから始まることを意味する。
一実施形態において、２Ａ自己切断ペプチドは、コンセンサス配列ＤＸＥＸＮＰＧＰ（配列番号６８）を含む１８～２２アミノ酸長の配列であり、Ｘは任意のアミノ酸であり得る。
したがって、２Ａ自己切断ペプチドもまた、同じプロモーターの制御下で、第１のポリペプチド及び１つ以上の免疫阻害化合物の共発現を可能にする。ＩＲＥＳエレメントと同様に、２つ以上の免疫阻害化合物が本発明のベクターから発現される場合、免疫阻害化合物をコードする各核酸配列の上流に、２Ａペプチドをコードする核酸配列がベクター中に存在する必要がある。一例として、ベクターは、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列、第１の免疫阻害化合物をコードする第２の核酸配列、及び第２の免疫阻害化合物をコードする第３の核酸配列を含む。ベクターは、第１の核酸配列と第２の核酸配列との間にＴ２Ａペプチドをコードする核酸配列を含み、第２の核酸配列と第３の核酸配列との間にＰ２Ａペプチドをコードする核酸配列を含み得る。あるいは、２つ以上の免疫阻害化合物が本発明のベクターから発現される場合には、別のタイプの共発現エレメントが使用され得る。
更なる実施形態において、２Ａ自己切断ペプチドは、Ｔ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド及びＦ２Ａペプチドからなる群から選択される２Ａペプチドである。
一実施形態において、Ｔ２Ａペプチドは、表１又は表２に列挙されるＴ２Ａ配列と同一のアミノ酸配列を有する。更なる実施形態において、アミノ酸配列ＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号６９）が存在するが、Ｔ２Ａアミノ酸配列の残りは、表１のＴ２Ａアミノ酸配列に対して８０％～１００％の配列同一性、例えば８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。別の実施形態において、Ｔ２Ａペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を有する。
一実施形態において、Ｐ２Ａペプチドは、表１又は表２に列挙されるＰ２Ａ配列と同一のアミノ酸配列を有する。更なる実施形態において、アミノ酸配列ＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号６９）が存在するが、Ｐ２Ａアミノ酸配列の残りは、表１のＰ２Ａアミノ酸配列に対して８０％～１００％の配列同一性、例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。別の実施形態において、Ｐ２Ａペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列を有する。
一実施形態において、Ｅ２Ａペプチドは、表１又は表２に列挙されるＥ２Ａ配列と同一のアミノ酸配列を有する。更なる実施形態において、アミノ酸配列ＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号７０）が存在するが、Ｅ２Ａアミノ酸配列の残りは、表１のＥ２Ａ配列に対して８０％～１００％の配列同一性、例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。別の実施形態において、Ｅ２Ａペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を有する。
一実施形態において、Ｆ２Ａペプチドは、表１又は表２に列挙されるＦ２Ａ配列と同一のアミノ酸配列を有する。更なる実施形態において、アミノ酸配列ＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号７０）が存在するが、Ｆ２Ａアミノ酸配列の残りは、表１のＦ２Ａ配列に対して８０％～１００％の配列同一性、例えば、８１％、８２％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。別の実施形態において、Ｆ２Ａペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列を有する。
例えば、表２に示すように、野生型配列のＮ末端の前にＧＳＧ配列を挿入することによって、２Ａ－ペプチドの切断効率と発現効率を高めるように調節できることが概ね知られている。
別の実施形態において、本発明のベクターは、ＩＲＥＳエレメント及び２Ａペプチドをコードする核酸配列の両方を含有する。一例として、ベクターは、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列、第１の免疫阻害化合物をコードする第２の核酸配列、及び第２の免疫阻害化合物をコードする第３の核酸配列を含む。ベクターは、第１の核酸配列と第２の核酸配列との間にＩＲＥＳエレメントを含み、第２の核酸配列と第３の核酸配列との間に２Ａペプチドをコードする核酸配列を含み得る。あるいは、ベクターは、第１の核酸配列と第２の核酸配列との間に２Ａペプチドをコードする核酸配列を含み、第２の核酸配列と第３の核酸配列との間にＩＲＥＳエレメントを含み得る。更なる免疫阻害化合物をコードする更なる核酸配列が、同じ様式でベクター中に含まれ得る。
別の実施形態において、本発明のベクターは、２つの２Ａペプチドをコードする核酸配列を、すなわち２つの２Ａペプチドからなる連続配列として含有する。一例として、ベクターは、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列及び免疫阻害化合物をコードする第２の核酸を含む。ベクターは、第１の核酸配列と第２の核酸配列との間の連続配列として、２つの２Ａペプチドをコードする核酸配列を含み得る。
双方向プロモーター
本開示の一実施形態において、ベクターは、共発現エレメント（又は２つ以上の共発現エレメント）を含み、これにより、第１のポリペプチド及び１つ以上の免疫阻害化合物が別個の転写物として転写され、その結果、別個の転写産物、したがって別個のタンパク質が生じる。
本開示の一実施形態において、共発現エレメントは、双方向プロモーターであり、その概念を図３に示す。双方向プロモーターは、典型的には、双方向遺伝子対中の遺伝子の５’末端間のＤＮＡの短い（例えば１ｋｂｐ未満）遺伝子間領域である。「双方向遺伝子対」とは、５’末端が互いに向かって配向している、反対の鎖上にコードされた２つの隣接する遺伝子を指す。
本開示の一実施形態において、双方向プロモーターは、４つのＣＭＶエンハンサーを有するＣＡＧプロモーターの背中合わせ配置（ｂａｃｋ－ｔｏ－ｂａｃｋ ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）である（Ｓｌａｄｉｔｓｃｈｅｋ ＨＬ，Ｎｅｖｅｕ ＰＡ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １１（５），ｅ０１５５１７７，２０１６）。
本開示の一実施形態において、双方向プロモーターは、ＲＰＢＳＡである（Ｋｅｖｉｎ Ｈｅ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏ．ｌ Ｓｃｉ．２１（２３），９２５６，２０２０）。
本開示の一実施形態において、双方向プロモーターは、マウスＰｇｋ１及びヒト真核生物翻訳伸長因子１アルファ１プロモーターの背中合わせの構成である（Ｇｏｌｄｉｎｇ ＆ Ｍａｎｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １８，８１７－８２６，２０１１）。
一実施形態において、本発明のベクターは、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列と、免疫阻害化合物をコードする第２の核酸配列とを、それらの５’末端間に双方向プロモーターを含む双方向遺伝子対として含むプラスミドである。
複数のプロモーター
本開示の別の実施形態において、共発現エレメントは、様々なプロモーターであり、すなわち、ベクターは、例えば、第１のポリペプチド及び１つ以上の免疫阻害化合物をコードする核酸配列のそれぞれについて別個のプロモーターを含むプラスミド、すなわち、第１のポリペプチド及び１つ以上の免疫阻害化合物のそれぞれの別個の転写のためのプラスミドである。
一実施形態において、当該核酸配列のそれぞれは異なるプロモーターを有し、その概念は図４に示されている。一実施形態において、全ての核酸配列は、等モル発現を目的として同じプロモーターを有する。代替的な実施形態において、一方の核酸配列は、他方の核酸配列よりも強いプロモーターを有する。すなわち、より強力なプロモーターを有する核酸配列は、他のものよりも高いレベルで発現される可能性が高い。
多数のプロモーターが当技術分野で公知であり、本発明のプラスミドに含めるのに適している。本開示の一実施形態において、プロモーターは、ＣＭＶプロモーターなどのサイトメガロウイルスに由来する。
異なる共発現エレメントの組み合わせ
一実施形態において、本発明のベクターは、１つ以上の共発現エレメント、好ましくはＩＲＥＳエレメント、２Ａペプチド、双方向プロモーター及びプロモーターからなる群から選択される共発現エレメントを含む。
本発明のベクターは、あらゆる種類の共発現エレメントの組み合わせを含み得る。
一例として、本発明のベクターは、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列、第１の免疫阻害化合物をコードする第２の核酸配列、及び第２の免疫阻害化合物をコードする第３の核酸配列を含むＤＮＡプラスミドである。一実施形態において、ＤＮＡプラスミドは、ＩＲＥＳ及び２Ａペプチドを含み、これにより、第１のポリペプチド（プロモーターの制御下）並びに第１及び第２の免疫阻害化合物の共発現を可能にする。別の実施形態において、ＤＮＡプラスミドは、双方向プロモーター及び別のプロモーターを含む。
当業者は、上記の例における第１、第２、及び第３の核酸配列という用語が、本発明のプラスミドが第１、第２、及び第３の核酸配列の順序で核酸配列を含むことを意味しないことを理解するであろう。第２の核酸配列は、第１又は第３の核酸配列の下流又は上流であり得、第３の核酸配列は、第１又は第２の核酸配列の下流又は上流であり得、第１の核酸配列は、第２又は第３の核酸配列の上流又は下流であり得る。別の実施形態において、第１及び第２の核酸配列は、第１及び第３又は第２及び第３の核酸配列であり得るように、同じＤＮＡ鎖上で反対方向にあってもよい。更なる実施形態において、第１のポリペプチド及び免疫阻害化合物をコードする核酸配列は、反対のＤＮＡ鎖上にあってもよい。
免疫阻害化合物
本発明のベクターは、１つ以上の免疫阻害化合物をコードする１つ以上の核酸配列を含む。
本開示の一実施形態において、免疫阻害化合物は、免疫寛容を誘導、増加又は維持する化合物である。本開示の別の実施形態において、免疫阻害化合物は、免疫寛容を誘導、増加又は維持することが知られている化合物である。
なお別の実施形態において、免疫阻害化合物は、寛容誘導様式で抗原性ユニット中のエピトープの提示に有利に働く化合物、及び／又は寛容維持細胞（調節性Ｔ細胞、エフェクターＴ細胞のアネルギー又はアポトーシスだけではない）の誘導に有利に働く化合物、及び／又はこのような寛容維持細胞の維持を助ける化合物である。
なお別の実施形態において、免疫阻害化合物は、寛容誘導様式で抗原性ユニット中のエピトープの提示を促進及び／若しくは支持する化合物、及び／又は寛容維持細胞（調節性Ｔ細胞、エフェクターＴ細胞のアネルギー又はアポトーシスだけではない）の誘導を促進及び／若しくは支持する化合物、及び／又はこのような寛容維持細胞の維持を助ける化合物である。
本開示の一実施形態において、免疫阻害化合物は、阻害性チェックポイント分子の細胞外ドメインなどの細胞外部分である。一実施形態において、阻害性チェックポイント分子は、ＣＬＴＡ－４、ＰＤ－１、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＮＯＸ２、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９及びＴＩＭ－３からなる群から選択される。一実施形態において、阻害性チェックポイント分子は、ＣＬＴＡ－４である。一実施形態において、阻害性チェックポイント分子は、ＰＤ－１である。一実施形態において、阻害性チェックポイント分子は、ＢＴＬＡである。一実施形態において、阻害性チェックポイント分子は、ＴＩＭ－３である。
好ましい実施形態において、免疫阻害化合物は、ヒト（ｈ）阻害性チェックポイント分子の細胞外ドメインなどの細胞外部分、例えば、ｈＣＬＴＡ－４、ｈＰＤ－１、ｈＢＴＬＡ、ｈＬＡＧ３、ｈＮＯＸ２、ｈＳＩＧＬＥＣ７、ｈＳＩＧＬＥＣ９及びｈＴＩＭ－３からなる群から選択されるヒト阻害性チェックポイント分子の細胞外ドメインなどの細胞外部分である。一実施形態において、阻害性チェックポイント分子は、配列番号５１を有するｈＣＴＬＡ－４などのｈＣＬＴＡ－４である。一実施形態において、阻害性チェックポイント分子は、配列番号５２を有するｈＰＤ－１などのｈＰＤ－１である。一実施形態において、阻害性チェックポイント分子は、ｈＢＴＬＡである。一実施形態において、阻害性チェックポイント分子は、ｈＴＩＭ－３である。
本開示の一実施形態において、免疫阻害化合物は、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＩＬ－２７、ＩＬ－２、ＧＭ－ＣＳＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－３７及びＩＬ－３５からなる群から選択されるサイトカインである。一実施形態において、サイトカインはＩＬ－１０である。一実施形態において、サイトカインはＴＧＦ－β１である。一実施形態において、サイトカインはＩＬ－２７である。一実施形態において、サイトカインはＩＬ－２である。一実施形態において、サイトカインはＧＭ－ＣＳＦである。一実施形態において、サイトカインはＦＬＴ３Ｌである。一実施形態において、サイトカインはＩＦＮ－γである。一実施形態において、サイトカインはＩＬ－３７である。一実施形態において、サイトカインはＩＬ－３５である。
好ましい実施形態において、免疫阻害化合物は、ｈＩＬ－１０、ｈＴＧＦ－β１、ｈＴＧＦ－β２、ｈＴＧＦ－β３、ｈＩＬ－２７、ｈＩＬ－２、ｈＧＭ－ＣＳＦ、ｈＦＬＴ３Ｌ、ｈＩＦＮ－γ、ｈＩＬ－３７及びｈＩＬ－３５からなる群から選択されるヒトサイトカインである。一実施形態において、サイトカインは、配列番号５３を有するｈＩＬ－１０などのｈＩＬ－１０である。一実施形態において、サイトカインは、配列番号５４を有するｈＴＧＦ－β１などのｈＴＧＦ－β１である。一実施形態において、サイトカインは、配列番号５８を有するｈＴＧＦ－β２などのｈＴＧＦ－β２である。一実施形態において、サイトカインは、配列番号５９を有するｈＴＧＦ－β３などのｈＴＧＦ－β３である。一実施形態において、サイトカインは、ｈＩＬ－２７である。一実施形態において、サイトカインは、配列番号５５を有するｈＩＬ－２などのｈＩＬ－２である。一実施形態において、サイトカインは、配列番号５６を有するｈＧＭ－ＣＳＦなどのｈＧＭ－ＣＳＦである。一実施形態において、サイトカインはｈＦＬＴ３Ｌである。一実施形態において、サイトカインは、配列番号５７を有するｈＩＦＮ－γなどのｈＩＦＮ－γである。一実施形態において、サイトカインは、ｈＩＬ－３７である。一実施形態において、サイトカインは、ｈＩＬ－３５である。
複数の免疫阻害化合物をコードする複数の核酸配列を含むベクター
本開示の一実施形態において、ベクターは、２、３、４、５、６、７又は８個の免疫阻害化合物をコードする核酸配列を含む。別の実施形態において、ベクターは、２～６個の免疫阻害化合物、すなわち、２又は３又は４又は５又は６個の免疫阻害化合物をコードする核酸配列を含む。免疫阻害化合物は、同じであっても異なっていてもよく、好ましくは異なっている。
好ましい実施形態において、異なる免疫阻害化合物は、多くの異なるレベルで寛容誘導環境を生成又は促進する。例として、本発明のベクターは、３つの異なる免疫阻害化合物をコードする核酸配列を含み、第１のものは寛容を誘導し、第２のものは寛容を増加させ、第３のものは寛容を維持する。
第１の核酸配列
本開示のベクターは、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列、すなわち、二本鎖又は一本鎖のいずれかのゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びｍＲＮＡを含むＤＮＡ又はＲＮＡを含む。一実施形態において、第１の核酸配列は、ＤＮＡである。別の実施形態において、第１の核酸配列は、それが投与される対象の種に対して最適化されている。ヒトに投与する場合、一実施形態において、第１の核酸配列は、ヒトコドンに最適化されている。
第１の核酸配列は、ＡＰＣを標的とする標的化ユニット、二量体化ユニットなどの多量体化ユニット、及び抗原性ユニットを含む第１のポリペプチドをコードし、抗原性ユニットは、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む。対象に投与されると、第１のポリペプチドが発現され、多量体化ユニットの存在により多量体タンパク質を形成し、これが抗原性ユニットに含まれる１つ以上のＴ細胞エピトープに対する寛容原性応答を誘発する。
構築物
構築物は、Ｎ末端開始及びＣ末端を有するポリペプチドとして記載され得る（図５に示される）。第１のポリペプチドのエレメント及びユニット（標的化ユニット（ＴＵ）、多量体化ユニット、例えば、この図５では二量体化ユニット（ＤｉＭｕ）、及び抗原性ユニット）は、抗原性ユニットがポリペプチドのＣ末端（図５ａ）又はポリペプチドのＮ末端開始（図５ｂ）に位置するように、ポリペプチド中に配置され得る。好ましくは、抗原性ユニットは、ポリペプチドのＣ末端に位置する。
抗原性ユニットは、１つ以上のＴ細胞エピトープを含み、複数のＴ細胞エピトープが存在する場合には、Ｔ細胞エピトープを分離するための１つ以上のＴ細胞エピトープリンカーを含み得る。ユニットリンカー（ＵＬ）は、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットと抗原性ユニットとを接続し得る。図５は、Ｔ細胞エピトープリンカー（ＴＬ）によって分離された２つのＴ細胞エピトープ（Ｔ１、Ｔ２）を有する抗原性ユニットを示す。上記のユニット及びエレメントの順序及び配向は、多量体タンパク質及び第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列において同じである。
以下では、第１のポリペプチド／構築物の様々なユニット及びエレメントについて詳細に説明する。これらは、ユニット／エレメントをコードする核酸配列として第１の核酸配列中に存在するが、アミノ酸配列として第１のポリペプチド又は多量体タンパク質中に存在する。読みやすくするために、以下において、ユニット／エレメントは、主に第１のポリペプチド／多量体タンパク質に関連して、すなわちそれらのアミノ酸配列に基づいて説明される。
標的化ユニット
本発明のベクターに含まれる第１の核酸によってコードされる第１のポリペプチドは、ＡＰＣを標的とする標的化ユニットを含む。
本明細書で使用される「標的化ユニット」という用語は、本発明の構築物を抗原提示細胞に送達し、細胞を活性化することなく、ＡＰＣ上の表面分子と相互作用する、例えば、ＡＰＣ上の表面受容体に結合するユニットを指す。
別の実施形態において、本明細書で使用される「標的化ユニット」という用語は、本発明の構築物を抗原提示細胞に送達し、細胞の成熟を誘導することなく、ＡＰＣ上の表面分子と相互作用する、例えば、ＡＰＣ上の表面受容体に結合するユニットを指す。
ＡＰＣは、構築物を内在化し、例えば、共刺激シグナルをアップレギュレーションしないことによって、及び／又は、阻害性表面分子をアップレギュレーションすることによって、及び／又は、阻害性サイトカインの分泌を促進することによって、抗炎症性、寛容原性の様式で、ＭＨＣ上の抗原性ユニットに含まれるＴ細胞エピトープをその表面上に提示する。
一実施形態において、標的化ユニットは、ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、及びＴＧＦβＲ３を含む）、ＩＬ－１０ＲＡ及びＩＬ－１０ＲＢなどのＩＬ－１０Ｒ、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－１１Ｒ、ＩＬ－１３Ｒ、ＩＬ－２７Ｒ、ＩＬ－３５Ｒ、ＩＬ－３７Ｒ、ＧＭ－ＣＳＦＲ、ＦＬＴ３、ＣＣＲ７、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１０３、ＣＤ１４、ＣＤ３６、ＣＤ２０５、ＣＤ１０９、ＶＩＳＴＡ、ＭＡＲＣＯ、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ８３、ＳＩＧＬＥＣ、Ｃｌｅｃ１０Ａ（ＭＧＬ）、ＡＳＧＲ （ＡＳＧＲ１／ＡＳＧＲ２）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｃｌｅｃ９Ａ、Ｃｌｅｃ１２Ａ、Ｃｌｅｃ１２Ｂ、ＤＣＩＲ２、Ｌａｎｇｅｒｉｎ、ＭＲ、ＤＣ－Ｓｉｇｎ、Ｔｒｅｍｌ４、Ｄｅｃｔｉｎ－１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＨＶＥＭ、ＣＤ１６３及びＣＤ１４１からなる群から選択されるＡＰＣ上の表面分子に結合する部分を含むか又はそれからなる。
好ましい実施形態において、標的化ユニットは、ｈＴＧＦβ受容体（ｈＴＧＦβＲ１、ｈＴＧＦβＲ２、及びｈＴＧＦβＲ３を含む）、ｈＩＬ－１０ＲＡ及びｈＩＬ－１０ＲＢなどのｈＩＬ－１０Ｒ、ｈＩＬ－２Ｒ、ｈＩＬ－４Ｒ、ｈＩＬ－６Ｒ、ｈＩＬ－１１Ｒ、ｈＩＬ－１３Ｒ、ｈＩＬ－２７Ｒ、ｈＩＬ－３５Ｒ、ｈＩＬ－３７Ｒ、ｈＧＭ－ＣＳＦＲ、ｈＦＬＴ３、ｈＣＣＲ７、ｈＣＤ１１ｂ、ｈＣＤ１１ｃ、ｈＣＤ１０３、ｈＣＤ１４、ｈＣＤ３６、ｈＣＤ２０５、ｈＣＤ１０９、ｈＶＩＳＴＡ、ｈＭＡＲＣＯ、ｈＭＨＣＩＩ、ｈＣＤ８３、ｈＳＩＧＬＥＣ、ｈＣｌｅｃ１０Ａ（ｈＭＧＬ）、ｈＡＳＧＲ（ｈＡＳＧＲ１／ｈＡＳＧＲ２）、ｈＣＤ８０、ｈＣＤ８６、ｈＣｌｅｃ９Ａ、ｈＣｌｅｃ１２Ａ、ｈＣｌｅｃ１２Ｂ、ｈＤＣＩＲ２、ｈＬａｎｇｅｒｉｎ、ｈＭＲ、ｈＤＣ－Ｓｉｇｎ、ｈＴｒｅｍｌ４、ｈＤｅｃｔｉｎ－１、ｈＰＤＬ１、ｈＰＤＬ２、ｈＨＶＥＭ、ｈＣＤ１６３及びｈＣＤ１４１からなる群から選択されるヒト（ｈ）ＡＰＣ上の表面分子に結合する部分を含むか又はそれからなる。
この部分は、天然リガンド、抗体若しくはその一部、例えばｓｃＦｖ、又は合成リガンドであり得る。
一実施形態において、部分は、前述の表面分子のいずれかに対して特異性を有する抗体又はその一部、例えばｓｃＦｖであり、その表面分子への結合により、抗原性ユニットに含まれるＴ細胞エピトープ抗炎症性、寛容原性の様式で提示される。
別の実施形態において、部分は、前述の表面分子のいずれかに対して特異性を有する合成リガンドであり、その表面分子への結合により、抗原性ユニットに含まれるＴ細胞エピトープが抗炎症性、寛容原性の様式で提示される。タンパク質モデリングを使用して、このような合成リガンドを設計することができる。
なお別の実施形態において、部分は、天然リガンドである。一実施形態において、天然リガンドは、ＴＧＦβ、ＩＬ－１０、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３、ＩＬ－２７、ＩＬ－３５、ＩＬ－３７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＩＣＡＭ－１（ＣＤ５４としても知られる細胞間接着分子１）、ケラチン、ＶＳＩＧ－３、好ましくはＶＳＩＧ－３の細胞外ドメイン、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＣＴＬＡ－４、好ましくはＣＴＬＡ－４の細胞外ドメイン、ＰＤ－１、好ましくはＰＤ－１の細胞外ドメイン及びＢＴＬＡ、好ましくはＢＴＬＡの細胞外ドメインからなる群から選択される。
好ましい実施形態において、部分は、ｈＴＧＦβ、ｈＩＬ－１０、ｈＩＬ－２、例えば配列番号５５を有するｈＩＬ－２、ｈＩＬ－４、ｈＩＬ－６、ｈＩＬ－１１、ｈＩＬ－１３、ｈＩＬ－２７、ｈＩＬ－３５、ｈＩＬ－３７、ｈＧＭ－ＣＳＦ、例えば配列番号５６を有するｈＧＭ－ＣＳＦ、ｈＦＬＴ３Ｌ、ｈＣＣＬ１９、ｈＣＣＬ２１、ｈＩＣＡＭ－１（ＣＤ５４としても知られる細胞間接着分子１）、ｈケラチン、ｈＶＳＩＧ－３、好ましくはｈＶＳＩＧ－３の細胞外ドメイン、ｈＳＣＧＢ３Ａ２、ｈＣＴＬＡ－４、好ましくはｈＣＴＬＡ－４の細胞外ドメイン、例えば配列番号５１を有するｈＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン、ｈＰＤ－１、好ましくはＰＤ－１の細胞外ドメイン、例えば配列番号５２を有するｈＰＤ－１の細胞外ドメイン、及びｈＢＴＬＡ、好ましくはｈＢＴＬＡの細胞外ドメインからなる群から選択されるヒト（ｈ）天然リガンドである。
別の実施形態において、標的化ユニットは、ＩＬ１０又はＴＧＦβ、好ましくはヒトＩＬ－１０又はヒトＴＧＦβ、そのアイソフォームＴＧＦβ－１、ＴＧＦβ－２及びＴＧＦβ－３を含む、であるか、又はそれを含む。
別の実施形態において、標的化ユニットは、ヒトＴＧＦβのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。一実施形態において、標的化ユニットは、配列番号５４又は配列番号５８又は配列番号５９のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、標的化ユニットは、配列番号５４又は配列番号５８又は配列番号５９のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。
なお別の実施形態において、標的化ユニットは、配列番号５４又は配列番号５８又は配列番号５９のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも８６％又は少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。なお更に好ましい実施形態において、標的化ユニットは、配列番号５４又は配列番号５８又は配列番号５９のアミノ酸配列を含む。
なお別の実施形態において、標的化ユニットは、配列番号５４又は配列番号５８又は配列番号５９のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも８６％又は少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。なお更に好ましい実施形態において、標的化ユニットは、配列番号５４又は配列番号５８又は配列番号５９のアミノ酸配列からなる。
好ましい一実施形態において、標的化ユニットは、多くとも８０個のアミノ酸、例えば多くとも７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１個のアミノ酸が置換、欠失又は挿入されていることを除いて、配列番号５４又は配列番号５８又は配列番号５９のアミノ酸配列を含む。
好ましい一実施形態において、標的化ユニットは、多くとも８０個のアミノ酸、例えば多くとも７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１個のアミノ酸が置換、欠失又は挿入されていることを除いて、配列番号５４又は配列番号５８又は配列番号５９のアミノ酸配列からなる。
好ましい一実施形態において、標的化ユニットは、配列番号６０又は配列番号６１又は配列番号６２を有する核酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
更に好ましい実施形態において、標的化ユニットは、配列番号６０又は配列番号６１又は配列番号６２を有する核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも８６％又は少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。なお更に好ましい実施形態において、標的化ユニットは、配列番号６０又は配列番号６１又は配列番号６２の核酸配列を含む。
より好ましい実施形態において、標的化ユニットは、配列番号６０又は配列番号６１又は配列番号６２を有する核酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列からなる。
更に好ましい実施形態において、標的化ユニットは、配列番号６０又は配列番号６１又は配列番号６２の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも８６％又は少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列からなる。なお別の好ましい実施形態において、標的化ユニットは、配列番号６０又は配列番号６１又は配列番号６２の核酸配列を有する。
なお別の実施形態において、標的化ユニットは、ヒトＩＬ－１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。一実施形態において、標的化ユニットは、配列番号５３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、標的化ユニットは、配列番号５３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。
なお別の実施形態において、標的化ユニットは、配列番号５３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも８６％又は少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。なお更に好ましい実施形態において、標的化ユニットは配列番号５３のアミノ酸配列を含む。
なお別の実施形態において、標的化ユニットは、配列番号５３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも８６％又は少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。なお更に好ましい実施形態において、標的化ユニットは、配列番号５３のアミノ酸配列からなる。
好ましい一実施形態において、標的化ユニットは、多くとも３５個のアミノ酸、例えば多くとも３０、２５、２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１個のアミノ酸が置換、欠失又は挿入されていることを除いて、配列番号５３のアミノ酸配列を含む。
好ましい一実施形態において、標的化ユニットは、多くとも３５個のアミノ酸、例えば多くとも３０、２５、２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１個のアミノ酸が置換、欠失又は挿入されていることを除いて、配列番号５３のアミノ酸配列からなる。
好ましい一実施形態において、標的化ユニットは、配列番号６３を有する核酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
更に好ましい実施形態において、標的化ユニットは、配列番号６３を有する核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも８６％又は少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。なお更に好ましい実施形態において、標的化ユニットは、配列番号６３の核酸配列を含む。
より好ましい実施形態において、標的化ユニットは、配列番号６３を有する核酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列からなる。
更に好ましい実施形態において、標的化ユニットは、配列番号６３の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも８６％又は少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列からなる。なお別の好ましい実施形態において、標的化ユニットは配列番号６３の核酸配列を有する。
一実施形態において、標的化ユニットは、ＳＣＧＢ３Ａ２又はＶＳＩＧ－３、好ましくはヒトＶＳＩＧ－３、好ましくはヒトＶＳＩＧ－３又はヒトＳＣＧＢ３Ａ２の細胞外ドメインなどの細胞外部分であるか、又はそれを含む。
別の実施形態において、標的化ユニットは、ヒトＳＣＧＢ３Ａ２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。一実施形態において、標的化ユニットは、配列番号６４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、標的化ユニットは、配列番号６４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。
なお別の実施形態において、標的化ユニットは、配列番号６４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも８６％又は少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。なお更に好ましい実施形態において、標的化ユニットは、配列番号６４のアミノ酸配列を含む。
なお別の実施形態において、標的化ユニットは、配列番号６４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも８６％又は少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。なお更に好ましい実施形態において、標的化ユニットは、配列番号６４のアミノ酸配列からなる。
好ましい一実施形態において、標的化ユニットは、多くとも１８個のアミノ酸、例えば多くとも１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１個のアミノ酸が置換、欠失又は挿入されていることを除いて、配列番号６４のアミノ酸配列を含む。
好ましい一実施形態において、標的化ユニットは、多くとも１８個のアミノ酸、例えば多くとも１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１個のアミノ酸が置換、欠失又は挿入されていることを除いて、配列番号６４のアミノ酸配列からなる。
好ましい一実施形態において、標的化ユニットは、配列番号６５を有する核酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
更に好ましい実施形態において、標的化ユニットは、配列番号６５を有する核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも８６％又は少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。なお更に好ましい実施形態において、標的化ユニットは、配列番号６５の核酸配列を含む。
より好ましい実施形態において、標的化ユニットは、配列番号６５を有する核酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列からなる。
更に好ましい実施形態において、標的化ユニットは、配列番号６５の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも８６％又は少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列からなる。なお別の好ましい実施形態において、標的化ユニットは配列番号６５の核酸配列を有する。
なお別の実施形態において、標的化ユニットは、ヒトＶＳＩＧ－３の細胞外ドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。一実施形態において、標的化ユニットは、配列番号６６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、標的化ユニットは、配列番号６６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。
なお別の実施形態において、標的化ユニットは、配列番号６６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも８６％又は少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。なお更に好ましい実施形態において、標的化ユニットは、配列番号６７のアミノ酸配列を含む。
なお別の実施形態において、標的化ユニットは、配列番号６６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも８６％又は少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。なお更に好ましい実施形態において、標的化ユニットは、配列番号６６のアミノ酸配列からなる。
好ましい一実施形態において、標的化ユニットは、多くとも８６個のアミノ酸、例えば多くとも８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１個のアミノ酸が置換、欠失又は挿入されていることを除いて、配列番号６６のアミノ酸配列を含む。
好ましい一実施形態において、標的化ユニットは、多くとも８６個のアミノ酸、例えば多くとも８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１個のアミノ酸が置換、欠失又は挿入されていることを除いて、配列番号６６のアミノ酸配列からなる。
好ましい一実施形態において、標的化ユニットは、配列番号６７を有する核酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
更に好ましい実施形態において、標的化ユニットは、配列番号６７を有する核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも８６％又は少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。なお更に好ましい実施形態において、標的化ユニットは、配列番号６７の核酸配列を含む。
より好ましい実施形態において、標的化ユニットは、配列番号６７を有する核酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列からなる。
更に好ましい実施形態において、標的化ユニットは、配列番号６７の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも８６％又は少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列からなる。なお別の好ましい実施形態において、標的化ユニットは配列番号６７の核酸配列を有する。
なお別の実施形態において、標的化ユニットは、抗ヒトＣＤ２０５など、ＣＤ２０５に対する特異性を有する抗体又はその一部（例えばｓｃＦｖ）であるか、又はそれを含む。
多量体化ユニット／二量体化ユニット
本発明のベクターに含まれる第１の核酸配列によってコードされる第１のポリペプチドは、二量体化ユニットなどの多量体化ユニットを含む。
本明細書で使用される「多量体化ユニット」という用語は、抗原性ユニットと標的化ユニットとの間のヌクレオチド又はアミノ酸の配列を指す。抗原性ユニット及び標的化ユニットを接続することに加えて、多量体化ユニットは、複数のポリペプチド、例えば、２つ、３つ、４つ又はそれ以上のポリペプチドの、多量体タンパク質、例えば、二量体タンパク質、三量体タンパク質又は四量体タンパク質への多量体化の促進／連結を行う。更に、多量体化ユニットはまた、多量体タンパク質に可動性を与え、標的化ユニットが、可変距離に位置する場合であっても、ＡＰＣ上の複数の表面分子に最適に結合することを可能にする。多量体化ユニットは、これらの要件の１つ以上を満たすものであればどのようなユニットでもよい。
２つ以上のポリペプチドにおける多量体化の促進／連結を行う多量体化ユニット
一実施形態において、多量体化ユニットは、三量体化ユニット、例えば、コラーゲン由来三量体化ユニット、例えば、ヒトコラーゲン由来三量体化ドメイン、例えば、ヒトコラーゲン由来ＸＶＩＩＩ三量体化ドメインである（例えば、Ａ．Ａｌｖａｒｅｚ－Ｃｉｅｎｆｕｅｇｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ６，２８６４３（２０１６）参照）、又はヒトコラーゲンＸＶ三量体化ドメインである。したがって、一実施形態において、多量体化ユニットは、配列番号１１６を有する核酸配列、又は当該核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる三量体化ユニットである。別の実施形態において、三量体化ユニットは、Ｔ４フィブリチンのＣ末端ドメインである。したがって、一実施形態において、多量体化ユニットは、配列番号１１７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる三量体化ユニットである。
別の実施形態において、多量体化ユニットは、ｐ５３由来のドメインなどの四量体化ユニットであり、任意選択で、以下に記載するようなヒンジ領域を更に含む。したがって、一実施形態において、多量体化ユニットは、配列番号１１３を有する核酸配列、又は当該核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる四量体化ユニットであり、任意選択で、以下に記載されるヒンジ領域を更に含む。
二量体化ユニット
本明細書で使用される「二量体化ユニット」という用語は、抗原性ユニットと標的化ユニットとの間のヌクレオチド又はアミノ酸の配列を指す。抗原性ユニット及び標的化ユニットを接続することに加えて、二量体化ユニットは、２つの単量体ポリペプチドの二量体タンパク質への二量体化の促進／連結を行う。更に、二量体化ユニットはまた、二量体タンパク質に可動性を与え、標的化ユニットが、可変距離に位置する場合であっても、ＡＰＣ上の複数の表面分子に最適に結合することを可能にする。二量体化ユニットは、これらの要件を満たすものであればどのようなユニットでもよい。
したがって、一実施形態において、第１のポリペプチドは、ヒンジ領域を含む二量体化ユニットを含む。別の実施形態において、二量体化ユニットは、ヒンジ領域と二量体化を促進する別のドメインとを含む。なお別の実施形態において、二量体化ユニットは、ヒンジ領域、二量体化ユニットリンカー、及び二量体化を促進する別のドメインを含み、二量体化ユニットリンカーは、ヒンジ領域と二量体化を促進する他のドメインとを接続する。一実施形態において、二量体化ユニットリンカーは、グリシン－セリンリッチリンカー、好ましくはＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ（配列番号１１８）であり、すなわち、二量体化ユニットは、グリシン－セリンリッチ二量体化ユニットリンカー、好ましくは二量体化ユニットリンカーＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ（配列番号１１８）を含む。
「ヒンジ領域」という用語は、２つのポリペプチドの結合に寄与する、すなわち二量体タンパク質の形成を促進する、二量体化ユニットに含まれるアミノ酸配列を指す。２つ以上のポリペプチドにおける多量体化の促進／連結を行う多量体化ユニットの文脈において、「ヒンジ領域」という用語は、２つ以上のポリペプチド、例えば３つ若しくは４つのポリペプチドの連結に寄与し、及び／又は可動なスペーサーとして機能して、多量体タンパク質の２つの標的化ユニットが、可変距離に位置する場合であっても、ＡＰＣ上の複数の表面分子に同時に結合することを可能にする、このような多量体化ユニットに含まれるアミノ酸配列を指す。ヒンジ領域は、Ｉｇ由来、例えばＩｇＧ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ３由来であり得る。一実施形態において、ヒンジ領域は、ＩｇＭに由来し、例えば、配列番号１１９を有するヌクレオチド配列又は当該核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
ヒンジ領域は、共有結合、例えばシステイン間のジスルフィド架橋の形成を介して二量体化に寄与し得る。したがって、一実施形態において、ヒンジ領域は、１つ以上の共有結合を形成する能力を有する。好ましくは、共有結合は、ジスルフィド架橋である。
一実施形態において、二量体化ユニットは、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列１～２７と少なくとも８０％の配列同一性のアミノ酸配列を有する、ＩｇＧ３のヒンジエクソンｈ１及びヒンジエクソンｈ４（ヒトヒンジ領域１及びヒトヒンジ領域４）を含むか又はそれからなる。
好ましい実施形態において、二量体化ユニットは、配列番号１のアミノ酸配列１～２７に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％又は例えば少なくとも９９％の配列同一性のアミノ酸配列を有するヒンジエクソンｈ１及びヒンジエクソンｈ４を含むか又はそれからなる。
好ましい実施形態において、二量体化ユニットは、配列番号１のアミノ酸配列１～２７を有するヒンジエクソンｈ１及びヒンジエクソンｈ４を含むか又はそれからなる。
好ましい一実施形態において、二量体化ユニットは、最大で４個のアミノ酸、例えば最大で３個のアミノ酸、例えば最大で２個のアミノ酸又は例えば最大で１個のアミノ酸が置換、欠失又は挿入されていることを除いて、配列番号１のアミノ酸配列１～２７を含むか又はそれからなる。
好ましい一実施形態において、二量体化ユニットは、配列番号１０を有する核酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含むか又はそれからなる。
更に好ましい実施形態において、二量体化ユニットは、配列番号１０を有する核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも８６％又は少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むか又はそれからなる。
なお更に好ましい実施形態において、二量体化ユニットは、配列番号１０の核酸配列を含むか又はそれからなる。
別の実施形態において、二量体化ユニットは、二量体化を促進する別のドメインを含み、当該他のドメインは、免疫グロブリンドメイン、例えば、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン若しくはカルボキシ末端Ｃドメイン（すなわち、ＣＨ３ドメイン）などの免疫グロブリン定常ドメイン（Ｃドメイン）、又はこのようなＣドメインと実質的に同一である配列若しくはその変異体である。好ましくは、二量体化を促進する他のドメインは、ＩｇＧに由来するカルボキシ末端Ｃドメインである。より好ましくは、二量体化を促進する他のドメインは、ＩｇＧ３に由来するカルボキシ末端Ｃドメインである。
一実施形態において、二量体化ユニットは、配列番号１のアミノ酸配列３８～１４４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＩｇＧ３に由来するカルボキシ末端Ｃドメインを含むか又はそれからなる。
好ましい実施形態において、二量体化ユニットは、配列番号１のアミノ酸配列３８～１４４に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％又は例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＩｇＧ３由来のカルボキシ末端Ｃドメインを含むか又はそれからなる。
好ましい実施形態において、二量体化ユニットは、配列番号１のアミノ酸配列３８～１４４を有するＩｇＧ３に由来するカルボキシ末端Ｃドメインを含む。
好ましい一実施形態において、二量体化ユニットは、多くとも１６個のアミノ酸、例えば多くとも１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸が置換、欠失又は挿入されていることを除いて、配列番号１のアミノ酸配列３８～１４４を含むか又はそれからなる。
好ましい一実施形態において、二量体化ユニットは、配列番号１１を有する核酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含むか又はそれからなる。
更に好ましい実施形態において、二量体化ユニットは、配列番号１１を有する核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも８６％又は少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むか又はそれからなる。なお更に好ましい実施形態において、二量体化ユニットは、配列番号１１の核酸配列を含むか又はそれからなる。
免疫グロブリンドメインは、非共有相互作用、例えば疎水性相互作用を介して二量体化に寄与する。したがって、一実施形態において、免疫グロブリンドメインは、非共有相互作用を介して二量体を形成する能力を有する。好ましくは、非共有相互作用は、疎水性相互作用である。
二量体化ユニットがＣＨ３ドメインを含む場合、ＣＨ２ドメインを含まず、逆もまた同様であることが好ましい。
好ましい実施形態において、二量体化ユニットは、ヒンジエクソンｈ１、ヒンジエクソンｈ４、二量体化ユニットリンカー及びヒトＩｇＧ３のＣＨ３ドメインを含む。更に好ましい実施形態において、二量体化ユニットは、ヒンジエクソンｈ１、ヒンジエクソンｈ４、二量体化ユニットリンカー及びヒトＩｇＧ３のＣＨ３ドメインからなるポリペプチドを含む。別の好ましい実施形態において、二量体化ユニットは、ヒンジエクソンｈ１、ヒンジエクソンｈ４、二量体化ユニットリンカー及びヒトＩｇＧ３のＣＨ３ドメインからなるポリペプチドからなる。
一実施形態において、二量体化ユニットは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
好ましい実施形態において、二量体化ユニットは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％又は例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
更により好ましい実施形態において、二量体化ユニットは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
より好ましい実施形態において、二量体化ユニットは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％又は例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。
更により好ましい実施形態において、二量体化ユニットは、配列番号１のアミノ酸配列からなる。
好ましい一実施形態において、二量体化ユニットは、最大で２８個のアミノ酸、例えば最大で２５、２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１個のアミノ酸が置換、欠失又は挿入されていることを除いて、配列番号１のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
好ましい一実施形態において、二量体化ユニットは、配列番号１２を有する核酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含むか又はそれからなる。
更に好ましい実施形態において、二量体化ユニットは、配列番号１２を有する核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも８６％又は少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むか又はそれからなる。
なお更に好ましい実施形態において、二量体化ユニットは、配列番号１２の核酸配列を含むか又はそれからなる。
第１の核酸配列によってコードされる第１のポリペプチドにおいて、多量体化ユニット、例えば二量体化ユニットは、抗原性ユニット及び標的化ユニットに対して任意の配向を有し得る。一実施形態において、抗原性ユニットは、多量体化／二量体化ユニットのＣ末端に（例えば、ユニットリンカーを介して）接続され、標的化ユニットは、多量体化／二量体化ユニットのＮ末端に接続される。別の実施形態において、抗原性ユニットは、多量体化／二量体化ユニットのＮ末端に接続され（例えば、ユニットリンカーを介して）、標的化ユニットは、多量体化／二量体化ユニットのＣ末端に接続される。抗原性ユニットは、多量体化／二量体化ユニットのＣ末端に、例えばリンカーを介して、好ましくはユニットリンカーを介して接続され、標的化ユニットは、多量体化／二量体化ユニットのＮ末端に接続されることが好ましい。
抗原性ユニット
本発明のベクターに含まれる第１の核酸配列によってコードされる第１のポリペプチドは、自己抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープ、例えば、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の１つ以上のエピトープ又は１つ以上の阻害性ネオ抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原を含む抗原性ユニットを含む。
抗原性ユニットへの包含に適したＴ細胞エピトープは、当技術分野において公知であり得、すなわち、特定の免疫疾患に関与し、関連性があることが試験、提案及び／又は検証されており、例えば、科学文献において公開されている。
一実施形態において、抗原性ユニットは、自己抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープ、すなわち自己抗原の１つのＴ細胞エピトープ、又は自己抗原の２つ以上のＴ細胞エピトープ、すなわち自己抗原の複数のＴ細胞エピトープを含む。一実施形態において、複数のＴ細胞エピトープは、同じ自己抗原のものであり、すなわち、同じ自己抗原に含まれる。別の実施形態において、複数のＴ細胞エピトープは、複数の異なる自己抗原のものであり、すなわち、異なる自己抗原に含まれる。
「複数の」、「多数の」及び「いくつかの」という用語は、本明細書では「２つ以上の」と互換的に使用される。
例として、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）及びミエリン関連塩基性オリゴデンドロサイトタンパク質（ＭＯＢＰ）は全て、多発性硬化症（ＭＳ）に関与する自己抗原として試験及び提案されており、抗原性ユニットは、例えば、ＭＢＰの１つ以上のＴ細胞エピトープ、すなわち、ＭＢＰの１つのＴ細胞エピトープ又はＭＢＰの複数のＴ細胞エピトープを含み得る。更に、抗原性ユニットは、例えばＭＯＧ及びＰＬＰの複数のＴ細胞エピトープ、例えばＭＯＧの１つ又は複数のＴ細胞エピトープ及びＰＬＰの１つ又は複数のＴ細胞エピトープを含み得る。
別の実施形態において、抗原性ユニットは、アレルゲンの１つ以上のＴ細胞エピトープ、すなわち、アレルゲンの１つのＴ細胞エピトープ、又はアレルゲンの２つ以上のＴ細胞エピトープ、すなわち、アレルゲンの複数のＴ細胞エピトープを含む。一実施形態において、複数のＴ細胞エピトープは、同じアレルゲンのものであり、すなわち、同じアレルゲンに含まれる。別の実施形態において、複数のＴ細胞エピトープは、複数の異なるアレルゲンのものであり、すなわち、異なるアレルゲンに含まれる。
例として、Ｆｅｌ ｄ １、Ｆｅｌ ｄ ４及びＦｅｌ ｄ ７は、最も顕著なネコアレルゲンのうちの３つであり、ヒトのネコアレルギーの大部分を占め、抗原性ユニットは、例えば、Ｆｅｌ ｄ １の１つ以上のＴ細胞エピトープ、すなわち、Ｆｅｌ ｄ １の１つのＴ細胞エピトープ又はＦｅｌ ｄ １の複数のＴ細胞エピトープを含み得る。更に、抗原性ユニットは、例えばＦｅｌ ｄ ４及びＦｅｌ ｄ ７の複数のＴ細胞エピトープ、例えばＦｅｌ ｄ ４の１つ又は複数のＴ細胞エピトープ及びＦｅｌ ｄ ７の１つ又は複数のＴ細胞エピトープを含み得る。
別の実施形態において、抗原性ユニットは、同種抗原／異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープ、すなわち、同種抗原／異種抗原の１つのＴ細胞エピトープ、又は同種抗原／異種抗原の２つ以上のＴ細胞エピトープ、すなわち、同種抗原／異種抗原の複数のＴ細胞エピトープを含む。一実施形態において、複数のＴ細胞エピトープは、同じ同種抗原／異種抗原のものであり、すなわち、同じ同種抗原／異種抗原に含まれる。別の実施形態において、複数のＴ細胞エピトープは、複数の異なる同種抗原／異種抗原のものであり、すなわち、異なる同種抗原／異種抗原に含まれる。
一実施形態において、抗原性ユニットは、１つのＴ細胞エピトープを含む。別の実施形態において、抗原性ユニットは、２つ以上のＴ細胞エピトープ、すなわち複数のＴ細胞エピトープを含む。
一実施形態において、本発明のベクター／このようなベクターによってコードされる構築物は、個別化された治療、すなわち、特定の対象／１人の患者のために特異的に設計された治療において使用するためのものである。別の実施形態において、本発明のベクター／このようなベクターによってコードされる構築物は、患者集団又は患者における一般的な使用、すなわち既製の治療のためのものである。
個別化された構築物
個別化された構築物については、このような構築物をコードするベクターによる治療を受ける患者に最適化されたＴ細胞エピトープが抗原性ユニットに含まれるように選択される。これにより、その構築物を含む既製の治療と比較して治療効果が増大するであろう。
個別化された構築物の抗原性ユニットは、ＭＳに罹患している患者について例示されるように、以下のように設計することができる：
１）患者のＨＬＡクラスＩ及び／又はＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子を決定する。
２）Ｔ細胞エピトープが、１つ以上の自己抗原（例えば、ＭＳに関与する自己抗原として試験、提案及び／又は検証された自己抗原）に含まれることを同定する。
３）Ｔ細胞エピトープを、患者のＨＬＡクラスＩ及び／又はクラスＩＩ対立遺伝子への予測される結合に基づいて選択する。
４）１つ以上の試験構築物を設計及び産生し、Ｔ細胞エピトープを、本出願に記載されるように構築物の抗原性ユニット中に任意に配置する。
Ｔ細胞エピトープを、患者のＨＬＡクラスＩ／ＩＩ対立遺伝子に結合するそれらの予測される能力に基づいて上記の方法において選択する、すなわち、予測ＨＬＡ結合アルゴリズムを使用してｉｎ ｓｉｌｉｃｏで選択する。関連するエピトープを同定した後、エピトープを、患者のＨＬＡクラスＩ／ＩＩ対立遺伝子に結合するそれらの能力に従ってランク付けし、最もよく結合すると予測されるエピトープを選択して、試験構築物の抗原性ユニットに含める。
任意の適切なＨＬＡ結合アルゴリズム、例えば、以下のうちの１つを使用することができる：
ペプチド－ＭＨＣ結合の利用可能なソフトウェア解析（ＩＥＤＢ、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ及びＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎ）は、以下のウェブサイトからオンラインでダウンロード又は使用することができる：
ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／
ｓｅｒｖｉｃｅｓ．ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅ．ｐｈｐ？ＮｅｔＭＨＣｐａｎ－４．０
ｓｅｒｖｉｃｅｓ．ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅ．ｐｈｐ？ＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎ－３．２
既製の寛容誘導構築物
本発明のベクターによってコードされる既製の構築物の抗原性ユニットは、離散的なＴ細胞エピトープ、最小Ｔ細胞エピトープのホットスポット、又はその両方を含み得る。このような抗原性ユニットは、好ましくは、最小Ｔ細胞エピトープのホットスポット、すなわち、異なるＨＬＡ対立遺伝子によって提示されると予測される複数の最小Ｔ細胞エピトープ（例えば、７～１５アミノ酸の長さを有する）を含有する抗原の１つ以上の領域を含み、広範囲の対象、例えば民族の人口又は更に世界の人口をカバーする。このようなホットスポットを含めることにより、構築物が広範囲の対象において寛容を誘導する可能性が最大化される。
抗原性ユニットの更なる実施形態
本発明のベクターによってコードされる第１のポリペプチドの抗原性ユニットに含まれるＴ細胞エピトープは、７～約２００アミノ酸の長さを有し、より長いＴ細胞エピトープは、最小Ｔ細胞エピトープのホットスポットを含む可能性がある。
一実施形態において、抗原性ユニットは、７～１５０アミノ酸、好ましくは７～１００アミノ酸、例えば９～１００アミノ酸、又は１５～１００アミノ酸、又は９～６０アミノ酸、又は９～３０アミノ酸、又は１５～６０アミノ酸、又は１５～３０アミノ酸、又は２０～７５アミノ酸、又は２５～５０アミノ酸の長さを有する１つ以上のＴ細胞エピトープを含む。
約６０～２００アミノ酸の長さを有するＴ細胞エピトープは、より短い配列に分割され得、リンカー、例えば、本明細書に記載されるリンカー、によって分離された抗原性ユニットに含まれ得る。例として、１５０アミノ酸の長さを有するＴ細胞エピトープは、それぞれ５０アミノ酸の３つの配列に分割され得、３つの配列を互いに分離するリンカーを用いて抗原性ユニットに含まれ得る。
一実施形態において、１つのＴ細胞エピトープの長さは、Ｔ細胞エピトープを含むタンパク質が正しくフォールディングされないように調整される。例えば、最も顕著なネコアレルゲンであるＦｅｌ ｄ １は、２つのヘテロ二量体によって形成されるタンパク質であり、各二量体は２つの鎖から構成され、鎖１は７０アミノ酸残基を含み、鎖２は９０又は９２残基を含む。両鎖の長いＴ細胞エピトープを抗原性ユニットに含めると、タンパク質が正しくフォールディングされ、対象の肥満細胞及び好塩基球上の２つ以上のＩｇＥがＴ細胞エピトープを含む構築物の抗原性ユニットに結合すると、アレルギー反応が誘発される可能性がある。
したがって、より長いＴ細胞エピトープが抗原性ユニットに含まれる場合、タンパク質に対する抗体（例えば、ネコアレルゲン）を使用し、抗体がＴ細胞エピトープに結合するかどうかを決定するＥＬＩＳＡなどにより、タンパク質のフォールディングをｉｎ ｖｉｔｒｏで試験することができる。抗体がＴ細胞エピトープに結合する場合、本明細書に記載されているように、その長さを調整したり、より短い配列に分割したりすることができる。
一実施形態において、Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）による提示に適した長さを有する。ＭＨＣ分子には、２つの主要なクラス、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩがある。ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩという用語は、本明細書ではＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩと互換的に使用される。ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）は、ヒトにおける主要組織適合遺伝子複合体である。したがって、好ましい実施形態において、抗原性ユニットは、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ上での特異的提示に適した長さを有するＴ細胞エピトープを含む。一実施形態において、Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩ提示のために７～１１アミノ酸の長さを有する。別の実施形態において、Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ提示のために約１５アミノ酸の長さを有する。
Ｔ細胞エピトープの配置及び詳細
抗原性ユニット中のＴ細胞エピトープの数は、変動してもよく、抗原性ユニット中に含まれる他のエレメント、例えば本出願に記載されるＴ細胞エピトープリンカーの長さ及び数に依存する。
一実施形態において、抗原性ユニットは、最大３５００個のアミノ酸、例えば６０個～３５００個のアミノ酸、例えば約８０個又は約１００個又は約１５０個のアミノ酸～約３０００個のアミノ酸、例えば約２００個～約２５００個のアミノ酸、例えば約３００個～約２０００個のアミノ酸、又は約４００個～約１５００個のアミノ酸、又は約５００個～約１０００個のアミノ酸を含む。
一実施形態において、抗原性ユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８若しくは９若しくは１０個のＴ細胞エピトープなどの１～１０個のＴ細胞エピトープ、又は１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０個のＴ細胞エピトープなどの１１～２０個のＴ細胞エピトープ、又は２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０個のＴ細胞エピトープなどの２１～３０個のＴ細胞エピトープ、又は３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９若しくは４０個のＴ細胞エピトープなどの３１～４０個のＴ細胞エピトープ、又は４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９若しくは５０個のＴ細胞エピトープなどの４１～５０個のＴ細胞エピトープを含む。
一実施形態において、Ｔ細胞エピトープは抗原性ユニット中にランダムに配置されている。別の実施形態において、抗原性ユニット中にそれらを配置するための以下の方法のうちの１つ以上を使用することができる。
一実施形態において、Ｔ細胞エピトープは、多量体化ユニット（二量体化ユニットなど）から抗原性ユニットの末端への方向に、より抗原性の高いものからより抗原性の低いもの順に配置されている（図５参照）。あるいは、特に親水性／疎水性がＴ細胞エピトープ間で大きく異なる場合、最も疎水性のＴ細胞エピトープは、抗原性ユニットの実質的に中央に位置し、最も親水性のＴ細胞エピトープは、多量体化ユニット又は抗原性ユニットの末端に最も近い位置に位置することがある。
抗原性ユニットの真ん中に正確に位置することは、抗原性ユニットが奇数のＴ細胞エピトープを含む場合にのみ可能であるため、この文脈における「実質的に」という用語は、偶数のＴ細胞エピトープを含む抗原性ユニットであって、最も疎水性のＴ細胞エピトープが可能な限り真ん中に近い位置に位置している抗原性ユニットを指す。
例として、抗原性ユニットは、５つのＴ細胞エピトープを含み、これらは以下：１－２－３＊－４－５のように配置され、１、２、３＊、４及び５はそれぞれ異なるＴ細胞エピトープであり、－はＴ細胞エピトープリンカーであり、＊は最も疎水性のＴ細胞エピトープを示し、これは抗原性ユニットの中央に位置する。
別の例では、抗原性ユニットは、６個のＴ細胞エピトープを含み、これらは以下：１－２－３＊－４－５－６、あるいは以下：１－２－４－３＊－５－６のように配置され、１、２、３＊、４、５及び６はそれぞれＴ細胞エピトープであり、－はＴ細胞エピトープリンカーであり、＊は最も疎水性のＴ細胞エピトープを示し、これは実質的に抗原性ユニットの中央に位置する。
あるいは、Ｔ細胞エピトープは、親水性Ｔ細胞エピトープと疎水性Ｔ細胞エピトープとの間で交互に配置され得る。任意選択で、Ｔ細胞エピトープをコードするＧＣリッチ配列は、ＧＣクラスターが回避されるように配置される。一実施形態において、Ｔ細胞エピトープをコードするＧＣリッチ配列は、それらの間に少なくとも１つの非ＧＣリッチ配列が存在するように配置される。
Ｔ細胞エピトープリンカー
抗原性ユニットが複数のＴ細胞エピトープを含む場合、エピトープは、好ましくはＴ細胞エピトープリンカーによって分離される。これにより、各Ｔ細胞エピトープが最適な方法で免疫系に提示されることになる。抗原性ユニットがｎ個のＴ細胞エピトープを含む場合、好ましくは、各Ｔ細胞エピトープを１つ又は２つの他のＴ細胞エピトープから分離するｎ－１個のＴ細胞エピトープリンカーを含む。
一実施形態において、Ｔ細胞エピトープリンカーは、非免疫原性であるように設計される。Ｔ細胞エピトープリンカーは、剛性リンカーであり得、これは、リンカーが接続する２つのアミノ酸配列が互いに対して実質的に自由に動くことを可能にしないことを意味する。あるいは、可動性リンカー、すなわち、リンカーが接続する２つのアミノ酸配列が互いに対して実質的に自由に動くことを可能にするリンカーであり得る。両方のタイプのリンカーが有用である。一実施形態において、リンカーは、可動性リンカーであり、抗原性ユニットが多数のＴ細胞エピトープを含む場合であっても、Ｔ細胞エピトープを最適な方法で免疫系に提示することができる。
一実施形態において、Ｔ細胞エピトープリンカーは、４～４０個のアミノ酸、例えば３５、３０、２５又は２０個のアミノ酸、例えば４～２０個のアミノ酸、例えば５～２０個のアミノ酸、又は５～１５個のアミノ酸、又は８～２０個のアミノ酸、又は８～１５個のアミノ酸、又は１０～１５個のアミノ酸、又は８～１２個のアミノ酸からなるペプチドである。一実施形態において、Ｔ細胞エピトープリンカーは、１０個のアミノ酸からなる。
一実施形態において、抗原性ユニットに含まれる全てのＴ細胞エピトープリンカーは、同一である。しかし、１つ以上のＴ細胞エピトープがリンカーの配列と類似の配列を含む場合、隣接するＴ細胞エピトープリンカーを異なる配列のリンカーで置換することが有利になることがある。また、Ｔ細胞エピトープ／リンカー接合部がそれ自体でエピトープを構成すると予測される場合、異なる配列のＴ細胞エピトープリンカーを使用することが好ましい。
一実施形態において、Ｔ細胞エピトープリンカーは、可動性リンカー、好ましくは、小型の非極性（例えば、グリシン、アラニン若しくはロイシン）又は極性（例えば、セリン若しくはスレオニン）アミノ酸を含む可動性リンカーである。これらのアミノ酸は、サイズが小さいため可動性があり、接続されアミノ酸配列の移動が可能である。セリン又はスレオニンを組み込むことで、水分子と水素結合を形成し、水溶液中のリンカーの安定性を維持できるため、リンカーと抗原との間の好ましくない相互作用が低減される。一実施形態において、可動性リンカーは、セリン（Ｓ）及び／又はグリシン（Ｇ）リッチリンカー、すなわち、いくつかのセリン及び／又はいくつかのグリシン残基を含むリンカーである。好ましい例は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳＳ（配列番号７５）、ＧＧＧＳＧ（配列番号７６）、ＧＧＳＧＧ（配列番号７７）、ＳＧＳＳＧＳ（配列番号７８）、又はこれらの複数の変異体、例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７９）、（ＧＧＧＧＳ）ｍ（配列番号８０）、（ＧＧＧＳＳ）ｍ（配列番号８１）、（ＧＧＳＧＧ）ｍ（配列番号８２）、（ＧＧＧＳＧ）ｍ（配列番号８３））又は（ＳＧＳＳＧＳ）ｍ（配列番号８４）であり、ｍは１～５の整数、例えば１、２、３、４又は５であり、好ましい実施形態において、ｍは２である。別の好ましい実施形態において、セリン及び／又はグリシンリッチリンカーは、少なくとも１つのロイシン（Ｌ）残基、例えば、少なくとも１つ又は少なくとも２つ又は少なくとも３つのロイシン残基、例えば、１、２、３又は４個のロイシン残基を更に含む。
一実施形態において、Ｔ細胞エピトープリンカーは、ＬＧＧＧＳ（配列番号８５）、ＧＬＧＧＳ（配列番号８６）、ＧＧＬＧＳ（配列番号８７）、ＧＧＧＬＳ（配列番号８８）又はＧＧＧＧＬ（配列番号８９）を含むか又はそれからなる。別の実施形態において、Ｔ細胞エピトープリンカーは、ＬＧＧＳＧ（配列番号９０）、ＧＬＧＳＧ（配列番号９１）、ＧＧＬＳＧ（配列番号９２）、ＧＧＧＬＧ（配列番号９３）又はＧＧＧＳＬ（配列番号９４）を含むか又はそれからなる。なお別の実施形態において、Ｔ細胞エピトープリンカーは、ＬＧＧＳＳ（配列番号９５）、ＧＬＧＳＳ（配列番号９６）又はＧＧＬＳＳ（配列番号９７）を含むか又はそれからなる。
なお別の実施形態において、Ｔ細胞エピトープリンカーは、ＬＧＬＧＳ（配列番号９８）、ＧＬＧＬＳ（配列番号９９）、ＧＬＬＧＳ（配列番号１００）、ＬＧＧＬＳ（配列番号１０１）又はＧＬＧＧＬ（配列番号１０２）を含むか又はそれからなる。なお別の実施形態において、Ｔ細胞エピトープリンカーは、ＬＧＬＳＧ（配列番号１０３）、ＧＬＬＳＧ（配列番号１０４）、ＧＧＬＳＬ（配列番号１０５）、ＧＧＬＬＧ（配列番号１０６）又はＧＬＧＳＬ（配列番号１０７）を含むか又はそれからなる。なお別の実施形態において、Ｔ細胞エピトープリンカーは、ＬＧＬＳＳ（配列番号１０８）又はＧＧＬＬＳ（配列番号１０９）を含むか又はそれからなる。
別の実施形態において、Ｔ細胞エピトープリンカーは、１０アミノ酸の長さを有し、１又は２個のロイシン残基を含むセリン－グリシンリンカーである。
一実施形態において、Ｔ細胞エピトープリンカーは、ＬＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１０）、ＧＬＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１１）、ＧＧＬＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１２）、ＧＧＧＬＳＧＧＧＧＳ（配列番号１５５）、又はＧＧＧＧＬＧＧＧＧＳ（配列番号１１４）を含むか又はそれからなる。別の実施形態において、Ｔ細胞エピトープリンカーは、ＬＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１１５）、ＧＬＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１５６）、ＧＧＬＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１５７）、ＧＧＧＬＧＧＧＧＳＧ（配列番号１５８）又はＧＧＧＳＬＧＧＧＳＧ（配列番号１５９）を含むか又はそれからなる。なお別の実施形態において、Ｔ細胞エピトープリンカーは、ＬＧＧＳＳＧＧＧＳＳ（配列番号１２１）、ＧＬＧＳＳＧＧＧＳＳ（配列番号１２２）、ＧＧＬＳＳＧＧＧＳＳ（配列番号１２３）、ＧＧＧＬＳＧＧＧＳＳ（配列番号１２４）又はＧＧＧＳＬＧＧＧＳＳ（配列番号１２５）を含むか又はそれからなる。
更なる実施形態において、Ｔ細胞エピトープリンカーは、ＬＧＧＧＳＬＧＧＧＳ（配列番号１２６）、ＧＬＧＧＳＧＬＧＧＳ（配列番号１２７）、ＧＧＬＧＳＧＧＬＧＳ（配列番号１２８）、ＧＧＧＬＳＧＧＧＬＳ（配列番号１２９）又はＧＧＧＧＬＧＧＧＧＬ（配列番号１３０）を含むか又はそれからなる。別の実施形態において、Ｔ細胞エピトープリンカーは、ＬＧＧＳＧＬＧＧＳＧ（配列番号１３１）、ＧＬＧＳＧＧＬＧＳＧ（配列番号１３２）、ＧＧＬＳＧＧＧＬＳＧ（配列番号１３３）、ＧＧＧＬＧＧＧＧＬＧ（配列番号１３４）又はＧＧＧＳＬＧＧＧＳＬ（配列番号１３５）を含むか又はそれからなる。なお別の実施形態において、Ｔ細胞エピトープリンカーは、ＬＧＧＳＳＬＧＧＳＳ（配列番号１３６）、ＧＬＧＳＳＧＬＧＳＳ（配列番号１３７）又はＧＧＬＳＳＧＧＬＳＳ（配列番号１３８）を含むか又はそれからなる。
なお別の実施形態において、サブユニットリンカーは、ＧＳＧＧＧＡ（配列番号１３９）、ＧＳＧＧＧＡＧＳＧＧＧＡ（配列番号１４０）、ＧＳＧＧＧＡＧＳＧＧＧＡＧＳＧＧＧＡ（配列番号１４１）、ＧＳＧＧＧＡＧＳＧＧＧＡＧＳＧＧＧＡＧＳＧＧＧＡ（配列番号１４２）又はＧＥＮＬＹＦＱＳＧＧ（配列番号１４３）を含むか又はそれからなる。なお別の実施形態において、サブユニットリンカーは、ＳＧＧＧＳＳＧＧＧＳ（配列番号１４４）、ＳＳＧＧＧＳＳＧＧＧ（配列番号１４５）、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号１４６）、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１４７）、ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ（配列番号１１８）、ＧＧＧＳＳＳ（配列番号１４９）、ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＳＧＧＧＳＳ（配列番号１５０）又はＧＬＧＧＬＡＡＡ（配列番号１５１）を含むか又はそれからなる。
別の実施形態において、Ｔ細胞エピトープリンカーは剛性リンカーである。このような剛性リンカーは、（より大きい）Ｔ細胞エピトープを効率的に分離し、それらの相互干渉を防ぐのに役立つ可能性がある。一実施形態において、Ｔ細胞エピトープリンカーは、ＫＰＥＰＫＰＡＰＡＰＫＰ（配列番号１５２）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号１５３）、（ＥＡＡＡＫ）ｍ（配列番号１５４）、ＰＳＲＬＥＥＥＬＲＲＲＬＴＥＰ（配列番号１６０）又はＳＡＣＹＣＥＬＳ（配列番号１６１）を含むか又はそれからなる。
なお別の実施形態において、Ｔ細胞エピトープリンカーは、配列ＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬ（配列番号１６２）を含むか又はそれからなる。なお別の実施形態において、Ｔ細胞エピトープリンカーは、配列ＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬ（配列番号１６３）を含むか又はそれからなる。
なお別の実施形態において、Ｔ細胞エピトープリンカーは、ＧＧＳＡＧＧＳＧＳＧＳＳＧＧＳＳＧＡＳＧＴＧＴＡＧＧＴＧＳＧＳＧＴＧＳＧ（配列番号１６４）又はＧＧＳＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１６５）又はＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰ（配列番号１６６）を含むか又はそれからなる。
なお別の実施形態において、Ｔ細胞エピトープリンカーは、切断性リンカー、例えばエンドペプチダーゼ、例えばフューリン、カスパーゼ、カテプシンなどのエンドペプチダーゼに対する１つ以上の認識部位を含むリンカーである。
Ｔ細胞エピトープリンカーの例は、国際公開第２０２０／１７６７９７（Ａ１）号の段落［００９８］～［００９９］及び引用配列、米国特許出願公開第２０１９／００２２２０２（Ａ１）号の段落［０１３５］～［０１３９］、国際公開第２０１７／１１８６９５（Ａ１）号及び同第２０２１／２１９８９７（Ａ１）号に開示されており、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。
アレルゲン
本明細書に記載の構築物をコードするベクターは、様々な異なるタンパク質アレルゲン、例えば、翻訳後修飾を受けるタンパク質アレルゲンを含む、本発明のベクターの第１の核酸配列に含まれる核酸配列によってコードされ得るアレルゲンのＴ細胞エピトープに対する寛容を誘導するのに有用である。
抗原性ユニットに含まれる１つ以上のＴ細胞エピトープは、以下のアレルゲンに由来する可能性がある：
いくつかの実施形態において、アレルゲンは食物アレルゲンである。いくつかの実施形態において、アレルゲンは甲殻類アレルゲンである。いくつかの実施形態において、アレルゲンはトロポミオシンであり、他の実施形態において、アレルゲンはアルギニンキナーゼ、ミオシン軽鎖、筋小胞体カルシウム結合タンパク質、トロポニンＣ又はトリオースリン酸イソメラーゼ又はアクチンである。いくつかの実施形態において、アレルゲンはＰａｎ ｂ １である。いくつかの実施形態において、抗原性ユニットは、Ｐａｎ ｂ １ Ｔ細胞エピトープ（２５１～２７０）を含む。いくつかの実施形態において、抗原性ユニットはＭｅｔ ｅ １を含む。いくつかの実施形態において、抗原性ユニットは、Ｍｅｔ ｅ １ Ｔ細胞エピトープ（２４１～２６０）、（２１０～２３０）、（１３６～１５５）、（７６～９５）、（４６～６５）及び（１６～３５）のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、抗原性ユニットは、Ｍｅｔ ｅ １ Ｔ細胞エピトープ（２４１～２６０）、（２１０～２３０）、（１３６～１５５）、（７６～９５）、（４６～６５）及び（１６～３５）の全てを含む。
いくつかの実施形態において、アレルゲンは、牛乳アレルゲンである。いくつかの実施形態において、牛乳アレルゲンは、Ｂｏｓ ｄ ４、Ｂｏｓ ｄ ５、Ｂｏｓ ｄ ６、Ｂｏｓ ｄ ７、Ｂｏｓ ｄ ８、Ｂｏｓ ｄ ９、Ｂｏｓ ｄ １０、Ｂｏｓ ｄ １１又はＢｏｓ ｄ １２である。
いくつかの実施形態において、アレルゲンは、卵アレルゲンである。いくつかの実施形態において、卵アレルゲンは、オボムコイドであり、他の実施形態において、卵アレルゲンは、オボアルブミン、オボトランスフェリン、コンアルブミン、Ｇａｌ ｄ ３、卵リゾチーム、又はオボムチンである。
当技術分野で公知であり、卵アレルギーに関連して試験されている１つのＴ細胞エピトープは、アミノ酸配列ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１２０）を有するＯＶＡ（２５７～２６４）である。
一実施形態において、本発明のベクターにコードされる構築物の抗原性ユニットは、Ｔ細胞エピトープＯＶＡ（２５７～２６４）を含む。このようなベクター又はこのようなベクターを含む医薬組成物は、卵アレルギーの治療において使用することができる。
いくつかの実施形態において、アレルゲンは、魚アレルゲンである。いくつかの実施形態において、魚アレルゲンは、パルブアルブミンである。他の実施形態において、魚アレルゲンは、エノラーゼ、アルドラーゼ又はビテロゲニンである。
いくつかの実施形態において、アレルゲンは、果実アレルゲンである。いくつかの実施形態において、果実アレルゲンは、病因関連タンパク質１０、プロフィリン、ｎｓＬＴＰ、タウマチン様タンパク質、ジベレリン調節タンパク質、イソフラボンレダクターゼ関連タンパク質、クラス１キチナーゼ、β１，３グルカナーゼ、ゲルミン様タンパク質、アルカリセリンプロテアーゼ、病因関連タンパク質１、アクチニジン、フィトシスタチン、キウェリン、主要ラテックスタンパク質、キュピン（ｃｕｐｉｎ）又は２Ｓアルブミンである。
いくつかの実施形態において、アレルゲンは、植物アレルゲンである。いくつかの実施形態において、植物アレルゲンは、病因関連タンパク質１０、プロフィリン、ｎｓＬＴＰ１型、ｎｓＬＴＰ２型タンパク質、オスモチン様タンパク質、イソフラボンレダクターゼ様タンパク質、β－フルクトフラノシダーゼ、ＰＲタンパク質ＴＳＩ－１、シクロフィリン又はＦＡＤ含有オキシダーゼである。
いくつかの実施形態において、アレルゲンは、小麦アレルゲンである。いくつかの実施形態において、小麦アレルゲンは、Ｔｒｉ ａ １２、Ｔｒｉ ａ １４、Ｔｒｉ ａ １５、Ｔｒｉ ａ １８、Ｔｒｉ ａ １９、Ｔｒｉ ａ ２０、Ｔｒｉ ａ ２１、Ｔｒｉ ａ ２５、Ｔｒｉ ａ ２６、Ｔｒｉ ａ ２７、Ｔｒｉ ａ ２８、Ｔｒｉ ａ ２９、Ｔｒｉ ａ ３０、Ｔｒｉ ａ ３１、Ｔｒｉ ａ ３２、Ｔｒｉ ａ ３３、Ｔｒｉ ａ ３４、Ｔｒｉ ａ ３５、Ｔｒｉ ａ ３６、Ｔｒｉ ａ ３７又はＴｒｉ ａ ３８である。いくつかの実施形態において、アレルゲンは、大豆アレルゲンである。いくつかの実施形態において、大豆アレルゲンは、Ｇｌｙ ｍ １、Ｇｌｙ ｍ ２、Ｇｌｙ ｍ ３、Ｇｌｙ ｍ ４、Ｇｌｙ ｍ ５、Ｇｌｙ ｍ ６、Ｇｌｙ ｍ ７又はＧｌｙ ｍ ８である。他の実施形態において、大豆アレルゲンは、Ｇｌｙ ｍ アグルチニン、Ｇｌｙ ｍ Ｂｄ２８Ｋ、Ｇｌｙ ｍ ３０ ｋＤ、Ｇｌｙ ｍ ＣＰＩ又はＧｌｙ ｍ ＴＩである。
いくつかの実施形態において、アレルゲンは、ピーナッツアレルゲンである。いくつかの実施形態において、ピーナッツアレルゲンは、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ４、Ａｒａ ｈ ５、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ ７、Ａｒａ ｈ ８、Ａｒａ ｈ ９、Ａｒａ ｈ １０、Ａｒａ ｈ １１、Ａｒａ ｈ １２、Ａｒａ ｈ １３、Ａｒａ ｈ １４、Ａｒａ ｈ １５、Ａｒａ ｈ １６、又はＡｒａ ｈ １７である。いくつかの実施形態において、アレルゲンは、木の実又は種子アレルゲンである。いくつかの実施形態において、アレルゲンは、１１Ｓグロブリン、７Ｓグロブリン、２Ｓグロブリン、ＰＲ１０、ＰＲ－１４ ｎｓＬＴＰ、オレオシン又はプロフィリンである。
他の実施形態において、食物アレルゲンは、そば、セロリ、着色剤、卵、魚、果実、ニンニク、グルテン、オート麦、豆類、トウモロコシ、乳、マスタード、ナッツ、ピーナツ、家禽、肉、米、ごま、甲殻類、大豆、木の実及び小麦からなる群から選択されるアレルゲンである。
いくつかの実施形態において、アレルゲンは、ハチ毒アレルゲンである。いくつかの実施形態において、ハチ毒アレルゲンは、ホスホリパーゼＡ２、ヒアルロニダーゼ、酸性ホスファターゼ、メリチン、アレルゲンＣ／ＤＰＰ、ＣＲＰ／イカラピン又はビテロゲニンである。いくつかの実施形態において、アレルゲンは、スズメバチアレルゲンである。いくつかの実施形態において、スズメバチアレルゲンは、ホスホリパーゼＡ１、ヒアルロニダーゼ、プロテアーゼ、抗原５、ＤＰＰ ＩＶ又はビテロゲニンである。
いくつかの実施形態において、アレルゲンは、ラテックスアレルゲンである。いくつかの実施形態において、ラテックスアレルゲンは、Ｈｅｖ ｂ １、Ｈｅｖ ｂ ２、Ｈｅｖ ｂ ３、Ｈｅｖ ｂ ４、Ｈｅｖ ｂ ５、Ｈｅｖ ｂ ６、Ｈｅｖ ｂ ７、Ｈｅｖ ｂ ８、Ｈｅｖ ｂ ９、Ｈｅｖ ｂ １０、Ｈｅｖ ｂ １１、Ｈｅｖ ｂ １２、Ｈｅｖ ｂ １３、Ｈｅｖ ｂ １４又はＨｅｖ ｂ １５である。
いくつかの実施形態において、アレルゲンはチリダニアレルゲン（ｄｕｓｔ ｍｉｔｅ ａｌｌｅｒｇｅｎ）である。いくつかの実施形態において、アレルゲンはヒョウヒダニアレルゲン（ｈｏｕｓｅ ｄｕｓｔ ｍｉｔｅ ａｌｌｅｒｇｅｎ）である。いくつかの実施形態において、アレルゲンは貯蔵チリアレルゲン（ｓｔｏｒａｇｅ ｄｕｓｔ ａｌｌｅｒｇｅｎ）である。いくつかの実施形態において、ヒョウヒダニアレルゲンは、Ｄｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｐ ２、Ｄｅｒ ｐ ３、Ｄｅｒ ｐ ４、Ｄｅｒ ｐ ５、Ｄｅｒ ｐ ７、Ｄｅｒ ｐ ８、Ｄｅｒ ｐ １０、Ｄｅｒ ｐ １１、Ｄｅｒ ｐ ２１、又はＤｅｒ ｐ ２３である。いくつかの実施形態において、抗原性ユニットは、Ｄｅｒ ｐ １ Ｔ細胞エピトープ（１１１～１３９）を含む。いくつかの実施形態において、ヒョウヒダニアレルゲンは、Ｄｅｒ ｆ １、Ｄｅｒ ｆ ２、Ｄｅｒ ｆ ３、Ｄｅｒ ｆ ７、Ｄｅｒ ｆ ８又はＤｅｒ ｆ １０である。いくつかの実施形態において、ヒョウヒダニアレルゲンは、Ｂｌｏｔ ｔ １、Ｂｌｏｔ ｔ ２、Ｂｌｏｔ ｔ ３、Ｂｌｏｔ ｔ ４、Ｂｌｏｔ ｔ ５、Ｂｌｏｔ ｔ ８、Ｂｌｏｔ ｔ １０、Ｂｌｏｔ ｔ １２又はＢｌｏｔ ｔ ２１である。
いくつかの実施形態において、アレルゲンは、ゴキブリアレルゲンである。いくつかの実施形態において、ゴキブリアレルゲンは、Ｂｌａ ｇ １、Ｂｌａ ｇ ２、Ｂｌａ ｇ ３、Ｂｌａ ｇ ４、Ｂｌａ ｇ ５、Ｂｌａ ｇ ６、Ｂｌａ ｇ ７、Ｂｌａ ｇ ８又はＢｌａ ｇ １１である。いくつかの実施形態において、ゴキブリアレルゲンは、Ｐｅｒ ａ １、Ｐｅｒ ａ ２、Ｐｅｒ ａ ３、Ｐｅｒ ａ ６、Ｐｅｒ ａ ７、Ｐｅｒ ａ ９又はＰｅｒ ａ １０である。
いくつかの実施形態において、アレルゲンは、カビアレルゲンである。いくつかの実施形態において、カビアレルゲンは、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）アレルゲンである。いくつかの実施形態において、アスペルギルス・フミガーツスアレルゲンは、Ａｓｐ ｆ １、Ａｓｐ ｆ ２、Ａｓｐ ｆ ３、Ａｓｐ ｆ ４、Ａｓｐ ｆ ５、Ａｓｐ ｆ ６、Ａｓｐ ｆ ７、Ａｓｐ ｆ ８、Ａｓｐ ｆ ９、Ａｓｐ ｆ １０、Ａｓｐ ｆ １１、Ａｓｐ ｆ １２、Ａｓｐ ｆ １３、Ａｓｐ ｆ １４、Ａｓｐ ｆ １５、Ａｓｐ ｆ １６、Ａｓｐ ｆ １７、Ａｓｐ ｆ １８、Ａｓｐ ｆ ２２、Ａｓｐ ｆ ２３、Ａｓｐ ｆ ２７、Ａｓｐ ｆ ２８、Ａｓｐ ｆ ２９、又はＡｓｐ ｆ ３４である。
いくつかの実施形態において、アレルゲンは、真菌アレルゲンである。いくつかの実施形態において、真菌アレルゲンは、マラセチアアレルゲンである。いくつかの実施形態において、マラセチアアレルゲンは、Ｍａｌａ ｆ １、Ｍａｌａ ｆ ２、Ｍａｌａ ｆ ３、Ｍａｌａ ｆ ４、Ｍａｌａ ｆ ５、Ｍａｌａ ｆ ６、Ｍａｌａ ｆ ７、Ｍａｌａ ｆ ８、Ｍａｌａ ｆ ９、Ｍａｌａ ｆ １０、Ｍａｌａ ｆ １１、Ｍａｌａ ｆ １２若しくはＭａｌａ ｆ １３又はＭＧＬ＿１２０４である。
いくつかの実施形態において、アレルゲンは毛皮動物アレルゲン（ｆｕｒｒｙ ａｎｉｍａｌ ａｌｌｅｒｇｅｎ）である。いくつかの実施形態において、アレルゲンはイヌアレルゲンである。いくつかの実施形態において、イヌアレルゲンは、Ｃａｎ ｆ １、２、３、４、５、又は６である。いくつかの実施形態において、アレルゲンはウマアレルゲンである。いくつかの実施形態において、ウマアレルゲンは、Ｅｃｕ ｃ １、２、３又は４である。いくつかの実施形態において、アレルゲンはネコアレルゲンである。いくつかの実施形態において、ネコアレルゲンは、Ｆｅｌ ｄ １、Ｆｅｌ ｄ ２、Ｆｅｌ ｄ ３、Ｆｅｌ ｄ ４、Ｆｅｌ ｄ ５、Ｆｅｌ ｄ ６、Ｆｅｌ ｄ ７、又はＦｅｌ ｄ ８である。いくつかの実施形態において、アレルゲンは実験動物アレルゲンである。いくつかの実施形態において、アレルゲンは、リポカリン、尿中プレアルブミン、セクレトグロブリン又は血清アルブミンである。
いくつかの実施形態において、アレルゲンは、花粉アレルゲンである。いくつかの実施形態において、アレルゲンは、イネ科花粉アレルゲン（ｇｒａｓｓ ｐｏｌｌｅｎ ａｌｌｅｒｇｅｎ）である。いくつかの実施形態において、イネ科花粉アレルゲンは、オオアワガエリ、カモガヤ、ナガハグサ、ペレニアルライ麦、ハルガヤ、バヒアグラス、セイバンモロコシ又はギョウギシバアレルゲンである。いくつかの実施形態において、イネ科花粉アレルゲンは、Ｐｈｌ ｐ １、Ｐｈｌ ｐ ２、Ｐｈｌ ｐ ３、Ｐｈｌ ｐ ４、Ｐｈｌ ｐ ５、Ｐｈｌ ｐ ６、Ｐｈｌ ｐ ７、Ｐｈｌ ｐ １１、Ｐｈｌ ｐ １２又はＰｈｌ ｐ １３である。
いくつかの実施形態において、アレルゲンは、樹木花粉アレルゲンである。いくつかの実施形態において、樹木花粉アレルゲンは、ハンノキ、シラカバ、シデ、ハシバミ、ヨーロッパアサダ、クリ、ヨーロッパブナ、ホワイトオーク、トネリコ、イボタノキ、オリーブ、ライラック、ヒノキ又はスギの花粉アレルゲンである。いくつかの実施形態において、樹木花粉アレルゲンは、Ａｌｎ ｇ １又はＡｌｎ ｇ ４、Ｂｅｔ ｖ １、Ｂｅｔ ｖ ２、Ｂｅｔ ｖ ３、Ｂｅｔ ｖ ４、Ｂｅｔ ｖ ６又はＢｅｔ ｖ ７、Ｃａｒ ｂ １、Ｃｏｒ ａ １、Ｃｏｒ ａ ２、Ｃｏｒ ａ ６、Ｃｏｒ ａ ８、Ｃｏｒ ａ ９、Ｃｏｒ ａ １０、Ｃｏｒ ａ １１、Ｃｏｒ ａ １２、１ Ｃｏｒ ａ ３、Ｃｏｒ ａ １４、Ｏｓｔ ｃ １、Ｃａｓ １、Ｃａｓ ５、Ｃａｓ ８又はＣａｓ ９、Ｆａｇ ｓ １、Ｑｕｅ ａ １、Ｆｒａ ｅ １、Ｌｉｇ ｖ １、Ｏｌｅ ｅ １、Ｏｌｅ ｅ ２、Ｏｌｅ ｅ ３、Ｏｌｅ ｅ ４、Ｏｌｅ ｅ ５、Ｏｌｅ ｅ ６、Ｏｌｅ ｅ ７、Ｏｌｅ ｅ ８、Ｏｌｅ ｅ ９、Ｏｌｅ ｅ １０、Ｏｌｅ ｅ １１又はＯｌｅ ｅ １２、Ｓｙｒ ｖ １、Ｃｈａ ｏ １、Ｃｈａ ｏ ２、Ｃｒｙ ｊ １、Ｃｒｙ ｊ ２、Ｃｕｐ ｓ １、Ｃｕｐ ｓ ３、Ｊｕｎ ａ １、Ｊｕｎ ａ ２、Ｊｕｎ ａ ３、Ｊｕｎ ｏ ４、Ｊｕｎ ｖ １、Ｊｕｎ ｖ ３、Ｐｌａ ａ １、Ｐｌａ ａ ２又はＰｌａ ａ ３である。いくつかの実施形態において、抗原性ユニットは、Ｂｅｔ ｖ １ Ｔ細胞エピトープ（１３９～１５２）を含む。
いくつかの実施形態において、アレルゲンは、雑草花粉アレルゲンである。いくつかの実施形態において、雑草アレルゲンは、ブタクサ、ヨモギ、ヒマワリ、ナツシロギク、ピレトリウム、ヘラオオバコ、一年生ヤマアイ（ａｎｎｕａｌ ｍｅｒｃｕｒｙ）、アカザ、ロシアアザミ又はアマランサスの花粉アレルゲンである。いくつかの実施形態において、ブタクサ花粉アレルゲンは、Ａｍｂ ａ １、Ａｍｂ ａ ４、Ａｍｂ ａ ６、Ａｍｂ ａ ８、Ａｍｂ ａ ９、Ａｍｂ ａ １０、又はＡｍｂ ａ １１である。いくつかの実施形態において、ヨモギ花粉アレルゲンは、Ａｒｔ ｖ １、Ａｒｔ ｖ ３、Ａｒｔ ｖ ４、Ａｒｔ ｖ ５、又はＡｒｔ ｖ ６である。いくつかの実施形態において、ヒマワリ花粉アレルゲンは、Ｈｅｌ ａ １又はＨｅｌ ａ ２である。いくつかの実施形態において、ピレトリウム花粉アレルゲンは、Ｐａｒ ｊ １、Ｐａｒ ｊ ２、Ｐａｒ ｊ ３又はＰａｒ ｊ ４である。いくつかの実施形態において、ヘラオオバコ花粉アレルゲンはＰｌａ ｌ １である。いくつかの実施形態において、一年生ヤマアイ花粉アレルゲンはＭｅｒ ａ １である。いくつかの実施形態において、アカザ花粉アレルゲンは、Ｃｈｅ ａ １、Ｃｈｅ ａ ２又はＣｈｅ ａ ３である。いくつかの実施形態において、ロシアアザミ花粉アレルゲンは、Ｓａｌ ｋ １、Ｓａｌ ｋ ４又はＳａｌ ｋ ５である。いくつかの実施形態において、アマランサス花粉アレルゲンは、Ａｍａ ｒ ２である。
なお他の実施形態において、アレルゲンは、昆虫、ゴキブリ、ヒョウヒダニ又はカビなどの環境アレルゲンから選択される。
いくつかの実施形態において、本発明のベクターは、アレルギー性鼻炎、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性胃腸疾患、接触性皮膚炎及び薬物アレルギー又はこれらの組み合わせからなる群から選択されるアレルギー性疾患の治療において使用され得る。
薬物に対するアレルギーは、一般人口の７％超に影響を及ぼしている。本発明のベクターによってコードされる構築物は、このような薬物中に存在する免疫原性Ｔ細胞エピトープに対する寛容を誘導するために使用することができるため、罹患した患者がこの薬物による治療を継続し、この薬物治療から利益を受けることを可能にする。
したがって、いくつかの実施形態において、アレルゲンは、望ましくない免疫原性を有する薬物に含まれる。いくつかの実施形態において、アレルゲンは、第ＶＩＩＩ因子である。いくつかの実施形態において、アレルゲンは、インスリンである。いくつかの実施形態において、アレルゲンは、療法に使用されるモノクローナル抗体である。
自己抗原
別の実施形態において、本発明のベクターは、自己免疫疾患に関与する自己アレルゲンに含まれる１つ以上のＴ細胞エピトープを含有する構築物をコードする。これにより、免疫系全般を阻害することなく、自己免疫疾患の原因である免疫系の一部を抗原特異的にダウンレギュレーションすることができる。
いくつかの実施形態において、自己免疫疾患はＭＳである。いくつかの実施形態において、自己抗原はミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）である。他の実施形態において、自己抗原は、ＭＡＧ、ＭＯＢＰ、ＣＮＰａｓｅ、Ｓ１００β又はトランスアルドラーゼである。いくつかの実施形態において、自己抗原はミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）である。いくつかの実施形態において、自己抗原はミエリンプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）である。いくつかの実施形態において、本発明のベクターによってコードされる構築物は、前述の自己抗原のうちの１つ以上に由来する１つ以上のＴ細胞エピトープを含む。
ＭＳ関連Ｔ細胞エピトープは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）由来のＴ細胞エピトープである。ＭＯＧは、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、中枢神経系のみで発現する。ＭＯＧ（３５－５５）は、自己抗体産生及び再発寛解型神経疾患を誘発することができ、広範なプラーク様脱髄を引き起こす。ＭＯＧ（３５－５５）に対する自己抗体応答は、ＭＳ患者において観察されており、ＭＯＧ（３５－５５）誘導性実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、Ｃ５７／ＢＬ６マウス及びＬｅｗｉｓラットにおいて観察されている。別のＭＯＧ Ｔ細胞エピトープは、ＭＯＧ（２７－６３）である。
当該分野で公知であり、試験されている他のＭＳ関連Ｔ細胞エピトープとしては、以下の表３に列挙されるものが挙げられる：
＊Ｔ細胞エピトープ誘導性ＥＡＥが観察された。
好ましい実施形態において、本発明のベクターによってコードされる構築物の抗原性ユニットは、ＭＯＧ（３５－５５）、ＭＯＧ（２７－６３）、ＰＬＰ（１３９－１５１）、ＰＬＰ（１３１－１５９）、ＰＬＰ（１７８－１９１）、ＰＬＰ（１７０－１９９）、ＭＢＰ（８４－１０４）及びＭＢＰ（７６－１１２）からなる群から選択される１つ以上のＴ細胞エピトープを含む。このようなベクター又はこのようなベクターを含む医薬組成物は、ＭＳの治療において使用され得る。
いくつかの実施形態において、自己免疫疾患は、１型糖尿病である。いくつかの実施形態において、自己抗原は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５－キロダルトンアイソフォーム（ＧＡＤ６５）であり、これは、１型糖尿病に関与する自己抗原である。いくつかの他の実施形態において、自己抗原は、インスリン、ＩＡ－２又はＺｎＴ８である。なおいくつかの他の実施形態において、自己抗原は、ＩＧＲＰ、ＣｈｇＡ、ＩＡＰＰ、ペリフェリン、テトラスパニン－７、ＧＲＰ７８、ウロコルチン－３又はインスリン遺伝子エンハンサータンパク質ｉｓｌ－１である。いくつかの実施形態において、本発明のベクターによってコードされる構築物は、前述の自己抗原のうちの１つ以上に由来する１つ以上のＴ細胞エピトープを含む。
いくつかの実施形態において、自己免疫疾患は、セリアック病である。いくつかの実施形態において、自己抗原は、α－グリアジン、γ－グリアジン、ω－グリアジン、低分子量グルテニン、高分子量グルテニン、ホルデイン、セカリン、又はアベニンｂである。いくつかの実施形態において、抗原性ユニットは、Ｔ細胞エピトープα－グリアジン（７６～９５）を含む。いくつかの実施形態において、本発明のベクターによってコードされる構築物は、前述の自己抗原のうちの１つ以上に由来する１つ以上のＴ細胞エピトープを含む。
いくつかの実施形態において、自己免疫疾患は関節リウマチである。いくつかの実施形態において、自己抗原はコラーゲンである。いくつかの実施形態において、自己抗原は熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）である。いくつかの実施形態において、自己抗原はＢａｎｄ ３である。いくつかの実施形態において、自己抗原は、核内低分子リボ核タンパク質Ｄ１（ＳｍＤ１）である。いくつかの実施形態において、自己抗原は、アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）である。いくつかの実施形態において、自己抗原はミエリンタンパク質ゼロ（Ｐ０）である。いくつかの実施形態において、本発明のベクターによってコードされる構築物は、前述の自己抗原のうちの１つ以上に由来する１つ以上のＴ細胞エピトープを含む。
一実施形態において、自己免疫疾患は、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）であり、自己抗原はニューロファシン１５５である。別の実施形態において、自己免疫疾患は橋本甲状腺炎（ＨＴ）であり、自己抗原は甲状腺ペルオキシダーゼ及び／又はサイログロブリンである。別の実施形態において、自己免疫疾患は落葉状天疱瘡であり、自己抗原はデスモソーム関連糖タンパク質である。別の実施形態において、自己免疫疾患は尋常性天疱瘡であり、自己抗原はデスモグレイン３である。別の実施形態において、自己免疫疾患は甲状腺眼症（ＴＥＤ）であり、自己抗原はカルシウム結合タンパク質（カルセクエストリン）である。別の実施形態において、自己免疫疾患はバセドウ病であり、自己抗原は甲状腺刺激ホルモン受容体である。別の実施形態において、自己免疫疾患は、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）であり、自己抗原は、抗ミトコンドリア抗体（ＡＭＡ）、抗核抗体（ＡＮＡ）、リム様／膜（ＲＬ／Ｍ）及び／又は多核ドット（ＭＮＤ）である。別の実施形態において、自己免疫疾患は重症筋無力症であり、自己抗原はアセチルコリン受容体である。別の実施形態において、自己免疫疾患はインスリン抵抗性糖尿病であり、自己抗原はインスリン受容体である。別の実施形態において、自己免疫疾患は自己免疫性溶血性貧血であり、自己抗原は赤血球である。別の実施形態において、自己免疫疾患は乾癬であり、自己抗原は、カテリシジン（ＬＬ－３７）、ディスインテグリン様及びメタロプロテアーゼドメイン含有トロンボスポンジン１型モチーフ様５（ＡＤＡＭＴＳＬ５）、ホスホリパーゼＡ２グループＩＶＤ（ＰＬＡ２Ｇ４Ｄ）、異種核リボ核タンパク質Ａ１（ｈｎＲＮＰ－Ａ１）及びケラチン１７からなる群から選択される。別の実施形態において、自己免疫疾患は関節リウマチであり、自己抗原はシトルリン化タンパク質、ホモシトルリン化タンパク質及びＩｇＧのＦｃ部分からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本発明のベクターによってコードされる構築物は、前述の自己抗原のうちの１つ以上に由来する１つ以上のＴ細胞エピトープを含む。
ユニットリンカー
抗原性ユニットは、好ましくはユニットリンカーによって多量体化ユニットに接続される。したがって、一実施形態において、本発明のベクターに含まれる第１の核酸配列は、抗原性ユニットを多量体化ユニットに接続するユニットリンカーをコードする。
ユニットリンカーは、第１の核酸配列の構築を容易にするために制限部位を含み得る。一実施形態において、ユニットリンカーは、ＧＬＧＧＬ（配列番号１０２）又はＧＬＳＧＬ（配列番号１７４）である。別の実施形態において、ユニットリンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１７５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７９）、（ＧＧＧＧＳ）ｍ（配列番号８０）、ＥＡＡＡＫ（配列番号１７６）、（ＥＡＡＡＫ）ｍ（配列番号１５４）、（ＥＡＡＫ）ＭｇＳ（配列番号１７８）、（ＥＡＡＡＫ）ＭｇＳ（配列番号１７７）、ＧＰＳＲＬＥＥＥＬＲＲＲＬＴＥＰＧ（配列番号１７９）、ＡＡＹ又はＨＥＹＧＡＥＡＬＥＲＡＧ（配列番号１７３）を含むか又はそれからなる。
シグナルペプチド
本開示の一実施形態において、１つ以上の免疫阻害化合物をコードする第１の核酸配列及び１つ以上の更なる核酸配列のうちの少なくとも１つは、シグナルペプチドもコードする。シグナルペプチドは、第１のポリペプチドにおける標的化ユニットの配向によって、標的化ユニットのＮ末端又は標的化ユニットのＣ末端のいずれかに位置する。更に、シグナルペプチドは、免疫阻害化合物のＮ末端に位置する。シグナルペプチドは、本発明のベクターを含む細胞からの第１のポリペプチド及び／又は免疫阻害化合物の分泌を可能にするように設計される。好ましくは、第１の核酸配列及び１つ以上の免疫阻害化合物をコードする更なる核酸配列のそれぞれはまた、シグナルペプチドをコードする。
任意の適切なシグナルペプチドを使用することができる。第１のポリペプチドに関して、好適なシグナルペプチドの例は、好ましくは標的化ユニットが抗体又はその一部、例えばｓｃＦｖである場合、ヒトＩｇ ＶＨシグナルペプチドである。一実施形態において、シグナルペプチドは、標的化ユニットであるタンパク質の天然のリーダー配列、すなわち、標的化ユニットとして本発明のベクターにコードされるタンパク質のＮ末端に天然に存在するシグナルペプチドである。このようなシグナルペプチドの例は、ヒトＩＬ－１０のシグナルペプチド（標的化ユニットがヒトＩＬ－１０である）又はヒトＴＧＦ－β１のシグナルペプチド（標的化ユニットがヒトＴＧＦ－β１である）である。
１つ以上の免疫阻害化合物について、シグナルペプチドは、好ましくは、免疫阻害化合物の天然のリーダー配列、すなわち、免疫阻害化合物のＮ末端に天然に存在するシグナルペプチドである。このようなシグナルペプチドの例は、ＣＴＬＡ－４のシグナルペプチド（免疫阻害化合物がＣＴＬＡ－４、好ましくはＣＴＬＡ－４の細胞外ドメインである）又はＧＭ－ＣＳＦのシグナルペプチド（免疫阻害化合物がＧＭ－ＣＳＦである）である。
したがって、一実施形態において、本発明のベクターは、配列番号６９を有するヒトＩＬ－１０シグナルなどのヒトＩＬ－１０シグナルペプチドをコードする第１の核酸配列を含む。好ましい実施形態において、このようなベクターは、ヒトＩＬ－１０標的化ユニットをコードし、ヒトＩＬ－１０シグナルペプチドもコードする第１の核酸配列を含む。別の実施形態において、本発明のベクターは、配列番号２を有するヒトＩｇ ＶＨシグナルペプチドなどのヒトＩｇ ＶＨシグナルペプチドをコードする第１の核酸配列を含む。好ましい実施形態において、このようなベクターは、ｓｃＦｖ標的化ユニット、例えば抗ヒトＣＤ２０５標的化ユニットをコードし、ヒトＩｇ ＶＨシグナルペプチドもコードする第１の核酸配列を含む。
一実施形態において、本発明のベクターは、ヒトＩｇ ＶＨシグナルペプチド、ｈＴＧＦ－β１のシグナルペプチド、ｈＴＧＦ－β２のシグナルペプチド、ｈＴＧＦ－β３のシグナルペプチド、ｈＩＬ－１０のシグナルペプチド、ｈＩＬ－２のシグナルペプチド、ｈＩＬ－４のシグナルペプチド、ｈＩＬ－６のシグナルペプチド、ｈＩＬ－１１のシグナルペプチド、ｈＩＬ－１３のシグナルペプチド、ｈＩＬ－２７のシグナルペプチド、ｈＩＬ－３５のシグナルペプチド、ｈＩＬ－３７のシグナルペプチド、ｈＧＭ－ＣＳＦのシグナルペプチド、ｈＦＬＴ３Ｌのシグナルペプチド、ｈＣＣＬ１９のシグナルペプチド、ｈＣＣＬ２１のシグナルペプチド、ｈＩＣＡＭ－１のシグナルペプチド、ｈケラチンのシグナルペプチド、ｈＶＳＩＧ－３のシグナルペプチド、ｈＳＣＧＢ３Ａ２のシグナルペプチド、ｈＣＴＬＡ－４のシグナルペプチド、ｈＰＤ－１のシグナルペプチド及びｈＢＴＬＡのシグナルペプチドからなる群から選択されるシグナルペプチド、例えば、本明細書の「配列の概要」の節に列挙されている前述のシグナルペプチドのいずれかをコードする第１の核酸配列を含む。
別の実施形態において、本発明のベクターは、１つ以上の免疫阻害化合物をコードし、ｈＣＬＴＡ－４のシグナルペプチド、ｈＰＤ－１のシグナルペプチド、ｈＢＴＬＡのシグナルペプチド、ｈＬＡＧ３のシグナルペプチド、ｈＮＯＸ２のシグナルペプチド、ｈＳＩＧＬＥＣ７のシグナルペプチド、ｈＳＩＧＬＥＣ９のシグナルペプチド、ｈＴＩＭ－３のシグナルペプチド、ｈＩＬ－１０のシグナルペプチド、ｈＴＧＦ－β１のシグナルペプチド、ｈＴＧＦ－β２のシグナルペプチド、ｈＴＧＦ－β３のシグナルペプチド、ｈＩＬ－２７のシグナルペプチド、ｈＩＬ－２のシグナルペプチド、ｈＧＭ－ＣＳＦのシグナルペプチド、ｈＦＬＴ３Ｌのシグナルペプチド、ｈＩＦＮ－γのシグナルペプチド並びにｈＩＬ－３７のシグナルペプチド及びｈＩＬ－３５のシグナルペプチドからなる群から選択されるシグナルペプチド、例えば、本明細書の「配列の概要」の節に列挙されている前述のシグナルペプチドのいずれかを更にコードする、１つ以上の更なる核酸配列を含む。
配列同一性
配列同一性は、以下のように決定され得る：配列同一性が高いということは、第２の配列が第１の配列に由来する可能性が高いことを示す。アミノ酸配列の同一性には、整列した２つの配列間で同一のアミノ酸配列が必要である。したがって、参照配列と７０％のアミノ酸同一性を共有する候補配列は、アラインメント後に、候補配列中のアミノ酸の７０％が参照配列中の対応するアミノ酸と同一であることを必要とする。同一性は、コンピュータ解析を利用して決定することができ、例えば、限定されるものではないが、ＣｌｕｓｔａｌＷコンピュータアラインメントプログラム（Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｊ．，Ｇｉｂｓｏｎ Ｔ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．Ｇ．，Ｇｉｂｓｏｎ Ｔ．Ｊ．，１９９４．ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ ａｎｄ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ ｃｈｏｉｃｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０）、及びそこに提案されているデフォルトパラメータを利用することができる。このプログラムをデフォルト設定で使用すると、クエリ及び参照ポリペプチドの成熟（生物活性）部分を整列させる。完全に保存された残基の数を計数し、参照ポリペプチドの長さで割る。そうすることで、クエリ配列の一部を形成する任意のタグ又は融合タンパク質配列は、アラインメント及びその後の配列同一性の決定において無視される。
ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムは、ヌクレオチド配列を整列させるために同様に使用できる。配列同一性は、アミノ酸配列について示したのと同様の方法で算出することができる。
配列の比較に利用される別の好ましい数学的アルゴリズムは、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＦＡＳＴＡ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている（Ｐｅａｒｓｏｎ ＷＲ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２０００，１３２：１８５－２１９）。Ａｌｉｇｎは、グローバルアラインメントに基づいて配列同一性を算出する。Ａｌｉｇｎ０は、配列の末端におけるギャップにペナルティを課さない。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮ及びＡｌｉｇｎ０プログラムを利用する場合、ギャップ開始／拡張ペナルティが－１２／－２であるＢＬＯＳＵＭ５０置換マトリックスを使用することが好ましい。
アミノ酸配列の変異体は、第１のポリペプチド及び／又は１つ以上の免疫刺激性化合物をコードするヌクレオチド配列に適切な変化を導入することによって、又はペプチド合成によって調製され得る。このような修飾には、例えば、アミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は残基への挿入、及び／又は残基の置換が含まれる。アミノ酸配列及び配列同一性に関して本明細書で使用される置換された／置換、欠失された／欠失及び挿入された／挿入という用語は、当業者に周知であり、明らかである。欠失、挿入、置換をどのように組み合わせても、最終的な第１のポリペプチド及び／又は１つ以上の免疫刺激性化合物に到達することができるが、最終的なタンパク質が所望の特性を有することが条件である。例えば、アミノ酸残基の欠失、挿入又は置換は、サイレントな変化を生じさせ、そして機能的に等価なポリペプチド／免疫刺激性化合物をもたらす可能性がある。
意図的なアミノ酸置換は、問題のタンパク質の所望の特性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の性質における類似性に基づいて行うことができる。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられ、正に荷電したアミノ酸としては、リジン及びアルギニンが挙げられ、同様の親水性値を有する非荷電極性頭部基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンが挙げられる。
本明細書に包含されるのは、保存的置換、すなわち、塩基性と塩基性、酸性と酸性、極性と極性などの類似置換、及び非保存的置換、すなわち、あるクラスの残基から別のクラスの残基への置換、あるいはオルニチン、ジアミノ酪酸オルニチン、ノルロイシン、オルニチン、ピリイルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン及びフェニルグリシンなどの非天然アミノ酸の包含を伴う置換である。行われ得る保存的置換は、例えば、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、脂肪族アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン）、極性アミノ酸（グルタミン、アスパラギン、セリン、スレオニン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、ヒドロキシルアミノ酸（セリン、スレオニン）、大型アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン）及び小型アミノ酸（グリシン、アラニン）のグループ内である。
非天然アミノ酸による置換も可能であり、置換残基としては、アルファ＊及びアルファ－二置換＊アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸＊、乳酸＊、天然アミノ酸のハロゲン化物誘導体、例えば、トリフルオロチロシン＊、ｐ－Ｃｌ－フェニルアラニン＊、ｐ－Ｂｒ－フェニルアラニン＊、ｐ－Ｉ－フェニルアラニン＊、Ｌ－アリル－グリシン＊、β－アラニン＊、Ｌ－α－アミノ酪酸＊、Ｌ－γ－アミノ酪酸＊、Ｌ－α－アミノイソ酪酸＊、Ｌ－ε－アミノカプロン酸＊、７－アミノヘプタン酸＊、Ｌ－メチオニンスルホン＊、Ｌ－ノルロイシン＊、Ｌ－ノルバリン＊、ｐ－ニトロ－Ｌ－フェニルアラニン＊、Ｌ－ヒドロキシプロリン＊、Ｌ－チオプロリン＊、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）のメチル誘導体、例えば、４－メチルＰｈｅ＊ペンタメチル－Ｐｈｅ＊、Ｌ－Ｐｈｅ（４－アミノ）＃、Ｌ－Ｔｙｒ（メチル）＊、Ｌ－Ｐｈｅ（４－イソプロピル）＊、Ｌ－Ｔｉｃ（１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボキシル酸）＊、Ｌ－ジアミノプロピオン酸＊、及びＬ－Ｐｈｅ（４－ベンジル）＊が挙げられる。
上記の段落において、＊は置換残基の疎水性を示し、＃は置換残基の親水性を示し、＃＊は置換残基の両親媒性を示す。変異体アミノ酸配列は、グリシン又はβ－アラニン残基などのアミノ酸スペーサーに加えて、メチル基、エチル基又はプロピル基などのアルキル基を含む、配列の任意の２つのアミノ酸残基の間に挿入され得る適切なスペーサー基を含み得る。変種の更なる形態には、ペプトイド形態の１つ以上のアミノ酸残基の存在が含まれる。
ポリペプチド及び多量体／二量体タンパク質
本発明のベクターは、上記の第１のポリペプチドをコードする。ポリペプチド（及び１つ以上の免疫阻害化合物）は、ベクターを対象に投与した結果、ｉｎ ｖｉｖｏで発現される。
多量体化ユニット（例えば、二量体化ユニット）の存在により、ポリペプチドが発現されると多量体タンパク質が形成される。
多量体タンパク質は、ホモ多量体であってもヘテロ多量体であってもよく、例えば、タンパク質が二量体タンパク質である場合、二量体タンパク質はホモ二量体、すなわち、２つのポリペプチド鎖が同一であり、その結果、同一のユニット、したがって、Ｔ細胞エピトープを含む二量体タンパク質であってもよく、二量体タンパク質は、２つのポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体であってもよく、ポリペプチド鎖１は、その抗原性ユニットにおいて、ポリペプチド２とは異なるＴ細胞エピトープを含む。後者は、抗原性ユニットに含めるＴ細胞エピトープの数が、抗原性ユニットの上限サイズを超える場合に関連する可能性がある。多量体タンパク質はホモ多量体タンパク質であることが好ましい。
宿主細胞及びベクターの調製
本発明のベクターは、概ね、宿主細胞をトランスフェクトし、ａ）第１の核酸配列によってコードされる第１のポリペプチドの発現及びこのような第１のポリペプチドの複数から構成される多量体タンパク質の形成、並びにｂ）更なる核酸配列によってコードされる１つ以上の免疫阻害化合物の発現をそれぞれ行うのに適したベクターである。
一実施形態において、本発明のベクターを含む宿主細胞は、細胞培養物の細胞、例えば細菌細胞であり、ベクターによってコードされるタンパク質がｉｎ ｖｉｔｒｏで発現される。別の実施形態において、本発明のベクターを含む宿主細胞は、対象の細胞であり、ベクターによってコードされるタンパク質は、対象へのベクターの投与の結果として、当該対象において、すなわちｉｎ ｖｉｖｏで発現される。
ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションに適した宿主細胞としては、原核生物細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は高等真核細胞が挙げられる。ｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションに適した宿主細胞は、例えば筋細胞である。
一実施形態において、ベクターは、ＣｐＧフリーベクターである。別の一実施形態において、ベクターは、ｐＡＬＤ－ＣＶ７７ベクターである。
本発明のベクター、例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡプラスミドなどの発現ベクター又はウイルスベクターの操作及び産生方法は周知であり、当業者であれば、このような公知の方法を使用して本発明のベクターを操作／産生することができるであろう。更に、様々な商業的製造業者が、ベクター設計及び産生のためのサービスを提供している。
一態様では、本開示は、
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドが、抗原提示細胞を標的とする標的化ユニット、二量体化ユニットなどの多量体化ユニット、及び抗原性ユニットを含み、抗原性ユニットが、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、第１の核酸配列と、
（ｂ）１つ以上の免疫阻害化合物をコードする１つ以上の更なる核酸配列と、を含み、
第１のポリペプチド及び１つ以上の免疫阻害化合物を別個の分子として共発現させることを可能にする、ベクターを産生する方法であって、
ａ）細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで、ベクターを用いてトランスフェクトすることと、
ｂ）当該細胞を培養することと、
ｃ）任意選択で、細胞を溶解して、ベクターを細胞から放出させることと、
ｄ）ベクター又はＤＮＡプラスミドを回収し、任意選択で精製することと、を含む方法に関する。
医薬組成物
本開示の一実施形態において、ベクター、例えばＤＮＡプラスミドは、医薬品として使用するためのものである。
したがって、本開示の一実施形態において、ベクターは、ベクター及び薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む医薬組成物で提供される。
したがって、一態様では、本開示は、（ｉ）薬学的に許容される担体又は希釈剤と、（ｉｉ）
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドが、抗原提示細胞を標的とする標的化ユニット、二量体化ユニットなどの多量体化ユニット、及び抗原性ユニットを含み、抗原性ユニットが、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、第１の核酸配列と、
（ｂ）１つ以上の免疫阻害化合物をコードする１つ以上の更なる核酸配列と、を含み、
第１のポリペプチド及び１つ以上の免疫阻害化合物を別個の分子として共発現させることを可能にする、ベクターと、を含む医薬組成物に関する。
適切な薬学的に許容される担体又は希釈剤としては、生理食塩水、ＰＢＳなどの緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、等張水性緩衝液、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、薬学的に許容される担体又は希釈剤は、水性緩衝液である。別の実施形態において、水性緩衝液は、タイロード緩衝液、例えば、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（Ｈｅｐｅｓ）ｐＨ７．４、及び１０ｍＭグルコースを含むタイロード緩衝液である。
医薬組成物は、宿主細胞のトランスフェクションを容易にする分子、すなわちトランスフェクション剤を含み得る。
医薬組成物は、アジュバントを含み得る。一実施形態において、アジュバントは、デキサメタゾン、エンテロトキシンコレラ毒素（ＣＴＢ）のＢサブユニット、ＴＬＲ２リガンド、蠕虫由来の排泄／分泌（ＥＳ）産物、ラパマイシンビタミンＤ３類似体及びアリール炭化水素受容体リガンドからなる群から選択される。
いくつかの具体的な実施形態において、医薬組成物は、ポリ（エチレンオキシド）及びポリ（プロピレンオキシド）のブロックを含む薬学的に許容される両親媒性ブロックコポリマーを含む。
本明細書で使用される「両親媒性ブロックコポリマー」とは、ポリ（エチレンオキシド）（「ＰＥＯ」）のブロック及びポリ（プロピレンオキシド）（「ＰＰＯ」）のブロックを含むか又はそれからなる直鎖状又は分岐状のコポリマーである。有用なＰＥＯ－ＰＰＯ両親媒性ブロックコポリマーの典型的な例は、一般構造ＰＥＯ－ＰＰＯ－ＰＥＯ（ポロキサマー）、ＰＰＯ ＰＥＯ ＰＰＯ、（ＰＥＯ ＰＰＯ－）４ＥＤ（ポロキサミン）、及び（ＰＰＯ ＰＥＯ－）４ＥＤ（逆ポロキサミン）［式中、「ＥＤ」はエチレンジアミニル基である］を有する。
「ポロキサマー」とは、１つのＰＥＯのブロックに結合した１つのポリ（プロピレンオキシド）のブロックに結合した１つのポリ（エチレンオキシド）のブロック、すなわち、式ＥＯａ－ＰＯｂ－ＥＯａ［式中、ＥＯはエチレンオキシドであり、ＰＯはプロピレンオキシドであり、ａは２～１３０の整数であり、ｂは１５～６７の整数である］の構造によって構成される直鎖状の両親媒性ブロックコポリマーである。ポロキサマーは、通常、３桁の識別子を使用することによって命名され、最初の２桁に１００を掛けたものがＰＰＯ含量のおおよその分子量を示し、最後の桁に１０を掛けたものがＰＥＯ含量のおおよその割合を示す。例えば、「ポロキサマー１８８」は、分子量約１８００のＰＰＯブロック（ｂが約３１のＰＰＯに相当）及び約８０％（ｗ／ｗ）のＰＥＯ（ａが約８２に相当）を含むポリマーを指す。しかし、値はある程度変動することが知られており、研究グレードのＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８及び臨床グレードのＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ１８８などの市販製品は、製造者のデータシートによれば両方ともポロキサマー１８８であり、分子量の大きな変動（７，６８０～９，５１０）を示し、これらの特定の製品について提供されるａ及びｂの値は、それぞれ約７９及び２８であることが示されている。これは、ブロックコポリマーの不均一な性質を反映しており、ａ及びｂの値が最終配合物で平均的に見られることを意味している。
「ポロキサミン」又は「連続ポロキサミン」（Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標）の商品名で市販されている）は、４つのＰＥＯ－ＰＰＯアームが、ＰＥＯ－ＰＰＯアームに含まれる遊離ＯＨ基とエチレンジアミン部分中の一級アミン基との間の結合を介して、中央のエチレンジアミン部分に接続されたＸ型ブロックコポリマーである。逆ポロキサミンも同様に、４つのＰＰＯ－ＰＥＯアームが、ＰＰＯ－ＰＥＯアームに含まれる遊離ＯＨ基とエチレンジアミン中の一級アミン基との間の結合を介して、中央のエチレンジアミン部分に接続されたＸ型ブロックコポリマーである。
好ましい両親媒性ブロックコポリマーは、ポロキサマー又はポロキサミンである。ポロキサマー４０７及び１８８が好ましく、特にポロキサマー１８８が好ましい。好ましいポロキサミンは、式（ＰＥＯ－ＰＰＯ）４－ＥＤの連続ポロキサミンである。特に好ましいポロキサミンは、それぞれ登録商標Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標）９０４、７０４、及び３０４として市販されているものである。これらのポロキサミンの特性は、以下のとおりである：Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標）９０４の総平均分子量は６７００、ＰＰＯ単位の総平均重量は４０２０、ＰＥＯの割合は約４０％；Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標）７０４の総平均分子量は５５００、ＰＰＯ単位の総平均重量は３３００、ＰＥＯの割合は約４０％；及びＴｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標）３０４の総平均分子量は１６５０、ＰＰＯ単位の総平均重量は９９０、ＰＥＯの割合は約４０％である。
一実施形態において、医薬組成物は、両親媒性ブロックコポリマーを０．２％ｗ／ｖ～２０％ｗ／ｖ、例えば０．２％ｗ／ｖ～１８％ｗ／ｖ、０．２％ｗ／ｖ～１６％ｗ／ｖ、０．２％ｗ／ｖ～１４％ｗ／ｖ、０．２％ｗ／ｖ～１２％ｗ／ｖ、０．２％ｗ／ｖ～１０％ｗ／ｖ、０．２％ｗ／ｖ～８％ｗ／ｖ、０．２％ｗ／ｖ～６％ｗ／ｖ、０．２％ｗ／ｖ～４％ｗ／ｖ、０．４％ｗ／ｖ～１８％ｗ／ｖ、０．６％ｗ／ｖ～１８％ｗ／ｖ、０．８％ｗ／ｖ～１８％ｗ／ｖ、１％ｗ／ｖ～１８％ｗ／ｖ、２％ｗ／ｖ～１８％ｗ／ｖ、１％ｗ／ｖ～５％ｗ／ｖ、又は２％ｗ／ｖ～４％ｗ／ｖの量で含む。特に好ましいのは、０．５％ｗ／ｖ～５％ｗ／ｖの範囲の量である。別の実施形態において、医薬組成物は、両親媒性ブロックコポリマーを２％ｗ／ｖ～５％ｗ／ｖ、例えば約３％ｗ／ｖの量で含む。
医薬組成物は、対象への投与に適した任意の方法で、例えば、注射用の、例えば、皮内又は筋肉内注射用の液体製剤などで製剤化することができる。
医薬組成物は、皮内、筋肉内、若しくは皮下注射による投与、又は鼻腔内若しくは経口などの粘膜適用若しくは上皮適用による投与など、対象への投与に適した任意の方法で投与することができる。
好ましい実施形態において、医薬組成物は、筋肉内注射又は皮内注射によって投与される。
医薬組成物中のベクター、例えば、ＤＮＡプラスミド、の量は、医薬組成物が予防的治療のために投与されるか、又は療法的治療のために投与されるかに応じて変化し得る。
本発明の医薬組成物は、典型的には、ベクター、例えばＤＮＡプラスミドを、０．１～１０ｍｇ、例えば約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９若しくは１ｍｇ、又は例えば２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０ｍｇの範囲で含む。
好ましい実施形態において、医薬組成物は、滅菌医薬組成物である。
治療
本開示のいくつかの態様では、ベクター、例えばＤＮＡプラスミドは、望ましくない免疫反応を伴う状態、すなわち免疫疾患の予防的治療又は療法的治療、例えば自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶反応の予防的治療又は療法的治療において使用するためのものである。
したがって、更なる態様において、本発明は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶反応からなる群から選択される免疫疾患を有する対象又はその予防を必要とする対象を治療するための方法であって、
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドが、抗原提示細胞を標的とする標的化ユニット、二量体化ユニットなどの多量体化ユニット、及び抗原性ユニットを含み、抗原性ユニットが、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、第１の核酸配列と、
（ｂ）１つ以上の免疫阻害化合物をコードする１つ以上の更なる核酸配列と、を含み、
第１のポリペプチド及び１つ以上の免疫阻害化合物を別個の分子として共発現させることを可能にする、ベクターを対象に投与することを含む、方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、自己免疫疾患を有する対象又はその予防を必要とする対象を治療するための方法であって、
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドが、抗原提示細胞を標的とする標的化ユニット、二量体化ユニットなどの多量体化ユニット、及び抗原性ユニットを含み、抗原性ユニットが、自己抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、第１の核酸配列と、
（ｂ）１つ以上の免疫阻害化合物をコードする１つ以上の更なる核酸配列と、を含み、
第１のポリペプチド及び１つ以上の免疫阻害化合物を別個の分子として共発現させることを可能にする、ベクターを対象に投与することを含む、方法を提供する。
別の実施形態において、本発明は、アレルギー性疾患を有するか又はその予防を必要とする対象を治療するための方法であって、
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドが、抗原提示細胞を標的とする標的化ユニット、二量体化ユニットなどの多量体化ユニット、及び抗原性ユニットを含み、抗原性ユニットが、アレルゲンの１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、第１の核酸配列と、
（ｂ）１つ以上の免疫阻害化合物をコードする１つ以上の更なる核酸配列と、を含み、
第１のポリペプチド及び１つ以上の免疫阻害化合物を別個の分子として共発現させることを可能にする、ベクターを対象に投与することを含む、方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、移植片拒絶反応を有する対象又はその予防を必要とする対象を治療するための方法であって、
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドが、抗原提示細胞を標的とする標的化ユニット、二量体化ユニットなどの多量体化ユニット、及び抗原性ユニットを含み、抗原性ユニットが、同種抗原又は異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、第１の核酸配列と、
（ｂ）１つ以上の免疫阻害化合物をコードする１つ以上の更なる核酸配列と、を含み、
第１のポリペプチド及び１つ以上の免疫阻害化合物を別個の分子として共発現させることを可能にする、ベクターを対象に投与することを含む、方法を提供する。
治療方法において、ベクターは、好ましくは、治療有効量又は予防有効量で投与される。このような量のベクターは、１回の投与、すなわち１回投与で投与してもよいし、数回の投与、すなわち反復投与で投与してもよいし、例えば数日、数週間又は数ヶ月又は数年にわたる一連の投与で投与してもよい。
実際の投与量は、治療が予防的治療であるか療法的治療であるか、治療対象の免疫疾患の重症度、対象の年齢、体重、性別、病歴、既往症、及び全身状態などのパラメータ、並びに医療専門家の判断によって異なり、変動する可能性がある。
治療方法において、ベクターは、医薬組成物の形態で、本明細書に記載の投与様式で投与することができる。
本発明による治療方法は、患者のケアを監督する臨床医が、方法が有効であり、治療が必要であると判断する限り、継続することができる。
治療成功の指標としては、抗原特異的調節性Ｔ細胞のレベルの増加、抗原特異的エフェクターＴ細胞のレベルの減少（及び調節性Ｔ細胞のレベルの増加）、エフェクターＴ細胞のレベルの減少、抗原性ユニット／抗原性ユニット内のＴ細胞エピトープで刺激されたときのＥＬＩＳＰＯＴにおけるＴ細胞活性化レベルの減少、好塩基球活性化試験（ＢＡＴ）における好塩基球活性化レベルの減少などが当技術分野で知られている。
放射性アレルゲン吸着試験（ＲＡＳＴ）も同様に、免疫療法構築物の投与前後の対象の血液サンプル中のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体レベルを比較するために使用することができ、アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体レベルがより低いほど寛容誘導が成功したことを示す。
また、本明細書に開示されるのは、
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドが、抗原提示細胞を標的とする標的化ユニット、二量体化ユニットなどの多量体化ユニット、及び抗原性ユニットを含み、抗原性ユニットが、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、第１の核酸配列と、
（ｂ）１つ以上の免疫阻害化合物をコードする１つ以上の更なる核酸配列と、を含み、
自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶反応からなる群から選択される免疫疾患を有する対象又はその予防を必要とする対象の治療において使用するために、第１のポリペプチド及び１つ以上の免疫阻害化合物を別個の分子として共発現させることを可能にし、当該対象に投与される、ベクターである。
また、本明細書に開示されるのは、
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドが、抗原提示細胞を標的とする標的化ユニット、二量体化ユニットなどの多量体化ユニット、及び抗原性ユニットを含み、抗原性ユニットが、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、第１の核酸配列と、
（ｂ）１つ以上の免疫阻害化合物をコードする１つ以上の更なる核酸配列と、を含み、
自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶反応からなる群から選択される免疫疾患を有する対象又はその予防を必要とする対象の治療において使用する医薬品の製造のために、第１のポリペプチド及び１つ以上の免疫阻害化合物を別個の分子として共発現させることを可能にし、当該医薬品が当該対象に投与される、ベクターの使用である。
また、本明細書に開示されるのは、
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドが、抗原提示細胞を標的とする標的化ユニット、二量体化ユニットなどの多量体化ユニット、及び抗原性ユニットを含み、抗原性ユニットが、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、第１の核酸配列と、
（ｂ）１つ以上の免疫阻害化合物をコードする１つ以上の更なる核酸配列と、を含み、
自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶反応からなる群から選択される免疫疾患を有する対象又はその予防を必要とする対象を治療するために、第１のポリペプチド及び１つ以上の免疫阻害化合物を別個の分子として共発現させることを可能にする、ベクターの使用である。
また、本明細書に開示されるのは、
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドが、抗原提示細胞を標的とする標的化ユニット、二量体化ユニットなどの多量体化ユニット、及び抗原性ユニットを含み、抗原性ユニットが、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、第１の核酸配列と、
（ｂ）１つ以上の免疫阻害化合物をコードする１つ以上の更なる核酸配列と、を含み、
自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶反応からなる群から選択される免疫疾患の療法的治療又は予防的治療において使用される場合、第１のポリペプチド及び１つ以上の免疫阻害化合物を別個の分子として共発現させることを可能にする、ベクターである。
また、本明細書に開示されるのは、
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドが、抗原提示細胞を標的とする標的化ユニット、二量体化ユニットなどの多量体化ユニット、及び抗原性ユニットを含み、抗原性ユニットが、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、第１の核酸配列と、
（ｂ）１つ以上の免疫阻害化合物をコードする１つ以上の更なる核酸配列と、を含み、
自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶反応からなる群から選択される免疫疾患の療法的治療又は予防的治療のために、第１のポリペプチド及び１つ以上の免疫阻害化合物を別個の分子として共発現させることを可能にする、ベクターの使用である。
また、本明細書において開示されるのは、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、及び移植片拒絶反応からなる群から選択される免疫疾患を治療又は予防するための医薬品であって、当該疾患を有する対象又は当該疾患の予防を必要とする対象において、
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドが、抗原提示細胞を標的とする標的化ユニット、二量体化ユニットなどの多量体化ユニット、及び抗原性ユニットを含み、抗原性ユニットが、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、第１の核酸配列と、
（ｂ）１つ以上の免疫阻害化合物をコードする１つ以上の更なる核酸配列と、を含み、
第１のポリペプチド及び１つ以上の免疫阻害化合物を別個の分子として共発現させることを可能にする、ベクターを対象に投与することによって行う、医薬品である。
前述の書面による説明は、当業者が本発明を実施するのに十分であると考えられる。以下の実施例は、例示のみを目的として提供されており、いかなる形でも本発明の範囲を限定することを意図するものではない。実際に、本明細書に示され、記載されたものに加えて、本発明の様々な変更が、前述の説明から当業者に明らかになり、添付の特許請求の範囲に含まれる。
実施例１：
マウスミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）２７－６３をコードし、更に以下のエレメント／ユニットをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡベクターを設計及び産生した：
＊ＭＯＧ（２７－６３）配列は、Ｋｒｉｅｎｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３７１，１４５－１５３，２０２１から取得した。
ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）は、中枢神経系において発現されるタンパク質である。上記ＤＮＡベクターの抗原性ユニットに含まれるＭＯＧ（２７－６３）配列は、ＭＯＧの免疫優性３５－５５ Ｔ細胞エピトープであるＭＯＧ（３５－５５）を含み、これは、多発性硬化症の間の細胞性免疫応答及び体液性免疫応答の両方の主要な標的である。ＭＯＧ（３５－５５）誘発実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、多発性硬化症の動物モデルとして最もよく用いられている。
以下において、「ｍ」、「マウス（ｍｕｒｉｎｅ）」及び「マウス（ｍｏｕｓｅ）」は互換的に使用され、「ｈ」及びヒトは互換的に使用される。
本発明によるベクターであるＤＮＡベクターＶＢ５０４９＊（配列番号３）は、上記の表４に記載されるような標的化ユニット、二量体化ユニット、ユニットリンカー、及び抗原性ユニットを含む第１のポリペプチドと、免疫阻害化合物としてのＩＬ－１０とをコードする。共発現エレメントＴ２Ａの存在により、第１のポリペプチド及び免疫阻害化合物は、別個の分子として発現される。
ＤＮＡベクターＶＢ５０５２＊（配列番号４）は、免疫原性様式でＡＰＣを標的化することが知られている、すなわち、このような標的化ユニットを含む第１のポリペプチド／二量体タンパク質は、それらが投与される対象において炎症誘発性免疫応答を誘導することが知られている、ヒトマクロファージ炎症性タンパク質アルファ変異体標的化ユニット（ｈＣＣＬ３Ｌ１、ＬＤ７８β又はｈＭＩＰ１αとも呼ばれる）を含む第１のポリペプチドをコードする（例えば、国際公開第２０１１／１６１２４４（Ａ１）号を参照のこと）。ＶＢ５０５２＊は、ＶＢ５０４９＊の「炎症誘発性バージョン」であり、本発明の構築物との比較として使用される。
ＤＮＡベクターＶＢ５０５１＊（配列番号５）は、抗原性ユニット、すなわちＭＯＧ（２７－６３）；単一のタンパク質／ペプチドのみをコードする。ＶＢ５０５１＊は、本発明の構築物に対する比較として使用される。
ＤＮＡベクターの産生
この実施例の節における全てのＤＮＡベクターは、この実施例の節における表に記載されるような配列をＧｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂ．Ｖ．，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから注文し、発現ベクターｐＡＬＤ－ＣＶ７７、ＤＮＡプラスミド、にクローニングすることにより産生した。
実施例２：
本試験の目的は、哺乳動物細胞への一過性トランスフェクション後のＤＮＡベクターＶＢ５０４９＊及びＶＢ５０５２＊によってコードされるタンパク質の発現及び分泌の特性を評価することであった。
ＨＥＫ２９３細胞をＡＴＣＣから入手し、ＶＢ５０４９＊又はＶＢ５０５２＊ＤＮＡベクターで一過性にトランスフェクトした。簡単に説明すると、２×１０５細胞／ウェルを、１０％ＦＢＳ増殖培地を含む２４ウェル組織培養プレートにプレーティングし、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、それぞれのＤＮＡベクター１μｇでトランスフェクトした。その後、トランスフェクトした細胞を５％ＣＯ２、３７℃で５日間維持した後、細胞上清を回収し、ＶＢ５０４９＊又はＶＢ５０５２＊によってコードされる分泌タンパク質の特性評価を、上清のサンドイッチＥＬＩＳＡによって、ｈＩｇＧ ＣＨ３ドメインに対する抗体（検出抗体、１００μＬ／ウェル、０．１μｇ／ｍＬマウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ二次抗体、ビオチン（０５－４２４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））及びＭＯＧに対する抗体（捕捉抗体、１００μＬ／ウェル、０．２５μｇ／ｍＬマウス抗ＭＯＧ抗体（ＮＹＲＭＯＧ、ｓｃ－７３３３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））を用いて行った。結果を図６Ａに示す。
ＶＢ５０４９＊によってコードされるＩＬ－１０の分泌を、マウスＩＬ－１０に対する抗体（捕捉抗体、１００μＬ／ウェル、０．４μｇ／ｍＬラット抗マウスＩＬ－１０抗体（ＭＡＢ４１７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、検出抗体、１００μＬ／ウェル、０．２μｇ／ｍＬヤギ抗マウスＩＬ－１０ビオチン化抗体（ＢＡＦ４１７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ））を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。結果を図６Ｂに示す。
ＶＢ５０４９＊からの２つの別個のタンパク質としての第１のポリペプチド及びＩＬ－１０の分泌を、マウスＭＯＧに対する抗体（捕捉抗体、１００μＬ／ウェル、０．２５μｇ／ｍＬマウス抗ＭＯＧ抗体（ＮＹＲＭＯＧ、ｓｃ－７３３３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、及びマウスＩＬ－１０に対する抗体（検出抗体、１００μＬ／ウェル、０．２μｇ／ｍＬヤギ抗マウスＩＬ－１０ビオチン化抗体（ＢＡＦ４１７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ））を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡで示した。結果を図６Ｃに示す。
ＶＢ５０５２＊によってコードされる第１のポリペプチドの分泌を、ｈＩｇＧ ＣＨ３ドメインに対する抗体（捕捉抗体、１００μＬ／ウェル、１μｇ／ｍＬ、マウス抗ヒトＩｇＧ（ＣＨ３ドメイン）、１５３２７２、Ｂｉｏｒａｄ）及びｈＣＣＬ３Ｌ１に対する抗体（検出抗体、１００μＬ／ウェル、０．２μｇ／ｍＬ、ヤギ抗ヒトＣＣＬ３Ｌ１ビオチン抗体）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによって更に示した。結果を図６Ｄに示す。
図６Ａ（捕捉抗体：抗ＭＯＧ抗体、検出抗体：抗ｈＩｇＧ ＣＨ３ドメイン抗体）及び図６Ｄ（捕捉抗体：抗ｈＩｇＧ ＣＨ３ドメイン、検出抗体：抗ヒトＣＣＬ３Ｌ１）から明らかなように、それぞれＶＢ５０４９＊及びＶＢ５０５２＊によってコードされる第１のポリペプチドがいずれも高レベルで分泌された。
図６Ｂは、希釈されていない上清中のＩＬ－１０分泌のレベルを示す。上清の希釈曲線を組換えＩＬ－１０の希釈曲線と比較することにより、上清中の分泌レベルは、２．２５μｇ／ｍＬであると推定された。
図６Ｃは、捕捉抗体として抗ＭＯＧ抗体及び検出抗体として抗マウスＩＬ－１０抗体を用いて得られたＥＬＩＳＡ結果を示す。予想通り、ＶＢ５０４９＊は、非常に弱いシグナルを示し、Ｔ２Ａペプチドの存在により、第１のポリペプチド及びＩＬ－１０が、２つの別個の分子として発現されることが確認された。
図６Ａ～図６Ｄに示される結果は、ＤＮＡベクターＶＢ５０４９＊及びＶＢ５０５２＊によってコードされる第１のポリペプチド／二量体タンパク質（標的化ユニット、二量体化ユニット及び抗原性ユニットを含む）がトランスフェクトされた細胞から分泌されること、並びにＶＢ５０４９＊については、ＩＬ－１０も別個のタンパク質として発現及び分泌されることを示す。
発現したタンパク質の特性を更に評価するために、ウェスタンブロット（ＷＢ）分析を行った。簡単に説明すると、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（３×１０６細胞／ｍＬ、１．６ｍＬ）を６ウェル培養プレートに播種した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．）を用い、１μｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡで細胞をトランスフェクトし、プレートを加湿ＣＯ２セルインキュベーター（８％ＣＯ２、３７℃）内のオービタルシェーカー（直径１９ｍｍ、１２５ｒｐｍ）でインキュベートした。１８時間のインキュベーション後、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．）を各ウェルに添加した。プレートを更に２８時間インキュベートした後、上清を回収した。
還元条件及び非還元条件についてそれぞれ７．５μＬのＤＴＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．）又は７．５μＬの超純水で、トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清１０５μＬを、３７．５μＬの４×Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）と混合することによって、サンプルを調製した。サンプル（還元又は非還元）を７０℃で１０分間加熱した後、１０μＬを４％～２０％Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅプレキャストゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に添加した。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｌｌ Ｂｌｕｅ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質標準（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用い、１×Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳランニング緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）中で、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。Ｔｒａｎ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏセミドライ転写システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、ゲルからＥｔＯＨ活性化低蛍光（ＬＦ）０．４５μｍ ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）にタンパク質を転写した。ＰＶＤＦ膜をＥｖｅｒｙＢｌｏｔ緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）中で５分間ブロッキングし、マウス抗ＭＯＧ（ｓｃ－７３３３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びラット抗マウスＩＬ－１０抗体（ＭＡＢ４１７、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）でプローブして、第１のポリペプチド／二量体タンパク質及びＩＬ－１０をそれぞれ検出した。膜を蛍光色素コンジュゲート二次抗体と共に室温で１時間インキュベートし、次いで洗浄し、乾燥させた。ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＭＰ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（設定Ｄｙｌｉｇｈｔ ４８８及び８００、Ａｕｔｏ Ｏｐｔｉｍａｌ）を使用することによって、画像を取得した。
図７Ａ及び図７Ｂは、ＶＢ５０４９＊及びＶＢ５０５２＊によってコードされる第１のポリペプチド／二量体タンパク質、並びにＶＢ５０４９＊によってコードされるＩＬ－１０の成功した発現及び分泌を示す。
図７Ａは、ＶＢ５０５２＊及びＶＢ５０４９＊によって発現され、トランスフェクトされた細胞から分泌され、還元条件及び非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけられたタンパク質が検出できたことを示している。膜をマウス抗マウスＭＯＧでプローブした。還元条件下では、ＶＢ５０５２＊によってコードされる第１のポリペプチドは、単量体（３１ｋＤａ）として検出され、一方、非還元条件下では、単量体（３１ｋＤａ、第１のポリペプチド）及び二量体（６１ｋＤａ、二量体タンパク質）の両方として検出された。還元条件下では、ＶＢ５０４９＊によってコードされる第１のポリペプチドは、単量体（５１ｋＤａ）として検出されたが、非還元条件下では、単量体（５１ｋＤａ、第１のポリペプチド）及び二量体（１０１ｋＤａ、二量体タンパク質）の両方として検出された。
図７Ｂは、ＩＬ－１０（１８ｋＤａ）の検出を示す。７１ｋＤａのタンパク質は、検出されず、ＩＬ－１０が別のタンパク質としてＶＢ５０４９＊から発現していることが確認された。
ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロットのデータを総合すると、Ｔ２Ａペプチドを共発現エレメントとして用いることにより、インタクトな第１のポリペプチド／二量体タンパク質をＤＮＡベクターからｍＩＬ１０とともに共発現できることが実証された。
実施例３：
ＩＬ－１０（免疫寛容に関連する抗炎症性サイトカイン）及びＩＦＮ－γ（炎症性免疫応答を誘導するためのマーカー）を測定し、ＩＬ－１０／ＩＦＮ－γの比を算出することによって、ＶＢ５０４９＊の寛容誘導能を判定した。この比は、ＶＢ５０４９＊によって誘導される免疫応答が、どの程度寛容原性プロファイルに偏っているかを示している。
以下の試験設計を適用した：
雌の６週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＪａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ（Ｆｒａｎｃｅ）から入手した。全ての動物をＲａｄｉｕｍ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）の動物施設に収容した。全ての動物プロトコールは、Ｆｏｏｄ Ｓａｆｅｔｙ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ（Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）によって承認された。ＶＢ５０４９＊、ＶＢ５０５２＊及びＶＢ５０５１＊の試験には５例のマウス／群を用い、陰性対照（ＰＢＳのみ）には２例のマウス／群を用いた。ＶＢ５０５２＊は、ＶＢ５０４９＊の炎症誘発性バージョンであり、ＶＢ５０４９＊との比較として含まれている。ＶＢ５０４９＊の炎症誘発性バージョンであるＶＢ５０５２＊は、ＩＦＮ－γ産生を誘導することが予想される。ＶＢ５０５１＊をＶＢ５０４９＊との比較として含めた。
滅菌ＰＢＳに溶解した各ＤＮＡベクター５０μｇを、筋肉内注射により各脛骨筋内部に１回投与し（２×２５μＬ、１０００μｇ／ｍＬ）、次いでＡｇｉｌｅＰｕｌｓｅ ｉｎ ｖｉｖｏエレクトロポレーションシステム（ＢＴＸ，ＵＳＡ）を用いてエレクトロポレーションを行った。
投与７日後に脾臓を回収し、セルストレーナーで潰して単細胞懸濁液を得た。塩化アンモニウム－カリウム（ＡＣＫ）溶解緩衝液を使用して赤血球を溶解した。洗浄後、脾細胞をＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２０２（ＣｈｅｍＯＭｅｔｅｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して計数し、６×１０６細胞／ｍＬの最終濃度に再懸濁し、９６ウェルＩＦＮ－γ／ＩＬ－１０二色ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔプレート中に６×１０５細胞／ウェルとして播種した。次いで、脾細胞を１６．６７μｇ／ｍＬのＭＯＧ（３５－５５）ペプチドで４４時間再刺激した後、製造業者のプロトコール（Ｍａｂｔｅｃｈ ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）に従って、二色ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔでＩＦＮ－γ及びＩＬ－１０サイトカイン産生について試験した。スポット形成細胞を、ＩＲＩＳ ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ及びＥＬＩＳｐｏｔプレートリーダー（Ｍａｂｔｅｃｈ ＡＢ）で測定し、Ａｐｅｘソフトウェア（Ｍａｂｔｅｃｈ ＡＢ）を使用して解析した。結果を、ＩＬ－１０＋又はＩＦＮ－γ＋スポット／１０６脾細胞の３連の平均数として示す。
図８から分かるように、ＶＢ５０４９＊で得られたＩＬ－１０／ＩＦＮ－γの比は高く、ＶＢ５０４９＊が炎症性サイトカインＩＦＮ－γよりも有意に高いレベルの免疫阻害性サイトカインＩＬ－１０を誘導することを示している。これは、約１のＩＬ－１０／ＩＦＮ－γ比を示したＶＢ５０５２＊の場合ではなく、ＭＯＧ（３５－５５）ペプチドによる再刺激後に両方のサイトカインが同等のレベルで産生されることを示している。
ＤＮＡベクターを投与したマウスから得られた全脾細胞もまた、多色フローサイトメトリーで解析した。簡単に説明すると、細胞をＭＯＧ（３５－５５）ペプチドで１６時間再刺激し、次いで回収し、計数した。１サンプル当たり２×１０６細胞をフローサイトメトリー解析に使用した。細胞をまず、暗所にて室温で１０分間、固定可能生存率色素（ｅＦｌｕｏｒ７８０）で染色した。この後、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し（遠心分離し（４００ｇ／１０分／４℃）、表面染色抗体（Ａｂ）ミックス（抗ＣＤ３ ＢＵＶ３９５、抗ＣＤ４ ＢＶ７８５、及び抗ＣＤ８）と共に４℃、暗所で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、細胞ペレットをフロー緩衝液（ＰＢＳ、１０％ＦＢＳ及び２ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁した。次いで、細胞を固定し、暗所にて４℃で４５～６０分間透過処理した（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ）。続いて、細胞を１×透過化緩衝液で洗浄し、前述のように遠心分離し、細胞ペレットを細胞内染色Ａｂミックス（抗ＩＦＮ－γＡＰＣ、抗ＩＬ－１７ Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８、ＢＶ４２１、抗Ｆｏｘｐ３ ＰＥ）に再懸濁した。細胞を細胞内染色Ａｂミックスと共に４℃、暗所で３０分間インキュベートした。その後、ＢＤ Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ａ５フローサイトメーターでフローサイトメトリーを実施するまで、細胞を洗浄し、フロー緩衝液に再懸濁した。蛍光色素コンジュゲートＡｂに対しては、単一染色Ｕｌｔｒａ ｃｏｍｐ ｅＢｅａｄｓを使用し、固定可能生存率色素に対しては、ＡｒＣ反応性ビーズを使用して補正を設定した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてフローサイトメトリーファイルを解析した。
ＩＦＮ－γ及びＩＬ－１７は両方とも、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）及び多発性硬化症などの慢性炎症性疾患及び自己免疫疾患の病態形成に寄与する炎症誘発性サイトカインである。したがって、寛容誘導構築物は、例えば、自己免疫を悪化させ得る炎症誘発性サイトカインを誘導することによって、自己抗原免疫応答を不注意に感作することなく、寛容を確実に誘導しなければならない。
図９Ａ及び図９Ｂは、ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイで観察されたように、ＶＢ５０４９＊投与時のＩＦＮ－γ産生の欠如がフローサイトメトリーで確認されたことを示す。更に、フローサイトメトリーは、ＶＢ５０４９＊がＩＬ－１７産生を誘導しないことも実証した。逆に、炎症誘発性ＶＢ５０５２＊の投与は、予想され得るように、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－１７の産生を誘導した。ＶＢ５０５１＊投与は、脾細胞においていくらかのＩＦＮ－γ産生を誘導したが、ＩＬ－１７のレベルは、非常に低かった。
ＭＯＧ特異的調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、すなわち、ＭＯＧ特異的炎症性免疫応答を抑制及び制御し、それによって自己寛容を維持するように作用するＴ細胞の生成を、ＭＯＧ特異的四量体染色及びフローサイトメトリーによって同定した（ＣＤ４＋ＭＯＧ（３５－５５）－ｔｅｔ＋Ｆｏｘｐ３＋細胞）。
簡単に説明すると、各群からプールした１～２×１０６個の脾細胞を９６ウェルＶ底プレートに移した。四量体及び抗体を、使用前に５％ＦＢＳを含むＰＢＳ中で希釈し、光から保護した。細胞洗浄を必要とした全ての工程は、別段の記載がない限り、５％ＦＢＳを含むＰＢＳを用いて行った。最初に、ＭＯＧ（３５－５５）に特異的なＴ－Ｓｅｌｅｃｔ ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ ＩＩ Ｔｅｔｒａｍｅｒｓ（１０μＬ／ウェル、Ｈ－２ ＩＡｂ ＭＯＧ（３５－５５）Ｔｅｔｒａｍｅｒ－ＰＥ、ＴＳ－Ｍ７０４－１、ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）又はＭＯＧ（３８－４９）に特異的なＰｒｏＴ２（登録商標）ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ ＩＩ Ｔｅｔｒａｍｅｒｓ（１μｇ／ｍＬ、Ｈ－２ ＩＡｂ－ＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨ－ＰｒｏＴ２（登録商標）Ｔｅｔｒａｍｅｒ ＰＥ、２９５８、Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ）を用いて、製造業者の指示に従って細胞を染色した。細胞を洗浄することなく、Ｆｃ受容体を氷上で５分間ブロックして、フローサイトメトリー抗体（Ａｂ）のＦｃ受容体への非特異的結合を防止した（０．２５μｇ／ｍＬ、ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（商標）ＰＬＵＳ（抗マウスＣＤ１６／３２）Ａｎｔｉｂｏｄｙ、１５６６０４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。洗浄せずに、Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＣＤ８ ＰＥ－Ｃｙ７（０．２５μｇ／ｍＬ、Ｃｌｏｎｅ：５３－６．７、１００７２１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＣＤ４ ｅＦｌｕｏｒ４５０（０．２５μｇ／ｍＬ、Ｃｌｏｎｅ：ＧＫ１．５、４８－００４１－８２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ／ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＡｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＣＤ２５ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（０．２５μｇ／ｍＬ、Ｃｌｏｎｅ：ＰＣ６１、１０２０３０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含有する表面Ａｂカクテルを用いて、細胞を氷上で３０分間染色した。細胞をＰＢＳで２回洗浄した。次に、細胞を氷上で１０分間、固定可能生存率色素（１ウェル当たり１５０μＬ、ＰＢＳで１：８０００に希釈、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｓｔａｉｎ ７８０、５６５３８８、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。細胞を、５％ＦＢＳを含むＰＢＳで２回洗浄し、Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔを製造業者の指示に従って使用して固定及び透過処理した（１ウェル当たり２００μＬ、００－５５２３－００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ／ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。細胞を洗浄し、Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＦＯＸＰ３ ｅＦｌｕｏｒ ６６０（０．２５μｇ／ｍＬ、Ｃｌｏｎｅ：ＦＪＫ－１６ｓ、５０－５７７３－８２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ／ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＡｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ Ｋｉ－６７ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（０．２５μｇ／ｍＬ、Ｃｌｏｎｅ：Ｃｌｏｎｅ：１１Ｆ６、１５１２０４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含有する細胞内Ａｂカクテルを用いて氷上で３０分間染色した。細胞を２回洗浄し、５％ＦＢＳを含む２００μＬのＰＢＳに再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳｙｍｐｈｏｎｙ（商標）Ａ３ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒで分析した。以下の対照を、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ｖ１０．８ソフトウェア（ＢＤ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して所望の集団をゲーティングするためのガイドとして使用した：未染色対照（細胞をＡｂで処理しなかった）及びＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｎｕｓ Ｏｎｅ（ＦＭＯ）対照（本明細書で使用される全ての蛍光標識Ａｂで染色されたサンプルから、ゲーティングされる１つの蛍光標識Ａｂｓを除いたサンプル）。
図１０に示すように、ＶＢ５０５２＊及びＶＢ５０５１＊と比較して、ＶＢ５０４９＊の単回投与後には、ＭＯＧ（３５－５５）特異的Ｆｏｘｐ３＋細胞の割合がより多く検出された。ＶＢ５０５２＊の場合、観察されたＭＯＧ特異的Ｔｒｅｇは、ＶＢ５０５２＊によって誘発される炎症性免疫応答に対する自然なフィードバックループの結果である（実施例５でより詳細に論じる）。
したがって、実施例３は、ＶＢ５０４９＊が、炎症誘発性対照構築物ＶＢ５０５２＊と比較して、より高い抗炎症性サイトカイン対炎症性サイトカイン比（ＩＬ－１０／ＩＦＮ－γ）を誘導したことを示し、炎症性ＩＦＮ－γ産生の欠如を示している。実施例３は更に、ＶＢ５０４９＊が、ＶＢ５０５２＊又はＶＢ５０５１＊と比較して、より多くのＭＯＧ（３５－５５）特異的Ｆｏｘｐ３＋細胞を誘導することを示す。これらの結果を総合すると、ＶＢ５０４９＊の投与が、ＶＢ５０５１＊及びＶＢ５０５２＊の投与と比較して、より大きな抗原特異的寛容原性応答を誘発したことが示される。
実施例４
ＭＯＧ（２７－６３）をコードし、更に以下のエレメント／ユニットをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡベクターを設計及び産生した：
更に、ＤＮＡベクターＶＢ５０４９（配列番号３２）、ＶＢ５０５２（配列番号３３）及びＶＢ５０１（配列番号３４）を設計及び産生した。これらは、ＶＢ５０４９＊、ＶＢ５０５２＊及びＶＢ５０１＊（表４）と同一であるが、配列番号１６のＭＯＧ（２７－６３）＊をコードするヌクレオチド配列を含む代わりに、配列番号１８のＭＯＧ（２７－６３）をコードするヌクレオチド配列を含む。
ＤＮＡベクターＶＢ５０４９、ＶＢ５０５２及びＶＢ５０６２～ＶＢ５０６５は、ＭＯＧ（２７－６３）を有する抗原性ユニットを含む同じ第１のポリペプチドをコードする：
・ＶＢ５０４９は、更にｍＩＬ－１０をコードしており、これは別個の分子として発現する
・ＶＢ５０６２は、更にｍＴＧＦ－β１をコードしており、これは別個の分子として発現する
・ＶＢ５０６３は、更にｍＣＴＬＡ－４の細胞外ドメインをコードしており、これは別個の分子として発現する
・ＶＢ５０６４は、更にｍＩＬ－２をコードしており、これは別個の分子として発現する
・ＶＢ５０６５は、更にｍＩＦＮ－γをコードしており、これは別個の分子として発現する
・ＶＢ５０４８は、第１のポリペプチドのみをコードしているが、免疫阻害化合物はコードしていない。これは、本発明のベクターとの比較の役割を果たす。
・ＶＢ５０５２は、前述のベクターの「炎症誘発性」バージョンであり、本発明のベクターとの比較の役割を果たす。
・ＶＢ５０５１は、ＭＯＧ（２７－６３）のみをコードし、本発明のベクターとの比較の役割を果たす。
ＤＮＡベクターによってコードされるタンパク質の発現及び分泌の特性評価
ＶＢ５０４９、ＶＢ５０５２、ＶＢ５０６２、ＶＢ５０６３、ＶＢ５０６４及びＶＢ５０６５によってコードされるタンパク質の発現及び分泌の特性評価を、以下のように行った。
簡単に説明すると、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（１．７×１０６細胞／ｍＬ、１ｍＬ）を９６ウェル培養プレートに播種した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．）を用い、０．６４μｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡで細胞をトランスフェクトし、プレートを加湿ＣＯ２セルインキュベーター（８％ＣＯ２、３７℃）内のオービタルシェーカー（直径３ｍｍ、９００ｒｐｍ）でインキュベートした。トランスフェクションの７２時間後に上清を回収した。
分泌された第１のポリペプチド／二量体タンパク質の特性評価を、ＭＯＧに対する抗体（捕捉抗体、マウス抗ＭＯＧ抗体、０．２５μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル、ｓｃ－７３３３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びｈＩｇＧ ＣＨ３ドメインに対する抗体（検出抗体、マウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ二次抗体、ビオチン、０．１μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル、０５－４２４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた上清のサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて行った。図１１に示すように、全ての第１のポリペプチド／二量体タンパク質が高度に発現し、分泌された。
コードされた免疫阻害化合物ｍＩＬ－１０、ｍＴＧＦ－β１、ｍＣＴＬＡ－４、ｍＩＬ－２及びｍＩＦＮ－γの発現及び分泌の特性評価を、それぞれｍＩＬ－１０、ｈＴＧＦ－β１（ｍＴＧＦ－β１にも結合）、ｍＣＴＬＡ－４、ｍＩＬ－２及びｍＩＦＮ－γに対する抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによって行った。結果を図１２Ａ～図１２Ｅに示す。
以下の抗体を使用した：
（Ａ）捕捉抗体：１μｇ／ｍＬラット抗マウスＩＬ－１０抗体、１００μＬ／ウェル、ＭＡＢ４１７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ。検出抗体：０．２μｇ／ｍＬ、ヤギ抗マウスＩＬ－１０ビオチン化抗体、１００μＬ／ウェル、ＢＡＦ４１７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ。
（Ｂ）捕捉抗体：２μｇ／ｍＬ ＴＧＦ－β１抗体、１００μＬ／ウェル、ＭＡＢ２４０２、ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ。検出抗体：０．８μｇ／ｍＬニワトリ抗ヒトＴＧＦ－β１ビオチン化抗体、１００μＬ／ウェル、ＢＡＦ２４０、ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ。
（Ｃ）捕捉抗体：０．８μｇ／ｍＬヤギ抗マウスＣＴＬＡ－４抗体、１００μＬ／ウェル、ＡＦ４７６、ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ。検出抗体：０．８μｇ／ｍＬヤギ抗マウスＣＴＬＡ－４ビオチン化抗体、１００μＬ／ウェル、ＢＡＦ４７６、ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ。
（Ｄ）捕捉抗体：２μｇ／ｍＬラット抗マウスＩＬ－２抗体、１００μＬ／ウェル、５０３７０１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ。検出抗体：２μｇ／ｍＬラット抗マウスＩＬ－２ビオチン化抗体、１００μＬ／ウェル、５０３８０３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ。
（Ｅ）捕捉抗体：２μｇ／ｍＬラット抗マウスＩＦＮ－γ抗体、１００μＬ／ウェル、５０５８０２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ。検出抗体：２μｇ／ｍＬラット抗マウスＩＦＮ－γビオチン化抗体、１００μＬ／ウェル、５０５７０４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ。
図１２Ａ～図１２Ｅに示すように、５つの免疫阻害化合物は全て、それぞれのベクターから発現し、分泌された。
ＭＯＧに対する抗体及び免疫阻害化合物ｍＩＬ－１０、ｍＴＧＦ－β１、ｍＣＴＬＡ－４、ｍＩＬ－２に対する抗体をそれぞれ用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより、第１のポリペプチド／二量体タンパク質及び免疫阻害化合物が別個のタンパク質として発現及び分泌されていることを確認した。結果を図１３Ａ～図１３Ｄに示す。
以下の抗体を使用した：
捕捉抗体：マウス抗ＭＯＧ抗体、０．２５μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル、ｓｃ－７３３３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。検出抗体：
（Ａ）０．２μｇ／ｍＬヤギ抗マウス抗ＩＬ－１０ビオチン化抗体、１００μＬ／ウェル、ＢＡＦ４１７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ。
（Ｂ）０．８μｇ／ｍＬニワトリ抗ヒトＴＧＦ－β１ビオチン化抗体、１００μＬ／ウェル、ＢＡＦ２４０、ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ。
（Ｃ）０．８μｇ／ｍＬヤギ抗マウスＣＴＬＡ－４ビオチン化抗体、１００μＬ／ウェル、ＢＡＦ４７６、ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ。
（Ｄ）２μｇ／ｍＬラット抗マウスＩＦＮ－γビオチン化抗体、１００μＬ／ウェル、５０５７０４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ
図１３Ａ～図１３Ｄに示されるように、第１のポリペプチド及び免疫阻害化合物は、融合タンパク質として発現されるのではなく、別個の分子として発現及び分泌される。
ＤＮＡベクターから発現したインタクトなタンパク質の特性評価
トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清サンプルに対してウェスタンブロット分析を実施して、同一の第１のポリペプチドをコードするが異なる免疫阻害化合物をコードするＶＢ５０４９、ＶＢ５０６２、ＶＢ５０６３及びＶＢ５０６４によってコードされるタンパク質の特性評価を更に行った。前述のＤＮＡベクターと同じ第１のポリペプチドをコードするが、免疫阻害化合物をコードしないＶＢ５０４８を比較として含めた。
還元条件及び非還元条件についてそれぞれ１μＬのＤＴＴ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）又は１μＬの超純水で、トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清１４μＬを、５μＬの４×Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）と混合することによって、サンプルを調製した（全サンプル量を所定の比率でスケールアップ）。サンプル（還元又は非還元）を７０℃で１０分間加熱した後、４％～２０％Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅプレキャストゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に添加した。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｌｌ Ｂｌｕｅ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質標準（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用い、１×Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳランニング緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）中で、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏセミドライ転写システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、ゲルからＥｔＯＨ活性化低蛍光（ＬＦ）０．４５μｍ ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）にタンパク質を転写した。ＰＶＤＦ膜をＥｖｅｒｙＢｌｏｔ緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）中で５分間ブロッキングし、マウス抗ＭＯＧ（ｓｃ－７３３３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ラット抗マウスＩＬ－１０（ＭＡＢ４１７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヤギ抗マウスＣＴＬＡ－４（ＡＦ４６７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）又はラット抗マウスＩＬ－２（５０３７０２）でプローブして、それぞれＭＯＧ、ｍＩＬ－１０、ｍＣＴＬＡ－４又はｍＩＬ－２を検出した。膜を蛍光色素コンジュゲート種特異的二次抗体と共に室温で１時間インキュベートし、次いで洗浄し、乾燥させた。Ｄｙｌｉｇｈｔチャネル４８８におけるｍＩＬ１０検出のために、膜をＤｙｌｉｇｈｔ－４８８二次抗体で再プローブした。膜をエタノール及びＴＢＳＴ中で再活性化した。膜をブロッキングし、Ｄｙｌｉｇｈｔ ４８８コンジュゲート二次抗体と共に室温で１時間インキュベートし、次いで洗浄し、乾燥させた。ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＭＰ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを用いて画像を取得した。結果を図１４に示す。
ウェスタンブロット分析によりＥＬＩＳＡ結果が確認され、ＶＢ５０４９、ＶＢ５０６２、ＶＢ５０６３及びＶＢ５０６４が２つのタンパク質、すなわち第１のポリペプチド／二量体タンパク質（図１４Ａ及びＢ、還元及び非還元条件）及び第２のタンパク質としての免疫阻害化合物、すなわちｍＩＬ－１０（図１４Ｃ）、ｍＣＴＬＡ－４（図１４Ｄ）又はｍＩＬ－２（図１４Ｅ）を発現していることが示された。重要なことに、抗ＩＬ－１０、抗ＣＴＬＡ－４及び抗ＩＬ－２でプローブした膜で更なるバンドは観察されず、これは、Ｔ２Ａ配列でのリボソームスキッピングが成功し、単一のＤＮＡプラスミドから第１のポリペプチドと免疫阻害化合物が別個のタンパク質として発現したことを示している。
ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロットのデータを総合すると、Ｔ２Ａペプチドを共発現エレメントとして用いることにより、標的化ユニット、二量体化ユニット及び抗原性ユニットを含むインタクトな二量体タンパク質を、免疫阻害化合物とともにＤＮＡプラスミドから共発現させることができることが実証された。
ベクターＶＢ５０５１からのＭＯＧ（２７－６３）ペプチドの発現及び分泌の特性評価
ベクターＶＢ５０５１によってコードされるＭＯＧ（２７－６３）のタンパク質発現及び分泌を、この実施例４において前述したように判定した。
ＭＯＧ（２７－６３）ペプチドの分泌の特性評価を、直接ＥＬＩＳＡ、上清でのコーティング、及びＭＯＧに対する抗体（捕捉抗体、１００μＬ／ウェル、３．３μｇ／ｍＬマウス抗ＭＯＧ抗体、ｓｃ－７３３３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用する検出によって行った。図１５は、ＭＯＧ（２７－６３）ペプチドがＶＢ５０５１から発現され、当該ベクターでトランスフェクトされた哺乳動物細胞から分泌されることを示す。
実施例５：
ＶＢ５０４９の寛容誘導能を、ＶＢ５０４９を投与したマウスの脾臓において評価し（実施例４を参照）、ＭＯＧ（３５－５５）ペプチドによる再刺激後に二色ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイにおいて産生されたＩＬ－１０（免疫寛容に関連する抗炎症性サイトカイン）及びＩＦＮ－γ（炎症性免疫応答を誘導するためのマーカー）シグナルから算出されたＩＬ－１０／ＩＦＮ－γ比、並びにＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の検出によって判定した。更に、ＭＳの病態に関与することが知られている２つの炎症誘発性サイトカインであるＩＦＮ－γ及びＩＬ－１７産生がないことが実証された。得られた結果を、ＶＢ５０５２又はＶＢ５０５１投与によって誘発された応答と比較した（これらのベクターのユニット／エレメント及び説明については、実施例４を参照）。
適用した試験設計及び方法は、ＶＢ５０４９について、異なる投与スケジュールを試験して、実施例３で得られた結果を検証し、単回投与レジメンを超えてデータを更に拡張したことを除いて、実施例３でＶＢ５０４９＊について記載したものと同様であった。
簡単に説明すると、５０μｇのＤＮＡベクターＶＢ５０４９、ＶＢ５０５１又はＶＢ５０５２を４回（Ｄ０、Ｄ３、Ｄ７及びＤ１０）筋肉内投与し、続いてエレクトロポレーションを行い、最初の投与から１４日後に脾臓を採取した。脾臓をセルストレーナーで潰して単細胞懸濁液を得て、脾細胞をＭＯＧ（３５－５５）ペプチドで４４時間再刺激するか、又は再刺激せず、その後、実施例３に記載のように実施した二色ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイでＩＦＮ－γ及びＩＬ－１０の産生について試験した。
図１６Ａに示すように、ＶＢ５０４９、ＶＢ５０５１又はＶＢ５０５２を投与したマウスから採取した再刺激していない脾細胞では、ＩＬ－１０のいくらかの産生が検出されたが、ＩＦＮ－γの低いバックグラウンドレベルのみが観察された。脾細胞のＭＯＧ（３５－５５）再刺激の際、ＶＢ５０４９又はＶＢ５０５１のいずれかを投与されたマウスの群では有意なＩＦＮ－γ産生は検出されなかったが、対照的に、ＶＢ５０５２を投与されたマウスの脾細胞では有意に上昇したレベルのＩＦＮ－γが検出された（図１６Ｂ）。過剰な炎症を回避し、最終的に炎症を解消するために、ＩＦＮ－γなどの炎症誘発性サイトカインの産生が、ＩＬ－１０などの抗炎症性サイトカインの産生を含む負のフィードバック機構によって調節されることが重要である（例えば、Ｓｕｇｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ２０１６，Ｖｏｌ．７，Ａｒｔｉｃｌｅ １６０）。したがって、ＶＢ５０５２に応答して観察されたＩＬ－１０のレベルの増加は、誘導された炎症応答を制御するためのこのようなフィードバック機構によって説明され得る。図１７に示すように、ＶＢ５０５２と比較してＶＢ５０４９では有意に高いＩＬ－１０／ＩＦＮ－γ比が検出され、ＶＢ５０５２と比較してＶＢ５０４９の免疫抑制能が高いことが示された。
フローサイトメトリーによるＦｏｘｐ３、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－１７の検出：
Ｆｏｘｐ３を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の存在を、フローサイトメトリーによって脾細胞集団において同定した。ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞は、エフェクターＴ細胞及び炎症性免疫応答を抑制し、それによって自己寛容を維持することができる。フローサイトメトリーを実施例３に記載したように行った。
図１８に示すように、ＶＢ５０５１投与と比較してＶＢ５０４９投与に応答してＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の割合がより高く検出され、ＶＢ５０５１と比較してＶＢ５０４９によって誘導される抑制性Ｔ細胞のレベルがより高いことが示された。炎症誘発性サイトカインであるＩＦＮ－γ及びＩＬ－１７は、それぞれ図１９Ａ及び１９Ｂに示されるように、ＶＢ５０４９投与に応答してフローサイトメトリーによって検出されなかった。それとは反対に、炎症誘発性比較ベクターＶＢ５０５２の投与に応答して、両方の炎症誘発性サイトカインが検出された。
したがって、実施例５は、抗ＤＥＣ２０５標的化ユニットと、二量体化ユニットと、ＭＯＧ（２７－６３）を含む抗原と、を含む第１のポリペプチドをコードし、更にＩＬ－１０をコードするＶＢ５０４９の投与が、ＭＯＧ（２７－６３）のみをコードするＶＢ５０５１の投与と比較して、より高い抗炎症性サイトカイン対炎症性サイトカイン比（ＩＬ－１０／ＩＦＮ－γ）をもたらすことを示している。更に、ＶＢ５０４９の投与により、ＶＢ５０５１と比較して、炎症性ＩＦＮ－γ及びＩＬ－１７サイトカイン産生が欠如し、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の割合がより高くなる。これらの結果を総合すると、ＶＢ５０４９は、その炎症誘発性バージョンであるＶＢ５０５２とは対照的に、抗炎症的に抗原単独（ＶＢ５０５１）と比較して、より大きな抗原特異的寛容原性応答を誘発できることを示している。これらの結果はまた、実施例３の結果を検証し、ＶＢ５０４９の寛容原性特性がマウスへの反復投与後に保存されることを示す。
実施例６：
ＶＢ５０６２の寛容誘導能を、ＶＢ５０６２を投与したマウスの脾臓において評価し（表５／実施例４を参照）、ＭＯＧ（３５－５５）ペプチドによる再刺激後に二色ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイにおいて産生されたＩＬ－１０（免疫寛容に関連する抗炎症性サイトカイン）及びＩＦＮ－γ（炎症性免疫応答を誘導するためのマーカー）シグナルから算出されたＩＬ－１０／ＩＦＮ－γ比、並びにＭＯＧ（３８－４９）特異的四量体を用いてｅｘ ｖｉｖｏで検出されたＦｏｘｐ３＋ＭＯＧ（３８－４９）特異的調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の検出によって判定した。得られた結果を、ＶＢ５０５２によって誘発された免疫原性及びＶＢ５０５１の寛容誘導能と比較した（これらのベクターのユニット／エレメント及び説明については、実施例４を参照）。
簡単に説明すると、５０μｇのＤＮＡベクターＶＢ５０６２、ＶＢ５０５１又はＶＢ５０５２をマウス（１群あたり５例）に筋肉内投与し、続いてエレクトロポレーションを行った。投与７日後に脾臓を採取し、セルストレーナーで潰して単細胞懸濁液を得た。脾細胞を、ＭＯＧ（３５－５５）ペプチドで４４時間再刺激するか、又は再刺激せず、その後、実施例３に記載のように実施した二色ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイにおいてＩＦＮ－γ及びＩＬ－１０の産生について試験した。
図２０Ａに示すように、ＶＢ５０６２、ＶＢ５０５１又はＶＢ５０５２を投与したマウスから採取した再刺激していない脾細胞では、ＩＬ－１０の産生が検出されたが、ＩＦＮ－γの低いバックグラウンドレベルのみが観察された。脾細胞のＭＯＧ（３５－５５）再刺激の際、ＶＢ５０６２又はＶＢ５０５１群のいずれかを投与されたマウスの群では有意なＩＦＮ－γ産生は検出されなかったが、対照的に、ＶＢ５０５２を投与されたマウスの脾細胞では有意に上昇したレベルのＩＦＮ－γが検出された（図２０Ｂ）。ＶＢ５０５２に応答して観察されたＩＬ－１０レベルの増加は、実施例５に記載されるように、誘導される炎症応答を制御するための潜在的なフィードバック機構によって説明され得る。図２１に示すように、ＶＢ５０５２と比較してＶＢ５０６２では、有意に高いＩＬ－１０／ＩＦＮ－γ比が検出され、ＶＢ５０５２と比較してＶＢ５０６２の免疫抑制能が高いことが示された。
ＭＯＧ（３８－４９）四量体染色及びフローサイトメトリーを、実施例３に記載されるように行った。二色ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイでは、ＶＢ５０６２及びＶＢ５０５１について同様のＩＬ－１０レベルが検出されたが（図２０Ａ～図２０Ｂ）、更なる単細胞分析では、図２２に示されるように、ＶＢ５０６２を投与したマウスでは、ＶＢ５０５１を投与したマウスと比較して、ＣＤ４＋ＭＯＧ（３８－４９）特異的Ｆｏｘｐ３＋細胞の割合が増加した。
したがって、実施例６は、抗ＤＥＣ２０５標的化ユニットと、二量体化ユニットと、ＭＯＧ（２７－６３）を含む抗原性ユニットと、を含む第１のポリペプチドをコードし、更に免疫阻害化合物ＴＧＦβ１をコードするＶＢ５０６２の投与が、より高い抗炎症性サイトカイン対炎症性サイトカイン比（ＩＬ－１０／ＩＦＮ－γ）をもたらすことを示している。更に、ＶＢ５０６２を投与したマウスの脾細胞は、炎症誘発性バージョンのＶＢ５０５２を投与したマウスから得られた脾細胞と比較して、炎症性ＩＦＮ－γサイトカイン産生の欠如を示した。ＶＢ５０６２の投与は、ＶＢ５０５１と比較して、より高い割合のＭＯＧ（３８－４９）特異的Ｆｏｘｐ３＋細胞を誘導した。これらの結果を総合すると、ＶＢ５０６２は、その炎症誘発性バージョンであるＶＢ５０５２とは対照的に、抗炎症的に抗原単独（ＶＢ５０５１）と比較して、より大きな抗原特異的寛容原性応答を誘発できることを示している。
実施例７：
実施例６に記載されるように、ＶＢ５０６３の寛容誘導能を測定し、ＶＢ５０５２の免疫原性及びＶＢ５０５１の寛容誘導能と比較した（これらのベクターのユニット／エレメント及び説明については、表５／実施例４を参照）。
図２３Ａに示すように、ＶＢ５０６２、ＶＢ５０５１又はＶＢ５０５２を投与したマウスから採取した再刺激していない脾細胞では、ＩＬ－１０の産生が検出されたが、ＩＦＮ－γの低いバックグラウンドレベルのみが観察された。脾細胞のＭＯＧ（３５－５５）再刺激の際、ＶＢ５０６３又はＶＢ５０５１のいずれかを投与されたマウスの群では有意なＩＦＮ－γ産生は検出されなかったが、対照的に、ＶＢ５０５２を投与されたマウスの脾細胞では有意に上昇したレベルのＩＦＮ－γが検出された（図２３Ｂ）。ＶＢ５０６３を投与したマウスから採取した非刺激脾細胞及びＭＯＧ（３５－５５）再刺激脾細胞の両方において、ＶＢ５０５１を投与したマウスで検出されたレベルと比較して、有意に高いＩＬ－１０レベルが検出された。ＶＢ５０５２に応答して観察されたＩＬ－１０レベルの増加は、実施例５に記載されるように、炎症応答を制御するための潜在的なフィードバック機構によって説明され得る。図２４に示すように、ＶＢ５０５２と比較してＶＢ５０６３では有意に高いＩＬ－１０／ＩＦＮ－γ比が検出され、ＶＢ５０５２と比較してＶＢ５０６３の免疫抑制能が高いことが示された。
図２５に示すように、ＶＢ５０５１と比較して、ＶＢ５０６３に応答して、ＭＯＧ（３８－４９）特異的Ｆｏｘｐ３＋細胞のより高い割合が検出されたことから、ＶＢ５０６３投与に応答して免疫抑制性Ｔｒｅｇの生成が増加したことが示された。
更に、ＶＢ５０６３投与に応答して誘導された活発に増殖しているＴｒｅｇ細胞の割合を求めるために、ＶＢ５０６３又はＶＢ５０５１を投与したマウスから採取した脾細胞で、Ｋｉ６７（分裂細胞に厳密に関連する核マーカー）の発現を分析した。図２６に示すように、ＶＢ５０５１と比較して、ＶＢ５０６３を投与したマウスでは、Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）集団内のＫｉ６７＋細胞の割合がｅｘ ｖｉｖｏでより高く検出された。
したがって、実施例７は、抗ＤＥＣ２０５標的化ユニットと、二量体化ユニットと、ＭＯＧ（２７－６３）を含む抗原性ユニットと、を含む第１のポリペプチドをコードし、更に免疫阻害化合物ＣＴＬＡ－４をコードするＶＢ５０６３の投与が、より高い抗炎症性サイトカイン対炎症性サイトカイン比（ＩＬ－１０／ＩＦＮ－γ）をもたらすことを示している。更に、ＶＢ５０６３を投与したマウスの脾細胞は、炎症誘発性バージョンのＶＢ５０５２と比較して、炎症性ＩＦＮ－γサイトカイン産生の欠如を示した。更に、ＶＢ５０６３は、ＶＢ５０５１と比較して、ＭＯＧ（３８－４９）特異的Ｆｏｘｐ３＋及びＣＤ４＋ＣＤ５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｋｉ６７＋増殖Ｔｒｅｇ細胞の両方をより高い割合で誘導した。これらの結果を総合すると、ＶＢ５０６３は、その炎症誘発性バージョンであるＶＢ５０５２とは対照的に、抗炎症的に抗原単独（ＶＢ５０５１）と比較して、より大きな抗原特異的寛容原性応答を誘発できることを示している。
実施例８：
実施例６に記載されるように、ＶＢ５０６４の寛容誘導能を測定し、ＶＢ５０５２の免疫原性及びＶＢ５０５１の寛容誘導能と比較した（これらのベクターのユニット／エレメント及び説明については、表５／実施例４を参照）。
図２７Ａに示すように、ＶＢ５０６４、ＶＢ５０５１又はＶＢ５０５２を投与したマウスから採取した再刺激していない脾細胞では、ＩＬ－１０の産生が検出されたが、ＩＦＮ－γの低いバックグラウンドレベルのみが観察された。脾細胞のＭＯＧ（３５－５５）再刺激の際、ＶＢ５０６４又はＶＢ５０５１のいずれかを投与されたマウスの群では有意なＩＦＮ－γ産生は検出されなかったが、対照的に、ＶＢ５０５２を投与されたマウスの脾細胞では有意に上昇したレベルのＩＦＮ－γが検出された（図２７Ｂ）。ＶＢ５０５２に応答して観察されたＩＬ－１０レベルの増加は、実施例５に記載されるように、炎症応答を制御するための潜在的なフィードバック機構によって説明され得る。図２８に示すように、ＶＢ５０５２と比較してＶＢ５０６４では有意に高いＩＬ－１０／ＩＦＮ－γ比が検出され、ＶＢ５０５２と比較してＶＢ５０６４の免疫抑制能が高いことが示された。
二色ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイでは、ＶＢ５０６４とＶＢ５０５１で同様のＩＬ－１０レベルが検出されたが（図２７Ａ、図２７Ｂ）、ＶＢ５０５１と比較してＶＢ５０６４に応答して、ＭＯＧ（３８－４９）特異的Ｆｏｘｐ３＋細胞のより高い割合が検出された（図２９）。
更に、ＶＢ５０６４投与に応答して誘導された活発に増殖しているＴｒｅｇ細胞の割合を求めるために、ＶＢ５０６４又はＶＢ５０５１を投与したマウスから採取した脾細胞で、Ｋｉ６７（分裂細胞に厳密に関連する核マーカー）の発現を分析した。図３０に示すように、ＶＢ５０５１と比較して、ＶＢ５０６４を投与したマウスの脾細胞では、Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）集団内のＫｉ６７＋細胞の割合がｅｘ ｖｉｖｏでより高く検出された。
したがって、実施例８は、抗ＤＥＣ２０５標的化ユニットと、二量体化ユニットと、ＭＯＧ（２７－６３）を含む抗原性ユニットと、を含む第１のポリペプチドをコードし、更に免疫阻害化合物ＩＬ－２をコードするＶＢ５０６４の投与が、より高い抗炎症性サイトカイン対炎症性サイトカイン比（ＩＬ－１０／ＩＦＮ－γ）をもたらすことを示している。更に、ＶＢ５０６４を投与したマウスの脾細胞は、炎症誘発性バージョンのＶＢ５０５２を投与したマウスから得られた脾細胞と比較して、炎症性ＩＦＮ－γサイトカイン産生の欠如を示した。更に、ＶＢ５０６４は、ＶＢ５０５１と比較して、ＭＯＧ（３８－４９）特異的Ｆｏｘｐ３＋及びＣＤ４＋ＣＤ５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｋｉ６７＋増殖Ｔｒｅｇ細胞の両方をより高い割合で誘導した。これらの結果を総合すると、ＶＢ５０６４は、その炎症誘発性バージョンであるＶＢ５０５２とは対照的に、抗炎症的に抗原単独（ＶＢ５０５１）と比較して、より大きな抗原特異的寛容原性応答を誘発できることを示している。
実施例９
ＭＯＧ（２７－６３）をコードし、更に以下のエレメント／ユニットをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡベクターを設計及び産生した：
ＤＮＡベクターＶＢ５０４９、ＶＢ５０４４及びＶＢ５０５４は、ＭＯＧ（２７－６３）を有する抗原性ユニットを含む同じ第１のポリペプチドをコードし、表６に列挙された共発現エレメントの存在のために別個の分子として発現される以下の免疫阻害化合物を更にコードする：
・ＶＢ５０４９：ｍＩＬ－１０（ウェスタンブロット分析における対照として機能する）
・ＶＢ ５０４４：ｍＩＬ－１０及びｍＴＧＦ－β１
・ＶＢ ５０５４：ｍＩＬ－１０及びｍＴＧＦ－β１及びｍＧＭ－ＣＳＦ
ＤＮＡベクターによってコードされるタンパク質の発現及び分泌の特性評価
ＶＢ５０４４及びＶＢ５０５４によってコードされるタンパク質の発現及び分泌の特性評価を、実施例４に記載されるように行った。図３１に示すように、両方のベクターからの第１のポリペプチド／二量体タンパク質が高度に発現し、分泌された。
コードされた免疫阻害化合物ｍＩＬ－１０、ｍＴＧＦ－β１及びｍＧＭ－ＣＳＦの発現及び分泌の特性評価を、それぞれｍＩＬ－１０、ｈＴＧＦ－β１及びｍＧＭ－ＣＳＦに対する抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによって行った。結果を図３２Ａ～図３２Ｃに示すが、これは、ＶＢ５０４４又はＶＢ５０５４によってコードされる全ての免疫阻害化合物が発現及び分泌されたことを示している。ベクターＶＢ５０５４によってコードされる第３の免疫阻害化合物であるｍＧＭ－ＣＳＦでさえ、高度に発現し、分泌された（図３２Ｃ）。
ＭＯＧに対する抗体及び免疫阻害化合物ｍＩＬ－１０、ｍＴＧＦ－β１及びｍＧＭ－ＣＳＦに対する抗体をそれぞれ用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより、第１のポリペプチド／二量体タンパク質及び免疫阻害化合物が、別個のタンパク質として発現及び分泌されていることを確認した。結果は、リボソームスキッピングペプチドＴ２Ａ及びＰ２Ａが非常に有効であること、並びに全ての第１のポリペプチド／二量体タンパク質及び免疫阻害化合物が別個のタンパク質として発現及び分泌されたことを示す（図３３Ａ～図３３Ｃ）。
ウェスタンブロットによるＶＢ５０４４及びＶＢ５０５４から発現したインタクトなタンパク質の特性評価
トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清に対してウェスタンブロット（ＷＢ）分析を実施して、ＶＢ５０４４及びＶＢ５０５４によってコードされるタンパク質の特性評価を更に行った。同じ第１のポリペプチド及び免疫阻害化合物ＩＬ－１０をコードするＶＢ５０４９を対照として含めた。
ＷＢを実施例４に記載したように行った。ＰＶＤＦ膜をマウス抗ＭＯＧ（ｓｃ－７３３３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ラット抗マウスＩＬ－１０（ＭＡＢ４１７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ウサギ抗ＴＧＦβ１（ＵＳＢ１０４２７７７－Ｂｉｏｔｉｎ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）又はヤギ抗マウスＧＭ－ＣＳＦ（ＢＡＦ４１５、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でプローブして、第１のポリペプチド／二量体タンパク質、ｍＩＬ－１０、ｍＴＧＦ－β１及びｍＧＭ－ＣＳＦをそれぞれ検出した。結果を図３４Ａ～図３４Ｅに示す。
ＷＢ分析によりＥＬＩＳＡ結果が確認され、ＶＢ５０４４及びＶＢ５０５４がそれぞれ３つ及び４つのタンパク質、すなわち第１のポリペプチド／二量体タンパク質（図３４Ａ及び図３４Ｂ、還元条件及び非還元条件）並びに２つ又は３つの免疫阻害化合物、すなわちｍＩＬ－１０（図３４Ｃ）、ｍＴＧＦ－β１（図３４Ｄ）及びｍＧＭ－ＣＳＦ（図３４Ｅ）を発現していることが示された。重要なことに、抗ＩＬ－１０、抗ＴＧＦ－β１及び抗ＧＭ－ＣＳＦでプローブした膜で更なるバンドは観察されず、これは、２Ａ配列でのリボソームスキッピングが成功し、単一のＤＮＡプラスミドから第１のポリペプチドと免疫阻害化合物が別個のタンパク質として発現したことを示している。
ＥＬＩＳＡ及びＷＢのデータを総合すると、異なる２Ａペプチドを共発現エレメントとして用いることにより、標的化ユニット、二量体化ユニット及び抗原性ユニットを含むインタクトな二量体タンパク質を、いくつかの免疫阻害化合物とともにＤＮＡベクターから共発現させることができることが実証された。
実施例１０
ＭＯＧ（２７－６３）をコードし、更に以下のエレメント／ユニットをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡベクターを設計及び産生した：
ＤＮＡベクターＶＢ５０６８、ＶＢ５０６９及びＶＢ５０７０は、ＭＯＧ（２７－６３）を有する抗原性ユニットを含む第１のポリペプチドをコードし、Ｔ２Ａペプチド共発現エレメントの存在のために別個の分子として発現される免疫阻害化合物ＩＬ－１０を更にコードする。これらのベクターによってコードされる第１のポリペプチドは、異なる標的化ユニットを含む：
・ＶＢ５０６８：ｍＳＣＧＢ３Ａ２
・ＶＢ５０６９：ｍＶＳＩＧ３細胞外ドメイン
・ＶＢ５０７０：ｍＰＤ－１細胞外ドメイン
ＤＮＡベクターによってコードされるタンパク質の発現及び分泌の特性評価
ＶＢ５０６８、ＶＢ５０６９及びＶＢ５０７０によってコードされるタンパク質の発現及び分泌の特性評価を、実施例４に記載されるように行った。図３５に示すように、３つ全てのベクターからの第１のポリペプチド／二量体タンパク質は、高度に発現し、分泌された。
ＶＢ５０６８及びＶＢ５０７０によってコードされる完全長の第１のポリペプチド／二量体タンパク質の発現及び分泌を、ＭＯＧ並びにそれぞれの標的化ユニット、ｍＳＣＧＢ３Ａ２及びｍＰＤ－１に対する抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによって検証した。図３６Ａ及び図３６Ｂは、完全長タンパク質が両方のベクターから高度に発現及び分泌されたことを示す。
これらの結果を総合すると、ＤＮＡベクターＶＢ５０６８及びＶＢ５０７０でトランスフェクトした細胞は、標的化ユニット（ｍＳＣＧＢ３Ａ２又はｍＰＤ－１）、ＣＨ３含有二量体化ユニット、及びマウスＭＯＧ（２７－６３）抗原を含むタンパク質を発現及び分泌することが実証された。
ＶＢ５０６８及びＶＢ５０６９によってコードされる免疫阻害化合物ｍＩＬ－１０の分泌の特性評価を、マウスＩＬ－１０に対する抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによって行った。図３７は、ｍＩＬ－１０が両方のベクターから高度に発現及び分泌されたことを示す。
ＭＯＧ及びマウスＩＬ－１０に対する抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより、第１のポリペプチド／二量体タンパク質及び免疫阻害化合物ＩＬ－１０が別個のタンパク質として発現及び分泌されていることを確認した。結果は、リボソームスキッピングペプチドＴ２Ａが非常に有効であること、並びに第１のポリペプチド／二量体タンパク質及びｍＩＬ－１０が別個のタンパク質として発現及び分泌されたことを示す（図３８）。
ＶＢ５０６９及びＶＢ５０７０から発現したインタクトなタンパク質の特性評価
トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清に対してウェスタンブロット分析を実施して、ＤＮＡベクターＶＢ５０６９及びＶＢ５０７０によってコードされるタンパク質の特性評価を更に行った。
ウェスタンブロットを実施例４に記載したように行った。ＰＶＤＦ膜をマウス抗ＭＯＧ（ｓｃ－７３３３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でプローブし、第１のポリペプチド／二量体タンパク質を検出し、ラット抗マウスＩＬ－１０（ＭＡＢ４１７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でプローブし、免疫阻害化合物ｍＩＬ－１０を検出した。結果を図３９Ａ及び図３９Ｂに示す。
ウェスタンブロット分析によりＥＬＩＳＡ結果が確認され、ＶＢ５０６９及びＶＢ５０７０が２つのタンパク質、すなわち第１のポリペプチド（図３９Ａ、還元された上清サンプル）及びｍＩＬ－１０（図３９Ｂ）を発現することが実証された。重要なことに、抗ＩＬ－１０でプローブした膜で更なるバンドは観察されず、これは、Ｔ２Ａ配列でのリボソームスキッピングが成功し、単一のＤＮＡベクターから２つの別個のタンパク質が発現したことを示している。
本明細書に開示した前述の実施例を考慮し、ＥＬＩＳＡ及びＷＢデータを総合すると、マウスＣＤ２０５に対する特異性を有するｓｃＦｖとは異なる標的化ユニットを含むインタクトな第１のポリペプチドが、共発現エレメントとしてＴ２Ａペプチドを使用することによって、免疫阻害化合物（ｍＩＬ－１０）とともにＤＮＡベクターから共発現され得ることが実証された。
実施例１１．
実施例６に記載されるように、ＶＢ５０６８の寛容誘導能（表７参照）を測定し、ＶＢ５０５２（ＶＢ５０６８の炎症誘発性バージョン）の免疫原性及びＶＢ５０５１の寛容誘導能と比較した（これらのベクターのユニット／エレメント及び説明については、実施例４を参照）。
図４０Ａに示すように、ＶＢ５０６８、ＶＢ５０５１又はＶＢ５０５２を投与したマウスから採取した再刺激していない脾細胞では、ＩＬ－１０の産生が検出されたが、ＩＦＮ－γの低いバックグラウンドレベルのみが観察された。脾細胞のＭＯＧ（３５－５５）再刺激の際、ＶＢ５０６８又はＶＢ５０５１を投与されたマウスの群ではＩＦＮ－γ産生は検出されなかったが、対照的に、ＶＢ５０５２を投与されたマウスの脾細胞では有意に上昇したレベルのＩＦＮ－γが検出された（図４０Ｂ）。ＶＢ５０５２に応答して観察されたＩＬ－１０レベルの増加は、実施例５に記載されるように、炎症応答を制御するための潜在的なフィードバック機構によって説明され得る。
二色ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイでは、ＶＢ５０６８又はＶＢ５０５１のいずれかを投与されたマウスの脾細胞において同様のＩＬ－１０レベルが検出されたが（図４０Ａ／Ｂ）、フローサイトメトリーでは、ＶＢ５０５１と比較してＶＢ５０６８に応答して、ＭＯＧ（３８－４９）特異的Ｆｏｘｐ３＋細胞のより高い割合が検出された（図４１）。
ＶＢ５０６８に応答して検出された、Ｔｒｅｇを示すＭＯＧ（３８－４９）特異的Ｆｏｘｐ３＋細胞に観察されたより高い割合（図４１）は、Ｔｒｅｇを同定するための更なる表現型マーカーであるＣＤ２５を含めることによって検証及び確認された。ＶＢ５０６８を投与したマウスから採取し、フローサイトメトリーによって分析した脾細胞は、ＶＢ５０５１又はＶＢ５０５２のいずれかを投与したマウスの脾臓において検出されたレベルと比較して、より高いレベルのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ＭＯＧ（３８－４９）－ｔｅｔ＋Ｔｒｅｇを示した（図４２）。
更に、ＶＢ５０６４投与に応答して誘導された活発に増殖しているＴｒｅｇ細胞の割合を求めるために、ＶＢ５０６８又はＶＢ５０５１を投与したマウスから採取した脾細胞で、Ｋｉ６７（分裂細胞に厳密に関連する核マーカー）の発現を分析した。図４３に示すように、ＶＢ５０５１及びＶＢ５０５２と比較して、ＶＢ５０６８を投与したマウスでは、Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）集団内のＫｉ６７＋細胞の割合がｅｘ ｖｉｖｏでより高く検出された。
ＶＢ５０６８の投与後にｅｘ ｖｉｖｏで誘導及び検出されたＴｒｅｇの割合（図４１及び図４２）を評価及び確認するために、脾細胞のＭＯＧ（３５－５５）再刺激後のＴｒｅｇの誘導も評価した。ＶＢ５０６８、ＶＢ５０５１又はＶＢ５０５２を投与したマウスの脾細胞を、ＭＯＧ（３５－５５）ペプチドで１６時間再刺激し、更なる実験においてフローサイトメトリーによって解析した。図４４に示されるように、ＶＢ５０５１又はＶＢ５０５２のいずれかを投与したマウスの脾臓において検出されたものと比較して、ＶＢ５０６８を投与されたマウスから採取された脾細胞において、より高い割合のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇが検出された。
実施例１１は、ＳＣＧＢ３Ａ２標的化ユニットと、二量体化ユニットと、ＭＯＧ（２７－６３）を含む抗原性ユニットと、を含む第１のポリペプチドをコードし、更に免疫阻害化合物ＩＬ－１０をコードするＶＢ５０６８をマウスに投与することが、より高い抗炎症性サイトカイン対炎症性サイトカイン比（ＩＬ－１０／ＩＦＮ－γ）をもたらすことを示している。更に、ＶＢ５０６８を投与したマウスの脾細胞は、炎症誘発性バージョンのＶＢ５０５２を投与したマウスからの脾細胞と比較して、炎症性ＩＦＮ－γサイトカイン産生の欠如を示した。更に、ＶＢ５０６８は、ＶＢ５０５１及びＶＢ５０５２の両方と比較して、ＭＯＧ（３８－４９）特異的Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ及びＣＤ４＋ＣＤ５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｋｉ６７＋増殖Ｔｒｅｇ細胞の両方をより高い割合で誘導した。これらの結果を総合すると、ＶＢ５０６４は、その炎症誘発性バージョンであるＶＢ５０５２とは対照的に、抗炎症的に抗原単独（ＶＢ５０５１）と比較して、より大きな抗原特異的寛容原性応答を誘発できることを示している。更に、実施例１１に提示されるデータは、本発明のベクターの汎用性を示し、種々の標的化ユニット（抗ＣＤ２０５及びＳＣＧＢ３Ａ２標的化ユニット）により、抗原性ユニットに含まれる抗原のＡＰＣへの寛容原性様式での標的化を可能にすることを実証している。
実施例１２
Ｍｅｔａｐｅｎａｅｕｓ ｅｎｓｉｓ種由来のエビアレルゲンであるトロポミオシンのＴ細胞エピトープをコードし、更に以下のエレメント／ユニットをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを設計及び産生した：
トロポミオシンは、甲殻類における主要なアレルゲンである。Ｍｅｔ ｅ １過敏性のＢａｌｂ／ｃマウスモデルにおいて、エビ種Ｍｅｔａｐｅｎａｅｕｓ ｅｎｓｉｓ由来のトロポミオシン（Ｍｅｔ ｅ １アレルゲン）について、６つの主要なＴ細胞エピトープが同定された。６つのＴ細胞エピトープのペプチドによる経口免疫療法は、エビトロポミオシンに対するアレルギー応答を効果的に減少させた（Ｗａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ ２０（１８），４６５６，２０１５）。
ＤＮＡベクターＶＢ５０７６は、Ｍｅｔ ｅ １由来のＴ細胞エピトープを含む抗原性ユニットを含む第１のポリペプチドをコードする。６つのＴ細胞エピトープ（（２４１－２６０）、（２１０－２３０）、（１３６－１５５）、（７６－９５）、（４６－６５）、及び（１６－３５））は、Ｔ細胞エピトープリンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳによって互いに分離されている。ＶＢ５０７６は、免疫阻害化合物ｍＩＬ１０を更にコードする。
ＤＮＡベクターＶＢ５０７６によってコードされるタンパク質の発現及び分泌の特性評価
ＶＢ５０７６によってコードされるタンパク質の発現及び分泌の特性評価を、実施例４に記載されるように行った。図４５に示すように、ＶＢ５０７６由来の第１のポリペプチド／二量体タンパク質は、高レベルで発現及び分泌された。
ＶＢ５０７６によってコードされる免疫阻害化合物ｍＩＬ－１０の分泌の特性評価を、マウスＩＬ－１０に対する抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによって行った。図４６は、ｍＩＬ－１０がＶＢ５０７６から高度に発現及び分泌されたことを示す。
ＶＢ５０７６から発現したインタクトなタンパク質の特性評価
トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清に対してウェスタンブロット分析を実施して、ＶＢ５０７６によってコードされるタンパク質の特性評価を更に行った。ＶＢ５０７６によって発現される第１のポリペプチド／二量体タンパク質に対する市販の抗体で、ウェスタンブロッティングに適合するものは同定できなかった。したがって、免疫阻害化合物ｍＩＬ－１０のみを検出することができた。
ウェスタンブロットを実施例４に記載したように行った。ＰＶＤＦ膜をラット抗マウスＩＬ－１０（ＭＡＢ４１７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でプローブして、免疫阻害化合物ｍＩＬ－１０を検出した。結果を図４７に示す。
抗ＩＬ－１０でプローブした膜では、ＩＬ－１０の予想される分子量の主要なバンドが１つ観察され、Ｔ２Ａ配列でのリボソームスキッピングが成功し、ＶＢ５０７６とは別個の分子としてｍＩＬ１０が発現したことが示された。
ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロットのデータを総合すると、Ｔ２Ａペプチドを共発現エレメントとして用いることにより、いくつかのＴ細胞エピトープを有する抗原性ユニットを含む第１のポリペプチド／二量体タンパク質を、別のタンパク質（免疫阻害化合物）とともにＤＮＡプラスミドから共発現させることができることが実証された。
配列の概要
配列番号１
ヒトＩｇＧ３由来のヒンジ領域１（アミノ酸１～１２）、ヒトＩｇＧ３由来のヒンジ領域４（アミノ酸１３～２７）、グリシン－セリンリンカー（アミノ酸２８～３７）、ヒトＩｇＧ３由来のＣＨ３ドメイン（アミノ酸３８～１４４）からなる二量体化ユニットの実施形態のアミノ酸配列
ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２
ｍＩｇ ＶＨのシグナルペプチド
ＭＮＦＧＬＲＬＩＦＬＶＬＴＬＫＧＶＱＣ
配列番号３
ＶＢ５０４９＊のアミノ酸配列
アミノ酸１～１９：マウス免疫グロブリン重鎖シグナルペプチド；アミノ酸２０～２６５：マウス単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗ＤＥＣ２０５；アミノ酸２６６～４０９：二量体化ユニット（配列番号１）：ヒトＩｇＧ３由来のヒンジ領域１、ヒトＩｇＧ３由来のヒンジ領域４、グリシン－セリンリンカー、ヒトＩｇＧ３由来のＣＨ３ドメイン；アミノ酸４１０～４１４：ユニットリンカー；アミノ酸４１５～４５１マウスＭＯＧ ２７－６３（ＭＯＧ ３５－５５下線）、アミノ酸４５２～４５４：リンカー；アミノ酸４５５～４７２共発現エレメントＴ２Ａペプチド；アミノ酸４７３～４９０：シグナルペプチドマウスＩＬ－１０、天然のリーダー配列；アミノ酸４９１～６５０：マウスＩＬ－１０
配列番号４
ＶＢ５０５２＊のアミノ酸配列
アミノ酸１～２３：シグナルペプチドヒトＣＣＬ３Ｌ１；アミノ酸２４～９３：ヒトＣＣＬ３Ｌ１；。アミノ酸９４～２３７：二量体化ユニット（配列番号１）：ヒトＩｇＧ３由来のヒンジ領域１、ヒトＩｇＧ３由来のヒンジ領域４、グリシン－セリンリンカー、ヒトＩｇＧ３由来のＣＨ３ドメイン；アミノ酸２３８～２４２：ユニットリンカー；アミノ酸２４３～２７９：マウスＭＯＧ ２７－６３（ＭＯＧ ３５－５５下線）
配列番号５
ＶＢ５０５１＊のアミノ酸配列
アミノ酸１～１９：マウス免疫グロブリン重鎖シグナルペプチド；アミノ酸２０～５６：マウスＭＯＧ ２７－６３（ＭＯＧ ３５－５５下線）。
配列番号６
Ｔ２Ａ
ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ
配列番号７
Ｐ２Ａ
ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ
配列番号８
Ｅ２Ａ
ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ
配列番号９
Ｆ２Ａ
ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ
配列番号１０
配列番号１のアミノ酸１～２７をコードするヌクレオチド配列
ＧＡＧＣＴＣＡＡＡＡＣＣＣＣＡＣＴＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡ
配列番号１１：
配列番号１のアミノ酸３８～１４４をコードするヌクレオチド配列
ＧＧＡＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＡＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＧＣＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡ
配列番号１２：
配列番号１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
ＧＡＧＣＴＣＡＡＡＡＣＣＣＣＡＣＴＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＴＧＧＡＡＧＣＡＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＡＡＧＴＧＧＡＧＧＡＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＡＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＧＣＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡ
配列番号１３
シグナルペプチドｈＣＣＬ３Ｌ１
ＭＱＶＳＴＡＡＬＡＶＬＬＣＴＭＡＬＣＮＱＶＬＳ
配列番号１４
ｈＣＣＬ３Ｌ１
ＡＰＬＡＡＤＴＰＴＡＣＣＦＳＹＴＳＲＱＩＰＱＮＦＩＡＤＹＦＥＴＳＳＱＣＳＫＰＳＶＩＦＬＴＫＲＧＲＱＶＣＡＤＰＳＥＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥＬＳＡ
配列番号１５
マウスＣＤ２０５に対する特異性を有するｓｃＦｖ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＦＬＳＴＳＬＧＮＳＩＴＩＴＣＨＡＳＱＮＩＫＧＷＬＡＷＹＱＱＫＳＧＮＡＰＱＬＬＩＹＫＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＩＦＴＩＳＮＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＨＹＱＳＦＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＬＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＫＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＤＦＹＭＮＷＩＲＱＰＰＧＱＡＰＥＷＬＧＶＩＲＮＫＧＮＧＹＴＴＥＶＮＴＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＱＮＩＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＩＹＹＣＡＲＧＧＰＹＹＹＳＧＤＤＡＰＹＷＧＱＧＶＭＶＴＶＳＳ
配列番号１６
ＭＯＧ（２７－６３）＊
ＳＰＧＫＮＡＴＧＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫＤＱＤＡＥＡＱＰ
配列番号１７
シグナルペプチドｍＩＬ－１０
ＭＰＧＳＡＬＬＣＣＬＬＬＬＴＧＭＲＩ
配列番号１８
ｍＩＬ－１０
ＳＲＧＱＹＳＲＥＤＮＮＣＴＨＦＰＶＧＱＳＨＭＬＬＥＬＲＴＡＦＳＱＶＫＴＦＦＱＴＫＤＱＬＤＮＩＬＬＴＤＳＬＭＱＤＦＫＧＹＬＧＣＱＡＬＳＥＭＩＱＦＹＬＶＥＶＭＰＱＡＥＫＨＧＰＥＩＫＥＨＬＮＳＬＧＥＫＬＫＴＬＲＭＲＬＲＲＣＨＲＦＬＰＣＥＮＫＳＫＡＶＥＱＶＫＳＤＦＮＫＬＱＤＱＧＶＹＫＡＭＮＥＦＤＩＦＩＮＣＩＥＡＹＭＭＩＫＭＫＳ
配列番号１９
ＭＯＧ（２７－６３）
ＳＰＧＫＮＡＴＧＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫＤＱＤＡＥＱＡＰ
配列番号２０
ＶＢ５０６２
ＭＮＦＧＬＲＬＩＦＬＶＬＴＬＫＧＶＱＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＦＬＳＴＳＬＧＮＳＩＴＩＴＣＨＡＳＱＮＩＫＧＷＬＡＷＹＱＱＫＳＧＮＡＰＱＬＬＩＹＫＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＩＦＴＩＳＮＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＨＹＱＳＦＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＬＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＫＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＤＦＹＭＮＷＩＲＱＰＰＧＱＡＰＥＷＬＧＶＩＲＮＫＧＮＧＹＴＴＥＶＮＴＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＱＮＩＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＩＹＹＣＡＲＧＧＰＹＹＹＳＧＤＤＡＰＹＷＧＱＧＶＭＶＴＶＳＳＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬＳＰＧＫＮＡＴＧＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫＤＱＤＡＥＱＡＰＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＰＰＳＧＬＲＬＬＰＬＬＬＰＬＰＷＬＬＶＬＴＰＧＲＰＡＡＧＬＳＴＣＫＴＩＤＭＥＬＶＫＲＫＲＩＥＡＩＲＧＱＩＬＳＫＬＲＬＡＳＰＰＳＱＧＥＶＰＰＧＰＬＰＥＡＶＬＡＬＹＮＳＴＲＤＲＶＡＧＥＳＡＤＰＥＰＥＰＥＡＤＹＹＡＫＥＶＴＲＶＬＭＶＤＲＮＮＡＩＹＥＫＴＫＤＩＳＨＳＩＹＭＦＦＮＴＳＤＩＲＥＡＶＰＥＰＰＬＬＳＲＡＥＬＲＬＱＲＬＫＳＳＶＥＱＨＶＥＬＹＱＫＹＳＮＮＳＷＲＹＬＧＮＲＬＬＴＰＴＤＴＰＥＷＬＳＦＤＶＴＧＶＶＲＱＷＬＮＱＧＤＧＩＱＧＦＲＦＳＡＨＣＳＣＤＳＫＤＮＫＬＨＶＥＩＮＧＩＳＰＫＲＲＧＤＬＧＴＩＨＤＭＮＲＰＦＬＬＬＭＡＴＰＬＥＲＡＱＨＬＨＳＳＲＨＲＲＡＬＤＴＮＹＣＦＳＳＴＥＫＮＣＣＶＲＱＬＹＩＤＦＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨＡＮＦＣＬＧＰＣＰＹＩＷＳＬＤＴＱＹＳＫＶＬＡＬＹＮＱＨＮＰＧＡＳＡＳＰＣＣＶＰＱＡＬＥＰＬＰＩＶＹＹＶＧＲＫＰＫＶＥＱＬＳＮＭＩＶＲＳＣＫＣＳ
配列番号２１
ＶＢ５０６３
ＭＮＦＧＬＲＬＩＦＬＶＬＴＬＫＧＶＱＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＦＬＳＴＳＬＧＮＳＩＴＩＴＣＨＡＳＱＮＩＫＧＷＬＡＷＹＱＱＫＳＧＮＡＰＱＬＬＩＹＫＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＩＦＴＩＳＮＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＨＹＱＳＦＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＬＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＫＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＤＦＹＭＮＷＩＲＱＰＰＧＱＡＰＥＷＬＧＶＩＲＮＫＧＮＧＹＴＴＥＶＮＴＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＱＮＩＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＩＹＹＣＡＲＧＧＰＹＹＹＳＧＤＤＡＰＹＷＧＱＧＶＭＶＴＶＳＳＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬＳＰＧＫＮＡＴＧＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫＤＱＤＡＥＱＡＰＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＡＣＬＧＬＲＲＹＫＡＱＬＱＬＰＳＲＴＷＰＦＶＡＬＬＴＬＬＦＩＰＶＦＳＥＡＩＱＶＴＱＰＳＶＶＬＡＳＳＨＧＶＡＳＦＰＣＥＹＳＰＳＨＮＴＤＥＶＲＶＴＶＬＲＱＴＮＤＱＭＴＥＶＣＡＴＴＦＴＥＫＮＴＶＧＦＬＤＹＰＦＣＳＧＴＦＮＥＳＲＶＮＬＴＩＱＧＬＲＡＶＤＴＧＬＹＬＣＫＶＥＬＭＹＰＰＰＹＦＶＧＭＧＮＧＴＱＩＹＶＩＤＰＥＰＣＰＤＳＤ
配列番号２２
ＶＢ５０６４
ＭＮＦＧＬＲＬＩＦＬＶＬＴＬＫＧＶＱＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＦＬＳＴＳＬＧＮＳＩＴＩＴＣＨＡＳＱＮＩＫＧＷＬＡＷＹＱＱＫＳＧＮＡＰＱＬＬＩＹＫＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＩＦＴＩＳＮＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＨＹＱＳＦＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＬＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＫＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＤＦＹＭＮＷＩＲＱＰＰＧＱＡＰＥＷＬＧＶＩＲＮＫＧＮＧＹＴＴＥＶＮＴＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＱＮＩＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＩＹＹＣＡＲＧＧＰＹＹＹＳＧＤＤＡＰＹＷＧＱＧＶＭＶＴＶＳＳＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬＭＹＳＭＱＬＡＳＣＶＴＬＴＬＶＬＬＶＮＳＡＰＴＳＳＳＴＳＳＳＴＡＥＡＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱＨＬＥＱＬＬＭＤＬＱＥＬＬＳＲＭＥＮＹＲＮＬＫＬＰＲＭＬＴＦＫＦＹＬＰＫＱＡＴＥＬＫＤＬＱＣＬＥＤＥＬＧＰＬＲＨＶＬＤＬＴＱＳＫＳＦＱＬＥＤＡＥＮＦＩＳＮＩＲＶＴＶＶＫＬＫＧＳＤＮＴＦＥＣＱＦＤＤＥＳＡＴＶＶＤＦＬＲＲＷＩＡＦＣＱＳＩＩＳＴＳＰＱ
配列番号２３
ＶＢ５０６５
ＭＮＦＧＬＲＬＩＦＬＶＬＴＬＫＧＶＱＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＦＬＳＴＳＬＧＮＳＩＴＩＴＣＨＡＳＱＮＩＫＧＷＬＡＷＹＱＱＫＳＧＮＡＰＱＬＬＩＹＫＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＩＦＴＩＳＮＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＨＹＱＳＦＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＬＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＫＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＤＦＹＭＮＷＩＲＱＰＰＧＱＡＰＥＷＬＧＶＩＲＮＫＧＮＧＹＴＴＥＶＮＴＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＱＮＩＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＩＹＹＣＡＲＧＧＰＹＹＹＳＧＤＤＡＰＹＷＧＱＧＶＭＶＴＶＳＳＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬＭＮＡＴＨＣＩＬＡＬＱＬＦＬＭＡＶＳＧＣＹＣＨＧＴＶＩＥＳＬＥＳＬＮＮＹＦＮＳＳＧＩＤＶＥＥＫＳＬＦＬＤＩＷＲＮＷＱＫＤＧＤＭＫＩＬＱＳＱＩＩＳＦＹＬＲＬＦＥＶＬＫＤＮＱＡＩＳＮＮＩＳＶＩＥＳＨＬＩＴＴＦＦＳＮＳＫＡＫＫＤＡＦＭＳＩＡＫＦＥＶＮＮＰＱＶＱＲＱＡＦＮＥＬＩＲＶＶＨＱＬＬＰＥＳＳＬＲＫＲＫＲＳＲＣ
配列番号２４
シグナルペプチドｍＴＧＦ－β１
ＭＰＰＳＧＬＲＬＬＰＬＬＬＰＬＰＷＬＬＶＬＴＰＧＲＰＡＡＧ
配列番号２５
ｍＴＧＦ－β１
ＬＳＴＣＫＴＩＤＭＥＬＶＫＲＫＲＩＥＡＩＲＧＱＩＬＳＫＬＲＬＡＳＰＰＳＱＧＥＶＰＰＧＰＬＰＥＡＶＬＡＬＹＮＳＴＲＤＲＶＡＧＥＳＡＤＰＥＰＥＰＥＡＤＹＹＡＫＥＶＴＲＶＬＭＶＤＲＮＮＡＩＹＥＫＴＫＤＩＳＨＳＩＹＭＦＦＮＴＳＤＩＲＥＡＶＰＥＰＰＬＬＳＲＡＥＬＲＬＱＲＬＫＳＳＶＥＱＨＶＥＬＹＱＫＹＳＮＮＳＷＲＹＬＧＮＲＬＬＴＰＴＤＴＰＥＷＬＳＦＤＶＴＧＶＶＲＱＷＬＮＱＧＤＧＩＱＧＦＲＦＳＡＨＣＳＣＤＳＫＤＮＫＬＨＶＥＩＮＧＩＳＰＫＲＲＧＤＬＧＴＩＨＤＭＮＲＰＦＬＬＬＭＡＴＰＬＥＲＡＱＨＬＨＳＳＲＨＲＲＡＬＤＴＮＹＣＦＳＳＴＥＫＮＣＣＶＲＱＬＹＩＤＦＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨＡＮＦＣＬＧＰＣＰＹＩＷＳＬＤＴＱＹＳＫＶＬＡＬＹＮＱＨＮＰＧＡＳＡＳＰＣＣＶＰＱＡＬＥＰＬＰＩＶＹＹＶＧＲＫＰＫＶＥＱＬＳＮＭＩＶＲＳＣＫＣＳ
配列番号２６
シグナルペプチドｍＣＬＴＡ－４
ＭＡＣＬＧＬＲＲＹＫＡＱＬＱＬＰＳＲＴＷＰＦＶＡＬＬＴＬＬＦＩＰＶＦＳ
配列番号２７
ｍＣＬＴＡ－４
ＥＡＩＱＶＴＱＰＳＶＶＬＡＳＳＨＧＶＡＳＦＰＣＥＹＳＰＳＨＮＴＤＥＶＲＶＴＶＬＲＱＴＮＤＱＭＴＥＶＣＡＴＴＦＴＥＫＮＴＶＧＦＬＤＹＰＦＣＳＧＴＦＮＥＳＲＶＮＬＴＩＱＧＬＲＡＶＤＴＧＬＹＬＣＫＶＥＬＭＹＰＰＰＹＦＶＧＭＧＮＧＴＱＩＹＶＩＤＰＥＰＣＰＤＳＤ
配列番号２８
シグナルペプチドｍＩＬ－２
ＭＹＳＭＱＬＡＳＣＶＴＬＴＬＶＬＬＶＮＳ
配列番号２９
ｍＩＬ－２
ＡＰＴＳＳＳＴＳＳＳＴＡＥＡＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱＨＬＥＱＬＬＭＤＬＱＥＬＬＳＲＭＥＮＹＲＮＬＫＬＰＲＭＬＴＦＫＦＹＬＰＫＱＡＴＥＬＫＤＬＱＣＬＥＤＥＬＧＰＬＲＨＶＬＤＬＴＱＳＫＳＦＱＬＥＤＡＥＮＦＩＳＮＩＲＶＴＶＶＫＬＫＧＳＤＮＴＦＥＣＱＦＤＤＥＳＡＴＶＶＤＦＬＲＲＷＩＡＦＣＱＳＩＩＳＴＳＰＱ
配列番号３０
シグナルペプチドｍＩＦＮ－γ
ＭＮＡＴＨＣＩＬＡＬＱＬＦＬＭＡＶＳＧＣＹＣ
配列番号３１
ｍＩＦＮ－γ
ＨＧＴＶＩＥＳＬＥＳＬＮＮＹＦＮＳＳＧＩＤＶＥＥＫＳＬＦＬＤＩＷＲＮＷＱＫＤＧＤＭＫＩＬＱＳＱＩＩＳＦＹＬＲＬＦＥＶＬＫＤＮＱＡＩＳＮＮＩＳＶＩＥＳＨＬＩＴＴＦＦＳＮＳＫＡＫＫＤＡＦＭＳＩＡＫＦＥＶＮＮＰＱＶＱＲＱＡＦＮＥＬＩＲＶＶＨＱＬＬＰＥＳＳＬＲＫＲＫＲＳＲＣ
配列番号３２
ＶＢ５０４９
ＭＮＦＧＬＲＬＩＦＬＶＬＴＬＫＧＶＱＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＦＬＳＴＳＬＧＮＳＩＴＩＴＣＨＡＳＱＮＩＫＧＷＬＡＷＹＱＱＫＳＧＮＡＰＱＬＬＩＹＫＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＩＦＴＩＳＮＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＨＹＱＳＦＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＬＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＫＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＤＦＹＭＮＷＩＲＱＰＰＧＱＡＰＥＷＬＧＶＩＲＮＫＧＮＧＹＴＴＥＶＮＴＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＱＮＩＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＩＹＹＣＡＲＧＧＰＹＹＹＳＧＤＤＡＰＹＷＧＱＧＶＭＶＴＶＳＳＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬＳＰＧＫＮＡＴＧＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫＤＱＤＡＥＱＡＰＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＰＧＳＡＬＬＣＣＬＬＬＬＴＧＭＲＩＳＲＧＱＹＳＲＥＤＮＮＣＴＨＦＰＶＧＱＳＨＭＬＬＥＬＲＴＡＦＳＱＶＫＴＦＦＱＴＫＤＱＬＤＮＩＬＬＴＤＳＬＭＱＤＦＫＧＹＬＧＣＱＡＬＳＥＭＩＱＦＹＬＶＥＶＭＰＱＡＥＫＨＧＰＥＩＫＥＨＬＮＳＬＧＥＫＬＫＴＬＲＭＲＬＲＲＣＨＲＦＬＰＣＥＮＫＳＫＡＶＥＱＶＫＳＤＦＮＫＬＱＤＱＧＶＹＫＡＭＮＥＦＤＩＦＩＮＣＩＥＡＹＭＭＩＫＭＫＳ
配列番号３３
ＶＢ５０５２
ＭＱＶＳＴＡＡＬＡＶＬＬＣＴＭＡＬＣＮＱＶＬＳＡＰＬＡＡＤＴＰＴＡＣＣＦＳＹＴＳＲＱＩＰＱＮＦＩＡＤＹＦＥＴＳＳＱＣＳＫＰＳＶＩＦＬＴＫＲＧＲＱＶＣＡＤＰＳＥＥＷＡＶＱＫＹＶＳＤＬＥＬＳＡＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬＳＰＧＫＮＡＴＧＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫＤＱＤＡＥＱＡＰ
配列番号３４
ＶＢ５０５１
ＭＮＦＧＬＲＬＩＦＬＶＬＴＬＫＧＶＱＣＳＰＧＫＮＡＴＧＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫＤＱＤＡＥＱＡＰ
配列番号３５
ＶＢ５０４８
ＭＮＦＧＬＲＬＩＦＬＶＬＴＬＫＧＶＱＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＦＬＳＴＳＬＧＮＳＩＴＩＴＣＨＡＳＱＮＩＫＧＷＬＡＷＹＱＱＫＳＧＮＡＰＱＬＬＩＹＫＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＩＦＴＩＳＮＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＨＹＱＳＦＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＬＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＫＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＤＦＹＭＮＷＩＲＱＰＰＧＱＡＰＥＷＬＧＶＩＲＮＫＧＮＧＹＴＴＥＶＮＴＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＱＮＩＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＩＹＹＣＡＲＧＧＰＹＹＹＳＧＤＤＡＰＹＷＧＱＧＶＭＶＴＶＳＳＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬＳＰＧＫＮＡＴＧＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫＤＱＤＡＥＱＡＰ
配列番号３６
ＶＢ５０４４
ＭＮＦＧＬＲＬＩＦＬＶＬＴＬＫＧＶＱＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＦＬＳＴＳＬＧＮＳＩＴＩＴＣＨＡＳＱＮＩＫＧＷＬＡＷＹＱＱＫＳＧＮＡＰＱＬＬＩＹＫＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＩＦＴＩＳＮＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＨＹＱＳＦＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＬＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＫＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＤＦＹＭＮＷＩＲＱＰＰＧＱＡＰＥＷＬＧＶＩＲＮＫＧＮＧＹＴＴＥＶＮＴＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＱＮＩＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＩＹＹＣＡＲＧＧＰＹＹＹＳＧＤＤＡＰＹＷＧＱＧＶＭＶＴＶＳＳＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬＳＰＧＫＮＡＴＧＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫＤＱＤＡＥＱＡＰＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＰＧＳＡＬＬＣＣＬＬＬＬＴＧＭＲＩＳＲＧＱＹＳＲＥＤＮＮＣＴＨＦＰＶＧＱＳＨＭＬＬＥＬＲＴＡＦＳＱＶＫＴＦＦＱＴＫＤＱＬＤＮＩＬＬＴＤＳＬＭＱＤＦＫＧＹＬＧＣＱＡＬＳＥＭＩＱＦＹＬＶＥＶＭＰＱＡＥＫＨＧＰＥＩＫＥＨＬＮＳＬＧＥＫＬＫＴＬＲＭＲＬＲＲＣＨＲＦＬＰＣＥＮＫＳＫＡＶＥＱＶＫＳＤＦＮＫＬＱＤＱＧＶＹＫＡＭＮＥＦＤＩＦＩＮＣＩＥＡＹＭＭＩＫＭＫＳＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＰＰＳＧＬＲＬＬＰＬＬＬＰＬＰＷＬＬＶＬＴＰＧＲＰＡＡＧＬＳＴＣＫＴＩＤＭＥＬＶＫＲＫＲＩＥＡＩＲＧＱＩＬＳＫＬＲＬＡＳＰＰＳＱＧＥＶＰＰＧＰＬＰＥＡＶＬＡＬＹＮＳＴＲＤＲＶＡＧＥＳＡＤＰＥＰＥＰＥＡＤＹＹＡＫＥＶＴＲＶＬＭＶＤＲＮＮＡＩＹＥＫＴＫＤＩＳＨＳＩＹＭＦＦＮＴＳＤＩＲＥＡＶＰＥＰＰＬＬＳＲＡＥＬＲＬＱＲＬＫＳＳＶＥＱＨＶＥＬＹＱＫＹＳＮＮＳＷＲＹＬＧＮＲＬＬＴＰＴＤＴＰＥＷＬＳＦＤＶＴＧＶＶＲＱＷＬＮＱＧＤＧＩＱＧＦＲＦＳＡＨＣＳＣＤＳＫＤＮＫＬＨＶＥＩＮＧＩＳＰＫＲＲＧＤＬＧＴＩＨＤＭＮＲＰＦＬＬＬＭＡＴＰＬＥＲＡＱＨＬＨＳＳＲＨＲＲＡＬＤＴＮＹＣＦＳＳＴＥＫＮＣＣＶＲＱＬＹＩＤＦＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨＡＮＦＣＬＧＰＣＰＹＩＷＳＬＤＴＱＹＳＫＶＬＡＬＹＮＱＨＮＰＧＡＳＡＳＰＣＣＶＰＱＡＬＥＰＬＰＩＶＹＹＶＧＲＫＰＫＶＥＱＬＳＮＭＩＶＲＳＣＫＣＳ
配列番号３７
ＶＢ５０５４
ＭＮＦＧＬＲＬＩＦＬＶＬＴＬＫＧＶＱＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＦＬＳＴＳＬＧＮＳＩＴＩＴＣＨＡＳＱＮＩＫＧＷＬＡＷＹＱＱＫＳＧＮＡＰＱＬＬＩＹＫＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＩＦＴＩＳＮＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＨＹＱＳＦＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＬＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＫＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＤＦＹＭＮＷＩＲＱＰＰＧＱＡＰＥＷＬＧＶＩＲＮＫＧＮＧＹＴＴＥＶＮＴＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＱＮＩＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＩＹＹＣＡＲＧＧＰＹＹＹＳＧＤＤＡＰＹＷＧＱＧＶＭＶＴＶＳＳＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬＳＰＧＫＮＡＴＧＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫＤＱＤＡＥＱＡＰＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＰＧＳＡＬＬＣＣＬＬＬＬＴＧＭＲＩＳＲＧＱＹＳＲＥＤＮＮＣＴＨＦＰＶＧＱＳＨＭＬＬＥＬＲＴＡＦＳＱＶＫＴＦＦＱＴＫＤＱＬＤＮＩＬＬＴＤＳＬＭＱＤＦＫＧＹＬＧＣＱＡＬＳＥＭＩＱＦＹＬＶＥＶＭＰＱＡＥＫＨＧＰＥＩＫＥＨＬＮＳＬＧＥＫＬＫＴＬＲＭＲＬＲＲＣＨＲＦＬＰＣＥＮＫＳＫＡＶＥＱＶＫＳＤＦＮＫＬＱＤＱＧＶＹＫＡＭＮＥＦＤＩＦＩＮＣＩＥＡＹＭＭＩＫＭＫＳＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＰＰＳＧＬＲＬＬＰＬＬＬＰＬＰＷＬＬＶＬＴＰＧＲＰＡＡＧＬＳＴＣＫＴＩＤＭＥＬＶＫＲＫＲＩＥＡＩＲＧＱＩＬＳＫＬＲＬＡＳＰＰＳＱＧＥＶＰＰＧＰＬＰＥＡＶＬＡＬＹＮＳＴＲＤＲＶＡＧＥＳＡＤＰＥＰＥＰＥＡＤＹＹＡＫＥＶＴＲＶＬＭＶＤＲＮＮＡＩＹＥＫＴＫＤＩＳＨＳＩＹＭＦＦＮＴＳＤＩＲＥＡＶＰＥＰＰＬＬＳＲＡＥＬＲＬＱＲＬＫＳＳＶＥＱＨＶＥＬＹＱＫＹＳＮＮＳＷＲＹＬＧＮＲＬＬＴＰＴＤＴＰＥＷＬＳＦＤＶＴＧＶＶＲＱＷＬＮＱＧＤＧＩＱＧＦＲＦＳＡＨＣＳＣＤＳＫＤＮＫＬＨＶＥＩＮＧＩＳＰＫＲＲＧＤＬＧＴＩＨＤＭＮＲＰＦＬＬＬＭＡＴＰＬＥＲＡＱＨＬＨＳＳＲＨＲＲＡＬＤＴＮＹＣＦＳＳＴＥＫＮＣＣＶＲＱＬＹＩＤＦＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨＡＮＦＣＬＧＰＣＰＹＩＷＳＬＤＴＱＹＳＫＶＬＡＬＹＮＱＨＮＰＧＡＳＡＳＰＣＣＶＰＱＡＬＥＰＬＰＩＶＹＹＶＧＲＫＰＫＶＥＱＬＳＮＭＩＶＲＳＣＫＣＳＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＷＬＱＮＬＬＦＬＧＩＶＶＹＳＬＳＡＰＴＲＳＰＩＴＶＴＲＰＷＫＨＶＥＡＩＫＥＡＬＮＬＬＤＤＭＰＶＴＬＮＥＥＶＥＶＶＳＮＥＦＳＦＫＫＬＴＣＶＱＴＲＬＫＩＦＥＱＧＬＲＧＮＦＴＫＬＫＧＡＬＮＭＴＡＳＹＹＱＴＹＣＰＰＴＰＥＴＤＣＥＴＱＶＴＴＹＡＤＦＩＤＳＬＫＴＦＬＴＤＩＰＦＥＣＫＫＰＶＱＫ
配列番号３８
シグナルペプチドｍＧＭ－ＣＳＦ
ＭＷＬＱＮＬＬＦＬＧＩＶＶＹＳＬＳ
配列番号３９
ｍＧＭ－ＣＳＦ
ＡＰＴＲＳＰＩＴＶＴＲＰＷＫＨＶＥＡＩＫＥＡＬＮＬＬＤＤＭＰＶＴＬＮＥＥＶＥＶＶＳＮＥＦＳＦＫＫＬＴＣＶＱＴＲＬＫＩＦＥＱＧＬＲＧＮＦＴＫＬＫＧＡＬＮＭＴＡＳＹＹＱＴＹＣＰＰＴＰＥＴＤＣＥＴＱＶＴＴＹＡＤＦＩＤＳＬＫＴＦＬＴＤＩＰＦＥＣＫＫＰＶＱＫ
配列番号４０
ＶＢ５０６８
ＭＫＬＶＳＩＦＬＬＶＴＩＧＩＣＧＹＳＡＴＡＬＬＩＮＲＬＰＶＶＤＫＬＰＶＰＬＤＤＩＩＰＳＦＤＰＬＫＭＬＬＫＴＬＧＩＳＶＥＨＬＶＴＧＬＫＫＣＶＤＥＬＧＰＥＡＳＥＡＶＫＫＬＬＥＡＬＳＨＬＶＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬＳＰＧＫＮＡＴＧＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫＤＱＤＡＥＱＡＰＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＰＧＳＡＬＬＣＣＬＬＬＬＴＧＭＲＩＳＲＧＱＹＳＲＥＤＮＮＣＴＨＦＰＶＧＱＳＨＭＬＬＥＬＲＴＡＦＳＱＶＫＴＦＦＱＴＫＤＱＬＤＮＩＬＬＴＤＳＬＭＱＤＦＫＧＹＬＧＣＱＡＬＳＥＭＩＱＦＹＬＶＥＶＭＰＱＡＥＫＨＧＰＥＩＫＥＨＬＮＳＬＧＥＫＬＫＴＬＲＭＲＬＲＲＣＨＲＦＬＰＣＥＮＫＳＫＡＶＥＱＶＫＳＤＦＮＫＬＱＤＱＧＶＹＫＡＭＮＥＦＤＩＦＩＮＣＩＥＡＹＭＭＩＫＭＫＳ
配列番号４１
ＶＢ５０６９
ＭＴＲＲＲＳＡＰＡＳＷＬＬＶＳＬＬＧＶＡＴＳＬＥＶＳＥＳＰＧＳＶＱＶＡＲＧＱＴＡＶＬＰＣＡＦＳＴＳＡＡＬＬＮＬＮＶＩＷＭＶＩＰＬＳＮＡＮＱＰＥＱＶＩＬＹＱＧＧＱＭＦＤＧＡＬＲＦＨＧＲＶＧＦＴＧＴＭＰＡＴＮＶＳＩＦＩＮＮＴＱＬＳＤＴＧＴＹＱＣＬＶＮＮＬＰＤＲＧＧＲＮＩＧＶＴＧＬＴＶＬＶＰＰＳＡＰＱＣＱＩＱＧＳＱＤＬＧＳＤＶＩＬＬＣＳＳＥＥＧＩＰＲＰＴＹＬＷＥＫＬＤＮＴＬＫＬＰＰＴＡＴＱＤＱＶＱＧＴＶＴＩＲＮＩＳＡＬＳＳＧＬＹＱＣＶＡＳＮＡＩＧＴＳＴＣＬＬＤＬＱＶＩＳＰＱＰＲＳＶＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬＳＰＧＫＮＡＴＧＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫＤＱＤＡＥＱＡＰＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＰＧＳＡＬＬＣＣＬＬＬＬＴＧＭＲＩＳＲＧＱＹＳＲＥＤＮＮＣＴＨＦＰＶＧＱＳＨＭＬＬＥＬＲＴＡＦＳＱＶＫＴＦＦＱＴＫＤＱＬＤＮＩＬＬＴＤＳＬＭＱＤＦＫＧＹＬＧＣＱＡＬＳＥＭＩＱＦＹＬＶＥＶＭＰＱＡＥＫＨＧＰＥＩＫＥＨＬＮＳＬＧＥＫＬＫＴＬＲＭＲＬＲＲＣＨＲＦＬＰＣＥＮＫＳＫＡＶＥＱＶＫＳＤＦＮＫＬＱＤＱＧＶＹＫＡＭＮＥＦＤＩＦＩＮＣＩＥＡＹＭＭＩＫＭＫＳ
配列番号４２
ＶＢ５０７０
ＭＷＶＲＱＶＰＷＳＦＴＷＡＶＬＱＬＳＷＱＳＧＷＬＬＥＶＰＮＧＰＷＲＳＬＴＦＹＰＡＷＬＴＶＳＥＧＡＮＡＴＦＴＣＳＬＳＮＷＳＥＤＬＭＬＮＷＮＲＬＳＰＳＮＱＴＥＫＱＡＡＦＣＮＧＬＳＱＰＶＱＤＡＲＦＱＩＩＱＬＰＮＲＨＤＦＨＭＮＩＬＤＴＲＲＮＤＳＧＩＹＬＣＧＡＩＳＬＨＰＫＡＫＩＥＥＳＰＧＡＥＬＶＶＴＥＲＩＬＥＴＳＴＲＹＰＳＰＳＰＫＰＥＧＲＦＱＧＭＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬＳＰＧＫＮＡＴＧＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫＤＱＤＡＥＱＡＰＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＰＧＳＡＬＬＣＣＬＬＬＬＴＧＭＲＩＳＲＧＱＹＳＲＥＤＮＮＣＴＨＦＰＶＧＱＳＨＭＬＬＥＬＲＴＡＦＳＱＶＫＴＦＦＱＴＫＤＱＬＤＮＩＬＬＴＤＳＬＭＱＤＦＫＧＹＬＧＣＱＡＬＳＥＭＩＱＦＹＬＶＥＶＭＰＱＡＥＫＨＧＰＥＩＫＥＨＬＮＳＬＧＥＫＬＫＴＬＲＭＲＬＲＲＣＨＲＦＬＰＣＥＮＫＳＫＡＶＥＱＶＫＳＤＦＮＫＬＱＤＱＧＶＹＫＡＭＮＥＦＤＩＦＩＮＣＩＥＡＹＭＭＩＫＭＫＳ
配列番号４３
シグナルペプチドｍＳＣＧＢ３Ａ２
配列番号４４
ｍＳＣＧＢ３Ａ２
ＬＬＩＮＲＬＰＶＶＤＫＬＰＶＰＬＤＤＩＩＰＳＦＤＰＬＫＭＬＬＫＴＬＧＩＳＶＥＨＬＶＴＧＬＫＫＣＶＤＥＬＧＰＥＡＳＥＡＶＫＫＬＬＥＡＬＳＨＬＶ
配列番号４５
シグナルペプチドｍＶＳＩＧ３
ＭＴＲＲＲＳＡＰＡＳＷＬＬＶＳＬＬＧＶＡＴＳ
配列番号４６
ｍＶＳＩＧ３細胞外ドメイン
ＬＥＶＳＥＳＰＧＳＶＱＶＡＲＧＱＴＡＶＬＰＣＡＦＳＴＳＡＡＬＬＮＬＮＶＩＷＭＶＩＰＬＳＮＡＮＱＰＥＱＶＩＬＹＱＧＧＱＭＦＤＧＡＬＲＦＨＧＲＶＧＦＴＧＴＭＰＡＴＮＶＳＩＦＩＮＮＴＱＬＳＤＴＧＴＹＱＣＬＶＮＮＬＰＤＲＧＧＲＮＩＧＶＴＧＬＴＶＬＶＰＰＳＡＰＱＣＱＩＱＧＳＱＤＬＧＳＤＶＩＬＬＣＳＳＥＥＧＩＰＲＰＴＹＬＷＥＫＬＤＮＴＬＫＬＰＰＴＡＴＱＤＱＶＱＧＴＶＴＩＲＮＩＳＡＬＳＳＧＬＹＱＣＶＡＳＮＡＩＧＴＳＴＣＬＬＤＬＱＶＩＳＰＱＰＲＳＶ
配列番号４７
シグナルペプチドｍＰＤ－１
ＭＷＶＲＱＶＰＷＳＦＴＷＡＶＬＱＬＳＷＱＳＧＷＬ
配列番号４８
ｍＰＤ－１細胞外ドメイン
ＬＥＶＰＮＧＰＷＲＳＬＴＦＹＰＡＷＬＴＶＳＥＧＡＮＡＴＦＴＣＳＬＳＮＷＳＥＤＬＭＬＮＷＮＲＬＳＰＳＮＱＴＥＫＱＡＡＦＣＮＧＬＳＱＰＶＱＤＡＲＦＱＩＩＱＬＰＮＲＨＤＦＨＭＮＩＬＤＴＲＲＮＤＳＧＩＹＬＣＧＡＩＳＬＨＰＫＡＫＩＥＥＳＰＧＡＥＬＶＶＴＥＲＩＬＥＴＳＴＲＹＰＳＰＳＰＫＰＥＧＲＦＱＧＭ
配列番号４９
ＶＢ５０７６
ＭＮＦＧＬＲＬＩＦＬＶＬＴＬＫＧＶＱＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＦＬＳＴＳＬＧＮＳＩＴＩＴＣＨＡＳＱＮＩＫＧＷＬＡＷＹＱＱＫＳＧＮＡＰＱＬＬＩＹＫＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＩＦＴＩＳＮＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＨＹＱＳＦＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＬＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＫＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＤＦＹＭＮＷＩＲＱＰＰＧＱＡＰＥＷＬＧＶＩＲＮＫＧＮＧＹＴＴＥＶＮＴＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＱＮＩＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＩＹＹＣＡＲＧＧＰＹＹＹＳＧＤＤＡＰＹＷＧＱＧＶＭＶＴＶＳＳＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬＫＥＶＤＲＬＥＤＥＬＶＮＥＫＥＫＹＫＳＩＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＹＫＥＱＩＫＴＬＴＮＫＬＫＡＡＥＡＲＡＥＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＮＱＬＫＥＡＲＦＬＡＥＥＡＤＲＫＹＤＥＶＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＬＮＲＲＩＱＬＬＥＥＤＬＥＲＳＥＥＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＬＤＱＶＱＥＳＬＬＫＡＮＮＱＬＶＥＫＤＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＱＱＮＫＥＡＮＮＲＡＥＫＳＥＥＥＶＨＮＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＰＧＳＡＬＬＣＣＬＬＬＬＴＧＭＲＩＳＲＧＱＹＳＲＥＤＮＮＣＴＨＦＰＶＧＱＳＨＭＬＬＥＬＲＴＡＦＳＱＶＫＴＦＦＱＴＫＤＱＬＤＮＩＬＬＴＤＳＬＭＱＤＦＫＧＹＬＧＣＱＡＬＳＥＭＩＱＦＹＬＶＥＶＭＰＱＡＥＫＨＧＰＥＩＫＥＨＬＮＳＬＧＥＫＬＫＴＬＲＭＲＬＲＲＣＨＲＦＬＰＣＥＮＫＳＫＡＶＥＱＶＫＳＤＦＮＫＬＱＤＱＧＶＹＫＡＭＮＥＦＤＩＦＩＮＣＩＥＡＹＭＭＩＫＭＫＳ
配列番号５０
Ｍｅｔ ｅ １
ＫＥＶＤＲＬＥＤＥＬＶＮＥＫＥＫＹＫＳＩＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＹＫＥＱＩＫＴＬＴＮＫＬＫＡＡＥＡＲＡＥＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＮＱＬＫＥＡＲＦＬＡＥＥＡＤＲＫＹＤＥＶＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＬＮＲＲＩＱＬＬＥＥＤＬＥＲＳＥＥＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＬＤＱＶＱＥＳＬＬＫＡＮＮＱＬＶＥＫＤＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＱＱＮＫＥＡＮＮＲＡＥＫＳＥＥＥＶＨＮ
配列番号５１
ｈＣＴＬＡ４細胞外ドメイン、シグナルペプチド下線部
配列番号５２
ｈＰＤ－１細胞外ドメイン、シグナルペプチド下線部
配列番号５３
ｈＩＬ－１０、シグナルペプチド下線部
配列番号５４
ｈＴＧＦβ－１、シグナルペプチド下線部
配列番号５５
ｈＩＬ－２、シグナルペプチド下線部
配列番号５６
ｈＧＭ－ＣＳＦ、シグナルペプチド下線部
配列番号５７
ｈＩＦＮ－γ、シグナルペプチド下線部
配列番号５８
ｈＴＧＦβ－２
ＭＨＹＣＶＬＳＡＦＬＩＬＨＬＶＴＶＡＬＳＬＳＴＣＳＴＬＤＭＤＱＦＭＲＫＲＩＥＡＩＲＧＱＩＬＳＫＬＫＬＴＳＰＰＥＤＹＰＥＰＥＥＶＰＰＥＶＩＳＩＹＮＳＴＲＤＬＬＱＥＫＡＳＲＲＡＡＡＣＥＲＥＲＳＤＥＥＹＹＡＫＥＶＹＫＩＤＭＰＰＦＦＰＳＥＴＶＣＰＶＶＴＴＰＳＧＳＶＧＳＬＣＳＲＱＳＱＶＬＣＧＹＬＤＡＩＰＰＴＦＹＲＰＹＦＲＩＶＲＦＤＶＳＡＭＥＫＮＡＳＮＬＶＫＡＥＦＲＶＦＲＬＱＮＰＫＡＲＶＰＥＱＲＩＥＬＹＱＩＬＫＳＫＤＬＴＳＰＴＱＲＹＩＤＳＫＶＶＫＴＲＡＥＧＥＷＬＳＦＤＶＴＤＡＶＨＥＷＬＨＨＫＤＲＮＬＧＦＫＩＳＬＨＣＰＣＣＴＦＶＰＳＮＮＹＩＩＰＮＫＳＥＥＬＥＡＲＦＡＧＩＤＧＴＳＴＹＴＳＧＤＱＫＴＩＫＳＴＲＫＫＮＳＧＫＴＰＨＬＬＬＭＬＬＰＳＹＲＬＥＳＱＱＴＮＲＲＫＫＲＡＬＤＡＡＹＣＦＲＮＶＱＤＮＣＣＬＲＰＬＹＩＤＦＫＲＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＮＡＮＦＣＡＧＡＣＰＹＬＷＳＳＤＴＱＨＳＲＶＬＳＬＹＮＴＩＮＰＥＡＳＡＳＰＣＣＶＳＱＤＬＥＰＬＴＩＬＹＹＩＧＫＴＰＫＩＥＱＬＳＮＭＩＶＫＳＣＫＣＳ
配列番号５９
ｈＴＧＦβ－３
ＭＫＭＨＬＱＲＡＬＶＶＬＡＬＬＮＦＡＴＶＳＬＳＬＳＴＣＴＴＬＤＦＧＨＩＫＫＫＲＶＥＡＩＲＧＱＩＬＳＫＬＲＬＴＳＰＰＥＰＴＶＭＴＨＶＰＹＱＶＬＡＬＹＮＳＴＲＥＬＬＥＥＭＨＧＥＲＥＥＧＣＴＱＥＮＴＥＳＥＹＹＡＫＥＩＨＫＦＤＭＩＱＧＬＡＥＨＮＥＬＡＶＣＰＫＧＩＴＳＫＶＦＲＦＮＶＳＳＶＥＫＮＲＴＮＬＦＲＡＥＦＲＶＬＲＶＰＮＰＳＳＫＲＮＥＱＲＩＥＬＦＱＩＬＲＰＤＥＨＩＡＫＱＲＹＩＧＧＫＮＬＰＴＲＧＴＡＥＷＬＳＦＤＶＴＤＴＶＲＥＷＬＬＲＲＥＳＮＬＧＬＥＩＳＩＨＣＰＣＨＴＦＱＰＮＧＤＩＬＥＮＩＨＥＶＭＥＩＫＦＫＧＶＤＮＥＤＤＨＧＲＧＤＬＧＲＬＫＫＱＫＤＨＨＮＰＨＬＩＬＭＭＩＰＰＨＲＬＤＮＰＧＱＧＧＱＲＫＫＲＡＬＤＴＮＹＣＦＲＮＬＥＥＮＣＣＶＲＰＬＹＩＤＦＲＱＤＬＧＷＫＷＶＨＥＰＫＧＹＹＡＮＦＣＳＧＰＣＰＹＬＲＳＡＤＴＴＨＳＴＶＬＧＬＹＮＴＬＮＰＥＡＳＡＳＰＣＣＶＰＱＤＬＥＰＬＴＩＬＹＹＶＧＲＴＰＫＶＥＱＬＳＮＭＶＶＫＳＣＫＣＳ
配列番号６０
ｈＴＧＦβ－１
ＡＴＧＣＣＧＣＣＣＴＣＣＧＧＧＣＴＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＡＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＣＧＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＡＣＴＡＴＣＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＡＣＴＡＴＣＧＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＣＡＴＣＧＡＧＧＣＣＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＡＧＡＴＣＣＴＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧＣＧＧＣＴＣＧＣＣＡＧＣＣＣＣＣＣＧＡＧＣＣＡＧＧＧＧＧＡＧＧＴＧＣＣＧＣＣＣＧＧＣＣＣＧＣＴＧＣＣＣＧＡＧＧＣＣＧＴＧＣＴＣＧＣＣＣＴＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＣＧＣＧＡＣＣＧＧＧＴＧＧＣＣＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣＡＧＡＡＣＣＧＧＡＧＣＣＣＧＡＧＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＡＡＧＧＡＧＧＴＣＡＣＣＣＧＣＧＴＧＣＴＡＡＴＧＧＴＧＧＡＡＡＣＣＣＡＣＡＡＣＧＡＡＡＴＣＴＡＴＧＡＣＡＡＧＴＴＣＡＡＧＣＡＧＡＧＴＡＣＡＣＡＣＡＧＣＡＴＡＴＡＴＡＴＧＴＴＣＴＴＣＡＡＣＡＣＡＴＣＡＧＡＧＣＴＣＣＧＡＧＡＡＧＣＧＧＴＡＣＣＴＧＡＡＣＣＣＧＴＧＴＴＧＣＴＣＴＣＣＣＧＧＧＣＡＧＡＧＣＴＧＣＧＴＣＴＧＣＴＧＡＧＧＣＴＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡＣＣＡＧＡＡＡＴＡＣＡＧＣＡＡＣＡＡＴＴＣＣＴＧＧＣＧＡＴＡＣＣＴＣＡＧＣＡＡＣＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＧＡＣＴＣＧＣＣＡＧＡＧＴＧＧＴＴＡＴＣＴＴＴＴＧＡＴＧＴＣＡＣＣＧＧＡＧＴＴＧＴＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＴＴＧＡＧＣＣＧＴＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＴＴＧＡＧＧＧＣＴＴＴＣＧＣＣＴＴＡＧＣＧＣＣＣＡＣＴＧＣＴＣＣＴＧＴＧＡＣＡＧＣＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＣＡＣＴＧＣＡＡＧＴＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＧＧＧＴＴＣＡＣＴＡＣＣＧＧＣＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧＣＣＡＣＣＡＴＴＣＡＴＧＧＣＡＴＧＡＡＣＣＧＧＣＣＴＴＴＣＣＴＧＣＴＴＣＴＣＡＴＧＧＣＣＡＣＣＣＣＧＣＴＧＧＡＧＡＧＧＧＣＣＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣＡＡＡＧＣＴＣＣＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＧＡＧＣＣＣＴＧＧＡＣＡＣＣＡＡＣＴＡＴＴＧＣＴＴＣＡＧＣＴＣＣＡＣＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＴＧＣＴＧＣＧＴＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＴＡＣＡＴＴＧＡＣＴＴＣＣＧＣＡＡＧＧＡＣＣＴＣＧＧＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＴＡＣＣＡＴＧＣＣＡＡＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣＧＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＡＣＡＴＴＴＧＧＡＧＣＣＴＧＧＡＣＡＣＧＣＡＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＧＴＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＴＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＴＡＡＣＣＣＧＧＧＣＧＣＣＴＣＧＧＣＧＧＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＣＣＧＣＴＧＣＣＣＡＴＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＧＴＧＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＴＣＣＡＡＣＡＴＧＡＴＣＧＴＧＣＧＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＡ
配列番号６１
ｈＴＧＦβ－２
ＡＴＧＣＡＣＴＡＣＴＧＴＧＴＧＣＴＧＡＧＣＧＣＴＴＴＴＣＴＧＡＴＣＣＴＧＣＡＴＣＴＧＧＴＣＡＣＧＧＴＣＧＣＧＣＴＣＡＧＣＣＴＧＴＣＴＡＣＣＴＧＣＡＧＣＡＣＡＣＴＣＧＡＴＡＴＧＧＡＣＣＡＧＴＴＣＡＴＧＣＧＣＡＡＧＡＧＧＡＴＣＧＡＧＧＣＧＡＴＣＣＧＣＧＧＧＣＡＧＡＴＣＣＴＧＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＡＧＣＴＣＡＣＣＡＧＴＣＣＣＣＣＡＧＡＡＧＡＣＴＡＴＣＣＴＧＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＡＧＴＣＣＣＣＣＣＧＧＡＧＧＴＧＡＴＴＴＣＣＡＴＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＡＧＧＧＡＣＴＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＡＡＧＧＣＧＡＧＣＣＧＧＡＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＧＡＧＣＧＣＧＡＧＡＧＧＡＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＧＴＡＣＴＡＣＧＣＣＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡＣＡＡＡＡＴＡＧＡＣＡＴＧＣＣＧＣＣＣＴＴＣＴＴＣＣＣＣＴＣＣＧＡＡＡＣＴＧＴＣＴＧＣＣＣＡＧＴＴＧＴＴＡＣＡＡＣＡＣＣＣＴＣＴＧＧＣＴＣＡＧＴＧＧＧＣＡＧＣＴＴＧＴＧＣＴＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＴＣＴＧＴＧＧＧＴＡＣＣＴＴＧＡＴＧＣＣＡＴＣＣＣＧＣＣＣＡＣＴＴＴＣＴＡＣＡＧＡＣＣＣＴＡＣＴＴＣＡＧＡＡＴＴＧＴＴＣＧＡＴＴＴＧＡＣＧＴＣＴＣＡＧＣＡＡＴＧＧＡＧＡＡＧＡＡＴＧＣＴＴＣＣＡＡＴＴＴＧＧＴＧＡＡＡＧＣＡＧＡＧＴＴＣＡＧＡＧＴＣＴＴＴＣＧＴＴＴＧＣＡＧＡＡＣＣＣＡＡＡＡＧＣＣＡＧＡＧＴＧＣＣＴＧＡＡＣＡＡＣＧＧＡＴＴＧＡＧＣＴＡＴＡＴＣＡＧＡＴＴＣＴＣＡＡＧＴＣＣＡＡＡＧＡＴＴＴＡＡＣＡＴＣＴＣＣＡＡＣＣＣＡＧＣＧＣＴＡＣＡＴＣＧＡＣＡＧＣＡＡＡＧＴＴＧＴＧＡＡＡＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＧＣＧＡＡＴＧＧＣＴＣＴＣＣＴＴＣＧＡＴＧＴＡＡＣＴＧＡＴＧＣＴＧＴＴＣＡＴＧＡＡＴＧＧＣＴＴＣＡＣＣＡＴＡＡＡＧＡＣＡＧＧＡＡＣＣＴＧＧＧＡＴＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＣＴＴＡＣＡＣＴＧＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣＡＣＴＴＴＴＧＴＡＣＣＡＴＣＴＡＡＴＡＡＴＴＡＣＡＴＣＡＴＣＣＣＡＡＡＴＡＡＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＣＴＡＧＡＡＧＣＡＡＧＡＴＴＴＧＣＡＧＧＴＡＴＴＧＡＴＧＧＣＡＣＣＴＣＣＡＣＡＴＡＴＡＣＣＡＧＴＧＧＴＧＡＴＣＡＧＡＡＡＡＣＴＡＴＡＡＡＧＴＣＣＡＣＴＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＣＡＧＴＧＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＡＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＴＡＡＴＧＴＴＡＴＴＧＣＣＣＴＣＣＴＡＣＡＧＡＣＴＴＧＡＧＴＣＡＣＡＡＣＡＧＡＣＣＡＡＣＣＧＧＣＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＴＧＣＴＴＴＧＧＡＴＧＣＧＧＣＣＴＡＴＴＧＣＴＴＴＡＧＡＡＡＴＧＴＧＣＡＧＧＡＴＡＡＴＴＧＣＴＧＣＣＴＡＣＧＴＣＣＡＣＴＴＴＡＣＡＴＴＧＡＴＴＴＣＡＡＧＡＧＧＧＡＴＣＴＡＧＧＧＴＧＧＡＡＡＴＧＧＡＴＡＣＡＣＧＡＡＣＣＣＡＡＡＧＧＧＴＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＣＴＴＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＧＣＡＴＧＣＣＣＧＴＡＴＴＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＡＣＴＣＡＧＣＡＣＡＧＣＡＧＧＧＴＣＣＴＧＡＧＣＴＴＡＴＡＴＡＡＴＡＣＣＡＴＡＡＡＴＣＣＡＧＡＡＧＣＡＴＣＴＧＣＴＴＣＴＣＣＴＴＧＣＴＧＣＧＴＧＴＣＣＣＡＡＧＡＴＴＴＡＧＡＡＣＣＴＣＴＡＡＣＣＡＴＴＣＴＣＴＡＣＴＡＣＡＴＴＧＧＣＡＡＡＡＣＡＣＣＣＡＡＧＡＴＴＧＡＡＣＡＧＣＴＴＴＣＴＡＡＴＡＴＧＡＴＴＧＴＡＡＡＧＴＣＴＴＧＣＡＡＡＴＧＣＡＧＣＴＡＡ
配列番号６２
ｈＴＧＦβ－３
ＡＴＧＡＡＧＡＴＧＣＡＣＴＴＧＣＡＡＡＧＧＧＣＴＣＴＧＧＴＧＧＴＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＴＴＴＧＣＣＡＣＧＧＴＣＡＧＣＣＴＣＴＣＴＣＴＧＴＣＣＡＣＴＴＧＣＡＣＣＡＣＣＴＴＧＧＡＣＴＴＣＧＧＣＣＡＣＡＴＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＧＴＧＧＡＡＧＣＣＡＴＴＡＧＧＧＧＡＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＧＧＣＴＣＡＣＣＡＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＧＣＣＡＡＣＧＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＣＧＴＣＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＴＣＣＴＧＧＣＣＣＴＴＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＣＡＴＧＧＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＣＴＧＣＡＣＣＣＡＧＧＡＡＡＡＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＡＡＴＡＣＴＡＴＧＣＣＡＡＡＧＡＡＡＴＣＣＡＴＡＡＡＴＴＣＧＡＣＡＴＧＡＴＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧＧＣＧＧＡＧＣＡＣＡＡＣＧＡＡＣＴＧＧＣＴＧＴＣＴＧＣＣＣＴＡＡＡＧＧＡＡＴＴＡＣＣＴＣＣＡＡＧＧＴＴＴＴＣＣＧＣＴＴＣＡＡＴＧＴＧＴＣＣＴＣＡＧＴＧＧＡＧＡＡＡＡＡＴＡＧＡＡＣＣＡＡＣＣＴＡＴＴＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＴＴＣＣＧＧＧＴＣＴＴＧＣＧＧＧＴＧＣＣＣＡＡＣＣＣＣＡＧＣＴＣＴＡＡＧＣＧＧＡＡＴＧＡＧＣＡＧＡＧＧＡＴＣＧＡＧＣＴＣＴＴＣＣＡＧＡＴＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＡＴＧＡＧＣＡＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡＣＡＧＣＧＣＴＡＴＡＴＣＧＧＴＧＧＣＡＡＧＡＡＴＣＴＧＣＣＣＡＣＡＣＧＧＧＧＣＡＣＴＧＣＣＧＡＧＴＧＧＣＴＧＴＣＣＴＴＴＧＡＴＧＴＣＡＣＴＧＡＣＡＣＴＧＴＧＣＧＴＧＡＧＴＧＧＣＴＧＴＴＧＡＧＡＡＧＡＧＡＧＴＣＣＡＡＣＴＴＡＧＧＴＣＴＡＧＡＡＡＴＣＡＧＣＡＴＴＣＡＣＴＧＴＣＣＡＴＧＴＣＡＣＡＣＣＴＴＴＣＡＧＣＣＣＡＡＴＧＧＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＴＴＣＡＣＧＡＧＧＴＧＡＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＴＴＣＡＡＡＧＧＣＧＴＧＧＡＣＡＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡＣＣＡＴＧＧＣＣＧＴＧＧＡＧＡＴＣＴＧＧＧＧＣＧＣＣＴＣＡＡＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＧＡＴＣＡＣＣＡＣＡＡＣＣＣＴＣＡＴＣＴＡＡＴＣＣＴＣＡＴＧＡＴＧＡＴＴＣＣＣＣＣＡＣＡＣＣＧＧＣＴＣＧＡＣＡＡＣＣＣＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＧＧＴＣＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＧＣＴＴＴＧＧＡＣＡＣＣＡＡＴＴＡＣＴＧＣＴＴＣＣＧＧＴＧＡ
配列番号６３
ｈＩＬ－１０
ＡＴＧＣＡＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＣＴＧＣＴＣＴＧＴＴＧＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＣＴＧＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧＣＴＧＣＡＣＣＣＡＣＴＴＣＣＣＡＧＧＣＡＡＣＣＴＧＣＣＴＡＡＣＡＴＧＣＴＴＣＧＡＧＡＴＣＴＣＣＧＡＧＡＴＧＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＴＴＴＣＴＴＴＣＡＡＡＴＧＡＡＧＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＴＴＧＴＴＧＴＴＡＡＡＧＧＡＧＴＣＣＴＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＴＴＴＡＡＧＧＧＴＴＡＣＣＴＧＧＧＴＴＧＣＣＡＡＧＣＣＴＴＧＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＴＣＣＡＧＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＧＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＡＧＡＡＣＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡＴＣＡＡＧＧＣＧＣＡＴＧＴＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＧＧＧＧＡＧＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＣＣＣＴＣＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＴＡＣＧＧＣＧＣＴＧＴＣＡＴＣＧＡＴＴＴＣＴＴＣＣＣＴＧＴＧＡＡＡＡＣＡＡＧＡＧＣＡＡＧＧＣＣＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＴＧＣＣＴＴＴＡＡＴＡＡＧＣＴＣＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＣＡＴＣＴＡＣＡＡＡＧＣＣＡＴＧＡＧＴＧＡＧＴＴＴＧＡＣＡＴＣＴＴＣＡＴＣＡＡＣＴＡＣＡＴＡＧＡＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＡＣＡＡＴＧＡＡＧＡＴＡＣＧＡＡＡＣＴＧＡ
配列番号６４
ｈＳＣＧＢ３Ａ２、シグナルペプチド下線部
配列番号６５
ｈＳＣＧＢ３Ａ２
ＡＴＧＡＡＧＣＴＧＧＴＡＡＣＴＡＴＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＴＴＴＧＴＡＧＴＴＡＣＴＣＴＧＣＴＡＣＴＧＣＣＴＴＣＣＴＣＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＴＧＣＣＣＣＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＧＴＴＧＧＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＴＣＴＧＧＡＣＡＡＣＡＴＴＣＴＴＣＣＣＴＴＴＡＴＧＧＡＴＣＣＡＴＴＡＡＡＧＣＴＴＣＴＴＣＴＧＡＡＡＡＣＴＣＴＧＧＧＣＡＴＴＴＣＴＧＴＴＧＡＧＣＡＣＣＴＴＧＴＧＧＡＧＧＧＧＣＴＡＡＧＧＡＡＧＴＧＴＧＴＡＡＡＴＧＡＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＧＡＧＧＣＴＴＣＴＧＡＡＧＣＴＧＴＧＡＡＧＡＡＡＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＣＧＣＴＡＴＣＡＣＡＣＴＴＧＧＴＧＴＧＡ
配列番号６６
ｈＶＳＩＧ－３細胞外ドメイン、シグナルペプチド下線部
配列番号６７
ｈＶＳＩＧ－３細胞外ドメイン
ＡＴＧＡＣＴＴＣＴＣＡＧＣＧＴＴＣＣＣＣＴＣＴＧＧＣＧＣＣＴＴＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＣＴＣＴＣＴＧＣＡＣＧＧＴＧＴＴＧＣＡＧＣＡＴＣＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＴＣＡＧＡＧＡＧＣＣＣＴＧＧＧＡＧＴＡＴＣＣＡＧＧＴＧＧＣＣＣＧＧＧＧＴＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＴＣＣＴＧＣＣＣＴＧＣＡＣＴＴＴＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＧＣＴＧＣＣＣＴＣＡＴＴＡＡＣＣＴＣＡＡＴＧＴＣＡＴＴＴＧＧＡＴＧＧＴＣＡＣＴＣＣＴＣＴＣＴＣＣＡＡＴＧＣＣＡＡＣＣＡＡＣＣＴＧＡＡＣＡＧＧＴＣＡＴＣＣＴＧＴＡＴＣＡＧＧＧＴＧＧＡＣＡＧＡＴＧＴＴＴＧＡＴＧＧＴＧＣＣＣＣＣＣＧＧＴＴＣＣＡＣＧＧＴＡＧＧＧＴＡＧＧＡＴＴＴＡＣＡＧＧＣＡＣＣＡＴＧＣＣＡＧＣＴＡＣＣＡＡＴＧＴＣＴＣＴＡＴＣＴＴＣＡＴＴＡＡＴＡＡＣＡＣＴＣＡＧＴＴＡＴＣＡＧＡＣＡＣＴＧＧＣＡＣＣＴＡＣＣＡＧＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＣＡＡＣＣＴＴＣＣＡＧＡＣＡＴＡＧＧＧＧＧＣＡＧＧＡＡＣＡＴＴＧＧＧＧＴＣＡＣＣＧＧＴＣＴＣＡＣＡＧＴＧＴＴＡＧＴＴＣＣＣＣＣＴＴＣＴＧＣＣＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＡＡＡＴＣＣＡＡＧＧＡＴＣＣＣＡＧＧＡＴＡＴＴＧＧＣＡＧＣＧＡＴＧＴＣＡＴＣＣＴＧＣＴＣＴＧＴＡＧＣＴＣＡＧＡＧＧＡＡＧＧＣＡＴＴＣＣＴＣＧＡＣＣＡＡＣＴＴＡＣＣＴＴＴＧＧＧＡＧＡＡＧＴＴＡＧＡＣＡＡＴＡＣＣＣＴＣＡＡＡＣＴＡＣＣＴＣＣＡＡＣＡＧＣＴＡＣＴＣＡＧＧＡＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＧＧＡＡＣＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＣＧＧＡＡＣＡＴＣＡＧＴＧＣＣＣＴＧＴＣＴＴＣＡＧＧＴＴＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＣＧＴＧＧＣＴＴＣＴＡＡＴＧＣＴＡＴＴＧＧＡＡＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＴＣＴＴＣＴＧＧＡＴＣＴＣＣＡＧＧＴＴＡＴＴＴＣＡＣＣＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧＡＡＣＡＴＴＧＧＡ
実施形態
１．
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、第１のポリペプチドが、抗原提示細胞を標的とする標的化ユニット、二量体化ユニットなどの多量体化ユニット、及び抗原性ユニットを含み、抗原性ユニットが、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、第１の核酸配列と、
（ｂ）１つ以上の免疫阻害化合物をコードする１つ以上の更なる核酸配列と、を含み、
第１のポリペプチド及び１つ以上の免疫阻害化合物を別個の分子として共発現させることを可能にする、ベクター。
２．１つ以上の免疫阻害化合物が、免疫寛容を誘導する、実施形態１に記載のベクター。
３．１つ以上の免疫阻害化合物が、免疫寛容を増加させる、実施形態１に記載のベクター。
４．１つ以上の免疫阻害化合物が、免疫寛容を維持する、実施形態１に記載のベクター。
５．１つ以上の免疫阻害化合物が、免疫寛容を誘導し、及び／又は免疫寛容を増加させ、及び／又は免疫寛容を維持する、実施形態１に記載のベクター。
６．１つ以上の免疫阻害化合物が、寛容誘導様式で抗原性ユニット中の１つ以上のＴ細胞エピトープの提示に有利に働く、例えば、寛容誘導様式で抗原性ユニット中の１つ以上のＴ細胞エピトープの提示を促進及び／又は支持する、実施形態１～５のいずれか１つに記載のベクター。
７．１つ以上の免疫阻害化合物が、寛容維持細胞の誘導に有利に働く、例えば、寛容維持細胞の誘導を促進及び／又は支持する、実施形態１～６のいずれか１つに記載のベクター。
８．１つ以上の免疫阻害化合物が、寛容維持細胞の維持に役立つ、実施形態１～７のいずれか１つに記載のベクター。
９．免疫阻害化合物が、阻害性チェックポイント分子の細胞外ドメインなどの細胞外部分である、実施形態１～８のいずれか１つに記載のベクター。
１０．阻害性チェックポイント分子が、ＣＬＴＡ－４、ＰＤ－１、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＮＯＸ２、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９及びＴＩＭ－３からなる群から選択される、実施形態９に記載のベクター。
１１．阻害性チェックポイント分子が、ヒト阻害性チェックポイント分子であり、好ましくは、配列番号５１を有するｈＣＴＬＡ－４などのｈＣＬＴＡ－４、配列番号５２を有するｈＰＤ－１などのｈＰＤ－１、ｈＢＴＬＡ、ｈＬＡＧ３、ｈＮＯＸ２、ｈＳＩＧＬＥＣ７、ｈＳＩＧＬＥＣ９及びｈＴＩＭ－３からなる群から選択されるヒト阻害性チェックポイント分子である、実施形態９又は１０に記載のベクター。
１２．免疫阻害化合物が、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＩＬ－２７、ＩＬ－２、ＧＭ－ＣＳＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－３７及びＩＬ－３５からなる群から選択されるサイトカインである、実施形態１～８のいずれか１つに記載のベクター。
１３．サイトカインが、配列番号５３を有するｈＩＬ－１０などのｈＩＬ－１０、配列番号５４を有するｈＴＧＦ－β１などのｈＴＧＦ－β１、ｈＴＧＦ－β２、ｈＴＧＦ－β３、ｈＩＬ－２７、配列番号５５を有するｈＩＬ－２などのｈＩＬ－２、配列番号５６を有するｈＧＭ－ＣＳＦなどのｈＧＭ－ＣＳＦ、ｈＦＬＴ３Ｌ、配列番号５７を有するｈＩＦＮ－γなどのｈＩＦＮ－γ、ｈＩＬ－３７及びｈＩＬ－３５からなる群から選択されるヒトサイトカインである、実施形態１２に記載のベクター。
１４．複数の免疫阻害化合物、例えば２、３、４、５、６、７又は８個の免疫阻害化合物、例えば２、３、４、５、６、７又は８個の異なる免疫阻害化合物をコードする複数の更なる核酸配列を含む、実施形態１～１３のいずれか１つに記載のベクター。
１５．当該複数の免疫阻害化合物が、異なるレベルで寛容誘導環境を生成又は促進する異なる免疫阻害化合物である、実施形態１４に記載のベクター。
１６．当該異なる免疫阻害化合物が、寛容を誘導し、寛容を増加させ、寛容を維持するか、又は寛容を誘導し、寛容を増加させるか、又は寛容を誘導し、寛容を維持する、実施形態１４又は１５に記載のベクター。
１７．１つ以上の共発現エレメントを含む、実施形態１～１６のいずれか１つに記載のベクター。
１８．当該１つ以上の共発現エレメントが、単一の転写物上での第１のポリペプチド及び１つ以上の免疫阻害化合物の転写、並びに別個の第１のポリペプチド及び別個の１つ以上の免疫阻害化合物への独立した翻訳を引き起こす、実施形態１７に記載のベクター。
１９．１つ以上の共発現エレメントが、ＩＲＥＳエレメント又は２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸配列である、実施形態１７又は１８に記載のベクター。
２０．ＩＲＥＳエレメント若しくは２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸配列、又はＩＲＥＳエレメント及び２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸配列である、２つ以上の共発現エレメントを含む、実施形態１７又は１８に記載のベクター。
２１．２Ａ自己切断ペプチドが、Ｔ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド及びＦ２Ａペプチドからなる群から選択される、実施形態１７～２０のいずれか１つに記載のベクター。
２２．２Ａ自己切断ペプチドが、配列番号６のアミノ酸配列に対して８０％～１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＴ２Ａペプチド、配列番号７のアミノ酸配列に対して８０％～１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＰ２Ａペプチド、配列番号８のアミノ酸配列に対して８０％～１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＥ２Ａペプチド、及び配列番号９のアミノ酸配列に対して８０％～１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＦ２Ａペプチドからなる群から選択される、実施形態１７～２１のいずれか１つに記載のベクター。
２３．２Ａ自己切断ペプチドが、配列番号６のアミノ酸配列を有するＴ２Ａペプチド、配列番号７のアミノ酸配列を有するＰ２Ａペプチド、配列番号８のアミノ酸配列を有するＥ２Ａペプチド、及び配列番号９のアミノ酸配列を有するＦ２Ａペプチドからなる群から選択される、実施形態１７～２２のいずれか１つに記載のベクター。
２４．当該１つ以上の共発現エレメントが、第１のポリペプチド及び１つ以上の免疫阻害化合物の転写を別個の転写物として引き起こす、実施形態１７に記載のベクター。
２５．当該１つ以上の共発現エレメントが双方向プロモーターである、実施形態２４に記載のベクター。
２６．当該１つ以上の共発現エレメントがプロモーターであり、ベクターが、第１のポリペプチド及び１つ以上の免疫阻害化合物をコードする核酸配列のそれぞれについて別個のプロモーターを含む、実施形態２４に記載のベクター。
２７．当該１つ以上の共発現エレメントが双方向プロモーター及びプロモーターである、実施形態２４に記載のベクター。
２８．ＩＲＥＳエレメント、２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸配列、双方向プロモーター及びプロモーターからなる群から選択される１つ以上の共発現エレメントを含む、実施形態１７～２７のいずれか１つに記載のベクター。
２９．抗原性ユニットが、自己抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、実施形態１～２８のいずれか１つに記載のベクター。
３０．抗原性ユニットが、自己抗原の複数のＴ細胞エピトープを含む、実施形態２９に記載のベクター。
３１．抗原性ユニットが、複数の異なる自己抗原の複数のＴ細胞エピトープを含む、実施形態２９に記載のベクター。
３２．自己抗原が、多発性硬化症に関与する、実施形態２９～３１のいずれか１つに記載のベクター。
３３．１つ以上のＴ細胞エピトープが、ＭＯＧ（３５－５５）などのＭＯＧ、ＭＢＰ（８４－１０４）及びＭＢＰ（７６－１１２）などのＭＢＰ、ＰＬＰ（１３９－１５１）、ＰＬＰ（１３１－１５９）及びＰＬＰ（１７８－１９１）などのＰＬＰ、ＭＡＧ、ＭＯＢＰ、ＣＮＰａｓｅ、Ｓ１００β、並びにトランスアルドラーゼからなる群から選択される、実施形態２９～３２のいずれか１つに記載のベクター。
３４．抗原性ユニットが、ＭＯＧ（３５－５５）、ＭＯＧ（２７－６３）、ＰＬＰ（１３９－１５１）、ＰＬＰ（１３１－１５９）、ＰＬＰ（１７８－１９１）、ＰＬＰ（１７０－１９９）、ＭＢＰ（８４－１０４）及びＭＢＰ（７６－１１２）からなる群から選択される１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、実施形態２９～３３のいずれか１つに記載のベクター。
３５．自己抗原が、１型糖尿病に関与する、実施形態２９～３１のいずれか１つに記載のベクター。
３６．自己抗原が、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５キロダルトンアイソフォーム（ＧＡＤ６５）、インスリン、ＩＡ－２、ＺｎＴ８、ＩＧＲＰ、ＣｈｇＡ、ＩＡＰＰ、ペリフェリン、テトラスパニン－７、ＧＲＰ７８、ウロコルチン－３、及びインスリン遺伝子エンハンサータンパク質ｉｓｌ－１からなる群から選択される、実施形態３５に記載のベクター。
３７．自己抗原が、セリアック病に関与する、実施形態２９～３１のいずれか１つに記載のベクター。
３８．自己抗原が、α－グリアジン、γ－グリアジン、例えばα－グリアジン（７６－９５）、ω－グリアジン、低分子量グルテニン、高分子量グルテニン、ホルデイン、セカリン及びアベニンｂからなる群から選択される、実施形態３７に記載のベクター。
３９．自己抗原が、関節リウマチに関与する、実施形態２９～３１のいずれか１つに記載のベクター。
４０．自己抗原が、コラーゲン、熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）、Ｂａｎｄ ３、核内低分子リボ核タンパク質Ｄ１（ＳｍＤ１）、アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）及びミエリンタンパク質ゼロ（Ｐ０）からなる群から選択される、実施形態３９に記載のベクター。
４１．自己抗原が、多発性硬化症、１型糖尿病、セリアック病、関節リウマチ、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、橋本甲状腺炎、落葉状天疱瘡、尋常性天疱瘡、甲状腺眼症、バセドウ病、原発性胆汁性肝硬変、重症筋無力症、インスリン抵抗性糖尿病、溶血性貧血及び乾癬からなる群から選択される疾患に関与する、及び／又は、抗原性ユニットが、ニューロファシン１５５、甲状腺ペルオキシダーゼ、サイログロブリン、デスモソーム関連糖タンパク質、デスモグレイン３カルシウム結合タンパク質（カルセクエストリン）、甲状腺刺激ホルモン受容体、抗ミトコンドリア抗体（ＡＭＡ）、抗核抗体（ＡＮＡ）、リム様／膜（ＲＬ／Ｍ）、多核ドット（ＭＮＤ）、アセチルコリン受容体、インスリン受容体、赤血球カテリシジン（ＬＬ－３７）、ディスインテグリン様及びメタロプロテアーゼドメイン含有トロンボスポンジン１型モチーフ様５（ＡＤＡＭＴＳＬ５）、ホスホリパーゼＡ２グループＩＶＤ（ＰＬＡ２Ｇ４Ｄ）、異種核リボ核タンパク質Ａ１（ｈｎＲＮＰ－Ａ１）、ケラチン１７、シトルリン化タンパク質、ホモシトルリン化タンパク質、及びＩｇＧのＦｃ部分からなる群から選択される１つ以上の自己抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、実施形態２９～３１のいずれか１つに記載のベクター。
４２．抗原性ユニットが、アレルゲンの１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、実施形態１～２８のいずれか１つに記載のベクター。
４３．抗原性ユニットが、アレルゲンの複数のＴ細胞エピトープを含む、実施形態４２に記載のベクター。
４４．抗原性ユニットが、複数の異なるアレルゲンの複数のＴ細胞エピトープを含む、実施形態４２に記載のベクター。
４５．アレルゲンが、食物アレルゲンである、実施形態４２～４４のいずれか１つに記載のベクター。
４６．抗原性ユニットが、甲殻類アレルゲン、牛乳アレルゲン、卵アレルゲン、魚アレルゲン、果実アレルゲン、小麦アレルゲン、ピーナッツアレルゲン、木の実アレルゲン、大豆アレルゲン、種子アレルゲン、そばアレルゲン、セロリアレルゲン、ニンニクアレルゲン、グルテンアレルゲン、オート麦アレルゲン、豆類アレルゲン、トウモロコシアレルゲン、乳アレルゲン、マスタードアレルゲン、ナッツアレルゲン、家禽アレルゲン、肉アレルゲン、米アレルゲン及びゴマアレルゲンからなる群から選択される１つ以上のアレルゲンの１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、実施形態４２～４５のいずれか１つに記載のベクター。
４７．抗原性ユニットが、トロポミオシン、アルギニンキナーゼ、ミオシン軽鎖、筋小胞体カルシウム結合タンパク質、トロポニンＣ、トリオースリン酸イソメラーゼ及びアクチンからなる群から選択される１つ以上の甲殻類アレルゲンの１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、実施形態４２～４５のいずれか１つに記載のベクター。
４８．１つ以上のＴ細胞エピトープが、Ｐａｎ ｂ １ Ｔ細胞エピトープ（２５１－２７０）、Ｍｅｔ ｅ １ Ｔ細胞エピトープ（２４１－２６０）、Ｍｅｔ ｅ １ Ｔ細胞エピトープ（２１０－２３０）、Ｍｅｔ ｅ １ Ｔ細胞エピトープ（１３６－１５５）、Ｍｅｔ ｅ １ Ｔ細胞エピトープ（７６－９５）、Ｍｅｔ ｅ １ Ｔ細胞エピトープ（４６－６５）及びＭｅｔ ｅ １ Ｔ細胞エピトープ（１６－３５）からなる群から選択される、実施形態４７に記載のベクター。
４９．抗原性ユニットが、ハチ毒アレルゲン、スズメバチアレルゲン、ラテックスアレルゲン、チリダニアレルゲン、ヒョウヒダニアレルゲン、貯蔵チリダニアレルゲン、ゴキブリアレルゲン、カビアレルゲン、真菌アレルゲン、イヌアレルゲン、ネコアレルゲン及びウマアレルゲンなどの毛皮動物アレルゲン、イネ科花粉アレルゲン、樹木花粉アレルゲン、雑草花粉アレルゲンなどの花粉アレルゲン、昆虫アレルゲン、並びに薬物アレルゲンからなる群から選択される１つ以上のアレルゲンの１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、実施形態４２～４４のいずれか１つに記載のベクター。
５０．抗原性ユニットが、第ＶＩＩＩ因子、インスリン及び治療用モノクローナル抗体からなる群から選択される薬物の薬物アレルゲンの１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、実施形態４２～４４及び４９のいずれか１つに記載のベクター。
５１．抗原性ユニットが、同種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、実施形態１～２８のいずれか１つに記載のベクター。
５２．抗原性ユニットが、同種抗原の複数のＴ細胞エピトープを含む、実施形態５１に記載のベクター。
５３．抗原性ユニットが、複数の異なる同種抗原の複数のＴ細胞エピトープを含む、実施形態５１に記載のベクター。
５４．抗原性ユニットが、異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、実施形態１～２８のいずれか１つに記載のベクター。
５５．抗原性ユニットが、異種抗原の複数のＴ細胞エピトープを含む、実施形態５４に記載のベクター。
５６．抗原性ユニットが、複数の異なる異種抗原の複数のＴ細胞エピトープを含む、実施形態５４に記載のベクター。
５７．抗原性ユニットが、離散的なＴ細胞エピトープである複数のＴ細胞エピトープを含む、実施形態１～５６のいずれか１つに記載のベクター。
５８．抗原性ユニットが、１つ以上のホットスポットに含まれる最小Ｔ細胞エピトープである複数のＴ細胞エピトープを含む、実施形態１～５６のいずれか１つに記載のベクター。
５９．抗原性ユニットが、離散的なＴ細胞エピトープ及び１つ以上のホットスポットに含まれる最小Ｔ細胞エピトープからなる群からの複数のＴ細胞エピトープを含む、実施形態１～５６のいずれか１つに記載のベクター。
６０．１つ以上のＴ細胞エピトープが、７～約２００アミノ酸、例えば７～１５０アミノ酸、好ましくは７～１００アミノ酸、例えば９～１００アミノ酸、又は１５～１００アミノ酸、又は９～６０アミノ酸、又は９～３０アミノ酸、又は１５～６０アミノ酸、又は１５～３０アミノ酸、又は２０～７５アミノ酸、又は２５～５０アミノ酸の長さを有する、実施形態１～５９のいずれか１つに記載のベクター。
６１．１つ以上のＴ細胞エピトープが、ＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）による提示に適した長さ、例えば、ＭＨＣクラスＩ提示については７～１１アミノ酸の長さ、又はＭＨＣクラスＩＩ提示については約１５アミノ酸の長さを有する、実施形態６０に記載のベクター。
６２．抗原性ユニットが、最大３５００個のアミノ酸、例えば約２１個～約２０００個のアミノ酸、又は約６０個～３５００個のアミノ酸、例えば約８０個又は約１００個又は約１５０個～約３０００個のアミノ酸、例えば約２００個～約２５００個のアミノ酸、例えば約３００個～約２０００個のアミノ酸、又は約４００個～約１５００個のアミノ酸、又は約５００個～約１０００個のアミノ酸を含む、実施形態１～６１のいずれか１つに記載のベクター。
６３．抗原性ユニットが、１、２、３、４、５、６、７、８若しくは９若しくは１０個のＴ細胞エピトープなどの１～１０個のＴ細胞エピトープ、又は１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０個のＴ細胞エピトープなどの１１～２０個のＴ細胞エピトープ、又は２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０個のＴ細胞エピトープなどの２１～３０個のＴ細胞エピトープ、又は３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９若しくは４０個のＴ細胞エピトープなどの３１～４０個のＴ細胞エピトープ、又は４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９若しくは５０個のＴ細胞エピトープなどの４１～５０個のＴ細胞エピトープを含む、実施形態１～６２のいずれか１つに記載のベクター。
６４．抗原性ユニットが、Ｔ細胞エピトープリンカーによって分離された複数の離散的なＴ細胞エピトープを含む、実施形態１～６３のいずれか１つに記載のベクター。
６５．標的化ユニットが、細胞を活性化することなく抗原提示細胞上の表面分子と相互作用する部分であるか、又はそれを含む、実施形態１～６４のいずれか１つに記載のベクター。
６６．標的化ユニットが、細胞の成熟を誘導することなく抗原提示細胞上の表面分子と相互作用する部分であるか、又はそれを含む、実施形態１～６５のいずれか１つに記載のベクター。
６７．表面分子が、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、及びＴＧＦβＲ３などのＴＧＦβ受容体、ＩＬ－１０ＲＡ及びＩＬ－１０ＲＢなどのＩＬ－１０Ｒ、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－１１Ｒ、ＩＬ－１３Ｒ、ＩＬ－２７Ｒ、ＩＬ－３５Ｒ、ＩＬ－３７Ｒ、ＧＭ－ＣＳＦＲ、ＦＬＴ３、ＣＣＲ７、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１０３、ＣＤ１４、ＣＤ３６、ＣＤ２０５、ＣＤ１０９、ＶＩＳＴＡ、ＭＡＲＣＯ、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ８３、ＳＩＧＬＥＣ、Ｃｌｅｃ１０Ａ（ＭＧＬ）、ＡＳＧＲ（ＡＳＧＲ１／ＡＳＧＲ２）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｃｌｅｃ９Ａ、Ｃｌｅｃ１２Ａ、Ｃｌｅｃ１２Ｂ、ＤＣＩＲ２、Ｌａｎｇｅｒｉｎ、ＭＲ、ＤＣ－Ｓｉｇｎ、Ｔｒｅｍｌ４、Ｄｅｃｔｉｎ－１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＨＶＥＭ、ＣＤ１６３及びＣＤ１４１からなる群から選択される、実施形態６５又は６６に記載のベクター。
６８．表面分子が、ヒト抗原提示細胞上に存在する表面分子であり、当該表面分子が、ｈＴＧＦβＲ１、ｈＴＧＦβＲ２、及びｈＴＧＦβＲ３などのｈＴＧＦβ受容体、ｈＩＬ－１０ＲＡ及びｈＩＬ－１０ＲＢなどのｈＩＬ－１０Ｒ、ｈＩＬ－２Ｒ、ｈＩＬ－４Ｒ、ｈＩＬ－６Ｒ、ｈＩＬ－１１Ｒ、ｈＩＬ－１３Ｒ、ｈＩＬ－２７Ｒ、ｈＩＬ－３５Ｒ、ｈＩＬ－３７Ｒ、ｈＧＭ－ＣＳＦＲ、ｈＦＬＴ３、ｈＣＣＲ７、ｈＣＤ１１ｂ、ｈＣＤ１１ｃ、ｈＣＤ１０３、ｈＣＤ１４、ｈＣＤ３６、ｈＣＤ２０５、ｈＣＤ１０９、ｈＶＩＳＴＡ、ｈＭＡＲＣＯ、ｈＭＨＣＩＩ、ｈＣＤ８３、ｈＳＩＧＬＥＣ、ｈＣｌｅｃ１０Ａ（ｈＭＧＬ）、ｈＡＳＧＲ（ｈＡＳＧＲ１／ｈＡＳＧＲ２）、ｈＣＤ８０、ｈＣＤ８６、ｈＣｌｅｃ９Ａ、ｈＣｌｅｃ１２Ａ、ｈＣｌｅｃ１２Ｂ、ｈＤＣＩＲ２、ｈＬａｎｇｅｒｉｎ、ｈＭＲ、ｈＤＣ－Ｓｉｇｎ、ｈＴｒｅｍｌ４、ｈＤｅｃｔｉｎ－１、ｈＰＤＬ１、ｈＰＤＬ２、ｈＨＶＥＭ、ｈＣＤ１６３及びｈＣＤ１４１からなる群から選択される、実施形態６５又は６６に記載のベクター。
６９．部分が天然リガンド、抗体若しくはその一部、例えばｓｃＦｖ、又は合成リガンドである、実施形態６５～６８のいずれか１つに記載のベクター。
７０．部分が、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２及びＴＧＦ－β３などのＴＧＦβ、ＩＬ－１０、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３、ＩＬ－２７、ＩＬ－３５、ＩＬ－３７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＩＣＡＭ－１（ＣＤ５４としても知られる細胞間接着分子１）、ケラチン、ＶＳＩＧ－３、好ましくはＶＳＩＧ－３の細胞外ドメイン、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＣＴＬＡ－４、好ましくはＣＴＬＡ－４の細胞外ドメイン、ＰＤ－１、好ましくはＰＤ－１の細胞外ドメイン、並びにＢＴＬＡ、好ましくはＢＴＬＡの細胞外ドメインからなる群から選択される天然リガンドである、実施形態６５～６８のいずれか１つに記載のベクター。
７１．部分が、ｈＴＧＦβ、ｈＩＬ－１０、配列番号５５を有するｈＩＬ－２などのｈＩＬ－２、ｈＩＬ－４、ｈＩＬ－６、ｈＩＬ－１１、ｈＩＬ－１３、ｈＩＬ－２７、ｈＩＬ－３５、ｈＩＬ－３７、配列番号５６を有するｈＧＭ－ＣＳＦなどのｈＧＭ－ＣＳＦ、ｈＦＬＴ３Ｌ、ｈＣＣＬ１９、ｈＣＣＬ２１、ｈＩＣＡＭ－１（ＣＤ５４としても知られる細胞間接着分子１）、ｈケラチン、ｈＶＳＩＧ－３、好ましくはｈＶＳＩＧ－３の細胞外ドメイン、ｈＳＣＧＢ３Ａ２、ｈＣＴＬＡ－４、好ましくは配列番号５１を有するｈＣＴＬＡ４の細胞外ドメインなどのｈＣＴＬＡ－４の細胞外ドメイン、ｈＰＤ－１、好ましくは配列番号５２を有するｈＰＤ－１の細胞外ドメインなどのＰＤ－１の細胞外ドメイン、及びｈＢＴＬＡ、好ましくはｈＢＴＬＡの細胞外ドメインからなる群から選択されるヒト天然リガンドである、実施形態６５～６８のいずれか１つに記載のベクター。
７２．標的化ユニットが、ＩＬ１－１０、ＴＧＦβ－１、ＴＧＦβ－２及びＴＧＦβ－３などのＴＧＦβ、ＳＣＧＢ３Ａ２又はＶＳＩＧ－３、好ましくはＶＳＩＧ－３の細胞外ドメインであるか、又はそれを含む、実施形態６５～７０のいずれか１つに記載のベクター。
７３．標的化ユニットが、ｈＩＬ１－１０、ｈＴＧＦβ－１、ｈＴＧＦβ－２及びｈＴＧＦβ－３などのｈＴＧＦβ、ｈＳＣＧＢ３Ａ２又はｈＶＳＩＧ－３、好ましくはｈＶＳＩＧ－３の細胞外ドメインであるか、又はそれを含む、実施形態６５～７０のいずれか１つに記載のベクター。
７４．多量体化ユニットが、二量体化ユニット、三量体化ユニット、例えばコラーゲン由来三量体化ユニット、例えばヒトコラーゲン由来三量体化ドメイン、例えばヒトコラーゲン由来ＸＶＩＩＩ三量体化ドメイン若しくはヒトコラーゲンＸＶ三量体化ドメイン又はＴ４フィブリチンのＣ末端ドメイン、及び四量体化ユニット、例えばｐ５３に由来するドメインからなる群から選択され、当該多量体化ユニットが、ヒンジ領域、例えばヒンジエクソンｈ１及びヒンジエクソンｈ４、好ましくはＩｇＧ３のヒンジエクソンｈ１及びヒンジエクソンｈ４を任意選択で含む、実施形態１～７３のいずれか１つに記載のベクター。
７５．ベクターが、１つ以上の共有結合を形成する能力を有するヒンジ領域を含む、実施形態７４に記載のベクター。
７６．ヒンジ領域が、Ｉｇ由来である、実施形態７４又は７５に記載のベクター。
７７．多量体化ユニットが、二量体化ユニットであり、当該二量体化ユニットが、二量体化を促進する別のドメインを更に含む、実施形態７４～７６のいずれか１つに記載のベクター。
７８．他のドメインが、免疫グロブリンドメイン、好ましくは免疫グロブリン定常ドメインである、実施形態７７に記載のベクター。
７９．他のドメインが、ＩｇＧ、好ましくはＩｇＧ３に由来するカルボキシ末端Ｃドメインである、実施形態７７又は７８に記載のベクター。
８０．二量体化ユニットが、ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧなどのグリシン－セリンリッチリンカーなどの二量体化ユニットリンカーを更に含む、実施形態７７～７９のいずれか１つに記載のベクター。
８１．二量体化ユニットリンカーが、ヒンジ領域と二量体化を促進する他のドメインとを接続する、実施形態８０に記載のベクター。
８２．二量体化ユニットが、ヒンジエクソンｈ１及びヒンジエクソンｈ４、二量体化ユニットリンカー、並びにヒトＩｇＧ３由来のＣＨ３ドメインを含む、実施形態７７～８１のいずれか１つに記載のベクター。
８３．二量体化ユニットが、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態８２に記載のベクター。
８４．二量体化ユニットが、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、実施形態８３に記載のベクター。
８５．二量体化ユニットが、配列番号１のアミノ酸配列からなる、実施形態８４に記載のベクター。
８６．第１の核酸配列が、抗原性ユニットを多量体化ユニットに接続するユニットリンカーを更に含む第１のポリペプチドをコードし、ユニットリンカーが、非免疫原性リンカー及び／又は可動性リンカー若しくは剛性リンカーである、実施形態１～８５のいずれか１つに記載のベクター。
８７．第１の核酸配列が、シグナルペプチドを更に含む第１のポリペプチドをコードする、実施形態１～８６のいずれか１つに記載のベクター。
８８．シグナルペプチドが、標的化ユニットであるタンパク質の天然のリーダー配列である、実施形態８７に記載のベクター。
８９．シグナルペプチドが、ヒトＩｇ ＶＨシグナルペプチド、ｈＴＧＦ－β１のシグナルペプチド、ｈＴＧＦ－β２のシグナルペプチド、ｈＴＧＦ－β３のシグナルペプチド、ｈＩＬ－１０のシグナルペプチド、ｈＩＬ－２のシグナルペプチド、ｈＩＬ－４のシグナルペプチド、ｈＩＬ－６のシグナルペプチド、ｈＩＬ－１１のシグナルペプチド、ｈＩＬ－１３のシグナルペプチドｈＩＬ－２７のシグナルペプチド、ｈＩＬ－３５のシグナルペプチド、ｈＩＬ－３７のシグナルペプチド、ｈＧＭ－ＣＳＦのシグナルペプチド、ｈＦＬＴ３Ｌのシグナルペプチド、ｈＣＣＬ１９のシグナルペプチド、ｈＣＣＬ２１のシグナルペプチド、ｈＩＣＡＭ－１のシグナルペプチド、ｈケラチンのシグナルペプチド、ｈＶＳＩＧ－３のシグナルペプチド、ｈＳＣＧＢ３Ａ２のシグナルペプチド、ｈＣＴＬＡ－４のシグナルペプチド、ｈＰＤ－１のシグナルペプチド、及びｈＢＴＬＡのシグナルペプチドからなる群から選択される、実施形態８７又は８８に記載のベクター。
９０．１つ以上の更なる核酸配列が、シグナルペプチドを更に含む１つ以上の免疫阻害化合物をコードする、実施形態１～８９のいずれか１つに記載のベクター。
９１．シグナルペプチドが、免疫阻害化合物の天然のリーダー配列である、実施形態９０に記載のベクター。
９２．シグナルペプチドが、ｈＣＬＴＡ－４のシグナルペプチド、ｈＰＤ－１のシグナルペプチド、ｈＢＴＬＡのシグナルペプチド、ｈＬＡＧ３のシグナルペプチド、ｈＮＯＸ２のシグナルペプチド、ｈＳＩＧＬＥＣ７のシグナルペプチド、ｈＳＩＧＬＥＣ９のシグナルペプチド、ｈＴＩＭ－３のシグナルペプチド、ｈＩＬ－１０のシグナルペプチド、ｈＴＧＦ－β１のシグナルペプチド、ｈＴＧＦ－β２のシグナルペプチド、ｈＴＧＦ－β３のシグナルペプチド、ｈＩＬ－２７のシグナルペプチド、ｈＩＬ－２のシグナルペプチド、ｈＧＭ－ＣＳＦのシグナルペプチド、ｈＦＬＴ３Ｌのシグナルペプチド、ｈＩＦＮ－γのシグナルペプチド、並びにｈＩＬ－３７のシグナルペプチド及びｈＩＬ－３５のシグナルペプチドからなる群から選択されるシグナルペプチドからなる群から選択される、実施形態９０～９１のいずれか１つに記載のベクター。
９３．ベクターが、ＲＮＡウイルスベクター若しくはＤＮＡウイルスベクターなどのウイルスベクター、又はＲＮＡプラスミド若しくはＤＮＡプラスミドなどのプラスミドである、実施形態１～９２のいずれか１つに記載のベクター。
９４．ベクターが、ＤＮＡウイルスベクター又はＤＮＡプラスミド、好ましくはＤＮＡプラスミドである、実施形態１～９３のいずれか１つに記載のベクター。
９５．実施形態１～９４のいずれか１つに記載のベクターを産生する方法であって、
ａ）細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで、ベクターを用いてトランスフェクトすることと、
ｂ）当該細胞を培養することと、
ｃ）任意選択で、細胞を溶解して、ベクターを細胞から放出させることと、
ｄ）ベクターを回収し、任意選択で精製することと、を含む、方法。
９６．原核生物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、動物又はヒト由来の細胞などの高等真核細胞からなる群から選択される宿主細胞などの、実施形態１～９４のいずれか１つに記載のベクターを含む宿主細胞。
９７．医薬品として使用するための、実施形態１～９４のいずれか１つに記載のベクター。
９８．実施形態１～９４のいずれか１つに記載のベクターと、薬学的に許容される担体又は希釈剤と、を含む、医薬組成物。
９９．薬学的に許容される担体又は希釈剤が、生理食塩水、ＰＢＳなどの緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、等張水性緩衝液及びタイロード緩衝液、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態９８に記載の医薬組成物。
１００．トランスフェクション剤を更に含む、実施形態９８又は９９に記載の医薬組成物。
１０１．ポリ（エチレンオキシド）及びポリ（プロピレンオキシド）のブロックを含む薬学的に許容される両親媒性ブロックコポリマーを更に含み、例えば、ポリ（エチレンオキシド）及びポリ（プロピレンオキシド）のブロックを含む薬学的に許容される両親媒性ブロックコポリマーを、０．２％ｗ／ｖ～２０％ｗ／ｖの量で更に含む、実施形態９８～１００のいずれか１つに記載の組成物。
１０２．アジュバント、例えば、デキサメタゾン、エンテロトキシンコレラ毒素（ＣＴＢ）のＢサブユニット、ＴＬＲ２リガンド、蠕虫由来の排泄／分泌（ＥＳ）産物、ラパマイシンビタミンＤ３類似体及びアリール炭化水素受容体リガンドからなる群から選択されるアジュバントを更に含む、実施形態９８～１０１のいずれか１つに記載の組成物。
１０３．当該ベクター、例えば当該ＤＮＡプラスミドを０．１～１０ｍｇの範囲で含む、実施形態９８～１０２のいずれか１つに記載の医薬組成物。
１０４．自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶反応からなる群からの免疫疾患を有する対象又はその予防を必要とする対象を治療する方法であって、実施形態１～９４のいずれか１つに記載のベクター又は実施形態９８～１０３のいずれか１つに記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。
１０５．ベクター又は医薬組成物が、治療有効量又は予防有効量で投与される、実施形態１０４に記載の方法。
１０６．ベクター又は医薬組成物が、皮内、筋肉内、若しくは皮下注射によって、又は鼻腔内若しくは経口などの粘膜適用若しくは上皮適用によって投与される、実施形態１０４又は１０５に記載の方法。
１０７．自己免疫疾患を有する対象又はその予防を必要とする対象を治療する方法であって、実施形態１～４１のいずれか１つに記載のベクターを含むベクター、又はこのようなベクターを含む実施形態９８～１０３のいずれか１つに記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。
１０８．ベクター又は医薬組成物が、治療有効量で投与される、実施形態１０７に記載の方法。
１０９．ベクター又は医薬組成物が、皮内、筋肉内、若しくは皮下注射によって、又は鼻腔内若しくは経口などの粘膜適用若しくは上皮適用によって投与される、実施形態１０７又は１０８に記載の方法。
１１０．アレルギー性疾患を有する対象又はその予防を必要とする対象を治療する方法であって、実施形態１～２８若しくは４２～５０のいずれか１つに記載のベクターを含むベクター、又はこのようなベクターを含む実施形態９８～１０３のいずれか１つに記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。
１１１．ベクター又は医薬組成物が、治療有効量で投与される、実施形態１１０に記載の方法。
１１２．ベクター又は医薬組成物が、皮内、筋肉内、若しくは皮下注射によって、又は鼻腔内若しくは経口などの粘膜適用若しくは上皮適用によって投与される、実施形態１１０又は１１１に記載の方法。
１１３．移植片拒絶反応を有する対象又はその予防を必要とする対象を治療する方法であって、実施形態１～２８若しくは５１～５６のいずれか１つに記載のベクターを含むベクター、又はこのようなベクターを含む実施形態９８～１０３のいずれか１つに記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。
１１４．ベクター又は医薬組成物が、治療有効量で投与される、実施形態１１３に記載の方法。
１１５．ベクター又は医薬組成物が、皮内、筋肉内、若しくは皮下注射によって、又は鼻腔内若しくは経口などの粘膜適用若しくは上皮適用によって投与される、実施形態１１３又は１１４に記載の方法。

Claims (51)

  1. （ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、前記第１のポリペプチドが、抗原提示細胞を標的とする標的化ユニット、二量体化ユニットなどの多量体化ユニット、及び抗原性ユニットを含み、前記抗原性ユニットが、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、第１の核酸配列と、
    （ｂ）１つ以上の免疫阻害化合物をコードする１つ以上の更なる核酸配列と、を含み、
    前記第１のポリペプチド及び前記１つ以上の免疫阻害化合物を別個の分子として共発現させることを可能にする、ベクター。
  2. 前記１つ以上の免疫阻害化合物が、免疫寛容を誘導し、及び／又は免疫寛容を増加させ、及び／又は免疫寛容を維持する、請求項１に記載のベクター。
  3. 前記１つ以上の免疫阻害化合物が、阻害性チェックポイント分子の細胞外ドメインなどの細胞外部分である、請求項１又は２に記載のベクター。
  4. 前記阻害性チェックポイント分子が、ＣＬＴＡ－４、ＰＤ－１、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＮＯＸ２、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９及びＴＩＭ－３からなる群から選択され、好ましくは、ｈＣＬＴＡ－４、ｈＰＤ－１、ｈＢＴＬＡ、ｈＬＡＧ３、ｈＮＯＸ２、ｈＳＩＧＬＥＣ７、ｈＳＩＧＬＥＣ９及びｈＴＩＭ－３からなる群から選択されるヒト阻害性チェックポイント分子である、請求項３に記載のベクター。
  5. 前記免疫阻害化合物が、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＩＬ－２７、ＩＬ－２、ＧＭ－ＣＳＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－３７及びＩＬ－３５からなる群から選択されるサイトカイン、好ましくはｈＩＬ－１０、ｈＴＧＦ－β１、ｈＴＧＦ－β２、ｈＴＧＦ－β３、ｈＩＬ－２７、ｈＩＬ－２、ｈＧＭ－ＣＳＦ、ｈＦＬＴ３Ｌ、ｈＩＦＮ－γ、ｈＩＬ－３７及びｈＩＬ－３５からなる群から選択されるヒトサイトカインである、請求項１又は２に記載のベクター。
  6. 前記ベクターが、２つ以上の免疫阻害化合物、例えば２、３、４、５、６、７又は８つの免疫阻害化合物、例えば２、３、４、５、６、７又は８つの異なる免疫阻害化合物をコードする複数の更なる核酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のベクター。
  7. １つ以上の共発現エレメントを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のベクター。
  8. 前記１つ以上の共発現エレメントが、単一の転写物上での前記第１のポリペプチド及び前記１つ以上の免疫阻害化合物の転写、並びに別個の第１のポリペプチド及び別個の１つ以上の免疫阻害化合物への独立した翻訳を引き起こす、請求項７に記載のベクター。
  9. 前記１つ以上の共発現エレメントが、ＩＲＥＳエレメント又は２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸配列である、請求項７又は８に記載のベクター。
  10. 前記１つ以上の共発現エレメントが、前記第１のポリペプチド及び前記１つ以上の免疫阻害化合物の転写を別個の転写物として引き起こす、請求項９に記載のベクター。
  11. 前記１つ以上の共発現エレメントが、ａ）双方向プロモーター、又はｂ）プロモーターであり、前記ベクターが、前記第１のポリペプチド及び前記１つ以上の免疫阻害化合物をコードする核酸配列のそれぞれについて別個のプロモーターを含む、請求項１０に記載のベクター。
  12. 前記抗原性ユニットが、自己抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のベクター。
  13. 前記抗原性ユニットが、１つ以上の自己抗原の複数のＴ細胞エピトープを含む、請求項１２に記載のベクター。
  14. 前記１つ以上の自己抗原が、多発性硬化症に関与する自己抗原、１型糖尿病に関与する自己抗原、セリアック病に関与する自己抗原、関節リウマチに関与する自己抗原、慢性炎症性脱髄性多発神経炎に関与する自己抗原、橋本甲状腺炎に関与する自己抗原、落葉状天疱瘡に関与する自己抗原、尋常性天疱瘡に関与する自己抗原、甲状腺眼症に関与する自己抗原、バセドウ病に関与する自己抗原、原発性胆汁性肝硬変に関与する自己抗原、重症筋無力症に関与する自己抗原、インスリン抵抗性糖尿病に関与する自己抗原、溶血性貧血に関与する自己抗原、及び乾癬に関与する自己抗原からなる群から選択される、請求項１３に記載のベクター。
  15. 前記抗原性ユニットが、アレルゲンの１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のベクター。
  16. 前記抗原性ユニットが、１つ以上のアレルゲンの複数のＴ細胞エピトープを含む、請求項１５に記載のベクター。
  17. 前記１つ以上のアレルゲンが、甲殻類アレルゲン、牛乳アレルゲン、卵アレルゲン、魚アレルゲン、果実アレルゲン、小麦アレルゲン、ピーナッツアレルゲン、木の実アレルゲン、大豆アレルゲン、種子アレルゲン、そばアレルゲン、セロリアレルゲン、ニンニクアレルゲン、グルテンアレルゲン、オート麦アレルゲン、豆類アレルゲン、トウモロコシアレルゲン、乳アレルゲン、マスタードアレルゲン、ナッツアレルゲン、家禽アレルゲン、肉アレルゲン、米アレルゲン、ゴマアレルゲン、ハチ毒アレルゲン、スズメバチアレルゲン、ラテックスアレルゲン、チリダニアレルゲン、昆虫アレルゲン、カビアレルゲン、真菌アレルゲン、毛皮動物アレルゲン、花粉アレルゲン及び薬物アレルゲンからなる群から選択される、請求項１６に記載のベクター。
  18. 前記抗原性ユニットが、第ＶＩＩＩ因子、インスリン及び治療用モノクローナル抗体からなる群から選択される薬物の薬物アレルゲンの１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、請求項１５～１７のいずれか一項に記載のベクター。
  19. 前記抗原性ユニットが、同種抗原又は異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のベクター。
  20. 前記抗原性ユニットが、１つ以上の同種抗原の複数のＴ細胞エピトープ、又は１つ以上の異種抗原の複数のＴ細胞エピトープを含む、請求項１２に記載のベクター。
  21. 前記抗原性ユニットが、Ｔ細胞エピトープリンカーによって分離された複数の離散的なＴ細胞エピトープを含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のベクター。
  22. 前記抗原性ユニットが、１つ以上のホットスポットに含まれる最小Ｔ細胞エピトープである複数のＴ細胞エピトープを含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載のベクター。
  23. 前記標的化ユニットが、前記細胞を活性化することなく、前記抗原提示細胞上の表面分子と相互作用する部分であるか、又はそれを含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載のベクター。
  24. 前記標的化ユニットが、前記細胞の成熟を誘導することなく、前記抗原提示細胞上の表面分子と相互作用する部分であるか、又はそれを含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載のベクター。
  25. 前記表面分子が、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、及びＴＧＦβＲ３などのＴＧＦβ受容体、ＩＬ－１０ＲＡ及びＩＬ－１０ＲＢなどのＩＬ－１０Ｒ、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－１１Ｒ、ＩＬ－１３Ｒ、ＩＬ－２７Ｒ、ＩＬ－３５Ｒ、ＩＬ－３７Ｒ、ＧＭ－ＣＳＦＲ、ＦＬＴ３、ＣＣＲ７、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１０３、ＣＤ１４、ＣＤ３６、ＣＤ２０５、ＣＤ１０９、ＶＩＳＴＡ、ＭＡＲＣＯ、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ８３、ＳＩＧＬＥＣ、Ｃｌｅｃ１０Ａ（ＭＧＬ）、ＡＳＧＲ（ＡＳＧＲ１／ＡＳＧＲ２）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｃｌｅｃ９Ａ、Ｃｌｅｃ１２Ａ、Ｃｌｅｃ１２Ｂ、ＤＣＩＲ２、Ｌａｎｇｅｒｉｎ、ＭＲ、ＤＣ－Ｓｉｇｎ、Ｔｒｅｍｌ４、Ｄｅｃｔｉｎ－１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＨＶＥＭ、ＣＤ１６３及びＣＤ１４１からなる群から選択される、請求項２３又は２４に記載のベクター。
  26. 前記表面分子が、ヒト抗原提示細胞上に存在する表面分子であり、前記表面分子が、ｈＴＧＦβＲ１、ｈＴＧＦβＲ２、及びｈＴＧＦβＲ３などのｈＴＧＦβ受容体、ｈＩＬ－１０ＲＡ及びｈＩＬ－１０ＲＢなどのｈＩＬ－１０Ｒ、ｈＩＬ－２Ｒ、ｈＩＬ－４Ｒ、ｈＩＬ－６Ｒ、ｈＩＬ－１１Ｒ、ｈＩＬ－１３Ｒ、ｈＩＬ－２７Ｒ、ｈＩＬ－３５Ｒ、ｈＩＬ－３７Ｒ、ｈＧＭ－ＣＳＦＲ、ｈＦＬＴ３、ｈＣＣＲ７、ｈＣＤ１１ｂ、ｈＣＤ１１ｃ、ｈＣＤ１０３、ｈＣＤ１４、ｈＣＤ３６、ｈＣＤ２０５、ｈＣＤ１０９、ｈＶＩＳＴＡ、ｈＭＡＲＣＯ、ｈＭＨＣＩＩ、ｈＣＤ８３、ｈＳＩＧＬＥＣ、ｈＣｌｅｃ１０Ａ（ｈＭＧＬ）、ｈＡＳＧＲ（ｈＡＳＧＲ１／ｈＡＳＧＲ２）、ｈＣＤ８０、ｈＣＤ８６、ｈＣｌｅｃ９Ａ、ｈＣｌｅｃ１２Ａ、ｈＣｌｅｃ１２Ｂ、ｈＤＣＩＲ２、ｈＬａｎｇｅｒｉｎ、ｈＭＲ、ｈＤＣ－Ｓｉｇｎ、ｈＴｒｅｍｌ４、ｈＤｅｃｔｉｎ－１、ｈＰＤＬ１、ｈＰＤＬ２、ｈＨＶＥＭ、ｈＣＤ１６３及びｈＣＤ１４１からなる群から選択される、請求項２５に記載のベクター。
  27. 前記部分が、天然リガンド、抗体若しくはその一部、例えばｓｃＦｖ、又は合成リガンドである、請求項２３～２６のいずれか一項に記載のベクター。
  28. 前記部分が、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２及びＴＧＦ－β３などのＴＧＦβ、ＩＬ－１０、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３、ＩＬ－２７、ＩＬ－３５、ＩＬ－３７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＩＣＡＭ－１、ケラチン、ＶＳＩＧ－３、好ましくはＶＳＩＧ－３の細胞外ドメイン、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＣＴＬＡ－４、好ましくはＣＴＬＡ－４の細胞外ドメイン、ＰＤ－１、好ましくはＰＤ－１の細胞外ドメイン、及びＢＴＬＡ、好ましくはＢＴＬＡの細胞外ドメインからなる群から選択される天然リガンドである、請求項２７に記載のベクター。
  29. 前記部分が、ｈＴＧＦβ、ｈＩＬ－１０、ｈＩＬ－２、ｈＩＬ－４、ｈＩＬ－６、ｈＩＬ－１１、ｈＩＬ－１３、ｈＩＬ－２７、ｈＩＬ－３５、ｈＩＬ－３７、ｈＧＭ－ＣＳＦ、ｈＦＬＴ３Ｌ、ｈＣＣＬ１９、ｈＣＣＬ２１、ｈＩＣＡＭ－１、ｈケラチン、ｈＶＳＩＧ－３、好ましくはｈＶＳＩＧ－３の細胞外ドメイン、ｈＳＣＧＢ３Ａ２、ｈＣＴＬＡ－４、好ましくはｈＣＴＬＡ－４の細胞外ドメイン、ｈＰＤ－１、好ましくはＰＤ－１の細胞外ドメイン、及びｈＢＴＬＡ、好ましくはｈＢＴＬＡの細胞外ドメインからなる群から選択されるヒト天然リガンドである、請求項２８に記載のベクター。
  30. 前記標的化ユニットが、ｈＩＬ１－１０、ｈＴＧＦβ－１、ｈＴＧＦβ－２及びｈＴＧＦβ－３などのｈＴＧＦβ、ｈＳＣＧＢ３Ａ２又はｈＶＳＩＧ－３、好ましくはｈＶＳＩＧ－３の細胞外ドメインであるか、又はそれを含む、請求項２３～２９のいずれか一項に記載のベクター。
  31. 前記多量体化ユニットが、二量体化ユニット、三量体化ユニット、例えばコラーゲン由来三量体化ユニット、例えばヒトコラーゲン由来三量体化ドメイン、例えばヒトコラーゲン由来ＸＶＩＩＩ三量体化ドメイン若しくはヒトコラーゲンＸＶ三量体化ドメイン又はＴ４フィブリチンのＣ末端ドメイン、並びに四量体化ユニット、例えばｐ５３に由来するドメインからなる群から選択され、前記多量体化ユニットが、ヒンジ領域、例えばヒンジエクソンｈ１及びヒンジエクソンｈ４を任意選択で含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載のベクター。
  32. １つ以上の共有結合を形成する能力を有し、好ましくはＩｇ由来であるヒンジ領域を含む、請求項３１に記載のベクター。
  33. 前記多量体化ユニットが、二量体化ユニットであり、前記二量体化ユニットが、二量体化を促進する別のドメインを更に含み、好ましくは、他のドメインが、免疫グロブリンドメイン、より好ましくは、免疫グロブリン定常ドメインである、請求項３１又は３２に記載のベクター。
  34. 他のドメインが、ＩｇＧ、好ましくは、ＩｇＧ３に由来するカルボキシ末端Ｃドメインである、請求項３３に記載のベクター。
  35. 前記二量体化ユニットが、ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧなどのグリシン－セリンリッチリンカーなどの二量体化ユニットリンカーを更に含み、好ましくは、前記二量体化ユニットリンカーが、前記ヒンジ領域と、二量体化を促進する他のドメインとを接続する、請求項３３又は３４に記載のベクター。
  36. 前記二量体化ユニットが、ヒンジエクソンｈ１及びヒンジエクソンｈ４、二量体化ユニットリンカー、並びにヒトＩｇＧ３由来のＣＨ３ドメインを含む、請求項３３～３５のいずれか一項に記載のベクター。
  37. 前記第１の核酸配列が、前記抗原性ユニットを前記多量体化ユニットに接続するユニットリンカーを更に含む、第１のポリペプチドをコードし、前記ユニットリンカーが、非免疫原性リンカー及び／又は可動性リンカー若しくは剛性リンカーである、請求項１～３６のいずれか一項に記載のベクター。
  38. 前記第１の核酸配列が、シグナルペプチドを更に含む第１のポリペプチドをコードし、好ましくは、前記１つ以上の更なる核酸配列もシグナルペプチドを更にコードする、請求項１～３７のいずれか一項に記載のベクター。
  39. 前記ベクターが、ＲＮＡウイルスベクター若しくはＤＮＡウイルスベクターなどのウイルスベクター、又はＲＮＡプラスミド若しくはＤＮＡプラスミドなどのプラスミドである、請求項１～３８のいずれか一項に記載のベクター。
  40. 請求項１～３９のいずれか一項に記載のベクターを産生する方法であって、
    ａ）細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで、前記ベクターを用いてトランスフェクトすることと、
    ｂ）前記細胞を培養することと、
    ｃ）任意選択で、前記細胞を溶解して、前記ベクターを前記細胞から放出させることと、
    ｄ）前記ベクターを回収し、任意選択で精製することと、を含む、方法。
  41. 原核生物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、動物又はヒト由来の細胞などの高等真核細胞からなる群から選択される宿主細胞などの、請求項１～３９のいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞。
  42. 医薬品として使用するための、請求項１～３９のいずれか一項に記載のベクター。
  43. 請求項１～３９のいずれか一項に記載のベクターと、薬学的に許容される担体又は希釈剤と、を含む、医薬組成物。
  44. トランスフェクション剤を更に含む、請求項４３に記載の医薬組成物。
  45. デキサメタゾン、エンテロトキシンコレラ毒素（ＣＴＢ）のＢサブユニット、ＴＬＲ２リガンド、蠕虫由来の排泄／分泌（ＥＳ）産物、ラパマイシンビタミンＤ３類似体、及びアリール炭化水素受容体リガンドからなる群から選択されるアジュバントなどのアジュバントを更に含む、請求項４３又は４４に記載の医薬組成物。
  46. 前記ベクター、例えば前記ＤＮＡプラスミドを０．１～１０ｍｇの範囲で含む、請求項４３～４５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  47. 自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶反応からなる群からの免疫疾患を有する対象又はその予防を必要とする対象を治療する方法であって、請求項１～３９のいずれか一項に記載のベクター、又は請求項４３～４６のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  48. 自己免疫疾患を有する対象又はその予防を必要とする対象を治療する方法であって、請求項１～１４及び２１～３９のいずれか一項に記載のベクター、又はこのようなベクターを含む請求項４３～４６のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  49. アレルギー性疾患を有する対象又はその予防を必要とする対象を治療するための方法であって、請求項１～１１、１５～１８及び２１～３９のいずれか一項に記載のベクター、又はこのようなベクターを含む請求項４３～４６のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  50. 移植片拒絶反応を有する対象又はその予防を必要とする対象を治療するための方法であって、請求項１～１１及び１９～３９のいずれか一項に記載のベクター、又はこのようなベクターを含む請求項４３～４６のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  51. 前記ベクター又は前記医薬組成物が、治療有効量又は予防有効量で投与される、例えば、皮内注射、筋肉内注射、若しくは皮下注射によって、又は粘膜適用若しくは上皮適用、例えば、鼻腔内適用若しくは経口適用によって投与される、請求項４７～５０のいずれか一項に記載の方法。
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