DE69432919T2

DE69432919T2 - Verfahren für den Nachweis spezifischer Polynukleotiden

Info

Publication number: DE69432919T2
Application number: DE69432919T
Authority: DE
Inventors: Tetsu Otawara-shi Hase; Harumi Otawara-shi Masubuchi
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd; Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd; Tanabe Seiyaku Co Ltd
Priority date: 1993-12-28
Filing date: 1994-12-21
Publication date: 2004-05-27
Anticipated expiration: 2014-12-22
Also published as: DE69432919D1; EP0663447A2; EP0663447A3; EP0663447B1; US5849487A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines in einer Probe vorhandenen Polynucleotids mit einer spezifischen Sequenz (im folgenden als "nachzuweisendes Polynucleotid" bezeichnet), wobei das Verfahren zur Diagnose von genetisch bedingten Erkrankungen sowie Infektionskrankheiten geeignet ist. Ein für das Verfahren verwendeter Kit zum Nachweis eines Polynucleotids ist ebenfalls umfasst.
Ein auf der Komplementarität zwischen Nucleotidsequenzen beruhendes Analyseverfahren ermöglicht die direkte Analyse genetischer Merkmale. Es stellt daher ein sehr wirkungsvolles Mittel zur Identifizierung genetisch bedingter Erkrankungen, einer karzinomartigen Veränderung von normalen Zellen, Mikroorganismen, usw. dar. Da es das Gen direkt nachweist, lassen sich damit zeitaufwendige und schwierige Arbeitsschritte wie Kultivierung usw. vermeiden.
Es ist jedoch im allgemeinen nicht leicht, eine in Spuren vorkommende Menge eines nachzuweisenden Nucleotids in einer Probe nachzuweisen, so dass das nachzuweisende Nucleotid selbst bzw. ein Signal davon amplifiziert werden sollte. Ein bekanntes Verfahren zur Amplifikation des nachzuweisenden Nucleotids ist die Polymerasekettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR). Bei der PCR handelt es sich um das gängigste Verfahren einer in vitro Nukleinsäureamplifikation. Mit der PCR sind jedoch bekannte Nachteile, z. B. das Erfordernis einer Temperatur-kontrolleinheit bei der praktischen Durchführung, unzureichende Quantifizierung aufgrund der logarithmischen Amplifikation und die leichte Anfälligkeit gegenüber Verunreinigungen, verbunden.
Das heißt, dass eine Reaktion, z. B. eine PCR, in der DNA mehrere Millionen Male amplifiziert wird, leicht zu fehlerhaften Ergebnissen führen kann, die durch die gleichzeitige Amplifikation von Spuren von DNA-Verunreinigungen hervorgerufen werden. Dadurch entsteht ein ernstes Problem, insbesondere bei der gleichzeitigen Bearbeitung einer großen Anzahl von Proben. Um eine derartige Kontaminierung zu verhindern, wird ein Labor daher geteilt, usw. Des weiteren gibt es einen chemischen Ansatz, bei dem eine Uracilbase während der PCR eingebaut wird und danach die Probe vor dem Start einer weiteren PCR-Amplifikation mit Uracil-Glycosylase behandelt wird, so dass nur das Amplifikationsprodukt aus einem anderen Reaktionssystem, welches aus einer verunreinigten Probe stammt, abgebaut wird. Diese obigen Ansätze sind jedoch hinsichtlich der Verhinderung von Kontaminierungen nicht immer zufriedenstellend.
Als ein Verfahren zur Amplifikation eines Signals ist ein Verfahren zur Amplifikation von Signal-RNA durch Qβ-Replicase bekannt (P. M. Lizardi et al., Bio/Technology, 6, 1197–1202 (1988)). Da jedoch dieses Verfahren die Insertion einer Amplifikationssequenz in eine Sequenz, die von der Replicase erkannt werden kann, erfordert, sind die inserierte Sequenz sowie die Position, in der sie inseriert wird, stereostrukturell eingeschränkt. Bei diesem Amplifikationsverfahren besteht ebenfalls das Kontaminierungsproblem, ähnlich wie bei der PCR.
Neben der obengenannten Amplifikation der nachzuweisenden Nucleotidsequenz gibt es Signalamplifikationsverfahren, mit denen Abbauprodukte nachgewiesen werden.
So ist beispielsweise aus der EP 0 455 517 A1 ein Signalamplifikationsverfahren bekannt, das die Hybridisierung einer Oligonucleotid-DNA-Sonde mit dem nachzuweisenden Nucleotid, ihre Behandlung mit einem Restriktionsenzym sowie den Nachweis des geschnittenen Sondenfragments umfasst. Obwohl seine Nachweisempfindlichkeit niedriger als die der PCR ist, lässt sich dieses Verfahren mit ausgezeichneter Quantifizierung durchführen, ohne dass irgendwelche speziellen Laborausrüstungen erforderlich sind. Das Verfahren benötigt jedoch zusätzlich zur DNA-Sonde ein zweites spezifisches Oligonucleotid, um die Reaktion wiederholt stattfinden zu lassen. Ein weiterer Nachteil besteht in den Limitierungen bezüglich der spezifischen Stelle hinsichtlich Restriktionsenzymen.
Auch wurde ein zyklischer Assay mit λ-Exonuclease, die für die Spaltung doppelsträngiger DNA spezifisch ist, entwickelt (C. G. Copley et al., BioTechniques, Vol. 13, Nr. 6, 882–892 (1992)). Bei diesem Verfahren wird eine Oligonucleotidsonde mit einer zu ihr komplementären Sequenz hybridisiert, wodurch die λ-Exonuclease die gebildete doppelsträngige DNA angreifen kann, so dass die hybridisierte DNA-Sonde abgebaut wird. Die DNA-Sonde wird durch eine weitere DNA-Sonde ersetzt, die daraufhin abgebaut wird. Diese zyklische Reaktion wird dann wiederholt. Bei diesem Verfahren lässt sich durch den Nachweis der abgebauten Sonde die Anwesenheit einer spezifischen DNA-Sequenz abschätzen. Dieses Verfahren ist gegenüber Verfahren mit Restriktionsenzymen ( EP 04 555 17 A1 ) dahingehend vorteilhaft, dass das Reaktionsprinzip einfach ist und die Restriktionsstelle nicht benötigt wird.
λ-Exonuclease benötigt jedoch als Substrat eine am 5'-Ende phosphorylierte DNA-Sonde. Ein Problem bei diesem Verfahren scheint die Schwierigkeit bei der Reproduktion der 5'-phosphorylierten Sonde zu sein. Bei der chemischen Synthese der DNA-Sonde im DNA-Syntheseautomat wird das 5'-Ende nicht phosphoryliert. Daher ist es schwierig, die vollständige Phosphorylierung aller 5'-Enden sicherzustellen. Ein weiteres Problem ist die niedrige Wiederholungsrate der zyklischen Reaktionen (etwa 500 mal pro Stunde nach Literaturangaben), da bei konstanter Temperatur der geschwindigkeitsbestimmende Schritt die Hybridisierung zwischen der DNA-Sonde und dem DNA-Template, die in dem zykli schen Assay wiederholt durchgeführt wird und Reaktionszeit in Anspruch zu nehmen scheint, ist.
Ein weiterer zyklischer Assay mit einer Exonuclease wird in der EP 0 500 224 A1 offenbart. Bei diesem Verfahren verläuft die Synthese eines komplementären Stranges von einem Primer aus gleichzeitig mit dem Abbau desselben Primers von der anderen Seite her durch eine 5' → 3'-Exonuclease, so dass ein weiterer Primer mit der nachzuweisenden Sequenz anstelle des abgebauten, zuvor hybridisierten Primers hybridisiert. Auf diese Weise wird 1 Reaktionszyklus, d. h. die Synthese eines komplementären Stranges durch DNA-Polymerase und der Abbau des synthetisierten Stranges, wiederholt durchgeführt. Zwar wird im obigen Prozess eine komplizierte Temperaturkontrolle, wie beispielsweise in der PCR, nicht benötigt, jedoch ist die Wechselzahl (die Anzahl der zwischen Primer und nachzuweisendem Nucleotid stattfindenden Hybridisierungen) immer noch niedrig, da der Hybridisierungsschritt wiederholt durchgeführt werden muss.
Aus der WO 93/21340 ist ein Verfahren zur Sequenzierung von DNA bekannt, bei dem fluoreszenzmarkierte Nucleotide am Ende eines Primers eingebaut werden. Die Nucleotide werden jeweils nacheinander eingebaut, und die Art des hinzugefügten Nucleotids (A, T, C oder G) wird vor Entfernung der Fluoreszenzmarkierung bestimmt und danach der Vorgang wiederholt. Um die Addition von mehr als einem Nucleotid zu verhindern, werden Kettenverlängerungsinhibitoren eingebaut. Diese Inhibi-toren müssen vor der nächsten Syntheserunde durch eine Exonuclease entfernt werden, so dass der Nachweis stattfinden kann. Um zu verhindern, dass die Exonuclease den Primer selbst verdaut, wird ein Nuclease-resistenter Primer verwendet.
Aus der WO 93/23564 ist ein Verfahren zur Identifizierung einer einzelnen Base an einer nachzuweisen den Position einer bekannten DNA-Sequenz bekannt. Dies wird erreicht, indem ein komplementäres Nucleotid am Ende eines an einen einzelsträngigen DNA-Strang gebundenen Primers eingebaut wird und die daraus folgende Pyrophosphatfreisetzung nachgewiesen wird. Da jeweils nur eine Nucleotidart (A, T, C oder G) verwendet wird, erlaubt die Bildung von Pyrophosphat die Identifizierung der Base an der nachzuweisenden Position. Der zur Durchführung dieses Verfahrens beschriebene Kit umfasst wenigstens einen Primer, Polymerase, Enzyme zur Identifizierung der Pyrophosphatfreisetzung, Desoxynucleotide und gegebenenfalls Didesoxynucleotide.
Zur Lösung der obigen Probleme wurde von den Erfindern der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer Nucleotidsequenz entwickelt, in dem ein Verstärkungsreagenz zusammen mit Exonuclease III verwendet wird (japanische Offenlegungsschrift Nr. JP 6327499 ). Dieses Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass die Sonde leicht hergestellt werden kann, keine spezielle Temperaturkontrollausrüstung benötigt wird und das Verfahren verunreinigungsfrei ist. Doch obwohl das Verstärkungsreagenz die Wiederholungsrate erhöht, lässt sich nicht unbedingt eine hohe Empfindlichkeit erzielen, da sich die DNA-Sonde nur schwer wiederholt hybridisieren lässt.
In den bisher beschriebenen Amplifikationsverfahren wird ein als Primer zugegebenes Oligonucleotid zu einem amplifizierten Produkt und fungiert nicht länger als Primer. Daher sollte das Oligonucleotid in großem Überschuss relativ zu der geschätzten Menge des nachzuweisenden Nucleotids zugegeben werden. Besonders in einem System wie z. B. PCR, in der die Amplifikation logarithmisch erfolgt, sollte eine extrem große Oligonucleotidmenge vor Beginn zugegeben werden. Vom wirtschaftlichen Gesichtspunkt her ist eine geringere Oligonucleotidmenge vorzuziehen, unbeachtlich ob sie chemisch synthetisiert oder aus biologischen Materialien gewonnen wird.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis eines Polynucleotids bereitzustellen, das in einem einfachen Reaktionssystem weniger anfällig gegenüber dem Einfluss von Verunreinigungen ist, ohne dass irgendeine spezielle Ausrüstung, wie etwa eine komplizierte Temperaturkontrolle, erforderlich ist. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Nachweisverfahrens, das auf eine große Vielfalt einer unbegrenzten Zahl von Nucleotidsequenzen angewendet werden kann. Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Nachweisverfahren bereitzustellen, mit dem sich, nach geeigneter Wahl des vorliegenden Nachweissystems, eine höhere Empfindlichkeit und bessere Quantifizierung erzielen lässt.
Als Ergebnis ihrer Forschungsbemühungen wurde von den Erfindern der vorliegenden Erfindung erfolgreich ein Verfahren entwickelt, worin eine Nuclease, die an einer doppelsträngigen DNA angreift, jedoch nicht an einer einzelsträngigen DNA angreift, zusammen mit DNA-Polymerase verwendet wird, so dass das Signal amplifiziert werden kann.
Das heißt, die vorliegende Erfindung umfasst:

1. Verfahren zum Nachweis eines nachzuweisenden Polynucleotids, umfassend: Hybridisieren eines Nuclease-resistenten Oligonucleotidprimers, der eine Sequenz aufweist, die komplementär zu einer bekannten Nucleotidsequenz eines Teils des nachzuweisenden Polynucleotids ist, in Gegenwart von DNA-Polymerase, Nuclease dafür sowie mindestens einer Desoxynucleosid-Triphosphat-Art, welche zu demjenigen Nucleotid des nachzuweisenden Polynucleotids komplementär ist, das sich in 5'-Richtung an dasjenige Nucleotid des nachzuweisenden Polynucleotids an schließt, welches zum 3'-Ende des Primers komplementär ist, unter Bedingungen, worunter das 3'-Ende des Primers durch Hinzufügen des Desoxynucleosid-Monophosphatrests des Desoxynucleosid-Triphosphats verlängert wird, gefolgt vom Entfernen des hinzugefügten Desoxynucleosids durch eine Nuclease, die an doppelsträngiger DNA angreift, nicht aber einzelsträngige DNA angreift, wobei die Vorgänge des Verlängerns und Entfernens einmal oder mehrfach wiederholt werden, und Nachweisen der erhaltenen Pyrophosphorsäure und/oder des Desoxynucleosid-Monophosphats, die durch das Verlängern oder Entfernen freigesetzt werden.
2. Verfahren zum Nachweis eines Polynucleotids nach Punkt 1, wobei der Oligonucleotidprimer im Bereich des 3'-Endes phosphorothioiert ist.
3. Verfahren zum Nachweis eines Polynucleotids nach Punkt 1 oder 2, wobei die DNA-Polymerase eine DNA-Polymerase I, das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, T4 DNA-Polymerase, T7 DNA-Polymerase oder Phi29 DNA-Polymerase ist.
4. Verfahren zum Nachweis eines Polynucleotids nach einem der Punkte 1 bis 3, wobei die Nuclease die Exonuclease III ist.
5. Verfahren zum Nachweis eines Polynucleotids nach einem der Punkte 1 bis 4, wobei ein Atom oder ein Molekül, mit Ausnahme der Phosphorsäuremoleküle an Position β und γ des Desoxynucleosid-Triphosphats, mit einem Radioisotop markiert ist und das Desoxynucleosid-Monophosphat, das bei der Nuclease-Spaltung freigesetzt wird, nachgewiesen wird.
6. Verfahren zum Nachweis eines Polynucleotids nach einem der Punkte 1 bis 5, wobei das bei der Nuclease-Spaltung freigesetzte Desoxynucleosid-Monophosphat chromatographisch abgetrennt und optisch bestimmt wird.
7. Verfahren zum Nachweis eines Polynucleotids nach einem der Punkte 1 bis 6, wobei die Pyrophosphorsäure, die beim Einbau einer komplementären Base durch die DNA-Polymerase gebildet wird, mit Adenosin-5'-Phosphosulfat und Adenonsin-Triphosphat-Sulfurylase zur Reaktion gebracht werden kann, wobei Adenosin-Triphosphat gebildet wird, welches daraufhin nachgewiesen wird.
8. Verfahren zum Nachweis eines Polynucleotids nach Punkt 7, wobei Adenosin-Triphosphat durch eine Luciferin/Luciferase-Reaktion bestimmt wird.
9. Kit zur Verwendung in dem Verfahren zum Nachweis eines Polynucleotids nach einem der Punkte 1 bis 8, umfassend:
1. einen Nuclease-resistenten Oligonucleotidprimer mit einer Sequenz, die komplementär zu einem Teil des nachzuweisenden Polynucleotids mit bekannter Nucleotidsequenz ist;
2. eine DNA-Polymerase;
3. mindestens eine Desoxynucleosid-Triphosphat-Art;
4. eine Nuclease mit der Wirkung, eine doppelsträngige DNA in der 3' zu 5'-Richtung abzubauen, die aber nicht an einzelsträngiger DNA angreift; und
5. Reagenzien zum Nachweis von Desoxynucleosid-Monophosphat und/oder Reagenzien zum Nachweis von Pyrophosphorsäure.

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden ausführlich beschrieben.

(A) Bei dem in der vorliegenden Erfindung nachzuweisenden Molekül handelt es sich um ein Polynucleotid mit einer bekannten Nucleotidsequenz.

Das nachzuweisende Polynucleotid der vorliegenden Erfindung umfasst, ohne darauf beschränkt zu sein, Polynucleotide aus solchen Organismen wie Tier, Pflanze, Bakterium, Hefe, Schimmelpilze, Mycoplasma, Rickettsien, Virus, usw. Die Polynucleotidarten umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, genomische Nucleinsäure und von RNA-Virus bzw. mRNA abgeleitete cDNA.
Für die praktische Analyse kann eine DNA-Sequenz, bei der es sich weder um das nachzuweisende Polynucleotid noch um eine als Primer für die DNA-Synthese in Frage kommende Sequenz handelt, ein Problem darstellen. Es besteht die Möglichkeit der Verunreinigung der Probe mit DNA-Polymerase- bzw. Nuclease-inhibierenden Substanzen sowie mit Desoxynucleosid-Triphosphat. Weiterhin kann in den Fällen, in denen Pyrophosphorsäure als Signal von dem nachzuweisenden Nucleotid verwendet wird, die in einer Probe vorhandene Pyrophosphorsäure die Analyse stören.
Daher ist bei der Amplifikation in der vorliegenden Erfindung die Minimierung einer solchen Verunreinigung bevorzugt. Die vorliegende Erfindung ist in der Lage, ein hintergrundfreies, hochempfindliches Nachweissystem zur Verfügung zu stellen, indem beispielsweise das nachzuweisende Nucleotid mit einer Festphasengebundenen Fängersonde usw. eingefangen und gewaschen wird. Ist die Fängersonde am 5'-Ende an eine Festphase gebunden (H. Kohsaka et al., Eur. J. Immunol., 23, 1895–1901 (1993); H. Kohsaka et al., Nucleic Acids Research, 21, 3469–3472 (1993)), lässt sich die Fänger sonde selbst ebenfalls als Primer bei der Anwendung des vorliegenden experimentellen Verfahrens einsetzen. Die obenerwähnte Pyrophosphorsäure in der Probe lässt sich ebenfalls enzymatisch mit Pyrophosphatase entfernen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, in der insbesondere ein Nucleotid wiederholt eingebaut und abgebaut wird, lässt sich eine Punktmutation wie im folgenden beschrieben nachweisen.
Das Verfahren zum Nachweis einer Punktmutation ist bekannt, wie beispielsweise beschrieben in der EP 123 513 A1 . Dieses Verfahren beruht auf dem Reaktionsprinzip, bei dem die Synthese eines komplementären Stranges von einer Primer-DNA ausgeht. Ein Nucleotidderivat, das eine Nuclease-Resistenz enthält, wird eingebaut, falls eine Punktmutation vorhanden (bzw. nicht vorhanden) ist. Da das Reaktionsprodukt Exonuclease-resistent wird, sobald das Nucleotidderivat eingebaut ist, lässt sich die Punktmutation durch Untersuchung des Vorhandenseins des Nucleotidabbaus durch Nuclease nachweisen.
Das vorgenannte Verfahren stimmt mit der vorliegenden Erfindung in einigen Elementen überein. Ein wesentlicher Unterschied liegt jedoch darin, dass das vorgenannte Verfahren die Gegenwart bzw. Abwesenheit eines Nuclease-resistenten Fragments als Indikator der Anwesenheit der Punktmutation verwendet, wohingegen in der vorliegenden Erfindung das Auftreten einer wiederholt ablaufenden Reaktion eingesetzt wird. Weiterhin besitzt das vorliegende Verfahren beim Nachweis einer Punktmutation eine höhere Empfindlichkeit gegenüber dem obigen Verfahren.

(B) Die vorliegende Erfindung ist gekennzeichnet durch Hybridisieren eines bekannten Polynucleotids mit einem Nuclease-resistenten Oligonucleotidprimer mit einer Sequenz, die zu einem Teil des bekannten Polynucleotids komplementär ist.

In der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Ausdruck "komplementär" auf den Zustand, der es zwei Nucleinsäureketten gestattet, eine doppelsträngige Kette über Wasserstoffbrückenbindung gemäß der Watson-Crick-Basenpaarung zu bilden. Insbesondere ist Thymin (T) komplementär zu Adenin (A) und Cytosin (C) komplementär zu Guanin (G). In der vorliegenden Erfindung muss der Primer nicht vollkommen komplementär zu der nachzuweisenden Polynucleotidsequenz sein, insoweit das nachzuweisende Oligonucleotid als Ganzes mit dem nachzuweisenden Polynucleotid hybridisieren kann. Insbesondere sollten wenigstens 70% des Primer-Oligonucleotids komplementär zu dem nachzuweisenden Polynucleotid sein, unter der Bedingung, dass das 3'-Ende des Primers an das nachzuweisende Nucleotid hybridisiert und vollständig komplementär zu diesem ist. Eine Komplementarität von weniger als 70% ist aufgrund unzureichender Hybridisierung nicht bevorzugt. In der vorliegenden Erfindung ist die Bedingung, dass das 3'-Ende des Oligonucleotidprimers zu dem nachzuweisenden Nucleotid, an das der Primer hybridisiert, komplementär ist, eine Voraussetzung für die Nucleotidverlängerung am 3'-Ende. Falls der 3'-terminale Bereich nicht in der Lage ist, mit der nachzuweisenden DNA zu hybridisieren, und daher einzelsträngig bleibt, kann der Primerbereich von Polymerase und Nuclease nicht erkannt werden.
Der Oligonucleotidprimer in der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass er zu "einem Teil" eines nachzuweisenden bekannten Polynucleotids komplementär ist. Der Grund dafür ist, dass das vorliegende Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass eine spezifische Desoxynucleotid-Art, die zu dem Reaktionssystem gegeben wird und dann von der DNA-Polymerase an das 3'-Ende des Oligonucleotidprimers gebunden wird, nachgewiesen wird. Das heißt, falls das nachzuweisende Polynucleotid, welches als Template für das an das 3'-Ende des Primers gebundene SubstratDesoxynucleotid dient, unbekannt ist, kann niemand wissen, welche Desoxynucleotid-Art als Substrat zu dem System gegeben werden sollte. Daher muss der Oligonucleotidprimer komplementär zu "einem Teil" eines bekannten nachzuweisenden Polynucleotids sein.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Oligonucleotidprimer sollte Nuclease-resistent sein, um den Abbau durch die in dem System vorhandene Nuclease zu verhindern.
Das Verfahren zur Übertragung der Nuclease-Resistenz auf dem Oligonucleotidprimer ist nicht besonders beschränkt, und es lassen sich daher alle im Fachgebiet bekannten Verfahren dazu verwenden.
So kann beispielsweise ein Oligonucleotidprimer mit Nuclease-Resistenz in einem DNA-Syntheseautomat synthetisiert werden, indem eine Phosphorothioatbindung in die gewünschte Stelle des Primers mit einem im Fachgebiet bekannten Verfahren eingeführt wird. Insbesondere wird der Oligonucleotidprimer beispielsweise in dem Festphasen-Phosphoramiditverfahren synthetisiert, bei dem der herkömmliche Oxidationsschritt mit Iodwasser durch eine oxidative Behandlung mit einem für die Phosphorothioierung geeigneten Reagenz ersetzt wird, wodurch eine Phosphorothioatbindung anstelle einer Phosphordiesterbindung eingeführt werden kann. Als Phosphorothioierungsreagenz sind 3H-1,2-Benzodithiol-3-on-1,l-dioxid (Beaucage's Reagenz), TETD/Acetonitril (TETD: Tetraethylthiuramdisulfid), usw. zu nennen. Dieses Verfahren ermöglicht die Einführung einer Phosphorothioatbindung in das Oligonucleotid an einer beliebigen Stelle.
Als ein alternatives Verfahren zur Einführung einer Phosphorothioatbindung in den Oligonucleotidprimer lässt sich die enzymatische DNA-Synthese mit DNA-Polymerase in Gegenwart von Desoxyribonucleosid- Triphosphat durchführen, bei dem das Sauerstoffatom an der α-Stellung durch Schwefel ersetzt ist. Als derartige substituierte Verbindungen sind α-S-Desoxythymidin-Triphosphat, α-S-Desoxycytidin-Triphosphat, α-S-Desoxyadenosin-Triphosphat sowie α-S-Desoxyguanosin-Triphosphat (die im folgenden gemeinsam als SdXTP bezeichnet werden) zu nennen. DNA-Polymerase baut SdXTP anstelle von Desoxynucleosid-Triphosphat (im folgenden als dXTP bezeichnet) ein, so dass sich ein phosphorothioierter Oligonucleotidprimer mit Nuclease-Resistenz ergibt. Eine Phosphorothioatbindung lässt sich durch DNA-Polymerase ebenfalls in ein mit dem nachzuweisenden Polynucleotid hybridisiertes Oligonucleotid einführen. Das heisst, dem Oligonucleotidprimer wird während der Analyse Nuclease-Resistenz verliehen, und er braucht daher nicht unbedingt vorher hergestellt werden.
In diesem Fall führt die DNA-Polymerase eine Verlängerung mit mindestens 2 Nucleotiden durch, d. h. zunächst wird SdXTP eingebaut und danach dXTP unmittelbar neben dem eingebauten SdXMP (α-S-Desoxynucleosid-Monophosphat) gebunden. Das letztere dXMP kann von der Nuclease angegriffen werden. Sobald Nuclease-Resistenz vorliegt, kann die nachfolgende Reaktion gemäß dem unten beschriebenen Reaktionsprinzip ablaufen.
In jedem Fall verleiht die Gegenwart einer Bindung einer Phosphorothioatgruppe anstelle einer Phosphodiesterbindung in der Umgebung des 3'-Endes des Primers dem Oligonucleotidprimer Resistenz gegenüber einem Nucleaseangriff an der 3'-terminalen Seite. Es ist jedoch anzumerken, dass die Hybridisierungseffizienz mit wachsender Nuclease-Resistenz durch die Einführung von mehr Phosphorothioatbindungen in dem gesamten Oligonucleotidprimer abnimmt. Unter Berücksichtigung des Gleichgewichts zwischen Hybridisierungseffizienz und Nuclease-Resistenz wird vorzugsweise eine Phosphorothioatbindung bzw. wenige Phosphorothioatbindungen verwen det. Durch die Einführung von lediglich einer Phosphorothioatbindung wird genügend Nuclease-Resistenz verliehen. Es wird jedoch durch Einführung einiger weniger Phosphorothioatbindungen, vorzugsweise drei Phosphorothioatbindungen, eine bessere Nuclease-Resistenz verliehen.
Verglichen mit dXTP ist die Einbaueffizienz von SdXTP durch DNA-Polymerase relativ niedrig. Daher sollte SdXTP vor Zugabe von dXTP zugegeben werden, andernfalls müsste es im Überschuss zugegeben werden.
Neben der obenerwähnten Phosphorothiotierung lassen sich Methylphosphonat-, Phosphoroamidat-, Polyamidnucleinsäure-(PNA-)Bindungen, usw. als Mittel zur Verleihung von Nuclease-Resistenz verwenden. Diese Bindungen modifizieren das Nucleotid an der Phosphorsäurebindungsstelle, im Bereich der Ribose bzw. im Bereich der Base oder in dessen Struktur, so dass sich eine Nuclease-Resistenz ergibt.
Alternativ kann eine RNA als Oligonucleotidprimer verwendet werden. RNA ist gegenüber einer auf DNA wirkenden Nuclease weitgehend resistent. Daher entfällt bei der Verwendung eines RNR-Primers der Bedarf an einem modifizierten, gegenüber einer auf DNA wirkenden Nuclease-resistenten Oligonucleotidprimer weg. Da jedoch einige Vertreter der auf DNA wirkenden Nucleasen sowie DNA-Polymerasen auch eine RNase-H-Aktivität besitzen, sollte hier angemerkt werden, dass solche Enzyme RNA-Primer abbauen und daher zu einer Verschlechterung der Empfindlichkeit führen.
In der vorliegenden Erfindung beträgt die Anzahl der Nucleotide im Oligonucleotidprimer mindestens 6, vorzugsweise 10 bis 50 und weiter bevorzugt 15 bis 30.
Bei einem Primer mit einer Länge von weniger als 6 Nucleotiden lässt sich unter Normalbedingungen eine Hybri disierung nur schwer erzielen. Und selbst für den Fall, dass das kurze Oligomer an die nachzuweisende DNA hybridisiert, treten nichtspezifische Reaktionen mit hoher Effizienz auf. Wird andererseits einem Oligonucleotidprimer durch Phosphorothioierung Nuclease-Resistenz verliehen, erniedrigt sich seine Affinität zum Template (Tm), so dass als Kompensation für die Affinitätsabnahme eine gewisse Länge erforderlich ist. Ein Primer mit einer Länge von mehr als 30 Nucleotiden ist jedoch vom wirtschaftlichen Gesichtspunkt her ungünstig, da sich bei Verlängerung des Primerstranges die Ausbeute in der chemischen Synthese verringert. Darüber hinaus treten bei einem zu langen Primer leicht nichtspezifische Reaktionen auf, da sich leicht eine doppelsträngige Kette über Wasserstoffbrückenbindungen intramolekular oder zwischen Primern ausbilden kann. Daher verursacht ein zu langer Primer eine nichtspezifische Synthese, usw. und ist daher nicht bevorzugt.
Einige DNA-Polymerasearten, wie z. B. DNA-Polymerase I, besitzen eine 5' → 3'-Exonucleaseaktivität, durch die doppelsträngige DNA verdaut wird. Für die Verwendung eines derartigen Enzyms als DNA-Polymerase ist es bevorzugt, den Primer am 5'-Ende Nuclease-resistent zu machen, um den Abbau vom 5'-terminalen Bereich her zu verhindern. DNA-Polymerasen, wie z. B. das Klenow-Fragment und Phi29-DNA-Polymerase, sind bevorzugt, da sie keine solche Aktivität besitzen und daher keine besondere Modifikation am 5'-Ende erforderlich ist.
In einem herkömmlichen Verfahren zur Amplifikation einer Nucleotidsequenz wird zur Bildung eines amplifizierten Produkts der Oligonucleotidprimer selbst verbraucht. Deswegen wird der Oligonucleotidprimer relativ zur nachzuweisenden DNA im Überschuss zugegeben. Dies steht im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung, da hier nach erfolgter Hybridisierung der Oligonucleo-tidprimer wiederholt tätig werden kann, so dass damit die Reaktion quantitativ mit einer relativ zur Template- Nucleotidsequenz mindestens äquimolaren Menge ablaufen kann. In der Praxis wird vorzugsweise eine zur Erzielung eines die Hybridisierung begünstigenden Gleichgewichts ausreichende Menge an Oligonucleotidprimer eingesetzt. Obwohl die Abschätzung des Gehalts an der nachzuweisenden Sequenz vor der Analyse schwierig sein kann, läßt sich eine hohe Empfindlichkeit durch die Anwesenheit eines Oligonucleotidprimers, der bezogen auf den gewünschten Nachweisbereich wenigstens äquimolar und vorzugsweise in einem 5fachen Überschuss vorliegt, sicherstellen.
Die Hybridisierungsbedingungen sind nicht besonders beschränkt, insoweit als die nachfolgende Reaktion in Gegenwart von DNA-Polymerase und Nuclease ablaufen kann. Daher sollten die Reaktionsbedingungen so gewählt werden, dass die Nucleaseaktivität beibehalten und optimiert wird, wenn die Temperaturstabilität der Nuclease nicht so hoch ist wie beispielsweise bei der in der PCR verwendeten Taq-Polymerase. Andere Faktoren wie z. B. Puffer, pH usw. sollten ebenfalls so gewählt werden, daß ausreichende Nucleaseaktivität und ausreichende Hybridisierung erzielt wird. Insbesondere liegt die Temperatur im Bereich von 20 bis 55°C, vorzugsweise 30 bis 45°C, und der pH-Wert im Bereich von etwa 7 bis 9, vorzugsweise pH 7,5 bis 8,5, z. B. in Tris-HCl-Puffer.
Wie in den Beispielen gezeigt, wird eine Probe 5 min. bei 100°C erhitzt, um die nachzuweisende DNA in einer Lösung, die ausschließlich aus 0,1 pmol Primer, 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) sowie 10 mM MgCl₂ besteht, zu denaturieren, und dann 10 min. bei 65°C "annealt", d. h. wieder aushärtet, wobei unmittelbar auf das Annealing eine Behandlung mit DNA-Polymerase und Nuclease bei 37°C folgen kann.
Falls die in der Reaktion angereicherte Pyrophosphorsäure enzymatisch bestimmt wird, sollten Bedingungen wie pH, Salzkonzentration, Temperatur, usw. in geeigne ter Weise so gewählt sein, dass sie an die Enzymreaktion angepasst sind.
Stabilisatoren für die DNA-Polymerase bzw. Nuclease dürfen hinzugefügt werden. Bei solchen Stabilisatoren handelt es sich beispielsweise um Rinderserumalbumin (RSA), Dithiothreitol (DTT) und β-Mercaptoethanol, die in einer Menge von 10 bis 500 μg/ml für RSA, etwa 1 mM für DTT und etwa 10 mM für β-Mercaptoethanol zugegeben werden.
Ist das nachzuweisende Polynucleotid doppelsträngig, sollte es zuvor durch Denaturierung in die einzelsträngige Form überführt werden. Die Denaturierung lässt sich mit einem beliebigen, im Fachgebiet bekannten Verfahren ausführen, wie Hitzedenaturierung, saurer Denaturierung, alkalischer Denaturierung, usw., von denen die Hitzedenaturierung (Erhitzen bei 90–100°C für 5 min. oder länger) aufgrund der einfachen Vorgehensweise und Zuverlässigkeit bevorzugt ist.
Vor der Zugabe von DNA-Polymerase kann die Probe mit Exonuclease behandelt werden, wodurch eine Hybridisierung einer von der nachzuweisenden DNA verschiedenen DNA sowie eine durch nichtspezifische Hybridisierung verursachte nichtspezifische Reaktion verhindert werden kann.

(C) Die vorliegende Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass nach der obigen Hybridisierung mindestens eine Art von Desoxynucleosid-Triphosphat, DNA-Polymerase und Nuclease zu dem System gegeben werden, so dass ein sich an das 3'-Ende des Primers anschließendes und zum nachzuweisenden Polynucleotid komplementäres Nucleotid eingebaut und anschließend abgebaut wird, wobei die Synthese und der Abbau des komplementären Stranges ein oder mehrere Male wiederholt wird.

Das Reaktionsprinzip der vorliegenden Erfindung ist in 1 und Schema 1 dargestellt.
Schema 1
Es findet eine Hybridisierung mit dem Oligonucleotidprimer (der durch die Anwesenheit einer Phosphorothioatbindung zwischen dem T-C am 3'-Ende Nucleaseresistent gemacht wurde) statt:
Ein Molekül PPi wird nach Verlängerung mit C (markiert mit *) am 3'-Ende des Primers durch DNA-Polymerase gebildet:
C wird durch Nuclease als dCMP abgespalten:
Ein weiteres C wird durch DNA-Polymerase an das 3'-Ende des Primers angefügt:
Zunächst wird ein Oligonucleotidprimer mit dem nachzuweisenden Nucleotid hybridisiert. Danach wird ein komplementärer Strang durch Einbau eines Moleküls dXTP an das 3'-Ende des Oligonucleotidprimers verlängert, wobei gleichzeitig ein Molekül Pyrophosphorsäure (PPi) freigesetzt wird. Danach wird der komplementäre Strang vom 3'-Ende her durch Nuclease abgebaut, wobei ein Molekül Desoxynucleosid-Monophosphat (dXMP) freigesetzt wird. Aufgrund der Stelle mit Nuclease-Resistenz wird der Oligonucleotidprimer selbst von der Nuclease nicht abgebaut. Die Nucleotidsequenz bleibt intakt und ermöglicht eine weitere Runde der von ihr ausgehenden Verlängerung durch DNA-Polymerase. Die Reaktion wiederholt sich, so daß Pyrophosphorsäure und das von der Nuclease gebildete Desoxynucleosid-Monophosphat sich im System anreichern.
Der Oligonucleotidprimer lässt sich während der Durchführung der obigen Reaktion unter Verwendung der bereits beschriebenen DNA-Polymerasereaktion Nucleaseresistent machen.
Die Pyrophosphorsäure bzw. das beim Abbau durch Nuclease gebildete Desoxynucleosid-Monophosphat wird zum Nachweis bzw. der Quantifizierung des nachzuweisenden Nucleotids verwendet.
Weiterhin kann das vorliegende Nachweisverfahren ein System für den Nachweis eines nachzuweisenden Nucleotids mit einer Punktmutation bilden, falls die Stelle der Punktmutation bereits bekannt ist. Das heißt, eine zu dem sich an das 5'-Ende der Punktmutation anschlie ßenden Bereich komplementäre Sequenz wird als Oligonucleotidprimer verwendet. Wenn nur diejenige dXTP-Art, die dem Nucleotid in der Normalsequenz entspricht, als Substrat zugegeben wird, findet an der Stelle der Punktmutation keine Verlängerung statt, und die Reaktion kann nicht weiterlaufen. Auf diese Weise lässt sich die Anwesenheit der Punktmutation leicht bestätigen (Schema 2).
Schema 2
Zunächst wird der Oligonucleotidprimer (der durch die Anwesenheit einer Phosphorothioatbindung zwischen dem T-C am 3'-Ende Nuclease-resistent gemacht wurde) hybridisiert:
Handelt es sich bei der nachzuweisenden Sequenz um eine Normalsequenz (in diesem Fall mit einem G-Rest), wird das 3'-Ende des Primers von der DNA-Polymerase mit einem C (mit einem * angedeutet) verlängert:
Wird G bei der Punktmutation durch ein anderes Nucleotid (z. B. A) ersetzt, findet in Gegenwart von dCTP als dem einzigen Substrat keine Verlängerung der DNA mit dem zu A komplementären T statt:
Selbst wenn eine Mutation innerhalb des mit dem Oligonucleotidprimers hybridisierenden Bereichs liegt, lässt sich die Anwesenheit der Punktmutation ebenfalls nachweisen, da der Primer nicht mit dem nachzuweisenden Nucleotid hybridisiert und die Reaktion nicht weiterläuft.
Die oben verwendete DNA-Polymerase katalysiert die Verlängerung eines komplementären Stranges in 5' → 3'-Richtung von dem Oligonucleotidprimer, der mit dem nachzuweisenden Nucleotid hybridisiert hat. Jede bis jetzt bekannte DNA-Polymerase besitzt die DNA-Syntheseaktivität in 5' → 3'-Richtung. In Abwesenheit eines mit einem Template-Strang hybridisierten Primers findet keine DNA-Synthese statt. Daher beruht die vorliegende Erfindung auf einer hohen Spezifität, die von der Hybridisierung zwischen dem Primer und dem Template-Strang abhängt. Als DNA-Polymerase zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind die DNA-Polymerase I, das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, T4-DNA-Polymerase, T7-DNA-Polymerase und Phi29-DNA-Polymerase sowie Mutationen davon zu nennen.
Wenn eine DNA-Polymerase mit einer starken 3' → 5'-Exonucleaseaktivität, wie z. B. T4-DNA-Polymerase oder T7-DNA-Polymerase, verwendet wird, besteht die Möglichkeit, den Gehalt an einer Nuclease herabzusetzen, und in einigen Fällen kann sogar auf die Verwendung der Nuclease ganz verzichtet werden. Eine solche DNA-Polymerase kann jedoch die Empfindlichkeit beeinträchtigen, da das Enzym zu einem gewissen Grad Phosphorothioatbindungen abbauen kann. In diesem Fall ist die Einführung mehrerer Phosporothioatbindungen in der Nähe des Primerendes bzw. die Modifikation des Primers mit anderen Mitteln als der Phosphorothioierung bevorzugt, um die Resistenz des Primers gegenüber Nuclease zu erhöhen.
Bei der oben verwendeten Nuclease handelt es sich um diejenige, die eine doppelsträngige DNA in 3' → 5'-Richtung abbaut. Exonuclease III ist bekanntermaßen eine solche Nuclease. Obwohl Exonuclease III aus E. coli kommerziell erhältlich ist, kann jede beliebige, entweder aus anderen Mikroorganismen stammende oder durch genetische Rekombination erhaltene Exonuclease verwendet werden. Exonuclease III wird unter fast denselben Bedingungen wie für DNA-Polymerasen, wie DNA-Polymerase I, ihr Klenow-Fragment, T4-DNA-Polymerase usw., eingesetzt, so dass sowohl für Exonuclease III als auch DNA-Polymerase der gleiche Reaktionspuffer verwendet werden kann. Für die vorliegende zyklische Reaktion ist Exonuclease III stark bevorzugt, da sie spezifisch doppelsträngige DNA in 3' → 5'-Richtung abbaut, keine einzelsträngige DNA, wie das nachzuweisende Nucleotid und den Primer selbst, abbaut und ein Primer durch Phosphorothioierung oder Synthese in Gegenwart von SdXTP leicht resistent gegenüber Exonuclease III gemacht wird.
Als Substrat zur Verlängerung der DNA von dem Oligonucleotidprimer aus durch DNA-Polymerase wird Desoxynucleosid-Triphosphat (dXTP) verwendet. In der vorliegenden Erfindung lässt sich ein Polynucleotid bekannter Sequenz durch die Analyse einer Ein-Basen-Verlängerung nachweisen. Daher kann die vorliegende Reaktion in Anwesenheit von einer Desoxynucleosid-Triphosphat-Art als Substrat, das der nachzuweisenden Sequenz entspricht, ablaufen. Das Substrat (dXTP) wird in einer bezogen auf die Anzahl Mole des nachzuweisenden Nucleotids ausreichenden Menge bzw. im Überschuss dazu zugegeben. Da es normalerweise schwierig ist, vor der Analyse die Menge des nachzuweisenden Nucleotids genau vorherzusagen, ist es bevorzugt, mindestens 0,1 μmol/l, vorzugsweise 1 μmol/l oder mehr, zuzugeben, um einen Mangel an Substrat (dXTP) praktisch zu verhindern.

(D) Die vorliegende Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass Pyrophosphorsäure oder Desoxynucleosid-Monophosphat nachgewiesen wird.

(1) Nachweis von angereichertem Desoxynucleosid-Monophosphat
Im vorliegenden Verfahren lässt sich das nachzuweisende Polynucleotid durch Bestimmung des durch Abbau des eingebauten Nucleotids nach der Polymerisierung angereicherten Desoxynucleosid-Monophosphats (dXMP) nachweisen.
Zur Bestimmung des dXMP wird das dXTP-Substrat mit einem Radioisotop (³²P oder ³³P) an einem Phosphoratom in der α-Stellung; mit ³H an einem Wasserstoffatom der Phosphorsäure in der α-Stellung, der Desoxyribosegruppe bzw. der Basengruppe; oder mit ¹⁴C an einem Kohlenstoffatom der Desoxyribosegruppe markiert. Danach wird das dXMP vom dXTP-Substrat unter Verwendung von Chromatographietechniken z. B. einem Ionenaustauschharz getrennt, wobei die Radioaktivität verfolgt wird, so daß das dXMP durch seine Radioaktivität bestimmt wird. dATP, dCTP, dGTP und dTTP sind als das mit ³²P an einem Phosphoratom in der α-Stellung markierte dXTP kommerziell erhältlich. dATP und dCTP sind ebenfalls als das mit ³³P an einem Phosphoratom in der α-Stellung markierte dXTP kommerziell erhältlich. Schließlich sind dATP, dCTP, dGTP und dTTP als das mit ³H in der Basengruppe markierte dXTP kommerziell erhältlich.
Radioaktiv markiertes dXMP lässt sich leicht und qualitativ durch Bestimmung seiner Radioaktivität mittels Autoradiographie nach Trennung durch Dünnschichtchromatographie auf einem Ionenaustauschharz nachweisen. Wie in den Beispielen gezeigt, lässt sich dXMP auch quantitativ bestimmen, indem die Radioaktivität eines ausgeschnittenen Stückchens in einem Szintillationszähler bestimmt wird. Die Markierung eines Substrats mit einem Isotop ist jedoch nicht unbedingt für die Trennung und Bestimmung von dXMP erforderlich. So lässt sich beispielsweise nach Auftrennung der Reaktionslösung durch mit einem kommerziellen Fluoreszenzfarbstoff beschichtete Dünnschichtchromatographie dXMP als ein nicht fluoreszierender Fleck bei Bestrahlung mit ultraviolettem Licht sichtbar machen, da das Nucleotid ultraviolettes Licht absorbiert. dXMP lässt sich auch quantitativ nachweisen, indem es durch Flüssigchromatographie getrennt und seine ultraviolette Lichtabsorption bestimmt wird.
(2) Quantifizierung von bei der Strangverlängerung mit DNR-Polymerase gebildeter Pyrophosphorsäure
In der vorliegenden Erfindung lässt sich das nachzuweisende Polynucleotid durch Bestimmung des bei der Verlängerung von dXMP durch DNA-Polymerase gebildeten PPi nachweisen.
Das PPi lässt sich ohne jede Trennung von dXMP und cXTP mittels Chromatographie usw. enzymatisch bestimmen. So verspricht beispielsweise die folgende bekannte Reaktion 1 eine hochempfindliche Bestimmung bei einfacher Durchführung in einem homogenen System (T. Tabary et al., J. Immunological Methods, 156, 55–60 (1992)).
Reaktion 1:
Als weiteres Verfahren zur Bestimmung von Pyrophosporsäure ist das in Anal. Biochem., 94, 117–120 (1979) beschriebene Verfahren zu nennen.

(E) Das erfindungsgemäße Reaktionssystem beispielhaft wird unter Bezugnahme auf ein spezifisches Oligonucleotid im folgenden Reaktionssystem (Schema 3) erläutert.

Schema 3
Eine für den menschlichen Cytomegalievirus (im folgenden als CMV bezeichnet) spezifische Sequenz im D-Fragment im Genom
PPi wird durch Verlängerung mit A (mit *markiert) durch DNA-Polymerase gebildet.
Nuclease baut die 3'-Bindung zwischen T und A ab, wobei dAMP abgespalten wird. Daraufhin wird die Position unbesetzt und steht für einen neuerlichen Einbau von dAMP zur Verfügung:
Ein weiteres A wird als Verlängerung durch DNA-Polymerase eingebaut:

(1) Für den Nachweis von CMV wird die Primersequenz von dem D-Fragment in einem mit dem Restriktionsenzym EcoRI hergestellten Fragment in der genomischen DNA abgeleitet. Die Sequenz ist in Schema 3 gezeigt.

In der folgenden Beschreibung wird ein zu der nachzuweisenden Sequenz zwischen "→" und "←" komplementärer Strang als die Primersequenz (SEQ ID Nr: 1) verwendet, obwohl man hinsichtlich der zu hybridisierenden Primersequenz nicht besonders eingeschränkt ist und daher einen beliebigen Teil der nachzuweisenden Sequenz in Schema 3 verwenden kann. Bei der Bindung zwischen A-T am 3'-Ende des Primers handelt es sich um eine Phosphorothioatbindung anstelle einer natürlichen Phosphordiesterbindung.
Das Vorhandensein einer CMV-Sequenz lässt sich über den Nachweis des PPi bzw. des Abbauprodukts dAMP feststellen.

(2) Für den Nachweis einer Punktmutation, wie oben beschrieben, lässt sich als bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren ein Verfahren, bei dem insbesondere ein Nucleotid wiederholt eingebaut und abgelöst wird, einsetzen. In dem folgenden Beispiel wird die Punktmutation des menschlichen Onkogens Ki-ras/12 nachgewiesen. Eine bekannte Ki-ras/12-Mutante ist in Schema 4 dargestellt (die Normalsequenz ist mit Punkten dargestellt).

Schema 4
Die Teilsequenz (SEQ ID Nr. 2) in Schema 4 wird als Primer verwendet. Dem Primer wird durch die Anwesenheit einer Thiophosphatbindung zwischen dem T-G am 3'-Ende Nuclease-Resistenz verliehen. Für die DNA-Polymerasereaktion wird nur eine Art von Substrat, nämlich dGTP, zugegeben. In diesem Beispiel sollte dGTP eingebaut werden, wenn die Probe die Normalsequenz besitzt, und PPi und dGMP sollten dann angereichert werden. Besitzt die Probe eine Mutationssequenz, findet aufgrund der Tat0sache, dass die mutierte Sequenz einen A-Rest aufweist, in Abwesenheit von dTTP keine Synthese des komplementären Stranges statt. Die Anwesenheit der Punktmutation lässt sich bestätigen, wenn die Reaktion durch Zugabe von dTTP als Substrat initiiert wird. Auf diese Weise kann erfindungsgemäß eine Punktmutation nachgewiesen werden (siehe Schema 5).
Schema 5
dGTP wird in die Normalsequenz eingebaut.
In den Schemata 4 und 5 ist der Primer in der oberen Sequenz und die Template-Sequenz in der unteren Sequenz gezeigt, wobei diese Darstellungsweise verschieden zu der in den Schemata 1–3 ist (Primer in der unteren Sequenz und Template in der oberen Sequenz).

(F) Der Kit zum Nachweis eines Polynucleotids gemäß der vorliegenden Erfindung

Die oben beschriebenen, für die vorliegende Erfindung notwendigen Elemente können in Form von zuvor zusammengegebenen Reagenzien bereitgestellt werden. Im folgenden wird der erfindungsgemäße Kit erläutert. Die folgenden Reagenzien können mit beliebigen Komponenten, z. B. solchen, die für den Markierungsnachweis benötigt werden, Pufferreagenzien für die Reaktionslösung oder Komponenten für positive bzw. negative Kontrollen usw., kombiniert werden.
Der erfindungsgemäße Kit stellt sich wie folgt dar:

1. Ein Nuclease-resistenter Oligonucleotidprimer mit einer Sequenz, die komplementär zu einem Teil des nachzuweisenden Polynucleotids mit bekannter Nucleotidsequenz ist
2. Eine DNA-Polymerase
3. Mindestens eine Desoxynucleosid-Triphosphat-Art und
4. Eine Nuclease mit der Wirkung, eine doppelsträngige DNA in 3' → 5'Richtung abzubauen.

Der die Bestandteile 1–4 enthaltende Kit kann zusätzliche Reagenzien, die für den Nachweis der angereicherten Verbindung benötigt werden, enthalten. So ist vorgesehen, dass der Kit beispielsweise zum Nachweis von dXMP Reagenzien zum Nachweis von Desoxynucleosid-Monophospat enthält.
Bei den Reaktionsreagenzien handelt es sich beispielsweise um phosphorothioiertes Oligonucleotid als Primer, das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, Desoxynucleosid-Triphosphat (mit ³²P markiert), Exonuclease III, Tris-HCl-Puffer, MgCl₂, RSA und DTT. In dem Kit ist ebenfalls EDTA-Lösung zum Beenden der Reaktion enthalten. Für den Nachweis von dXMP wird Celullose für den Innenaustausch (PEI = Polyethylenimincellulose) zur Dünnschichtchromatographie sowie LiCl (Laufmittel) verwendet. Andererseits wird für den Nachweis von Pyrophosphorsäure ATP-Sulfurylase, Adenosin-5'-Phosphosulfat, Luciferin und Luciferase verwendet.
Im folgenden sind der Mechanismus und die Wirkungen der vorliegenden Erfindung zusammengefasst.
Der erfindungsgemäße Oligonucleotidprimer wird spezifisch mit der nachzuweisenden Nucleotidsequenz hybridisiert, um von dort aus die Verlängerung durch DNA-Polymerase zu ermöglichen. Eine Nuclease-Resistenz wird diesem Primer entweder in einer vorhergehenden Synthese oder während der Analyse durch Bindung eines Desoxynucleotidderivats (SdXTP usw.) in der Polymerisierungsreaktion vermittelt. Der Oligonucleotidprimer erlaubt dann die Addition von Desoxynucleosid-Triphosphat (dXTP) durch DNA-Polymerase sowie dessen Ablösung durch Nuclease. Die Reaktion findet wiederholt statt, wodurch sich das von der Nuclease abgebaute Produkt im Reaktionssystem anreichert. Auf diese Weise wird von der vorliegenden Erfindung ein quantitatives und hochempfindliches System bereitgestellt.
Selbst falls der Primer mit einer anderen Sequenz als dem nachzuweisenden Nucleotid hybridisiert, läuft die nachfolgende Reaktion nicht weiter, wenn das zuvor als Substrat zugegebene dXTP zu der sich an den Primer anschließenden Sequenzstelle nicht komplementär ist.
Da in der vorliegenden Erfindung die Wiederholung des Denaturierungsvorgangs der Erhitzung von DNA nicht erforderlich ist, brauchen die Reagenzien einschließlich DNA-Polymerase nicht temperaturstabil zu sein, und eine komplizierte Temperaturkontrolle ist nicht erforder lich. Daher liegt ein weiterer Vorteil darin, dass sich diese Vorgänge leicht automatisieren lassen.
In der vorliegenden Erfindung wird von der DNA-Polymerase ein Strang synthetisiert, der zu einer sich an den Bereich, an den der Primer hybridisiert worden ist, anschließenden Teilsequenz komplementär ist. Bei dieser Synthese wird nach der Additionsreaktion von einem (1) Molekül dXTP ein (1) Molekül PPi gebildet. PPi lässt sich durch eine Enzymreaktion spezifisch bestimmen, das heißt, die vorliegende Erfindung ermöglicht, dass Signals gleichzeitig mit der Verlängerungsreaktion die Signalisierung stattfindet. In einer weiteren Ausführungsform kann die von Nuclease abgespaltene verlängerte Kette nachgewiesen werden. Durch die Verwendung von DNA-Polymerase lässt sich Nuclease-Resistenz auf ein Nuclease-empfindliches Oligonucleotid in Gegenwart eines Desoxynucleotidderivats als Substrat übertragen.
In der vorliegenden Erfindung wird von der Nuclease der von dem mit dem nachzuweisenden Nucleotid hybridisierten Primer aus verlängerte Strang spezifisch hydrolysiert, solange bis der Abbau die Nuclease-resistente Stelle erreicht. Bei Abwesenheit der nachzuweisenden Sequenz findet keine Hydrolyse statt. Selbst wenn die nachzuweisende Sequenz vorhanden ist, findet ohne ihre Hybridisierung an ein Oligonucleotid sowie die nachfolgende Verlängerung eines komplementären Stranges durch DNA-Polymerase keine Hydrolyse statt. Das durch Nuclease entstandene Abbauprodukt ist spezifisch für das nachzuweisende Polynucleotid und reichert sich in der Reaktionslösung an, wobei seine Menge in einer linearen Abhängigkeit vom Gehalt an nachzuweisendem Polynucleotid zunimmt, so dass eine sehr genaue Analyse ermöglicht wird.
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt in der äußerst geringen Anfälligkeit gegenüber dem Einfluss von Verunreinigungen, da selbst wenn eine zu un tersuchende Probenlösung mit einer bereits reagierten Probenlösung verunreinigt ist, das darin Produkt nicht als Template für eine weitere Amplifikationsrunde fungieren kann. Damit ist das vorliegende Verfahren in der Praxis sehr vorteilhaft.
Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung ein homogenes System für einfache Arbeitsschritte bereit. Die folgende Erfindung stellt weiterhin ein Reaktionssystem bereit, das keine Vorgänge wie Hybridisierung mit einer zusätzlichen Sonde, Trennung durch Elektrophorese usw. benötigt, indem das nach Addition von dXTP durch DNA-Polymerase gebildete PPi bestimmt wird. Die spezifische Analyse von PPi mittels Enzymreaktion lässt sich in der Reaktionslösung für die Verlängerung und den Abbau durchführen. Dieser Vorteil wird deutlich im Hinblick auf die PCR, bei der für den Nachweis des Amplifikationsprodukts Sondenhybridisierung und Trennung durch Elektrophorese benötigt werden.
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt in einer geringeren benötigten Primermenge. Das heißt, es reicht aus, den Primer in leichtem Überschuss gegenüber dem Molverhältnis des nachzuweisenden Nucleotids zuzugeben, da der in der ersten Reaktion mit dem nachzuweisenden Nucleotid hybridisierte Primer eine wiederholt stattfindende Verlängerung erlaubt. Dies steht im Gegensatz zu einem System wie PCR, zu dem der Primer in großem Überschuss zugegeben werden sollte, um den als Amplifikationsprodukt verbrauchten Primer auszugleichen. Dies trifft auf Desoxynucleosid-Triphosphat als Substrat zu. Beispielsweise benötigt die PCR für die Verlängerung vier Desoxynucleosid-Triphosphate (dXTP). Andererseits reicht es bei der vorliegenden Erfindung aus, nur eine (1) Art von Desoxynucleosid-Triphosphat als Substrat zuzugeben, welches zu dem sich an den hybridisierten Bereich anschließenden Nucleotid komplementär ist. Dies führt zu einer Vereinfachung der Zusammensetzung der Reagenzien.
In einer weiteren Ausführungsform lässt sich die vorliegende Erfindung auf den Nachweis einer Punktmutation anwenden, falls die Position sowie die Sequenz der Punktmutation bereits bekannt sind. Bei dieser Anwendung wird der Primer mit einer sich an die bekannte Position einer Punktmutation anschließenden nachzuweisenden Nucleotidsequenz hybridisiert, wobei, falls eine Punktmutation vorhanden ist, die Strangverlängerung verhindert wird, da das zu der Punktmutation komplementäre Nucleotidsubstrat fehlt.
Das folgende Verfahren besitzt, wie beschrieben, viele Vorteile und kann ein wirkungsvolles Verfahren bei der Genanalyse darstellen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, womit ein eine spezifische Sequenz enthaltendes Polynucleotid nachgewiesen werden kann und welches zur Diagnose von genetisch bedingten Erkrankungen sowie Infektionskrankheiten geeignet ist, sowie ein für dieses Verfahren eingesetzter Kit zum Nachweis eines Polynucleotids.
1 ist eine graphische Darstellung des Reaktionsprinzips der vorliegenden Erfindung.
2 zeigt das Ergebnis einer Autoradiographie des erfindungsgemäßen Nachweises des Gens für HBV-e-Antigen.
3 zeigt das Ergebnis einer Autoradiographie, worin der die Anreicherung des Abbauprodukts bei Nucleaseresistentem Primer mit der bei Nuclease-empfindlichem Primer im System der vorliegenden Erfindung verglichen wird.
4 zeigt das Ergebnis einer Autoradiographie zur Wirkung der Komplementarität zwischen einer Primerse quenz und ihrer nachzuweisenden Nucleotidsequenz auf die Anreicherung des Abbauprodukts.
5 zeigt das Ergebnis einer Autoradiographie, bei der die Anreicherung des Abbauprodukts in Gegenwart einer anderen Art von Substrat untersucht wird.
6 zeigt das Ergebnis einer Autoradiographie zur Empfindlichkeit des vorliegenden Verfahrens gegenüber verschiedenen Konzentrationen des nachzuweisenden Polynucleotids.
7 zeigt das Ergebnis einer Autoradiographie, bei der T4-DNA-Polymerase im System der vorliegenden Erfindung in Abwesenheit von Nuclease verwendet wird.
Im folgenden wird die vorliegende Erfindung ausführlich mit Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, die jedoch nicht als Einschränkung des Rahmens der Erfindung aufzufassen sind, beschrieben.
BEISPIEL: Nachweis eines HBV-e-Antigen-Gens in HBV-DNR
Der Nachweis eines Gens für HBV-e-Antigen in HBV-DNA wurde in der folgenden Weise durchgeführt. Exonuclease III (ein Produkt der Firma Takara Shuzo Co., Ltd.) aus E. coli wurde als die Nuclease verwendet, und das Oligonucleotid der SEQ ID Nr 3 wurde chemisch als die Primer-DNA synthetisiert.
1.1 Herstellung der Primer-DNA
Das Oligonucleotid mit der obigen Sequenz (SEQ ID Nr. 3) wurde mittels der β-Cyanoethylamidit-Methode synthetisiert (J. Am. Chem. Soc., 112, 1253–1254 (1990)). Ein Nuclease-resistenter Oligonucleotidprimer wurde durch Einführung einer Phosphorothioatbindung in T-C am 3'-Ende mit 3H-1,2-Benzodithiol-3-on-1,l-dioxid (Beaucage's Reagenz) als Reagenz für die Phosporothioierung erhalten. Für die Synthese der DNA wurde ein Cyclone" Plus DNA/RNA-Syntheseautomat (Japan Millipore Limited) eingesetzt. Das synthetisierte, phosphorothioierte Oligonucleotid wurde in üblicher Weise mittels HPLC gereinigt.
1.2 Nachweis der Nucleotidsequenz
Der Oligonucleotidprimer wurde mit der HBV-DNA als ein nachzuweisendes Nucleotid tragender M13-Phagen-DNA gemischt und diese Mischung der Reaktion der vorliegenden Erfindung ausgesetzt. Die Zusammensetzung der Reaktionslösung ist unten gezeigt, wobei die Endkonzentrationen angegeben sind. Um das Fortschreiten der Reaktion zu bestätigen, wurde der Reaktion gestattet, in Abwesenheit von jeweils einer Komponente abzulaufen. Um die Notwendigkeit des Nuclease-resistenten Primers in dem System zu bestätigen, wurde der Nuclease-resistente Primer mit dem dieselbe Sequenz tragenden Nucleaseempfindlichen Primer verglichen.
Wenn der in diesem Beispiel verwendete Primer mit dem nachzuweisenden Polynucleotid hybridisiert wird, so ist das sich an das 3'-Ende anschließende Nucleotid ein G, so daß für die Synthese des komplementären Stranges dCTP benötigt wird. Das dCTP wird dann von Nuclease unter Erhalt von dCMP verdaut.
Zusammensetzungen
Erste Reaktionslösung (5 μl)

10 fmol nachzuweisendes Nucleotid (einzelsträngige
DNA mit dem HBV-e-Antigen-Gen auf M13-Phagen-DNA)
1 pmol Primer-DNA
50 mmol/l Tris-HCl, pH 7,5
10 mmol/l MgCl₂

Zweite Reaktionslösung (10 μl)

1 Einheit (unit) Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I
5 Einheiten (units) Exonuclease III
10 μmol/l dCTP (markiert mit ³²P, 5 × 10⁴ cpm)
50 μg/ml Rinderserumalbumin (BSA)
10 mmol/l Dithiothreitol

In der ersten Reaktion wurde die Reaktionslösung (5 μl) 5 min. bei 100°C erhitzt, wodurch die DNA in die einzelsträngige Form überführt wurde. Der Oligonucleotidprimer wurde dann mit dem nachzuweisenden Nucleotid hybridisiert, indem es 10 min. bei 65°C stehen gelassen wurde. Die zweite Reaktionslösung wurde dann hinzugegeben und 1 Stunde bei 37°C reagieren gelassen. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 1 μl 20 mmol/l EDTA beendet. Die gesamte Reaktionslösung wurde mittels Dünnschichtchromatographie (Dünnschicht: PEI-Cellulose F, Merck) 40 min. bei Raumtemperatur mit 0,4 mol/l LiCl als Laufmittel entwickelt. dCMP wurde dann durch Autoradiographie als das Nuclease-Abbauprodukt nachgewiesen.
Wie aus 2 ersichtlich ist, konnte dCMP als Abbauprodukt bei Fehlen eines der Elemente, d. h. des nachzuweisenden Nucleotids, des Klenow-Fragments bzw. der Exonuclease III (Spuren 2–4), nicht nachgewiesen werden, während die Reaktion gemäß der vorliegenden Erfindung spezifisch ablief (Spur 1). Spur 1 stellt das System der vorliegenden Erfindung (das nachzuweisende Nucleotid + alle Reagenzien) dar. Die Spuren 2–4 sind identisch zu Spur 1, außer daß das nachzuweisende Nucleotid, das Klenow-Fragment bzw. Exonuclease III in den Spuren 2–4 fehlt.
Falls der Nuclease-empfindliche Primer anstelle des Nuclease-resistenten Primers verwendet wird, reichert sich, wie in 3 gezeigt (Spur 1: Nucleaseresistenter Primer, Spur 2: nicht modifizierter, d. h. Nuclease-empfindlicher, Primer) dCMP als Abbauprodukt nicht im Reaktionssystem an. Es wird vermutet, daß dieses Ergebnis auf dem Abbau des 3'-terminalen Bereichs, d. h. der Additionsstelle von dCTP, des Primers durch die Nuclease beruht.
2. Template-Spezifität
Im folgenden Experiment wurde bestätigt, daß das Substrat (dXTP) von Nuclease nur dann abgebaut wird, wenn der Primer komplementär zum nachzuweisenden Nucleotid ist. Die Reaktionsbedingungen waren dieselben wie in (1) oben, außer dass eine Primersequenz ohne jegliche Komplementarität zum nachzuweisenden Nucleotid (Spur 2) bzw. keine nachzuweisende Sequenz (Spur 3) zugegeben wurde.
Wie in 4 gezeigt, reicherte sich das dCMP als Ergebnis des Abbaus an (Spur 1: das zum Primernucleotid komplementäre nachzuweisende Nucleotid), während sich in den anderen Fällen kein Abbauprodukt anreicherte (Spur 2: nachzuweisendes Nucleotid identisch, d. h. nicht komplementär, zur Primersequenz, Spur 3: kein nachzuweisendes Nucleotid). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die erfindungsgemäße Reaktion nur dann weiterläuft, wenn das nachzuweisende Nucleotid eine zum Primer komplementäre Sequenz besitzt.
3. Substrat-(Desoxynucleosid-Triphosphat-)Spezifität
Im folgenden Experiment wurde gezeigt, daß das Substrat nur dann in das 3'-Ende des Primers eingebaut werden kann, wenn dCTP als einzige Quelle für Desoxynucleosid-Triphosphat eingesetzt wurde. Im Gegensatz dazu wurde dann kein Abbauprodukt nachgewiesen, wenn eine andere Desoxynucleosid-Triphosphat-Art als Substrat verwendet wurde (dGTP wurde anstelle des Substrats dCTP in (1) oben verwendet).
Wie in 5 gezeigt (Spur 1: dCTP als einzige Substratquelle, Spur 2: dGTP als einzige Substratquelle, Spur 3: dCMP und dCTP als Marker und Spur 4: dGMP und dGTP als Marker) läuft nur in Anwesenheit von dCTP als einziger Substratquelle die Reaktion weiter, wobei das Abbauprodukt (dCMP) beobachtet wurde (Spur 1). In Gegenwart von dGTP als einziger Substratquelle (Spur 2) findet hingegen keine Anreicherung (d. h. keine Produktbildung) statt.
Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass sich das vorliegende Verfahren auf den Nachweis einer Punktmutation anwenden lässt.
4. Empfindlichkeit des vorliegenden Verfahrens
Die Empfindlichkeit des vorliegenden Verfahrens wurde an 0 bis 1 pmol DNA pro Reaktionsmischung als nachzuweisendes Nucleotid in der gleichen Weise wie in 1. oben untersucht (6 und Tabelle 1). Wie in 6 gezeigt, konnte 1 fmol DNA (Spur 4) nachgewiesen werden (Spur 1: 1 pmol der DNA, Spur 2: 0,1 pmol der DNA, Spur 3: 0,01 pmol der DNA, Spur 4: 1 fmol der DNA, Spur 5: 0,1 fmol der DNA, Spur 6: 0,01 fmol der DNA, Spur 7: 1 amol der DNA, Spur 8: keine DNA). Somit wurde die äußerst hohe Empfindlichkeit der vorliegenden Erfindung bestätigt. Die Banden wurden jeweils ausgeschnitten und ihre Radioaktivität in einem Flüssig-Szintillationszähler bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. In Tabelle 1 ist unter (A) und (B) jeweils die Radioaktivität der einzelnen Banden aufgeführt (CPM; Zählrate pro Minute). Es wurde bestätigt, dass die Probe im Bereich von 0,1 fmol bis 0,01 pmol quantitativ bestimmt werden kann.
In diesem Beispiel wurde ³²P-markiertes dCTP zuvor mit unmarkiertem dCTP verdünnt, um eine Bande im Autoradiogramm deutlich sichtbar machen zu können. Daher lässt sich eine höhere Empfindlichkeit mit einem höheren Anteil an markiertem dCTP erzielen.
Tabelle 1.: Empfindlichkeit des vorliegenden Nachweisverfahrens
5. Verwendung von T4-DNA-Polymerase mit den vorliegenden Verfahren
Das vorliegende Verfahren zum Nachweis der nachzuweisenden Nucleotidsequenz wurde in der gleichen Weise wie in 1. oben durchgeführt, außer dass anstelle des Klenow-Fragments T4-DNA-Polymerase verwendet wurde. Wie oben beschrieben, besitzt T4-DNA-Polymerase zusätzlich zu ihrer Polymeraseaktivität eine starke 3' → 5'-Exonucleaseaktivität, so dass bei ihrer Verwendung auf die Verwendung von Exonuclease im Reakionssystem verzichtet werden kann.
In dem unten beschriebenen Reaktionssystem wurden 4 Einheiten T4-DNA-Polymerase eingesetzt. Die anderen Reaktionsbedingungen waren dieselben wie in (1) oben. Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt (Spur 1: Klenow-Fragment + Exonuclease, Spur 2: Klenow-Fragment + Exonuclease + nachzuweisendes Nucleotid, Spur 3: T4-DNA-Polymerase, Spur 4: T4-DNA-Polymerase + nachzuweisendes Nucleotid). Obwohl die entstandene Bande (Spur 4) im Vergleich zur Kontrolle (Spur 2) klein war, wurde die Bildung von dCMP als das Abbauprodukt bestätigt. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die erfindungsgemäße Reaktion mit T4-DNA-Polymerase in Abwesenheit einer Nuclease weiterlaufen kann.
Zusammensetzungen
Erste Reaktionslösung (5 μl)

10 fmol nachzuweisendes Nucleotid
1 pmol Primer-DNA
67 mmol/l Tris-HCl, pH 8,8
6,7 mmol/l MgCl₂
16,7 mmol/l (NH₄)₂SO₄
6,7 mmol/l EDTA

Zweite Reaktionslösung (10 μl)

10 mmol/l β-Mercaptoethanol
10 umol/l dCTP (markiert mit ³²P, 5 × 10⁴ cpm)
50 μg/ml RSA
4 Einheiten T4-DNA-Polymerase (ein Produkt der Firma Takara Shuzo Co., Ltd.)

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Nachweis eines Polynucleotids, umfassend: Hybridisieren eines Nuclease-resistenten Oligonucleotidprimers, der eine Sequenz aufweist, die komplementär zu einer bekannten Nucleotidsequenz eines Teils des nachzuweisenden Polynucleotids ist, in Gegenwart von DNA-Polymerase, Nuclease dafür sowie mindestens einer Desoxynucleosid-Triphosphat-Art, welche zu demjenigen Nucleotid des nachzuweisenden Polynucleotids komplementär ist, das sich in 5'-Richtung an dasjenige Nucleotid des nachzuweisenden Polynucleotids anschließt, welches zum 3'-Ende des Primers komplementär ist; unter Bedingungen, worunter das 3'-Ende des Primers durch Hinzufügen des Desoxynucleosid-Monophosphatrests des Desoxynucleosid-Triphosphats verlängert wird; gefolgt vom Entfernen des hinzugefügten Desoxynucleosids durch Nuclease, die an doppelsträngiger DNA angreift, nicht aber einzelsträngige DNA angreift, wobei die Vorgänge des Verlängerns und Entfernens einmal oder mehrfach wiederholt werden; und Nachweisen der erhaltenen Pyrophosphorsäure oder des Desoxynucleosid-Monophosphats, die durch das Verlängern oder Entfernen freigesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Oligonucleotidprimer im Bereich des 3'-Endes phosphorothioiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die DNA-Polymerase eine DNA-Polymerase I, das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, T4 DNA-Polymerase, T7 DNA-Polymerase oder Phi29 DNA-Polymerase ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Nuclease die Exonuclease III ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei ein Atom oder ein Molekül, mit Ausnahme der Phosphorsäuremoleküle an Position ß und y des Desoxynucleosid-Triphosphats, mit einem Radioisotop markiert ist und das Desoxynucleosid-Monophosphat, das bei der Nuclease-Spaltung freigesetzt wird, nachgewiesen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das bei der Nuclease-Spaltung freigesetzte Desoxynucleosid-Monophosphat chromatographisch abgetrennt und optisch bestimmt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Pyrophosphorsäure, die beim Einbau einer komplementären Base durch die DNA-Polymerase gebildet wird, mit Adenosin-5'-Phosphosulfat und Adenonsin-Triphosphat-Sulfurylase zur Reaktion gebracht werden kann, wobei Adenosin-Triphosphat gebildet wird, welches daraufhin nachgewiesen wird.
Verfahren zum Nachweis eines Polynucleotids nach Anspruch 7, wobei Adenosin-Triphosphat durch eine Luciferin/Luciferase-Reaktion bestimmt wird.
Kit zum Nachweis eines Polynucleotids mit einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, umfassend: (i) einen Nuclease-resistenten Oligonucleotidprimer mit einer Sequenz, die komplementär zu einem Teil des nachzuweisenden Polynucleotids mit bekannter Nucleotidsequenz ist; (ii) eine DNA-Polymerase; (iii) mindestens eine Desoxynucleosid-Triphosphat-Art; (iv) eine Nuclease mit der Wirkung, eine doppelsträngige DNA in der 3' zu 5'-Richtung abzubauen, die aber nicht an einzelsträngiger DNA angreift; und (v) Reagenzien zum Nachweis von Desoxynucleosid-Monophosphat und/oder Reagenzien zum Nachweis von Pyrophosphorsäure.
Kit gemäß Anspruch 9 umfassend Reagenzien zum Nachweis von Desoxynucleosid-Monophosphat und Reagenzien zum Nachweis von Pyrophosphorsäure.