CN102858959B - 溶瘤弹状病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明的实施方式包括涉及Maraba病毒的组合物和方法以及它们作为抗癌疗法的用途。这种弹状病毒具有体外和体内的肿瘤细胞杀伤性质。

Description

溶瘤弹状病毒
本申请要求2009年12月10日提出的美国临时申请案第61/285,461号的优先权，通过引用将前述申请的全部内容合并至本申请中。
发明的背景
I.发明领域
本发明大体涉及病毒学和药物学。在某些方面，本发明涉及溶瘤病毒，特别是溶瘤弹状病毒（oncolyticrhabdovirus）。
II.背景
已有大量报道显示，在体外实验中，很多病毒会在多种肿瘤细胞中复制并杀死肿瘤细胞(辛德毕斯病毒(Sindbisvirus)(Unno等，2005)；仙台病毒(Kinoh等，2004)；柯萨奇病毒(Coxackievirus)(Shafren等，2004)；单纯性疱疹病毒(Mineta等，1995)；细小病毒(Abschuetz等，2006)；腺病毒(Heise等，2000)；脊髓灰质炎病毒(Gromeier等，2000)；新城疫病毒；水泡性口炎病毒(Stojdl等，2000)；麻疹病毒(Grote等，2001)；呼肠病毒(Coffey等，1998)；逆转录病毒(Logg等，2001)；痘苗病毒(Timiryasova等，1999)；以及流感病毒(Bergmann等，2001))。此外，已证明，这些病毒对治疗癌症动物模型有效。但是，仍有必要提供其他治疗方法来治疗癌症。
发明概述
本发明所描述的是一种用以遗传操作Maraba病毒的新的溶瘤平台和重组系统。Maraba双重突变株(“DM”)已被制造出来，并且在多种肿瘤模型(具有免疫功能的肿瘤模型和人异种移植肿瘤模型)中证实通过系统递送是安全和有效的。
几种新发现的弹状病毒在杀死特定癌症或癌细胞系方面比VSV有效得多。而且，VSV和VSV的减毒突变株是具有神经毒性的，会引起啮齿类动物和灵长类动物的CNS病变。有些弹状病毒不会感染CNS（如MuirSprings病毒和BahiaGrande病毒：Kerschner等，1986），表现出更可接受的安全性。另外，基于新型弹状病毒的治疗方案可被用来治疗原发性和继发性CNS癌症。本发明的弹状病毒(和/或其它溶瘤试剂)可被连续使用以不引发宿主对特定治疗性病毒的免疫应答。这样可以延长治疗时间并改善疗效。
本发明的实施方式包括有关弹状病毒的组合物和方法以及它们作为抗癌治疗的用途。这些弹状病毒在体内和体外都具备杀死肿瘤细胞的性质。
本发明中，弹状病毒可以是Maraba病毒或Maraba病毒的基因工程变异体。本申请所述的病毒可以与其它弹状病毒结合使用。其它弹状病毒包括一种或多种以下病毒或其变异体：Carajas病毒、金迪普拉病毒(Chandipuravirus)、Cocal病毒、Isfahan病毒、皮里病毒(Piryvirus)、水泡性口炎阿拉戈斯病毒(VesicularstomatitisAlagoasvirus)、BeAn157575病毒、博特克病毒(Botekevirus)、Calchaqui病毒、美国鳗鲡病毒(EelvirusAmerican)、格雷洛奇病毒(GrayLodgevirus)、朱罗纳病毒(Juronavirus)、克拉马斯病毒(Klamathvirus)、Kwatta病毒、LaJoya病毒、MalpaisSpring病毒、芒特埃尔岗蝙蝠病毒(MountElgonbatvirus)、Perinet病毒、Tupaia病毒、Farmington病毒、BahiaGrande病毒、MuirSpring病毒、ReedRanch病毒、HartPark病毒、弗兰德斯病毒(Flandersvirus)、凯米斯病毒(Kamese)、Mosqueiro病毒、莫苏里病毒(Mossurilvirus)、Barur病毒、Fukuoka病毒、KernCanyon病毒、Nkolbisson病毒、LeDantec病毒、Keuraliba病毒、Connecticut病毒、新明托病毒(NewMintovirus)、Sawgrass病毒、Chaco病毒、SenaMadureira病毒、Timbo病毒、Almpiwar病毒、Aruac病毒、班戈兰病毒(Bangoranvirus)、Bimbo病毒、BivensArm病毒、蓝蟹病毒(Bluecrabvirus)、Charleville病毒、滨海平原病毒(CoastalPlainsvirus)、DakArK7292病毒、Entamoeba病毒、Garba病毒、Gossas病毒、HumptyDoo病毒、Joinjakaka病毒、Kannamangalam病毒、Kolongo病毒、Koolpinyah病毒、Kotonkon病毒、Landjia病毒、Manitoba病毒、Marco病毒、Nasoule病毒、Navarro病毒、Ngaingan病毒、Oak-Vale病毒、Obodhiang病毒、Oita病毒、奥安戈病毒(Ouangovirus)、ParryCreek病毒、RioGrandecichlid病毒、Sandjimba病毒、Sigma病毒、Sripur病毒、SweetwaterBranch病毒、Tibrogargan病毒、Xiburema病毒、Yata病毒，RhodeIsland病毒、AdelaideRiver病毒、Berrimah病毒、Kimberley病毒或牛流行热病毒。在某些情况下，弹状病毒可以指双感染弹状病毒(Dimarhabdovirus，其被定义为能够感染昆虫细胞和哺乳动物细胞的弹状病毒)的超群。在具体的实施例中，弹状病毒不是VSV。在特定情况下，弹状病毒是Carajas病毒、Maraba病毒、Farmington病毒、MuirSprings病毒和/或Bahiagrande病毒(包括它们的变异体)。这些病毒中的任何1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个或更多(包括这之间的所有整数值或范围值)个病毒可被具体排除在本申请权利要求的保护范围之外。
本发明的一个实施方式包括包含溶瘤Maraba病毒的方法和组合物，该病毒编码与Maraba病毒的M蛋白或G蛋白具有至少或至多20%、30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%、100%(包括这些数值之间所有范围和百分数)的氨基酸同一性的变异M蛋白和/或变异G蛋白。在某些情况下，MarabaG蛋白的第242个氨基酸被突变。在另外的情况下，M蛋白的第123个氨基酸被突变。在另外的情况下，G蛋白（SEQIDNO:5）的第242个氨基酸和M蛋白（SEQIDNO:4）的第123个氨基酸被突变。第242个氨基酸可以被精氨酸取代（Q242R），或被其他可以减弱病毒毒性的氨基酸取代。第123个氨基酸可以被色氨酸取代（L123W），或被其他可减少病毒毒性的氨基酸取代。在某些情况下，两种单独的突变各自减少了病毒对正常健康细胞的毒性作用。一旦将上述突变相结合，病毒在肿瘤细胞中会变得比野生型病毒更加有毒性。因此，MarabaDM的治疗指数出人意料地增加。
本发明的方法和组合物可包括第二种治疗病毒，例如溶瘤病毒或复制缺陷型病毒。溶瘤通常指能够杀死、溶解或阻止癌细胞生长的试剂。溶瘤病毒是指可在癌细胞中一定程度上复制，导致癌细胞死亡、溶解(溶瘤)或癌细胞生长停止，并且通常对非癌细胞具有微小的毒性作用。第二种病毒包括但不限于腺病毒、牛痘病毒、新城疫病毒、阿尔法病毒、细小病毒、疱疹病毒、弹状病毒等。另一方面，所述组合物是药学上可接受的组合物。所述组合物还可包括第二抗癌剂，例如化疗剂、放疗剂或免疫治疗剂。
本发明的另外的实施方式涉及杀死增生性(hyperproliferative)细胞的方法，该方法包括将该细胞与本文所述的分离的溶瘤弹状病毒组合物接触。
另外的方法涉及癌症患者的治疗，包括施用有效量的本文所述的溶瘤弹状病毒组合物。
在本发明的某些方面，可将细胞包括在患者体内，该细胞可为增生性的、瘤性的、前癌性的、转移性(metastatic)的或转移性(metastasized)的细胞。弹状病毒(例如Maraba病毒)可被施用至患者，该患者具有易被至少一种弹状病毒或包含弹状病毒的治疗方案或组合物杀死的细胞。治疗组合物的施用可利用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种弹状病毒或重组弹状病毒（单独或以各种方式组合）进行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次。所施用的组合物可具有10、100、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014个或更多个病毒颗粒或噬菌斑形成单位(pfu)。施用可为腹膜内、静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、皮下或鼻腔施用。在某些方面，组合物被系统性施用，特别是通过血管内施用，包括注射、灌注等。本发明的方法可进一步包括施用第二种抗癌疗法，例如第二种治疗病毒。在某些方面，治疗病毒可为溶瘤病毒，更特别为Maraba病毒。在其他方面，第二种抗癌疗法为化疗剂、放疗剂、免疫治疗剂、手术等。
本发明的实施方式包括与包含异源性G蛋白(假型病毒)的弹状病毒有关的组合物和方法以及它们作为抗癌疗法的用途。这种弹状病毒具有体内和体外肿瘤细胞杀伤性质。因此，如本文所述的Maraba病毒可通过联合异源性G蛋白而被进一步修饰。如本文所使用的，异源性G蛋白包括弹状病毒G蛋白。弹状病毒将包括一种或多种以下病毒或其变异体：Carajas病毒、金迪普拉病毒(Chandipuravirus)、Cocal病毒、Isfahan病毒、Maraba病毒、皮里病毒(Piryvirus)、水泡性口炎阿拉戈斯病毒(VesicularstomatitisAlagoasvirus)、BeAn157575病毒、博特克病毒(Botekevirus)、Calchaqui病毒、美国鳗鲡病毒(EelvirusAmerican)、格雷洛奇病毒(GrayLodgevirus)、朱罗纳病毒(Juronavirus)、克拉马斯病毒(Klamathvirus)、Kwatta病毒、LaJoya病毒、MalpaisSpring病毒、芒特埃尔岗蝙蝠病毒(MountElgonbatvirus)、Perinet病毒、Tupaia病毒、Farmington病毒、BahiaGrande病毒、MuirSpring病毒、ReedRanch病毒、HartPark病毒、弗兰德斯病毒(Flandersvirus)、凯米斯病毒(Kamese)、Mosqueiro病毒、莫苏里病毒(Mossurilvirus)、Barur病毒、Fukuoka病毒、KernCanyon病毒、Nkolbisson病毒、LeDantec病毒、Keuraliba病毒、Connecticut病毒、新明托病毒(NewMintovirus)、Sawgrass病毒、Chaco病毒、SenaMadureira病毒、Timbo病毒、Almpiwar病毒、Aruac病毒、班戈兰病毒(Bangoranvirus)、Bimbo病毒、BivensArm病毒、蓝蟹病毒(Bluecrabvirus)、Charleville病毒、滨海平原病毒(CoastalPlainsvirus)、DakArK7292病毒、Entamoeba病毒、Garba病毒、Gossas病毒、HumptyDoo病毒、Joinjakaka病毒、Kannamangalam病毒、Kolongo病毒、Koolpinyah病毒、Kotonkon病毒、Landjia病毒、Manitoba病毒、Marco病毒、Nasoule病毒、Navarro病毒、Ngaingan病毒、Oak-Vale病毒、Obodhiang病毒、Oita病毒、奥安戈病毒(Ouangovirus)、ParryCreek病毒、RioGrandecichlid病毒、Sandjimba病毒、Sigma病毒、Sripur病毒、SweetwaterBranch病毒、Tibrogargan病毒、Xiburema病毒、Yata病毒，RhodeIsland病毒、AdelaideRiver病毒、Berrimah病毒、Kimberley病毒或牛流行热病毒。在某些情况下，弹状病毒可以指双感染弹状病毒(Dimarhabdovirus，其被定义为能够感染昆虫细胞和哺乳动物细胞的弹状病毒)的超群。在特定情况下，弹状病毒是Carajas病毒、Maraba病毒、MuirSprings病毒和/或Bahiagrande病毒(包括它们的变异体)。
本发明的另外的实施方式包括杀死超增生性(hyperproliferative)细胞的方法，该方法包括将该细胞接触或施以溶瘤Maraba病毒组合物。
另外的方法涉及癌症患者的治疗，包括施用有销量的这种病毒组合物。
在本发明的某些方面，可将细胞包括在患者体内，该细胞可为增生性的、瘤性的、前癌性的、癌性的、转移性(metastatic)的或转移性(metastasized)的细胞。本发明的病毒可被施用至患者，该患者具有易被至少一种病毒或包含病毒的治疗方案或组合物杀死的细胞。治疗组合物的施用可利用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种病毒(单独或以各种方式组合)进行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次。所施用的组合物可具有10、100、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014个或更多个病毒颗粒或噬菌斑形成单位(pfu)。施用可为腹膜内、静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、皮下或鼻腔施用。在某些方面，组合物被系统性施用，特别是通过血管内施用，包括注射、灌注等。本发明的方法可进一步包括施用第二种抗癌疗法，例如第二种治疗病毒。在某些方面，治疗病毒可为溶瘤病毒，例如本文所述的Maraba病毒。在其他方面，第二种抗癌疗法为化疗剂、放疗剂、免疫治疗剂、手术等。
本发明的其他实施方式在整个申请中有描述。关于本发明的一个方面的任何实施方式也适用本发明的其他方面，反之亦然。详细描述和实施例部分的实施方式应理解为可适用于本发明各个方面的非限制性实施方式。
当用于权利要求和/或说明书中时，术语“抑制”、“降低”或“防止”或这些术语的任何变形，包括为实现期望结果(例如癌症治疗)的任何可测量的减少或完全抑制。期望结果包括但不限于癌症或增生性病症或癌症相关症状的缓解、降低、减慢或根除，以及改善的生活质量或生命延长。
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时，词语“一(a)”或“一(an)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
本发明的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，但详细描述和具体实施例(虽然表示本发明的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本发明的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
附图说明
以下附图构成了本发明的一部分并且用于进一步阐释本发明的某些方面。本发明可通过一个或多个附图并结合具体实施方式的详细说明而被更好地理解。
图1A-1B.新弹状病毒Maraba显示出在癌细胞中的高病毒产率。一步生长曲线被用来定量Maraba、Carajas、Farmington和BahiaGrande病毒在图1ANCIH226细胞中的病毒产率和在图1BSNB19细胞中的病毒产率。与其他病毒相比，Maraba在两个细胞系统均始终复制至较高的效价。
图2A-2F.Maraba突变体保留它们在癌细胞中的杀伤潜能但对正常细胞减弱了毒性。(图2B)Maraba基因组工程化Maraba病毒作为溶瘤剂的图示勾勒出我们单突变体(L123W、V221Y、Q242R)和双突变体(Q242RL123W)的各突变位点。(图2C)G蛋白和M蛋白的突变减弱了Maraba杀死GM38细胞的能力。在用Maraba和所示的Maraba突变体感染后72小时，对GM38细胞进行了存活率试验。(图2D)将L123W突变体改造成Q242R突变体噬菌斑尺寸恢复至野生型表型。在用野生型Maraba、单突变体和双突变体感染的SNB19细胞中进行噬菌斑试验。测量出噬菌斑直径并利用等式A=TTr2计算出噬菌斑面积。(图2E)Maraba和Maraba变异体在多种肿瘤细胞系中是高度裂解性的。利用野生型Maraba和Maraba变异体感染后48小时的PC3细胞、ES2细胞、A549细胞和SW620细胞的图片。(图2F)利用刃天青(resazurin)来检验用野生型Maraba和Maraba突变体感染的细胞的存活率。在用Maraba及其变异体感染后48小时，所有被处理细胞系的存活率急剧降低。
图3A-3C.Maraba突变体之间阻断干扰素产生的能力有差别。使用Maraba变异体感染PC-3细胞，上清液用来保护Vero细胞不受野生型Maraba病毒的后续感染。(图3A)Q242R突变体以类似野生型Maraba的方式阻断干扰素。(图3B)L123W突变体、V221Y突变体、MarabaΔM51和双突变体L123W-M/Q242R-G允许干扰素在PC3细胞感染后产生。(图3C)rMaraba阻断IFN-β的细胞核/细胞质运输。通过qRTPCR未检测到rMaraba或MarabaQ242R感染的细胞质碎片中的IFN-βmRNA诱导。用ΔM51、L123W和MarabaDM感染的细胞显示出在感染后的细胞质中的IFN-βmRNA诱导。
图4A-4D.MarabaDM的系统性给药在同基因和异种移植小鼠肿瘤模型中是有效的。(图4A)MarabaDM在治疗CT-26双侧肿瘤模型是有效的(i)DMGFT和DM-FLUC在IV注射(5×108pfu)24小时在肿瘤位点选择性复制。(ii)用MarabaDM治疗后Balb/C小鼠对双侧CT26肿瘤的耐受存活率(durablesurvival)。(iii)每两周计算一次肿瘤体积。误差棒代表SEM。(iv)对用MarabaDM处理前后以及对照组测定小鼠体重。误差棒代表SEM。(图4B)弥散性CT-26肿瘤的系统性治疗。(i)在肿瘤移植后第10天用PBS、Carajas病毒或MarabaDM静脉内方式治疗CT-26肺肿瘤。在第17天，杀死动物并获得肺部图像。(ii)用6份静脉内剂量的MarabaDM(5×108pfu/剂)治疗肿瘤有效。(图4C)MarabaDM在人卵巢(ES-2)异种移植模型(IP注射，1×104pfu/剂)中有效。(i)IVIS成像证实病毒处理后快速的肿瘤退化。(ii)生物发光量曲线定量显示病毒处理后腹部肿瘤负担的显著降低。(iii)KaplanMeier曲线证实了病毒处理后增强的存活率。(图4D)MarabaDM在治疗ES-2异种移植肿瘤(IV注射，1×105-1×107pfu/剂)方面比VSVΔ51更好。(i-ii)KaplanMeier曲线证实了与VSVΔ51相比用MarabaDM处理的动物的存活率提高。
图5.NCI60细胞板上弹状病毒介导的细胞杀伤。将来自NCI60细胞板的细胞接种至96孔板中以达到90%的汇合率(confluency)。利用各种弹状病毒(如图所示)以对数稀释来感染这些细胞。使用工程化的Maraba病毒作为溶瘤剂感染48小时或96小时，将单层细胞洗涤、固定并以1%结晶紫溶液染色。随后将染色的单层细胞溶解在1%SDS水溶液中，得到均匀的溶解物。测量595nm处的吸收值并为活细胞计分。如图所示，MOIEC50的计分以范围值显示。
发明详述
本发明的各个方面以弹状病毒(例如Maraba病毒)或假型弹状病毒对几种或几类癌细胞的杀伤为基础。这些溶瘤弹状病毒和重组弹状病毒的一些优点包括：(1)本发明的弹状病毒的抗体在世界大多数人口中都很少直至不存在。(2)弹状病毒比其他溶瘤病毒(例如腺病毒、呼肠病毒、麻疹病毒、细小病毒、逆转录酶病毒和HSV)复制得更快。(3)弹状病毒生长至高效价，可通过0.2微米过滤器来过滤。(4)溶瘤弹状病毒及其重组体具有广泛的宿主范围，能够感染许多不同类型的癌细胞，并且不受特定细胞上的受体的限制(例如柯萨奇病毒、麻疹病毒、腺病毒)。(5)本发明的弹状病毒可经受遗传操作。(6)弹状病毒还具有细胞质声明周期并且不会整合到宿主细胞的遗传物质中，这将赋予更加有利的安全性。
如本文所述的，本发明发现了一种新型溶瘤病毒，其用作建立有效的基于病毒的癌症疗法的平台。筛选弹状病毒以获得具有有助于实现强溶瘤效果的性质的病毒。系统性给药是已知的给药方法并且在临床上是治疗弥散性癌症的一个有利的方面。在某些方面，病毒被静脉内递送，并且可引起在不同肿瘤位点的感染。假设有效治疗的其中一个体内局限性在于病毒递送至肿瘤床可能是有限的。实际上，已观察到存在这样的剂量阈值，低于该阈值病毒不能被有效地递送至小鼠模型的肿瘤中，并且这些剂量是没有效果的(Stojdl等，2003)。因此，本发明的发明人致力于寻找能够以低感染复数(“MOI”)杀死肿瘤细胞的病毒，该病毒能快速复制，以产生大量后代，从而使肿瘤床感染的几率和程度最大化。为此，设计出一种多孔板分析来识别能够以低MOI杀死大范围肿瘤细胞的病毒。MOI分析之后，分析大多数潜质病毒的生长动力学和裂解量。Maraba病毒被鉴定为很有前景的候选物。
Maraba病毒(SEQIDNO:1)和Carajas病毒(CRJ)(SEQIDNO:7)的全基因组序列已被获得。
一旦Maraba病毒被鉴定为候选物，本发明的发明人进行了基因工程研究以改善其肿瘤选择性。在研究中最初发现了两个令人感兴趣的突变，用于监测变化的环境中的RNA病毒适应性。在之前的报道中，L123W和H242R(在Maraba中为Q242R)能够单独增加VSV在BHK21细胞中的复制。另外，已报道称，这两种突变的组合保留了这种适应性表型。L123W/Q242R突变提供了具有至少3级对数的治疗指数的病毒(在某些肿瘤细胞上，EC50<10-3MOI；在GM38成纤维细胞上，EC50=3MOI)。Q242R和L123W突变导致病毒毒性在正常成纤维细胞上减弱。L123W显得与ΔM51和V221Y具有大致相同的功能，导致阻断细胞核/细胞质传输的能力上的缺陷，从而抑制宿主IFN转录级联反应。据发明人的知识所知，这是第一次证实该基质蛋白的这个区域在减轻宿主先天性免疫防御中起作用。之前有报道称，此区域的突变影响病毒mRNA的翻译(Connor等，2006)。Q242R突变严重降低Maraba病毒对正常细胞的细胞溶解，但这种降低与IFN无关。这些性质构成了潜在肿瘤选择性的基础，肿瘤选择性导致这种新型的基于Maraba的溶瘤病毒平台的治疗指示的显著增加。
如从体外结果所预知的，当静脉内递送至Balb/C小鼠中时，MarabaDM变异体比野生型病毒具有显著降低的毒性。最大耐受剂量(“MTD”)是野生型病毒的100倍。这就允许在MTD以下进行剂量设计以实现在两种肿瘤模型中的显著的肿瘤退化。例如在CT26模型中，6剂MarabaDM病毒即足够提供在所有小鼠中的完全耐受治愈(durablecure)。对于临床治疗特别重要的是，通过系统性递送，MarabaDM在治疗人异种移植肿瘤和具有免疫能力的同基因肿瘤模型都是有效的。在静脉内注射之后证实了在CT26肿瘤模型中肿瘤位点发生了病毒复制，这与病毒介导的溶瘤效应(疗效的贡献因素之一)一致。实际上，在ES2异种移植模型中，MarabaDM显得比之前的候选物VSVΔM51更加有效。这与证实MarabaDM比野生型病毒在杀死肿瘤细胞方面更加有效的体外数据一致。几个研究已明确证实，宿主免疫反应在溶瘤病毒疗效方面起着正面和负面作用(Dhar等，2008；Altomonte等，2008；Endo等，2008；Chiocca等，2008)。
本发明的实施方式包括涉及Maraba病毒或假型弹状病毒的组合物和方法，以及它们作为抗癌疗法的用途。
I．弹状病毒科(弹状病毒)
原型弹状病毒是狂犬病病毒和疱疹性口炎病毒(VSV)，也是这个病毒科研究最多的两种病毒。虽然这些病毒具有相似的形态，但它们在生命周期、宿主范围和病理学方面非常不同。弹状病毒是具有子弹形状的病毒科，其具有非分段(-)义RNA基因组。已知有250多种感染哺乳动物、鱼类、昆虫和植物的弹状病毒。
弹状病毒科包括但不限于：Carajas病毒、金迪普拉病毒(AF128868/gi:4583436,AJ810083/gi:57833891,AY81800/gi:62861470,AY871799/gi:62861468,AY871798/gi:62861466,AY871797/gi:82862464,AY871796/gi:62861462,AY871795/gi:82861460,AY871794/gi:62861459,AY871893/gi:62861457,AY871792/gi:62861455,AY871791/gi:62861453)、Cocal病毒(AF045556/gi:2865658)、Isfahan病毒(AJ810084/gi:57834038)、Maraba病毒(SEQIDNO:1-6)、Carajas病毒(SEQIDNO:7-12,AY335185/gi:33578037)、皮里病毒(D26175/gi:442480,Z15093/gi:61405)、水泡性口炎阿拉戈斯病毒、BeAn157575病毒、博特克病毒、Calchaqui病毒、美国鳗鲡病毒、格雷洛奇病毒、朱罗纳病毒、克拉马斯病毒、Kwatta病毒、LaJoya病毒、MalpaisSpring病毒、芒特埃尔岗蝙蝠病毒(DQ457103/gi|91984805)、Perinet病毒(AY854652/gi:71842381)、Tupaia病毒(NC_007020/gi:66508427)、Farmington病毒、BahiaGrande病毒(SEQIDNO:13-18)、MuirSpring病毒、ReedRanch病毒、HartPark病毒、弗兰德斯病毒(AF523199/gi:25140635,AF523197/gi:25140634,AF523196/gi:25140633,AF523195/gi:25140632,AF523194/gi:25140631,AH012197/gi:25140630)、凯米斯病毒、Mosqueiro病毒、莫苏里病毒、Barur病毒、Fukuoka病毒(AY854651/gi:71842379)、KernCanyon病毒、Nkolbisson病毒、LeDantec病毒(AY854650/gi:71842377)、Keuraliba病毒、Connecticut病毒、新明托病毒、Sawgrass病毒、Chaco病毒、SenaMadureira病毒、Timbo病毒、Almpiwar病毒(AY854645/gi:71842367)、Aruac病毒、班戈兰病毒、Bimbo病毒、BivensArm病毒、蓝蟹病毒、Charleville病毒、滨海平原病毒、DakArK7292病毒、Entamoeba病毒、Garba病毒、Gossas病毒、HumptyDoo病毒(AY854643/gi:71842363)、Joinjakaka病毒、Kannamangalam病毒、Kolongo病毒(DQ457100/gi|91984799核蛋白(N)mRNA，部分cds)、Koolpinyah病毒、Kotonkon病毒(DQ457099/gi:91984797,AY854683/gi:71842354)、Landjia病毒、Manitoba病毒、Marco病毒、Nasoule病毒、Navarro病毒、Ngaingan病毒(AY854649/gi:71842375)、Oak-Vale病毒(AY854670/gi:71842417)、Obodhiang病毒(DQ457098/gi|91984795)、Oita病毒(AB116386/gi:46020027)、奥安戈病毒、ParryCreek病毒(AY854647/gi:71842371)、RioGrandecichlid病毒、Sandjimba病毒(DQ457102/gi|91984803)、Sigma病毒(AH004209/gi:1680545,AH004208/gi:1680544,AH004206/gi:1680542)、Sripur病毒、SweetwaterBranch病毒、Tibrogargan病毒(AY854646/gi:71842369)、Xiburema病毒、Yata病毒，RhodeIsland病毒、AdelaideRiver病毒(U10363/gi:600151,AF234998/gi:10443747,AF234534/gi:9971785,AY854635/gi:71842348)、Berrimah病毒(AY854636/gi:71842350)、Kimberley病毒(AY854637/gi:71842352)或牛流行热病毒(NC_002526/gi:10086561)。
A.弹状病毒基因组
通常，弹状病毒基因组约为11-15kb，具有(-)义病毒RNA(vRNA)的约50个核苷酸的3’先导序列和约60个核苷酸的5’非翻译区。通常，弹状病毒vRNA具有编码5种蛋白质的5个基因。弹状病毒在每个基因的末端具有保守的多腺苷信号并且在5个基因的每一个之间具有短基因间隔区。所有弹状病毒含有至少五个基因，分别编码核衣壳蛋白(N)、磷蛋白质(P，也表示为NS)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和大蛋白(L)。通常，这些基因在反义vRNA上如下排列：3’-N-P-M-G-(X)-L-5’(SEQIDNO:29)。基因的顺序很重要，因为其决定合成的蛋白质的比例。弹状病毒基因组的任何操作通常会包括至少五个转录域以维持高水平感染和复制的能力。弹状病毒具有内源性RNA聚合酶用于转录正义信使RNA(mRNA)。不是所有的弹状病毒都具有X基因。X基因编码在鱼感染性造血坏死病毒中发现的非结构蛋白(GenBankDQ164103/gi|76262981;DQ164102/gi|76262979;DQ164101/gi|76262977;DQ164100/gi|76262975;DQ164099/gi|76262973;AB250935/gi|112821165;AB250934/gi|112821163;AB250933/gi|112821161;AB250932/gi|112821159;AB250931/gi|112821157;AB250930/gi|112821155;AB250929/gi|112821153;AB250928/gi|112821151;AB250927/gi|112821149,描述编码G蛋白核苷酸序列)、在牛流行热病毒中发现的非结构蛋白和在狂犬病毒中发现的假基因。该额外的(X)基因已被发现在弹状病毒基因组的不同位点上。M蛋白在感染细胞中的合成导致细胞病变，并最终导致细胞死亡。
弹状病毒的传播根据病毒/宿主而变化，但大多数是通过直接接触传播，例如，狂犬病毒传播通过动物咬伤或昆虫载体进行。在体内，病毒具有很长的潜伏期，但这未反映在培养物中的病毒复制动力学上。G蛋白突起结合到宿主细胞表面的受体，病毒通过胞吞作用进入细胞，并通过G蛋白的介导而与小泡的膜融合。
不愿受任何特定理论的约束，弹状病毒的受体分子被认为是磷脂或碳水化合物，而不是特定的蛋白质。弹状病毒复制发生在细胞质中，L蛋白和NS蛋白都需要转录，两者都不能单独发挥作用。转录产生五种单顺反子mRNA，其5’端加帽，3’端具有多腺苷，并且每个mRNA在其5’端具有来自vRNA的3’端的先导序列。这些mRNA是通过病毒基因组中ORF的序列转录获得的，并且已有资料显示，每个基因之间的间隔序列负责转录的终止和重新启动(通过聚合酶)，因此产生单独的转录体。
子代vRNA由(+)义中间体形成。基因组通过L+P聚合酶复合物(转录时)复制，但还需要额外的宿主细胞因素。弹状病毒的特点是这些时间都发生在细胞质的一部分，其如同病毒“工厂”并且显得是特有的细胞质包含体。
B.病毒蛋白变异体
在某些实施方式中，Maraba病毒或弹状病毒将包含N、P、M、G和/或L蛋白中的一个或多个的变异体。在本发明的某些方面，这些病毒蛋白变异体可被包括在治疗病毒或以下进一步定义的蛋白质组合物中。蛋白质组合物包括病毒颗粒和其他具有一种或多种病毒蛋白成分的组合物。这些多肽变异体可被工程化或其一种或多种生理学或生物学特性可被选择用来修饰，例如宿主细胞范围、宿主细胞特异性、对非目标细胞或器官的毒性、复制、对目标细胞的细胞毒性、癌细胞的杀伤性、癌细胞的停滞(stasis)、感染性、制造参数、病毒颗粒的尺寸、病毒颗粒的稳定性、体内清除、免疫反应性等。这些多肽变异体可利用本领域已知的多种方法而被工程化，包括各种诱变技术。在某些方面，N、P、M、G和/或L蛋白对于一个病毒可以是异源性的(例如VSV可包含IsfahanG蛋白或其变异体)。
C.重组弹状病毒
重组弹状病毒可通过以下方法产生：(1)完全利用cDNA，或(2)将cDNA的组合体转染至辅助细胞，或(3)将cDNA转染至细胞，随后用微小病毒(minivirus)感染细胞，以反式(intrans)提供生产感染性或非感染性重组弹状病毒所需的剩余成分或行为。使用任何一种方法(例如，微小病毒、辅助细胞系或仅cDNA转染)，所需要的最少成分是含有顺式作用信号的RNA分子，用于(1)通过弹状病毒N蛋白将基因组(反义基因组)RNA衣壳化，和(2)复制基因组或反义基因组(复制性中间体)RNA等价物。
发明人所述的复制元件或复制子是指一段RNA链，其最少在5’端和3’端含有弹状病毒的先导序列和尾随序列。在基因组意义上，先导序列位于3’端，尾随序列位于5’端。因此，任何位于这两个复制信号之间的RNA都将被复制。先导区和尾随区必须进一步含有最少的顺式作用元件，用于通过N蛋白进行衣壳化并用于结合启动转录和复制所需的聚合酶。
为制备工程化的弹状病毒，含有G基因的微小病毒还含有先导区、尾随区和具有合适起始和终止信号以生产G蛋白mRNA的G基因。如果微小病毒进一步包含M基因，也必须存在用于生产M蛋白mRNA的合适的起始和终止信号。
对于任何包含在工程化的弹状病毒基因组中的基因，该基因将在两侧具有合适的转录起始和终止信号，以允许这些基因的表达以及蛋白产物的生产，特别是异源性基因。异源性基因是指通常不被从自然界分离的弹状病毒编码的基因，或含有的弹状病毒编码区的位置、形式和环境(context)通常未被发现，例如嵌合G蛋白。
为生产“非感染性”工程化弹状病毒，工程化的蛋白病毒必须具有最少的复制子元件以及N、P和L蛋白，并且它必须含有M基因(一个例子是ΔG或G-缺乏结构体，其缺少G蛋白编码区)。这生产出从细胞中芽生但的病毒颗粒，但是非感染性的颗粒。为生产“感染性”颗粒，病毒颗粒必须额外包含可介导病毒颗粒结合和融合(例如通过使用附着蛋白或受体配体)的蛋白。弹状病毒的天然受体配体为G蛋白。
“合适的细胞”或“宿主细胞”是指允许重组弹状病毒组装的任何细胞。在制备感染性病毒颗粒的一种方法中，首先用牛痘病毒Vtf7-3(Fuerst等，1986)或等价物感染合适的细胞系(例如BHK细胞)，其中牛痘病毒或等价物编码T7RNA聚合酶或其他合适的噬菌体聚合酶(例如T3或SP6聚合酶)(见Usdin等，1993或Rodriguez等，1990)。这些细胞随后用含有编码G、N、P、L和M弹状病毒蛋白质的基因的单独cDNA来转染。这些cDNA将提供用于建立重组弹状病毒颗粒的蛋白质。可利用本领域已知的任何方法来转染细胞(例如，脂质体、电穿孔等)。
还被转染进细胞系中的是含有弹状病毒基因组RNA等价物的“多顺反子cDNA”。如果感染性的重组弹状病毒颗粒要用来裂解感染细胞，那么编码N、P、M和L蛋白的基因以及任何异源性核酸片段必须存在。如果感染性重组弹状病毒颗粒不用来裂解细胞，那么编码M蛋白的基因不被包括在多顺反子DNA中。“多顺反子cDNA”是指包含至少一个具有编码N、P和L蛋白的基因的转录单元的cDNA。重组弹状病毒多顺反子DNA也可含有编码蛋白变异体或其多肽片段的基因，或治疗性核酸。作为选择，任何最初联合制首先生成的病毒颗粒的蛋白或其片段可被反式提供。
另一个实施方式提供一种多顺反子DNA，其包含编码报道蛋白或荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白及其衍生物、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、氯霉素乙酰转移酶等)的基因、N-P-L或N-P-L-M基因、和/或融合蛋白或治疗性核酸。另一种多顺反子DNA可含有编码蛋白质变异体的基因、编码报道蛋白的基因、治疗性核酸、和/或N-P-L基因或N-P-L-M基因。
生产重组弹状病毒的第一步是RNA的表达，该RNA是cDNA的基因组或反义基因组等价物。随后，该RNA被N蛋白包裹，再借助P/L蛋白被复制。这样生产的病毒可被回收。如果重组RNA基因组中不存在G蛋白，那么通常以反式提供G蛋白。如果G蛋白和M蛋白都不存在，那么两者都可以反式提供。
为制备“非感染性弹状病毒”颗粒，程序可与以上相同，只是转染到细胞中的多顺反子cDNA将只含有弹状病毒的N、P和L基因。非感染性弹状病毒颗粒的多顺反子cDNA可额外含有编码报道蛋白的基因或治疗性核酸。关于生产缺少编码G蛋白的基因的重组弹状病毒的方法的其他描述，参见Takada等(1997)。
1.培养细胞以生产病毒
转染的细胞通常在期望的温度(通常为约37℃)培养至少24个小时。对于非感染性病毒颗粒，收集上清液并分离病毒颗粒。对于感染性病毒颗粒，收集含有病毒的上清液并转移至新鲜细胞。将新鲜细胞培养约48个小时，并收集上清液。
2.重组弹状病毒的纯化
术语“分离”弹状病毒是指培养和纯化病毒颗粒从而留下非常小的细胞碎片的过程。一个例子是收集含毒粒的上清液并将其通过0.1-0.2微米孔径的过滤器(例如Millex-GS、Millipore)以出去病毒和细胞碎片。重组弹状病毒颗粒随后可被重悬于任何期望的赋形剂或载体中。可通过利用对特定蛋白特异的抗体通过间接免疫荧光法来测定效价。
3.利用cDNA和微小病毒或辅助细胞系制备重组弹状病毒的方法
“微小病毒”和“辅助细胞”(也称“辅助细胞系”)提供同样的东西：提供用于弹状病毒毒粒组装的弹状病毒蛋白质来源。弹状病毒微小病毒的一个例子是VSV微小病毒，如Stillman等(1995)所报道的，其仅表达G蛋白和M蛋白。辅助病毒和微小病毒被用做提供弹状病毒蛋白质的方法，而编码弹状病毒蛋白质的基因的转染DNA不生产这些弹状病毒蛋白质。
当使用微小病毒时，如上所述，使用牛痘病毒感染细胞以提供T7RNA聚合酶。期望的多顺反子RNA以及含有N、P和L基因的质粒被转染进细胞中。约在3个小时后，除去转染混合液，使用微小病毒以约1的感染复数(m.o.i)感染细胞。微小病毒提供缺失的G蛋白和/或M蛋白。转染进细胞的多顺反子RNA将取决于想要感染性还是非感染性重组弹状病毒。
作为选择，微小病毒可被用来提供N、P和L基因。除N、P和L蛋白之外，微小病毒也可被用来生产M蛋白。微小病毒也可生产G蛋白。
当使用辅助细胞系时，编码缺失的弹状病毒蛋白质的基因由辅助细胞系生产。辅助细胞系具有用于生产重组弹状病毒颗粒的N、P、L和G蛋白，辅助细胞系部编码野生型G蛋白。蛋白质是由不构成重组病毒基因组的一部分的基因或DNA来表达。这些质粒或其他载体系统被稳定地整合到细胞系的基因组中。蛋白质随后从细胞的基因组中生产出来，而不从细胞质中的复制子生产。辅助细胞系随后可用含有其他不被辅助病毒表达的弹状病毒基因的多顺反子DNA和质粒cDNA来转染。所使用的多顺反子RNA将取决于想要感染性还是非感染性重组弹状病毒。否则，缺失的基因产物(例如G蛋白和/或M蛋白)的供应可通过上述方式完成。
II.病毒组合物
本发明涉及弹状病毒，其在研究和治疗患者的超增生性或瘤性细胞(例如癌细胞)或超增生性或瘤性病症(例如癌症)是有利的。这可涉及(但不限于)具有降低的神经毒性的弹状病毒，例如Maraba病毒。在某些方面，弹状病毒编码或含有一种或多种蛋白成分(N、P、M、G和/或L蛋白)或不同于VSV基因组的核酸基因组(即，在氨基酸或核苷酸水平有至少或至多10%、20%、40%、50%、60%、70%、80%相同)，和/或弹状病毒被构建成与野生型病毒或病毒蛋白相比具有一个或多个突变或变化，从而使病毒具有期望的性质以用于对抗癌细胞，但相比于原始分离的病毒或VSV来说对非癌细胞具有较低的毒性或无毒性。以下描述的内容提供本发明的实施方法和组合物的各种例子。它们提供了通过利用生物选择或重组DNA或核酸技术生成突变的或变异的病毒的背景技术。
A.蛋白质组合物
本发明的蛋白质组合物包括病毒颗粒和包含病毒颗粒的组合物以及分离的多肽。在某些实施方式中，本发明涉及生成或分离弹状病毒(例如Maraba病毒)、假型或溶瘤弹状病毒(溶解、杀死或阻断癌细胞生长的弹状病毒)。在某些实施方式中，弹状病毒将被工程化以包括弹状病毒蛋白质(N、P、M、G和/或L)的多肽变异体和/或编码治疗性多肽的治疗性核酸。本发明的其他方面包括缺少一种或多种功能性多肽或蛋白质的弹状病毒的分离。在其他实施方式中，本发明涉及弹状病毒及其作为药学上可接受的制剂与蛋白质组合物结合使用或被包括在蛋白质组合物中。
如本文所使用的，“蛋白质”或“多肽”是指包含氨基酸残基的聚合物的分子。在某些实施方式中，使用蛋白质或多肽的野生型版本，但在本发明的许多实施方式中，缺失或改变了所有或一部分病毒蛋白质，以使病毒更加有用于治疗患者。上述术语可以在本文中互换使用。“修饰的蛋白质”、“修饰的多肽”、“变异蛋白质”或“变异多肽”是指相对于野生型或参考蛋白质或多肽，化学结构或氨基酸序列被改变的蛋白质或多肽。在一些实施方式中，修饰的蛋白质或多肽具有至少一种被修饰的活性或功能(要承认这些蛋白质或多肽可具有多种活性或功能)。所修饰的活性或功能相对于野生型蛋白质或多肽的活性或功能或含有这种多肽的病毒的特性来说，可被降低、削弱、消除、增强、改善或以其他方式(例如感染特异性)改变。要预期到的是，修饰的蛋白质或多肽可相对于一种活性或功能被干部而在其他方面保留野生型或未改变的活性或功能。作为选择，修饰的蛋白质可完全无功能，或者其同源核酸序列可被改变从而根本不再表达多肽，或多肽被截短，或由于阅读框移位或其他修饰导致表达出不同的氨基酸序列。
在某些实施方式中，重组蛋白质或多肽的大小可包括，但不限于，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1750、2000、2250、2500个或更多个氨基分子残基(包括其间的任何范围值个残基)。要预期到，多肽可通过截短而被修饰，使得它们比相应的未改变形式要短，或者通过融合或结构域混编而被修饰，使得改变后的蛋白质更长。
如本文所使用的，“氨基分子”是指本领域技术人员所知的任何氨基酸、氨基酸衍生物或氨基酸模拟物。在某些实施方式中，蛋白质分子的残基是连续的，没有任何非氨基分子打断氨基分子残基的序列。在其他实施方式中，序列可包含一个或多个非氨基分子部分。在特别的实施方式中，蛋白质分子的残基序列可被一个或多个非氨基分子部分打断。因此，术语“蛋白质组合物”包括含有自然合成蛋白质中的20种普通氨基酸中的至少一种或至少一种经修饰的或非普通氨基酸的氨基分子序列。
蛋白质组合物可通过本领域技术人员已知的任何技术制备，包括通过标准分子生物学技术表达蛋白质、多肽或肽，从天然资源中分离蛋白质成分，或化学合成蛋白质材料。各种弹状病毒基因或基因组的核苷酸序列和多肽序列之前已公开，并可在本领域技术人员已知的计算机化的数据库中找到。一种这样的数据库是美国国家生物技术信息中心的GenBank数据库和GenPept数据库，可通过互联网在ncbi.nlm.nih.gov/获得。编码这些已知基因和病毒的区域可利用本文公开的技术或本领域技术人员已知的技术来扩增和/或表达。
B．功能方面
除非另有说明，当本申请涉及病毒蛋白质或多肽的功能或活性时，是指该病毒蛋白或多肽在生理学条件下的活性或功能。例如，G蛋白涉及结合和感染特定细胞类型的特异性和效率。可利用本领域技术人员熟知的实验方法来确定哪些分子具备这种性质，例如感染性实验、蛋白结合实验、噬菌斑实验等。
C.病毒多肽的变异体
本发明的多肽的氨基酸序列变异体可以是取代变异体、插入变异体或缺失变异体。与野生型或未改变的多肽或其他参考多肽相比，编码病毒多肽的基因中的突变可能会影响多肽的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500个或更多个非连续或连续氨基酸(即区段)。弹状病毒编码的各种多肽可通过GenBank登录号以及本文所公开的每个病毒的相关公共数据库记录来识别，通过引用将涉及弹状病毒科的所有GenBank记录都合并至本文中。
缺失变异体缺少了天然的、未改变的或野生型蛋白质的一个或多个残基。单个残基可被缺失，或者整个或部分结构域(例如催化或结合结构域)可被缺失。终止密码子可被引入(通过取代或插入)到编码用核酸序列中以生成截短的蛋白质。插入突变体通常在多肽的非末端位点添加物质。插入的特定类型是嵌合型多肽，其在目标蛋白的相关部分包括了相关蛋白的同源性或形似部分。这可包括插入免疫反应性表位或仅是一个或多个残基。末端添加(通常称为融合蛋白质)也可被产生。
取代变异体通常在蛋白质的一个或多个位点用一个氨基酸替换另一个氨基酸，并且可被设计用来调节多肽的一种或多种性质，同时丧失或不丧失其他功能或性质。取代可以是保守的，即用具有相似性质和电荷的氨基酸取代一个氨基酸。保守取代在本领域是熟知的，包括例如以下变化：丙氨酸到丝氨酸；精氨酸到赖氨酸；天冬酰胺到谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸到谷氨酸；半胱氨酸到丝氨酸；谷氨酰胺到天冬酰胺；谷氨酸到天冬氨酸；甘氨酸到脯氨酸；组氨酸到天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸到亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸到缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸到精氨酸；甲硫氨酸到亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸到酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸到苏氨酸；苏氨酸到丝氨酸；色氨酸到酪氨酸；酪氨酸到色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸到异亮氨酸或亮氨酸。作为选择，取代可以是非保守的，从而影响多肽的功能和活性。非保守的变化通常包括用化学上不相似的残基取代，例如用极性或带电的氨基酸取代非极性或不带电的氨基酸，反之亦然。
术语“功能上等价的密码子”在本文是指编码相同氨基酸的密码子，例如精氨酸或丝氨酸的6个密码子，并且也指编码生物学上等价的氨基酸的密码子(见下表1)。
表1.密码子表
氨基酸 密码子
丙氨酸 Ala A GCA GCC GCG GCU
半胱氨酸 Cys C UGC UGU
天冬氨酸 Asp D GAC GAU
谷氨酸 Glu E GAA GAG
苯丙氨酸 Phe F UUC UUU
甘氨酸 Gly G GGA GGC GGG GGU
组氨酸 His H CAC CAU
异亮氨酸 Ile I AUA AUC AUU
赖氨酸 Lys K AAA AAG
亮氨酸 Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU
甲硫氨酸 Met M AUG
天冬酰胺 Asn N AAC AAU
脯氨酸 Pro P CCA CCC CCG CCU
谷氨酰胺 Gln Q CAA CAG
精氨酸 Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU
丝氨酸 Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU
苏氨酸 Thr T ACA ACC ACG ACU
缬氨酸 Val V GUA GUC GUG GUU
色氨酸 Trp W UGG
酪氨酸 Tyr Y UAC UAU
要理解的是，氨基酸序列和核酸序列可包括额外的残基，例如额外的N-末端氨基酸或C-末端氨基酸或5’或3’序列，其仍然是本发明要阐述的，包括具有特定的生物学活性。末端序列的添加特别适用于下述核酸序列，例如该核酸序列可包括在编码区的5’或3’部分的两侧的非编码序列，或者该核酸序列可包括已知在基因内出现的各种内部序列，即内显子。
以下内容是关于改变N、P、L、M或G蛋白的氨基酸以产生等价的、甚至改善的分子的描述。例如，蛋白质结构中的某些氨基酸可被其他氨基酸取代，而察觉不到与结构(例如抗体的抗原结合区或底物分子的结合位点)的相互结合能力的丧失。因为蛋白质的相互结合能力和性质决定蛋白质的生物学功能活性，可在蛋白质序列和下级的DNA编码序列中进行某些氨基酸取代，但产生具有相似性质的蛋白质。因此，本发明的发明人预期，如下文所述，可对弹状病毒的DNA序列作出各种改变而不丧失感兴趣的生物学用途或活性。
在作出这些改变时，可考虑氨基酸的亲水指数。氨基酸亲疏水指数在赋予蛋白质的生物学功能方面的重要性在本领域是普遍知道的(Kyte和Doolittle，1982)。已接受的是，氨基酸的相对亲疏水特性对所产生的蛋白质的二级结构有影响，二级结构又决定了蛋白质与其他分子的相互作用，其他分子例如是酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等。
还要理解的是，相似氨基酸的取代可基于亲水性而有效地进行。美国专利4554101号(通过引用合并至本文中)指出，蛋白质的最大局部平均亲水性(由其邻近氨基酸的亲水性决定)与蛋白质的生物学性质相关。如美国专利4554101号详细描述的，氨基酸残基的亲水值为：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。要理解的是，一个氨基酸可被具有相似亲水值的另一个氨基酸取代，但仍产生生物学上等价的或免疫学上等价的蛋白质。在这种改变中，优选取代亲水值在±2以内的氨基酸，特别优选的是亲水值±1以内的氨基酸，更特别优选的是亲水值±0.5以内的氨基酸.
如上所述，氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性来进行，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑了各种前述特征的示例性取代对于本领域技术人员是熟知的，包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
III.核酸分子
本发明包括可从能够表达所有或部分病毒蛋白或多肽的细胞中分离出的多核苷酸。在本发明的一些实施方式中，其涉及病毒基因组的全部或部分，该病毒基因组已被特定地突变或改变以生产具有特定性质和/或特性的病毒或病毒多肽，例如假型或弹状病毒多肽或病毒。多核苷酸可编码含有全部或部分病毒的或异源的氨基酸序列的肽或多肽，或者可被工程化以使得它们不编码这样的多肽或编码的病毒多肽的至少一个功能或活性被添加、增加、降低、削弱或缺失。重组蛋白质可从表达细胞中纯化以产生活性蛋白。弹状病毒成员的基因组可在NCBI数据库或类似数据库中以GenBank登录号找到，通过引用将每个数据库合并至本文中。
A.编码天然或修饰的蛋白质的多核苷酸
如本文所使用的，术语“RNA、DNA或核酸片段”是指不含总基因组DNA或其他污染物的已分离的RNA、DNA或核酸分子。因此，编码多肽的核酸片段是指含有野生型、多态性或突变的编码多肽的序列的核酸片段，并且与基因组核酸分离或被纯化而不含基因组核酸。术语“核酸片段”包括多核苷酸、小于多核苷酸的核酸片段和重组载体(包括例如质粒、粘粒、噬菌体、病毒等)。
如本文所使用的，术语“弹状病毒多核苷酸”可指编码至少一种弹状病毒多肽的假型或弹状病毒核酸分子。在某些实施方式中，多核苷酸已被分离得不含其它核酸。类似地，Maraba病毒、Carajas病毒、MuirSpring病毒和/或BahiaGrande病毒多核苷酸是指编码Maraba病毒、Carajas病毒、MuirSpring病毒和/或BahiaGrande病毒多肽并已于其它核酸相分离的核酸分子。“弹状病毒基因组”或Maraba病毒、Carajas病毒、MuirSpring病毒和/或BahiaGrande病毒基因组是指可被提供至宿主以产生病毒颗粒的VSV或核酸分子，这种提供可在存在或不存在辅助病毒或反式供应其它因子的补充编码区的情况下进行。与野生型或未改变的病毒相比，基因组可能或可能未以重组方式被突变。
术语“cDNA”是指以RNA为模板制备的DNA。全基因组序列或部分基因组序列都有可能是优选的。
也要预期到的是，来自给定物种的特定多肽可被具有稍微不同的核酸序列但编码相同蛋白质的天然变异体(见表1)来代表。
类似地，编码分离的或纯化的野生型或修饰的多肽的多核苷酸是指包括编码野生型或突变多肽的序列(特定情况下还包括调控序列)的DNA片段，这些序列基本上与其他天然基因或蛋白编码序列相分离。关于这点，为简明起见，术语“基因”是指编码蛋白质、多肽或肽的核酸单元(包括任何需要用于合适的转录、翻译后修饰或定位的序列)。如本领域技术人员所理解的，该功能性术语包括基因组序列、cDNA序列和表达或可被改造以表达蛋白质、多肽、结构域、肽、融合蛋白质和突变体的较小的工程化核酸片段。编码全部或部分天然或修饰的多肽的核酸可含有：10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1095、1100、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、9000、10000个或更多的核苷酸、核苷或碱基对的连续核酸。
在特定的实施方式中，本发明涉及分离的核酸片段和包含核酸序列的重组载体，所述核酸序列编码野生型或突变的弹状病毒多肽，所述弹状病毒多肽在其氨基酸序列内包括与天然多肽一致或本质上相对应的连续氨基酸序列。术语“重组”可与多肽或具体多肽的名字相连用，它通常是指由已在体外被操作的核酸分子生成的多肽或由这样的核酸分子的复制产物生成的多肽。
在其他实施方式中，本发明涉及分离的核酸片段和包含编码多肽或肽的核酸序列的重组载体，所述多肽或肽在其氨基酸序列中包括与一种或多种弹状病毒多肽一致或本质上相对应的连续氨基酸序列。
用在本发明中的核酸片段，无论编码序列本身的长度如何，都可与其他核酸序列结合，例如启动子、多腺苷信号、额外的限制酶切位点、多克隆位点、其他编码片段等，使得它们的总体长度可有相当大的变化。因此，可以预期的是，可使用几乎任何长度的核酸片段，总长度优选由制备的简易性和在预期重组核酸方案中的用途来限定。
要预期到，本发明的核酸构建体可编码任何来源的全长多肽或编码这些多肽的截短版本或修饰版本，例如截短的弹状病毒多肽，从而编码区的转录体代表截短的版本。截短的转录体随后可被翻译成截短的蛋白质。作为选择，核酸序列可编码具有额外的异源性编码序列的圈成多肽序列，例如以允许纯化多肽、运输、翻译后修饰或有利于治疗(例如靶定或效率)。如上所述，标签或其他异源性多肽可被添加至修饰的多肽编码序列中，其中“异源性”是指与修饰的多肽不相同的多肽或其片段，或被发现不与天然病毒结合或不被天然病毒编码的多肽或其片段。
在一个非限制性的例子中，可制备出包括连续延伸(contiguousstretch)的核苷酸的一个或多个核酸构建体，该连续延伸的核苷酸与特定病毒片段(例如弹状病毒N、P、M、G或L基因)相同或互补。核酸构建体的长度可为至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、30000、50000、100000、250000、500000、750000个到至少1000000个核苷酸，以及更大尺寸的构建体，直至包括染色体大小(包括所有中间长度和中间范围)。容易理解的是，“中间长度”和“中间范围”在本文是指包含所列举值或在所列举值之间(即，包含这些值的所有整数以及这些值之间的所有整数)的任何长度或范围。
用在本发明中的核酸片段包括编码修饰的多肽的修饰的核酸。这种序列可能由于密码子冗余和功能等价(已知在核酸序列和所编码的蛋白质中自然发生)而出现。作为选择，功能上等价的蛋白质或肽可通过重组DNA技术的应用而产生，在该技术中，蛋白质结构的变化可基于被交换的氨基酸的性质的考虑而被工程化。人类设计的变化可通过应用定点突变技术来引入，例如用于改善或引入蛋白质抗原性，用于降低蛋白质在体内对给予该蛋白质的对象的毒性作用，或用于增加使用该蛋白或包含该蛋白的病毒进行的任何治疗的疗效。
在某些其他实施方式中，本发明涉及分离的核酸片段和重组载体，所述重组载体在其序列中包括来自本文以序列形式显示(和/或通过引用合并)的核酸序列的连续核酸序列。但是，这样的序列可被突变以生成活性相对于野生型发生改变的蛋白质产物。
还要理解的是，本发明并不限于特定的核酸和这些序列的氨基酸序列。重组载体和分离的核酸片段因此可广泛地包括弹状病毒编码区本身、含有对基本编码区的选择的改变或修饰的编码区，或者它们可编码包括弹状病毒编码区的更大的多肽，或者可编码具有变异的氨基酸序列的生物学上功能等价的蛋白质或多肽。
本发明的核酸片段可编码弹状病毒蛋白质和多肽，所述蛋白质和多肽是增加病毒的治疗益处的弹状病毒的或其变异体或突变体的生物学功能等价物。这种序列可能由于密码子冗余和功能等价(已知在核酸序列和所编码的蛋白质中自然发生)而出现。作为选择，功能上等价的蛋白质或肽可通过重组DNA技术的应用而产生，在该技术中，蛋白质结构的变化可基于被交换的氨基酸的性质的考虑而被工程化。人类设计的变化可通过应用定点突变技术来引入，例如用于改善病毒蛋白对癌细胞的结合能力。
B.弹状病毒多核苷酸的突变
在各种实施方式中，弹状病毒多核苷酸可被改变或突变。改变或突变可包括插入、缺失、点突变、倒位(inversion)等，并且可导致某些蛋白质或分子机制的调节、激活和/或失活，以及改变基因产物的功能、位置或表达，特别是使基因产物没有功能。当使用时，编码全部或部分弹状病毒的多肽的突变可通过各种标准的突变程序(Sambrook等，2001)来完成。突变是一种致使生物体的数量或结构发生变化的过程。突变可包括单个基因、基因块或整个基因组的核苷酸序列的改变。单个基因中的变化可由点突变造成，点突变包括DNA序列中的单个核苷酸碱基的移除、添加或取代，或者它们也可以由涉及大量核苷酸的插入或缺失的改变而导致。
1.随机突变
a．插入突变
插入突变基于通过插入已知核酸片段而使基因失活。因为它涉及插入某些类型的核酸片段，所以所产生的突变体通常失去功能，而不是获得功能。但是，也有几个插入突变的例子是产生获得功能的突变体。插入突变可利用标准分子生物学技术来实现。
b．化学突变
化学突变提供了某些优点，例如能够发现具有不同程度表型严重程度(phenotypicseverity)的各突变体，并且能够轻易且便宜地进行。大多数化学致癌剂可对DNA产生突变。苯并[a]芘、N-乙酰氧基-2-乙酰基氨基芴和黄曲霉毒素B1导致细菌细胞和哺乳动物细胞中GC转化为TA。苯并[a]芘也可产生碱基替换，例如AT变为TA。N-亚硝基化合物可产生GC到AT的转变。由于暴露于N-亚硝基脲而诱导的胸腺嘧啶的O4位置的烷基化导致TA转变为CG。
c.辐射突变
电离辐射可降解生物分子。吸收入射能导致形成离子和自由基并破坏某些共价键。分子之间以及相同分子的不同晶形之间对辐射损坏的敏感度显得差异巨大。它取决于总累计剂量以及剂量率(一旦存在自由基，它们导致的分子损伤取决于它们自然扩散速率，因此会实时变化)。通过使样品尽可能地冷，来降低和控制损伤。电离辐射导致DNA损伤，通常损伤与剂量率成比例。
在本发明中，术语“电离辐射”是指包含粒子或光子的辐射，所述粒子或光子具有足够的能量或可产生足够的能量来产生电离(获得或失去电子)。一个示例性和优选的电离辐射是x光辐射。对于给定细胞或特定分子来说，所需的电离辐射的量通常取决于该细胞或分子的性质以及突变目标的性质。测定辐射的有效量的手段在本领域是熟知的。
d.体外扫描突变
随机突变也可通过利用易错PCR来产生。突变的频率可通过利用模板的不同稀释物在多个管中进行PCR来提高。一个特别有用的突变技术是丙氨酸扫描突变，其中使用丙氨酸逐个替换许多残基从而可确定失去侧链相互作用的影响，同时使得蛋白质构型的大规模扰动的风险降到最低(Cunningham等，1989)。
体外扫描饱和突变提供了一种获得大量结构-功能信息的快速方法，包括：(i)识别调节配体结合特异性的残基，(ii)基于识别在给定位点保留活性的氨基酸和消除活性的氨基酸能更好地理解配体结合，(iii)评价活性位点或蛋白质亚结构域的整体可塑性，(iv)识别导致结合增加的氨基酸取代。
2.定点突变
结构引导性定点突变是一种剖析和工程化蛋白质-配体相互作用的有利工具(Wells,1996;Braisted等，1996)。该技术通过向选定的DNA中引用一个或多个核苷酸序列变化而制备和测试序列变异体。
C．载体
为在弹状病毒基因组中产生突变，天然的和修饰的多肽可被包含在载体内的核酸分子所编码。术语“载体”用来指一种载体核酸分子，外源性核酸序列可被插入到其中，从而引入到其可被复制的细胞中。核酸分子可以是“外源性的”，是指对于载体所要被引入的细胞来说是外来的，或者该序列与细胞中的序列同源但位于宿主细胞核酸中通常不能发现该序列的位置。载体包括质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如YAC)。本领域技术人员将有足够的能力通过标准重组技术来构建载体，这些技术在Sambrook等(2001)和Ausubel等(1994)中描述，通过引用将它们合并至本文。
除了编码修饰的多肽(例如修饰的N蛋白、P蛋白、M蛋白、G蛋白或L蛋白)之外，载体可编码非修饰的多肽序列，例如标签或靶向分子。编码这样的融合蛋白的有用的载体包括pIN载体(Inouye等，1985)、编码一链组氨酸的载体以及pGEX载体，用于生产谷胱甘肽S转移酶(GST)可溶性融合蛋白，以用于后续纯化、分离或裂解。靶向分子是一种将修饰的多肽引导向对象身体的特定器官、组织、细胞或其他位置。作为选择，靶向分子改变生物体(例如弹状病毒)对特定细胞类型(例如癌细胞)的趋向性。
术语“表达载体”是指包含核酸序列的载体，该序列编码能够被转录的基因产物的至少一部分。在某些情况下，RNA分子被翻译成蛋白质、多肽或肽。在其他情况下，这些序列不被翻译出来，例如在生成反义分子或核酶的过程中。表达载体可含有各种“控制序列”。控制序列是指可操作地连接的编码序列在特定宿主生物体内的转录和翻译(可能的情况下)所需的核酸序列。除了掌控转录和翻译的控制序列之外，载体和表达载体还含有用于其他功能的核酸序列（以下详述）。
1.启动子和增强子
“启动子”是控制序列，它是一个区域的核酸序列，在该区域内，转录的启动和速率被控制。它可含有结合调节蛋白质和分子(例如RNA聚合酶和其他转录因子)的遗传元件。短语“可操作地位于”、“可操作地结合”、“可操作地连接”、“受控制”和“受转录控制”是指启动子相对于核酸序列处于正确的功能位置和/或方向以控制该序列的转录起始和/或表达。启动子可与或不与“增强子”结合使用。增强子是指在核酸序列的转录活化中涉及到的顺式作用调节序列。
启动子可以是与基因或序列天然结合的启动子，例如可通过分离位于编码片段和/或外显子上游的5’非编码区而获得。这样的启动子可被称为是“内源性”的。相似地，增强子可为与核酸序列天然结合的增强子，其位于该序列的上游或下游。作为选择，通过将编码核酸片段置于重组或异源性启动子的控制之下可获得某些优点。重组或异源启动子是指在自然环境下通常不与核酸序列结合的启动子。重组或异源增强子也指在其自然环境下通常不与核酸结合的增强子。这样的启动子或增强子可包括其他基因的启动子或增强子，以及分离自任何其他原核细胞、病毒或真核细胞的启动子或增强子，以及“非天然”的启动子或增强子(即含有不同转录调控区的不同元件和/或改变表达的突变)。
除了合成法产生启动子和增强子的核酸序列之外，可以结合本文所公开的组合物利用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括PCR?)产生(见美国专利4683202、5928906号，通过引用将每个合并至本文)。而且，要预期到的是，引导序列在非细胞核的细胞器(例如线粒体、叶绿体等)中的转录和/或表达的控制序列也可被使用。
使用有效导引核酸片段在被选择用于表达的细胞类型、细胞器和生物体中的表达的启动子和/或增强子自然是重要的。分子生物学领域技术人员通常知道使用启动子、增强子和细胞类型组合来实现蛋白质表达，例如参见Sambrook等(2001)，通过引用合并至本文。所使用的启动子可以是组成型的、组织特异性的、细胞选择性的(即与另一种细胞类型相比在一种细胞类型中更有效)、诱导型的和/或在合适条件下可用于引导所引入的核酸片段的高水平表达(例如在重组蛋白质和/或肽的大规模生产中是有利的)。启动子可以是异源性的或内源性的。
在本发明中，可使用集中元件/启动子来调节基因的表达。该列举不是对涉及促进表达的所有可能的元件的穷举，而仅是示例性的。此处还提供了诱导型元件的例子，它是指可响应特定刺激而被活化的核酸序列区域。启动子/增强子(参考)包括：免疫球蛋白重链(Banerji等，1983；Gilles等,1983;Grosschedl等，1985；Atchinson等，1986,1987；Imler等，1987；Weinberger等，1984；Kiledjian等，1988；Porton等，1990)；免疫球蛋白轻链(Queen等，1983；Picard等，1984);T细胞受体(Luria等，1987；Winoto等，1989；Redondo等，1990)；HLADQα和/或DQβ(Sullivan等，1987)；β干扰素(Goodbourn等，1986；Fujita等，1987；Goodbourn等，1988);白细胞介素-2受体(Greene等，1989;Lin等，1990)；MHCII类5(Koch等，1989);MHCII类HLA-DRα(Sherman等，1989);β-肌动蛋白(Kawamoto等,1988;Ng等;1989)；肌酸激酶(MCK)(Jaynes等,1988;Horlick等,1989;Johnson等,1989)；前白蛋白(转甲状腺素蛋白)(Costa等,1988)；弹性蛋白酶I(Omitz等,1987)；金属硫蛋白(MTII)(Karin等,1987;Culotta等,1989)；胶原酶(Pinkert等,1987;Angel等,1987)；白蛋白(Pinkert等,1987;Tronche等,1989,1990)；α-甲胎蛋白(Godbout等,1988;Campere等,1989)；γ-球蛋白(Bodine等,1987;Perez-Stable等,1990)；β-球蛋白(Trudel等,1987)；c-fos(Cohen等,1987)；c-HA-ras(Triesman,1986;Deschamps等,1985)；胰岛素(Edlund等,1985)；神经细胞粘附分子(NCAM)(Hirsh等,1990)；α1-抗胰酶(Latimer等,1990)；H2B(TH2B)组蛋白(Hwang等,1990)；小鼠和/或I型胶原蛋白(Ripe等,1989)；葡萄糖调节蛋白(GRP94和GRP78)(Chang等,1989)；大鼠生长激素(Larsen等,1986)；人血清淀粉样蛋白A(SAA)(Edbrooke等,1989)；肌钙蛋白I(TNI)(Yutzey等,1989)；血小板源性生长因子(PDGF)(Pech等,1989)；杜兴氏肌营养不良(Klamut等,1990)；SV40(Banerji等,1981;Moreau等,1981;Sleigh等,1985;Firak等,1986;Herr等,1986;Imbra等,1986;Kadesch等,1986;Wang等,1986;Ondek等,1987;Kuhl等,1987;Schaffher等,1988)；多瘤病毒(Swartzendruber等,1975;Vasseur等,1980;Katinka等,1980,1981;Tyndell等,1981;Dandolo等,1983;deVilliers等,1984;Hen等,1986;Satake等,1988;Campbell等,1988)；逆转录病毒(Kriegler等,1982,1983;Levinson等,1982;Kriegler等,1983,1984a,b,1988;Bosze等,1986;Miksicek等,1986;Celander等,1987;Thiesen等,1988;Celander等,1988;Choi等,1988;Reisman等,1989)；乳头瘤病毒(Campo等,1983;Lusky等,1983;Spandidos和Wilkie,1983;Spalholz等,1985;Lusky等,1986;Cripe等,1987;Gloss等,1987;Hirochika等,1987;Stephens等,1987)；乙型肝炎病毒(Bulla等,1986;Jameel等,1986;Shaul等,1987;Spandau等,1988;Vannice等,1988)；人免疫缺陷病毒(Muesing等,1987;Hauber等,1988;Jakobovits等,1988;Feng等,1988;Takebe等,1988;Rosen等,1988;Berkhout等,1989;Laspia等,1989;Sharp等,1989;Braddock等,1989)；巨细胞病毒(CMV)(Weber等,1984;Boshart等,1985;Foecking等,1986)；以及长臂猿白血病病毒(Holbrook等,1987;Quinn等,1989)。
诱导元件(元件/诱导物(参考))包括：MTII/佛波酯(TNFA)、重金属(Palmiter等,1982;Haslinger等,1985;Searle等,1985;Stuart等,1985;Magana等,1987,Karin等,1987;Angel等,1987b;McNeal等,1989)；MMTV(鼠乳腺瘤病毒)/糖皮质激素类(Huang等,1981;Lee等,1981;Majors等,1983;Chandler等,1983;Lee等,1984;Ponta等,1985;Sakai等,1988)；β-干扰素/poly(rI)x,poly(rc)(Tavernier等,1983)；腺病毒5E2/E1A(Imperiale等,1984)；胶原酶/佛波酯(TPA)(Angel等,1987a)；基质裂解素/佛波酯(TPA)(Angel等,1987b)；SV40/佛波酯(TPA)(Angel等,1987b)；鼠科MX基因/干扰素、新城疫病毒(Hug等,1988)；GRP78基因/A23187(Resendez等,1988)；α-2-巨球蛋白/IL-6(Kunz等,1989)；波形蛋白/血清(Rittling等,1989)；MHCI类基因H-2Kb/干扰素(Blanar等,1989)；HSP70/E1A，SV40大T抗原(Taylor等,1989,1990a,1990b)；增殖蛋白/佛波酯-TPA(Mordacq等,1989)；以及甲状腺刺激激素α基因/甲状腺激素(Chatterjee等,1989)。
组织特异性或选择选择性的启动子或元件(即，与另一种细胞相比在一种细胞中具有更大活性的启动子)的识别，以及确定它们活性的实验，对于本领域技术人员来说是熟知的。这样的区域的例子包括人LIMK2基因(Nomoto等，1999)、生长抑素受体2基因(Kraus等,1998)、鼠科附睾视黄酸结合蛋白基因(Lareyre等,1999)、人CD4(Zhao-Emonet等,1998)、小鼠α2(XI)胶原蛋白(Tsumaki等,1998)、D1A多巴胺受体基因(Lee等,1997)、胰岛素样生长因子II(Wu等,1997)、人血小板内皮细胞黏附分子-1(Almendro等,1996)和SM22启动子。
可用于本发明的额外的病毒启动子、细胞启动子/增强子以及诱导型启动子/增强子已列举在本文中。此外，任何启动子/增强子结合(根据真核生物启动子数据库EPDB)也可被用来驱动结构基因的表达，这些结构基因编码寡糖处理酶、蛋白质折叠附属蛋白、可选择标记蛋白或感兴趣的异源蛋白。作为选择，用于癌基因治疗的组织特异性启动子(表2)或肿瘤靶向的组织特异性启动子(表3)可与本发明的核酸分子一起使用。
表2癌基因治疗的组织特异性候选启动子
组织特异性启动子 启动子在其中有活性的癌症 启动子在其中有活性的正常细胞
癌胚抗原(CEA)* 大多数结直肠癌；50%的肺癌；40-50%的胃癌；大多数胰腺癌；大许多乳癌 结肠黏膜；胃黏膜；肺上皮细胞；外分泌汗腺；睾丸中的细胞
前列腺特异性抗原(PSA) 大多数前列腺癌 前列腺上皮组织
血管活性肠肽(VIP) 大多数非小细胞肺癌 神经元细胞；淋巴细胞；肥大细胞；嗜酸性粒细胞
表面活性蛋白A(SP-A) 大多数肺腺癌细胞 肺泡的II型肺细胞；Clara细胞
人无刚毛鳞甲同系物(hASH) 大多数小细胞肺癌 肺神经内分泌细胞
粘蛋白-1(MUC1)** 大多数腺癌(起源于任何组织) 乳腺中的以及呼吸道、胃肠道和泌尿生殖道中的腺上皮细胞
α-胎蛋白 大多数肝细胞癌；可能多数睾丸癌 肝细胞(特定情况下)；睾丸
白蛋白 大多数肝细胞癌 肝细胞
酪氨酸酶 大多数黑色素瘤 黑色素细胞；星细胞；Schwann细胞；某些神经元细胞
酪氨酸结合蛋白(TRP) 大多数黑色素瘤 黑色素细胞；星细胞；Schwann细胞；某些神经元细胞
角蛋白14 推测许多鳞状细胞癌(例如头部癌和颈部癌) 角质形成细胞
EBV LD-2 许多头部和颈部的鳞状细胞癌 上消化道的角质形成细胞
胶质原纤维酸性蛋白(GFAP) 许多星形细胞瘤 星细胞
髓鞘碱性蛋白(MBP) 许多胶质瘤 少突胶质细胞
睾丸特异性血管紧张素转化酶(睾丸特异性ACE) 可能许多睾丸癌 精细胞
骨钙蛋白 可能许多骨肉瘤 成骨细胞
表3.用于肿瘤的组织特异性靶向的候选启动子
启动子 启动子在其中有活性的癌症 启动子在其中有活性的正常细胞
E2F调节的启动子 几乎所有癌症 增生细胞
HLA-G 许多结直肠癌；许多黑色素瘤；可能许多其他癌症 淋巴细胞；单细胞；精母细胞；滋养层细胞
FasL 许多黑色素瘤；许多胰腺癌；大多数星形细胞瘤；可能许多其他癌症 活化白细胞；神经元细胞；内皮细胞；角质形成细胞；免疫豁免组织中的细胞；肺、卵巢、肝和前列腺中的一些细胞
Myc调节的启动子 大多数肺癌(小细胞和非小细胞肺癌)；大多数结直肠癌 增生细胞(仅某些细胞类型)；哺乳动物上皮细胞(包括非增生性细胞)
MAGE-1 大多数黑色素瘤；一些非小细胞肺癌；一些乳癌 睾丸
VEGF 70%的癌症(在许多癌症中组成型过量表达) 新生血管位置的细胞(但不同于在肿瘤中，表达是短暂的，不那么强，并且不是组成型的)
bFGF 推测许多不同癌症，因为bFGF表达由缺血状态诱导 缺血位置的细胞(但不同于在肿瘤中，表达是短暂的，不那么强，并且不是组成型的)
COX-2 大多数结直肠癌；大多数肺癌；可能许多其他癌症 炎症位置的细胞
IL-10 大多数结直肠癌；许多肺癌；头部和颈部的许多鳞状细胞癌；可能许多其他癌症 白细胞
GRP78/BiP 推测许多不同癌症，因为GRP7S表达由肿瘤特异性条件诱导 缺血位置的细胞
来自Egr-1的CarG元件 由电离辐射诱导，因此可理解为经辐射的大多数肿瘤 暴露于电离辐射的细胞；白细胞
2.起始信号和内部核糖体结合位点
编码序列的有效翻译可能还需要特异性的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子或相邻序列。可能需要提供外源性翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域技术人员将能够轻易确定这些并提供所需要的信号。众所周知，起始密码子必须在期望编码序列的阅读框之内，以确保整个插入序列的翻译。外源性翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。表达的效率可通过包括合适的转录增强元件来增强。
在本发明的某些实施方式中，内部核糖体进入位点(IRES)元件的使用可被用来产生多基因或多顺反子信使。IRES元件能够绕过5’甲基化的帽依赖性翻译的核糖体扫描模式，并且在内部位点开始翻译(Pelletier和Sonenberg，1988)。来自小核糖核酸病毒科的两个成员(脊髓灰质炎病毒和脑心肌炎病毒)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg，1988)以及来自哺乳动物信使的IRES(Macejak和Sarnow，1991)已在文献中被描述过。IRES元件可被连接至异源性开放阅读框。多个开放阅读框可被一起转录，每个通过IRES隔开，从而产生多顺反子信使。通过IRES元件，每个开放阅读框都可接触到核糖体，从而保证有效的翻译。可使用单个启动子/增强子来转录出一个信使，从而有效地表达多个基因(见美国专利5925565和5935819，通过引用将它们合并至本文)。
3.多克隆位点
载体可包括多克隆位点(MCS)，多克隆位点是含有多个限制酶切位点的核酸区域，每个限制酶切位点可利用标准重组技术来消化所述载体。(见Carbonelli等，1999；Levenson等，1998和Cocea，1997，通过引用合并至本文。)“限制酶切消化”是指利用仅在核酸分子的特异性位置起作用的酶来催化裂解核酸分子。许多这样的限制性酶可从商业上购得。本领域技术人员普遍指导如何使用这样的酶。通常，使用在MCS内切断载体的限制性酶将载体线性化或片段化，从而使外源性序列连接至载体。“连接”是指在两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程，这两个核酸片段彼此之间可以是连续的或不连续的。有关限制性酶和连接反应的技术对于重组技术领域的技术人员来说的熟知的。
4.终止信号
本发明的载体或构建体通常将包括至少一个终止信号。“终止信号”或“终止子”由RNA序列构成，该序列涉及通过RNA聚合酶特异性终止RNA转录体。因此，在某些实施方式中，结束RNA转录体的生成的终止信号可被预期到。在体内可能需要终止子来实现期望的信使水平。
在反义RNA病毒(包括弹状病毒)中，终止是由RNA模体(motif)来限定的。可用于本发明的终止子包括任何在本文中描述或本领域技术人员已知的转录终止子，包括但不限于，例如基因的终止序列(例如牛生长激素终止子)或病毒终止序列(例如SV40终止子)。在某些实施方式中，终止信号可能缺少转录或翻译序列，例如由于序列截短造成。
5.多腺苷化信号
在表达时，特别是真核表达时，通常将包括一个多腺苷化信号以实现转录体的适当腺苷化。腺苷化信号的性质并不认为对于本发明的成功实施是至关重要的，并且/或者可使用任何这样的序列。优选的例子包括SV40多腺苷信号和/或牛生长激素多腺苷信号，这两个都方便使用并且/或者已知在多种靶细胞中都能很好地起作用。多腺苷化可增加转录体的稳定性或可便于细胞质运输。
6.复制起点
为了在宿主细胞中繁殖载体，载体可含有一个或多个复制起始位点(通常记作“ori”)，它是一种特异性核酸序列，复制在该序列处启动。作为选择，如果宿主细胞是酵母，可使用自主复制序列(ARS)。
7.选择标记和筛选标记
在本发明的某些实施方式中，含有本发明的核酸构建体的细胞可通过在表达载体中包括一个标记物而在体内或体外被识别出来。这样的标记物可赋予细胞可识别的变化，从而容易识别出含有表达载体的细胞。通常，选择标记是赋予可被选择出来的性质的标记物。阳性选择标记是指该标记物的存在使得其被选择，阴性选择标记是指该标记物的存在使得其不被选择。阳性选择标记物的一个例子是耐药标记物。
通常，将耐药标记物包括在内有助于转化体的克隆和识别，例如赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、博莱霉素和组氨醇耐药性的基因可用作选择性标记。除了赋予表现型的标记物(能够基于操作条件辨别转化体)之外，还可预期到其他类型的标记物，包括筛选标记，例如GFP(基于色度分析)。作为选择，可使用筛选酶，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员也将知道如何使用免疫标记物，可能结合FACS分析来使用。所使用的标记物并不认为是重要的，只要它能够与编码基因产物的核酸同时表达。选择标记和筛选标记的其他例子对于本领域技术人员来说是熟知的。
D.宿主细胞
本文所使用的术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用。所有这些术语还包括它们的后代(任何和所有的子代)。要理解的是，由于有意或无意突变，所有后代可能并不相同。从表达异源核酸序列的意义上说，“宿主细胞”是指原核或真核细胞，并且它包括能够复制载体和/或表达由该载体编码的异源基因的任何可转化的生物体。宿主细胞能够并且已被用作载体或病毒(如果它不表达外源性多肽，则不能称为载体)的受体。宿主细胞可被“转染”或“转化”，它们是指外源性核酸(例如修饰蛋白编码序列)被转移或引入到宿主细胞的过程。转化的细胞包括原代细胞及其后代。
宿主细胞可来自于原核生物或真核生物，包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，这取决于期望的结果是复制载体还是表达部分或所有的载体编码的核酸序列。许多细胞系和细胞培养物可被用作宿主细胞，并且它们可通过美国典型培养物保藏管理局(AmericanTypeCultureCollection,ATCC)获得。ATCC是一个收集保管活培养物和遗传材料的组织(www.atcc.org)。本领域技术人员可基于载体骨架和期望的结果来确定合适的宿主。例如，质粒或粘粒可被引入到原核宿主细胞中用于复制许多载体。用于载体复制和/或表达的宿主细胞的细菌细胞包括DH5α、JM109和KC8以及大量可从商业上获得的细菌宿主，例如SURE?感受态细胞核SOLOPACKTM金细胞(STRATAGENE?，LaJolla，CA)。作为选择，细菌细胞(例如E.ColiLE392)可被用作噬菌体病毒的宿主细胞。合适的酵母细胞包括酿酒酵母、裂殖酵母和毕赤酵母。
用于载体的复制和/或表达的真核宿主细胞的例子包括HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、Cos、CHO、Saos和PC12。本领域技术人员可得到和知道来自各种细胞类型和生物体的许多宿主细胞。类似地，病毒载体可与真核或原核宿主细胞结合使用，特别是与允许载体复制或表达的宿主细胞结合使用。
某些载体可具有控制序列，其允许载体在原核和真核细胞中都被复制和/或表达。本领域技术人员将进一步理解培养所有上述宿主细胞以维持它们并允许载体复制的条件。还要理解和知道的是允许大规模生产载体和载体所编码的核酸以及相应多肽、蛋白质或肽的技术和条件。
E.表达系统
存在有许多表达系统，这些细胞包括至少所有或部分上述成分。本发明可使用基于原核和/或真核的系统，以生产核酸序列或它们相应的多肽、蛋白质和肽。许多这样的系统可从商业上获得并且有广泛的渠道。
昆虫细胞/杆状病毒系统可产生异源核酸片段的高水平的蛋白表达，例如在美国专利5871986和4879236号(通过引用合并至本文)中描述的那些系统，它们是例如INVITROGEN?公司的MAXBAC?以及CLONTECH?公司的BACPACK?杆状病毒表达系统。
除了本发明所公开的表达系统之外，其他表达系统的例子包括STRATAGENE?的COMPLETECONTROL?诱导型哺乳动物表达系统(涉及合成的蜕皮激素诱导的受体)或其pET表达系统(E.coli表达系统)。诱导型表达系统的另一个例子可从INVITRONGEN?获得，它携带T-REX?(四环素调节的表达)系统，这是一个使用全长CMV启动子的诱导型哺乳动物表达系统。INVITRONGEN?还提供酵母表达系统(称甲醇毕赤酵母表达系统)，其被设计用于在甲基营养型甲醇毕赤酵母中高水平生产重组蛋白质。本领域技术人员将知道如何表达载体(例如表达构建体)以生产核酸序列或其相应的多肽、蛋白质或肽。
F.核酸检测
除了用于引导表达痘病毒蛋白、多肽和/或肽之外，本文公开的核酸序列具有各种其他用途。例如，它们可用作涉及核酸杂交的实施方式的探针或引物。它们可被用在本发明的诊断方法或筛选方法中。本发明包括检测编码弹状病毒或弹状病毒多肽调节剂的核酸。
1.杂交
使用长度在13至100个核苷酸，优选17至100个核苷酸或某些情况下长达1-2kb或更长的探针或引物可形成既稳定又具选择性的双链分子。通常优选具有大于20个碱基长度的连续链的互补序列的分子，从而增加所获得的杂交分子的稳定性和/或选择性。技术人员通常优选设计具有一个或多个20至30个核苷酸长(有时期望更长)的互补序列的核酸分子用于杂交。这种片段可通过例如借助化学手段直接合成或通过将选定序列引入到重组载体中用于重组生产而轻易制备出来。
因此，本发明的核苷酸序列可根据它们的能力被用于与DNA和/或RNA互补链选择性地形成双链分子或提供用于从样品中扩增DNA或RNA的引物。根据所设想的应用，技术人员会期望使用各种杂交条件以获得用于靶序列的各种不同选择度的探针或引物。
对于需要高选择度的应用，通常期望使用相对高度严格条件来形成杂交体。例如，相对低盐和/或高温度条件，例如约0.02M至约0.10MNaCl，温度为约50℃至约70℃。这样的高度严格条件容忍非常少(如有)的探针或引物与模板或靶链之间的错配，并且特别适合用于分离特定的基因或用于检测特定的mRNA转录体。通常要意识到，可通过逐渐增加甲酰胺的量来使条件更加严格。
对于某些应用(例如定点突变)，要意识到的是，优选使用较低严格度的条件。在这些条件下，即使杂交链的序列并不完美地互补，而是在一个或多个位点错配，也会发生杂交。可通过逐渐增加盐浓度和/或降低温度来使得条件更不严格。例如，中等严格条件可为约0.1至0.25MNaCl，温度在约37℃至约55℃，而低严格条件可为约0.15M至约0.9M盐，温度为约20℃至约55℃。杂交条件可根据期望的结果而容易操控。
在其他实施方式中，杂交可在例如以下条件下实现：50mMTris-HCl(pH8.3)、75mMKCl、3mMMgCl2、1.0mM二硫苏糖醇、温度为约20℃至约37℃。其他杂交条件可包括约10mMTris-HCl(pH8.3)、50mMKCl、1.5mMMgCl2、温度为约40℃至约72℃。
在某些实施方式中，将本发明的确定序列的核酸与用于确定杂交的合适手段(例如标记)结合使用是有利的。本领域已知有各种合适的指示手段，包括荧光、放射性、酶或其他能够被检测的配体，例如亲和素/生物素。在优选的实施方式中，可能期望使用荧光标记或酶标签(例如脲酶、碱性磷酸酶或过氧化物酶)，而不使用放射性或其他对环境不友好的试剂。如果使用酶标签，已知有比色指示底物可被用来提供检测手段(可以是视觉检测或分光光度法检测)，以识别与含有互补核酸的样本的特异性杂交。
通常，可以想到，本文所述的探针或引物可用作溶液杂交的试剂，例如用在PCR?中，用于检测相应基因的表达以及用在使用固相的实施方式中。在使用固相的实施方式中，测试DNA(或RNA)被吸附或以其他方式粘附至选定的基质或表面。这个固定的单链核酸随后用选定的探针在期望的条件下杂交。所选择的条件将取决于特定的情况(取决于例如G+C含量、靶核酸类型、核酸来源、杂交探针大小等)。本领域技术人员熟知对于特定感兴趣的应用的杂交条件的优化。在洗涤杂交分子以移除非特异性结合的探针分子后，通过测定结合的标记物的量来检测和/或定量杂交。代表性的固相杂交方法在美国专利5843663、5900481和5919626中公开。其他可用在本发明实践中的杂交方法公开在美国专利5849481、5849486和5851772中。通过引用将在说明书这部分中指出的这些和其他参考文献的相关部分合并至本文中。
2.核酸的扩增
用作扩增模板的核酸可从细胞、组织或其他样品中根据标准方法(Sambrook等，2001)来分离。在某些实施方式中，在整个细胞或组织匀浆或生物学流体样本上进行分析，而不实质性纯化模板核酸。核酸可为基因组DNA或分解的或整个细胞RNA。当使用RNA时，可能期望首先将RNA转化为互补DNA。
本文所用的术语“引物”包括能够在模板依赖性程序中导引新生核酸合成的任何核酸。通常，引物是寡核苷酸，长度为10至20和/或30个碱基对，但可使用更长的序列。可提供双链和/或单链形式的引物，但优选单链形式。
被设计用来选择性杂交至对应基因序列的核酸的引物对被与模板核酸在允许选择性杂交的条件下接触。根据期望的应用，可选择高度严格杂交条件，以仅允许杂交至与引物完全互补的序列。在其他实施方式中，杂交可在降低的严格度下进行，以允许扩增出与引物序列有一个或多个错配的核酸。一旦杂交，模板-引物复合物与一个或多个酶接触以便进行模板依赖性核酸合成。进行多轮扩增(也称为“循环”)，直到生产出足够量的扩增产物。
许多模板依赖性程序可被利用从而扩增存在于给定模板样本中的寡核苷酸序列。其中一个广为人知的扩增方法是聚合酶链反应(称为PCR?)，它在美国专利4683195、4683202和4800159中以及Innis等，1988中有详细描述，通过引用将它们全部合并至本文。
反转录酶PCR?扩增程序可被用来定量所扩增的mRNA的量，这是熟知的(见Sambrook等，2001；WO90/07641和美国专利5882864号)。
另一种扩增方法是连接酶链式反应(“LCR”)，其在欧洲专利申请320308中公开，通过引用将其合并至本文。美国专利4883750描述一种类似于LCR用于将探针对结合至靶序列的方法。也可以使用基于PCR?和寡核苷酸连接酶实验(OLA)的方法(公开于美国专利5912148号)。可用在本发明中的其他扩增靶核酸序列的方法公开在美国专利5843650、5846709、5846783、5849546、5849547、5858652、5866366、5916776、5922574、5928905、5928906、5932451、5935825、5939291和5942391中以及GB申请号2202328、PCT申请号PCT/US89/01025中，通过引用将每个文献以整体形式合并至本文。可也可使用如Waler等(1992)描述的等温扩增，以及美国专利5916799号公开的链置换扩增(SDA)。
其他核酸扩增程序包括基于转录的扩增系统(TAS)，包括基于核酸序列的扩增(NASBA)和3SR(Kwoh等，1989；PCT申请WO88/10315，通过引用将它们合并至本文)。欧洲专利申请329822号公开了一种核酸扩增方法，包括循环地合成单链RNA(“ssRNA”)、ssDNA和双链DNA(dsDNA)，该方法可用于本发明。
PCT申请WO89/06700(通过引用合并至本文)公开了一种核酸序列扩增方案，该方案基于启动子区域/引物序列与靶单链DNA(“ssDNA”)的杂交，气候为序列的许多RNA拷贝的转录。其他扩增方法包括“RACE”和“单边PCR”(Frohman，1990；Ohara等，1989)。
3.核酸的检测
在任何扩增之后，可能期望将扩增产物与模板和/或过量引物分离开来。在一个实施方式中，扩增产物通过琼脂糖、琼脂糖-丙烯酰胺或聚丙烯酰胺凝胶电泳利用标准方法(Sambrook等，2001)而被分离。
核酸的分离也可通过本领域已知的色谱技术来进行。有许多色谱种类可被用于本发明，包括吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、羟基磷灰石色谱、分子筛色谱、反相色谱、柱色谱、纸层析、薄层层析和气相色谱以及HPLC。
通常的现象方法包括用溴化乙锭对胶染色以及在UV光线下显象条带。作为选择，如果扩增产物在内部被标记有放射性或荧光标记的核苷酸，所分离的扩增产物可暴露于X光膜或在合适的激发频谱下现象。
在特别的实施方式中，通过Southern杂交和与标记探针杂交来实现检测。本领域技术人员对于Southern杂交所涉及的技术是熟知的(见Sambrook等，2001)。前述内容的一个例子在美国专利5279721中有描述(通过引用将其合并至本文)，其公开了一种核酸的自动电泳和转移的装置和方法。
可用于本发明的核酸检测的其他方法公开在美国专利5840873、5843640、5843651、5846717、5846726、5846729、5849487、5853990、5853992、5853993、5856092、5861244、5863732、5863753、5866331、5905024、5910407、5912124、5912145、5919630、5925517、5928862、5928869、5959227、5932413和5935791中，通过引用将每个文献都合并至本文。
4.其他实验
在本发明的范围中，可使用其他遗传筛选方法，例如用来检测基因组核酸、cDNA和/或RNA样本中的突变。用来检测点突变的方法包括变性梯度凝胶电泳(“DGGE”)、限制性片段长度多态性分析(“RFLP”)、化学或酶裂解法、PCR?(见上)扩增的靶区域的直接测序、单链构象多态性检测(“SSCP”)和本领域已知的其他方法。筛选点突变的一个方法是基于RNA/DNA或RNA/RNA异源双链体重碱基对错配的RNase裂解。本文所使用的术语“错配”被定义为在双链RNA/RNA、RNA/DNA或DNA/DNA分子中一个或多个未配对或错配对的核苷酸的区域。因此，该定义包括由于插入/缺失突变导致的错配以及单个或多个碱基点突变(例如见美国专利4946773)。可被用于本发明的用于检测缺失、插入或替代突变的替代性方法公开在美国专利5849483、5851770、5866337、5925525和5928870中，通过引用将每个文献合并至本文中。
G.基因转移的方法
用于核酸递送以实现本发明的成分的表达的合适方法被认为包括实质上任何可将核酸(例如DNA或RNA，包括病毒和非病毒载体)引入到细胞器、细胞、组织或生物体的方法，包括如本文所述的方法或如本领域技术人员所知的方法。这种方法包括但不限于核酸的直接递送，例如通过注射(美国专利5994624、5981274、5945100、5780448、5736524、5702932、5656610、5589466和5580859，通过引用将每一篇都合并至本文)，包括微注射(Harland和Weintraub，1985；美国专利5789215号，通过引用合并至本文)；通过电穿孔(美国专利5384253，通过引用合并至本文)；通过磷酸钙沉淀(Graham和VanDerEb，1973;Chen和Okayam，1987;Pippe等，1990)；通过使用DEAE葡聚糖随后用聚乙二醇(Gopal，1985)；通过直接超声加载(Fechheimer等，1987)；通过脂质体介导的转染(Nicolau和Sene,1982;Fraley等,1979;Nicolau等,1987;Wong等,1980;Kaneda等,1989;Kato等,1991)；通过微弹射击法(PCT申请WO94/09699和95/06128;美国专利5610042、5322783、5563055、5550318、5538877和5538880号，通过引用将每个合并至本文)；通过用碳化硅纤维搅拌(Kaeppler等,1990;美国专利5302523和5464765，通过引用将每个合并至本文)；通过农杆菌介导的转化(US专利5591616和5563055，通过引用将每个合并至本文)；或通过PEG介导的原生质体转化(Omirulleh等,1993;US专利4684611和4952500，通过引用将每个合并至本文)；通过干燥抑制介导的DNA吸收(Potrykus等,1985)。通过应用这些方法，可稳定地或短暂地转化细胞器、细胞、组织或生物体。
H.脂质组分和部分(Moiety)
在某些实施方式中，本发明涉及包含一种或多种与核酸、氨基酸分子(例如肽)或其他小分子化合物相连的脂质的组合物。在本文所述的任何实施方式中，所述分子可以是弹状病毒多肽或弹状病毒多肽调节剂，例如是编码所有或部分的任何一种弹状病毒多肽的核酸，或者是编码所有或部分的弹状病毒多肽调节剂的氨基酸分子。脂质是一种特征是不溶于水并且可用有机溶剂提取的物质。本领域技术人员可理解本文明确描述的那些化合物之外的哪些化合物是脂质，并且可被包括在本发明的组合物和方法中。脂质组分和非脂质组分可以共价键或非共价键的方式彼此连接。
脂质可以是天然的或合成的(即，由人类设计或生产出来)。但是，脂质通常是生物学物质。生物学脂质在本领域是熟知的，包括例如中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、类固醇、萜烯、血溶性脂类(lysolipid)、鞘糖脂、糖脂、硫脂、具有连接了醚和酯的脂肪酸的脂质、可聚合脂质、和它们的组合。
连有脂质的核酸分子或氨基酸分子(例如肽)可被分散在含有脂质的溶液中、可用脂质溶解、可用脂质乳化、可与脂质混合、可与脂质结合、可共价键合至脂质、可以悬浮液形式被包含在脂质内、或以其他方式与脂质相关联。本发明的脂质或脂质/病毒相关组合物并不限于任何特定结构。例如，它们也可被简单地散布于溶液中，可能形成尺寸或形状都不均匀的聚集体。在另一个例子中，它们可以双层结构存在，呈胶团状，或具有“崩塌(collapsed)”结构。在另一个非限制性的例子中，也可以是Lipofectamine(GibcoBRL)-痘病毒或Superfect(Qiagen)-病毒复合物。
在某些实施方式中，脂质组合物可包含约1%、约2%、约3%、约4%、约5%、约6%、约7%、约8%、约9%、约10%、约11%、约12%、约13%、约14%、约15%、约16%、约17%、约18%、约19%、约20%、约21%、约22%、约23%、约24%、约25%、约26%、约27%、约28%、约29%、约30%、约31%、约32%、约33%、约34%、约35%、约36%、约37%、约38%、约39%、约40%、约41%、约42%、约43%、约44%、约45%、约46%、约47%、约48%、约49%、约50%、约51%、约52%、约53%、约54%、约55%、约56%、约57%、约58%、约59%、约60%、约61%、约62%、约63%、约64%、约65%、约66%、约67%、约68%、约69%、约70%、约71%、约72%、约73%、约74%、约75%、约76%、约77%、约78%、约79%、约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约98%、约100%或任何它们之间的范围值的特定脂质、脂质类型或非脂质成分(例如药物、蛋白质、糖、核酸或本文描述的或本领域技术人员已知的其他物质)。在一个非限制性的例子中，脂质组合物可包含约10%至约20%的中性脂质，和约33%至约34%的脑苷脂，以及约1%的胆固醇。因此，可预期到，本发明的脂质组合物可包含以任何方式组合或任何百分含量范围的任何脂质、脂质类型或其他成分。
IV.药物制剂和治疗方案
在本发明的实施方式中，提供一种通过递送弹状病毒(例如Maraba病毒、Carajas病毒、MuirSprings病毒和/或BahiaGrande病毒)治疗超增生性或瘤性疾病(例如癌症)的方法。可预期治疗的癌症的例子包括肺癌、头颈癌、乳癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、子宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、肿瘤前病变、肺部肿瘤前病变、结肠癌、黑色素瘤、膀胱癌、和可被治疗的任何其他癌症或肿瘤(包括转移性癌症或全身分布性癌症)。
通常，药物组合物的有效量被定义为足以可检测地且重复地减缓、改善、降低、最小化或限制疾病或其症状的程度的量。也可适用更严格的定义，包括消除、根除或治愈疾病。
优选地，患者具有适当的骨髓功能(外周血粒细胞绝对计数>2000/mm3且血小板计数100000/mm3)和适当的肾功能(肌酐<1.5mg/dl)。
A.施用
为了利用本发明的方法和组合物杀死细胞、抑制细胞生长、抑制转移、减小肿瘤或组织大小或以其他方式逆转、保持或降低肿瘤细胞的恶性表现型，通常将超增生性或瘤性细胞与治疗组合物(例如病毒或编码多肽的表达构建体)接触。施用的途径自然将根据病变的位置和性质而变化，包括例如皮内、透皮、肠胃外、血管内、静脉内、肌肉内、鼻腔、皮下、区域性、经皮、气管内、腹膜内、动脉内、膀胱内、瘤内、吸入、灌注、灌洗、直接注射、营养和口腔施用和制剂。
为实现血管疾病的疗效，将血管细胞与治疗化合物接触。也可对血管疾病使用关于治疗或诊断癌症所描述的任何制剂和施用途径。
对于离散肿瘤、实体肿瘤和可触及肿瘤，可使用瘤内注射或注射到肿瘤血管构筑(vasculature)内。也可局部、区域性或全身性施用，特别是对于那些全身性或可能全身性传播的癌症。病毒颗粒可通过至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次注射而被施用。
在手术介入的情况下，本发明可在术前使用，使得不能手术的肿瘤可被切除。或者，本发明可在手术时使用，并且/或者在术后使用，以治疗残留的或转移的疾病。例如，切除的肿瘤床可用包含弹状病毒多肽或弹状病毒的制剂注射或灌注，这可能保护或可能不保护对于治疗癌症或癌细胞有利的突变。灌注可在切除后持续进行，例如通过在手术位置植入导管来实现。可以想到在手术受进行定期的治疗。
适当时，例如当肿瘤被切除且肿瘤床被处理以消除残留的、微小的疾病时，也可进行连续施用。优选通过注射器或导管进行递送。这种连续灌注可在最初治疗之后进行约1-2小时至约2-6小时、至约6-12小时、至约12-24小时、至约1-2天、至约1-2周或更长时间。通常，经连续灌注所使用的治疗组合物的剂量将与通过单次或多次注射而给予的剂量相等，并且在灌注持续的时间内可调节剂量。进一步可预期到，可使用肢体灌注来施用本发明的治疗组合物，特别是在治疗黑色素瘤和肉瘤的情况下。
治疗方案也可能变化，通常取决于肿瘤类型、肿瘤位置、疾病进展以及患者的健康状况和年龄。明显地，某些类型的肿瘤将需要更加侵入性的治疗，但同时某些患者不能忍受更繁重的方案。医生最适合基于治疗制剂的已知疗效和毒性(如有)来作出决定。
在某些实施方式中，被治疗的肿瘤可能(至少最开始)不可切除。使用治疗性病毒构建体治疗，因为边缘皱缩或通过消除某些特别具有侵入性的部分，可增加肿瘤的可切除性。治疗之后，切除变得可能。切除后的额外的治疗可用来消除在肿瘤位置处的微小残留疾病。
对于原发性肿瘤或切除后肿瘤床来说，通常的疗程将包括多个剂量。通常的原发性肿瘤治疗包括在1、2、3、4、5、6周或更长时间内施用1、2、3、4、5、6或更多剂。两周的治疗方案可被重复1、2、3、4、5、6或更多次。在治疗过程中，可重新评估是否需要完成计划的剂量。
治疗可包括各种“单位剂量”。单位剂量被定义为含有预定量的治疗组合物。临床领域的技术人员知道施用的量以及特定途径和制剂。单位剂量不需要通过单次注射来施用，而是可包括在一个预设时间段内连续注射。本发明的单位剂量可方便地以噬菌斑形成单位(pfu)或病毒构建体的病毒颗粒的形式描述。单位剂量可为103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013pfu或vp或更高。或者，根据病毒的种类和可得到的效价，可向患者或患者的细胞中递送1至100、10至50、100-1000、或多至约1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、或1×1015个或更多的感染性病毒颗粒(vp)。
B.可注射组合物和制剂
在本发明中，将编码所有或部分弹状病毒基因组的表达构建体或病毒递送至癌细胞或肿瘤细胞的优选方法是通过血管内注射。但是，本文公开的药物组合物也可通过如美国专利5543158、5641515和5399363号(通过引用将每篇专利以其完整形式合并至本文中)所描述的瘤内、肠胃外、静脉内、动脉内、皮内、肌肉内、透皮、甚至腹膜内施用。
核酸构建体的注射可通过注射器或其他任何用于注射溶液的方法来递送，只要表达构建体可通过注射用针的特定规格(例如美国专利5846233和5846225号)。
活性化合物的游离碱或药理学上可接受的盐的溶液可在适当地混合有表面活性剂(例如羟丙基纤维素)的水中制备。也可在甘油、聚乙二醇和它们的混合物以及在油类中制备分散液。在普通储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂用以防止微生物生长。适合注射用的药物形式包括无菌水溶液或分散液以及用于即时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末(美国专利5466468号，通过引用合并至本文)。在所有的情况下，制剂必须是无菌的并且必须达到易于注射的流动性。制剂必须在制造和存储条件下是稳定的，并且必须被保护而不受微生物(例如细菌和真菌)的污染。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们的合适混合物、和/或植物油。例如，可通过使用涂层(例如卵磷脂)、通过维持所需的颗粒尺寸(当为分散液时)以及通过使用表面活性剂，来维持适当的流动性。预防微生物的作用可通过各种抗菌剂和抗真菌剂来实现，例如对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫汞撒(thimerosal)等。在许多情况下，优选将等渗剂(例如糖或氯化钠)包括在内。可通过在组合物中使用延迟吸收剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射组合物的延长的吸收。
对于水溶液形式的肠胃外给药，如果需要，溶液例如首先被适当地缓冲，并使用足量的生理盐水或葡萄糖首先使液体稀释剂呈等渗的。这些特别的水溶液特别适合于静脉内、肌肉内、皮下、瘤内和腹膜内施用。关于这点，本领域技术人员根据本发明公开内容将知道可被使用的无菌水性介质。例如，一份剂量可被溶解在1ml的等渗NaCl溶液中，再被添加至1000ml的皮下灌输液中或被注射到建议的注射位置(参见例如“Remington’sPharmaceuticalSciences”，第15版，第1035-1038页和1570-1580页)。根据被治疗对象的状况，有必要对剂量作出改变。无论怎样，负责施用的人员将确定用于单个对象的合适剂量。而且，对于人类施用，制剂还需符合使用该组合物的国家政府所要求的无菌性、致热原性、一般安全性和纯度标准。
本文公开的组合物可被配制成中性或盐形式。药物学可接受的盐包括酸加成盐(用蛋白质的游离氨基形成)，它们利用无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成。利用有利羧酸基团形成的盐也可由无机碱衍生，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，或由有机碱衍生，例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等)。配制后，溶液将以与剂量制剂相容的方式和治疗有效量被施用。制剂容易以各种剂量形式(例如可注射溶液、药物释放胶囊等)被施用。
本文使用的术语“载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、赋形剂、涂层、稀释剂、抗菌剂、抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收剂、缓冲液、载体溶液、悬浮液、胶体等。本领域熟知将这些介质和溶剂用于药学上有活性的物质。除了迄今与活性组分不相容的任何常规介质或溶剂之外，可以预期其在治疗性组合物中的使用。补充活性组分也可被加入组合物中。
术语“药学上可接受的”或“药理上可接受的”是指当施用至人时不会产生过敏反应或类似不利的反应的分子实体和组合物。本领域技术人员熟知含有蛋白质作为活性组分的液体组合物的制备。通常，这种组合物被制备成可注射物(液体溶液形式或悬浮液形式)；也可制备出适合于在注射之前溶解或悬浮在液体中的固体形式。
C.联合治疗
本发明的组合物和方法可被用在超增生性或瘤性疾病/病症(包括癌症和动脉硬化)中。为了增加利用本发明的组合物(例如弹状病毒)治疗的有效性，可能期望将这些组合物与其他在治疗那些疾病和病症中有效的试剂结合在一起。例如，癌症的治疗可通过利用本发明的治疗性组合物以及其他抗癌疗法(例如抗癌剂或手术)一起来进行。
可使用各种组合；例如弹状病毒(例如Maraba病毒)为“A”，次级抗癌疗法为“B”(可包括第二种弹状病毒或其他溶瘤病毒)：
A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BA/B/BB/A/AA/B/B/BB/A/B/B
B/B/B/AB/B/A/BA/A/B/BA/B/A/BA/B/B/AB/B/A/A
B/A/B/AB/A/A/BA/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/A
本发明的治疗性病毒或病毒构建体向患者的施用将根据施用该特定次级疗法的通常方案进行并考虑病毒治疗的毒性(如有)。可以预期的是，治疗循环可按需要重复。还预期的是，各种标准疗法以及手术介入可与所述的癌细胞或肿瘤细胞疗法结合使用。
1.抗癌疗法
“抗癌”剂能够通过杀死癌细胞、诱导癌细胞凋亡、降低癌细胞生长速率、降低转移的发生率或数量、降低肿瘤大小、抑制肿瘤生长、降低对肿瘤或癌细胞的供血量、促进对癌细胞或肿瘤的免疫响应、预防或抑制癌症的发展或增加患癌对象的寿命来负面地影响治疗对象的癌症。抗癌剂包括生物试剂(生物疗法)、化疗剂和放疗剂。通常，这些其他组合物能够以有效杀死或抑制细胞增生的结合量来提供。该过程可包括将细胞与病毒或病毒构建体以及试剂或多种因素同时接触。这可通过将细胞与包含两种试剂的单个组合物或药理学制剂接触，或通过将细胞与两种不同的组合物或制剂同时接触(其中一种组合物包括病毒，另一种组合物包括第二种试剂)来实现。
对化疗剂和放疗剂有耐性的肿瘤细胞成为临床肿瘤学上的一个主要问题。当前的癌症研究的一个目标就是寻找各种方法而通过将化疗和放疗与基因疗法结合来改善它们的疗效。例如，单纯疱疹胸苷激酶(HS-tK)基因，当通过逆转录病毒载体系统被递送至脑瘤时，成功地诱导了对抗病毒剂更昔洛韦的敏感性(Culver等，1992)。在本发明中，除了其他促凋亡剂或细胞周期调节剂之外，预期痘病毒疗法可类似地与化疗、放疗、免疫疗法或其他生物学干预结合使用。
或者，病毒疗法可在其他治疗之前或之后间隔数分钟至数周时间进行。在单独施用其他试剂和病毒至细胞的实施方式中，通常要保证每次递送之间不要超过很长时间，使得试剂和病毒仍能够对细胞施加有利的组合效果。在这种情况下，预期到可将细胞与两种形式在彼此施用后的约12-24小时内，更优选为约6-12小时内接触。在一些情况下，可能期望将治疗的时间段显著延长，此时各施用之间可能间隔数天(2、3、4、5、6或7天)至几周(1、2、3、4、5、6、7或8周)时间。
a.化学疗法
癌症疗法还包括具有基于化学和辐射治疗的多种组合疗法。组合化学疗法包括例如顺铂(CDDP)、卡铂、丙卡巴肼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥、白消安(busulfan)、亚硝基脲、放线菌素、道诺霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、博来霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicomycin)、丝裂霉素、依托泊甙(VP16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、雌激素受体结合剂、紫杉醇、吉西他滨(gemcitabien)、诺维本(navelbine)、法尼基蛋白(farnesyl-protein)转移酶抑制剂、反铂、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春花碱和甲氨蝶呤、替莫唑胺(Temazolomide，DTIC的水溶液形式)、或前述药物的任何类似物或衍生物变体。化学疗法与生物学疗法的组合被称为生化疗法。
b.放射疗法
导致DNA损伤并且已被广泛应用的其他因素包括普遍已知的γ射线、X-射线、质子束、和/或放射性同位素向肿瘤细胞的引导递送。还预期有其他形式的DNA损伤因子，例如微波和UV辐射。很可能的情况是，所有这些因素对DNA、DNA前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维持产生广泛的损伤影响。X-射线的剂量范围是：日剂量为50至200伦琴(用于延长的时间段(3至4周))，到2000至6000伦琴的单次剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大，它取决于同位素的半寿期、所激发的辐射的强度和类型以及瘤细胞的吸收量。
本文所使用的术语“接触”和“暴露”，当应用于细胞时，是用来描述治疗性构建体和化疗剂或放疗剂被递送至靶细胞的过程，或被与靶细胞直接邻接地放置的过程。为了实现细胞杀伤和停滞，两种试剂都被递送至细胞，联合递送量为能有效地杀死细胞或阻止细胞分裂的量。
c.免疫疗法
免疫疗法通常依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向和摧毁癌细胞。免疫效应物例如可为对肿瘤细胞的表面上的某些标记物特异的抗体。抗体可单独作为治疗的效应无，或者它可招募其他细胞来实际实现细胞杀伤。抗体也可与药物或毒素(化疗剂、放射性核素、蓖麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)结合，并且仅作为靶向剂。或者，效应物可为携带表面分子的淋巴细胞，该表面分子直接或间接地与肿瘤靶细胞相互作用。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。治疗方案的组合，即直接细胞毒性活性以及某些弹状病毒或弹状病毒多肽的抑制或降低，将提供癌症治疗方面的治疗优势。
免疫疗法也可作为联合疗法的一部分。联合疗法的一般方法在以下讨论。在免疫疗法的一个方面，肿瘤细胞必须具有一些负责靶定的标记物，即这些标记物不存在于大部分其他细胞上。存在有许多肿瘤标记物，它们中的任何一个可能都适合用在本发明中用于靶定。通常的肿瘤标记物包括癌胚抗原、前列腺特异性抗原、膀胱肿瘤相关抗原、胚胎抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激素受体、层粘连蛋白受体、erbB和p155。肿瘤细胞裂解物也可被用在抗原组合物中。
免疫疗法的另一个方面是将抗癌作用与免疫刺激作用结合。免疫刺激分子包括：细胞因子(例如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、IFNy)；趋化因子(例如MIP-1、MCP-1、IL-8)以及生长因子(例如FLT3配体)。将免疫刺激分子(以蛋白质形式或使用基因递送)与肿瘤抑制剂结合已显示出增强的抗肿瘤作用(Ju等,2000)。
如前所述，当前正在研究或使用中的免疫疗法的例子是免疫佐剂(例如牛分枝杆菌、恶性疟原虫、二硝基氯化苯和芳香族化合物)(美国专利5801005和5739169号；Hui和Hashimoto,1998;Christodoulides等,1998)；细胞因子治疗(例如干扰素α、β和γ；IL-1；GM-CSF和TNF)(Bukowski等,1998;Davidson等,1998;Hellstrand等,1998)；基因疗法(例如TNF、IL-1、IL-2、p53)(Qin等,1998;Austin-Ward和Villaseca,1998;美国专利5830880和5846945号)；和单克隆抗体(例如，抗神经节苷脂GM2、抗-HER-2、抗-p185)(Pietras等,1998;Hanibuchi等,1998;美国专利5824311)。赫赛汀(曲妥珠单抗)是嵌合型(小鼠-人)单克隆抗体，其阻断HER2-neu受体(Dillman，1999)。赫赛汀与化学疗法的癌症联合治疗以显示出比单独疗法更有效。因此，预期一种或多种抗癌疗法可与本发明的弹状病毒相关疗法一起使用。
(1)被动免疫疗法
存在许多的癌症被动免疫疗法的不同方法。它们可被大体分类为：仅注射抗体；注射结合有毒素或化疗剂的抗体；注射结合有放射性同位素的抗体；注射抗独特型抗体；以及清除骨髓中的肿瘤细胞。
优选地，人单克隆抗体被用于被动免疫疗法，因为它们在患者中产生很少或者不产生副作用。但是，它们的应用某种程度上受限于它们的稀缺性并且迄今仅通过病灶内施用。神经节苷酯抗原的人单克隆抗体已被病灶内施用至患有皮肤周期性黑色素瘤的患者(Irie和Morton,1986)。在每天或每周病灶内注射后，十个患者中有六个观察到了肿瘤退化。在另一项研究中，两种人单克隆抗体的病灶内注射获得了适度的成功(Irie等,1989)。施用针对两种不同抗原的一种以上的单克隆抗体，或者施用具有多个抗原特异性的抗体，可能是有利的。治疗方法还可包括施用如Bajorin等(1988)所描述的淋巴因子或其他免疫增强剂。人单克隆抗体的开发在说明书的其他地方做进一步详细描述。
(2)主动免疫疗法
在主动免疫疗法中，抗原肽、抗原多肽或抗原蛋白，或自体或同种异体肿瘤细胞组合物或“疫苗”通常与独特的细菌性佐剂(bacterialadjuvant)一起施用(Ravindranath和Morton,1991;Morton等,1992;Mitchell等,1990;Mitchell等,1993)。在黑色素瘤免疫疗法中，引发高IgM反应的那些患者通常比没有引发或引发低IgM抗体的患者活得好(Morton等,1992)。IgM抗体通常是瞬态抗体(transientantibody)，抗神经节苷酯抗体或抗糖抗体显得是例外。
(3)过继免疫疗法
在过继免疫疗法中，患者的循环淋巴细胞或肿瘤浸润淋巴细胞被在体外分离、用淋巴因子(例如IL2)活化或用肿瘤坏死基因转导，并被重新施用(Rosenberg等,1988;1989)。为实现该疗法，要将免疫学上有效量的活化淋巴细胞与本文所述的加入了佐剂的抗原肽组合物联合施用至动物或人患者。活化淋巴细胞最优选是患者自己的细胞，该细胞早前从血液或肿瘤样本中分离出来并在体外被活化(或“扩张(expanded)”)。这种形式的免疫疗法已产生了几例黑色素瘤和肾癌的退化，但相比较于不响应的患者数，响应患者的百分比很少。
d.基因
在另一个实施方式中，次级治疗是基因疗法，其中治疗性多核苷酸在施用弹状病毒之前、之后或同时被施用。弹状病毒与编码以下基因产物的至少一种的载体结合递送将对靶组织具有联合的抗癌作用。或者，弹状病毒可被工程化成病毒载体从而包括治疗性多核苷酸。本发明包括多种蛋白质，其中一些在以下描述。表4列举了可与本发明结合使用的某些形式的基因疗法中可被靶向的各种基因。
(1)细胞增殖诱导物
诱导细胞增殖的蛋白质根据其功能可被分为几类。这些蛋白质的共性在于它们能够调节细胞增殖。例如，sis致癌基因(PDGF的一种形式)是一种分泌的生长因子。致癌基因很少来源于编码生长因子的基因，并且现在sis是唯一已知的天然致癌基因生长因子。在本发明的一个实施方式中，预期针对特定的细胞增殖诱导物的反义mRNA可被用来阻止该细胞增殖诱导物的表达。
(2)细胞增殖抑制物
肿瘤抑制致癌基因用来抑制过度的细胞增殖。这些基因的失活摧毁了它们的抑制性能，导致不受调节的增殖。肿瘤抑制物包括p53、p16和C-CAM。其他根据本发明可被使用的基因包括Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、zacl、p73、VHL、MMAC1/PTEN、DBCCR-1、FCC、rsk-3、p27、p27/p16融合基因、p21/p27融合基因、抗血栓形成基因(例如COX-1、TFPI)、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、与血管发生相关的基因(例如，VEGF、FGF、凝血酶敏感蛋白、BAI-1、GDAIF、或它们的受体)以及MCC。
(3)程序性细胞死亡的调节物
细胞凋亡(或程序性细胞死亡)是正常胚胎发育、维持成体组织平衡和抑制癌形成的重要过程(Kerr等,1972)。Bcl-2蛋白家族和ICE样蛋白酶已在其他系统中被证实是细胞凋亡的重要调节物和效应物。Bcl2蛋白(在滤泡型淋巴瘤中发现)在控制细胞凋亡和增强细胞在响应各种凋亡刺激时的存活率方面具有突出作用(Bakhshi等,1985;Cleary和Sklar,1985;Cleary等,1986;Tsujimoto等,1985;Tsujimoto和Croce,1986)。进化上保守的Bcl-2蛋白现在是相关蛋白家族的成员，其可被分类为死亡激动剂或死亡拮抗剂。
发现该蛋白之后，Bcl2显示出抑制由多种刺激引发的细胞死亡。另外，现在明显的是，Bcl-2细胞死亡调节蛋白家族具有共同的结构和序列同源性。这些不同的家族成员已显示出具有与Bcl2相似的功能(例如BclXL、BclW、BclS、Mcl-1、A1、Bfl-1)，或与Bcl2功能相反并促进细胞死亡(例如Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、Bad、Harakiri)。
e.手术
约60%的癌症患者将经受某种类型的手术治疗，包括预防性、诊断性或分期性、治愈性和减轻性手术。治愈性手术是一种癌症治疗手段，它可与其他疗法(例如本发明的治疗方法、化疗、放疗、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或其他疗法)结合使用。
治愈性手术包括切除术，其中所有或部分癌组织被物理性移除、切掉和/或摧毁。肿瘤切除是指物理移除肿瘤的至少一部分。除肿瘤切除之外，手术治疗包括激光手术、冷冻手术、电手术、微观控制手术(Mohs氏手术)。还预期的是，本发明可与浅表癌、前癌或附带量的正常组织的移除结合使用。
一旦切除部分或所有的癌细胞、组织或肿瘤，在体内会形成凹腔。可通过灌注、直接注射或对该区域利用额外的抗癌疗法进行局部施用来实现治疗。这种治疗可例如每1、2、3、4、5、6、或7天重复一次，或者每1、2、3、4、或5周重复一次，或者每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12个月重复一次。这些治疗也可使用不同的剂量。
f.其他试剂
要预期到，其他试剂可与本发明结合使用从而改善治疗的效果。这些额外的试剂包括免疫调节剂、影响细胞表面受体的上调和间隙连接(GAPjunction)的试剂、细胞周期停滞剂和细胞分化剂、细胞粘附抑制剂、增加超增生性细胞对凋亡诱导物敏感性的试剂或其他生物学试剂。免疫调节剂包括肿瘤坏死因子；干扰素α、β和γ；IL-2和其他细胞因子；F42K和其他细胞因子类似物；或MIP-1、ΜΙΡ-1β、MCP-1、RANTES和其他趋化因子。还要预期到，细胞表面受体或其配体(例如Fas/Fas配体、DR4或DR5/TRAIL(Apo-2配体))的上调，通过建立对超增生性细胞的自分泌或旁分泌作用，将增强本发明的凋亡诱导能力。通过提升间隙连接的数量来增加细胞间信号传导将增加对邻近超增生性细胞群的抗超增生作用。在其他实施方式中，细胞周期停滞剂或分化剂可与本发明结合使用，用来改善治疗的抗超增生效果。细胞粘附的抑制剂预期可改善本发明的效果。细胞粘附抑制剂的例子是局部粘着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。进一步预期的是，其他增加超增生细胞对凋亡的敏感性的试剂(例如c225抗体)可与本发明结合使用，来改善治疗效果。
自从引入了细胞毒性化疗药物之后，癌症疗法取得了很多进步。但是，化疗的一个后果是发展/获得了抗药表现型以及发展出了多药抗药性。抗药性的发展仍然是肿瘤治疗的主要障碍，因此明显需要替代性的方法，例如病毒疗法。
与化疗、放疗和生物疗法结合使用的其他形式疗法包括高温疗法，在该高温疗法中，患者的组织暴露于高温(高达106°F)。外部或内部加热装置可被用在局部、区域或全身高温疗法的应用中。局部高温疗法包括将热施用至小的区域，例如肿瘤。可利用来自人体外部装置的高频波从外部产生热并靶向肿瘤。内部热量可涉及无菌探头(包括薄的、热金属丝或充满温水的中空管)、植入式微波天线或射频电极。
加热患者的器官或肢体用于局部治疗，加热利用产生高能量的装置(例如磁铁)来实现。或者，某些患者的血液在被灌注到将被内部加热的区域之前被移除出来并被加热。全身加热也可在癌症扩散至全身的情况下进行。暖水毯、热蜡、电磁线圈和热处理室可被用于此目的。激素疗法也可与本发明结合使用或与之前所述的任何其他癌症疗法结合使用。激素的使用可被用在治疗某些癌症中，例如乳癌、前列腺癌、卵巢癌或子宫颈癌，以降低某些激素的水平或阻断某些激素的作用，例如睾丸激素或雌激素。这种治疗通常与至少一种其他癌症治疗结合使用。
V.实施例
以下实施例仅为阐释本发明的各种实施方式而给出，并不意在以任何方式限制本发明。本领域技术人员将容易意识到，本发明能够被广泛地修改以实现所述目的和获得所提及的目标和优点，以及本发明固有的目的、目标和优点。这些实施例以及所描述的方法当前优选的代表性实施方式，是示例性的并且并不对本发明的范围产生任何限制。本领域技术人员可在本发明权利要求定义的范围内对本发明作出修改或其他用途。
A.结果
Maraba病毒在体外证实了潜在的溶瘤性质
弹状病毒科很庞大并且在遗传上和地理上有各种变化。本发明的发明人选择了具有之前文献报道过的能力的一组弹状病毒在哺乳动物细胞中复制作为起点。选择七种病毒进行体外筛选以识别具有潜在的肿瘤细胞溶解能力的病毒(表4)。在来自NCI60肿瘤细胞板的细胞系和一组小鼠肿瘤细胞系上以96孔形式进行细胞杀伤实验(图5)。几个物种被证实在人肿瘤细胞系上是高度裂解性的，对于所测试的大多数细胞系来说，根据噬菌斑形成单元(pfu)，EC50值小于0.1MOI。特别地，从细胞板中表现出的所有癌症指标来看，Maraba病毒(TravassosdaRosa等,1984)、Carajas(CRJ)病毒(TravassosdaRosa等,1984)和Farmington病毒(FMT)(TravassosdaRosa等,2002)显得在杀死人肿瘤细胞系方面非常有效。值得注意的一个例外是，观察到FMT病毒难以杀死来源于结肠肿瘤的细胞系。有趣的是，不是所有的弹状病毒都具有有效杀死癌细胞的能力。例如，MuirSprings病毒(MS)(Kerschner等,1986)、BahiaGrande病毒(BG)(Kerschner等,1986)、Ngaingin病毒(NGG)(Doherty等,1973)和Tibrogargan病毒(TIB)(Cybinski等,1980)在非常小比率的肿瘤细胞中显示出活性。控制这些病毒的能力限制的机制当前仍是未知。
表4.未特征化的弹状病毒的新毒株在NCI60细胞板上是高度裂解性的
*按照肿瘤类型，被视为对病毒感染高度敏感的NCI60细胞系的百分数；括号内的数字表示在每个癌症指标分群内所测试的细胞系的数目。感染96小时后EC50<0.1MOI的病毒被记为对细胞系是高度裂解的。
为进一步分析这些病毒的特征，在易感细胞系(SNB19)以及相对耐性的细胞系(NCIH226)上进行一步生长曲线，以监控复制的速率并定量病毒裂解量。发明人无法再用BG病毒感染NCIH226细胞后检测到病毒，这与BG在该细胞系上裂解性很差的观测结果一致。但是，BG能够以与FMT和CRJ病毒类似的程度在SNB1细胞上复制，这再次与其裂解能力有关。当在NCH226细胞上实验时，FMT和CRJ病毒以类似的动力学和相等的裂解量产生后代。FMT与CRJ相比显得在SNB19细胞上复制到更高的滴度，虽然两者都明显产生足够的后代导致该易感细胞系的快速死亡(图1)。MRB以与其他3个毒株相等或比其更快的动力学产生病毒，并且在SNB19和NCIH226细胞上产生并其他病毒高得多的滴度。
MRB病毒正式了对肿瘤细胞系的良好的细胞溶解活性、快速的病毒生产和大的裂解量。这些所有性质都有助于实现良好的细胞溶解活性。Maraba病毒被选择作为溶瘤病毒进一步开发。
Maraba病毒
作为遗传操作Maraba病毒的序言，使用“鸟枪”测序法获得该毒株的全长基因组序列。随后通过将MarabaL蛋白的氨基酸序列与弹状病毒科的6个已知属的成员进行比对来进行系统发育分析。该病毒具有与其他弹状病毒共同的期望基因组结构，5个分散的顺反子由负责描绘病毒的N、P、M、G和L基因的转录终止/起始序列隔开。
工程化的Maraba病毒突变体显示出改善的癌细胞选择性
将全长抗基因组序列克隆到带T7启动子的载体中，并将N、P和L基因克隆到CMV启动子的表达构建体中。该策略已被成功用来开发几种负链RNA病毒的反向遗传系统(Schnell等,1994;Whelan等,1995;Lawson等,1995;Nakaya等,2001)。所产生的病毒通过将基因组构建体、N、P和L质粒转染到A549细胞中而获得拯救并被命名为rMarabaWT(重组Maraba野生型)，该A549细胞先前用表达T7聚合酶的牛痘病毒感染。
发明人引入了突变以改善野生型Maraba病毒的肿瘤选择性杀伤性质。发明人之前已证实过，VSV的M蛋白的甲硫氨酸51的缺失使得病毒不能在受感染的细胞中阻断干扰素反应(Stojdl等,2003)。类似地，发明人已显示，VSVM蛋白在V221F和S226R氨基酸处的两个突变也使得病毒不能阻断宿主mRNA的核质运输，因而允许宿主细胞传导IFN反应(Stojdl等,2003)。考虑到VSV的Glasgow株也在其基质蛋白中具有S226R变化，V221FS226R双突变体的减毒表现型被假设是由仅V221F处的突变引起的。因此，发明人构建和拯救了ΔΜ51Maraba重组病毒和V221YMaraba突变株作为可能的减毒变异体(图2B)。
据报道，其他两种突变改善了VSV在BHK-21细胞上的复制(M蛋白L1232；L蛋白H242R)(Sanjuan等,2004)。将Maraba序列与VSV比对，对应的突变分别是M和L蛋白的Maraba序列的L123W和Q242R。重组Maraba病毒，M蛋白L123W单突变或G蛋白Q242R单突变，或L123W和Q242R双突变(以下称MarabaDM)(图2B)。
在人原代皮肤成纤维细胞(GM38细胞)上测试我们的rMarabaWT和突变株的细胞毒性，以检测和定量由于工程化的突变造成的任何减毒作用(图2C)。ΔΜ51Maraba病毒与rMarabaWT(EC50=0.01MOI)相比在这些原代细胞上呈现减毒作用(EC50>>10MOI)。V221Y也呈现出减毒作用，虽然比ΔΜ51的程度稍小。令人惊讶的是，L123W和Q242R突变体都高度减毒(EC50=3MOI)。而且，结合了L123W和Q242R突变的双突变体与单突变体相比减毒作用相等，导致在人原代成纤维细胞感染72小时后EC50增加了100倍(EC50=3MOI)。鉴于两种突变被预期改善复制(而不是减毒病毒)，这些结果是令人惊讶的。这些表现型也与噬菌斑形成有关。在GM38成纤维细胞感染后，在用rMarabaWT感染一周后，可看见小的但是可检测到的噬菌斑。但是，对于各种Maraba单突变体或MarabaDM来说，在相同的时间段未见到噬菌斑。这再一次证实V221Y、L123W和MarabaDM在正常原代成纤维细胞上的严重减毒性质。相反，在用rMarabaWT、V221Y、L123W或MarabaDM感染仅24小时后，在肿瘤细胞系(SNB19)上形成了大的噬菌斑(图2D)。但是，Q242R突变体与其他毒株相比噬菌斑较小，表明该突变体可能稍微破坏该毒株在肿瘤细胞中的复制。但是，感兴趣的是，双突变体(含Q242R突变)明显证实了在恶性细胞中没有这种破坏(图2D)。
与我们在正常成纤维细胞上观测结果相反，当在一组恶性细胞系上实验时，所有的突变株仍然具有高度的裂解性(图2E)。在暴露于病毒48小时后，利用AlamarBlue活体染色来定量各株的裂解能力(图2E)。L123W株在肿瘤细胞上显得与rMarabaWT一样的细胞溶解性，从而证实比WT株改善的体外治疗指数。MarabaQ242R在所有三种病毒细胞系上都非常具有细胞溶解性，虽然与其亲本rMarabaWT株相比显得细胞溶解性较弱；与我们噬菌斑大小观测结果一致。但是，双突变体证实了这种表现型的感兴趣的相反现象，因为它显示出由于存在Q242R突变细胞毒性没有破坏。实际上，MarabaDM始终显得癌细胞系的最有裂解性的毒株(图2E)，甚至比亲本WT更具裂解性。L123W和Q242R的组合显得提供出仅对癌细胞具有选择性剧毒但对正常成纤维细胞保持减毒的Maraba株。当在OVCAR4人卵巢癌细胞中分析病毒蛋白生产时，这种现象更明显(图2F)。rMarabaWT和L123W株显示出快速的病毒蛋白诱导，而Q242R突变体落后。同样，Q242RL123W双突变Maraba没有显示出病毒蛋白动力学的破坏。
Maraba突变体在阻断宿主IFN抗病毒反应方面有变化的缺陷性
已建立了几种在正常原代成纤维细胞中选择性减毒的Maraba突变株，发明人想知道是否这种减毒是由于先天免疫阻断缺陷引起的。例如，ΔΜ51和V221突变体先前已显示出在VSV中使得并不不能阻断核质mRNA运输，从而抑制宿主细胞IFN转录级联。当PC3细胞被模拟感染或用rMarabaWT感染时，发明人未检测到人IFN产生，这与亲本病毒阻断先天免疫相应的能力一致(图3A)。如所预期的，ΔΜ51和V221Y突变体未显示出阻断IFN产生的能力方面的缺陷(如生物检测中所测定的，图3B)。令人感兴趣的是，L123W突变体也证实了其在阻断IFN生产的能力方面的缺陷，阻断的程度与V221Y突变体类似(图3B)。但是，Q242R突变体在PC3细胞中阻断细胞因子产生的能力与WT病毒相似，因此推断该突变体在IFN阻断方面没有缺陷。因此，Q242R突变体的深度减毒显得与宿主IFN反应无关。当两种单突变体被结合在MarabaDM变异体中时，所产生的病毒无法与L123W单突变体区别开来(图3B)。而且，已观察到，在用WTMaraba或Q242R突变体感染后，干扰素βmRNA由细胞核到细胞质的运输被阻断(图3C)。这些结果与之前的报道一致，之前的报道表明某些病毒通过几种机制(包括阻断mRNA运输到细胞质)而依赖于它们的基质蛋白来抑制IFN转录级联(Ferran和Lucas-Lenard,1997;Terstegen等,2001;Stojdl等,2003)。这些结果表明Maraba病毒利用了相同的策略。相反，MarabaΔΜ51、L123W株和MarabaDM所有都显示出在病毒感染后IFNβmRNA的“泄漏”，并且可在细胞质中检测到，mRNA阻断方面的这种缺陷与病毒的阻断IFN反应(如生物检测中所测定的)的能力有关(图2B)。
MarabaDM在体内毒性较低
测定MarabaWT和几种减毒株的LD50和最大耐受量(MTD)。因为治疗播散肿瘤的期望的治疗施用途径是静脉内施用，所以通过血管内施用以一系列剂量的WT病毒或两种突变株来治疗小鼠。发明人观察到Maraba病毒在被静脉内注射到Balb/C小鼠后能够被很好地耐受。如从体外数据预测到的(图2C)，MarabaDM的MTD比亲本WTMaraba的高2个对数(表5)。接受致死剂量的WT、V221Y或DM的动物显示出CNS感染的迹象并且在它们的脑部具有非常高的病毒滴度(数据未显示)。在MTD以下的剂量，小鼠通常显示出暂时的体重减轻、脱水、毛发直立(与病毒感染一致)。这些症状在感染后3-4天内消除并且在感染后第12天将这些小鼠杀死，在它们脑部没有检测到病毒。
表5.rMaraba病毒株的静脉内单剂量毒性a.在Balb/C小鼠(5-8周龄雌性)中实验并利用SpearmanKarber法计算获得单剂量LD50。b.最大耐受剂量(MTD)等于不导致持久(durable)发病率(按行为和体重来测定)的最大剂量。
MarabaDM在同基因肿瘤模型和异种移植肿瘤模型中都是有效的
发明人寻求确定MarabaDM是否在癌症小鼠模型的体内是有效的。MarabaDM株被工程化以表达GFP或荧光素酶，并检查它们在系统性施用后再皮下CT26肿瘤中的复制情况。发明人利用在动物整体中的生物发光成像和肿瘤移植体的荧光显微镜技术，观察要被递送至肿瘤床并在肿瘤组织中复制的MarabaDM病毒(图4A(i))。随后，测试MarabaDM在双侧CT26皮下肿瘤模型上的效率(图4A(ii)和(iii))。具体而言，双侧肿瘤达到10-600mm3的动物利用MarabaDM静脉内治疗2周，每周3次。第一次治疗后5天，用生理盐水处理的对照动物达到终点(endpoint)，肿瘤达到了750mm3或更大。但是，接受6剂系统性给药的MarabaDM的动物到第35天时肿瘤完全退化，实现100%动物的持久治愈(图4A(ii)和(iii))。最后，静脉内MarabaDM治疗在动物中能被很好地耐受，没有发生死亡并且具有最低的发病率。观察到了毛发直立、中度脱水和短暂的体重减轻(图4A(iv))，但都在第一次治疗2周内消除。
发明人也寻求确定MarabaDM在播散疾病模型中降低肿瘤负荷的效用。因此，将CT-26细胞静脉内注射到Balb/C小鼠中以诱导播散肺肿瘤。虽然生理盐水(PBS)和Carajas处理的动物显示出巨大的肿瘤负荷，但MarabaDM动物显示出很少、直至没有显示出肿瘤负荷，并显示出正常肺部表现型(图4B(i))。而且，当被系统性给药2周，每周3次时，MarabaDM还导致寿命的显著延长(图4B(ii))。该数据与皮下模型的观察结果一致，并且进一步证实MarabaDM在有效治疗侵入性皮下肿瘤模型或播散性同基因肿瘤模型中的潜力。
作为对病毒在有免疫能力的动物中的效果研究的补充，使用生物发光人ES-2卵巢异种移植模型中测试MarabaDM。即使是在非常低的剂量(1×104pfu)，用MarabaDM处理的动物的肿瘤负荷都显著降低(图4C(i-iii))。相反，对照处理的小鼠很快发展为腹水，并且肿瘤负荷持续增加直至达到终点。使用低剂量和高剂量的病毒系统性治疗含ES2肿瘤的小鼠证实了剂量依赖性肿瘤响应(图4D(i-ii))。发明人对MarabaDM与之前开发的溶瘤病毒株(VSVΔΜ51)进行了对比测试，MarabaDM在两种剂量水平都显示出比VSVΔΜ51更好的效果。
B.材料与方法
细胞系.在补充有10%胎牛血清(Cansera,Etobicoke,Ontario,Canada)的Dulbecco氏改性Eagle氏培养基(Hyclone,Logan,UT)中繁殖人A549肺癌细胞、人Hela宫颈癌细胞、小鼠CT26结肠癌细胞(AmericanTypeTissueCollection)、人GM38原代成纤维细胞(NationalInstituteofGeneralMedicalSciencesMutantCellRepository,Camden,NJ)和来自DevelopmentalTherapeuticsProgram,NationalCancerInstitute(Bethesda,MD)的NCI61细胞板的细胞系。
体外细胞毒性筛选.来自NCI60细胞板的细胞被种植在96孔平板上，融合率为90%。使用所指出的各种弹状病毒以对数稀释率感染这些细胞。在感染后96小时，单层细胞被洗涤、固定并用1%结晶紫溶液染色。随后，将染色的单层细胞溶解在1%SDS水溶液中，已产生匀质的溶解产物。测定在595nm处的吸收值并对活细胞计分。
一步生长曲线.以5pfu/细胞的感染复数用所示病毒感染NCI226细胞核SNB19细胞1小时。随后，用PBS洗涤细胞并在37℃培养。在0、4、8、12、16、24、48和72小时时间点取整分试样，并在Vero细胞上测定滴度。
弹状病毒的测序和克隆.Maraba弹状病毒被在Vero细胞上扩增，并通过标准技术(Trizol+RNAeasy?,Invitrogen)从纯化病毒中分离RNA。利用mRNAComplete克隆试剂盒(Invitrogen)获得除5’和3’末端之外的病毒序列。在T4RNA连接酶介导的T7DNA引物与任何一末端的连接之后，再进行RT-PCR和克隆进pCR2.1-TOPO?(Invitrogen)中，从而对3’和5’末端测序。在单次RT-PCR反应中扩增病毒cDNA(产生>11kbp的片段)，并将cDNA克隆进携带T7启动子的修饰的LC-KAN载体(LucigenCorporation)，该启动子位于5’-抗基因组前导序列的上游并且紧接在3’-终止子的下游是修饰的HDV核酶和T7聚合酶终止信号序列。
系统发育分析.基于L蛋白氨基酸序列的Muscle比对并利用副粘液病毒MeaslesEdmonston株作为外类群来分析弹状病毒之间的系统发育关系。通过邻接法生成系统发育树并利用1000次建树来估算Bootstrap值(每个节点都计算)。分支长度与遗传距离成比例。比例尺对应于取代数/氨基酸位点。
重组Maraba拯救系统.在六孔板上以每孔3.0×105个细胞的密度接种A549肺癌细胞，24小时后，使用表达T7RNA聚合酶的牛痘病毒以感染复数(MOI)等于10在OptiMeM培养基中感染细胞1.5小时。移除牛痘病毒后，根据制造商说明书，使用lipofectamine2000(5μl/孔)，用LC-KANMaraba(2μg)和编码MarabaN(1μg)、P(1.25μg)和L(0.25μg)蛋白的pCI-Neo构建体转染每个孔。在5个小时后，除去转染试剂，并用含有10%FBS的DMEM替代。转染后48小时，收集培养基(来自2个平板)、过滤(0.2μm)以除去污染的牛痘病毒，并用1mL来感染一个6孔平板的每个孔中的SNB-19成胶质细胞瘤细胞。24-48小时后可见细胞病变效果，即表明成功地拯救，通过纯化病毒RNA并用Maraba特异性引物进行RT-PCR来确认。所有病毒在放大培养之前经历3轮噬菌斑纯化(在SNB-19细胞上)、在蔗糖垫上纯化并在含有15%葡萄糖的PBS中重悬。
突变和Maraba变异体.使用单磷酸化突变引物(45-55bp)与高保真Phusion酶(NEB)来产生一组LC-KANMaraba突变体。简而言之，使用100ng突变引物、100ngDNA模板，并添加热启动酶(98℃-2分钟，保持80℃-添加酶)，使用常用的PCR设置(98℃-10秒、55℃-30秒、72℃-7分钟，30个循环)进行PCR反应。以2%的增量在0至6%范围内添加二甲亚砜(DMSO)。使用DpnI(NEB)消化(37℃，1小时)亲本质粒，并使用25μLDpnI-消化的PCR混合物中的4μL来转化TOP-10?感受态细胞(Invitrogen)。
通过引入非编码区限制性位点变化(添加或移除)再测序来筛选阳性克隆。本文所述的不同减毒突变体包括在M蛋白中缺失Met-51(ΔΜ51)、将M蛋白中Leu-123突变为Trp(L123W)、将M蛋白中Val-221突变为Tyr(V221Y)、将G蛋白中Gln-242突变为Arg(Q242R)以及将M蛋白中Leu-123突变为Trp并将G蛋白中Gln-242突变为Arg的双突变体(MarabaDM)。
存活率实验.将所示的细胞系以10000细胞/孔的密度接种到96孔平板中。第二天，用所示病毒以各种感染复数(0.0001-10pfu/细胞)来感染细胞。培养48小时后，添加AlamarBlue(Resazurin钠盐(Sigma-Aldrich))到20μg/ml的终浓度。培养6个小时后，测定波长573nm处的吸收值。
噬菌斑实验.在6孔板上以5×105细胞/孔的密度接种Vero细胞。第2天，制备出100μl的一系列病毒稀释液，并添加至Vero细胞(添加耗时1小时)。在病毒吸收后，添加2ml的琼脂糖覆盖物(1:11%琼脂糖:2XDMEM和20%FCS)。在第二天对噬菌斑进行计数。
干扰素生物实验.使用rMarabaMT、ΔΜ51、V221Y、L123W、Q242R或MarabaDM以3pfu/细胞的感染复数感染PC-3细胞24小时。第2天用0.25NHCl酸中和上清液(4℃、过夜)，随后添加0.25NaOH调节pH至7。Vero细胞与中和后的上清液培养24小时，随后用rMarabaMT以0.0001至100pfu/细胞的感染复数感染细胞。PC-3细胞应答Maraba或减毒突变体而分泌的任何干扰素将随后保护Vero细胞不受Maraba感染。24小时后，利用结晶紫实验定量存活率。简要地说，细胞与1%结晶紫溶液一起培养，洗涤、干燥、在1%SDS中冲寻并在595nm波长处读取吸收值。
定量RT-PCR检测细胞核和细胞质干扰素.细胞核与细胞质RNA如之前所述那样分离。简而言之，模拟处理或用Maraba、ΔΜ51、L123W、Q242R或MarabaDM感染的OVCAR4细胞被收集在PBS中，制粒，并在200μl的裂解缓冲液(25mMTris[pH7.4],15mMNaCl,12.5mMMgCl2，5%蔗糖，1%NP-40)中重悬。裂解液在4℃温育10分钟，偶尔摇晃。通过以1000×g离心3分钟收集细胞核。收集上清液(细胞质部分)，使用250μl裂解缓冲液洗涤细胞核部分一次，随后用QiagenRNeasy试剂盒(根据制造商说明书;Qiagen)提取总RNA。使用之前所述的引物，利用来自Qiagen的QuantitectSYBRGreenRT-PCR试剂盒进行IFN-βmRNA的QRTPCR。分析来自细胞核部分和细胞质部分的IFN-β，并校正(normalize)成来自相同区室(compartment)的HPRTmRNA。校正值被再次校正成来自未感染细胞核和未感染细胞质部分的值，从而确定每个区室在病毒感染后的倍数诱导值(foldinductionvalue)。标绘值表示由细胞质区室到细胞核区室的校正的mRNA诱导的比值。所有QPCR值都利用ΔCT法计算。
体内毒性的确定.使用3×106pfu-3×109pfu的病毒以半对数增量静脉内注射Balb/C小鼠(6-8周龄)组(3-5个/组)(注射一次)。监测动物的不适迹象，包括体重减轻、发病率、毛发直立、后肢麻痹和呼吸窘迫。
双侧皮下肿瘤模型.向6-8周龄Balb/C小鼠的左右两侧注射鼠CT26结肠癌细胞(3×105)。让肿瘤生长至10-600mm3，随后6次(每周3次)静脉内注射51VSV或MR-SDM(剂量为5×108pfu)。在首次注射后，每周两次测量肿瘤。观察动物的毛发直立、体重减轻、发病率、后腿麻痹和呼吸窘迫。当肿瘤负荷超过750mm3的尺寸后，对动物实施安乐死。以下公式被用来计算肿瘤体积(L×W)/2。
在皮下肿瘤模型中成像MarabaDM.通过分别在eGFP或荧光素酶(FLUC)中进行遗传工程化，而将MarabaDM改造用于荧光成像或生物发光成像。将DM-GFP和DM-FLUC静脉内注射(1×108)到含有皮下CT-26肿瘤的Balb/C动物中。在感染后24小时，对DM-GFP感染的动物实施安乐死，并在Nikon荧光显微镜下成像。感染DM-FLUC的动物用荧光素注射并利用IVISXenogen200系统进行活体成像。
肺肿瘤模型.通过单次静脉注射3×105CT-26结肠癌细胞到6-8周龄Balb/C动物，从而建立肺肿瘤。通常，在第16-18天，小鼠会遭受严重呼吸窘迫、毛发直立和缩成一团，此时对它们实施安乐死。在第10、12和14、17、19和21天，使用PBS、Carajas或MarabaDM(5×108pfu)静脉内处理小鼠。有些动物在第17天被杀死，并在Nikon解剖显微镜上捕获图像。剩下的动物监测其存活状况。
卵巢异种移植模型.人卵巢ES-2细胞被改造用于生物发光成像，此时向6-8周龄无胸腺CD-1裸鼠腹膜内注射1×106ES-2细胞。未处理的CD-1动物在约第15-17天形成腹水。在第8、9、12、14和16天用1×104-1×107pfu的MarabaDM或VSVΔ51进行腹膜内注射和静脉内(尾静脉)注射。使用Xenogen200IVIS系统(CaliperLS,USA)捕获肿瘤图像。
统计学.对于噬菌斑尺寸测定，利用Bonfeironi多重比较测试以生成P值(GraphpadPrism)，从而进行单因素ANOVA。对于KaplanMeier曲线，利用Mantel-Cox对数秩分析(GraphpadPrism)对比存活曲线。
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caggctaccggttttggaaccaatgagacagagtacttgttcgaggttgacaatttgacc720
tacgtccaacttgaatcaagattcacaccacagtttctgctccagctgaatgagacaata780
tatacaagtgggaaaaggagcaataccacgggaaaactaatttggaaggtcaaccccgaa840
attgatacaacaatcggggagtgggccttctgggaaactaaaaaaaacctcactagaaaa900
attcgcagtgaagagttgtctttcacagttgtatcaaacggagccaaaaacatcagtggt960
cagagtccggcgcgaacttcttccgacccagggaccaacacaacaactgaagaccacaaa1020
atcatggcttcagaaaattcctctgcaatggttcaagtgcacagtcaaggaagggaagct1080
gcagtgtcgcatctaacaacccttgccacaatctccacgagtccccaatccctcacaacc1140
aaaccaggtccggacaacagcacccataatacacccgtgtataaacttgacatctctgag1200
gcaactcaagttgaacaacatcaccgcagaacagacaacgacagcacagcctccgacact1260
ccctctgccacgaccgcagccggacccccaaaagcagagaacaccaacacgagcaagagc1320
actgacttcctggaccccgccaccacaacaagtccccaaaaccacagcgagaccgctggc1380
aacaacaacactcatcaccaagataccggagaagagagtgccagcagcgggaagctaggc1440
ttaattaccaatactattgctggagtcgcaggactgatcacaggcgggagaagaactcga1500
agagaagcaattgtcaatgctcaacccaaatgcaaccctaatttacattactggactact1560
caggatgaaggtgctgcaatcggactggcctggataccatatttcgggccagcagccgag1620
ggaatttacatagaggggctaatgcacaatcaagatggtttaatctgtgggttgagacag1680
ctggccaacgagacgactcaagctcttcaactgttcctgagagccacaactgagctacgc1740
accttttcaatcctcaaccgtaaggcaattgatttcttgctgcagcgatggggcggcaca1800
tgccacattctgggaccggactgctgtatcgaaccacatgattggaccaagaacataaca1860
gacaaaattgatcagattattcatgattttgttgataaaacccttccggaccagggggac1920
aatgacaattggtggacaggatggagacaatggataccggcaggtattggagttacaggc1980
gttataattgcagttatcgctttattctgtatatgcaaatttgtcttttag2031
<210>25
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>25
ctcgagggtatgaaaaaaactaacagatatcacggctag39
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<212>PRT
<213>IsfahanG蛋白
<400>26
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151015
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202530
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354045
GluLeuAsnLeuGluProAspLeuLysThrMetAlaPheAspSerLys
505560
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65707580
AlaAlaLysTrpValThrThrCysAspPheArgTrpTyrGlyProLys
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100105110
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LysSerLysPheHisAlaHisMetLysGlyAspArgValCysLysMet
225230235240
LysPheCysAsnLysAsnGlyLeuArgLeuGlyAsnGlyGluTrpIle
245250255
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PheProAspCysLeuValGlySerValValLysSerThrLeuLeuSer
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IleSerValIleLeuIleIleGlyLeuMetArgLeuLeuProLeuLeu
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ArgVal
530
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<212>PRT
<213>Jaagsietke羊逆转录病毒G蛋白
<400>28
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ArgAsnSerLeuThrHisGlnMetGlnArgMetThrLeuSerGluPro
202530
ThrSerGluLeuProThrGlnArgGlnIleGluAlaLeuMetArgTyr
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LeuIleMetLeuLeuLeuLeuLeuGlnArgIleGlnAsnGlyAlaAla
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AlaThrPheTrpAlaTyrIleProAspProProMetLeuGlnSerLeu
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AspTrpAlaProGlyGlyThrProAspPheProGluTyrArgGlyGln
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IleAsnThrAlaLeuSerArgProLysArgGlyLeuSerLeuIleIle
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SerValSerLeuAlaGlnSerIleGlnValAlaHisThrValAspSer
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LeuSerSerAsnValThrLysValMetGlyThrGlnGluAsnIleAsp
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HisAlaAsnTyrLysTrpIleCysValThrLysLysProTyrAsnThr
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SerAspPheProTrpAspLysValLysLysHisLeuGlnGlyIleTrp
485490495
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LeuAspIleGluAsnSerProLysAlaThrLeuAsnIleAlaAspThr
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SerLeuTrpArgSerIleIleAlaMetGlyAlaValLeuThrPheVal
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LeuIleIleIleCysLeuAlaProCysLeuIleArgSerIleValLys
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GlnHisLeuMetGluLeuLeuAsnAsnLysGluArgGlyAlaAlaGly
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AspAspPro
610
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<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(5)
<223>Xaa可为任何天然氨基酸
<400>29
AsnProMetGlyXaaLeu
15

Claims (15)

1.一种减毒的弹状病毒，其包含G蛋白、M蛋白、N蛋白、P蛋白和L蛋白；
所述M蛋白的氨基酸序列与SEQIDNO:4的氨基酸序列100%相同并且在对应SEQIDNO:4的第123位置的位置处具有色氨酸，或
所述G蛋白的氨基酸序列与SEQIDNO:5的氨基酸序列100%相同并且在对应SEQIDNO:5的第242位置的位置处具有精氨酸，和M蛋白的氨基酸序列与SEQIDNO:4的氨基酸序列100%相同并且在对应SEQIDNO:4的第123位置的位置处具有色氨酸。
2.如权利要求1所述的弹状病毒，其中仅将氨基酸序列如SEQIDNO:5所示的弹状病毒的G蛋白的第242处的氨基酸突变成精氨酸，并且将氨基酸序列如SEQIDNO:4所示的弹状病毒的M蛋白的第123处的氨基酸突变成色氨酸。
3.一种包含分离的溶瘤弹状病毒的组合物，所述溶瘤弹状病毒具有核酸片段，所述核酸片段编码：G蛋白、M蛋白、N蛋白、P蛋白和L蛋白；
所述M蛋白的氨基酸序列与SEQIDNO:4的氨基酸序列100%相同并且在对应SEQIDNO:4的第123位置的位置处具有色氨酸，或
所述G蛋白的氨基酸序列与SEQIDNO:5的氨基酸序列100%相同并且在对应SEQIDNO:5的第242位置的位置处具有精氨酸，和M蛋白的氨基酸序列与SEQIDNO:4的氨基酸序列100%相同并且在对应SEQIDNO:4的第123位置的位置处具有色氨酸。
4.如权利要求3所述的组合物，所述组合物进一步包含第二种溶瘤病毒。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述第二种溶瘤病毒是牛痘病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、腺病毒或弹状病毒。
6.如权利要求5所述的组合物，其中所述第二种溶瘤病毒是弹状病毒。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述弹状病毒是Carajas病毒、金迪普拉病毒、Cocal病毒、Isfahan病毒、皮里病毒、水泡性口炎阿拉戈斯病毒、BeAn157575病毒、博特克病毒、Calchaqui病毒、美国鳗鲡病毒、格雷洛奇病毒、朱罗纳病毒、克拉马斯病毒、Kwatta病毒、LaJoya病毒、MalpaisSpring病毒、芒特埃尔岗蝙蝠病毒、Perinet病毒、Tupaia病毒、Farmington病毒、BahiaGrande病毒、MuirSpring病毒、ReedRanch病毒、HartPark病毒、弗兰德斯病毒、凯米斯病毒、Mosqueiro病毒、莫苏里病毒、Barur病毒、Fukuoka病毒、KernCanyon病毒、Nkolbisson病毒、LeDantec病毒、Keuraliba病毒、Connecticut病毒、新明托病毒、Sawgrass病毒、Chaco病毒、SenaMadureira病毒、Timbo病毒、Almpiwar病毒、Aruac病毒、班戈兰病毒、Bimbo病毒、BivensArm病毒、蓝蟹病毒、Charleville病毒、滨海平原病毒、DakArK7292病毒、Entamoeba病毒、Garba病毒、Gossas病毒、HumptyDoo病毒、Joinjakaka病毒、Kannamangalam病毒、Kolongo病毒、Koolpinyah病毒、Kotonkon病毒、Landjia病毒、Manitoba病毒、Marco病毒、Nasoule病毒、Navarro病毒、Ngaingan病毒、Oak-Vale病毒、Obodhiang病毒、Oita病毒、奥安戈病毒、ParryCreek病毒、RioGrandecichlid病毒、Sandjimba病毒、Sigma病毒、Sripur病毒、SweetwaterBranch病毒、Tibrogargan病毒、Xiburema病毒、Yata病毒，RhodeIsland病毒、AdelaideRiver病毒、Berrimah病毒、Kimberley病毒或牛流行热病毒。
8.如权利要求3所述的组合物，其中所述组合物是药学上可接受的组合物。
9.如权利要求8所述的组合物，所述组合物进一步包括第二种抗癌剂。
10.如权利要求9所述的组合物，其中所述第二种抗癌剂是化学治疗剂、放射治疗剂或免疫治疗剂。
11.权利要求3所述包含分离的溶瘤弹状病毒的组合物在制备用于杀死超增生性细胞的药物中的应用。
12.如权利要求11所述的应用，其中所述细胞被包括在患者体内。
13.如权利要求12所述的应用，其中所述细胞是癌细胞。
14.如权利要求13所述的应用，其中所述癌细胞是转移性癌细胞。
15.权利要求3所述包含分离的溶瘤弹状病毒的组合物在制备治疗癌症患者的药物中的应用。
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