JP7421256B2 - トランス複製型ｒｎａ - Google Patents

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Description

本発明は一般に、高レベルのタンパク質の作製に適するシステム及び方法に関する。本発明は、機能的に連結された、２つの個別のＲＮＡ分子を含むシステムであって、１つのＲＮＡ分子である、レプリカーゼコンストラクトが、アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクトを含み、第２のＲＮＡ分子である、トランスレプリコンが、トランスで、レプリカーゼにより複製することができるＲＮＡ配列を含むシステムを供する。トランスレプリコンは、発現させるための、目的の遺伝子、例えば、ワクチンをコードする遺伝子を含みうる。アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクトは、５’キャップを含む。トランスでの目的の遺伝子の高レベルの発現には、５’キャップが極めて重要であることが見出された。本発明は、ウイルス粒子の繁殖を必要とせず、目的のタンパク質、例えば、標的生物、例えば、動物におけるワクチンなど、治療用タンパク質又は抗原性タンパク質を、効率的、かつ、安全に作製するのに適する。
予防及び治療を目的とする、１又は複数のポリペプチドをコードする外来遺伝情報の導入は、多年にわたり、生物医学的研究の目標であった。先行技術の手法は、核酸分子の、標的細胞又は標的生物への送達を共有するが、核酸分子及び／又は送達システムの種類が異なる。デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子の使用と関連する安全性の懸念の影響で、近年、リボ核酸（ＲＮＡ）分子が、ますます関心を集めている。ネイキッドＲＮＡの形態、又は複合体化形態若しくはパッケージング形態、例えば、非ウイルス性送達媒体若しくはウイルス性送達媒体による、一本鎖ＲＮＡ若しくは二本鎖ＲＮＡの投与を含む、多様な手法が提起されている。ウイルス及びウイルス性送達媒体では、典型的に、遺伝情報を、タンパク質及び／又は脂質（ウイルス粒子）により封入する。例えば、ＲＮＡウイルスに由来する、操作ＲＮＡウイルス粒子が、植物を治療する（国際公開第２０００／０５３７８０Ａ２号）ための送達媒体として、又は哺乳動物のワクチン接種（Tubulekas等, 1997, Gene, vol. 190, pp. 191-195）のために提起されている。
一般に、ＲＮＡウイルスは、ＲＮＡゲノムを伴う感染性粒子の多様な群である。ＲＮＡウイルスは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルス及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）ウイルスへと細分することができ、ｓｓＲＮＡウイルスは一般に、プラス鎖［（＋）鎖］及び／又はマイナス鎖［（－）鎖］ウイルスへと更に分けることができる。プラス鎖ＲＮＡウイルスは、明らかに、それらのＲＮＡが、宿主細胞内の翻訳のための鋳型として直接用いられうるため、生物医学における送達システムとして魅力的である。
アルファウイルスは、プラス鎖ＲＮＡウイルスの典型的な代表例である。アルファウイルスは、感染細胞の細胞質内で複製される（アルファウイルスの生活環の総説については、Jose等, Future Microbiol., 2009, vol. 4, pp. 837-856を参照されたい）。多くのアルファウイルスの総ゲノム長は、典型的に、１１，０００から１２，０００ヌクレオチドの間の範囲であり、ゲノムは典型的に、５’キャップ及び３’ポリ（Ａ）テールを有する。アルファウイルスのゲノムは、非構造タンパク質（ウイルスＲＮＡの転写、修飾、及び複製、並びにタンパク質の修飾に関与する）及び構造タンパク質（ウイルス粒子を形成する）をコードする。ゲノム内には、典型的に、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在する。４つの非構造タンパク質（ｎｓＰ１－ｎｓＰ４）が、典型的に、ゲノムの５’末端の近傍において始まる第１のＯＲＦにより共にコードされるのに対し、アルファウイルスの構造タンパク質は、第１のＯＲＦの下流において見出される第２のＯＲＦ内で共にコードされ、ゲノムの３’末端の近傍に伸びている。典型的に、第１のＯＲＦは、ほぼ２：１の比で、第２のＯＲＦより大型である。
アルファウイルスが感染した細胞では、非構造タンパク質だけが、ゲノムＲＮＡから翻訳されるのに対し、構造タンパク質は、真核生物メッセンジャーＲＮＡに相似するＲＮＡ分子である、サブゲノム転写物から翻訳可能である（ｍＲＮＡ；Gould等, 2010, Antiviral Res., vol. 87, pp. 111-124）。感染後、すなわち、ウイルス生活環の早期において、（＋）鎖ゲノムＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡと同様に、非構造ポリタンパク質（ｎｓＰ１２３４）の翻訳のために直接作用する。一部のアルファウイルスでは、ｎｓＰ３のコード配列と、ｎｓＰ４のコード配列との間に、オパール終止コドンが存在する。つまり、翻訳が、オパール終止コドンで終結すると、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、及びｎｓＰ３を含有するＰ１２３ポリタンパク質が産生され、加えて、ｎｓＰ４も含有するポリタンパク質Ｐ１２３４が、このオパールコドンの読了時に産生される（Strauss及びStrauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562、Rupp等, 2015, J. Gen. Virology, vol. 96, pp. 2483-2500）。ｎｓＰ１２３４は、自己タンパク質分解により、断片であるｎｓＰ１２３及びｎｓＰ４へと切断される。ポリペプチドであるｎｓＰ１２３及びｎｓＰ４は、会合して、（＋）鎖ゲノムＲＮＡを鋳型として使用して、（－）鎖ＲＮＡを転写する、（－）鎖レプリカーゼ複合体を形成する。典型的に、後期には、ｎｓＰ１２３断片は、個別のタンパク質である、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３及びｎｓＰ４へと完全に切断され（Shirako及びStrauss, 1994, J. Virol. Vol. 68, pp. 1874-1885）、これらのタンパク質は、ゲノムＲＮＡの（－）鎖相補体を鋳型として使用して、新たな（＋）鎖ゲノムを合成する（＋）鎖レプリカーゼ複合体を形成するようにアセンブルされる（Kim等, 2004, Virology, vol. 323, pp. 153-163、Vasiljeva等, 2003, J. Biol. Chem. Vol. 278, pp. 41636-41645）。
アルファウイルスの構造タンパク質（ウイルス粒子の全ての構成要素である、コアヌクレオカプシドタンパク質Ｃ、エンベロープタンパク質Ｐ６２、及びエンベロープタンパク質Ｅ１）は、典型的に、単一のサブゲノムプロモーターの制御下にあるオープンリーディングフレームによりコードされる（Strauss及びStrauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562）。サブゲノムプロモーターは、シスで作用する、アルファウイルスの非構造タンパク質により認識される。特に、アルファウイルスレプリカーゼは、ゲノムＲＮＡの（－）鎖相補体を鋳型として使用して、（＋）鎖サブゲノム転写物を合成する。（＋）鎖サブゲノム転写物は、アルファウイルスの構造タンパク質をコードする（Kim等, 2004, Virology, vol. 323, pp. 153-163、Vasiljeva等, 2003, J. Biol. Chem. Vol. 278, pp. 41636-41645）。サブゲノムＲＮＡ転写物は、構造タンパク質を、１つのポリタンパク質としてコードするオープンリーディングフレームの翻訳のための鋳型として用いられ、ポリタンパク質は、切断されて、構造タンパク質をもたらす。宿主細胞内のアルファウイルス感染の後期には、ｎｓＰ２のコード配列内に配置されるパッケージングシグナルが、構造タンパク質によりパッケージングされた出芽ビリオンへの、ゲノムＲＮＡの選択的パッケージングを確保する（White等, 1998, J. Virol., vol. 72, pp. 4320-4326）。
感染細胞内では、サブゲノムＲＮＡ並びに新たなゲノムＲＮＡには、ｎｓＰ１により、５’キャップがもたらされ（Pettersson等 1980, Eur. J. Biochem. 105, 435-443、Rozanov等, 1992, J. Gen. Virology, vol. 73, pp. 2129-2134）、ｎｓＰ４により、ポリアデニル酸［ポリ（Ａ）］テールがもたらされる（Rubach等, Virology, 2009, vol. 384, pp. 201-208）。したがって、サブゲノムＲＮＡ及びゲノムＲＮＡのいずれも、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に相似する。
アルファウイルスゲノムは、宿主細胞内のウイルスＲＮＡの複製に重要であることが理解されている（Strauss及びStrauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562）、４つの保存配列エレメント（ＣＳＥ）を含む。ウイルスゲノムの５’末端において、又はこの近傍において見出されるＣＳＥ１は、（－）鎖鋳型からの（＋）鎖の合成のためのプロモーターとして機能すると考えられる。ｎｓＰ１のコード配列内にあり、ＣＳＥ１の下流に配置されているが、それでもゲノムの５’末端に近接するＣＳＥ２は、ゲノムＲＮＡ鋳型からの（－）鎖合成の開始のためのプロモーターとして作用すると考えられる（ＣＳＥ２を含まないサブゲノムＲＮＡ転写物は、（－）鎖の合成のための鋳型として機能しないことに留意されたい）。ＣＳＥ３は、非構造タンパク質のコード配列と、構造タンパク質のコード配列との間の接合領域内に配置され、サブゲノム転写物の効率的な転写のためのコアプロモーターとして作用する。最後に、アルファウイルスゲノムの３’非翻訳領域内のポリ（Ａ）配列のすぐ上流に配置されるＣＳＥ４は、（－）鎖合成の開始のためのコアプロモーターとして機能すると理解される（Jose等, Future Microbiol., 2009, vol. 4, pp. 837-856）。アルファウイルスのＣＳＥ４及びポリ（Ａ）テールは、効率的な（－）鎖合成のために共に機能すると理解される（Hardy及びRice, J. Virol., 2005, vol. 79, pp. 4630-4639）。アルファウイルスタンパク質に加えてまた、宿主細胞因子、おそらくは、タンパク質も、保存配列エレメントに結合しうる（Strauss及びStrauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562）。
典型的なアルファウイルスである、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）のゲノムの一部の特色を、図１Ａに例示する。
アルファウイルスの宿主は、昆虫、魚類、並びに家畜及びヒトなどの哺乳動物を含む、広範にわたる動物を含み、したがって、アルファウイルス由来のベクターは、外来遺伝情報の、広範にわたる標的生物への送達のための潜在的なベクターとして考えられている。先行技術による一部の手法であって、アルファウイルスを、遺伝情報の送達のためのベクターとして使用する手法については、Ｓｔｒａｕｓｓ及びＳｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．４９１－５６２により総説されており、より近年では、Ｌｊｕｎｇｂｅｒｇ及びＬｉｌｊｅｓｔｒｏｍ，２０１５，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ，ｖｏｌ．１４，ｐｐ．１７７－９４により総説されている。既に、Ｓｔｒａｕｓｓ及びＳｔｒａｕｓｓは、アルファウイルスベースのベクターが、遺伝情報の送達に、特に有利であると考え、これらの著者らは、サブゲノムプロモーターの下流において、目的のタンパク質をコードするベクターについて記載している。それぞれの核酸分子（レプリコン）を、図１Ｂに、概略的に描示する。図１Ｂに概略的に描示されるレプリコンを、宿主細胞へと導入すると、コードされるレプリカーゼが合成され、膜陥入を伴って複製複合体を形成し、これはシス複製を優先することが想定される。シス優先的複製は、アルファウイルスと同様のゲノム構成を伴うトガウイルス（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）科のメンバーである、風疹ウイルス（Ｒｕｂｅｌｌａ ｖｉｒｕｓ）（Liang及びGillam, 2001, Virology 282, 307-319）で裏付けられた。
しかし、複製は、シス制約的ではなく、２つの個別の核酸分子上のアルファウイルスエレメントに依拠するトランス複製についても記載されている。アルファウイルス由来のトランス複製システムは、１つの核酸分子が、ウイルスレプリカーゼをコードし、他の核酸分子が、トランスで前記レプリカーゼによる複製（トランス複製システム）が可能である、２つの核酸分子を含む。このようなトランス複製システムは、トランス複製のために、単一の宿主細胞内の、両方の核酸分子の存在を必要とする。
ウイルスＲＮＡベクターは、繁殖コンピテントのウイルス粒子を形成することにより、治療される個体において繁殖するそれらの潜在的可能性のために、しばしば、不利であると考えられている。これは、治療される個体についての健康上の危険性だけではなく、また、一般的な人口についての健康上の危険性とも関連すし、例えば、一部のアルファウイルスは、ヒトに対して病原性である（例えば、チクングニヤウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）；アルファウイルスの、ヒト及び動物の疾患における役割については、Strauss及びStrauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562において総説されている）。
代替法では、非ウイルス性トランス複製システムを、宿主細胞へと導入することが提起された（Sanz等, Cellular Microbiol., 2015, vol. 17, pp. 520-541、Spuul等, J. Virol., 2011, vol. 85, pp. 4739-4751）。これらの参考文献に従うトランス複製システムは、ＤＮＡベクターの、宿主細胞への導入に基づき、この場合、ベクターは、バクテリオファージＴ７プロモーターを含有し、宿主細胞は、Ｔ７ポリメラーゼを発現する、特化された操作細胞である（Buchholz等, J. Virol., 1999, vol. 73, pp. 251-259）。Ｓｐｕｕｌらにより使用されたＤＮＡコンストラクトは、Ｔ７プロモーターの下流において、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメントをコードし、この論文によれば、ＩＲＥＳエレメントは、おそらく、細胞内のＴ７ポリメラーゼにより合成される、キャップなしのＲＮＡ転写物の発現の増強に関与する。Ｓａｎｚ等は、加えて、ＩＲＥＳの下流における、ＲＮＡレプリカーゼコンストラクト（ｎｓＰ１－４をコードする）の直接的な使用についても記載し、ＲＮＡコンストラクトを、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、キャップ構造であるｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇの非存在下で調製する。まとめると、これらの２つの研究は、トランス複製システムが、バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼを発現する操作宿主細胞内でＲＮＡを合成するための、バクテリオファージプロモーターを伴う間接的なＤＮＡベクターとして、又はレプリカーゼの翻訳を駆動するために、ＩＲＥＳを含む、直接的なＲＮＡシステムの形態で機能的であることを示す。
安全性の懸念を念頭に、医学コミュニティー及び獣医学コミュニティーは、ＤＮＡベクター又は自己複製ウイルス核酸を、ヒト又は動物へと投与することに消極的である。これに加え、核酸、特に、ＲＮＡの送達のための多くの先行技術による手法は、トランス遺伝子の不満足な発現レベルを伴う。
したがって、ワクチンなど、治療価値を伴うタンパク質をコードする核酸を送達する、安全且つ効率的な方法が必要とされている。本明細書で記載される通り、本発明の態様及び実施態様は、この必要に取り組む。
免疫療法的戦略は、例えば、感染性疾患及び癌疾患の予防及び治療のための、有望な選択肢である。ますます多数の病原体関連抗原及び腫瘍関連抗原の同定は、免疫療法に適する標的の広範なコレクションをもたらした。本発明は、一般に、疾患を予防及び治療するための、効率的な免疫療法による治療に適する薬剤及び方法を包含する。
第１の態様では、本発明は、
アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクトと、
トランスで、レプリカーゼにより複製することができるＲＮＡレプリコンと
を含み、
アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクトが、レプリカーゼによる翻訳を駆動するための５’キャップを含む
システムを提供する。
一実施態様では、５’キャップは、天然の５’キャップ又は５’キャップ類似体である。
一実施態様では、アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクトは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを含まない。したがって、レプリカーゼの翻訳は、ＩＲＥＳエレメントにより駆動されない。
一実施態様では、アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクトは、レプリカーゼをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。加えて、５’－ＵＴＲ及び／又は３’－ＵＴＲも存在しうる。好ましい実施態様では、アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクトは、
（１）５’ＵＴＲと、
（２）レプリカーゼをコードするオープンリーディングフレームと、
（３）３’ＵＴＲと
を含む。
好ましくは、５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲは、レプリカーゼが由来するアルファウイルスに対して、異種又は非天然である。
好ましくは、アルファウイルスレプリカーゼをコードするオープンリーディングフレームは、ＲＮＡの複製に必要とされる非構造タンパク質のコード領域を含む。
一実施態様では、アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクトは、３’ポリ（Ａ）配列を含む。
一実施態様では、アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクトを、レプリカーゼにより複製することができない。
一実施態様では、ＲＮＡレプリコンは、
（１）アルファウイルスの５’複製認識配列と、
（２）アルファウイルスの３’複製認識配列と
を含む。
一実施態様では、アルファウイルスの５’複製認識配列及びアルファウイルスの３’複製認識配列は、レプリカーゼの存在下で、ＲＮＡレプリコンの複製を導くことが可能である。したがって、アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクト及びＲＮＡレプリコンが、共に存在する場合、これらの複製認識配列は、ＲＮＡの複製を導く。
一実施態様では、アルファウイルスの５’複製認識配列及びアルファウイルスの３’複製認識配列は、レプリカーゼが由来するアルファウイルスに対して天然である。
一実施態様では、ＲＮＡレプリコンは、異種核酸を含む。
一実施態様では、ＲＮＡレプリコンは、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。
好ましくは、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、レプリカーゼが由来するアルファウイルスに対して非天然である。好ましくは、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、アルファウイルスの構造タンパク質をコードしない。
一実施態様では、ＲＮＡレプリコンは、サブゲノムプロモーターを含む。
好ましくは、目的のタンパク質（すなわち、目的の遺伝子）をコードする遺伝子は、サブゲノムプロモーターの制御下にある。これは、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームの発現を、サブゲノムプロモーターの制御下に置くことを可能とする。
好ましくは、サブゲノムプロモーターは、レプリカーゼが由来するアルファウイルスに対して天然である。
好ましくは、サブゲノムプロモーターは、アルファウイルスの構造タンパク質のためのプロモーターである。これは、サブゲノムプロモーターが、アルファウイルスに対して天然であり、前記アルファウイルス内の、１又は複数の構造タンパク質の遺伝子の転写を制御するプロモーターであることを意味する。
一実施態様では、ＲＮＡレプリコンは、３’ポリ（Ａ）配列を含む。
１つの代替的な実施態様又は更なる実施態様では、ＲＮＡレプリコンは、５’キャップを含む。
一実施態様では、アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクト、及び／又はＲＮＡレプリコンは、インタクトのアルファウイルス構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含まない。
一実施態様では、アルファウイルスは、セムリキ森林ウイルスである。
第２の態様では、本発明は、レプリカーゼによる翻訳を駆動するための５’キャップを含む、アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクトを提供する。
第３の態様では、本発明は、本発明の第１の態様に従う、アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクト、本発明の第１の態様に従うＲＮＡレプリコン、又はこれらの両方をコードする核酸配列を含むＤＮＡを提供する。好ましくは、ＤＮＡは、本発明の第１の態様に従うシステムをコードする。
第４の態様では、本発明は、
（ａ）アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクトを得る工程と、
（ｂ）トランスで、レプリカーゼによる複製が可能であり、タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むＲＮＡレプリコンを得る工程と、
（ｃ）アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクトと、ＲＮＡレプリコンとを、細胞へと共接種する工程と
を含み、
アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクトが、レプリカーゼによる翻訳を駆動するための５’キャップを含む、
細胞内でタンパク質を作製するための方法を提供する。
方法についての多様な実施態様では、アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクト、及び／又はＲＮＡレプリコンは、本発明のシステムについて上記で規定した通りである。
第５の態様では、本発明は、第１の態様のシステムを含有する細胞を提供する。一実施態様では、細胞を、第４の態様に従う方法に従い接種する。一実施態様では、細胞は、本発明の第４の態様の方法により得られる。一実施態様では、細胞は、生物の一部である。
第６の態様では、本発明は、
（ａ）アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクトを得る工程と、
（ｂ）トランスで、レプリカーゼによる複製が可能であり、タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むＲＮＡレプリコンを得る工程と、
（ｃ）アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクトと、ＲＮＡレプリコンとを、対象へと投与する工程と
を含み、
アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクトが、レプリカーゼによる翻訳を駆動するための５’キャップを含む、
対象においてタンパク質を作製するための方法を提供する。
方法についての多様な実施態様では、アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクト、及び／又はＲＮＡレプリコンは、本発明のシステムについて上記で規定した通りである。
アルファウイルスゲノムの構成と、アルファウイルスゲノムに由来するエレメントを含む操作核酸コンストラクトとを示す図である。 記号及び略号：Ａｎ：ポリ（Ａ）テール、Ｃ：キャップ、ＳＧＰ：サブゲノムプロモーター（ＣＳＥ３を含む）、ＳＦＶ：セムリキ森林ウイルス、ＣＳＥ：保存配列エレメント。 図１Ａ：アルファウイルスのゲノムが、大型ポリタンパク質の２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする、プラス鎖の一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ（＋））であることを示す図である。ゲノムの５’末端におけるＯＲＦは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（レプリカーゼ）へと翻訳され、プロセシングされる、非構造タンパク質であるｎｓＰ１からｎｓＰ４（ｎｓＰ１－４）をコードし、３’末端におけるＯＲＦは、構造タンパク質（カプシド及び糖タンパク質）をコードする。３’末端におけるＯＲＦは、サブゲノムプロモーター（ＳＧＰ）による転写制御下にある。アルファウイルスゲノムを、シス複製システムと称することができる。 図１Ｂ：シスレプリコンを示す図である。遺伝子操作により、サブゲノムプロモーター（ＳＧＰ）の下流の構造タンパク質を、目的の遺伝子で置き換えることができる。アルファウイルスレプリカーゼによる複製能を有するそれぞれのコンストラクトを、シスレプリコンと称する。シスレプリコンは、本発明のトランスレプリコンと異なる（「発明を実施する形態」を参照されたい）。 図１Ｃ：本発明のトランス複製システムの態様についての概略表示を示す図である。トランス複製システムでは、アルファウイルスレプリカーゼをコードするＲＮＡ（レプリカーゼコンストラクト）と、ＲＮＡレプリコン（「トランスレプリコン」）とは、２つの個別のＲＮＡ分子である。ＲＮＡレプリコンは、好ましくは、目的の遺伝子をコードする。好ましくは、レプリカーゼコンストラクトは、５’キャップ、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、及びポリ（Ａ）テール（レプリカーゼをコードするｍＲＮＡ）のうちの１又は複数、好ましくは、全てを伴う細胞内ｍＲＮＡに相似する。レプリカーゼコンストラクトは、典型的に、アルファウイルスレプリカーゼによる複製に必要とされる配列エレメントを欠く。しかし、アルファウイルスレプリカーゼによる複製に必要とされる配列エレメントは、ＲＮＡレプリコン上に配置される。一部の実施態様では、ＲＮＡレプリコンは、ＣＳＥ１、ＣＳＥ２、及びＣＳＥ４、並びにＳＧＰを含む。 キャップジヌクレオチドの構造を示す図である。 上：天然のキャップジヌクレオチドである、ｍ７ＧｐｐｐＧ。 下：ホスホロチオエートキャップ類似体である、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡジヌクレオチド：逆相ＨＰＬＣにおけるそれらの溶出特徴に従い、Ｄ１及びＤ２と称する、立体中心であるＰ中心のために、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡには、２つのジアステレオマーが存在する。 レプリコンによりコードされるトランス遺伝子の発現の効率が、レプリカーゼをコードするＯＲＦの分子環境に依存することを示す図である。ＢＨＫ２１細胞への、シスレプリコンＲＮＡとトランスレプリコンＲＮＡとの共送達（左）、又はレプリカーゼをコードするｍＲＮＡと、トランスレプリコンＲＮＡとの共送達（右）（実施例１）の後において、ＦＡＣＳにより測定される、ｅＧＦＰの蛍光強度。ｅＧＦＰ陽性細胞の百分率（バー）、及びｅＧＦＰ陽性細胞の平均値蛍光強度（ＭＦＩ）（菱形）が示される。ｍＲＮＡ＝本発明に従うレプリカーゼコンストラクト。 初代細胞内の遺伝子発現が、トランス複製システムの効率を確認することを示す図である。シス複製システム（ｅＧＦＰレプリコンＲＮＡ）の、ヒト包皮線維芽細胞への送達、又はトランス複製システム（レプリカーゼＲＮＡ及びトランスレプリコンＲＮＡを含む）の、ヒト包皮線維芽細胞への共送達の後に測定されたｅＧＦＰの蛍光強度。ワクシニアウイルスプロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）阻害剤Ｅ３をコードするＲＮＡを共送達して、ＰＫＲの活性化を抑制し、これにより、ＲＮＡの翻訳を増加させた（実施例２）。ｅＧＦＰ陽性細胞の百分率（バー）、及びｅＧＦＰ陽性細胞の平均値蛍光強度（ＭＦＩ）（菱形）が示される。 レプリカーゼのＲＮＡ及びレプリカーゼのコドン使用の量の影響を示す図である。初代ヒト包皮線維芽細胞への、異なる量の、ｍレプリカーゼをコードするＲＮＡのリポフェクションの後に測定された、相対光単位［ＲＬＵ］（分泌型ＮａｎｏＬｕｃ）（実施例３）を示す図である。 レプリカーゼのＲＮＡ及びレプリカーゼのコドン使用の量の影響を示す図である。レプリカーゼＲＮＡ及びトランスレプリコンＲＮＡの、ＢＨＫ２１細胞への共送達後に、ＦＡＣＳにより測定されたｅＧＦＰの蛍光強度（実施例４）を示す図である。ｅＧＦＰ陽性細胞の百分率（バー）、及びｅＧＦＰ陽性細胞の平均値蛍光強度（ＭＦＩ）（菱形）が示される。実施例４で記載する通り、コドン使用の修飾は、トランス遺伝子の発現、及びトランスレプリコンの生産的な複製に有利ではない（詳細については、実施例４を参照されたい）。ｈｓのコドン使用：ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）に適合させたコドン使用、ｗｔのコドン使用：野生型アルファウイルスのコドン使用。 下部：ｍｙｃ－ｎｓＰ３及びアクチンのレベルを指し示すウェスタンブロット。 ｉｎ ｖｉｖｏにおける、効率的な、トランスレプリコンによりコードされる、トランス遺伝子の発現を示す図である。ルシフェラーゼをコードするトランスレプリコンＲＮＡと、ｍＲＮＡの形態のレプリカーゼコンストラクトとを含む、本発明に従うトランス複製システムの、筋内（ｉ．ｍ．）及び皮内（ｉ．ｄ．）共注射後における、マウスについての生物発光イメージング（ＢＬＩ）（実施例５）。発光は、１秒間当たりの光子［ｐ／秒］で表される。 インフルエンザＨＡを、目的のタンパク質としてコードするトランスレプリコンが、致死性のウイルス感染からの防御をもたらすことを示す図である。実施例６で記載する通り、Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、インフルエンザＨＡ（Ｒ－ＨＡ）をコードする、５μｇのシスレプリコン、又は１μｇのトランスレプリコン（ＴＲ－ＨＡ）を、３週間以内に、２回にわたり（プライム－ブースト）、皮内ワクチン接種した。適応の場合、４μｇから１４μｇの、レプリカーゼをコードするｍＲＮＡを、トランスレプリコンと共投与した。適応の場合、翻訳を増強するために、ワクシニアウイルスＥ３をコードするｍＲＮＡを共投与した。 ポジティブコントロール：不活化ウイルス（ＩＡＶ）。ネガティブコントロール：溶媒（ＰＢＳ緩衝液）。 図７Ａ：致死性用量のインフルエンザウイルスによるチャレンジ感染の前日における、ウイルス中和力価（ＶＮＴ）の決定を示す図である。 図７Ｂ：マウス血清についての、ヘマグルチニン阻害（ＨＡＩ）アッセイを示す図である。 図７Ｃ：チャレンジ感染におけるマウスの生存を示す、カプラン－マイヤー曲線を示す図である。緩衝液で治療されたマウスは、５日以内に死んだ。 キャップの影響を示す図である。ＢＨＫ２１細胞に、レプリカーゼＯＲＦの上流に、ＩＲＥＳ（ＥＭＣＶ）（脳心筋炎ウイルスに由来する内部リボソーム侵入部位）を伴う、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ２）キャップありのレプリカーゼｍＲＮＡ又はキャップなしのｍＲＮＡと共に、自己切断型ペプチドであるＰ２Ａ（ブタテッショウウイルス１ ２Ａ）により隔てられた、ｅＧＦＰ及びｓｅｃＮＬｕｃ（分泌型ルシフェラーゼ）をコードするトランスレプリコンＲＮＡをエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの２４時間後に、細胞を、ＦＡＣＳにより、ｅＧＦＰ発現について解析し（Ａ）、上清を、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により、ｓｅｃＮＬｕｃの分泌レベルについて解析した（Ｂ）。 キャップの影響を示す図である。ＢＨＫ２１細胞に、レプリカーゼＯＲＦの上流に、ＩＲＥＳ（ＥＭＣＶ）（脳心筋炎ウイルスに由来する内部リボソーム侵入部位）を伴う、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ２）キャップありのレプリカーゼｍＲＮＡ又はキャップなしのｍＲＮＡと共に、自己切断型ペプチドであるＰ２Ａ（ブタテッショウウイルス１ ２Ａ）により隔てられた、ｅＧＦＰ及びｓｅｃＮＬｕｃ（分泌型ルシフェラーゼ）をコードするトランスレプリコンＲＮＡをエレクトロポレーションした。レプリカーゼの発現について、ウェスタンブロットにより解析した。
本発明について、下記で詳細に記載するが、本発明は、それらは、変動しうるので、本明細書で記載される特定の方法、プロトコール、及び試薬に限定されるものでないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語法は、特定の実施態様について記載することだけを目的とするものであり、付属の特許請求の範囲だけにより限定される、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されたい。そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される、全ての技術用語及び科学用語は、当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。
好ましくは、本明細書で使用される用語は、“Ａ ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）”、Ｈ．Ｇ．Ｗ．Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ、Ｂ．Ｎａｇｅｌ、及びＨ．Ｋｏｅｌｂｌ編、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、ＣＨ－４０１０ Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ（１９９５）において記載されている通りに規定される。
本発明の実施では、そうでないことが指し示されない限りにおいて、当技術分野の範囲内の、化学、生化学、細胞生物学、免疫学、及び組換えＤＮＡ法の従来の方法が利用され、これらについては、当技術分野の文献において説明されている（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition， J. Sambrook等編， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor 1989を参照されたい）。
以下では、本発明の要素について記載する。これらの要素を、具体的な実施態様と列挙するが、それらを、任意の形及び任意の数で組み合わせて、更なる実施態様を創出しうることを理解されたい。様々に記載される例及び好ましい実施態様は、本発明を、明示的に記載された実施態様だけに限定するようには解釈されないものとする。この記載は、明示的に記載された実施態様を、任意の数の、開示された要素及び／又は好ましい要素と組み合わせる実施態様を開示し、包含するように理解されるものとする。更に、本出願で記載される全ての要素の、任意の順列及び組合せは、文脈によりそうでないことが指し示されない限りにおいて、この記載により開示されると考えられるものとする。
「約」という用語は、「およそ」又は「ほぼ」を意味し、本明細書で明示される数値又は範囲の文脈では、好ましくは、引用されるか又は主張される数値又は範囲の±１０％を意味する。
「ある（ａ）」及び「ある（ａｎ）」及び「その」、並びに本発明について記載する文脈で（とりわけ、特許請求の範囲の文脈で）使用される類似の言及は、本明細書でそうでないことが指し示されないか、又は文脈により明確に否定されない限りにおいて、単数及び複数の両方を対象とするように解釈されるものとする。本明細書における値の範囲の列挙は、範囲内に収まる各個別の値に、個々に言及することの縮約法として用いられることだけを意図するものである。本明細書でそうでないことが指し示されない限りにおいて、各個別の値は、本明細書で個別に列挙された場合と同様に、本明細書で利用される。本明細書でそうでないことが指し示されないか、又は文脈により明確に否定されない限りにおいて、本明細書で記載される全ての方法は、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提示される、任意の例及び全ての例、又は例示のための表現（例えば、「など」）の使用は、本発明をよりよく例示することだけを意図するものであり、他の形で特許請求される本発明の範囲に、限定を施すものではない。本明細書におけるいかなる表現も、本発明の実施に不可欠な、任意の、特許請求されていない要素を指し示すとは解釈されないものとする。
そうでないことが明示的に指定されない限りにおいて、「～を含むこと」という用語は、本文献の文脈では、「～を含むこと」により導入されるリストのメンバーに加えて、更なるメンバーも、任意選択で存在しうることを指し示すのに使用される。しかし、本発明の具体的実施態様として、「～を含むこと」という用語は、更なるメンバーが存在しない可能性も包含する、ことも想定される。すなわち、この実施態様の目的では、「～を含むこと」とは、「～からなること」の意味を有すると理解されるものとする。
総称により特徴づけられる構成要素の相対量の表示は、前記総称が対象とする、全ての特異的変異体又はメンバーの総量を指すことを意図する。総称により規定される、ある特定の構成要素が、ある特定の相対量で存在することが指定され、この構成要素が、総称により特徴づけられる特定の変異体又はメンバーであることが更に特徴づけられる場合、総称により対象とされる構成要素の全相対量が、指定された相対量を超えるように、総称により対象とされる、他の変異体又はメンバーも更に存在することはなく、より好ましくは、総称により対象とされる、他の変異体又はメンバーは、全く存在しないことを意味する。
いくつかの文献が、本明細書の本文を通して引用される。本明細書で引用される文献の各々（全ての特許、特許出願、学術刊行物、製造元の仕様、指示書などを含む）は、上記の引用であれ、下記の引用であれ、出典明示によりそれらの全体において利用される。本明細書におけるいかなる事柄も、本発明が、このような開示に先行する権利が与えられていないことの容認として解釈されないものとする。
本明細書で使用される「～を低減する」又は「～を阻害する」などの用語は、好ましくは、５％又はこれを超える、１０％又はこれを超える、２０％又はこれを超える、より好ましくは、５０％又はこれを超えるレベルの全体的な低下を引き起こし、最も好ましくは、７５％又はこれを超えるレベルの全体的な低下を引き起こす能力を意味する。「～を阻害する」という用語又は同様の語句は、完全又は本質的に完全な阻害、すなわち、ゼロ又は本質的にゼロへの低減を含む。
「～を増加させる」又は「～を増強する」などの用語は、好ましくは、少なくとも約１０％、好ましくは、少なくとも２０％、好ましくは、少なくとも３０％、より好ましくは、少なくとも４０％、より好ましくは、少なくとも５０％、なおより好ましくは、少なくとも８０％の増加又は増強に関し、最も好ましくは、少なくとも１００％の増加又は増強に関する。
「正味の電荷」という用語は、化合物又は粒子など、全対象物上の電荷を指す。
全体的な正味の正の電荷を有するイオンが、カチオンであるのに対し、全体的な正味の負の電荷を有するイオンは、アニオンである。したがって、本発明によると、アニオンとは、陽子より多くの電子を伴うイオンであり、正味の負の電荷をもたらすが、カチオンとは、陽子より少ない電子を伴うイオンであり、正味の正の電荷をもたらす。
所与の化合物又は粒子に言及する場合の「帯電した」、「正味の電荷」、「負に帯電した」、又は「正に帯電した」という用語は、ｐＨ７．０で、水中に溶解又は懸濁させた場合の、所与の化合物又は粒子の、正味の電荷を指す。
本発明によると、「核酸」という用語はまた、ヌクレオチド塩基上、糖上、又はリン酸上の核酸の化学的誘導、及び非天然のヌクレオチド及びヌクレオチド類似体を含有する核酸も含む。一部の実施態様では、核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）である。
本発明によると、「ＲＮＡ」又は「ＲＮＡ分子」という用語は、リボヌクレオチド残基を含み、好ましくは、リボヌクレオチド残基から、完全又は実質的に構成された分子に関する。「リボヌクレオチド」という用語は、β－Ｄ－リボフラノシル基の２’位に、ヒドロキシル基を伴うヌクレオチドに関する。「ＲＮＡ」という用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的又は完全に精製されたＲＮＡなどの単離ＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、並びに１又は複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換、及び／又は変更により、天然にあるＲＮＡと異なる修飾ＲＮＡなど、組換えにより生成されたＲＮＡを含む。このような変更は、ＲＮＡの末端又は内部、例えば、ＲＮＡの１又は複数のヌクレオチドなどにおける、非ヌクレオチド材料の付加を含みうる。ＲＮＡ分子内のヌクレオチドはまた、天然にないヌクレオチド又は化学的な合成ヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドなどの非標準的ヌクレオチドも含みうる。これらの変更ＲＮＡを、類似体、特に、天然にあるＲＮＡの類似体と称することができる。
本発明によると、ＲＮＡは、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もある。本発明の一部の実施態様では、一本鎖ＲＮＡが好ましい。「一本鎖ＲＮＡ」という用語は、一般に、相補的な核酸鎖（典型的に、相補的なＲＮＡ鎖、すなわち、相補的なＲＮＡ分子）が、ＲＮＡ分子と会合しない実施態様を指す。一本鎖ＲＮＡは、マイナス鎖［（－）鎖］として存在する場合もあり、プラス鎖［（＋）鎖］として存在する場合もある。（＋）鎖とは、遺伝情報を含むか又はコードする鎖である。遺伝情報は、例えば、タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列でありうる。（＋）鎖ＲＮＡが、タンパク質をコードする場合、（＋）鎖は、翻訳（タンパク質合成）のための鋳型として、直接用いられる。（－）鎖は、（＋）鎖の相補体である。二本鎖ＲＮＡの場合、（＋）鎖及び（－）鎖は、２つの個別のＲＮＡ分子であり、これらのＲＮＡ分子のいずれも、互いと会合して、二本鎖ＲＮＡ（「二重鎖ＲＮＡ」）を形成する。
ＲＮＡの「安定性」という用語は、ＲＮＡの「半減期」に関する。「半減期」とは、分子の活性、量、又は数の半分を消失させるのに必要とされる時間に関する。本発明の文脈では、ＲＮＡの半減期は、前記ＲＮＡの安定性を示す。ＲＮＡの半減期は、ＲＮＡの「発現の持続時間」に影響を及ぼしうる。半減期が長いＲＮＡは、長時間にわたり発現することが予測される。
「断片」又は「核酸配列の断片」とは、核酸配列の一部、すなわち、５’末端及び／又は３’末端において短縮された核酸配列を表す配列に関する。好ましくは、核酸配列の断片は、前記核酸配列に由来するヌクレオチド残基のうちの、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％を含む。本発明では、ＲＮＡの安定性及び／又は翻訳の効率を保持するＲＮＡ分子の断片が好ましい。
本発明によると、例えば、核酸及びアミノ酸配列に関する「変異体」という用語は、任意の変異体、特に、突然変異体、ウイルス株、スプライス変異体、コンフォメーション、アイソフォーム、対立遺伝子変異体、種変異体、及び種相同体、特に、天然に存在する変異体を含む。対立遺伝子変異体は、正常な遺伝子配列の変更に関するが、その意義は、不明であることが多い。完全な遺伝子シーケンシングは、所与の遺伝子に対する、多数の対立遺伝子変異体を同定することが多い。核酸分子に関して、「変異体」という用語は、縮重核酸配列を含むが、この場合、本発明に従う縮重核酸とは、遺伝子コードの縮重のために、コドン配列が基準核酸と異なる核酸である。種相同体とは、所与の核酸配列又はアミノ酸配列の種と由来が異なる種による核酸配列又はアミノ酸配列である。ウイルス相同体とは、所与の核酸配列又はアミノ酸配列のウイルスと由来が異なるウイルスによる核酸配列又はアミノ酸配列である。
本発明によると、核酸変異体は、基準核酸と比較した、単一の又は複数のヌクレオチドの欠失、付加、突然変異、及び／又は挿入を含む。欠失は、１又は複数のヌクレオチドの、基準核酸からの除去を含む。付加変異体は、１、２、３、５、１０、２０、３０、５０の、又はこれを超えるヌクレオチドなど、１又は複数のヌクレオチドの、５’末端及び／又は３’末端における融合を含む。突然変異は、配列内の少なくとも１つのヌクレオチドを除去し、別のヌクレオチドを、その場所に挿入する（塩基転換及び塩基転移など）置換、非塩基性部位、架橋部位、及び化学的に変更するか又は修飾した塩基を含みうるがこれらに限定されない。挿入は、少なくとも１つのヌクレオチドの、基準核酸への付加を含む。
特異的核酸配列の変異体は、好ましくは、前記特異的配列の、少なくとも１つの機能的な特性を有し、好ましくは、前記特異的配列と機能的に同等であり、例えば、核酸配列は、特異的核酸配列の特性と同一又は同様の特性を呈する。
好ましくは、所与の核酸配列と、前記所与の核酸配列の変異体である核酸配列との間の同一性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも７５％、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも８５％、なおより好ましくは、少なくとも９０％、又は最も好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％であろう。同一性の程度は、好ましくは、少なくとも約３０、少なくとも約５０、少なくとも約７０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、又は少なくとも約４００ヌクレオチドの領域について与えられる。好ましい実施態様では、同一性の程度は、基準核酸配列の全長について与えられる。
「配列類似性」とは、同一であるか、又は保存的アミノ酸置換を表すアミノ酸の百分率を指し示す。２つのポリペプチド又は核酸配列の間の「配列同一性」とは、配列の間で同一なアミノ酸又はヌクレオチドの百分率を指し示す。
「～％同一な」という用語は特に、比較される２つの配列の間の最適なアライメントにおいて同一なヌクレオチドの百分率であって、純粋に統計学的であり、２つの配列の間の差違が、配列の全長にわたり、ランダムに分布することが可能であり、２つの配列の間の最適なアライメントを得るために、比較される配列が、基準配列と比較した付加又は欠失を含む百分率を指すことを意図する。２つの配列の比較は通例、最適アライメントの後で、対応する配列の局所領域を同定するために、セグメント又は「比較域」に関して、前記配列を比較することにより実行する。比較のための最適アライメントは、手動で実行することもでき、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ、１９８１、Ａｄｓ Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２による局所的相同性アルゴリズムを一助として実行することもでき、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、１９７０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３による局所的相同性アルゴリズムを一助として実行することもでき、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，２４４４による類似性検索アルゴリズムを一助として実行することもでき、前記アルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ Ｎ、及びＴＦＡＳＴＡ in Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）を使用するコンピュータプログラムを一助として実行することもできる。
同一性百分率は、比較される配列が対応する同一な位置の数を決定し、この数を、比較される位置の数で除し、この結果に１００を乗ずることにより得られる。
例えば、ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｗｂｌａｓｔ２．ｃｇｉ上で入手可能なＢＬＡＳＴプログラムである、「ＢＬＡＳＴ２配列」を使用することができる。
２つの配列が、互いと相補的である場合、核酸は、別の核酸と「ハイブリダイズすることが可能である」か、又はこれと「ハイブリダイズする」。２つの配列が、互いと安定的な二重鎖を形成することが可能である場合、核酸は、別の核酸と「相補的」である。本発明によると、ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能とする条件（厳密な条件）下で実行することが好ましい。厳密な条件については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ等編、２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９、又はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ等編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋにおいて記載されており、例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液（３．５倍濃度のＳＳＣ、０．０２％のＦｉｃｏｌｌ、０．０２％のポリビニルピロリドン、０．０２％のウシ血清アルブミン、２．５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％のＳＤＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ）中、６５℃のハイブリダイゼーションを参照されたい。ＳＳＣとは、０．１５Ｍの塩化ナトリウム／０．１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７である。ハイブリダイゼーションの後、ＤＮＡを転写した膜を、例えば、２倍濃度のＳＳＣ中、室温で洗浄し、次いで０．１－０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳ中、最高６８℃で洗浄する。
相補性パーセントとは、第２の核酸配列と、水素結合（例えば、ワトソン－クリック型の塩基対合）を形成しうる、核酸分子内の連続残基の百分率（例えば、１０のうちの５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０が、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％相補的である）を指し示す。「完全に（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ）相補的」又は「完全に（ｆｕｌｌｙ）相補的」とは、核酸配列の全ての連続残基が、第２の核酸配列内の、同じ数の連続残基と水素結合することを意味する。好ましくは、本発明に従う相補性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも７５％、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも８５％、なおより好ましくは、少なくとも９０％、又は最も好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％である。最も好ましくは、本発明に従う相補性の程度は、１００％である。
「誘導体」という用語は、ヌクレオチド塩基上、糖上、又はリン酸上の核酸の任意の化学的誘導を含む。「誘導体」という用語はまた、天然にないヌクレオチド及びヌクレオチド類似体を含有する核酸も含む。好ましくは、核酸の誘導は、その安定性を増加させる。
本発明によると、「核酸配列に由来する核酸配列」とは、それが由来する核酸の変異体である核酸を指す。好ましくは、それがＲＮＡ分子内の特異的配列を置き換える場合、特異的配列に対して変異体である配列は、ＲＮＡの安定性及び／又は翻訳の効率を保持する。
「転写」及び「～を転写すること」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが、一本鎖ＲＮＡ分子を作製するように、特定の核酸配列を伴う核酸分子（「核酸鋳型」）が、ＲＮＡポリメラーゼにより読み取られる過程に関する。転写時には、核酸鋳型内の遺伝情報が転写される。核酸鋳型は、ＤＮＡでありうるが、例えば、アルファウイルスの核酸鋳型からの転写の場合、鋳型は、典型的に、ＲＮＡである。その後、転写されたＲＮＡは、タンパク質へと翻訳されうる。本発明によると、「転写」という用語は、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写」を含み、この場合、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写」という用語は、ＲＮＡ、特に、ｍＲＮＡが、ｉｎ ｖｉｔｒｏの、細胞非含有のシステム内で合成される過程に関する。好ましくは、転写物の生成に、クローニングベクターを適用する。これらのクローニングベクターは一般に、転写ベクターと称し、本発明による「ベクター」という用語に包含される。本発明によると、ＲＮＡは、好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）であり、適切なＤＮＡ鋳型のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により得ることができる。転写を制御するためのプロモーターは、任意のＲＮＡポリメラーゼのための、任意のプロモーターでありうる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特に、ｃＤＮＡのクローニングと、これを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に適するベクターへと導入することとにより得ることができる。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写により得ることができる。
転写時に産生される一本鎖核酸分子は、典型的に、鋳型の相補的な配列である核酸配列を有する。
本発明によると、「鋳型」又は「核酸鋳型」又は「鋳型核酸」という用語は一般に、複製又は転写されうる核酸配列を指す。
「核酸配列から転写された核酸配列」という用語は、該当する場合、鋳型核酸配列の転写産物である、完全なＲＮＡ分子の部分としての核酸配列を指す。典型的に、転写された核酸配列は、一本鎖ＲＮＡ分子である。
「核酸の３’末端」とは、本発明によると、遊離ヒドロキシ基を有する末端を指す。二本鎖核酸、特に、ＤＮＡについての概略表示では、３’末端は常に、右側にある。「核酸の５’末端」とは、本発明によると、遊離リン酸基を有する末端を指す。二本鎖核酸、特に、ＤＮＡについての概略表示では、５’末端は常に、左側にある。
５’末端 ５’－－Ｐ－ＮＮＮＮＮＮＮ－ＯＨ－３’ ３’末端
３’－ＨＯ－ＮＮＮＮＮＮＮ－Ｐ－－５’
「上流」とは、核酸分子の第１のエレメントの、この核酸分子の第２のエレメントに対する相対的配置であって、いずれのエレメントも、同じ核酸分子内に含まれ、第１のエレメントを、この核酸分子の第２のエレメントより、核酸の５’末端分子の近くに配置した相対的配置について記載する。したがって、第２のエレメントを、この核酸分子の第１のエレメントの「下流」であるという。第２のエレメントの「上流」に配置されるエレメントは、この第２のエレメントの「５’」側に配置されていることと同義に称することができる。二本鎖核酸分子については、「上流」及び「下流」などの表示は、（＋）鎖に関してなされる。
本発明によると、「機能的な連結」又は「機能的に連結された」は、機能的な関係内にある接続に関する。核酸は、それが、別の核酸配列と機能的に関連する場合、「機能的に連結」されている。例えば、プロモーターは、それが、前記コード配列の転写に影響を与える場合、コード配列へと機能的に連結されている。機能的に連結された核酸は典型的に、互いと隣接し、該当する場合、更なる核酸配列により隔てられ、特定の実施態様では、ＲＮＡポリメラーゼにより転写されて、単一のＲＮＡ分子（一般的な転写物）をもたらす。
特定の実施態様では、核酸を、本発明によると、核酸に対して相同な場合もあり、異種の場合もある、発現制御配列と、機能的に連結する。
「発現制御配列」という用語は、本発明に従うプロモーター、リボソーム結合性配列、及び遺伝子の転写、又はこれに由来するＲＮＡの翻訳を制御する、他の制御エレメントを含む。本発明の特定の実施態様では、発現制御配列を調節することができる。発現制御配列の正確な構造は、種又は細胞型に応じて変動しうるが、通例、それぞれ、転写及び翻訳の開始に関与する、５’非転写配列、並びに５’非翻訳配列及び３’非翻訳配列を含む。より具体的には、５’非転写発現制御配列は、機能的に連結された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。発現制御配列はまた、エンハンサー配列又は上流のアクチベーター配列も含みうる。ＤＮＡ分子の発現制御配列は、通例、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などの、５’非転写配列、並びに５’非翻訳配列及び３’非翻訳配列を含む。アルファウイルスＲＮＡの発現制御配列は、サブゲノムプロモーター、及び／又は１若しくは複数の保存配列エレメントを含みうる。本発明に従う具体的な発現制御配列は、本明細書で記載される、アルファウイルスのサブゲノムプロモーターである。
本明細書で指定される核酸配列、特に、転写可能なコード核酸配列は、前記核酸配列に対して、相同な場合もあり、異種の場合もある、任意の発現制御配列、特に、プロモーターと組み合わせることができるが、この場合、「相同」という用語は、核酸配列が、天然においてもまた、発現制御配列と機能的に連結されているという事実を指し、「異種」という用語は、核酸配列が、天然では、発現制御配列と機能的に連結されていないという事実を指す。
転写される核酸配列、特に、ペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列と、発現制御配列とは、それらが、互いと、転写される核酸配列の転写又は発現、特に、コード核酸配列の転写又は発現が、発現制御配列の制御下にあるか、又は影響下にあるような形で、共有結合的に連結されている場合、互いと「機能的に」連結されている。核酸配列を、機能的なペプチド又はタンパク質へと翻訳しようとする場合、コード配列へと機能的に連結された発現制御配列の誘導は、コード配列内でフレームシフトを引き起こさずに、又は所望されるペプチド又はタンパク質へと翻訳することが不可能なコード配列を伴わずに、前記コード配列の転写を結果としてもたらす。
「プロモーター」又は「プロモーター領域」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼに対する認識部位及び結合性部位をもたらすことにより、転写物、例えば、コード配列を含む転写物の合成を制御する核酸配列を指す。プロモーター領域は、前記遺伝子の転写の調節に関与する、更なる因子に対する、更なる認識部位又は結合性部位を含みうる。プロモーターは、原核生物の遺伝子の転写を制御する場合もあり、真核生物の遺伝子の転写を制御する場合もある。プロモーターは、「誘導性」プロモーターであり、インデューサーに応答して、転写を開始する場合もあり、転写が、インデューサーにより制御されず、「構成的」プロモーターである場合もある。インデューサーが非存在である場合、誘導性プロモーターは、極めてわずかな程度に限り発現するか、又は全く発現しない。インデューサーの存在下では、遺伝子は、「オンに切り替え」られるか、又は転写のレベルが増加する。これは通例、特異的転写因子の結合により媒介される。本発明に従う特異的プロモーターは、本明細書で記載される、アルファウイルスのサブゲノムプロモーターである。他の特異的プロモーターは、アルファウイルスの、ゲノムのプラス鎖又はマイナス鎖のプロモーターである。
「コアプロモーター」という用語は、プロモーターに含まれる核酸配列を指す。コアプロモーターは、典型的に、転写を適正に開始するのに必要とされるプロモーターの最小部分である。コアプロモーターは、典型的に、転写開始部位と、ＲＮＡポリメラーゼに対する結合性部位とを含む。
「ポリメラーゼ」とは、一般に、単量体の構成単位からのポリマー分子の合成を触媒することが可能な分子実体を指す。「ＲＮＡポリメラーゼ」とは、リボヌクレオチド構成単位からのＲＮＡ分子の合成を触媒することが可能な分子実体である。「ＤＮＡポリメラーゼ」とは、デオキシリボヌクレオチド構成単位からのＤＮＡ分子の合成を触媒することが可能な分子実体である。ＤＮＡポリメラーゼ及びＲＮＡポリメラーゼの場合、分子実体は、典型的に、タンパク質、又は複数のタンパク質のアセンブリー若しくは複合体である。典型的に、ＤＮＡポリメラーゼは、典型的にＤＮＡ分子である鋳型核酸に基づき、ＤＮＡ分子を合成する。典型的に、ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ分子（この場合、ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであるＤｄＲＰである）、又はＲＮＡ分子（この場合、ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであるＲｄＲＰである）である鋳型核酸に基づき、ＲＮＡ分子を合成する。
「ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」又は「ＲｄＲＰ」とは、ＲＮＡ鋳型からのＲＮＡの転写を触媒する酵素である。アルファウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの場合、ゲノムＲＮＡ及び（＋）鎖のゲノムＲＮＡの、（－）鎖相補体の逐次的合成は、ＲＮＡの複製をもたらす。したがって、アルファウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、同義に、「ＲＮＡレプリカーゼ」とも称する。天然では、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、典型的に、レトロウイルスを除く、全てのＲＮＡウイルスによりコードされる。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードするウイルスの典型的な代表例は、アルファウイルスである。
本発明によると、「ＲＮＡの複製」とは、一般に、所与のＲＮＡ分子（鋳型ＲＮＡ分子）のヌクレオチド配列に基づき合成されるＲＮＡ分子を指す。合成されるＲＮＡ分子は、例えば、鋳型ＲＮＡ分子と同一であるか、又は相補的でありうる。一般に、ＲＮＡの複製は、ＤＮＡ中間体の合成を介して生じる場合もあり、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）により媒介される、ＲＮＡ依存性ＲＮＡの複製により直接生じる場合もある。アルファウイルスの場合、ＲＮＡの複製は、ＤＮＡ中間体を介して生じず、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）により媒介される。つまり、鋳型ＲＮＡ鎖（第１のＲＮＡ鎖）は、第１のＲＮＡ鎖又はその一部と相補的な、第２のＲＮＡ鎖の合成のための鋳型として用いられる。第２のＲＮＡ鎖は、任意選択で、第２のＲＮＡ鎖又はその一部と相補的な、第３のＲＮＡ鎖の合成のための鋳型として用いられうる。したがって、第３のＲＮＡ鎖は、第１のＲＮＡ鎖又はその一部と同一である。したがって、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型の相補的なＲＮＡ鎖を、直接的に合成することが可能であり、同一なＲＮＡ鎖を、間接的に合成すること（相補的な中間体鎖を介して）が可能である。
本発明によると、「遺伝子」という用語は、１又は複数の細胞産物を産生し、且つ／又は１若しくは複数の細胞間機能若しくは細胞内機能を達成する一因となる、特定の核酸配列を指す。より具体的には、前記用語は、特異的なタンパク質又は機能的若しくは構造的なＲＮＡ分子をコードする核酸を含む核酸区画（典型的には、ＤＮＡであるが、ＲＮＡウイルスの場合には、ＲＮＡ）に関する。
本明細書で使用される「単離分子」とは、他の細胞物質など、他の分子を実質的に含まない分子を指すことを意図する。「単離核酸」という用語は、本発明によると、核酸が、（ｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅されているか、（ｉｉ）クローニングにより、組換えで作製されているか、（ｉｉｉ）例えば、切断及びゲル電気泳動分画により精製されているか、又は（ｉｖ）例えば、化学合成により合成されていることを意味する。単離核酸は、組換え法による操作に利用可能な核酸である。
「ベクター」という用語は、本明細書では、その最も一般的な意味で使用され、例えば、前記核酸を、原核宿主細胞及び／又は真核宿主細胞へと導入し、該当する場合、ゲノムへと組み込むことを可能とする、核酸のための任意の中間媒体を含む。このようなベクターは、細胞内で複製及び／又は発現されることが好ましい。ベクターは、プラスミド、ファージミド、ウイルスゲノム、及びこれらの部分を含む。
本発明の文脈における「組換え」という用語は、「遺伝子操作により作製された」ことを意味する。好ましくは、本発明の文脈における組換え細胞などの「組換え対象物」とは、天然にあるものではない。
本明細書で使用される「天然にある」という用語は、対象物が、天然で見出されうるという事実を指す。例えば、生物（ウイルスを含む）に存在し、天然の供給源から単離することができ、実験室内で、意図的に改変されていないペプチド又は核酸は、天然にあるものである。
本発明によると、「発現」という用語は、その最も一般的な意味で使用され、ＲＮＡ、又はＲＮＡ及びタンパク質の産生を含む。発現はまた、核酸の部分的な発現も含む。更に、発現は、一過性の場合もあり、安定的な場合もある。ＲＮＡに関して、「発現」又は「翻訳」という用語は、メッセンジャーＲＮＡの鎖が、ペプチド又はタンパク質を作り出すように、アミノ酸の配列のアセンブリーを導く、細胞のリボソーム内の過程に関する。
本発明によると、「ｍＲＮＡ」という用語は、「メッセンジャーＲＮＡ」を意味し、典型的に、ＤＮＡ鋳型を使用することにより生成し、ペプチド又はタンパク質をコードする転写物に関する。典型的に、ｍＲＮＡは、５’－ＵＴＲ、タンパク質コード領域、３’－ＵＴＲ、及びポリ（Ａ）配列を含む。ｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により、ＤＮＡ鋳型から生成させることができる。当業者には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写法が公知である。例えば、様々なｉｎ ｖｉｔｒｏ転写キットが市販されている。本発明によると、修飾及びキャッピングを安定化させることにより、ｍＲＮＡを改変することができる。
本発明によると、「ポリ（Ａ）配列」又は「ポリ（Ａ）テール」という用語は、典型的に、ＲＮＡ分子の３’末端に配置される、アデニル酸残基の、間断のない配列又は間断のある配列を指す。間断のない配列は、連続アデニル酸残基を特徴とする。天然では、間断のないポリ（Ａ）配列が典型的である。ポリ（Ａ）配列は、通常、真核ＤＮＡ内ではコードされないが、真核細胞による転写後に、細胞の核内で、鋳型非依存性ＲＮＡポリメラーゼにより、ＲＮＡの遊離３’末端へと接合し、本発明は、ＤＮＡによりコードされるポリ（Ａ）配列を含む。
本発明によると、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡなどの核酸は、ペプチド又はタンパク質をコードしうる。したがって、転写可能な核酸配列又はその転写物は、ペプチド又はタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有しうる。
本発明によると、「ペプチド又はタンパク質をコードする核酸」という用語は、核酸が、適切な環境内、好ましくは、細胞内に存在する場合、翻訳の過程において、ペプチド又はタンパク質を産生するように、アミノ酸のアセンブリーを導きうることを意味する。好ましくは、本発明に従うＲＮＡは、ペプチド又はタンパク質の翻訳を可能とする、細胞の翻訳機構と相互作用することが可能である。
本発明によると、「ペプチド」という用語は、オリゴペプチド及びポリペプチドを含み、ペプチド結合を介して互いと連結された、２又はこれを超える、好ましくは、３又はこれを超える、好ましくは、４又はこれを超える、好ましくは、６又はこれを超える、好ましくは、８又はこれを超える、好ましくは、１０又はこれを超える、好ましくは、１３又はこれを超える、好ましくは、１６又はこれを超える、好ましくは、２０又はこれを超える、最大で、好ましくは、５０、好ましくは、１００、又は、好ましくは、１５０の連続アミノ酸を含む物質を指す。「タンパク質」という用語は、大型のペプチド、好ましくは、少なくとも１５１アミノ酸を有するペプチドを指すが、本明細書では、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は通例、同意語として使用される。
「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本発明によると、アミノ酸構成要素だけでなく、また、糖構造及びリン酸構造など、アミノ酸以外の構成要素も含有する物質を含み、また、エステル結合、チオエーテル結合、又はジスルフィド結合などの結合を含有する物質も含む。
本発明によると、「アルファウイルス」という用語は、広義に理解され、アルファウイルスの特徴を有する、任意のウイルス粒子を含む。アルファウイルスの特徴は、宿主細胞内の複製に適する遺伝情報をコードし、ＲＮＡポリメラーゼ活性を含む、（＋）鎖ＲＮＡの存在を含む。多くのアルファウイルスの更なる特徴については、例えば、Ｓｔｒａｕｓｓ及びＳｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、１９９４、ｖｏｌ．５８、ｐｐ．４９１－５６２、Ｇｏｕｌｄ等，２０１０，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．、ｖｏｌ．８７，ｐｐ．１１１－１２４、Ｒｕｐｐ等，２０１５、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．９６、ｐｐ．２４８３－２５００において記載されている。「アルファウイルス」という用語は、天然で見出されるアルファウイルスのほか、その任意の変異体又は誘導体を含む。一部の実施態様では、変異体又は誘導体は、天然では見出されない。
一実施態様では、アルファウイルスは、天然で見出されるアルファウイルスである。典型的に、天然で見出されるアルファウイルスは、動物（ヒトなどの脊椎動物、及び昆虫などの節足動物を含む）など、１又は複数の任意の真核生物に対して感染性である。典型的な実施態様では、天然で見出されるアルファウイルスは、動物に対して感染性である。天然で見出される、多くのアルファウイルスは、脊椎動物及び／又は節足動物に対して感染性である（Strauss及びStrauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562）。
天然で見出されるアルファウイルスは、好ましくは、以下：バーマ森林ウイルス複合体（バーマ森林ウイルスを含む）；東部ウマ脳炎複合体（東部ウマ脳炎ウイルスの７つの抗原型を含む）；ミドルバーグウイルス複合体（ミドルバーグウイルスを含む）；ヌドゥムウイルス複合体（ヌドゥムウイルスを含む）；セムリキ森林ウイルス複合体（ベバルウイルス、チクングニヤウイルス、マヤロウイルス及びその亜型であるウナウイルス、オニョンニョンウイルス及びその亜型であるイグボ－オラウイルス、ロスリバーウイルス及びその亜型であるベバルウイルス、ゲタウイルス、サギヤマウイルス、セムリキ森林ウイルス及びその亜型であるメトリウイルスを含む）；ベネズエラウマ脳炎ウイルス複合体（カバスーウイルス、エバーグレーズウイルス、モッソダスペドラスウイルス、ムカンボウイルス、パラマナウイルス、ピクスナウイルス、リオネグロウイルス、トロカラウイルス及びその亜型であるビジューブリッジウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含む）；西部ウマ脳炎ウイルス複合体（アウラウイルス、ババンキウイルス、キジラガチウイルス、シンドビスウイルス、オケルボウイルス、ワタロアウイルス、バギークリークウイルス、フォートモーガンウイルス、ハイランドＪウイルス、西部ウマ脳炎ウイルスを含む）；並びにサケ膵臓病ウイルス；睡眠病ウイルス；ミナミゾウアザラシウイルス；トナテウイルスを含む、一部の未分類ウイルスからなる群から選択される。より好ましくは、アルファウイルスは、セムリキ森林ウイルス複合体（セムリキ森林ウイルスを含む、上記に表示のウイルス型を含む）、西部ウマ脳炎ウイルス複合体（シンドビスウイルスを含む、上記に表示のウイルス型を含む）、東部ウマ脳炎ウイルス（上記に表示のウイルス型を含む）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス複合体（ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含む、上記に表示のウイルス型を含む）からなる群から選択される。
更に好ましい実施態様では、アルファウイルスは、セムリキ森林ウイルスである。代替的な、更に好ましい実施態様では、アルファウイルスは、シンドビスウイルスである。代替的な、更に好ましい実施態様では、アルファウイルスは、ベネズエラウマ脳炎ウイルスである。
本発明の一部の実施態様では、アルファウイルスは、天然で見出されるアルファウイルスではない。典型的に、天然で見出されないアルファウイルスは、天然で見出されるアルファウイルスの変異体又は誘導体であって、ヌクレオチド配列内、すなわち、ゲノムＲＮＡ内の少なくとも１つの突然変異により、天然で見出されるアルファウイルスから識別される変異体又は誘導体である。ヌクレオチド配列内の突然変異は、天然で見出されるアルファウイルスと比較した、１又は複数のヌクレオチドの挿入、置換、又は欠失から選択することができる。ヌクレオチド配列内の突然変異は、ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド内又はタンパク質内の突然変異を伴う場合も伴わない場合もある。例えば、天然で見出されないアルファウイルスは、弱毒化アルファウイルスでありうる。天然で見出されない弱毒化アルファウイルスは、典型的に、そのヌクレオチド配列内の、少なくとも１つの突然変異であって、それにより、天然で見出されるアルファウイルスから識別される突然変異を有し、全く感染性ではないか、又は感染性であるが、病原能が低度であるか、若しくは病原能を全く有さないアルファウイルスである。例示的な例として述べると、ＴＣ８３は、天然で見出されるベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）から識別される弱毒化アルファウイルス（MyKinney等, 1963, Am. J. Trop. Med. Hyg., 1963, vol. 12; pp. 597-603）である。
「天然で見出される」という用語は、「天然で存在する」を意味し、公知の対象物のほか、いまだ、自然から発見及び／又は単離されていないが、将来、天然の供給源から発見及び／又は単離されうる対象物を含む。
アルファウイルス属のメンバーはまた、ヒトにおけるそれらの相対的な臨床特色に基づいても分類することができる。つまり、主に脳炎と関連するアルファウイルス、並びに、主に、発熱、発赤、及び多発性関節炎と関連するアルファウイルスである。
「アルファウイルスの」という用語は、アルファウイルス内で見出されるか、又はアルファウイルスに由来するか、又は、例えば、遺伝子操作により、アルファウイルスから導出されることを意味する。
本発明によると、「ＳＦＶ」とは、セムリキ森林ウイルスを表す。本発明によると、「ＳＩＮ」又は「ＳＩＮＶ」とは、シンドビスウイルスを表す。本発明によると、「ＶＥＥ」又は「ＶＥＥＶ」とは、ベネズエラウマ脳炎ウイルスを表す。
「保存配列エレメント」又は「ＣＳＥ」という用語は、アルファウイルスＲＮＡ内で見出されるヌクレオチド配列を指す。異なるアルファウイルスのゲノム内には、オーソログが存在し、異なるアルファウイルスのオーソログであるＣＳＥは、好ましくは、高百分率の配列同一性及び／又は類似の二次構造若しくは三次構造を共有するため、これらの配列エレメントを、「保存的」と称する。ＣＳＥという用語は、ＣＳＥ１、ＣＳＥ２、ＣＳＥ３、及びＣＳＥ４を含む（詳細については、Jose等, Future Microbiol., 2009, vol. 4, pp. 837-856を参照されたい）。
本発明によると、「サブゲノムプロモーター」又は「ＳＧＰ」という用語は、核酸配列（例えば、コード配列）の上流（５’側）の核酸配列であって、ＲＮＡポリメラーゼ、典型的に、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対する認識部位及び結合性部位をもたらすことにより、前記核酸配列の転写を制御する核酸配列を指す。ＳＧＰは、更なる因子に対する、更なる認識部位又は結合性部位を含みうる。サブゲノムプロモーターは、典型的に、アルファウイルスなど、プラス鎖ＲＮＡウイルスの遺伝子エレメントである。アルファウイルスのサブゲノムプロモーターは、ウイルスゲノムＲＮＡ内に含まれる核酸配列である。サブゲノムプロモーターは一般に、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、アルファウイルスレプリカーゼの存在下で、転写（ＲＮＡ合成）の開始を可能とすることを特徴とする。ＲＮＡ（－）鎖、すなわち、アルファウイルスゲノムＲＮＡの相補体は、（＋）鎖であるサブゲノムＲＮＡ分子の合成のための鋳型として用いられ、サブゲノム（＋）鎖の合成は、典型的に、サブゲノムプロモーターにおいて、又はこの近傍で開始される。例示的で非限定的な目的で、例であるアルファウイルスゲノム内に含まれるＳＧＰの典型的な配置を、図１Ａに例示する。しかし、本明細書で使用される「サブゲノムプロモーター」という用語は、このようなサブゲノムプロモーターを含む核酸内の、任意の特定の配置に制約されない。一部の実施態様では、ＳＧＰは、ＣＳＥ３と同一であるか、又はＣＳＥ３と重複するか、又はＣＳＥ３を含む。
「自家」という用語は、同じ対象に由来する何ものかについて記載するのに使用される。例えば、「自家細胞」とは、同じ対象に由来する細胞を指す。対象への自家細胞の導入は、これらの細胞が、そうでなければ、拒絶を結果としてもたらす、免疫学的障壁を越えるために、有利である。
「同種」という用語は、同じ種の異なる個体に由来する何ものかについて記載するのに使用される。１又は複数の遺伝子座における遺伝子が同一ではない場合、２つ又はこれを超える個体を、互いと同種であるという。
「同系」という用語は、同一な遺伝子型を有する個体又は組織、すなわち、同一な双生児若しくは同じ近交系の動物、又はそれらの組織若しくは細胞に由来する何ものかについて記載するのに使用される。
「異種」という用語は、複数の異なるエレメントからなる何ものかについて記載するのに使用される。例としては、１つの個体の細胞の、異なる個体への導入は、異種移植を構成する。異種遺伝子とは、対象以外の供給源に由来する遺伝子である。
以下は、本発明の個別の特色について、具体的変化形及び／又は好ましい変化形を提示する。本発明はまた、特に好ましい実施態様として、本発明の特色のうちの、２つ又はこれを超えるものについて記載される、具体的変化形及び／又は好ましい変化形のうちの、２つ又はこれを超えるものを組み合わせることにより生成しうる実施態様も想定する。
本発明のシステム
第１の態様では、本発明は、
アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクトと、
トランスで、レプリカーゼにより複製することができるＲＮＡレプリコンと、
を含み、
アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクトが、５’キャップを含む
システムを提供する。５’キャップは、レプリカーゼの翻訳を駆動する目的に適う。
したがって、本発明は、２つの核酸分子：レプリカーゼを発現させるための（すなわち、レプリカーゼをコードする）第１のＲＮＡ分子と、第２のＲＮＡ分子（レプリコン）とを含むシステムを提供する。本明細書では、レプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクトに、「レプリカーゼコンストラクト」と同義に言及する。
本発明のシステムでは、レプリカーゼの役割は、トランスでレプリコンを増幅することである。したがって、レプリコンを、トランスレプリコンと称することができる。レプリコンが、発現させる目的の遺伝子をコードする場合、レプリカーゼのレベルを改変することにより、目的の遺伝子の発現レベル、及び／又は発現の持続期間を、トランスで調節することができる。
一般に、ＲＮＡは、ヒト及び動物の治療におけるＤＮＡの使用と関連する、潜在的な、安全性についての危険性を回避するための、ＤＮＡに対する魅力的な代替法を表す。ＲＮＡの治療的使用の利点は、一過性発現と、非形質転換性特徴とを含み、ＲＮＡは、発現するために、核に侵入する必要がなく、これにより、腫瘍形成の危険性を最小化する。
これらの利点にもかかわらず、臨床適用のためのＲＮＡの使用は、とりわけ、ＲＮＡの不安定性、及びこれと関連する、ＲＮＡの短い半減期のために制約されている。本発明では、宿主細胞又は生物におけるＲＮＡの複製を駆動するシステムにより、ＲＮＡの短い半減期を補償することができる。これに加えて、本発明は、ＲＮＡの安定性に有利な、特異的なＲＮＡ修飾、製剤、媒体、及び送達方式を提供する。下記では、これらについて記載する。実際、本発明のシステムのＲＮＡを、細胞又は動物へと導入すると、遺伝情報の効率的な発現が達成される。
ＤＮＡ鋳型の転写と、核から細胞質への転写物の輸送とが可欠であることは、先行技術の手法と比較した、本発明の利点である。これは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの適正な機能と、ｍＲＮＡの輸送とに対する依存を消失させる。代わりに、本発明のレプリカーゼコンストラクトは、翻訳にすぐ利用可能である。
本明細書で記載される通り、本発明のシステムは、宿主細胞又は宿主生物における、所望されるポリペプチド（例えば、トランス遺伝子）の効率的な作製に適する。シスにおける複製に適する全長レプリコンの場合より高度な、トランス遺伝子の発現を達成しうることは、本発明の１つの利点である。高レベルの目的の遺伝子の発現を、野生型初代細胞（実施例２を参照されたい）内、及び生存動物、すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏ（実施例５及び６）において達成しうることは、本発明の更なる利点である。これは、バクテリオファージ由来のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現する操作細胞株に依存する先行技術のシステム（Spuul等, J. Virol., 2011, vol. 85, pp. 4739-4751、Sanz等, Cellular Microbiol., 2015, vol. 17, pp. 520-541）と比較した、著明な利点である。哺乳動物細胞は、特異的に操作されない限り、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現しないことが典型的である（Buchholz等, J. Virol., 1999, vol. 73, pp. 251-259）。まとめると、ＲＮＡベースの本発明のシステムは、従来型の遺伝子送達法又は遺伝子治療法を凌駕して有利である。
本発明のシステムは、たやすく調製することができる。例えば、ＲＮＡ分子は、ＤＮＡ鋳型から、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写することができる。一実施態様では、本発明のＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）である。したがって、一実施態様では、本発明のシステムは、ＩＶＴ－ＲＮＡを含む。好ましくは、本発明のシステムの、全てのＲＮＡ分子は、ＩＶＴ－ＲＮＡである。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）は、療法のために特に関心のある対象である。
本発明のシステムは、少なくとも２つの核酸分子を含む。したがって、本発明のシステムは、２つ若しくはこれを超える、３つ若しくはこれを超える、４つ若しくはこれを超える、５つ若しくはこれを超える、６つ若しくはこれを超える、７つ若しくはこれを超える、８つ若しくはこれを超える、９つ若しくはこれを超える、又は１０若しくはこれを超える核酸分子を含みうる。好ましい実施態様では、本発明のシステムは、正確に２つの核酸分子、好ましくは、ＲＮＡ分子、レプリコン及びレプリカーゼコンストラクトを含有する。代替的な好ましい実施態様では、システムは、レプリカーゼコンストラクトに加えて、各々が、好ましくは、少なくとも１つの目的のタンパク質をコードする、１つを超えるレプリコンを含む。これらの実施態様では、レプリカーゼコンストラクトによりコードされるレプリカーゼは、各レプリコンに作用して、それぞれ、サブゲノム転写物の複製及び作製を駆動しうる。例えば、各レプリコンは、薬学的に活性のペプチド又はタンパク質をコードしうる。例えば、いくつかの異なる抗原に対する、対象のワクチン接種が所望される場合、これは有利である。
好ましくは、本発明のシステムは、ウイルス粒子、特に、次世代ウイルス粒子を形成することが可能ではない。好ましくは、本発明のレプリカーゼコンストラクトは、標的細胞又は標的生物における自己複製が可能ではない。
本明細書では、ＲＮＡの態様及び利点について記載するが、本発明の一部の実施態様ではシステムが、１又は複数のＤＮＡ分子を含むことも、代替的に可能である。本発明の一部の実施態様ではシステムの、任意の１又は複数の核酸分子は、ＤＮＡ分子でありうる。レプリカーゼコンストラクト及び／又はレプリコンは、ＤＮＡ分子であることが可能である。ＤＮＡ分子の場合、好ましくは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーターが存在し、これにより、感染しているか又はワクチン接種された宿主細胞又は宿主生物における転写を可能とする。
本発明のシステムの、更なる実施態様及び利点を、以下に記載する。
レプリカーゼコンストラクトの特徴付け
好ましくは、アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクト（レプリカーゼコンストラクト）は、アルファウイルスレプリカーゼをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。
本発明によると、「レプリカーゼ」とは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）を指す。ＲｄＲＰとは、酵素機能である。レプリカーゼは、一般に、（－）鎖ＲＮＡ鋳型に基づく（＋）鎖ＲＮＡの合成を触媒することが可能であり、且つ／又は（＋）鎖ＲＮＡ鋳型に基づく（－）鎖ＲＮＡの合成を触媒することが可能なポリペプチド、又は１つを超える同一なタンパク質及び／若しくは非同一なタンパク質の複合体若しくは会合体を指す。レプリカーゼは、加えて、例えば、プロテアーゼ（自己切断のための）、ヘリカーゼ、末端アデニリルトランスフェラーゼ（ポリ（Ａ）テール付加のための）、メチルトランスフェラーゼ及びグアニリルトランスフェラーゼ（核酸に５’キャップを施すための）、核局在化部位、トリホスファターゼなど、１又は複数の更なる機能も有しうる（Gould等, 2010, Antiviral Res., vol. 87, pp. 111-124、Rupp等, 2015, J. Gen. Virol., vol. 96, pp. 2483-500）。
本発明によると、「アルファウイルスレプリカーゼ」とは、アルファウイルスに由来するＲＮＡレプリカーゼであって、天然にあるアルファウイルスに由来するＲＮＡレプリカーゼ、及び弱毒化アルファウイルスなど、アルファウイルスの変異体又は誘導体に由来するＲＮＡレプリカーゼを含むＲＮＡレプリカーゼを指す。本発明の文脈では、文脈により、任意の特定のレプリカーゼが、アルファウイルスレプリカーゼではないことが指示されない限りにおいて、「レプリカーゼ」及び「アルファウイルスレプリカーゼ」という用語は、互換的に使用される。「レプリカーゼ」という用語は、アルファウイルス感染細胞が発現するか、又はレプリカーゼをコードする核酸をトランスフェクトされた細胞が発現する、アルファウイルスレプリカーゼの全ての変異体、特に、翻訳後修飾された変異体、コンフォメーション、アイソフォーム、及び相同体を含む。更に、「レプリカーゼ」という用語は、組換え法により作製されたレプリカーゼ、及び組換え法により作製されうるレプリカーゼの全ての形態を含む。例えば、実験室におけるレプリカーゼの検出及び／又は精製を容易とするタグ、例えば、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、又はオリゴヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含むレプリカーゼを、組換え法により作製することができる。
任意選択で、レプリカーゼは、加えて、アルファウイルスの、保存配列エレメント１（ＣＳＥ１）又はその相補的な配列、保存配列エレメント２（ＣＳＥ２）又はその相補的な配列、保存配列エレメント３（ＣＳＥ３）又はその相補的な配列、保存配列エレメント４（ＣＳＥ４）又はその相補的な配列のうちのいずれか１又は複数への結合能によっても、機能的に規定される。好ましくは、レプリカーゼは、ＣＳＥ２［すなわち、（＋）鎖］、及び／若しくはＣＳＥ４［すなわち、（＋）鎖］への結合が可能であるか、又はＣＳＥ１［すなわち、（－）鎖］の相補体、及び／若しくはＣＳＥ３［すなわち、（－）鎖］の相補体への結合が可能である。
レプリカーゼの由来は、いかなる特定のアルファウイルスにも限定されない。好ましい実施態様では、アルファウイルスレプリカーゼは、天然にあるセムリキ森林ウイルス、及び弱毒化セムリキ森林ウイルスなど、セムリキ森林ウイルスの変異体又は誘導体を含むセムリキ森林ウイルスに由来する。代替的な好ましい実施態様では、レプリカーゼは、天然にあるシンドビスウイルス、及び弱毒化シンドビスウイルスなど、シンドビスウイルスの変異体又は誘導体を含むシンドビスウイルスに由来する。代替的な好ましい実施態様では、レプリカーゼは、天然にあるＶＥＥＶ、及び弱毒化ＶＥＥＶなど、ＶＥＥＶウイルスの変異体又は誘導体を含むベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）に由来する。
アルファウイルスレプリカーゼは、典型的に、アルファウイルス非構造タンパク質（ｎｓＰ）を含むか、又はこれからなる。この文脈では、「非構造タンパク質」とは、アルファウイルス由来の、任意の１又は複数の個別の非構造タンパク質（ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）、又はアルファウイルス由来の、１つを超える非構造タンパク質のポリペプチド配列を含むポリタンパク質、例えば、ｎｓＰ１２３４を指す。一部の実施態様では、「非構造タンパク質」とは、ｎｓＰ１２３を指す。他の実施態様では、「非構造タンパク質」とは、ｎｓＰ１２３４を指す。他の実施態様では、「非構造タンパク質」とは、ｎｓＰ１２３（Ｐ１２３も同義）と、ｎｓＰ４との複合体又は会合体を指す。一部の実施態様では、「非構造タンパク質」とは、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、及びｎｓＰ３の複合体又は会合体を指す。一部の実施態様では、「非構造タンパク質」とは、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、及びｎｓＰ４の複合体又は会合体を指す。一部の実施態様では、「非構造タンパク質」とは、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、及びｎｓＰ４からなる群から選択される、任意の１又は複数の複合体又は会合体を指す。
好ましくは、「複合体又は会合体」とは、多数のエレメントの機能的な集合体である。アルファウイルスレプリカーゼの文脈では、「複合体又は会合体」という用語は、それらのうちの少なくとも１つが、アルファウイルス非構造タンパク質である、多数の、少なくとも２つのタンパク質分子について記載し、この場合、複合体又は会合体は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）活性を有する。複合体又は会合体は、複数の異なるタンパク質（ヘテロ多量体）からなる場合もあり、且つ／又は１つの特定のタンパク質の複数のコピー（ホモ多量体）からなる場合もある。多量体又は多数性の文脈では、「マルチ」とは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の、又は１０を超えるなど、１を超えることを意味する。
複合体又は会合体はまた、１を超える異なるアルファウイルスに由来するタンパク質も含みうる。例えば、異なるアルファウイルス非構造タンパク質を含む、本発明に従う複合体又は会合体では、全ての非構造タンパク質が、同じアルファウイルスに由来することは必要とされない。本発明には、異種の複合体又は会合体も、同様に含まれる。例示だけを目的として述べると、異種の複合体又は会合体は、第１のアルファウイルス（例えば、シンドビスウイルス）に由来する、１又は複数の非構造タンパク質（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２）と、第２のアルファウイルス（セムリキ森林ウイルス）に由来する、１又は複数の非構造タンパク質（例えば、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）とを含みうる。
「複合体」又は「会合体」という用語は、２つ又はこれを超える、同じ又は異なるタンパク質分子であって、空間的に近接するタンパク質分子を指す。複合体のタンパク質は、互いと、直接的又は間接的な、物理的又は物理化学的接触にあることが好ましい。複合体又は会合体は、複数の異なるタンパク質（ヘテロ多量体）からなる場合もあり、且つ／又は１つの特定のタンパク質の複数のコピー（ホモ多量体）からなる場合もある。
「レプリカーゼ」という用語は、アルファウイルス非構造タンパク質の、炭水化物修飾（グリコシル化など）形態及び脂質修飾形態を含む、各共翻訳修飾形態又は各翻訳後修飾形態、及びあらゆる共翻訳修飾形態又はあらゆる翻訳後修飾形態を含む。
「レプリカーゼ」という用語は、アルファウイルスレプリカーゼの、各機能的断片及びあらゆる機能的断片を含む。断片は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）として機能する場合に機能的である。
一部の実施態様では、レプリカーゼは、レプリカーゼを発現する細胞内で、膜性複製複合体、及び／又は液胞を形成することが可能である。
好ましくは、レプリカーゼコンストラクトは、上記で規定した、レプリカーゼのコード領域を含む。コード領域は、１又は複数のオープンリーディングフレームからなりうる。
一実施態様では、レプリカーゼコンストラクトは、アルファウイルスの、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、及びｎｓＰ４の全てをコードする。一実施態様では、レプリカーゼコンストラクトは、アルファウイルスのｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、及びｎｓＰ４を、単一のオープンリーディングフレームによりコードされる、単一の、任意選択で、切断型のポリタンパク質：ｎｓＰ１２３４としてコードする。一実施態様では、レプリカーゼコンストラクトは、アルファウイルスのｎｓＰ１、ｎｓＰ２、及びｎｓＰ３を、単一のオープンリーディングフレームによりコードされる、単一の、任意選択で、切断型のポリタンパク質：ｎｓＰ１２３としてコードする。この実施態様では、ｎｓＰ４は、個別にコードされうる。
好ましくは、本発明のレプリカーゼコンストラクトは、アルファウイルスのサブゲノムプロモーターを含まない。
好ましくは、レプリカーゼコンストラクトは、ｍＲＮＡ分子である。ｍＲＮＡ分子は、好ましくは、ＣＳＥ１も、ＣＳＥ４も含まない。理論に束縛されることを望まずに述べると、レプリコンを、レプリカーゼにより、極めて効率的に複製することができるように、このようなｍＲＮＡは、レプリカーゼの結合について、レプリコンと競合しないことが想定される。
レプリカーゼコンストラクトのＲＮＡは、好ましくは、二本鎖ではなく、好ましくは、一本鎖であり、より好ましくは、（＋）鎖ＲＮＡである。レプリカーゼは、レプリカーゼコンストラクト上のオープンリーディングフレームによりコードされる。
一実施態様では、本発明のレプリカーゼコンストラクトは、イントロン非含有のＲＮＡ、好ましくは、イントロンを含有しないｍＲＮＡである。好ましくは、レプリカーゼコンストラクトは、天然でイントロン非含有のＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。例えば、イントロン非含有のＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける合成、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により得られる。一実施態様では、レプリカーゼコンストラクトは、イントロンを含まない。ｎｓＰ１２３４をコードするオープンリーディングフレームを含む。一実施態様では、レプリカーゼコンストラクトは、イントロンを含まない。ｎｓＰ１２３をコードするオープンリーディングフレームを含む。好ましくは、レプリカーゼコンストラクトは、ウサギベータ－グロビン遺伝子から得られるイントロン（国際公開第２００８／１１９８２７Ａ１号において記載されている）を含まない。
本明細書で使用される「イントロン」とは、ＲＮＡのコード配列の、ポリペプチドへの翻訳の前に、ＲＮＡから除去される、すなわち、スプライスアウトされる、前駆体ｍＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）の非コード区画と規定される。イントロンがプレｍＲＮＡからスプライスアウトされると、結果として得られるｍＲＮＡ配列は、ポリペプチドへと翻訳される準備ができている。言い換えれば、イントロンのヌクレオチド配列は、タンパク質へと翻訳されないことが典型的である。イントロンを含有しないｍＲＮＡは、連続する順序でポリペプチドへと翻訳される、コドン（塩基トリプレット）を含有するｍＲＮＡである。イントロンを含有しないｍＲＮＡ天然でイントロンを含有しない（すなわち、当初から、例えば、細胞内で、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ転写において、イントロンを含有しないｍＲＮＡとして合成された）場合もあり、イントロンを含有するプレｍＲＮＡをスプライシングすることにより、イントロンを含有しないｍＲＮＡへと成熟する場合もある。本発明では、天然ではイントロンを含有しないｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡが好ましい。
本発明のレプリカーゼコンストラクトは、少なくとも、自己複製が可能でない点、及び／又はサブゲノムプロモーターの制御下にあるオープンリーディングフレームを含まない点で、アルファウイルスゲノムＲＮＡと異なる。自己複製が不可能である場合、レプリカーゼコンストラクトはまた、「自殺コンストラクト」とも称される。
好ましくは、本発明のレプリカーゼコンストラクトは、アルファウイルスの構造タンパク質と会合していない。好ましくは、レプリカーゼコンストラクトは、アルファウイルスの構造タンパク質によりパッケージングされない。より好ましくは、レプリカーゼコンストラクトは、ウイルス粒子内にパッケージングされない。好ましくは、レプリカーゼコンストラクトは、ウイルスタンパク質（ウイルスタンパク質非含有のシステム）と会合していない。ウイルスタンパク質非含有のシステムは、例えば、上記Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ等による先行技術の、ヘルパーウイルスベースのシステムと比較した利点をもたらす。
好ましくは、レプリカーゼコンストラクトは、（＋）鎖鋳型に基づく（－）鎖合成、及び／又は（－）鎖鋳型に基づく（＋）鎖合成に必要とされる、少なくとも１つの保存配列エレメント（ＣＳＥ）を欠く。より好ましくは、レプリカーゼコンストラクトは、アルファウイルスに由来する保存配列エレメント（ＣＳＥ）を含まない。特に、アルファウイルスの４つのＣＳＥ（Strauss及びStrauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562、Jose等, Future Microbiol., 2009, vol. 4, pp. 837-856）の中で、以下のＣＳＥ：
・天然で見出されるアルファウイルス内の、（－）鎖鋳型に基づく（＋）鎖合成のためのプロモーターとして機能すると考えられるＣＳＥ１、
・天然で見出されるアルファウイルスの、（＋）鎖のゲノムＲＮＡに基づく（－）鎖合成のためのプロモーターとして機能すると考えられるＣＳＥ２、
・天然で見出されるアルファウイルス内の、サブゲノム（＋）鎖ＲＮＡの効率的な転写に寄与すると考えられるＣＳＥ３、
・天然で見出されるアルファウイルス内の、（＋）鎖のゲノムＲＮＡに基づく（－）鎖合成の開始のためのコアプロモーターとして機能すると考えられるＣＳＥ４
のうちの任意の１又は複数は、好ましくは、レプリカーゼコンストラクト上に存在しない。
一実施態様では、ＣＳＥ１、ＣＳＥ３、及びＣＳＥ４は、存在せず、ＣＳＥ２は、存在する場合もあり、存在しない場合もある。
特に、任意の１又は複数のアルファウイルスＣＳＥの非存在下で、本発明のレプリカーゼコンストラクトは、アルファウイルスゲノムＲＮＡに相似するよりはるかによく、典型的な真核ｍＲＮＡに相似する。
一実施態様では、本発明のレプリカーゼコンストラクトは、単離核酸分子である。
キャップ
アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクト（レプリカーゼコンストラクト）は、５’キャップを含む。「５’キャップ」、「キャップ」、「５’キャップ構造」、「キャップ構造」という用語は、前駆体メッセンジャーＲＮＡなど、一部の真核細胞一次転写物の５’末端に見出されるジヌクレオチドを指すように、同義に使用される。５’キャップは、（任意選択で、修飾された）グアノシンを、５’－５’三リン酸連結（又は、ある特定のキャップ類似体の場合における、修飾三リン酸連結）を介して、ｍＲＮＡ分子の最初のヌクレオチドへと結合させた構造である。用語は、従来型のキャップを指す場合もあり、キャップ類似体を指す場合もある。例示のために、一部の特定のキャップジヌクレオチド（キャップ類似体ジヌクレオチドを含む）を、図２に示す。
「５’キャップを含むＲＮＡ」又は「５’キャップを施されたＲＮＡ」又は「５’キャップで修飾されたＲＮＡ」又は「キャップありのＲＮＡ」とは、５’キャップを含むＲＮＡを指す。例えば、ＲＮＡに５’キャップを施すことは、前記５’キャップの存在下における、ＤＮＡ鋳型のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により達成することができるが、この場合、前記５’キャップを、共転写により、生成するＲＮＡ鎖へと組み込むか、又は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により、ＲＮＡを生成させ、転写後に、キャッピング酵素、例えば、ワクシニアウイルスのキャッピング酵素を使用して、５’キャップを、ＲＮＡへと接合させることができる。キャップありのＲＮＡでは、（キャップありの）ＲＮＡ分子の最初の塩基の３’位を、ホスホジエステル結合を介して、ＲＮＡ分子の後続の塩基（「第２の塩基」）の５’位へと連結する。例示のために、図１では、本発明に従う核酸分子のキャップの位置を、Ｃという文字で記号化する。
「従来型の５’キャップ」という用語は、天然にある５’キャップ、好ましくは、７－メチルグアノシンキャップを指す。７－メチルグアノシンキャップでは、キャップのグアノシンは、修飾グアノシンであり、この場合、修飾は、７位におけるメチル化からなる（図２の上）。
本発明の文脈では、「５’キャップ類似体」という用語は、従来型の５’キャップに相似する分子構造を指すが、好ましくは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、且つ／又は細胞内で、ＲＮＡに接合させた場合にそのＲＮＡを安定化させる能力を有するように修飾されている。キャップ類似体は、従来型の５’キャップではない。
本発明は、レプリカーゼの翻訳が、レプリカーゼコンストラクト上の５’キャップにより駆動されるという点で、先行技術のトランス複製システムから識別される。本発明者らは、とりわけ、レプリカーゼコンストラクト上の５’キャップが、極めて肯定的な影響を、レプリカーゼの発現に対してだけでなく、また、全体としてのシステムの性能に対しても及ぼす、つまりトランスでコードされる目的の遺伝子の、極めて効率的な作製を達成しうること（実施例を参照されたい）を見出した。一実施態様では、本発明のレプリカーゼコンストラクトは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを含まない。
一般に、ＩＲＥＳと略記される内部リボソーム侵入部位とは、例えば、ｍＲＮＡ配列の中間の位置など、ｍＲＮＡ配列の５’末端と異なる位置に由来するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）からの翻訳開始を可能とするヌクレオチド配列である。本明細書では、ＩＲＥＳ及びＩＲＥＳエレメントという用語は、互換的に使用される。ＩＲＥＳエレメント真核生物のほか、真核生物に感染することが可能ウイルスにおいても見出される。しかし、ウイルスＩＲＥＳ機能の機構は、現在、真核生物ＩＲＥＳ機能の機構より良好に特徴づけられている（Lopez-Lastra等, 2005, Biol. Res., vol. 38, pp. 121-146）。真核細胞内のアルファウイルスレプリカーゼの発現を駆動するためにＩＲＥＳを使用することが示唆されている（例えば、Sanz等, Cellular Microbiol., 2015, vol. 17, pp. 520-541）。本発明者らは、多様な実施態様では、トランスレプリコン上でコードされる遺伝子の効率的な遺伝子発現は、レプリカーゼコンストラクトが、ＩＲＥＳを含まない場合に達成しうる（実施例１から６を参照されたい）ことを示す。したがって、一実施態様では、アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクト（レプリカーゼコンストラクト）は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを含まない。好ましくは、レプリカーゼの翻訳は、ＩＲＥＳエレメントにより駆動されない。ＩＲＥＳの下流のオープンリーディングフレーム内でコードされる翻訳タンパク質のレベルは、広範に変動し、特定のＩＲＥＳの種類及び配列、並びに実験設定の詳細に依存することが公知である（Balvay等, 2009, Biochim. Biophys. Acta, vol. 1789, pp. 542-557において総説されている）。先行技術におけるＩＲＥＳ含有ＲＮＡからの遺伝子発現の場合、大型のトランスレプリコンからの遺伝子発現が、短いトランスレプリコンからの場合と比較して、それほど効率的ではなく（Spuul等, J. Virol., 2011, vol. 85, pp. 4739-4751）、アルファウイルスレプリカーゼに典型的な、膜性複製複合体のサイズは、トランスレプリコンの長さに依存することが観察された（Kallio等, 2013, J. Virol., vol. 87, pp. 9125-9134）。ＩＲＥＳ含有ＲＮＡはまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏでも転写され、トランスレプリコンと共に、細胞へとトランスフェクトされた（Sanz等, Cellular Microbiol., 2015, vol. 17, pp. 520-541）。この研究は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されるＩＲＥＳ含有ｍＲＮＡの使用は、細胞内でレプリカーゼを発現させ、レプリコンの複製を、トランスで媒介するのに機能的であることを示唆した。
本発明の手法は、先行技術と顕著に異なり、上記Ｓｐｕｕｌ等は、それらのＲＮＡ（トランスフェクト細胞内のｉｎ ｓｉｔｕで産生された）が、キャップなしであることを仮定した。Ｓｐｕｕｌ等は、キャップなしのＲＮＡへの、キャップの組込みを予見しなかった：Ｓｐｕｕｌ等は、代替法を選び取り、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを、Ｔ７プロモーターの下流に組み込んだが、この参考文献によれば、ＩＲＥＳエレメントは、おそらく、キャップなしのＲＮＡの発現の増強に関与している。本発明のレプリカーゼコンストラクトはまた、上記Ｓａｎｚ等により記載されている、ｎｓＰ１－４をコードする、ＩＲＥＳを含有する、キャップなしのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡとも異なる。
本発明における、５’キャップによるＩＲＥＳの置換（上記Sanz等及び上記Spuul等により使用されている）は、ＲＮＡ分子によりコードされるポリペプチドの配列に影響を及ぼさない、ＲＮＡ分子の特定の修飾（ポリペプチド配列非修飾型修飾）である。
原則として、任意のコードＲＮＡは、ポリペプチド配列非修飾型修飾に適する。現代の分子生物学では、いくつかのシステムにおける、ポリペプチド配列非修飾型修飾の、例えば、遺伝子発現の効率に対する可能な効果が研究されている。しかし、効率的な遺伝子発現、例えば、非修飾配列と比較して改善された遺伝子発現を達成するために、どの種類の、ポリペプチド配列非修飾型修飾を選択すべきなのかについて、一般に適用可能な規則は確立されていない。したがって、任意の特定のコード核酸及び／又は任意の特定の発現システムに適切なポリペプチド配列非修飾型修飾の選択は、困難な課題である。当技術分野では、様々な異なるポリペプチド配列非修飾型修飾について記載されている。例えば、真核メッセンジャーＲＮＡについて、研究されているポリペプチド配列非修飾型修飾は、特定の非翻訳領域（例えば、国際公開第２０１３／１４３６９９Ａ１号、国際公開第２０１３／１４３６９８Ａ１号、Holtkamp等, Blood, 2006, vol. 108, pp. 4009-4017において記載されているＵＴＲ）の選択、イントロン、例えば、ウサギベータ－グロビンイントロンＩＩ配列の導入（例えば、Li等, J. Exp. Med., 1998, vol. 188, pp. 681-688）、又は例えば、コードされるポリペプチド配列を変更しない、宿主細胞又は宿主生物の優先的なコドン使用への適合化による、コード配列のサイレント修飾（例えば、国際公開第２００３／０８５１１４Ａ１号において一般に記載されているサイレント修飾）を含む。本発明者らに管見の限りにおいて、アルファウイルスベースの発現システム内の、多様なポリペプチド配列非修飾型修飾の影響についての体系的な比較研究は、現在のところ、利用可能ではない。
本発明に到達すべく行われた研究では、例えば、ポリペプチド配列非修飾型修飾を伴う、多様な手法について、丹念に検討し、結果として、驚くべきことに、ＩＲＥＳの、レプリカーゼコンストラクト上の５’キャップによる特異的な置換は、トランスにおいて有益な効果、すなわち、トランスにおけるレプリコンのレベルにおいて有益な効果を及ぼしている、つまり、本発明に従うレプリコンによりコードされる目的のタンパク質の作製は、キャップが、レプリカーゼコンストラクト上に存在すると効率的であることが見出された。特に、代替的なポリペプチド配列非修飾型修飾、すなわち、コード配列の修飾の適合化は、本発明のシステムの性能を改善するのに失敗した：それどころか、レプリコンによりコードされる目的のタンパク質の作製の効率は、低減さえされたので、これは注目すべきことである。これについては、実施例４で例示する。したがって、アルファウイルスＲＮＡエレメントに基づくトランス複製システムの場合、レプリカーゼコンストラクト上の５’キャップの組入れは、特に有利なポリペプチド配列非修飾型修飾である。コドン適合化セムリキ森林ウイルスレプリカーゼを、トランスフェクトされたＢＨＫ－２１宿主細胞内で発現させることについて記載し、コドン最適化ＳＦＶレプリカーゼが、高度に活性であり、トランスにおけるレポーター遺伝子の発現を増強することが可能であると結論づける、国際公開第２００８／１１９８２７Ａ１号を念頭に置いてもまた、本発明の知見は驚くべきことである。したがって、国際公開第２００８／１１９８２７Ａ１号は、本発明と異なる方向を指示することから、代替的なポリペプチド配列非修飾型修飾、すなわち、イントロンの、レプリカーゼのコード配列への導入が、効率的なレプリカーゼ発現の一助となることが示唆される。
真核細胞のｍＲＮＡでは、５’キャップの存在は、とりわけ、核からのｍＲＮＡの移出の調節、及びプロセシング、特に、５’側の近位イントロンの切出しの促進において、役割を果たすと考えられる（Konarska等, 2014, Cell, vol. 38, pp. 731-736）。本発明のレプリカーゼコンストラクトは典型的に、核から移出されることも、プロセシングされることも必要としない。それにもかかわらず、驚くべきことに、レプリカーゼコンストラクト上の５’キャップの存在は有利であることが見出された。
真核細胞のｍＲＮＡの場合、５’キャップはまた、一般に、ｍＲＮＡの効率的な翻訳に関与すると記載されており、一般に、真核生物では、翻訳は、ＩＲＥＳが存在しない限りにおいて、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子の５’末端だけで開始される。真核細胞は、核内の転写時において、ＲＮＡに５’キャップを施すことが可能であり、新たに合成されたｍＲＮＡは通例、例えば、転写物が、２０－３０ヌクレオチドの長さに到達すると、５’キャップ構造で修飾される。まず、５’末端のヌクレオチドであるｐｐｐＮ（ｐｐｐは、三リン酸を表し、Ｎは、任意のヌクレオシドを表す）は、細胞内で、ＲＮＡ ５’－トリホスファターゼ活性及びグアニリルトランスフェラーゼ活性を有するキャッピング酵素により、５’ＧｐｐｐＮへと転換される。ＧｐｐｐＮはその後、細胞内で、（グアニン－７）－メチルトランスフェラーゼ活性を伴う第２の酵素によりメチル化して、モノメチル化ｍ７ＧｐｐｐＮキャップを形成しうる。一実施態様では、本発明で使用される５’キャップは、天然の５’キャップである。
本発明では、天然の５’キャップジヌクレオチドは、典型的に、非メチル化キャップジヌクレオチド（Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ、ＧｐｐｐＮとも称される）及びメチル化キャップジヌクレオチド（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ、ｍ７ＧｐｐｐＮとも称される）からなる群から選択される。ｍ７ＧｐｐｐＮ（式中、Ｎは、Ｇである）は、以下の式：
Figure 0007421256000001
により表される。
本発明のレプリカーゼコンストラクトは、宿主細胞内のキャッピング機構に依存しない。宿主細胞へとトランスフェクトされると、本発明のレプリカーゼコンストラクトは典型的に、細胞の核、すなわち、そうでなければ、典型的な真核細胞内で、キャッピングが生じる部位へは局在化しないことが想定される。
理論に束縛されることを望まずに、先行技術によるコンストラクト上のＩＲＥＳとの類推で述べると、レプリカーゼコンストラクト上の５’キャップが、レプリカーゼの翻訳の開始を誘発するために有用であることが想定されうる。真核生物の翻訳開始因子であるｅＩＦ４Ｅは、本発明に従うキャップありのｍＲＮＡの、リボソームとの会合に関与することが想定されうる。驚くべきことに、本発明者らは、５’キャップの存在が、性能を著明に増加させることを見出した。したがって、本発明のレプリカーゼコンストラクトは、５’キャップを含む。
５’キャップの存在はまた、本発明のトランス複製システムにおいて、予測外の相乗効果ももたらす：実施例で示す通り、キャップありのレプリカーゼコンストラクトが、レプリコンＲＮＡに対してトランスに置かれる場合、キャップありのレプリカーゼコンストラクトは、目的のタンパク質の産生を、より効率的に誘発する（例えば、実施例１を参照されたい）。したがって、本明細書では、５’キャップと、トランスにおける複製との相乗効果、すなわち、シスにおける複製より優れた相乗効果が裏付けられる。
本発明のキャップありのＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて調製することができ、したがって、宿主細胞内のキャッピング機構に依存しない。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、キャップありのＲＮＡを作り出す、もっともよく使用される方法は、４つのリボヌクレオシド三リン酸全て、及びｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍ７ＧｐｐｐＧともまた呼ばれる）などのキャップジヌクレオチドの存在下で、細菌ＲＮＡポリメラーゼ又はバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼにより、ＤＮＡ鋳型を転写する方法である。ＲＮＡポリメラーゼは、次の鋳型ヌクレオシド三リン酸（ｐｐｐＮ）のα－リン酸上のｍ７ＧｐｐｐＧのグアノシン部分の３’－ＯＨによる求核攻撃により転写を開始する結果として、中間体であるｍ７ＧｐｐｐＧｐＮ（式中、Ｎは、ＲＮＡ分子の第２の塩基である）をもたらす。競合的ＧＴＰにより誘発される産物である、ｐｐｐＧｐＮの形成は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写時のキャップ対ＧＴＰのモル比を、５－１０の間に設定することにより抑制する。
本発明の好ましい実施態様では、５’キャップは、５’キャップ類似体である。これらの実施態様は、特に、ＲＮＡが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により得られる、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）である場合に適する。キャップ類似体は、まず、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写による、ＲＮＡ転写物の大スケールの合成を容易とすることが初期には記載されていた。
既に記載されている操作アルファウイルス複製システム（例えば、国際公開第２００８／１１９８２７Ａ１号、国際公開第２０１２／００６３７６Ａ２号）とは対照的に、本発明のレプリカーゼコンストラクトは、好ましくは、キャップ類似体を含む。したがって、本発明のシステムのレプリカーゼの翻訳は、好ましくは、キャップ類似体により駆動される。理想的には、高度な翻訳効率、及び／又はｉｎ ｖｉｖｏにおける分解に対する耐性の増加、及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏにおける分解に対する耐性の増加と関連するキャップ類似体が選択される。したがって、本発明は、好ましくは、修飾ヌクレオチドを含有せず、ｍ７ＧｐｐｐＧとも呼ばれ、任意選択で、市販のＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｍ７Ｇ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により付加される天然のキャップであるｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを含むアルファウイルス発現コンストラクトについて記載する先行技術（国際公開第２０１２／００６３７６Ａ２号）と顕著に異なる手法をもたらす。
メッセンジャーＲＮＡについては、現在、一部のキャップ類似体（合成キャップ）が一般に記載されており、これらは全て、本発明の文脈でも使用することができる。１つの方向に限り、ＲＮＡ鎖へと組み込まれうるキャップ類似体を使用することが好ましい。Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ等（1995, RNA J., vol., 1, pp. 957-967）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写時において、バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼは、転写の開始のために、７－メチルグアノシン単位を使用するが、この場合、キャップを伴う約４０－５０％の転写物が、逆方向のキャップジヌクレオチド（すなわち、初期反応産物は、Ｇｐｐｐｍ７ＧｐＮである）を有することを裏付けた。適正なキャップを伴うＲＮＡと比較して、リバースキャップを伴うＲＮＡは、コードされるタンパク質の翻訳に関して機能的ではない。したがって、適正な方向でキャップを組み込むこと、すなわち、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＮなどに本質的に対応する構造を伴うＲＮＡを結果としてもたらすことが所望される。キャップ－ジヌクレオチドの逆組込みは、メチル化グアノシン単位の２’－ＯＨ基又は３’－ＯＨ基の置換により阻害されることが示されている（Stepinski等, 2001; RNA J., vol. 7, pp. 1486-1495、Peng等, 2002; Org. Lett., vol. 24, pp. 161-164）。このような「抗リバースキャップ類似体」の存在下で合成されるＲＮＡは、従来型の５’キャップであるｍ７ＧｐｐｐＧの存在下でｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されるＲＮＡより効率的に翻訳される。この目的で、メチル化グアノシン単位の３’ＯＨ基を、ＯＣＨ３で置き換えた、１つのキャップ類似体については、例えば、Ｈｏｌｔｋａｍｐ等、２００６、Ｂｌｏｏｄ， ｖｏｌ． １０８、ｐｐ． ４００９－４０１７により記載されている（７－メチル（３’－Ｏ－メチル）ＧｐｐｐＧ、抗リバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ））。ＡＲＣＡは、本発明に従う、適切なキャップジヌクレオチド
Figure 0007421256000002
である。
本発明の好ましい実施態様では、本発明のＲＮＡは、本質的にキャップ除去を受けにくい。一般に、培養哺乳動物細胞へと導入された合成ｍＲＮＡから産生されるタンパク質の量は、天然におけるｍＲＮＡの分解により限定されるため、これは重要である。ｉｎ ｖｉｖｏにおける、ｍＲＮＡ分解の１つの経路は、ｍＲＮＡキャップの除去で始まる。この除去は、調節性サブユニット（Ｄｃｐ１）と、触媒性サブユニット（Ｄｃｐ２）とを含有する、ヘテロ二量体のピロホスファターゼにより触媒される。触媒性サブユニットは、三リン酸架橋のαリン酸基と、βリン酸基との間を切断する。本発明では、この種の切断を受けないか、又は受けにくい、キャップ類似体が選択されうるか、又は存在しうる。この目的に適するキャップ類似体は、式（Ｉ）：
Figure 0007421256000003
Ｒ１は、任意選択で、置換アルキル、任意選択で、置換アルケニル、任意選択で、置換アルキニル、任意選択で、置換シクロアルキル、任意選択で、置換ヘテロシクリル、任意選択で、置換アリールと、任意選択で、置換ヘテロアリールとからなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は、独立に、Ｈ、ハロ、ＯＨと、任意選択で、置換アルコキシとからなる群から選択されるか、又はＲ２及びＲ３は共に、Ｏ－Ｘ－Ｏを形成し、Ｘは、任意選択で、置換ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）、及びＣ（ＣＨ３）２からなる群から選択されるか、又はＲ２は、－Ｏ－ＣＨ２－又は－ＣＨ２－Ｏ－を形成するように、Ｒ２を接合させる環の４’位の水素原子と組み合わされ、
Ｒ５は、Ｓ、Ｓｅ、及びＢＨ３からなる群から選択され、
Ｒ４及びＲ６は、独立に、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、及びＢＨ３からなる群から選択され、
ｎは、１、２、又は３である］
に従うキャップジヌクレオチドから選択することができる。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６に好ましい実施態様は、国際公開第２０１１／０１５３４７Ａ１号に開示されており、したがって、本発明でも選択することができる。本発明の一実施態様では、Ｒ１は、メチルであり、Ｒ２及びＲ３は、独立に、ヒドロキシ又はメトキシである。
例えば、本発明の好ましい実施態様では、本発明のＲＮＡは、ホスホロチオエート－キャップ類似体を含む。ホスホロチオエート－キャップ類似体は、三リン酸鎖内の３つの非架橋Ｏ原子のうちの１つを、Ｓ原子で置き換えた、すなわち、式（Ｉ）中のＲ４、Ｒ５、又はＲ６のうちの１つが、Ｓである特異的キャップ類似体である。ホスホロチオエート－キャップ類似体は、Ｊ．Ｋｏｗａｌｓｋａ等、２００８、ＲＮＡ，ｖｏｌ．１４、ｐｐ．１１１９－１１３１により、所望されないキャップ除去過程に対する解決策、したがって、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＲＮＡの安定性を増加させる解決策として記載されている。特に、５’キャップのベータ－リン酸基における、酸素原子の、硫黄原子への置換は、Ｄｃｐ２に対する安定化を結果としてもたらす。本発明において好ましいこの実施態様では、式（Ｉ）中のＲ５は、Ｓであり、Ｒ４及びＲ６は、Ｏである。
更に本発明の好ましい実施態様では、本発明のＲＮＡは、ＲＮＡ ５’キャップのホスホロチオエート修飾を、「抗リバースキャップ類似体」（ＡＲＣＡ）修飾と組み合わせた、ホスホロチオエート－キャップ類似体を含む。それぞれのＡＲＣＡ－ホスホロチオエート－キャップ類似体は、国際公開第２００８／１５７６８８Ａ２号において記載されており、全て、本発明のＲＮＡ内で使用することができる。この実施態様では、式（Ｉ）中のＲ２又はＲ３のうちの少なくとも１つは、ＯＨではなく、好ましくは、Ｒ２及びＲ３のうちの１つは、メトキシ（ＯＣＨ３）であり、Ｒ２及びＲ３のうちの他の１つは、好ましくは、ＯＨである。好ましい実施態様では、ベータ－リン酸基における酸素原子を、硫黄原子に置換する（式（Ｉ）中のＲ５が、Ｓであり、Ｒ４及びＲ６が、Ｏであるように）。ＡＲＣＡのホスホロチオエート修飾は、αリン酸、βリン酸、及びγリン酸、並びにホスホロチオエート基が、翻訳機構及びキャップ除去機構のいずれにおいても、キャップ結合性タンパク質の活性部位内に正確に配置されることを確保することが考えられる。少なくともこれらの類似体のうちの一部は、ピロホスファターゼであるＤｃｐ１／Ｄｃｐ２に対して、本質的に耐性である。ホスホロチオエート修飾ＡＲＣＡは、ホスホロチオエート基を欠く、対応するＡＲＣＡより、ｅＩＦ４Ｅに対して、はるかに大きなアフィニティーを有することが記載された。
本発明において特に、好ましい、それぞれのキャップ類似体、すなわち、ｍ２’ ７，２’－ＯＧｐｐｓｐＧを、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡと称する（国際公開第２００８／１５７６８８Ａ２号、Kuhn等, Gene Ther., 2010, vol. 17, pp. 961-971）。したがって、本発明の一実施態様では、本発明のレプリカーゼコンストラクトを、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡで修飾する。ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡは、以下の構造：
Figure 0007421256000004
により表される。
一般に、架橋リン酸における、酸素原子の、硫黄原子への置き換えは、ＨＰＬＣにおけるそれらの溶出パターンに基づき、Ｄ１及びＤ２と称される、ホスホロチオエートジアステレオマーを結果としてもたらす。略述すると、「ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマー」又は「ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）」とは、ＨＰＬＣカラム上で、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ２ジアステレオマー（ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ２））と比較して、最初に溶出し、したがって、短い保持時間を呈する、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡのジアステレオマーである。ＨＰＬＣによる立体化学配置の決定については、国際公開第２０１１／０１５３４７Ａ１号において記載されている。
本発明の、第１の、特に好ましい実施態様では、本発明のレプリカーゼコンストラクトを、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ２）ジアステレオマーで修飾する。ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡの２つのジアステレオマーは、ヌクレアーゼに対する感受性が異なる。ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ２ジアステレオマーを保有するＲＮＡは、Ｄｃｐ２切断に対して、ほぼ完全に耐性である（非修飾ＡＲＣＡ ５’キャップの存在下で合成されたＲＮＡと比較して、６％の切断にとどまる）のに対し、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）５’キャップを伴うＲＮＡは、Ｄｃｐ２切断に対する中程度の感受性（７１％の切断）を呈することが示されている。更に、Ｄｃｐ２切断に対する安定性の増加が、哺乳動物細胞内のタンパク質発現の増加と相関することも示されている。特に、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ２）キャップを保有するＲＮＡは、細胞内で、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）キャップを保有するＲＮＡより効率的に翻訳されることが示されている。したがって、本発明の一実施態様では、本発明のレプリカーゼコンストラクトを、式（Ｉ）に従うキャップ類似体であって、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ２ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学配置に対応する式（Ｉ）中の置換基Ｒ５を含むＰ原子における立体化学配置を特徴とするキャップ類似体で修飾する。この実施態様では、式（Ｉ）中のＲ５は、Ｓであり、Ｒ４及びＲ６は、Ｏである。加えて、式（Ｉ）中のＲ２又はＲ３のうちの少なくとも１つは、好ましくは、ＯＨではなく、好ましくは、Ｒ２及びＲ３のうちの１つは、メトキシ（ＯＣＨ３）であり、Ｒ２及びＲ３のうちの他の１つは、好ましくは、ＯＨである。
本発明の、第２の、特に好ましい実施態様では、本発明のレプリカーゼコンストラクトを、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）ジアステレオマーで修飾する。この実施態様は、ワクチン接種などを目的する、キャップありのＲＮＡの、未成熟抗原提示細胞への導入に特に適する。ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）ジアステレオマーは、それぞれキャップありのＲＮＡが、未成熟抗原提示細胞へと導入されると、ＲＮＡの安定性を増加させ、ＲＮＡの翻訳効率を増加させ、ＲＮＡの翻訳を延長し、ＲＮＡの全タンパク質発現を増加させ、且つ／又は前記ＲＮＡによりコードされる抗原又は抗原ペプチドに対する免疫応答を増加させるのに、特に適することが裏付けられている（Kuhn等, Gene Ther., 2010, vol. 17, pp. 961-971）。したがって、本発明の代替的実施態様では、本発明のレプリカーゼコンストラクトを、式（Ｉ）に従うキャップ類似体であって、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学配置に対応する式（Ｉ）中の置換基Ｒ５を含むＰ原子における立体化学配置を特徴とするキャップ類似体で修飾する。それぞれのキャップ類似体及びそれらの実施態様については、国際公開第２０１１／０１５３４７Ａ１号及びＫｕｈｎ等、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２０１０、ｖｏｌ．１７、ｐｐ．９６１－９７１において記載されている。本発明では、国際公開第２０１１／０１５３４７Ａ１号において記載されている、任意のキャップ類似体であって、置換基Ｒ５を含むＰ原子における立体化学配置が、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学配置に対応するキャップ類似体を使用することができる。好ましくは、式（Ｉ）中のＲ５は、Ｓであり、Ｒ４及びＲ６は、Ｏである。加えて、式（Ｉ）中のＲ２又はＲ３のうちの少なくとも１つは、好ましくは、ＯＨではなく、好ましくは、Ｒ２及びＲ３のうちの１つは、メトキシ（ＯＣＨ３）であり、Ｒ２及びＲ３のうちの他の１つは、好ましくは、ＯＨである。
一実施態様では、本発明のレプリカーゼコンストラクトを、式（Ｉ）に従う５’キャップ構造であって、任意の１つのリン酸基を、ボラノリン酸基又はホスホロセレノエート基で置き換えた５’キャップ構造で修飾する。このようなキャップは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのいずれにおいても、安定性を増加させている。任意選択で、それぞれの化合物は、２’－Ｏ－アルキル基又は３’－Ｏ－アルキル基（式中、アルキルは、好ましくは、メチルである）を有し、それぞれのキャップ類似体を、ＢＨ３－ＡＲＣＡ又はＳｅ－ＡＲＣＡと称する。ｍＲＮＡのキャッピングに特に適する化合物は、国際公開第２００９／１４９２５３Ａ２号に記載されている、β－ＢＨ３－ＡＲＣＡ及びβ－Ｓｅ－ＡＲＣＡを含む。これらの化合物には、式（Ｉ）中の置換基Ｒ５を含むＰ原子における立体化学配置であって、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学配置に対応する立体化学配置が好ましい。
ＵＴＲ
「非翻訳領域」又は「ＵＴＲ」という用語は、転写されるが、アミノ酸配列へと翻訳されない領域、又はｍＲＮＡ分子など、ＲＮＡ分子内の対応する領域に関する。３’－ＵＴＲは、存在する場合、遺伝子の３’末端の、タンパク質コード領域の終結コドンの下流に位置するが、「３’－ＵＴＲ」という用語は、好ましくは、ポリ（Ａ）テールを含まない。したがって、３’－ＵＴＲは、ポリ（Ａ）テール（存在する場合）の上流にあり、例えば、ポリ（Ａ）テールに直に隣接する。
５’－ＵＴＲは、存在する場合、遺伝子の５’末端の、タンパク質コード領域の開始コドンの上流に位置する。５’－ＵＴＲは、５’キャップ（存在する場合）の下流にあり、例えば、５’キャップに直に隣接する。
本発明によると、５’非翻訳領域及び／又は３’非翻訳領域を、これらの領域が、前記オープンリーディングフレームを含むＲＮＡの安定性及び／又は翻訳効率を増加させる形で、オープンリーディングフレームと関連するように、オープンリーディングフレームへと、機能的に連結することができる。
非翻訳領域（ＵＴＲ）は、レプリカーゼをコードするオープンリーディングフレームの５’（上流）（５’－ＵＴＲ）、及び／又はレプリカーゼをコードするオープンリーディングフレームの３’（下流）（３’－ＵＴＲ）に存在しうる。好ましい実施態様では、アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクト（レプリカーゼコンストラクト）は、
（１）５’ＵＴＲと、
（２）レプリカーゼをコードするオープンリーディングフレームと、
（３）３’ＵＴＲと
を含む。
本発明のレプリカーゼコンストラクトについての実施態様ではとりわけ、「３’－ＵＴＲ」という用語は、レプリカーゼのコード領域の３’側に位置する領域に関し、「５’－ＵＴＲ」という用語は、レプリカーゼのコード領域の５’側に位置する領域に関する。
ＵＴＲは、ＲＮＡベースのワクチンを使用する効果的な免疫応答に必須である、ＲＮＡの安定性及び翻訳効率に関与する。本明細書で記載される、５’キャップ及び／又は３’ポリ（Ａ）テールに関する構造的修飾以外に、特異的５’非翻訳領域及び／又は３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を選択することにより、ＲＮＡの安定性及び翻訳効率のいずれも改善することができる。ＵＴＲ内の配列エレメントは一般に、翻訳の効率（主に、５’－ＵＴＲ）及びＲＮＡ安定性（主に、３’－ＵＴＲ）に影響を及ぼすと理解される。核酸配列の翻訳効率及び／又は安定性を増加させるために、活性の５’－ＵＴＲが存在することが好ましい。独立に、又は加えて、核酸配列の翻訳効率及び／又は安定性を増加させるために、活性の３’－ＵＴＲが存在することが好ましい。
第１の核酸配列（例えば、ＵＴＲ）に言及する、「核酸配列の翻訳効率及び／又は安定性を増加させるために、活性である核酸配列」という用語は、第１の核酸配列が、第２の核酸配列と共通の転写物内で、前記翻訳効率及び／又は安定性を、前記第１の核酸配列の非存在下における、前記第２の核酸配列の翻訳効率及び／又は安定性と比較して増加させる形で、前記第２の核酸配列の翻訳効率及び／又は安定性を修飾することが可能であることを意味する。この文脈では、「翻訳効率」という用語は、ＲＮＡ分子によりもたらされる翻訳産物の量であって、特に、時間を伴う量に関し、「安定性」という用語は、ＲＮＡ分子の半減期に関する。
好ましくは、レプリカーゼコンストラクトは、レプリカーゼが由来するアルファウイルスに対して、異種又は非天然である、５’－ＵＴＲ及び／又は３’－ＵＴＲを含む。これは、非翻訳領域を、所望の翻訳効率及びＲＮＡの安定性に従いデザインすることを可能とする。したがって、異種ＵＴＲ又は非天然ＵＴＲは、高度の柔軟性を可能とし、この柔軟性は、天然のアルファウイルスＵＴＲと比較して有利である。特に、アルファウイルス（天然）ＲＮＡはまた、５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲも含むことが公知であるが、アルファウイルスのＵＴＲは、二重の機能を果たす、すなわち、（ｉ）ＲＮＡの複製を駆動するほか、（ｉｉ）翻訳を駆動する。アルファウイルスのＵＴＲは、翻訳に非効率的であることが報告されている（Berben-Bloemheuvel等, 1992, Eur. J. Biochem., vol. 208, pp. 581-587）が、それらの二重の機能のために、より効率的なＵＴＲで、たやすく置き換えることはできない。しかし、本発明では、レプリカーゼコンストラクトの５’－ＵＴＲ及び／又は３’－ＵＴＲを、ＲＮＡの複製に対する、それらの潜在的な影響から独立して選択することができる。
好ましくは、レプリカーゼコンストラクトは、ウイルス由来ではない、特に、アルファウイルス由来ではない、５’－ＵＴＲ及び／又は３’－ＵＴＲを含む。一実施態様では、ＲＮＡは、真核細胞の５’－ＵＴＲに由来する５’－ＵＴＲ、及び／又は真核細胞の３’－ＵＴＲに由来する３’－ＵＴＲを含む。
本発明に従う５’－ＵＴＲは、任意選択で、リンカーにより隔てられた、１つを超える核酸配列の任意の組合せを含みうる。本発明に従う３’－ＵＴＲは、任意選択で、リンカーにより隔てられた、１つを超える核酸配列の任意の組合せを含みうる。
本発明によると、「リンカー」という用語は、前記２つの核酸配列を接続するように、２つの核酸配列の間に付加される核酸配列に関する。リンカー配列に関する特定の制限は存在しない。
３’－ＵＴＲは、典型的に、２００から２０００ヌクレオチド、例えば、５００から１５００ヌクレオチドの長さを有する。免疫グロブリンｍＲＮＡの３’非翻訳領域は、比較的短い（約３００ヌクレオチド未満）が、他の遺伝子の３’非翻訳領域は、比較的長い。例えば、ｔＰＡの３’非翻訳領域は、約８００ヌクレオチドの長さであり、因子ＶＩＩＩの３’非翻訳領域は、約１８００ヌクレオチドの長さであり、エリスロポエチンの３’非翻訳領域は、約５６０ヌクレオチドの長さである。
哺乳動物ｍＲＮＡの３’非翻訳領域は、典型的に、ＡＡＵＡＡＡヘキサヌクレオチド配列として公知の相同性領域を有する。この配列は、ポリ（Ａ）接合シグナルであると推定され、ポリ（Ａ）接合部位の１０から３０塩基上流に位置することが多い。
３’非翻訳領域は、エキソリボヌクレアーゼに対する障壁として作用するか、又はＲＮＡの安定性を増加させることが公知のタンパク質（例えば、ＲＮＡ結合性タンパク質）と相互作用する、ステムループ構造をもたらすようにフォールドしうる、１又は複数の逆位リピートを含有しうる。
ヒトベータ－グロビンの３’－ＵＴＲ、特に、ヒトベータ－グロビンの３’－ＵＴＲの、２つの連続する同一なコピーは、高度な転写物の安定性及び翻訳の効率に寄与する（Holtkamp等, 2006, Blood, vol. 108, pp. 4009-4017）。したがって、一実施態様では、本発明のレプリカーゼコンストラクトは、ヒトベータ－グロビンの３’－ＵＴＲの、２つの連続する同一なコピーを含む。したがって、本発明のレプリカーゼコンストラクトは、５’→３’方向に：（ａ）任意選択で、５’－ＵＴＲ；（ｂ）レプリカーゼをコードするオープンリーディングフレーム；（ｃ）ヒトベータ－グロビンの３’－ＵＴＲの、２つの連続する同一なコピー、その断片、又はヒトベータ－グロビンの３’－ＵＴＲ若しくはその断片の変異体を含む３’－ＵＴＲを含む。
一実施態様では、本発明のレプリカーゼコンストラクトは、レプリカーゼコンストラクトの翻訳効率及び／又は安定性を増加させるために活性であるが、ヒトベータ－グロビンの３’－ＵＴＲ、その断片、又はヒトベータ－グロビンの３’－ＵＴＲ若しくはその断片の変異体ではない３’－ＵＴＲを含む。
一実施態様では、本発明のレプリカーゼコンストラクトは、レプリカーゼコンストラクトの翻訳効率及び／又は安定性を増加させるために活性である５’－ＵＴＲを含む。
本発明に従うＵＴＲ含有ＲＮＡは、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により調製することができる。これは、５’－ＵＴＲ及び／又は３’－ＵＴＲを伴うＲＮＡの転写を可能とする形で、本発明の核酸分子（例えば、ＤＮＡ）の発現を遺伝子改変することにより達成することができる。
Ｐｏｌｙ（Ａ）配列
一実施態様では、アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクト（レプリカーゼコンストラクト）は、３’ポリ（Ａ）配列を含む。
アルファウイルスでは、少なくとも１１の連続アデニル酸残基、又は少なくとも２５の連続アデニル酸残基の、３’ポリ（Ａ）配列が、マイナス鎖の効率的な合成に重要であると考えられる。特に、アルファウイルスでは、少なくとも２５の連続アデニル酸残基の３’ポリ（Ａ）配列は、保存配列エレメント４（ＣＳＥ４）と共に機能して、（－）鎖の合成を促進すると理解される（Hardy及びRice, J. Virol., 2005, vol. 79, pp. 4630-4639）。しかし、本発明では、レプリカーゼコンストラクトの（－）鎖合成は、典型的に、所望されず、ポリ（Ａ）配列は、主に、トランスフェクトされた真核細胞内の、ＲＮＡの安定性及びタンパク質の翻訳に影響を及ぼす機能を果たす。実際、約１２０のＡヌクレオチドの３’ポリ（Ａ）配列が、トランスフェクトされた真核細胞内のＲＮＡのレベル、並びに３’ポリ（Ａ）配列の上流（５’）に存在するオープンリーディングフレームから翻訳されるタンパク質のレベルに対して、有益な影響を及ぼすことが裏付けられている（Holtkamp等, 2006, Blood, vol. 108, pp. 4009-4017）。本発明によると、一実施態様では、ポリ（Ａ）配列は、少なくとも２０、好ましくは、少なくとも２６、好ましくは、少なくとも４０、好ましくは、少なくとも８０、好ましくは、少なくとも１００のＡヌクレオチドであり、好ましくは、最大で５００、好ましくは、最大で４００、好ましくは、最大で３００、好ましくは、最大で２００のＡヌクレオチドであり、特に、最大で１５０のＡヌクレオチドであり、特に、約１２０のＡヌクレオチドを含むか、又はこれらから本質的になるか、又はこれらからなる。この文脈では、「～から本質的になる」とは、ポリ（Ａ）配列内の大半のヌクレオチド、典型的に、「ポリ（Ａ）配列」内のヌクレオチドの数で、少なくとも５０％であり、好ましくは、少なくとも７５％が、Ａヌクレオチドであるが、残りのヌクレオチドが、Ｕヌクレオチド（ウリジル酸）、Ｇヌクレオチド（グアニル酸）、Ｃヌクレオチド（シチジル酸）など、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドであることを許容することを意味する。この文脈では、「～からなる」とは、ポリ（Ａ）配列内の全てのヌクレオチド、すなわち、ポリ（Ａ）配列内のヌクレオチドの数で１００％が、Ａヌクレオチドであることを意味する。「Ａヌクレオチド」又は「Ａ」という用語は、アデニル酸を指す。
本発明は、ＲＮＡ転写時、すなわち、コード鎖と相補的な鎖内の、反復ｄＴヌクレオチド（デオキシチミジル酸）内のポリ（Ａ）配列を含むＤＮＡ鋳型に基づく、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡの調製時に接合させる３’ポリ（Ａ）配列を提供する。ポリ（Ａ）配列（コード鎖）をコードするＤＮＡ配列を、ポリ（Ａ）カセットと称する。
本発明の好ましい実施態様では、ＤＮＡのコード鎖内に存在する３’ポリ（Ａ）カセットは、ｄＡヌクレオチドから本質的になるが、４つのヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ）の分布が均等なランダム配列により中断されている。このようなランダム配列は、５から５０、好ましくは、１０から３０、より好ましくは、１０から２０ヌクレオチドの長さでありうる。このような カセットは、国際公開第２０１６／００５００４Ａ１号において開示されている。本発明では、国際公開第２０１６／００５００４Ａ１号において開示されている、任意のポリ（Ａ）カセットを使用することができる。ｄＡヌクレオチドから本質的になるが、４つのヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ）の分布が均等なランダム配列により中断されており、例えば、５から５０ヌクレオチドの長さであるポリ（Ａ）カセットは、ＤＮＡレベルでは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内のプラスミドＤＮＡの一定の繁殖を示し、なお、ＲＮＡレベルでは、ＲＮＡの安定性及び翻訳の効率の支援に関する有益な特性とも関連する。
結果として、本発明の好ましい実施態様では、本明細書で記載されるＲＮＡ分子内に含有される３’ポリ（Ａ）配列は、Ａヌクレオチドから本質的になるが、４つのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）の分布が均等なランダム配列により中断されている。このようなランダム配列は、５から５０、好ましくは、１０から３０、より好ましくは、１０から２０ヌクレオチドの長さでありうる。
コドン使用
一般に、遺伝子コードの縮重は、同じコード能を維持しながらの、ＲＮＡ配列内に存在するある特定のコドン（塩基トリプレット）の、他のコドン（塩基トリプレット）による置換を可能とするであろう。本発明の一部の実施態様では、ＲＮＡ分子に含まれるオープンリーディングフレームの、少なくとも１つのコドンは、オープンリーディングフレームが由来する種における、それぞれのオープンリーディングフレーム内のそれぞれのコドンと異なる。この実施態様では、オープンリーディングフレームのコード配列を、「適合させた」という。
例えば、オープンリーディングフレームのコード配列を適合させる場合、高頻度で使用されるコドンを選択することができ、国際公開第２００９／０２４５６７Ａ１号は、核酸分子のコード配列の適合化であって、より高頻度で使用されるコドンによる、希少なコドンの置換を伴う適合化について記載する。コドン使用の頻度は、宿主細胞又は宿主生物に依存するので、この種の適合化は、核酸配列を、特定の宿主細胞又は宿主生物における発現へと適応させるのに適する。一般的に述べると、より高頻度で使用されるコドンは、典型的に、宿主細胞又は宿主生物において、より効率的に翻訳されるが、オープンリーディングフレームの全てのコドンの適合化が、常に必要とされるわけではない。
例えば、オープンリーディングフレームのコード配列を適合させる場合、各アミノ酸について、ＧＣ含量が最高となるコドンを選択することにより、Ｇ（グアニル酸）残基及びＣ（シチジル酸）残基の含量を変更することができる。オープンリーディングフレームがＧＣリッチなＲＮＡ分子は、免疫の活性化を低減し、翻訳及びＲＮＡの半減期を改善する潜在的可能性を有することが報告されている（Thess等, 2015, Mol. Ther. 23, 1457-1465）。
本発明に従うレプリカーゼをコードするオープンリーディングフレームは、それぞれ適応させることができる。
レプリコンの特徴付け
本発明のシステムは、レプリコンを含む。レプリカーゼ、好ましくは、アルファウイルスレプリカーゼによる複製が可能な核酸コンストラクトを、レプリコンと称する。典型的に、本発明に従うレプリコンは、ＲＮＡ分子である。
本発明によると、「レプリコン」という用語は、（ＤＮＡ中間体を伴わずに）ＲＮＡレプリコンの、１又は複数の、同一であるか、又は本質的に同一なコピーをもたらす、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより複製することができるＲＮＡ分子を規定する。「ＤＮＡ中間体を伴わずに」とは、レプリコンのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のコピー又は相補体が、ＲＮＡレプリコンのコピーを形成する過程において形成されず、且つ／又はＲＮＡレプリコン又はその相補体のコピーを形成する過程において、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を鋳型として使用しうることを意味する。
本発明によると、「複製することができる」という用語は、一般に、核酸の、１又は複数の、同一であるか、又は本質的に同一なコピーを調製することができることについて記載する。「レプリカーゼにより複製することができる」など、「レプリカーゼ」という用語と共に使用される場合、「複製することができる」という用語は、レプリカーゼに関する、レプリコンの機能的特徴について記載する。これらの機能的特徴は、（ｉ）レプリカーゼが、レプリコンを認識することが可能であること、及び（ｉｉ）レプリカーゼが、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）として作用することが可能であることのうちの少なくとも１つを含む。好ましくは、レプリカーゼは、（ｉ）レプリコンを認識すること、及び（ｉｉ）ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとして作用することの両方が可能である。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、レプリコン、その相補体、又はこれらのいずれかの一部を、鋳型として使用しうる。
「～を認識することが可能」という表現は、レプリカーゼが、レプリコンと物理的に会合することが可能であり、好ましくは、レプリカーゼが、典型的に、非共有結合的に、レプリコンに結合することが可能であることについて記載する。「結合すること」という用語は、レプリカーゼが、保存配列エレメント１（ＣＳＥ１）又はその相補的な配列（レプリコンに含まれる場合）、保存配列エレメント２（ＣＳＥ２）又はその相補的な配列（レプリコンに含まれる場合）、保存配列エレメント３（ＣＳＥ３）又はその相補的な配列（レプリコンに含まれる場合）、保存配列エレメント４（ＣＳＥ４）又はその相補的な配列（レプリコンに含まれる場合）のうちのいずれか１又は複数への結合能を有することを意味しうる。好ましくは、レプリカーゼは、ＣＳＥ２［すなわち、（＋）鎖］、及び／若しくはＣＳＥ４［すなわち、（＋）鎖］への結合が可能であるか、又はＣＳＥ１［すなわち、（－）鎖］の相補体、及び／若しくはＣＳＥ３［すなわち、（－）鎖］の相補体への結合が可能である。
「ＲｄＲＰとして作用することが可能」という表現は、レプリカーゼが、アルファウイルスゲノムの（＋）鎖ＲＮＡの（－）鎖相補体の合成を触媒することが可能であり、この場合、（＋）鎖ＲＮＡが、鋳型機能を有すること、及び／又はレプリカーゼが、（＋）鎖であるアルファウイルスゲノムＲＮＡの合成を触媒することが可能であり、この場合、（－）鎖ＲＮＡが鋳型機能を有することを意味することを含む。一般に、「ＲｄＲＰとして作用することが可能」という表現はまた、レプリカーゼが、（＋）鎖サブゲノム転写物の合成を触媒することが可能であり、この場合、（－）鎖ＲＮＡが、鋳型機能を有し、且つ、（＋）鎖サブゲノム転写物の合成が、典型的に、アルファウイルスのサブゲノムプロモーターにおいて開始されることも含みうる。
「結合が可能」及び「ＲｄＲＰとして作用することが可能」という表現は、通常の生理学的条件における能力を指す。特に、表現は、アルファウイルスレプリカーゼを発現させるか、又はアルファウイルスレプリカーゼをコードする核酸をトランスフェクトされた細胞内部の条件を指す。細胞は、好ましくは、真核細胞である。結合能及び／又はＲｄＲＰとして作用する能力は、例えば、細胞非含有のｉｎ ｖｉｔｒｏシステム又は真核細胞において、実験により調べることができる。任意選択で、前記真核細胞は、レプリカーゼの由来を表す、特定のアルファウイルスが感染性である種に由来する細胞である。例えば、ヒトに対して感染性である、特定のアルファウイルスに由来するアルファウイルスレプリカーゼを使用する場合、正常な生理学的条件は、ヒト細胞内の条件である。より好ましくは、真核細胞（一例では、ヒト細胞）は、レプリカーゼの由来を表す、特定のアルファウイルスが感染性である、同じ組織又は器官に由来する。
これらの機能的な特徴を念頭に、本発明のレプリコンと、本発明のレプリカーゼコンストラクトとは、機能的な対を形成する。アルファウイルスレプリカーゼは、本発明に従う、任意のアルファウイルスレプリカーゼであることが可能であり、レプリコンを、アルファウイルスレプリカーゼにより、トランスで複製することができる限りにおいて、レプリコンＲＮＡのヌクレオチド配列は、特に、限定されない。
本発明のシステムを、細胞、好ましくは、真核細胞へと導入する場合、レプリカーゼコンストラクト上でコードされるレプリカーゼは、翻訳され、これにより、レプリカーゼ酵素を生成させうる。翻訳の後、レプリカーゼは、トランスで、ＲＮＡレプリコンを複製することが可能である。したがって、本発明は、トランスでＲＮＡを複製するためのシステムを提供する。結果として、本発明のシステムは、トランス複製システムである。したがって、本発明に従うレプリコンは、トランスレプリコンである。
本明細書では、トランス（例えば、トランス作用型、トランス調節型の文脈における）とは、一般に、「異なる分子から作用すること」（すなわち、分子間で作用すること）を意味する。トランスとは、一般に、「同じ分子から作用すること」（すなわち、分子内で作用すること）を意味するシス（例えば、シス作用型、シス調節型の文脈における）の逆である。ＲＮＡ合成（ＲＮＡの転写及び複製を含む）の文脈では、トランス作用型エレメントは、ＲＮＡ合成が可能な酵素（レプリカーゼ）をコードする遺伝子を含有する核酸配列を含む。レプリカーゼは、第２の核酸分子、すなわち、異なる分子の合成において機能する。トランス作用型のＲＮＡ、及びそれがコードするタンパク質のいずれも、標的遺伝子に対して「トランスで作用する」という。本発明の文脈では、トランス作用型のＲＮＡは、アルファウイルスのＲＮＡポリメラーゼをコードする。アルファウイルスのＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡを複製することが可能であり、したがって、レプリカーゼと称される。レプリカーゼは、第２のＲＮＡ分子（レプリコン）に対して、トランスで作用する。本明細書では、本発明に従う、トランスでレプリカーゼにより複製することができるレプリコンを、「トランスレプリコン」又は「本発明に従うレプリコン」として、同義に称する。
アルファウイルスレプリカーゼが一般に、トランスで、鋳型ＲＮＡを認識し、複製することが可能であるという事実は、１９８０年代に初めて発見されたが、とりわけ、トランス複製されたＲＮＡは、効率的な複製を阻害すると考えられた（これは、感染細胞内のアルファウイルスゲノムと共に共複製される欠損干渉（ＤＩ）ＲＮＡの場合に発見された）ため、生物医学的適用のためのトランス複製の潜在的可能性は、認識されされなかった（Barrett等, 1984, J. Gen. Virol., vol. 65 (Pt 8), pp. 1273-1283、Lehtovaara等, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, vol. 78, pp. 5353-5357、Pettersson, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, vol. 78, pp. 115-119）。ＤＩ ＲＮＡは、細胞株への、高ウイルスロードの感染時に、半天然で生じうるトランスレプリコンである。ＤＩエレメントは、親ウイルスの毒力を低減し、これにより、阻害性寄生ＲＮＡとして作用する程度に効率的に共複製される（Barrett等, 1984, J. Gen. Virol., vol. 65 (Pt 11), pp. 1909-1920）。生物医学的適用への潜在的可能性は認識されなかったが、トランス複製の現象は、シスにおいて、同じ分子からのレプリカーゼを発現させることを必要とせずに、複製の機構を解明することを目的とする、いくつかの基礎研究において使用され、更に、レプリカーゼと、レプリコンとの分離はまた、それぞれの突然変異体が、機能喪失突然変異体であったにせよ、ウイルスタンパク質の突然変異体を伴う機能研究も可能とする（Lemm等, 1994, EMBO J., vol. 13, pp. 2925-2934）。これらの機能喪失研究及びＤＩ ＲＮＡは、アルファウイルスエレメントに基づくトランス活性化システムが、最終的に、治療目的に適うように利用可能となりうることを示唆しなかった。ＲＮＡの、脊椎動物へのｉｎ ｖｉｖｏ送達のための、より近年の手法は、自己複製ＲＮＡ分子を含む、シス複製システムを示唆する（国際公開第２０１２／００６３７６Ａ２号）。
先行技術における示唆とは対照的に、本発明のトランス複製システムは、遺伝子発現に極めて適しており、本発明のトランス複製システムは、高発現レベル、高抗原力価と関連し、抗原をコードするＲＮＡのレベルが、比較的低レベルである場合であってもなお、ワクチン接種された動物の、十分な程度の生存を達成することができる。特に、本発明のシステムのトランスレプリコン－ＲＮＡ １μｇの投与は、シスレプリコン５μｇの投与と同等な、ウイルス中和力価及びＨＡ力価をもたらしうる（実施例６及び図７を参照されたい）。これは、ワクチンをコードする核酸の全体量を低減しうるので、当技術分野、特に、動物へのワクチン接種の分野の進歩に対する著明な寄与を表す。これは、作製のための費用及び時間を節約し、少なくとも以下の理由で重要である。
まず何にもまして、本発明のシステムの多用途性（２つの個別のＲＮＡ分子を含む）は、レプリコン及びレプリカーゼコンストラクトを、異なる時点及び／又は異なる部位において、デザイン及び／又は調製しうることを可能とする。一実施態様では、レプリカーゼコンストラクトを、第１の時点において調製し、レプリコンを、後の時点において調製する。例えば、その調製後、レプリカーゼコンストラクトを、後の時点における使用のために保存することができる。本発明は、シスレプリコンと比較した柔軟性の増加を提供する。つまり、新たな病原体が出現したら、新たな病原体に対する免疫応答を誘発するポリペプチドをコードする核酸へと、レプリコンをクローニングすることにより、本発明のシステムを、ワクチン接種のためにデザインすることができる。既に調製されたレプリカーゼコンストラクトは、保存物から回収することができる。したがって、レプリカーゼコンストラクトを、デザイン及び調製する時点において、特定の病原体、又は特定の病原体の抗原（１又は複数）の性格が既知であることは必要とされない。結果として、レプリカーゼコンストラクトを、デザイン及び調製する時点において、特定の新たな病原体に対する免疫応答を誘発するポリペプチドをコードするレプリコンが利用可能であることは必要とされない。言い換えれば、レプリカーゼコンストラクトは、任意の特定のレプリコンから独立に、デザイン及び調製することができる。これは、レプリカーゼを欠くレプリコンの調製は、シスレプリコンの調製より、必要とされる労力及び資源が少ないため、新たな病原体、又は少なくとも１つの新たな抗原の発現を特徴とする病原体の出現に対して、迅速に反応することを可能とする。歴史は、病原体に対する迅速な反応を可能とするシステムが必要とされると語っており、これは、例えば、近年における、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、エボラウイルス、及び多様なインフルエンザウイルス亜型を引き起こす病原体の発生により例示される。
第２に、動物へのワクチン接種の場合、ワクチンの費用は、獣医学的コミュニティー及び農場的コミュニティーにおけるその成功への鍵である。本発明のレプリコンは、例えば、ワクチン接種された動物の細胞内の、機能的なアルファウイルス非構造タンパク質の存在下で複製することができるので、比較的低量のレプリコンＲＮＡを投与する場合であってもなお、高レベルの目的の遺伝子の発現を達成しうる。低量のレプリコンＲＮＡは、対象１例当たりのワクチンの費用に、肯定的に影響する。
第３に、トランス本発明に従うレプリコンは、典型的なシスレプリコンより短い核酸分子である。これは、目的のタンパク質、例えば、免疫原性ポリペプチドをコードするレプリコンの、より迅速なクローニングを可能とし、高収率の目的のタンパク質をもたらす（例えば、実施例１を参照されたい）。
好ましい実施態様では、レプリコンを、天然にあるセムリキ森林ウイルス、及び弱毒化セムリキ森林ウイルスなど、セムリキ森林ウイルスの変異体又は誘導体を含む、セムリキ森林ウイルスから、アルファウイルスレプリカーゼにより複製することができる。代替的な好ましい実施態様では、レプリコンを、天然にあるシンドビスウイルス、及び弱毒化シンドビスウイルスなど、シンドビスウイルスの変異体又は誘導体を含む、シンドビスウイルスから、アルファウイルスレプリカーゼにより複製することができる。代替的な好ましい実施態様では、レプリコンを、天然にあるＶＥＥＶ、及び弱毒化ＶＥＥＶなど、ＶＥＥＶの変異体又は誘導体を含む、ベネズエラウマ脳炎ウイルス （ＶＥＥＶ）から、アルファウイルスレプリカーゼにより複製することができる。
本発明に従うＲＮＡレプリコンは、好ましくは、一本鎖ＲＮＡ分子である。一般に、一本鎖をコードする核酸分子は、核酸素材の１重量単位（例えば、１μｇ）当たり２倍の遺伝情報を含む。したがって、一本鎖の性質は、例えば、上記Ｓｐｕｕｌ等により利用されている、先行技術による二本鎖ＤＮＡベクターと比較して、更なる利点を表す。本発明に従うレプリコンは、典型的に、（＋）鎖ＲＮＡ分子である。
一実施態様では、ＲＮＡレプリコンは、単離核酸分子である。
本発明のトランス複製システムは、宿主細胞への接種、及び宿主細胞内の目的の遺伝子の発現に適する（例えば、実施例１－３を参照されたい）。本発明の一部の実施例では、トランスレプリコンＲＮＡは、目的の遺伝子として、それぞれの目的の遺伝子の発現の効率をたやすく決定することを可能とする、レポータータンパク質（例えば、ＧＦＰ又はｅＧＦＰなどの蛍光タンパク質）をコードする遺伝子を含む。実施例２に示す通り、トランス複製システム（２つのＲＮＡを含む）は、シス複製（ｅＧＦＰレプリコンＲＮＡ）と比較した、目的の遺伝子の発現の、著明に良好な効率と関連する。
本発明のトランス複製システムは、ヒト又は動物における、例えば、高レベルでの発現のための、目的の遺伝子の、効率的な発現に適する。特に、実施例５は、レポータータンパク質を効率的に産生しうることを裏付け、実施例６は、本発明のシステムで治療された動物では、治療効果、病原性感染からの保護を達成しうることを裏付ける。
いかなる特定の理論により束縛されることを望まずに述べると、例えば、典型的な、天然で見出されるアルファウイルス内のレプリカーゼをコードする、約７４００ヌクレオチドは、全長レプリコンの増幅が必要とされるので、細胞に負荷をかけることが考えられる。例えば、ｍＲＮＡの形態の、非複製性レプリカーゼコンストラクトを、レプリカーゼ発現のために使用する場合、この負荷の主要部分は消滅することが考えられる。これは、トランスレプリコンを、ＲＮＡの増幅及びトランス遺伝子の発現に使用することを可能とする。レプリカーゼコンストラクトが、細胞内で複製されない（すなわち、複製される唯一の外来コンストラクトが、本発明のトランスレプリコンである）場合、細胞エネルギー及び資源（ヌクレオチドなど）の浪費が回避されることから、優れた発現レベルが説明されうるであろう。更に、短いレプリコンＲＮＡは、ＲＮＡ合成のために必要とする時間が短い可能性が高い。したがって、時間、細胞エネルギー、及び／又は資源の節約が、高レベルの複製に寄与することが考えられる。
保存配列エレメント
一実施態様では、レプリコンは、アルファウイルスゲノムＲＮＡであるか、若しくはこれを含むか、又は、アルファウイルスゲノムＲＮＡに由来する。一実施態様では、本発明に従うレプリコンは、保存配列エレメント（ＣＳＥ）（Strauss及びStrauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562）のうちの１又は複数を含む。特に、レプリコンは、天然で見出されるアルファウイルス又はその変異体若しくは誘導体の、保存配列エレメント（ＣＳＥ）のうちの１又は複数を含みうる。
・（－）鎖鋳型からの（＋）鎖合成のためのプロモーターとして機能すると考えられるＣＳＥ１。存在する場合、ＣＳＥ１は、典型的に、レプリコンＲＮＡの５’末端において、又はこの近傍に配置される。
・（＋）鎖のゲノムＲＮＡ鋳型からの（－）鎖合成のためのプロモーター又はエンハンサーとして機能すると考えられるＣＳＥ２。存在する場合、ＣＳＥ２は、典型的に、ＣＳＥ１の下流であるが、ＣＳＥ３の上流に配置される。
・サブゲノムＲＮＡの効率的な転写に寄与すると考えられるＣＳＥ３。存在する場合、ＣＳＥ３は、典型的に、目的の遺伝子（存在する場合）のコード配列の上流であるが、ＣＳＥ２の下流に配置される。
・（－）鎖合成の開始のためのコアプロモーターとして機能すると考えられるＣＳＥ４。存在する場合、ＣＳＥ４は、典型的に、目的の遺伝子（存在する場合）のコード配列の下流に配置される。ともあれ、ＣＳＥ４は、典型的に、ＣＳＥ３の下流に存在する。多様なアルファウイルスにおけるＣＳＥ４（３’ＣＳＥとも称される）の配列の詳細については、Ｈａｒｄｙ及びＲｉｃｅ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００５、ｖｏｌ．７９、ｐｐ．４６３０－４６３９において記載されており、本発明では、ＣＳＥ４の配列を、例えば、この文献の教示に従い、選択することができる。
一実施態様では、本発明に従うＲＮＡレプリコンは、
（１）アルファウイルスの５’複製認識配列と、
（２）アルファウイルスの３’複製認識配列と
を含む。
一実施態様では、アルファウイルスの５’複製認識配列は、アルファウイルスのＣＳＥ１及び／又はＣＳＥ２を含む。天然にあるアルファウイルスでは、ＣＳＥ１及び／又はＣＳＥ２は典型的に、５’複製認識配列内に含まれる。
一実施態様では、アルファウイルスの３’複製認識配列は、アルファウイルスＣＳＥ４を含む。天然にあるアルファウイルスでは、ＣＳＥ４は典型的に、３’複製認識配列内に含まれる。
一実施態様では、アルファウイルスの５’複製認識配列及びアルファウイルスの３’複製認識配列は、レプリカーゼの存在下で、本発明に従うＲＮＡレプリコンの複製を導くことが可能である。したがって、単独で、又は、好ましくは、共に存在する場合、これらの認識配列は、レプリカーゼの存在下で、ＲＮＡレプリコンの複製を導く。いかなる特定の理論により束縛されることを望まずに述べると、アルファウイルスの、保存配列エレメント（ＣＳＥ）１、ＣＳＥ２、及びＣＳＥ４が、レプリカーゼの存在下で、ＲＮＡレプリコンの複製を導く認識配列である（この中に含まれる）ことが理解される。したがって、この実施態様では、レプリコンは、典型的に、ＣＳＥ１、ＣＳＥ２、及びＣＳＥ４を含むと予想される。
レプリカーゼコンストラクトによりコードされるレプリカーゼは、レプリコンの、アルファウイルスの５’複製認識配列及びアルファウイルスの３’複製認識配列の両方を認識することが可能なアルファウイルスレプリカーゼであることが好ましい。
一実施態様では、これは、アルファウイルスの５’複製認識配列及びアルファウイルスの３’複製認識配列が、レプリカーゼが由来するアルファウイルスに対して天然である場合に達成される。天然とは、これらの配列の天然の由来が、同じアルファウイルスであることを意味する。一実施態様では、ＣＳＥ１、ＣＳＥ２、及びＣＳＥ４は、レプリカーゼが由来するアルファウイルスに対して天然である。
代替的実施態様では、５’複製認識配列（並びに／又はＣＳＥ１及び／若しくはＣＳＥ２）及び／又はアルファウイルスの３’複製認識配列（及び／又はＣＳＥ４）は、アルファウイルスレプリカーゼが、レプリコンの５’複製認識配列（並びに／又はＣＳＥ１及び／若しくはＣＳＥ２）及び３’複製認識配列（及び／又はＣＳＥ４）の両方を認識することが可能であるという条件で、レプリカーゼが由来するアルファウイルスに対して天然ではない。言い換えれば、レプリカーゼは、５’複製認識配列（並びに／又はＣＳＥ１及び／若しくはＣＳＥ２）及び３’複製認識配列（及び／又はＣＳＥ４）と適合性である。非天然アルファウイルスレプリカーゼが、それぞれの配列又は配列エレメントを認識することが可能である場合、レプリカーゼを、適合性（ウイルス間適合性）という。当技術分野では、（３’／５’）複製認識配列及びＣＳＥのそれぞれの、異なるアルファウイルスに由来する非天然レプリカーゼとのウイルス間適合性の例が公知である（例えば、Strauss及びStrauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562により総説されている）。ウイルス間適合性が存在する限りにおいて、（３’／５’）複製認識配列及びＣＳＥのそれぞれの、アルファウイルスレプリカーゼとの任意の組合せが可能である。本発明を実行する当業者は、被験レプリカーゼを、被験３’複製認識配列及び被験５’複製認識配列を有するＲＮＡと共に、ＲＮＡの複製に適する条件で、例えば、適切な宿主細胞内でインキュベートすることにより、ウイルス間適合性について、たやすく調べることができる。複製が生じる場合、（３’／５’）複製認識配列とレプリカーゼとは、適合性であると決定される。
サブゲノムプロモーター
特定の実施態様では、本発明に従うＲＮＡレプリコンは、発現制御配列を含む。典型的な発現制御配列は、プロモーターであるか、又はこれを含む。一実施態様では、本発明に従うＲＮＡレプリコンは、サブゲノムプロモーターを含む。好ましくは、サブゲノムプロモーターは、アルファウイルスのサブゲノムプロモーターである。サブゲノムプロモーターのヌクレオチド配列は、アルファウイルス間で高度に保存的である（Strauss及びStrauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562）。
好ましくは、サブゲノムプロモーターは、アルファウイルスの構造タンパク質のためのプロモーターである。これは、サブゲノムプロモーターが、アルファウイルスに対して天然であり、前記アルファウイルス内の、１又は複数の構造タンパク質の遺伝子の転写を制御するプロモーターであることを意味する。
サブゲノムプロモーターは、レプリカーゼコンストラクトのレプリカーゼと適合性であることが好ましい。この文脈における適合性とは、アルファウイルスレプリカーゼが、サブゲノムプロモーターを認識することが可能であることを意味する。したがって、レプリカーゼコンストラクトによりコードされるレプリカーゼは、レプリコンのサブゲノムプロモーターを認識することが可能なアルファウイルスレプリカーゼであることが好ましい。
一実施態様では、これは、サブゲノムプロモーターが、レプリカーゼが由来するアルファウイルスに対して天然である場合に達成される。天然とは、サブゲノムプロモーターの天然の由来と、レプリカーゼの天然の由来とが、同じアルファウイルであることを意味する。
代替的実施態様では、サブゲノムプロモーターは、アルファウイルスレプリカーゼが、レプリコンのサブゲノムプロモーターを認識することが可能であるという条件で、レプリカーゼが由来するアルファウイルスに対して天然ではない。言い換えれば、レプリカーゼは、サブゲノムプロモーターと適合性（ウイルス間適合性）である。ウイルス間適合性が存在する限りにおいて、サブゲノムプロモーターとレプリカーゼとの任意の組合せが可能である。本発明を実行する当業者は、被験レプリカーゼを、被験サブゲノムプロモーターを有するＲＮＡと共に、サブゲノムプロモーターからのＲＮＡ合成に適する条件でインキュベートすることにより、ウイルス間適合性について、たやすく調べることができる。サブゲノム転写物が調製される場合、サブゲノムプロモーターとレプリカーゼとは、適合性であると決定される。ウイルス間適合性の多様な例が公知であり、場合によって、非天然サブゲノムプロモーターはなお、天然のサブゲノムプロモーターより効率的な転写さえももたらす（Strauss及びStrauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562により総説されている）。
好ましくは、本発明に従うレプリコンは、アルファウイルスに由来する保存配列エレメント３（ＣＳＥ３）を含む。ＣＳＥ３は、サブゲノムＲＮＡ効率的な転写に寄与すると考えられる。サブゲノムＲＮＡの転写は、ＣＳＥ３が存在する場合に、極めて効率的に生じることが公知である。典型的に、ＣＳＥ３は、約２４ヌクレオチドのポリヌクレオチドの連なりである。アルファウイルスゲノムでは、ＣＳＥ３は、非構造タンパク質のコード配列と、構造タンパク質のコード配列との間の接合領域内に配置される。本発明のトランスレプリコン内では、ＣＳＥ３は、典型的に、サブゲノムプロモーターの制御下にあるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流（５’側）に存在する。本発明に従うレプリコンが、サブゲノムプロモーターの制御下にある１つのＯＲＦを含有する場合、ＣＳＥ３は、この１つのＯＲＦの５’側に配置される。本発明に従うレプリコンが、サブゲノムプロモーターの制御下にある１つを超えるＯＲＦを含有する場合、ＣＳＥ３は、このような各ＯＲＦの５’側に配置されうる。一実施態様では、ＣＳＥ３は、レプリカーゼが由来するアルファウイルスに対して天然である。代替的実施態様では、ＣＳＥ３は、アルファウイルスレプリカーゼが、レプリコンのＣＳＥ３を認識することが可能であるという条件で、レプリカーゼが由来するアルファウイルスに対して天然ではない。
レプリコンの、任意選択の更なる特色
一実施態様では、本発明に従うＲＮＡレプリコンは、３’ポリ（Ａ）配列を含む。アルファウイルスＲＮＡのポリ（Ａ）配列は、ウイルス非構造タンパク質の翻訳効率及びＲＮＡの安定性における役割であって、細胞内ｍＲＮＡにおけるその役割と類似の役割を果たすことが記載されている（Hardy及びRice, J. Virol., 2005, vol. 79, pp. 4630-4639）。本発明では、ポリ（Ａ）配列が、目的の遺伝子の翻訳の効率、及びレプリコンの安定性において役割を果たすことを想定する。レプリカーゼコンストラクトの３’ポリ（Ａ）配列について、本明細書で開示される実施態様の中で、本発明に従うレプリコンの、３’ポリ（Ａ）配列についての実施態様及び好ましい実施態様を選択することができる。これに加えて、一実施態様では、ポリ（Ａ）配列（本発明に従うレプリコン上に存在する場合）に、アルファウイルスの、保存配列エレメント４（ＣＳＥ４）を前置させる。ＣＳＥ４の、最も３’側のヌクレオチドが、ポリ（Ａ）テールの、最も５’側のＡヌクレオチドに直に隣接するように、ポリ（Ａ）配列は、ＣＳＥ４に直に隣接することが好ましい。
一実施態様では、本発明に従うＲＮＡレプリコンは、５’キャップ（キャップ類似体を含む）を含む。例示のために、図１では、キャップ（又はキャップ類似体）を、Ｃという文字で記号化する。本発明に従うレプリコンのキャップ（又は類似体）についての態様は、ＲＮＡレプリコンの場合には、キャップの存在が必須ではないことを除き、レプリカーゼコンストラクトのキャップ（又は類似体）について、本明細書で記載される態様と同一である。したがって、代替的実施態様では、本発明に従うＲＮＡレプリコンは、キャップを含まない。この実施態様では、本発明に従うＲＮＡレプリコンは、遊離５’ＯＨ末端、又は任意の適切な５’修飾を含みうる。図１が、ＲＮＡレプリコンが、Ｃという文字により例示されるキャップを含む代替的実施態様について、概略的に描示するという事実に関わらず、この実施態様も同等に、本発明に含まれる。
一実施態様では、本発明に従うレプリコン上に存在する（存在する場合）オープンリーディングフレームのコード配列を適合させる。レプリカーゼコンストラクトのコドン適合化について、本明細書で開示される実施態様の中で、本発明に従うレプリコンの、コドン適合化についての実施態様及び好ましい実施態様を選択することができる。オープンリーディングフレームのコドンは、宿主細胞又は宿主生物における発現に適合させることができる。
異種核酸配列
一実施態様では、レプリコンは加えて、ウイルスに由来しない、特に、アルファウイルスに由来しない、少なくとも１つの核酸配列も含む。好ましい実施態様では、本発明によると、ＲＮＡレプリコンは、異種核酸配列を含む。本発明によると、「異種」という用語は、核酸配列が、天然では、アルファウイルスの発現制御配列、特に、アルファウイルスのサブゲノムプロモーターなど、アルファウイルスの核酸配列へと、機能的に連結されていない状況を指す。異種核酸配列は、レプリコンの核酸配列に含まれる。
好ましくは、異種核酸配列は、サブゲノムプロモーター、好ましくは、アルファウイルスのサブゲノムプロモーターの制御下にある。より好ましくは、異種核酸配列は、サブゲノムプロモーターの下流に配置される。アルファウイルスのサブゲノムプロモーターは、極めて効率的であり、したがって、高レベルでの、異種遺伝子の発現に適する（Jose等, Future Microbiol., 2009, vol. 4, pp. 837-856）。好ましくは、サブゲノムプロモーターは、異種核酸配列又はその一部の転写物を含む、サブゲノムＲＮＡの産生を制御する。
好ましくは、サブゲノムプロモーターは、アルファウイルスの構造タンパク質のためのプロモーターである。これは、サブゲノムプロモーターが、アルファウイルスに対して天然であり、前記アルファウイルス内の、１又は複数の構造タンパク質のコード配列の転写を制御するプロモーターであることを意味する。本発明によると、異種核酸配列は、アルファウイルスの構造タンパク質をコードする核酸配列などのウイルス性核酸配列を、部分的又は完全に置き換えうる。好ましくは、異種核酸配列は、アルファウイルスに由来せず、特に、異種核酸配列は、サブゲノムプロモーターが由来するアルファウイルスと同じアルファウイルスに由来しないことが好ましい。一実施態様では、レプリコンは、ＣＳＥ３を含み、異種核酸配列は、ＣＳＥ３に対して異種である。
目的のタンパク質
一実施態様では、本発明に従うＲＮＡレプリコンは、目的のペプチド又は目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。好ましくは、目的のタンパク質は、異種核酸によりコードされる。好ましくは、目的のタンパク質（すなわち、目的の遺伝子）をコードする遺伝子は、発現制御配列と共に存在する。好ましくは、目的の遺伝子は、プロモーターの制御下、好ましくは、本明細書で記載されるサブゲノムプロモーターの制御下にある。より好ましくは、目的の遺伝子を、サブゲノムプロモーターの下流に配置する。
目的のタンパク質をコードする遺伝子は、「目的の遺伝子」又は「トランス遺伝子」と同義に称される。トランス遺伝子は、好ましくは、サブゲノムプロモーターの制御下にある、本発明に従うレプリコン上に存在し、したがって、その配置は、アルファウイルス内の構造遺伝子の配置に相似する。好ましくは、サブゲノムプロモーターの下流の位置は、サブゲノム転写物が、目的の遺伝子の転写物を含むような位置である。好ましくは、目的の遺伝子は、開始コドン（塩基トリプレット）、典型的に、ＡＵＧ（ＲＮＡ分子内の）又はＡＴＧ（それぞれのＤＮＡ分子内の）を含むオープンリーディングフレームを含む。
好ましくは、本発明に従うレプリコンＲＮＡが、少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（タンパク質コード領域）を含む場合、レプリコンは、ｍＲＮＡ分子である。
本発明に従うレプリコンは、単一のポリペプチドをコードする場合もあり、複数のポリペプチドをコードする場合もある。複数のポリペプチドは、単一のポリペプチド（融合ポリペプチド）としてコードされる場合もあり、個別のポリペプチドとしてコードされる場合もある。ポリペプチドが、個別のポリペプチドによりコードされる場合、これらのうちの１又は複数は、上流のＩＲＥＳ又は更なるウイルスプロモーターエレメントと共にもたらされる。代替的に、本発明に従うレプリコンは、それらの各々がサブゲノムプロモーターの制御下にある、１つを超えるオープンリーディングフレームを含みうる。このような複数のＯＲＦレプリコンが、真核細胞内に配置されれば、各々が、それ自身のサブゲノムプロモーターにより開始される、複数のサブゲノム転写物が調製されるであろう（Strauss及びStrauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562）。代替的に、ポリタンパク質又は融合ポリペプチドは、自己触媒性プロテアーゼ（例えば、口蹄疫ウイルス２Ａタンパク質）、又はインテインにより隔てられた、個別のポリペプチドを含む。
好ましくは、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、レプリカーゼが由来するアルファウイルスに対して非天然である。好ましくは、サブゲノムプロモーターの制御下にあるオープンリーディングフレームは、アルファウイルスタンパク質をコードしない。好ましい実施態様では、サブゲノムプロモーターの制御下にあるオープンリーディングフレームは、全長アルファウイルス非構造タンパク質（ｎｓＰ）若しくはその断片をコードせず、且つ／又は、全長アルファウイルスの構造タンパク質（ｓＰ）若しくはその断片をコードしない。好ましくは、目的のタンパク質をコードするサブゲノムプロモーターの制御下にあるオープンリーディングフレームは、アルファウイルスの構造タンパク質をコードしない。一実施態様では、本発明のシステムは、１又は複数のアルファウイルスの構造タンパク質をコードする核酸配列を含まない。一実施態様では、システムは、いずれかのコアヌクレオカプシドタンパク質Ｃ、エンベロープタンパク質Ｐ６２、及び／又はエンベロープタンパク質Ｅ１をコードする核酸配列を含まない。
本発明のシステムが、アルファウイルスの構造タンパク質をコードするヘルパーウイルスの存在又は投与を必要としないことは、本発明のシステムの利点である。これは、構造タンパク質のＯＲＦを欠くレプリコンベクターを、ウイルス粒子へとパッケージングすることが可能なトランス複製システムであって、構造タンパク質を、トランスで、ヘルパーＲＮＡから発現させなければならない、トランス複製システムについて記載する先行技術（例えば、Bredenbeek等, J. Virol, 1993, vol. 67, pp. 6439-6446）と比較した利点である。アルファウイルスの構造タンパク質をコードする、これらのヘルパーＲＮＡの複製は、典型的に、抗原をコードするレプリコンＲＮＡから発現するレプリカーゼに依存する。ヘルパーＲＮＡ自体は、機能的なレプリカーゼを欠き、複製に必要とされる保存的ＲＮＡ配列エレメントだけを含有する（Smerdou及びLiljestroem, 1999, J. Virol., vol. 73, pp. 1092-1098、Ehrengruber及びLundstrom, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, vol. 96, pp. 7041-7046）。しかし、アルファウイルスの構造タンパク質をコードする、このようなヘルパーＲＮＡは、本発明の成功を達成するのに必要とされない。したがって、本発明の核酸分子は、アルファウイルスの構造タンパク質をコードしないことが好ましい。
一実施態様では、オープンリーディングフレームは、レポータータンパク質をコードする。この実施態様では、オープンリーディングフレームは、レポーター遺伝子を含む。ある特定の遺伝子は、それらを発現させる細胞又は生物に付与する特徴が、たやすく同定及び測定しうるか、又は選択用マーカーであるため、レポーターとして選び出すことができる。レポーター遺伝子は、ある特定の遺伝子が、細胞内又は生物集団内に取り込まれているか、又はこれらにおいて発現しているのかどうかについての指標として使用されることが多い。好ましくは、レポーター遺伝子の発現産物は、目視により検出可能である。目視により検出可能な、一般的なレポータータンパク質は、典型的に、蛍光タンパク質の又は発光タンパク質を有する。具体的なレポーター遺伝子の例は、それを発現させる細胞を、青色光下で緑色に発光させる、クラゲの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子、ルシフェリンとの反応を触媒して光をもたらす酵素であるルシフェラーゼ、及び赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を含む。変異体が、目視により検出可能な特性を有する限りにおいて、これらの特異的レポーター遺伝子のうちのいずれかの変異体も可能である。例えば、ｅＧＦＰは、ＧＦＰの点突然変異体である。レポータータンパク質の実施態様は、本発明のトランス複製システムにより媒介される発現について、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで調べるのに特に適する（例えば、実施例２及び４を参照されたい）。例えば、いずれの場合（シス複製システム及びトランス複製システムのそれぞれ）にも、レポータータンパク質の存在は、レポータータンパク質をコードする核酸配列を含むサブゲノム転写物の調製を前提とする。一方、細胞内のサブゲノム転写物の産生は、レプリカーゼコンストラクトが、この細胞内に存在し、レプリカーゼ遺伝子が、発現することを前提とする。
代替的実施態様では、オープンリーディングフレームは、レポータータンパク質をコードしない。例えば、例えば、実施例６で示す通り、本発明のシステムを、薬学的に活性のペプチド又はタンパク質を、ヒト対象又は動物対象へと導入するためにデザインする場合、蛍光レポータータンパク質は、コードされない可能性がある。例えば、薬学的に活性のタンパク質は、サブゲノムプロモーターの制御下にあるオープンリーディングフレームによりコードされるタンパク質だけでありうる。
本発明によると、一実施態様では、レプリコンのＲＮＡは、薬学的に活性のＲＮＡを含むか、又はこれからなる。「薬学的に活性のＲＮＡ」とは、薬学的に活性のペプチド又はタンパク質をコードするＲＮＡでありうる。好ましくは、本発明に従うＲＮＡレプリコンは、薬学的に活性のペプチド又はタンパク質をコードする。好ましくは、オープンリーディングフレームは、薬学的に活性のペプチド又はタンパク質をコードする。好ましくは、ＲＮＡレプリコンは、好ましくは、サブゲノムプロモーターの制御下にある、薬学的に活性のペプチド又はタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。
「薬学的に活性のペプチド又はタンパク質」は、対象へと、治療有効量で投与されると、対象の状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）又は疾患状態（ｄｉｓｅａｓｅ ｓｔａｔｅ）に対して、肯定的であるか又は有利な効果を及ぼす。好ましくは、薬学的に活性のペプチド又はタンパク質は、治癒特性又は緩和特性を有し、疾患又は障害の、１又は複数の症状を改善するか、抑制するか、和らげるか、好転させるか、これらの発症を遅延させるか、これらの重症度を軽減するように投与することができる。薬学的に活性のペプチド又はタンパク質は、予防特性を有する場合もあり、疾患の発症を遅延させるか、又はこのような疾患若しくは病理学的状態の重症度を軽減するのに使用することができる。「薬学的に活性のペプチド又はタンパク質」という用語は、全タンパク質又は全ポリペプチドを含み、また、これらの薬学的に活性の断片を指す場合もある。「薬学的に活性のペプチド又はタンパク質」という用語はまた、ペプチド又はタンパク質の、薬学的に活性の類似体も含みうる。「薬学的に活性のペプチド又はタンパク質」という用語は、抗原であるペプチド及びタンパク質を含む、すなわち、ペプチド又はタンパク質は、対象において、治療的な場合もあり、部分的又は完全に保護的な場合もある、免疫応答を誘発する。薬学的に活性のペプチド又はタンパク質はまた、治療用ペプチド又は治療用タンパク質とも称しうる。
一実施態様では、薬学的に活性のペプチド又はタンパク質は、免疫学的に活性の化合物又は抗原又はエピトープであるか、又はこれを含む。
本発明によると、「免疫学的に活性の化合物」という用語は、好ましくは、免疫細胞の成熟を誘導及び／若しくは抑制すること、サイトカインの生合成を誘導及び／若しくは抑制すること、並びに／又はＢ細胞による抗体産生を刺激することにより、体液性免疫を変更することにより、免疫応答を変更する、任意の化合物に関する。一実施態様では、免疫応答は、抗体応答（通例、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を含む）の刺激を伴う。免疫学的に活性の化合物は、抗ウイルス活性及び抗腫瘍活性を含むがこれらに限定されない、強力な免疫刺激活性を有するが、また、例えば、ＴＨ２免疫応答からの、免疫応答のシフティングであって、広範にわたるＴＨ２媒介性疾患を治療するのに有用であるシフティングにより、免疫応答の他の側面も下方調節しうる。
本発明によると、「抗原」又は「免疫原」という用語は、免疫応答を誘発する任意の物質を対象とする。特に、「抗原」とは、抗体又はＴリンパ球（Ｔ細胞）と特異的に反応する任意の物質に関する。本発明によると、「抗原」という用語は、少なくとも１つのエピトープを含む任意の分子を含む。好ましくは、本発明の文脈における抗原とは、任意選択で、プロセシングの後、免疫反応を誘導し、好ましくは、抗原に対して特異的な分子である。本発明によると、免疫反応のための候補物質であって、免疫反応が、体液性免疫反応並びに細胞性免疫反応のいずれでもありうる候補物質である、任意の適切な抗原を使用することができる。本発明の実施態様の文脈では、抗原は、細胞、好ましくは、抗原に対する免疫反応を結果としてもたらすＭＨＣ分子の文脈では、抗原提示細胞により、好ましくは、提示される。抗原は、好ましくは、天然にある抗原に対応するか、又はこれらに由来する産物である。このような天然にある抗原は、アレルゲン、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物、及び他の感染作用物質を含みうるか、又はこれらに由来することが可能であり、病原体又は抗原はまた、腫瘍抗原でもありうる。本発明によると、抗原は、天然にある産物、例えば、ウイルスタンパク質又はその一部に対応しうる。好ましい実施態様では、抗原は、表面ポリペプチド、すなわち、天然で、細胞、病原体、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、アレルゲン、又は腫瘍の表面上に提示されたポリペプチドである。抗原は、細胞、病原体、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、アレルゲン、又は腫瘍に対する免疫応答を誘発しうる。
「病原体」という用語は、生物、好ましくは、脊椎生物において疾患を引き起こすことが可能な、病原性の生物学的物質を指す。病原体は、細菌、単細胞性真核生物（原虫）、真菌のほか、ウイルスなどの微生物を含む。
本明細書では、「エピトープ」、「抗原ペプチド」、「抗原エピトープ」、「免疫原性ペプチド」、及び「ＭＨＣ結合性ペプチド」という用語は、互換的に使用され、抗原など、分子内の抗原決定基、すなわち、特に、ＭＨＣ分子の文脈で提示されると、免疫系により認識される、免疫学的に活性の化合物、例えば、Ｔ細胞により認識される、免疫学的に活性の化合物中の部分又はその断片を指す。タンパク質のエピトープは、好ましくは、前記タンパク質の連続的部分又は非連続的部分を含み、好ましくは、５から１００アミノ酸の間、好ましくは、５から５０アミノ酸の間、より好ましくは、８から３０アミノ酸の間、最も好ましくは、１０から２５アミノ酸の間の長さであり、例えば、エピトープは、好ましくは、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５アミノ酸の長さでありうる。本発明によると、エピトープは、細胞の表面上のＭＨＣ分子などのＭＨＣ分子に結合することが可能であり、したがって、「ＭＨＣ結合性ペプチド」又は「抗原ペプチド」でありうる。「主要組織適合性複合体」という用語及び「ＭＨＣ」という略号は、ＭＨＣクラスＩ分子及びＭＨＣクラスＩＩ分子を含み、全ての脊椎動物において存在する、遺伝子の複合体に関する。ＭＨＣタンパク質又はＭＨＣ分子は、免疫反応における、リンパ球及び抗原提示細胞又は罹患細胞の間のシグナル伝達に重要であり、この場合、ＭＨＣタンパク質又はＭＨＣ分子は、ペプチドに結合し、それらを、Ｔ細胞受容体による認識のために提示する。ＭＨＣによりコードされるタンパク質は、細胞の表面上に発現し、自己抗原（細胞自体に由来するペプチド断片）及び非自己抗原（例えば、侵襲する微生物の断片）の両方を、Ｔ細胞へと提示する。好ましいこのような免疫原性部分は、ＭＨＣクラスＩ分子及びＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する。本明細書で使用される免疫原性部分は、このような結合性が、当技術分野で公知の任意のアッセイを使用して検出可能である場合、ＭＨＣクラスＩ分子及びＭＨＣクラスＩＩ分子「に結合する」という。「ＭＨＣ結合性ペプチド」という用語は、ＭＨＣクラスＩ分子及び／又はＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチドに関する。クラスＩのＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合性ペプチドは、典型的に、８－１０アミノ酸長であるが、より長いペプチド又はより短いペプチドも効果的でありうる。クラスＩＩのＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合性ペプチドは、典型的に、１０－２５アミノ酸長であり、特に、１３－１８アミノ酸長であるが、この場合、より長いペプチド及びより短いペプチドも効果的でありうる。
一実施態様では、本発明に従う目的のタンパク質は、標的生物へのワクチン接種に適するエピトープを含む。当業者には、免疫生物学及びワクチン接種の原理の１つが、疾患に対する免疫防御反応は、治療される疾患に関して、免疫学的に関連する抗原で、生物を免疫化することによりもたらされるという事実に基づくことが公知であろう。本発明によると、抗原は、自己抗原及び非自己抗原を含む群から選択される。非自己抗原は、好ましくは、細菌抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、アレルゲン、又は寄生生物抗原である。抗原は、標的生物において、免疫応答を誘発することが可能であるエピトープを含むことが好ましい。例えば、エピトープは、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、アレルゲン、又は腫瘍に対する免疫応答を誘発しうる。
一部の実施態様では、非自己抗原は、細菌抗原である。一部の実施態様では、抗原は、鳥類、魚類、及び家畜を含む哺乳動物を含む動物に感染する細菌に対する免疫応答を誘発する。好ましくは、それに対する免疫応答が誘発される細菌は、病原性細菌である。
一部の実施態様では、非自己抗原は、ウイルス抗原である。ウイルス抗原は、例えば、ウイルス表面タンパク質、例えば、カプシドポリペプチド又はスパイクポリペプチドに由来するペプチドでありうる。一部の実施態様では、抗原は、鳥類、魚類、及び家畜を含む哺乳動物を含む動物に感染するウイルスに対する免疫応答を誘発する。それに対する免疫応答が誘発されるウイルスは、病原性ウイルスである。
一部の実施態様では、非自己抗原は、真菌に由来するポリペプチド又はタンパク質である。一部の実施態様では、抗原は、鳥類、魚類、及び家畜を含む哺乳動物を含む動物に感染する真菌に対する免疫応答を誘発する。それに対する免疫応答が誘発される真菌は、病原性真菌である。
一部の実施態様では、非自己抗原は、単細胞性の真核寄生生物に由来するポリペプチド又はタンパク質である。一部の実施態様では、抗原は、単細胞性の真核免疫応答寄生生物、好ましくは、病原性の単細胞性真核寄生生物に対する免疫応答を誘発する。病原性の単細胞性真核寄生生物は、例えば、マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）属、例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）、若しくは卵形マラリア原虫（Ｐ．ｏｖａｌｅ）、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）属、又はトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）属、例えば、クルーズトリパノソーマ（Ｔ．ｃｒｕｚｉ）若しくはブルーストリパノソーマ（Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ）に由来しうる。
一部の実施態様では、非自己抗原は、アレルゲン性ポリペプチド又はアレルゲン性タンパク質である。アレルゲン性タンパク質又はアレルゲン性ポリペプチドは、減感作としてもまた公知の、アレルゲン免疫療法に適する。
一部の実施態様では、抗原は、自己抗原、特に、腫瘍抗原である。当業者には、腫瘍抗原及びそれらの決定が公知である。
本発明の文脈では、「腫瘍抗原」又は「腫瘍関連抗原」という用語は、正常条件下の、限定数の組織及び／若しくは器官又は特異的発生段階において特異的に発現するタンパク質に関し、例えば、腫瘍抗原は、正常条件下の、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）組織、好ましくは、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）粘膜、生殖器官、例えば、精巣、栄養膜組織、例えば、胎盤、又は生殖細胞系列細胞において、特異的に発現する場合があり、１又は複数の腫瘍組織内又は癌組織内で、発現又は異常に発現する。この文脈では、「限定数」とは、好ましくは、３を超えない、より好ましくは、２を超えない数を意味する。本発明の文脈における腫瘍抗原は、例えば、分化抗原、好ましくは、細胞型特異的分化抗原、すなわち、正常条件下の、ある特定の分化段階にある、ある特定の細胞型において、特異的に発現するタンパク質、癌／精巣抗原、すなわち、正常条件下の、精巣内と、場合によって、胎盤内とで特異的に発現するタンパク質、生殖細胞系列特異的抗原を含む。本発明の文脈では、腫瘍抗原は、好ましくは、癌細胞の細胞表面に付随し、好ましくは、正常組織内では発現しないか、又はまれにしか発現しない。好ましくは、腫瘍抗原又は腫瘍抗原の異常な発現は、癌細胞を同定する。本発明の文脈では、対象、例えば、癌疾患を患う患者における癌細胞が発現する腫瘍抗原は、好ましくは、前記対象における自己タンパク質である。好ましい実施態様では、本発明の文脈における腫瘍抗原は、正常条件下の、非必須の組織内若しくは器官内、すなわち、免疫系により損傷しても、対象の死をもたらさない組織内若しくは器官内で、又は免疫系がアクセスしないか、若しくはほとんどアクセスしない器官内若しくは身体構造内で特異的に発現する。好ましくは、腫瘍抗原のアミノ酸配列は、正常組織内で発現する腫瘍抗原と、癌組織内で発現する腫瘍抗原との間で同一である。
本発明において有用でありうる腫瘍抗原の例は、ｐ５３、ＡＲＴ－４、ＢＡＧＥ、ベータ－カテニン／ｍ、Ｂｃｒ－ａｂＬ ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ－１、ＣＡＳＰ－８、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、ＣＬＡＵＤＩＮ－６、ＣＬＡＵＤＩＮ－１８．２、及びＣＬＡＵＤＩＮ－１２など、ｃｌａｕｄｉｎファミリーの細胞表面タンパク質、ｃ－ＭＹＣ、ＣＴ、Ｃｙｐ－Ｂ、ＤＡＭ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ－Ｖ、Ｇａｐ１００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＨＰＶ－Ｅ７、ＨＰＶ－Ｅ６、ＨＡＳＴ－２、ｈＴＥＲＴ（又はｈＴＲＴ）、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ－Ａ、好ましくはＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ５、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ７、ＭＡＧＥ－Ａ８、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１１、又はＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ｂ、ＭＡＧＥ－Ｃ、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ、ＭＣ１Ｒ、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ－１、－２、－３、ＮＡ８８－Ａ、ＮＦ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＮＹ－ＢＲ－１、ｐ１９０ ｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ａｂＬ、Ｐｍ１／ＲＡＲａ、ＰＲＡＭＥ、プロテイナーゼ３、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１又はＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ－１又はＳＡＲＴ－３、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＳＣＰ１、ＳＣＰ２、ＳＣＰ３、ＳＳＸ、ＳＵＲＶＩＶＩＮ、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、ＴＰＴＥ、及びＷＴである。特に好ましい腫瘍抗原は、ＣＬＡＵＤＩＮ－１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）及びＣＬＡＵＤＩＮ－６（ＣＬＤＮ６）を含む。
一部の実施態様では、薬学的に活性のペプチド又はタンパク質が、免疫応答を誘発する抗原であることを必要とされない。適切な薬学的に活性のペプチド又はタンパク質は、免疫学的に活性の化合物（例えば、インターロイキン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、エリスロポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロン、インテグリン、アドレッシン、セレクチン、ホーミング受容体、Ｔ細胞受容体、免疫グロブリン）など、サイトカイン及び免疫系タンパク質、ホルモン（インスリン、甲状腺ホルモン、カテコールアミン、ゴナドトロピン、栄養ホルモン、プロラクチン、オキシトシン、ドーパミン、ウシソマトトロフィン、レプチンなど）、成長ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン）、増殖因子（例えば、表皮増殖因子、神経増殖因子、インスリン様増殖因子など）、増殖因子受容体、酵素（組織プラスミノーゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ、コレステロール生合成酵素又はコレステロール分解酵素、ステロイド産生酵素、キナーゼ、ホスホジエステラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、デヒドロゲナーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、アロマターゼ、チトクローム、アデニル酸シクラーゼ又はグアニル酸シクラーゼ、ノイラミニダーゼなど）、受容体（ステロイドホルモン受容体、ペプチド受容体）、結合性タンパク質（成長ホルモン結合性タンパク質又は増殖因子結合性タンパク質など）、転写因子及び翻訳因子、腫瘍増殖抑制タンパク質（例えば、血管新生を阻害するタンパク質）、構造タンパク質（など、コラーゲン、フィブロイン、フィブリノーゲン、エラスチン、チューブリン、アクチン、及びミオシン）、血液タンパク質（トロンビン、血清アルブミン、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩＩ、インスリン、因子ＩＸ、因子Ｘ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、プロテインＣ、フォンウィレブランド因子、抗トロンビンＩＩＩ、グルコセレブロシダーゼ、エリスロポエチン顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、又は修飾因子ＶＩＩＩ、抗凝固因子など）からなる群から選択することができる。一実施態様では、本発明に従う、薬学的に活性のタンパク質は、リンパ系のホメオスタシスの調節に関与するサイトカイン、好ましくは、Ｔ細胞の発生、プライミング、拡大、分化及び／又は生存に関与し、好ましくは、これらを誘導又は増強するサイトカインである。一実施態様では、サイトカインは、インターロイキン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、又はＩＬ－２１である。
本発明のシステムの多用途性
本発明のシステムの利点は、２つの個別のＲＮＡ分子上の、鍵となる遺伝情報の、核内の転写及び存在への非依存性であって、かつてないデザインの自由度をもたらす非依存性を含む。互いと組合せ可能な、その多用途性エレメントを念頭に、本発明は、レプリカーゼの発現を、所望のＲＮＡ増幅レベル、所望の標的生物、目的のタンパク質の所望の産生レベルなどに最適化することを可能とする。トランスでレプリカーゼにより複製することができるレプリコンは、独立にデザインすることができる。
本明細書では、本開示に基づき、例えば、以下のエレメント：レプリカーゼコンストラクトのキャッピング（特に、特異的キャップの選出し）、レプリカーゼコンストラクトの５’－ＵＴＲ、レプリカーゼをコードするＯＲＦのコード配列（コドン最適化）、レプリカーゼコンストラクトの３’－ＵＴＲ、レプリカーゼコンストラクトのポリ（Ａ）テール、５’－ＵＴＲのレプリコン（レプリコンが、アルファウイルスレプリカーゼの５’複製認識配列を含む限りにおいて）、サブゲノムプロモーター配列、レプリコンから生成するサブゲノム転写物の５’－ＵＴＲ、目的の遺伝子をコードするＯＲＦのコード配列（コドン最適化）、レプリコン及び／又はレプリコンから生成するサブゲノム転写物の３’－ＵＴＲ（レプリコンが、アルファウイルスレプリカーゼの３’複製認識配列を含む限りにおいて）、レプリコン及び／又はレプリコンから生成するサブゲノム転写物のポリ（Ａ）テールを、個別に選び出し、デザインし、且つ／又は適合させることができる。
これに加えて、本発明は、所与の任意の細胞型（休眠細胞又は周期細胞）に最適量のレプリコン及びレプリカーゼコンストラクトを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏにおいて、共トランスフェクトすることも可能とする。
本発明の実施態様の安全性の特色
本発明では、単独で、又は任意の適する組合せにおける、以下の特色が好ましい。
好ましくは、本発明のシステムは、コアヌクレオカプシドタンパク質Ｃ、エンベロープタンパク質Ｐ６２、及び／又はエンベロープタンパク質Ｅ１など、任意のアルファウイルスの構造タンパク質を含まない。
好ましくは、本発明のシステムは、粒子形成システムではない。これは、本発明のシステムによる宿主細胞の接種の後、宿主細胞が、次世代ウイルス粒子などのウイルス粒子を産生するわけではないことを意味する。一実施態様では、システムは、コアヌクレオカプシドタンパク質Ｃ、エンベロープタンパク質Ｐ６２、及び／又はエンベロープタンパク質Ｅ１など、任意のアルファウイルスの構造タンパク質をコードする遺伝情報を全く含まない。本発明のこの態様は、安全性の点で、構造タンパク質がトランス複製ヘルパーＲＮＡ上でコードされる先行技術システム（例えば、Bredenbeek等, J. Virol, 1993, vol. 67, pp. 6439-6446）を上回る付加価値を提供する。
好ましくは、レプリコンも、レプリカーゼコンストラクトも、それ自身の複製、すなわち、シス複製を駆動することが可能ではない。一実施態様では、レプリコンは、機能的なアルファウイルスレプリカーゼをコードしない。一実施態様では、レプリカーゼコンストラクトは、（＋）鎖鋳型に基づく（－）鎖合成、及び／又は（－）鎖鋳型に基づく（＋）鎖合成に必要とされる、少なくとも１つの配列エレメント（好ましくは、少なくとも１つのＣＳＥ）を欠く。一実施態様では、レプリカーゼコンストラクトは、ＣＳＥ１及び／又はＣＳＥ４を含まない。
好ましくは、本発明に従うレプリコンも、本発明に従うレプリカーゼコンストラクトも、アルファウイルスパッケージングシグナルを含まない。例えば、ＳＦＶのｎｓＰ２のコード領域内に含まれるアルファウイルスパッケージングシグナル（White等, 1998, J. Virol., vol. 72, pp. 4320-4326）は、例えば、欠失又は突然変異により除去することができる。アルファウイルスパッケージングシグナルを除去する適切な方式は、ｎｓＰ２のコード領域のコドン使用の適合化を含む。遺伝子コードの縮重は、コードされるｎｓＰ２のアミノ酸配列に影響を及ぼさずに、パッケージングシグナルの機能を欠失させることを可能としうる。
一実施態様では、本発明のシステムは、孤立システムである。この実施態様では、システムは、哺乳動物細胞の内部など、細胞の内部に存在しないか、又は、アルファウイルスの構造タンパク質を含むコートの内部など、ウイルスカプシドの内部に存在しない。一実施態様では、本発明のシステムは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて存在する。
インターフェロン（ＩＦＮ）シグナル伝達の阻害
ＲＮＡを発現させるために導入した細胞の生存率は、特に、細胞に、ＲＮＡを、複数回にわたりトランスフェクトした場合、低減されることが報告されている。解決策として、ＩＦＮ阻害剤との共トランスフェクションは、ＲＮＡを発現させる細胞の生存率を増強することが見出された（国際公開第２０１４／０７１９６３Ａ１号）。本発明では、国際公開第２０１４／０７１９６３Ａ１号において記載されている、細胞内ＩＦＮシグナル伝達又は細胞外ＩＦＮシグナル伝達の任意の阻害剤が適する。好ましくは、阻害剤は、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達の阻害剤である。
本発明の一実施態様では、本発明のシステムは、翻訳を増強する、特に、翻訳に対する負の影響を阻害するようにデザインすることができる。これは、細胞内インターフェロン（ＩＦＮ）シグナル伝達を阻害し、細胞外ＩＦＮによる、ＩＦＮ受容体への会合を防止することを含みうる。細胞外ＩＦＮによる、ＩＦＮ受容体への会合を防止し、細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害することは、細胞内のＲＮＡの安定的発現を可能とする。代替的に、又は加えて、特に、細胞に、繰り返し、ＲＮＡをトランスフェクトする場合、細胞外ＩＦＮによる、ＩＦＮ受容体への会合を防止し、細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害することは、細胞の生存を増強する。理論に束縛されることを望まずに述べると、細胞内ＩＦＮシグナル伝達は、翻訳の阻害及び／又はＲＮＡの分解を結果としてもたらしうることが想定される。これは、１又は複数のＩＦＮ誘導性抗ウイルス活性エフェクタータンパク質を阻害することにより対処することができる。ＩＦＮ誘導性抗ウイルス活性エフェクタータンパク質は、ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）、２’，５’－オリゴアデニル酸シンセターゼ（ＯＡＳ）、及びＲＮアーゼＬからなる群から選択することができる。細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害することは、ＰＫＲ依存性経路及び／又はＯＡＳ依存性経路を阻害することを含みうる。ＰＫＲ依存性経路を阻害することは、ｅＩＦ２－アルファのリン酸化を阻害することを含みうる。ＰＫＲを阻害することは、細胞を、少なくとも１つのＰＫＲ阻害剤で治療することを含みうる。ＰＫＲ阻害剤は、ウイルス性のＰＫＲ阻害剤でありうる。好ましいウイルス性のＰＫＲ阻害剤は、ワクシニアウイルスＥ３である。ペプチド又はタンパク質（例えば、Ｅ３、Ｋ３）により、細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害する場合、ペプチド又はタンパク質の細胞内発現が好ましい。
ワクシニアウイルスＥ３は、ｄｓＲＮＡに結合し、これを隔離して、ＰＫＲ及びＯＡＳの活性化を防止する、２５ｋＤａのｄｓＲＮＡ結合性タンパク質（Ｅ３Ｌ遺伝子によりコードされる）である。Ｅ３は、ＰＫＲに直接結合し、その活性を阻害する結果として、ｅＩＦ２－アルファのリン酸化の低減をもたらす。ＩＦＮシグナル伝達の、他の適切な阻害剤は、単純ヘルペスウイルスＩＣＰ３４．５、トスカーナウイルスＮＳ、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）核多角病ウイルスＰＫ２、及びＨＣＶ ＮＳ３４Ａである。
細胞内ＩＦＮシグナル伝達の阻害剤は、細胞へと、細胞内ＩＦＮシグナル伝達の阻害剤をコードする核酸配列（例えば、ＲＮＡ）の形態で施すことができる。
一実施態様では、細胞内ＩＦＮシグナル伝達又は細胞外ＩＦＮシグナル伝達の阻害剤は、ｍＲＮＡ分子によりコードされる。このｍＲＮＡ分子は、本明細書で記載される、ポリペプチド配列非修飾型修飾、例えば、キャップ、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、ポリ（Ａ）配列、コドン使用の適合化を含みうる。
代替的実施態様では、細胞内ＩＦＮシグナル伝達又は細胞外ＩＦＮシグナル伝達の阻害剤は、レプリコン、好ましくは、トランスレプリコンによりコードされる。レプリコンは、アルファウイルスレプリカーゼ、典型的に、ＣＳＥ１、ＣＳＥ２、及びＣＳＥ４による複製を可能とする核酸配列エレメントを含み、好ましくは、また、サブゲノム転写物、すなわち、ＣＳＥ３を典型的に含む、サブゲノムプロモーターの作製を可能とする核酸配列エレメントも含む。レプリコンは、加えて、１又は複数の本明細書で記載される、ポリペプチド配列非修飾型修飾、例えば、キャップ、ポリ（Ａ）配列、コドン使用の適合化を含みうる。
アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクト
第２の態様では、本発明は、レプリカーゼによる翻訳を駆動するための５’キャップを含む、アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクト（レプリカーゼコンストラクト）を提供する。第２の態様では、本発明に従うアルファウイルスレプリコンが存在しないことが可能である。言い換えれば、本発明の第２の態様では、本明細書で記載される、本発明のレプリカーゼコンストラクトを、本発明のレプリコンから独立に提供しうる。第２の態様では、レプリカーゼコンストラクトは、本発明の第１の態様のレプリカーゼコンストラクトのうちの、任意の１又は複数特色を独立に特徴としうる。一実施態様では、アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクトは、単離核酸分子である。これは、他の核酸分子から隔絶された、すなわち、これらを本質的に含まない実施態様を含む。
第２の態様に従うＲＮＡコンストラクトは、例えば、システム又はキットの形態における、適切なレプリコンの組合せに適する。
本発明に従うＤＮＡ
第３の態様では、本発明は、本発明の第１の態様に従う、アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクト（レプリカーゼコンストラクト）、本発明の第１の態様に従うＲＮＡレプリコン、又はこれらの両方をコードする核酸配列を含むＤＮＡを提供する。
一実施態様では、本発明に従うＤＮＡ分子は、本発明の第１の態様に従うシステムのレプリコン及びレプリカーゼコンストラクトをコードする。代替的実施態様では、第１のＤＮＡ分子は、本発明の第１の態様に従うシステムの、１つのＲＮＡエレメント（レプリコン又はレプリカーゼコンストラクト）をコードし、第２のＤＮＡ分子は、本発明に従うシステムの、他のそれぞれのＲＮＡエレメントをコードする。
好ましくは、ＤＮＡは、二本鎖である。
好ましい実施態様では、本発明に従うＤＮＡの第３の態様は、プラスミドである。本明細書で使用される「プラスミド」という用語は、一般に、通例、染色体ＤＮＡとは独立に複製しうる、環状のＤＮＡ二重鎖である、染色体外の遺伝子素材のコンストラクトに関する。
本発明のＤＮＡは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識されうるプロモーターを含みうる。これは、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてコードされるＲＮＡ、例えば、本発明のＲＮＡの転写を可能とする。ＩＶＴベクターを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のための鋳型として、標準化された形で使用することができる。本発明に従う好ましいプロモーターの例は、ＳＰ６ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼ、又はＴ７ポリメラーゼのためのプロモーターである。
一実施態様では、本発明のＤＮＡは、単離核酸分子である。
ＲＮＡを調製する方法
本発明によると、任意のＲＮＡ分子は、本発明のシステムの一部であろうと、そうでなかろうと、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により得られうる。本発明では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）は、特に、関心の対象である。ＩＶＴ－ＲＮＡは、核酸分子（特に、ＤＮＡ分子）からの転写により得られる。本発明の第３の態様のＤＮＡ分子は、特に、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識されうるプロモーターを含む場合に、このような目的に適する。
本発明に従うＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて合成することができる。これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応物へとキャップ類似体を添加することを可能とする。典型的に、ポリ（Ａ）テールは、ＤＮＡ鋳型上のポリ（ｄＴ）配列によりコードされる。代替的に、キャッピング及びポリ（Ａ）テール付加は、転写後に。酵素的に達成することができる。
当業者には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写法が公知である。例えば、国際公開第２０１１／０１５３４７Ａ１号で言及されている通り、様々なｉｎ ｖｉｔｒｏ転写キットが市販されている。
キット
本発明はまた、本発明の第１の態様に従うシステム、又は本発明の第２の態様に従う、アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクトを含むキットも提供する。
一実施態様では、キットの構成要素は、個別の実体として存在する。例えば、キットの１つの核酸分子は、１つの実体内に存在することが可能であり、キットの別の核酸は、別個の実体内に存在しうる。例えば、開放容器又は閉止容器は、適切な実体である。閉止容器が好ましい。使用される容器は、好ましくは、ＲＮアーゼ非含有又は本質的にＲＮアーゼ非含有であるものとする。
一実施態様では、本発明のキットは、細胞への接種及び／又はヒト対象又は動物対象への投与のためのＲＮＡを含む。
本発明に従うキットは、任意選択で、表示又は情報要素の他の形態、例えば、電子的データ担体を含む。表示又は情報要素は、指示書、例えば、印刷された書面の指示書、又は、任意選択で、印刷可能な、電子形態の指示書を含む。指示書は、少なくとも１つの、適切で可能なキットの使用を指す場合がある。
薬学的組成物
本明細書で記載されるアルファウイルスレプリカーゼ及び／又はレプリコンを発現させるためのコンストラクトは、薬学的組成物の形態で存在しうる。本発明に従う薬学的組成物は、本発明に従う、少なくとも１つの核酸分子、好ましくは、ＲＮＡを含みうる。本発明に従う薬学的組成物は、薬学的に許容される希釈剤及び／又は薬学的に許容される賦形剤及び／又は薬学的に許容される担体及び／又は薬学的に許容される媒体を含む。薬学的に許容される担体、媒体、賦形剤、又は希釈剤の選出しは、特に限定されない。当技術分野で公知の、任意の適適切な、薬学的に許容される担体、媒体、賦形剤、又は希釈剤を使用することができる。
本発明の一実施態様では、薬学的組成物は、ＲＮＡの完全性を保存することを可能とする、水性溶媒又は任意の溶媒などの溶媒を更に含みうる。好ましい実施態様では、薬学的組成物は、ＲＮＡを含む水溶液である。水溶液は、任意選択で、溶質、例えば、塩を含みうる。
本発明の一実施態様では、薬学的組成物は、凍結乾燥組成物の形態にある。凍結乾燥組成物は、それぞれの水性組成物を凍結乾燥させることにより得られる。
一実施態様では、薬学的組成物は、少なくとも１つのカチオン性実体を含む。一般に、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、及び正の電荷を伴う他の物質は、負に帯電した核酸との複合体を形成しうる。カチオン性化合物、好ましくは、例えば、カチオン性又はポリカチオン性のペプチド又はタンパク質などのポリカチオン性化合物との複合体化により、本発明に従うＲＮＡを安定化させることが可能である。一実施態様では、本発明に従う薬学的組成物は、プロタミン、ポリエチレンイミン、ポリ－Ｌ－リシン、ポリ－Ｌ－アルギニン、ヒストン、又はカチオン性脂質からなる群から選択される、少なくとも１つのカチオン性分子を含む。
本発明によると、カチオン性脂質は、カチオン性両親媒性分子、例えば、少なくとも１つの親水性部分及び親油性部分を含む分子である。カチオン性脂質は、モノカチオン性の場合もあり、ポリカチオン性の場合もある。カチオン性脂質典型的に、ステロール鎖、アシル鎖、又はジアシル鎖などの親油性部分を有し、全体的な正味の正電荷を有する。脂質のヘッド基は、典型的に、正の電荷を保有する。カチオン性脂質は、好ましくは、１から１０価の正電荷、より好ましくは、１から３価の正電荷を有し、より好ましくは、１価の正電荷を有する。カチオン性脂質の例は、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）；ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）；１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）；１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）；１，２－ジアシルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン；１，２－ジアルキルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン；ジオクタデシルジメチル塩化アンモニウム（ＤＯＤＡＣ）、１，２－ジミリストイルオキシプロピル－１，３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、及び２，３－ジオレオイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパナミニウム（ｐｒｏｐａｎａｍｉｕｍ）トリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ）を含むがこれらに限定されない。カチオン性脂質はまた、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）を含む三級アミン基を伴う脂質も含む。カチオン性脂質は、リポソーム、エマルジョン、及びリポプレックスなど、本明細書で記載される脂質製剤中でＲＮＡを製剤化するのに適する。典型的に、正の電荷は、少なくとも１つのカチオン性脂質による寄与であり、負の電荷は、ＲＮＡによる寄与である。一実施態様では、薬学的組成物は、カチオン性脂質に加えて、少なくとも１つのヘルパー脂質を含む。ヘルパー脂質は、中性脂質の場合もあり、アニオン性脂質の場合もある。ヘルパー脂質は、リン脂質など、天然脂質の場合もあり、天然脂質の類似体の場合もあり、完全な合成脂質の場合もあり、天然脂質と類似しない脂質様分子の場合もある。薬学的組成物が、カチオン性脂質及びヘルパー脂質の両方を含む場合、カチオン性脂質の、中性脂質に対するモル比は、製剤の安定性などを念頭に、適切に決定することができる。
一実施態様では、本発明に従う薬学的組成物は、プロタミンを含む。本発明によると、プロタミンは、カチオン性担体薬剤として有用である。「プロタミン」という用語は、アルギニンに富む、比較的低分子量で、強塩基性の多様なタンパク質のうちのいずれかを指し、とりわけ、魚類など、動物の精子細胞内で、体細胞ヒストンに代わりに、ＤＮＡと会合していることが見出される。特に、「プロタミン」という用語は、魚類精子内で見出されるタンパク質、強塩基性、水中で可溶性であり、熱により凝固せず、複数のアルギニン単量体を含むタンパク質を指す。本明細書で使用される、本発明によると、「プロタミン」という用語は、天然供給源又は生物学的供給源から得られるか、又はこれらに由来する任意のプロタミンアミノ酸配列であって、その断片、及び前記アミノ酸配列又はその断片の多量体形態を含むプロタミンアミノ酸配列を含むことを意図する。更に、用語は、人工的であり、特異的目的で特異的にデザインされ、天然供給源又は生物学的供給源からは単離されえない（合成）ポリペプチドを包含する。
一部の実施態様では、本発明の組成物は、１又は複数のアジュバントを含みうる。アジュバントを、ワクチンへと添加して、免疫系の応答を刺激しうるが、アジュバントは、典型的に、免疫自体はもたらさない。例示的なアジュバントは、限定せずに述べると、以下：無機化合物（例えば、アラム、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、水酸化リン酸カルシウム）、鉱物油（例えば、パラフィン油）、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－１２）、免疫刺激性ポリヌクレオチド（ＲＮＡ又はＤＮＡ、例えば、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドなど）、サポニン（例えば、キラヤ（Ｑｕｉｌｌａｊａ）属、ダイズ、セネガ（Ｐｏｌｙｇａｌａ ｓｅｎｅｇａ）に由来する植物サポニン）、油エマルジョン又はリポソーム、ポリオキシエチレンエーテル製剤及びポリオキシエチレンエステル製剤、ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）、ムラミルペプチド、イミダゾキノロン化合物、チオセミカルバゾン化合物、Ｆｌｔ３リガンド（国際公開第２０１０／０６６４１８Ａ１号）、又は当業者に公知の、他の任意のアジュバントを含む。本発明に従うＲＮＡの投与に好ましいアジュバントは、Ｆｌｔ３リガンド（国際公開第２０１０／０６６４１８Ａ１号）である。Ｆｌｔ３リガンドを、抗原をコードするＲＮＡと共に投与すると、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の大幅な増加が観察される。
本発明に従う薬学的組成物は、緩衝することができる（例えば、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液で）。
ＲＮＡ含有粒子
一部の実施態様では、非保護ＲＮＡの不安定性のために、本発明のＲＮＡ分子を、複合体化形態又は封入形態で提供することが有利である。本発明では、それぞれの薬学的組成物が提供される。特に、本発明の一部の実施態様では薬学的組成物は、核酸含有粒子、好ましくは、ＲＮＡ含有粒子を含む。それぞれの薬学的組成物を、粒子製剤と称する。本発明によると、粒子製剤では、粒子は、本発明に従う核酸と、核酸の送達に適する、薬学的に許容される担体、又は薬学的に許容される媒体とを含む。核酸含有粒子は、例えば、タンパク質性粒子の形態の場合もあり、脂質含有粒子形態の場合もある。適切なタンパク質又は脂質を、粒子形成剤と称する。タンパク質性粒子及び脂質含有粒子は、粒子形態におけるアルファウイルスＲＮＡの送達に適すると、既に記載されている（例えば、Strauss及びStrauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562）。特に、アルファウイルスの構造タンパク質（例えば、ヘルパーウイルスによりもたらされる）は、タンパク質性粒子の形態における、ＲＮＡの送達のための、適切な担体である。
本発明に従うシステムを、粒子製剤として製剤化する場合、各ＲＮＡ分子種（例えば、レプリコン、レプリカーゼコンストラクト、及び、ＩＦＮを阻害するのに適するタンパク質をコードするＲＮＡなど、任意選択の、更なるＲＮＡ分子種）を、個別の粒子製剤として、個別に製剤化することが可能である。この場合、各個別の粒子製剤は、１つのＲＮＡ分子種を含むであろう。個別の粒子製剤は、例えば、個別の容器内に、個別の実体として存在しうる。このような製剤は、粒子形成剤と併せた各ＲＮＡ分子種を、個別に（典型的に、各々、ＲＮＡ含有溶液の形態で）用意し、これにより、粒子の形成を可能とすることにより得られる。それぞれの粒子は、もっぱら、粒子が形成される場合にもたらされる特異的ＲＮＡ分子種（個別の粒子製剤）を含有するであろう。
一実施態様では、本発明に従う薬学的組成物は、１つを超える個別の粒子製剤を含む。それぞれの薬学的組成物を、混合粒子製剤と称する。本発明に従う混合粒子製剤は、上記で記載した、個別の粒子製剤を、個別に形成するのに続き、個別の粒子製剤を混合する工程により得られる。混合工程により、ＲＮＡ含有粒子の混合集団を含む１つの製剤が得られる（例示のために述べると、例えば、粒子の第１の集団は、本発明に従うレプリコンを含有することが可能であり、粒子の第２の製剤は、本発明に従うレプリカーゼコンストラクトを含有しうる）。個別の粒子状集団は、個別の粒子製剤の混合集団を含む、１つの容器内に共に存在しうる。
代替的に、薬学的組成物の全てのＲＮＡ分子種（例えば、レプリコン、レプリカーゼコンストラクト、及び、ＩＦＮを阻害するのに適するタンパク質をコードするＲＮＡなど、任意選択の、更なる分子種）を、組合せ粒子製剤として、共に製剤化することが可能である。このような製剤は、粒子形成剤と併せた、全てのＲＮＡ分子種の組合せ（典型的に、組合せ溶液）を用意し、これにより、粒子の形成を可能とすることにより得られる。混合粒子製剤とは対照的に、組合せ粒子製剤は、典型的に、１つを超えるＲＮＡ分子種を含む粒子を含むであろう。組合せ粒子組成物では、異なるＲＮＡ分子種は、典型的に、単一粒子内に共に存在する。
一実施態様では、本発明の粒子製剤は、ナノ粒子製剤である。この実施態様では、本発明に従う組成物は、ナノ粒子の形態にある、本発明に従う核酸を含む。ナノ粒子製剤は、多様なプロトコールにより、多様な複合体化化合物と共に得ることができる。脂質、ポリマー、オリゴマー、又は両親媒性物質は、ナノ粒子製剤の、典型的な構成要素である。
本明細書で使用される「ナノ粒子」という用語は、粒子を、全身投与、特に、非経口投与に適するものとする直径を有する、任意の粒子であって、特に、典型的に、直径を１０００ナノメートル（ｎｍ）又はこれ未満とする核酸の粒子を指す。一実施態様では、ナノ粒子は、約５０ｎｍ－約１０００ｎｍ、好ましくは、約５０ｎｍ－約４００ｎｍ、好ましくは、約１５０ｎｍ－約２００ｎｍなど、約１００ｎｍ－約３００ｎｍの範囲の平均直径を有する。一実施態様では、ナノ粒子は、約２００－約７００ｎｍ、約２００－約６００ｎｍ、好ましくは、約２５０－約５５０ｎｍ、特に、約３００－約５００ｎｍ、又は約２００－約４００ｎｍの範囲の直径を有する。
一実施態様では、動的光散乱により測定される、本明細書で記載されるナノ粒子の多分散指数（ＰＩ）は、０．５若しくはこれ未満、好ましくは、０．４若しくはこれ未満、又は、なおより好ましくは、０．３若しくはこれ未満である。「多分散指数」（ＰＩ）とは、測定値粒子混合物中の個別の粒子（リポソームなど）の、均質又は不均質のサイズ分布であり、混合物中の粒子分布の幅を指し示す。ＰＩは、例えば、国際公開第２０１３／１４３５５５Ａ１号において記載されている通りに決定することができる。
本明細書で使用される「ナノ粒子製剤」という用語又は同様の用語は、少なくとも１つのナノ粒子を含有する、任意の粒子製剤を指す。一部の実施態様では、ナノ粒子組成物は、ナノ粒子の一様なコレクションである。一部の実施態様では、ナノ粒子組成物は、リポソーム製剤又はエマルジョンなどの脂質を含有する薬学的製剤である。
脂質を含有する薬学的組成物
一実施態様では、本発明の薬学的組成物は、少なくとも１つの脂質を含む。好ましくは、少なくとも１つの脂質は、カチオン性脂質である。前記脂質を含有する薬学的組成物は、本発明に従う核酸を含む。一実施態様では、本発明に従う薬学的組成物は、小胞内、例えば、リポソーム内に封入されたＲＮＡを含む。一実施態様では、本発明に従う薬学的組成物は、エマルジョンの形態のＲＮＡを含む。一実施態様では、本発明に従う薬学的組成物は、カチオン性化合物と共に複合体化し、これにより、例えば、いわゆるリポプレックス又はポリプレックスを形成するＲＮＡを含む。リポソームなどの小胞内のＲＮＡの封入は、例えば、脂質／ＲＮＡ複合体と顕著に異なる。脂質／ＲＮＡ複合体は、例えば、ＲＮＡを、例えば、あらかじめ形成されたリポソームと混合する場合に得られる。
一実施態様では、本発明に従う薬学的組成物は、小胞内に封入されたＲＮＡを含む。このような製剤は、本発明に従う、特定の粒子製剤である。小胞とは、球殻へと巻き込まれ、小空間を囲い込み、この空間を小胞外部の空間から隔てる脂質二重層である。典型的に、小胞内部の空間は、水性空間である、すなわち、水を含む。典型的に、小胞外部の空間は、水性空間である、すなわち、水を含む。脂質二重層は、１又は複数の脂質（小胞形成脂質）により形成される。小胞を囲い込む膜は、細胞膜のラメラ相と同様のラメラ相である。本発明に従う小胞は、多層型小胞の場合もあり、単層型小胞の場合もあり、これらの混合物の場合もある。小胞内に封入されると、ＲＮＡは、典型的に、任意の外部培地から隔てられる。したがって、ＲＮＡは、天然のアルファウイルス内の保護形態と機能的に同等な保護形態で存在する。適切な小胞は、粒子、特に、本明細書で記載されるナノ粒子である。
例えば、ＲＮＡは、リポソーム内に封入することができる。この実施態様では、薬学的組成物は、リポソーム製剤であるか、又はこれを含む。リポソーム内の封入は、典型的に、ＲＮＡを、ＲＮアーゼによる消化から保護するであろう。リポソームは、一部の外部ＲＮＡ（例えば、それらの表面上の）を含むが、ＲＮＡのうちの少なくとも半分（及び理想的にはその全て）を、リポソームのコア内に封入することが可能である。
リポソームは、リン脂質など、小胞形成脂質の、１又は複数の二重層を有することが多い、微小な脂質性小胞であり、薬物、例えば、ＲＮＡを封入することが可能である。本発明の文脈では、それらに限定せずに述べると、多層型小胞（ＭＬＶ）、小型の単層型小胞（ＳＵＶ）、大型の単層型小胞（ＬＵＶ）、立体安定化リポソーム（ＳＳＬ）、多胞性小胞（ＭＶ）、及び大型の多胞性小胞（ＬＭＶ）のほか、当技術分野で公知の、他の二重層形態を含む、異なる種類のリポソームを利用することができる。リポソームのサイズ及びラメラ性は、調製方式に依存するであろう。単層から構成されるラメラ相、六方相及び逆六方相、立方相、ミセル、逆ミセルを含む脂質が、水性培地中に存在しうる、いくつかの他の形態の超分子構成が存在する。これらの相はまた、ＤＮＡ又はＲＮＡとの組合せでも得ることができ、ＲＮＡ及びＤＮＡとの相互作用は、相状態に、実質的に影響を及ぼしうる。このような相は、本発明のナノ粒子状ＲＮＡ製剤中に存在しうる。
リポソームは、当業者に公知の標準的方法を使用して形成することができる。それぞれの方法は、逆蒸発法、エタノール注射法、脱水－再水和法、超音波処理法、又は他の適する方法を含む。リポソームの形成後、リポソームをサイズ分けして、実質的に均一のサイズ範囲を有するリポソームお集団を得る。
本発明の好ましい実施態様では、ＲＮＡは、少なくとも１つのカチオン性脂質を含むリポソーム内に存在する。それぞれのリポソームは、少なくとも１つのカチオン性脂質を使用することを条件として、単一の脂質から形成することもでき、脂質の混合物から形成することもできる。好ましいカチオン性脂質は、プロトン化が可能な窒素原子を有し、好ましくは、このようなカチオン性脂質は、三級アミン基を伴う脂質である。特に、適切な三級アミン基を伴う脂質は、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）である。一実施態様では、本発明に従うＲＮＡは、国際公開第２０１２／００６３７８Ａ１号において記載されているリポソーム製剤、つまり、ＲＮＡを含む水性コアを封入する脂質二重層を有するリポソームであって、脂質二重層が、ｐＫａが５．０から７．６の範囲にある脂質であり、好ましくは、三級アミン基を有する脂質を含むリポソーム内に存在する。好ましいカチオン性三級アミン基を伴う脂質は、ＤＬｉｎＤＭＡ（ｐＫａ ５．８）を含み、一般に、国際公開第２０１２／０３１０４６Ａ２号において記載されている。国際公開第２０１２／０３１０４６Ａ２号に従い、それぞれの化合物を含むリポソームは、ＲＮＡの封入に特に適し、したがって、リポソームによるＲＮＡの送達に特に適する。一実施態様では、本発明に従うＲＮＡは、リポソーム製剤中に存在し、この場合、リポソームは、それらのヘッド基が、プロトン化が可能な、少なくとも１つの窒素原子（Ｎ）を含む、少なくとも１つのカチオン性脂質を含み、この場合、リポソーム及びＲＮＡは、１：１から２０：１の間のＮ：Ｐ比を有する。本発明によると、「Ｎ：Ｐ比」とは、国際公開第２０１３／００６８２５Ａ１号において記載されている通り、カチオン性脂質内の窒素原子（Ｎ）の、脂質含有粒子（例えば、リポソーム）内に含まれるＲＮＡ内のリン酸原子（Ｐ）に対するモル比を指す。１：１から２０：１の間のＮ：Ｐ比は、リポソームの正味の電荷、及び脊椎動物細胞へのＲＮＡの送達効率に関与する。
一実施態様では、本発明に従うＲＮＡは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む、少なくとも１つの脂質を含むリポソーム製剤中に存在し、この場合、ＲＮＡは、ＰＥＧ部分が、国際公開第２０１２／０３１０４３Ａ１号及び国際公開第２０１３／０３３５６３Ａ１号に記載されている通り、リポソームの外殻上に存在するように、ＰＥＧ化リポソーム内に封入されている。
一実施態様では、本発明に従うＲＮＡは、リポソーム製剤中に存在し、この場合、リポソームは、国際公開第２０１２／０３０９０１Ａ１号に記載されている通り、６０－１８０ｎｍの範囲の直径を有する。
一実施態様では、本発明に従うＲＮＡは、リポソーム製剤中に存在し、この場合、ＲＮＡ含有リポソームは、国際公開第２０１３／１４３５５５Ａ１号において開示されている通り、ゼロに近いか、又は負である、正味の電荷を有する。
他の実施態様では、本発明に従うＲＮＡは、エマルジョンの形態で存在する。エマルジョンについては、ＲＮＡ分子など、核酸分子の、細胞への送達に使用されることが既に記載されている。本明細書では、水中油エマルジョンが好ましい。それぞれのエマルジョン粒子は、油コア及びカチオン性脂質を含む。本発明に従うＲＮＡを、エマルジョン粒子へと複合体化させた、カチオン性水中油エマルジョンがより好ましい。エマルジョン粒子は、油コア及びカチオン性脂質を含む。カチオン性脂質は、負に帯電したＲＮＡと相互作用することが可能であり、これにより、ＲＮＡを、エマルジョン粒子へとアンカリングする。水中油エマルジョン中では、エマルジョン粒子は、水性連続相中に分散している。例えば、エマルジョン粒子の平均直径は、典型的に、約８０ｎｍから１８０ｎｍでありうる。一実施態様では、本発明の薬学的組成物は、エマルジョン粒子が、国際公開第２０１２／００６３８０Ａ２号に記載されている通り、油コア及びカチオン性脂質を含む、カチオン性水中油エマルジョンである。本発明に従うＲＮＡは、国際公開第２０１３／００６８３４Ａ１号に記載されている通り、エマルジョンのＮ：Ｐ比が、少なくとも４：１であるカチオン性脂質を含むエマルジョンの形態で存在しうる。本発明に従うＲＮＡは、国際公開第２０１３／００６８３７Ａ１号に記載されている通り、カチオン性脂質エマルジョンの形態で存在しうる。特に、組成物は、油／脂質の比が、少なくとも約８：１（モル：モル）である、カチオン性水中油エマルジョンの粒子と複合体化させたＲＮＡを含みうる。
他の実施態様では、本発明に従う薬学的組成物は、リポプレックスのフォーマットで、ＲＮＡを含む。「リポプレックス」又は「ＲＮＡリポプレックス」という用語は、脂質と、ＲＮＡなどの核酸との複合体を指す。リポプレックスは、カチオン性（正に帯電した）リポソームと、アニオン性（負に帯電した）核酸とから形成することができる。カチオン性リポソームはまた、中性「ヘルパー」脂質も含みうる。最も単純な場合には、ある特定の混合プロトコールで、核酸を、リポソームと混合することにより、リポプレックスは、自発的に形成されるが、他の多様なプロトコールも適用することができる。正に帯電したリポソームと、負に帯電した核酸との静電相互作用が、リポプレックス形成の駆動力である（国際公開第２０１３／１４３５５５Ａ１号）ことが理解される。本発明の一実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子の正味の電荷は、ゼロに近いか、又は負である。ＲＮＡ及びリポソームの、電気的に中性であるか、又は負に帯電したリポプレックスは、全身投与の後、脾臓樹状細胞（ＤＣ）内で、実質的なＲＮＡ発現をもたらすが、正に帯電したリポソーム及びリポプレックスについて報告されている毒性の増加を伴わない（国際公開第２０１３／１４３５５５Ａ１号を参照されたい）ことが公知である。したがって、本発明の一実施態様では、本発明に従う薬学的組成物は、（ｉ）ナノ粒子内の正の電荷の数が、ナノ粒子内の負の電荷の数を超えず、且つ／又は（ｉｉ）ナノ粒子が、中性であるか、若しくは正味の負の電荷を有し、且つ／又は（ｉｉｉ）ナノ粒子内の、正の電荷の、負の電荷に対する電荷比が、１．４：１若しくはこれ未満であり、且つ／又は（ｉｖ）ナノ粒子のゼータポテンシャルが、０若しくはこれ未満である、ナノ粒子、好ましくは、リポプレックスナノ粒子のフォーマットで、ＲＮＡを含む。国際公開第２０１３／１４３５５５Ａ１号において記載されている通り、ゼータポテンシャルとは、コロイド系における、動電学的ポテンシャルについての学術用語である。本発明では、（ａ）ゼータポテンシャル、及び（ｂ）ナノ粒子内の、カチオン性脂質の、ＲＮＡに対する電荷比のいずれも、国際公開第２０１３／１４３５５５Ａ１号において開示されている通りに計算することができる。まとめると、本発明の文脈では、規定された粒子サイズを伴うナノ粒子状リポプレックス製剤であって、粒子の正味の電荷が、国際公開第２０１３／１４３５５５Ａ１号において開示されている通り、ゼロに近いか、又は負であるナノ粒子状リポプレックス製剤である薬学的組成物が、好ましい薬学的組成物である。
タンパク質を作製するための方法
第４の態様では、本発明は、
（ａ）アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクトを得る工程と、
（ｂ）トランスで、レプリカーゼによる複製が可能であり、タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むＲＮＡレプリコンを得る工程と、
（ｃ）アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクトと、ＲＮＡレプリコンとを、細胞へと共接種する工程と
を含み、
アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクトが、レプリカーゼによる翻訳を駆動するための５’キャップを含む、
細胞内でタンパク質を作製するための方法を提供する。
（ａ）によるアルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクトは、本発明の第１の態様に従うシステムに含まれる、レプリカーゼコンストラクトの特色のうちの、任意の１又は複数を特徴としうる。
（ｂ）に従うＲＮＡレプリコンは、本発明の第１の態様に従うシステムに含まれる、レプリコンの特色のうちの、任意の１又は複数を特徴としうる。
一実施態様では、細胞内でタンパク質を作製するための方法において使用される、（ａ）によるアルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクト、及び（ｂ）に従うＲＮＡレプリコンは、本発明に従うシステムの構成要素である。
１又は複数の核酸分子を接種しうる細胞を、「宿主細胞」と称することができる。本発明によると、「宿主細胞」という用語は、外因性核酸分子を形質転換又はトランスフェクトしうる、任意の細胞を指す。「細胞」という用語は、好ましくは、インタクトの細胞、すなわち、酵素、細胞小器官、又は遺伝子素材など、その正常な細胞内構成要素を放出していない、インタクトの膜を伴う細胞である。インタクト細胞は、好ましくは、生細胞、すなわち、その正常な代謝機能を実行ことが可能な生存細胞である。「宿主細胞」という用語は、本発明によると、原核細胞（例えば、大腸菌）又は真核細胞（例えば、ヒト及び動物細胞、並びに昆虫細胞）を含む。ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、及びヤギを含む家畜のほか、霊長動物に由来する細胞などの哺乳動物細胞が、特に好ましい。細胞は、複数の組織型に由来することが可能であり、初代細胞及び細胞株を含みうる。具体例は、角化細胞、末梢血白血球、骨髄幹細胞、及び胚性幹細胞を含む。他の実施態様では、宿主細胞は、抗原提示細胞、特に、樹状細胞、単球、又はマクロファージである。核酸は、宿主細胞内に、単一のコピー又はいくつかのコピーで存在することが可能であり、一実施態様では、宿主細胞内で発現する。
細胞は、原核細胞の場合もあり、真核細胞の場合もある。原核細胞は、本明細書では、例えば、本発明に従うＤＮＡの繁殖に適し、真核細胞は、本明細書では、例えば、レプリコンのオープンリーディングフレームの発現に適する。
本発明の方法では、本発明に従うシステム、又は本発明に従うキット、又は本発明に従う薬学的組成物のうちのいずれかを使用することができる。ＲＮＡは、薬学的組成物の形態で使用することもできる、例えば、エレクトロポレーションのためのネイキッドＲＮＡとして使用することもできる。ＲＮＡを含む組成物の、細胞への接種のほか、ネイキッドＲＮＡの、細胞へのエレクトロポレーションについては、既に記載されている（本明細書の、本発明に従う薬学的組成物について記載する節において引用する参考文献を参照されたい）。
本発明の方法に従い、宿主細胞内の、目的の遺伝子の効率的な発現を達成することができる（例えば、実施例１及び２を参照されたい）。
本発明に従う、細胞内でタンパク質を作製するための方法では、第１の態様に従う、異なるＲＮＡ分子（レプリコン及びレプリカーゼコンストラクト）は、同じ時点に接種することもでき、代替的に、異なる時点に接種することもできる。第２の場合には、レプリカーゼコンストラクトを、典型的に、第１の時点に接種し、レプリコンを、典型的に、第２の時点、後の時点に接種する。この場合、レプリカーゼは、既に、細胞内で翻訳されているので、レプリコンは、すぐに複製されることが想定される。第２の時点は、典型的に、第１の時点の直後、例えば、第１の時点の１分間から２４時間後である。
一実施態様では、更なるＲＮＡ分子、好ましくは、ｍＲＮＡ分子を、細胞へと接種することができる。任意選択で、更なるＲＮＡ分子は、本明細書で記載されるＥ３など、ＩＦＮの阻害に適するタンパク質をコードする。任意選択で、更なるＲＮＡ分子を、本発明に従うレプリコン又はレプリカーゼコンストラクト又はシステムの接種の前に接種することもできる。
本発明に従う、細胞内でタンパク質を作製するための方法では、細胞は、抗原提示細胞であることが可能であり、方法を、抗原をコードするＲＮＡを発現させるために使用することができる。この目的で、本発明は、抗原をコードするＲＮＡの、樹状細胞などの抗原提示細胞への導入を伴いうる。樹状細胞などの抗原提示細胞のトランスフェクションのために、抗原をコードするＲＮＡを含む薬学的組成物を使用することができる。
一実施態様では、細胞内でタンパク質を作製するための方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法である。一実施態様では、細胞内でタンパク質を作製するための方法は、手術又は治療による、ヒト対象又は動物対象からの細胞の除去を含まない。
この実施態様では、本発明の第４の態様に従い接種される細胞は、対象においてタンパク質を作製し、対象にタンパク質を施すように、対象へと投与することができる。細胞は、対象に関して、自家の場合もあり、同系の場合もあり、同種の場合もあり、異種の場合もある。
別の実施態様では、細胞内でタンパク質を作製するための方法における細胞は、患者など、対象において存在しうる。この実施態様では、細胞内でタンパク質を作製するための方法は、ＲＮＡ分子の、対象への投与を含むｉｎ ｖｉｖｏ法である。
この点で、本発明また、
（ａ）アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクトを得る工程と、
（ｂ）トランスで、レプリカーゼによる複製が可能であり、タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むＲＮＡレプリコンを得る工程と、
（ｃ）アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクトと、ＲＮＡレプリコンとを、対象へと投与する工程と
を含み、
アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクトが、レプリカーゼによる翻訳を駆動するための５’キャップを含む、
対象においてタンパク質を作製するための方法も提供する。
（ａ）によるアルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのＲＮＡコンストラクトは、本発明の第１の態様に従うシステムに含まれる、レプリカーゼコンストラクトの特色のうちの、任意の１又は複数を特徴としうる。（ａ）に従うＲＮＡコンストラクトは、例えば、本明細書で記載される通りに得ることができる。
（ｂ）に従うＲＮＡレプリコンは、本発明の第１の態様に従うシステムに含まれる、レプリコンの特色のうちの、任意の１又は複数を特徴としうる。好ましくは、（ｂ）に従うレプリコンは、薬学的に活性のペプチド又はタンパク質を、目的のタンパク質としてコードする。一実施態様では、薬学的に活性のペプチド又はタンパク質は、免疫学的に活性の化合物又は抗原である。（ｂ）に従うＲＮＡレプリコンは、例えば、本明細書で記載される通りに得ることができる。本発明に従う、対象においてタンパク質を作製するための方法は、予防的適用のほか、治療的適用にも特に適する。好ましくは、対象においてタンパク質を作製するための方法では、ＲＮＡレプリコンは、目的の遺伝子として、薬学的に活性のタンパク質又はポリペプチドをコードする。
対象において、タンパク質を作製するための方法では、（ａ）に従うＲＮＡレプリカーゼコンストラクト及び（ｂ）に従うレプリコンは、同じ時点に投与することもでき、代替的に、異なる時点に投与することもできる。第２の場合には、（ａ）に従うＲＮＡレプリカーゼコンストラクトを、典型的に、第１の時点に投与し、（ｂ）に従うレプリコンを、典型的に、第２の時点、後の時点に投与する。この場合、レプリカーゼは、既に、細胞内で翻訳されているので、レプリコンは、すぐに複製されることが想定される。第２の時点は、典型的に、第１の時点の直後、例えば、第１の時点の１分間から２４時間後である。好ましくは、レプリコン及びレプリカーゼコンストラクトが、同じ標的組織又は細胞に到達する見込みを増加させるために、レプリコンの投与を、同じ部位に、レプリカーゼコンストラクトの投与と同じ投与経路を介して実施する。「部位」とは、対象の身体の位置を指す。適切な部位は、例えば、左腕、右腕などである。
一実施態様では、更なるＲＮＡ分子、好ましくは、ｍＲＮＡ分子を、対象へと投与することができる。任意選択で、更なるＲＮＡ分子は、本明細書で記載されるＥ３など、ＩＦＮの阻害に適するタンパク質をコードする。任意選択で、更なるＲＮＡ分子を、本発明に従うレプリコン又はレプリカーゼコンストラクト又はシステムの接種の前に投与することもできる。
本発明に従うシステム、又は本発明に従うキット、又は本発明に従う薬学的組成物のうちのいずれかを、本発明に従う、対象においてタンパク質を作製するための方法において使用することができる。例えば、本発明の方法では、ＲＮＡは、例えば、本明細書で記載される薬学的組成物のフォーマットで使用することもでき、ネイキッドＲＮＡとして使用することもできる。ＲＮＡを含む薬学的組成物投与については、既に記載されており、例えば、本明細書の、本発明に従う薬学的組成物について記載する節において引用する参考文献を参照されたい。
対象へと投与される効能を念頭に、本発明に従うシステム、又は本発明に従うキット、又は本発明に従う薬学的組成物の各々を、「医薬」などと称することができる。本発明は、本発明のシステム、キット、及び／又は薬学的組成物を、医薬としての使用のために提供することを見越す。医薬を使用して、対象を治療することができる。「～を治療する」とは、本明細書で記載される化合物又は組成物又は他の実体を、対象へと投与することを意味する。用語は、療法により、ヒト又は動物の身体を治療するための方法を含む。
上記で記載した医薬は、典型的に、ＤＮＡを含まず、したがって、先行技術（例えば、国際公開第２００８／１１９８２７Ａ１号）に記載されているＤＮＡワクチンと比較して、更なる安全性の特色と関連している。
本発明に従う、代替的な医学的使用は、本発明の第４の態様に従う、細胞内でタンパク質を作製するための方法であって、細胞が、樹状細胞などの抗原提示細胞でありうる方法に続き、前記細胞の、対象への導入を行う方法を含む。例えば、抗原など、薬学的に活性のタンパク質をコードするレプリコンを含むシステムを、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、抗原提示細胞へと導入（トランスフェクト）することができる、例えば、対象から採取した抗原提示細胞と、任意選択で、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、クローン的に繁殖させた抗原提示細胞とを、同じ対象又は異なる対象へと導入することができる。トランスフェクトされた細胞は、当技術分野で公知の、任意の手段を使用して、対象へと再導入することができる。
本発明に従う医薬は、それを必要とする対象へと投与することができる。本発明の医薬は、対象を治療する予防法のほか、治療法においても使用することができる。
本発明に従う医薬は、有効量で投与する。「有効量」とは、単独で又は他の投与と共に、反応又は所望の効果を引き起こすのに十分な量に関する。対象における、ある特定の疾患又はある特定の状態の治療の場合、所望される効果は、疾患の進行の阻害である。これは、疾患の進行の減速化、特に、疾患の進行の中断を含む。疾患又は状態の治療における所望の効果はまた、疾患の発生の遅延又は疾患の発生の阻害でもありうる。
有効量は、治療される状態、疾患の重症度、年齢、生理学的状態、身長、及び体重を含む、患者の個別のパラメータ、治療の持続期間、併用療法（存在する場合）の種類、具体的投与方式、及び他の因子に依存するであろう。
ワクチン接種
「免疫化」又は「ワクチン接種」という用語は、一般に、治療的理由又は予防的理由で、対象を治療する工程を指す。治療、特に、予防的治療は、好ましくは、例えば、１又は複数の抗原に対する、対象の免疫応答を誘導又は増強することを目的とする治療であるか、又はこれを含む。本発明によると、本明細書で記載されるＲＮＡを使用することにより、免疫応答を誘導又は増強することが所望される場合、免疫応答は、ＲＮＡにより、誘発又は増強することができる。一実施態様では、本発明は、好ましくは、対象のワクチン接種であるか、又はこれを含む予防的治療を提供する。レプリコンが、目的のタンパク質として、免疫学的に活性の化合物又は抗原である、薬学的に活性のペプチド又はタンパク質をコードする、本発明の実施態様は、ワクチン接種に、特に、有用である。
病原体又は癌を含む、外来の作用物質に対するワクチン接種のためのＲＮＡについては、既に記載されている（近年、Ulmer等, 2012, Vaccine, vol. 30, pp. 4414-4418により総説されている）。先行技術における一般的な手法とは対照的に、本発明に従うレプリコンは、本発明のレプリカーゼコンストラクトによりコードされるレプリカーゼによるトランス複製能のために、効率的なワクチン接種に、特に、適するエレメントである。本発明に従うワクチン接種を、例えば、弱く免疫原性であるタンパク質に対する免疫応答の誘導のために使用することができる。本発明に従うＲＮＡワクチンの場合、タンパク質抗原を血清抗体へと曝露するのではなく、ＲＮＡの翻訳の後で、トランスフェクト細胞自体が産生する。したがって、アナフィラキシーは、問題とならないはずである。したがって、本発明は、アレルギー反応の危険性を伴わずに、患者の免疫化の反復を可能とする。
本発明の実施例５は、組換えタンパク質の極めて強力な発現から証拠立てられる通り、トランス遺伝子含有レプリコンが、ワクチン接種された動物において、高コピー数に到達することに説得力を与える。実施例６は、レプリコンが、治療用タンパク質をコードする、本発明に従うワクチン接種が、極めて効率的であることを証拠立てる。したがって、本発明は、アルファウイルスベースのトランス複製ＲＮＡシステムによる効率的なワクチン接種を可能とする。
本発明に従うワクチン接種を伴う方法では、特に、抗原を伴う疾患を有するか、又は抗原を伴う疾患により、疾病に罹患する危険性がある対象を治療することが所望される場合、本発明の医薬を、対象へと投与する。
本発明に従うワクチン接種を伴う方法では、本発明に従うレプリコンによりコードされる目的のタンパク質は、例えば、それに対する免疫応答が導かれる細菌抗原、又はそれに対する免疫応答が導かれるウイルス抗原、又はそれに対する免疫応答が導かれる癌抗原、又はそれに対する免疫応答が導かれる単細胞生物の抗原をコードする。ワクチン接種の有効性は、生物に由来する抗原特異的ＩｇＧ抗体の測定など、公知の標準的方法により評価することができる。本発明に従う、アレルゲン特異的免疫療法を伴う方法では、本発明に従うレプリコンによりコードされる目的のタンパク質は、アレルギーに関連する抗原をコードする。アレルゲン特異的免疫療法（減感作としてもまた公知である）は、原因アレルゲンへのその後の曝露に伴う症状が緩和される状態を達成するために、好ましくは、１又は複数のアレルギーを伴う生物へのアレルゲンワクチンの用量を増加させる投与として規定される。アレルゲン特異的免疫療法の有効性は、生物に由来するアレルゲン特異的ＩｇＧ抗体及びアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の測定など、公知の標準的方法により評価することができる。
本発明の医薬は、例えば、対象のワクチン接種を含む、対象の治療のために、対象へと投与することができる。
「対象」という用語は、脊椎動物、特に、哺乳動物に関する。例えば、本発明の文脈における哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長動物、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマなどの家畜哺乳動物、マウス、ラット、ウサギ、モルモットなどなどの実験室動物のほか、動物園動物などの捕獲動物である。「対象」という用語はまた、鳥類（特に、ニワトリ、カモ、ガチョウ、シチメンチョウなどの家禽）及び魚類（特に、養殖魚、例えば、サケ又はナマズ）など、哺乳動物以外の脊椎動物にも関する。本明細書で使用される「動物」という用語はまた、ヒトも含む。
一部の実施態様では、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマ、ラクダ、ニワトリ、カモ、ガチョウ、シチメンチョウなどの家畜、又は野生動物、例えば、キツネ、シカ、ノロジカ、イノシシへの投与が好ましい。例えば、本発明に従う予防用ワクチン接種は、例えば、畜産業における動物集団にワクチン接種するのにも適し、野生の動物集団にワクチン接種するのにも適しうる。愛玩動物又は動物園動物など、他の捕獲動物集団にも、ワクチン接種することができる。
対象へと投与されると、医薬として使用されるレプリコン及び／又はレプリカーゼコンストラクトは、好ましくは、治療される対象が属する種又は属に対して感染性であるアルファウイルスの種類に由来する配列を含まない。好ましくは、この場合、レプリコン及び／又はレプリカーゼコンストラクトは、それぞれの種又は属に感染しうるアルファウイルスに由来するヌクレオチド配列を含まない。この実施態様は、ＲＮＡを投与される対象が、（例えば、偶然に）感染性アルファウイルスに罹患した場合であってもなお、感染性（例えば、完全に機能的な又は野生型）アルファウイルスによる組換えが可能ではないという利点を保有する。例示的な例として述べると、ブタの治療のために、使用されるレプリコン及び／又はレプリカーゼコンストラクトは、ブタに感染しうるアルファウイルスに由来するヌクレオチド配列を含まない。
投与方式
本発明に従う医薬は、任意の適切な経路により、対象へと適用することができる。
例えば、医薬は、全身、例えば、静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、皮内（ｉ．ｄ．）、又は吸入により投与することができる。
一実施態様では、本発明に従う医薬を、骨格筋などの筋肉組織、又は皮膚へと、例えば、皮下投与する。一般に、ＲＮＡの、皮膚又は筋肉への移入は、高度且つ持続的な発現と並行して、体液性免疫応答及び細胞性免疫応答の強力な誘導をもたらす（Johansson等, 2012, PLoS. One., 7, e29732、Geall等, 2012, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, vol. 109, pp. 14604-14609）ことが理解される。
筋肉組織又は皮膚への投与に対する代替法は、皮内投与、鼻腔内投与、眼内投与、腹腔内投与、静脈内投与、間質内、口腔内投与、経皮投与、又は舌下投与を含むがこれらに限定されない。皮内投与及び筋内投与が、２つの好ましい経路である。
投与は、多様な方式で達成することができる。一実施態様では、本発明に従う医薬を、注射により投与する。好ましい実施態様では、注射は、注射針を介する。無針注射を、代替法として使用することができる。
本発明について、詳細に記載し、図及び例により例示してきたが、これらは、例示だけを目的として使用されるものであり、限定的であることを意図するものではない。記載及び例により、当業者は、それらもまた本発明に含まれる、更なる実施態様にアクセス可能である。
材料及び方法：
下記で記載される例では、以下の材料及び方法を使用した。
レプリコン、レプリカーゼコンストラクト、及びＥ３ＬをコードするＤＮＡ；並びにｉｎ ｖｉｔｒｏにおける転写
（１）例において使用されるシスレプリコンをコードするＤＮＡは、以下の通りに調製した：セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）レプリカーゼによる複製が可能なＲＮＡレプリコンのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に適するＤＮＡプラスミドを調製した：基準セムリキ森林ウイルスレプリコンプラスミド（ｐＳＦＶ－ｇｅｎ－ＧＦＰ）は、Ｋ．Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ（Lundstrom等, 2001, Histochem. Cell Biol., vol. 115, pp. 83-91、Ehrengruber及びLundstrom, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, vol. 96, pp. 7041-7046）により恵与された。ｐＳＦＶ－ｇｅｎ－ＧＦＰによりコードされるポリ（Ａ）カセットは、元のベクター内の６２アデニル酸残基から、１２０アデニル酸残基へと伸長させたものであり、ＳａｐＩ制限部位を、ポリ（Ａ）カセットのすぐ下流に配置した。このポリ（Ａ）デザインは、合成ｍＲＮＡの発現を増強することが記載された（Holtkamp等, 2006, Blood, vol. 108, pp. 4009-4017）。最後に、ファージ－ポリメラーゼプロモーターを、ＳＰ６から、Ｔ７へと変化させた。
（２）ベクター骨格を保ちながら、アルファウイルスレプリカーゼをコードするオープンリーディングフレーム（レプリカーゼＯＲＦのヌクレオチド２２２－６３２１）を欠失させることにより、トランスレプリコンをコードするＤＮＡを、上記で記載したシスレプリコンから操作した。
（１ａ、２ａ）本発明者らは、レポーター遺伝子ホタルルシフェラーゼ、分泌型ＮａｎｏＬｕｃ（いずれも、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡにより市販されている）、インフルエンザウイルスＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／０８／１９３４のヘマグルチニン（ＨＡ）、及び増強型緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ；図中では、「ＧＦＰ」又は「ｅＧＦＰ」）を、シスレプリコン及びトランスレプリコンのサブゲノムプロモーターに対して３’側に、独立にクローニングした。
（３）レプリカーゼコンストラクトを創出するために、ＳＦＶレプリカーゼをコードするオープンリーディングフレームを、ヒトベータ－グロビンの３’ＵＴＲ、ポリ（Ａ１２０）テール、及びポリ（Ａ）テールのすぐ下流におけるＳａｐＩ制限部位のタンデムコピーを特徴とする、ｐＳＴ１プラスミド（Holtkamp等, 2006, Blood, vol. 108, pp. 4009-4017）へとクローニングした。
（４）ワクシニアウイルスＥ３Ｌをコードするオープンリーディングフレームを、ヒトベータ－グロビンの３’ＵＴＲ、ポリ（Ａ１２０）テール、及びポリ（Ａ）テールのすぐ下流におけるＳａｐＩ制限部位のタンデムコピーを特徴とする、ｐＳＴ１プラスミド（Holtkamp等, 2006, Blood, vol. 108, pp. 4009-4017）へとクローニングした。
ｐＳＴ１に由来するプラスミド及びｐＳＦＶ－ｇｅｎ－ＧＦＰに由来するプラスミド［（１ａ）、（２ａ）、（３）、及び（４）］からのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、及びＲＮＡの精製は、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ２）キャップ類似体を、ＡＲＣＡの代わりに使用したことを例外として、既に記載されている（上記Holtkamp等、Kuhn等, Gene Ther., 2010, vol. 17, pp. 961-971）通りに実施した。精製されたＲＮＡの品質は、分光光度法、及び２１００ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＵＳＡ）上の解析により評価した。例において使用されるＲＮＡは、精製ＩＶＴ－ＲＮＡである。
細胞へのＲＮＡの移入：
エレクトロポレーションのために、以下の設定：７５０Ｖ／ｃｍ、１６ミリ秒（ｍｓ））の１パルスを使用する、方形波エレクトロポレーションデバイス（ＢＴＸ ＥＣＭ ８３０、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して、ＲＮＡを、室温で、細胞へとエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションのために、ＲＮＡを、キュベットのギャップサイズ１ｍｍ当たりの最終容量６２．５μｌ中に再懸濁させた。
製造元の指示書（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸを使用して、ＲＮＡリポフェクションを実施した。増殖面積１ｃｍ２当たりの細胞約２０，０００個で、細胞を播種し、１ｃｍ２当たりの合計２６０ｎｇのＲＮＡ及び１ｃｍ２当たり１μｌのＲＮＡｉＭＡＸをトランスフェクトした。ＲＮＡ分子種を、ＲＮアーゼ非含有のエッペンドルフ管内で混合し、トランスフェクションのために使用するまで、氷上で保持した。
細胞培養物：全ての成長培地、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、抗生剤、及び他の補充物質は、そうでないことが言明されない限りにおいて、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏにより提供された。Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＨＦＦ、新生児）又はＡＴＣＣ（ＣＣＤ－１０７９Ｓｋ）から得たヒト包皮線維芽細胞を、１５％のＦＣＳ、１ｍｌ当たり１単位のペニシリン、１ｍｌ当たり１μｇのストレプトマイシン、１％の非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含有する最小必須培地（ＭＥＭ）中、３７℃で培養した。細胞を、５％のＣＯ２へと平衡化させた加湿雰囲気中、３７℃で増殖させた。ＢＨＫ２１細胞（ＡＴＣＣ；ＣＣＬ１０）を、１０％のＦＣＳを補充した、イーグル最小必須培地中で増殖させた。
フローサイトメトリー：そうでないことが指し示されない限りにおいて、トランスフェクションの１６時間後に、トランスフェクト細胞を採取して、生産的トランスフェクションの効率、及びフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によるトランス遺伝子（ｅＧＦＰ）の発現を測定した。測定は、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用するフローサイトメトリーにより実施し、収集されたデータは、対応するＤｉｖａソフトウェア又はＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ．、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡ）により解析した。
ルシフェラーゼアッセイ：トランスフェクト細胞内のルシフェラーゼの発現について評価するために、トランスフェクト細胞を、９６ウェル白色マイクロプレート（Ｎｕｎｃ、Ｌａｎｇｅｎｓｅｌｂｏｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）内に播種した。ホタルルシフェラーゼの検出は、Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍにより実施し、ＮａｎｏＬｕｃは、製造元の指示書に従い、ＮａｎｏＧｌｏキットを使用して検出した（いずれも、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）。生物発光は、マイクロプレート発光リーダーである、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｅｎｎｅｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して測定した。データは、相対ルシフェラーゼ単位［ＲＬＵ］で表し、ルシフェラーゼ陰性細胞を使用して、バックグラウンドシグナルを控除した。
動物：６－８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを、Ｊａｎｖｉｅｒ ＬＡＢＳ（Ｓａｉｎｔ Ｂｅｒｔｈｅｖｉｎ Ｃｅｄｅｘ、Ｆｒａｎｃｅ）から購入し、概日明暗周期、並びに標準的なマウス飼料及び水道水の自由摂取を伴う、通常の実験室条件下で飼育した。全ての実験は、Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｃｏｕｎｃｉｌ’ｓ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ（Ｋｏｂｌｅｎｚ／Ｒｈｉｎｅｌａｎｄ－Ｐａｌａｔｉｎａｔｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｇ １３－８－０６３）により承認された。
インフルエンザウイルスの作製及び力価の決定：感染させるために、Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙイヌ腎臓ＩＩ（ＭＤＣＫ－ＩＩ）細胞を、ＦＣＳ（感染培地）の代わりに、０．２％ウシ血清アルブミン（３０％、とりわけ、ＩｇＧ非含有のＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ）を含有するＭＥＭ中で培養した。マウスに適合させたインフルエンザウイルスＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／０８／１９３４を、１μｇ／ｍｌのトシルスルホニルフェニルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）処理トリプシン（Ｓｉｇｍａ）を含有する感染培地中のＭＤＣＫ－ＩＩ細胞内で繁殖させた。細胞上清を、低速遠心分離により清明化させ、－８０℃で保存した。ウイルス力価（１ｍｌ当たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ））は、コンフルエンシーを７０－８０％とする、ＭＤＣＫ－ＩＩ細胞単層（１２ウェルプレート）を使用するプラークアッセイにより決定した。細胞に、ウイルス調製物の１０倍の系列希釈液（１０－２－１０－８倍）２００μｌを接種した。ウイルスを、３７℃で、１時間にわたり吸着させてから、細胞に、低粘性の培地であるＡｖｉｃｅｌを重層化させて、ウイルスの拡散を低減し、プラークの形成を可能とした。２．４％のＡｖｉｃｅｌ溶液を、２倍濃度のＭＥＭ／１μｇ／ｍｌのＴＰＣＫ処理トリプシンで希釈して、１．２％の最終Ａｖｉｃｅｌ濃度へと到達させた。３日後、重層化層を除去し、１０％のホルムアルデヒドを含有する、１％のクリスタルバイオレット水溶液を使用して、細胞を染色した（ＲＴで１０分間にわたる）。染色された細胞を、水で洗浄し、ウェル１つ当たりのプラークをカウントし、１ｍｌ当たりのＰＦＵを計算した。
赤血球凝集力価（ＨＡ力価）：赤血球凝集単位（ＨＡＵ）は、２０１１年の「Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ」において、ＷＨＯにより公表された推奨に従い、ニワトリ赤血球（ＲＢＣ、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、ＵＳＡ）を使用して決定した。略述すると、ウイルス調製物の系列希釈（２倍）は、Ｖ字型の９６ウェルプレート内で実施し、次いで、０．５％のニワトリＲＢＣ（「標準化ＲＢＣ」）５０μｌと共に、２５℃で、３０分間にわたりインキュベートした。ウイルス調製物とのインキュベーションの後で、ＲＢＣが、なおも懸濁している場合に、赤血球凝集を完全であると考えた（非凝集ＲＢＣは、ウェルの底部に沈殿した）。ＨＡ力価は、完全凝集を示した最低の希釈率の逆数として記録し、等容量の標準化ＲＢＣ凝集させるのに必要なウイルス量を、５０μｌ当たりの１赤血球凝集単位（ＨＡＵ）として規定した。
赤血球凝集阻害（ＨＡＩ）アッセイ：免疫化マウスにおける赤血球凝集を阻害する抗ＨＡ抗体の血清レベルを決定するために、血清を回収し、比を１：５とする受容体破壊酵素ＩＩ「Ｓｅｉｋｅｎ」（ＲＤＥ（ＩＩ）；日本、デンカ生研株式会社）で、一晩にわたり処理するのに続き、５６℃で３０分間にわたり熱不活化させた。血清を、二連で使用し、系列希釈（１：２）を実施してから、２５μｌのＰＲ８ウイルス希釈液（５０μｌ当たり４ＨＡＵ）を添加した。室温で１５分間にわたるインキュベーションの後、０．５％のＲＢＣ ５０μｌを添加し、混合物を、３０分間にわたりインキュベートしてから、凝集を査定した。ＨＡＩ力価は、凝集を阻害した最低の希釈率の逆数（５０μｌ当たりのＨＡＩ）として記録した。
ウイルス中和力価（ＶＮＴ）の決定：ワクチン接種されたマウスの血清中のウイルス中和抗体の力価を決定するために、本発明者らは、血清抗体が、Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞の感染を防止する能力についてアッセイし、したがって、ＭＤＣＫ細胞からの、デノボのウイルス放出を防止する能力についてアッセイした。この目的のために、ワクチン接種マウス及びコントロールマウスに由来する熱不活化（５６℃３０分間にわたり）血清の、１：２の系列希釈液を、一定濃度の感染性インフルエンザウイルス（１μｌ当たり２ＴＣＩＤ５０）（組織培養物感染用量（５０））と共にインキュベートした。コントロールは、ウイルス調製物の力価を確認するように、各マイクロ滴定プレート上に、無血清コントロール及び無ウイルスコントロールのほか、血清の非存在下におけるウイルス調製物の逆滴定も含む。全ての調製物（血清－ウイルス混合物及びコントロール試料）を、１μｇ／ｍｌのトシルスルホニルフェニルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）処理トリプシンの存在下、３７℃で、２時間にわたりインキュベートしてから、ＭＤＣＫ細胞を、３７℃で、３日間にわたり、調製物へと曝露した。３日後、細胞培養物上清を、ＭＤＣＫ細胞から採取し、上記で記載したＨＡ力価決定にかけた。
動物の皮内免疫化、ウイルスチャレンジによる感染、及び査定：８－１０週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、免疫化実験に使用した。イソフルランの吸入により、マウスに麻酔をかけ、背部領域を剃毛し、レプリカーゼ及びＥ３ ｍＲＮＡと組み合わせた、ＨＡレプリコンＲＮＡを、２０μｌのＲＮアーゼ非含有ＰＢＳ中に溶解させ、０及び２１日目に皮内注射した。血液は、初回の免疫化後２０、３５、及び５５日目、イソフルラン麻酔下の、眼窩静脈叢における採血により採取した。遠心分離により、細胞破砕物を、血液からペレット化させ、血清試料を、ヘマグルチニン（ＨＡＩ）アッセイのために使用した。インフルエンザウイルスによる感染に対する防御について査定するため、免疫化マウスに、ケタミン／キシラジンで麻酔をかけながら、１０倍ＬＤ５０のマウス適合インフルエンザウイルスＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／０８／１９３４（ＰＲ８）でチャレンジした。マウスを毎日秤量し、チャレンジの１４日間後、又は打切り基準（２５％の体重減少）が満たされたら、安楽死させた。
実施例１
トランス遺伝子の発現効率は、レプリカーゼをコードするＲＮＡ分子の種類に依存する
ＳＧＰの下流で、レプリカーゼをコードし、ルシフェラーゼをコードする、ＲＮＡシスレプリコン（「シスレプリコンＲＮＡ」）、又はレプリカーゼをコードする合成ｍＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）の各々を、ＳＧＰの下流でｅＧＦＰをコードするＲＮＡトランスレプリコンと共に、エレクトロポレーションにより、ＢＨＫ２１細胞へと導入した（図３）。トランスレプリコンの発現は、ＦＡＣＳを介して、ｅＧＦＰの蛍光を測定することにより決定し、シスレプリコンからのルシフェラーゼの発現には注目しなかった。特に、実験の成功は、ｅＧＦＰ陽性細胞の百分率（図３のバー）により反映されるトランスフェクション率を決定し、ｅＧＦＰ陽性細胞の平均値蛍光強度（ＭＦＩ）（図３の菱形）により反映される、ｅＧＦＰの発現レベルを決定することにより定量化した。図３に示す通り、トランス複製システム（この場合、レプリカーゼを、ｍＲＮＡの形態で、トランスに用意する）は、シス複製が可能なレプリコン（「シスレプリコンＲＮＡ」）から発現させたレプリカーゼと比較して、大きなｅＧＦＰ陽性細胞の百分率、並びに高度なｅＧＦＰ陽性細胞の平均値蛍光強度の両方をもたらした。したがって、シス複製が可能なレプリコンから発現させたレプリカーゼは、トランスレプリコンのサブゲノム転写物を増幅するのに、それほど強力ではない結果として、低レベルのトランス遺伝子の発現をもたらす。加えて、ＢＨＫ２１細胞へと共送達される、レプリカーゼｍＲＮＡ及びトランスレプリコンＲＮＡを含むシステムは、ｅＧＦＰ陽性細胞の百分率から推定される通り、トランスレプリコンを複製する生産性を増加させる可能性が高い（図３のバー）。
まとめると、トランス複製システム内の目的の遺伝子の発現は、レプリカーゼを送達するのに、ｍＲＮＡを使用する場合に、より効率的であることが結論づけられた。
実施例２
ｍＲＮＡによりコードされるレプリカーゼと、トランス遺伝子をコードするトランスレプリコンとから構成されるトランス複製システムは、初代細胞内でもまた、高レベルのトランス遺伝子の発現をもたらし、トランス遺伝子をコードするシスレプリコンと比較して、高度な発現を結果としてもたらす
ＲＮＡトランスレプリコン（「ｅＧＦＰトランスレプリコンＲＮＡ」）と併せた、シス複製が可能なＲＮＡレプリコン（「ｅＧＦＰ－レプリコンＲＮＡ」）；又はレプリカーゼをコードするｍＲＮＡ（「レプリカーゼｍＲＮＡ」）を、初代ヒト包皮線維芽細胞へとトランスフェクトした（図４）。プロテインキナーゼＲの活性を低減するために、ワクシニアウイルスタンパク質Ｅ３をコードするｍＲＮＡを、各ＲＮＡ試料へと添加した。トランスフェクションは、ＲＮＡ又はＲＮＡの混合物を、ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬と組み合わせ、この製剤を、細胞の培地へと添加すること（添加し、これにより、ＲＮＡを、同じリポソーム内に共送達すること）により実施した。
目的の遺伝子の発現は、ｅＧＦＰの蛍光を測定すること、すなわち、ｅＧＦＰ陽性細胞の百分率（図４のバー）を決定し、ｅＧＦＰ陽性細胞の平均値蛍光強度（ＭＦＩ）（図４の菱形）を決定することにより決定した。トランス複製システム（「レプリカーゼｍＲＮＡ」と併せた「ｅＧＦＰトランスレプリコンＲＮＡ」）は、シス複製システム（「ｅＧＦＰ－レプリコンＲＮＡ」）より大きなｅＧＦＰ陽性細胞の百分率、並びに高度なｅＧＦＰ陽性細胞の平均値蛍光強度の両方をもたらした。したがって、トランス複製システムの場合、トランス遺伝子をコードするＲＮＡの生産的な複製が生じる可能性は大きい。いずれのシステムにおいても、生産的な複製を確立する可能性は、用量依存性であるが、５０ｎｇのトランスレプリコンＲＮＡは、６２５ｎｇの基準レプリコン（シスレプリコン）とほぼ同じ程度に強力であり、１０ｎｇのトランスレプリコンは、５００ｎｇの基準レプリコンと同じ程度に強力である。加えて、トランス複製システムは、基準レプリコンより高度な、細胞１個当たりのトランス遺伝子発現レベル（ＭＦＩにより反映される）ももたらす（図４の菱形）。
実施例３
目的のタンパク質の作製は、レプリカーゼの用量に依存する
図５Ａに指し示す通り、ＲＮＡトランスレプリコン（「トランスレプリコン」）及びＥ３ ｍＲＮＡと併せた、レプリカーゼをコードするＲＮＡ（「レプリカーゼｍＲＮＡ」）を、初代ヒト包皮線維芽細胞へとリポフェクトした。ＲＮＡトランスレプリコンは、分泌型レポータータンパク質である、ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼを、目的の遺伝子としてコードする。タンパク質作製の効率は、分泌されるＮａｎｏＬｕｃの測定により裏付けられる通り、レプリカーゼＲＮＡの量により、用量依存的にモジュレートすることができる（図５Ａ）。
実施例４
レプリカーゼコンストラクトのコドン使用の修飾は、有利なポリペプチド配列非修飾型修飾ではない
本実施例では、レプリカーゼコンストラクトが、ｍｙｃでタグづけしたｎｓＰ３をコードする、トランス複製システムを使用した。ｍｙｃタグを、ｎｓＰ３の可変領域へと挿入して、抗ｍｙｃ抗体によるウェスタンブロットによる、ｎｓＰ３レベル（総レプリカーゼ量を反映する）の検出を可能とした。ｎｓＰ３の可変領域への挿入は、レプリカーゼポリタンパク質の活性に影響を及ぼさない（Spuul等, 2010, J. Virol, vol. 85, pp. 7543-7557）。ｍｙｃでタグづけしたレプリカーゼのコドン使用（「レプリカーゼのｗｔのコドン使用」）を、任意選択で、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）におけるコドン使用（「レプリカーゼのｈｓのコドン使用」をもたらす）へと適合させた。ｅＧＦＰを目的の遺伝子としてコードするトランスレプリコンを、指し示す通り、異なる量のレプリカーゼＲＮＡと共に、ＢＨＫ２１細胞へと共リポフェクトした（図５Ｂ）。
目的の遺伝子の発現は、ｅＧＦＰの蛍光を測定すること、すなわち、ｅＧＦＰ陽性細胞の百分率（図５Ｂのバー）を決定し、ｅＧＦＰ陽性細胞の平均値蛍光強度（ＭＦＩ）（図５Ｂの菱形）を決定することにより決定した。
コドン使用の修飾は、レプリカーゼレベル（ｍｙｃでタグづけしたｎｓＰ３のレベル）の増加をもたらすが、これは、ｅＧＦＰをコードするトランスレプリコンからの、目的の遺伝子の発現に有利ではない：コドン最適化ＲＮＡからの、非コドン最適化レプリカーゼＲＮＡと比較してはるかに高度なレプリカーゼの発現は、高ｅＧＦＰ発現として反映されることはなく（図５Ｂの菱形）、トランスレプリコンの生産的な複製を確立する可能性は、ｅＧＦＰ陽性細胞の百分率により示されある通り、小さくなる（図５Ｂのバー）。
実施例５
本発明に従うレプリコンによりコードされる効率的なトランス遺伝子の発現は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいても達成することができる
ＲＮＡトランスレプリコン及びワクシニアウイルスタンパク質Ｅ３をコードするｍＲＮＡと併せた、レプリカーゼをコードするＩＶＴ ＲＮＡを、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）中に再懸濁させ、マウスへと、皮内共注射するか、又は前脛骨筋（筋内）へと共注射した。トランスレプリコンのオープンリーディングフレームは、レポータータンパク質であるルシフェラーゼを、目的のタンパク質としてコードする。
群１つ当たりの動物を３匹ずつとする群２つを使用した。各動物の２つの位置に注射した。ｉｎ ｖｉｖｏにおけるルシフェラーゼの発現は、記載されている通りに測定した（Kuhn等, Gene Ther., 2010, vol. 17, pp. 961-971）。発現は、ＲＮＡの、それぞれ、筋内（ｉ．ｍ．）共注射及び皮内（ｉ．ｄ．）共注射の後における、マウスの生物発光イメージング（ＢＬＩ）により示される通り、少なくとも９日間にわたり持続する。結果を、図６に示す。
実施例６
インフルエンザＨＡを、目的のタンパク質としてコードする、本発明に従うレプリコンを含むトランス複製システムによるワクチン接種は、致死性のウイルス感染からの防御をもたらす
Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、図７に指し示す通り、ヘマグルチニン（ＨＡ）を、目的の遺伝子としてコードするＲＮＡレプリコン（図７では：「Ｒ－ＨＡ」）；又はレプリカーゼをコードするＲＮＡ（図７では：「レプリカーゼ」）、及びヘマグルチニン（ＨＡ）を、目的の遺伝子としてコードするトランスレプリコンＲＮＡ（図７では：「ＴＲ－ＨＡ」）を、３週間以内に、２回にわたり（プライム－ブースト）、皮内ワクチン接種した。適応の場合、翻訳を増強するために、ワクシニアウイルスＥ３をコードするｍＲＮＡを共トランスフェクトした。コントロール動物には、不活化ウイルス（ＩＡＶ）をワクチン接種するか、又は溶媒（ＰＢＳ）を施した。
致死性用量のインフルエンザウイルスによるチャレンジ感染の前日に、全ての動物の血清を回収し、ウイルス中和力価（ＶＮＴ）を決定するのに使用した。基準レプリコン群では、全ての動物は、ＩＡＶで治療された動物の力価に近接するＶＮＴを示す。トランスレプリコン群では、共移入されるレプリカーゼｍＲＮＡが多いほど、ＶＮＴがより大きく増加した。トランスレプリコンに対して、１４倍過剰量のレプリカーゼｍＲＮＡにより、レプリコンコントロールによるＶＮＴと同程度のＶＮＴが達成されたことは、わずかに２０％の、抗原をコードするＲＮＡ（５μｇのＲ－ＨＡと対比した、１μｇのＴＲ－ＨＡ）が、同等なＶＮＴ力価を結果としてもたらしたことを意味する（図７Ａ）。
マウス血清はまた、ヘマグルチニン阻害（ＨＡＩ）アッセイにもかけた。ＲＮＡでワクチン接種された全ての動物は、同等なＨＡＩ力価を示した（図７Ｂ）。
チャレンジ感染後におけるマウスの生存をモニタリングした。緩衝液で治療されたマウスは、５日以内に死んだ。ワクチン接種された全てのマウスは、ＴＲ－ＨＡ及び１５μｇのＥ３でワクチン接種された１匹を、群内の例外として生存した（図７Ｃ）。
まとめると、ＨＡをコードするトランスレプリコンによるワクチン接種は、致死性のウイルス感染からの防御をもたらし、抗原をコードするＲＮＡの量の低減を可能とすることが結論づけられた。
実施例７
キャップの影響
ＢＨＫ２１細胞に、レプリカーゼＯＲＦの上流に、ＩＲＥＳ（ＥＭＣＶ）（脳心筋炎ウイルスに由来する内部リボソーム侵入部位）を伴う、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ２）キャップありのレプリカーゼｍＲＮＡ又はキャップなしのｍＲＮＡと共に、自己切断型ペプチドであるＰ２Ａ（ブタテッショウウイルス１ ２Ａ）により隔てられた、ｅＧＦＰ及びｓｅｃＮＬｕｃ（分泌型ルシフェラーゼ）をコードするトランスレプリコンＲＮＡをエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの２４時間後に、細胞を、ＦＡＣＳにより、ｅＧＦＰ発現について解析し（図８Ａ）、上清を、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により、ｓｅｃＮＬｕｃの分泌レベルについて解析し（図８Ｂ）、レプリカーゼの発現について、ウェスタンブロットにより解析した（図８Ｃ）。
図８Ａで裏付ける通り、キャップありのレプリカーゼｍＲＮＡは、ｅＧＦＰ陽性の百分率（バー）により測定される、トランスレプリコンの複製を確立する大きな可能性と、陽性細胞内の高ｅＧＦＰ発現レベル（菱形）とをもたらす。
差違を定量化するために、分泌型ルシフェラーゼの活性を測定し、いずれのレプリカーゼｍＲＮＡも機能的である（アッセイバックグラウンドは、－１０ＲＬＵである）ことを明らかにしたが、記載されるトランス複製システムは、図８Ｂで裏付ける通り、キャップありのｍＲＮＡを使用する場合に、３７倍強力である。
図８Ｃで裏付ける通り、上記の観察の理由は、試料を、抗ｍｙｃ抗体でプロービングすること（上ブロット）により示される通り、発現を、キャップ（左レーン）により駆動する場合に、ＩＲＥＳ（右レーン）と比較してレプリカーゼタンパク質濃度が高いことである。図８Ａで既に示した通り、抗ｅＧＦＰ抗体による試料のプロービング（中ブロット）は、高ｅＧＦＰ発現を確認した。ゲルへのローディング量が等しいことは、対応する抗体（低ブロット）による、細胞タンパク質であるα－チューブリンの検出により確認する。

Claims (21)

  1. （ａ）アルファウイルスレプリカーゼを発現させるための単離されたｍＲＮＡコンストラクトであって、自己複製が可能ではない、単離されたｍＲＮＡコンストラクト；
    （ｂ）トランスで、レプリカーゼにより複製することができる、単離されたＲＮＡレプリコン；及び
    （ｃ）粒子形成剤
    を含み、
    （ａ）に記載のアルファウイルスレプリカーゼを発現させるための単離されたｍＲＮＡコンストラクトが、レプリカーゼの翻訳を駆動するための５’キャップを含み、且つレプリカーゼの結合について（ｂ）に記載の単離されたＲＮＡレプリコンと競合することがなく、
    （ｂ）に記載の単離されたＲＮＡレプリコンが、
    （１）アルファウイルス５’複製認識配列、
    （２）薬学的に活性のタンパク質又はペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、及び
    （３）アルファウイルス３’複製認識配列、
    を含み、
    アルファウイルス５’複製認識配列及びアルファウイルス３’複製認識配列が、レプリカーゼの存在下で、ＲＮＡレプリコンの複製を導く、
    ＲＮＡ含有粒子。
  2. ５’キャップが、天然の５’キャップ又は５’キャップ類似体である、請求項１に記載のＲＮＡ含有粒子。
  3. アルファウイルスレプリカーゼを発現させるための単離されたｍＲＮＡコンストラクトが、レプリカーゼの翻訳を駆動するための、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを含まない；且つ／又は
    アルファウイルスレプリカーゼを発現させるための単離されたｍＲＮＡコンストラクトが、
    （１）５’ＵＴＲ、
    （２）レプリカーゼをコードするオープンリーディングフレーム、及び
    （３）３’ＵＴＲ
    を含む、
    請求項１又は２に記載のＲＮＡ含有粒子。
  4. ５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲが、レプリカーゼが由来するアルファウイルスに対して非天然である、請求項３に記載のＲＮＡ含有粒子。
  5. アルファウイルスレプリカーゼをコードするオープンリーディングフレームが、ＲＮＡの複製に必要とされる非構造タンパク質のコード領域を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のＲＮＡ含有粒子。
  6. アルファウイルスレプリカーゼを発現させるための単離されたｍＲＮＡコンストラクトが、３’ポリ（Ａ）配列を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のＲＮＡ含有粒子。
  7. アルファウイルス５’複製認識配列及びアルファウイルス３’複製認識配列が、レプリカ－ゼが由来するアルファウイルスに対して天然である、請求項１から６のいずれか一項に記載のＲＮＡ含有粒子。
  8. （ａ）薬学的に活性のタンパク質又はペプチドが、ワクチン接種に適するエピトープを含む、
    （ｂ）薬学的に活性のタンパク質又はペプチドが、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、アレルゲン、又は腫瘍に対する免疫応答を誘発するエピトープを含む、若しくは
    （ｃ）薬学的に活性のタンパク質又はペプチドをコードするオープンリーディングフレームが、レプリカーゼが由来するアルファウイルスに対して非天然である；且つ／又は
    薬学的に活性のタンパク質又はペプチドをコードするオープンリーディングフレームの発現が、サブゲノムプロモーターの制御下にある；且つ／又は
    サブゲノムプロモーターが、アルファウイルスの構造タンパク質のためのプロモーターである、
    請求項１から７のいずれか一項に記載のＲＮＡ含有粒子。
  9. サブゲノムプロモーターが、レプリカーゼが由来するアルファウイルスに対して、天然である、請求項８に記載のＲＮＡ含有粒子。
  10. 単離されたＲＮＡレプリコンが、３’ポリ（Ａ）配列及び／又は５’キャップを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のＲＮＡ含有粒子。
  11. アルファウイルスレプリカーゼを発現させるためのｍＲＮＡコンストラクト、及び／又はＲＮＡレプリコンが、インタクトのアルファウイルス構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含まない、請求項１から１０のいずれか一項に記載のＲＮＡ含有粒子。
  12. アルファウイルスが、セムリキ森林ウイルス又はベネズエラウマ脳炎ウイルス又はシンドビスウイルス又はチクングニヤウイルスである、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＲＮＡ含有粒子。
  13. 薬学的に許容される担体、又は単離されたｍＲＮＡコンストラクト及び単離されたＲＮＡレプリコンの送達に適する薬学的に許容される媒体を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載のＲＮＡ含有粒子。
  14. タンパク質性粒子の形態又は脂質含有粒子の形態である、請求項１から１３のいずれか一項に記載のＲＮＡ含有粒子。
  15. リポプレックス粒子である、請求項１から１４のいずれか一項に記載のＲＮＡ含有粒子。
  16. リポプレックスナノ粒子である、請求項１５に記載のＲＮＡ含有粒子。
  17. カチオン性脂質を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載のＲＮＡ含有粒子。
  18. 粒子形成剤が、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、又はカチオン性若しくはポリカチオン性のペプチド若しくはタンパク質である、請求項１から１７のいずれか一項に記載のＲＮＡ含有粒子。
  19. 粒子形成剤が、プロタミン、ポリエチレンイミン、ポリ－Ｌ－リシン、ポリ－Ｌ－アルギニン、ヒストン、又はカチオン性脂質からなる群から選択される、請求項１から１８のいずれか一項に記載のＲＮＡ含有粒子。
  20. 請求項１から１９のいずれか一項に記載のＲＮＡ含有粒子を含む医薬又はワクチン。
  21. ＲＮＡ含有粒子、医薬、又はワクチンを対象に投与するステップを含む治療における使用のための、請求項１から１９のいずれか一項に記載のＲＮＡ含有粒子又は請求項２０に記載のワクチン。
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