KR20100075884A

KR20100075884A - 진핵 타입 ｉ 인터페론 반응 억제제의 동시-발현에 의해 세균-계 전달 시스템으로부터 형질전이 유전자 발현을 증가시키는 방법

Info

Publication number: KR20100075884A
Application number: KR1020107007191A
Authority: KR
Inventors: 제럴드 씨. 사도프; 모하마드 파크루딘-자밀루딘; 라비 피. 아난타; 존 에프. 주니어 풀커슨
Original assignee: 아에라스 글로벌 티비 백신 파운데이션
Priority date: 2007-09-12
Filing date: 2008-09-11
Publication date: 2010-07-05
Also published as: US7608256B2; US20110086066A1; EP2188377A4; CN101874114A; JP5665541B2; US7883696B2; US20130224242A1; US20090068222A1; WO2009036137A1; US8414884B2; US8658136B2; EP2188377A1; US20100003219A1; JP2010538649A

Abstract

향상된 형질전이 유전자 발현을 갖는 세균 전달 시스템이 제공된다. 재조합 세균 전달 시스템은 진핵 세포에 관심 형질전이 유전자 및 진핵 타입 I 인터페론 반응의 억제제를 전달한다. 진핵 타입 I 인터페론 반응의 억제는 암호화된 형질전이 유전자의 향상된 발현을 가능케 한다.

Description

진핵 타입 Ｉ 인터페론 반응 억제제의 동시-발현에 의해 세균-계 전달 시스템으로부터 형질전이 유전자 발현을 증가시키는 방법{Methods to increase transgene expression from bacterial based delivery systems by co-expressing suppressors of the eukaryotic type I interferon response}

본 발명은 포괄적으로 선천적 타입 I 인터페론 반응을 억제함으로써 진핵 세포 내에서 향상된 형질전이 유전자 발현을 촉진하는 세균 전달 시스템에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 i) 형질전이 유전자 및 ii) 진핵 타입 I 인터페론 반응의 억제제를 진핵 세포에 전달하는 재조합 세균 전달 시스템을 제공한다.

몇몇 병원성 세균의 생 약독화된 돌연변이가 점막 경로에 의한 이종 유래 항원 전달을 위한 잠재적 백신 벡터로 개발되어 왔다. 이러한 생 벡터는 단일 경구, 비강내 또는 흡입성 용량으로 포유동물 세포 및 조직에 거대분자의 표적 전달의 이점을 제공하고, 그로 인해 전신성 및 점막 면역반응 모두를 자극한다. 백신 항원 및/또는 치료 분자를 암호화하는 플라스미드 DNA의 세균-매개 전달의 중요한 잠재력이 감염성 질환, 종양 및 유전자 결손의 실험 동물 모델에서 입증되었다.

불행히도, 포유동물 내에서 외래 단백질 또는 억제성 RNAs의 발현을 위한 일과성(passenger) RNA/DNA 및 기타 분자의 세균성 벡터화 분비는 타입 I 인터페론 (IFN) 반응을 유발한다. 침투하는 병원체에 대한 숙주의 감시 시스템의 중심 성분은 세포벽 성분 내지 핵산 범위의 패턴화된 미생물/바이러스 리간드에 결합하는 병원체 인식 수용체(PRR)의 진화적으로 보존된 패밀리이다. PRR 신호전달은 핵 인자-B(NF-B) 및 인터페론 조절 인자 3(IRF-3)과 같은 전사 인자의 활성화를 유발하고, 이는 숙주 방어의 신속한 활성화를 위한 면역 환경을 제공한다. NF-B 경로는 IL-1 및 종양 괴사 인자-α와 같은 전염증성 사이토카인의 발현을 조절하는 반면, IRF-3 경로는 타입 I 인터페론(IFN-α 및 IFN-β)의 생산을 야기한다. 이 초기에 생산된 "제1 파동(first wave)" IFN은 매우 낮은 농도로 대부분의 세포에 통상 존재하는, 관련 인자, IRF-7의 발현을 촉발한다(Sato M 등, 면역, 13(4): 539-548; 2000). IRF-3은 아마도 IRF-7과 협력하고 "제2 파동" IFNs으로서 몇몇 IFN-α 아형의 합성을 개시하는 양성 피드백 고리(positive feedback loop)를 담당한다(Marie 등, EMBO J 17(22): 6660-6669; 1998, 및 Sato M 등, FEBS Lett 441(1): 106-110; 1998). 타입 I IFNs는 자가분비 및 주변분비 신호전달(ISGs)에 의해 수백 개의 IFN 자극화 유전자를 활성화시키는데(de Veer 등, J Leukocyte Biol 69(6): 912-920, 2001; Der 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(26): 15623-15628; 1998), 이들 중 일부는 항바이러스 단백질을 암호화한다. 현재까지, 3개의 IFN 자극화 경로가 확고히 확립되었다. 이들은 단백질 키나제 R(PKR)(Williams, Oncogene 18(45): 6112-6120; 1999), 2'-5' 올리고아데닐레이트-합성효소(2'-5' OAS)(Silverman., J Interferon Res 14(3): 101-104; 1994) 및 Mx 단백질(Haller 및 Kochs, Traffic 3(10): 710-714; 2002)을 포함한다. 이 타입 I IFN 반응은 PKR 및 2'-5' OAS에 의해 외래 유전자 또는 억제성 RNAs의 발현을 제한한다. 활성화된 PKR은 진핵 억제 인자 eIF2의 α 아형을 인산화시킴으로써 번역을 차단한다. 한편, 2-5A 합성효소는, mRNA 및 리보솜 RNA를 분해하는 RNase L, 단일-가닥 특이적 엔도리보뉴클리아제를 활성화시키는, 짧은 2'-5' OAS 연합 올리고아데닐레이트를 생산한다. 특정 RNA 바이러스로의 감염 후 숙주 생존에서 Mx 단백질의 중요성은 충분히 입증되었지만(Hefti 등, J Virology 73(8): 6984-6991; 1999), 그의 정확한 작용 기작은 아직까지 명확하지 않다. 따라서 이 타입 I IFN 반응은 RNA 생산 및 안정성을 감소시키는 기작에 의해 외래 핵산의 발현을 제한하고 또한 세균성 벡터에 의해 전달되는 일과성 핵산으로부터의 정보 번역을 억제한다.

세균성 벡터의 다양한 성분이 숙주세포 내에서 IFN 반응을 촉발한다. 세균은 자발적으로 톨-유사 수용체(Toll-like receptor)를 통해 IFN 반응을 촉발할 수 있다. 전사 중에 일과성 핵산에 의해 생산된 이중 가닥 RNA는 타입 I IFNs를 유도할 뿐만 아니라 PKR 및 2'-5' OAS를 직접적으로 활성화시킨다. 포유동물 세포의 세포질 내로의 전달 시, 플라스미드 DNA는 종종 dsRNA를 형성하기 위해 mRNA와 어닐링(anneal)되는 안티-센스 RNA를 생성하는 잠적(cryptic) 프로모터를 포함한다. 따라서 세균성 벡터의 이러한 모든 성분들은 생의학적 수단으로서 세균성 벡터의 효능을 감소시킨다.

미국특허 제6,525,029호(Falck-Perersen 등, 2003년 2월 25일)는 아데노바이러스 벡터와 같은 재조합 벡터에 대한 면역반응을 억제하는 방법을 기술한다. 그러나, 이 기술은 벡터에 의해 암호화되는 유전자의 장기간 발현에 대한 체액성(예컨대, 항체) 반응 및 면역 시스템에 의한 벡터의 소거를 방지하는 방향으로 유도되고, 세균성 벡터 또는 그의 일과성 핵산에 대한 타입 I IFN 반응의 방지를 지시하지 않는다.

선행 기술은 지금까지 숙주세포의 타입 I IFN 반응을 제거하거나 약화시키는 세균성 벡터를 제공하는데 실패하였다.

본 발명은 세균성 발현 벡터에 의해 침투에 대한 반응으로 포유동물 숙주세포에 의해 일반적으로 장착되는(mounted) 타입 I IFN 반응을 성공적으로 제거하거나 약화시키는 재조합 세균성 발현 벡터를 제공한다. 재조합 세균성 발현 벡터는 숙주세포 내에서 타입 I IFN 반응을 억제하거나 억압하는 인자를 암호화함으로써 통상의 IFN 반응을 회피한다. IFN 억제제는 i) 단백질로서 전달용 세균 세포 내 또는 ii) 세균 세포에 의해 전달되는 염기 서열로부터 진핵 세포 내에서 발현된다. IFN 반응의 억제는 세균성 벡터에 의해 전달되는 일과성 유전자의 더욱 강력한 발현을 허용하고, 발현은 타입 I IFN 반응이 억제되었던 진핵 세포 내에서만 증강된다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 세균성 발현 벡터가 그에 대한 면역반응이 요구되는 항원을 암호화하는 일과성 염기 서열을 전달할 때, 포유동물 세포에 의한 그러한 항원의 생산은 숙주 IFN 시스템에 의해 덜 방해되거나 방해되지 않고(또는 방해의 정도가 감소됨), 항원이 발현되고, 그 항원에 대해 요구되는 면역반응이 야기될 수 있다. 대안적으로, 효소, 호르몬 또는 치료적 또는 건강기능성(nutraceutic) 인자와 같이 요구되는 단백질, 포유동물 세포에 의한 이들 단백질 생성물의 생산은 숙주 IFN 시스템에 의해 덜 방해되거나 방해되지 않는다.

본 발명의 목적은 i) 하나 이상의 일과성 유전자; 및 ii) 포유동물 인터페론 반응을 억제하는 하나 이상의 인자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 유전적으로 조작된 세균을 제공하는 것이다. 하나 이상의 일과성 유전자를 암호화하는 핵산 서열은 진핵 프로모터에 작동적으로 연결되고, 포유동물 타입 I 인터페론 반응을 억제하는 하나 이상의 인자를 암호화하는 핵산 서열은 진핵 프로모터 또는 원핵 프로모터에 작동적으로 연결된다. 또 다른 실시형태에서, 포유동물 인터페론 반응을 억제하는 하나 이상의 인자를 암호화하는 발현가능한 핵산 서열은 유전적으로 조작된 세균의 염색체 상에 존재한다. 추가 실시형태에서, i) 상기 하나 이상의 일과성 유전자를 암호화하고, 진핵 세포 내에서 발현가능한 핵산 서열; 및 ii) 상기 포유동물 인터페론 반응을 억제하는 하나 이상의 인자를 암호화하는 핵산 서열의 하나 또는 모두는 플라스미드 상에 존재한다. 또한, 포유동물 인터페론 반응을 억제하는 하나 이상의 인자는 바이러스 기원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 일과성 유전자는 결핵 또는 말라리아 항원을 암호화한다. 다른 실시형태에서, 유전적으로 조작된 세균은 쉬겔라균 또는 미코박테륨이다. 또한, 일과성 유전자는 이종 유래 형질전이 유전자일 수 있다.

본 발명은 추가로 세포 또는 조직 내에서 하나 이상의 관심 유전자 생성물의 생산을 증가시키는 방법을 제공한다. 당해 방법은 세포 또는 조직에 i) 하나 이상의 관심 유전자 생성물 및 ii) 포유동물 인터페론 반응을 억제하는 하나 이상의 인자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 유전적으로 조작된 세균을 투여하는 단계를 포함한다. 하나 이상의 일과성 유전자를 암호화하는 핵산 서열은 진핵 프로모터에 작동적으로 연결되고, 포유동물 타입 I 인터페론 반응을 억제하는 하나 이상의 인자를 암호화하는 핵산 서열은 진핵 프로모터 또는 원핵 프로모터에 작동적으로 연결된다. 투여 단계는 유전적으로 조작된 세균이 세포 또는 조직으로 침투하여 세포 또는 조직 내에서 하나 이상의 관심 유전자 생성물 및 하나 이상의 인자를 생산하는 것을 허용하는 조건 하에서 수행된다. 일 실시형태에서, 발현가능한 핵산 서열의 전사는 진핵 프로모터에 의해 조절된다. 다른 실시형태에서, 포유동물 인터페론 반응을 억제하는 하나 이상의 인자를 암호화하는 발현가능한 핵산 서열의 전사는 원핵 프로모터에 의해 조절된다. 또 다른 실시형태에서, 포유동물 인터페론 반응을 억제하는 하나 이상의 인자를 암호화하는 발현가능한 핵산 서열은 유전적으로 조작된 세균의 염색체 상에 존재한다. 추가 실시형태에서, i) 하나 이상의 관심 유전자 생성물; 및 ii) 포유동물 인터페론 반응을 억제하는 하나 이상의 인자를 암호화하는 발현가능한 핵산 서열의 하나 또는 모두는 플라스미드 상에 존재한다. 또한, 포유동물 인터페론 반응을 억제하는 하나 이상의 인자는 바이러스 기원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 관심 유전자 생성물은 결핵 항원일 수 있다. 추가 실시형태에서, 유전적으로 조작된 세균은 쉬겔라균 또는 미코박테륨이다.

본 발명은 추가로 포유동물 내에서 관심 항원에 대한 면역반응을 유도하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 포유동물에게 관심 항원을 암호화하는 핵산 서열; 및 포유동물 인터페론 반응을 억제하는 하나 이상의 인자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 유전적으로 조작된 세균을 투여하는 단계를 포함한다. 하나 이상의 일과성 유전자를 암호화하는 핵산 서열은 진핵 프로모터에 작동적으로 연결되고, 포유동물 타입 I 인터페론 반응을 억제하는 하나 이상의 인자를 암호화하는 핵산 서열은 진핵 프로모터 또는 원핵 프로모터에 작동적으로 연결된다. 발명의 일 실시형태에서, 관심 항원은 미코박테륨 투베르쿨로시스 항원이다. 일부 실시형태에서, 발현가능한 핵산 서열의 전사는 진핵 프로모터에 의해 조절된다. 다른 실시형태에서, 포유동물 인터페론 반응을 억제하는 하나 이상의 인자를 암호화하는 발현가능한 핵산 서열의 전사는 원핵 프로모터에 의해 조절된다. 또 다른 실시형태에서, 포유동물 인터페론 반응을 억제하는 하나 이상의 인자를 암호화하는 발현가능한 핵산 서열은 유전적으로 조작된 세균의 염색체 상에 존재한다. 일부 실시형태에서, i) 관심 항원을 암호화하는 발현가능한 핵산 서열, 및 ii) 포유동물 인터페론 반응을 억제하는 하나 이상의 인자를 암호화하는 발현가능한 핵산 서열의 하나 또는 모두는 플라스미드 상에 존재한다. 추가 실시형태에서, 포유동물 인터페론 반응을 억제하는 하나 이상의 인자는 바이러스 기원이다.

본 발명의 재조합 세균성 발현 벡터는 세균의 침투에 대한 반응으로 포유동물 숙주세포에 의해 일반적으로 장착되는 타입 I 인터페론 반응을 제거하고, 약화시키거나 억제하는 인자를 암호화하도록 유전적으로 조작된다. 이러한 인자들은 세균성 발현 벡터에 의해 발현될 수 있거나 진핵 숙주세포에 의해 번역되는 핵산 내에서 암호화될 수 있다. 진핵 숙주세포 내 IFN 반응의 약화 또는 제거는 벡터가 도입된 핵산으로부터 관심 단백질 또는 펩티드의 효율적인 전사 및 번역을 허용한다. 이러한 벡터화 분자는 세균 내에 포함된 관심 "일과성" 분자뿐만 아니라, 세균성 생식 및 생존에 필수적인 펩티드 및 단백질을 암호화할 수 있다. 관심 일과성 핵산의 예시에는, 예를 들어 세균이 암호화하도록 유전적으로 조작되는 항원을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 진핵 숙주세포의 타입 I IFN 반응이 약화되기 때문에, 항원은 숙주세포가 그 항원에 대한 면역반응을 장착하는 것을 야기하기에 충분한 수준으로 지속적으로 발현된다. 따라서 본 발명의 세균성 발현 벡터는 백신 제조에 사용하기에 이상적이다.

본 발명의 세균성 발현 벡터는 타입 I IFN 반응을 제거하고, 약화시키고, 억제하거나 억압하는 인자를 암호화하도록 유전적으로 조작된다. 당해 분야의 숙련자는 많은 바이러스가 IFN 반응의 특정 매개체를 표적하는 인자를 암호화함을 인식할 것이다. 이러한 인자들은 IFN 반응 길항제로서 언급될 수 있다. 이들 중 가장 잘 특징이 규명된 바이러스 표적은 단백질 키나제 R(PKR), RNaseL 활성화 (2'-5') 올리고아데닐레이트 합성효소 및 단백질의 인터페론 조절성 인자(IRF) 패밀리이다.

면역반응을 "억제하는" 또는 "억압하는"에 의해 본 발명자들은 진핵 세포 내에서 촉발되는 전형적 또는 정상적 면역반응이 완전히 또는 부분적으로 억제되고, 줄어들고, 감소하고, 방해되는 등을 의미한다. 이러한 억제는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 면역반응(예컨대, IFNα, IFNβ 등)의 각인(hallmark)이고, 특징이고, 또는 그와 관련된 성분의 양, 활성 또는 특성에 있어서의 감소를 검출하는 것을 포함하는, 당해 분야의 숙련자에게 자명할 임의의 몇몇 방식으로 검출되고 측정될 수 있다. 억제 수준은 일반적으로 약 25% 이상, 바람직하게는 약 50% 및 더욱 바람직하게는 약 60, 70, 80, 90 또는 100%이다. 억제 수준은 전형적으로, 대조군 세포(하나 이상의 형질전이 유전자를 암호화하지만 면역체계 억제제를 암호화하지 않는 바이러스 벡터로 GGCTCGACTC CGTGGCCTGG AGGCTAAGCG AACGGGTTGG GCTGCGCGTG TACCCCGGTTCGAATCTCGA ATCAGGCTGG AGCCGCAGCT AACGTGGTAC TGGCACTCCC GTCTCGACCCAGGCCTGCAC AAAACCTCCA GGATACGGAG GCGGGTCG

형질감염된 세포)에서 생산된 동일한 성분의 양과 비교하여, 본 발명의 바이러스 벡터(하나 이상의 형질전이 유전자와 하나 이상의 면역체계 억제제를 암호화하는 벡터)로 형질감염된 숙주세포 내에서 생산된 하나 이상의 성분들의 양 사이의 차이를 검출함으로써 측정된다.

유사하게, "형질전이 유전자의 "증강하는" 또는 "증가하는" 발현은 일반적으로, 대조군 세포와 비교하여, 본 발명의 벡터로 형질감염된 숙주세포 내에서 발현된(즉, 전사되고 번역된) 형질전이 유전자의 양에 있어서의 증가, 증대 등을 일컫는다. 이러한 증강은 당해 분야의 숙련자에게 자명할 임의의 몇몇 방법들에 의해, 예컨대, 벡터로부터 생산된 형질전이 유전자 생성물의 양, 활성 또는 특성에 있어서의 증가를 검출함으로써; 생산된 형질전이 유전자 생성물과 관련된 성분(예컨대, mRNA, 형질전이 유전자 생성물에 의해 생산된 성분 또는 효과, 형질전이 유전자 생성물에 대한 항체 등)의 양, 활성 또는 특성에 있어서의 증가를 검출함으로써 측정될 수 있다. 증강 수준은 일반적으로 약 25% 이상, 바람직하게는 약 50% 및 더욱 바람직하게는 약 60, 70, 80, 90 또는 100%, 또는 심지어 그 이상이다.

본 발명에 사용하기에 적합한 면역반응 억제 단백질은 다양한 바이러스에 의해 암호화되는데, 그의 예시에는: 로타바이러스 비구조 단백질 1(NSP1); 인플루엔자-A 바이러스 비구조 단백질 1(NS1); 아데노바이러스 연합 RNA I 및 II(VAI 및 II); 우두 바이러스 E3L 또는 vIFN-α/β Rc 단백질; 간염 C 바이러스 비구조 단백질 5A(NS5A) 또는 NS3/4A 프로테아제; 시미안 바이러스-V 단백질; 센다이 바이러스 C 단백질; 엑트로멜리아 바이러스 C12R 단백질; 아데노바이러스 E1A 단백질, 파라믹소바이러스의 C 단백질, 또는 인간 파필로마바이러스(HPV) E6 종양단백질이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

바이러스 감염에 대한 숙주 방어로서 IFN 체계의 기본적인 중요성은 수많은 바이러스가 IFN-유도된 항바이러스 반응을 중화하는 유전자 생성물을 암호화한다는 발견에 의해 더욱 설명된다. 바이러스는 IFN-유도성 단백질의 유도 및 작용을 차단하기 위해 수개의 상이한 전략을 사용한다. DNA 및 RNA 바이러스는 모두 IFN 신호전달 경로의 활성을 손상시키는 단백질을 암호화한다. 다중 기작이 관여하는 것으로 보인다. 이들 중에는 모방(mimicry)이 있다. 바이러스가 IFN 신호전달 경로의 세포성 성분을 모방하는 생성물을 암호화하는 몇몇 예시가 존재한다. 이러한 분자적 모방은 IFN 신호전달 과정의 길항작용(antagonism)을 야기할 수 있다. 예를 들어, 폭스바이러스는 가용성 IFN 수용체 동종체(vIFN-Rc)를 암호화한다. 이들 vIFN-Rc 동종체는 폭스바이러스-감염된 세포로부터 분비되고 IFNs에 결합하며, 그로 인해 이들이 자신의 선천적 수용체를 통해 항바이러스 반응을 촉발하도록 작용하는 것을 방지한다. vIFN-α/β Rc 단백질은 우두 바이러스 및 몇몇 부가적인 오르토폭스바이러스로부터 분비된다. vDFN-α/β 수용체 동종체인, 웨스턴 리저브(Western Reserve) 균주 내 B18R 유전자 생성물 및 코펜하겐(Copenhagen) 균주 내 B19R 생성물은 FFN-β뿐만 아니라 몇몇 상이한 IFN-α 아종(subspecies)에 결합하고 IFN-α/β 신호전달 활성을 차단한다. IFN 신호전달에 영향을 미치는 3개의 추가적인 DNA 바이러스는 아데노바이러스, 파필로마바이러스, 및 인간 헤르페스바이러스 8(HHV-8)이다. 아데노바이러스 E1A 단백질은 ISGF-3 활성화의 상류 지점에서 IFN-매개된 신호전달을 차단한다. ISGF-3의 DNA 결합 활성은 E1A에 의해 억제된다. SeV의 C 단백질, 숙주의 세포질 내에서 복제하는 파라믹소바이러스는 IFN-유도된 세포성 유전자의 전사 활성을 방해함으로써 IFN-유도된 항바이러스 반응의 활성화를 회피한다. 센다이 바이러스의 경우에, C 단백질은 2 이상의 방식으로 IFN 작용을 방해한다. C 단백질은 STAT-1의 합성을 방해하고 이들은 또한 STAT-1의 증가된 턴오버(turnover)를 유발한다. 인간 파필로마바이러스(HPV) E6 종양단백질은 IRF-3에는 선택적으로 결합하지만 IRF-2 및 IRF-9를 유도하는 기타 세포성 IRFs에 대해서는 단지 매우 빈약하게 결합한다. IRF-3과 E6의 연합은 전이활성(transactivation)을 억제하고, 그로 인해 IFN 반응을 회피하는 기작을 HPV에 제공한다. 아데노바이러스 E1A 단백질은 또한 p300에 결합하는 E1A의 능력에 좌우되는 기작에 의해 IRF-3-매개된 전사 활성화를 억제한다. HHV-8, 카포시 육종과 관련된 감마 헤르페스 바이러스는 IFN-α/β에 의해 유도되는 전사 활성화의 억제제(repressor)로서 기능하는 IRF 동종체(vIRF)를 합성한다. HHV-8-암호화된 vIRF 단백질은 또한 IRF-1-매개된 전사 활성화를 억제한다. 다른 2개의 헤르페스바이러스인, 베리셀라-조스터 바이러스(VZV) 및 사이토메갈로바이러스(CMV)는 또한 IFN 신호전달 경로의 기능을 파괴한다. VZV는 STAT-1 및 JAK-2 단백질의 발현을 억제하지만 JAK-1에는 별다른 영향을 미치지 않는다. 상이한 전략의 길항작용이 MHC 클래스 II 발현이 또한 억제된, CMV-감염된 세포에서 야기된다. CMV-감염된 섬유모세포에서 증강된 단백질 분해로 인해 JAK-1의 수준에서 특이적인 감소가 일어난다. 몇몇 비분절된 음성-가닥 RNA 바이러스는 타입 I IFN 수용체로부터 IFN 수용체-매개된 신호전달을 중화하는 유전자 생성물을 암호화한다. 예를 들어, 시미안 바이러스 5 또는 멈프스 바이러스로의 감염은 STAT-1의 증가된 프로테오솜-매개된 분해를 야기하는 반면, 파라인플루엔자 바이러스 타입 2로 감염된 세포에서는 STAT-2의 분해가 일어난다. 에볼라 바이러스의 VP35 단백질, 음성-가닥 RNA 바이러스는 길항작용의 정확한 생화학적 기작이 아직 정의되지 않았다고 하더라도 타입 I IFN 길항제로 작용한다. VP35는 IFN-β 프로모터의 바이러스 유도 및 ISRE-유도된 유전자 발현의 dsRNA- 및 바이러스-매개된 활성화를 억제한다. 3개의 예시적인 억제제(인플루엔자 바이러스 유래 NS1, 로타바이러스 유래 NSP1, 및 아데노바이러스 유래 VAI)를 암호화하는 핵산 서열을 도 9A-C에 나타내었다.

IFN 억제 인자는 또한 다른 비-바이러스 근원으로부터, 예를 들어 숙주세포(예컨대, 사이토카인 신호전달의 억제제(SOCS), PKR의 우성 음성 및 RNase L의 우성 음성)으로부터 입수될 수 있고, 본 발명의 실행 내에 사용될 수 있다. IFN 반응(예컨대, 인터페론 자극된 유전자에 대한 siRNAs)을 억제하거나 약화시키고 세균성 발현 벡터 내로 유전적으로 조작되고 그로부터 성공적으로 발현될 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화되는 임의의 인자가 본 발명의 실행 내에 사용될 수 있다. 예시에는 타입 I IFNs의 항바이러스 작용에 필수적인 다양한 자가분비 IFN-유도된 효과기 및 조정자 단백질, 예컨대 RNA-의존성 단백질 키나아제(PKR); 2,5'-올리고아데닐레이트 합성효소(OAS); RNase L; Mx 단백질 GTPases; IFN-유도성 RNA-특이적 아데노신 디아미나제(ADAR1); IRF-5 및 IRF-7와 같은 IFN 조절성 인자; TLR3, TLR4, TLR7 및 TLR9와 같은 (IRF) 패밀리의 전사 인자; IRAKI/4 및 TRAF6과 같은 인자; RLR, MyD88, TAKl, TOLLIP, TlFA 등 뿐만 아니라, 상기에 기술된 것들을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

"세균성 발현 벡터"에 의해 본 발명자들은 관심 핵산 서열을 포함하고 전달하고/하거나 발현하도록 유전적으로 조작된 세균성 세포를 의미한다. 이러한 방식으로 사용될 수 있는 세균의 예시에는 캄필로박터 spp, 나이세리아 spp, 헤모필러스 spp, 아로모나스 spp, 프란시셀라 spp, 예르시니아 spp, 클렙시엘라 spp, 보르데텔라 spp, 레지오넬라 spp, 코리네박테륨 spp, 시트로박터 spp, 클라미디아 spp, 부르셀라 spp, 슈도모나스 spp, 헬리코박터 spp, 또는 비브리오 spp가 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

사용된 특정한 캄필로박터 균주가 본 발명에 결정적인 것은 아니다. 본 발명에 사용될 수 있는 캄필로박터 균주의 예시에는: C. 제주니(ATCC Nos. 43436, 43437, 43438), C. 하이오인테스티날리스(ATCC No. 35217), C. 페터스(ATCC No. 19438) C. 페칼리스(ATCC No. 33709) C. 도일레이(ATCC No. 49349) 및 C. 콜라이(ATCC Nos. 33559, 43133)가 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

사용된 특정한 예르시니아 균주가 본 발명에 결정적인 것은 아니다. 본 발명에 사용될 수 있는 예르시니아 균주의 예시에는: Y. 엔테로콜리티카(ATCC No. 9610) 또는 Y. 페스티스(ATCC No.19428), Y. 엔테로콜리티카 Ye03-R2(al Hendy 등, Infect. Immun., 60: 870; 1992) 또는 Y. 엔테로콜리티카 aroA (O'Gaora 등, Micro. Path., 9: 105; 1990)이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

사용된 특정한 클렙시엘라 균주가 본 발명에 결정적인 것은 아니다. 본 발명에 사용될 수 있는 클렙시엘라 균주의 예시에는 K. 뉴모니아(ATCC No. 13884)가 포함된다.

사용된 특정한 보르데텔라 균주가 본 발명에 결정적인 것은 아니다. 본 발명에 사용될 수 있는 보르데텔라 균주의 예시에는 B. 페르투스시스, 및 B. 브론키셉티카(ATCC No. 19395)가 포함된다.

사용된 특정한 나이세리아 균주가 본 발명에 결정적인 것은 아니다. 본 발명에 사용될 수 있는 나이세리아 균주의 예시에는 N. 메닌지티디스(ATCC No. 13077) 및 N. 고노르로에아(ATCC No. 19424)가 포함되고, N. 고노르로에아 MS11은 돌연변이이다(Chamberlain 등, Micro. Path., 15: 51-63; 1993).

사용된 특정한 아로모나스 균주가 본 발명에 결정적인 것은 아니다. 본 발명에 사용될 수 있는 아로모나스 균주의 예시에는 A. 살미노시다(ATCC No. 33658), A. 스츄베리(ATCC No. 43700), A. 하이드로필리아, A. 유크레노필리아(ATCC No. 23309)가 포함된다.

사용된 특정한 프란시셀라 균주가 본 발명에 결정적인 것은 아니다. 본 발명에 사용될 수 있는 프란시셀라 균주의 예시에는 F. 툴라렌시스(ATCC No. 15482)가 포함된다.

사용된 특정한 코리네박테륨 균주가 본 발명에 결정적인 것은 아니다. 본 발명에 사용될 수 있는 코리네박테륨 균주의 예시에는 C. 슈도투베르쿨로시스(ATCC No. 19410)가 포함된다.

사용된 특정한 시트로박터 균주가 본 발명에 결정적인 것은 아니다. 본 발명에 사용될 수 있는 시트로박터 균주의 예시에는 C. 프레운디(ATCC No. 8090)가 포함된다.

사용된 특정한 클라미디아 균주가 본 발명에 결정적인 것은 아니다. 본 발명에 사용될 수 있는 클라미디아 균주의 예시에는 C. 뉴모니아(ATCC No. VR1310)가 포함된다.

사용된 특정한 헤모필러스 균주가 본 발명에 결정적인 것은 아니다. 본 발명에 사용될 수 있는 헤모필러스 균주의 예시에는 H. 인플루엔자에(Lee 등, J. Biol. Chem. 270: 27151; 1995), H. 솜누스(ATCC No. 43625)가 포함된다.

사용된 특정한 부르셀라 균주가 본 발명에 결정적인 것은 아니다. 본 발명에 사용될 수 있는 부르셀라 균주의 예시에는 B. 아보르투스(ATCC No. 23448)가 포함된다.

사용된 특정한 레지오넬라 균주가 본 발명에 결정적인 것은 아니다. 본 발명에 사용될 수 있는 레지오넬라 균주의 예시에는 L. 뉴코필리아(ATCC No. 33156), 또는 L. 뉴모필리아 mip 돌연변이(Ott, FEMS Micro. Rev., 14: 161; 1994)가 포함된다.

사용된 특정한 슈도모나스 균주가 본 발명에 결정적인 것은 아니다. 본 발명에 사용될 수 있는 슈도모나스 균주의 예시에는 P. 아루지노사(ATCC No. 23267)가 포함된다.

사용된 특정한 헬리코박터 균주가 본 발명에 결정적인 것은 아니다. 본 발명에 사용될 수 있는 헬리코박터 균주의 예시에는 H. 파일로리(ATCC No. 43504), H. 무스텔라에(ATCC No. 43772)가 포함된다.

사용된 특정한 비브리오 균주가 본 발명에 결정적인 것은 아니다. 본 발명에 사용될 수 있는 비브리오 균주의 예시에는 비브리오 콜레라에(ATCC No. 14035), 비브리오 신신나티엔시스(ATCC No. 35912), V. 콜레라에 RSI 병원성 돌연변이(Taylor 등, J. Infect. Dis., 170: 1518-1523; 1994) 및 V. 콜레라에 ctxA, ace, zot, cep 돌연변이(Waldor J 등, Infect. Dis., 170: 278-283; 1994)가 포함된다.

바람직한 실시형태에서, 본 발명에서 그로부터 벡터 균주가 개발되는 세균성 균주에는 담체 및 백신 벡터로서 모두 제공되는 잠재력을 보유하는 세균, 예컨대 이들로 한정되는 것은 아니지만, 에스케리치아 spp, 쉬겔라 spp, 및 살모넬라 spp를 포함하는 엔테로박테리아세아가 포함된다. 그람-양성 및 항-산(acid-fast) 벡터 균주가 리스테리아 모노시토제네스 또는 미코박테륨 spp로부터 유사하게 제작될 수 있다.

사용된 특정한 에스케리치아 균주가 본 발명에 결정적인 것은 아니다. 본 발명에 사용될 수 있는 에스케리치아 균주의 예시에는 대장균(E. coli) 균주 DH5α, HB 101, HS-4, 4608-58, 1184-68, 53638-C-17, 13-80, 및 6-81(예를 들어, 문헌[Sambrook 등, 상동; Grant 등, 상동; Sansonetti 등, Ann. Microbiol. (Inst. Pasteur), 132A: 351; 1982)] 참고), 장독소생성 E. coli(예컨대, 문헌[Evans 등, Infect. Immun., 12: 656; 1975] 참고), 장병원성 E. coli(예컨대, 문헌[Donnenberg 등, J. Infect. Dis., 169: 831; 1994] 참고), 장침투성 E. coli(예컨대, 문헌[Small 등, Infect Immun., 55: 1674; 1987] 참고) 및 장출혈 E. coli(예컨대, 문헌[McKee 및 O'Brien, Infect. Immun., 63: 2070; 1995] 참고)가 포함된다.

사용된 특정한 살모넬라 균주가 본 발명에 결정적인 것은 아니다. 본 발명에 사용될 수 있는 살모넬라 균주의 예시에는 S. 타리피(예컨대, ATCC No. 7251 참고), S. 타이피뮤리움(예컨대, ATCC No. 13311 참고), 살모넬라 갈리나룸(ATCC No. 9184), 살모넬라 엔테리디티스(예컨대, ATCC No. 4931 참고) 및 살모넬라 타이피뮤리움(예컨대, ATCC No. 6994 참고). S. 타이피 aroC, aroD 이중 돌연변이(예컨대, 문헌[Hone 등, Vacc., 9: 810-816; 1991] 참고), S. 타이피뮤리움 aroA 돌연변이(예컨대, 문헌[Mastroeni 등, Micro. Pathol., 13: 477-491; 1992] 참고)가 포함된다.

사용된 특정한 쉬겔라 균주가 본 발명에 결정적인 것은 아니다. 본 발명에 사용될 수 있는 쉬겔라 균주의 예시에는 쉬겔라 플렉스네리(예컨대, ATCC No. 29903 참고), 쉬겔라 플렉스네리 CVD1203(예컨대, 문헌[Noriega 등, Infect. Immun. 62: 5168; 1994] 참고), 쉬겔라 플렉스네리 15D(예컨대, 문헌[Sizemore 등, Science 270: 299; 1995] 참고), 쉬겔라 손네이(예컨대, ATCC No. 29930 참고), 및 쉬겔라 디센테리아(예컨대, ATCC No. 13313 참고)가 포함된다.

사용된 특정한 미코박테륨 균주가 본 발명에 결정적인 것은 아니다. 본 발명에 사용될 수 있는 미코박테륨 균주의 예시에는 M. 투베르쿨로시스 CDC1551 균주(예컨대, 문헌[Griffith 등, Am. J. Respir. Crit. Care Med. Aug; 152(2): 808; 1995] 참고), M. 투베르쿨로시스 북경 균주(Soolingen 등, 1995) H37Rv 균주(ATCC # 25618), M. 투베르쿨로시스 판토테네이트 영양요구성 균주(Sambandamurthy, Nat. Med. 2002 8(10): 1171; 2002), M. 투베르쿨로시스 rpoV 돌연변이 균주(Collins 등, Proc Natl Acad Sci USA. 92(17): 8036; 1995), M. 투베르쿨로시스 류신 영양요구성 균주(Hondalus 등, Infect. Immun. 68(5): 2888; 2000), 칼메트-게랑 간균(BCG) 덴마크 균주(ATCC # 35733), BCG 일본 균주(ATCC # 35737), BCG 시카고 균주(ATCC # 27289), BCG 코펜하겐 균주(ATCC # 27290), BCG 파스퇴르 균주(ATCC # 35734), BCG 글락소 균주(ATCC # 35741), BCG 코넛(Connaught) 균주(ATCC # 35745), BCG 몬트리올 (ATCC # 35746)가 포함된다.

사용된 특정한 리스테리아 모노시토제네스 균주가 본 발명에 결정적인 것은 아니다. 본 발명에 사용될 수 있는 리스테리아 모노시토제네스 균주의 예시에는 L. 모노시토제네스 균주 10403S(예컨대, 문헌[Stevens 등, J .Virol 78: 8210-8218; 2004]) 또는 돌연변이 L. 모노시토제네스 균주, 예컨대 (i) actA plcB 이중 돌연변이(Peters 등, FEMS Immunology and Medical Microbiology 35: 243-253; 2003; Angelakopoulous 등, Infect and Immunity 70: 3592-3601; 2002); (ii) 알라닌 락타메이즈 유전자 및 D-아미노산 아미노전이효소 유전자에 대한 dal dat 이중 돌연변이(Thompson 등, Infect and Immunity 66: 3552-3561; 1998)가 포함된다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 세균은 특히, 쉬겔라 종, 특히 약독화 침투성 쉬겔라 플렉스네리 2a이다. 이러한 균주, MPC51 및 NCD1은 asd 및 murI 결실 돌연변이가 도입된 S. 플렉스네리 균주 2457T의 유도체이다. asd 결손은 발현 벡터 암호화된 asd 대립유전자에 의해 보완되고 murI 돌연변이는 균주의 D-글루타메이트 합성능을 무력화시키고; 따라서, 이들 균주는 디아미노피멜린산(diaminopimelic acid) 및 D-글루타메이트의 부재 시에 적절한 세포벽을 합성할 수 없고, 이는 진핵 세포의 침투 후에 세균성 세포의 용해를 촉진한다. 젠타마이신 보호 분석에 의해 측정되는 바와 같이, △asd, △murI 이중 돌연변이 MPC51의 HeLa 세포 침투성 행동은 양친 균주 및 MPC51pYA3342(asd를 암호화하는 플라스미드)의 것과 유사하였다. 이 균주는 염색체 asd 유전자좌 내에 미리 삽입된 카나마이신 내성 유전자의 제거에 의해 추가로 변경되었다. 수득되는 균주, 쉬겔라 플렉스네리 NCD1은 따라서 항생제 내성 마커를 포함하지 않고, 여전히 asd 및 murI 유전자의 염색체 결실을 보유하며, 통상의 조절 요구 하에서 인간에게 약학적으로 사용하는 것이 허용된다. NCD1은 또한 양친 균주와 유사한 방식으로 HeLa 및 Caco-2 세포에서 침투성인 것으로 나타났다.

일반적으로, 본 발명의 세균성 발현 벡터는 IFN을 억제하는 인자 및 하나 이상의 다른 관심 유전자, 즉 일과성 유전자 모두를 암호화하고 전달하도록 유전적으로 조작된다. 일과성 유전자는 전형적으로 다른 유기체, 예컨대 다른 세균 또는 병원체로부터 기원하고, 임의의 유기체로부터 일 수 있는 이종 유래 형질전이 유전자이다. 그러나, "일과성 유전자"는 또한 세균성 벡터 자체 내에서 자연적으로 발생하는 유전자일 수 있지만(즉, 벡터로 제공되는 세균으로부터 유래하거나 기원함), 하나 이상의 부가적인 복제수가, 예를 들어, 세균에 전형적인 수준 이상으로 전사 수준을 증가시키는 프로모터, 또는 특정 유형의 숙주 세포 또는 조직(예컨대, 폐, 림프절, 수지상 세포 등)에 특이적인 프로모터의 조절 하에서 세균성 벡터 내로 유전적으로 조작된다. 또한, "일과성 유전자"는 전체 "유전자"뿐 아니라 관심 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 또는 핵산을 암호화하는 임의의 서열을 지칭하는 것으로 의도된다. 즉, 전체 "유전자" 그 자체로는 포함되지 않을 수 있지만, 관심 폴리펩티드 또는 펩티드, 예컨대 항원성 펩티드를 암호화하는 유전자의 일부분은 포함될 수 있다. 나아가, 다양한 기타 구조물, 예컨대 키메라 단백질, 또는 아미노산 서열의 다양한 돌연변이(자연 발생적이거나 유전적으로 조작됨)가 일과성 유전자에 의해 암호화될 수 있다. 또한, 자연계에는 나타나지 않는 완전히 인공적인 아미노산 서열이 또한 암호화될 수 있다. 세균성 발현 벡터는 이러한 "일과성 유전자"의 하나 이상을 포함하도록 유전적으로 조작되고 또한 개별적인 일과성 유전자의 다중 복제수를 암호화할 수 있다. 재조합 세균성 발현 벡터는, 유전자 생성물이 발현되고, 즉 유전자 서열이 발현될 수 있고 유전자 생성물의 전사 및/또는 번역이 세균에 의해 침투된 숙주세포 내에서 야기되는, 세균에 의해 침투된 숙주세포 내로 일과성 유전자(들)를 운반하는 벡터로 작용한다. 일과성 유전자를 암호화하는 서열은 발현 조절 서열, 특히 세균 및/또는 진핵 숙주세포 내에서 발현되게 하는 발현 조절 서열에 작동적으로 연결된다. "작동적으로 연결되는"에 의해 본 발명자는 일과성 유전자를 암호화하는 핵산 서열이 적합한 숙주세포, 예컨대 세균성 벡터 또는 포유동물 세포 내에서 성공적인 전사 및 번역에 순응하게 됨을 의미한다 .

특히, 이러한 일과성 유전자는 항원이고, 면역반응을 촉발하는데 요구되는 하나 이상의 펩티드 또는 단백질을 암호화할 수 있다. 당해 분야의 숙련자는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 다양한 바이러스, 세균, 진균, 다양한 기생체 등과 같은 감염체와 관련된 것들을 비롯한, 이러한 항원의 넓은 다양성이 존재함을 인식할 것이다. 바이러스 항원이 유래하는, 바이러스 병원체에는 인플루엔자 바이러스(분류학 ID: 59771)와 같은 오르토믹소바이러스; RSV, HTLV-1(분류학 ID: 39015), 및 HTLV-II(분류학 ID: 11909)와 같은 레트로바이러스; HPV(분류학 ID: 337043)와 같은 파필로마비리데; EBV(분류학 ID: 10295), CMV(분류학 ID: 10358) 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스 (ATCC # VR-1487)와 같은 헤르페스바이러스; HIV-1(분류학 ID: 12721) 및 HIV-2(분류학 ID: 11709)와 같은 렌티바이러스; 광견병과 같은 라브도바이러스; 폴리오바이러스(분류학 ID: 12080)와 같은 피코르노바이러스; 우두(분류학 ID: 10245)와 같은 폭스바이러스; 로타바이러스(분류학 ID: 10912); 및 아데노-연합 바이러스 1(분류학 ID: 85106)과 같은 파르보바이러스가 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

바이러스 항원의 예시는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 인간 면역결핍 바이러스 항원 Nef(국립 알레르기 및 감염병 연구소(National Institute of Allergy and Infectious Disease) HIV 저장형(Repository) Cat. # 183; Genbank 등재번호 # AF238278), Gag, Env(국립 알레르기 및 감염병 연구소 HIV 저장형 Cat. # 2433; Genbank 등재번호 # U39362), Tat(국립 알레르기 및 감염병 연구소 HIV 저장형 Cat. # 827; Genbank 등재번호 # M13137), Tat의 돌연변이 유도체, 예컨대 Tat-31-45(Agwale 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 10037; 2002), Rev(국립 알레르기 및 감염병 연구소 HIV 저장형 Cat. # 2088; Genbank 등재번호 # L14572), 및 Pol(국립 알레르기 및 감염병 연구소 HIV 저장형 Cat. # 238; Genbank 등재번호 # AJ237568) 및 gp120의 T 및 B 세포 에피토프(Hanke 및 McMichael, AIDS Immunol Lett., 66: 177; 1999; Hanke, 등, 백신, 17: 589; 1999; Palker 등, J. Immunol., 142: 3612 3619; 1989), HIV-1 Env 및 gp120의 키메라 유도체, 예컨대 이로 한정되는 것은 아니지만 gp120 및 CD4 사이의 융합(Fouts 등, J. Virol., 74: 11427-11436; 2000); HIV-1 env의 절단되거나(truncated) 변경된 유도체, 예컨대 이로 한정되는 것은 아니지만 gp140(Stamatos 등, J Virol, 72: 9656-9667; 1998) 또는 HIV-1 Env의 유도체 및/또는 그의 gp140(Binley, 등, J Virol, 76: 2606-2616; 2002; Sanders, 등, J Virol, 74: 5091-5100; 2000; Binley, 등, J Virol, 74: 627-643; 2000), B형 간염 표면 항원(Genbank 등재번호 # AF043578; Wu 등, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86: 4726 4730; 1989); VP4와 같은 로타바이러스 항원(Genbank 등재번호 # AJ293721; Mackow 등, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87: 518 522; 1990) 및 VP7(GenBank 등재번호 # AY003871; Green 등, J. Virol., 62: 1819-1823; 1988), 헤마글루티닌과 같은 인플루엔자 바이러스 항원(GenBank 등재번호 # AJ404627; Pertmer 및 Robinson, Virology, 257: 406; 1999); 핵산단백질(GenBank 등재번호 # AJ289872; Lin 등, Proc. Natl. Acad. Sci., 97: 9654-9658; 2000), 티미딘 키나제와 같은 헤르페스 심플렉스 바이러스 항원(Genbank 등재번호 # AB047378; Whitley 등, In: New Generation Vaccines, pages 825-854)을 포함하는 군에서 확인할 수 있다.

세균성 항원이 유래하는, 세균성 병원체에는: 미코박테륨 spp ., 헬리코박터pylori, 살모넬라 spp ., 쉬겔라 spp ., 대장균, 리켓치아 spp ., 리스테리아 spp ., 레지오넬라 뉴모니아 , 슈도모나스 spp ., 비브리오 spp ., 바실러스 안트라시스 및 보렐리아 부르그도페리가 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

세균성 병원체의 방어 항원의 예시에는 장독소생성 E. coli의 체세포 항원, 예컨대 CFA/I 섬모(fimbrial) 항원(Yamamoto 등, Infect. Immun., 50: 925-928; 1985) 및 열 민감 독소의 비독성 B 아단위( 등, Infect. Immun., 40: 888-893; 1983); 보르데텔라 페르투시스의 페르탁틴(pert액틴)(Roberts 등, Vacc., 10: 43-48; 1992), B. 페르투시스의 아데닐레이트 사이클라제 용혈소(hemolysin)(Guiso 등, Micro. Path., 11: 423-431; 1991), 클로스트리듐 테타니의 파상풍 독소의 분절 C(Fairweather 등, Infect. Immun., 58: 1323-1326; 1990), 보렐리아 부르그도페리의 OspA(Sikand 등, Pediatrics, 108: 123-128; 2001; Wallich 등, Infect Immun, 69: 2130-2136; 2001), 리켓치아 프로와제키 및 리켓치아 타이피의 방어 준결정체-표면-층 단백질(Carl 등, Proc Natl Acad Sci USA, 87: 8237-8241; 1990), 리스테리아 모노시토제네스의 리스테오라이신("Llo" 및 "Hly"로도 알려짐) 및/또는 과산소 디스뮤타제("SOD" 및 "p60"으로도 알려짐)(Hess, J., 등, Infect. Immun. 65: 1286-92; 1997; Hess, J., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 1458-1463; 1996; Bouwer 등, J. Exp. Med. 175: 1467-71; 1992), 헬리코박터 파일로리의 요소분해효소(Gomez-Duarte 등, 백신 16, 460-71; 1998; Corthesy-Theulaz, 등, Infection & 면역 66, 581-6; 1998), 및 바실러스 안트라시스 방어 항원 및 치사 인자 수용체-결합 도메인(Price, 등, Infect. Immun. 69, 4509-4515; 2001)이 포함된다.

기생성 항원이 유래하는, 기생성 병원체에는: 플라스모디움 spp., 예컨대 플라스모디움 팔시파룸(ATCC #: 30145); 트리파노좀 spp., 예컨대 트리파노조마 크루지(ATCC #: 50797); 지아르디아 spp., 예컨대 지아르디아 인테스티날리스(ATCC #: 30888D); 부필러스 spp., 바베시아 spp., 예컨대 바베시아 미크로티(ATCC #: 30221); 엔타모에바 spp., 예컨대 엔타모에바 히스토리티카(ATCC #: 30015); 에이메리아 spp., 예컨대 에이메리아 막시마(ATCC # 40357); 레이스마니아 spp.(분류학 ID: 38568); 스키스토솜 spp., 브루지아 spp., 파스시다 spp., 디로필라리아 spp., 우체레리아 spp., 및 온코세레아 spp가 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

기생성 병원체의 방어 항원의 예시에는 플라스모디움 spp.의 포자소체(circumsporozoite) 항원(Sadoff 등, Science, 240: 336 337; 1988), 예컨대 P. 베르게이의 포자소체 항원, 팔시파룸의 포자소체 항원; 플라스모디움 spp.의 분열소체(merozoite) 표면 항원(Spetzler 등, Int. J. Pept. Prot. Res., 43: 351-358; 1994); 엔타모에바 히스토리티카의 갈락토스 특이적 렉틴(Mann 등, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88: 3248-3252; 1991), 레이스마니아 spp.의 gp63(Russell 등, J. Immunol., 140: 1274 1278; 1988; Xu and Liew, Immunol., 84: 173-176; 1995), 레이스마니아 메이저의 gp46(Handman 등, Vaccine, 18: 3011-3017; 2000), 브루지아 말레이의 파라미오신(Li 등, Mol. Biochem. Parasitol., 49:315-323; 1991), 스키스토소마 만소니의 삼탄당-인산 이소머라제(triose-phosphate isomerase)(Shoemaker 등, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89: 1842-1846; 1992); 트리코스트론질루스 콜루브리포르미스의 분비된 글로빈-유사 단백질(Frenkel 등, Mol. Biochem. Parasitol., 50: 27-36; 1992); 프라스시올라 헤파티카(Hillyer 등, Exp. Parasitol., 75: 176-186; 1992), 스키스토소마 보비스 및 S. 자포니쿰(Bashir 등, Trop. Geog. Med., 46: 255-258; 1994)의 글루타치온-S-전이효소; 및 스키스토소마 보비스 및 S. 자포니쿰의 KLH(Bashir 등, 상동, 1994)이 포함된다.

대안적으로, 감염체와 관련되지 않는 항원, 예를 들어, 암세포, 알츠하이머병, 타입 1 당뇨, 심장 질환, 크론병, 다발경화증과 관련된 항원에 대한 면역반응을 촉발하는 것이 바람직할 수 있다.

또한, 세균에 의해 운반되는 일과성 유전자는 항원을 암호화할 필요는 없지만, 임의의 관심 펩티드 또는 단백질을 암호화할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 유전성 장애의 교정을 위한 일과성 분자의 전달을 위해 사용될 수 있다. 이러한 유전자는 예를 들어, 낭성섬유증을 위한 낭성섬유증 막투과 전도도 조절인자(CFTR) 유전자와 같은 결손 유전자의 대체; 또는 HIV 치료를 위한 인테그레이즈 안티센스 유전자와 같은 새로운 유전자의 도입; 또는 인터루킨-27(IL-27)와 같은 타입 I T 세포 반응을 증강시키기 위한 유전자; 또는 특정 수용체, 대사산물 또는 호르몬, 예컨대 콜레스테롤 및 콜레스테롤 수용체 또는 인슐린 및 인슐린 수용체의 발현을 조정하기 위한 유전자; 또는 종양 괴사 인자(TNF)-관련 세포자멸-유도 리간드 (TRAIL)와 같은 암세포를 사멸할 수 있는 생성물을 암호화하는 유전자; 또는 골 흡수를 억제하는 자연 발생적인 단백질 오스테오프로테그린(OPG); 또는 완전-길이 인간화 항체, 예를 들어, 암세포 상의 HER2/neu(erbB2) 수용체에 작용하는 인간화 단일클론 항체를 효과적으로 발현하기 위한 유전자를 포함할 것이다.

또한, 일과성 유전자는 "소 억제성" siRNAs와 같은 억제성 RNAs를 암호화할 수 있다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 이러한 RNAs는 관심 mRNA에 대해 보체로 그에 결합하여, 예컨대, 유전자 생성물의 발현을 방지하는 수단으로서, mRNA의 번역을 방지한다.

유사한 방법이 자가면역 질환 또는 다른 면역체계 질환을 예방하거나 제어하도록 면역체계를 하향 조절하기 위해 일과성 분자의 전달을 위해 사용될 수 있다. 예시에는 당뇨병, 다발경화증, 홍반 루프스 및 크론병 및 염증성 관절 및 피부 질환의 예방 또는 치료가 포함된다. 기타 예시에는 암 및 기타 질환의 치료적 면역반응을 우회시키는 면역반응의 하향 조절과 같은 특정 면역반응을 방해하는 면역반응의 정교한 조율을 포함한다. 예를 들어, Th1 반응이 암, 리슈만편모충증(Leishmaniasis), 결핵, 및 HIV의 예방 및 치료에 적합할 때, Th2 반응의 하향 조절이 있다. 이는 적당한 면역반응의 자극 및 부적당한 면역반응의 억제에 적합한 사이토카인 환경을 발현하는 능력과 함께 면역체계의 면역억제 특성의 조작을 통해 본 발명의 기술을 이용하여 달성될 수 있다.

바람직한 실시형태에서, 본 발명은 숙주세포 내로의 IFN 내성 유전자의 도입을 위한 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은, 관심 유전자 또는 핵산 서열을 암호화하는 서열과 함께, 목적하는 IFN 내성 유전자를 세균-계 전달 시스템 내로 도입하여 IFN 내성 단백질 및 관심 핵산 서열이 숙주에 세균을 투여할 때 발현되게 하는 것을 포함한다. IFN 억제제는 세균(예컨대, 쉬겔라)에 의해 또는 숙주세포에 의해 생산될 수 있다. 다시 말해, IFN 내성 유전자는 원핵 프로모터로부터 또는 진핵 프로모터로부터 발현될 수 있다. 관심 유전자 또는 핵산 서열(일과성 유전자)은 숙주세포 내에서 발현된다. 또한, 모든 유전성 서열은 구성적으로 또는 일시적으로 발현되거나 유도될 수 있다.

또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 시험관 내에서 세포 내로 하나 이상의 관심 유전자와 함께 타입 I IFN 내성 유전자의 도입을 위한 방법을 제공한다. 이러한 방법은 하나 이상의 IFN 내성 유전자와 함께 하나 이상의 관심 단백질을 암호화하는 유전자를, 예를 들어, 약독화된 또는 약독화/불활성화된 쉬겔라 내로 도입하여 세포에 쉬겔라가 투여될 때 목적하는 단백질/펩티드가 생산되게 하는 것을 포함한다. 쉬겔라는 BHK(아기 햄스터 신장 세포), HeLa(인간 자궁경부 유상피 암종), CaCo-2(인간 결장 샘암종)와 같은 몇몇 다양한 세포 유형을 감염시키고, 따라서, 세포 내로 목적하는 일과성 분자를 전달할 수 있다. 쉬겔라-감염된 세포 내 유전자 발현은 타입 I IFN 반응의 억제제에 의해 증가한다. 핵산 전달 이후에, 세포는 치료적 목적으로, 유전자 요법을 위해 이식될 수 있고, 또는 진단 분석의 시약으로서 사용될 수 있다.

일부 사례에서, 세균은 목적하는 성분을 암호화하는 세포 핵산 서열을 전달하고 세포 내에서 그의 생산을 매개함으로써 "유전자 요법" 제제로서 제공된다. 예를 들어, CXCR4/또는 CCR5 결합 케모카인-암호화 유전자를 쉬겔라 벡터를 이용하여 창자 내로 전달하는 것은 HIV-1 감염의 치료법으로 고려될 수 있다. 세균을 유전적으로 조작하는 과정은 당해 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있고, 이러한 과정을 수행하는 안내도 잘 알려져 있다. 대장균, 살모넬라, 미코박테륨 투베르쿨로시스, 쉬겔라, 및 리스테리아를 약독화시키는 방법이 당해 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다(Evans 등, J. of Immuno., vol. 120, 1978, p. 1423; Noriega 등, Infect. Immun., 62(11): 5168-5172 1994; Hone 등, Vacc., 9: 810-816; 1991).

예를 들어, 세포 내로 목적하는 유전자 또는 유전자들을 전달하는 방법은 세균의 균주 내로 관심 유전자를 도입하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명에 따라, 항-IFN 반응 유전자 또는 유전자들이 당해 분야의 숙련자에게 잘 알려진 방법에 의해 세균성 염색체 또는 병원성 플라스미드 내로 도입될 수 있거나 대안적으로 복제 또는 비복제 플라스미드 내에 전달될 수 있다. 관심 벡터는 세균 내로 예를 들어, 형질전환, 전기천공, 형질감염, 접합 등을 통해 도입될 수 있다. 균주 및 세균성 벡터의 제작에 사용되는 재조합 DNA 과정은, 다른 문헌에 기술된(Miller, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; 1992; Bothwell 등, Methods for Cloning and Analysis of Eucaryotic Gene, Eds., Jones and Bartlett Publishers Inc., Boston, Mass. 1990; 및 Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, vol. 2: 10.8.1-10.8.13, 1992), 중합효소 연쇄반응(PCR), 제한효소(본 발명에서는 "RE"로 언급됨) 절단, DNA 연결, 아가로스 겔 전기영동, DNA 정제, 및 디데옥시뉴클레오티드 서열분석, 박테리오파아지-매개 형질도입(de Boer 등, Cell, 56: 641-649; 1989; Miller, 상동, 1992; 및 Ausubel 등, 상동), 또는 화학적(Bothwell 등, 상동; Ausubel 등, 상동; Felgner 등, 상동; 및 Farhood, 상동), 전기천공(Bothwell 등, 상동; Ausubel 등, 상동; Sambrook, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; 1992); 및 물리적 형질전환 기술(Bothwell 등, 상동)이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 유전자는 파아지(de Boer 등, 상동), 플라스미드 벡터(Curtiss, In: New Generation Vaccines: The Molecular Approach, Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., pages 161-188 및 269-288 1989) 내로 도입되거나 표적 균주의 염색체(Hone 등, 상동) 내로 접합될 수 있다.

유전자 서열은, 예를 들어, 제조사에 의해 제공되는 절차에 따라서, 어플라이드 바이오시스템즈 3900 고-성능 DNA 합성기(Applied Biosystems ABI^TM 3900 High-Throughput DNA Synthesizer, Foster City, CA 94404 U.S.A.)를 이용하여 합성적으로 제조될 수 있다. 큰 서열, 즉 200 bp보다 큰 서열을 합성하기 위해, 전장 서열의 일련의 분절들이 PCR에 의해 형성되고 당해 분야에 잘 알려진 과정을 이용하여 전장 서열을 형성하기 위해 함께 결찰된다. 그러나, 더 작은 서열, 즉 약 200 bp보다 작은 서열은 단일 회수에서 합성적으로 제조될 수 있다.

재조합 플라스미드는 예를 들어, 바이오레드 진-펄서(BioRad Gene-Pulser)를 이용하여 전기청공에 의해 세균성 균주 내로 도입될 수 있다. cDNA 서열을 검증하기 위해 핵산 서열분석이 표준 자동화 서열분석 기술(예컨대, 어플라이드 바이오시스템즈 자동화 서열분석기(Applied Biosystems automated sequencer), 모델 373A 이용)에 의해 달성될 수 있다. DNA 서열분석 및 중합효소 연쇄반응(본 발명에서 "PCR"로 언급됨)용 DNA 시발체가 합성적으로 제조될 수 있다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 유전적으로 조작되는 세균은 약독화된 침투성 쉬겔라 플렉스네리이고 세균 내로 도입되는 유전자는 진핵 프로모터의 조절 하에 클로닝되고 전기천공에 의해 세균 내로 도입되는 아데노바이러스 VAI 유전자, 로타바이러스의 NSP1, 및/또는 인플루엔자 바이러스의 NS1이다.

본 발명은 또한 본 발명의 재조합 세균성 발현 벡터를 투여하기 위한 제제를 제공한다. 예를 들어, 면역반응을 촉발하는데 사용하기 위한 백신 제제가 제공된다. 당해 제제는 본 명세서에 기술된 바와 같은 하나 이상의 유전적으로 조작된 세균성 균주, 및 약학적으로 적합한 담체를 포함한다. 이러한 (예컨대, 백신으로 사용하기 위한) 조성물의 제조는 당해 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 전형적으로, 이러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로 제조되지만, 정제, 알약, 분말 등과 같은 고체 형태가 또한 고려된다. 투여 전에, 용액 또는 현탁액인, 액체와 혼합하기 위해 고체 형태 또는 농축된 형태가 또한 제조될 수 있다. 제제는 또한 유화될 수 있다. 활성 성분은 약학적으로 허용가능하고 활성 제제와 양립할 수 있는 부형제와 혼합될 수 있다. 적합한 부형제는, 예를 들어, 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등, 또는 이의 조합이다. 또한, 당해 조성물은 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 등과 같은 소량의 보조 성분을 포함할 수 있다. 본 발명의 백신 제제는 항원보강제를 추가로 포함할 수 있는데, 그의 적합한 예시에는 셉픽(Seppic), 퀼(Quil) A, 알하이드로겔(Alhydrogel)과 같은 알루미늄 계 항원보강제가 포함되지만 이들로 한정되는 것은 아니다.

만약 조성물의 경구 형태를 투여하는 것이 바람직하다면, 다양한 증점제, 향미제, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제 등이 첨가될 수 있다. 본 발명의 조성물은 투여에 적합한 형태로 조성물을 제공하기 위해 임의의 이러한 부가적인 성분들을 포함할 수 있다. 제형 내 재조합 세균의 최종 양은 달라질 수 있지만, 일반적으로 약 1-99%일 것이다. 또한, 본 발명의 제제는 단일 유형의 재조합 세균 또는 하나 이상 유형의 재조합 세균을 포함할 수 있다. 초기에, 세균성 벡터 균주는 약 10² - 10⁹ cfu의 용량으로 투여되고, 적합한 경로에 의해 투여된다. 투여 횟수는 개별적인 벡터 균주의 효능, 및 암호화된 관심 재조합 생성물의 원자가, 특정 용도 등에 따라 달라질 수 있다.

백신 제제의 경우, 본 발명은 또한 세균에 의해 암호화된 항원에 대한 면역반응을 촉발하는 방법, 및 이러한 항원과 관련된 질환 또는 상태에 대해 포유동물을 면역접종하는 방법을 제공한다. 면역반응을 촉발함에 의해, 본 발명자는 본 발명의 백신 제제의 투여가 특정 항체의 합성(1 내지 1×10⁶의 범위, 바람직하게는 1×10³의 범위, 더욱 바람직하게는 약 1×10³내지 약 1×10⁶의 범위, 및 가장 바람직하게는 1×10⁶ 이상의 역가로) 및/또는 예컨대, ³H 티미딘 도입에 의해 측정되는 바와 같은, 세포성 증식을 야기함을 의미한다. 당해 방법은 약학적으로 허용가능한 담체 내에 본 발명의 세균성 균주를 포함하는 조성물을 포유동물에 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 조성물은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 주사에 의해, 경구로, 비강 내로, 흡입에 의해, 재조합 세균을 포함하는 식품 제품의 섭취에 의해 등을 포함하는, 당해 분야의 숙련자에게 잘 알려진 임의의 많은 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 투여 방식은 경구, 피하, 진피내 또는 근육내이다.

본 발명은 하기 비-제한적인 실시예에 의해 추가로 설명된다.

도 1. β-갈락토시다제의 진핵 발현을 암호화하는 플라스미드를 포함하는 쉬겔라 플렉스네리 NCD1로 HeLa 또는 BHK-21 세포(IFN 결핍)의 침투 후 세포 용해물의 베타-갈락토시다제 활성. 검정색 막대는 lacZ 유전자를 암호화하는 플라스미드를 포함하는 세균성 균주로의 침투 후 세포로부터의 β-갈락토시다제 활성을 나타내고; 흰색 막대는 lacZ 플라스미드가 부족한 세균성 균주의 침투 후 세포로부터의 β-갈락토시다제 활성을 나타낸다.
도 2. β-갈락토시다제를 암호화하는 플라스미드를 보유하는 쉬겔라 플렉스 네리 NCD1로의 침투 후 및 PKR의 아데노바이러스 유래 억제제(아데노바이러스-연계 I, VAI)를 암호화하는 쉬겔라 플렉스네리 NCD1로의 동시-침투 후에 HeLa 세포 용해물의 β-갈락토시다제.
도 3. 진핵 GFP 리포터 유전자 단독(레인 4) 또는 GFP 플러스 NS1(레인 5) 또는 NSP1(레인 2)을 운반하는 쉬겔라 플렉스네리 균주 MPC51로의 침투 후 HeLa 세포 내 녹색 형광 단백질(GFP)의 형질전이 유전자 발현을 나타내는 면역블롯; 레인 3: 비-침투된 HeLa 세포.
도 4. HeLa 세포 내 NS1 단백질 IFN-α/β 경로의 효과. NS1은 쉬겔라에 의해 유도된 IFN 연계 유전자의 발현(회색 막대)을 억제한다(흑색 막대).
도 5. HeLa 세포 내 VAI RNA 유전자 IFN-α/β 경로의 효과. VAI RNA 유전자는 쉬겔라에 의해 유도된 IFN 연계 유전자의 발현(흰색 막대)을 억제한다(검정색 막대).
도 6. 리포터 벡터를 암호화하는 IFN 길항제의 도식적 지도. GFP 리포터 벡터의 골격 내 IFN 길항제 유전자의 클로닝. RNA 중합효소 III 프로모터의 조절 하에서 VAI RNA 유전자의 전사 및 Pef-a 프로모터를 통한 숙주세포에 의해 GFP 유전자의 발현을 위한 단일 플라스미드 시스템.
도 7. GFP를 암호화하는 플라스미드(pGFP) 또는 GFP 및 VAI IFN-억제제를 암호화하는 플라스미드(pAdgfp)를 보유하는 쉬겔라 플렉스네리로의 HeLa 세포의 침투. GFP의 발현을 토끼 항-GFP 항혈청을 이용한 면역블롯 분석에 의해 결정한다. 증가된 GFP 단백질 발현이 GFP 및 VAI RNA 유전자(pAdgfp) 모두를 포함하는 쉬겔라에 의해 침투된 HeLa 세포 내에서 관찰되었다. 2개의 별개의 실험 결과를 나타내었다.
도 8. IFN 억제제 NS1을 포함하는 플라스미드의 존재 및 부재와 함께 Mtb 항원 85A를 암호화하는 RNA를 운반하는 쉬겔라로 침투된 BHK21 세포의 용해물의 웨스턴 블롯팅. 레인 1, 51 MS85A 28; 레인 2, 51 MS85A 37; 레인 3, 51 MS85A pNS1 28; 레인 4, 51 MS85A pNS1 37; 레인 5, 51 MS85A pNS1 37; 레인 6, S. 플렉스네리 NCD pcDNA-85A; 레인 7, MPC51 pLM2653; 레인 8, BHK21 세포; 레인 9, pcDNA-85A로 형질감염된 BHK21 세포.
도 9A-C. 항-바이러스 면역반응 억제제의 서열. A, 인플루엔자 바이러스 유래 NS1의 DNA 서열(서열번호: 1); B, 로타바이러스 유래 NSP1의 DNA 서열(서열번호: 2); C, 아데노바이러스 유래 VAI의 RNA 유전자 서열(서열번호: 3).

실시예

실시예 1. 재조합 쉬겔라 벡터에 의한 숙주세포 내 타입 I 인터페론 반응의 유도

포유동물 세포 내에서 타입 1 인터페론 반응을 유도하는 세균의 능력을 검사하고 이 반응의 특성을 분석하였다. 실험 조건은 다음과 같다: 반-융합성 단층의 HeLa 세포를 37℃의 6-웰 플레이트에서 100의 다중 감염도(MOI)로 1시간 동안 RNA 일과성 분자를 운반하는 쉬겔라 플렉스네리에 노출시켰다. 세포를 둘베코 변형 이글스 배지(DMEM)로 2회 세척하였다. 150 ㎍/ml 젠타마이신을 포함하는 배지를 세포외 세균을 사멸하기 위해 1시간 동안 세포에 첨가하였다. 이어서, 세포를 2회 세척하고, 10% 우태아혈청(FBS) 함유 DMEM을 첨가하고 감염된 세포를 20시간 동안 배양하였다. 이어서 세포를 인산염 완충 식염수(PBS)로 2회 세척하고 총 RNA를 RNeasy 미니 키트(Qiagen)를 이용하여 분리하였다. 84개 인터페론 관련 유전자의 발현의 상향 조절 또는 하향 조절을 식별하기 위해 인간 인터페론 및 리셉터 RT² 프로파일러^TM PCR 어레이(Superarray Biosciences)를 사용하였다.

그 결과를 표 1에 나타내었다. 나타낸 바와 같이, 인간 세포 내로 쉬겔라 벡터의 침투는 타입 I IFNs 및 IFN 자극 유전자, 예컨대 2'-5'-올리고아데닐레이트 합성효소(2'-5'-OAS)의 전사 유도를 야기한다. 검사된 89개 유전자 중에서, 74개는 전사에서 2-배 이상의 증가를 나타내었다.

또한, 추가의 실험은 IFN-α/β 결핍 세포 내로 쉬겔라에 의해 전달된 플라스미드 DNA 일과성 분자로부터 리포터 유전자의 발현이 완전한 IFN 시스템을 갖는 세포와 비교하여 증가하였음을 나타낸다(도 1).

이러한 결과는 IFN 자극 유전자가 세균성 벡터에 의해 포유동물 세포에 전달된 일과성 분자로부터 유전자의 발현을 억제함을 나타낸다.

감별 IFN 관련 유전자 발현: 쉬겔라-침투 HeLA 세포와 비-침투 HeLa 세포의 비교

유전자	유도 배수
ADAR (RNA에 작용하는 아데노신 디아미나제)	3.37
CNTFR (섬모 신경영향 인자 수용체)	3.54
CRLF2 (사이토카인 수용체-유사 인자 2)	3.10
CSF2RA (콜로니 자극 인자 2 수용체)	2.80
CSF3R (콜로니 자극 인자 3 수용체)	5.44
CXCL10 (케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 10)	649.87
EBI3 (엡스타인-바 바이러스 유도 유전자 3)	4.30
F3 응고 인자 III (트롬보플라스틴, 조직 인자)	2.90
IL20RB (인터루킨 20 수용체 베타)	1.35
ISG15 (인터페론 자극 유전자 15)	13.87
IFI6 (인터페론, 알파-유도성 단백질 6)	18.69
IFI16 (인터페론, 감마-유도성 단백질 16)	5.11
IFI27 (인터페론, 알파-유도성 단백질 27)	52.13
IFI30 (인터페론, 감마-유도성 단백질 30)	1.56
IFI35 (인터페론-유도 단백질 35)	4.54
IFI44 (인터페론-유도 단백질 44)	5.22
IFI44L (인터페론-유도 단백질 44-유사)	7.33
IFIH1 (헬리케이즈 C 도메인 1로 유도된 인터페론)	65.53
IFIT1 (테트라트리코펩티드 반복-1 함유 인터페론-유도 단백질)	12.94
IFIT1L (테트라트리코펩티드 반복-1-유사 함유 인터페론-유도 단백질)	13.21
IFIT2 (테트라트리코펩티드 반복-2 함유 인터페론-유도 단백질)	6.47
IFIT3 (테트라트리코펩티드 반복-3 함유 인터페론-유도 단백질)	19.08
IFITM1 (인터페론 유도 막투과 단백질 1)	3.47
IFITM2 (인터페론 유도 막투과 단백질 2)	0.85
IFNA1 (인터페론, 알파 1)	2.34
IFNA14 (인터페론, 알파 14)	3.02
IFNA2 (인터페론, 알파 2)	19.48
IFNA21 (인터페론, 알파 21)	14.66
IFNA4 (인터페론, 알파 4)	7.86
IFNA5 (인터페론, 알파 5)	37.90
IFNA6 (인터페론, 알파 6)	3.28
IFNA8 (인터페론, 알파 8)	3.77
IFNAR1 (인터페론 (알파, 베타 및 오메가) 수용체 1)	2.44
IFNAR2 (인터페론 (알파, 베타 및 오메가) 수용체 2)	3.72
IFNB1 (인터페론, 베타 1)	21.92
IFNE1 (인터페론 엡실론 1)	1.72
IFNG (인터페론, 감마)	6.21
IFNGR1 (인터페론-감마 수용체 1)	8.08
IFNGR2 (인터페론-감마 수용체 2)	3.13
IFNK (인터페론, 카파)	5.40
IFNW1 (인터페론, 오메가 1)	18.18
IFRD1 (인터페론-관련 발달 조절인자 1)	8.36
IFRD2 (인터페론-관련 발달 조절인자 2)	1.07
IL10RA (인터루킨 10 수용체, 알파)	9.67
IL10RB (인터루킨 10 수용체, 베타)	3.28
IL11RA (인터루킨 11 수용체, 알파)	2.02
IL12B (인터루킨 12, 베타)	31.00
IL13RA1 (인터루킨 13 수용체, 알파-1)	1.64
IL15 (인터루킨 15)	2.59
IL20RA (인터루킨 20 수용체, 알파)	2.82
IL21R (인터루킨 21 수용체)	6.21
IL22RA2 (인터루킨 22 수용체, 알파-2)	8.78
IL28A (인터루킨 28, 알파)	5.26
IL28RA (인터루킨 28 수용체, 알파)	1.94
IL29 (인터루킨 29)	25.71
IL2RB (인터루킨 2 수용체, 베타)	9.47
IL2RG (인터루킨 2 수용체, 감마)	26.61
IL31RA (인터루킨 31 수용체, 알파)	5.22
IL3RA (인터루킨 3 수용체, 알파)	12.85
IL4R (인터루킨 4 수용체)	4.33
IL5RA (인터루킨 5 수용체, 알파)	3.24
IL6 (인터루킨 6)	42.34
IL6R (인터루킨 6 수용체)	11.91
IL7R (인터루킨 7 수용체)	22.38
IL9R (인터루킨 9 수용체)	1.91
IRF1 (인터페론 조절성 인자 1)	20.03
IRF2 (인터페론 조절성 인자 2)	3.85
IRF2BP1 (인터페론 조절성 인자 2 결합 단백질 1)	2.32
IRF2BP2 (인터페론 조절성 인자 2 결합 단백질 2)	4.94
IRF3 (인터페론 조절성 인자 3)	1.88
IRF4 (인터페론 조절성 인자 4)	49.32
IRF5 (인터페론 조절성 인자 5)	5.75
IRF6 (인터페론 조절성 인자 6)	5.67
IRF7 (인터페론 조절성 인자 7)	3.02
IRF8 (인터페론 조절성 인자 8)	30.36
IRGM (면역-관련 GTPase 패밀리, M)	350.68
LEPR (렙틴 수용체)	2.23
MPL (골수증식성 백혈병 단백질)	4.64
MX1 (믹소바이러스 (인플루엔자) 내성 1)	13.40
OAS1 (2'-5'-올리고아데닐레이트 합성효소)	8.66
PSME1 (프로테아솜 (프로솜, 마크로페인) 활성인자 아단위 1)	1.13
PYHIN1 (피린 및 HIN 도메인)	2.63
SP110 (핵체 단백질)	1.82
TTN (중심 근섬유분절 단백질, 틴틴 암호화)	45.07
B2M (베타-2-저분자글로불린)	2.21
HPRT1 (하이포잔틴 포스포리보 실전이효소 1)	0.68
RPL13A (리보좀 단백질 L13a)	0.49
GAPDH (글리세르알데하이드-3-인산 탈수소효소)	0.98
ACTB (액틴, 베타)	1.39

실시예 2. 세균성 벡터에 의해 전달된 일과성 핵산의 발현 시 타입 I IFN 반응을 억제하는 세균성 전달 시스템의 제작

본 실시예는 타입 I IFN 반응을 억제하는 2개의 세균성 전달 시스템의 제작 및 용도와 일과성 핵산의 발현에 대한 이들의 효과를 기술한다. 두 경우 모두, 핵산은 전기천공에 의해 약독화된, 침투성 쉬겔라 플렉스네리 균주 내로 유전적으로 조작되었다. 쉬겔라 플렉스네리는 많은 조직 배양 세포주 및 동물 모델에서 본래 침투성이기 때문에 선택되었다. 쉬겔라 균주는 진핵 세포의 침투 후 용해되고 세포내이입 소포로부터 회피하여, 일과성 분자가 진핵 세포의 세포질 내로 분비되게 하는 도입된 염색체 돌연변이를 수반한다.

제1 세트의 실험에서, 전기-적격(electro-competent) 쉬겔라 플렉스네리 균주 NCD1을 준비하고 E. coli 베타-갈락토시다제-발현 리포터 벡터 pcDNA3.1/His/lacZ(Invitrogen)로 전기천공시켰다. 리포터 벡터 pcDNA3.1/His/lacZ는 포유동물 세포 내에서 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터의 조절 하에서 E. coli 베타-갈락토시다제를 발현하여, 벡터의 전달 후 포유동물-매개 유전자 발현의 용이한 분석을 허용한다. 본 실험에 사용된 인터페론 내성 유전자는 아데노바이러스-연계 I(VAI) RNA 유전자였다. 아데노바이러스 RNA 유전자는 아데노바이러스 감염 후 RNA 중합효소 III에 의해 대량으로 전사되는 것으로 알려져 있다(Reich 등, J. Mol. Biol. 17, 428, 1966; Price 등, J. Virol. 9, 62, 1972; Weinmann 등, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 71, 3426; Soderlund 등, Cell 7, 585, 1976). 아데노바이러스는 인터페론-유도, 이중-가닥 RNA-활성화 단백질 키나제 PKR의 활성화를 차단함으로써 세포성 항바이러스 반응에 대한 방어로서 바이러스-암호 바이러스-연계 RNA를 사용한다(Galabru J, Katze MG, Robert N, Hovanessian AG. Eur J Biochem. 1989 Jan 2; 178(3): 581-9). 1,724 bp 삽입체 상에 아데노바이러스 바이러스-연계 I(VAI) RNA 유전자를 포함하는 pAdVAntage 벡터를 또한 쉬겔라 플렉스네리 NCD1 균주 내로 전기천공하였다. 전기천공에 의한 HeLa 세포의 쉬겔라 플렉스네리 균주로의 감염은 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하였다. 간략히 설명하면, VAI 유전자의 항-인터페론 효과를 검사하기 위해, HeLa 세포를 1) 베타-갈락토시다제 리포터 벡터(pcDNA3.1/His/lacZ)를 포함하는 쉬겔라 플렉스네리 NCD1 및 pAdVAntage 벡터를 포함하는 쉬겔라 플렉스네리 NCD1; 또는 2) 베타-갈락토시다제 리포터 벡터만을 포함하는 쉬겔라 플렉스네리 NCD1 균주로 감염시켰다. 24시간 후, 베타-갈락토시다제 분석 시약(Stratagene)을 세포 용해 및 세포 추출물 내 베타-갈락토시다제 활성 분석 모두에 사용하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다. 나타낸 바와 같이, 베타-갈락토시다제 활성에 있어서의 큰 증가가 베타-갈락토시다제 리포터 벡터 및 VAI 항-인터페론 벡터 모두를 포함하는 쉬겔라에 의해 침투된 HeLa 세포에서 관찰되었다.

유사하게, 제2 세트의 실험에서, 리포터 유전자 녹색 형광 단백질(GFP)을 운반하는 재조합 이중-가닥 RNA 뉴클레오캡시드(rdsRN)를 포함하는 쉬겔라 벡터 균주를 진핵 발현 벡터 pcDNA 3.1 zeo(+)(Invitrogen) 내에 클로닝된 인플루엔자-A NS1 또는 로타바이러스 NSP1을 암호화하는 서열로 전기천공하였다. 그렇게 수득된 쉬겔라 균주는 모두 RNA 뉴클레오캡시드(rdsRN) 내 GFP 유전자 및 pcDNA 내 NSP1 또는 NS1을 모두 포함하고 있다. BHK-21 및 HeLa 세포를 GFP 및 NSP1- 또는 NS1-발현 플라스미드 보유 쉬겔라 균주, 또는 GFP-발현 플라스미드만을 보유하는 쉬겔라 균주로 감염시켰다. 16시간 후, 침투된 HeLa 세포를 녹색 형광에 대해 검사하였고 HeLa 세포 용해물을 면역블롯에 의해 GFP 단백질에 대해 분석하였다. 형광 결과는 GFP 단백질의 발현이 GFP 유전자(결과 미제공)만을 보유하는 쉬겔라 균주로 침투된 세포와 비교하여, NS1- 또는 NSP1-발현 플라스미드 보유 쉬겔라 균주로 침투된 세포에서 증가하였음을 나타내었다. 진핵 세포에 의해 생산된 총 단백질의 면역블롯팅은 NS1 또는 NSP1-발현 플라스미드 보유 쉬겔라 균주로 침투된 세포에서 더 높은 GFP 발현을 확인하였다(도 3).

이러한 발견은 타입 I 인터페론 반응의 억제제(예컨대, VAI, NS1 또는 NSP1)를 암호화하는 유전자의 포유동물 세포 내 세균성 벡터에 의한 발현은 관심 단백질(예컨대, 베타-갈락토시다제 또는 GFP)을 암호화하는 형질전이 유전자의 동시-발현을 증강시킴을 보여준다. 본 실시예에 기술된 결과는 관심 단백질의 증가된 발현이 세균성-계 전달 시스템을 이용한 IFN 반응에 의해 약화됨으로써 달성될 수 있음을 보여주는 첫 번째 증거이다.

실시예 3. 재조합 쉬겔라 벡터에 의한 포유동물 숙주세포 내 타입 I 인터페론 반응의 유도는 인터페론 길항제에 의해 억제된다.

본 실시예는 포유동물 세포 내 세균에 의해 유도되는 인터페론 자극 유전자(ISGs)의 발현을 억제하는 인터페론 길항제의 능력을 기술한다. 이들 실험에 사용된 쉬겔라 플렉스네리 균주는 이 균주가 진핵 세포에 침투한 후 용해되는 것을 야기하는 염색체 돌연변이를 운반한다. 쉬겔라는 숙주세포 내에서 포유동물 세포의 세포질 내로 인터페론 길항제를 포함하는 일과성 플라스미드 분자의 분비를 가능케 하는, 세포내이입 소포를 회피하기에 충분히 생존한다. 쉬겔라 균주는 리포터 유전자 녹색 형광 단백질(GFP)을 암호화하는 재조합 뉴클레오캡시드를 포함하고 발현한다. S. 플렉스네리 균주를 각각 플라스미드 벡터 pcDNA3.1 zeo(+) 및 pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 클로닝되어 있는 인플루엔자-A NS1 유전자 또는 아데노바이러스 VAI RNA 유전자로 전기천공하였다. NS1 유전자 또는 VAI RNA 유전자를 보유하는 이들 S. 플렉스네리 균주를 포유동물 세포 내 유전자 발현을 연구하기 위해 사용하였다.

실험 조건은 다음과 같다: 반-융합성 단층의 HeLa 세포를 37℃, 6-웰 플레이트에서 100 다중감염도(MOI)로 1시간 동안 IFN 억제 유전자를 운반하는 S. 플렉스네리에 노출시켰다. 세포를 이글스 최소 필수 배지(EMEM)로 세척하고 150 ㎍/ml 젠타마이신을 함유하는 EMEM을 세포외 세균을 사멸하도록 1시간 동안 세포에 첨가하였다. 이어서, 세포를 2회 세척하고, 신선한 EMEM을 첨가하고 침투된 세포를 20시간 동안 배양되게 하였다. 그 후에 세포를 인산염 완충 식염수(PBS)로 2회 세척하고 총 RNA를 RNeasy 미니 키트(Qiagen)를 이용하여 분리하였다. 인간 인터페론 및 수용체 RT²프로파일러^TM PCR 어레이(Superarray Biosciences)를 84개 인터페론 관련 유전자의 상향 조절 또는 하향 조절을 식별하기 위해 사용하였다.

그 결과를 표 2에 나타내었다. 나타낸 바와 같이, 인간 세포 내로의 S. 플렉스네리의 침투는 2'-5'-올리고아데닐레이트 합성효소(2'-5'-OAS)와 같은 타입 I IFNs 및 IFN 자극 유전자의 전사적 유도를 야기하였다. 유도된 유전자는 S. 플렉스네리에 의해 벡터화된 일과성 핵산의 전사 및 번역의 억제에 관여한다. 그러나, 도 4에 나타난 바와 같이, 인터페론 길항제 NS1 유전자를 운반하는 S. 플렉스네리 균주로 침투된 HeLa 세포는 S. 플렉스네리 단독으로 침투된 세포와 비교하여 더 낮은 수준의 ISGs 발현을 나타내었다. 이러한 결과는 NS1이 포유동물 세포 내 ISGs의 세균적으로 유도된 발현을 억제함을 입증한다.

실시예 4. 인터페론 길항제에 의한 인터페론 자극 유전자(ISGs)의 발현 억제

본 실시예는 포유동물 세포 내 세균에 의해 유도된 인터페론 자극 유전자(ISGs)의 발현을 억제하는 인터페론 길항제의 능력을 기술한다. 이 실험에 사용된 쉬겔라 균주는 이 균주가 진핵 세포에 침투한 후 용해되고, 포유동물 세포의 세포질 내로 인터페론 길항제를 포함하는 일과성 플라스미드 분자의 분비를 가능케 하는 세포내이입 소포로부터 회피하는 것을 야기하는 염색체 돌연변이를 운반한다. 쉬겔라 플렉스네리 균주 NCD를 각각 플라스미드 벡터 pcDNA3.1 zeo(+) 및 pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 클로닝되어 있는 인플루엔자-A NS1 유전자 또는 아데노바이러스 VAI RNA 유전자로 전기천공하였다. 그렇게 NS1 유전자 또는 VAI RNA 유전자를 보유하는 쉬겔라 균주를 타입 I IFN 반응의 유도 및 억제를 연구하기 위해 사용하였다.

실험 조건은 다음과 같다: 반-융합성 단층의 HeLa 세포를 37℃, 6-웰 플레이트에서 100 다중감염도(MOI)로 1시간 동안 IFN 억제제 유전자(NS1 또는 VAI)를 운반하는 쉬겔라 플렉스네리에 노출시켰다. 세포를 이글스 최소 필수 배지(EMEM)로 세척하고 150 ㎍/ml 젠타마이신을 함유하는 신선한 EMEM을 세포외 세균을 사멸하도록 1시간 동안 세포에 첨가하였다. 이어서, HeLa 세포를 2회 세척하고, 신선한 EMEM을 첨가하고 세포를 침투 후 20시간 동안 배양되게 하였다. 그 후에 HeLa 세포를 인산염 완충 식염수(PBS)로 2회 세척하고 총 RNA를 RNeasy 미니 키트(Qiagen)를 이용하여 분리하였다. 인간 인터페론 및 수용체 RT²프로파일러^TM PCR 어레이(Superarray Biosciences)를 84개 인터페론 관련 유전자의 상향 조절 또는 하향 조절을 식별하기 위해 사용하였다.

표 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 인간 세포 내로의 쉬겔라의 침투는 침투되지 않은 세포와 비교하여 2'-5'-올리고아데닐레이트 합성효소(2'-5'-OAS)와 같은 타입 I IFNs 및 IFN 자극 유전자의 전사적 유도를 야기하였다. 그러나, 도 4에 나타난 바와 같이, 타입 I 인터페론 길항제 NS1 유전자를 운반하는 쉬겔로 균주로 침투된 HeLa 세포는 쉬겔라 단독과 비교하여 더 낮은 수준의 ISGs 발현을 나타내었다. 이러한 결과는 세균적으로 유도된 ISGs의 발현을 억제함을 입증한다. 유사하게, 아데노바이러스 VAI RNA 유전자를 발현하는 쉬겔라로 감염된 HeLa 세포의 qRT-PCR 발현 연구는 CXCL10 및 MX2와 같은 ISGs의 발현이 또한 인터페론 길항제에 의해 억제되었음을 나타낸다(도 5). 상기 결과는 세균성 벡터에 의해 암호화된 이종 유래 일과성 유전자의 더욱 강력한 발현을 허용하는 IFN 반응 억제의 잠재적인 분자 기작을 설명한다.

이러한 결과는 세균성 벡터로부터 타입 I IFN 반응의 바이러스성 억제제의 발현이 감염된 세포의 IFN 반응을 억제함을 보여준다.

쉬겔라에 의해 벡터화된 일과성 핵산의 전사 및 번역의 억제에 관여하는 분자의 과발현: 쉬겔라-침투된 HeLa 세포 대 비-침투된 HeLa 세포의 비교

유전자 기호	유도 배수
CXCL10	1937
ISG15	30
IF16	40
IF127	225
IFI44L	23
IFIH1	35
IFIT1	25
IFT2	28
IFIT3	30
IFN6	17
IFNB1	12
IFN12B	10
IL 12RG	32
IRF4	9
OAS	13

실시예 5. 동시-발현 IFN 길항제에 의해 개선된 세균-계 형질전이 유전자 발현 전달 시스템의 제작

플라스미드 벡터를 리포터 유전자 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하도록 제작하였다. GFP 유전자를 아큐프라임(Accuprime) DNA 중합효소(Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 HpaI 및 NotI 제한효소 부위를 포함하는 시발체를 사용하여 PCR 증폭하였다. 증폭된 서열의 크기를 아가로스 겔 전기영동으로 확인하고, 제조사의 지침(Qiagen, Cat. No. 28106, Valencia, CA)에 따라 퀴아퀵(QIAquick) PCR 정제 키트를 사용하여 정제하였다. GFP 유전자를 포유동물 발현 플라스미드 p슈터(pShooter)(Invitrogen, Carlsbad, CA)의 HincII 및 NotI 부위(New England Biolabs, Beverly, MA) 내로 클로닝하였다. p슈터 벡터 내 발현은 강력한, 구성적 인간 EF-1α 프로모터에 의해 유도된다. 본 실험에 사용된 인터페론 내성 유전자는 RNA 중합효소 III 프로모터에 의해 유도된 아데노바이러스-연계 I(VAI) RNA 유전자였다. RNA 중합효소 III 프로모터의 VAI RNA 유전자 하류를 암호화하는 유전자를 PCR 증폭하고 GFP p슈터 벡터의 EcoRI 부위 내로 클로닝하였다. 수득된 구조물의 지도를 도 6에 나타내었다.

적합한 삽입물을 보유하는 재조합 플라스미드를 확인하고 신규한 플라스미드를 pAdgfp로 명명하였다. pAdgfp 벡터를 쉬겔라 플렉스네리 NCD1 균주 내로 전기천공하였다. HeLa 세포의 침투를 실시예 3에 기술된 바와 같이 수행하였다. 간략히 설명하면, VAI 유전자의 효과를 증가시키는 발현을 검사하기 위해, HeLa 세포 를 플라스미드(GFP 및 VAI 암호화)를 포함하는 쉬겔라 플렉스네리 NCD1 또는 GFP만을 암호화하는 p슈터 플라스미드(pGFP)를 운반하는 쉬겔라 플렉스네리 NCD1 균주로 침투시켰다. 24시간 후, 각 웰의 세포를 용해시키고 GFP 특이적 항혈청으로 면역블롯팅하여 분석하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다. 나타낸 바와 같이, GFP 발현의 증가가 GFP 및 항-인터페론 VAI RNA 유전자 모두를 포함하는 쉬겔라로 침투된 HeLa 세포 내에서 관찰되었다.

실시예 6. 인플루엔자 인터페론 억제제 NS1을 발현하는 약독화된 쉬겔라 플렉스네리에 의해 진핵 세포 내로 전달될 때 플라스미드 암호화된 베타-갈락토시다제의 증가된 발현

CMV 프로모터의 번역 조절 하에서 베타-갈락토시다제를 암호화하는 플라스미드(pcDNA-lacZ)를 쉬겔라 플렉스네리 NCD 내로 전기천공하였다. 인플루엔자 A NS1 유전자(pEF NS1)를 암호화하는 두 번째 플라스미드를 또한 별개의 쉬겔라 플렉스네리 NCD 균주 내로 전기천공하였다. pEF NS1 벡터 내에서, NS1 유전자 발현은 강력한, 구성적 인간 EF-1α 프로모터에 의해 유도된다. HeLa 세포의 쉬겔라 플렉스네리 균주로의 침투는 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행되었다. 간략히 설명하면, NS1 유전자의 항-인터페론 효과를 검사하기 위해, HeLa 세포를 베타-갈락토시다제 리포터 벡터(pcDNA3.1/His/lacZ)를 포함하는 쉬겔라 플렉스네리 NCD 및 pEF NS1 벡터를 포함하는 쉬겔라 플렉스네리 NCD로, 또는 쉬겔라 플렉스네리 NCD 균주 단독(벡터 부재)으로 동시-침투시켰다. 18시간 후, 베타-갈락토시다제 분석 시약(Stratagene)을 HeLa 세포 용해 및 세포 추출물 내 베타-갈락토시다제 활성 분석에 모두 사용하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다. 나타낸 바와 같이, 베타-갈락토시다제 활성의 큰 증가가 베타-갈락토시다제 리포터 벡터 및 NS1 유전자 모두를 포함하는 쉬겔라에 의해 동시-침투된 HeLa 세포 내에서 관찰되었다.

포유동물 세포 내 베타-갈락토시다제 활성

균주	프로모터 유형	β-갈락토시다제 특이적 활성(OD)
HeLa 대조군 세포	NA	0.047
NCD	NA	0.03
NCD pcDNA3.1-lacZ	CMV 프로모터	0.46
NCD pEF-NS1	EF-1α 프로모터	0.050
NCD pcDNA3.1-lacZ+pEFNS1	CMV EF-1α 프로모터	1.8

실시예 7. 인플루엔자 인터페론 억제제 NS1을 발현하는 약독화된 쉬겔라 플렉스네리에 의해 전달될 때 캡시드-암호화된 MTB 항원 85A의 발현

재조합 뉴클레오캡시드를 S 및 M RNA 분절 모두에서 미코박테륨 투베르쿨로 시스 항원 85A(51 MS85A)를 발현하도록 제작하였다. 침투 분석을 이들 캡시드 ± 인플루엔자 NS1 유전자를 발현하는 쉬겔라 플렉스네리 및 CMV 프로모터의 조절 하에 포유동물 플라스미드 상에서 항원 85A를 발현하는 S. 플렉스네리 균주(pcDNA-85A)를 사용하여 수행하였다. 세균을 28℃ 또는 37℃에서 초기 대수증식기까지 성장시키고 S. 플렉스네리 병원성 유전자의 발현을 유도하기 위해 교반 없이 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 이 세균을 이글스 최소 필수 배지(EMEM) 내에 재현탁하고 10⁶ 세포/웰로 6-웰 플레이트에 접종되어 있는 BHK21 세포로 100 MOI에서 37℃ + 5% CO₂에서 1시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS로 3회 세척하고 임의의 세포외 세균을 사멸하기 위해 EMEM + 젠타마이신(150 ㎍/ml)으로 배양하였다. 이어서 세포를 PBS로 3회 세척하고 EMEM 배지 내에서 20시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS로 1회 세척하고 250:1 MPER 포유동물 단백질 추출 시약(Pierce)으로 용해시켰다. 30:1의 각 세포 추출물을 SDS-PAGE 겔 상에 로우딩하고, 니트로셀룰로스 막에 옮긴 후 항원 85A에 대한 항혈청으로 면역블롯팅하였다(도 8). 항원 85A의 발현이 28℃에서 성장한 NS1 유전자를 발현하는 플라스미드(MS85A pNS1)를 함유하는 85A 캡시드 균주 내 BHK-21 세포에서만 확인되었다(레인 3). 28℃ 또는 37℃에서 성장한 pNS1이 없는 MS85A 또는 37℃에서 성장한 MS85A pNS1로부터는 어떠한 발현도 확인되지 않았다(레인 1, 2 및 4). 이는 NS1 단백질의 발현이 S. 플렉스네리 균주에 의해 전달되는 재조합 뉴클레오캡시드에 의해 암호화되는 항원의 발현에 필요함을 나타낸다.

실시예 8. 세균 및 포유동물 세포 모두에서 인터페론 내성 유전자와 포유동물 세포 내에서 관심 단백질만을 발현하는 발현 벡터의 제작

플라스미드 벡터를 HIV-1의 면역우세 Gag 펩티드를 발현하도록 제작한다. 600 bp 단편을 합성 gag 유전자로부터 PCR 증폭한다. 이 서열은 아큐프라임 DNA 중합효소(Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 HpaI 및 NotI RE 부위를 포함하는 시발체를 이용하여 증폭된다. 증폭된 서열의 크기를 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인하고, 제조사의 지침에 따라서 퀴아퀵 PCR 정제 키트를 사용하여 정제한다(Qiagen, Cat. No. 28106, Valencia, CA). 600 bp gag 유전자를 발현 벡터 플라스미드 pcDNA3.1zeo(+)(Invitrogen, Carlsbad, CA)의 EcoRV 및 NotI 부위(New England Biolabs, Beverly, MA) 내로 클로닝한다. 적합한 삽입물을 보유하는 재조합 플라스미드를 동정하고 신규한 플라스미드를 pGAG4X로 명명한다.

인터페론 내성 유전자(예컨대, NS1 또는 NSP1)를 적합한 진핵 프로모터(예컨대, SV40 프로모터) 또는 원핵 프로모터(예컨대, arg1의 하우스 키핑(house keeping) 프로모터), 또는 모두의 조절 하에 pGAG4X 벡터 내로 클로닝하여, 이중 발현 벡터를 형성한다. (본 명세서에 기술된 특정 진핵 및 원핵 프로모터 서열이 벡터의 제작에 결정적인 것은 아니며 기타 적당한 프로모터가 당해 분야의 숙련자에게 자명할 것이다.) 따라서, 본 발현 벡터는 세균 및 포유동물 세포 모두에서 인터페론 내성 유전자를 발현한다; 그러나 관심 단백질(예컨대, HIV-1의 Gag)은 포유동물 세포에서만 발현된다. 이러한 접근법은 포유동물 세포에서 관심 외래 단백질 또는 억제성 RNAs의 발현을 위한 일과성 RNA/DNA 및 기타 분자들의 전사 안정성 및 후속된 번역을 향상시킨다.

실시예 9. 백신으로서 IFN 반응을 억제하도록 유전적으로 조작된 재조합 세균성 발현 벡터의 사용

임의의 세균성 생-벡터 백신의 효능은 목적하는 보호적 면역반응을 개시하도록 인간 면역체계에 대해 외래 항원을 충분히 발현하는 그의 능력에 근거한다. 그러나, 일과성 DNA/RNA 분자는 숙주 방어 시스템, 즉 IFN 반응으로 인해 생체 내에서 불안정해져서 외래 유전자의 손실 및 의도된 면역반응의 감소를 야기할 수 있다. 본 발명은 IFN 방어 시스템을 약화시킴으로써 숙주세포 내 높은 수준의 항원의 합성에 대한 해답을 제공한다.

IFN 내성 및 관심 항원을 암호화하는 유전자의 전달 및 발현은 관심 형질전이 유전자 및 타입 I IFN 반응의 억제제를 암호화하는 핵산을 운반하는 비-병원성 또는 약독화된 세균성 백신 벡터로의 표적 세포(조직, 유기체 등)의 접종에 의해 달성될 수 있다. 관심 생물학적 반응에는 보호적 또는 조절성 면역반응; 치료적 반응; 및 숙주 단백질의 유전자 발현의 하향-조절(예컨대, siRNA) 및 유전자 발현의 상향-조절(예컨대, 사이토카인 발현)이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

일단 비-병원성 또는 약독화된 세균성 백신 벡터 균주가 선택되면, 균주는 인터페론 반응 억제 균주로 제공하기 위해 변경된다. 이는 균주 내로 하나 이상의 IFN 내성 유전자의 도입을 수반하는 상기에 기술된 전략을 사용하여 달성된다.

타입 I IFN 내성 유전자 및 관심 항원을 포함하는 균주를 형성하기 위해, 시험관 내에서 합성된 유전자(들)를 전기천공에 의해 균주 내로 도입하고 형질전환체를 재조합 플라스미드 내 양성 선별 대립유전자를 보유하고 발현하는 균주의 성장만을 허용하는 조건 하에서(예컨대, 항생제 내성 또는 영양요구성의 상보성) 고체 배지 상에서 분리한다. 생 벡터에 의한 발현 플라스미드의 유전적 성질을 증가시키는 하나의 방법은 세균성 염색체 내에 도입된 돌연변이를 보완하도록 고안된 일과성 핵산의 제작을 포함한다. 플라스미드-계 상보성 시스템에서, 세균의 세포질 내에서 복제하는 플라스미드는 성장하고 복제하기 위해 세균에 의해 요구되는 결정적인 단백질을 발현하고; 이러한 플라스미드의 손실은 결정적인 단백질을 발현하는 세균의 능력을 제거하고 세포 사멸을 초래한다. (임의의 무-플라스미드 세균의 사멸을 초래하는, 세균성 복제 동안 플라스미드 손실 현상은 또한 "후-분리성 사멸(post segregational killing)"로 언급된다.) 이러한 시스템은 살모넬라 타이피뮤리움 내에서 성공적으로 사용되었고 아스파라진산 β-세미알데하이드 탈수소효소(Asd)를 암호화하는 asd 유전자의 발현에 근거한다(Galen 등, Gene 1990; 49: 29-35). Asd는 그람-음성 세균 내 세포벽의 형성에 필수적인 구조적 성분의 합성에 관여하는 결정적인 효소이다. 따라서, 이렇게 결정적인 효소를 암호화하는 플라스미드의 손실은 염색체로부터 Asd를 합성하지 못하는 임의의 세균에 대해 치명적일 것이다.

투여되는 이러한 재조합 세균의 양은 치료되는 질환 또는 상태뿐만 아니라, 대상의 종에 따라 달라진다. 일반적으로, 사용되는 투여량은 약 10³ 내지 10¹¹ 생육가능 유기체, 바람직하게는 약 10³ 내지 10⁹ 생육가능 유기체이다. DNA/RNA 일과성 분자를 보유하는 세균성 벡터는 일반적으로 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 함께 투여된다. 사용된 특정한 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제가 본 발명에 결정적인 것은 아니다. 희석제의 예시에는 인산염 완충 식염수, 위 내에서 위산에 대해 완충작용을 하는 완충제, 예컨대 수크로스 함유 구연산 완충제(pH 7.0), 중탄산염 완충제(pH 10) 단독(Levine 등, J. Clin. Invest., 79: 888-902; 1987; Black 등, J. Infect. Dis., 155: 1260-1265; 1987), 또는 아스코르브산, 락토스, 및 선택적으로 아스파르탐을 함유하는 중탄산염 완충제(Levine 등, Lancet, II: 467 470; 1988)가 포함된다. 담체의 예시에는 예컨대, 탈지유에서 발견되는 바와 같은, 단백질, 예컨대, 수크로스와 같은, 당, 또는 폴리비닐피롤리돈이 포함된다. 전형적으로 이들 담체는 약 0.1-90 %(w/v)의 농도로 사용될 것이지만 바람직하게는 1-10 %(w/v)의 비율로 사용될 것이다.

벡터 균주의 생물학적 활성을 적합한 동물 모델(예컨대, 마우스, 토끼, 기니픽 또는 붉은털 원숭이)에서 평가한다. 먼저, 세균성 벡터 균주를 10² - 10⁹ cfu의 용량으로 투여하고, 적합한 경로에 의해 투여한다(예컨대, E. coli, 살모넬라 및 쉬겔라는 위내로 또는 비강내로 주어질 수 있다). 투여 횟수는 개별적인 벡터 균주의 효능, 및 암호화된 관심 재조합 생성물의 원자가, 특정 용도 등에 따라 달라질 수 있다.

동물 모델에서 암호화된 생성물에 대한 면역 및 기타 생물학적 반응의 측정 방법은 당해 분야의 숙련된 자에게 잘 알려져 있다. 항원에 대한 혈청 IgG 및 IgA 반응을 측정하기 위해, 혈청을 면역접종 전 및 그 후 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 및 80일째에 회수하였다. 약 400-500 ㎕의 혈액을 별개의 튜브에 회수하고 얼음 중에 4시간 동안 보관하여 응고되게 한다. 5분간 원심분리기 내에서 원심분리 후, 혈청을 새 튜브에 옮기고 -80℃에 보관한다. 관심 유전자에 의해 발현된 항원에 대한 점막 IgG 및 IgA 반응을 면역접종 전 및 그 후에 일정한 간격으로 회수될 대변 침전물 및 질 세척액을 이용하여 결정하였다(Srinivasan 등, Biol. Reprod. 53: 462; 1995; Staats 등, J. Immunol. 157: 462; 1996). 표준 ELISAs를 혈청 및 점막 시료 내 관심 항원에 대한 IgG 및 IgA 반응을 정량하는데 사용한다(Abacioglu 등, AIDS Res. Hum. Retrovir. 10: 371; 1994; Pincus 등, AIDS Res. Hum. Retrovir. 12: 1041; 1996). 난 알부민은 음성 대조군 항원으로서 각 ELISA에 포함될 수 있다. 또한, 각 ELISA는 양성 대조군 혈청, 대변 침전물 또는 질 세척액 시료를 적절히 포함할 수 있다. 양성 대조군 시료는 기술된 바와 같이, 10 μg 콜레라 독소와 혼합된 관심 유전자에 의해 발현된 10 μg의 항원이 비강 내로 면역접종된 동물로부터 회수된다(Yamamoto 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 5267; 1997). 종말점 역가는 음성 대조군 열의 평균과 3개의 표준 오차 값의 합보다 큰 490 nm에서의 흡광도에 있어서의 증가를 야기하는 최후 혈청 희석의 역수를 취함으로써 계산된다.

세포성 면역은 세포 내 사이토카인 염색(세포 내 사이토카인 세포계산으로도 언급됨)에 의해 또는 ELISPOT(Letsch A. 등, Methods 31: 143-49; 2003)에 의해 측정될 수 있다. ICS가 또한 항원-특이적 CD4+ 및 CD8+ T-세포를 표현형적으로 특정하기 위해 동시 능력을 부가한다고 하더라도, 두 방법 모두 항원-특이적 면역반응의 정량을 가능케 한다. 이러한 분석은 IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-IO 및 IFN-을 분비하는 항원-특이적 T 세포의 개수를 평가할 수 있다(Wu 등, AIDS Res. Hum. Retrovir. 13: 1187; 1997). ELISPOT 분석은 기술되고(Wu 등, Infect. Immun. 63: 4933; 1995) 이전에 사용된(Xu-Amano 등, J. Exp. Med. 178: 1309; 1993; Okahashi 등, Infect. Immun. 64: 1516; 1996) 바와 같이, 상업적으로 이용가능한 포획 및 검출 mAbs(R&D Systems and Pharmingen)를 사용하여 수행된다. 각 분석은 미토겐(Con A) 및 난 알부민 대조군을 포함한다. 본 명세서에 기술된 항-IFN 암호화 벡터 시스템은 IFN 내성 유전자를 포함하지 않는 전달 시스템에 비해 몇몇 장점을 갖는다. 항원 유전자가 더 높은 수준으로 더 오랜 기간 동안 발현되고, 따라서 더 강력한 면역반응을 유도한다. 효능을 발휘하고 동물 모델에서 비-독성인 세균성 벡터는 임상 실험에서 더욱 평가된다.

실시예 10. 결핵 백신의 개발

BCG 세균은 1) 일과성 유전자로서 하나 이상의 결핵 항원, 및 2) 포유동물 숙주세포 타입 I 인터페론 반응을 억제하거나 방해하는 하나 이상의 인자를 암호화하는 핵산을 포함하도록 본 명세서에 기술된 바와 같이 유전적으로 조작된다. 포유동물 숙주(예컨대, 인간)에 투여될 때, 유전적으로 조작된 BCG는 숙주세포를 침투하고, 엔도솜을 회피하고, 하나 이상의 결핵 항원을 생산하기 위해 일과성 유전자를 분비하도록 용해된다. 또한, BCG는 또한 숙주세포 IFN 반응을 억제하는 하나 이상의 인자를 생산한다. 인자는 숙주세포 IFN 반응을 약화시키고, 이는 다르게는 TB 항원(들)의 생산을 감소시킬 것이다. 그 결과, 충분한 TB 항원(들)이 TB 항원(들)에 대한 강력한 면역반응을 유발하도록 생산된다.

본 발명이 그의 바람직한 실시형태에 관하여 기술되었다고 하더라도, 당해 분야의 숙련자는 본 발명이 첨부된 청구범위의 요지 및 범주 내에서 변경과 함께 실행될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명은 상기에 기술된 바와 같은 실시형태로 한정되지 않아야 하고, 본 명세서에 제공된 상세한 설명의 요지 및 범주 내에서 모든 변경 및 그의 등가물을 추가로 포함해야만 한다.

<110> AERAS GLOBAL TB VACCINE FOUNDATION <120> Methods to increase transgene expression from bacterial based delivery systems by co-expressing suppressors of the eukaryotic type I interferon response <150> US 11/854,027 <151> 2007-09-12 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 693 <212> DNA <213> Influenza virus <400> 1 atggatccaa acactgtgtc aagctttcag gtagattgct ttctttggca tgtccgcaaa 60 cgagttgcag accaagaact aggtgatgcc ccattccttg atcggcttcg ccgagatcag 120 aaatccctaa gaggaagggg cagcactctc ggtctggaca tcgagacagc cacacgtgct 180 ggaaagcaga tagtggagcg gattctgaaa gaagaatccg atgaggcact taaaatgacc 240 atggcctctg tacctgcgtc gcgttaccta actgacatga ctcttgagga aatgtcaagg 300 gactggtcca tgctcatacc caagcagaaa gtggcaggcc ctctttgtat cagaatggac 360 caggcgatca tggataagaa catcatactg aaagcgaact tcagtgtgat ttttgaccgg 420 ctggagactc taatattgct aagggctttc accgaagagg gagcaattgt tggcgaaatt 480 tcaccattgc cttctcttcc aggacatact gctgaggatg tcaaaaatgc agttggagtc 540 ctcatcggag gacttgaatg gaatgataac acagttcgag tctctgaaac tctacagaga 600 ttcgcttgga gaagcagtaa tgagaatggg agacctccac tcactccaaa acagaaacga 660 gaaatggcgg gaacaattag gtcagaagtt tga 693 <210> 2 <211> 1479 <212> DNA <213> Rotavirus sp. <400> 2 atggcaacct ttaaggatgc ttgttttcat tatagaagga ttacaaaact aaacagggaa 60 ttactgagaa ttggagcaaa ctcagtatgg actccagttt cttcaaataa aattagagga 120 tggtgcattg agtgttgtca attgactgaa ttgacctttt gtcatggatg ctcattggct 180 cacgtttgtc aatggtgcat tcaaaacaaa cgttgcttct tagacaatga accacatctt 240 ttaaagttaa gaacctttga atctccaata acaaaggaaa aattgcagtg cattattgat 300 ttatataatc tactatttcc aatcagccct ggtatcataa atagatttaa aaaagcagtt 360 aaacaaagaa agtgtagaaa tgaaagtgat aaatcgtggt ataatcaatt actacttcca 420 attactctaa atgccgcagt ttttaaattt cattcgaggg aaatttacat ttttggattt 480 tatgaaggat catcagcatg catagattta ccatatagac ttgtaaattg cattgactta 540 tatgataaat tgctgttaga tcaaataaat tttgaaagaa tgagttgtct tccagataag 600 ttacaatcta tctatgcaaa taattatttt aaattgagca gacttccttc aatgaagttg 660 aaacaagttt attattcaga cttctccaaa caaaatttga ttaataagta taaaactaag 720 agtcgcatag tacttagaaa tctgactgaa ttcacttggg attctcaaat tgatttgcat 780 catgatctaa tcaataacaa agataaaata cttgcagcat tatcaacatc atcgttaaaa 840 caattcgaaa cacatgattt aaatttagga agagtaaaag ctgacatttt tgaacttgga 900 catcattgca aaccaaatta tatttcatca aatcattggc aaccggcatc aaaaattttc 960 cagtgtaagt ggtgcaatgt aaagtatgca tttagagata tggattggaa gatggaatca 1020 atgtataatg aactcttaag ttttctacag tcctgttaca aaagtaatgt taatgtaggg 1080 cattgtagtt caattgaaag tgtttatcca ctagtcaaag atatgctttg gcattcaatt 1140 acaaaatata ttgatcaaac tattgagaaa ttatttgatg caatgaatcc ggtgcaagtg 1200 aatgagcaac ttgtaattaa cttctattgg caaatagata tcgctctgta cactcacatc 1260 aaaatgatac taaaaactga agctcttccg tttactttca cacttaacca gttcaattct 1320 ataattaagg gaatcattaa ccaatggtgt gacgtcgctg aattggatct tttaccgtta 1380 tgcactgaac aaaccgacaa attggttaaa ctgaaagaag aagggaaact gtctgaagag 1440 tatgagctcc taatctcgga ttccgaagac gacgactga 1479 <210> 3 <211> 158 <212> DNA <213> Adenovirus <400> 3 ggctcgactc cgtggcctgg aggctaagcg aacgggttgg gctgcgcgtg taccccggtt 60 cgaatctcga atcaggctgg agccgcagct aacgtggtac tggcactccc gtctcgaccc 120 aggcctgcac aaaacctcca ggatacggag gcgggtcg 158

Claims

하나 이상의 일과성 유전자; 및
포유동물 타입 I 인터페론 반응을 억제하는 하나 이상의 인자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하고,
상기 하나 이상의 일과성 유전자를 암호화하는 상기 핵산 서열이 진핵 프로모터에 작동적으로 연결되고, 포유동물 타입 I 인터페론 반응을 억제하는 상기 하나 이상의 인자를 암호화하는 상기 핵산 서열이 진핵 프로모터 또는 원핵 프로모터에 작동적으로 연결되는, 유전적으로 조작된 세균.
제1항에 있어서, 포유동물 타입 I 인터페론 반응을 억제하는 상기 하나 이상의 인자를 암호화하는 상기 핵산 서열이 진핵 프로모터에 작동적으로 연결되는 것인 유전적으로 조작된 세균.
제1항에 있어서, 포유동물 타입 I 인터페론 반응을 억제하는 상기 하나 이상의 인자를 암호화하는 상기 핵산 서열이 원핵 프로모터에 작동적으로 연결되는 것인 유전적으로 조작된 세균.
제1항에 있어서, 포유동물 인터페론 반응을 억제하는 상기 하나 이상의 인자를 암호화하는 핵산 서열이 상기 유전적으로 조작된 세균의 염색제 상에 존재하는 것인 유전적으로 조작된 세균.
제1항에 있어서, i) 상기 하나 이상의 일과성 유전자를 암호화하는 핵산 서열; 및 ii) 포유동물 인터페론 반응을 억제하는 상기 하나 이상의 인자를 암호화하는 핵산 서열의 하나 또는 모두가 플라스미드 상에 존재하는 것인 유전적으로 조작된 세균.
제1항에 있어서, 포유동물 인터페론 반응을 억제하는 상기 하나 이상의 인자가 바이러스 기원인 것인 유전적으로 조작된 세균.
제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 일과성 유전자가 결핵 항원을 암호화하는 것인 유전적으로 조작된 세균.
제1항에 있어서, 상기 유전적으로 조작된 세균이 쉬겔라 세균인 것인 유전적으로 조작된 세균.
제1항에 있어서, 상기 유전적으로 조작된 세균이 미코박테륨인 것인 유전적으로 조작된 세균.
제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 일과성 유전자가 이종 유래 형질전이 유전자인 것인 유전적으로 조작된 세균.
세포 또는 조직 내 하나 이상의 관심 유전자 생성물의 생산을 증가시키는 방법으로,
상기 세포 또는 조직에 i) 상기 하나 이상의 관심 유전자 생성물, 및 ii) 포유동물 인터페론 반응을 억제하는 하나 이상의 인자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 유전적으로 조작된 세균을 투여하고,
상기 하나 이상의 일과성 유전자를 암호화하는 상기 핵산 서열이 진핵 프로모터에 작동적으로 연결되고, 포유동물 타입 I 인터페론 반응을 억제하는 상기 하나 이상의 인자를 암호화하는 상기 핵산 서열이 진핵 프로모터 또는 원핵 프로모터에 작동적으로 연결되고,
상기 투여 단계가 상기 유전적으로 조작된 세균이 상기 세포 또는 조직 내로의 침투를 허용하는 조건 하에서 수행되고;
상기 세포 또는 조직이 상기 하나 이상의 관심 유전자 생성물을 생산하게 하는 것을 포함하는 방법.
제11항에 있어서, 포유동물 타입 I 인터페론 반응을 억제하는 상기 하나 이상의 인자를 암호화하는 상기 핵산 서열이 진핵 프로모터에 작동적으로 연결되는 것인 방법.
제11항에 있어서, 포유동물 타입 I 인터페론 반응을 억제하는 상기 하나 이상의 인자를 암호화하는 상기 핵산 서열이 원핵 프로모터에 작동적으로 연결되는 것인 방법.
제11항에 있어서, 포유동물 인터페론 반응을 억제하는 상기 하나 이상의 인자를 암호화하는 상기 핵산 서열이 상기 유전적으로 조작된 세균의 염색체 상에 존재하는 것인 방법.
제11항에 있어서, i) 상기 하나 이상의 관심 유전자 생성물을 암호화하는 상기 핵산 서열, 및 ii) 포유동물 인터페론 반응을 억제하는 상기 하나 이상의 인자를 암호화하는 상기 핵산 서열의 하나 또는 모두가 플라스미드 상에 존재하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 포유동물 인터페론 반응을 억제하는 상기 하나 이상의 인자가 바이러스 기원인 것인 방법.
제11항에 있어서, 상기 하나 이상의 관심 유전자 생성물이 미코박테륨 투베르쿨로시스 항원인 것인 방법.
제11항에 있어서, 상기 유전적으로 조작된 세균이 쉬겔라, 리스테리아, 살모넬라, 및 칼메트-게랑 간균(Bacille Calmette-Guerin, BCG)으로 구성된 군으로부터 선택되는 세균인 것인 방법.
제11항에 있어서, 상기 하나 이상의 일과성 유전자가 이종 유래 형질전이 유전자인 것인 방법.
포유동물 내에서 관심 항원에 대한 면역반응을 유도하는 방법으로,
상기 관심 항원을 암호화하는 핵산 서열; 및 포유동물 인터페론 반응을 억제하는 하나 이상의 인자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 유전적으로 조작된 세균을 상기 포유동물에게 투여하고,
상기 하나 이상의 일과성 유전자를 암호화하는 상기 핵산 서열이 진핵 프로모터에 작동적으로 연결되고, 포유동물 타입 I 인터페론 반응을 억제하는 상기 하나 이상의 인자를 암호화하는 상기 핵산 서열이 진핵 프로모터 또는 원핵 프로모터에 작동적으로 연결되고;
상기 포유동물 내 세포 또는 조직이 상기 관심 항원을 생산하게 하고, 그로 인해 면역반응이 상기 관심 항원에 대해 야기되는 단계를 포함하는 것인 방법.
제20항에 있어서, 상기 관심 항원이 미코박테륨 투베르쿨로시스 항원인 것인 방법.
제20항에 있어서, 포유동물 타입 I 인터페론 반응을 억제하는 상기 하나 이상의 인자를 암호화하는 상기 핵산 서열이 진핵 프로모터에 작동적으로 연결되는 것인 방법.
제20항에 있어서, 포유동물 타입 I 인터페론 반응을 억제하는 상기 하나 이상의 인자를 암호화하는 상기 핵산 서열이 원핵 프로모터에 작동적으로 연결되는 것인 방법.
제20항에 있어서, 포유동물 인터페론 반응을 억제하는 상기 하나 이상의 인자를 암호화하는 상기 핵산 서열이 상기 유전적으로 조작된 세균의 염색체 상에 존재하는 것인 방법.
제20항에 있어서, i) 상기 관심 항원을 암호화하는 상기 핵산 서열, 및 ii) 포유동물 인터페론 반응을 억제하는 상기 하나 이상의 인자를 암호화하는 상기 핵산 서열의 하나 또는 모두가 플라스미드 상에 존재하는 것인 방법.
제20항에 있어서, 포유동물 인터페론 반응을 억제하는 상기 하나 이상의 인자가 바이러스 기원인 것인 방법.
숙주세포 또는 조직 1형 인터페론(IFN) 반응 억제제 인자를 암호화하는 하나 이상의 유전적으로 조작된 핵산 서열, 및 하나 이상의 숙주세포 또는 조직 활성 아미노산 서열을 암호화하는 하나 이상의 유전적으로 조작된 핵산으로 유전적으로 형질전환된 세균을 포함하고,
상기 하나 이상의 숙주세포 또는 조직 활성 아미노산 서열을 암호화하는 상기 하나 이상의 유전적으로 조작된 핵산이 상기 숙주세포 또는 조직을 침투하는 상기 세균에서 과 발현되는 것인 재조합 세균 벡터.
제27항에 있어서, 상기 숙주세포 또는 조직 1형 IFN 반응 억제제 인자가 로타바이러스 NSP1 또는 인플루엔자 바이러스 NS1인 것인 재조합 세균 벡터.
제27항에 있어서, 상기 하나 이상의 숙주세포 또는 조직 활성 아미노산 서열이 결핵 항원 및 말라리아 항원으로부터 선택되는 것인 재조합 세균 벡터.
제27항에 있어서, 상기 하나 이상의 숙주세포 또는 조직 활성 아미노산 서열이 로타바이러스, 인플루엔자 바이러스, 엑트로멜리아 바이러스, 간염 바이러스, 우두 바이러스, 아데노바이러스, 파라믹소바이러스, HPV, HIV, HTLV, 엔테로바이러스, 헤르페스바이러스, EEE, VEE, 서부 나일강 바이러스, 노르워크 바이러스, 파르보바이러스, 뎅기 바이러스, 및 출혈열 바이러스의 하나 이상으로부터 유래되는 하나 이상의 면역자극 아미노산 서열을 포함하는 것인 재조합 세균 벡터.
제27항에 있어서, 상기 하나 이상의 숙주세포 또는 조직 활성 아미노산 서열이 호르몬, 효소, 항암제, 및 세포자멸 인자로부터 선택되는 것인 재조합 세균 벡터.
제27항에 있어서, 상기 숙주세포 또는 조직 1형 IFN 반응 억제제 인자가 로타바이러스 NSP1, 인플루엔자 바이러스 NS1, 엑트로멜리아 바이러스 C12R 단백질, 간염 C 바이러스 NS3/4A 프로테아제, 우두 바이러스 vIFN-α/β Rc 단백질, 아데노바이러스 E1A 단백질, 파라믹소바이러스의 C 단백질, 및 인간 파필로마바이러스 (HPV) E6 종양단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 재조합 세균 벡터.