JP2023527910A - 多用途かつ効率的な遺伝子発現のためのｒｎａレプリコン - Google Patents

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Abstract

本発明は、自己複製ウイルスのレプリカーゼ、例えばアルファウイルス起源のレプリカーゼによって複製され得るＲＮＡレプリコン（自己増幅ＲＮＡベクター（ｓａＲＮＡ））を包含する。本発明によれば、レプリカーゼオープンリーディングフレームの翻訳は、レプリカーゼオープンリーディングフレームの翻訳を内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の翻訳制御下に置くことによって５'末端キャップから切り離される。それにより、翻訳の開始はそれぞれのＩＲＥＳの分子特性に依存し、これは、キャップ依存性翻訳と比較して、リボソームを翻訳開始部位に誘導するための細胞開始因子をほとんどまたは全く必要としない可能性がある。本発明によれば、ＩＲＥＳ制御レプリカーゼ翻訳は、キャップされていない合成ｓａＲＮＡの使用を可能にし得る。さらに、ＩＲＥＳの使用は、ＩＲＥＳの上流にさらなる導入遺伝子を挿入する選択肢を提供する。

Description

本発明は、自己複製ウイルスのレプリカーゼ、例えばアルファウイルス起源のレプリカーゼによって複製され得るＲＮＡレプリコン（自己増幅ＲＮＡベクター（ｓａＲＮＡ））を包含する。本発明によれば、レプリカーゼオープンリーディングフレームの翻訳は、レプリカーゼオープンリーディングフレームの翻訳を内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の翻訳制御下に置くことによって５'末端キャップから切り離される。それにより、翻訳の開始はそれぞれのＩＲＥＳの分子特性に依存し、これは、キャップ依存性翻訳と比較して、リボソームを翻訳開始部位に誘導するための細胞開始因子をほとんどまたは全く必要としない可能性がある。本発明によれば、ＩＲＥＳ制御レプリカーゼ翻訳は、キャップされていない合成ｓａＲＮＡの使用を可能にし得る。さらに、ＩＲＥＳの使用は、ＩＲＥＳの上流にさらなる導入遺伝子を挿入する選択肢を提供する。
予防および治療目的のための１つ以上のポリペプチドをコードする外来遺伝子情報を含む核酸分子は、長年にわたって生物医学研究において検討されてきた。先行技術のアプローチは、標的細胞または生物への核酸分子の送達を共有するが、核酸分子および／または送達システムの種類が異なる：デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子の使用に関連する安全性の懸念の影響を受けて、リボ核酸（ＲＮＡ）分子が近年ますます注目されている。裸のＲＮＡの形態、または複合体化もしくはパッケージング形態、例えば非ウイルスもしくはウイルス送達ビヒクルでの一本鎖または二本鎖ＲＮＡの投与を含む、様々なアプローチが提案されてきた。ウイルスおよびウイルス送達ビヒクルでは、遺伝情報は、典型的にはタンパク質および／または脂質によって封入されている（ウイルス粒子）。例えば、ＲＮＡウイルスに由来する操作されたＲＮＡウイルス粒子が、植物を処理するため（国際公開第２０００／０５３７８０Ａ２号）または哺乳動物のワクチン接種のための（Ｔｕｂｕｌｅｋａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１９０，ｐｐ．１９１－１９５）送達ビヒクルとして提案されている。一般に、ＲＮＡウイルスは、ＲＮＡゲノムを有する感染性粒子の多様な群である。ＲＮＡウイルスは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスおよび二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）ウイルスに細分することができ、ｓｓＲＮＡウイルスは、一般に、複製サイクル中にＲＮＡゲノムをＤＮＡに逆転写するプラス鎖［（＋）鎖］および／またはマイナス鎖［（－）鎖］ウイルスまたはレトロウイルスにさらに分けることができる。プラス鎖ＲＮＡウイルスは、そのＲＮＡが宿主細胞での翻訳の鋳型として直接機能し得るため、生物医学における送達システムとして一見したところでは魅力的である。
アルファウイルスは、プラス鎖ＲＮＡウイルスの典型的な代表例である。アルファウイルスの宿主には、昆虫、魚類、ならびに家畜およびヒトなどの哺乳動物を含む広範囲の生物が含まれる。アルファウイルスは、感染細胞の細胞質で複製する（アルファウイルスの生活環の総説については、Ｊｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００９，ｖｏｌ．４，ｐｐ．８３７－８５６参照）。多くのアルファウイルスの総ゲノム長は、典型的には１１，０００～１２，０００ヌクレオチドの範囲であり、ゲノムＲＮＡは、典型的には５'キャップおよび３'ポリ（Ａ）尾部を有する。アルファウイルスのゲノムは、非構造タンパク質（ウイルスＲＮＡの転写、修飾および複製ならびにタンパク質修飾に関与する）および構造タンパク質（ウイルス粒子を形成する）をコードする。典型的には、ゲノム内に２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在する。４つの非構造タンパク質（ｎｓＰ１～ｎｓＰ４）は、典型的にはゲノムの５'末端付近から始まる第１のＯＲＦによって一緒にコードされ、一方アルファウイルスの構造タンパク質は、第１のＯＲＦの下流に見出され、ゲノムの３'末端付近に伸びる第２のＯＲＦによって一緒にコードされる。典型的には、第１のＯＲＦは第２のＯＲＦよりも大きく、その比率はおよそ２：１である。
アルファウイルスに感染した細胞では、非構造タンパク質のみがゲノムＲＮＡから翻訳され、一方構造タンパク質は、真核生物メッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ；Ｇｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．８７，ｐｐ．１１１－１２４）に類似したＲＮＡ分子であるサブゲノム転写物から翻訳可能である。感染後、すなわちウイルス生活環の初期段階には、（＋）鎖ゲノムＲＮＡは、非構造ポリタンパク質（ｎｓＰ１２３４）をコードするオープンリーディングフレームの翻訳のためにメッセンジャＲＮＡのように直接作用する。一部のアルファウイルスでは、ｎｓＰ３のコード配列とｎｓＰ４のコード配列との間にオパール終止コドンが存在する：翻訳がオパール終止コドンで終結すると、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２およびｎｓＰ３を含むポリタンパク質Ｐ１２３が生成され、さらにｎｓＰ４も含むポリタンパク質Ｐ１２３４がこのオパールコドンの読み取り終了時に生成される（Ｓｔｒａｕｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．４９１－５６２；Ｒｕｐｐ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．９６，ｐｐ．２４８３－２５００）。ｎｓＰ１２３４は、ｎｓＰ１２３およびｎｓＰ４断片へと自己タンパク質分解的に切断される。ポリペプチドｎｓＰ１２３およびｎｓＰ４は会合して、（＋）鎖ゲノムＲＮＡを鋳型として使用して、（－）鎖ＲＮＡを転写する（－）鎖レプリカーゼ複合体を形成する。典型的には、後の段階で、ｎｓＰ１２３断片は、個別のタンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２およびｎｓＰ３に完全に切断される（Ｓｈｉｒａｋｏ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，１９９４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．ｖｏｌ．６８，ｐｐ．１８７４－１８８５）。４つのタンパク質全てが、ゲノムＲＮＡの（－）鎖相補体を鋳型として使用して、新たな（＋）鎖ゲノムを合成する（＋）鎖レプリカーゼ複合体を形成する（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３２３，ｐｐ．１５３－１６３、Ｖａｓｉｌｊｅｖａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２７８，ｐｐ．４１６３６－４１６４５）。
感染細胞では、ｎｓＰ１によってサブゲノムＲＮＡおよび新たなゲノムＲＮＡに５'キャップが与えられ（Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０５，４３５－４４３；Ｒｏｚａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．７３，ｐｐ．２１２９－２１３４）、ｎｓＰ４によってポリアデニル酸［ポリ（Ａ）］尾部が与えられる（Ｒｕｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００９，ｖｏｌ．３８４，ｐｐ．２０１－２０８）。したがって、サブゲノムＲＮＡとゲノムＲＮＡの両方がメッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に類似する。
アルファウイルス構造タンパク質（全てウイルス粒子の成分である、コアヌクレオカプシドタンパク質Ｃ、エンベロープタンパク質Ｅ２およびエンベロープタンパク質Ｅ１）は、典型的にはサブゲノムプロモータの制御下で単一のオープンリーディングフレームによってコードされる（Ｓｔｒａｕｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．４９１－５６２）。サブゲノムプロモータは、シスで作用するアルファウイルス非構造タンパク質によって認識される。特に、アルファウイルスレプリカーゼは、ゲノムＲＮＡの（－）鎖相補体を鋳型として使用して（＋）鎖サブゲノム転写物を合成する。（＋）鎖サブゲノム転写物は、アルファウイルス構造タンパク質をコードする（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３２３，ｐｐ．１５３－１６３、Ｖａｓｉｌｊｅｖａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２７８，ｐｐ．４１６３６－４１６４５）。サブゲノムＲＮＡ転写物は、構造タンパク質を１つのポリタンパク質としてコードするオープンリーディングフレームの翻訳のための鋳型として働き、ポリタンパク質は、切断されて構造タンパク質を生じる。宿主細胞でのアルファウイルス感染の後期には、ｎｓＰ２のコード配列内に位置するパッケージングシグナルが、構造タンパク質によってパッケージングされた出芽ビリオンへのゲノムＲＮＡの選択的パッケージングを確実にする（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．７２，ｐｐ．４３２０－４３２６）。
感染細胞では、（－）鎖ＲＮＡの合成は、典型的には感染後最初の３～４時間にのみ観察され、後期段階では検出不能であり、この時点では（＋）鎖ＲＮＡ（ゲノムおよびサブゲノムの両方）の合成のみが観察される。Ｆｒｏｌｏｖ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＲＮＡ，ｖｏｌ．７，ｐｐ．１６３８－１６５１によれば、ＲＮＡ合成の調節についての一般的なモデルは、非構造ポリタンパク質のプロセシングへの依存性を示唆する：非構造ポリタンパク質ｎｓＰ１２３４の最初の切断はｎｓＰ１２３およびｎｓＰ４を生じる；ｎｓＰ４は、（－）鎖合成には活性であるが、（＋）鎖ＲＮＡの生成には非効率的なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）として作用する。ｎｓＰ２／ｎｓＰ３接合部での切断を含む、ポリタンパク質ｎｓＰ１２３のさらなるプロセシングは、（＋）鎖ＲＮＡの合成を増加させ、（－）鎖ＲＮＡの合成を減少または終結させるようにレプリカーゼの鋳型特異性を変化させる。
アルファウイルスＲＮＡの合成は、４つの保存された配列エレメント（ＣＳＥ；Ｓｔｒａｕｓｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．４９１－５６２；およびＦｒｏｌｏｖ，２００１，ＲＮＡ，ｖｏｌ．７，ｐｐ．１６３８－１６５１）を含むシス作用性ＲＮＡエレメントによっても調節される。
アルファウイルスゲノムは、宿主細胞におけるウイルスＲＮＡ複製のために重要であると理解されている４つの保存された配列エレメント（ＣＳＥ）を含む（Ｓｔｒａｕｓｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．４９１－５６２）。ウイルスゲノムの５'末端またはその近くに見出されるＣＳＥ １は、（－）鎖鋳型からの（＋）鎖合成のためのプロモータとして機能すると考えられている。ＣＳＥ １の下流に位置するが、ｎｓＰ１のコード配列内のゲノムの５'末端に依然として近いＣＳＥ ２は、ゲノムＲＮＡ鋳型からの（－）鎖合成の開始のためのプロモータとして作用すると考えられている（ＣＳＥ ２を含まないサブゲノムＲＮＡ転写物は、（－）鎖合成のための鋳型として機能しないことに留意されたい）。ＣＳＥ ３は、非構造タンパク質および構造タンパク質のコード配列の間の接合領域に位置し、サブゲノム転写物の効率的な転写のためのコアプロモータとして作用する。最後に、アルファウイルスゲノムの３'非翻訳領域のポリ（Ａ）配列のすぐ上流に位置するＣＳＥ ４は、（－）鎖合成の開始のためのコアプロモータとして機能すると理解されている（Ｊｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００９，ｖｏｌ．４，ｐｐ．８３７－８５６）。アルファウイルスのＣＳＥ ４およびポリ（Ａ）尾部は、効率的な（－）鎖合成のために一緒に機能すると理解されている（Ｈａｒｄｙ＆Ｒｉｃｅ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００５，ｖｏｌ．７９，ｐｐ．４６３０－４６３９）。アルファウイルスタンパク質に加えて、おそらくはタンパク質である宿主細胞因子も、保存された配列エレメントに結合し得る（Ｓｔｒａｕｓｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．４９１－５６２）。アルファウイルスゲノムの５'複製認識配列は、翻訳開始に関与するだけでなく、ウイルスＲＮＡの合成に関与する２つの保存された配列エレメント、ＣＳＥ １およびＣＳＥ ２も含む。ＣＳＥ １およびＣＳＥ ２の機能にとって、二次構造は直鎖状配列よりも重要であると考えられている（Ｓｔｒａｕｓｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．４９１－５６２）。
アルファウイルス由来のベクターは、外来遺伝情報を標的細胞または標的生物に送達するために提案されている。単純なアプローチでは、アルファウイルス構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームに置き換える。アルファウイルスに基づくトランス複製系は、２つの別個の核酸分子上のアルファウイルスヌクレオチド配列エレメントに依存する：一方の核酸分子はウイルスレプリカーゼをコードし（典型的にはポリタンパク質ｎｓＰ１２３４として）、他方の核酸分子は前記レプリカーゼによってトランスで複製されることが可能である（したがってトランス複製系という呼称）。トランス複製には所与の宿主細胞におけるこれら両方の核酸分子の存在が必要である。トランスでレプリカーゼによって複製され得る核酸分子は、アルファウイルスレプリカーゼによる認識およびＲＮＡ合成を可能にする特定のアルファウイルス配列エレメントを含まなければならない。
アルファウイルス由来ＲＮＡベクターなどのレプリコンＲＮＡとも呼ばれる自己増幅ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）は、サブゲノムプロモータの制御下で目的の遺伝子の効率的な発現を可能にする。しかしながら、最初にインビトロで転写された合成ｓａＲＮＡはキャップを必要とするので、そのようなベクターの汎用性は限られている。これは、そのようなベクターを提供するためのコストおよび費用を増加させる。さらに、従来のｓａＲＮＡを使用したタンパク質発現（レプリカーゼおよび目的の遺伝子（ＧＯＩ））はキャップ制御されており、正準翻訳を可能にしている、調節している、または制限している全ての細胞翻訳開始因子を必要とする。
国際公開第２０００／０５３７８０Ａ２号
Ｔｕｂｕｌｅｋａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１９０，ｐｐ．１９１－１９５ Ｊｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００９，ｖｏｌ．４，ｐｐ．８３７－８５６ Ｇｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．８７，ｐｐ．１１１－１２４ Ｓｔｒａｕｓ ＆ Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．４９１－５６２ Ｒｕｐｐ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．９６，ｐｐ．２４８３－２５００ Ｓｈｉｒａｋｏ ＆ Ｓｔｒａｕｓｓ，１９９４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．ｖｏｌ．６８，ｐｐ．１８７４－１８８５ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３２３，ｐｐ．１５３－１６３ Ｖａｓｉｌｊｅｖａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２７８，ｐｐ．４１６３６－４１６４５ Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０５，４３５－４４３ Ｒｏｚａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．７３，ｐｐ．２１２９－２１３４ Ｒｕｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００９，ｖｏｌ．３８４，ｐｐ．２０１－２０８ Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．７２，ｐｐ．４３２０－４３２６ Ｆｒｏｌｏｖ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＲＮＡ，ｖｏｌ．７，ｐｐ．１６３８－１６５１ Ｈａｒｄｙ ＆ Ｒｉｃｅ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００５，ｖｏｌ．７９，ｐｐ．４６３０－４６３９
本発明は、レプリカーゼの翻訳を指示するために内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を使用することにより、レプリカーゼのキャップ依存性翻訳によって通常課せられる制約を取り除く。さらなるＧＯＩをＩＲＥＳの上流に挿入し、５'末端キャップの制御下に配置し得る。そのようなＧＯＩは、５'複製認識配列（ＲＲＳ）と重複するｎｓＰ１配列にインフレームで融合され、元のｎｓＰ１開始コドンから翻訳され得るか、またはＧＯＩがそれ自体のＡＵＧから翻訳されるように、ＡＵＧコドンがＲＲＳのｎｓＰ１内で除去される。
一態様では、本発明は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）と、自己複製ウイルス由来の機能性非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームとを含むＲＮＡレプリコンであって、ＩＲＥＳが機能性非構造タンパク質の発現を制御する、ＲＮＡレプリコンを提供する。
一実施形態では、自己複製ウイルス由来の機能性非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、ＩＲＥＳの下流に位置する。
一実施形態では、ＩＲＥＳは細胞ストレスに反応しない。一実施形態では、ＩＲＥＳは、インターフェロン、好ましくはインターフェロン－アルファおよび／またはインターフェロン－ベータなどのＩ型インターフェロンに反応しない。一実施形態では、ＩＲＥＳは、細胞またはウイルスのＩＲＥＳ、好ましくはウイルスのＩＲＥＳである。一実施形態では、ＩＲＥＳは、ピコルナウイルス、フラビウイルスまたはジシストロウイルスからなる群より選択されるウイルスに由来する。一実施形態では、ＩＲＥＳは、ピコルナウイルスまたはジシストロウイルス、好ましくはジシストロウイルスに由来する。一実施形態では、ＩＲＥＳはＩＶ型ＩＲＥＳである。一実施形態では、ＩＲＥＳによって制御される発現は、ＩＲＥＳトランス作用因子とは無関係である。一実施形態では、ＩＲＥＳによって制御される発現は、細胞翻訳開始因子とは無関係である。一実施形態では、ＩＲＥＳによって制御される発現は、真核生物開始因子２（ｅＩＦ２）のリン酸化とは無関係である。
一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは５'キャップを含まない。
一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは５'複製認識配列を含む。一実施形態では、機能性非構造タンパク質は５'複製認識配列に対して異種である。一実施形態では、５'複製認識配列は、自己複製ウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列を含む。一実施形態では、ＲＮＡレプリコンの５'複製認識配列は、アルファウイルスの保存された配列エレメント１（ＣＳＥ １）および保存された配列エレメント２（ＣＳＥ ２）に相同な配列を含む。一実施形態では、５'複製認識配列は、自己複製ウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列を含み、自己複製ウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列は、天然のウイルス配列と比較して少なくとも１つの開始コドンの除去を含むことを特徴とする。一実施形態では、自己複製ウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列は、少なくとも自己複製ウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームの天然の開始コドンの除去を含むことを特徴とする。一実施形態では、自己複製ウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列は、自己複製ウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームの天然の開始コドン以外の少なくとも１つの開始コドンの除去を含むことを特徴とする。一実施形態では、自己複製ウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列は、開始コドンを含まないことを特徴とする。一実施形態では、５'複製認識配列は、ＲＮＡレプリコンに関する５'複製認識配列の機能性を提供する１つ以上のステムループを含む。一実施形態では、５'複製認識配列の１つ以上のステムループが欠失または破壊されるが、その欠失または破壊は、５'複製認識配列の機能に影響を及ぼさない。好ましい実施形態では、５'複製認識配列の１つ以上のステムループは欠失または破壊されない。より好ましくは、５'複製認識配列のステムループのいずれも欠失または破壊されない。一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、少なくとも１つの開始コドンの除去によって導入された少なくとも１つのステムループ内のヌクレオチド対合破壊を補償する少なくとも１つのヌクレオチド変化を含む。一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、自己複製ウイルス由来のトランケートされた非構造タンパク質、特にｎｓＰ１の断片をコードするオープンリーディングフレームを含まない。一実施形態では、自己複製ウイルス由来の機能性非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、５'複製認識配列と重複しない。
一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、５'複製認識配列の下流およびＩＲＥＳの上流に目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。一実施形態では、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、サブゲノムプロモータの制御下にない。一実施形態では、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、サブゲノムプロモータの制御下にある。一実施形態では、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、好ましくは自己複製ウイルスに由来しない導入遺伝子である。一実施形態では、５'複製認識配列および目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームは重複せず、好ましくは５'複製認識配列はＲＮＡレプリコンのいかなるオープンリーディングフレームとも重複せず、例えば５'複製認識配列は機能的開始コドンを含まず、好ましくはいかなる開始コドンも含まない。一実施形態では、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームの開始コドンは、ＲＮＡレプリコンの５'→３'方向で最初の機能的開始コドン、好ましくは最初の開始コドンである。一実施形態では、目的のタンパク質は、鋳型としてＲＮＡレプリコンから発現され得る。一実施形態では、目的のタンパク質は、さらにサブゲノムＲＮＡから発現され得る。一実施形態では、目的のタンパク質は、自己複製ウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列によってコードされるタンパク質またはペプチドとの融合タンパク質として発現され、融合タンパク質の発現は、自己複製ウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列の開始コドンで開始される。一実施形態では、自己複製ウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列の開始コドンは、自己複製ウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームの天然の開始コドンである。一実施形態では、目的のタンパク質の発現は、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームの開始コドンで開始される。
一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むサブゲノムＲＮＡの産生を制御するサブゲノムプロモータを含む。一実施形態では、サブゲノムＲＮＡは、自己複製ウイルス由来の機能性非構造タンパク質に由来するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの転写産物である。一実施形態では、目的のタンパク質は、鋳型としてサブゲノムＲＮＡから発現され得る。一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、自己複製ウイルス由来の機能性非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの下流に、サブゲノムプロモータによって制御される目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。一実施形態では、サブゲノムプロモータは、自己複製ウイルス由来の機能性非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームと重複する。一実施形態では、サブゲノムプロモータは、自己複製ウイルス由来の機能性非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームと重複しない。
一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは３'複製認識配列を含む。一実施形態では、自己複製ウイルス由来の機能性非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、５'および／または３'複製認識配列、ならびにサブゲノムプロモータは、自己複製ウイルス、好ましくは同じ自己複製ウイルス種に由来する。
一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、自己複製ウイルス由来の機能性非構造タンパク質に由来するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって複製され得る。
一実施形態では、自己複製ウイルスはアルファウイルスである。
一実施形態では、アルファウイルスは、ベネズエラウマ脳炎複合体ウイルス、東部ウマ脳炎複合体ウイルス、西部ウマ脳炎複合体ウイルス、セムリキ森林ウイルス複合体ウイルス、バーマフォレストウイルス、ミデルブルグウイルスおよびヌドゥムウイルスからなる群より選択される。一実施形態では、アルファウイルスはベネズエラウマ脳炎ウイルスまたはセムリキ森林ウイルスである。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載のＲＮＡレプリコンを含む非ウイルス粒子を提供する。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載のＲＮＡレプリコンをコードする核酸配列を含むＤＮＡを提供する。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載のＲＮＡレプリコンと薬学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。
さらなる態様では、本発明は、治療に使用するための本明細書に記載の組成物を提供する。
さらなる態様では、本発明は、細胞内で目的のタンパク質を生成するための方法であって、
（ａ）目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む本明細書に記載のＲＮＡレプリコンを得る工程、および
（ｂ）ＲＮＡレプリコンを細胞に接種する工程
を含む方法を提供する。
さらなる態様では、本発明は、対象において目的のタンパク質を生成するための方法であって、
（ａ）目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む本明細書に記載のＲＮＡレプリコンを得る工程、および
（ｂ）ＲＮＡレプリコンを対象に投与する工程
を含む方法を提供する。
一実施形態では、目的のタンパク質は抗原性ペプチドまたはタンパク質である。
一実施形態では、本方法は、対象において免疫応答を誘発するための方法である。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載のレプリコンを含む細胞を提供する。一実施形態では、細胞は、本明細書に記載の方法に従って接種される。一実施形態では、細胞は、本明細書に記載の方法によって得ることができる。一実施形態では、細胞は生物の一部である。
ＲＮＡ構築物。（１）従来のアルファウイルスレプリコンでは、非構造タンパク質１～４（ｎｓＰ１～４；＝レプリカーゼ酵素複合体）は、ＲＮＡの５'末端からキャップ依存的に翻訳される。サブゲノムプロモータ（ＳＧＰ）内で始まり、第１の目的の遺伝子（ＧＯＩ １）をコードするサブゲノム転写物もキャップされる。（２）ＳＧＰを内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）に置き換えた場合、ＧＯＩ １は、もはやキャップされたサブゲノム転写物によってコードされない。その代わりに、ゲノムＲＮＡによってコードされ、その翻訳は、キャップとは無関係に内部で（ｎｓＰ１～４の下流で）開始する。（３）ｎｓＰ１～４の上流のＩＲＥＳは、ｎｓＰ１～４の翻訳を５'キャップから切り離す。ＲＮＡの複製能を保存するためには、５'非翻訳領域（ＵＴＲ）およびｎｓＰ１（ｎｓＰ１＊）のＮ末端と重複する改変されていない（野生型；ｗｔ）５'複製認識配列（ＲＲＳ）を維持する必要がある。このＩＲＥＳ開始レプリコンでは、ｎｓＰ１～４の翻訳は選択されたＩＲＥＳの特性に依存するが、ＧＯＩ １の発現はＳＧＰの制御下のままである。（４）第２のＧＯＩ（ＧＯＩ ２）は、５'ＲＲＳに重なるｎｓＰ１＊のＮ末端部分にインフレームで融合することができる。（５）さらなる変異体では、ＳＧＰおよびその下流のＧＯＩ １を除去し得る。（６）Ｎ末端ｎｓＰ１＊の翻訳を回避するために、元の開始コドンおよびさらなる推定ＡＵＧコドンを変異させることができ（ΔＡＵＧ）、それによってＧＯＩ ２のＡＵＧでキャップ依存性翻訳が開始することが可能になる。ｎｓＰ１～４はＩＲＥＳの下流のままであり、ＧＯＩ １はＳＧＰの下流のままである。（７）ＡＵＧを欠き、かつＳＧＰおよびＧＯＩ １を欠く５'ＲＲＳを有する単純化された構築物。 ＩＲＥＳ媒介発現は、キャップ依存性翻訳よりも約１０倍弱い。 ＩＲＥＳ媒介レプリカーゼ発現はＲＮＡ複製を可能にする。 ＩＲＥＳ開始レプリコンは、両方のオープンリーディングフレームの堅固な発現を示す。 ＥＭＣＶ ＩＲＥＳと比較した因子非依存性ジシストロウイルス遺伝子間領域。 セムリキ森林ウイルス由来のＩＲＥＳ開始レプリコンは、キャップありおよびキャップなしで複製している。 エンテロウイルス７１ ＩＲＥＳおよびＣ型肝炎ウイルスＩＲＥＳの制御されたレプリカーゼ発現は複製を可能にする。 ＶＥＥＶワクチン株ＴＣ－８３由来のＩＲＥＳ開始レプリコンは、ＷＴ ＶＥＥＶよりも効率的に複製し、発現する。 ＷＴおよびＴＣ－８３ ＶＥＥＶ株のキャップされていない従来のレプリコンは、ほとんど複製しない。 ＩＲＥＳの上流に発現されるインターフェロン阻害剤は、ＩＲＥＳ開始レプリコンの発現を増強する。
本発明を以下で詳細に説明するが、本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコルおよび試薬に限定されず、これらは異なり得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
好ましくは、本明細書で使用される用語は、"Ａ ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）"，Ｈ．Ｇ．Ｗ．Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｂ．Ｎａｇｅｌ，ａｎｄ Ｈ．Ｋｏｌｂｌ，Ｅｄｓ．，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，ＣＨ－４０１０ Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，（１９９５）に記載されているように定義される。
本発明の実施は、特に指示されない限り、当技術分野の文献（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ １９８９参照）で説明されている化学、生化学、細胞生物学、免疫学、および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を用いる。
以下において、本発明の要素を説明する。これらの要素を具体的な実施形態と共に列挙するが、それらは、さらなる実施形態を創出するために任意の方法および任意の数で組み合わせてもよいことが理解されるべきである。様々に説明される例および好ましい実施形態は、本発明を明示的に記載される実施形態のみに限定すると解釈されるべきではない。この説明は、明示的に記載される実施形態を任意の数の開示される要素および／または好ましい要素と組み合わせた実施形態を開示し、包含すると理解されるべきである。さらに、本出願において記載される全ての要素の任意の並び替えおよび組合せは、文脈上特に指示されない限り、この説明によって開示されているとみなされるべきである。
「約」という用語は、およそまたはほぼを意味し、本明細書に記載の数値または範囲の文脈では、好ましくは列挙または特許請求される数値または範囲の＋／－１０％を意味する。
本発明を説明する文脈で（特に特許請求の範囲の文脈で）使用される「１つの」および「その」という用語ならびに同様の言及は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、その範囲内に属する各々別々の値を個別に言及することの簡略方法として機能することが意図されている。本明細書で特に指示されない限り、各個々の値は、本明細書で個別に列挙されているかのごとくに本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的言語（例えば「など」）の使用は、単に本発明をより良く説明することを意図し、特許請求される本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言語も、本発明の実施に不可欠な、特許請求されていない要素を指示すると解釈されるべきではない。
特に明記されない限り、「含む」という用語は、「含む」によって導入されたリストのメンバーに加えて、さらなるメンバーが任意に存在し得ることを示すために本文書の文脈で使用される。しかし、「含む」という用語は、さらなるメンバーが存在しない可能性を包含することが本発明の特定の実施形態として企図され、すなわちこの実施形態の目的のためには、「含む」は「からなる」の意味を有すると理解されるべきである。
総称によって特徴付けられる成分の相対量の表示は、その総称でカバーされる全ての特定の変異体またはメンバーの合計量を指すこと該とされている。総称によって定義された特定の成分が特定の相対量で存在すると指定され、かつ、この成分が総称でカバーされる特定の変異体またはメンバーであるとさらに特徴付けられる場合、総称でカバーされる他の変異体またはメンバーが、総称でカバーされる成分の合計相対量が指定された相対量を超えるように付加的に存在しないこと、より好ましくは総称でカバーされる他の変異体またはメンバーが全く存在しないことを意味する。
本明細書の本文全体を通していくつかの資料を引用する。本明細書で引用される資料（全ての特許、特許出願、科学出版物、製造者の仕様書、指示書等を含む）の各々は、上記または下記のいずれでも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本発明がそのような開示に先行する権利を有さなかったことの承認と解釈されるべきではない。
本明細書で使用される「低減する」または「阻害する」などの用語は、好ましくは５％以上、１０％以上、２０％以上、より好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％以上のレベルの全体的な減少を生じさせる能力を意味する。「阻害する」という用語または同様の語句は、完全なまたは本質的に完全な阻害、すなわちゼロまたは本質的にゼロへの低減を含む。
「増加する」または「増強する」などの用語は、好ましくは、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも１００％の増加または増強に関する。
「正味電荷」という用語は、化合物または粒子などの物体全体の電荷を指す。
全体的な正味の正電荷を有するイオンはカチオンであり、一方、全体的な正味の負電荷を有するイオンはアニオンである。したがって、本発明によれば、アニオンは陽子よりも多くの電子を有するイオンであり、正味の負電荷を与え、カチオンは陽子よりも少ない電子を有するイオンであり、正味の正電荷を与える。
所与の化合物または粒子に関して、「帯電した」、「正味電荷」、「負に帯電した」または「正に帯電した」という用語は、ｐＨ７．０の水に溶解または懸濁した場合の所与の化合物または粒子の正味電荷を指す。
本発明による「核酸」という用語は、ヌクレオチド塩基上、糖上またはリン酸塩上の核酸、ならびに非天然ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含む核酸の化学的誘導体化も含む。いくつかの実施形態では、核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）である。一般に、核酸分子または核酸配列は、好ましくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）である核酸を指す。本発明によれば、核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、組換えによって調製された分子および化学合成された分子を含む。本発明によれば、核酸は、一本鎖または二本鎖の線状または共有結合閉環分子の形態であり得る。
本発明によれば、「核酸配列」は、核酸、例えばリボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中のヌクレオチドの配列を指す。この用語は、核酸分子全体（核酸分子全体の一本鎖など）またはその一部（例えば断片）を指し得る。
本発明によれば、「ＲＮＡ」または「ＲＮＡ分子」という用語は、リボヌクレオチド残基を含み、好ましくは完全にまたは実質的にリボヌクレオチド残基からなる分子に関する。「リボヌクレオチド」という用語は、β－Ｄ－リボフラノシル基の２'位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドに関する。「ＲＮＡ」という用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的または完全に精製されたＲＮＡなどの単離されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、ならびに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変によって天然に存在するＲＮＡとは異なる修飾ＲＮＡなどの組換え生産されたＲＮＡを含む。そのような改変は、例えばＲＮＡの末端（一方もしくは両方）へのまたは内部での、例えばＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドにおける、非ヌクレオチド物質の付加を含み得る。ＲＮＡ分子中のヌクレオチドは、非天然のヌクレオチドまたは化学合成されたヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドなどの非標準のヌクレオチドも含み得る。これらの改変されたＲＮＡは、類似体、特に天然に存在するＲＮＡの類似体と称され得る。
本発明によれば、ＲＮＡは一本鎖または二本鎖であり得る。本発明のいくつかの実施形態では、一本鎖ＲＮＡが好ましい。「一本鎖ＲＮＡ」という用語は、一般に、相補的な核酸分子（典型的には相補的なＲＮＡ分子）が結合していないＲＮＡ分子を指す。一本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡの一部が折り返され、塩基対、ステム、ステムループおよびバルジを含むがこれらに限定されない二次構造モチーフを形成することを可能にする自己相補的配列を含み得る。一本鎖ＲＮＡは、マイナス鎖［（－）鎖］またはプラス鎖［（＋）鎖］として存在することができる。（＋）鎖は、遺伝情報を含むまたはコードする鎖である。遺伝情報は、例えばタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列であり得る。（＋）鎖ＲＮＡがタンパク質をコードする場合、（＋）鎖は翻訳（タンパク質合成）の鋳型として直接機能し得る。（－）鎖は（＋）鎖の相補体である。二本鎖ＲＮＡの場合、（＋）鎖と（－）鎖は２つの別個のＲＮＡ分子であり、これら両方のＲＮＡ分子が互いに会合して二本鎖ＲＮＡ（「二重鎖ＲＮＡ」）を形成する。
ＲＮＡの「安定性」という用語は、ＲＮＡの「半減期」に関する。「半減期」は、分子の活性、量、または数の半分を除去するのに必要な期間に関する。本発明の文脈において、ＲＮＡの半減期は、そのＲＮＡの安定性の指標である。ＲＮＡの半減期は、ＲＮＡの「発現の持続期間」に影響を及ぼし得る。長い半減期を有するＲＮＡは長期間発現されると予想することができる。
「翻訳効率」という用語は、特定の期間内にＲＮＡ分子によって提供される翻訳産物の量に関する。
核酸配列に関する「断片」は、核酸配列の一部、すなわち５'末端および／または３'末端で短縮された核酸配列を表す配列に関する。好ましくは、核酸配列の断片は、前記核酸配列からのヌクレオチド残基の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む。本発明では、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を保持するＲＮＡ分子の断片が好ましい。
アミノ酸配列（ペプチドまたはタンパク質）に関する「断片」は、アミノ酸配列の一部、すなわちＮ末端および／またはＣ末端で短縮されたアミノ酸配列を表す配列に関する。Ｃ末端で短縮された断片（Ｎ末端断片）は、例えばオープンリーディングフレームの３'末端を欠くトランケートされたオープンリーディングフレームの翻訳によって得ることができる。Ｎ末端で短縮された断片（Ｃ末端断片）は、例えば、トランケートされたオープンリーディングフレームが翻訳を開始させるように働く開始コドンを含む限り、オープンリーディングフレームの５'末端を欠くトランケートされたオープンリーディングフレームの翻訳によって得ることができる。アミノ酸配列の断片は、例えばアミノ酸配列からのアミノ酸残基の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％を含む。
本発明による、例えば核酸およびアミノ酸配列に関する「変異体」という用語は、任意の変異体、特に突然変異体、ウイルス株変異体、スプライス変異体、立体配座、アイソフォーム、対立遺伝子変異体、種変異体および種ホモログ、特に天然に存在するものを含む。対立遺伝子変異体は、遺伝子の通常の配列における改変に関連しており、その重要性はしばしば不明である。完全な遺伝子配列決定によって、所与の遺伝子の多数の対立遺伝子変異体がしばしば同定される。核酸分子に関して、「変異体」という用語は縮重核酸配列を含み、本発明による縮重核酸は、遺伝暗号の縮重のためにコドン配列が参照核酸とは異なる核酸である。種ホモログは、所与の核酸またはアミノ酸配列のものとは異なる種を起源とする核酸またはアミノ酸配列である。ウイルスホモログは、所与の核酸またはアミノ酸配列のものとは異なるウイルスを起源とする核酸またはアミノ酸配列である。
本発明によれば、核酸変異体は、参照核酸と比較して単一または複数のヌクレオチドの欠失、付加、変異、置換および／または挿入を含む。欠失は、参照核酸からの１つ以上のヌクレオチドの除去を含む。付加変異体は、１つ以上のヌクレオチド、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０、またはそれ以上のヌクレオチドの５'末端および／または３'末端融合を含む。置換の場合、配列中の少なくとも１つのヌクレオチドが除去され、少なくとも１つの他のヌクレオチドがその場所に挿入される（トランスバージョンおよびトランジションなど）。変異には、脱塩基部位、架橋部位、および化学的に改変または修飾された塩基が含まれる。挿入には、参照核酸への少なくとも１つのヌクレオチドの付加が含まれる。
本発明によれば、「ヌクレオチド変化」は、参照核酸と比較して単一または複数のヌクレオチドの欠失、付加、変異、置換および／または挿入を指すことができる。いくつかの実施形態では、「ヌクレオチド変化」は、参照核酸と比較して、単一ヌクレオチドの欠失、単一ヌクレオチドの付加、単一ヌクレオチドの変異、単一ヌクレオチドの置換および／または単一ヌクレオチドの挿入からなる群より選択される。本発明によれば、核酸変異体は、参照核酸と比較して１つ以上のヌクレオチド変化を含み得る。
特定の核酸配列の変異体は、好ましくは前記特定の配列の少なくとも１つの機能的特性を有し、好ましくは前記特定の配列と機能的に等価であり、例えば特定の核酸配列の特性と同一または類似の特性を示す核酸配列である。
以下に記載されるように、本発明のいくつかの実施形態は、とりわけ、他の核酸配列と相同な核酸配列によって特徴付けられる。これらの相同な配列は、他の核酸配列の変異体である。
好ましくは、所与の核酸配列と前記所与の核酸配列の変異体である核酸配列との間の同一性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。同一性の程度は、好ましくは少なくとも約３０、少なくとも約５０、少なくとも約７０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、または少なくとも約４００ヌクレオチドの領域について与えられる。好ましい実施形態では、同一性の程度は、参照アミノ酸配列の全長について与えられる。
「配列類似性」は、同一であるかまたは保存的アミノ酸置換を表すアミノ酸の割合を示す。２つのポリペプチドまたは核酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるアミノ酸またはヌクレオチドの割合を示す。
「％同一」という用語は、特に、比較する２つの配列間の最適なアラインメントにおいて同一であるヌクレオチドの割合を指すことが意図されており、前記割合は純粋に統計的であり、２つの配列間の相違は配列の全長にわたってランダムに分布していてもよく、比較する配列は、２つの配列間の最適なアラインメントを得るために、参照配列と比較して付加または欠失を含んでいてもよい。２つの配列の比較は、通常、対応する配列の局所領域を同定するために、最適なアラインメント後に、セグメントまたは「比較ウィンドウ」に関して前記配列を比較することによって実施される。比較のための最適なアラインメントは、手作業によって、またはＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２による局所相同性アルゴリズムを用いて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３による局所相同性アルゴリズムを用いて、およびＰｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，２４４４の類似性検索アルゴリズムを用いて、または前記アルゴリズムを使用したコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ ＮおよびＴＦＡＳＴＡ）を援用して実施し得る。
同一性パーセントは、比較する配列が一致する同一の位置の数を決定し、この数を比較する位置の数で除して、この結果に１００を乗じることによって得られる。
例えば、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｗｂｌａｓｔ２．ｃｇｉで入手可能なＢＬＡＳＴプログラム「ＢＬＡＳＴ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」を使用し得る。
２つの配列が互いに相補的である場合、核酸は別の核酸に「ハイブリダイズすることができる」または「ハイブリダイズする」。２つの配列が互いに安定な二重鎖を形成することができる場合、核酸は別の核酸に「相補的」である。本発明によれば、ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ポリヌクレオチド間の特異的なハイブリダイゼーションを可能にする条件（ストリンジェントな条件）下で実施される。ストリンジェントな条件は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｉｔｏｒｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されており、例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液（３．５×ＳＳＣ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中の６５°Ｃでのハイブリダイゼーションを指す。ＳＳＣは、０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡが転写された膜を、例えば室温で２×ＳＳＣ中で洗浄し、次に６８℃までの温度で０．１～０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳ中で洗浄する。
相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合（例えばワトソン－クリック塩基対合）を形成することができる核酸分子中の連続する残基の割合を示す（例えば１０個のうちの５、６、７、８、９、１０個が５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％相補的である）。「完全に相補的」または「全面的に相補的」とは、核酸配列の全ての連続する残基が、第２の核酸配列中の同じ数の連続する残基と水素結合することを意味する。好ましくは、本発明による相補性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。最も好ましくは、本発明による相補性の程度は１００％である。
「誘導体」という用語は、ヌクレオチド塩基上、糖上またはリン酸塩上の核酸の化任意の学的誘導体化を含む。「誘導体」という用語はまた、天然には存在しないヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含有する核酸を含む。好ましくは、核酸の誘導体化はその安定性を高める。
本発明によれば、「核酸配列に由来する核酸配列」とは、それが由来する核酸の変異体である核酸を指す。好ましくは、ＲＮＡ分子中の特定の配列を置換する場合、特定の配列に関して変異体である配列は、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を保持する。
「ｎｔ」は、１つのヌクレオチドの略語であるか、または複数のヌクレオチド、好ましくは核酸分子中の連続するヌクレオチドの略語である。
本発明によれば、「コドン」という用語は、リボソームでのタンパク質合成中に次にどのアミノ酸が付加されるかを特定する、コード核酸中の塩基トリプレットを指す。
「転写」および「転写する」という用語は、特定の核酸配列を有する核酸分子（「核酸鋳型」）がＲＮＡポリメラーゼによって読み取られ、その結果ＲＮＡポリメラーゼが一本鎖ＲＮＡ分子を生成するプロセスに関する。転写中に、核酸鋳型の遺伝情報が転写される。核酸鋳型はＤＮＡであってもよい；しかし、例えばアルファウイルス核酸鋳型からの転写の場合、鋳型は、典型的にはＲＮＡである。その後、転写されたＲＮＡはタンパク質に翻訳され得る。本発明によれば、「転写」という用語は「インビトロ転写」を含み、「インビトロ転写」という用語は、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡが無細胞系においてインビトロで合成されるプロセスに関する。好ましくは、クローニングベクターが転写物の生成に適用される。これらのクローニングベクターは、一般に転写ベクターと歩ばれ、本発明によれば「ベクター」という用語に包含される。クローニングベクターは、好ましくはプラスミドである。本発明によれば、ＲＮＡは、好ましくはインビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）であり、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって得られ得る。転写を制御するためのプロモータは、任意のＲＮＡポリメラーゼのための任意のプロモータであり得る。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡをクローニングし、それをインビトロ転写のための適切なベクターに導入することによって得られ得る。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写によって得られ得る。
転写中に生成される一本鎖核酸分子は、典型的には鋳型の相補的配列である核酸配列を有する。
本発明によれば、「鋳型」または「核酸鋳型」または「鋳型核酸」という用語は、一般に、複製または転写され得る核酸配列を指す。
「核酸配列から転写された核酸配列」および同様の用語は、適切な場合、鋳型核酸配列の転写産物である完全なＲＮＡ分子の一部としての核酸配列を指す。典型的には、転写された核酸配列は一本鎖ＲＮＡ分子である。
「核酸の３'末端」は、本発明によれば、遊離ヒドロキシ基を有するその末端を指す。二本鎖核酸、特にＤＮＡの図式的表示では、３'末端は常に右側にある。「核酸の５'末端」は、本発明によれば、遊離リン酸基を有するその末端を指す。二本鎖核酸、特にＤＮＡの図式的表示では、５'末端は常に左側にある。
５'末端 ５'－－Ｐ－ＮＮＮＮＮＮＮ－ＯＨ－３' ３'末端
３'－ＨＯ－ＮＮＮＮＮＮＮ－Ｐ－－５'
「上流」とは、核酸分子の第１のエレメントと第２のエレメントの両方が同じ核酸分子中に含まれ、核酸分子の第１のエレメントが第２のエレメントよりもその核酸分子の５'末端のより近くに位置する、核酸分子の第１のエレメントの、その核酸分子の第２のエレメントに対する相対的な位置を表す。その場合、第２のエレメントは、その核酸分子の第１のエレメントの「下流」にあると言われる。第２のエレメントの「上流」に位置するエレメントは、同義的に、その第２のエレメントの「５'側」に位置すると称され得る。二本鎖核酸分子については、「上流」および「下流」のような指示は、「＋」鎖に関して与えられる。
本発明によれば、「機能的連結」または「機能的に連結された」は、機能的関係内での接続に関する。核酸は、別の核酸配列と機能的に関連している場合、「機能的に連結されて」いる。例えば、プロモータは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、前記コード配列に機能的に連結されている。機能的に連結された核酸は、典型的には互いに隣接しているが、適切な場合はさらなる核酸配列によって分離されており、特定の実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼによって転写されて単一のＲＮＡ分子（共通転写物）を生じる。
特定の実施形態では、核酸は、本発明によれば、核酸に関して同種または異種であり得る発現制御配列に機能的に連結される。
「発現制御配列」という用語は、本発明によれば、プロモータ、リボソーム結合配列、および遺伝子の転写または誘導されたＲＮＡの翻訳を制御する他の制御エレメントを含む。本発明の特定の実施形態では、発現制御配列を調節することができる。発現制御配列の正確な構造は、種または細胞型に応じて異なり得るが、通常、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する５'非転写配列ならびに５'および３'非翻訳配列を含む。より具体的には、５'非転写発現制御配列は、機能的に連結された遺伝子の転写制御のためのプロモータ配列を包含するプロモータ領域を含む。発現制御配列は、エンハンサー配列または上流活性化配列も含み得る。ＤＮＡ分子の発現制御配列は、通常、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などの５'非転写配列ならびに５'および３'非翻訳配列を含む。アルファウイルスＲＮＡの発現制御配列は、サブゲノムプロモータおよび／または１つ以上の保存された配列エレメントを含み得る。本発明による特定の発現制御配列は、本明細書に記載されるように、アルファウイルスのサブゲノムプロモータである。
本明細書で特定される核酸配列、特に転写可能なコード核酸配列は、任意の発現制御配列、特に前記核酸配列と同種または異種であり得るプロモータと組み合わせてもよく、「同種」という用語は、核酸配列が天然でも発現制御配列に機能的に連結されているという事実を指し、「異種」という用語は、核酸配列が天然では発現制御配列に機能的に連結されていないという事実を指す。
転写可能な核酸配列、特にペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列と発現制御配列とは、それらが、転写可能な、特にコード核酸配列の転写または発現が発現制御配列の制御下または影響下にあるように互いに共有結合されている場合、互いに「機能的に」連結されている。核酸配列が機能的なペプチドまたはタンパク質に翻訳される場合、コード配列に機能的に連結された発現制御配列の誘導は、コード配列のフレームシフトを引き起こすことなく、またはコード配列が所望のペプチドまたはタンパク質に翻訳されるのを不可能にすることなく、前記コード配列の転写をもたらす。
「プロモータ」または「プロモータ領域」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼの認識および結合部位を提供することによって、転写物、例えばコード配列を含む転写物の合成を制御する核酸配列を指す。プロモータ領域は、前記遺伝子の転写の調節に関与するさらなる因子のためのさらなる認識または結合部位を含み得る。プロモータは、原核生物または真核生物遺伝子の転写を制御し得る。プロモータは「誘導性」であり得、誘導因子に応答して転写を開始し得るか、または転写が誘導因子によって制御されない場合は「構成的」であり得る。誘導因子が存在しない場合、誘導性プロモータはごくわずかしか発現されないかまたは全く発現されない。誘導因子の存在下では、遺伝子の「スイッチが入る」か、または転写のレベルが増加する。これは通常、特定の転写因子の結合によって媒介される。本発明による特定のプロモータは、本明細書に記載されるように、例えばアルファウイルスのサブゲノムプロモータである。他の特定のプロモータは、例えばアルファウイルスのゲノムプラス鎖またはマイナス鎖プロモータである。
「コアプロモータ」という用語は、プロモータに含まれる核酸配列を指す。コアプロモータは、典型的には転写を適切に開始するのに必要なプロモータの最小部分である。コアプロモータは、典型的には転写開始部位とＲＮＡポリメラーゼの結合部位とを含む。
「ポリメラーゼ」は、一般に、モノマー構築ブロックからのポリマー分子の合成を触媒することができる分子実体を指す。「ＲＮＡポリメラーゼ」は、リボヌクレオチド構築ブロックからのＲＮＡ分子の合成を触媒することができる分子実体である。「ＤＮＡポリメラーゼ」は、デオキシリボヌクレオチド構築ブロックからのＤＮＡ分子の合成を触媒することができる分子実体である。ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼの場合、分子実体は、典型的にはタンパク質または複数のタンパク質の集合体もしくは複合体である。典型的には、ＤＮＡポリメラーゼは、典型的にはＤＮＡ分子である鋳型核酸に基づいてＤＮＡ分子を合成する。典型的には、ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ分子であるか（その場合、ＲＮＡポリメラーゼはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＤｄＲＰである）、またはＲＮＡ分子である（その場合、ＲＮＡポリメラーゼはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲｄＲＰである）、鋳型核酸に基づいてＲＮＡ分子を合成する。
「ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」または「ＲｄＲＰ」は、ＲＮＡ鋳型からのＲＮＡの転写を触媒する酵素である。アルファウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの場合、ゲノムＲＮＡの（－）鎖相補体と（＋）鎖のゲノムＲＮＡの連続合成によってＲＮＡ複製がもたらされる。したがって、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、同義的に「ＲＮＡレプリカーゼ」と称される。自然界では、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、典型的にはレトロウイルスを除く全てのＲＮＡウイルスによってコードされている。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードするウイルスの典型的な代表例はアルファウイルスである。
本発明によれば、「ＲＮＡ複製」は、一般に、所与のＲＮＡ分子（鋳型ＲＮＡ分子）のヌクレオチド配列に基づいて合成されたＲＮＡ分子を指す。合成されるＲＮＡ分子は、例えば鋳型ＲＮＡ分子と同一または相補的であり得る。一般に、ＲＮＡ複製は、ＤＮＡ中間体の合成を介して起こり得るか、またはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）によって媒介されるＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製によって直接起こり得る。アルファウイルスの場合、ＲＮＡ複製はＤＮＡ中間体を介して起こるのではなく、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）によって媒介される：鋳型ＲＮＡ鎖（第１のＲＮＡ鎖）－またはその一部－が、第１のＲＮＡ鎖またはその一部に相補的な第２のＲＮＡ鎖を合成するための鋳型として働く。第２のＲＮＡ鎖－またはその一部－は、今度は、場合により第２のＲＮＡ鎖またはその一部に相補的な第３のＲＮＡ鎖を合成するための鋳型として働く。それにより、第３のＲＮＡ鎖は、第１のＲＮＡ鎖またはその一部と同一である。したがって、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型の相補的ＲＮＡ鎖を直接合成することができ、（相補的中間体鎖を介して）同一のＲＮＡ鎖を間接的に合成することができる。
本発明によれば、「鋳型ＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって転写または複製され得るＲＮＡを指す。
本発明によれば、「遺伝子」という用語は、１つ以上の細胞産物の産生および／または１つ以上の細胞間もしくは細胞内機能の達成に関与する特定の核酸配列を指す。より具体的には、前記用語は、特定のタンパク質または機能もしくは構造ＲＮＡ分子をコードする核酸を含む核酸セクション（典型的にはＤＮＡ；ただしＲＮＡウイルスの場合はＲＮＡ）に関する。
本明細書で使用される「単離された分子」は、他の細胞物質などの他の分子を実質的に含まない分子を指すことが意図されている。「単離された核酸」という用語は、本発明によれば、核酸が、（ｉ）例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってインビトロで増幅された、（ｉｉ）クローニングによって組換え生産された、（ｉｉｉ）例えば切断およびゲル電気泳動分画によって精製された、または（ｉｖ）例えば化学合成によって合成されたことを意味する。単離された核酸は、組換え技術による操作に利用可能な核酸である。
「ベクター」という用語は、本明細書ではその最も一般的な意味で使用され、例えば核酸を原核生物および／または真核生物宿主細胞に導入し、適切な場合にはゲノムに組み込むことを可能にする、前記核酸のための任意の中間ビヒクルを含む。そのようなベクターは、好ましくは細胞内で複製および／または発現される。ベクターは、プラスミド、ファージミド、ウイルスゲノム、およびそれらの画分を含む。
本発明の文脈における「組換え」という用語は、「遺伝子操作を介して作製された」ことを意味する。好ましくは、本発明の文脈における組換え細胞などの「組換え物体」は、天然には存在しない。
本明細書で使用される「天然に存在する」という用語は、物体が自然界で見出され得るという事実を指す。例えば、生物（ウイルスを含む）中に存在し、自然界の供給源から単離することができ、実験室で人によって意図的に改変されていないペプチドまたは核酸は、天然に存在する。「自然界で見出される」という用語は、「自然界に存在する」ことを意味し、公知の物体ならびに自然からまだ発見および／または単離されていないが、天然源から将来発見および／または単離される可能性がある物体を含む。
本発明によれば、「発現」という用語は、その最も一般的な意味で使用され、ＲＮＡおよび／またはタンパク質の産生を含む。この用語はまた、核酸の部分的発現も含む。さらに、発現は一過性または安定であり得る。ＲＮＡに関して、「発現」または「翻訳」という用語は、コードＲＮＡ（例えばメッセンジャＲＮＡ）の鎖が、ペプチドまたはタンパク質を生成するようにアミノ酸の配列のアセンブリを指示する、細胞のリボソームにおけるプロセスに関する。
本発明によれば、「ｍＲＮＡ」という用語は「メッセンジャＲＮＡ」を意味し、典型的にはＤＮＡ鋳型を使用することによって生成され、ペプチドまたはタンパク質をコードする転写物に関する。典型的には、ｍＲＮＡは、５'－ＵＴＲ、タンパク質コード領域、３'－ＵＴＲおよびポリ（Ａ）配列を含む。ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によって生成され得る。インビトロ転写の方法は当業者に公知である。例えば、様々なインビトロ転写キットが市販されている。本発明によれば、ｍＲＮＡは、安定化修飾およびキャッピングによって修飾され得る。
本発明によれば、「ポリ（Ａ）配列」または「ポリ（Ａ）尾部」という用語は、典型的にはＲＮＡ分子の３'末端に位置するアデニル酸残基の連続的または断続的な配列を指す。連続的な配列は、連続するアデニル酸残基を特徴とする。自然界では、連続的なポリ（Ａ）配列が典型的である。ポリ（Ａ）配列は通常真核生物のＤＮＡにはコードされていないが、細胞核での真核生物の転写中に、転写後の鋳型非依存性ＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡの遊離３'末端に結合するが、本発明は、ＤＮＡによってコードされるポリ（Ａ）配列を包含する。
本発明によれば、核酸分子に関して「一次構造」という用語は、ヌクレオチドモノマーの直鎖状配列を指す。
本発明によれば、核酸分子に関して「二次構造」という用語は、塩基対合、例えば一本鎖ＲＮＡ分子の場合、特に分子内塩基対合を反映する核酸分子の二次元表示を指す。各ＲＮＡ分子は単一のポリヌクレオチド鎖のみを有するが、分子は、典型的には（分子内）塩基対の領域を特徴とする。本発明によれば、「二次構造」という用語は、塩基対、ステム、ステムループ、バルジ、内部ループおよび多分岐ループなどのループを含むがこれらに限定されない構造モチーフを含む。核酸分子の二次構造は、塩基対合を示す二次元図面（平面グラフ）によって表すことができる（ＲＮＡ分子の二次構造の詳細については、Ａｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｒａｐｈ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ Ａｐｐｌ．，２００６，ｖｏｌ．１０，ｐｐ．３２９－３５１参照）。本明細書に記載されるように、特定のＲＮＡ分子の二次構造は本発明の文脈に関連する。
本発明によれば、核酸分子、特に一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造は、ＲＮＡ二次構造予測のためのウェブサーバ（ｈｔｔｐ：／／ｒｎａ．ｕｒｍｃ．ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ．ｅｄｕ／ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅＷｅｂ／Ｓｅｒｖｅｒｓ／Ｐｒｅｄｉｃｔ１／Ｐｒｅｄｉｃｔ１．ｈｔｍｌ）を使用した予測によって決定される。好ましくは、本発明によれば、核酸分子に関して「二次構造」は、具体的には前記予測によって決定される二次構造を指す。予測はまた、ＭＦＯＬＤ構造予測（ｈｔｔｐ：／／ｕｎａｆｏｌｄ．ｒｎａ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕ／？ｑ＝ｍｆｏｌｄ）を使用して実行または確認してもよい。
本発明によれば、「塩基対」は、２つのヌクレオチド塩基が塩基上のドナー部位とアクセプタ部位との間の水素結合を介して互いに会合する二次構造の構造モチーフである。相補的な塩基であるＡ：ＵおよびＧ：Ｃは、塩基上のドナー部位とアクセプタ部位との間の水素結合を介して安定な塩基対を形成する；Ａ：ＵおよびＧ：Ｃ塩基対はワトソン－クリック塩基対と呼ばれる。より弱い塩基対（ウォブル塩基対と呼ばれる）は、塩基ＧとＵ（Ｇ：Ｕ）によって形成される。塩基対Ａ：ＵおよびＧ：Ｃは、正準塩基対と呼ばれる。Ｇ：Ｕ（ＲＮＡではかなり頻繁に存在する）および他のまれな塩基対（例えばＡ：Ｃ；Ｕ：Ｕ）のような他の塩基対は、非正準塩基対と呼ばれる。
本発明によれば、「ヌクレオチド対合」は、２つのヌクレオチドの塩基が塩基対（正準または非正準塩基対、好ましくは正準塩基対、最も好ましくはワトソン－クリック塩基対）を形成するように互いに会合する、２つのヌクレオチドを指す。
本発明によれば、核酸分子に関して「ステムループ」または「ヘアピン」または「ヘアピンループ」という用語は、全て互換的に、核酸分子、典型的には一本鎖ＲＮＡなどの一本鎖核酸分子の特定の二次構造を指す。ステムループで表される特定の二次構造は、ステムおよびヘアピンループとも呼ばれる（末端）ループを含む連続する核酸配列からなり、ステムは、ステム－ループ構造のループを形成する短い配列（例えば３～１０ヌクレオチド）によって分離された２つの隣接する完全にまたは部分的に相補的な配列エレメントによって形成される。２つの隣接する完全にまたは部分的に相補的な配列は、例えばステムループエレメントのステム１およびステム２として定義され得る。ステムループは、これらの２つの隣接する完全にまたは部分的に逆相補的な配列、例えばステムループエレメントのステム１とステム２が互いに塩基対を形成する場合に形成され、ステムループエレメントのステム１とステム２の間に位置する短い配列によって形成されるその末端に不対ループを含む二本鎖核酸配列をもたらす。したがって、ステムループは２つのステム（ステム１およびステム２）を含み、これらは、－核酸分子の二次構造のレベルでは－互いに塩基対を形成し、および－核酸分子の一次構造のレベルでは－ステム１またはステム２の一部ではない短い配列によって分離されている。説明すると、ステムループの二次元表示はロリポップ形状の構造に類似する。ステムループ構造の形成は、それ自体が折りたたまれて対合した二本鎖を形成することができる配列の存在を必要とする；対合した二本鎖はステム１とステム２によって形成される。対合したステムループエレメントの安定性は、典型的には、長さ、ステム２のヌクレオチドと塩基対（好ましくは正準塩基対、より好ましくはワトソン－クリック塩基対）を形成することができるステム１のヌクレオチドの数と、ステム２のヌクレオチドとそのような塩基対を形成することができないステム１のヌクレオチド（ミスマッチまたはバルジ）の数とによって決定される。本発明によれば、最適なループ長は３～１０ヌクレオチド、より好ましくは４～７，ヌクレオチド、例えば４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチドまたは７ヌクレオチドである。所与の核酸配列がステムループを特徴とする場合、それぞれの相補的な核酸配列も、典型的にはステムループを特徴とする。ステムループは、典型的には一本鎖ＲＮＡ分子によって形成される。例えば、アルファウイルスゲノムＲＮＡの５'複製認識配列には、いくつかのステムループが存在する。
本発明によれば、核酸分子の特定の二次構造（例えばステムループ）に関して「破壊」または「破壊する」とは、特定の二次構造が存在しないかまたは改変されていることを意味する。典型的には、二次構造は、二次構造の一部である少なくとも１つのヌクレオチドの変化の結果として破壊され得る。例えば、ステムループは、ステムを形成する１つ以上のヌクレオチドの変化によって破壊され得、その結果、ヌクレオチドの対合は不可能である。
本発明によれば、「二次構造破壊を補償する」または「二次構造破壊の補償」とは、核酸配列の１つ以上のヌクレオチド変化を指す；より典型的には、以下を特徴とする、１つ以上の第１のヌクレオチド変化も含む核酸配列における１つ以上の第２のヌクレオチド変化を指す：１つ以上の第１のヌクレオチド変化は、１つ以上の第２のヌクレオチド変化が存在しない場合、核酸配列の二次構造の破壊を引き起こすが、１つ以上の第１のヌクレオチド変化と１つ以上の第２のヌクレオチド変化の共起は、核酸の二次構造の破壊を引き起こさない。共起とは、１つ以上の第１のヌクレオチド変化と１つ以上の第２のヌクレオチド変化の両方の存在を意味する。典型的には、１つ以上の第１のヌクレオチド変化と１つ以上の第２のヌクレオチド変化は、同じ核酸分子内に一緒に存在する。特定の実施形態では、二次構造破壊を補償する１つ以上のヌクレオチド変化は、１つ以上のヌクレオチド対合破壊を補償する１つ以上のヌクレオチド変化である。したがって、一実施形態では、「二次構造破壊の補償」とは、「ヌクレオチド対合破壊の補償」、すなわち１つ以上のヌクレオチド対合破壊、例えば１つ以上のステムループ内の１つ以上のヌクレオチド対合破壊の補償を意味する。１つ以上のヌクレオチド対合破壊は、少なくとも１つの開始コドンの除去によって導入された可能性がある。二次構造破壊を補償する１つ以上のヌクレオチド変化の各々は、１つ以上のヌクレオチドの欠失、付加、置換および／または挿入からそれぞれ独立して選択され得るヌクレオチド変化である。例示的な例では、ヌクレオチド対合Ａ：ＵがＡからＣへの置換によって破壊された場合（ＣおよびＵは、典型的にはヌクレオチド対を形成するのに適さない）、ヌクレオチド対合破壊を補償するヌクレオチド変化は、ＧによるＵの置換であり得、それによってＣ：Ｇヌクレオチド対合の形成が可能になる。したがって、ＧによるＵの置換は、ヌクレオチド対合破壊を補償する。代替的な例では、ヌクレオチド対合Ａ：ＵがＡからＣへの置換によって破壊された場合、ヌクレオチド対合破壊を補償するヌクレオチド変化は、ＡによるＣの置換であり得、それによって元のＡ：Ｕヌクレオチド対合の形成が回復される。一般に、本発明では、元の核酸配列を回復せず、新規のＡＵＧトリプレットも創出しない、二次構造破壊を補償するヌクレオチド変化が好ましい。上記の一連の例では、ＵからＧへの置換がＣからＡへの置換よりも好ましい。
本発明によれば、核酸分子に関して「三次構造」という用語は、原子座標によって定義される核酸分子の三次元構造を指す。
本発明によれば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡなどの核酸は、ペプチドまたはタンパク質をコードし得る。したがって、転写可能な核酸配列またはその転写物は、ペプチドまたはタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み得る。
本発明によれば、「ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸」という用語は、核酸が、適切な環境、好ましくは細胞内に存在する場合、翻訳プロセス中にペプチドまたはタンパク質を産生するようにアミノ酸のアセンブリを指示することができることを意味する。好ましくは、本発明によるコードＲＮＡは、コードＲＮＡの翻訳を可能にする細胞翻訳機構と相互作用して、ペプチドまたはタンパク質を生成することができる。
本発明によれば、「ペプチド」という用語は、オリゴペプチドおよびポリペプチドを含み、ペプチド結合を介して互いに連結された２個以上、好ましくは３個以上、好ましくは４個以上、好ましくは６個以上、好ましくは８個以上、好ましくは１０個以上、好ましくは１３個以上、好ましくは１６個以上、好ましくは２０個以上、および最大で好ましくは５０個、好ましくは１００個または好ましくは１５０個までの連続するアミノ酸を含む物質を指す。「タンパク質」という用語は、大きなペプチド、好ましくは少なくとも１５１個のアミノ酸を有するペプチドを指すが、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では通常同義語として使用される。
「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本発明によれば、アミノ酸成分だけでなく、糖およびリン酸構造体などの非アミノ酸成分も含有する物質を含み、エステル、チオエーテルまたはジスルフィド結合などの結合を含有する物質も含む。
本発明によれば、「開始コドン」および「出発コドン」という用語は、同義的に、リボソームによって翻訳される最初のコドンである可能性のあるＲＮＡ分子のコドン（塩基トリプレット）を指す。そのようなコドンは、典型的には真核生物のアミノ酸メチオニンおよび原核生物の修飾メチオニンをコードする。真核生物および原核生物における最も一般的な開始コドンはＡＵＧである。ＡＵＧ以外の開始コドンを意味すると本明細書で特に明記されない限り、ＲＮＡ分子に関して「開始コドン」および「出発コドン」という用語はコドンＡＵＧを指す。本発明によれば、「開始コドン」および「出発コドン」という用語はまた、デオキシリボ核酸の対応する塩基トリプレット、すなわちＲＮＡの開始コドンをコードする塩基トリプレットを指すためにも使用される。メッセンジャＲＮＡの開始コドンがＡＵＧである場合、ＡＵＧをコードする塩基トリプレットはＡＴＧである。本発明によれば、「開始コドン」および「出発コドン」という用語は、好ましくは機能的な開始コドンまたは出発コドン、すなわち翻訳を開始するためにリボソームによってコドンとして使用されるかまたは使用されることになる開始コドンまたは出発コドンを指す。ＲＮＡ分子には、例えばコドンからキャップまでの距離が短いために、翻訳を開始するためにリボソームによってコドンとして使用されないＡＵＧコドンが存在し得る。これらのコドンは、機能的な開始コドンまたは出発コドンという用語には包含されない。
本発明によれば、「オープンリーディングフレームの出発コドン」または「オープンリーディングフレームの開始コドン」という用語は、コード配列、例えば自然界で見出される核酸分子のコード配列におけるタンパク質合成の開始コドンとして働く塩基トリプレットを指す。ＲＮＡ分子では、オープンリーディングフレームの開始コドンの前に５'非翻訳領域（５'－ＵＴＲ）がしばしば存在するが、これは厳密には必要ではない。
本発明によれば、「オープンリーディングフレームの天然の出発コドン」または「オープンリーディングフレームの天然の開始コドン」という用語は、天然のコード配列におけるタンパク質合成の開始コドンとして働く塩基トリプレットを指す。天然のコード配列は、例えば自然界で見出される核酸分子のコード配列であり得る。いくつかの実施形態では、本発明は、自然界で見出される核酸分子の変異体を提供し、これは、天然の開始コドン（天然のコード配列中に存在する）が除去されている（そのため変異体核酸分子には存在しない）ことを特徴とする。
本発明によれば、「最初のＡＵＧ」は、メッセンジャＲＮＡ分子の最も上流のＡＵＧ塩基トリプレット、好ましくは翻訳を開始するためにリボソームによってコドンとして使用されるかまたは使用されることになるメッセンジャＲＮＡ分子の最も上流のＡＵＧ塩基トリプレットを意味する。したがって、「最初のＡＴＧ」とは、最初のＡＵＧをコードするコードＤＮＡ配列のＡＴＧ塩基トリプレットを指す。いくつかの場合には、ｍＲＮＡ分子の最初のＡＵＧは、オープンリーディングフレームの開始コドン、すなわちリボソームタンパク質合成中に開始コドンとして使用されるコドンである。
本発明によれば、核酸変異体の特定のエレメントに関して「除去を含む」または「除去を特徴とする」という用語および同様の用語は、参照核酸分子と比較して、前記特定のエレメントが核酸変異体において機能しないかまたは存在しないことを意味する。限定されることなく、除去は、特定のエレメントの前部もしくは一部の欠失、特定のエレメントの前部もしくは一部の置換、または特定のエレメントの機能的もしくは構造的特性の改変で構成され得る。核酸配列の機能的エレメントの除去は、除去を含む核酸変異体の位置で機能が発揮されないことを必要とする。例えば、特定の開始コドンの除去を特徴とするＲＮＡ変異体は、リボソームタンパク質合成が除去を特徴とするＲＮＡ変異体の位置で開始されないことを必要とする。核酸配列の構造エレメントの除去は、構造エレメントが除去を含む核酸変異体の位置に存在しないことを必要とする。例えば、特定のＡＵＧ塩基トリプレット、すなわち特定の位置のＡＵＧ塩基トリプレットの除去を特徴とするＲＮＡ変異体は、例えば、特定のＡＵＧ塩基トリプレット（例えばΔＡＵＧ）の一部もしくは全部の欠失、または特定のＡＵＧ塩基トリプレットの１つ以上のヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｇ）の、１つ以上の異なるヌクレオチドによる置換を特徴とし得、その結果、生じる変異体のヌクレオチド配列は前記ＡＵＧ塩基トリプレットを含まない。１個のヌクレオチドの適切な置換は、ＡＵＧ塩基トリプレットをＧＵＧ、ＣＵＧもしくはＵＵＧ塩基トリプレットに、またはＡＡＧ、ＡＣＧもしくはＡＧＧ塩基トリプレットに、またはＡＵＡ、ＡＵＣもしくはＡＵＵ塩基トリプレットに変換するものである。それに応じて、より多くのヌクレオチドの適切な置換を選択することができる。
本発明によれば、「自己複製ウイルス」という用語は、宿主細胞内で自律的に複製することができるＲＮＡウイルスを含む。自己複製ウイルスは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ゲノムを有し得、アルファウイルス、フラビウイルス、麻疹ウイルス（ＭＶ）およびラブドウイルスを含む。アルファウイルスおよびフラビウイルスは正の極性のゲノムを有するが、麻疹ウイルス（ＭＶ）およびラブドウイルスのゲノムはマイナス鎖ｓｓＲＮＡである。典型的には、自己複製ウイルスは、細胞の感染後に直接翻訳され得る（＋）鎖ＲＮＡゲノムを有するウイルスであり、この翻訳は、感染ＲＮＡからアンチセンス転写物とセンス転写物の両方を産生するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを提供する。以下では、自己複製ウイルス由来ベクターの例としてアルファウイルス由来のベクターを参照することによって本発明を説明する。しかし、本発明はアルファウイルス由来のベクターに限定されないことが理解されるべきである。
本発明によれば、「アルファウイルス」という用語は広く理解されるべきであり、アルファウイルスの特徴を有する任意のウイルス粒子を含む。アルファウイルスの特徴には、ＲＮＡポリメラーゼ活性を含む、宿主細胞における複製に適した遺伝情報をコードする（＋）鎖ＲＮＡの存在が含まれる。多くのアルファウイルスのさらなる特徴は、例えばＳｔｒａｕｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．４９１－５６２に記載されている。「アルファウイルス」という用語は、自然界で見出されるアルファウイルス、およびその任意の変異体または誘導体を含む。いくつかの実施形態では、変異体または誘導体は自然界では見出されない。
一実施形態では、アルファウイルスは、自然界で見出されるアルファウイルスである。典型的には、自然界で見出されるアルファウイルスは、動物（ヒトなどの脊椎動物、および昆虫などの節足動物を含む）などの１つ以上の真核生物に対して感染性である。
自然界で見出されるアルファウイルスは、好ましくは以下からなる群より選択される：バーマフォレストウイルス複合体（バーマフォレストウイルスを含む）；東部ウマ脳炎複合体（７つの抗原型の東部ウマ脳炎ウイルスを含む）；ミデルブルグウイルス複合体（ミデルブルグウイルスを含む）；ヌドゥムウイルス複合体（ヌドゥムウイルスを含む）；セムリキ森林ウイルス複合体（ベバルウイルス、チクングニアウイルス、マヤロウイルスおよびそのサブタイプであるウナウイルス、オニョンニョンウイルスおよびそのサブタイプであるイグボオラウイルス、ロスリバーウイルスおよびそのサブタイプであるベバルウイルス、ゲタウイルス、サギヤマウイルス、セムリキ森林ウイルスおよびそのサブタイプであるメトリウイルスを含む）；ベネズエラウマ脳炎複合体（カバソウウイルス、エバーグレーズウイルス、モッソダスペドラスウイルス、ムカンボウイルス、パラマナウイルス、ピクスナウイルス、リオネグロウイルス、トロカラウイルスおよびそのサブタイプであるビジューブリッジウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含む）；西部ウマ脳炎複合体（アウラウイルス、ババンキーウイルス、キジラガッチェウイルス、シンドビスウイルス、オケルボウイルス、ワタロアウイルス、バギークリークウイルス、フォートモーガンウイルス、ハイランドＪウイルス、西部ウマ脳炎ウイルスを含む）；ならびにサケ膵臓病ウイルスを含むいくつかの未分類ウイルス；睡眠病ウイルス；ミナミゾウアザラシウイルス、トナテウイルス。より好ましくは、アルファウイルスは、セムリキ森林ウイルス複合体（セムリキ森林ウイルスを含む、上記に示したウイルス型を含む）、西部ウマ脳炎複合体（シンドビスウイルスを含む、上記に示したウイルス型を含む）、東部ウマ脳炎ウイルス（上記に示したウイルス型を含む）、ベネズエラウマ脳炎複合体（ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含む、上記に示したウイルス型を含む）からなる群より選択される。
さらなる好ましい実施形態では、アルファウイルスはセムリキ森林ウイルスである。代替的なさらなる好ましい実施形態では、アルファウイルスはシンドビスウイルスである。代替的なさらなる好ましい実施形態では、アルファウイルスはベネズエラウマ脳炎ウイルスである。
本発明のいくつかの実施形態では、アルファウイルスは、自然界で見出されるアルファウイルスではない。典型的には、自然界では見出されないアルファウイルスは、ヌクレオチド配列、すなわちゲノムＲＮＡの少なくとも１つの変異によって自然界で見出されるアルファウイルスとは区別される、自然界で見出されるアルファウイルスの変異体または誘導体である。ヌクレオチド配列の変異は、自然界で見出されるアルファウイルスと比較して、１つ以上のヌクレオチドの挿入、置換または欠失から選択され得る。ヌクレオチド配列の変異は、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはタンパク質における変異と関連していてもよく、または関連していなくてもよい。例えば、自然界では見出されないアルファウイルスは、弱毒化アルファウイルスであり得る。自然界では見出されない弱毒化アルファウイルスは、典型的にはそのヌクレオチド配列中に少なくとも１つの変異を有し、それによって自然界で見出されるアルファウイルスと区別され、および全く感染性ではないか、または感染性ではあるが疾患を引き起こす能力がより低いもしくは疾患を引き起こす能力を全く有さないアルファウイルスである。例示的な例として、ＴＣ８３は、自然界で見出されるベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）とは区別される弱毒化アルファウイルスである（ＭｃＫｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９６３，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．，１９６３，ｖｏｌ．１２；ｐｐ．５９７－６０３）。
アルファウイルス属のメンバーはまた、ヒトにおけるそれらの相対的な臨床的特徴に基づいて、主に脳炎に関連するアルファウイルスと、主に発熱、発疹、および多発性関節炎に関連するアルファウイルスとに分類され得る。
「アルファウイルス性」という用語は、アルファウイルスにおいて見出されるか、またはアルファウイルスを起源とするか、または例えば遺伝子工学によってアルファウイルスから誘導されることを意味する。
本発明によれば、「ＳＦＶ」はセムリキ森林ウイルスを表す。本発明によれば、「ＳＩＮ」または「ＳＩＮＶ」はシンドビスウイルスを表す。本発明によれば、「ＶＥＥ」または「ＶＥＥＶ」はベネズエラウマ脳炎ウイルスを表す。
本発明によれば、「アルファウイルスの」という用語は、アルファウイルスを起源とする実体を指す。説明すると、アルファウイルスのタンパク質は、アルファウイルスに見出されるタンパク質および／またはアルファウイルスによってコードされるタンパク質を指し得、アルファウイルスの核酸配列は、アルファウイルスに見出される核酸配列および／またはアルファウイルスによってコードされる核酸配列を指し得る。好ましくは、「アルファウイルスの」核酸配列は、「アルファウイルスのゲノムの」および／または「アルファウイルスのゲノムＲＮＡの」核酸配列を指す。
本発明によれば、「アルファウイルスＲＮＡ」という用語は、アルファウイルスゲノムＲＮＡ（すなわち（＋）鎖）、アルファウイルスゲノムＲＮＡの相補体（すなわち（－）鎖）、およびサブゲノム転写物（すなわち（＋）鎖）のいずれか１つ以上、またはそのいずれかの断片を指す。
本発明によれば、「アルファウイルスゲノム」は、アルファウイルスのゲノム（＋）鎖ＲＮＡを指す。
本発明によれば、「天然のアルファウイルス配列」という用語および同様の用語は、典型的には、天然に存在するアルファウイルス（自然界で見出されるアルファウイルス）の（例えば核酸）配列を指す。いくつかの実施形態では、「天然のアルファウイルス配列」という用語は、弱毒化アルファウイルスの配列も含む。
本発明によれば、「５'複製認識配列」という用語は、好ましくは、アルファウイルスゲノムなどの自己複製ウイルスのゲノムの５'断片と同一または相同である連続する核酸配列、好ましくはリボ核酸配列を指す。「５'複製認識配列」は、アルファウイルスレプリカーゼなどのレプリカーゼによって認識され得る核酸配列である。５'複製認識配列という用語は、天然の５'複製認識配列ならびにその機能的等価物、例えば自然界で見出される自己複製ウイルス、例えば自然界で見出されるアルファウイルスの５'複製認識配列の機能的変異体を含む。本発明によれば、機能的等価物は、本明細書に記載の少なくとも１つの開始コドンの除去を特徴とする５'複製認識配列の誘導体を含む。５'複製認識配列は、アルファウイルスゲノムＲＮＡの（－）鎖相補体の合成に必要であり、（－）鎖鋳型に基づく（＋）鎖ウイルスゲノムＲＮＡの合成に必要である。天然の５'複製認識配列は、典型的には少なくともｎｓＰ１のＮ末端断片をコードするが、ｎｓＰ１２３４をコードするオープンリーディングフレーム全体は含まない。天然の５'複製認識配列が、典型的には少なくともｎｓＰ１のＮ末端断片をコードするという事実を考慮すると、天然の５'複製認識配列は、典型的には少なくとも１つの開始コドン、典型的にはＡＵＧを含む。一実施形態では、５'複製認識配列は、アルファウイルスゲノムの保存された配列エレメント１（ＣＳＥ １）またはその変異体およびアルファウイルスゲノムの保存された配列エレメント２（ＣＳＥ ２）またはその変異体を含む。５'複製認識配列は、典型的には４つのステムループ（ＳＬ）、すなわちＳＬ１、ＳＬ２、ＳＬ３、ＳＬ４を形成することができる。これらのステムループの番号付けは、５'複製認識配列の５'末端から始まる。
「保存された配列エレメント」または「ＣＳＥ」という用語は、アルファウイルスＲＮＡに見出されるヌクレオチド配列を指す。これらの配列エレメントは、オルソログが異なるアルファウイルスのゲノムに存在し、異なるアルファウイルスのオルソログＣＳＥが、好ましくは高い割合の配列同一性および／または類似の二次もしくは三次構造を共有するため、「保存された」と称される。ＣＳＥという用語は、ＣＳＥ １、ＣＳＥ ２、ＣＳＥ ３およびＣＳＥ ４を含む。
本発明によれば、「ＣＳＥ １」または「４４－ｎｔ ＣＳＥ」という用語は、同義的に、（－）鎖鋳型からの（＋）鎖合成に必要なヌクレオチド配列を指す。「ＣＳＥ １」という用語は、（＋）鎖上の配列を指し、（（－）鎖上の）ＣＳＥ １の相補的配列は（＋）鎖合成のためのプロモータとして機能する。好ましくは、ＣＳＥ １という用語は、アルファウイルスゲノムの最も５'側のヌクレオチドを含む。ＣＳＥ １は、典型的には保存されたステムループ構造を形成する。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、ＣＳＥ １の場合、二次構造は、一次構造、すなわち直鎖状配列よりも重要であると考えられている。モデルアルファウイルスであるシンドビスウイルスのゲノムＲＮＡでは、ＣＳＥ １は、ゲノムＲＮＡの最も５'側の４４個のヌクレオチドによって形成される、４４個のヌクレオチドの連続する配列からなる（Ｓｔｒａｕｓｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．４９１－５６２）。
本発明によれば、「ＣＳＥ ２」または「５１－ｎｔ ＣＳＥ」という用語は、同義的に、（＋）鎖鋳型からの（－）鎖合成に必要なヌクレオチド配列を指す。（＋）鎖鋳型は、典型的にはアルファウイルスゲノムＲＮＡまたはＲＮＡレプリコンである（ＣＳＥ ２を含まないサブゲノムＲＮＡ転写物は（－）鎖合成のための鋳型として機能しないことに留意されたい）。アルファウイルスのゲノムＲＮＡでは、ＣＳＥ ２は、典型的にはｎｓＰ１のコード配列内に局在する。モデルアルファウイルスであるシンドビスウイルスのゲノムＲＮＡでは、５１－ｎｔ ＣＳＥはゲノムＲＮＡのヌクレオチド位置１５５～２０５に位置する（Ｆｒｏｌｏｖ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＲＮＡ，ｖｏｌ．７，ｐｐ．１６３８－１６５１）。ＣＳＥ ２は、典型的には２つの保存されたステムループ構造を形成する。これらのステムループ構造は、アルファウイルスゲノムＲＮＡの５'末端から数えて、それぞれアルファウイルスゲノムＲＮＡの３番目と４番目の保存されたステムループであるため、ステムループ３（ＳＬ３）およびステムループ４（ＳＬ４）と呼称される。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、ＣＳＥ ２の場合、二次構造は、一次構造、すなわち直鎖状配列よりも重要であると考えられている。
本発明によれば、「ＣＳＥ ３」または「接合配列」という用語は、同義的に、アルファウイルスゲノムＲＮＡに由来し、サブゲノムＲＮＡの開始部位を含むヌクレオチド配列を指す。（－）鎖におけるこの配列の相補体は、サブゲノムＲＮＡ転写を促進するように作用する。アルファウイルスゲノムＲＮＡでは、ＣＳＥ ３は、典型的にはｎｓＰ４のＣ末端断片をコードする領域と重複し、構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの上流に位置する短い非コード領域にまで及ぶ。
本発明によれば、「ＣＳＥ ４」または「１９－ｎｔの保存された配列」または「１９－ｎｔ ＣＳＥ」という用語は、同義的に、アルファウイルスゲノムの３'非翻訳領域のポリ（Ａ）配列のすぐ上流の、アルファウイルスゲノムＲＮＡからのヌクレオチド配列を指す。ＣＳＥ ４は、典型的には１９個の連続するヌクレオチドからなる。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、ＣＳＥ ４は、（－）鎖合成の開始のためのコアプロモータとして機能すると理解されており（Ｊｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００９，ｖｏｌ．４，ｐｐ．８３７－８５６）、および／またはアルファウイルスゲノムＲＮＡのＣＳＥ ４およびポリ（Ａ）尾部は、効率的な（－）鎖合成のために一緒に機能すると理解されている（Ｈａｒｄｙ＆Ｒｉｃｅ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００５，ｖｏｌ．７９，ｐｐ．４６３０－４６３９）。
本発明によれば、「サブゲノムプロモータ」または「ＳＧＰ」という用語は、核酸配列（例えばコード配列）の上流（５'側）の核酸配列であって、ＲＮＡポリメラーゼ、典型的にはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、特に機能性アルファウイルス非構造タンパク質の認識および結合部位を提供することによって前記核酸配列の転写を制御する核酸配列を指す。ＳＧＰは、さらなる因子のためのさらなる認識または結合部位を含み得る。サブゲノムプロモータは、典型的にはアルファウイルスなどのプラス鎖ＲＮＡウイルスの遺伝要素である。アルファウイルスのサブゲノムプロモータは、ウイルスゲノムＲＮＡに含まれる核酸配列である。サブゲノムプロモータは、一般に、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、例えば機能性アルファウイルス非構造タンパク質の存在下で転写の開始（ＲＮＡ合成）を可能にすることを特徴とする。ＲＮＡ（－）鎖、すなわちアルファウイルスゲノムＲＮＡの相補体は、（＋）鎖サブゲノム転写物の合成のための鋳型として働き、（＋）鎖サブゲノム転写物の合成は、典型的にはサブゲノムプロモータにおいてまたはその付近で開始される。本明細書で使用される「サブゲノムプロモータ」という用語は、そのようなサブゲノムプロモータを含む核酸内の特定の局在化に限定されない。一部の実施形態では、ＳＧＰは、ＣＳＥ ３と同一であるか、ＣＳＥ ３と重複するか、またはＣＳＥ ３を含む。
「サブゲノム転写物」または「サブゲノムＲＮＡ」という用語は、同義的に、ＲＮＡ分子を鋳型（「鋳型ＲＮＡ」）として使用した転写の結果として得られるＲＮＡ分子を指し、鋳型ＲＮＡは、サブゲノム転写物の転写を制御するサブゲノムプロモータを含む。サブゲノム転写物は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、特に機能性アルファウイルス非構造タンパク質の存在下で得ることができる。例えば、「サブゲノム転写物」という用語は、アルファウイルスゲノムＲＮＡの（－）鎖相補体を鋳型として使用して、アルファウイルスに感染した細胞で調製されるＲＮＡ転写物を指し得る。しかし、本明細書で使用される「サブゲノム転写物」という用語はそれに限定されず、異種ＲＮＡを鋳型として使用することによって得られる転写物も含む。例えば、サブゲノム転写物はまた、本発明によるＳＧＰ含有レプリコンの（－）鎖相補体を鋳型として使用することによっても得ることができる。したがって、「サブゲノム転写物」という用語は、アルファウイルスゲノムＲＮＡの断片を転写することによって得られるＲＮＡ分子、ならびに本発明によるレプリコンの断片を転写することによって得られるＲＮＡ分子を指し得る。
「自己」という用語は、同じ対象に由来するものを表すために使用される。例えば、「自己細胞」とは、同じ対象に由来する細胞を指す。自己細胞の対象への導入は、これらの細胞が、さもなければ拒絶反応をもたらす免疫学的障壁を克服するので、有利である。
「同種異系」という用語は、同じ種の異なる個体に由来するものを表すために使用される。２つ以上の個体は、１つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一でない場合、互いに同種異系であると言われる。
「同系」という用語は、同一の遺伝子型を有する個体または組織、すなわち一卵性双生児もしくは同じ近交系の動物、またはそれらの組織もしくは細胞に由来するものを表すために使用される。
「異種」という用語は、複数の異なる要素からなるものを表すために使用される。一例として、ある個体の細胞を異なる個体に導入することは、異種移植を構成する。異種遺伝子は、対象以外の供給源に由来する遺伝子である。
以下は、本発明の個々の特徴の特定のおよび／または好ましい変形を提供する。本発明はまた、本発明の特徴の２つ以上について記載される特定のおよび／または好ましい変形の２つ以上を組み合わせることによって生成される実施形態を、特に好ましい実施形態として企図する。
ＲＮＡレプリコン
レプリカーゼのオープンリーディングフレームの内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）依存性翻訳
本発明は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）と、自己複製ウイルス由来の機能性非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームとを含むＲＮＡレプリコンであって、ＩＲＥＳが機能性非構造タンパク質の発現を制御する、ＲＮＡレプリコンを提供する。好ましくは、ＲＮＡレプリコンは、機能性非構造タンパク質による複製を可能にする配列エレメントを含む。一実施形態では、自己複製ウイルスはアルファウイルスであり、機能性非構造タンパク質による複製を可能にする配列エレメントはアルファウイルスに由来する。
アルファウイルスレプリカーゼはキャッピング酵素機能を有し、典型的には、ゲノムおよびサブゲノム（＋）鎖ＲＮＡがキャップされる。５'キャップは、ｍＲＮＡを分解から保護し、その後近傍の開始コドンから翻訳を開始することができるリボ核タンパク質複合体をｍＲＮＡ上に形成するために、リボソームサブユニットおよび細胞因子をｍＲＮＡに誘導するように働く。この複雑なプロセスは、文献に広く記載されている（総説については：Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ ２０１０，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ；Ｖｏｌ １０；ｐｐ １１３－１２７）。
キャップ依存性翻訳の非常に精巧で効率的な機構にもかかわらず、細胞は、５'キャップと完全にまたは部分的に独立して翻訳を開始する手段を有する（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ２０１２；Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１１；ｐｐ ５５８－５６６）。それにより、キャップ依存性翻訳の全体的な下方制御をもたらす細胞ストレスの状況では、細胞は、しばしばＩＲＥＳの助けを借りて、選択された遺伝子を依然として選択的に発現し得る。
ウイルスはまた、ウイルス遺伝子の翻訳のための細胞機構を利用するための異なる手段を進化させた。ウイルス感染は、細胞の抗ウイルス応答（インターフェロン応答；ストレス応答）をもたらす細胞によって感知されることが多いので、多くのウイルスはまた、キャップ非依存性翻訳、特にＲＮＡウイルスを利用する。キャップ非依存性翻訳は、ウイルスに、それらの生活環を全うし、感染細胞から放出される機会を与える細胞ストレス応答時のウイルスＲＮＡ翻訳にとっての利点を保証する。
内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）は、翻訳開始コドン、ＡＵＧなどの近傍に開始前複合体を誘引する適切な二次構造を形成するＲＮＡ配列である。４つのクラスのＩＲＥＳは、共通の特徴を共有すると文献に記載されている。原型ＩＲＥＳは、ポリオウイルスＩＲＥＳ（Ｉ型）、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳ（ＩＩ型）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＩＲＥＳ（ＩＩＩ型）およびジシストロウイルスの遺伝子間領域に見出されるＩＲＥＳ（ＩＶ型）である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ２０１２；Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１１；ｐｐ ５５８－５６６；Ｌｏｚａｎｏ ｅｔ ａｌ．２０１８；Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８：１８０１５５）。
Ｉ型～ＩＩＩ型ＩＲＥＳはＡＵＧ開始コドンで翻訳を開始するという共通点を有するが、ＩＶ型ＩＲＥＳは非ＡＵＧコドン（例えばＧＣＵ）で開始する。それにより、Ｉ型～ＩＩＩ型は、ｅＩＦ２／ＧＴＰ（ｅＩＦ２／ＧＴＰ／Ｍｅｔ－ｔＲＮＡｉＭｅｔ）の助けによってメチオニンを送達する開始因子ｔＲＮＡを必要とする。ストレス下でのｅＩＦ２キナーゼの活性化は、ＡＵＧで開始する翻訳を阻害するｅＩＦ２のαサブユニットをリン酸化する。それにより、ＩＶ型ＩＲＥＳによって指示される翻訳は、ｅＩＦ２リン酸化によって阻害されない。
本発明によれば、「内部リボソーム進入部位」、略して「ＩＲＥＳ」という用語は、リボソームをｍＲＮＡの内部領域に動員してキャップ非依存的に翻訳を開始するＲＮＡエレメントに関する。ＩＲＥＳは、一般にＲＮＡウイルスの５'－ＵＴＲに位置する。しかしながら、ジシストロウイルス科（ｄｉｃｉｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ ｆａｍｉｌｙ）由来のウイルスのｍＲＮＡは２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有し、それぞれの翻訳は２つの異なるＩＲＥＳによって指示される。また、いくつかの哺乳動物細胞ｍＲＮＡもＩＲＥＳを有することが示唆されている。これらの細胞ＩＲＥＳエレメントは、ストレス生存および生存に重要な他のプロセスに関与する遺伝子をコードする真核生物ｍＲＮＡに位置すると考えられている。ＩＲＥＳエレメントの位置は、しばしば５'－ＵＴＲにあるが、ｍＲＮＡの他の場所にも存在し得る。
本発明によれば、「内部リボソーム侵入部位」、略して「ＩＲＥＳ」という用語は、ポリオウイルス（ＰＶ）および脳心筋炎ウイルスなどのピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ ｆａｍｉｌｙ）のウイルスならびにヒト免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）および口蹄疫ウイルスを含む病原性ウイルスに存在するＩＲＥＳを含む。これらのウイルスＩＲＥＳは多様な配列を含むが、それらの多くは類似の二次構造を有し、類似の機構を介して翻訳を開始する。さらに、ＩＲＥＳの活性は、ＩＲＥＳトランス作用因子（ＩＴＡＦ）として公知の他の因子からの支援をしばしば必要とする。翻訳開始因子（ＩＦ）およびＩＴＡＦの構造および必要条件に基づいて、ウイルスＩＲＥＳは、本明細書に記載される４つのタイプに分類される。これらのＩＲＥＳタイプのいずれもが、本発明によれば有用であり、ＩＶ型ＩＲＥＳが特に好ましい。
ウイルスＩＲＥＳの２つの群、Ｉ型およびＩＩ型は、４０Ｓ小リボソームサブユニットに直接結合することができない。代わりに、それらは、異なるＩＴＡＦを介して４０Ｓ小リボソームサブユニットを動員し、キャップ依存性翻訳において正準ＩＦ（すなわちｅＩＦ２、ｅＩＦ３、ｅＩＦ４Ａ、ｅＩＦ４Ｂ、およびｅＩＦ４Ｇ）を必要とする。Ｉ型ＩＲＥＳとＩＩ型ＩＲＥＳとの間の主な違いは４０Ｓリボソームスキャニングの必要性であり、ＩＩ型ＩＲＥＳには４０Ｓリボソームスキャニングは不要である。Ｉ型ＩＲＥＳの例としては、ポリオウイルス（ＰＶ）およびライノウイルスに見出されるＩＲＥＳが挙げられる。ＩＩ型ＩＲＥＳの例としては、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）およびタイラーマウス脳脊髄炎ウイルス（ＴＭＥＶ）に見出されるＩＲＥＳが挙げられる。
ＩＩＩ型ＩＲＥＳは、特殊なＲＮＡ構造を有する４０Ｓ小リボソームサブユニットと直接相互作用することができるが、それらの活性は、通常、ｅＩＦ２およびｅＩＦ３ならびに開始因子Ｍｅｔ－ｔＲＮＡｉを含むいくつかのＩＦの支援を必要とする。例としては、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）および豚テスコウイルス（ＰＴＶ）に見出されるＩＲＥＳが挙げられる。
ＩＶ型ウイルスＩＲＥＳは一般に強い活性を有し、さらなるＩＴＡＦまたはｅＩＦ２／Ｍｅｔ－ｔＲＮＡｉ／ＧＴＰ三元複合体さえも必要とせずに非ＡＵＧ開始コドンから翻訳を開始することができる。これらのＩＲＥＳは、４０Ｓ小リボソームサブユニットと直接相互作用するコンパクトな構造に折り畳まれる。例としては、コオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）、チャバネアオカメムシ（ｐｌａｕｔｉａ ｓｔａｌｉ）腸管ウイルス（ＰＳＩＶ）、およびタウラ症候群ウイルス（ＴＳＶ）などのジシストロウイルスに見出されるＩＲＥＳが挙げられる。
本発明によれば、「内部リボソーム進入部位」、略して「ＩＲＥＳ」という用語はまた、細胞ｍＲＮＡに見出されるＩＲＥＳも含み、その多くは、例えばアポトーシス、有糸分裂、低酸素および栄養制限の状態でストレス応答に必要なタンパク質をコードする。細胞ＩＲＥＳは、リボソーム動員の機構に基づいて２つのタイプに大別することができる：Ｉ型ＩＲＥＳは、シスエレメント、例えばＲＮＡ結合モチーフに結合したＩＴＡＦおよびＮ－６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）修飾を介してリボソームと相互作用するが、ＩＩ型ＩＲＥＳは、１８Ｓ ｒＲＮＡと対合してリボソームを動員する短いシスエレメントを含む。
機能性非構造タンパク質
本明細書に記載のＲＮＡレプリコンは、その発現が内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の制御下にある自己複製ウイルス由来の機能性非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。
「非構造タンパク質」という用語は、ウイルスによってコードされるがウイルス粒子の一部ではないタンパク質に関する。この用語は、典型的には、ＲＮＡレプリカーゼまたは他の鋳型指向性ポリメラーゼなどの、ウイルスがそれ自体を複製するために使用する様々な酵素および転写因子を含む。「非構造タンパク質」という用語は、非構造タンパク質の糖鎖修飾（グリコシル化など）および脂質修飾形態を含む、ありとあらゆる同時翻訳または翻訳後修飾形態を含み、好ましくは「アルファウイルス非構造タンパク質」に関する。
いくつかの実施形態では、「アルファウイルス非構造タンパク質」という用語は、アルファウイルス起源の個々の非構造タンパク質（ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）のいずれか１つ以上、またはアルファウイルス起源の複数の非構造タンパク質のポリペプチド配列を含むポリタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、「アルファウイルス非構造タンパク質」は、ｎｓＰ１２３および／またはｎｓＰ４を指す。他の実施形態では、「アルファウイルス非構造タンパク質」は、ｎｓＰ１２３４を指す。一実施形態では、オープンリーディングフレームによってコードされる目的のタンパク質は、単一の、任意で切断可能なポリタンパク質：ｎｓＰ１２３４としてのｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４の全てからなる。一実施形態では、オープンリーディングフレームによってコードされる目的のタンパク質は、単一の、任意で切断可能なポリタンパク質：ｎｓＰ１２３としてのｎｓＰ１、ｎｓＰ２およびｎｓＰ３からなる。その実施形態では、ｎｓＰ４はさらなる目的のタンパク質であり得、さらなるオープンリーディングフレームによってコードされ得る。
いくつかの実施形態では、非構造タンパク質は、例えば宿主細胞において、複合体または会合体を形成することができる。いくつかの実施形態では、「アルファウイルス非構造タンパク質」は、ｎｓＰ１２３（同義的にＰ１２３）とｎｓＰ４の複合体または会合体を指す。一部の実施形態では、「アルファウイルス非構造タンパク質」は、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、およびｎｓＰ３の複合体または会合体を指す。いくつかの実施形態では、「アルファウイルス非構造タンパク質」は、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４の複合体または会合体を指す。いくつかの実施形態では、「アルファウイルス非構造タンパク質」は、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４からなる群より選択されるいずれか１つ以上の複合体または会合体を指す。いくつかの実施形態では、アルファウイルス非構造タンパク質は少なくともｎｓＰ４を含む。
「複合体」または「会合体」という用語は、空間的に近接している２つ以上の同じまたは異なるタンパク質分子を指す。複合体のタンパク質は、好ましくは、互いに直接または間接的に物理的または物理化学的に接触している。複合体または会合体は、複数の異なるタンパク質（ヘテロ多量体）および／または１つの特定のタンパク質の複数のコピー（ホモ多量体）で構成され得る。アルファウイルス非構造タンパク質の文脈において、「複合体または会合体」という用語は、多数の、そのうちの少なくとも１つがアルファウイルス非構造タンパク質である少なくとも２つのタンパク質分子を表す。複合体または会合体は、１つの特定のタンパク質の複数のコピー（ホモ多量体）および／または複数の異なるタンパク質の複数のコピー（ヘテロ多量体）で構成され得る。多量体の文脈において、「多」は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個または１０個超などの、１個より多いことを意味する。
「機能アルファウイルス非構造タンパク質」という用語は、レプリカーゼ機能を有する非構造タンパク質を含む。したがって、「機能性非構造タンパク質」は、アルファウイルスレプリカーゼを含む。「レプリカーゼ機能」は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）、すなわち（＋）鎖ＲＮＡ鋳型に基づいて（－）鎖ＲＮＡの合成を触媒することができる、および／または（－）鎖ＲＮＡ鋳型に基づいて（＋）鎖ＲＮＡの合成を触媒することができる酵素の機能を含む。したがって、「機能性非構造タンパク質」という用語は、（＋）鎖（例えばゲノム）ＲＮＡを鋳型として使用して（－）鎖ＲＮＡを合成するタンパク質もしくは複合体、ゲノムＲＮＡの（－）鎖相補体を鋳型として使用して新しい（＋）鎖ＲＮＡを合成するタンパク質もしくは複合体、および／またはゲノムＲＮＡの（－）鎖相補体の断片を鋳型として使用してサブゲノム転写物を合成するタンパク質もしくは複合体を指すことができる。機能性非構造タンパク質は、１つ以上のさらなる機能、例えばプロテアーゼ（自己切断のため）、ヘリカーゼ、末端アデニリルトランスフェラーゼ（ポリ（Ａ）尾部の付加のため）、メチルトランスフェラーゼおよびグアニリルトランスフェラーゼ（核酸に５'キャップを提供するため）、核局在化部位、トリホスファターゼなどをさらに有し得る（Ｇｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．８７ ｐｐ．１１１－１２４；Ｒｕｐｐ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．９６，ｐｐ．２４８３－５００）。
本発明によれば、「レプリカーゼ」という用語は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含む。本発明によれば、「アルファウイルレプリカーゼ」という用語は、天然に存在するアルファウイルス（自然界で見出されるアルファウイルス）由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、および弱毒化アルファウイルス由来などのアルファウイルスの変異体または誘導体由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含む、「アルファウイルスレプリカーゼ」を含む。
「レプリカーゼ」という用語は、アルファウイルス感染細胞によって発現されるか、またはアルファウイルスレプリカーゼをコードする核酸でトランスフェクトされた細胞によって発現される、アルファウイルスレプリカーゼの全ての変異体、特に翻訳後修飾変異体、立体配座、アイソフォームおよびホモログを含む。さらに、「レプリカーゼ」という用語は、組換え法によって生成された、および生成され得る全ての形態のレプリカーゼを含む。例えば、実験室でのレプリカーゼの検出および／または精製を容易にするタグ、例えばｍｙｃタグ、ＨＡタグまたはオリゴヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含むレプリカーゼは、組換え法によって生成され得る。
任意で、アルファウイルスレプリカーゼは、アルファウイルスの保存された配列エレメント１（ＣＳＥ １）またはその相補的な配列、保存された配列エレメント２（ＣＳＥ ２）またはその相補的な配列、保存された配列エレメント３（ＣＳＥ ３）またはその相補的な配列、保存された配列エレメント４（ＣＳＥ ４）またはその相補的な配列のいずれか１つ以上に結合する能力によってさらに機能的に定義される。好ましくは、レプリカーゼは、ＣＳＥ ２［すなわち（＋）鎖］および／もしくはＣＳＥ ４［すなわち（＋）鎖］に結合することができるか、またはＣＳＥ １の相補体［すなわち（－）鎖］および／もしくはＣＳＥ ３の相補体［すなわち（－）鎖］に結合することができる。
アルファウイルスレプリカーゼの起源は、特定のアルファウイルスに限定されない。好ましい実施形態では、アルファウイルスレプリカーゼは、天然に存在するセムリキ森林ウイルスおよび弱毒化セムリキ森林ウイルスなどのセムリキ森林ウイルスの変異体または誘導体を含む、セムリキ森林ウイルス由来の非構造タンパク質を含む。代替的な好ましい実施形態では、アルファウイルスレプリカーゼは、天然に存在するシンドビスウイルスおよび弱毒シンドビスウイルスなどのシンドビスウイルスの変異体または誘導体を含む、シンドビスウイルス由来の非構造タンパク質を含む。代替的な好ましい実施形態では、アルファウイルスレプリカーゼは、天然に存在するベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）および弱毒化ＶＥＥＶなどのＶＥＥＶの変異体または誘導体を含む、ＶＥＥＶ由来の非構造タンパク質を含む。代替的な好ましい実施形態では、アルファウイルスレプリカーゼは、天然に存在するチクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）および弱毒化ＣＨＩＫＶなどのＣＨＩＫＶの変異体または誘導体を含む、ＣＨＩＫＶ由来の非構造タンパク質を含む。
レプリカーゼはまた、複数のウイルス、例えば複数のアルファウイルス由来の非構造タンパク質を含み得る。したがって、アルファウイルス非構造タンパク質を含み、レプリカーゼ機能を有する異種複合体または会合体も、同様に本発明に含まれる。単に例示目的のために、レプリカーゼは、第１のアルファウイルス由来の１つ以上の非構造タンパク質（例えばｎｓＰ１、ｎｓＰ２）、および第２のアルファウイルス由来の１つ以上の非構造タンパク質（ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）を含み得る。複数の異なるアルファウイルス由来の非構造タンパク質は、別々のオープンリーディングフレームによってコードされ得るか、またはポリタンパク質、例えばｎｓＰ１２３４として単一のオープンリーディングフレームによってコードされ得る。
いくつかの実施形態では、機能性非構造タンパク質は、機能性非構造タンパク質が発現される細胞において膜複製複合体および／または液胞を形成することができる。
機能性非構造タンパク質、すなわちレプリカーゼ機能を有する非構造タンパク質が本発明による核酸分子によってコードされる場合、レプリコンのサブゲノムプロモータは、存在する場合、前記レプリカーゼと適合性であることが好ましい。この文脈において適合性であるとは、レプリカーゼが、サブゲノムプロモータが存在する場合、サブゲノムプロモータを認識できることを意味する。一実施形態では、これは、サブゲノムプロモータが、レプリカーゼが由来するウイルスに天然である、すなわちこれらの配列の天然起源が同じウイルスである場合に達成される。代替的な実施形態では、サブゲノムプロモータは、ウイルスレプリカーゼがサブゲノムプロモータを認識することができる限り、ウイルスレプリカーゼが由来するウイルスに天然ではない。言い換えれば、レプリカーゼはサブゲノムプロモータと適合性である（交差ウイルス適合性）。異なるアルファウイルスに由来するサブゲノムプロモータおよびレプリカーゼに関する交差ウイルス適合性の例は、当技術分野で公知である。交差ウイルス適合性が存在する限り、サブゲノムプロモータとレプリカーゼの任意の組合せが可能である。交差ウイルス適合性は、サブゲノムプロモータからのＲＮＡ合成に適した条件で、試験するレプリカーゼを、試験するサブゲノムプロモータを有するＲＮＡと共にインキュベートすることにより、本発明を実施する当業者によって容易に試験され得る。サブゲノム転写物が生成される場合、サブゲノムプロモータとレプリカーゼは適合性であると決定される。交差ウイルス適合性の様々な例が公知である（Ｓｔｒａｕｓｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．４９１－５６２によって総説されている）。
レプリコンは、好ましくは、機能性非構造タンパク質によって複製され得る。特に、機能性非構造タンパク質をコードするＲＮＡレプリコンは、レプリコンによってコードされる機能性非構造タンパク質によって複製され得る。好ましい実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。一実施形態では、レプリコンは、目的のタンパク質をコードするさらなるオープンリーディングフレームを含む。この実施形態は、本発明による目的のタンパク質を生産するためのいくつかの方法に特に適する。一実施形態では、目的のタンパク質をコードするさらなるオープンリーディングフレームは、５'複製認識配列の下流かつＩＲＥＳの上流（および自己複製ウイルス由来の機能性非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの上流）ならびに／または自己複製ウイルス由来の機能性非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの下流に位置する。５'複製認識配列の下流かつＩＲＥＳの上流（および自己複製ウイルス由来の機能性非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの上流）に位置する目的のタンパク質をコードするさらなるオープンリーディングフレームは、５'複製認識配列によってコードされる配列との融合タンパク質として発現され得る。５'複製認識配列の下流かつＩＲＥＳの上流（および自己複製ウイルス由来の機能性非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの上流）に位置する目的のタンパク質をコードするさらなるオープンリーディングフレームは、サブゲノムプロモータによって制御されてもよく、または制御されなくてもよい。自己複製ウイルス由来の機能性非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの下流に位置する１つ以上の目的のタンパク質をコードする１つ以上のさらなるオープンリーディングフレームは、一般に、（ａ）サブゲノムプロモータによって制御される。
機能性非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、５'複製認識配列と重複しないことが好ましい。一実施形態では、機能性非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、サブゲノムプロモータが存在する場合、サブゲノムプロモータと重複しない。その実施形態は、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１７／１６２４６０号に開示されている。
レプリカーゼおよびタンパク質コード領域による複製に必要な配列エレメントの切り離し
ｎｓＰ１２３４をコードするオープンリーディングフレームは、アルファウイルスゲノムの５'複製認識配列（ｎｓＰ１のコード配列）と重複し、また典型的にはＣＳＥ ３を含むサブゲノムプロモータ（ｎｓＰ４のコード配列）とも重複するため、多用途アルファウイルス由来のベクターを開発することは困難である。
本明細書に記載のＲＮＡレプリコンは、一般に、レプリカーゼによる複製に必要な配列エレメント、特に５'複製認識配列を含む。本発明によれば、非構造タンパク質のコード配列はＩＲＥＳの制御下にあり、したがって、ＩＲＥＳは非構造タンパク質のコード配列の上流に位置する。したがって、一実施形態では、アルファウイルス非構造タンパク質のＮ末端断片のコード配列と通常重複する５'複製認識配列は、ＩＲＥＳの上流に位置し、非構造タンパク質のコード配列とは重複しない。
一実施形態では、ｎｓＰ１コード配列などの５'複製認識配列のコード配列は、ＩＲＥＳの上流に位置する目的の遺伝子にインフレームで融合される。
一実施形態では、５'複製認識配列は、アルファウイルス非構造タンパク質またはその断片などのタンパク質またはその断片をコードしない。したがって、本発明によるＲＮＡレプリコンでは、レプリカーゼおよびタンパク質コード領域による複製に必要な配列エレメントは切り離され得る。切り離しは、天然のウイルスゲノムＲＮＡ、例えば天然のアルファウイルスゲノムＲＮＡと比較して、５'複製認識配列中の少なくとも１つの開始コドンの除去によって達成され得る。
したがって、レプリコンは５'複製認識配列を含み得、５'複製認識配列は、天然のウイルス５'複製認識配列、例えば天然のアルファウイルス５'複製認識配列と比較して、少なくとも１つの開始コドンの除去を含むことを特徴とする。
本発明による、天然のウイルス５'複製認識配列と比較して少なくとも１つの開始コドンの除去を含むことを特徴とする５'複製認識配列は、本明細書では「修飾５'複製認識配列」または「本発明による５'複製認識配列」と称され得る。本明細書で以下に記載されるように、本発明による５'複製認識配列は、任意で１つ以上のさらなるヌクレオチド変化の存在を特徴とし得る。
レプリカーゼ、好ましくはアルファウイルスレプリカーゼによって複製されることができる核酸構築物は、レプリコンと称される。本発明によれば、「レプリコン」という用語は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって複製され、ＤＮＡ中間体なしで、ＲＮＡレプリコンの１つまたは複数の同一または本質的に同一のコピーを生じることができるＲＮＡ分子を定義する。「ＤＮＡ中間体なしで」とは、ＲＮＡレプリコンのコピーを形成する過程でデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のコピーもしくはレプリコンの相補体が形成されないこと、および／またはＲＮＡレプリコンのコピーもしくはその相補体を形成する過程でデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子が鋳型として使用されないことを意味する。レプリカーゼの機能は、典型的には、機能性非構造タンパク質、例えば機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって提供される。
本発明によれば、「複製することができる」および「複製可能である」という用語は一般に、核酸の１つ以上の同一または本質的に同一のコピーを生成することができることを表す。「レプリカーゼ」という用語と共に使用される場合、例えば「レプリカーゼによって複製可能である」などにおいて、「複製することができる」および「複製可能である」という用語は、レプリカーゼに関する、核酸分子、例えばＲＮＡレプリコンの機能的特徴を表す。これらの機能的特徴は、（ｉ）レプリカーゼがレプリコンを認識することができること、および（ｉｉ）レプリカーゼがＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）として作用することができることの少なくとも１つを含む。好ましくは、レプリカーゼは、（ｉ）レプリコンを認識すること、および（ｉｉ）ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとして作用することの両方が可能である。
「認識することができる」という表現は、レプリカーゼがレプリコンと物理的に結合することができること、および好ましくは、レプリカーゼが、典型的には非共有結合的に、レプリコンに結合することができることを表す。「結合」という用語は、レプリカーゼが、保存された配列エレメント１（ＣＳＥ １）またはその相補的配列（レプリコンに含まれる場合）、保存された配列エレメント２（ＣＳＥ ２）またはその相補的配列（レプリコンに含まれる場合）、保存された配列エレメント３（ＣＳＥ ３）またはその相補的配列（レプリコンに含まれる場合）、保存された配列エレメント４（ＣＳＥ ４）またはその相補的配列（レプリコンに含まれる場合）のいずれか１つ以上に結合する能力を有することを意味し得る。好ましくは、レプリカーゼは、ＣＳＥ ２［すなわち（＋）鎖］および／もしくはＣＳＥ ４［すなわち（＋）鎖］に結合することができるか、またはＣＳＥ １の相補体［すなわち（－）鎖］および／もしくはＣＳＥ ３の相補体［すなわち（－）鎖］に結合することができる。
一実施形態では、「ＲｄＲＰとして作用することができる」という表現は、レプリカーゼが、（＋）鎖ＲＮＡが鋳型機能を有する場合、アルファウイルスゲノム（＋）鎖ＲＮＡの（－）鎖相補体の合成を触媒できること、および／またはレプリカーゼが、（－）鎖ＲＮＡが鋳型機能を有する場合、（＋）鎖アルファウイルスゲノムＲＮＡの合成を触媒できることを意味する。一般に、「ＲｄＲＰとして作用することができる」という表現は、レプリカーゼが、（－）鎖ＲＮＡが鋳型機能を有し、および（＋）鎖サブゲノム転写物の合成が、典型的にはアルファウイルスサブゲノムプロモータで開始される場合、（＋）鎖サブゲノム転写物の合成を触媒することができることも含み得る。一実施形態では、ウイルスはアルファウイルスである。
「結合することができる」および「ＲｄＲＰとして作用することができる」という表現は、通常の生理学的条件における能力を指す。特に、機能性非構造タンパク質を発現するか、または機能性非構造タンパク質をコードする核酸でトランスフェクトされた細胞内の状態を指す。細胞は、好ましくは真核細胞である。結合する能力および／またはＲｄＲＰとして作用する能力は、例えば無細胞インビトロ系または真核細胞において実験的に試験することができる。任意で、前記真核細胞は、レプリカーゼの起源である特定のウイルスが感染性である種に由来する細胞である。例えば、ヒトに対して感染性である特定のウイルス由来のウイルスレプリカーゼが使用される場合、通常の生理学的条件はヒト細胞における条件である。より好ましくは、真核細胞（一例ではヒト細胞）は、レプリカーゼの起源である特定のウイルスが感染性である同じ組織または器官に由来する。
本発明によれば、「天然のアルファウイルス配列と比較して」および同様の用語は、天然のアルファウイルス配列の変異体である配列を指す。変異体は、典型的にはそれ自体が天然のアルファウイルス配列ではない。
一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは３'複製認識配列を含む。３'複製認識配列は、機能性非構造タンパク質によって認識され得る核酸配列である。言い換えれば、機能性非構造タンパク質は３'複製認識配列を認識することができる。好ましくは、３'複製認識配列は、レプリコンの３'末端（レプリコンがポリ（Ａ）尾部を含まない場合）、またはポリ（Ａ）尾部のすぐ上流（レプリコンがポリ（Ａ）尾部を含む場合）に位置する。一実施形態では、３'複製認識配列は、ＣＳＥ ４からなるか、またはＣＳＥ ４を含む。
一実施形態では、５'複製認識配列および３'複製認識配列は、機能性非構造タンパク質の存在下で本発明によるＲＮＡレプリコンの複製を指示することができる。したがって、単独でまたは好ましくは一緒に存在する場合、これらの認識配列は、機能性非構造タンパク質の存在下でＲＮＡレプリコンの複製を指示する。
レプリコンの５'複製認識配列および３'複製認識配列の両方を認識することができる機能性非構造タンパク質が提供されることが好ましい。一実施形態では、これは、３'複製認識配列が、機能性アルファウイルス非構造タンパク質が由来するアルファウイルスに天然である場合、および５'複製認識配列が、機能性アルファウイルス非構造タンパク質が由来するアルファウイルスに天然であるか、または機能性アルファウイルス非構造タンパク質が由来するアルファウイルスに天然である５'複製認識配列の変異体である場合に達成される。天然とは、これらの配列の天然の起源が同じアルファウイルスであることを意味する。代替的な実施形態では、５'複製認識配列および／または３'複製認識配列は、機能性アルファウイルス非構造タンパク質がレプリコンの５'複製認識配列および３'複製認識配列の両方を認識することができる限り、機能性アルファウイルス非構造タンパク質が由来するアルファウイルスに天然ではない。言い換えれば、機能性アルファウイルス非構造タンパク質は、５'複製認識配列および３'複製認識配列に適合性である。非天然の機能性アルファウイルス非構造タンパク質がそれぞれの配列または配列エレメントを認識することができる場合、機能性アルファウイルス非構造タンパク質は適合性であると言われる（交差ウイルス適合性）。（３'／５'）複製認識配列およびＣＳＥと、機能性アルファウイルス非構造タンパク質とのそれぞれ任意の組合せは、交差ウイルス適合性が存在する限り可能である。交差ウイルス適合性は、ＲＮＡ複製に適した条件で、例えば適切な宿主細胞において、試験する機能性アルファウイルス非構造タンパク質を、試験する３'および５'複製認識配列を有するＲＮＡと共にインキュベートすることにより、本発明を実施する当業者によって容易に試験され得る。複製が起こる場合、（３'／５'）複製認識配列と機能性アルファウイルス非構造タンパク質は適合性であると決定される。
５'複製認識配列内の少なくとも１つの開始コドンの除去は、いくつかの利点を提供する。ｎｓＰ１＊（ｎｓＰ１のＮ末端断片）をコードする核酸配列に開始コドンが存在しないことは、典型的にはｎｓＰ１＊が翻訳されないことを引き起こす。さらに、ｎｓＰ１＊は翻訳されないので、目的のタンパク質（「ＧＯＩ ２」）をコードするオープンリーディングフレームは、リボソームがアクセスできる最も上流のオープンリーディングフレームである；したがって、レプリコンが細胞内に存在する場合、翻訳は、目的の遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＲＮＡ）の最初のＡＵＧで開始される。
本発明による少なくとも１つの開始コドンの除去は、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって達成され得る。例えば、本発明によるレプリコンをコードする、すなわち開始コドンの除去を特徴とする適切なＤＮＡ分子をインシリコで設計し、その後インビトロで合成することができる（遺伝子合成）；あるいは、レプリコンをコードするＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発によって適切なＤＮＡ分子を入手し得る。いずれの場合も、それぞれのＤＮＡ分子はインビトロ転写のための鋳型として働くことができ、それによって本発明によるレプリコンを提供する。
天然の５'複製認識配列と比較した少なくとも１つの開始コドンの除去は、特に限定されず、１つ以上のヌクレオチドの置換（ＤＮＡレベルでの開始コドンのＡおよび／またはＴおよび／またはＧの置換を含む）、１つ以上のヌクレオチドの欠失（ＤＮＡレベルでの開始コドンのＡおよび／またはＴおよび／またはＧの欠失を含む）、ならびに１つ以上のヌクレオチドの挿入（ＤＮＡレベルでの開始コドンのＡとＴとの間および／またはＴとＧとの間の１つ以上のヌクレオチドの挿入を含む）を含む、任意のヌクレオチド修飾から選択され得る。ヌクレオチド修飾が置換、挿入または欠失であるかどうかにかかわらず、ヌクレオチド修飾は新しい開始コドンの形成をもたらしてはならない（例示的な例として：ＤＮＡレベルでの挿入はＡＴＧの挿入であってはならない）。
少なくとも１つの開始コドンの除去を特徴とするＲＮＡレプリコンの５'複製認識配列（すなわち本発明による修飾５'複製認識配列）は、好ましくは自然界で見出されるアルファウイルスのゲノムの５'複製認識配列の変異体である。一実施形態では、本発明による修飾５'複製認識配列は、好ましくは、自然界で見出される少なくとも１つのアルファウイルスのゲノムの５'複製認識配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の配列同一性の程度を特徴とする。
一実施形態では、少なくとも１つの開始コドンの除去を特徴とし得るＲＮＡレプリコンの５'複製認識配列は、アルファウイルスの５'末端、すなわちアルファウイルスゲノムの５'末端の約２５０個のヌクレオチドに相同な配列を含む。好ましい実施形態では、これは、アルファウイルスの５'末端、すなわちアルファウイルスゲノムの５'末端の約２５０～５００個、好ましくは約３００～５００個のヌクレオチドに相同な配列を含む。「アルファウイルスゲノムの５'末端」とは、アルファウイルスゲノムの最も上流のヌクレオチドから始まり、それを含む核酸配列を意味する。言い換えれば、アルファウイルスゲノムの最も上流のヌクレオチドは、ヌクレオチド番号１と呼ばれ、例えば「アルファウイルスゲノムの５'末端の２５０個のヌクレオチド」とは、アルファウイルスゲノムのヌクレオチド１～２５０を意味する。一実施形態では、ＲＮＡレプリコンの５'複製認識配列は、自然界で見出される少なくとも１つのアルファウイルスのゲノムの５'末端の少なくとも２５０個のヌクレオチドと８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の配列同一性の程度を特徴とする。少なくとも２５０個のヌクレオチドは、例えば２５０個のヌクレオチド、３００個のヌクレオチド、４００個のヌクレオチド、５００個のヌクレオチドを含む。
自然界で見出されるアルファウイルスの５'複製認識配列は、典型的には、少なくとも１つの開始コドンおよび／または保存された二次構造モチーフを特徴とする。例えば、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）の天然の５'複製認識配列は、５つの特定のＡＵＧ塩基トリプレットを含む。Ｆｒｏｌｏｖ ｅｔ ａｌ．（２００１，ＲＮＡ，ｖｏｌ．７，ｐｐ．１６３８－１６５１）によれば、ＭＦＯＬＤによる分析は、セムリキ森林ウイルスの天然の５'複製認識配列が、ステムループ１～４（ＳＬ１、ＳＬ２、ＳＬ３、ＳＬ４）と称される４つのステムループ（ＳＬ）を形成すると予測されることを明らかにした。Ｆｒｏｌｏｖ ｅｔ ａｌ．によれば、ＭＦＯＬＤによる分析は、異なるアルファウイルスであるシンドビスウイルスの天然の５'複製認識配列も、４つのステムループ：ＳＬ１、ＳＬ２、ＳＬ３、ＳＬ４を形成すると予測されることを明らかにした。
アルファウイルスゲノムの５'末端が、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によるアルファウイルスゲノムの複製を可能にする配列エレメントを含むことは公知である。本発明の一実施形態では、ＲＮＡレプリコンの５'複製認識配列は、アルファウイルスの保存された配列エレメント１（ＣＳＥ １）に相同な配列および／または保存された配列エレメント２（ＣＳＥ ２）に相同な配列を含む。
アルファウイルスゲノムＲＮＡの保存された配列エレメント２（ＣＳＥ ２）は、典型的には、アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓＰ１の最初のアミノ酸残基をコードする天然の開始コドンを少なくとも含むＳＬ２が先行するＳＬ３およびＳＬ４によって表される。しかし、この説明において、いくつかの実施形態では、アルファウイルスゲノムＲＮＡの保存された配列エレメント２（ＣＳＥ ２）は、ＳＬ２からＳＬ４に及び、アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓＰ１の最初のアミノ酸残基をコードする天然の開始コドンを含む領域を指す。好ましい実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、ＣＳＥ ２またはＣＳＥ ２に相同な配列を含む。一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、好ましくは、自然界で見出される少なくとも１つのアルファウイルスのＣＳＥ ２の配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の配列同一性の程度を特徴とする、ＣＳＥ ２に相同な配列を含む。
好ましい実施形態では、５'複製認識配列は、アルファウイルスのＣＳＥ ２に相同な配列を含む。アルファウイルスのＣＳＥ ２は、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームの断片を含み得る。
したがって、好ましい実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列を含むことを特徴とする。非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列は、典型的には、自然界で見出されるアルファウイルスの非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片の変異体である。一実施形態では、非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列は、好ましくは、自然界で見出される少なくとも１つのアルファウイルスの非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の配列同一性の程度を特徴とする。
より好ましい実施形態では、本発明のレプリコンに含まれる非構造タンパク質のオープンリーディングフレームに相同な配列は、非構造タンパク質の天然の開始コドンを含まず、より好ましくは非構造タンパク質のいかなる開始コドンも含まない。好ましい実施形態では、ＣＳＥ ２に相同な配列は、天然のアルファウイルスＣＳＥ ２配列と比較して、全ての開始コドンの除去を特徴とする。したがって、ＣＳＥ ２に相同な配列は、好ましくはいかなる開始コドンも含まない。
オープンリーディングフレームに相同な配列がいかなる開始コドンも含まない場合、オープンリーディングフレームに相同な配列は、翻訳の鋳型として機能しないので、それ自体オープンリーディングフレームではない。
一実施形態では、５'複製認識配列は、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列を含み、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列は、天然のアルファウイルス配列と比較して少なくとも１つの開始コドンの除去を含むことを特徴とする。
好ましい実施形態では、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列は、少なくとも非構造タンパク質のオープンリーディングフレームの天然の開始コドンの除去を含むことを特徴とする。好ましくは、前記配列は、少なくともｎｓＰ１をコードするオープンリーディングフレームの天然の開始コドンの除去を含むことを特徴とする。
天然の開始コドンは、宿主細胞にＲＮＡが存在する場合に宿主細胞のリボソームでの翻訳が始まるＡＵＧ塩基トリプレットである。言い換えれば、天然の開始コドンは、例えば天然の開始コドンを含むＲＮＡが接種された宿主細胞において、リボソームタンパク質合成中に翻訳される最初の塩基トリプレットである。一実施形態では、宿主細胞は、天然のアルファウイルス５'複製認識配列を含む特定のアルファウイルスの天然宿主である真核生物種由来の細胞である。好ましい実施形態では、宿主細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡから入手可能な細胞株「ＢＨＫ２１［Ｃ１３］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ１０（商標））」由来のＢＨＫ２１細胞である。
多くのアルファウイルスのゲノムは完全に配列決定されており、公的にアクセス可能であり、これらのゲノムによってコードされる非構造タンパク質の配列も公的にアクセス可能である。そのような配列情報により、天然の開始コドンをインシリコで決定することが可能である。
好ましい実施形態では、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列は、非構造タンパク質のオープンリーディングフレームの天然の開始コドン以外の１つ以上の開始コドンの除去を含むことを特徴とする。より好ましい実施形態では、前記核酸配列は、天然の開始コドンの除去をさらに特徴とする。例えば、天然の開始コドンの除去に加えて、任意の１つまたは２つまたは３つまたは４つまたは４つより多い（例えば５つ）開始コドンが除去されていてもよい。
レプリコンが、非構造タンパク質のオープンリーディングフレームの天然の開始コドンの除去、および任意で天然の開始コドン以外の１つ以上の開始コドンの除去を特徴とする場合、オープンリーディングフレームに相同な配列は、翻訳のための鋳型として機能しないので、それ自体はオープンリーディングフレームではない。
好ましくは天然の開始コドンの除去に加えて、除去される天然の開始コドン以外の１つ以上の開始コドンは、好ましくは翻訳を開始する可能性を有するＡＵＧ塩基トリプレットから選択される。翻訳を開始する可能性を有するＡＵＧ塩基トリプレットは、「潜在的な開始コドン」と称され得る。所与のＡＵＧ塩基トリプレットが翻訳を開始する可能性を有するかどうかは、インシリコまたは細胞ベースのインビトロアッセイで決定することができる。
一実施形態では、所与のＡＵＧ塩基トリプレットが翻訳を開始する可能性を有するかどうかはインシリコで決定される：その実施形態では、ヌクレオチド配列が調べられ、ＡＵＧ塩基トリプレットがＡＵＧＧ配列の一部、好ましくはコザック配列の一部である場合、塩基トリプレットは翻訳を開始する可能性を有すると決定される。
一実施形態では、所与のＡＵＧ塩基トリプレットが翻訳を開始する可能性を有するかどうかは細胞ベースのインビトロアッセイで決定される：天然の開始コドンの除去を特徴とし、天然の開始コドンの除去位置の下流に所与のＡＵＧ塩基トリプレットを含むＲＮＡレプリコンが宿主細胞に導入される。一実施形態では、宿主細胞は、天然のアルファウイルス５'複製認識配列を含む特定のアルファウイルスの天然宿主である真核生物種由来の細胞である。好ましい実施形態では、宿主細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡから入手可能な細胞株「ＢＨＫ２１［Ｃ１３］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ１０（商標））」由来のＢＨＫ２１細胞である。天然の開始コドンの除去位置と所与のＡＵＧ塩基トリプレットとの間にさらなるＡＵＧ塩基トリプレットが存在しないことが好ましい。天然の開始コドンの除去を特徴とし、所与のＡＵＧ塩基トリプレットを含むＲＮＡレプリコンの宿主細胞への移入後に、所与のＡＵＧ塩基トリプレットで翻訳が開始される場合、所与のＡＵＧ塩基トリプレットは翻訳を開始する可能性を有すると決定される。翻訳が開始されるかどうかは、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって決定され得る。例えば、レプリコンは、所与のＡＵＧ塩基トリプレットの下流に、所与のＡＵＧ塩基トリプレットとインフレームで、翻訳産物（存在する場合）の検出を容易にするタグ、例えばｍｙｃタグまたはＨＡタグをコードし得る；コードされたタグを有する発現産物が存在するかどうかは、例えばウェスタンブロットによって決定され得る。この実施形態では、所与のＡＵＧ塩基トリプレットとタグをコードする核酸配列との間にさらなるＡＵＧ塩基トリプレットが存在しないことが好ましい。細胞ベースのインビトロアッセイは、複数の所与のＡＵＧ塩基トリプレットについて個別に実施することができる：各々の場合に、天然の開始コドンの除去位置と所与のＡＵＧ塩基トリプレットとの間にさらなるＡＵＧ塩基トリプレットが存在しないことが好ましい。これは、天然の開始コドンの除去位置と所与のＡＵＧ塩基トリプレットとの間にある全てのＡＵＧ塩基トリプレット（存在する場合）を除去することによって達成され得る。それによって、所与のＡＵＧ塩基トリプレットは、天然の開始コドンの除去位置の下流の最初のＡＵＧ塩基トリプレットになる。
好ましくは、本発明によるＲＮＡレプリコンの５'複製認識配列は、全ての潜在的な開始コドンの除去を特徴とする。したがって、本発明によれば、５'複製認識配列は、好ましくはタンパク質に翻訳され得るオープンリーディングフレームを含まない。
好ましい実施形態では、本発明によるＲＮＡレプリコンの５'複製認識配列は、ウイルスゲノムＲＮＡの５'複製認識配列の（予測される）二次構造に相当する二次構造を特徴とする。この目的のために、ＲＮＡレプリコンは、少なくとも１つの開始コドンの除去によって導入された１つ以上のステムループ内のヌクレオチド対合破壊を補償する１つ以上のヌクレオチド変化を含み得る。
好ましい実施形態では、本発明によるＲＮＡレプリコンの５'複製認識配列は、アルファウイルスゲノムＲＮＡの５'複製認識配列の二次構造に相当する二次構造を特徴とする。好ましい実施形態では、本発明によるＲＮＡレプリコンの５'複製認識配列は、アルファウイルスゲノムＲＮＡの５'複製認識配列の予測二次構造に相当する予測二次構造を特徴とする。本発明によれば、ＲＮＡ分子の二次構造は、好ましくはＲＮＡ二次構造予測のためのウェブサーバ、ｈｔｔｐ：／／ｒｎａ．ｕｒｍｃ．ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ．ｅｄｕ／ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅＷｅｂ／Ｓｅｒｖｅｒｓ／Ｐｒｅｄｉｃｔ１／Ｐｒｅｄｉｃｔ１．ｈｔｍｌによって予測される。
天然のアルファウイルス５'複製認識配列と比較して少なくとも１つの開始コドンの除去を特徴とするＲＮＡレプリコンの５'複製認識配列の二次構造または予測二次構造を比較することによって、ヌクレオチド対合破壊の存在または非存在を同定することができる。例えば、天然のアルファウイルス５'複製認識配列と比較して、少なくとも１つの塩基対、例えばステムループ内、特にステムループのステム内の塩基対が所与の位置に存在しない場合がある。
好ましい実施形態では、５'複製認識配列の１つ以上のステムループは欠失または破壊されない。より好ましくは、ステムループ３および４は欠失または破壊されない。より好ましくは、５'複製認識配列のステムループのいずれも欠失または破壊されない。
一実施形態では、少なくとも１つの開始コドンの除去は、５'複製認識配列の二次構造を破壊しない。代替的な実施形態では、少なくとも１つの開始コドンの除去は、５'複製認識配列の二次構造を破壊する。この実施形態では、少なくとも１つの開始コドンの除去は、天然の５'複製認識配列と比較して、所与の位置の少なくとも１つの塩基対、例えばステムループ内の塩基対が存在しない原因となり得る。天然の５'複製認識配列と比較して、ステムループ内に塩基対が存在しない場合、少なくとも１つの開始コドンの除去は、ステムループ内にヌクレオチド対合破壊を導入すると決定される。ステムループ内の塩基対は、典型的にはステムループのステム内の塩基対である。
好ましい実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、少なくとも１つの開始コドンの除去によって導入された１つ以上のステムループ内のヌクレオチド対合破壊を補償する１つ以上のヌクレオチド変化を含む。
少なくとも１つの開始コドンの除去が、天然の５'複製認識配列と比較して、ステムループ内にヌクレオチド対合破壊を導入する場合、ヌクレオチド対合破壊を補償すると予想される１つ以上のヌクレオチド変化が導入され得、それによって得られる二次構造または予測二次構造を天然の５'複製認識配列と比較し得る。
共通の一般的知識および本明細書の開示に基づいて、特定のヌクレオチド変化は、ヌクレオチド対合破壊を補償すると当業者によって予想され得る。例えば、天然の５'複製認識配列と比較して、少なくとも１つの開始コドンの除去を特徴とするＲＮＡレプリコンの所与の５'複製認識配列の二次構造または予測二次構造の所与の位置で塩基対が破壊された場合、好ましくは開始コドンを再導入することなく、その位置で塩基対を復元するヌクレオチド変化は、ヌクレオチド対合破壊を補償すると予想される。
好ましい実施形態では、レプリコンの５'複製認識配列は、翻訳可能な核酸配列、すなわちペプチドまたはタンパク質、特にｎｓＰ、特にｎｓＰ１、またはそのいずれかの断片に翻訳可能な核酸配列と重複しないか、またはそれを含まない。ヌクレオチド配列が「翻訳可能」であるためには、開始コドンの存在を必要とする；開始コドンは、ペプチドまたはタンパク質の最もＮ末端側のアミノ酸残基をコードする。一実施形態では、レプリコンの５'複製認識配列は、ｎｓＰ１のＮ末端断片をコードする翻訳可能な核酸配列と重複しないか、またはそれを含まない。
以下で詳細に説明するいくつかの状況では、ＲＮＡレプリコンは少なくとも１つのサブゲノムプロモータを含む。好ましい実施形態では、レプリコンのサブゲノムプロモータは、翻訳可能な核酸配列、すなわちペプチドまたはタンパク質、特にｎｓＰ、特にｎｓＰ４、またはそのいずれかの断片に翻訳可能な核酸配列と重複しないか、またはそれを含まない。一実施形態では、レプリコンのサブゲノムプロモータは、ｎｓＰ４のＣ末端断片をコードする翻訳可能な核酸配列と重複しないか、またはそれを含まない。翻訳可能な核酸配列、例えばｎｓＰ４のＣ末端断片に翻訳可能な核酸配列と重複しないか、またはそれを含まないサブゲノムプロモータを有するＲＮＡレプリコンは、ｎｓＰ４のコード配列の一部（典型的にはｎｓＰ４のＮ末端部分をコードする部分）を欠失させることによって、および／または欠失されていないｎｓＰ４のコード配列の一部のＡＵＧ塩基トリプレットを除去することによって生成され得る。ｎｓＰ４のコード配列またはその一部のＡＵＧ塩基トリプレットが除去される場合、除去されるＡＵＧ塩基トリプレットは、好ましくは潜在的な開始コドンである。あるいは、サブゲノムプロモータがｎｓＰ４をコードする核酸配列と重複しない場合、ｎｓＰ４をコードする核酸配列全体を欠失させてもよい。
一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、トランケートされた非構造タンパク質、例えばトランケートされたアルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含まない。この実施形態の文脈において、ＲＮＡレプリコンがｎｓＰ１のＮ末端断片をコードするオープンリーディングフレームを含まず、任意でｎｓＰ４のＣ末端断片をコードするオープンリーディングフレームを含まないことが特に好ましい。ｎｓＰ１のＮ末端断片は、トランケートされたアルファウイルスタンパク質である；ｎｓＰ４のＣ末端断片も、トランケートされたアルファウイルスタンパク質である。
いくつかの実施形態では、本発明によるレプリコンは、アルファウイルスのゲノムの５'末端のステムループ２（ＳＬ２）を含まない。上記のＦｒｏｌｏｖ ｅｔ ａｌ．によれば、ステムループ２は、ＣＳＥ ２の上流の、アルファウイルスのゲノムの５'末端に見出される保存された二次構造であるが、複製には不要である。
本発明によるＲＮＡレプリコンは、好ましくは一本鎖ＲＮＡ分子である。本発明によるＲＮＡレプリコンは、典型的には（＋）鎖ＲＮＡ分子である。一実施形態では、本発明のＲＮＡレプリコンは、単離された核酸分子である。
レプリコンに含まれる少なくとも１つのオープンリーディングフレーム
一実施形態では、本発明によるＲＮＡレプリコンは、目的のペプチドまたは目的のタンパク質をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む。好ましくは、目的のタンパク質は異種核酸配列によってコードされる。目的のペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子は、同義的に「目的の遺伝子」または「導入遺伝子」と称される。様々な実施形態では、目的のペプチドまたはタンパク質は異種核酸配列によってコードされる。本発明によれば、「異種」という用語は、核酸配列が天然ではウイルス核酸配列、例えばアルファウイルス核酸配列に機能的または構造的に連結されていないという事実を指す。
本発明によるレプリコンは、単一のポリペプチドまたは複数のポリペプチドをコードし得る。複数のポリペプチドは、単一のポリペプチド（融合ポリペプチド）として、または別個のポリペプチドとしてコードされ得る。いくつかの実施形態では、本発明によるレプリコンは複数のオープンリーディングフレームを含み得、その各々は独立して、サブゲノムプロモータの制御下にあるか否かが選択され得る。あるいは、ポリタンパク質または融合ポリペプチドは、２Ａ自己切断ペプチド（例えば口蹄疫ウイルス２Ａタンパク質由来）またはプロテアーゼ切断部位またはインテインによって分離された個々のポリペプチドを含む。
目的のタンパク質は、例えばレポータタンパク質、薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質、細胞内インターフェロン（ＩＦＮ）シグナル伝達の阻害剤からなる群より選択され得る。本発明によれば、目的のタンパク質は、好ましくは、自己複製ウイルス由来の機能性非構造タンパク質、例えば機能性アルファウイルス非構造タンパク質を含まない。
レポータタンパク質
一実施形態では、オープンリーディングフレームはレポータタンパク質をコードする。その実施形態では、オープンリーディングフレームはレポータ遺伝子を含む。特定の遺伝子がそれらを発現する細胞または生物に付与する特徴は容易に同定および測定され得るため、またはそれらが選択マーカーであるため、特定の遺伝子はレポータとして選択され得る。レポータ遺伝子は、特定の遺伝子が細胞または生物の集団によって取り込まれたかまたはそれらにおいて発現されたかどうかの指標として使用されることが多い。好ましくは、レポータ遺伝子の発現産物は視覚的に検出可能である。一般的な視覚的に検出可能なレポータタンパク質は、典型的には蛍光または発光タンパク質を有する。具体的なレポータ遺伝子の例としては、それを発現する細胞を青色光下で緑色に発光させるクラゲ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェリンとの反応を触媒して光を生成する酵素ルシフェラーゼ、および赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）をコードする遺伝子が挙げられる。これらの特異的レポータ遺伝子のいずれかの変異体は、視覚的に検出可能な特性を有する限り可能である。例えば、ｅＧＦＰはＧＦＰの点突然変異体である。レポータタンパク質の実施形態は、発現を試験するのに特に適する。
薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質
本発明によれば、一実施形態では、レプリコンのＲＮＡは、薬学的に活性なＲＮＡを含むか、またはそれからなる。「薬学的に活性なＲＮＡ」は、薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡであり得る。好ましくは、本発明によるＲＮＡレプリコンは、薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質をコードする。好ましくは、オープンリーディングフレームは、薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質をコードする。好ましくは、ＲＮＡレプリコンは、任意でサブゲノムプロモータの制御下で、薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。
「薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質」は、治療有効量で対象に投与された場合、対象の状態または疾患状態にプラスのまたは有利な効果を有する。好ましくは、薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、治癒特性または緩和特性を有し、疾患または障害の１つ以上の症状を改善する、緩和する、軽減する、逆転させる、発症を遅延させるまたは重症度を軽減するために投与され得る。薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、予防特性を有し得、疾患の発症を遅延させるため、またはそのような疾患もしくは病的状態の重症度を軽減するために使用され得る。「薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質」という用語は、タンパク質またはポリペプチド全体を含み、その薬学的に活性な断片も指すことができる。この用語はまた、ペプチドまたはタンパク質の薬学的に活性な類似体を含み得る。「薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質」という用語は、抗原であるペプチドおよびタンパク質を含み、すなわち、ペプチドまたはタンパク質は、治療的または部分的もしくは完全に保護的であり得る免疫応答を対象において誘発する。
一実施形態では、薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、免疫学的に活性な化合物または抗原またはエピトープであるか、またはそれらを含む。
本発明によれば、「免疫学的に活性な化合物」という用語は、好ましくは免疫細胞の成熟を誘導および／もしくは抑制する、サイトカイン生合成を誘導および／もしくは抑制する、ならびに／またはＢ細胞による抗体産生を刺激することにより体液性免疫を変化させることによって、免疫応答を変化させる任意の化合物に関する。一実施形態では、免疫応答は、抗体応答（通常、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を含む）の刺激を含む。免疫学的に活性な化合物は、抗ウイルスおよび抗腫瘍活性を含むがこれらに限定されない強力な免疫刺激活性を有し、また免疫応答の他の局面を下方制御する、例えば免疫応答をＴＨ２免疫応答からシフトさせることもでき、これは、広範囲のＴＨ２媒介疾患を治療するのに有用である。
本発明によれば、「抗原」または「免疫原」という用語は、免疫応答を誘発する任意の物質を包含する。特に、「抗原」は、抗体またはＴリンパ球（Ｔ細胞）と特異的に反応する任意の物質に関する。本発明によれば、「抗原」という用語は、少なくとも１つのエピトープを含有する任意の分子を含む。好ましくは、本発明の文脈における抗原は、任意でプロセシング後に、好ましくは抗原に特異的な免疫反応を誘導する分子である。本発明によれば、免疫反応の候補である任意の適切な抗原を使用することができ、免疫反応は体液性および細胞性免疫反応の両方であり得る。本発明の実施形態の文脈において、抗原は、ＭＨＣ分子に関連して、好ましくは細胞、好ましくは抗原提示細胞によって提示され、抗原に対する免疫反応をもたらす。抗原は、好ましくは、天然に存在する抗原に対応するまたは由来する生成物である。そのような天然に存在する抗原は、アレルゲン、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物ならびに他の感染性因子および病原体を含んでもよく、もしくはそれらに由来してもよく、または抗原は腫瘍抗原であってもよい。本発明によれば、抗原は、天然に存在する生成物、例えばウイルスタンパク質、またはその一部に対応し得る。好ましい実施形態では、抗原は、表面ポリペプチド、すなわち細胞、病原体、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、アレルゲンまたは腫瘍の表面に天然に提示されるポリペプチドである。抗原は、細胞、病原体、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、アレルゲンまたは腫瘍に対する免疫応答を誘発し得る。
「病原体」という用語は、生物、好ましくは脊椎動物において疾患を引き起こすことができる病原性の生物学的物質を指す。病原体には、細菌、単細胞真核生物（原生動物）、真菌、およびウイルスなどの微生物が含まれる。
「エピトープ」、「抗原ペプチド」、「抗原エピトープ」、「免疫原性ペプチド」および「ＭＨＣ結合ペプチド」という用語は、本明細書では互換的に使用され、抗原などの分子中の抗原決定基、すなわち免疫系によって認識される、例えば、特にＭＨＣ分子に関連して提示された場合にＴ細胞によって認識される、免疫学的に活性な化合物の一部または断片を指す。タンパク質のエピトープは、好ましくは前記タンパク質の連続または不連続部分を含み、好ましくは５～１００、好ましくは５～５０、より好ましくは８～３０、最も好ましくは１０～２５アミノ酸長であり、例えばエピトープは、好ましくは９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸長であり得る。本発明によれば、エピトープは、細胞の表面上のＭＨＣ分子などのＭＨＣ分子に結合することができ、したがって、「ＭＨＣ結合ペプチド」または「抗原ペプチド」であり得る。「主要組織適合遺伝子複合体」という用語および「ＭＨＣ」という略語は、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子を含み、全ての脊椎動物に存在する遺伝子の複合体に関する。ＭＨＣタンパク質または分子は、免疫反応におけるリンパ球と抗原提示細胞または疾患細胞との間のシグナル伝達に重要であり、ＭＨＣタンパク質または分子は、ペプチドに結合し、Ｔ細胞受容体による認識のためにそれらを提示する。ＭＨＣによってコードされるタンパク質は、細胞の表面に発現され、自己抗原（細胞自体からのペプチド断片）および非自己抗原（例えば侵入微生物の断片）の両方をＴ細胞に表示する。好ましいそのような免疫原性部分は、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子に結合する。本明細書で使用される場合、免疫原性部分は、そのような結合が当技術分野で公知のいずれかのアッセイを使用して検出可能である場合、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子をに「結合する」と言われる。「ＭＨＣ結合ペプチド」という用語は、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチドに関する。クラスＩ ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には８～１０アミノ酸長であるが、より長いまたはより短いペプチドも有効であり得る。クラスＩＩ ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には１０～２５アミノ酸長であり、特に１３～１８アミノ酸長であるが、より長いおよびより短いペプチドも有効であり得る。
一実施形態では、本発明による目的のタンパク質は、標的生物のワクチン接種に適したエピトープを含む。当業者は、免疫生物学およびワクチン接種の原理の１つが、治療される疾患に関して免疫学的に関連する抗原で生物を免疫することによって疾患に対する免疫保護反応が生じるという事実に基づくことを理解している。本発明によれば、抗原は、自己抗原および非自己抗原を含む群から選択される。非自己抗原は、好ましくは細菌抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、アレルゲンまたは寄生生物抗原である。抗原は、標的生物において免疫応答を誘発することができるエピトープを含むことが好ましい。例えば、エピトープは、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、アレルゲン、または腫瘍に対する免疫応答を誘発し得る。
いくつかの実施形態では、非自己抗原は細菌抗原である。いくつかの実施形態では、抗原は、鳥類、魚類、および家畜を含む哺乳動物を含む動物に感染する細菌に対する免疫応答を誘発する。好ましくは、免疫応答が誘発される細菌は病原性細菌である。
いくつかの実施形態では、非自己抗原はウイルス抗原である。ウイルス抗原は、例えばウイルス表面タンパク質由来のペプチド、例えばカプシドポリペプチドまたはスパイクポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、抗原は、鳥類、魚類および家畜を含む哺乳動物を含む動物に感染するウイルスに対する免疫応答を誘発する。好ましくは、免疫応答が誘発されるウイルスは病原性ウイルスである。
いくつかの実施形態では、非自己抗原は、真菌由来のポリペプチドまたはタンパク質である。いくつかの実施形態では、抗原は、鳥類、魚類および家畜を含む哺乳動物を含む動物に感染する真菌に対する免疫応答を誘発する。好ましくは、免疫応答が誘発される真菌は病原性真菌である。
いくつかの実施形態では、非自己抗原は、単細胞真核生物寄生虫由来のポリペプチドまたはタンパク質である。いくつかの実施形態では、抗原は、単細胞真核生物寄生虫、好ましくは病原性単細胞真核生物寄生虫に対する免疫応答を誘発する。病原性単細胞真核生物寄生虫は、例えば、プラスモジウム属（ｇｅｎｕｓ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、例えば熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）もしくは卵形マラリア原虫（Ｐ．ｏｖａｌｅ）、リーシュマニア属（ｇｅｎｕｓ Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、またはトリパノソーマ属（ｇｅｎｕｓ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、例えばクルーズトリパノソーマ（Ｔ．ｃｒｕｚｉ）もしくはブルーストリパノソーマ（Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ）に由来し得る。
いくつかの実施形態では、非自己抗原は、アレルゲン性ポリペプチドまたはアレルゲン性タンパク質である。アレルゲン性タンパク質またはアレルゲン性ポリペプチドは、減感作としても公知のアレルゲン免疫療法に適する。
いくつかの実施形態では、抗原は自己抗原、特に腫瘍抗原である。腫瘍抗原およびそれらの決定は当業者に公知である。
本発明の文脈において、「腫瘍抗原」または「腫瘍関連抗原」という用語は、正常条件下では限られた数の組織および／もしくは器官で、または特定の発生段階で特異的に発現されるタンパク質に関し、例えば腫瘍抗原は、正常条件下では胃組織、好ましくは胃粘膜、生殖器官、例えば精巣、栄養膜組織、例えば胎盤、または生殖系列細胞で特異的に発現され得、１つ以上の腫瘍または癌組織で発現されるかまたは異常発現される。この文脈において、「限られた数」は、好ましくは３以下、より好ましくは２以下を意味する。本発明に関連して腫瘍抗原には、例えば、分化抗原、好ましくは細胞型特異的分化抗原、すなわち正常条件下では特定の分化段階で特定の細胞型において特異的に発現されるタンパク質、癌／精巣抗原、すなわち正常条件下では精巣および時には胎盤において特異的に発現されるタンパク質、ならびに生殖系列特異的抗原が含まれる。本発明の文脈において、腫瘍抗原は、好ましくは癌細胞の細胞表面に関連し、好ましくは正常組織では発現されないか、またはまれにしか発現されない。好ましくは、腫瘍抗原または腫瘍抗原の異常発現は、癌細胞を同定する。本発明の文脈において、対象、例えば癌疾患に罹患している患者において癌細胞によって発現される腫瘍抗原は、好ましくは前記対象の自己タンパク質である。好ましい実施形態では、本発明に関連して腫瘍抗原は、正常条件下では非必須である組織もしくは器官、すなわち免疫系によって損傷された場合に対象の死をもたらさない組織もしくは器官において、または免疫系がアクセスできないもしくはほとんどアクセスできない身体の器官または構造において特異的に発現される。好ましくは、腫瘍抗原のアミノ酸配列は、正常組織で発現される腫瘍抗原と癌組織で発現される腫瘍抗原との間で同一である。
本発明において有用であり得る腫瘍抗原の例は、ｐ５３、ＡＲＴ－４、ＢＡＧＥ、β－カテニン／ｍ、Ｂｃｒ－ａｂＬ ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ－１、ＣＡＳＰ－８、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、クローディン－６、クローディン－１８．２およびクローディン－１２などのクローディンファミリーの細胞表面タンパク質、ｃ－ＭＹＣ、ＣＴ、Ｃｙｐ－Ｂ、ＤＡＭ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ－Ｖ、Ｇａｐ１００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＨＰＶ－Ｅ７、ＨＰＶ－Ｅ６、ＨＡＳＴ－２、ｈＴＥＲＴ（またはｈＴＲＴ）、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ－Ａ、好ましくはＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ５、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ７、ＭＡＧＥ－Ａ８、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１１、またはＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ｂ、ＭＡＧＥ－Ｃ、ＭＡＲＴ－１／メランＡ、ＭＣ１Ｒ、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ－１、ＭＵＭ－２、ＭＵＭ－３、ＮＡ８８－Ａ、ＮＦ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＮＹ－ＢＲ－１、ｐ１９０マイナーＢＣＲ－ａｂＬ、Ｐｍ１／ＲＡＲａ、ＰＲＡＭＥ、プロテイナーゼ３、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１またはＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ－１またはＳＡＲＴ－３、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＳＣＰ１、ＳＣＰ２、ＳＣＰ３、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、ＴＰＴＥおよびＷＴである。特に好ましい腫瘍抗原としては、クローディン－１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）およびクローディン－６（ＣＬＤＮ６）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、免疫応答を誘発する抗原である必要はない。適切な薬学的に活性なタンパク質またはペプチドは、サイトカインおよび免疫系タンパク質、例えば免疫学的に活性な化合物（例えば、インターロイキン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、エリスロポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロン、インテグリン、アドレシン、セレチン、ホーミング受容体、Ｔ細胞受容体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、免疫グロブリン）、ホルモン（インスリン、甲状腺ホルモン、カテコールアミン、ゴナドトロピン、栄養ホルモン、プロラクチン、オキシトシン、ドーパミン、ウシソマトトロピン、レプチンなど）、成長ホルモン（例えばヒト成長ホルモン）、成長因子（例えば上皮成長因子、神経成長因子、インスリン様増殖因子など）、成長因子受容体、酵素（組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ、コレステロール生合成または分解性酵素、ステロイド産生酵素、キナーゼ、ホスホジエステラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、デヒドロゲナーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、アロマターゼ、シトクロム、アデニル酸またはグアニル酸シクラーゼ、ノイラミニダーゼなど）、受容体（ステロイドホルモン受容体、ペプチド受容体）、結合タンパク質（成長ホルモンまたは成長因子結合タンパク質など）、転写および翻訳因子、腫瘍成長抑制タンパク質（例えば血管新生を阻害するタンパク質）、構造タンパク質（コラーゲン、フィブロイン、フィブリノーゲン、エラスチン、チューブリン、アクチン、ミオシンなど）、血液タンパク質（トロンビン、血清アルブミン、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、インスリン、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、プロテインＣ、フォン・ヴィレブランド因子、アンチトロンビンＩＩＩ、グルコセレブロシダーゼ、エリスロポエチン顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）または修飾第ＶＩＩＩ因子、抗凝固因子などからなる群より選択され得る。一実施形態では、本発明による薬学的に活性なタンパク質は、リンパ系ホメオスタシスの調節に関与するサイトカイン、好ましくはＴ細胞の発生、プライミング、拡大、分化および／または生存に関与し、好ましくは誘導または増強するサイトカインである。一実施形態では、サイトカインは、インターロイキン、例えばＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５またはＩＬ－２１である。
インターフェロン（ＩＦＮ）シグナル伝達の阻害剤
オープンリーディングフレームによってコードされる目的のさらなる適切なタンパク質は、インターフェロン（ＩＦＮ）シグナル伝達の阻害剤である。発現のためにＲＮＡが導入された細胞の生存能力が、特に細胞がＲＮＡで複数回トランスフェクトされた場合、低下し得ることが報告されているが、ＩＦＮ阻害剤は、ＲＮＡが発現される細胞の生存能力を高めることが見出された（国際公開第２０１４／０７１９６３ Ａ１号）。好ましくは、阻害剤は、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達の阻害剤である。細胞外ＩＦＮによるＩＦＮ受容体の係合を防止し、細胞における細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害することは、細胞内でのＲＮＡの安定な発現を可能する。あるいはまたはさらに、細胞外ＩＦＮによるＩＦＮ受容体の係合を防止し、細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害することは、特に細胞がＲＮＡで繰り返しトランスフェクトされる場合、細胞の生存を増強する。理論に拘束されることを望むものではないが、細胞内ＩＦＮシグナル伝達は、翻訳の阻害および／またはＲＮＡ分解をもたらし得ることが想定される。これは、１つ以上のＩＦＮ誘導性の抗ウイルス活性エフェクタタンパク質を阻害することによって対処することができる。ＩＦＮ誘導性の抗ウイルス活性エフェクタタンパク質は、ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）、２'，５'－オリゴアデニル酸シンテターゼ（ＯＡＳ）およびＲＮａｓｅＬからなる群より選択することができる。細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害することは、ＰＫＲ依存性経路および／またはＯＡＳ依存性経路を阻害することを含み得る。目的の適切なタンパク質は、ＰＫＲ依存性経路および／またはＯＡＳ依存性経路を阻害することができるタンパク質である。ＰＫＲ依存性経路を阻害することは、ｅＩＦ２－αリン酸化を阻害することを含み得る。ＰＫＲを阻害することは、少なくとも１つのＰＫＲ阻害剤で細胞を処理することを含み得る。ＰＫＲ阻害剤は、ＰＫＲのウイルス阻害剤であり得る。ＰＫＲの好ましいウイルス阻害剤は、ワクシニアウイルスＥ３である。ペプチドまたはタンパク質（例えばＥ３、Ｋ３）が細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害するべきである場合、ペプチドまたはタンパク質の細胞内発現が好ましい。ワクシニアウイルスＥ３は、ｄｓＲＮＡに結合して隔離し、ＰＫＲおよびＯＡＳの活性化を妨げる２５ｋＤａのｄｓＲＮＡ結合タンパク質（遺伝子Ｅ３Ｌによってコードされる）である。Ｅ３は、ＰＫＲに直接結合することができ、その活性を阻害し、ｅＩＦ２－αのリン酸化の低減をもたらす。ＩＦＮシグナル伝達の他の適切な阻害剤は、単純ヘルペスウイルスＩＣＰ３４．５、トスカナウイルスＮＳ、カイコ核多角体病ウイルスＰＫ２、およびＨＣＶ ＮＳ３４Ａである。
ＲＮＡレプリコンにおける少なくとも１つのオープンリーディングフレームの位置
ＲＮＡレプリコンは、任意でサブゲノムプロモータの制御下で、目的のペプチドまたは目的のタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現に適する。様々な実施形態が可能である。それぞれが目的のペプチドまたは目的のタンパク質をコードする１つ以上のオープンリーディングフレームがＲＮＡレプリコン上に存在し得る。ＲＮＡレプリコンの最も上流のオープンリーディングフレームは、「第１のオープンリーディングフレーム」と称される。一実施形態では、目的のタンパク質をコードする第１のオープンリーディングフレームは、５'複製認識配列の下流かつＩＲＥＳ（および自己複製ウイルス由来の機能性非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム）の上流に位置する。いくつかの実施形態では、「第１のオープンリーディングフレーム」は、ＲＮＡレプリコンの唯一のオープンリーディングフレームである。任意で、１つ以上のさらなるオープンリーディングフレームが第１のオープンリーディングフレームの下流に存在し得る。第１のオープンリーディングフレームの下流の１つ以上のさらなるオープンリーディングフレームは、それらが第１のオープンリーディングフレームの下流に存在する順序（５'から３'へ）で、「第２のオープンリーディングフレーム」、「第３のオープンリーディングフレーム」などと称され得る。一実施形態では、１つ以上の目的のタンパク質をコードする１つ以上のさらなるオープンリーディングフレームは、自己複製ウイルス由来の機能性非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの下流に位置し、好ましくはサブゲノムプロモータによって制御される。好ましくは、各オープンリーディングフレームは、開始コドン（塩基トリプレット）、典型的にはＡＴＧ（それぞれのＤＮＡ分子中）に対応するＡＵＧ（ＲＮＡ分子中）を含む。
レプリコンが３'複製認識配列を含む場合、全てのオープンリーディングフレームが３'複製認識配列の上流に局在することが好ましい。
いくつかの実施形態では、レプリコンの少なくとも１つのオープンリーディングフレームは、サブゲノムプロモータ、好ましくはアルファウイルスサブゲノムプロモータの制御下にある。アルファウイルスサブゲノムプロモータは非常に効率的であり、したがって高レベルでの異種遺伝子発現に適する。好ましくは、サブゲノムプロモータは、アルファウイルスのサブゲノム転写物のためのプロモータである。これは、サブゲノムプロモータが、アルファウイルスに天然であり、好ましくは前記アルファウイルス中の１つ以上の構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの転写を制御するものであることを意味する。あるいは、サブゲノムプロモータは、アルファウイルスのサブゲノムプロモータの変異体であり、宿主細胞においてサブゲノムＲＮＡ転写のためのプロモータとして機能する任意の変異体が適切である。レプリコンがサブゲノムプロモータを含む場合、レプリコンは、保存された配列エレメント３（ＣＳＥ ３）またはその変異体を含むことが好ましい。
好ましくは、サブゲノムプロモータの制御下にある少なくとも１つのオープンリーディングフレームは、サブゲノムプロモータの下流に局在する。好ましくは、サブゲノムプロモータは、オープンリーディングフレームの転写物を含むサブゲノムＲＮＡの産生を制御する。
いくつかの実施形態では、第１のオープンリーディングフレームはサブゲノムプロモータの制御下にある。一実施形態では、第１のオープンリーディングフレームがサブゲノムプロモータの制御下にある場合、第１のオープンリーディングフレームによってコードされる遺伝子は、レプリコンおよびそのサブゲノム転写物の両方から発現され得る（後者は機能性アルファウイルス非構造タンパク質の存在下で）。それぞれがサブゲノムプロモータの制御下にある１つ以上のさらなるオープンリーディングフレームは、サブゲノムプロモータの制御下にあり得る第１のオープンリーディングフレームの下流に存在し得る。１つ以上のさらなるオープンリーディングフレームによって、例えば第２のオープンリーディングフレームによってコードされる遺伝子は、それぞれサブゲノムプロモータの制御下で、１つ以上のサブゲノム転写物から翻訳され得る。例えば、ＲＮＡレプリコンは、目的の第２のタンパク質をコードする転写物の産生を制御するサブゲノムプロモータを含み得る。
他の実施形態では、第１のオープンリーディングフレームはサブゲノムプロモータの制御下にない。一実施形態では、第１のオープンリーディングフレームがサブゲノムプロモータの制御下にない場合、第１のオープンリーディングフレームによってコードされる遺伝子はレプリコンから発現され得る。それぞれがサブゲノムプロモータの制御下にある１つ以上のさらなるオープンリーディングフレームは、第１のオープンリーディングフレームの下流に存在し得る。１つ以上のさらなるオープンリーディングフレームによってコードされる遺伝子は、サブゲノム転写物から発現され得る。
本発明によるレプリコンを含む細胞では、レプリコンは機能性非構造タンパク質によって増幅され得る。さらに、レプリコンがサブゲノムプロモータの制御下にある１つ以上のオープンリーディングフレームを含む場合、１つ以上のサブゲノム転写物は機能性非構造タンパク質によって生成されると予想される。
レプリコンが目的のタンパク質をコードする複数のオープンリーディングフレームを含む場合、各オープンリーディングフレームは異なるタンパク質をコードすることが好ましい。例えば、第２のオープンリーディングフレームによってコードされるタンパク質は、第１のオープンリーディングフレームによってコードされるタンパク質とは異なる。
本発明によるＲＮＡ分子の好ましい特徴
本発明によるＲＮＡ分子は、任意で、さらなる特徴、例えば５'キャップ、５'－ＵＴＲ、３'－ＵＴＲ、ポリ（Ａ）配列、および／またはコドン使用頻度の適合によって特徴付けられ得る。詳細を以下で説明する。
キャップ
いくつかの実施形態では、本発明によるレプリコンは５'キャップを含む。
「５'キャップ」、「キャップ」、「５'キャップ構造」、「キャップ構造」という用語は、前駆体メッセンジャＲＮＡなどのいくつかの真核生物一次転写物の５'末端に見出されるジヌクレオチドを指すために同義的に使用される。５'キャップは、（任意で修飾された）グアノシンが５'－５'三リン酸結合（または特定のキャップ類似体の場合は修飾三リン酸結合）を介してｍＲＮＡ分子の最初のヌクレオチドに結合している構造である。これらの用語は、従来のキャップまたはキャップ類似体を指す場合がある。
「５'キャップを含むＲＮＡ」または「５'キャップを備えたＲＮＡ」または「５'キャップで修飾されたＲＮＡ」または「キャップされたＲＮＡ」は、５'キャップを含むＲＮＡを指す。例えば、ＲＮＡに５'キャップを提供することは、前記５'キャップの存在下でのＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって達成され得、前記５'キャップは、生成されたＲＮＡ鎖に共転写的に組み込まれるか、または、例えばインビトロ転写によってＲＮＡが生成され得、５'キャップは、キャッピング酵素、例えばワクシニアウイルスのキャッピング酵素を使用して転写後にＲＮＡに結合され得る。キャップされたＲＮＡでは、（キャップされた）ＲＮＡ分子の最初の塩基の３'位置は、ホスホジエステル結合を介してＲＮＡ分子の次の塩基（「２番目の塩基」）の５'位置に連結される。
一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは５'キャップを含む。一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは５'キャップを含まない。
「従来の５'キャップ」という用語は、天然に存在する５'キャップ、好ましくは７－メチルグアノシンキャップを指す。７－メチルグアノシンキャップでは、キャップのグアノシンは修飾されたグアノシンであり、修飾は７位のメチル化からなる。
本発明の文脈において、「５'キャップ類似体」という用語は、従来の５'キャップに類似するが、好ましくはインビボおよび／または細胞内で、ＲＮＡに結合した場合にＲＮＡを安定化する能力を有するように修飾された分子構造を指す。キャップ類似体は従来の５'キャップではない。
真核生物のｍＲＮＡの場合、５'キャップは一般にｍＲＮＡの効率的な翻訳に関与すると記載されている：一般に、真核生物では、翻訳は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）が存在しない限り、メッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子の５'末端でのみ開始される。真核細胞は、核内での転写中にＲＮＡに５'キャップを提供することができる：新たに合成されたｍＲＮＡは通常、例えば転写物が２０～３０ヌクレオチドの長さに到達すると、５'キャップ構造で修飾される。最初に、５'末端ヌクレオチドｐｐｐＮ（ｐｐｐは三リン酸を表す；Ｎは任意のヌクレオシドを表す）は、ＲＮＡ ５'－トリホスファターゼおよびグアニリルトランスフェラーゼ活性を有するキャッピング酵素によって細胞内で５'ＧｐｐｐＮに変換される。ＧｐｐｐＮは、その後、（グアニン－７）－メチルトランスフェラーゼ活性を有する第２の酵素によって細胞内でメチル化されて、モノメチル化ｍ７ＧｐｐｐＮキャップを形成し得る。一実施形態では、本発明で使用される５'キャップは、天然の５'キャップである。
本発明では、天然の５'キャップジヌクレオチドは、典型的には、非メチル化キャップジヌクレオチド（Ｇ（５'）ｐｐｐ（５'）Ｎ；ＧｐｐｐＮとも称される）およびメチル化キャップジヌクレオチド（（ｍ７Ｇ（５'）ｐｐｐ（５'）Ｎ；ｍ７ＧｐｐｐＮとも称される）からなる群より選択される。ｍ７ＧｐｐｐＮ（ＮはＧである）は、以下の式で表される：
Figure 2023527910000001
本発明のキャップされたＲＮＡはインビトロで調製することができ、したがって、宿主細胞におけるキャッピング機構に依存しない。キャップされたＲＮＡをインビトロで作製するために最も頻繁に使用される方法は、４つ全てのリボヌクレオシド三リン酸およびｍ７Ｇ（５'）ｐｐｐ（５'）Ｇ（ｍ７ＧｐｐｐＧとも呼ばれる）などのキャップジヌクレオチドの存在下で、細菌またはバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼのいずれかでＤＮＡ鋳型を転写することである。ＲＮＡポリメラーゼは、次の鋳型ヌクレオシド三リン酸（ｐｐｐＮ）のα－リン酸上のｍ７ＧｐｐｐＧのグアノシン部分の３'－ＯＨによる求核攻撃で転写を開始し、中間体ｍ７ＧｐｐｐＧｐＮ（ＮはＲＮＡ分子の２番目の塩基である）をもたらす。競合するＧＴＰ開始産物ｐｐｐＧｐＮの形成は、インビトロ転写中のキャップ対ＧＴＰのモル比を５～１０に設定することによって抑制される。
本発明の好ましい実施形態では、５'キャップ（存在する場合）は５'キャップ類似体である。これらの実施形態は、ＲＮＡがインビトロ転写によって得られる、例えばインビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）である場合に特に適する。キャップ類似体は、最初に、インビトロ転写によってＲＮＡ転写物の大規模合成を促進すると記載されている。
メッセンジャＲＮＡについては、いくつかのキャップ類似体（合成キャップ）がこれまでに一般的に記載されており、それらは全て本発明の文脈で使用することができる。理想的には、より高い翻訳効率および／またはインビボ分解に対する増大した耐性および／またはインビトロ分解に対する増大した耐性に関連するキャップ類似体が選択される。
好ましくは、一方向でのみＲＮＡ鎖に組み込むことができるキャップ類似体が使用される。Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９５，ＲＮＡ Ｊ．，ｖｏｌ．，１，ｐｐ．９５７－９６７）は、インビトロ転写中に、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼが転写の開始のために７－メチルグアノシン単位を使用し、それによりキャップを有する転写物の約４０～５０％がキャップジヌクレオチドを逆方向に有する（すなわち、初期反応生成物はＧｐｐｐｍ７ＧｐＮである）ことを明らかにした。正しいキャップを有するＲＮＡと比較して、逆キャップを有するＲＮＡは、核酸配列のタンパク質への翻訳に関して機能的ではない。したがって、キャップを正しい方向に組み込むこと、すなわち、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＮなどに本質的に対応する構造を有するＲＮＡが得られることが望ましい。キャップジヌクレオチドの逆組み込みは、メチル化グアノシン単位の２'－ＯＨ基または３'－ＯＨ基のいずれかの置換によって阻害されることが示されている（Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００１；ＲＮＡ Ｊ．，ｖｏｌ．７，ｐｐ．１４８６－１４９５；Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．２４，ｐｐ．１６１－１６４）。そのような「アンチリバースキャップ類似体」の存在下で合成されるＲＮＡは、従来の５'キャップｍ７ＧｐｐｐＧの存在下でインビトロ転写されるＲＮＡよりも効率的に翻訳される。そのために、メチル化グアノシン単位の３'ＯＨ基がＯＣＨ３で置き換えられた１つのキャップ類似体が、例えばＨｏｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０８，ｐｐ．４００９－４０１７（７－メチル（３'－Ｏ－メチル）ＧｐｐｐＧ；アンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ））によって記載されている。ＡＲＣＡは、本発明による適切なキャップジヌクレオチドである。
Figure 2023527910000002
本発明の好ましい実施形態では、本発明のＲＮＡは、本質的にキャップ除去を受けにくい。一般に、培養哺乳動物細胞に導入された合成ｍＲＮＡから産生されるタンパク質の量は、ｍＲＮＡの自然分解によって制限されるため、これは重要である。ｍＲＮＡ分解の１つのインビボ経路は、ｍＲＮＡキャップの除去から始まる。この除去は、調節サブユニット（Ｄｃｐ１）および触媒サブユニット（Ｄｃｐ２）を含むヘテロ二量体ピロホスファターゼによって触媒される。触媒サブユニットは、三リン酸架橋のαリン酸基とβリン酸基との間を切断する。本発明では、この種の切断を受けないか、または受けにくいキャップ類似体が選択され得るか、または存在し得る。この目的のための適切なキャップ類似体は、式（Ｉ）：
Figure 2023527910000003
式（Ｉ）
に従うキャップジヌクレオチドから選択され得、
式中、Ｒ１は、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリール、および置換されていてもよいヘテロアリールからなる群より選択され、
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、ハロ、ＯＨおよび置換されていてもよいアルコキシからなる群より独立して選択されるか、またはＲ２およびＲ３は一緒になってＯ－Ｘ－Ｏを形成し、ここで、Ｘは、置換されていてもよいＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）およびＣ（ＣＨ３）２からなる群より選択されるか、またはＲ２は、Ｒ２が結合している環の４位の水素原子と結合して、－Ｏ－ＣＨ２－もしくはＣＨ２－Ｏを形成し、
Ｒ５は、Ｓ、ＳｅおよびＢＨ３からなる群より選択され、
Ｒ４およびＲ６は、Ｏ、Ｓ、ＳｅおよびＢＨ３からなる群より独立して選択される。
ｎは、１、２、または３である。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６の好ましい実施形態は、国際公開第２０１１／０１５３４７ Ａ１号に開示されており、本発明において適宜に選択され得る。
例えば、本発明の好ましい実施形態では、本発明のＲＮＡはホスホロチオエートキャップ類似体を含む。ホスホロチオエートキャップ類似体は、三リン酸鎖の３つの非架橋Ｏ原子の１つがＳ原子で置き換えられている、すなわち式（Ｉ）のＲ４、Ｒ５またはＲ６の１つがＳである特定のキャップ類似体である。ホスホロチオエートキャップ類似体は、Ｊ．Ｋｏｗａｌｓｋａ ｅｔ ａｌ．，２００８，ＲＮＡ，ｖｏｌ．１４，ｐｐ．１１１９－１１３１によって、望ましくないキャップ除去プロセスに対する解決策、したがってインビボでのＲＮＡの安定性を高めるための解決策として記載されている。特に、５'キャップのβリン酸基における硫黄原子を酸素原子に置換すると、Ｄｃｐ２に対する安定化をもたらす。本発明において好ましいその実施形態では、式（Ｉ）のＲ５はＳであり、Ｒ４およびＲ６はＯである。
本発明のさらなる好ましい実施形態では、本発明のＲＮＡは、ＲＮＡ ５'キャップのホスホロチオエート修飾が「アンチリバースキャップ類似体」（ＡＲＣＡ）修飾と組み合わされたホスホロチオエートキャップ類似体を含む。それぞれのＡＲＣＡ－ホスホロチオエートキャップ類似体は、国際公開第２００８／１５７６８８ Ａ２号に記載されており、それらは全て本発明のＲＮＡに使用することができる。その実施形態では、式（Ｉ）のＲ２またはＲ３の少なくとも一方はＯＨではなく、好ましくはＲ２およびＲ３の一方はメトキシ（ＯＣＨ３）であり、Ｒ２およびＲ３の他方は、好ましくはＯＨである。好ましい実施形態では、酸素原子は、βリン酸基において硫黄原子に置換される（したがって、式（Ｉ）のＲ５はＳであり、Ｒ４およびＲ６はＯである）。ＡＲＣＡのホスホロチオエート修飾は、α、β、およびγホスホロチオエート基が翻訳およびキャップ除去機構の両方でキャップ結合タンパク質の活性部位内に正確に配置されることを確実にすると考えられている。これらの類似体の少なくともいくつかは、本質的にピロホスファターゼＤｃｐ１／Ｄｃｐ２に耐性である。ホスホロチオエート修飾ＡＲＣＡは、ホスホロチオエート基を欠く対応するＡＲＣＡよりも、ｅＩＦ４Ｅに対してはるかに高い親和性を有すると記載された。
本発明において特に好ましいそれぞれのキャップ類似体、すなわちｍ２' ７，２'－ＯＧｐｐｓｐＧは、β－Ｓ－ＡＲＣＡと称される（国際公開第２００８／１５７６８８ Ａ２号；Ｋｕｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２０１０，ｖｏｌ．１７，ｐｐ．９６１－９７１）。したがって、本発明の一実施形態では、本発明のＲＮＡはβ－Ｓ－ＡＲＣＡで修飾される。β－Ｓ－ＡＲＣＡは以下の構造によって表される：
Figure 2023527910000004
β－Ｓ－ＡＲＣＡ
一般に、架橋リン酸塩の酸素原子を硫黄原子に置き換えると、ＨＰＬＣでのそれらの溶出パターンに基づいて、Ｄ１およびＤ２と称されるホスホロチオエートジアステレオマーをもたらす。簡単に言えば、β－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマー」または「β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）」は、β－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ２ジアステレオマー（β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ２））と比較して、ＨＰＬＣカラムで最初に溶出し、したがってより短い保持時間を示すβ－Ｓ－ＡＲＣＡのジアステレオマーである。ＨＰＬＣによる立体化学的配置の決定は、国際公開第２０１１／０１５３４７ Ａ１号に記載されている。
本発明の第１の特に好ましい実施形態では、本発明のＲＮＡは、β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ２）ジアステレオマーで修飾される。β－Ｓ－ＡＲＣＡの２つのジアステレオマーは、ヌクレアーゼに対する感受性が異なる。β－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ２ジアステレオマーを担持するＲＮＡは、Ｄｃｐ２切断に対してほぼ完全に耐性である（非修飾ＡＲＣＡ ５'キャップの存在下で合成されたＲＮＡと比較してわずか６％の切断）が、β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）５'キャップを有するＲＮＡは、Ｄｃｐ２切断に対して中程度の感受性を示す（７１％の切断）ことが示されている。さらに、Ｄｃｐ２切断に対する安定性の増加は、哺乳動物細胞におけるタンパク質発現の増加と相関することが示されている。特に、β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ２）キャップを担持するＲＮＡは、哺乳動物細胞においてβ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）キャップを担持するＲＮＡよりも効率的に翻訳されることが示されている。したがって、本発明の一実施形態では、本発明のＲＮＡは、β－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ２ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学的配置に対応する式（Ｉ）の置換基Ｒ５を含むＰ原子における立体化学的配置を特徴とする、式（Ｉ）に従うキャップ類似体で修飾される。その実施形態では、式（Ｉ）のＲ５はＳであり、Ｒ４およびＲ６はＯである。さらに、式（Ｉ）のＲ２またはＲ３の少なくとも一方は、好ましくはＯＨではなく、好ましくはＲ２およびＲ３の一方はメトキシ（ＯＣＨ３）であり、Ｒ２およびＲ３の他方は、好ましくはＯＨである。
第２の特に好ましい実施形態では、本発明のＲＮＡは、β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）ジアステレオマーで修飾される。この実施形態は、ワクチン接種目的などのための、キャップされたＲＮＡの未成熟抗原提示細胞への移入に特に適する。β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）ジアステレオマーは、それぞれキャップされたＲＮＡを未成熟抗原提示細胞に移入すると、ＲＮＡの安定性を高め、ＲＮＡの翻訳効率を高め、ＲＮＡの翻訳を延長し、ＲＮＡの総タンパク質発現を増加させ、および／または前記ＲＮＡによってコードされる抗原もしくは抗原ペプチドに対する免疫応答を増加させるのに特に適することが実証されている（Ｋｕｈｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，ｖｏｌ．１７，ｐｐ．９６１－９７１）。したがって、本発明の代替的な実施形態では、本発明のＲＮＡは、β－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学的配置に対応する式（Ｉ）の置換基Ｒ５を含むＰ原子における立体化学的配置を特徴とする、式（Ｉ）に従うキャップ類似体で修飾される。それぞれのキャップ類似体およびその実施形態は、国際公開第２０１１／０１５３４７ Ａ１号およびＫｕｈｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，ｖｏｌ．１７，ｐｐ．９６１－９７１に記載されている。置換基Ｒ５を含むＰ原子における立体化学的配置がβ－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学的配置に対応する、国際公開第２０１１／０１５３４７ Ａ１号に記載されている任意のキャップ類似体を本発明で使用し得る。好ましくは、式（Ｉ）のＲ５はＳであり、Ｒ４およびＲ６はＯである。さらに、式（Ｉ）のＲ２またはＲ３の少なくとも一方は、好ましくはＯＨではなく、好ましくはＲ２およびＲ３の一方はメトキシ（ＯＣＨ３）であり、Ｒ２およびＲ３の他方は、好ましくはＯＨである。
一実施形態では、本発明のＲＮＡは、いずれか１つのリン酸基がボラノリン酸基またはホスホセレノエート基によって置き換えられている、式（Ｉ）に従う５'キャップ構造で修飾される。そのようなキャップは、インビトロおよびインビボの両方で安定性が増加している。任意で、それぞれの化合物は２'－Ｏ－または３'－Ｏ－アルキル基を有する（アルキルは、好ましくはメチルである）；それぞれのキャップ類似体は、ＢＨ３－ＡＲＣＡまたはＳｅ－ＡＲＣＡと称される。ｍＲＮＡのキャッピングに特に適する化合物としては、国際公開第２００９／１４９２５３ Ａ２号に記載されている、β－ＢＨ３－ＡＲＣＡおよびβ－Ｓｅ－ＡＲＣＡが挙げられる。これらの化合物については、β－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学的配置に対応する、式（Ｉ）の置換基Ｒ５を含むＰ原子における立体化学的配置が好ましい。
ＵＴＲ
「非翻訳領域」または「ＵＴＲ」という用語は、転写されるがアミノ酸配列に翻訳されないＤＮＡ分子内の領域、またはｍＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子内の対応する領域に関する。非翻訳領域（ＵＴＲ）は、オープンリーディングフレームの５'側（上流）（５'－ＵＴＲ）および／またはオープンリーディングフレームの３'側（下流）（３'－ＵＴＲ）に存在し得る。
３'－ＵＴＲは、存在する場合、タンパク質コード領域の終止コドンの下流の、遺伝子の３'末端に位置するが、「３'－ＵＴＲ」という用語は、好ましくはポリ（Ａ）尾部を含まない。したがって、３'－ＵＴＲはポリ（Ａ）尾部（存在する場合）の上流にあり、例えばポリ（Ａ）尾部に直接隣接している。
５'－ＵＴＲは、存在する場合、タンパク質コード領域の開始コドンの上流の、遺伝子の５'末端に位置する。５'－ＵＴＲは、５'キャップ（存在する場合）の下流にあり、例えば５'キャップに直接隣接している。
５'および／または３'非翻訳領域は、本発明によれば、これらの領域が、オープンリーディングフレームを含むＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を高めるような方法でオープンリーディングフレームと結合されるように、前記オープンリーディングフレームに機能的に連結され得る。
いくつかの実施形態では、本発明によるＲＮＡレプリコンは、５'－ＵＴＲおよび／または３'－ＵＴＲを含む。
ＵＴＲは、ＲＮＡの安定性および翻訳効率に関与する。本明細書に記載の５'キャップおよび／または３'ポリ（Ａ）尾部に関する構造修飾に加えて、特定の５'および／または３'非翻訳領域（ＵＴＲ）を選択することによって、両方を改善することができる。ＵＴＲ内の配列エレメントは、一般に、翻訳効率（主に５'－ＵＴＲ）およびＲＮＡ安定性（主に３'－ＵＴＲ）に影響を及ぼすと理解されている。ＲＮＡレプリコンの翻訳効率および／または安定性を高めるために、活性な５'－ＵＴＲが存在することが好ましい。独立してまたはさらに、ＲＮＡレプリコンの翻訳効率および／または安定性を高めるために、活性な３'－ＵＴＲが存在することが好ましい。
第１の核酸配列（例えばＵＴＲ）に関して、「翻訳効率を高めるために活性な」および／または「安定性を高めるために活性な」という用語は、第１の核酸配列が、第２の核酸配列と共通の転写物において、前記第１の核酸配列の非存在下での前記第２の核酸配列の翻訳効率および／または安定性と比較して翻訳効率および／または安定性が増加するような方法で、前記第２の核酸配列の翻訳効率および／または安定性を改変することができることを意味する。
一実施形態では、本発明によるＲＮＡレプリコンは、機能性アルファウイルス非構造タンパク質が由来するアルファウイルスに対して異種または非天然である５'－ＵＴＲおよび／または３'－ＵＴＲを含む。これは、所望の翻訳効率およびＲＮＡ安定性に従って非翻訳領域を設計することを可能にする。したがって、異種または非天然ＵＴＲは高度の柔軟性を可能にし、この柔軟性は、天然のアルファウイルスＵＴＲと比較して有利である。
好ましくは、本発明によるＲＮＡレプリコンは、ウイルス起源ではない、特にアルファウイルス起源ではない５'－ＵＴＲおよび／または３'－ＵＴＲを含む。一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、真核生物の５'－ＵＴＲに由来する５'－ＵＴＲおよび／または真核生物の３'－ＵＴＲに由来する３'－ＵＴＲを含む。
本発明による５'－ＵＴＲは、任意でリンカーによって分離された、複数の核酸配列の任意の組合せを含み得る。本発明による３'－ＵＴＲは、任意でリンカーによって分離された、複数の核酸配列の任意の組合せを含み得る。
本発明による「リンカー」という用語は、２つの核酸配列を連結するために前記２つの核酸配列の間に付加される核酸配列に関する。リンカー配列に関する特定の制限はない。
３'－ＵＴＲは、典型的には２００～２０００ヌクレオチド、例えば５００～１５００ヌクレオチドの長さを有する。免疫グロブリンｍＲＮＡの３'非翻訳領域は比較的短い（約３００ヌクレオチド未満）が、他の遺伝子の３'非翻訳領域は比較的長い。例えば、ｔＰＡの３'非翻訳領域は約８００ヌクレオチド長であり、第ＶＩＩＩ因子の３'非翻訳領域は約１８００ヌクレオチド長であり、エリスロポエチンの３'非翻訳領域は約５６０ヌクレオチド長である。哺乳動物ｍＲＮＡの３'非翻訳領域は、典型的にはＡＡＵＡＡＡヘキサヌクレオチド配列として公知の相同領域を有する。この配列は、おそらくポリ（Ａ）付着シグナルであり、ポリ（Ａ）付着部位の１０～３０塩基上流に位置することが多い。３'－非翻訳領域は、エキソリボヌクレアーゼに対するバリアとして働くか、またはＲＮＡ安定性を高めることが公知のタンパク質（例えばＲＮＡ結合タンパク質）と相互作用するステムループ構造を与えるように折りたたむことができる、１つ以上の逆方向反復配列を含み得る。
ヒトβグロビン３'－ＵＴＲ、特にヒトβグロビン３'－ＵＴＲの２つの連続する同一のコピーは、高い転写物安定性および翻訳効率に寄与する（Ｈｏｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０８，ｐｐ．４００９－４０１７）。したがって、一実施形態では、本発明によるＲＮＡレプリコンは、ヒトβグロビン３'－ＵＴＲの２つの連続する同一のコピーを含む。したがって、これは、５'→３'方向に：（ａ）任意で５'－ＵＴＲ；（ｂ）オープンリーディングフレーム；（ｃ）３'－ＵＴＲを含み、前記３'－ＵＴＲは、ヒトβ－グロビン３'－ＵＴＲ、その断片、またはヒトβ－グロビン３'－ＵＴＲの変異体もしくはその断片の２つの連続する同一のコピーを含む。
一実施形態では、本発明によるＲＮＡレプリコンは、翻訳効率および／または安定性を高めるために活性であるが、ヒトβ－グロビン３'－ＵＴＲ、その断片、またはヒトβ－グロビン３'－ＵＴＲの変異体もしくはその断片ではない３'－ＵＴＲを含む。
一実施形態では、本発明によるＲＮＡレプリコンは、翻訳効率および／または安定性を高めるために活性な５'－ＵＴＲを含む。
ポリ（Ａ）配列
いくつかの実施形態では、本発明によるレプリコンは３'－ポリ（Ａ）配列を含む。レプリコンが保存された配列エレメント４（ＣＳＥ ４）を含む場合、レプリコンの３'－ポリ（Ａ）配列は、好ましくはＣＳＥ ４の下流に存在し、最も好ましくはＣＳＥ ４に直接隣接する。
本発明によれば、一実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２６個、好ましくは少なくとも４０個、好ましくは少なくとも８０個、好ましくは少なくとも１００個、および好ましくは最大５００個、好ましくは最大４００個、好ましくは最大３００個、好ましくは最大２００個、特に最大１５０個、特に最大約１２０個のＡヌクレオチドを含むか、または本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。この文脈において、「本質的に～からなる」とは、ポリ（Ａ）配列中のほとんどのヌクレオチド、典型的には「ポリ（Ａ）配列」中のヌクレオチド数で少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％がＡヌクレオチド（アデニル酸）であるが、残りのヌクレオチドが、Ｕヌクレオチド（ウリジル酸）、Ｇヌクレオチド（グアニル酸）、Ｃヌクレオチド（シチジル酸）などのＡヌクレオチド以外のヌクレオチドであることを許容することを意味する。この文脈において、「からなる」とは、ポリ（Ａ）配列中の全てのヌクレオチド、すなわちポリ（Ａ）配列中のヌクレオチド数の１００％がＡヌクレオチドであることを意味する。「Ａヌクレオチド」または「Ａ」という用語は、アデニル酸を指す。
実際に、約１２０個のＡヌクレオチドの３'ポリ（Ａ）配列は、トランスフェクトされた真核細胞中のＲＮＡのレベル、および３'ポリ（Ａ）配列の上流（５'側）に存在するオープンリーディングフレームから翻訳されるタンパク質のレベルに有益な影響を及ぼすことが実証されている（Ｈｏｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０８，ｐｐ．４００９－４０１７）。
アルファウイルスでは、少なくとも１１個の連続するアデニル酸残基、または少なくとも２５個の連続するアデニル酸残基の３'ポリ（Ａ）配列が、マイナス鎖の効率的な合成に重要であると考えられている。特に、アルファウイルスでは、少なくとも２５個の連続するアデニル酸残基の３'ポリ（Ａ）配列は、保存された配列エレメント４（ＣＳＥ ４）と共に機能して（－）鎖の合成を促進すると理解されている（Ｈａｒｄｙ＆Ｒｉｃｅ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００５，ｖｏｌ．７９，ｐｐ．４６３０－４６３９）。
本発明は、コード鎖に相補的な鎖内に反復ｄＴヌクレオチド（デオキシチミジル酸）を含むＤＮＡ鋳型に基づいて、ＲＮＡの転写中、すなわちインビトロ転写ＲＮＡの生成中に付着される３'ポリ（Ａ）配列を提供する。ポリ（Ａ）配列をコードするＤＮＡ配列（コード鎖）は、ポリ（Ａ）カセットと称される。
本発明の好ましい実施形態では、ＤＮＡのコード鎖に存在する３'ポリ（Ａ）カセットは、本質的にｄＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ）が均等に分布するランダムな配列によって中断されている。そのようなランダムな配列は、５～５０、好ましくは１０～３０、より好ましくは１０～２０ヌクレオチドの長さであり得る。そのようなカセットは、国際公開第２０１６／００５００４ Ａ１号に開示されている。国際公開第２０１６／００５００４ Ａ１号に開示されている任意のポリ（Ａ）カセットを本発明で使用し得る。本質的にｄＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ）が均等に分布し、例えば５～５０ヌクレオチドの長さを有するランダムな配列によって中断されているポリ（Ａ）カセットは、ＤＮＡレベルでは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるプラスミドＤＮＡの持続的な増殖を示し、ＲＮＡレベルでは、ＲＮＡの安定性および翻訳効率の支持に関して有益な特性と依然として関連している。
結果として、本発明の好ましい実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ分子に含まれる３'ポリ（Ａ）配列は、本質的にＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）が均等に分布するランダムな配列によって中断されている。そのようなランダムな配列は、５～５０、好ましくは１０～３０、より好ましくは１０～２０ヌクレオチドの長さであり得る。
コドン使用頻度
一般に、遺伝暗号の縮重は、同じコード能力を維持しながら、ＲＮＡ配列中に存在する特定のコドン（アミノ酸をコードする塩基トリプレット）を他のコドン（塩基トリプレット）で置換することを可能にする（置換するコドンは、置換されるコドンと同じアミノ酸をコードする）。本発明のいくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子に含まれるオープンリーディングフレームの少なくとも１つのコドンは、オープンリーディングフレームが由来する種のそれぞれのオープンリーディングフレーム内のそれぞれのコドンとは異なる。その実施形態では、オープンリーディングフレームのコード配列は「適合された」または「改変された」と言われる。レプリコンに含まれるオープンリーディングフレームのコード配列は適合され得る。
例えば、オープンリーディングフレームのコード配列を適合させる場合、高頻度で使用されるコドンを選択し得る：国際公開第２００９／０２４５６７ Ａ１号は、より高頻度で使用されるコドンによる希少なコドンの置換を含む、核酸分子のコード配列の適合を記載している。コドン使用頻度は宿主細胞または宿主生物に依存するので、この種の適合は、核酸配列を特定の宿主細胞または宿主生物における発現に適応させるのに適している。一般的に言えば、より高頻度で使用されるコドンは、典型的には宿主細胞または宿主生物においてより効率的に翻訳されるが、オープンリーディングフレームの全てのコドンの適合が必ずしも必要とされるわけではない。
例えば、オープンリーディングフレームのコード配列を適合させる場合、Ｇ（グアニル酸）残基およびＣ（シチジル酸）残基の含有量は、各アミノ酸について最も高いＧＣリッチ含有量を有するコドンを選択することによって変更し得る。ＧＣリッチなオープンリーディングフレームを有するＲＮＡ分子は、免疫活性化を低下させ、ＲＮＡの翻訳および半減期を改善する可能性を有することが報告された（Ｔｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２３，１４５７－１４６５）。
特に、非構造タンパク質のコード配列は、所望に応じて適合させることができる。非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームはレプリコンの５'複製認識配列と重複しないため、この自由度が可能である。
本発明の実施形態の安全性特徴
以下の特徴は、単独でまたは任意の適切な組合せで、本発明において好ましい：
好ましくは、本発明のレプリコンは粒子形成性ではない。これは、本発明のレプリコンによる宿主細胞の接種後、宿主細胞が、次世代ウイルス粒子などのウイルス粒子を産生しないことを意味する。一実施形態では、本発明によるＲＮＡレプリコンは、ウイルス構造タンパク質、例えばコアヌクレオカプシドプロテインＣ、エンベロープタンパク質Ｐ６２、および／またはエンベロープタンパク質Ｅ１などのアルファウイルス構造タンパク質をコードする遺伝情報を全く含まない。好ましくは、本発明によるレプリコンは、ウイルスパッケージングシグナル、例えばアルファウイルスパッケージングシグナルを含まない。例えば、ＳＦＶのｎｓＰ２のコード領域に含まれるアルファウイルスパッケージングシグナル（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．７２，ｐｐ．４３２０－４３２６）は、例えば欠失または突然変異によって除去し得る。アルファウイルスパッケージングシグナルを除去する適切な方法には、ｎｓＰ２のコード領域のコドン使用頻度の適合が含まれる。遺伝暗号の縮重は、コードされるｎｓＰ２のアミノ酸配列に影響を及ぼすことなく、パッケージングシグナルの機能を欠失させることを可能にし得る。
ＤＮＡ
本発明はまた、本発明によるＲＮＡレプリコンをコードする核酸配列を含むＤＮＡを提供する。
好ましくは、ＤＮＡは二本鎖である。
好ましい実施形態では、ＤＮＡはプラスミドである。本明細書で使用される「プラスミド」という用語は、一般に、染色体ＤＮＡとは独立して複製することができる染色体外遺伝物質の構築物、通常は環状ＤＮＡ二重鎖に関する。
本発明のＤＮＡは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識され得るプロモータを含み得る。これは、コードされるＲＮＡ、例えば本発明のＲＮＡのインビボまたはインビトロでの転写を可能にする。ＩＶＴベクターは、インビトロ転写の鋳型として標準化された方法で使用し得る。本発明による好ましいプロモータの例は、ＳＰ６、Ｔ３またはＴ７ポリメラーゼのプロモータである。
一実施形態では、本発明のＤＮＡは、単離された核酸分子である。
ＲＮＡを調製する方法
本発明によるＲＮＡ分子は、インビトロ転写によって得られ得る。インビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）は、本発明において特に興味深い。ＩＶＴ－ＲＮＡは、核酸分子（特にＤＮＡ分子）からの転写によって得ることができる。本発明のＤＮＡ分子（１つ以上）は、特にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識され得るプロモータを含む場合、そのような目的に適する。
本発明によるＲＮＡは、インビトロで合成することができる。これは、インビトロ転写反応にキャップ類似体を添加することを可能にする。典型的には、ポリ（Ａ）尾部は、ＤＮＡ鋳型上のポリ（ｄＴ）配列によってコードされる。あるいは、キャッピングおよびポリ（Ａ）尾部の付加は、転写後に酵素的に達成することができる。
インビトロ転写の方法は当業者に公知である。例えば、国際公開第２０１１／０１５３４７ Ａ１号に記載されているように、様々なインビトロ転写キットが市販されている。
キット
本発明はまた、本発明によるＲＮＡレプリコンを含むキットを提供する。
一実施形態では、キットの構成要素は別個の実体として存在する。例えば、キットの１つの構成要素が１つの実体に存在してもよく、キットの別の構成要素が別の実体に存在してもよい。例えば、開放容器または閉鎖容器は適切な実体である。閉鎖容器が好ましい。使用される容器は、好ましくはＲＮアーゼ不含であるかまたは本質的にＲＮアーゼ不含であるべきである。
一実施形態では、本発明のキットは、細胞の接種および／またはヒトもしくは動物対象への投与のためのＲＮＡを含む。
本発明によるキットは、任意でラベルまたは他の形態の情報要素、例えば電子データキャリアを含む。ラベルまたは情報要素は、好ましくは指示書、例えば印刷された書面による指示書、または任意で印刷可能な電子形式の指示書を含む。指示書は、キットの少なくとも１つの適切で可能な使用に言及し得る。
医薬組成物
本明細書に記載のＲＮＡレプリコンは、医薬組成物の形態で存在し得る。本発明による医薬組成物は、本発明による少なくとも１つの核酸分子を含み得る。本発明による医薬組成物は、薬学的に許容される希釈剤および／または薬学的に許容される賦形剤および／または薬学的に許容される担体および／または薬学的に許容されるビヒクルを含む。薬学的に許容される担体、ビヒクル、賦形剤または希釈剤の選択は特に限定されない。当技術分野で公知の任意の適切な薬学的に許容される担体、ビヒクル、賦形剤または希釈剤を使用し得る。
本発明の一実施形態では、医薬組成物は、水性溶媒またはＲＮＡの完全性を保存することを可能にする任意の溶媒などの溶媒をさらに含むことができる。好ましい実施形態では、医薬組成物は、ＲＮＡを含む水溶液である。水性組成物は、任意で溶質、例えば塩を含み得る。
本発明の一実施形態では、医薬組成物は凍結乾燥組成物の形態である。凍結乾燥組成物は、それぞれの水性組成物を凍結乾燥することによって得られる。
一実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１つのカチオン性実体を含む。一般に、カチオン性脂質、カチオン性ポリマーおよび正電荷を有する他の物質は、負に帯電した核酸と複合体を形成し得る。カチオン性化合物、好ましくは、例えばカチオン性またはポリカチオン性ペプチドまたはタンパク質などのポリカチオン性化合物との複合体化によって、本発明によるＲＮＡを安定化することが可能である。一実施形態では、本発明による医薬組成物は、プロタミン、ポリエチレンイミン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｌ－アルギニン、ヒストンまたはカチオン性脂質からなる群より選択される少なくとも１つのカチオン性分子を含む。
本発明によれば、カチオン性脂質は、カチオン性両親媒性分子、例えば少なくとも１つの親水性および親油性部分を含む分子である。カチオン性脂質は、モノカチオン性またはポリカチオン性であり得る。カチオン性脂質は、典型的には、ステロール鎖、アシル鎖またはジアシル鎖などの親油性部分を有し、全体として正味の正電荷を有する。脂質の頭部基は、典型的には正電荷を担持する。カチオン性脂質は、好ましくは１～１０価の正電荷、より好ましくは１～３価の正電荷、より好ましくは１価の正電荷を有する。カチオン性脂質の例としては、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２－ジアシルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン、１，２－ジアルキルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン、ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２－ジミリストイルオキシプロピル－１，３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、および２，３－ジオレオイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキシアミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパナミウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。カチオン性脂質には、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）を含む第三級アミン基を有する脂質も含まれる。カチオン性脂質は、リポソーム、エマルジョンおよびリポプレックスなどの本明細書に記載の脂質製剤にＲＮＡを製剤化するのに適している。典型的には、正電荷には少なくとも１つのカチオン性脂質が寄与し、負電荷にはＲＮＡが寄与する。一実施形態では、医薬組成物は、カチオン性脂質に加えて、少なくとも１つのヘルパー脂質を含む。ヘルパー脂質は、中性またはアニオン性脂質であり得る。ヘルパー脂質は、リン脂質などの天然脂質、または天然脂質の類似体、または完全合成脂質、または天然脂質と類似性のない脂質様分子であり得る。医薬組成物がカチオン性脂質とヘルパー脂質の両方を含む場合、カチオン性脂質対中性脂質のモル比は、製剤の安定性などを考慮して適切に決定することができる。
一実施形態では、本発明による医薬組成物はプロタミンを含む。本発明によれば、プロタミンはカチオン性担体剤として有用である。「プロタミン」という用語は、アルギニンに富み、魚類などの動物の精子細胞中で体細胞ヒストンの代わりに特にＤＮＡと会合して見出される、比較的低分子量の様々な強塩基性タンパク質のいずれかを指す。特に、「プロタミン」という用語は、強塩基性で、水に可溶性であり、熱によって凝固せず、複数のアルギニンモノマーを含む、魚類の精子中で見出されるタンパク質を指す。本発明によれば、本明細書で使用される「プロタミン」という用語は、その断片を含む、天然源または生物源から得られるまたはそれに由来する任意のプロタミンアミノ酸配列、および前記アミノ酸配列またはその断片の多量体形態を含むことが意図されている。さらに、この用語は、人工であり、特定の目的のために特別に設計され、天然源または生物源から単離することができない（合成された）ポリペプチドを包含する。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、１つ以上のアジュバントを含み得る。免疫系の応答を刺激するためにアジュバントをワクチンに添加し得る；アジュバントは、典型的にはそれ自体免疫を提供しない。例示的なアジュバントとしては、限定されないが、以下が挙げられる：無機化合物（例えばミョウバン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、水酸化リン酸カルシウム）；鉱油（例えばパラフィン油）、サイトカイン（例えばＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－１２）；免疫刺激性ポリヌクレオチド（ＲＮＡもしくはＤＮＡ；例えばＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドなど）；サポニン（例えばキラヤ（Ｑｕｉｌｌａｊａ）、ダイズ、セネガ（Ｐｏｌｙｇａｌａ ｓｅｎｅｇａ）由来の植物サポニン）；油エマルジョンもしくはリポソーム；ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル製剤；ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）；ムラミルペプチド；イミダゾキノロン化合物；チオセミカルバゾン化合物；Ｆｌｔ３リガンド（国際公開第２０１０／０６６４１８ Ａ１号）；または当業者に公知の任意の他のアジュバント。本発明によるＲＮＡの投与のための好ましいアジュバントは、Ｆｌｔ３リガンド（国際公開第２０１０／０６６４１８ Ａ１号）である。Ｆｌｔ３リガンドを、抗原をコードするＲＮＡと共に投与すると、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の強い増加が観察され得る。
本発明による医薬組成物は緩衝することができる（例えば酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液を用いて）。
ＲＮＡ含有粒子
いくつかの実施形態では、保護されていないＲＮＡの不安定性のために、本発明のＲＮＡ分子を複合体または封入形態で提供することが有利である。それぞれの医薬組成物が本発明において提供される。特に、いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、核酸含有粒子、好ましくはＲＮＡ含有粒子を含む。それぞれの医薬組成物は、粒子製剤と称される。本発明による粒子製剤では、粒子は、本発明による核酸と、核酸の送達に適した薬学的に許容される担体または薬学的に許容されるビヒクルとを含む。核酸含有粒子は、例えば、タンパク質性粒子の形態または脂質含有粒子の形態であり得る。適切なタンパク質または脂質は、粒子形成剤と称される。タンパク質性粒子および脂質含有粒子は、粒子形態のアルファウイルスＲＮＡの送達に適することが以前に記載されている（例えばＳｔｒａｕｓｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．４９１－５６２）。特に、アルファウイルス構造タンパク質（例えばヘルパーウイルスによって提供される）は、タンパク質性粒子の形態でＲＮＡを送達するための適切な担体である。
一実施形態では、本発明の粒子製剤は、ナノ粒子製剤である。その実施形態では、本発明による組成物は、ナノ粒子の形態の本発明による核酸を含む。ナノ粒子製剤は、様々なプロトコルによって、および様々な複合体化化合物を用いて得ることができる。脂質、ポリマー、オリゴマー、または両親媒性物質は、ナノ粒子製剤の典型的な構成成分である。
本明細書で使用される場合、「ナノ粒子」という用語は、粒子を、特に核酸の全身投与、特に非経口投与に適したものにする直径、典型的には１０００ナノメートル（ｎｍ）以下の直径を有する任意の粒子を指す。一実施形態では、ナノ粒子は、約５０ｎｍ～約１０００ｎｍ、好ましくは約５０ｎｍ～約４００ｎｍ、好ましくは約１００ｎｍ～約３００ｎｍ、例えば約１５０ｎｍ～約２００ｎｍの範囲の平均直径を有する。一実施形態では、ナノ粒子は、約２００～約７００ｎｍ、約２００～約６００ｎｍ、好ましくは約２５０～約５５０ｎｍ、特に約３００～約５００ｎｍまたは約２００～約４００ｎｍの範囲の直径を有する。
一実施形態では、動的光散乱によって測定される、本明細書に記載のナノ粒子の多分散指数（ＰＩ）は、０．５以下、好ましくは０．４以下、さらにより好ましくは０．３以下である。「多分散指数」（ＰＩ）は、粒子混合物中の個々の粒子（リポソームなど）の均一または不均一なサイズ分布の測定値であり、混合物中の粒子分布の幅を示す。ＰＩは、例えば、国際公開第２０１３／１４３５５５ Ａ１号に記載されているように決定することができる。
本明細書で使用される場合、「ナノ粒子製剤」という用語または同様の用語は、少なくとも１つのナノ粒子を含む任意の粒子製剤を指す。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、ナノ粒子の均一な集合体である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、リポソーム製剤またはエマルジョンなどの脂質含有医薬製剤である。
脂質含有医薬組成物
一実施形態では、本発明の医薬組成物は、少なくとも１つの脂質を含む。好ましくは、少なくとも１つの脂質はカチオン性脂質である。前記脂質含有医薬組成物は、本発明による核酸を含む。一実施形態では、本発明による医薬組成物は、小胞、例えばリポソームに封入されたＲＮＡを含む。一実施形態では、本発明による医薬組成物は、エマルジョンの形態のＲＮＡを含む。一実施形態では、本発明による医薬組成物は、カチオン性化合物との複合体中にＲＮＡを含み、それにより、例えばいわゆるリポプレックスまたはポリプレックスを形成する。リポソームなどの小胞内へのＲＮＡの封入は、例えば脂質／ＲＮＡ複合体とは異なる。脂質／ＲＮＡ複合体は、例えばＲＮＡを、例えばあらかじめ形成されたリポソームと混合する場合に得られる。
一実施形態では、本発明による医薬組成物は、小胞に封入されたＲＮＡを含む。そのような製剤は、本発明による特定の粒子製剤である。小胞は、球状の殻に取り巻かれた脂質二重層であり、小さな空間を囲み、その空間を小胞の外側の空間から分離する。典型的には、小胞内部の空間は水性空間であり、すなわち水を含む。典型的には、小胞の外側の空間は水性空間であり、すなわち水を含む。脂質二重層は、１つ以上の脂質（小胞形成脂質）によって形成される。小胞を取り囲む膜は、細胞膜のものと類似のラメラ相である。本発明による小胞は、多層小胞、単層小胞、またはそれらの混合物であり得る。小胞に封入されると、ＲＮＡは、典型的には外部媒体から分離される。したがって、ＲＮＡは、天然アルファウイルスの保護された形態と機能的に同等の、保護された形態で存在する。適切な小胞は、本明細書に記載の粒子、特にナノ粒子である。
例えば、ＲＮＡはリポソームに封入され得る。その実施形態では、医薬組成物はリポソーム製剤であるか、またはリポソーム製剤を含む。リポソーム内への封入は、典型的には、ＲＮＡをＲＮアーゼ消化から保護する。リポソームは一部の外部ＲＮＡを含む（例えばその表面に）が、ＲＮＡの少なくとも半分（理想的にはその全て）がリポソームのコア内に封入されることが可能である。
リポソームは、しばしばリン脂質などの小胞形成脂質の１つ以上の二重層を有する微視的脂質小胞であり、薬物、例えばＲＮＡを封入することができる。多重層小胞（ＭＬＶ）、小型単層小胞（ＳＵＶ）、大型単層小胞（ＬＵＶ）、立体的に安定化されたリポソーム（ＳＳＬ）、多小胞性小胞（ＭＶ）および大型多小胞性小胞（ＬＭＶ）、ならびに当技術分野で公知の他の二重層形態を含むがこれらに限定されない、様々な種類のリポソームを本発明に関連して使用し得る。リポソームのサイズおよびラメラ性は、調製方法に依存する。ラメラ相、六方晶相および逆六方晶相、立方相、ミセル、単層からなる逆ミセルを含む、脂質が水性媒体中に存在し得るいくつかの他の形態の超分子構造が存在する。これらの相は、ＤＮＡまたはＲＮＡと組み合わせて得ることもでき、ＲＮＡおよびＤＮＡとの相互作用は、相状態に実質的に影響を及ぼし得る。そのような相は、本発明のナノ粒子ＲＮＡ製剤中に存在し得る。
リポソームは、当業者に公知の標準的な方法を使用して形成され得る。それぞれの方法には、逆蒸発法、エタノール注入法、脱水－再水和法、超音波処理または他の適切な方法が含まれる。リポソームの形成後に、リポソームをサイズ分類して、実質的に均一なサイズ範囲を有するリポソームの集団を得ることができる。
本発明の好ましい実施形態では、ＲＮＡは、少なくとも１つのカチオン性脂質を含むリポソーム中に存在する。それぞれのリポソームは、少なくとも１つのカチオン性脂質が使用されることを条件として、単一の脂質からまたは脂質の混合物から形成され得る。好ましいカチオン性脂質は、プロトン化され得る窒素原子を有し、好ましくは、そのようなカチオン性脂質は、第三級アミン基を有する脂質である。第三級アミン基を有する特に適切な脂質は、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）である。一実施形態では、本発明によるＲＮＡは、国際公開第２０１２／００６３７８ Ａ１号に記載されているリポソーム製剤中に存在し、リポソームは、ＲＮＡを含む水性コアを封入する脂質二重層を有し、脂質二重層は、好ましくは第三級アミン基を有する、５．０～７．６の範囲のｐＫａを有する脂質を含む。第三級アミン基を有する好ましいカチオン性脂質には、ＤＬｉｎＤＭＡ（ｐＫａ ５．８）が含まれ、国際公開第２０１２／０３１０４６ Ａ２号に一般的に記載されている。国際公開第２０１２／０３１０４６ Ａ２号によれば、それぞれの化合物を含むリポソームは、ＲＮＡの封入、したがってＲＮＡのリポソーム送達に特に適する。一実施形態では、本発明によるＲＮＡはリポソーム製剤中に存在し、リポソームは、その頭部基が、プロトン化され得る少なくとも１つの窒素原子（Ｎ）を含む少なくとも１つのカチオン性脂質を含み、リポソームおよびＲＮＡは、１：１～２０：１のＮ：Ｐ比を有する。本発明によれば、「Ｎ：Ｐ比」は、国際公開第２０１３／００６８２５ Ａ１号に記載されているように、カチオン性脂質中の窒素原子（Ｎ）対脂質含有粒子（例えばリポソーム）に含まれるＲＮＡ中のリン酸原子（Ｐ）のモル比を指す。１：１～２０：１のＮ：Ｐ比は、リポソームの正味電荷および脊椎動物細胞へのＲＮＡの送達効率に関与する。
一実施形態では、本発明によるＲＮＡは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む少なくとも１つの脂質を含むリポソーム製剤中に存在し、ＲＮＡは、国際公開第２０１２／０３１０４３ Ａ１号および国際公開第２０１３／０３３５６３ Ａ１号に記載されているように、ＰＥＧ部分がリポソームの外側に存在するようにＰＥＧ化リポソーム内に封入される。
一実施形態では、本発明によるＲＮＡは、国際公開第２０１２／０３０９０１ Ａ１号に記載されているように、リポソームが６０～１８０ｎｍの範囲の直径を有するリポソーム製剤中に存在する。
一実施形態では、本発明によるＲＮＡは、国際公開第２０１３／１４３５５５ Ａ１号に開示されているように、ＲＮＡ含有リポソームがゼロに近いまたは負の正味電荷を有するリポソーム製剤中に存在する。
他の実施形態では、本発明によるＲＮＡはエマルジョンの形態で存在する。エマルジョンは、ＲＮＡ分子などの核酸分子を細胞に送達するために使用されることが以前に記載されている。本明細書では、水中油型エマルジョンが好ましい。それぞれのエマルジョン粒子は、油コアおよびカチオン性脂質を含む。本発明によるＲＮＡがエマルジョン粒子に複合体化されているカチオン性水中油型エマルジョンがより好ましい。エマルジョン粒子は、油コアおよびカチオン性脂質を含む。カチオン性脂質は負に帯電したＲＮＡと相互作用することができ、それによってＲＮＡをエマルジョン粒子に固定する。水中油型エマルジョンでは、エマルジョン粒子は水性連続相に分散している。例えば、エマルジョン粒子の平均直径は、典型的には約８０ｎｍ～１８０ｎｍであり得る。一実施形態では、本発明の医薬組成物は、国際公開第２０１２／００６３８０ Ａ２号に記載されているように、エマルジョン粒子が油コアおよびカチオン性脂質を含む、カチオン性水中油型エマルジョンである。本発明によるＲＮＡは、国際公開第２０１３／００６８３４ Ａ１号に記載されているように、エマルジョンのＮ：Ｐ比が少なくとも４：１である、カチオン性脂質を含むエマルジョンの形態で存在し得る。本発明によるＲＮＡは、国際公開第２０１３／００６８３７ Ａ１号に記載されているように、カチオン性脂質エマルジョンの形態で存在し得る。特に、組成物は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体化したＲＮＡを含んでもよく、油／脂質の比は少なくとも約８：１（モル：モル）である。
他の実施形態では、本発明による医薬組成物は、リポプレックスの形式のＲＮＡを含む。「リポプレックス」または「ＲＮＡリポプレックス」という用語は、脂質と、ＲＮＡなどの核酸との複合体を指す。リポプレックスは、カチオン性（正に帯電した）リポソームおよびアニオン性（負に帯電した）核酸から形成され得る。カチオン性リポソームは、中性の「ヘルパー」脂質も含み得る。最も単純な場合には、特定の混合プロトコルで核酸とリポソームとを混合することによってリポプレックスが自発的に形成されるが、他の様々なプロトコルも適用し得る。正に帯電したリポソームと負に帯電した核酸との間の静電的相互作用が、リポプレックス形成の駆動力であることが理解されている（国際公開第２０１３／１４３５５５ Ａ１号）。本発明の一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子の正味電荷はゼロに近いかまたは負である。ＲＮＡおよびリポソームの電気的に中性または負に帯電したリポプレックスは、全身投与後に脾臓樹状細胞（ＤＣ）における実質的なＲＮＡ発現をもたらし、正に帯電したリポソームおよびリポプレックスについて報告されている毒性の増加には関連しないことが公知である（国際公開第２０１３／１４３５５５ Ａ１号参照）。したがって、本発明の一実施形態では、本発明による医薬組成物は、（ｉ）ナノ粒子中の正電荷の数がナノ粒子中の負電荷の数を超えず、および／または（ｉｉ）ナノ粒子が中性もしくは正味の負電荷を有し、および／または（ｉｉｉ）ナノ粒子の正電荷対負電荷の電荷比が１．４：１以下であり、および／または（ｉｖ）ナノ粒子のゼータ電位が０以下である、ナノ粒子、好ましくはリポプレックスナノ粒子の形式のＲＮＡを含む。国際公開第２０１３／１４３５５５ Ａ１号に記載されているように、ゼータ電位は、コロイド系の界面動電位の科学用語である。本発明では、（ａ）ゼータ電位および（ｂ）ナノ粒子中のＲＮＡに対するカチオン性脂質の電荷比は、両方とも、国際公開第２０１３／１４３５５５ Ａ１号に開示されているように計算することができる。要約すると、国際公開第２０１３／１４３５５５ Ａ１号に開示されているように、粒子の正味電荷がゼロに近いかまたは負である、定義された粒径を有するナノ粒子リポプレックス製剤である医薬組成物が、本発明の文脈において好ましい医薬組成物である。
タンパク質を生成するための方法
本発明はまた、細胞内で目的のタンパク質を生成するための方法であって、
（ａ）目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む本発明によるＲＮＡレプリコンを得る工程、および
（ｂ）ＲＮＡレプリコンを細胞に接種する工程
を含む方法を提供する。
本方法の様々な実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、機能性非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームおよび目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、機能性非構造タンパク質によって複製され得る限り、本発明のＲＮＡレプリコンについて上記で定義された通りである。
１つ以上の核酸分子を接種することができる細胞は、「宿主細胞」と称され得る。本発明によれば、「宿主細胞」という用語は、外因性核酸分子で形質転換またはトランスフェクトすることができる任意の細胞を指す。「細胞」という用語は、好ましくは無傷の細胞、すなわち酵素、細胞小器官、または遺伝物質などのその正常な細胞内成分を放出していない無傷の膜を有する細胞である。無傷の細胞は、好ましくは生存可能な細胞、すなわちその正常な代謝機能を実行することができる生細胞である。「宿主細胞」という用語は、本発明によれば、原核細胞（例えば大腸菌）または真核細胞（例えばヒトおよび動物細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞）を含む。ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジおよびヤギを含む家畜、ならびに霊長動物由来の細胞などの哺乳動物細胞が特に好ましい。細胞は、多数の組織型に由来してもよく、初代細胞および細胞株を含み得る。具体的な例としては、ケラチノサイト、末梢血白血球、骨髄幹細胞および胚性幹細胞が挙げられる。他の実施形態では、宿主細胞は、抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球またはマクロファージである。核酸は、単一またはいくつかのコピーで宿主細胞中に存在してもよく、一実施形態では、宿主細胞で発現される。
細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。原核細胞は、本明細書では、例えば本発明によるＤＮＡの増殖に適しており、真核細胞は、本明細書では、例えばレプリコンのオープンリーディングフレームの発現に適している。
本発明の方法では、本発明によるＲＮＡレプリコン、または本発明によるキット、または本発明による医薬組成物のいずれかを使用することができる。ＲＮＡは、医薬組成物の形態で、または例えばエレクトロポレーションのための裸のＲＮＡとして使用することができる。
本発明に従って細胞内でタンパク質を生成する方法では、細胞は抗原提示細胞であり得、この方法は、抗原をコードするＲＮＡを発現させるために使用し得る。この目的のために、本発明は、抗原をコードするＲＮＡを樹状細胞などの抗原提示細胞に導入することを含み得る。樹状細胞などの抗原提示細胞のトランスフェクションには、抗原をコードするＲＮＡを含む医薬組成物を使用し得る。
一実施形態では、細胞内でタンパク質を生成する方法は、インビトロ法である。一実施形態では、細胞内でのタンパク質生成のための方法は、手術または治療法によるヒトまたは動物対象からの細胞の除去を含まない。
この実施形態では、本発明に従って接種された細胞は、対象においてタンパク質を生成し、対象にタンパク質を提供するために対象に投与され得る。細胞は、対象に関して自己、同系、同種異系または異種であり得る。
他の実施形態では、細胞内でタンパク質を生成する方法における細胞は、患者などの対象に存在し得る。これらの実施形態では、細胞内でタンパク質を生成する方法は、ＲＮＡ分子を対象に投与することを含むインビボ法である。
この点で、本発明はまた、対象において目的のタンパク質を生成するための方法であって、
（ａ）目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む本発明によるＲＮＡレプリコンを得る工程、および
（ｂ）ＲＮＡレプリコンを対象に投与する工程
を含む方法を提供する。
本方法の様々な実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、機能性非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームおよび目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、機能性非構造タンパク質によって複製され得る限り、本発明のＲＮＡレプリコンについて上記で定義された通りである。
本発明によるＲＮＡレプリコン、または本発明によるキット、または本発明による医薬組成物のいずれも、本発明に従って対象において細タンパク質を生成する方法で使用することができる。例えば、本発明の方法では、ＲＮＡは、例えば本発明に記載されるように医薬組成物の形式で、または裸のＲＮＡとして使用することができる。
対象に投与される能力を考慮して、本発明によるＲＮＡレプリコン、または本発明によるキット、または本発明による医薬組成物のそれぞれは、「薬剤」などと称され得る。本発明は、本発明のＲＮＡレプリコン、キット、医薬組成物が薬剤として使用するために提供されることを予測する。薬剤は、対象を治療するために使用することができる。「治療する」とは、本明細書に記載の化合物または組成物または他の実体を対象に投与することを意味する。この用語は、療法によるヒトまたは動物の身体の治療のための方法を含む。
上記の薬剤は、典型的にはＤＮＡを含まず、したがって、先行技術（例えば国際公開第２００８／１１９８２７ Ａ１号）に記載されているＤＮＡワクチンと比較してさらなる安全性の特徴と関連する。
本発明による代替的な医学的用途は、本発明に従って細胞内でタンパク質を生成するための方法を含み、細胞は樹状細胞などの抗原提示細胞であり得、続いて前記細胞を対象に導入する。例えば、抗原などの薬学的に活性なタンパク質をコードするＲＮＡを、エクスビボで抗原提示細胞、例えば対象から採取された抗原提示細胞に導入（トランスフェクト）してもよく、任意でエクスビボでクローン増殖させた抗原提示細胞を、同じかまたは異なる対象に再導入し得る。トランスフェクトされた細胞は、当技術分野で公知の任意の手段を使用して対象に再導入し得る。
本発明による薬剤は、それを必要とする対象に投与し得る。本発明の薬剤は、対象の治療の予防的および治療的方法において使用することができる。
本発明による薬剤は、有効量で投与される。「有効量」は、単独で、または他の用量と共に、反応または所望の効果を生じさせるのに十分な量に関する。対象における特定の疾患または特定の状態の治療の場合、所望の効果は、疾患進行の阻害である。これは、疾患進行の減速、特に疾患進行の中断を含む。疾患または状態の治療における所望の効果はまた、疾患の発症の遅延または疾患の発症の阻害であり得る。
有効量は、治療される状態、疾患の重症度、年齢、生理学的状態、サイズおよび体重を含む患者の個々のパラメータ、治療の期間、付随する治療の種類（存在する場合）、特定の投与方法ならびに他の因子に依存する。
ワクチン接種
「免疫化」または「ワクチン接種」という用語は、一般に、治療上または予防上の理由で対象を治療するプロセスを指す。治療、特に予防的治療は、好ましくは、例えば１つ以上の抗原に対する対象の免疫応答を誘導または増強することを目的とする治療であるか、またはそれを含む。本発明によれば、本明細書に記載のＲＮＡを使用することによって免疫応答を誘導または増強することを所望する場合、免疫応答は、ＲＮＡによって誘発または増強され得る。一実施形態では、本発明は、好ましくは対象のワクチン接種であるかまたはそれを含む予防的治療を提供する。レプリコンが、目的のタンパク質として、免疫学的に活性な化合物または抗原である薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質をコードする本発明の実施形態は、ワクチン接種に特に有用である。
病原体または癌を含む外来因子に対するワクチン接種のためのＲＮＡは以前に記載されている（Ｕｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｖａｃｃｉｎｅ，ｖｏｌ．３０，ｐｐ．４４１４－４４１８によって総説されている）。先行技術の一般的なアプローチとは対照的に、本発明によるレプリコンは、本明細書に記載の機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって複製される能力のために、効率的なワクチン接種に特に適した要素である。本発明によるワクチン接種は、例えば弱免疫原性タンパク質に対する免疫応答の誘導に使用することができる。本発明によるＲＮＡワクチンの場合、タンパク質抗原は決して血清抗体に曝露されず、ＲＮＡの翻訳後にトランスフェクト細胞自体によって産生される。したがって、アナフィラキシーは問題ではないはずである。したがって、本発明は、アレルギー反応のリスクなしに患者の反復免疫化を可能にする。
本発明に従うワクチン接種を含む方法では、本発明の薬剤は、特に抗原が関与する疾患を有するか、または抗原が関与する疾患に罹患する危険性がある対象を治療することを所望する場合に、対象に投与される。
本発明に従うワクチン接種を含む方法では、本発明によるレプリコンによってコードされる目的のタンパク質は、例えば、免疫応答が向けられる細菌抗原、または免疫応答が向けられるウイルス抗原、または免疫応答が向けられる癌抗原、または免疫応答が向けられる単細胞生物の抗原をコードする。ワクチン接種の有効性は、生物由来の抗原特異的ＩｇＧ抗体の測定などの公知の標準的な方法によって評価することができる。本発明に従うアレルゲン特異的免疫療法を含む方法では、本発明によるレプリコンによってコードされる目的のタンパク質は、アレルギーに関連する抗原をコードする。アレルゲン特異的免疫療法（減感作としても公知）は、原因アレルゲンへのその後の曝露に関連する症状が緩和された状態を達成するために、１つ以上のアレルギーを有する生物に、好ましくは漸増用量のアレルゲンワクチンを投与することと定義される。アレルゲン特異的免疫療法の有効性は、生物由来のアレルゲン特異的ＩｇＧおよびＩｇＥ抗体の測定などの公知の標準的な方法によって評価することができる。
本発明の薬剤は、例えば対象のワクチン接種を含む対象の治療のために、対象に投与することができる。
「対象」という用語は、脊椎動物、特に哺乳動物に関する。例えば、本発明の文脈における哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長動物、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマ等のような飼いならされた哺乳動物、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等のような実験動物、ならびに動物園の動物などの捕らわれている動物である。「対象」という用語はまた、鳥類（特にニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウなどの飼いならされた鳥）、および魚類（特に養殖魚、例えばサケまたはナマズ）などの非哺乳類脊椎動物にも関する。本明細書で使用される「動物」という用語は、ヒトも含む。
いくつかの実施形態では、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマ、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウなどの家畜、または野生動物、例えばキツネへの投与が好ましい。例えば、本発明による予防的ワクチン接種は、例えば農業における動物集団または野生動物集団にワクチン接種するのに適し得る。愛玩動物または動物園の動物などの捕らわれている他の動物集団にワクチン接種し得る。
対象に投与される場合、薬剤として使用されるレプリコンは、好ましくは、治療される対象が属する種または属に感染性である種類のウイルス、例えばアルファウイルス由来の配列を含まない。好ましくは、その場合、レプリコンは、それぞれの種または属に感染し得るアルファウイルス由来のヌクレオチド配列を含まない。この実施形態は、ＲＮＡが投与される対象が感染性アルファウイルスに（例えば偶然に）罹患した場合であっても、感染性（例えば完全に機能性または野生型）アルファウイルスによる組換えが不可能であるという利点を有する。例示的な例として、ブタの治療のために、使用されるレプリコンは、ブタに感染し得るアルファウイルス由来のヌクレオチド配列を含まない。
投与方法
本発明による薬剤は、任意の適切な経路で対象に適用することができる。
例えば、薬剤は、全身的に、例えば静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、皮内（ｉ．ｄ．）または吸入によって投与され得る。
一実施形態では、本発明による薬剤は、骨格筋などの筋肉組織、または皮膚、例えば皮下に投与される。皮膚または筋肉へのＲＮＡの移入は、体液性および細胞性免疫応答の強力な誘導と並行して、高くかつ持続的な局所発現をもたらすことが一般に理解されている（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１２，ＰＬｏＳ．Ｏｎｅ．，７，ｅ２９７３２；Ｇｅａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，ｖｏｌ．１０９，ｐｐ．１４６０４－１４６０９）。
筋肉組織または皮膚への投与の代替法としては、皮内、鼻腔内、眼内、腹腔内、静脈内、間質、口腔内、経皮、または舌下投与が挙げられるが、これらに限定されない。皮内および筋肉内投与が２つの好ましい経路である。
投与は様々な方法で達成することができる。一実施形態では、本発明による薬剤は注射によって投与される。好ましい実施形態では、注射は針を介する。代替法として、無針注射を使用し得る。
本発明を詳細に説明し、図面および実施例によって例示するが、これらは例示目的のみに使用されるものであり、限定することを意図しない。説明および実施例によって、同様に本発明に含まれるさらなる実施形態が当業者にアクセス可能である。
実施例
材料および方法：
実施例では、以下の材料および方法を使用した。
プラスミド
本明細書で使用されるベクター系は、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ；アクセッション番号Ｌ０１４４２）から操作したが（図１）、他の全てのアルファウイルスから同等の方法で行うことができる。第１の工程では、従来の自己複製ＲＮＡ（レプリコンと呼ばれる）をコードするプラスミドを、商業的提供者からの遺伝子合成によって得られたＶＥＥＶゲノムの断片を組み合わせることによって得た。この構築物は、ＶＥＥＶ構造遺伝子を欠くが、複製認識配列（ＲＲＳ）として機能し、ウイルス複製を制御するＶＥＥＶの全ての保存された配列エレメント（ＣＳＥ）を含む。ＶＥＥＶ配列を、Ｔ７ファージＲＮＡ－ポリメラーゼプロモータの転写制御下でｐＳＴ１プラスミド骨格（Ｈｏｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０８，ｐｐ．４００９－４０１７）に挿入した。１０個のヌクレオチドのランダムな配列（国際公開第２０１６／００５００４ Ａ１号）で分離された３０個および７０個のアデニル酸残基からなるポリ（Ａ）カセット（ポリＡ３０－７０）を、ＶＥＥＶ ３'ＣＳＥの一番最後のヌクレオチドのすぐ下流に付加した。プラスミドの線形化のためのＳａｐＩ制限部位をポリ（Ａ）カセットのすぐ下流に配置した。レプリコンへの目的の遺伝子（ＧＯＩ）の挿入は、サブゲノムプロモータ（ＳＧＰ）の下流で行われる。
ＰＣＲおよび組換えに基づくシームレスクローニング技術を使用して、必要なプラスミドを作製した。ホタルルシフェラーゼをコードするレプリコンＲＮＡを作製するために、ＧＯＩとしてルシフェラーゼのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をＳＧＰの下流に挿入した。強化緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と分泌型ナノルシフェラーゼ（ＳＮＬ）との融合物を発現するレプリコンＲＮＡについて、それぞれの融合遺伝子（ＧＦＰ－ＳＮＬ）をＳＧＰの下流に挿入した。構築物を以下の体系的な方法で命名した：ルシフェラーゼをコードするレプリコンを「ｃ－Ｒ－ｓＬ」（ｃ＝キャップ、Ｒ＝レプリカーゼ、ｓ＝サブゲノムプロモータ、Ｌ＝ホタルルシフェラーゼ）と命名し、ＧＦＰ－ＳＮＬをコードするレプリコンをそれに応じて「ｃ－Ｒ－ｓＧＦＰＳＮＬ」と命名した。「ｃ」は、レプリカーゼが５'末端キャップ構造の制御下で翻訳されることを示す。
従来のレプリコンの誘導は、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）に対するＳＧＰの交換を利用した。これにより、ＩＲＥＳはＧＯＩの上流にある。ルシフェラーゼを発現する構築物を「ｃ－Ｒ－ｉＬ」と命名し、「ｉ」は、レプリカーゼはキャップ依存的（「ｃ」）に翻訳されるままであるが、ルシフェラーゼを発現するためにＳＧＰの代わりにＩＲＥＳを使用することを示す。
キャップ下流からのレプリカーゼのＥＭＣＶ ＩＲＥＳへの翻訳をもたらすレプリコンの誘導体を生成するために、野生型（ｗｔ）ＲＲＳを、元のレプリカーゼ開始コドンならびにＲＲＳと重複するｎｓＰ１配列の内部の他の全てのＡＴＧトリプレットを欠く改変５'複製認識配列（ＲＲＳ）（ΔＡＴＧ－ＲＲＳ）と交換した（国際公開第２０１７／１６２４６０号）。その下流にホタルルシフェラーゼを挿入し、さらに下流にＥＭＣＶ ＩＲＥＳを挿入し、次にレプリカーゼＯＲＦを挿入した。ＲＮＡがこのプラスミドから転写されると、ルシフェラーゼはキャップ依存的に、レプリカーゼはＩＲＥＳ依存的に翻訳される。したがって、構築物を「ｃ－Ｌ－ｉＲ」と略した。
これのさらなる変異体を、ＩＲＥＳ制御レプリカーゼの下流にＳＧＰを担持するカセットを有するプラスミド上にコードし、このＳＧＰの後にＧＦＰ－ＳＮＬ融合タンパク質のＯＲＦを続けた。したがって、構築物を「ｃ－Ｌ－ｉＲ－ｓＧＦＰＳＮＬ」と命名した。
野生型配列を有するレプリカーゼをコードする構築物に加えて、変異した転写的に不活性なレプリカーゼｎｓＰ４サブユニットを有するバージョンを作製し、したがって、それらは複製欠損であった。この目的のために、アミノ酸配列中のレプリカーゼの２３５１位および２３５２位の２つのアスパラギン酸残基をアラニンに交換した（ｎｓＰ４－ＧＡＡ）。変異レプリカーゼを有するレプリコンを「ｃ－Ｒ（ＧＡＡ）－ｉＬ」、「ｃ－Ｒ（ＧＡＡ）－ｓＬ」、「ｃ－Ｌ－ｉＲ（ＧＡＡ）」または「ｃ－Ｌ－ｉＲ（ＧＡＡ）－ｓＧＦＰＳＮＬ」と命名した。
ホタルルシフェラーゼをコードする非複製ｍＲＮＡのインビトロ転写に使用されるプラスミド（ｍＲＮＡ－Ｌと命名）を、いくつかの実験において参照として使用した。
ＩＲＥＳの上流にＳＮＬ、下流にホタルルシフェラーゼを有するバイシストロン性トランス複製コンピテントＲＮＡをコードするプラスミドを、「Δ５ＡＴＧ－ＲＲＳ－バイシストロン性」（国際公開第２０１７／１６２４６０号に記載されている）に相当するプラスミド骨格から作製した。ＳＧＰの代わりに、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳまたはイスラエル急性麻痺ウイルス（ＩＡＰＶ）遺伝子間領域（ＩＧＲ）のいずれかを挿入した。複製ＲＮＡを「ｃ－Ｓ－ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ－Ｌ」および「ｃ－Ｓ－ＩＡＰＶ ＩＧＲ－Ｌ」と命名した。
さらに、ＥＭＣＶ－ＩＲＥＳによって開始されるＶＥＥＶレプリコンと同じモジュール構造を有するセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）配列に基づくＩＲＥＳ開始レプリコン（クローンＳＦＶ４）をクローニングした。この目的のために、ＳＦＶのｗｔ ＲＲＳを、元のレプリカーゼ開始コドン、ならびにＲＲＳと重複するｎｓＰ１配列の内部の他の全てのＡＴＧトリプレットを欠く改変５'－ＲＲＳ（ΔＡＴＧ－ＲＲＳ）と交換し（国際公開第２０１７／１６２４６０号）、その後にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、ＳＦＶ－レプリカーゼ、ＳＦＶサブゲノムプロモータ、ＧＦＰ－ＳＮＬレポータ遺伝子ならびにＳＦＶ ３'－ＵＴＲおよび３'ＲＲＳが続いた。
ＲＮＡ複製能が増加したＶＥＥＶ ＩＲＥＳ開始レプリコンの変異体（ｃ－Ｌ－ｉＲ）を試験するために、ＶＥＥＶワクチン株ＴＣ－８３（ΔＡＴＧ－ＲＲＳ－ＴＣ８３）に等しい５'－ＲＲＳ内のヌクレオチド４をＧからＡに交換した。
さらに、ＶＥＥＶワクチン株ＴＣ－８３（ΔＡＴＧ－ＲＲＳ－ＴＣ８３）から作製されたＩＲＥＳ開始レプリコンは、ＥＭＣＶ－ＩＲＥＳを有するベクターと同様に他のウイルス由来のＩＲＥＳを備えた。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の５'非翻訳領域（ＵＴ）およびポリタンパク質オープンリーディングフレームの開始点、ならびにエンテロウイルス７１（ＥＶ７１）の５'－ＵＴＲは、ＩＲＥＳ活性を有する。本発明者らのベクターにおいてＩＲＥＳとして使用するために、ＨＣＶの５'末端の４０８ヌクレオチド（アクセッション番号ＡＢ０１６７８５）およびＥＶ７１の５'末端の７４３ヌクレオチド）（アクセッション番号Ｕ２２５２１）をクローニングした。
インターフェロン阻害剤がベクター発現を増加させることができるかどうかを評価するために、ワクシニアウイルスＰＫＲ阻害剤Ｅ３またはトスカナウイルス遺伝子ＮＳを、ＥＭＣＶ－ＩＲＥＳの上流で、ΔＡＴＧ－ＲＲＳ－ＴＣ８３を有するＩＲＥＳ開始ＶＥＥＶレプリコンに挿入した。
インビトロ転写
上記のプラスミドからのインビトロ転写およびＲＮＡの精製は、ＡＲＣＡの代わりにβ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ２）キャップ類似体を使用したことを除いて、以前に記載されているように実施した（Ｈｏｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，前出；Ｋｕｈｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，ｖｏｌ．１７，ｐｐ．９６１－９７１）。精製ＲＮＡの品質は、分光測光法およびキャピラリ電気泳動（２１００ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ、Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＵＳＡ）によって評価した。実施例で使用されるＲＮＡは精製ＩＶＴ－ＲＮＡである。
細胞培養：全ての増殖培地、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、抗生物質および他の補助物質は、特に明記される場合を除いて、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏによって供給された。Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから得たヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ、新生児）を、１５％ＦＣＳ、１％非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含有する最少必須培地（ＭＥＭ）中、３７°Ｃで培養した。細胞は、５％ＣＯ２に平衡化した加湿雰囲気中、３７°Ｃで増殖させた。ＢＨＫ２１細胞（ＡＴＣＣ；ＣＣＬ１０）は、１０％ＦＣＳを添加したイーグル最小必須培地中で増殖させた。Ｃ２Ｃ１２細胞（ＡＴＣＣ；ＣＲＬ－１７７２）は、１０％ＦＣＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウムを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。Ｋ－５６２細胞（ＡＴＣＣ；ＣＣＬ－２４３）は、１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ培地で増殖させた。
細胞へのＲＮＡの移入
エレクトロポレーションのために、６２．５μｌ／ｍｍキュベットギャップサイズの最終用量で再懸濁したＲＮＡを、矩形波エレクトロポレーション装置（ＢＴＸ ＥＣＭ ８３０、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して室温で細胞にエレクトロポレーションした。使用した細胞型について、以下の設定を適用した：ＨＦＦ（５００Ｖ／ｃｍ、２４ミリ秒（ｍｓ）の１パルス）；ＢＨＫ－２１（７５０Ｖ／ｃｍ、１６ｍｓの１パルス）；Ｃ２Ｃ１２（６００Ｖ／ｃｍ、５ｍｓの５パルス、４００ｍｓ間隔）；Ｋ５６２（６５０Ｖ／ｃｍ、８ｍｓの３パルス、４００ｍｓ間隔）。
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸを製造者の指示書（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に従って使用して、ＲＮＡリポフェクションを実施した。接着細胞を約２０，０００細胞／ｃｍ２の増殖領域に播種し、２４時間後に総量２５０ｎｇ／ｃｍ２のＲＮＡおよび１μｌ／ｃｍ２のＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸをトランスフェクトした。ＲＮＡ種をＲＮＡｓｅ不含のエッペンドルフチューブ中で混合した。
ルシフェラーゼアッセイ：トランスフェクト細胞におけるルシフェラーゼの発現を評価するために、トランスフェクト細胞を９６ウェル白色マイクロプレート（Ｎｕｎｃ，Ｌａｎｇｅｎｓｅｌｂｏｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種した。ホタルルシフェラーゼの検出は、Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを用いて行った；ＮａｎｏＬｕｃを、ＮａｎｏＧｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を製造者の指示書に従って使用して検出した。生物発光を、マイクロプレートルミネセンスリーダＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して測定した。データを相対ルシフェラーゼ単位［ＲＬＵ］で表す。ルシフェラーゼ陰性細胞を使用してバックグラウンドシグナルを評価した。
ウェスタンブロット：ＲＩＰＡ緩衝液を用いて細胞を溶解した。４×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液を添加した溶解物を７．５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してニトロセルロース膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＬＳ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）にウェットブロットした。膜を１×ＰＢＳ－Ｔ中の５％脱脂粉乳でブロックし、一次抗体（抗ｍｙｃクローン９Ｅ１０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｍ４４３９）、抗チューブリンクローンＢ－５－１－２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｔ５１６８）および二次抗体の適切な希釈物と共にインキュベートした。ｎｓＰ３サブユニットの可変ドメインにインフレームで挿入したｍｙｃタグを使用して、レプリカーゼ発現を検出した。細胞溶解物中にタンパク質の濃度を等しく負荷することを確実にするために、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）によって測定し、α－チューブリンの検出によって制御した。化学発光シグナルを、Ｌｕｍｉ－Ｌｉｇｈｔ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて発色させ、ＬＡＳ ４０００システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＬＳ）を用いて記録した。
定量的リアルタイム逆転写酵素ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）：トランスフェクト細胞における外因性ＲＮＡの増幅を分析するために、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の指示書に従って使用して全細胞ＲＮＡを抽出し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＰｒｉｍｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）からのランダムヘキサマーを用いて逆転写した。ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）、ＡＢＩ ７３００ Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ＳｙｓｔｅｍおよびコンパニオンＳＤＳ分析ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、製造業者の指示書に従って実施した。以下の特異的プライマーを使用した：ｆＶＥＥｎｓｐ１ ５'－ＣＡＣＧＴＴＧＡＣＡＴＣＧＡＧＧＡＡＧＡＣ－３'；ｒＶＥＥｎｓｐ１ ５'－ＴＣＣＡＣＣＴＣＣＧＴＴＴＣＧＡＴＣＡＧ－３'。
（実施例１）（図１参照）
ＲＮＡ構築物。（１）従来のアルファウイルスレプリコンでは、非構造タンパク質１～４（ｎｓＰ１～４；＝レプリカーゼ酵素複合体）は、ＲＮＡの５'末端からキャップ依存的に翻訳される。サブゲノムプロモータ（ＳＧＰ）内で始まり、第１の目的の遺伝子（ＧＯＩ １）をコードするサブゲノム転写物もキャップされる。（２）ＳＧＰを内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）に置き換えた場合、ＧＯＩ １は、もはやキャップされたサブゲノム転写物によってコードされない。その代わりに、ゲノムＲＮＡによってコードされ、その翻訳は、キャップとは無関係に内部で（ｎｓＰ１～４の下流で）開始する。（３）ｎｓＰ１～４の上流のＩＲＥＳは、ｎｓＰ１～４の翻訳を５'キャップから切り離す。ＲＮＡの複製能を保存するためには、５'非翻訳領域（ＵＴＲ）およびｎｓＰ１（ｎｓＰ１＊）のＮ末端と重複する改変されていない（野生型；ｗｔ）５'複製認識配列（ＲＲＳ）を維持する必要がある。このＩＲＥＳ開始レプリコンでは、ｎｓＰ１～４の翻訳は選択されたＩＲＥＳの特性に依存するが、ＧＯＩ １の発現はＳＧＰの制御下のままである。（４）第２のＧＯＩ（ＧＯＩ ２）は、５'ＲＲＳに重なるｎｓＰ１＊のＮ末端部分にインフレームで融合することができる。（５）さらなる変異体では、ＳＧＰおよびその下流のＧＯＩ １を除去し得る。（６）Ｎ末端ｎｓＰ１＊の翻訳を回避するために、元の開始コドンおよびさらなる推定ＡＵＧコドンを変異させることができ（ΔＡＵＧ）、それによってキャップ依存性翻訳がＧＯＩ ２のＡＵＧで開始することを可能にする。ｎｓＰ１～４はＩＲＥＳの下流のままであり、ＧＯＩ １はＳＧＰの下流のままである。（７）ＡＵＧを欠き、かつＳＧＰおよびＧＯＩ １を欠く５'ＲＲＳを有する単純化された構築物。（１～７）全ての構築物は、インビトロおよびインセルロで５'－ポリアデニル化されている。（３～７）全てのＩＲＥＳ開始レプリコンは、インビトロでキャップされてもいてもよく、またはキャップされていなくてもよい。細胞において、ｎｓＰ１～４は、新規ＲＮＡコピーにキャップおよびポリＡを付加する。
（実施例２）（図２参照）
ＩＲＥＳ媒介発現はキャップ依存性翻訳よりも約１０倍弱い。（Ａ）図示されているように、Ｋ５６２細胞に不活性レプリカーゼ（ｎｓＰ４－ＧＡＡ変異体）およびルシフェラーゼを発現する３μｇのレプリコンをエレクトロポレーションした。不活性レプリカーゼをＥＭＣＶ ＩＲＥＳ（ｃ－Ｒ（ＧＡＡ）－ｉＬ）の下流の５'キャップおよびルシフェラーゼの制御下に置くか、またはその逆に、ルシフェラーゼをＩＲＥＳ（ｃ－Ｌ－ｉＲ（ＧＡＡ））の下流のキャップおよびレプリカーゼの制御下に置いた。エレクトロポレーションの６時間～４８時間後にルシフェラーゼ活性を測定し、ルシフェラーゼの総発現を曲線下面積（ＡＵＣ）として計算した。ＯＲＦをＩＲＥＳの下流に配置した場合、ルシフェラーゼ翻訳ははるかに低く、これは文献から公知である（Ｈｅｎｎｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ ２９，Ｎｏ．１６，ｐｐ ３３２７－３３３４）。（Ｂ）不活性レプリカーゼおよびルシフェラーゼを発現する５μｇの図示されている構築物によるＢＨＫ－２１細胞のエレクトロポレーション。６時間後に細胞を溶解して、ウェスタンブロットによってレプリカーゼ翻訳を評価した（ｍｙｃタグ付きｎｓＰ３の検出）。ＩＲＥＳ含有構築物（ｃ－Ｒ（ＧＡＡ）－ｉＬおよびｃ－Ｌ－ｉＲ（ＧＡＡ））におけるレプリカーゼの翻訳を評価するために、サブゲノムプロモータ（ｃ－Ｒ（ＧＡＡ）－ｓＬ）の下流にルシフェラーゼを発現する従来の、ただしレプリカーゼ不活性のレプリコンも参照として含めた。レプリカーゼ発現は、以前に記載されているようにｎｓＰ３の可変領域内でｍｙｃタグ付けされたｎｓＰ３サブユニットから推測された（Ｂｅｉｓｓｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０２０；ｖｏｌ ２８（１）；ｐｐ．１１９－１２８）。
参照におけるレプリカーゼ翻訳は、弱いが検出可能であった。レプリカーゼをキャップの翻訳制御下に維持しながら、サブゲノムプロモータをＩＲＥＳに交換しても、レプリカーゼの発現は変化しなかった。しかし、レプリカーゼをＩＲＥＳの下流に配置した場合、その発現は、ルシフェラーゼをＩＲＥＳの下流に配置した場合の観察と一致して、はるかに低かった。
（実施例３）（図３参照）
ＩＲＥＳ媒介レプリカーゼ発現はＲＮＡ複製を可能にする。Ｃ２Ｃ１２またはＫ５６２細胞に、活性レプリカーゼを発現する３μｇの示されているレプリコンをエレクトロポレーションした。ＲＮＡ構築物の自己増幅を評価するために、細胞を溶解し、複製開始前（０．５時間）、またはエレクトロポレーションの６時間後および２４時間後の移入後早期にＲＮＡを抽出し、逆転写して、ＲＮＡ増幅を評価および比較した。ｑＰＣＲプライマーをレプリカーゼ（ｎｓＰ１）内で結合させて、ゲノムＲＮＡコピーを検出および定量化した。ＲＮＡの倍数増幅を、エレクトロポレーション直後のＲＮＡレベルに対する指示された時点でのＲＮＡレベルの商として計算した（ＲＮＡの倍数増幅）。
試験した全ての構築物を自己増幅させた。以前に本発明者らが検出したＩＲＥＳの下流の非常に低いレプリカーゼ翻訳（実施例１）は、増幅に対する障壁を課さなかった。
（実施例４）（図４参照）
ＩＲＥＳ開始レプリコンは、両方のオープンリーディングフレームの堅固な発現を示す。（Ａ）強化緑色蛍光タンパク質と分泌型ナノルシフェラーゼ（ＧＦＰ－ＳＮＬ）との融合タンパク質を発現する等モル量のレプリコンＲＮＡ構築物を、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）およびＣ２Ｃ１２細胞にエレクトロポレーションした。従来のｓａＲＮＡは、ＧＦＰ－ＳＮＬ（ｃ－Ｒ－ｓＧＦＰＳＮＬ）のサブゲノム発現の参照として機能し、等モル濃度を３μｇのｃ－Ｒ－ｓＧＦＰＳＮＬに調整した。ＧＦＰはトランスフェクション率を監視するのに役立った。分泌型ナノ－ルシフェラーゼは、細胞培養上清中で非常に長い半減期（４日間）を有するので、ＲＮＡ移入と上清の採取との間の期間で総タンパク質蓄積を評価することを可能にする。ＩＲＥＳの下流およびＳＧＰの上流でレプリカーゼを発現する構築物を、５'インビトロキャップ（ｃ－Ｌ－ｉＲ－ｓＧＦＰＳＮＬ）または５'非キャップ（－Ｌ－ｉＲ－ｓＧＦＰＳＮＬ）のいずれかで使用した。エレクトロポレーションの２４時間後に測定されたＧＦＰ発現、ならびにエレクトロポレーションの４８時間後にサブゲノム転写物から発現されたＳＮＬの蓄積の両方が、全ての自己増幅ＲＮＡの遺伝子発現が同等であることを示した。これは、ＩＲＥＳによって媒介される低レベルのレプリカーゼ翻訳が導入遺伝子発現に対する障壁を課さないことを実証した。（Ｂ）新規のＩＲＥＳ開始レプリコンＲＮＡの構築物構成は、ＩＲＥＳの上流に目的の第２の遺伝子を挿入することを可能にする。この上流遺伝子は、５'キャップの制御下で翻訳される。インビトロでは、このキャップはインビトロ転写中に付加されてもよく、または付加されなくてもよい。細胞に移入され、その後複製されると、新たに転写されたＲＮＡはレプリカーゼｎｓＰ１サブユニットによってキャップされる。ここで、本発明者らは、ＩＲＥＳの上流にホタルルシフェラーゼを新規ベクターに配置した。７２時間の時間経過実験を、６時間、２４時間、４８時間および７２時間の測定で行った。曲線下面積を計算することによって、総発現を概算した。ルシフェラーゼをコードする非複製ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ－Ｌ）は、新規ｓａＲＮＡベクターにおけるキャップ依存性翻訳の強度を評価するための参照として機能し、従来のｓａＲＮＡはサブゲノム発現の参照として機能した（ｃ－Ｒ－ｓＬ）。データは、上流ルシフェラーゼが、ｍＲＮＡ媒介発現とサブゲノム媒介発現との間のレベルで、細胞において良好に発現されることを示す。それにより、ＩＲＥＳ開始レプリコンは、トランスフェクトされた細胞内で２つの遺伝子を独立して異なるレベルで共発現させる機会を提供する。
（実施例５）（図５参照）
ＥＭＣＶ ＩＲＥＳと比較した因子非依存性ジシストロウイルス遺伝子間領域。（Ａ）キャップされたバイシストロン性ナノトランスレプリコンは、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳ（ｃ－Ｓ－ＥＭＣＶ－ＩＲＥＳ－Ｌ）またはイスラエル急性麻痺ウイルス（ＩＡＰＶ）遺伝子間領域（ＩＧＲ）（ｃ－Ｓ－ＩＡＰＶ－ＩＧＲ－Ｌ）のいずれかの上流に分泌型ナノルシフェラーゼ（ＳＮＬ）、下流にホタルルシフェラーゼをコードする。これらのトランスレプリコンの５'末端はＡＵＧを有さなかった（ΔＡＴＧ－ＲＲＳ）。両方のＲＮＡ構築物を、ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘを使用して初代ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）、Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞およびＢＨＫ－２１細胞にリポフェクトした。導入遺伝子発現を２４時間後に測定した。（Ｂ）両方の構築物のキャップ依存性ＳＮＬ翻訳。（Ｃ）ホタルルシフェラーゼのＥＭＣＶ ＩＲＥＳおよびＩＡＰＶ ＩＧＲ依存性発現。
ＳＮＬのキャップ依存性翻訳は、ＨＦＦと比較してＣ２Ｃ１２およびＢＨＫ－２１細胞においてはるかに強かった。外因遺伝子発現のレベルは、自然免疫応答の依存性が細胞で異なる。ＨＦＦは、キャップ依存性翻訳に影響を及ぼすＲＮＡトランスフェクション時の強力なＩＦＮ応答およびプロテインキナーゼＲ活性化を開始する。ＥＭＣＶ ＩＲＥＳは、キャップ結合タンパク質を除いて、キャップ依存性翻訳と同じセットの細胞翻訳開始因子を必要とする。したがって、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳも、キャップ依存性翻訳と非常に類似して自然免疫の影響を受ける。しかしながら、ＩＡＰＶ ＩＧＲは細胞因子を必要とせず、このＲＮＡ配列は、ｔＲＮＡ模倣によってリボソームをＲＮＡに直接誘引する。したがって、ＩＡＰＶ ＩＧＲ媒介ルシフェラーゼ発現は、３つ全ての細胞株において同等であった。
（実施例６）（図６参照）
セムリキ森林ウイルス由来のＩＲＥＳ開始レプリコンは、キャップありおよびキャップなしで複製している。（Ａ）この実施例で使用したＩＲＥＳ開始レプリコンは、材料および方法の段落に記載されているように、ＧＦＰ－ＳＮＬをコードするセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）レプリコンベクター（ｃ－Ｒ（ＳＦＶ）－ｓＧＦＰＳＮＬ）から構築した（ｃ－ｉＲ（ＳＦＶ）－ｓＧＦＰＳＮＬ）。ＩＲＥＳ開始レプリコンＲＮＡを、キャップ類似体を用いておよびキャップ類似体なしでインビトロ転写し、親レプリコンをキャップした。（Ｂ、Ｃ）マウスＣ２Ｃ１２細胞または（Ｄ、Ｅ）ＢＨＫ２１細胞を、ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘを使用してリポフェクトした。２４時間後、細胞培養上清および細胞を回収した。（Ｂ、Ｄ）細胞上清を使用して、トランスフェクション後２４時間以内の総タンパク質分泌を反映するＳＮＬの蓄積を測定した（ＮａｎｏＧｌｏアッセイ）。（Ｃ、Ｅ）細胞のＧＦＰ発現をフローサイトメトリによって評価して、ＧＦＰ＋細胞のトランスフェクション率および平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定した。
ＶＥＥＶベースのベクターについて以前に観察されたように、ＳＦＶベースのＩＲＥＳ開始レプリコンは複製コンピテントであり、両方の細胞株において堅固なレポータ遺伝子発現をもたらした。キャッピングは有益であったが、ベクター発現に必須ではなかった。
（実施例７）（図７参照）
エンテロウイルス７１ ＩＲＥＳおよびＣ型肝炎ウイルスＩＲＥＳ制御レプリカーゼ発現は複製を可能にする。
（Ａ）この実施例で使用したホタルルシフェラーゼ（Ｌ）を発現するＩＲＥＳ開始レプリコンは、ＶＥＥＶワクチン株ＴＣ－８３（ΔＡＴＧ－ＲＲＳ－ＴＣ８３）から構築した。材料および方法に記載されているように、ＥＭＣＶ－ＩＲＥＳによって開始されるレプリコン（ｃ－ｉ（ＥＭＣＶ）Ｒ－Ｌ）を改変し、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳをＨＣＶ－ＩＲＥＳ（ｃ－ｉ（ＨＣＶ）Ｒ－Ｌ）またはＥＶ７１－ＩＲＥＳ（ｃ－ｉ（ＥＶ７１）Ｒ－Ｌ）と交換した。ベクターＲＮＡを、キャップ類似体ありおよびキャップ類似体なしでインビトロ転写した。（Ｂ）ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）または（Ｃ）ＢＨＫ２１細胞を、ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘを使用して四連でリポフェクトした。２４時間後、ホタルルシフェラーゼ発現を測定した。
ＥＭＣＶ－ＩＲＥＳ開始ベクターと同様に、ＥＶ７１－ＩＲＥＳおよびＨＣＶ－ＩＲＥＳ開始ベクターは複製コンピテントであり、両方の細胞株において堅固なレポータ遺伝子発現をもたらした。したがって、ベクターの概念はＩＲＥＳの種々のクラスと適合性である。
（実施例８）（図８参照）
ＶＥＥＶワクチン株ＴＣ－８３由来のＩＲＥＳ開始レプリコンは、ＷＴ ＶＥＥＶよりも効率的に複製および発現する。
（Ａ）この実施例で使用したＩＲＥＳ開始レプリコンは、ウイルスサブゲノムプロモータの制御下のＧＦＰ－ＳＮＬ、およびＩＲＥＳの上流の５'－ＯＲＦからのホタルルシフェラーゼ（Ｌ）の両方を発現していた。示されているように、ベクターをｗｔ ＶＥＥＶまたはＶＥＥＶワクチン株ＴＣ－８３（ΔＡＴＧ－ＲＲＳ－ＴＣ８３）から構築した。ベクターＲＮＡを、キャップ類似体ありおよびキャップ類似体なしでインビトロ転写した。ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）をエレクトロポレーションした。（Ｂ）エレクトロポレーション後７２時間にわたってホタルルシフェラーゼを測定し、ルシフェラーゼの総発現を曲線下面積（ＡＵＣ）として計算した。（Ｃ）ＧＦＰ＋細胞の数を定量化することによって、エレクトロポレーションの２４時間後にトランスフェクション率を評価した。
本発明者らは、ＴＣ８３ベースのベクターの発現がＷＴ ＶＥＥＶに基づくベクターよりも優れていることを観察した。ＴＣ８３によって提供される利益は、ゲノムレプリコンＲＮＡコピーの５'キャップから翻訳されるルシフェラーゼ発現に関してより顕著であった。これは、最初に、サブゲノム転写よりもむしろＴＣ８３のゲノムＲＮＡの複製がｗｔ ＶＥＥＶと比較して５'－ヌクレオチド交換によって加速されることを記載した文献（Ｋｕｌａｓｅｇａｒａｎ－Ｓｈｙｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３８７ ｐｐ．２１１－２２１）と一致する。
（実施例９）（図９参照）
ＷＴおよびＴＣ－８３ ＶＥＥＶ株のキャップされていない従来のレプリコンはほとんど複製しない。
（Ａ）この実施例で使用したｗｔ ＶＥＥＶまたはＶＥＥＶワクチン株ＴＣ－８３（ＲＲＳ－ＴＣ８３）から構築した従来のレプリコンは、示されているように、ウイルスサブゲノムプロモータの制御下でＧＦＰ－ＳＮＬを発現していた。ベクターＲＮＡを、キャップ類似体ありおよびキャップ類似体なしでインビトロ転写した。ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）をエレクトロポレーションした。（Ｂ）ＧＦＰ＋細胞の数を定量化することによって、エレクトロポレーションの２４時間後に細胞のトランスフェクション率を評価した。
本発明者らは、従来のレプリコンの発現がキャッピングに依存することを観察した。ＲＮＡをキャップしないままにした場合、細胞のごく一部のみがレプリコンにコードされたＧＦＰを発現していた。
（実施例１０）（図１０参照）
ＩＲＥＳの上流に発現されるインターフェロン阻害剤は、ＩＲＥＳ開始レプリコンの発現を増強する。
（Ａ）この実施例で使用したＩＲＥＳ開始レプリコンは、ウイルスサブゲノムプロモータの制御下でＧＦＰ－ＳＮＬを発現していた。それに加えて、ベクターは、ＩＲＥＳウイルス免疫回避遺伝子の上流に、ワクシニアウイルスＥ３（ｃ－Ｅ３－ｉＲ－ｓＧＦＰＳＮＬ）またはトスカナウイルスＮＳ（ｃ－ＮＳ－ｉＲ－ｓＧＦＰＳＮＬ）のいずれかを発現した。対照は、ＩＲＥＳの上流にタンパク質を発現しなかった（ｃ－ｉＲ－ｓＧＦＰＳＮＬ）。示されているように、ＶＥＥＶワクチン株ＴＣ－８３（ΔＡＴＧ－ＲＲＳ－ＴＣ８３）からベクターを構築した。ベクターＲＮＡを、キャップ類似体ありおよびキャップ類似体なしでインビトロ転写した。ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）をこれらのベクターでリポフェクトした。２４時間後、細胞培養上清および細胞を回収した。（Ｂ）細胞上清を使用して、トランスフェクション後２４時間以内の総タンパク質分泌を反映するＳＮＬの蓄積を測定した（ＮａｎｏＧｌｏアッセイ）。（Ｃ）細胞のＧＦＰ発現をフローサイトメトリによって評価して、ＧＦＰ＋細胞のトランスフェクション率および平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定した。
本発明者らは、ＩＲＯＮ開始レプリコンの発現が両方のインターフェロン阻害剤によって増強されることを観察した。ＲＮＡをキャップした場合、利益はより顕著であった。これは、複製中にレプリカーゼサブユニットｎｓＰ１によって新規ＲＮＡコピーがキャップされない限り、ＩＲＥＳの上流のＯＲＦをキャップされていないＲＮＡから翻訳することができないという事実と一致する。したがって、Ｅ３およびＮＳは、ＲＮＡがインビトロでキャップされている場合により早く発現され、非キャップＲＮＡと比較して発現のより顕著な増加が生じる。

Claims (43)

  1. 内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）と、自己複製ウイルス由来の機能性非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームとを含むＲＮＡレプリコンであって、前記ＩＲＥＳが前記機能性非構造タンパク質の発現を制御する、ＲＮＡレプリコン。
  2. 前記ＩＲＥＳが細胞ストレスに非感受性である、請求項１に記載のＲＮＡレプリコン。
  3. 前記ＩＲＥＳがインターフェロン、好ましくはＩ型インターフェロンに非感受性である、請求項１または２に記載のＲＮＡレプリコン。
  4. 前記ＩＲＥＳが細胞またはウイルスのＩＲＥＳ、好ましくはウイルスのＩＲＥＳである、請求項１～３のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。
  5. 前記ＩＲＥＳが、ピコルナウイルス、フラビウイルスまたはジシストロウイルスからなる群より選択されるウイルスに由来する、請求項１～４のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。
  6. 前記ＩＲＥＳがピコルナウイルスまたはジシストロウイルス、好ましくはジシストロウイルスに由来する、請求項１～５のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。
  7. 前記ＩＲＥＳがＩＶ型ＩＲＥＳである、請求項１～６のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。
  8. 前記ＩＲＥＳによって制御される発現がＩＲＥＳトランス作用因子とは無関係である、請求項１～７のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。
  9. 前記ＩＲＥＳによって制御される発現が細胞翻訳開始因子とは無関係である、請求項１～８のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。
  10. 前記ＩＲＥＳによって制御される発現が、真核生物開始因子２（ｅＩＦ２）のリン酸化とは無関係である、請求項１～９のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。
  11. ５'キャップを含まない、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。
  12. ５'複製認識配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。
  13. 前記５'複製認識配列が、自己複製ウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列を含み、自己複製ウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な前記配列が、天然のウイルス配列と比較して少なくとも１つの開始コドンの除去を含むことを特徴とする、請求項１２に記載のＲＮＡレプリコン。
  14. 自己複製ウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な前記配列が、少なくとも自己複製ウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームの天然の開始コドンの除去を含むことを特徴とする、請求項１３に記載のＲＮＡレプリコン。
  15. 自己複製ウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な前記配列が、自己複製ウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームの天然の開始コドン以外の少なくとも１つの開始コドンの除去を含むことを特徴とする、請求項１３または１４に記載のＲＮＡレプリコン。
  16. 自己複製ウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な前記配列が、開始コドンを含まないことを特徴とする、請求項１３～１５のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。
  17. 少なくとも１つの開始コドンの除去によって導入された少なくとも１つのステムループ内のヌクレオチド対合破壊を補償する少なくとも１つのヌクレオチド変化を含む、請求項１３～１６のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。
  18. 自己複製ウイルス由来のトランケートされた非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含まない、請求項１～１７のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。
  19. 自己複製ウイルス由来の機能性非構造タンパク質をコードする前記オープンリーディングフレームが前記５'複製認識配列と重複しない、請求項１２～１８のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。
  20. 前記５'複製認識配列の下流および前記ＩＲＥＳの上流に目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む、請求項１２～１９のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。
  21. 前記目的のタンパク質が、鋳型として前記ＲＮＡレプリコンから発現され得る、請求項２０に記載のＲＮＡレプリコン。
  22. 前記目的のタンパク質が、自己複製ウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な前記配列によってコードされるタンパク質またはペプチドとの融合タンパク質として発現され、前記融合タンパク質の発現が、自己複製ウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な前記配列の開始コドンで開始される、請求項２０または２１に記載のＲＮＡレプリコン。
  23. 自己複製ウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な前記配列の前記開始コドンが、自己複製ウイルス由来の非構造タンパク質の前記オープンリーディングフレームの天然の開始コドンである、請求項２２に記載のＲＮＡレプリコン。
  24. 前記目的のタンパク質の発現が、目的のタンパク質をコードする前記オープンリーディングフレームの開始コドンで開始される、請求項２０または２１に記載のＲＮＡレプリコン。
  25. 目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むサブゲノムＲＮＡの産生を制御するサブゲノムプロモータを含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。
  26. 前記サブゲノムＲＮＡが、自己複製ウイルス由来の前記機能性非構造タンパク質に由来するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの転写産物である、請求項２５に記載のＲＮＡレプリコン。
  27. 前記目的のタンパク質が、鋳型として前記サブゲノムＲＮＡから発現され得る、請求項２５または２６に記載のＲＮＡレプリコン。
  28. 自己複製ウイルス由来の機能性非構造タンパク質をコードする前記オープンリーディングフレームの下流に、前記サブゲノムプロモータによって制御される目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む、請求項２５～２７のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。
  29. 前記サブゲノムプロモータが、自己複製ウイルス由来の機能性非構造タンパク質をコードする前記オープンリーディングフレームと重複する、請求項２８に記載のＲＮＡレプリコン。
  30. ３'複製認識配列を含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。
  31. 自己複製ウイルス由来の機能性非構造タンパク質をコードする前記オープンリーディングフレーム、前記５'および／または３'複製認識配列、ならびに前記サブゲノムプロモータが、自己複製ウイルス、好ましくは同じ自己複製ウイルス種に由来する、請求項３０に記載のＲＮＡレプリコン。
  32. 自己複製ウイルス由来の前記機能性非構造タンパク質に由来するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって複製され得る、請求項１～３１のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。
  33. 前記自己複製ウイルスがアルファウイルスである、請求項１～３２のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。
  34. 前記アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎複合体ウイルス、東部ウマ脳炎複合体ウイルス、西部ウマ脳炎複合体ウイルス、セムリキ森林ウイルス複合体ウイルス、バーマフォレストウイルス、ミデルブルグウイルスおよびヌドゥムウイルスからなる群より選択される、請求項３３に記載のＲＮＡレプリコン。
  35. 前記アルファウイルスがベネズエラウマ脳炎ウイルスまたはセムリキ森林ウイルスである、請求項３３または３４に記載のＲＮＡレプリコン。
  36. 請求項１～３５のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコンを含む非ウイルス粒子。
  37. 請求項１～３５のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコンをコードする核酸配列を含むＤＮＡ。
  38. 請求項１～３５のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコンおよび薬学的に許容される担体を含む組成物。
  39. 治療に使用するための、請求項３８に記載の組成物。
  40. 細胞内で目的のタンパク質を生成するための方法であって、
    （ａ）前記目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコンを得る工程、および
    （ｂ）前記ＲＮＡレプリコンを前記細胞に接種する工程
    を含む、方法。
  41. 対象において目的のタンパク質を生成するための方法であって、
    （ａ）前記目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコンを得る工程、および
    （ｂ）前記ＲＮＡレプリコンを前記対象に投与する工程
    を含む、方法。
  42. 前記目的のタンパク質が抗原性ペプチドまたはタンパク質である、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記対象において免疫応答を誘発するための方法である、請求項４２に記載の方法。
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