CN109922827B - 致耐受性dna疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于耐受免疫，特别是用于预防和/或延迟例如1型糖尿病的编码胰岛素抗原和细胞因子的质粒。

Description

致耐受性DNA疫苗
技术领域
本发明涉及用于降低抗原特异性T细胞反应性的致耐受性DNA免疫治疗疫苗。
背景技术
根据传统的疫苗方法，将纯化的蛋白质/抗原注射到人/患者/动物体内，以刺激特异性针对该蛋白质/抗原的免疫应答。这种疫苗方法往往主要影响抗体产生，而T细胞往往不会受到显著影响，除了生成抗原的T细胞记忆外。因此，传统的疫苗方法被认为不适合于治疗和/或预防T细胞驱动的疾病，例如1型糖尿病(T1D)，因为T细胞，特别是CD8+ T细胞的激活被认为是该疾病的致病原因。使用致耐受性的、基于蛋白质的疫苗的实验方法主要针对产生抗体的B细胞，而不是疾病相关的T细胞。
与基于蛋白质的疫苗相比，基于DNA的疫苗通常是编码特定抗原的质粒—这些质粒被宿主体内的细胞摄取(“转染”)。然后这些转染的宿主细胞产生抗原，并将该抗原加工成小片段(T细胞表位)以呈递给免疫系统，特别是呈递给循环T细胞。由于T细胞只能检测这些小抗原片段而不能检测完整的蛋白质，因此该方法优先导致T细胞应答的改变，特别是针对CD8+ T细胞(或细胞毒性T细胞)—例如T1D病理学的关键驱动因素。因此，DNA疫苗适合于诱导T细胞应答，而蛋白质疫苗则不适合。虽然目前没有可用于人类的DNA疫苗，但有三种刺激性质粒DNA疫苗被许可用于兽医用途：诱导对马传染性贫血病毒、西尼罗病毒和某些犬癌症的免疫。
与刺激性DNA疫苗相反，致耐受性DNA免疫治疗疫苗旨在抑制针对抗原的免疫反应性，而不是激活针对该抗原的免疫应答。这些疫苗不刺激针对所编码的抗原的免疫，或者不改变刺激的类型(像例如针对变态反应的抗原脱敏接种方法一样)，而是导致自身反应性T细胞的消耗和/或功能缺乏和/或死亡。为了做到这一点，必须将抗原呈递给免疫系统而没有共刺激或炎症效应，否则其将引发刺激性免疫应答。这种呈递会被免疫系统忽视或耐受的抗原的方法在治疗自身免疫性疾病中可能是有价值的，因为将会针对该疾病的特定机制，而不是全身性地抑制整个免疫应答。因此，致耐受性DNA免疫治疗疫苗是调节不希望的免疫应答的温和方法。
T1D特异性致耐受性DNA免疫治疗疫苗的最终目标是保持β细胞功能和内源性胰岛素产生。这可以通过以下手段来发生：预防或延迟疾病(在难以监测并且生活“常态”是主要患者驱动因素的儿童和年轻成人群组中特别有价值)，或延长最小监测和胰岛素使用的“蜜月期”—经常在T1D诊断后的前六个月出现。
虽然已知基于DNA的疫苗是安全的，但是已经在临床研究中测试的(刺激性或致耐受性)DNA疫苗均不具有足够的效力作为治疗例如T1D的独立方法。本领域已知的致耐受性DNA疫苗显示出很低的效能，并且通常需要高度人工系统来诱导所需的效果。因此，本领域需要具有显著增加的效力而不损害安全性概况且最好也不需要不方便的施用方案的致耐受性DNA免疫治疗疫苗。
发明内容
本发明涉及多顺反子载体/质粒，其共表达/编码细胞保留的抗原，如胰岛素，以及分泌的免疫调节物，如TGF-β、IL-10和可选的IL-2。本发明还涉及包含这类质粒的DNA免疫治疗疫苗以及这类药物制剂及其试剂盒。本发明最后涉及这类产品的医药用途以及制备这类质粒的方法。
本文的质粒/DNA免疫治疗疫苗在治疗主要由T细胞驱动的自身免疫性疾病，例如1型糖尿病(T1D)中具有治疗潜力。
在一方面，本发明提供了质粒，其编码：
i.胰岛素抗原；
ii.TGF-β；以及
iii.IL-10。
附图简述
图1.环状质粒图谱。
图2.图1质粒的载体产物的mRNA和翻译的蛋白质图谱。
图3.经由G30针的三次注射传代的质粒剪切稳定性。
图4.通过在30℃下生长(传代1-50，使用17小时孵育；传代51-100，使用22小时孵育)对质粒保留表型的证实。
发明详述
本发明的发明人在此提供了单一载体，其驱动多种分泌细胞因子以及细胞保留的抗原从单一启动子/多顺反子mRNA的表达。
相比于用各自驱动单个组分表达的单独载体/质粒的混合物进行的免疫治疗疫苗接种，用在单个细胞中编码所有治疗组分的单一载体进行的DNA免疫治疗疫苗接种是高度优选的，因为用不同载体随机转染细胞不能保证从给定的特定转染细胞中表达所有组分，乃至任何特定比率的组分。
单个多顺反子质粒/载体的转染导致在转染的细胞周围存在特定工程化的局部环境/微环境。以这种方式，可以将免疫调节物的组合添加至抗原，使得它们增强单个T细胞的所需免疫效果，而不需要高的系统性免疫调节物剂量，这种高剂量可能引起不良事件和广泛的免疫抑制。
用DNA免疫治疗疫苗转染的宿主细胞产生免疫调节物方面的这种局部限制允许安全使用高效的细胞因子激素，这些细胞因子激素对T细胞应答的改变具有协同作用，但不能足够频繁地给药来达到效果，并且/或者被滴定以产生所需的应答，而没有不可接受的不良事件。
例如，已知白细胞介素-10(IL-10)和转化生长因子-β1(TGF-β1)均能够从幼稚CD4+ T细胞诱导调节性T细胞(Treg)。然而，与单独使用这两种细胞因子中的任一种相比，IL-10/TGF-β1组合在诱导Treg方面提供协同效应(有效性为15至20倍)(US6083919A)，并且与单独的任一细胞因子相比，该组合进一步在更广泛的靶细胞群体中导致免疫耐受性(Zeller JC,Panoskaltsis-Mortari A,Murphy WJ等人,1999J Immunol.163(7):3684-91)。
此外，已知白细胞介素-2(IL-2)可以扩充并稳定Treg，但另一方面也可能导致炎性应答。然而，IL-2和IL-10的组合导致抑制性Treg而不是炎性刺激。当循环T细胞遇到用本文DNA免疫治疗疫苗转染的细胞时，它们短暂暴露于次最佳浓度的IL-10和IL-2。循环T细胞略微偏向于耐受，并且如果它们也对共表达的抗原(例如胰岛素)具有反应性，则它们将与转染的细胞结合，从而接受更长时间的免疫调节物暴露，此外它们也会收到针对抑制效果对其进行编程/再训练(re-educate)的另一信号。以这种方式，当那些对编码的抗原具有响应性的T细胞遇到转染的细胞时，它们被选择性地再训练成抑制性表型。
因此，本文的质粒/载体/DNA免疫治疗疫苗被设计用于在抑制疾病的自身免疫部位(例如，在T1D中为胰腺)诱导抗原特异性Treg积累，而不是通过表达的细胞因子激素直接影响疾病。
除了抗原(在T1D的例子中为胰岛素)之外，本文的载体/操纵子/质粒还编码至少两种细胞因子(例如TGF-β1和IL-10)，这两种细胞因子一起协同抑制抗原呈递细胞以及T细胞功能，并驱动Treg的诱导。如果这也与有效暴露于抗原组合发生，则这种效果得到增强。
在一个实施方案中，TGF-β1是对于其功能而言不需要加工或炎性环境的组成型活性形式。虽然Treg可以经由暴露于抗原和TGF-β1从幼稚T细胞产生，但是，Treg是“塑性的”，这意味着它们可以去分化并转化为Th17效应细胞，然后引起更多而不是更少的自身免疫破坏。IL-10与TGF-β1的组合除了是更有效的免疫调节物外，还抑制将会产生致病性Th17细胞而不是Treg的环境。
在一个实施方案中，除抗原、TGF-β1、IL-10外，本文的多顺反子载体还编码IL-2。IL-2扩大Treg数目并稳定其表型(防止Treg细胞去分化为效应T细胞)，从而增加它们在发炎靶组织中的功能寿命。
因此，这三种细胞因子(TGF-β1、IL-10和IL-2)与抗原组合通过以下机制具有众所周知的诱导耐受性的协同效应：(i)显著增强的抗原特异性抑制性Treg的生成，(ii)更长的Treg寿命，以及(iii)每个单独的Treg细胞在抑制炎症/自身反应性方面的更大效能。然而，全身输注的纯化细胞因子的所需浓度将会产生许多严重的、也许甚至致命的副作用，例如：(i)过量TGF-β1引起的致死性纤维化，(ii)流感样症状，(iii)过量IL-2引起的毛细血管渗漏综合征，(iv)导致慢性感染的广泛免疫抑制，(v)增强的肿瘤发展，以及(vi)过量IL-10引起的贫血。
通过从相同载体/质粒共表达这些细胞因子，并因此通过抗原向免疫系统的相同细胞呈递，该载体获得所需的局部环境以供耐受性诱导，而没有高剂量纯化细胞因子施用将会引起的全身作用和相应副作用。
“裸露的”/“裸”质粒/载体DNA(仅载体和缓冲液)的注射具有非常低的摄取和转染率—在约100,000个质粒分子中有不到1个质粒分子转染细胞，而其余的则降解，因此没有任何生物学效应。这种极低的转染效率提供了针对分配和限制转染细胞的安全机制。
通过施用成熟蛋白质或通过高效病毒载体转导来施用全身活性量的任何这类细胞因子不能或难以滴定安全有效的剂量。将总暴露限制为分布在少数高表达微环境中的非常小的全身剂量导致非常有利的安全性和效能概况。
本文中抗原和这三种细胞因子的组合产生了针对T1D发展的有效保护，甚至似乎能够稳定地逆转疾病进展。由于裸DNA质粒/载体注射的低转染效率，很少有细胞产生这些重组蛋白，因此相对于质粒/载体编码的细胞因子没有可检测到的血清细胞因子水平变化—因此没有可检测到的针对除质粒/载体编码的抗原(前胰岛素原)之外的任何其他抗原的免疫刺激或免疫抑制。这导致了期望的安全性概况。
通常，DNA疫苗在皮下(s.c.)注射的情况下表现不佳，因此通常使用肌肉内注射(经常采用电穿孔)或者使用皮内射流注射来施用，后者需要笨重的装置以及重要的维护和校准。由于肌肉内注射的大多数副作用问题是佐剂相关的(注射部位刺激)，因此它们不是本文裸DNA免疫治疗疫苗形式的关注点。另外，注射的体积通常相对较小，因此不会引起显著的肌肉膨胀和疼痛。在一个实施方案中，注射的体积为1ml或更小。在另一个实施方案中，注射的体积约为0.6ml或0.5ml。无论如何，本文提供的多细胞因子质粒/载体出乎意料地似乎提供了针对T1D的保护，即使当通过皮下途径施用时也是如此，从而允许对患者的多种潜在给药形式。
除了提供局部协同作用外，通过用单个质粒/载体和单个启动子编码所有三种或四种翻译产物，经由提供本文的多顺反子质粒进一步简化了调节负担和原料药释放标准。
相反，如果每种蛋白质产物是由单独的质粒产生的，那么从相同转染细胞共表达的协同价值可能会丧失或减少，因为每个质粒/载体转染将会是可能针对不同细胞的独立事件。如果从两个、三个或四个单独的质粒/载体产生三到四种重组蛋白，则转染细胞的局部环境中的任何协同效应可能丧失；此外，因此几个单独的临床试验是必要的(每个质粒和每个组合各一个)。从单个质粒/载体和单个mRNA产生所有蛋白质减少了测试多个单独的分子和确定多质粒/载体形式固有的理想共包装比率的需要。
在此可以使用适合于本发明的任何载体形式，如质粒(复制质粒或被动质粒)、小环、线性载体(MiLV)、病毒载体(整合的[例如慢病毒]和非整合的[例如腺病毒]两者)、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、人类人工染色体(HAC)等。
此外，在此可以使用任何获得准许的转染增强方法：例如，电穿孔、声波穿孔(超声增强，有或没有微泡对比增强)、脂质/聚合物聚集、流体动力学(经由高注射量的压力)、生物弹道学/基因枪(经由压缩气体通过皮肤沉积)等。
在一个实施方案中，在此使用非复制附加型质粒DNA，原因在于：i)来源于单一质粒转染的mRNA的多个拷贝，以及ii)质粒核酸相对于mRNA和其他DNA载体形式的扩大的稳定性和功能。因此，尽管基于mRNA和基于DNA的表达系统都可以提供细胞内递送和共定位，但基于质粒的系统提供了更大的控制和持久的给药。
在一个实施方案中，质粒/载体编码以下四种蛋白质：
i)抗原，
ii)TGF beta 1(TGF-β1)，
iii)白细胞介素-10，以及
iv)白细胞介素-2。
在一个实施方案中，所述抗原是内体靶向的T1D相关抗原，如胰岛素或GAD65。内体靶向可以经由例如Ii/CD74融合、LIMPII/SCARB融合或转铁蛋白受体融合来完成。
在一个实施方案中，TGF-β1是活化形式。
一个质粒/载体可能表达四种蛋白质，例如，如果用A)分开的启动子、B)IRES(内部核糖体进入位点)序列—其募集新的核糖体以翻译每个区段—或C)病毒2A序列(例如FMDV2A或TaV 2A序列)—其被翻译并诱导核糖体暂停/跳跃—分隔所需的序列，这导致从单个开放阅读框产生单独的多肽。然而，在实践中，这些策略中的每一个都很复杂且难以实现。
通过使每个基因具有单独的启动子，最容易实现从单个质粒/载体表达四种独立的蛋白质。然而，这种形式具有明显的缺点，因为它A)由于多个启动子的长度过长而导致非常大的、不稳定且难以产生的质粒，B)导致翻译的蛋白质相对于彼此不可预测的行为(它们不再以彼此固定的比率产生)，C)每个启动子可以独立沉默，从而导致一些基因的选择性表达，而不是完全效能所需的其他基因的选择性表达，以及D)缺乏调节简易性。相反，IRES元件和2A序列在mRNA和翻译水平上起作用，并且可重复地从单个启动子共表达固定比率的每种蛋白质。
四类IRES元件中的每一类对于功能而言具有不同的辅因子要求，并且对于待翻译的下游基因而言具有不同的序列要求。例如，EMCV(心肌膜炎病毒)IRES是630个碱基对的1型IRES，其利用所有真核翻译起始因子，而CrPv(蟋蟀麻痹病毒)IRES是200个碱基对的4型IRES，其不需要辅因子，但利用非标准起始密码子。
当使用来自不同类别的IRES元件时，它们彼此干扰，使得每种类型的IRES元件仅可在每个质粒中使用一次，而当一起使用时，不同类型的IRES元件以难以预测的方式彼此减弱(效能降低)。
此外，改组基因/IRES组合导致翻译产物的不可预测的比率，因为基因与IRES元件的相互作用不是静态的，而是背景依赖性的——取决于侧翼核苷酸序列。此外，IRES元件对起始处或起始后紧接的前几个氨基酸位置施加限制。例如，CrPv IRES要求第一个氨基酸是丙氨酸而不是标准甲硫氨酸，而EMCV IRES不能容忍前三个密码子内有P、W、C、R或K氨基酸。在一个实施方案中，为了适应由EMCV IRES施加的N-末端氨基酸限制，DNA疫苗含有IL-10基因N-末端的三丙氨酸延伸。
此外，每个IRES元件包含相当数目的碱基对，范围从230bp至超过700bp；因此，包含多个IRES元件将质粒/载体的大小和复杂性增大至使得许多质粒/载体变得不稳定并且由于自发缺失和重组而难以在工业上生产的程度。此外，由于IRES元件赋予包含它们的转录mRNA的高度二级结构，IRES元件增加了在转染的细胞中激活病原体识别受体的可能性(Dabo S,Meurs EF.2012Viruses 4(11):2598-635.)以及产生与预期耐受性诱导相反的刺激作用的可能性。
与IRES元件不同，2A序列彼此之间没有相互作用，因此提供稳定且一致的性能。然而，它们自身被翻译，因此影响最终翻译的蛋白质产物的折叠、功能和稳定性。所有2A序列都导致向待分隔序列的5'端上的显著C-末端融合(19-22个氨基酸)，并且还使3'序列开始于脯氨酸。一些蛋白质容许这些修饰，而一些蛋白质不容许，导致对使用2A序列的实际限制。例如，白细胞介素-10产物容许2A尾，但如果在2A标签的上游表达，则白细胞介素-2和TGF-β1均错误折叠并丧失功能。因此，虽然可以表达由2A序列分隔的几种独立的蛋白质，但是其中四种蛋白质中的两种不能终止于2A标签中，因此必须使用其他策略。
由于每种类型的2A氨基酸序列在蛋白质翻译期间改变核糖体功能，因此它将在2A家族的两个核心性质中具有不同的效率，即(i)并列基因产物的分离，以及(ii)通向第二基因产物的持续性(重新起始)。不同的2A序列在生成打断肽骨架(产生两种单独的蛋白质)的核糖体暂停方面具有不同的效率，而且在重新起始第二基因产物的肽合成方面也具有不同的效率。
2A序列分离蛋白质产物和重新起始蛋白质翻译的能力取决于2A氨基酸序列(Donnelly ML,Hughes LE,Luke G等人,2001J Gen Virol.82(Pt5):1027-41)。2A氨基酸序列的小变异导致分离的和融合的侧翼基因产物的明显不同的混合物，范围从低于5％分离的(>95％融合的)到完全分离的(0％融合的或100％分离的)。
此外，本发明人在此发现，编码两种侧翼蛋白质产物的相邻氨基酸序列也影响2A序列的重新起始和分离的效率，从而导致与所报道的结果的显著偏差。因此，重新起始效率根据所用2A氨基酸序列的类型以及相邻氨基酸序列提供的环境而不同，因此2A前基因产物的比率和蛋白质的分离将由所用的2A氨基酸序列及其背景两者决定。
在一个实施方案中，此处在抗原编码序列与TGF-β1编码序列之间插入“FMDV 2A”；从而导致100％分离，以及1:1比率的蛋白质产物。
在另一个实施方案中，此处可以在IL-10编码序列与IL-2编码序列之间插入“TaV2A”；从而导致约50％的单独产物以及10:6比率的蛋白质产物。因此，每个转染的细胞递送相对较低剂量的白细胞介素-2，该剂量不能刺激效应T细胞，并且递送较高剂量的白细胞介素-10以使T细胞偏向于Treg表型。由于融合的IL-10/IL-2的产生是不利的，因此尝试改造提高TaV 2A区段的切割效率。尝试在2A区段之前加上“绝缘子区段”没有改善分离，该绝缘子区段是在TaV 2A上游延伸所翻译的区域以减少上游序列对2A元件的影响的元件。在解决融合问题的不同尝试中，添加具有所翻译的GSG蛋白质序列的上游解偶联区段；然而，这种方法仅导致切割效率的渐进式提高。
因此，用TAV 2A隔离IL-10编码基因和IL-2编码基因所产生的细胞因子融合体可能是免疫原性的。
在进一步的实施方案中，本文的载体/质粒具有“P 2A”区段。用P2A隔离IL-10编码基因和IL-2编码基因导致蛋白质产物的完全分离或接近完全的分离，以及IL-10与IL-2相比至少两倍的比率(或者也许甚至高达四倍或五倍)。
为了克服上述仅IRES和仅2A系统的缺点，本文的四种cDNA序列(抗原、TGF-β1、IL-10、IL-2)在单个IRES之前和之后成对排列。每一对进一步被2A序列隔离，这诱导核糖体跳跃并从多聚蛋白质对中的每个序列产生独立的蛋白质。由于TGF-β1和IL-2可能不在融合体的N端侧，因此其中一个必须终止于中心IRES位点，而另一个必须结束mRNA序列的翻译部分。
因此，此处表达的蛋白质和IRES/2A元件的时间顺序/序列可以如下：(i)抗原，(ii)FMDV 2A，(iii)TGFβ1，(iv)IRES，(v)IL-10，(vi)P 2A，和(vii)IL-2。因此，所有四种蛋白质可以独立地以稳定且可预测的方式从单个操纵子/基因区段表达。由于这些蛋白质中的每一种都是由单个mRNA表达的，因此每种产物的比率是固定的—例如，不可能产生相对于IL-10过量的IL-2。
除了使用IRES和2A元件的组合来分隔编码的基因之外，本文的替代解决方案可以是使用双向启动子来产生2个mRNA—这些mRNA各自编码一对蛋白质，而不是在一个mRNA分子中编码全部四个。因此，可以利用在双向哺乳动物启动子周围适当排列的成对表达盒并利用分隔2A序列和/或IRES元件来构建等同的布置。然而，这种方法存在缺点，主要是由于双向启动子的尺寸大，以及可能增加的在一种医药产品中包含单独的mRNA元件的调节负担。因此，本文优选的实施方案使用单一启动子以及IRES和2A元件的组合，而不是双向启动子。
理论上，一些2A序列可以用细胞内内源蛋白酶敏感序列代替。然而，本发明人在此发现这类蛋白酶具有显著的缺点(例如，缺乏报道的功能，导致融合蛋白产物的分泌)。
为了在质粒编码的细胞因子激素的局部环境内加工抗原并将其呈递给免疫系统，该抗原必须保留在转染的细胞内。在1型糖尿病的情况下，如果要从转染的细胞中分泌或以其他方式释放，则活性胰岛素的产生可能导致不希望的血糖降低。
为了避免抗原分泌，可以从抗原编码序列中除去任何分泌信号，例如从编码前胰岛素原的核酸序列中除去分泌信号编码序列，从而生成胰岛素原而不是前胰岛素原，从而使抗原在转染细胞内积累。虽然这种翻译的抗原产物(例如胰岛素)不会被主动分泌，但是由于CD8+ T细胞的攻击引起的坏死，它可以在裂解过程中释放。另外，胰岛素的信号序列是已知含有疾病相关表位(可能诱导自身免疫)的区域，因此包含信号序列确保了更广泛的耐受性诱导和更高的减轻疾病的可能性。
另外，抗原的细胞质保留仅允许经由蛋白酶体进行加工并通过MHC I类途径进行呈递，该途径经由CD8+ T细胞探测细胞内病原体。由于CD4+ T细胞是促炎细胞因子的重要贡献者，并且大多数(如果不是全部的话)自身免疫抑制性Treg是CD4+，因此将抗原呈递扩展到包括被CD4+ T细胞识别的MHC II类可能是有利的。
MHC II类加工和CD4+ T细胞刺激通常不包括细胞内抗原，因为进入该途径是经由细胞外抗原的胞吞。通常，在转染的细胞内产生的蛋白产物仅经由默认的细胞内/蛋白酶体加工途径和MHC I类来呈递，导致CD8+ T细胞效应，而不产生CD4+ T细胞效应。为了靶向CD4+和CD8+ T细胞两者进行免疫调节，优选的实施方案还包括导致MHC II类呈递的因素。
原则上，为了诱导MHC II类呈递，抗原可以与将融合体引导至内体区室的任何配偶体融合，但在活性和暴露方面存在功能差异。转铁蛋白受体(也称为铁转运蛋白受体)融合体从质膜/细胞外隙向内体循环，因此也可能使其他免疫细胞暴露于全抗原，如B细胞、巨噬细胞等。LimpII/SCARB融合体直接靶向内体，但优先靶向早期内体，有时导致抗原的过度加工和完全破坏。Ii(CD74)融合体，利用MHC II类对于晚期内体定位而使用的相同伴侣信号，在相同的发育阶段将抗原和MHC II类递送至相同的囊泡，并使在MHC II类背景下有效呈递抗原的可能性达到最大。另外，即使从Ii融合体进行内体分选，也必须使前胰岛素原分泌序列失活，否则抗原也会在加工之前分泌和丢失。
已经通过使通过粗面内质网上的SRP(信号识别颗粒)去除分泌标签所需的两个氨基酸发生突变，另外实现了对胰岛素抗原分泌的阻断。Ala(A)至Glu(E)的突变完全消除了前胰岛素原的成熟和分泌，同时保持抗原的所需表位结构以供获得最佳耐受性诱导。
在一个实施方案中，在此使用质粒DNA疫苗。该质粒例如在大肠杆菌(E.coli)中生长/复制，并从培养基中分离/纯化，随后配制成液体制剂，例如，水、盐水、PBS液体制剂，或作为用于皮内射流注射、鼻内施用或吸入的冻干粉末。在一个实施方案中，本文的质粒被配制在任选地包含稳定剂的水性药物制剂中。任何合适的微生物系统可用于质粒生产。
制剂中的稳定剂包括但不限于螯合剂，例如用于清除Mg++和Fe+++—否则它们可能参与DNA的降解—的EDTA、EGTA或DPTA和/或柠檬酸盐—其保护质粒免于非特异性降解效应。在一个实施方案中，本文的质粒可以在等渗PBS或TRIS+柠檬酸盐+EDTA中配制。这类质粒具有稳定、易于生产、使用安全方便的优点。
在另一个实施方案中，对于本发明可以添加递送剂，如病毒、脂质、脂质体、共包装剂等。然而，在此使用递送剂可能具有免疫、病毒整合等潜在问题。
定义
抗原：本文的DNA免疫治疗疫苗编码抗原。本文的抗原可以是可被免疫系统的T细胞组分识别的任何类型的免疫原性疾病相关蛋白质或其片段。例如，在1型糖尿病治疗或预防的情况下，可以使用胰岛素抗原。在一个实例中，该胰岛素抗原是InsB 9-23免疫显性肽。对于本文的多发性硬化DNA免疫治疗疫苗，髓鞘碱性蛋白(MBP)、髓鞘少突神经胶质细胞蛋白(MOG)和/或蛋白脂质蛋白(PLP)抗原可用作抗原。来自脱发、多肌炎/皮肌炎、口炎性腹泻和蛋白质变应原(例如花生蛋白质ara h 2)的代表性抗原的类似蛋白质抗原编码序列也是适合用于本文DNA免疫治疗疫苗的抗原的实例。
抗原靶向：在一个实施方案中，本文的抗原是内体靶向的。本文的抗原包括完整蛋白质、分泌缺陷的前蛋白质或其功能性或免疫显性肽片段。
例如，本文的胰岛素抗原是用于免疫调节疗法的抗原，而不是降葡萄糖剂。因此，不应将其完全加工/成熟或分泌，以确保其在MHC分子上呈递给循环T细胞。因此，本文的DNA免疫治疗疫苗不会导致血液中胰岛素水平增加，而是导致抗原向免疫系统，特别是向T细胞的呈递增加。
因此，本文中的胰岛素抗原可以是小的免疫显性肽编码片段(例如胰岛素B链9-23肽，包括展示出等同的T细胞表位的移位的登记肽(shifted register peptides))、全胰岛素原—其缺乏所需的分泌序列但是在其他方面是完整的—或含有分泌序列但经过修饰以阻止分泌功能的前胰岛素原突变蛋白质。
本文的胰岛素抗原的实例包括：
小鼠胰岛素原(SEQ ID NO 1)：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
人胰岛素原(SEQ ID NO 2)：
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
不分泌的经修饰的小鼠前胰岛素原(与野生型前胰岛素原相比的置换以粗体和下划线显示(SEQ ID NO 3))：
不分泌的经修饰的人前胰岛素原(与野生型前胰岛素原相比的置换以粗体和下划线显示(SEQ ID NO 4))：
小鼠野生型前胰岛素原(SEQ ID NO 5)：
ALWMRLLPLLALLALWGPDPAQAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
人野生型前胰岛素原(SEQ ID NO 6)：
MALWMRLLPLLALLALWGPDPAQAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
胰岛素肽“InsB 9-23”在小鼠与人之间相同：
SHLVEALYLVCGERG(SEQ ID NO 7)
修饰的InsB 9-23(与野生型InsB 9-23相比的置换以粗体和下划线显示(SEQ IDNO 8)和(SEQ ID NO 27))：
因此，本文的胰岛素抗原可以在转染的宿主细胞的胞质溶胶中积累，因此可以经由MHC I类呈递，或者在细胞溶解时释放。
导致MHC II类呈递的内体靶向在此可以经由抗原序列与前导序列的融合来实现，所述序列形成具有以下序列的跨膜区段：细胞质序列，其中Y是酪氨酸，X是任何氨基酸，并且是大体积疏水性氨基酸，如色氨酸或异亮氨酸；“[DE]XXXL[LI]”，其中D和E分别是天冬氨酸或谷氨酸，而L和I分别是亮氨酸和异亮氨酸；或“DXXLL”内体/溶酶体分选信号，它们在以下示例性序列中以下划线表示。因此包含这些信号的靶向或循环至内体/溶酶体的蛋白质结构域包括：转铁蛋白受体、LimpII或CD74，也称为恒定链、MHC II伴侣蛋白或Ii，或任何类似的结构域。
本文内体靶向结构域的实例包括但不限于：
小鼠CD74/恒定链(Ii)内体靶向结构域(SEQ ID NO 9)：
MDDQRDLISNHEQLPILGNRPREPERCSRGALYTGVSVLVALLLAGQATTAYFLYQQQGRLDKLTITSQNLQLESLRMKLP
人CD74/恒定链(Ii)内体靶向结构域(SEQ ID NO 10)：
MHRRRSRSCREDQKPVMDDQRDLISNNEQLPMLGRRPGAPESKCSRGALYTGFSILVTLLLAGQATTAY FLYQQQGRLDKLTITSQNLQLESLRMKLP
1型糖尿病：1型糖尿病(T1D)被认为是一种慢性自身免疫性疾病，其中自身侵袭性T细胞浸润胰腺中的胰岛，并且通过特异性破坏产生胰岛素的β细胞群体发挥重要作用。一旦大量胰岛细胞被破坏，胰岛素量减少或完全没有胰岛素将导致患者的胰岛素缺乏和高血糖症。因此，T1D患者不能产生足够的胰岛素，并且需要在整个生命中定期注射该激素。一些1型糖尿病患者被诊断为患有“1.5型糖尿病”、“潜伏性自身免疫性糖尿病”/LADA、“双重糖尿病”等，这些都是具有1型糖尿病和2型糖尿病两者的症状的糖尿病—因此所有具有1型和2型糖尿病两者的特点的糖尿病也包含在本文的术语“1型糖尿病”中。
致耐受性DNA疫苗：本文的基于DNA的免疫治疗疫苗/载体/质粒被设计用于关闭或下调负责破坏正常健康“自身”细胞的免疫系统部分，从而防止或改善基于T细胞的自身免疫。
如本文所用的术语“DNA免疫治疗疫苗”意指包含DNA分子的化合物或组合物，其施用于受试者以降低所述受试者发生一种或多种疾病的风险。
在一些实施方案中，本文的基于DNA的免疫治疗疫苗是编码特定抗原的质粒/载体。接种疫苗后，这些质粒被宿主体内的抗原呈递细胞摄取，换句话说，被转染到宿主体内的抗原呈递细胞中。然后“转染的”宿主细胞产生抗原并将该抗原的小片段呈递给免疫系统，特别是T细胞。这种方法导致对编码抗原的特异性T细胞应答的改变，以及对其他(非编码的或“无关的”)抗原的免疫应答的最小改变。本文的DNA疫苗质粒/载体通常仅转化极少的宿主细胞，这意味着最终可能少于十万分之一、五十万分之一、甚至少于百万分之一的质粒/载体分子进入宿主细胞。因此，本文的DNA疫苗代表了用于调节T1D患者或有发生T1D的风险的患者中针对抗原如胰岛素的免疫应答的一种非常温和且特异性的方法。
质粒：质粒是作为小的、环状双链DNA分子最常见于细菌中的小DNA分子。人工质粒广泛用作分子克隆中的载体，用于驱动宿主生物体内重组DNA序列的复制。可以将质粒工程化为适合用作免疫治疗DNA疫苗。质粒被认为是复制子，即能够在合适的宿主内自主复制的DNA单元。质粒可以经由三种主要机制—转化、转导和缀合—从一个细菌转移到另一个细菌，这两个细菌可以是相同或不同的细菌种。DNA疫苗质粒可以通过被动转化由宿主细胞摄取—通常以相对较低的速率。本文的质粒在细菌中有效复制—但不驱动蛋白质表达。本文的质粒还在人和其他哺乳动物，例如小鼠中驱动蛋白质表达—但没有质粒复制。在一个实施方案中，pVAX1载体(Invitrogen/LifeTechnologies)在此用作支架，用于插入作为本发明一部分的元件。本文中的其他合适的载体支架包括含有真核启动子元件、原核高拷贝复制起点和用于质粒维持的选择系统的任何载体骨架。
选择基因和选择系统：在一个方面，本文的DNA免疫治疗疫苗包含用于制备目的的选择基因/选择标记物。本文的选择标记物例如是赋予细胞毒素抗性—例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、链霉素等抗生素抗性的基因。
本文中其他类型的合适的选择系统包括例如条件致死性沉默系统(例如CcdA/CcdB或ParD/ParE Hok/Sok型系统)，或补充生产细胞株中的基因组缺陷从而允许原本不能存活的宿主生长的序列(例如dapD-或pyrF-营养缺陷型补充、infA-翻译起始补充等)。
在暴露于毒素/抗生素/条件时，带有包括选择标记物的质粒/DNA疫苗的生产细胞将存活，而那些未能摄取质粒序列的细胞将死亡。因此，在一个实施方案中，本文的DNA疫苗包含编码选择标记物的核酸序列，以便在生产细胞如大肠杆菌中提供更高的产率/纯度以及更有效的生产/复制。
虽然抗生素选择是常见的实验室策略，但是无抗生素的选择系统可能具有一些优点—例如，更有效的调节过程。虽然在此也可以使用不包含诸如小环、合成线性载体等选择机制的载体，但是这些实施方式在生产中存在某些缺点，特别是由于生产和质量控制成本增加。
补充(“拯救”)策略的实例在现有技术中是已知的，然而这些策略具有各种缺点。
代谢补充系统，如dapD[赖氨酸生物合成]或pyrF[尿苷生物合成]系统，在高密度大肠杆菌生产过程中经常导致“互养”，其中含质粒的细菌将产生和分泌过量的所需化合物，从而“放松”对没有该质粒的邻近细菌的选择压力。
本文合适的选择系统的另一个实例是编码必需蛋白质如infA的质粒，其编码蛋白质合成所需的IF1/启动因子1。在该选择系统中，因为不分泌infA蛋白，所以不发生互养。然而，不可能进一步修饰质粒或扩增缺乏质粒的细胞，因为无法外源补充所需的蛋白质/infA(J Bacteriol.1994年1月；176(1):198-205和J Biotechnol.2004年7月1日；111(1):17-30)。
为了规避与infA选择系统相关的缺点，本文提供了一种备选的选择系统，其具有来自单核细胞增生李斯特氏菌的侵入蛋白基因prfA的温度敏感型翻译开关(或“热传感器”)(Cell.2002年9月6日；110(5):551-61)。通过经由标准重组技术将RNA“热传感器”序列的发夹形成部分置于infA的大肠杆菌基因组拷贝的上游，可经由控制发酵温度调节其表达，使无质粒的细胞能够在37℃下缓慢生长，并且在<30℃的温度下发生快速细胞死亡。因此，用表达野生型infA的质粒转化工程化热敏感大肠杆菌生产菌株允许在所有温度下完全正常生长，从而允许在37℃下无质粒扩增并且允许在30℃下严格选择质粒。此外，这种系统不会对野生型大肠杆菌产生用来保留质粒的选择压力，因此在培养8小时内丢失—确保治疗性质粒没有环境持久性。
野生型大肠杆菌infA核苷酸序列(SEQ ID NO 11)：
ATGGCCAAAGAAGACAATATTGAAATGCAAGGTACCGTTCTTGAAACGTTGCCTAATACCATGTTCCGCGTAGAGTTAGAAAACGGTCACGTGGTTACTGCACACATCTCCGGTAAAATGCGCAAAAACTACATCCGCATCCTGACGGGCGACAAAGTGACTGTTGAACTGACCCCGTACGACCTGAGCAAAGGCCGCATTGTCTTCCGTAGTCGCTGA
由infA基因的翻译产生的野生型大肠杆菌IF1蛋白质序列(在prfA融合体中不包含初始甲硫氨酸/M—(SEQ ID NO 12))：
MAKEDNIEMQGTVLETLPNTMFRVELENGHVVTAHISGKMRKNYIRILTGDKVTVELTPYDLSKGRIVFRSR
因此，本文中用于产生DNA免疫治疗疫苗质粒的大肠杆菌生产细胞系可具有以下热敏prfA核苷酸序列：
野生型单核细胞增生李斯特氏菌prfA(“热传感器发夹”)核苷酸序列(SD序列以下划线显示，ATG起始密码子以粗体显示—(SEQ ID NO13))：
TGTAAAAAACATCATTTAGCGTGACTTTCTTTCAACAGCTAACAATTGTTGTTACTGCCTAATGTTTTTAGGGTATTTTAAAAAAGGGCGATAAAAAACGATTGGGGGATGAGAAATGAACGCTCAA
野生型单核细胞增生李斯特氏菌prfA蛋白质序列(在大肠杆菌IF1的上游融合—由SEQ ID NO 13的翻译产生)：
MNAQ
复制起点(“Ori”)：复制起点(也称为复制的起点)是基因组中的特定序列，在该序列处启动DNA链的复制。在一个实施方案中，本文的复制起点位点包括“pUC Ori”，其允许在细菌大肠杆菌生产细胞系中复制，但在哺乳动物宿主细胞，即来自接种疫苗的受试者/人/患者体内的细胞中不复制。本文其他合适的细菌复制起点包括但不限于：R6K、pBR322、ColE1、pMB1、15A、pSC101等。在一方面，本文的复制起点是产生高质粒/生物质比率以供更有效生产的高拷贝形式。本文还可以使用不含复制起点的载体，如小环、合成线性载体等。
启动子：启动子是启动特定基因转录的DNA区域。启动子位于基因的转录起始位点附近，位于DNA的同一条链上和上游，其朝向有义链的5'区。为了进行转录，RNA聚合酶必须附接在基因附近的DNA上。启动子含有为RNA聚合酶和募集RNA聚合酶的转录因子提供安全的初始结合位点的特定DNA序列，如应答元件。转录因子具有附接至特定启动子并调节基因表达的特定激活物或阻抑物序列。因此，启动子代表可以与其他调节区域如增强子、沉默子、边界元件/绝缘子协同工作以指导给定基因的转录水平的关键元件。经典启动子驱动单个信使RNA(mRNA)的产生，而本文的双向启动子驱动紧邻该启动子(在该启动子的上游和下游)的两个mRNA的产生。
在一个实施方案中，在此使用真核启动子。真核启动子不一定遵守一个基因/一个启动子的原则，例如可以有数个病毒启动子以及表现出广泛表达的启动子(即，不具有窄细胞类型特异性，如仅神经元表达)。本文中能够驱动大型多基因mRNA分子广泛转录的启动子的实例包括：病毒CMV立即早期(IE)和SV40启动子；内源性EF1a、PGK1、Ubc和β肌动蛋白启动子；以及合成启动子，如CAG杂合启动子。存在许多其他合适的哺乳动物启动子，并且更多启动子正在通过合成生物学努力来设计。在人类细胞中产生所需表达特征的任何启动子都可在本文的DNA免疫治疗疫苗质粒中使用。
增强子：增强子是提高启动子在产生mRNA转录物方面的效率的DNA元件。本文的增强子可以是相匹配的(例如SV40增强子/CMV启动子)或不相匹配的。在此可使用任何合适的用于真核功能的增强子/启动子组合。
真核翻译起始：真核翻译起始序列通常被称为“Kozak”共有序列。mRNA分子上的Kozak序列被核糖体识别为翻译起始位点，从该位点开始编码蛋白质。真核核糖体需要这种序列或其变体来启动蛋白质翻译。Kozak序列是简并的或可变的，并且很少与共有序列相匹配。事实上，共有Kozak序列通常比从哺乳动物mRNA分离的野生型变体低效。虽然弱Kozak序列通常从天然mRNA中分离并且可能在低丰度蛋白质的翻译控制中起作用，但本文的DNA免疫治疗疫苗优选编码中等或高效率Kozak序列。本文有用的Kozak序列的实例包括以下核苷酸序列：gccRccATGG(SEQ ID NO 14)，其中小写碱基是最常见的核苷酸但可以变化，而大写核苷酸是固定的(R是A或G碱基的IUPAC不确定性代码)，并且ATG表示位置+1的甲硫氨酸密码子的翻译起始位点。
内体分选信号：内体是真核细胞内的膜结合区室。一些蛋白质可以被转运到内体中，并在其中降解成肽片段。这些肽片段可以与内体中存在的MHC分子结合形成MHC/肽复合物，随后可以将其转运至细胞表面以呈递给循环T细胞，特别是CD4+ T细胞。蛋白质向内体的分选是由蛋白质的胞质结构域内存在的信号介导的。内体信号通常是短的线性氨基酸序列。本文的抗原优选使用内体分选信号如[DE]XXXL[LI]或DXXLL内体/溶酶体分选信号靶向内体。内体分选信号包括各种天然存在的或合成的内体分选信号。本文的实例包括存在于Cd74/恒定链/Ii、LimpII/SCARB或转铁蛋白受体上的内体分选信号。可以使用任何药学上可接受的并提供所需功能的内体靶向结构域。这样的内体靶向结构域与抗原的融合在翻译时将它们引导至内体区室以提高效能。除了在MHC I类复合物中的组成型呈递外，抗原的内体分选还提供在MHC II类复合物中的加工以及向免疫系统的呈递，以便更全面和稳定地诱导耐受性和可能的Treg扩增(这无法经由MHC I类/抗原复合物实现)。在一个实施方案中，本文的致耐受性DNA疫苗编码抗原与CD74/恒定链/Ii的融合体，以驱动抗原经由MHC II类的内体靶向和呈递。
内含子：内含子是mRNA内的非编码序列。已知一些内含子显著增加mRNA的翻译和功能。因此，在此也可包含内含子序列。可以使用标准内含子，如β-珠蛋白，或遵循哺乳动物剪接惯例的任何内含子，如MCM7。在一个实施方案中，本文的DNA免疫治疗疫苗载体包含编码一个或多个内含子的序列。在另一个实施方案中，本文的DNA免疫治疗疫苗载体不具有编码内含子的序列。
核糖体暂停标签：对于本发明，在本文的DNA免疫治疗疫苗载体/质粒中的蛋白质编码序列之间包括一个或多个核糖体暂停标签序列以分离蛋白质产物可能是有利的。
一个实例是病毒“FMDV 2A标签”(口蹄疫病毒2A标签)。FMDV2A经翻译的氨基酸序列是APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP-(SEQ ID NO 15)。FMDV 2A标签能够暂停和重启核糖体。FMDV 2A标签之前和之后的翻译产物的比率接近1:1，并且所得蛋白质产物通常是完全分离的。这些类型的核糖体标签先前已经用于共表达两个不同的结构域，例如，重组抗体生产中的重链和轻链。然而，本发明的发明人惊讶地发现，它们可用于多顺反子DNA疫苗，既用于分离侧翼产物又用于由于核糖体重新起始的固有效率而控制表达蛋白质的比率。在此优选在两个应优选以1:1(或接近)比率产生的蛋白质(例如胰岛素抗原和有效细胞因子如TGF-β)编码序列之间插入有利于1:1比率的翻译产物的序列标签。
本文的核糖体暂停标签序列的另一个实例是病毒序列标签“TaV 2A”(明脉扁刺蛾(Thosea asigna)病毒2A—TaV 2A的经翻译的氨基酸序列：RAEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ IDNO 16)。据报道，这种标签之前/上游和之后/下游的翻译产物的比率为(或接近)50:1。本发明的发明人惊讶地发现，虽然这种类型的标签在一种翻译产物相对于另一种翻译产物占绝对主导地位至关重要的情况下可以用来控制表达水平，但侧翼细胞因子产物的分离相对于文献中公开的序列小于50％，且表达比率约为10:6。对于本发明，2A型核糖体暂停标签序列应优选导致由相同载体/质粒编码的两种蛋白质的不同表达水平。在此希望相对于抗炎细胞因子如IL-10有少量多效性细胞因子(如IL-2)表达，而不希望是融合产物。
本文的核糖体暂停标签氨基酸序列的另一个实例是病毒序列“P 2A”(猪捷申病毒-1(Porcine teschovirus-1)2A，ATNFSLLKQAGDVEENPGP-(SEQ ID NO 17))。当在此插入IL-10与IL-2之间时，P 2A序列适当地起作用，导致IL-10与IL-2之间的几乎完全分离，表达比率>5:1。
或者，在此可使用蛋白酶敏感序列，其允许质粒表达的多聚蛋白之间的内源性切割。弗林蛋白酶敏感序列(识别RAKR基序)或羧肽酶敏感序列(识别RRRR、RKRR或RRKR基序)在此可用于分离蛋白质产物。然而，本发明的发明人惊讶地发现，弗林蛋白酶和羧肽酶切割序列在此都不会导致分离的产物—从而导致不需要的IL-10/IL-2融合蛋白的分泌。
TGF-b/β/β1(转化生长因子β/β1)：TGF-β是一种控制大多数细胞的增殖、细胞分化和其他功能的分泌蛋白。TGF-β是一种非常有效的细胞因子，以依赖于背景的方式显著影响细胞命运和表型，例如，取决于同时接收到的其他细胞因子信号。内源性TGF-β以与生产细胞的外膜表面相缔合的潜伏形式产生，并且需要激活(例如被表达CD36和纤维蛋白溶酶蛋白酶的炎性巨噬细胞激活)来进行活性形式的成熟和释放。在一个实施方案中，本文的TGF-β是组成型活性的修饰形式。这通过用不能形成二硫键的氨基酸替换223和225位的半胱氨酸来实现。例如，使用丝氨酸或缬氨酸替换223和225位的半胱氨酸。这导致活性蛋白质结构释放到局部微环境中。
人内源性TGF-β1序列-SEQ ID NO 18：
MPPSGLRLLLLLLPLLWLLVLTPGRPAAGLSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVLALYNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVTRVLMVETHNEIYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLLRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLLAPSDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSAHCSCDSRDNTLQVDINGFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMATPLERAQHLQSSRHRRALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS。
具有组成型活性且被分泌的修饰的人TGF-β1序列(与野生型TGF-β1相比的置换以粗体和下划线表示)—SEQ ID NO 19：
可以使用的另一种修饰的人TGF-β1序列是SEQ ID NO 25：
终止子序列：转录终止子是核酸序列的一部分，其标记基因在转录过程中的末端。转录复合物的释放导致释放出RNA聚合酶和相关的转录机制以开始新mRNA的转录。另外，相同的细胞因子添加了非模板化的“poly-A尾”，这显著增强了mRNA的寿命和功能。本文合适的转录终止子的实例包括“bGH_PA”终止子，CGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG(SEQ ID NO 20)。
在此可以使用任何可接受的终止子序列。变异包括在双向启动子的情况下使用两个不同的侧翼终止子序列，从而产生两个相反方向的mRNA。
在一个实施方案中，本发明的质粒具有如SEQ ID NO 24所示的序列。
在第二个实施方案中，本发明的质粒具有序列SEQ ID NO 26：完全(未注释的)质粒序列
GACTCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCACTGCAGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTAGGTAAGTTAATGAGACAGATAGAAACTGGTCTTGTAGAAACAGAGTAGTCGCCTGCTTTTCTGCCAGGTGCTGACTTCTCTCCCCTGGGCTTTTTTCTTTTTCTCAGGTTGAAAAGAAGAAGACGAAGAAGACGAAGAAGACAAACCGTCGTCGACTGCCATGCGCCGCTGATTAACGCCGCCACCATGGCCCACCGACGCAGATCCAGAAGCTGCCGTGAGGACCAGAAGCCCGTGATGGATGATCAGAGGGACCTTATCTCTAACAATGAACAACTGCCAATGCTCGGCAGACGGCCTGGGGCCCCGGAGAGCAAGTGCAGCAGAGGAGCCTTGTACACGGGGTTCTCCATTTTAGTGACTCTCCTTCTCGCCGGCCAAGCTACCACCGCCTACTTTCTGTACCAACAGCAAGGCAGACTAGACAAACTGACAATCACAAGCCAGAACCTTCAGCTGGAGTCTCTGCGGATGAAGCTGCCCGCTTTGTGGATGAGATTGCTTCCTCTACTTGCTCTCCTGGCGCTCTGGGGACCTGACCCCGAGCAAGAGTTTGTTAATCAGCACCTGTGTGGGAGTCATCTGGTGGAGGCACTCTATTTAGTGTGCGGAGAGAGGGGCTTCTTCTACACTCCAAAGACCAGACGGGAGGCCGAAGACCTTCAAGTGGGGCAAGTAGAACTGGGTGGCGGACCCGGTGCCGGGAGCCTTCAGCCGCTCGCCCTGGAGGGCTCTCTTCAGAAACGCGGCATCGTGGAGCAGTGTTGCACATCCATTTGCTCACTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACGGAAGCGGAGTGAAGCAGACGTTGAATTTTGATTTGTTGAAGTTGGCGGGGGATGTGGAGAGCAATCCGGGGCCGATGCCCCCTAGTGGCCTCAGACTTTTGTTATTGTTATTACCGCTTTTATGGCTCTTGGTGCTGACACCGGGCCGTCCGGCTGCTGGCTTGTCGACTTGTAAGACAATTGATATGGAATTGGTGAAACGAAAACGGATTGAGGCCATCCGAGGACAGATTTTGAGCAAGCTGCGGCTTGCCTCGCCACCCTCGCAAGGGGAAGTCCCACCCGGACCTCTACCAGAAGCAGTCCTAGCGCTGTACAACAGTACAAGAGATAGAGTGGCCGGGGAATCCGCAGAACCAGAGCCTGAGCCTGAAGCCGATTATTATGCAAAGGAAGTGACTAGGGTCCTGATGGTCGAGACCCATAACGAAATCTACGACAAATTCAAACAAAGTACCCACTCTATCTACATGTTCTTCAACACCAGTGAGCTAAGAGAAGCCGTGCCCGAACCTGTGCTTCTTTCCCGCGCAGAACTCCGCCTCTTGAGACTCAAATTGAAAGTTGAACAACACGTAGAGCTTTACCAGAAATACTCTAATAATTCATGGCGATATCTTTCTAATCGTCTCCTCGCCCCATCTGACAGCCCTGAATGGCTCTCCTTCGACGTTACGGGAGTTGTGCGCCAGTGGCTCAGCAGAGGCGGAGAGATAGAGGGCTTTCGGCTGAGCGCACATAGCTCTAGCGACTCAAGGGACAACACATTGCAAGTGGATATTAACGGTTTTACAACTGGACGGAGAGGGGACCTGGCGACCATCCACGGCATGAATAGACCTTTCCTGCTGCTGATGGCTACTCCCCTGGAGAGGGCACAGCACTTACAGTCTTCCAGACACCGGCGCGCCCTGGATACAAACTACTGCTTCAGCTCCACCGAAAAGAACTGTTGCGTGCGGCAGCTGTACATTGACTTCAGAAAGGATCTGGGCTGGAAGTGGATTCATGAGCCCAAGGGGTATCATGCCAACTTCTGTCTTGGGCCATGCCCATACATCTGGTCACTGGATACCCAGTACTCCAAAGTTCTGGCCTTGTACAATCAACACAACCCTGGAGCTTCCGCCGCTCCTTGCTGTGTGCCCCAAGCCCTAGAGCCCCTGCCCATCGTTTATTATGTCGGACGCAAGCCCAAAGTAGAACAGCTATCAAATATGATCGTGAGAAGCTGCAAGTGTAGCTGATAAACGCGTCGAGCATGCATCTAGGGCGGCCAATTCCGCCCCTCTCCCCCCCACCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGTAGACAGCGGAACCCCCCACCTGGCGATAGATGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGATGCACAGCTCAGCACTGCTCTGTTGCCTGGTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCCAGCCCAGGCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACAGCTGCACCCACTTCCCAGGCAACCTGCCTAACATGCTTCGAGATCTCCGAGATGCCTTCAGCAGAGTGAAGACTTTCTTTCAAATGAAGGATCAGCTGGACAACTTGTTGTTAAAGGAGTCCTTGCTGGAGGACTTTAAGGGTTACCTGGGTTGCCAAGCCTTGTCTGAGATGATCCAGTTTTACCTGGAGGAGGTGATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCAGACATCAAGGCGCATGTGAACTCCCTGGGGGAGAACCTGAAGACCCTCAGGCTGAGGCTACGGCGCTGTCATCGATTTCTTCCCTGTGAAAACAAGAGCAAGGCCGTGGAGCAGGTGAAGAATGCCTTTAATAAGCTCCAAGAGAAAGGCATCTACAAAGCCATGAGTGAGTTTGACATCTTCATCAACTACATAGAAGCCTACATGACAATGAAGATACGAAACGGGAGCGGCGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTATGTACAGAATGCAGCTGCTGAGCTGCATCGCCCTGAGCCTGGCCCTGGTGACCAACAGCGCACCCACGTCCTCTAGCACCAAGAAGACCCAGTTACAGTTGGAGCATCTACTTTTAGACCTGCAAATGATTTTGAACGGCATCAACAACTACAAGAATCCTAAACTTACTCGCATGCTTACCTTCAAATTTTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAACTGAAGCACTTGCAATGTCTGGAGGAAGAACTCAAGCCGCTGGAGGAAGTTCTCAACCTCGCGCAGTCCAAGAATTTCCACCTCCGGCCAAGAGACCTGATCAGTAACATTAATGTGATAGTGCTGGAGCTGAAGGGAAGCGAGACTACATTTATGTGCGAGTACGCCGATGAAACCGCTACAATCGTCGAGTTCCTGAATAGATGGATCACATTTTGCCAGTCAATTATCTCTACTCTGACATGATAACTCGAGGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTACTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTCGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGCTCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGGCCAAAGAAGACAATATTGAAATGCAAGGTACCGTTCTTGAAACGTTGCCTAATACCATGTTCCGCGTAGAGTTAGAAAACGGTCACGTGGTTACTGCACACATCTCCGGTAAAATGCGCAAAAACTACATCCGCATCCTGACGGGCGACAAAGTGACTGTTGAACTGACCCCGTACGACCTGAGCAAAGGCCGCATTGTCTTCCGTAGTCGCTGATAAATTATTAACGCTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATAGCACGTGCTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGGCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTT。
在第三个实施方案中，本发明的质粒具有序列SEQ ID NO 28：完全(未注释的)质粒序列
GACTCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTAGGTAAGTTAATGAGACAGATAGAAACTGGTCTTGTAGAAACAGAGTAGTCGCCTGCTTTTCTGCCAGGTGCTGACTTCTCTCCCCTGGGCTTTTTTCTTTTTCTCAGGTTGAAAAGAAGAAGACGAAGAAGACGAAGAAGACAAACCGTCGTCGACTGCCATGCGCCGCTGATTAACGCCGCCACCATGGCCCACCGACGCAGATCCAGAAGCTGCCGTGAGGACCAGAAGCCCGTGATGGATGATCAGAGGGACCTTATCTCTAACAATGAACAACTGCCAATGCTCGGCAGACGGCCTGGGGCCCCGGAGAGCAAGTGCAGCAGAGGAGCCTTGTACACGGGGTTCTCCATTTTAGTGACTCTCCTTCTCGCCGGCCAAGCTACCACCGCCTACTTTCTGTACCAACAGCAAGGCAGACTAGACAAACTGACAATCACAAGCCAGAACCTTCAGCTGGAGTCTCTGCGGATGAAGCTGCCCGCTTTGTGGATGAGATTGCTTCCTCTACTTGCTCTCCTGGCGCTCTGGGGACCTGACCCCGAGCAAGAGTTTGTTAATCAGCACCTGTGTGGGAGTCATCTGGTGGAGGCACTCTATTTAGTGTGCGGAGAGAGGGGCTTCTTCTACACTCCAAAGACCAGACGGGAGGCCGAAGACCTTCAAGTGGGGCAAGTAGAACTGGGTGGCGGACCCGGTGCCGGGAGCCTTCAGCCGCTCGCCCTGGAGGGCTCTCTTCAGAAACGCGGCATCGTGGAGCAGTGTTGCACATCCATTTGCTCACTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACGGAAGCGGAGTGAAGCAGACGTTGAATTTTGATTTGTTGAAGTTGGCGGGGGATGTGGAGAGCAATCCGGGGCCGATGCCCCCTAGTGGCCTCAGACTTTTGTTATTGTTATTACCGCTTTTATGGCTCTTGGTGCTGACACCGGGCCGTCCGGCTGCTGGCTTGTCGACTTGTAAGACAATTGATATGGAATTGGTGAAACGAAAACGGATTGAGGCCATCCGAGGACAGATTTTGAGCAAGCTGCGGCTTGCCTCGCCACCCTCGCAAGGGGAAGTCCCACCCGGACCTCTACCAGAAGCAGTCCTAGCGCTGTACAACAGTACAAGAGATAGAGTGGCCGGGGAATCCGCAGAACCAGAGCCTGAGCCTGAAGCCGATTATTATGCAAAGGAAGTGACTAGGGTCCTGATGGTCGAGACCCATAACGAAATCTACGACAAATTCAAACAAAGTACCCACTCTATCTACATGTTCTTCAACACCAGTGAGCTAAGAGAAGCCGTGCCCGAACCTGTGCTTCTTTCCCGCGCAGAACTCCGCCTCTTGAGACTCAAATTGAAAGTTGAACAACACGTAGAGCTTTACCAGAAATACTCTAATAATTCATGGCGATATCTTTCTAATCGTCTCCTCGCCCCATCTGACAGCCCTGAATGGCTCTCCTTCGACGTTACGGGAGTTGTGCGCCAGTGGCTCAGCAGAGGCGGAGAGATAGAGGGCTTTCGGCTGAGCGCACATAGCTCTAGCGACTCAAGGGACAACACATTGCAAGTGGATATTAACGGTTTTACAACTGGACGGAGAGGGGACCTGGCGACCATCCACGGCATGAATAGACCTTTCCTGCTGCTGATGGCTACTCCCCTGGAGAGGGCACAGCACTTACAGTCTTCCAGACACCGGCGCGCCCTGGATACAAACTACTGCTTCAGCTCCACCGAAAAGAACTGTTGCGTGCGGCAGCTGTACATTGACTTCAGAAAGGATCTGGGCTGGAAGTGGATTCATGAGCCCAAGGGGTATCATGCCAACTTCTGTCTTGGGCCATGCCCATACATCTGGTCACTGGATACCCAGTACTCCAAAGTTCTGGCCTTGTACAATCAACACAACCCTGGAGCTTCCGCCGCTCCTTGCTGTGTGCCCCAAGCCCTAGAGCCCCTGCCCATCGTTTATTATGTCGGACGCAAGCCCAAAGTAGAACAGCTATCAAATATGATCGTGAGAAGCTGCAAGTGTAGCTGATAAACGCGTCGAGCATGCATCTAGGGCGGCCAATTCCGCCCCTCTCCCCCCCACCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGTAGACAGCGGAACCCCCCACCTGGCGATAGATGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGATGCACAGCTCAGCACTGCTCTGTTGCCTGGTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCCAGCCCAGGCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACAGCTGCACCCACTTCCCAGGCAACCTGCCTAACATGCTTCGAGATCTCCGAGATGCCTTCAGCAGAGTGAAGACTTTCTTTCAAATGAAGGATCAGCTGGACAACTTGTTGTTAAAGGAGTCCTTGCTGGAGGACTTTAAGGGTTACCTGGGTTGCCAAGCCTTGTCTGAGATGATCCAGTTTTACCTGGAGGAGGTGATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCAGACATCAAGGCGCATGTGAACTCCCTGGGGGAGAACCTGAAGACCCTCAGGCTGAGGCTACGGCGCTGTCATCGATTTCTTCCCTGTGAAAACAAGAGCAAGGCCGTGGAGCAGGTGAAGAATGCCTTTAATAAGCTCCAAGAGAAAGGCATCTACAAAGCCATGAGTGAGTTTGACATCTTCATCAACTACATAGAAGCCTACATGACAATGAAGATACGAAACGGGAGCGGCGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTATGTACAGAATGCAGCTGCTGAGCTGCATCGCCCTGAGCCTGGCCCTGGTGACCAACAGCGCACCCACGTCCTCTAGCACCAAGAAGACCCAGTTACAGTTGGAGCATCTACTTTTAGACCTGCAAATGATTTTGAACGGCATCAACAACTACAAGAATCCTAAACTTACTCGCATGCTTACCTTCAAATTTTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAACTGAAGCACTTGCAATGTCTGGAGGAAGAACTCAAGCCGCTGGAGGAAGTTCTCAACCTCGCGCAGTCCAAGAATTTCCACCTCCGGCCAAGAGACCTGATCAGTAACATTAATGTGATAGTGCTGGAGCTGAAGGGAAGCGAGACTACATTTATGTGCGAGTACGCCGATGAAACCGCTACAATCGTCGAGTTCCTGAATAGATGGATCACATTTTGCCAGTCAATTATCTCTACTCTGACATGATAACTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTG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在第四个实施方案中，本发明的质粒具有序列SEQ ID NO 29：完全(未注释的)质粒序列
GACTCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTAGGTAAGTTAATGAGACAGATAGAAACTGGTCTTGTAGAAACAGAGTAGTCGCCTGCTTTTCTGCCAGGTGCTGACTTCTCTCCCCTGGGCTTTTTTCTTTTTCTCAGGTTGAAAAGAAGAAGACGAAGAAGACGAAGAAGACAAACCGTCGTCGACTGCCATGCGCCGCTGATTAACGCCGCCACCATGGCCCACCGACGCAGATCCAGAAGCTGCCGTGAGGACCAGAAGCCCGTGATGGATGATCAGAGGGACCTTATCTCTAACAATGAACAACTGCCAATGCTCGGCAGACGGCCTGGGGCCCCGGAGAGCAAGTGCAGCAGAGGAGCCTTGTACACGGGGTTCTCCATTTTAGTGACTCTCCTTCTCGCCGGCCAAGCTACCACCGCCTACTTTCTGTACCAACAGCAAGGCAGACTAGACAAACTGACAATCACAAGCCAGAACCTTCAGCTGGAGTCTCTGCGGATGAAGCTGCCCGCTTTGTGGATGAGATTGCTTCCTCTACTTGCTCTCCTGGCGCTCTGGGGACCTGACCCCGAGCAAGAGTTTGTTAATCAGCACCTGTGTGGGAGTCATCTGGTGGAGGCACTCTATTTAGTGTGCGGAGAGAGGGGCTTCTTCTACACTCCAAAGACCAGACGGGAGGCCGAAGACCTTCAAGTGGGGCAAGTAGAACTGGGTGGCGGACCCGGTGCCGGGAGCCTTCAGCCGCTCGCCCTGGAGGGCTCTCTTCAGAAACGCGGCATCGTGGAGCAGTGTTGCACATCCATTTGCTCACTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACGGAAGCGGAGTGAAGCAGACGTTGAATTTTGATTTGTTGAAGTTGGCGGGGGATGTGGAGAGCAATCCGGGGCCGATGCCCCCTAGTGGCCTCAGACTTTTGTTATTGTTATTACCGCTTTTATGGCTCTTGGTGCTGACACCGGGCCGTCCGGCTGCTGGCTTGTCGACTTGTAAGACAATTGATATGGAATTGGTGAAACGAAAACGGATTGAGGCCATCCGAGGACAGATTTTGAGCAAGCTGCGGCTTGCCTCGCCACCCTCGCAAGGGGAAGTCCCACCCGGACCTCTACCAGAAGCAGTCCTAGCGCTGTACAACAGTACAAGAGATAGAGTGGCCGGGGAATCCGCAGAACCAGAGCCTGAGCCTGAAGCCGATTATTATGCAAAGGAAGTGACTAGGGTCCTGATGGTCGAGACCCATAACGAAATCTACGACAAATTCAAACAAAGTACCCACTCTATCTACATGTTCTTCAACACCAGTGAGCTAAGAGAAGCCGTGCCCGAACCTGTGCTTCTTTCCCGCGCAGAACTCCGCCTCTTGAGACTCAAATTGAAAGTTGAACAACACGTAGAGCTTTACCAGAAATACTCTAATAATTCATGGCGATATCTTTCTAATCGTCTCCTCGCCCCATCTGACAGCCCTGAATGGCTCTCCTTCGACGTTACGGGAGTTGTGCGCCAGTGGCTCAGCAGAGGCGGAGAGATAGAGGGCTTTCGGCTGAGCGCACATAGCTCTAGCGACTCAAGGGACAACACATTGCAAGTGGATATTAACGGTTTTACAACTGGACGGAGAGGGGACCTGGCGACCATCCACGGCATGAATAGACCTTTCCTGCTGCTGATGGCTACTCCCCTGGAGAGGGCACAGCACTTACAGTCTTCCAGACACCGGCGCGCCCTGGATACAAACTACTGCTTCAGCTCCACCGAAAAGAACTGTTGCGTGCGGCAGCTGTACATTGACTTCAGAAAGGATCTGGGCTGGAAGTGGATTCATGAGCCCAAGGGGTATCATGCCAACTTCTGTCTTGGGCCATGCCCATACATCTGGTCACTGGATACCCAGTACTCCAAAGTTCTGGCCTTGTACAATCAACACAACCCTGGAGCTTCCGCCGCTCCTTGCTGTGTGCCCCAAGCCCTAGAGCCCCTGCCCATCGTTTATTATGTCGGACGCAAGCCCAAAGTAGAACAGCTATCAAATATGATCGTGAGAAGCTGCAAGTGTAGCTGATAAACGCGTCGAGCATGCATCTAGGGCGGCCAATTCCGCCCCTCTCCCCCCCACCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGTAGACAGCGGAACCCCCCACCTGGCGATAGATGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGATGCACAGCTCAGCACTGCTCTGTTGCCTGGTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCCAGCCCAGGCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACAGCTGCACCCACTTCCCAGGCAACCTGCCTAACATGCTTCGAGATCTCCGAGATGCCTTCAGCAGAGTGAAGACTTTCTTTCAAATGAAGGATCAGCTGGACAACTTGTTGTTAAAGGAGTCCTTGCTGGAGGACTTTAAGGGTTACCTGGGTTGCCAAGCCTTGTCTGAGATGATCCAGTTTTACCTGGAGGAGGTGATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCAGACATCAAGGCGCATGTGAACTCCCTGGGGGAGAACCTGAAGACCCTCAGGCTGAGGCTACGGCGCTGTCATCGATTTCTTCCCTGTGAAAACAAGAGCAAGGCCGTGGAGCAGGTGAAGAATGCCTTTAATAAGCTCCAAGAGAAAGGCATCTACAAAGCCATGAGTGAGTTTGACATCTTCATCAACTACATAGAAGCCTACATGACAATGAAGATACGAAACGGGAGCGGCGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTATGTACAGAATGCAGCTGCTGAGCTGCATCGCCCTGAGCCTGGCCCTGGTGACCAACAGCGCACCCACGTCCTCTAGCACCAAGAAGACCCAGTTACAGTTGGAGCATCTACTTTTAGACCTGCAAATGATTTTGAACGGCATCAACAACTACAAGAATCCTAAACTTACTCGCATGCTTACCTTCAAATTTTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAACTGAAGCACTTGCAATGTCTGGAGGAAGAACTCAAGCCGCTGGAGGAAGTTCTCAACCTCGCGCAGTCCAAGAATTTCCACCTCCGGCCAAGAGACCTGATCAGTAACATTAATGTGATAGTGCTGGAGCTGAAGGGAAGCGAGACTACATTTATGTGCGAGTACGCCGATGAAACCGCTACAATCGTCGAGTTCCTGAATAGATGGATCACATTTTGCCAGTCAATTATCTCTACTCTGACATGATAACTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTACTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTCGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGCTCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGGCCAAAGAAGACAATATTGAAATGCAAGGTACCGTTCTTGAAACGTTGCCTAATACCATGTTCCGCGTAGAGTTAGAAAACGGTCACGTGGTTACTGCACACATCTCCGGTAAAATGCGCAAAAACTACATCCGCATCCTGACGGGCGACAAAGTGACTGTTGAACTGACCCCGTACGACCTGAGCAAAGGCCGCATTGTCTTCCGTAGTCGCTGATAAATTATTAACGCTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATAGCACGTGCTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGGCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTT
如本文所用的术语“GLP-1/GLP-1肽/GLP-1R激动剂肽”是指本文的GLP-1分子/肽/蛋白质/变体/激动剂，它们是具有GLP-1R激动剂功能的分子，这意味着它们是GLP-1受体的激动剂。这类药物通常用于治疗糖尿病，特别是2型糖尿病。成熟“人GLP-1”的氨基酸序列是：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG(SEQ ID NO:21)。
如本文所用的术语“GLP-1类似物”是指作为GLP-1(SEQ ID NO:15)的变体的肽或化合物。术语“GLP-1类似物”和“类似物”在本文中可互换使用。
GLP-1类似物可参照以下两方面来描述：i)人GLP-1(SEQ ID NO:15)中与经修饰的氨基酸残基相对应的氨基酸残基的编号(即GLP-1(SEQ ID NO:1)中的相应位置)，和ii)实际修饰。
术语GLP-1衍生物是指GLP-1类似物的衍生物。如本文在GLP-1类似物的语境中所使用的术语“衍生物”意指经化学修饰的GLP-1类似物，其中一个或多个取代基已共价连接至GLP-1类似物。如本文所用的术语“取代基”是指与GLP-1蛋白质/激动剂/类似物缀合的化学部分或基团/侧基。该衍生物可包含一个或多个选自酰胺、碳水化合物、烷基基团、酰基基团、酯等的修饰。
在一些实施方案中，所述取代基经由所述多肽中例如选自位置22、23、27、34、35和36的一个氨基酸位置处的氨基酸残基共价连接。
在一些实施方案中，所述GLP-1衍生物包含含有亲脂性部分的取代基。如本文所用的术语“亲脂性部分”意指具有多于6个且少于30个碳原子的脂肪族烃或环状烃部分，其中所述烃部分可包含额外的取代基。
GLP-1激动剂的实例包括(但不限于)艾塞那肽(exenatide)、利拉鲁肽(liraglutide)、利西拉肽(lixisentide)、阿比鲁肽(albiglutide)、度拉糖肽(dulaglutide)、他司鲁肽(taspoglutide)和司美鲁肽(semaglutide)。在治疗例如新近发作的T1D患者时，使用本文质粒的DNA免疫治疗疫苗最初可以与平行的GLP-1R激动剂治疗相组合。GLP-1共同施用可以是长期的或暂时的，并且除肠胃外途径以外还包括口服途径。
利拉鲁肽：(SEQ ID NO 22)：
司美鲁肽(SEQ ID NO:23)：
本文的药物组合物优选是水性制剂，其包含至少50％的水，更优选至少60％的水，更优选至少75％的水，更优选至少90％的水，更优选至少95％的水，并且最优选至少99％的水。或者，本文的药物组合物可以是干燥制剂，如用于重建、吸入、鼻内滴注、皮内给药的冻干制剂等。
本文的药物制剂优选地在不使用增强转化的方法如电穿孔的情况下施用。在一个实施方案中，药物制剂用于肠胃外给药，例如，皮下给药、皮内给药、静脉内给药、肌肉内给药等。在另一个实施方案中，本文的药物组合物还可以局部、口服、直肠施用或通过吸入施用。
本文的药物组合物优选地不添加任何缩合剂或可引起局部反应的其他赋形剂。本文的制剂优选地含有自由基清除剂(例如1％乙醇)和/或螯合剂，例如二价阳离子清除剂(例如EDTA[CAS#60-00-4]、EGTA[CAS#67-42-5]或DPTA[CAS#67-43-6])，以增强水性质粒DNA的稳定性。此外，本文的药物组合物可以是盐水溶液和/或缓冲溶液的形式，或包含盐水溶液并且/或者包含缓冲溶液(例如PBS-磷酸盐缓冲盐水、TRIS缓冲液或等效的药学上可接受的缓冲液)。本文的药物制剂优选地不含任何佐剂以及其它典型的疫苗成分，例如氢氧化铝、苯酚、山梨糖醇、硅酮(silicone)等。
施用：本文的DNA免疫治疗疫苗可以施用于T1D患者或具有发生T1D的风险的患者。该疫苗可以例如每天一次、每隔一天一次、每周两次、每周一次、每月两次、每月一次、每两个月一次、每年四次或每年一次施用—频率可根据一般需求或个体需求来调整。本文的免疫治疗可以是长期的。治疗的持续时间可以是例如一个月、两个月、三个月、六个月、一年、两年、三年、五年、六年、七年、八年、九年或十年。
实施方案
以下实施方案说明了本发明，并且不应以任何限制方式来理解。应当理解，所有实施方案均可以以所有可能的方式组合。
1.质粒，其编码：
i.抗原；
ii.TGF-β；以及
iii.IL-10。
2.根据实施方案1的质粒，其中所述抗原是胰岛素抗原。
3.质粒，其(优选从单个操纵子)共表达/编码：(i)抗原，例如胰岛素抗原；(ii)TGF-β/TGF-β1(如组成型活性形式)；以及(iii)IL-10。
4.根据前述实施方案中任一项的质粒，其中所述胰岛素抗原选自：胰岛素原、不能分泌的前胰岛素原或其功能性或免疫显性肽片段。
5.根据前述实施方案中任一项的质粒，其中所述胰岛素抗原选自：胰岛素原、前胰岛素原及其功能性或免疫显性肽片段。
6.根据前述实施方案中任一项的质粒，其中所述胰岛素抗原为内体靶向的胰岛素。
7.根据前述实施方案中任一项的质粒，其中所述质粒以约1:1的比率表达胰岛素抗原和TGF-β。
8.根据前述实施方案中任一项的质粒，其中所述质粒以比IL-10低至少199/200的量表达胰岛素抗原和TGF-β。
9.根据前述实施方案中任一项的质粒，其中所述质粒以比IL-10低至少1/2的量表达胰岛素抗原和TGF-β。
10.根据前述实施方案中任一项的质粒，其中所述质粒进一步共表达白细胞介素-2(IL-2)。
11.根据前述实施方案中任一项的质粒，其中所述质粒表达相对于抗原(例如胰岛素)和TGF-β过量的IL-10和IL-2。
12.根据前述实施方案中任一项的质粒，其中所述质粒表达的IL-10和IL-2是表达的TGF-β和胰岛素抗原的至少约一倍、两倍、五倍或至少约一百倍(IL-10+IL-2与胰岛素+TGF-β的比率可以是至少1:1或2:1或5:1或100:1)。
13.根据前述实施方案中任一项的质粒，其中所述质粒表达的IL-10和IL-2是表达的TGF-β和胰岛素抗原的至少约一百倍、两百倍、五百倍或至少约一千倍(IL-10+IL-2与胰岛素+TGF-β的比率可以是至少100:1或200:1或500:1或1000:1)。
14.根据前述实施方案中任一项的质粒，其中所述质粒以约1:1–100:1，如1:1-50:1，如1:1-25:1，如1:1-10:1，或者1:1–5:1，或者1:1–3:1，或者1:1–2:1的比率表达IL-10和IL-2。或者，表达的IL-10与表达的IL-2之间的比率可以是约1:1、1:0.9、1:0.8、1:0.7、1:0.6、1:0.5、1:0.4、1:0.3、1:0.2或1:0.1。
15.根据前述实施方案中任一项的质粒，其中所述质粒包含：(i)分隔胰岛素抗原编码序列和TGF-β编码序列的FMDV 2A元件，(ii)分隔TGF-β编码序列和IL-10编码序列的EMCV IRES元件，以及(iii)分隔IL-10编码序列和IL-2编码序列的2A元件。
16.根据前述实施方案中任一项的质粒，其中所述质粒包含：
(i)分隔胰岛素抗原编码序列和TGF-β编码序列的2A元件(如FMDV 2A或P 2A元件)，
(ii)分隔TGF-β编码序列和IL-10编码序列的EMCV IRES元件(或者双向启动子)(优选地，紧临IL-10基因的N端编码三个丙氨酸氨基酸)，以及
(iii)分隔IL-10编码序列和IL-2编码序列的2A元件(如P 2A元件)。
17.根据前述实施方案中任一项的质粒，其中所述TGF-β编码序列编码组成型活性TGF-β，优选组成型活性人TGF-β1。
18.根据前述实施方案中任一项的质粒，其中所述质粒包含：(i)内体靶向的前胰岛素原编码序列，(ii)FMDV 2A元件，(iii)TGF-β编码序列，(iv)EMCV IRES元件，(v)IL-10编码序列，(vi)P 2A元件，(vii)IL-2编码序列，(viii)聚腺苷酸化/终止元件，(ix)选择基因，(x)复制起点，(xi)真核启动子元件，(xii)真核翻译起始序列，(xiii)内体分选序列，以及(xiv)可选的内含子。
19.根据前述实施方案中任一项的质粒，其中所述质粒包含以下元件：
(i)启动子(如CMV IE启动子)，
(ii)内含子(位于非编码前导序列内)，以及
(iii)真核翻译起始序列(如Kozak元件)，
(iv)内体靶向的抗原编码序列(如内体靶向的人分泌缺陷前胰岛素原编码序列)，
(v)优选地分隔抗原编码序列和TGF-β编码序列的FMDV 2A元件，
(vi)TGF-β编码序列(如组成型活性人TGF-β编码序列，优选组成型活性人TGF-β1编码序列)，
(vii)EMCV IRES元件(或者双向真核启动子)，其中所述EMCV IRES元件分隔TGF-β编码序列和IL-10编码序列，
(viii)IL-10编码序列(如在N-末端添加三个丙氨酸氨基酸的人IL-10编码序列)，
(ix)2A元件，如P 2A元件，其中所述2A元件分隔IL-10编码序列和IL-2编码序列，
(x)IL-2编码序列(如人IL-2编码序列)，
(xi)终止元件(如bGH_PA终止元件)，
(xii)选择基因(如卡那霉素编码序列或野生型infA编码序列)，
(xiii)复制起点(如原核复制起点，例如pUC ori)。
20.根据实施方案18的质粒，其中元件(i)-(xiii)按表达顺序排列。
21.根据前述实施方案中任一项的质粒，其中所述质粒的DNA序列如SEQ ID NO 24所示，或基本上如SEQ ID NO 24所示。
22.根据实施方案21的质粒，其中对本文的SEQ ID NO 24进行一些微小修饰，这些修饰导致例如在一种或多种抗原和/或细胞因子中有一个、两个、三个或四个氨基酸置换。
23.根据实施方案1-20中任一项的质粒，其中所述质粒的DNA序列如以下序列所示：SEQ ID NO:26，或导致例如在一种或多种抗原和/或细胞因子中有一个、两个、三个或四个氨基酸置换的SEQ ID NO:26的修饰，或导致与SEQ ID NO:26相比表达相同多肽序列的SEQ ID NO:26的修饰。
24.根据实施方案1-20中任一项的质粒，其中所述质粒的DNA序列如以下序列所示：SEQ ID NO:26，或具有少于100个与SEQ ID NO:26不同的碱基的SEQ ID NO:26的修饰。
25.根据实施方案1-20中任一项的质粒，其中所述质粒的DNA序列如以下序列所示：SEQ ID NO:28，或导致例如在一种或多种抗原和/或细胞因子中有一个、两个、三个或四个氨基酸置换的SEQ ID NO:28的修饰，或导致与SEQ ID NO:28相比表达相同多肽序列的SEQ ID NO:28的修饰。
26.根据实施方案1-20中任一项的质粒，其中所述质粒的DNA序列如以下序列所示：SEQ ID NO:28，或具有少于100个与SEQ ID NO:28不同的碱基的SEQ ID NO:28的修饰。
27.根据实施方案1-20中任一项的质粒，其中所述质粒的DNA序列如以下序列所示：SEQ ID NO:29，或导致例如在一种或多种抗原和/或细胞因子中有一个、两个、三个或四个氨基酸置换的SEQ ID NO:29的修饰，或导致与SEQ ID NO:29相比表达相同多肽序列的SEQ ID NO:29的修饰。
28.根据实施方案1-20中任一项的质粒，其中所述质粒的DNA序列如以下序列所示：SEQ ID NO:29，或具有少于100个与SEQ ID NO:29不同的碱基的SEQ ID NO:29的修饰。
29.根据实施方案1-20中任一项的质粒，其中所述质粒包含TGF-β基因，该TGF-β基因包含SEQ ID NO:25或具有少于10个碱基置换的SEQ ID NO:25。
30.根据前述实施方案中任一项的质粒，其用于延迟或预防I型糖尿病。
31.根据前述实施方案中任一项的质粒，其用于肌肉内、皮内、鼻内或皮下施用。
32.根据实施方案31的质粒，其用于皮下施用。
33.根据实施方案31的质粒，其用于肌肉内注射。
34.根据前述实施方案中任一项的质粒，其用于治疗受试者的医学状况，例如I型糖尿病、早发型I型糖尿病或增加的发生I型糖尿病(包括1.5型糖尿病类型的病况)的风险。
35.DNA免疫治疗疫苗，其包含根据前述实施方案中任一项的质粒。
36.根据实施方案35的DNA免疫治疗疫苗，其用于延迟或预防I型糖尿病。
37.根据实施方案35-36中任一项的DNA免疫治疗疫苗，其用于肌肉内、皮内、鼻内或皮下施用。
38.根据实施方案37的DNA免疫治疗疫苗，其用于皮下施用。
39.根据实施方案37的DNA免疫治疗疫苗，其用于肌肉内施用。
40.根据实施方案35-39中任一项的DNA免疫治疗疫苗，其与其他类型的医学治疗，例如β细胞/β干细胞疗法、β细胞/β干细胞移植等联合或并行使用，以延长移植细胞的存活和效能。
41.药物组合物，其包含根据实施方案34-39中任一项的DNA免疫治疗疫苗，或根据实施方案1-34中任一项的质粒，其中所述药物组合物包含盐水溶液和/或缓冲液和/或螯合剂。
42.药物组合物，其包含根据实施方案35-40中任一项的DNA免疫治疗疫苗，或根据实施方案1-34中任一项的质粒，其中所述药物组合物包含盐水溶液和/或缓冲液和/或螯合剂和/或乙醇。
43.根据实施方案41-42中任一项的药物组合物，其中乙醇的体积/体积百分比小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％。
44.根据实施方案41-43中任一项的药物组合物，其中所述组合物不包含任何病毒、脂质共包装剂或缩合剂。
45.根据实施方案41-44中任一项的药物组合物，其中所述组合物进一步包含GLP-1R激动剂。
46.根据实施方案41-44中任一项的药物组合物，其中所述组合物进一步包含GLP-1类似物/GLP-1R激动剂。
47.根据实施方案45-46中任一项的药物组合物，其中所述GLP-1类似物或所述GLP-1R激动剂选自利拉鲁肽、司美鲁肽或其混合物。
48.试剂盒，其包含根据实施方案41-47中任一项的药物组合物和包含GLP-1类似物/GLP-1R激动剂(例如利拉鲁肽和/或司美鲁肽)的药物组合物。
49.产生根据实施方案1-34中任一项的质粒的方法，其中所述方法包括(i)在合适的条件下孵育用所述质粒转染的宿主细胞，如细菌来源的宿主细胞，例如大肠杆菌，以及(ii)回收/纯化所述质粒。
50.根据实施方案49的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌infA热敏性菌株。
51.在有发生1型糖尿病(T1D)的风险或新近诊断为T1D的患者中延迟T1D或其症状发作的方法，所述方法包括施用包含根据实施方案1-31中任一项的质粒的DNA免疫治疗疫苗，任选地联合施用GLP-1类似物/GLP-1R激动剂。
52.在个体中保持β细胞功能和/或内源性胰岛素产生的方法，所述方法包括施用包含根据实施方案1-34中任一项的质粒的DNA免疫治疗疫苗，任选地联合施用GLP-1类似物/GLP-1R激动剂。
53.治疗糖尿病个体的方法，其包括施用包含根据实施方案1-34中任一项的质粒的疫苗，任选地联合施用GLP-1类似物/GLP-1R激动剂(例如利拉鲁肽和/或司美鲁肽)。
54.用于在有发生1型糖尿病(T1D)的风险或新近诊断为T1D的患者中预防或延迟T1D症状发作的疫苗，所述疫苗包含根据实施方案1-34中任一项的质粒。
55.降低患有1型糖尿病(T1D)的个体或具有发生T1D的风险的人中的胰岛素剂量的方法，所述方法包括施用包含根据实施方案1-33中任一项的质粒的DNA免疫治疗疫苗，任选地联合施用GLP-1类似物/GLP-1R激动剂(例如利拉鲁肽和/或司美鲁肽)。
实施例
非肥胖糖尿病小鼠(1型糖尿病的NOD小鼠模型)：自身免疫中的免疫功能依赖于在体外无法被充分评价的细胞相互作用的复杂网络。
本文的疾病抑制和/或治疗评价在NOD小鼠模型中进行，这种模型是多基因自发发作模型，其中大多数小鼠在12到30周龄之间产生升高的血糖浓度(BGV，血糖值，由尾静脉针刺和手持式仪表来测定)。疾病的发生率和进展是不可预测的，30周龄(WoA)时的总发病率为60％至95％，从诊断(两次连续的BGV读数>250)到终止(两次连续的BGV读数为600或更高)的进展为2天到4周不等。在连续的读数上重复显示的BGV升高是必要的，因为允许小鼠随意获取食物和水，这导致中等BGV变异性超过免疫病理学引起的变异性。
本文的质粒核苷酸序列的一个实例：
SEQ ID NO 24：完全(未注释的)质粒序列(6,401个碱基对)
GACTCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCACTGCAGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTAGGTAAGTTAATGAGACAGATAGAAACTGGTCTTGTAGAAACAGAGTAGTCGCCTGCTTTTCTGCCAGGTGCTGACTTCTCTCCCCTGGGCTTTTTTCTTTTTCTCAGGTTGAAAAGAAGAAGACGAAGAAGACGAAGAAGACAAACCGTCGTCGACTGCCATGCGCCGCTGATTAACGCCGCCACCATGGCCCACCGACGCAGATCCAGAAGCTGCCGTGAGGACCAGAAGCCCGTGATGGATGATCAGAGGGACCTTATCTCTAACAATGAACAACTGCCAATGCTCGGCAGACGGCCTGGGGCCCCGGAGAGCAAGTGCAGCAGAGGAGCCTTGTACACGGGGTTCTCCATTTTAGTGACTCTCCTTCTCGCCGGCCAAGCTACCACCGCCTACTTTCTGTACCAACAGCAAGGCAGACTAGACAAACTGACAATCACAAGCCAGAACCTTCAGCTGGAGTCTCTGCGGATGAAGCTGCCCGCTTTGTGGATGAGATTGCTTCCTCTACTTGCTCTCCTGGCGCTCTGGGGACCTGACCCCGAGCAAGAGTTTGTTAATCAGCACCTGTGTGGGAGTCATCTGGTGGAGGCACTCTATTTAGTGTGCGGAGAGAGGGGCTTCTTCTACACTCCAAAGACCAGACGGGAGGCCGAAGACCTTCAAGTGGGGCAAGTAGAACTGGGTGGCGGACCCGGTGCCGGGAGCCTTCAGCCGCTCGCCCTGGAGGGCTCTCTTCAGAAACGCGGCATCGTGGAGCAGTGTTGCACATCCATTTGCTCACTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACGGAAGCGGAGTGAAGCAGACGTTGAATTTTGATTTGTTGAAGTTGGCGGGGGATGTGGAGAGCAATCCGGGGCCGATGCCCCCTAGTGGCCTCAGACTTTTGTTATTGTTATTACCGCTTTTATGGCTCTTGGTGCTGACACCGGGCCGTCCGGCTGCTGGCTTGTCGACTTGTAAGACAATTGATATGGAATTGGTGAAACGAAAACGGATTGAGGCCATCCGAGGACAGATTTTGAGCAAGCTGCGGCTTGCCTCGCCACCCTCGCAAGGGGAAGTCCCACCCGGACCTCTACCAGAAGCAGTCCTAGCGCTGTACAACAGTACAAGAGATAGAGTGGCCGGGGAATCCGCAGAACCAGAGCCTGAGCCTGAAGCCGATTATTATGCAAAGGAAGTGACTAGGGTCCTGATGGTCGAGACCCATAACGAAATCTACGACAAATTCAAACAAAGTACCCACTCTATCTACATGTTCTTCAACACCAGTGAGCTAAGAGAAGCCGTGCCCGAACCTGTGCTTCTTTCCCGCGCAGAACTCCGCCTCTTGAGACTCAAATTGAAAGTTGAACAACACGTAGAGCTTTACCAGAAATACTCTAATAATTCATGGCGATATCTTTCTAATCGTCTCCTCGCCCCATCTGACAGCCCTGAATGGCTCTCCTTCGACGTTACGGGAGTTGTGCGCCAGTGGCTCAGCAGAGGCGGAGAGATAGAGGGCTTTCGGCTGAGCGCACATGTATCTGTGGACTCAAGGGACAACACATTGCAAGTGGATATTAACGGTTTTACAACTGGACGGAGAGGGGACCTGGCGACCATCCACGGCATGAATAGACCTTTCCTGCTGCTGATGGCTACTCCCCTGGAGAGGGCACAGCACTTACAGTCTTCCAGACACCGGCGCGCCCTGGATACAAACTACTGCTTCAGCTCCACCGAAAAGAACTGTTGCGTGCGGCAGCTGTACATTGACTTCAGAAAGGATCTGGGCTGGAAGTGGATTCATGAGCCCAAGGGGTATCATGCCAACTTCTGTCTTGGGCCATGCCCATACATCTGGTCACTGGATACCCAGTACTCCAAAGTTCTGGCCTTGTACAATCAACACAACCCTGGAGCTTCCGCCGCTCCTTGCTGTGTGCCCCAAGCCCTAGAGCCCCTGCCCATCGTTTATTATGTCGGACGCAAGCCCAAAGTAGAACAGCTATCAAATATGATCGTGAGAAGCTGCAAGTGTAGCTGATAAACGCGTCGAGCATGCATCTAGGGCGGCCAATTCCGCCCCTCTCCCCCCCACCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGTAGACAGCGGAACCCCCCACCTGGCGATAGATGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCTGCCGCTCATTCTAGTGCCCTTCTTTGCTGCCTGGTCCTGCTCACCGGGGTGCGAGCTAGCCCTGGACAAGGGACACAATCCGAAAACTCGTGCACCCACTTCCCGGGCAACCTCCCTAACATGCTGAGGGACCTCCGTGATGCCTTCAGTAGAGTGAAGACGTTCTTCCAAATGAAAGATCAGTTAGATAACCTGCTCCTGAAGGAGTCACTCTTAGAAGACTTCAAAGGATACCTCGGCTGCCAAGCACTTAGCGAGATGATTCAATTCTACTTAGAAGAAGTCATGCCTCAAGCTGAGAATCAAGACCCCGACATCAAAGCTCATGTGAATTCTTTGGGAGAAAATTTGAAGACTTTGCGGCTGCGGCTGCGGAGATGTCACCGCTTTCTGCCCTGTGAGAACAAATCAAAAGCGGTCGAGCAAGTTAAGAATGCCTTCAATAAGCTACAAGAGAAGGGCATCTACAAAGCAATGAGCGAGTTTGATATCTTTATCAATTACATTGAAGCCTACATGACAATGAAGATTAGGAATGCCGCGGGGAGCGGCGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTATGTACAGAATGCAGCTGCTGAGCTGCATCGCCCTGAGCCTGGCCCTGGTGACCAACAGCGCACCCACGTCCTCTAGCACCAAGAAGACCCAGTTACAGTTGGAGCATCTACTTTTAGACCTGCAAATGATTTTGAACGGCATCAACAACTACAAGAATCCTAAACTTACTCGCATGCTTACCTTCAAATTTTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAACTGAAGCACTTGCAATGTCTGGAGGAAGAACTCAAGCCGCTGGAGGAAGTTCTCAACCTCGCGCAGTCCAAGAATTTCCACCTCCGGCCAAGAGACCTGATCAGTAACATTAATGTGATAGTGCTGGAGCTGAAGGGAAGCGAGACTACATTTATGTGCGAGTACGCCGATGAAACCGCTACAATCGTCGAGTTCCTGAATAGATGGATCACATTTTGCCAGTCAATTATCTCTACTCTGACATGATAACTCGAGGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTACTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTCGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGCTCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGGCCAAAGAAGACAATATTGAAATGCAAGGTACCGTTCTTGAAACGTTGCCTAATACCATGTTCCGCGTAGAGTTAGAAAACGGTCACGTGGTTACTGCACACATCTCCGGTAAAATGCGCAAAAACTACATCCGCATCCTGACGGGCGACAAAGTGACTGTTGAACTGACCCCGTACGACCTGAGCAAAGGCCGCATTGTCTTCCGTAGTCGCTGATAAATTATTAACGCTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATAGCACGTGCTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGGCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTT
实施例1—与抗原+IL-10编码质粒相比的抗原编码质粒：
现有技术中已经提示，对于T1D的有效DNA免疫治疗治疗，需要耗尽质粒骨架中的免疫刺激性CpG序列。因此，该实验效仿先前发表的实验(2008J Immunol.181(12):8298-307)。
NOD小鼠从第9周(周龄)开始每周一次共给予8个剂量的质粒：以等摩尔比率给予空载体(pVAX1，50μg)，或pVAX1-胰岛素原Ag(非内体靶向的，不是前胰岛素原)，或CpG耗尽的pVAX1-胰岛素原Ag，或双顺反子构建体pVAX1-IL10-IRES-胰岛素原Ag。
所有施用均在异氟烷麻醉下在左股四头肌中肌肉内进行，并且在PBS+DTA中仅含有质粒。每周在所有小鼠中评估BGV，并且基于超过250mg/dl的两个BGV读数对1型糖尿病的发生率进行评分。评价小鼠直至30周龄或达到600的BGV，然后处死。
该实验的结果(表1)表明：A)CpG耗尽对于效能既不是必需的也不是有益的，B)免疫调节性细胞因子的包含显著增加效能，以及C)质粒骨架(空载体)等同于未处理组。
表1：NOD小鼠在30周龄时的T1D发生率
实施例2—由编码抗原、IL-10、IL-2和TGF-β的质粒产生的表达的蛋白质产物
创建多顺反子质粒，以便共表达TGF-β、IL-10和可选的IL-2。将Freestyle293细胞瞬时转染并在无血清培养基中培养。在72小时后收集上清液并进行ELISA定量。
以下表2中的结果表明：A)实现了从单一载体表达多种独立细胞因子，B)以预期比率产生了显著量的每种细胞因子，C)微小的序列变化显著提高了从第一代IL10/胰岛素原质粒表达IL-10，以及D)质粒骨架(空载体)或抗原(IIAg)的内体靶向均不诱导细胞因子产生或失调。表2：表达的蛋白质产物的ELISA定量
实施例3—TGF-β和IL-2对疾病抑制的影响
如实施例1中那样在NOD小鼠中评价多顺反子质粒的疾病预防，不同的是每周一次连续给药直至处死(糖尿病发作)或第30周。在给药10周后，将每组一只小鼠(初始n＝24)送去进行全面尸检—包括10个标准高度灌注组织的病理学、完全血细胞计数和临床化学。除了由于注射部位的机械创伤导致的轻微肌肉破坏和再生长之外，与未给药的动物相比没有偏差。
以下表3中的结果表明：A)TGFβ的添加显著增加了效能，B)白细胞介素-2的包含可增加效能而不诱导病理学，C)长期给予表达IL-10和抗原的质粒增加了疾病预防效能，以及D)长期给予表达TGFβ1、IL-10和IL-2的质粒增加了效能而不产生任何安全性信号。
表3：NOD小鼠中的T1D发生率
实施例4—IRES元件、内含子以及皮下施用的评价
如实施例3中那样在NOD小鼠中评价多顺反子质粒的疾病预防，不同的是更早(在第5周)开始给药以便更好地模拟长期儿科施用。除了验证含有内含子的pVAX1-IIAg/TGFβ/IL10和pVAX1-IIAg/TGFβ/IL10/IL2质粒外，还检查了其他对照组。具体地，对不同的IRES区段(CrPV[来自蟋蟀麻痹病毒]，相比EMCV[来自脑心肌炎病毒])评价其预期效能增加，并且对内含子区段的删除进行评价以评估其必要性。由于与亲本质粒(pVAX1-IIAg/TGFβ/IL10/IL2)相比明显缺乏效能，因此CrPV和无内含子(n.i.＝无内含子)组被提前终止。此外，在该实验中使用的小鼠群组比以前的群组经历更快的疾病进展，从诊断到处死的时间平均为1.25周，而不是先前实验的2.75周。最后，增加皮下施用组。向该组给予三重细胞因子质粒(pVAX1-IIAg/TGFβ/IL10/IL2)，每周一次在不进行麻醉的情况下向颈背的皮下间隙中注射。
表4中的结果表明：A)EMCV IRES元件比CrPV IRES提供明显更好的效能，B)内含子(在该质粒中位于CD74内体靶向区域内)的包含显著提高效能，C)虽然IL-2的包含在轻度疾病情况下提供的益处最小，但在侵袭性疾病环境中，其存在显著提高了治疗的效能和稳定性，以及D)在大多数DNA疫苗应用中无效的皮下给药在此显示出适度的效能和显著的疾病延迟，即使没有优化。
表4：NOD小鼠中的T1D发生率
实施例5—商购无抗生素选择系统与抗生素选择系统的比较
评价了另一种质粒骨架，其目的是除去卡那霉素抗性，以使之符合欧洲药品管理局指南。将相同的插入物(IIAg/TGFβ/IL10/IL2，包括内含子)克隆到NatureTechnologyNTC9385R“纳米质粒”骨架中。如实施例3那样在NOD小鼠中评价所得质粒，不同的是在第11周开始治疗(晚期开始)，并且由于基于NTC9385R的质粒失败而提前终止。
以下表5中的结果表明：A)质粒骨架选择系统的改变令人惊讶地诱导质粒有效性的显著变化，以及B)晚期开始治疗导致了早期转化。来自其他相关实验的数据表明，给予这些致耐受性DNA疫苗质粒需要两到四周才能产生效能，因此晚期开始治疗在治疗变得有效之前导致了几个早期糖尿病病例。
表5：NOD小鼠中的T1D疾病发生率
实施例6—含有和不含抗原的质粒的疾病抑制效能
为了确定所编码的抗原在质粒功能中的作用，进行了两个实验(实施例6和7)。评价了另一种质粒，其目的是除去抗原(前胰岛素原)编码区，同时保留CD74靶向结构域和所有三种分泌的细胞因子。如实施例3那样在NOD小鼠中评价所得质粒，不同的是在第11周开始治疗(晚期开始)。
该实验证明，抗原部分是完全效能所必需的，并且不仅仅是细胞因子的产生来驱动质粒的功能。这是证明治疗的抗原特异性所需的两个标准之一。
表6：NOD小鼠中的T1D发生率
实施例7—本文的抗原免疫治疗对无关抗原疫苗效率的影响
为了确定所编码的抗原在质粒功能中的作用，进行了两个实验(实施例6和7)。如实施例3那样对NOD小鼠用PBS注射进行假处理或用pVAX1-IIAg/TGFβ/IL10/IL2质粒处理。在4个剂量(即13周龄)后，每只小鼠用在100μl的1:1明矾悬浮液中的50μg无关抗原(鸡卵清蛋白，OVA)腹膜内免疫。每周进行一次假处理或质粒处理，直至在免疫后三周(21天)处死，此时收集血清。通过商购ELISA试剂盒测定针对卵清蛋白抗原的类别转换的(总IgG和IgG2a)抗体。在质粒处理组与假处理组之间没有观察到总抗OVA IgG水平的显著差异，两组也都没有产生抗OVA IgG2a。
以下表7中的结果显示，虽然质粒抑制与所针对的疾病相关的免疫应答，但它不抑制针对无关抗原(即，不由质粒编码的任何抗原)的免疫反应性。这是证明治疗的抗原特异性所需的两个标准中的第二个标准。由于儿科患者的治疗将涉及同时进行标准儿童疫苗接种，因此这是相对于经由诸如甲氨蝶呤或环孢菌素A等药剂的全身/一般免疫抑制的显著优势。
表7：已接受针对T1D的DNA免疫治疗疫苗接种的NOD小鼠中对无关抗原的应答。
处理 样品数 平均ug抗OVAIgG/mL血清 误差
质粒处理 8 7.517 +/-0.967
PBS(假)处理 5 8.954 +/-1.227
这些值导致非显著的p值，为0.377，置信区间为-1.99至4.87。这些结果表明，用免疫调节性质粒处理不会影响对不由质粒编码的其他抗原的免疫应答，因此不会导致广泛的或全身性的免疫抑制。
实施例8—从质粒表达的单个蛋白质产物
TaV 2A元件在此产生了意想不到的IL-10+IL-2融合产物(数据未示出)，因此评价了其他分离策略。初始分离技术包括TaV 2A序列的上游延伸(导致快速降解和缺乏分泌的IL-10)以及羧肽酶切割位点(其诱导经转染的细胞系死亡)。所评价的另一分离策略是GSG-TaV 2A，一种弗林蛋白酶切割位点，弗林蛋白酶位点之后是TaV 2A、P 2A和E 2A(马鼻炎病毒A)。
将Freestyle293细胞瞬时转染并在无血清培养基中培养。在72小时后收集细胞沉淀物和上清液，并进行半定量多色Western印迹分析。
以下表8中的结果表明：A)出乎意料地，蛋白水解切割位点在IL-10与IL-2基因之间不起作用，B)IL-10与IL-2之间的GSG标签(解偶联序列)优于延伸的绝缘子序列，C)P 2A优于TaV 2A或E 2A，以及D)2A序列可能对表达的上游蛋白质如IL-10的降解和分泌具有显著的和意想不到的效果。
表8：表达的IL-10和IL-2蛋白质产物的分离
实施例9—商购选择系统与本文提供的热敏选择系统的比较以及编码IL-2的质粒与不编码IL-2的质粒之间的比较(皮下施用)
创建并评价质粒骨架，其目的是除去卡那霉素抗性，以使之符合欧洲药品管理局指南。将校正的插入物(IIAg/GSG-FMDV 2A/TGFβ/EMCV IRES/IL10/GSG-P 2A/IL2，在上游非编码区中包括内含子)克隆到作为骨架的含有Nature Technology“RNA-OUT”选择标记物的改造的/最小修饰的pVAX1载体或编码野生型infA(“pNN”)的等效的最小修饰的pVAX1载体内。另外，产生了含有额外的SV40增强子元件或缺乏IL-2的质粒。如实施例3中那样在NOD小鼠中评价所得质粒，不同的是每周一次或每周三次(优选)皮下施用。
以下表9和表10中显示的结果表明：A)用可商购获得的RNA-OUT替换pVAX1骨架中的卡那霉素抗生素抗性仍然出乎意料地表现不佳，B)infA补充无抗生素选择系统与亲本pVAX1载体的表现等同，C)白细胞介素-2是最佳效能所需要的，D)添加SV40增强子元件不会改善效能，以及E)校正的三重细胞因子插入物保留完全功能。
表9：NOD小鼠中的T1D发生率
表10：NOD小鼠中的T1D发生率
实施例10—质粒撤除后耐受效果的持久性的检查
在先前的实验中(表9中表示)，pNN-IIAg/FMDV/TGFβ/IL10/P2A/IL2组在30周龄时未被处死，但是停止给予质粒。再额外跟踪血糖值十(10)周，至总计40周龄，以评估质粒是否已诱导耐受性的持久状态或持续给药对效能来说是否是必需的。
以下表11中显示的结果表明，耐受持久性需要持续给药，因为在停止给药后，到30周龄的稳定的无病状态迅速恶化。这表明有益的安全性概况，因为质粒给药可能遇到的任何不良事件预计也会随着给药停止而停止。
表11：停止质粒给药后NOD小鼠的T1D发生率。
到30周龄的疾病发生率 到40周龄的疾病发生率
1/23＝4.3％ 9/23＝39.1％
实施例11—关于注射的质粒稳定性和持久性的检查
质粒施用的一个关键问题是施用时的降解。在注射的情况下，在压力下穿过细针的粘性大质粒分子遇到的剪切力导致质粒的共价闭合环状结构的破坏—使其呈线性并且具有降低的转染能力和快速破坏。大多数质粒在通过临床使用可接受的尺寸的针注射时有5％至15％降解为线性形式，这导致效能降低或需要更大的初始剂量来补偿损失。在所公开的质粒中有意地使可导致质粒解旋和对剪切降解的易感性的几种类型的序列结构最小化，意图是增加注射方案的稳定性和可靠性。为了评估可随粘度、因而可随浓度而变化的质粒的剪切降解，将人类先导质粒重悬于Tris EDTA缓冲液中至浓度为5mg/ml、7mg/ml和9mg/ml，并通过G30针三次(排出，重新吸入注射器中，然后重新排出)，并在琼脂糖凝胶上对照着未经过注射步骤的参考样品运行一(1)微克样品。
令人惊讶的是，图3中显示的结果表明，在任何测试浓度或粘度下，质粒不会因三次注射过程而明显地降解。质粒降解会被显示为较小条带的成片化(smearing)(在6Kb的主要超螺旋带和凝胶底部的小过程杂质带之间或大约600bp)。对于通过注射过程的任何样品，都看不到这样的线性化/降解成片条带。这种可靠的给药物理稳定性是非常理想的，并且都比预期的或先前文献中报道的要大。
实施例12—用infA补充系统验证质粒保留
为了验证基于infA的质粒保留选择系统如期望的那样起作用，使质粒转化的细菌生长100次传代(每次传代大约36次倍增/代，总共检查3,600代的潜在漂变或质粒丢失)。传代1-100以每周11次传代产生—每个工作日在37℃下传代2次，每个周末在30℃下传代1次。所有传代均在补充有15微克/ml萘啶酮酸的液体无动物LB培养基(Teknova大豆蛋白胨)中进行(选择是针对基于DH5α的菌株，而不是针对质粒的存在)。从每次传代产生甘油储备物，并将其保留至获得所有100次传代以供同时处理。
使用甘油储备物的刮擦物接种5ml过夜培养物，该培养物利用Qiagen miniprep试剂盒按照供应商说明书使用真空歧管进行处理(由于凝胶尺寸限制，每次运行16或32个培养物)。没有尝试收集OD600读数用于细胞输入归一化，并且所有制备均基于标准体积进行。对1微升每种小量制备物进行PstI/XhoI消化，以将骨架(约2.4Kbp)从插入物(约4Kbp)分离，而不对由每次小量制备产生的质粒浓度进行校正。每块凝胶在电泳时具有旁侧Tridye2-Log梯状条带(NEB https://www.neb.com/products/n3200-2-log-dna-ladder-01-100-kb)，第一个样品泳道是未消化的质粒，并且用SybrSafe染料进行可视化。在凝胶图像中，尽管缺乏核酸量的对照，但所有消化物泳道均显示出质粒的存在和预期的消化模式(在传代1-16、17-48、49-80和81-100的图像上可见)。
作为额外的确认，还将传代1-100的甘油储备物在50格的无抗生素、无动物LB琼脂板上进行划线，并在30℃下孵育过夜。没有尝试对划线接种物进行控制。如图4所示，所有甘油储备物代表性划线均导致显著的生长，因此导致质粒保留。
实施例13—infA补充系统对规模放大的适用性
为了验证基于infA的质粒保留选择系统在生产规模上如期望的那样起作用，在以特定产率增强温度转变步骤运行的50L中试补料分批发酵罐中使用质粒转化的细菌。使用添加有酵母提取物的基本培养基，使得倍增率降低至0.88/小时。在接种后17小时00分开始分批补料，并通过pO2级联参数的连续增加(在32小时15分搅拌，在40小时30分加压，然后在45小时40分空气流动)实现30％溶解氧的调节。正如预期的那样，生物量增加率在转变到42℃后立即降低。使用模拟即时裂解后产生过程的小规模质粒提取程序，估计产生的质粒DNA的量为1.03±0.17g/L。

Claims (39)

1. 质粒，其中所述质粒的DNA序列如SEQ ID NO 24所示。
2.根据权利要求1所述的质粒在制备用于延迟或预防1型糖尿病的药物中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其用于肌肉内、皮内、鼻内或皮下施用。
4.根据权利要求3所述的用途，其用于皮下施用。
5.根据权利要求3所述的用途，其用于肌肉内注射。
6.根据权利要求1所述的质粒在制备用于治疗受试者的1型糖尿病或增加的发生1型糖尿病的风险的药物中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述1型糖尿病为早发型1型糖尿病。
8. DNA免疫治疗疫苗，其包含根据权利要求1所述的质粒。
9.根据权利要求8所述的DNA免疫治疗疫苗在制备用于延迟或预防1型糖尿病的药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其用于肌肉内、皮内、鼻内或皮下施用。
11.根据权利要求10所述的用途，其用于皮下施用。
12.根据权利要求10所述的用途，其用于肌肉内施用。
13.根据权利要求9-12中任一项所述的用途，其与其他类型的医学治疗联合或并行使用，以延长移植细胞的存活和效能。
14.根据权利要求13所述的用途，其中所述其他类型的医学治疗为β细胞或β干细胞疗法。
15.根据权利要求13所述的用途，其中所述其他类型的医学治疗为β细胞或β干细胞移植。
16.药物组合物，其包含根据权利要求8所述的DNA免疫治疗疫苗，或根据权利要求1所述的质粒，其中所述药物组合物包含盐水溶液和/或缓冲液和/或螯合剂。
17.药物组合物，其包含根据权利要求8所述的DNA免疫治疗疫苗，或根据权利要求1所述的质粒，其中所述药物组合物包含盐水溶液和/或缓冲液和/或螯合剂和/或乙醇。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中乙醇的体积/体积百分比小于5%。
19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中乙醇的体积/体积百分比小于4%。
20.根据权利要求19所述的药物组合物，其中乙醇的体积/体积百分比小于3%。
21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中乙醇的体积/体积百分比小于2%。
22.根据权利要求21所述的药物组合物，其中乙醇的体积/体积百分比小于1%。
23.根据权利要求16-22中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物不包含任何病毒、脂质共包装剂或缩合剂。
24.根据权利要求16-22中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物进一步包含GLP-1R激动剂。
25.根据权利要求24所述的药物组合物，其中所述GLP-1R激动剂选自利拉鲁肽、司美鲁肽或其混合物。
26.试剂盒，其包含根据权利要求16-25中任一项所述的药物组合物并且包含GLP-1R激动剂的药物组合物。
27.根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述GLP-1R激动剂为利拉鲁肽和/或司美鲁肽。
28.产生根据权利要求1所述的质粒的方法，其中所述方法包括（i）在合适的条件下孵育用所述质粒转染的宿主细胞，以及（ii）回收或纯化所述质粒。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述宿主细胞是细菌来源的宿主细胞。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述细菌来源的宿主细胞是大肠杆菌。
31.根据权利要求28-30中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌infA热敏性菌株。
32.包含根据权利要求1所述的质粒的DNA免疫治疗疫苗在制备用于在有发生1型糖尿病的风险或新近诊断为1型糖尿病的患者中延迟1型糖尿病或其症状发作的药物的用途。
33.根据权利要求32所述的用途，其联合施用GLP-1R激动剂。
34.包含根据权利要求1所述的质粒的DNA免疫治疗疫苗在制备用于在个体中保持β细胞功能和/或内源性胰岛素产生的药物的用途。
35.根据权利要求34所述的用途，其联合施用GLP-1R激动剂。
36.包含根据权利要求1所述的质粒的疫苗在制备用于治疗糖尿病的药物的用途。
37.根据权利要求36所述的用途，其联合施用GLP-1R激动剂。
38.根据权利要求33、35或37中任一项所述的用途，其中所述GLP-1R激动剂为利拉鲁肽和/或司美鲁肽。
39.用于在有发生1型糖尿病的风险或新近诊断为1型糖尿病的患者中预防或延迟1型糖尿病症状发作的疫苗，所述疫苗包含根据权利要求1所述的质粒。
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