TWI728201B - 耐受性dna疫苗 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於用於預防及/或延遲例如第1型糖尿病的質體。
Description
本發明係關於用於降低抗原專一性T細胞反應性的耐受性DNA免疫療法疫苗。
根據傳統疫苗方法,將純化的蛋白質/抗原注射至人/患者/動物以刺激專一性針對該蛋白質/抗原的免疫反應。此疫苗方法傾向主要影響抗體生產,而T細胞除了產生對該抗原的T細胞記憶以外,傾向不被顯著地影響。因此,對於T細胞驅動之疾病的治療及/或預防(諸如第1型糖尿病(T1D)),傳統疫苗方法不被認為是適用的,因為T細胞(特別是CD8+細胞)之活化被認為是這種疾病的成因媒介。已有使用耐受性、基於蛋白質的疫苗之實驗性方法,其主要以產生抗體的B細胞而非與疾病相關的T細胞為目標。
基於DNA的疫苗,與基於蛋白質的疫苗形成對比,通常是編碼特定抗原的質體-這些質體被宿主身體的細胞攝入(「轉染」)。接著,這些被轉染的宿主細胞生產抗原並將抗原加工成小片段(T細胞表位)以用於呈現給免疫系統,特別是循環中的T細胞。由於T細胞僅能偵測這些小抗原片段而非整個蛋白質,這種方法優先引發T細胞反應的改變,特別是 CD8+細胞(或胞毒T細胞),其為(例如)T1D病理學的關鍵驅動者。因此,DNA疫苗適合用於誘導T細胞反應而非蛋白質疫苗。雖然目前沒有用可供人類使用的DNA疫苗,有三種刺激性質體DNA疫苗核准用於獸醫用途,包括對馬傳染性貧血病毒、西尼羅病毒以及某些犬類癌症的免疫。
與刺激性DNA疫苗形成比,耐受性DNA免疫療法疫苗意欲抑制對抗原的免疫反應性而非活化針對其之免疫反應。這類疫苗不刺激針對編碼抗原的免疫或改變刺激的類型(如在例如對於過敏的抗原去敏化疫苗接種方法所進行的),而是造成自我反應性T細胞的空竭、及/或缺乏功能、及/或死亡。為了能如此進行,抗原必須呈現給免疫系統而無共刺激或發炎效應,否則其會起始刺激性免疫反應。此呈現被免疫系統忽略(或耐受)的抗原之方法具有治療自體免疫疾病方面的價值,因為這種疾病的特定機制會因此被靶定而非全身性地抑制全部的免疫反應。因此,耐受性DNA免疫療法疫苗是調節不欲的免疫反應之溫和方法。
T1D專一耐受性DNA免疫療法疫苗的最終目的是保留β細胞功能及內源胰島素生產。此可藉由疾病的預防或延遲(對小兒科及年輕成人族群是特別有價值的,於該等族群中監測是困難的且生活的「常態」是主要的患病因素)或延長通常發生在T1D診斷後前六個月之最小監測及胰島素使用的「蜜月期」而發生。
雖然基於DNA的疫苗已知是安全的,沒有已在臨床研究中測試的(刺激性或耐受性)DNA疫苗具有足夠的效力以作為治療(例如)T1D的單獨方法。技術領域中已知的耐受性DNA疫苗顯示貧乏的效力且典型地需要高度人工系統來誘導所欲功效。因此,技術領域中需要具有顯著 增加的效力、無安全性方面的妥協且較佳亦無需麻煩的投予方案之耐受性DNA免疫療法疫苗。
本發明係關於多重順反子的載體/質體,其共表現/編碼細胞保留抗原(諸如胰島素)以及分泌的免疫修飾物(諸如TGF-β、IL-10及視需要的IL-2)。本發明進一步關於包含這類質體的DNA免疫療法疫苗以及這類醫藥調配物及其套組。本發明最終關於這類產品的醫藥用途以及生產這類質體的方法。
本文之質體/DNA免疫療法疫苗對主要由T細胞驅動的自體免疫疾病(諸如第一型糖尿病,T1D)之治療具有治療潛力。
在一個態樣中,本發明提供編碼以下者之質體:i. 胰島素抗原;ii. TGF-β;及iii. IL-10。
圖1. 環狀質體圖譜。
圖2. 來自圖1之質體的載體產物之mRNA及轉譯之蛋白質圖譜。
圖3. 三次注射通過G30針頭的質體剪力穩定性。
圖4. 藉由在30℃下生長之質體保留表型之確認(使用17小時之培養的繼代1-50及使用22小時之培養的繼代51-100)。
本發明之發明人於本文中提供驅動多重分泌細胞介素以及細胞保留抗原從單一啟動子/多重順反子mRNA表現的單一載體。
由於細胞以不同載體之隨機轉染不能保證從給定的特定轉染細胞表現所有組分,或甚至組分之特定比例,相較於使用分開的各自驅動單一組分之表現的載體/質體之混合物的免疫療法疫苗接種,在單一細胞中使用編碼所有療法組分的單一載體之DNA免疫療法疫苗接種是受到高度青睞的。
單一多重順反子質體/載體的轉染在經轉染細胞周圍產生特定工程改造的局部環境/微環境。如此一來,可對抗原加上免疫調節物的組合,使得其等能夠實現所欲之單一T細胞的免疫功效而無須全身性免疫調劑物高劑量之需求,否則其會造成不利事件以及廣泛的免疫抑制。
此經DNA免疫療法疫苗轉染之宿主細胞的免疫調節物生產之局部限制使得能夠在沒有不可接受之不利事件的情況下安全使用具有高度效力的細胞介素激素(其對於T細胞反應之改變有協同性,但不能為了功效而足夠頻繁地給藥及/或為提供所欲的反應滴定給藥)。
舉例來說,介白素-10(IL-10)及轉形生長因子-β1(TGF-β1)皆已知為能夠從初始CD4+ T細胞誘導調節性T細胞(Treg)。然而,IL-10/TGF-β1組合相較於該兩種細胞介素中的單獨任一者對誘導Treg提供了協同功效(更有效15至20倍)(US6083919 A)且相較於單獨細胞介素各者,此組合進一步在更廣的目標細胞族群中產生免疫耐受性(Zeller JC,Panoskaltsis-Mortari A,Murphy WJ,et.al.1999 J Immunol.163(7):3684-91)。
此外,已知介白素-2(IL-2)會擴展並穩定Treg但另一方面 可能會促成發炎反應。然而,IL-2和IL-10的組合產生抑制性Treg而非發炎性刺激。當循環的T細胞遇到本文中經DNA免疫療法疫苗轉染的細胞,其暫時性地暴露於IL-10及IL-2的次優濃度。所述循環的T細胞些微偏向耐受性,且若其亦對共表現的抗原(例如胰島素)有反應性,其會結合至所述轉染的細胞並因此經受較長的免疫調節物暴露期間,且除此之外其亦會收到其他將其對抑制性功效進行設定/再教化的訊號。如此一來,當那些對所編碼之抗原有反應性的T細胞遇到經轉染的細胞時,其被選擇性地再教化為抑制性表型。
因此,本文的質體/載體/DNA免疫療法疫苗被設計用以誘導抗原專一性Treg在自體免疫的位置累積以減輕疾病(例如:T1D中的胰臟)而非直接經由所表現的細胞介素激素直接影響疾病。
除了抗原(在T1D的例子中為胰島素)以外,本文的載體/操縱組/質體編碼至少兩種細胞介素(例如:TGF-β1和IL-10),其一起協同性地抑制抗原呈現細胞以及T細胞功能,並驅動Treg的誘導。如果與對抗原的有效暴露組合發生時會增強此效果。
在一個具體實例中,TGF-β1呈持續活化型(constitutively active form),其不需要加工或發炎環境來執行功能。雖然Treg可從初始T細胞經由暴露至抗原及TGF-β1來產生,然而,Treg為「可塑性的」,意思是其可被去分化並轉變成Th17效應細胞並接著造成更多(而非更少)的自體免疫破壞。IL-10與TGF-β1的組合除了是更有效的免疫調節物,還抑制會產生病原性Th17細胞而非Treg的環境。
在一個具體實例中,本文的多重順反子載體在抗原、 TGF-β1、IL-10之外還編碼IL-2。IL-2擴增Treg數目並穩定其表型(防止Treg細胞去分化成效應T細胞)且因此增加其在發炎目標組織的功能性生命全期。
因此,這三種細胞介素(TGF-β1、IL-10及IL-2)與抗原組合經由以下機制對誘導耐受性具有為人所熟知的協同功效:(i)顯著加強抗原專一性抑制性Treg的產生,(ii)更長的Treg生命全期,及(iii)每個各別Treg細胞在抑制發炎/自體反應性方面更強的功效。然而,全身性輸注所需的經純化之細胞介素的濃度會有一些嚴重、或甚至致命的副作用,諸如:(i)過量TGF-β1造成的致命性纖維化,(ii)類似流感的症狀,(iii)過量IL-2造成的微血管滲漏症候群,(iv)廣泛的免疫抑制導致的慢性感染,(v)增強的腫瘤發展以及(vi)過量IL-10造成的貧血。
藉由從相同的載體/質體共表現這些細胞介素,且因此藉由相同細胞將抗原呈現給免疫系統,所述載體達成對於耐受性誘導所欲的局部環境,而不會有在其他狀況下由投予高劑量經純化的細胞介素所導致的全身性作用以及相對應的副作用。
注射「裸(naked/bare)」質體/載體DNA(僅載體及緩衝液)僅有相當低的攝取及轉染率-約十萬個質體分子不到一個轉染細胞,而其他的皆被降解且因此無任何生物功效。此極低的轉染無效率對於轉染細胞的分佈及限制提供了安全性機制。
投予任何所述細胞介素的全身性活性量(不論是藉由成熟蛋白質的投予或藉由高效病毒載體轉導)以滴定安全且有效的劑量如果不是不可能的,就是困難的。將總暴露限制在分佈於一些高度表現的微環境之 非常小的全身性劑量會產生高度有利的安全性及效力特性。
本文中抗原及這三種細胞介素的組合產生了有效的保護以免T1D的發展,且甚至似乎能夠穩定地逆轉疾病進程。由於裸DNA質體/載體注射的低轉染效率,非常少數的細胞產生這些重組的蛋白質,且因此在血清中沒有可偵測的來自質體/載體編碼之細胞介素的水平改變-且因此沒有對任何其他該質體/載體所編碼者(前胰島素原)以外的抗原之可偵測的免疫刺激或免疫抑制。此產生了所欲的安全性特性。
一般來說,DNA疫苗在皮下(s.c.)注射時表現不佳,且因此典型地使用肌肉內注射投予(通常以電穿孔)或可供選擇地使用真皮內噴氣注射投予,其需要難處理的裝置以及大量的維持與校準。由於大部分與肌肉內注射相關的副作用爭議是與佐劑相關的(注射部位刺激),因此,其並非本文中的裸DNA免疫療法疫苗形式的考量。此外,注射的體積通常相對小且因此不會造成顯著的肌肉膨脹及疼痛。在一個具體實例中,注射體積為1ml或更少。在另一個具體實例中,注射體積為約0.6或0.5ml。無論如何,本文中所提供的多重細胞介素質體/載體似乎無法預期地提供免於T1D的保護(甚至是當透過以s.c.的途徑投予時),藉此能夠提供患者多種有效的給藥形式。
除了提供局部協同性,藉由以單一質體/載體及單一啟動子編碼所有三或四種轉譯產品,提供本文的多重順反子質體進一步簡化調節工作及藥物物質釋放標準。
相較之下,如果各個蛋白質產物是從分開的質體生產,則此從相同轉染細胞共表現的協同性價值很可能會喪之或降低,因為各質體/載 體轉染會是獨力事件,可能會靶定不同的細胞。如果三到四種重組蛋白質是從二、三或四個各別的質體/載體產生,很可能會喪失任何轉染細胞局部環境的協同功效,此外,必須進行若干各別的臨床試驗(對每個質體及各個組合各一個)。從單一質體/載體及單一mRNA生產所有蛋白質減輕了多重質體/載體形式本質上測試多種各別分子以及確定理想的共包裝比例的需求。
任何適合本發明的載體形式皆可用於本文中,諸如質體(複製型或被動型(passive))、小環(mini-circle)、線性載體(MiLV)、病毒載體(整合性(例如:慢病毒)及非整合性(例如:腺病毒)兩者)、黏接質體、人造細菌染色體(BAC)、人造人類染色體(HAC)等等。
此外,可在本文中使用任何被允許的轉染增強方法,例如:電穿孔、超音波穿孔(sonoporation)(超聲波增強,有或沒有微泡對比增強、脂質/聚合物聚集體、流體動力學(藉由高注射體積的壓力)、生物彈道學/基因槍(藉由壓縮的氣體穿過皮膚沈積)等等。
在一個具體實例中,基於以下原因在本文中使用非複製性游離基因體質體DNA:i)源自單一質體轉染的mRNA之多重複本,及ii)質體核酸相較於mRNA及其他DNA載體形式延長的穩定性及功能。因此,雖然基於mRNA及基於DNA的表現系統兩者皆可提供細胞內運送及共定位,基於質體的系統提供較好的控制及給藥持續性。
在一個具體實例中,質體/載體編碼四種蛋白質:i)抗原,ii)TGF貝他1(TGF-β1), iii)介白素-10,及iv)介白素-2。
在一個具體實例中,抗原為經胞內體靶定的T1D相關抗原,諸如胰島素或GAD65。胞內體靶定可藉由例如以下者來完成:Ii/CD74融合、LIMPII/SCARB融合、或轉鐵蛋白受體融合。
在一個具體實例中,TGF-β1呈經活化型式。
從一個質體/載體表現四種蛋白質是可能的,例如:如果所欲序列用以下任一者分開:A)分開的啟動子,B)IRES(內部核糖體進入位點)序列,其募集新的核糖體以轉譯各個區段,或C)病毒2A序列(例如:FMDV 2A或TaV 2A序列),其經轉譯並誘導核糖體暫停/略過,其導致從單一開讀框產生分開的多肽。然而,在實務上,這些策略的每一者都是複雜且難以實現的。
從單一質體/載體表現四種獨立的蛋白質最簡單地由為各個基因提供分開的啟動子達成。然而,此形式在以下方面有顯著的缺點:A)由於多重啟動子長度過長,其導致非常大、不穩定且難以產生的質體,B)導致所轉譯的蛋白質相對於彼此無法預期的行為(其不再以相對於彼此固定的比例產生),C)各啟動子可能獨立地被靜默,造成在完整效力上,某些基因選擇性的表現而其他的沒有,D)缺乏調節簡易度。相較之下,IRES元件及2A序列在mRNA及轉譯層次上運作且再現性地從單一啟動子共表現固定比例的各個蛋白質。
四種類型的IRES元件的每一種要執行功能有不同的輔因子需求且對下游將轉譯的基因有不同的序列需求。舉例來說,EMCV(心內膜 肌炎病毒)IRES是630個鹼基對的第1型IRES,其利用所有真核轉譯起始因子,而CrPv(蟋蟀麻痺病毒)IRES是200個鹼基對的第4型IRES,其不需要輔因子但利用非標準起始密碼子。
當利用來自不同類型的IRES元件時,其會彼此干擾,使得各類型的IRES元件在各質體僅能使用一次,且當一起使用時,不同類型的IRES元件以難以預測的方式彼此減弱(效力降低)。
此外,由於基因與IRES元件的交互作用並非靜態的而是對側接的核苷酸序列有脈絡依賴性的,混排(shuffling)基因/IRES組合導致轉譯產品無法預期的比例。此外,IRES元件對位於起始處或緊接著起始處之後的最前面的幾個胺基酸位置設有限制。舉例來說,CrPv IRES要求第一個胺基酸是丙胺酸而非標準的甲硫胺酸且EMCV IRES無法耐受前三個密碼子內有P、W、C、R或K胺基酸。在一個具體實例中,為納入EMCV IRES所設下的N端胺基酸限制,DNA疫苗在IL-10基因的N端包含三個丙胺酸的延伸。
此外,各個IRES元件包含大量的鹼基對,範圍在230bp至超過700bp;因此,包含多重IRES元件增加質體/載體的大小及複雜度至因為自發性的缺失及重組讓許多變得不穩定且難以產業生產的程度。再者,由於IRES賦予包含其之轉錄的mRNA高度的二級結構,其增加在轉染的細胞中活化病原辨識受體的可能性(Dabo S,Meurs EF.2012 Viruses 4(11):2598-635)以及產生抵抗所欲之耐受性誘導的刺激性功效。
2A序列,不同於IRES元件,不彼此交互作用且因此提供穩定且一致的效能。然而,他們自己進行轉譯且因此影響最終轉譯蛋白質 產物的折疊、功能及穩定性。所有2A序列皆導致顯著的C端融合(19-22 aa)至將被分離的序列之5'端且亦以脯胺酸開始3’序列。有些蛋白質對這些修飾為容許性的而有些則否,導致使用2A序列實務上的限制。舉例來說,介白素-10產物對於2A尾巴有容許性,但介白素-2及TGF-β1兩者若在2A標籤上游表現則會錯誤折疊並失去功能。因此,雖然表現數種以2A序列分開的獨立蛋白質是可能的,本文中四種蛋白質中的兩種無法以2A標籤作結尾且因此必須利用其他策略。
由於各類2A胺基酸序列在蛋白質轉譯過程中修飾核糖體功能,其在2A家族的兩種核心性質(即,(i)分開並列的基因產物及(ii)進入第二基因產物的持續力(再起始))上會有不同的效率。不同的2A序列在產生打斷胜肽骨幹之核糖體暫停(產生兩個分開的蛋白質)上具有不同的效率,以及在再起始第二基因產物的胜肽合成上的不同效率。
2A序列分開蛋白質產物以及再起始蛋白質轉譯的能力依賴於其2A胺基酸序列(Donnelly ML,Hughes LE,Luke G,et.al.2001 J Gen Virol.82(Pt 5):1027-41)。2A胺基酸序列中的小變異對導致分開與融合的側接基因產物顯著不同的混合,範圍從低於5%(>95%融合)至完全分開(0%融合或100%分開)。
再者,在本文中,發明人發現編碼兩個側接的蛋白質產物之相鄰的胺基酸序列亦會影響再起始的效率及2A序列的分離,導致與報導的結果有顯著的誤差。因此,再起始效率依所使用的2A胺基酸序列的類型以及相鄰胺基酸序列所提供的環境而不同,且因此前2A基因產物的比例與蛋白質的分開會由所使用的2A胺基酸序列及其前後脈絡兩者來決定。
在一個具體實例中,「FMDV 2A」被插入在本文的抗原編碼序列及TGF-β1編碼序列之間;產生蛋白質產物100%的分開與1:1的比例。
另一個具體實例中,「TaV 2A」可被插入在本文的IL-10編碼序列與IL-2編碼序列之間;產生約50%的分開產物與蛋白質產物10比6的比例。因此,每個轉染的細胞遞送相對低的劑量之介白素-2(其無法刺激效應T細胞)以及較高劑量的介白素-10以將T細胞導向Treg表型。由於融合的IL-10/IL-2之生產是不利的,嘗試工程改造TaV 2A區段之增加的裂解效率。嘗試將「絕緣子區段」放置在2A區段之前(其為將TaV 2A上游的經轉譯區域進行延伸的元件,以減少上游序列對2A元件的影響),其沒有改善分開。在另一個為了解決融合問題的嘗試中,添加帶有GSG之經轉譯蛋白質序列的上游解聯物(uncoupler)區段,然而,此方法僅導致裂解效率的增加改善。
因此,藉由以TAV 2A分開IL-10及IL-2編碼基因所產生的細胞介素融合物很可能是免疫原性的,在另外的具體實例中,本文的載體/質體具有「P 2A」區段。藉由P2A分開IL-10及IL-2編碼基因導致完全或近乎完全的蛋白質產物分開,以及IL-10相較於IL-2至少兩倍(或可能甚至高達四或五倍)的比例。
為了解決上述單獨IRES及單獨2A系統的缺點,本文的四種cDNA序列(抗原、TGF-β1、IL-10、IL-2)以成對的方式安排於在單一IRES前面及後面。每對進一步藉由2A序列分開,其誘導核糖體略過及從該多蛋白質對中的各個序列產生獨立蛋白質。由於TGF-β1及IL-2可能沒辦法在該融合物的N端側,其中之一必須在中央IRES位點處終止且另一個 必須結束mRNA序列的經轉譯部分。
因此,本文中被表現的蛋白質及IRES/2A的時序/順序可如以下所示:(i)抗原、(ii)FMDV 2A、(iii)TGF β1、(iv)IRES、(v)IL-10、(vi)P 2A及(vii)IL-2。結果,所有四種蛋白質能夠以穩定且可預測的方式從單一操縱組/基因區段獨立地表現。由於這些蛋白質的每一者是從單一mRNA表現,各個產物的比例是固定的-例如,其不可能造成IL-2對IL-10的過量。
除了使用IRES及2A元件之組合來分開編碼基因之外,本文可供選擇的方案可使用雙向啟動子以產生2個mRNA-這些mRNA會各編碼一對蛋白質而非所有四種蛋白質在一個mRNA分子上。因此,可利用適當地安排在雙向哺乳動物啟動子周圍的表現卡匣對並利用分開2A序列及/或IRES元件構築等效的排列。然而,此方式伴隨有缺點,主要是因為雙向啟動子的大尺寸以及可能增加的在一個醫藥產品中包含有分開的mRNA元件的調節負擔。因此,本文中較佳的具體實例利用單一啟動子及IRES與2A元件的組合而非雙向啟動子。
理論上,一些2A序列能夠以細胞內的內源蛋白酶敏感序列來取代。然而,發明人於本文中發現這樣的蛋白酶伴隨有顯著的缺點(例如:缺乏被報導的功能造成融合蛋白質產物的分泌)。
為了讓抗原被加工並在質體編碼的細胞介素激素之局部環境呈現給免疫系統,抗原必須被保留在經轉染的細胞內。在第1型糖尿病的例子中,如果活性胰島素被分泌或是以其他方式從經轉染的細胞釋放,活性胰島素的生產可能導致不欲的血糖降低。
為了避免抗原分泌,可從抗原編碼序列移除任何分泌訊息(例如,從編碼前胰島素原的核酸序列移除分泌訊息編碼序列),因而產生胰島素原而非前胰島素原,從而使得抗原能夠在經轉染的細胞內部累積。當此經轉譯的抗原產物(例如:胰島素)不會被主動分泌,其能夠在CD8+ T細胞攻擊導致的壞死所造成的胞溶期間被釋放。此外,胰島素訊息序列已知為包含疾病相關表位的區域(可能誘導自體免疫)且因此包括該訊息序列確保產生更廣的耐受性誘導以及更高的疾病減少機率。
此外,抗原的細胞質滯留僅允許經由蛋白酶體的加工以及經由第I型MHC途徑的呈現,其透過CD8+ T細胞偵測細胞內病原。由於CD4+ T細胞是促發炎細胞介素的主要促成者,且大多數的(如果不是全部)自體免疫抑制Treg是CD4+,拓寬抗原呈現至包括第II型MHC(其透過CD4+ T細胞進行辨識)可能是有利的。
第II型MHC加工及CD4+ T細胞刺激通常不包括細胞內抗原,因為此途徑的使用是經由細胞外抗原的胞吞作用。正常情況下,在經轉染的細胞內產生的蛋白質產物僅經由預設的細胞內蛋白酶體加工途徑及第I型MHC呈現,產生CD8+ T細胞效應而非CD4+ T細胞效應。為了靶定CD4+及CD8+T細胞兩者以進行免疫調節,較佳的具體實例還包括引導至第II型MHC呈現的因子。
原則上,為誘導第II型MHC呈現,抗原可與任何將融合物導向胞內體隔室的配對物融合,但會有活性及暴露上的功能性差異。轉鐵蛋白受體(亦稱為鐵轉運蛋白質受體)融合物從細胞膜/細胞外空間到胞內體循環,且因此亦可使其他免疫細胞暴露於整個抗原,諸如B細胞、巨噬 細胞等。LimpII/SCARB融合物直接靶定胞內體,但優選地至早期胞內體且有時候會造成過度加工及抗原的完全破壞。Ii(CD74)融合物,其利用與第II型MHC對於晚期胞內體定位所用相同的伴護蛋白訊號,將抗原及第II型MHC在相同的發展階段遞送至相同的囊泡,並將抗原有效呈現於第II型MHC脈絡的可能性最大化。此外,即便有來自li融合物的胞內體分選,必須使前胰島素原分泌序列不活化否則抗原也會在加工前就被分泌且失去。
本文中胰島素抗原分泌的阻斷已替代性地藉由使兩個分泌標籤(其由粗糙內質網上的SRP(訊息辨識顆粒)移除)所必須的胺基酸突變來完成。Ala(A)至Glu(E)突變徹底破壞前胰島素原的成熟及分泌,同時維持用於最佳耐受誘導的抗原所需要的表位結構。
在一個具體實例中,於本文中使用質體DNA疫苗。該質體例如在大腸桿菌中增長/複製,並從培養基分離/純化,並接著調配於液體調配物中,例如:水、食鹽水、PBS液體調配物,或呈用於真皮內噴氣注射、鼻內投予或吸入的冷凍乾燥粉末形式。在一個具體實例中,本文的質體係調配於視需要包含穩定劑的水性醫藥調配物中。可利用任何適合的微生物系統來產生質體。
調配物中的穩定劑包括(但不限於)螯合劑,諸如用於清除Mg++及Fe+++(否則其可能涉及DNA的降解)的EDTA、EGTA或DPTA,及/或檸檬酸鹽,其保護質體免於非專一性的降解效應。在一個具體實例中,本文的質體可調配於等張PBS中或可供選擇地在TRIS+檸檬酸鹽+EDTA中。這類質體具有以下優點:穩定、容易生產且使用上安全且方便。
在另一個具體實例中,對於本發明可添加遞送媒介,諸如病毒、脂質、脂質體、共包裝等。然而,在本文中使用遞送媒介在免疫力、病毒整合等方面可能會有潛在的問題。
定義
抗原:本文之DNA免疫療法疫苗編碼抗原。本文中的抗原可為任何類型的免疫原性疾病相關蛋白或其片段,其可被免疫系統之T細胞組分辨識。舉例來說。在第1型糖尿病之治療或預防的例子,中可使用胰島素抗原。在一個例子中,胰島素抗原是InsB 9-23免疫優勢(immunodominant)胜肽。對於本文中的多發性硬化症DNA免疫療法疫苗,可使用髓磷脂鹼性蛋白(MBP)、髓磷脂寡樹突細胞蛋白(MOG)、及/或蛋白脂質蛋白(PLP)抗原作為抗原。來自禿頭、多發性肌炎/皮肌炎、腹部口瘡及蛋白質過敏原(例如花生蛋白ara h 2)之代表性抗原的類似蛋白抗原編碼序列亦為適合用於本文中之DNA免疫療法疫苗的抗原之實例。
抗原靶定:在一個具體實例中,本文中的抗原是經胞內體靶定的。本文中的抗原包括完整蛋白質、分泌缺陷前蛋白質、或其功能性或免疫優勢胜肽片段。
舉例來說,本文中之胰島素抗原是用於免疫調控療法的抗原並且不是葡萄糖降低劑。因此,其應被完全加工/成熟化或被分泌以確保其在MHC分子上呈現給循環T細胞。因此,本文中的DNA免疫療法疫苗不會導致血液中增加的胰島素水平,而會使得對免疫系統(特別是T細胞)的抗原呈現增加。
因此,本文中的胰島素抗原可以是小免疫優勢胜肽編碼片段 (例如:胰島素B鏈9-23胜肽,包括展現等效T細胞表位之偏移的登錄(register)胜肽)、完整的胰島素原(其缺乏所需的分泌序列但除此之外為完整的)、或前胰島素原突變蛋白,其包含分泌序列但經修飾以防止分泌功能。
胰島素胜肽「InsB 9-23」在小鼠及人類間相同:SHLVEALYLVCGERG(SEQ ID NO 7)
經修飾的InsB 9-23(相對於野生型InsB 9-23的取代以粗體及底線顯示(SEQ ID NO 8)及(SEQ ID NO 27)):SHLVEALYLVCGE E G及SHLVEALYLVCG GE G
因此,本文中之胰島素抗原可在經轉染的宿主細胞之細胞質液中累積,且因此可以經由呈現第I型MHC,或在細胞溶解時釋出。
胞內體靶定使得第II型MHC呈現可在本文中藉由抗原序列與前導序列之融合完成(其使用以下者形成跨膜區段:細胞質的「YXX」序列,其中Y是酪胺酸、X是任何胺基酸、且是龐大的疏水性胺基酸諸如色胺酸或異白胺酸,「[DE]XXXL[LI]」,其中D及E分別為天冬胺酸或麩胺酸,而L及I分別為白胺酸及異白胺酸,或「DXXLL」胞內體/溶體分選訊息,其在以下例示性序列中加底線)。因此,包括這些訊息因而靶定或循環至的胞內體/溶體的蛋白質之域包括:轉鐵蛋白受體、LimpII或CD74(亦稱為不變鏈、MHC II伴護蛋白或li)或任何類似的域。
第1型糖尿病:第1型糖尿病(T1D)被認為是慢性自體免疫疾病,其中自體攻擊的T細胞滲入胰臟中的胰島並藉由專一性地破壞產生胰島素的β細胞族群而扮演重要的角色。一旦顯著數量的胰島細胞被破壞,降低的胰島素量、或完全沒有胰島素會在患者中造成胰島素缺乏及高血糖。因此,T1D患者沒辦法生產足夠的胰島素且終其一生需要定期注射該激素。某些第1型糖尿病患者被診斷為「第1.5型糖尿病」、「潛在的自體免疫糖尿病」/LADA、「雙重糖尿病」等,其為帶有第1型糖尿病及第2型糖尿病兩者之症狀的糖尿病疾病-因此,所有帶有第1型糖尿病及第2型糖尿病兩者的隊列的糖尿病疾病也包含於本文中的用語「第1型糖尿病」。
耐受性DNA疫苗:本文中之基於DNA的免疫療法疫苗/載體/質體被設計用以關掉或下調負責破壞正常健康的「自我」細胞的免疫系統部分且因此防止或減緩基於T細胞的自體免疫。
本文中所使用之術語「DNA免疫療法疫苗」意欲表示包含DNA分子的化合物或組成物,且其被投予至個體以降低該個體發展一或多種疾病的風險。
在一些具體實例中,本文中之基於DNA的免疫療法疫苗為 編碼特定抗原的質體/載體。在疫苗接種之後,這些質體被攝入,換言之,轉染至宿主體內的抗原呈現細胞中。接著,這些「被轉染的」宿主細胞產生抗原並將抗原的小片段呈現給免疫系統,特別是T細胞。此方法產生對編碼抗原之專一性T細胞反應的改變以及對其他(非編碼或「不相關」)抗原最小的免疫反應改變。僅有非常少數的宿主細胞典型地被本文中之DNA疫苗質體/載體轉形,表示最終很可能十萬個裡面少於一個、五十萬個裡面少於一個或甚至百萬個裡面少於一個質體/載體進入宿主細胞。因此,本文中之DNA疫苗代表著調控對於抗原(諸如在T1D患者或處於發展T1D之風險的患者中的胰島素)的免疫反應上非常溫和且專一性的方法。
質體:質體是小DNA分子,其最常在細菌中以小的、環形的雙股DNA分子形式被發現。人造質體廣泛地在分子選殖中用作載體,以在宿主生物體中驅動重組DNA序列之複製。質體可經工程改造以適合用作免疫療法DNA疫苗。質體可被視為是複製原,能夠在合適的宿主內獨立自主複製的DNA單元。質體可從一個細菌傳送到另一個細菌(其可以是相同或不同的的細菌物種),其經由三種主要機制:轉形、轉導及接合。DNA疫苗質體可被宿主細胞藉由被動轉形納入-通常以相對低的比率。本文中之質體在細菌中有效率地複製,但不驅使蛋白質表現。本文中之質體進一步驅使在人類及其他哺乳動物(例如:小鼠)中的蛋白質表現-但沒有質體的複製。在一個具體實例中,使用pVAX1載體(Invitrogen/LifeTechnologies)作為本文中的支架以用於插入作為本發明之部分的元件。其他適合的載體支架包括任何含有真核生物啟動子元件、原核生物高複本複製起始序列以及用於質體維持的選擇系統之載體骨幹。
選擇基因及選擇系統:在一個方面,本文中之DNA免疫療法疫苗包含用於製造之目的的選擇基因/選擇標記。本文中之可篩選標記為,例如,賦予對細胞毒素(例如:抗生素,諸如安比西林、康黴素、氯黴素、鏈黴素等)之抗性的基因。
本文中之其他合適的選擇系統類型包括,例如,條件性的致命性緘默系統(例如:CcdA/CcdB或ParD/ParE Hok/Sok類型系統),或是補足生產細胞品系中的基因體缺陷且因此使得在其他情況下無法生存的宿主能夠生長的序列(例如:dapD-或pyrF-營養缺陷互補、infA-轉譯起始互補等)。
懷有質體/DNA疫苗(其包括選擇標記)的生產細胞在暴露至毒素/抗生素/條件時會存活,而其他未能攝入質體序列者會死亡。因此,在一個具體實例中,本文中之DNA疫苗包含核酸序列,其編碼選擇標記以提供較高的產率/純度以及在生產細胞(諸如大腸桿菌)中更有效率的生產/複製。
雖然抗生素選擇是常用的實驗室策略,無抗生素選擇系統可能有一些優點-例如:和更有效率的調節方法相關。雖然在本文中也能夠使用不包含選擇機制的載體(諸如小環、合成的線性載體等),這些實踐與生產上的某些缺點相關,特別是由於增加的生產及品質控管花費。
互補(「拯救」)策略的實例為先前技術中已知,然而,這些策略有各種不同的缺點。
代謝性互補系統(諸如dapD[離胺酸生物合成]或pyrF[尿核苷生物合成]系統)經常在高密度大腸桿菌生產期間造成「交叉餵養」,其中 含質體細菌會產生並分泌過量的所需化合物且由此為附近沒有質體的細菌「舒緩」選擇壓力。
本文中合適的選擇系統之另一個實例為編碼必要蛋白質(諸如infA,編碼IF1/起始因子1,其為蛋白質合成所需)的質體。在此選擇系統中不會發生交叉餵養,因為infA蛋白質不會被分泌。然而,不可能進一步修飾該質體或擴張質體缺陷細胞,因為沒有方式來外源地補充所需的蛋白質/infA(J Bacteriol.1994 Jan;176(1):198-205 and J Biotechnol.2004 Jul 1;111(1):17-30)。
為了避免與infA選擇系統相關的缺點,本文中已提供來自單核球增多性李斯特菌(L.monocytogenes)之入侵蛋白基因prfA的溫度敏感性轉錄開關(溫度感應器)(Cell.2002 Sep 6;110(5):551-61)為可供選擇的選擇系統。藉由將RNA「溫度感應器」序列的髮夾形成部分經由標準重組技術放置在大腸桿菌infA的基因體複本之上游,其表現變成經由控制發酵溫度來調控,使得無質體細胞能夠在37℃下緩慢生長並在<30℃的溫度下快速細胞死亡。因此,以表現野生型infA的質體轉形工程改造的溫度敏感性大腸桿菌生產品系允許在所有溫度下有完全正常的生長速率,允許在37℃下的無質體擴張以及在30℃下對質體的嚴格選擇。此外,此系統不會對野生型大腸桿菌產生選擇性壓力以維持質體,且因此會在培養中於8小時內失去-確保環境中沒有治療質體的持續存在。
本文中用來生產DNA免疫療法疫苗質體的大腸桿菌生產細胞株可因此懷有以下溫度敏感性prfA核苷酸序列: 野生型單核球增多性李斯特菌prfA(「溫度感應器髮夾」)核苷酸序列(Shine Dalgarno底線,ATG起始粗體-(SEQ ID NO 13)):
野生型單核球增多性李斯特菌prfA蛋白質序列(在大腸桿菌IF1上游融合-由SEQ ID NO 13的轉譯產生):MNAQ
複製起始序列(「Ori」):複製起始序列(亦稱為複製起點)是基因體中特定的序列,DNA股的複製在該處開始。在一個具體實例中,本文中之複製起始序列位點包括「pUC Ori」,其使得能夠在細菌性大腸桿菌生產細胞株中複製-但不在哺乳動物宿主細胞(即,來自被疫苗接種的個體/人/患者的身體之細胞)中。其他本文中之合適的細菌複製起點包括但不限於:R6K、pBR322、ColE1、pMB1、15A、pSC101等。在一個方面中, 本文中之複製起始序列是高複本數版本,其產生用於更有效的生產之高質體/生物量比率。亦可於本文中使用不包含複製起始序列的載體(諸如小環、合成的線性載體等)。
啟動子:啟動子是起始特定基因之轉錄的DNA區域。啟動子的位置靠近基因的轉錄起始位點,在DNA之相同的股上且位於上游,其朝向正義股的5’區域。為了進行轉錄,RNA聚合酶必須接附到靠近基因的DNA上。啟動子包含特定DNA序列,諸如回應元件,其為RNA聚合酶以及募集RNA聚合酶的轉錄因子提供可靠的起始結合位。轉錄因子具有特定的活化子或抑制子序列,其接附至特定啟動子並調節基因表現。因此,啟動子代表了與其他調控區域(諸如強化子、緘默子、邊界元件/絕緣子)合作的重要元件以指引給定基因的轉錄水平。傳統的啟動子驅動單一傳訊RNA(mRNA)的生產,而本文中之雙向啟動子驅動兩個緊鄰該啟動子的mRNA(該啟動子的上游及下游兩者)的生產。
在一個具體實例中,在本文中使用真核啟動子。真核啟動子不一定遵守一基因一啟動子規則,諸如數種病毒啟動子以及展現廣泛表現的啟動子(即,不具有狹隘的細胞類型專一性,諸如僅在神經元的表現)。本文中能夠驅動大型多重基因mRNA分子之廣泛轉譯的啟動子實例包括:病毒CMV立即-早期(IE)與SV40啟動子;內源EF1a、PGK1、Ubc及β肌動蛋白啟動子;及諸如CAG雜合啟動子之合成啟動子。存在有許多其他合適的哺乳動物啟動子且有更多經由合成生物學的努力被設計。任何可在人類細胞中產生所欲表現特徵的啟動子可用於本文中之DNA免疫療法疫苗質體。
強化子:強化子是增強啟動子生產mRNA轉錄本之效率的DNA元件。本文中之強化子可為相配的(例如SV40強化子/CMV啟動子)或未相配的。任何適合用於真核功能的強化子/啟動子組合可在本文中使用。
真核轉譯起始:真核轉譯起始序列通常被稱為「Kozak」共通序列。核糖體辨認mRNA分子上的Kozak序列作為轉譯起始位點,自此開始編碼蛋白質。真核核糖體需要此序列或其變體以開始蛋白質轉譯。Kozak序列是簡併的或多變的且鮮少與共通序列相配。事實上,共通Kozak序列相較於分離自哺乳動物mRNA的野生型變體典型地效率較差。雖然弱Kozak序列一般是從天然mRNA分離且很可能參與低豐度蛋白質的轉譯調控,本文中之DNA免疫療法疫苗較佳編碼具有中度或高度效率的Kozak序列。本文中有用的Kozak序列之實例包含以下核苷酸序列:gccRccATGG(SEQ ID NO 14),其中小寫鹼基為最常見的核苷酸但可有所變異而大寫核苷酸是固定的(R是IUPAC對於A或G鹼基的不確定性代碼),且該ATG表示位置+1處的甲硫胺酸密碼子之轉譯起始位點。
胞內體分選訊息:胞內體是真核細胞內以膜為界的隔室。一些蛋白質可被運送至胞內體且在該處被降解成胜肽片段。該胜肽片段可結合存在於胞內體中的MHC分子以形成MHC/胜肽複合體,其接著可被運送至細胞表面以供呈現給循環中的T細胞,特別是CD4+ T細胞。蛋白質分選至胞內體是由存在於所述蛋白質之細胞質液域內的訊息介導。所述胞內體訊息通常是短的線性胺基酸序列。本文中之抗原較佳使用胞內體分選訊息(諸如例如YXX、[DE]XXXL[LI]、或DXXLL胞內體/溶體分選訊息)被靶定至胞內體。胞內體分選訊息包括多種天然存在的或合成的胞內體分選 訊息。本文中之實例包括存在於Cd74/不變鏈/Ii、LimpII/SCARB或轉鐵蛋白受體上的胞內體分選訊息。可利用任何醫藥上可接受且提供所欲功能的胞內體靶定域。這類胞內體靶定域與抗原之融合一旦轉譯便將其引導至胞內體隔室以增加效率。除了在第I型MHC中的持續呈現之外,抗原的胞內體分選提供加工並以第II型MHC複合體呈現給免疫系統以獲得更完全且強健的耐受性誘導以及可能的Treg擴增(其無法經由第I型MHC/抗原複合體完成)。在一個具體實例中,本文中之耐受性DNA疫苗編碼抗原與CD74/不變鏈/Ii之融合物以驅動胞內體靶定以及抗原經由第II型MHC之呈現。
內含子:內含子是mRNA內的非編碼序列。已知某些內含子顯著增加mRNA的轉譯及功能。因此,本文中亦可使用內含子序列之包含。可利用標準內含子(諸如β-球蛋白)或任何遵守哺乳動物剪接常規的內含子(諸如MCM7)。在一個具體實例中,本文中之DNA免疫療法疫苗載體包含編碼一或多個內含子之序列。在另一個具體實例中,本文中之DNA免疫療法疫苗載體不具有編碼內含子之序列。
核糖體暫停標籤:對於本發明,在本文中之DNA免疫療法疫苗載體/質體中的蛋白質編碼序列之間包括一或多個核糖體暫停標籤序列以分開蛋白質產物可能是有利的。
一個實例是病毒「FMDV 2A標籤」(口蹄疫病毒2A標籤)。FMDV 2A經轉譯的胺基酸序列是APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP-(SEQ ID NO 15)。FMDV 2A標籤能夠暫停及再起始核糖體。在FMDV 2A標籤之前及之後之轉譯產物的比例接近1:1且所得蛋白質產物通常完全被 分開。這些核糖體標籤類型先前已被使用於兩個不同的域的共表現中,例如重組抗體生產中的重鏈及輕鏈。然而,本發明之發明人已驚訝地發現,由於本質上對核糖體再起始的效率,他們對於多重順反子DNA疫苗之側接產物的分開以及經表現蛋白質之比例控制兩者是有用的。本文中偏好轉譯產物1:1比例之序列標籤較佳插入在兩個較佳應以(或接近)1:1之比例生產的蛋白質(諸如例如:胰島素抗原及可能的細胞介素,諸如例如TGF-β)的編碼序列之間。
本文中之另一個核糖體暫停標籤序列的實例為病毒序列標籤「TaV 2A」(Thosea asigna病毒2A-TaV 2A經轉譯的胺基酸序列):RAEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO 16)。據報導,此標籤之前/上游及之後/下游之轉譯產物的比例為(或接近)50:1。本發明之發明人驚訝地發現雖然此類標籤能夠在一個轉譯產品對另一個轉譯產品具有絕對優勢是很重要的情況中用來控制表現程度,側接細胞介素產物的分開小於50%(相較於文獻中所揭示的序列)且因此表現比例為約10:6。對於本發明,2A類型的核糖體暫停標籤序列應較佳造成由相同載體/質體所編碼的兩個蛋白質之不同的表現程度。對本文來說希望有多效性細胞介素(諸如IL-2)相較於抗發炎細胞介素(諸如IL-10)之小量表現且不希望有融合產物。
本文中之核糖體暫停標籤胺基酸序列的另一個實例為病毒序列「P 2A」(豬鐵士古病毒-1 2A,ATNFSLLKQAGDVEENPGP-(SEQ ID NO 17)。當插入至本文中之IL-10及IL-2之間時,P 2A序列適切地執行功能,導致IL-10及IL-2之間將近完全的分離以及>5:1的表現比例。
可供選擇地,本文中可使用蛋白酶敏感性序列(其允許質體 表現的多蛋白質之間的內源裂解)。本文中可使用弗林(furin)敏感性序列(其辨認RAKR模體)或羧肽酶敏感性序列(其辨認RRRR、RKRR或RRKR模體)以分開蛋白質產物。然而,本發明之發明人驚訝地發現弗林及羧肽酶裂解序列皆無法產生本文中之分離產物-且因此導致不想要的IL-10/IL-2融合蛋白之分泌。
TGF-b/β/β1(轉形生長因子貝他/β1):TGF-β是控制大部分細胞中之增殖、細胞分化及其他功能的分泌蛋白質。TGF-β是以脈絡依賴性方式(例如:依賴同時接收到的其他細胞介素訊息)對細胞命運及表型具有顯著功效之非常有影響力的細胞介素。內源TGF-β是以與生產細胞之外側膜表面相連的潛伏形式生產且需要活化(例如,藉由表現CD36及胞漿素蛋白酶的發炎性巨噬細胞)來成熟並釋放活性形式。在一個具體實例中,本文中之TGF-β為有持續性活性之修飾形式。此係藉由將位置223及225之半胱胺酸以無法形成雙硫鍵的胺基酸取代來達成。舉例來說,使用絲胺酸或纈胺酸來取代位置223及225的半胱胺酸。此會產生被釋放到局部微環境中的活性蛋白質原結構。
終止子序列:轉錄終止子是標示轉錄期間基因結尾的核酸序 列節段。轉錄複合體之釋放釋出了RNA聚合酶及相關的轉錄機組以開始新mRNA的轉錄。此外,相同的細胞因子添加非模版的「多腺苷酸尾」,其顯著地增強mRNA的壽命及功能性。本文中合適的轉錄終止子之實例包括「bGH_PA」終止子, (SEQ ID NO 20)。
可在本文中利用任何可接受的終止子序列。變異形式包括在產生兩個方向相反的mRNA之雙向啟動子的例子中使用兩個不同的側接終止子序列。
在一個具體實例中,本發明之質體具有如SEQ ID NO 24所闡述的序列。
本文中所使用之術語「GLP-1/GLP-1胜肽/GLP-1R促效胜肽」係指本文中之GLP-1分子/胜肽/蛋白質/變體/促效劑,其為具有GLP-1R促效功能的分子(表示其為GLP-1受體的促效劑)。此類藥物一般用於糖尿病的治療,特別是第2型糖尿病。成熟的「人類GLP-1」之胺基酸序列為:HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG(SEQ ID NO:21)。
本文中所使用之術語「GLP-1類似物」係指GLP-1(SEQ ID NO:15)之變體的胜肽或化合物。術語「GLP-1類似物(analog)」及「類似物(analogue)」於本文中可互相交換使用。
GLP-1類似物可參照以下者來描述:i)人類GLP-1(SEQ ID NO:15)中對應於被修飾之胺基酸殘基的胺基酸殘基之編號,(即,在GLP-1(SEQ ID NO:15)中之對應位置),及ii)實際上的修飾。
術語GLP-1衍生物係指GLP-1類似物的衍生物。本文中在GLP-1類似物的前後文中所使用之術語「衍生物」意指化學修飾的GLP-1類似物,其中已將一或多個取代基共價地連接至GLP-1類似物。本文中所使用之術語「取代基」意指共軛至GLP-1蛋白質/促效劑/類似物之化學部分或基團/側基團。衍生物可包含選自以下者的一或多個修飾:醯胺、醣類、烷基基團、醯基基團、酯類及類似部分。
在一些具體實例中,取代基經由該多肽中的胺基酸殘基被共價地連接,例如,在選自由以下者所組成之群組之胺基酸位置之一:位置22、23、27、34、35及36。
在一些具體實例中,所述GLP-1衍生物包含含有親脂性部分的取代基。本文中所使用之術語「親脂性部分」意指具有多於6個且少於30個碳原子的脂肪族或環狀烴部分,其中該烴部分可包含額外的取代基。
GLP-1促效劑實例包括(但不限於)、艾塞那肽(exenatide)、利拉魯肽(liraglutide)、利西申肽(lixisentide)、阿必魯肽(albiglutide)、杜拉魯肽(dulaglutide)、他司魯肽(taspoglutide)及司美魯肽(semaglutide)。本文中之使用質體的DNA免疫療法疫苗在(例如)最近發病的T1D患者之治療中可初始地與並行的GLP-1R促效劑治療組合。GLP-1共投予可為慢 性的或暫時的且在非腸胃途徑外還包括經口途徑。
本文中之醫藥組成物較佳為水性調配物,其包含至少50%的水、更加至少60%的水、更加至少75%的水、更加至少90%的水、更加至少95%的水且最佳至少99%的水。本文中之醫藥組成物可供選擇地為乾燥調配物,諸如冷凍乾燥調配物,其意欲用於復水、吸入、鼻內滴入、真皮內投予、等。
本文中之醫藥調配物較佳不使用增強轉形(諸如:電穿孔)的方法而投予。在一個具體實例中,醫藥調配物意欲用於非腸胃投予,例如:皮下投予、真皮內投予、靜脈內投予、肌肉內投予等。在另一個具體實例中,本文中之醫藥組成物可進一步被局部、經口、經直腸或藉由吸入來投予。
本文中之醫藥組成物較佳無添加任何縮合劑或其他可能誘發局部反應的賦形劑。本文中之調配物較佳包含自由基清除劑(例如:1%乙醇)及/或螯合劑,諸如例如:二價陽離子清除劑(例如EDTA[CAS #60-00-4]、EGTA[CAS #67-42-5]或DPTA[CAS #67-43-6])以增強水性質體DNA之穩定性。本文中之醫藥組成物可進一步呈食鹽水溶液及/或緩衝液溶液之形式或包含食鹽水溶液及/或包含緩衝液溶液(例如:PBS-磷酸鹽緩衝之食鹽水、TRIS緩衝液或醫藥上可接受的等效緩衝液)。本文中之醫藥調配物較佳不含任何佐劑以及其他典型的疫苗成分,諸如例如:氫氧化鋁、酚、山梨糖醇、聚矽氧等。
投予:本文中之DNA免疫療法疫苗可投予至T1D患者,或處於發展T1D風險的患者。所述疫苗可例如以以下的基礎來投予:每日、每兩日、一週兩次、一週一次、一個月兩次、一月一個次、每兩個月、一年四次或一年一次-頻率可根據一般性或個別性需求來調整。本文中之免疫療法可為慢性的。療法之期間可為例如一個月、兩個月、三個月、6個月、一年、兩年、三年、五年、六年、七年、八年、九年、或10年。
具體實例
以下具體實例例示說明本發明且不以任何限制性的方式來理解。應理解所有具體實例可以所有可能的方式進行組合。
1. 一種質體,其編碼:i. 抗原,ii. TGF-β;及iii. IL-10。
2. 根據具體實例1的質體,其中該抗原為胰島素抗原。
3. 一種質體,其共表現/編碼(較佳來自單一操縱組):(i)抗原,諸如例如胰島素抗原;(ii)TGF-β/TGF-β1(諸如以持續活性形式);及(iii)IL-10。
4. 根據前述任一項具體實例之質體,其中該胰島素抗原係選自由以下者所組成之群組:胰島素原、不能分泌的前胰島素原、或其功能性或免疫優勢胜肽片段。
5. 根據前述任一項具體實例之質體,其中該胰島素抗原係選自由以下者所組成之群組:胰島素原、前胰島素原、及其功能性或免疫優勢胜肽片段。
6. 根據前述任一項具體實例之質體,其中該胰島素抗原為經胞內體靶定的胰島素。
7. 根據前述任一項具體實例之質體,其中該質體以約1:1之比例表現該胰島素抗原及TGF-β。
8. 根據前述任一項具體實例之質體,其中該質體以相較於IL-10低至少200倍的量表現胰島素抗原及TGF-β。
9. 根據前述任一項具體實例之質體,其中該質體以相較於IL-10低至少2倍的量表現胰島素抗原及TGF-β。
10. 根據前述任一項具體實例之質體,其中該質體進一步共表現介白素-2(IL-2)。
11. 根據前述任一項具體實例之質體,其中相較於該抗原(例如:胰島素)及TGF-β,該質體表現過量的IL-10及IL-2。
12. 根據前述任一項具體實例之質體,其中相較於TGF-β及胰島素抗原,該質體以至少約一倍、兩倍、五倍或至少約一百倍表現IL-10及IL-2(IL-10+IL-2比上胰島素+TGF-β之比例可為至少1:1、或2:1、或5:1或100:1)。
13. 根據前述任一項具體實例之質體,其中相較於TGF-β及胰島素抗原,該質體以至少約一百倍、兩百倍、五百倍或至少約一千倍表現IL-10及IL-2(IL-10+IL-2比上胰島素+TGF-β之比例可為至少100:1、或200:1、或500:1或1000:1)。
14. 根據前述任一項具體實例之質體,其中該質體以約1:1-100:1之比例表現IL-10及IL-2,諸如例如1:1-50:1、諸如例如1:1-25:1、諸如例如1:1-10:1、可供選擇地1:1-5:1、可供選擇地1:1-3:1、可供選擇地1:1-2:1。可供選擇地,表現的IL-10及表現的IL-2之間的比例可為約1:1、1:0.9、1:0.8、1:0,7、1:0.6、1:0.5、1:0.4;1:0.3、1:0.2或1:0.1。
15. 根據前述任一項具體實例之質體,其中該質體包含:(i)分開胰島素抗原編碼序列及TGF-β編碼序列之FMDV 2A元件,(ii)分開TGF-β編碼序列及IL-10編碼序列的EMCV IRES元件,及(iii)分開IL-10編碼序列及IL-2編碼序列的2A元件。
16. 根據前述任一項具體實例之質體,其中該質體包含:(i)分開胰島素抗原編碼序列及TGF-β編碼序列之2A元件(諸如FMDV 2A元件或P 2A元件),(ii)分開TGF-β編碼序列及IL-10編碼序列(較佳地,緊接著IL-10基因的N端編碼三個丙胺酸胺基酸)的EMCV IRES元件(可供選擇地為雙向啟動子),及(iii)分開IL-10編碼序列及IL-2編碼序列的2A元件(諸如P 2A元件)。
17. 根據前述任一項具體實例之質體,其中該TGF-β編碼序列編碼有持續活性的TGF-β,較佳為有持續活性的人類TGF-β1。
18. 根據前述任一項具體實例之質體,其中該質體包含:(i)經胞內體靶定的前胰島素原之編碼序列,(ii)FMDV 2A元件,(iii)TGF-β編碼序列,(iv)EMCV IRES元件,(v)IL-10編碼序列,(vi)P 2A元件,(vii)IL-2編碼序列,(viii)多腺苷酸化/終止元件,(ix)選擇基因,(x)複製起始序列,(xi)真核啟動子元件,(xii)真核轉譯起始序列,(xiii)胞內體分選序列(endosomal sorting sequence),及(xiv)視情況的內含子。
19. 根據前述任一項具體實例之質體,其中該質體包含以下元件:(i)啟動子(諸如CMV IE啟動子),(ii)內含子(位於非編碼前導序列之內),及(iii)真核轉譯起始序列(諸如Kozak元件),(iv)經胞內體靶定的抗原編碼序列(諸如經胞內體靶定的人類分泌缺陷型前胰島素原編碼序列),(v)較佳分開抗原編碼序列及TGF-β編碼序列之FMDV 2A元件,(vi)TGF-β編碼序列(諸如有持續活性的人類TGF-β編碼序列,較佳為有持續活性的人類TGF-β1編碼序列),(vii)EMCV IRES元件(或可供選擇地為雙向真核啟動子),其中該EMCV IRES元件分開TGF-β編碼序列及IL-10編碼序列,(viii)IL-10編碼序列(諸如:具有三個丙胺酸胺基酸N端添加的人類IL-10編碼序列),(ix)2A元件(諸如P 2A元件),其中該2A元件分開IL-10編碼序 列及IL-2編碼序列,(x)IL-2編碼序列(諸如人類IL-2編碼序列),(xi)終止元件(諸如bGH_PA終止元件),(xii)選擇基因(諸如康黴素編碼序列或野生型infA編碼序列),(xiii)複製起始序列(諸如原核複製起始序列,諸如例如pUC ori)。
20. 根據具體實例第18項之質體,其中該元件(i)-(xiii)依表現順序排列。
21. 根據前述任一項具體實例之質體,其中該質體之DNA序列如SEQ ID NO 24所闡述,或基本上如SEQ ID NO 24所闡述。
22. 根據具體實例第21項之質體,其中對本文中之SEQ ID NO 24進行一些次要修飾,造成例如:該抗原及/或細胞介素中之一或多個中的一、二、三或四個胺基酸取代。
23. 根據具體實例第1-20項中任一項之質體,其中該質體之DNA序列如SEQ ID NO:26所闡述、或由SEQ ID NO:26之修飾所闡述(其中該修飾造成例如:該抗原及/或細胞介素中之一或多個中的一、二、三或四個胺基酸取代)或由SEQ ID NO:26之修飾所闡述(其中該修飾導致與來自SEQ ID NO:26者相同之多肽的表現)。
24. 根據具體實例第1-20項中任一項之質體,其中該質體之DNA序列如SEQ ID NO:26所闡述或由SEQ ID NO:26之修飾所闡述(其中該修飾具有少於100個與SEQ ID NO:26不同的鹼基)。
25. 根據具體實例第1-20項中任一項之質體,其中該質體之DNA序列如SEQ ID NO:28所闡述、或由SEQ ID NO:28之修飾所闡述(其中該修飾 造成例如:該抗原及/或細胞介素中之一或多個中的一、二、三或四個胺基酸取代)或由SEQ ID NO:28之修飾所闡述(其中該修飾導致與來自SEQ ID NO:28者相同之多肽的表現)。
26. 根據具體實例第1-20項中任一項之質體,其中該質體之DNA序列如SEQ ID NO:28所闡述或由SEQ ID NO:28之修飾所闡述(其中該修飾具有少於100個與SEQ ID NO:28不同的鹼基)。
27. 根據具體實例第1-20項中任一項之質體,其中該質體之DNA序列如SEQ ID NO:29所闡述、或由SEQ ID NO:29之修飾所闡述(其中該修飾造成例如:該抗原及/或細胞介素中之一或多個中的一、二、三或四個胺基酸取代)或由SEQ ID NO:29之修飾所闡述(其中該修飾導致與來自SEQ ID NO:29者相同之多肽的表現)。
28. 根據具體實例第1-20項中任一項之質體,其中該質體之DNA序列如SEQ ID NO:29所闡述或由SEQ ID NO:29之修飾所闡述(其中該修飾具有少於100個與SEQ ID NO:29不同的鹼基)。
29. 根據具體實例第1-20項中任一項之質體,其中該質體包含含有SEQ ID NO:25或具有少於10個鹼基取代之SEQ ID NO:25的TGF-β基因。
30. 根據前述任一項具體實例之質體,其係用於延遲或預防第I型糖尿病。
31. 根據前述任一項具體實例之質體,其係用於肌肉內、真皮內、鼻內或皮下投予。
32. 根據具體實例第31項之質體,其係用於皮下投予。
33. 根據具體實例第31項之質體,其係用於肌肉內注射。
34. 根據前述任一項具體實例之質體,其係用於治療個體中之醫學病狀,諸如例如第I型糖尿病、早期發病第I型糖尿病或發展第I型糖尿病之增加的風險(包括第1,5型糖尿病病狀類型)。
35. 一種DNA免疫療法疫苗,其包含根據前述任一項具體實例之質體。
36. 根據具體實例第35項的DNA免疫療法疫苗,其係用於延遲或預防第I型糖尿病。
37. 根據具體實例第35-36項中任一項的DNA免疫療法疫苗,其係用於肌肉內、真皮內、鼻內或皮下投予。
38. 根據具體實例第37項的DNA免疫療法疫苗,其係用於皮下投予。
39. 根據具體實例第37項的DNA免疫療法疫苗,其係用於肌肉內投予。
40. 據具體實例第35-39項中任一項的DNA免疫療法疫苗,其係與其他類型的醫學治療(諸如例如β細胞/β幹細胞療法、β細胞/β幹細胞移植等)結合使用或併用以延長移植細胞的存活及功效。
41. 一種醫藥組成物,其包含根據具體實例第34-39項中任一項之DNA免疫療法疫苗或根據具體實例第1-34項中任一項之質體,其中該醫藥組成物包含食鹽水溶液及/或緩衝液及/或螯合劑。
42. 一種醫藥組成物,其包含根據具體實例第35-40項中任一項之DNA免疫療法疫苗或根據具體實例第1-34項中任一項之質體,其中該醫藥組成物包含食鹽水溶液及/或緩衝液及/或螯合劑及/或乙醇。
43. 根據具體實例第41-42項中任一項之醫藥組成物,其中該乙醇之體積/體積比例小於5%、小於4%、小於3%、小於2%或小於1%。
44. 根據具體實例第41-43項中任一項的醫藥組成物,其中該組成物不包含任何病毒、脂質共包裝劑(co-packing agent)或縮合劑。
45. 根據具體實例第41-44項中任一項的醫藥組成物,其中該組成物進一步包含GLP-1R促效劑。
46. 根據具體實例第41-44項中任一項的醫藥組成物,其中該組成物進一步包含GLP-1類似物/GLP-1R促效劑。
47. 根據具體實例第45-46項中任一項的醫藥組成物,其中該GLP-1類似物或該GLP-1R促效劑係選自利拉魯肽、司美魯肽或其混合物。
48. 一種套組,其包含根據具體實例第41-47項中任一項的醫藥組成物及包含GLP-1類似物/GLP-1R促效劑(例如:利拉魯肽及/或司美魯肽)之醫藥組成物。
49. 一種生產根據具體實例第1-34項中任一項的質體之方法,其中該方法包含(i)在合適條件下培養經該質體轉染的宿主細胞(諸如細菌(諸如例如大腸桿菌)來源的宿主細胞)及(ii)回收/純化該質體。
50. 根據具體實例第49項的方法,其中該宿主細胞是大腸桿菌infA溫度敏感性品系。
51. 一種在處於發展第1型糖尿病(T1D)之風險中或最近被診斷出T1D的患者中延遲T1D或其症狀發病的方法,該方法包含投予包含根據具體實例第1-31項中任一項的質體之DNA免疫療法疫苗,視需要與GLP-1類似物/GLP-1R促效劑組合。
52. 一種在個體中保留β細胞功能及/或內源胰島素生產的方法,該方法包含投予包含根據具體實例第1-34項中任一項的質體之DNA免疫療法 疫苗,視需要與GLP-1類似物/GLP-1R促效劑組合。
53. 一種治療糖尿病個體的方法,其包含投予包含根據具體實例第1-34項中任一項的質體之疫苗,視需要與GLP-1類似物/GLP-1R促效劑(例如:利拉魯肽及/或司美魯肽)組合。
54. 一種用於在處於發展第1型糖尿病(T1D)之風險中或最近被診斷出T1D的患者中預防或延遲T1D症狀發病的疫苗,該疫苗包含根據具體實例第1-34項中任一項的質體。
55. 一種用於在患有第1型糖尿病(T1D)的個體或處於發展T1D之風險中的人降低胰島素劑量的方法,該方法包含投予包含根據具體實例第1-33項中任一項的質體之DNA免疫療法疫苗,視需要與GLP-1類似物/GLP-1R促效劑(例如:利拉魯肽及/或司美魯肽)組合。
實施例
非肥胖糖尿病小鼠(第1型糖尿病之NOD小鼠模型):自體免疫中的免疫功能依賴複雜的細胞交互作用網絡,其無法在試管內適切地被評估。
本文中之疾病抑制及/或治療評估是在NOD小鼠模型中進行,此模型是多基因的自動發病模型,其中大部分的小鼠會在12至30週齡之間發展出升高的血糖濃度(BGV,血糖值,由尾靜脈針刺及手持儀表測定)。疾病的發生與進程是無法預期的,在30週齡(weeks of age,WoA)時的總發生率在60%至95%之範圍且從診斷(兩次連續BGV讀數>250)開始至結束(兩次連續BGV讀數為600或更高)的進程在2天至4週之範圍。因為小鼠被允許任意進食及飲水而導致中度的BGV變異(其超出由免疫病 理所造成之變異),在連續讀數中重複升高的BGV是必要的。
實施例1-抗原編碼質體與抗原+IL-10編碼質體比較:
先前技術中建議將質體骨架中的免疫刺激性CpG序列耗盡對於有效的T1D之DNA免疫療法治療是必須的。因此,此實驗以先前發表的實驗為模型(2008 J Immunol.181(12):8298-307)。
每週一次給予NOD小鼠八劑質體,從第9週(齡)開始:給予空的載 體(pVAX1,50ug)、或pVAX1-胰島素原Ag(非胞內體靶定的、非前胰島素原)、或CpG耗盡的pVAX1-胰島素原Ag、或等莫耳比例之pVAX1-IL10-IRES-胰島素原Ag之雙順反子構築體。
所有的投予是在異氟烷(isoflurane)麻醉下之左側四頭肌的肌肉內投予且在PBS+EDTA中僅包含質體。每週在所有小鼠中評估BGV並基於兩次BGV讀數超過250mg/dl記錄第1型糖尿病的發生。評估小鼠直到30週齡或BGV達到600,接著犧牲。
此實驗之結果(表1)證實A)CpG耗盡對於功效來說既非必須亦非有利的,B)包括免疫調節細胞介素顯著增加功效,及C)質體骨幹(空載體)與未治療的組等效。
實施例2-由編碼抗原IL-10、IL-2及TGF-β之質體所產生的經表現之蛋白質產物
製作多順反子質體以共表現TGF-β、IL-10及視需要的IL-2。暫時性轉染Freestyle293細胞並在無血清之培養基中培養。72小時後收集上清液並進行ELISA定量。
以下表2中的結果顯示:A)由單一載體達成多個獨立的細胞介素之表現,B)各個細胞介素以顯著的量以及所預期的比例產生,C)輕微的序列改變顯著改良IL-10從第一代IL10/胰島素原質體之表現,及D)質體骨幹(空載體)或抗原之胞內體靶定(IIAg)皆未誘導細胞介素生產或失調。
實施例3-TGF-β及IL-2對疾病抑制的影響
如實施例1在NOD小鼠中針對疾病的預防評估多順反子質體,差別在於持續每週一次給藥直到犧牲(糖尿病發病)或第30週。每組(初始n=24)中一隻小鼠在給藥10週後被送去作全套驗屍-包括對於10個標準高度浸潤組織、完整血液計數及臨床化學之病理學。除了在注射部位因機械力創傷造成的輕微肌肉斷裂及再生長,與未給藥動物相比並無偏差。
以下表3中的結果顯示:A)添加TGFβ顯著增加功效,B)包括介白素-2可增加功效且不誘導病理學,C)以表現IL-10及抗原的質體慢性給藥增加疾病預防的功效,及D)以表現TGFβ、IL-10及IL-2的質體慢性給藥增加功效而不會產生任何安全警訊。
實施例4 評估IRES元件、內含子以及皮下投予
如實施例3在NOD小鼠中針對疾病的預防評估多順反子質 體,差別在於較早開始給藥(第5週)以更好地模擬慢性小兒投予。除了驗證含有內含子的pVAX1-IIAg/TGFβ/IL10及pVAX1-IIAg/TGFβ/IL10/IL2質體,亦檢驗其他對照組。具體言之,針對功效的預期增加評估不同的IRES區段(CrPV[來自蟋蟀麻痺病毒]作為EMCV[來自腦心肌炎病毒]之對比),如內含子區段的缺失之於其必要性之評估。由於相較於親本質體(pVAX1-IIAg/TGFβ/IL10/IL2)明顯缺乏功效,CrPV及無內含子(n.i.=無內含子)的群組早期結束。此外,用於此實驗的小鼠群體相較於先前的群體經歷了更快速的疾病進程,從診斷到犧牲的時間平均為1.25週而非先前實驗中的2.75週。最後,增加皮下投予群組。此群組以三重細胞介素質體(pVAX1-IIAg/TGFβ/IL10/IL2)每週一次不經麻醉在頸部的頸背之s.c.空間中注射給藥。
以下表4中的結果顯示:A)EMCV IRES元件相較於CrPV IRES提供顯著較佳的功效,B)包括內含子(於此質體位於CD74胞內體靶定區域內)顯著增加功效,C)雖然包括IL-2在輕微疾病背景下提供最小的效益,其存在在侵略性疾病背景下的顯著增加治療的功效與強健性,及D)皮下給藥(其在大多數DNA疫苗應用中無效)在此顯現適度的功效及顯著的疾病延遲(甚至在未最佳化的情況下)。
實施例5 市售無抗生素選擇及抗生素選擇系統之比較
針對移除康黴素抗性之目的評估供選擇的質體骨幹以符合歐洲藥品管理局(European Medicines Agency)之基準。將相同的插入(IIAg/TGFβ/IL10/IL2,包括內含子)選殖至Nature Technology NTC9385R「奈米質體(nanoplasmid)」骨幹。如實施例3在NOD小鼠中評估所得的質體,差別在於治療在第11週開始(晚開始)並早結束(因為基於NTC9385R之質體的失敗)。
以下表5中的結果顯示:A)對質體骨幹之選擇系統的改變令人意外地誘導質體效力之顯著改變,及B)晚開始治療導致早轉變。從 其他相關實驗所得的數據指出以這些耐受性DNA疫苗質體給藥需要二至四周來發揮功效,因此晚開始治療導致在治療變得有效之前的若干早期糖尿病案例。
實施例6 有或沒有抗原的質體之疾病抑制功效
為確定編碼抗原在質體功能中的角色,進行兩個實驗(實施例6及7)。針對移除抗原(前胰島素原)編碼區域同時保留CD74靶定域及所有三種分泌細胞介素之目標評估供選擇的質體。如實施例3在NOD小鼠中評估所得的質體,差別在於治療在第11週開始(晚開始)。
此實驗證實抗原部分對於完全的效力是必須的且並非只是細胞介素的生產驅動質體的功能。此為證明治療之抗原專一性所需的兩項標準之一。
實施例7 本文中之抗原免疫療法對非相關抗原疫苗之功效的影響
為確定編碼抗原在質體功能中的角色,進行兩個實驗(實施例6及7)。NOD小鼠以PBS注射假處理或如實施例3以pVAX1-IIAg/TGFβ/IL10/IL2質體處理。在四次給藥後(即,在13週齡)以100μl的1:1明礬懸浮液中之50μg不相關抗原(雞卵白蛋白,OVA)對每隻小鼠進行i.p.免疫。持續每週一次進行假處理或質體處理直到免疫後三週(21天)犧牲,於該時間點收集血清。透過市售ELISA套組測定抗卵白蛋白抗原之類型轉變(全IgG及IgG2a)抗體。在質體及假處理組別之間,對其總抗-OVA IgG水平未觀察到顯著差異,各組亦未產生抗-OVA IgG2a。
以下表7中的結果顯示雖然質體抑制與目標疾病相關的免疫反應,其未抑制針對不相關抗原(即,任何該質體未編碼之抗原)之免疫反應性。此為證明治療之抗原專一性所需的兩項標準中的第二個。由於小兒患者之治療會涉及同時投予標準孩童疫苗接種,此相較於經由藥劑(諸如胺甲喋呤或環孢素A)的全身性/一般性的免疫抑制為顯著的優點。
這些數值產生了0.377的非顯著p值及-1.99至4.87之信賴區間。這些結果指示使用免疫調節性質體來治療不會影響對於未由質體編碼之其他抗原的免疫反應,且因此不會導致廣泛或全身性的免疫抑制。
實施例8 由質體表現之各別蛋白質產物
TaV 2A元件導致本文中無法預期的IL-10+IL-2融合產物(數據未顯示)且因此評估其他分離策略。初始的分離技術包括TaV 2A序列的上游延伸(導致快速降解及缺乏分泌的IL-10)還有羧肽酶裂解位點(其誘導經轉染的細胞株死亡)。其他評估的分離策略有GSG-TaV 2A、弗林裂解位點、弗林位點接著TaV 2A、P 2A及E 2A(馬鼻炎病毒A)。
暫時性轉染Freestyle293細胞並在無血清之培養基中培養。72小時後收集細胞沈澱物及上清液兩者並進行半定量多色西方印漬術。
以下表8中的結果顯示:A)無法預期地,蛋白水解裂解位點無法在IL-10及IL-2基因間發揮作用,B)相較於延伸絕緣子序列,IL-10IL-2間的GSG標籤(解偶子序列)為較佳的,C)相較於TaV 2A或E 2A,P 2A為較佳的,及D)2A序列對於所表現的上游蛋白質(諸如IL-10)之降解及分泌可具有顯著且無法預期的功效。
實施例9 市售選擇系統與本文中所提供之熱敏感性選擇系統之比較以及編碼IL-2的質體與無編碼IL-2的質體之間的比較(皮下投予)
針對移除康黴素抗性之目的製作並評估質體骨幹以符合歐洲藥品管理局之基準。將經修訂的插入(IIAg/GSG-FMDV 2A/TGFβ/EMCV IRES/IL10/GSG-P 2A/IL2,包括位於上游非編碼區中的內含子)選殖至作為骨架之含有Nature Technology「RNA-OUT」選擇標記之翻新的/最小修飾的pVAX1載體或是編碼野生型infA(「pNN」)之等效的最小修飾之pVAX1載體。此外,亦生產含有額外的SV40強化子元件或缺乏IL-2的質體。如實施例3在NOD小鼠中評估所得質體,差別在於投予是每週一次或每週三次(較佳)的s.c.。
以下表9+10中的結果顯示:A)市面可購得之用於pVAX1 骨幹中的康黴素抗生素抗性之RNA-OUT交換仍然無法預期地表現平平,B)infA互補無抗生素選擇系統之表現與親本pVAX1載體等效,C)介白素-2對於最理想的功效是必須的,D)加入SV40強化子元件未改變功效,及E)經修訂的三重細胞介素插入保持完整的功能性。
實施例10 質體撤回後耐受性功效之持久性檢驗
在先前的實驗中(呈現於表9),pNN-IIAg/FMDV/TGFβ/IL10/P2A/IL2組於30週齡時並未犧牲而是停止以質體給藥。額外追蹤血糖值十(10)週,至總共為40週齡,以評估質體是否已誘導耐受性的持久狀態或繼續給藥對於功效是必要的。
以下表11中的結果指出由於直到30週齡的穩定無疾病狀態在中斷給藥後快速惡化,繼續給藥對於耐受性的持久度是必要的。由於使用質體給藥時可能會遇到的任何不利事件被預期可連同給藥而停止,這代 表了有利的安全性特徵。
實施例11 對注射檢驗質體穩定性及持久性
對於質體投予的一個關鍵議題為投予時的降解。在注射的例子中,大尺寸及黏性質體分子在壓力下通過纖細針頭時所遇到的剪力會導致質體的共價封閉的環狀結構破損-使其變成線性而經受降低的轉染能力及快速破壞兩者。大部分質體在注射通過臨床使用可接受的針頭尺寸時會有5至15%降解成線性形式,其導致降低的功效或需要更大的初始劑量以彌補損失。一些可造成質體鬆解及剪力降解敏感性的序列結構類型有意地在所揭示的質體中減少至最低,意圖增加注射方案時的強健性與可靠性。為評估質體的剪力降解(其可因黏性因而及其濃度而變化),將人類前導質體懸浮於Tris EDTA緩衝液至濃度為5、7及9mg/ml並通過G30針頭三次(推出、重新吸入至注射器、接著重新再推出)並將一(1)微克的樣本對上參考樣本(其未通過注射過程)在瓊脂糖凝膠上運行。
顯示於圖3的結果指出,令人意外地,在任何測試濃度或黏度下質體並未明顯地被三次注射通行降解。質體降解會顯現為小色帶之抹糊(smearing)兩者(在6Kb處之超旋扭主要色帶以及在凝膠底部或約600bp的小過程雜質色帶之間)。這樣的線性化/降解抹糊未在通過注射過程的任何樣本中看到。此給藥時的強健物理穩定性為高度所欲的且優於所預期 的或先前於文獻中所報導的兩者。
實施例12 使用infA互補系統之質體保留的驗證
為了驗證基於infA的質體保留選擇系統如所欲地發揮功能,該質體轉形的細菌經過100次繼代生長(粗估每繼代36次倍化/個世代,檢驗總共3,600個世代之可能的漂變或質體丟失)。以每週11繼代(每個週間日在37℃下2繼代以及每個週末在30℃下一個繼代)產生繼代1-100。所有都在補充有15微克/ml口奈啶酸(naladixic acid)的液體非動物性LB培養基(Teknova大豆腖(soy-tone))(為DH5α基本品系而選擇而非用於質體保存)中進行。從每個繼代產生甘油儲備原液並保留直到獲得用於同時處理的所有100個繼代。
沾取甘油儲備原液以接種5ml隔夜培養物,其依照Qiagen小量製備(miniprep)套組上供貨商的指示使用真空岐管處理(由於凝膠尺寸限制,每批16或32個培養物)。未嘗試為輸入細胞之標準化收集OD600讀數且所有製備皆以標準體積為基礎。將一微升的每個製備以PstI/XhoI分解處理以將骨幹(約2.4Kbp)從插入物(約4Kbp)分辨出來,不針對從每個小量製備獲得的質體濃度進行校訂。每個凝膠以Tridye 2-Log標準品(NEB https://www.neb.com/products/n3200-2-log-dna-ladder-01-100-kb)位於兩側、第一個樣品泳道是未分解的質體且以SybrSafe染劑顯像的方式運行。在凝膠的影像中,雖然缺乏核酸品質的對照組,所有分解泳道顯示質體的存在以及預期分解模式兩者(於對於繼代1-16、17-48、49-80及81-100的影像中得見)。
作為另外的確認,繼代1-100之甘油儲備原液亦劃線於50 個部分的無抗生素且非動物性LB瓊脂培養盤上並在30℃下培養隔夜。未嘗試控制劃線接種物。如圖4所示,所有甘油儲備原液代表性劃線導致明顯的生長及自其可知之質體保留。
實施例13 以infA互補系統放大規模的適合性
為了驗證基於infA之質體保留選擇系統能在生產尺度上如所欲地發揮功效,將質體轉形的細菌用於50L的試點饋料批式發酵槽運作,伴有特定的產率強化溫度變換步驟。使用添加酵母菌萃取物的基本培養基,降低倍化速率至0.88/小時。饋料批在接種後17h00開始且藉由pO2級聯參數的連續增加實現將溶解氧調控在30%(於32h15攪動、於40h30加壓、接著於45h40空氣流動)。如所預期的,生物質增加率在切換至42℃後立即減少。使用模擬胞溶後即時產率的小規模質體萃取程序,估算所產生的質體DNA量為1.03±0.17g/L。
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<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Asp或Glu
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<222> (2)..(4)
<223> Xaa是任何胺基酸
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<223> Xaa是Leu或Ile
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<213> 人工序列
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Claims (22)
- 一種質體,其編碼:i.胰島素抗原;ii.TGF-β;iii.IL-10;及其中該質體進一步共表現介白素-2(IL-2)。
- 根據請求項1的質體,其中該胰島素抗原係選自由以下者所組成之群組:胰島素原、前胰島素原、及其功能性或免疫優勢(immuno-dominant)胜肽片段。
- 根據請求項1或2中任一項的質體,其中該胰島素抗原為經胞內體靶定的(endosomally targeted)胰島素。
- 根據請求項1或2中任一項的質體,其中該質體以相較於IL-10低至少2倍的量表現胰島素抗原及TGF-β。
- 根據請求項1或2中任一項的質體,其中該質體以相較於IL-10低至少2倍的量表現IL-2、胰島素抗原及TGF-β。
- 根據請求項1或2中任一項的質體,其中該質體包含:(i)分開該胰島素抗原編碼序列及該TGF-β編碼序列的FMDV 2A元件,(ii)分開該TGF-β編碼序列及該IL-10編碼序列的EMCV IRES元件,及(iii)2A元件,其位於IL-2編碼序列的上游但在IL-10編碼序列的下游,並分開該IL-10編碼序列及該IL-2編碼序列。
- 根據請求項1或2中任一項的質體,其中該TGF-β編碼序列編碼持續活性的(constitutively active)TGF-β。
- 根據請求項1或2中任一項的質體,其中該質體包含:(i)經胞內體靶定的前胰島素原之編碼序列,(ii)FMDV 2A元件,(iii)TGF-β編碼序列,(iv)EMCV IRES元件,(v)IL-10編碼序列,(vi)P 2A元件,(vii)IL-2編碼序列,(viii)多腺苷酸化/終止元件,(ix)選擇基因,(x)複製起始序列,(xi)真核啟動子元件,(xii)真核轉譯起始序列,(xiii)胞內體分選序列,及(xiv)視需要的內含子。
- 根據請求項1至2中任一項的質體,其係用於延遲或預防第I型糖尿病。
- 根據請求項1至2中任一項的質體,其係用於皮下投予。
- 根據請求項1至2中任一項的質體,其係用於肌肉內投予。
- 一種DNA免疫療法疫苗,其包含根據請求項1至8中任一項的質體。
- 根據請求項12的DNA免疫療法疫苗,其係用於延遲或預防第I型糖尿病。
- 根據請求項12的DNA免疫療法疫苗,其係用於皮下投予。
- 根據請求項12的DNA免疫療法疫苗,其係用於肌肉內投予。
- 根據請求項12的DNA免疫療法疫苗,其中該質體以相較於IL-10低至少2倍的量表現胰島素抗原、IL-2及TGF-β。
- 根據請求項16的DNA免疫療法疫苗,其係用於延遲或預防第I型糖尿病。
- 根據請求項16的DNA免疫療法疫苗,其係用於皮下投予。
- 根據請求項16的DNA免疫療法疫苗,其係用於肌肉內投予。
- 一種醫藥組成物,其包含根據請求項1至11中任一項的質體,其中該醫藥組成物包含食鹽水溶液及/或緩衝液及/或螯合劑。
- 根據請求項20的醫藥組成物,其中該緩衝液不包含任何病毒、脂質共包裝劑(co-packing agent)或縮合劑。
- 根據請求項20的醫藥組成物,其中該組成物進一步包含GLP-1R促效劑。
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