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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung
von Sequenzvariationen bei Nucleinsäuren.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Nachweis
und Identifizierung von Variationen in DNA-Sequenzen zwischen Individuen und Arten
haben Einblicke in evolutionäre
Verwandtschaftsverhältnisse,
Erbkrankheiten, erworbene Krankheiten und andere Aspekte der Molekulargenetik
gewährt.
Die Sequenzvariationsanalyse erfolgt routinemäßig durch Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus(RFLP)-Analyse,
die auf einer Änderung
der Restriktionsfragmentlänge als
Folge einer Sequenzänderung
beruht. Die RFLP-Analyse erfordert Größenauftrennung von Restriktionsfragmenten
auf einem Gel und Southern-Blotting mit einer geeigneten Sonde.
Diese Technik ist langsam und arbeitsintensiv und kann nicht eingesetzt
werden, wenn die Sequenzveränderung
nicht zu einer neuen oder zum Wegfall einer Restriktionsstelle führt.
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Seit
kürzerem
wird PCR verwendet, um die Sequenzanalyse von DNA zu vereinfachen.
Zum Beispiel verwendet man allelspezifische Oligonucleotide, um
Dot-Blots von PCR-Produkten
zwecks Krankheitsdiagnose zu untersuchen. Wenn eine Punktmutation
eine Restriktionsstelle erzeugt oder beseitigt, kann die Spaltung von
PCR-Produkten zur genetischen Diagnose genutzt werden (z.B. Sichelzellenanämie). Über allgemeine PCR-Techniken zur Analyse
von Sequenzvariationen ist ebenfalls berichtet worden. S. Kwok et
al. (1990, Nucl. Acids Res. 18: 999-1005) ermittelten die Auswirkung
verschiedener Primer-Matrizen-Fehlpaarungen
auf PCR, um Primer zur Amplifikation von HIV zu konstruieren, die
gegenüber
Sequenzvariationen tolerant wären.
Die Autoren haben auch erkannt, dass ihre Untersuchungen die Entwicklung
von Primern zur allelspezifischen Amplifikation erleichtern könnten. Kwok
et al. berichten, dass eine 3'-terminale Fehlpaarung
am PCR-Primer zu unterschiedlichen Ergebnissen führte. Mit Ausnahme einer 3'-T-Fehlpaarung führte dagegen
eine 3'-terminale Fehlpaarung,
die von einer zweiten Fehlpaarung innerhalb der letzten vier Nucleotide
der Primer begleitet wurde, gewöhnlich
zu einer dramatischen Abnahme beim Amplifikationsprodukt. Die Autoren
berichten, dass eine einzelne Fehlpaarung ein Nucleotid vom 3'-Terminus (N-1),
zwei Nucleotide vom 3'-Terminus
(N-2) oder drei Nucleotide vom 3'-Terminus (N-3) entfernt
keine Auswirkungen auf die Effizienz der Amplifikation durch PCR hatte.
C. R. Newton et al. (1989, Nucl. Acids Res. 17: 2503-2516) berichten über eine
Verbesserung der PCR zur Analyse einer beliebigen bekannten Mutation
bei genomischer DNA. Das System wird als "Amplification Refractory Mutation System" oder ARMS bezeichnet
und verwendet einen allelspezifischen PCR-Primer. Das 3'-terminale Nucleotid des PCR-Amplifikationsprimers
ist allelspezifisch und wird daher bei der PCR nicht als Amplifikationsprimer
wirken, wenn es mit dem Ziel fehlgepaart ist. Die Autoren berichten
außerdem,
dass in einigen Fällen
zusätzliche
Fehlpaarungen nahe dem 3'-Terminus
des Amplifikationsprimers die Alleldiskriminierung verbessern.
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WO-A-0062036
und WO-A-0061816 offenbaren Verfahren zur Multiplex-Amplifikation,
-Detektion und -Analyse von Nucleinsäuresequenzen, bei denen Einzelbasen-Polymorphismen
mittels allelspezifischer SDA-Detektorprimer mit einem 3'-terminalen diagnostischen Nucleotid
unterschieden werden.
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EP-A-0881302
offenbart ein Verfahren zum Nachweis einer Nucleinsäurezielsequenz
mittels eines Detektor-Oligonucleotids, das eine einzelsträngige Zielbindungssequenz
und eine an die Zielbindungssequenz angrenzende intramolekular basengepaarte
Sekundärstruktur
umfasst, wobei zunehmende Fehlpaarungen innerhalb des Detektor-Oligonucleotids
entsprechend geringere Fluoreszenzveränderungen erzeugen.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung
von Sequenzvariationen in einer Nucleinsäuresequenz von Interesse mittels
eines Detektorprimers bereit. Der Detektorprimer hybridisiert an
die Sequenz von Interesse und wird durch Polymerase verlängert, wenn
das 3'-Ende effizient mit dem
Ziel hybridisiert. Diese Verfahren eignen sich besonders gut für den Nachweis
und die Identifizierung einzelner Nucleotidunterschiede zwischen
der untersuchten Zielsequenz (z.B. ein mutantes Allel eines Gens)
und einer zweiten Nucleinsäuresequenz
(z.B. ein Wildtyp-Allel für
das gleiche Gen), da sie Nucleotidfehlpaarungen am oder nahe dem
3'-Ende des Detektorprimers
nutzen, um zwischen einem ersten Nucleotid und einem zweiten Nucleotid,
das an dieser Stelle in dem Ziel vorkommen könnte, zu unterscheiden. Es
hat sich gezeigt, dass die verringerte Effizienz der Primerverlängerung
durch DNA-Polymerasen, wenn ein oder mehrere Nucleotide am oder
nahe dem 3'-Terminus
eines Primers nicht effizient mit dem Ziel hybridisieren, als Mittel
zur Unterscheidung oder Identifizierung eines Nucleotids in dem
Ziel genutzt werden kann, das sich an der Stelle befindet, wo das
eine oder die mehreren Nucleotide des Detektorprimers hybridisieren.
Die Effizienz der Verlängerungsreaktion
für einen
an ein ausgewähltes
Ziel hybridisierten ausgewählten
Detektorprimer wird durch Ermittlung der in der Verlängerungsreaktion
erzeugten relativen Menge an verlängertem Detektorprimer überprüft.
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BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1A, 1B, 1C, 1D und 1E zeigen
die Ergebnisse von Beispiel 1 für
den Nachweis und die Identifizierung von SNPs mittels eines Modellzielsystems
und eines Detektorprimers mit einem diagnostischen 3'-terminalen Nucleotid
und einer nichtdiagnostischen Fehlpaarung bei N-3.
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2A, 2B, 2C, 2D und 2E zeigen
die Ergebnisse von Beispiel 2 für
den Nachweis und die Identifizierung von SNPs mittels eines Modellzielsystems
und eines Detektorprimers mit einem diagnostischen Nucleotid bei
N-1 und ohne nichtdiagnostische Fehlpaarung.
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3A, 3B und 3C zeigen
die Ergebnisse von Beispiel 3 für
die simultane Echtzeit-Detektion und -Identifizierung zweier Allele
von Exon 4 des HFE-Gens.
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4A, 4B und 4C zeigen
die Ergebnisse von Beispiel 4 für
die simultane Echtzeit-Detektion und -Identifizierung zweier Allele
von Exon 2 des HFE-Gens.
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5 erläutert einen
möglichen
Mechanismus für
die Erzeugung falsch-positiver Signale, wenn mehrere Detektorprimer
in einer Amplifikationsreaktion die gleiche 5'-Schwanzsequenz aufweisen.
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6 zeigt
die Ergebnisse von Beispiel 5, das die Leistung mehrerer Detektorprimer
in Reaktionen vergleicht, wenn die mehreren Detektorprimer die gleichen
oder unterschiedliche 5'-Schwanzsequenzen
aufweisen.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
Verfahren der Erfindung sind für
den Nachweis von Varianten einer in einer Zielnucleinsäure enthaltenen
Nucleinsäuresequenz
brauchbar. Insbesondere sind die Verfahren der Erfindung darauf
gerichtet, Einzelnucleotid-Polymorphismen (SNPs) in einer Nucleinsäuresequenz
von Interesse (z.B. Allele) nachzuweisen und wahlweise solche SNPs
oder Allele zu identifizieren. Solche Nucleotidsequenzvarianten
können
während
der Amplifikation der Zielsequenz in einer zu analysierenden Probe
direkt nachgewiesen werden. Die erfindungsgemäßen Verfahren beruhen auf der
relativen Ineffizienz der Primerverlängerung durch DNA-Polymerasen,
wenn an oder nahe dem 3'-Ende eines Primers,
der an eine sonst komplementäre
Sequenz hybridisiert hat, Fehlpaarungen vorliegen. Die Anmelder
haben festgestellt, dass, wenn die Nucleotide an oder nahe dem 3'-Ende eines Detektorprimers derart gewählt werden,
dass ein oder mehrere Fehlpaarungen auftreten, wenn der Detektorprimer
an ein erstes Allel einer Zielnucleinsäure hybridisiert ist, und eine
korrekte Basenpaarung erfolgt, wenn der Detektorprimer an ein zweites
Allel der Zielnucleinsäure
hybridisiert ist, der Unterschied in der Effizienz der Polymeraseverlängerung
bei Hybridisierung des Detektorprimers an die zwei verschiedenen Allele
dazu genutzt werden kann, anzuzeigen, welches Allel die Zielnucleinsäure enthält. Wenn
irgendeines von mehreren Allelen vorliegen könnte, werden mehrere Detektorprimer
bei der Analyse verwendet, jeder mit einer anderen potentiellen
Fehlpaarung an oder nahe dem 3'-Ende.
Der Detektorprimer, der am effizientesten verlängert wird, liefert die Identität des Allels
(d.h. die Identität
des in der analysierten Zielsequenz vorhandenen Nucleotids). wenn
zum Beispiel ein Satz von Detektorprimern, die A, G, C und T an
der Stelle des zu identifizierenden Allels enthalten, an das Ziel
von Interesse hybridisiert und verlängert wird, wird die Identität des Allels
dem Komplement des Nucleotids in dem Signalprimer entsprechen, der
am effizientesten durch die Polymerase verlängert wurde. Zur Identifizierung
des Allels in einer einzigen Reaktion, sind mehrere Detektorprimer
in der Reaktion anwesend, und jeder Detektorprimer ist mit einem
einzeln nachweisbaren Marker verbunden (z.B. verschiedenen Fluorophoren,
die in dem Gemisch von Detektorprimern voneinander unterschieden werden
können).
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Genauer
gesagt sind die Detektorprimer der Erfindung Oligonucleotide, die
an die Zielsequenz von Interesse hybridisieren und während der
isothermen Amplifikationsreaktion durch DNA-Polymerase verlängert werden.
Die Nucleotidsequenz des Detektorprimers wird so gewählt, dass
er spezifisch an die Zielnucleinsäure von Interesse hybridisiert
und der überwiegende
Teil des Detektorprimers in typischer Watson-Crick-Manier korrekt mit dem Ziel basenpaart.
Jedoch wird die Nucleotidsequenz des Detektorprimers an oder nahe
dem 3'-Ende derart
gewählt,
dass zwischen verschiedenen SNPs oder Allelen der Zielsequenz unterschieden
werden kann (diagnostische Nucleotidposition). Das diagnostische
Nucleotid wird als das Nucleotid in dem Detektorprimer definiert,
welches eine Analyse (z.B. Vorhandensein oder Identifizierung) eines
bestimmten Allels in einem ausgewählten Ziel gestattet. Das heißt, die
Sequenz des 3'-Endes
des Detektorprimers wird so gewählt, dass
eine Hybridisierung mit einer ersten einzelnen Nucleotidvariation
der Zielsequenz (z.B. einem Wildtyp- oder einem mutanten Allel eines
Gens) zu einer korrekten Watson-Crick-Basenpaarung
an dem Ort des SNP führt
und eine Hybridisierung des Detektorprimers mit einem Ziel, das
eine zweite einzelne Nucleotidvariation der Zielsequenz an dem gleichen
Ort enthält,
(z.B. einem zweiten mutanten Allel des Gens) zu einer Fehlpaarung
zwischen dem Detektorprimer und dem Ziel führt. Ein Beispiel dafür, wie Fehlpaarungen
in dem Primer eine Alleldiskriminierung in Amplifikationsreaktionen
ermöglichen:
Wenn ein Detektorprimer mit einem C-Rest an der diagnostischen Nucleotidposition
ein starkes Signal erzeugt, das eine effiziente Verlängerung
des Detektorprimers anzeigt, deutet dies darauf hin, dass das Zielallel
G ist. Ein schwaches Signal für
den verlängerten
Detektorprimer zeigt dagegen, dass das Zielallel nicht G ist. Die
Verwendung eines einzigen Detektorprimers zur Analyse ermöglicht die
Identifizierung eines Allels, wenn erwartet wird, dass nur ein SNP
in dem Ziel auftritt. Wenn an der gleichen Nucleotidposition mehrere
verschiedene Allele vorliegen können,
wird ein einzelner Detektorprimer Informationen über das Vorhandensein oder
Nichtvorhandensein des Allels, für
das der Detektorprimer diagnostisch ist, liefern. Um das Allel zu
identifizieren, wenn mehrere SNPs möglich sind, können mehrere
Detektorprimer, die A, T und G am Ort des SNP enthalten, zur Identifizierung
des Allels in dem Ziel verwendet werden, d.h., der Detektorprimer,
der ein starkes Signal in Verbindung mit dem Detektorprimer-Verlängerungsprodukt
erzeugt, enthält
das Nucleotid, welches das Komplement des SNP in dem Ziel ist. Bei
der vorliegenden Erfindung wird das potentiell fehlgepaarte Nucleotid
des Detektorprimers etwa ein bis zwei Nucleotidreste von dem 3'-Terminus entfernt angeordnet (d.h. bei
der Position N-1 oder N-2).
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Außerdem wurde
unterwartet festgestellt, dass es in vielen Fällen wünschenswert ist, eine zweite Fehlpaarung
in der Sequenz des Detektorprimers anzuordnen, die nicht auf einen
Nachweis oder eine Identifizierung des Allels von Interesse gerichtet
ist. Die zweite, nichtdiagnostische Fehlpaarung verbessert oft den Grad
der Diskriminierung zwischen den nachgewiesenen oder identifizierten
SNPs und wird vorzugsweise auf Basis einer Region der Zielsequenz
gewählt,
bei der keine Variation zu erwarten ist, so dass die nichtdiagnostische
Fehlpaarung unabhängig
von dem analysierten Zielallel erfolgen wird. Die zweite Fehlpaarung
kann an jedem Ort innerhalb des Detektorprimers auftreten, der einen
positiven Effekt auf die Alleldiskriminierung ausübt, erbringt
jedoch die größte Verbesserung,
wenn sie sich nahe am diagnostischen Nucleotid befindet. Dies ist
typischerweise innerhalb von einem bis fünfzehn Nucleotiden vom diagnostischen
Nucleotid, vorzugsweise jedoch innerhalb von etwa 1-5 Nucleotiden
vom diagnostischen Nucleotid des Detektorprimers der Fall. Aufgrund
der Beobachtung, dass mit zunehmender Entfernung der nichtdiagnostischen
Fehlpaarung von der diagnostischen Fehlpaarung ihre positive Auswirkung
auf die Alleldiskriminierung abnimmt, glauben die Anmelder, dass
die zweite, nichtdiagnostische Fehlpaarung eher einen Positionseffekt
als eine allgemeine Wirkung auf die Tm des
Detektorprimers ausübt.
Fachleute sind in der Lage, durch Routineexperimente die geeignete Anordnung
der nichtdiagnostischen Fehlpaarung in einem Detektorprimer durch
Evaluierung ihrer Wirkung auf die Alleldiskriminierung mittels des
Detektorprimers zu bestimmen.
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Obwohl
bekannt ist, dass eine Fehlpaarung in einem kürzeren Oligonucleotid eine
größere Auswirkung
auf die Hybridisierung zeigen wird als eine Fehlpaarung in einem
längeren
Oligonucleotid, kann die Alleldiskriminierung mittels der Detektorprimer
der Erfindung nicht völlig
einem Tm-assoziierten
Hybridisierungseffekt zugeschrieben werden. Wird zum Beispiel die
Position des diagnostischen Nucleotids vom 3'-Ende
des Detektorprimers weg zur Mitte des Moleküls hin verschoben, verringert
sich die Diskriminierung beträchtlich. Wenn
der einzige Mechanismus der Diskriminierung zwischen Allelen eine
Tm-assoziierte Hybridisierungseffizienz
wäre, sollte
die Umpositionierung Alleldiskriminierung eher erhöhen statt
verringern. wir haben das Gegenteil beobachtet, d.h., dass die beste
Alleldiskriminierung erfolgt, wenn sich das diagnostische Nucleotid nahe
dem 3'-Ende des
Detektorprimers befindet. Zudem haben wir beobachtet, dass Detektorprimer,
die eine diagnostische Fehlpaarung, welche sich nicht an dem 3'-Terminus befindet, und eine zusätzliche
nichtdiagnostische Fehlpaarung wie unten beschrieben enthalten,
eine gute Alleldiskriminierung bei relativ längeren Detektorprimern gewährleisten,
wo zu erwarten ist, dass einfache Unterschiede in der Hybridisierungseffizienz
zwischen gepaarten und fehlgepaarten Detektorprimern minimal sind.
Die Tatsache, dass das nichtdiagnostische Nucleotid die Diskriminierung
verbessert, wenn es sich nahe dem diagnostischen Nucleotid befindet,
und eine geringe Wirkung zeigt, wenn es mehr als fünfzehn Nucleotide
entfernt angeordnet ist, deutet ebenfalls darauf hin, dass neben
einer Modifizierung der Hybridisierungseffizienz zusätzliche
Faktoren an der erfindungsgemäßen Alleldiskriminierung
beteiligt sind.
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Die
Detektorprimer der Erfindung sind typischerweise etwa 12-50 Nucleotide
lang. Wenn nur ein diagnostisches Nucleotid vorhanden ist, ist der
Detektorprimer vorzugsweise etwa 12-24 Nucleotide lang, bevorzugter
etwa 12-19 Nucleotide lang. Für
Detektorprimer, die sowohl ein diagnostisches als auch ein nichtdiagnostisches
Nucleotid enthalten, werden Längen
von etwa 12-50 Nucleotiden bevorzugt, stärker bevorzugt von 15-36 Nucleotiden
und meistbevorzugt von 18-24 Nucleotiden.
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Die
Detektorprimer können
auf vielfältige
Weise in den isothermen Amplifikationsverfahren der Erfindung zum
Einsatz kommen. Bei einer ersten Ausführungsform kann der Detektorprimer
ein Amplifikationsprimer zur Verwendung in einer Nucleinsäure-Amplifikationsreaktion
sein. Das heißt,
der Detektorprimer kann in der Amplifikationsreaktion zwei Funktionen
erfüllen – Amplifikation
der Zielsequenz von Interesse und Nachweis oder Identifizierung
von SNPs innerhalb der Zielsequenz (ein "Detektor-/Amplifikationsprimer"). Die Struktur und
Funktion von Amplifikationsprimern für SDA, 3SR, NASBA, TMA und
andere isotherme Amplifikationsreaktionen sind auf dem Fachgebiet
wohlbekannt, und es gehört
zum durchschnittlichen Fachwissen, diese Amplifikationsprimer für die Verwendung
als Detektorprimer in der vorliegenden Erfindung durch die hierin
gelehrte Wahl der 3'-Nucleotidsequenz anzupassen.
Für eine
PCR sind keine speziellen Sequenzen oder Strukturen beim Amplifikationsprimer
erforderlich, um die Amplifikationsreaktion anzutreiben. Aus diesem
Grund bestehen Amplifikationsprimer für PCR gewöhnlich nur aus Zielbindungssequenzen.
Bei anderen Amplifikationsreaktionen jedoch umfassen die Amplifikationsprimer
spezialisierte Sequenzen und Strukturen, die für den Ablauf der Amplifikationsreaktion
notwendig sind. Zum Beispiel enthalten Amplifikationsprimer für 3SR und
NASBA einen RNA-Polymerasepromotor
nahe dem 5'-Ende.
Der Promotor ist an die Zielsequenz angehängt und dient dazu, die Amplifikationsreaktion
anzutreiben, indem er die Transkription mehrfacher RNA-Kopien des Ziels
steuert. Amplifikationsprimer für
SDA enthalten eine Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuclease nahe
dem 5'-Ende. Die
Restriktionsstelle ist an die Zielsequenz angehängt und wird während der
Amplifikationsreaktion hemimodifiziert und doppelsträngig. Nicking
der Restriktionsstelle, sobald sie doppelsträngig geworden ist, treibt die
SDA-Reaktion an, indem die Synthese und Verdrängung mehrfacher Kopien des
Ziels durch Polymerase ermöglicht
wird.
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Wenn
der Detektor-/Amplifikationsprimer eine Fehlpaarung mit dem Ziel
an oder nahe seinem 3'-Ende ausbildet,
ist die Amplifikationseffizienz verringert und die begleitende Signalabnahme
beim Nachweis des verlängerten
Detektor-/Amplifikationsprimers
(d.h. des Amplifikationsprodukts oder Amplikons) zeigt das Vorhandensein
oder die Identität
eines SNP an der Nucleotidposition in dem Ziel, wo die diagnostische
Fehlpaarung mit dem Detektor-/Amplifikationsprimer stattgefunden
hat. Wenn der Detektor-/Amplifikationsprimer mit einer Markierung
versehen ist, die (wie unten erörtert)
eine Signalveränderung
bewirkt, wenn der Detektor-/Amplifikationsprimer
verlängert
worden ist, können
die Verlängerungsprodukte
während
der Amplifikation des Ziels in Echtzeit nachgewiesen werden, wodurch
die zusätzlichen
Schritte einer postamplifikatorischen Detektion von Verlängerungsprodukten
entfallen. Bei isothermen Amplifikationsreaktionen wie SDA kann
eine einzelne Fehlpaarung bei N-1 oder N-2 in dem Detektor-/Amplifikationsprimer
im Allgemeinen eine effizientere Alleldiskriminierung erbringen
als eine einzelne Fehlpaarung am 3'-Terminus. Daher wird eine 3'-terminale Fehlpaarung nicht
bevorzugt, wenn der Detektorprimer ein Amplifikationsprimer für eine isotherme
Amplifikationsreaktion ist. Dies steht im Gegensatz zur Lehre des
bisherigen Stands der Technik für
Amplifikationsreaktionen mit Temperaturzyklierung, wo eine 3'-terminale Fehlpaarung
auf dem PCR-Amplifikationsprimer wie berichtet eine ausreichende
Alleldiskriminierung lieferte (siehe Kwok et al., oben). Ebenfalls
im Gegensatz zur Lehre des bisherigen Stands der Technik für PCR führen indes
bei den isothermen Amplifikationsverfahren der vorliegenden Erfindung
eine Fehlpaarung auf dem Detektor-/Amplifikationsprimer bei N-1
bis N-4 und ein komplementäres 3'-terminales Nucleotid
zu einer ausgezeichneten Alleldiskriminierung, insbesondere dann,
wenn die fakultative zweite nichtdiagnostische Fehlpaarung miteingeschlossen
wird. Diese Ausführungsform
wird daher für
Detektor-/Amplifikationsprimer der Erfindung bevorzugt.
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Bei
einer alternativen bevorzugten Ausführungsform wird der Detektorprimer
in einer isothermen Amplifikationsreaktion als Signalprimer (auch
als Detektorsonde bezeichnet) verwendet, wie dies in der
US 5,547,861 gelehrt wird,
deren Offenbarung hiermit durch Verweisung einbezogen wird. In der
Amplifikationsreaktion hybridisiert der Signalprimer an die Zielsequenz
stromabwärts
von einem Amplifikationsprimer, so dass die Verlängerung des Amplifikationsprimers
den Signalprimer und sein Verlängerungsprodukt
verdrängt. Nach
der Verlängerung
umfasst der Signalprimer die stromabwärtige Sequenz, welche die Hybridisierungsstelle
für den
zweiten Amplifikationsprimer darstellt. Der zweite Amplifikationsprimer
hybridisiert an den verlängerten
Signalprimer und primt die Synthese seines Komplementärstrangs.
Die Erzeugung dieser doppelsträngigen
sekundären
Amplifikationsprodukte kann nicht nur als ein Hinweis auf die Anwesenheit
der Zielsequenz detektiert werden, sondern ein Signalprimer, der
die Sequenzmerkmale eines Detektorprimers aufweist, (ein Detektor-/Signalprimer) erleichtert
bei den Verfahren der Erfindung auch den Nachweis und/oder die Identifizierung
von SNPs innerhalb der Zielsequenz. Bei dieser Ausführungsform
erbringt eine diagnostische Fehlpaarung an entweder N-1 oder N-2
eine ausgezeichnete Alleldiskriminierung. Die Alleldiskriminierung
wird weiterhin verbessert bei Verwendung einer zweiten nichtdiagnostischen
Fehlpaarung, wie sie zuvor beschrieben wurde, insbesondere bei Verwendung
längerer
Detektorprimer, wo der Unterschied in der Hybridisierungseffizienz
zwischen gepaarten und fehlgepaarten Detektorprimern gering ist.
Diese Erkenntnis war unerwartet, da bei Detektor-/Amplifikationsprimern eine 3'-terminale diagnostische
Fehlpaarung allein eine schlechte Alleldiskriminierung erbrachte.
Die Verwendung eines Detektor-/Signalprimers in einer isothermen
Amplifikationsreaktion ermöglicht
auch die Detektion von Verlängerungsprodukten
und die Analyse von SNPs in Echtzeit (d.h. gleichzeitig mit der
Amplifikation), wenn der Detektor-/Signalprimer mit einer Reportergruppe
markiert ist, die eine nachweisbare Veränderung beim Signal hervorruft,
wenn der Detektor-/Signalprimer verlängert wird. Alternativ kann
der Detektor-/Signalprimer nach oder ohne Amplifikation des Ziels
für den
Nachweis von SNPs Verwendung finden. Bei dieser Ausführungsform
wird der Detektor-/Signalprimer an das Ziel stromabwärts von einem
beliebigen Primer hybridisiert, der durch Polymerase verlängerbar
ist, so dass eine Verlängerung
des zweiten Primers den Detektor-/Signalprimer und jegliche Detektor-/Signalprimer-Verlängerungsprodukte,
die gegebenenfalls erzeugt worden sind, verdrängt.
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Die
Anmelder nehmen an, dass die andersartigen Ergebnisse, die mit einer
diagnostischen Fehlpaarung am 3'-Terminus
eines Detektor-/Signalprimers im Gegensatz zu einer diagnostischen
Fehlpaarung am 3'-Terminus
eines Detektor-/Amplifikationsprimers
erhalten wurden, wenigstens teilweise auf einen kinetischen Effekt
zurückzuführen sind.
Wenn ein Signalprimer an einem Ziel, an das er hybridisiert ist,
nicht effizient verlängert
wird (z.B., wenn er Fehlpaarungen enthält), wird er schnell durch
Verlängerung
des stromaufwärtigen Amplifikationsprimers
von der Matrize verdrängt
werden. Wenn der Signalprimer effizient verlängert wird, wird die Verlängerung
erfolgen, bevor der Signalprimer von dem Ziel verdrängt wird.
Das heißt,
der stromaufwärtige Amplifikationsprimer
(der typischerweise perfekt gepaart ist und effizient verlängert wird)
setzt dem Detektor/Signalprimer ein "Zeitlimit" für
die Verlängerung.
Im Gegensatz dazu hat der Amplifikationsprimer in einer isothermen
Amplifikationsreaktion typischerweise kein Zeitlimit für die Verlängerung,
das ihm durch zusätzliche Komponenten
der isothermen Amplifikationsreaktion oder durch Thermozyklierung
auferlegt wird. Daher kann ein Detektor-/Amplifikationsprimer bei
genügend
zur Verfügung
stehender Zeit letztendlich verlängert
werden, auch wenn die Verlängerungsreaktion
ineffizient ist. Dieses Phänomen
könnte
die Diskriminierung zwischen Allelen verringern, wenn ein Detektor-/Amplifikationsprimer
mit einer 3'-terminalen
Fehlpaarung in isothermen Amplifikationsreaktionen verwendet wird.
Jedoch kann vor der Amplifikation ein Zeitlimit gesetzt werden,
wenn, wie in US-Patent Nr. 5,270,184 beschrieben, ein zweiter Primer
stromaufwärts
vom Amplifikationsprimer bindet (z.B. der "externe" oder "Bumper"-Primer).
In diesem Fall setzt die Verlängerung
des stromaufwärtigen
Primers ein Zeitlimit für
die Verlängerung
des Amplifikationsprimers. Wenn die Verlängerung des Amplifikationsprimers durch
eine Fehlpaarung an oder nahe dem 3'-Ende verlangsamt ist, kann der Amplifikationsprimer
durch Elongation des stromaufwärtigen
Primers verdrängt
werden, bevor er verlängert
ist. Es ist zu erwarten, dass dieser kinetische Effekt die Fähigkeit
von Amplifikationsprimern, vor der Amplifikation zwischen gepaarten
und fehlgepaarten Zielen zu unterscheiden, erhöht, wenn ein stromaufwärtiger Primer
vorhanden ist, der sie verdrängt. Wenn
jedoch ein Mispriming erfolgt, kann die Fähigkeit von Amplifikationsprimern,
eine Fehlpaarung mit dem Ziel zu korrigieren, zu einem Amplifikationsprodukt
führen,
das keine getreue Kopie des originalen Ziels ist. Amplifikationsprimer
erzeugen Amplikons, die mit den Amplifikationsprimern, die sie erzeugen,
perfekt übereinstimmen,
wodurch die Grundlage der Alleldiskriminierung zerstört wird.
Bei Signalprimern erfolgt dagegen eine solche "Korrektur" nicht.
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Ob
die Hybridisierung des Detektorprimers zu einer korrekten Basenpaarung
oder zu einer Fehlpaarung an der diagnostischen Nucleotidposition
des analysierten Ziels führt,
wird durch Ermittlung der relativen Effizienz der Detektorprimerverlängerung
durch DNA-Polymerase bestimmt. Diese Bestimmung kann quantitativ
oder qualitativ sein. Detektorprimerverlängerung ist weniger effizient
bei Vorhandensein einer Fehlpaarung an oder nahe dem 3'-Ende und effizienter,
wenn das gesamte 3'-Ende
korrekt mit dem Ziel basengepaart ist. Das heißt, bei korrekter Basenpaarung
nahe dem 3'-Terminus
wird relativ mehr verlängertes
Detektorprimerprodukt erzeugt. Der verlängerte Detektorprimer wird
typischerweise anhand einer Markierung, die mit dem Detektorprimer
assoziiert ist, nachgewiesen. Wie auf dem Fachgebiet bekannt, kann
die Markierung direkt nachweisbar oder nur nach anschließender Reaktion
nachweisbar sein. Alternativ kann der Detektorprimer selbst unmarkiert
sein und wird das Verlängerungsprodukt
durch Hybridisierung an eine markierte Sonde oder in einer anschließenden Reaktion
wie einer Behandlung mit Ethidiumbromid zur Sichtbarmachung auf
einem Gel nachgewiesen. Die relative Menge an Signal von der Markierung,
die mit dem verlängerten
Detektorprimer assoziiert ist, verglichen mit der Menge an Signal,
die mit dem unverlängerten
Primer assoziiert ist, dient als Indikator für die Menge an erzeugtem Verlängerungsprodukt
und die Effizienz der Verlängerungsreaktion.
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Auf
dem Fachgebiet sind viele Techniken zur Bestimmung der Anwesenheit
oder Menge eines in der Amplifikationsreaktion erzeugten verlängerten
Detektorprimerprodukts bekannt. Zunächst einmal können die Verlängerungsprodukte
des Detektorprimers durch die ihre Größenzunahme nachgewiesen und/oder
quantifiziert. werden, zum Beispiel durch Abtrennung von unverlängertem
Detektorprimer durch Gelelektrophorese oder durch selektives Einfangen
des verlängerten
Detektorprimers auf einer Festphase. Bei einer bevorzugten Ausführungsform
sind jedoch die Detektorprimer mit einer Reportergruppe markiert,
die nur dann detektierbar ist, wenn der Detektorprimer verlängert wurde,
oder mit einer Markierung, die nur dann eine Signalveränderung erzeugt,
wenn der Detektorprimer verlängert
wurde. Ein Beispiel für
solche Markierungen sind Fluoreszenzfarbstoffe, die Veränderungen
in der Fluoreszenzpolarisation erfahren, wenn die Oligonucleotide,
an die sie gebunden sind, an eine Zielsequenz hybridisiert und daran
verlängert
wurden. Verfahren, die Veränderungen
in der Fluoreszenzpolarisation nutzen, um Hybridisierung und Verlängerung
eines Signalprimers nachzuweisen, sind in US-Patent Nr. 5,800,989,
US-Patent Nr. 5,593,867 und US-Patent Nr. 5,641,633 beschrieben.
Diese Patente beschreiben die Nutzung von Veränderungen in der Fluoreszenzpolarisation,
welche auftreten, wenn der Signalprimer doppelsträngig wird
(was durch seine erfolgreiche Verlängerung an der Zielsequenz
ermöglicht
wird) zum Nachweis von Zielamplifikation. Bei den Verfahren der
Erfindung können
Veränderungen
in der Fluoreszenzpolarisation eines fluoreszenzmarkierten Detektorprimers
dazu verwendet werden, die Verlängerungseffizienz
zu ermitteln und einen SNP in dem amplifizierten Ziel nachzuweisen
oder zu identifizieren.
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Ein
zweites Beispiel für
Markierungen, die eine nachweisbare Veränderung im Signal erfahren,
welche eine Primerverlängerung
anzeigt, sind fluoreszierende Donor-/Quencher-Farbstoffpaare. Der Quencherfarbstoff
kann ebenfalls fluoreszierend sein, muss es aber nicht. Wenn sich
der Donor und der Quencher in enger Nachbarschaft befinden, wird
die Fluoreszenz des Donors gequencht. Mit zunehmender Entfernung
der Farbstoffe wird das Quenching verringert und steigt die Donorfluoreszenz
an. Die Verwendung solcher Donor-/Quencher-Farbstoffpaare in verschiedentlichen
Mechanismen zur Vergrößerung der
Entfernung zwischen den Farbstoffen in Gegenwart von Ziel zum Nachweis
von Zielnucleinsäuren
ist in US-Patent Nr. 5,846,726, US-Patent Nr. 5,691,145 und
EP 0 881 302 beschrieben.
Es wird sowohl die Verwendung von Donor-/Quencher-Farbstoffpaaren in
Signalprimer-Amplifikationssystemen als auch in verlängerbaren
Primer/Sonden zum Nachweis von unamplifizierten oder postamplifikatorischen
Zielen offenbart. Bei der vorliegenden Erfindung können die
Detektorprimer der Erfindung mit Donor-/Quencher-Farbstoffpaaren
markiert sein und zum Nachweis und/oder zur Identifizierung von
SNPs in dem Ziel verwendet werden, wie dies auf dem Fachgebiet bekannt
ist.
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Wie
in den vorstehenden Verweisungen offenbart, sind eine Vielzahl verschiedener
Primerverlängerungsnachweissysteme
zur Verwendung in grundsätzlich
jeder Nucleinsäure-Amplifikationsreaktion
bekannt. Sie eignen sich besonders gut für isotherme Amplifikationsreaktionen,
wo sie eine schnelle Echtzeit-Detektion der Primerverlängerung
gewährleisten.
Bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung können Detektorprimer mit Strukturen
markiert werden, die fluoreszierende Reportergruppen enthalten,
wie sie in den vorstehenden Verweisungen gelehrt werden, und kann
das Verlängerungsprodukt
durch Veränderungen
in der Fluoreszenzpolarisation oder im Fluoreszenzquenching nachgewiesen
werden. Alternativ kann der Detektorprimer unmarkiert sein und sein
Verlängerungsprodukt,
wie in diesen Verweisungen gelehrt, durch Hybridisierung. an eine markierte
Primer/Sonde mittels Nachweis von Veränderungen in der Fluoreszenzpolarisation
oder im Fluoreszenzquenching der Primer/Sonde detektiert werden.
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BEISPIEL 1
-
Um
die Identifizierung eines Einzelnucleotid-Polymorphismus mittels markierter Detektorprimer
zu zeigen, wurden Modellzieloligonucleotide, die sich in nur einem
einzigen Nucleotid unterschieden, folgendermaßen hergestellt: Es wurden
vier Oligonucleotide synthetisiert, die außer an einer Position identische
Sequenzen enthielten. Die variante Position des Oligonucleotids
enthielt entweder Adenosin (A), Cytosin (C), Guanin (G) oder Thymin
(T). Es wurde außerdem
ein fünftes
Oligonucleotid synthetisiert, das komplementär zu den 3'-Termini der vier varianten Oligonucleotide
war. Jedes der vier varianten Oligonucleotide wurde mit dem fünften Oligonucleotid
gemischt, 2 min in einem kochenden Wasserbad erhitzt und in einem
Trockenschrank auf 37°C äquilibriert.
Das variante Oligonucleotid und das fünfte Oligonucleotid, die annealt
worden waren, wurden dann in einer Primerverlängerungsreaktion mit 14 mM
Desoxycytidin-α-(O-1- thio)-triphosphat,
2 mM Desoxyadenosintriphosphat, 2 mM Desoxyguanosintriphosphat,
2 mM Thymidintriphosphat und 40 Einheiten exonucleasefreier Klenow-DNA-Polymerase
verlängert.
Man ließ die
Primerverlängerungsreaktionen
45 min bei 37°C
ablaufen, worauf die Klenow-Polymerase durch 10-minütige Inkubation
der Reaktionen bei 70°C
in einem Trockenschrank inaktiviert wurde. Dies erzeugte vier doppelsträngige DNA-Modellzielsequenzen,
die sich nur an einer Nucleotidposition unterschieden. Die Ziele
wurden als A-, C-, G- und T-Ziele bezeichnet.
-
Es
wurde außerdem
ein zweiter Satz von vier Oligonucleotiden, die mit ihren 3'-Termini an der polymorphen
Nucleotidposition an die Modellzielsequenzen hybridisierten, zur
Verwendung als Detektorprimer synthetisiert. Jeder der vier Detektorprimer
wies eine der vier Nucleotidbasen (A, C, G oder T) an seinem 3'-Terminus (N, das
diagnostische Nucleotid) auf sowie ein "A"-Nucleotid
an der Position drei Basen vom 3'-Terminus, das eine
Fehlpaarung mit der Modellzielsequenz ausbildete (N-3, das nichtdiagnostische
Nucleotid). Die vier Detektorprimer wurden in 25-μl-Reaktionen
mit 1 μM
Detektorprimer, 25 Einheiten T4-Polynucleotidkinase (PNK), 175 μCi α- [32P] -Adenosintriphosphat (32P-ATP)
und PNK-Puffer von 1X-Konzentration
radioaktiv markiert. Die Markierungsreaktionen wurden durch Zugabe
von PNK zu einer Lösung,
welche die anderen Komponenten enthielt, gestartet. Die Reaktionen
wurden 20 min bei 37°C
inkubiert, dann 5 min in einem kochenden Wasserbad erhitzt, um die
PNK zu inaktivieren.
-
Die
Detektorprimer wurden in den Amplifikationsreaktionen als Signalprimer
verwendet. Für
jedes Ziel wurde ein 5-μl-Aliquot jeder der
markierten Detektorprimer-Präparationen
einer gesonderten SDA-Reaktion zugesetzt (50 μl, die 40 mM KH2PO4/K2HPO4 pH
7,6; 10% v/v Glycerol; 7, 5 mM Magnesiumacetat; 0,5 μM von jedem
Amplifikationsprimer; 1,4 mM Desoxycytidin-α-(O-1-thio)-triphosphat; 0,5 mM Desoxyadenosintriphosphat;
0,5 mM Desoxyguanosintriphosphat; 0,5 mM Thymidintriphosphat; 0,1
mg/ml Rinderserumalbumin; 0,5 μg
humane Plazenta-DNA, 104 A-, C-, G- oder
T-Ziel-DNA-Moleküle;
100 nM radioaktiv markierten Detektorprimer; 160 Einheiten BsoBI-Restriktionsendonuclease und
25 Einheiten Bst-DNA-Polymerase, großes Fragment, enthielten).
Die SDA-Reaktionen wurden ohne BsoBI und Bst zusammengemischt, und
die Ziel-DNA-Duplexe wurden durch 3-minütiges
Erhitzen dieser Reaktionsgemische in einem kochenden Wasserbad denaturiert.
Die Reaktionsgemische wurden in einem Trockenschrank 3 min auf 55°C äquilibriert,
und die SDA wurde durch Zugabe von 160 Einheiten BsoBI und 25 Einheiten
Bst-Polymerase (großes Fragment) zu
jeder Reaktion (Gesamtvolumen der Enzyme betrug 2 μl, eingestellt
mit 50% v/v Glycerol) gestartet. Man ließ die SDA 30 min bei 55°C ablaufen.
Während
der Reaktion wurden in 5-minütigen
Intervallen Aliquots jeder Reaktion (5 μl) entnommen und 5 μl einer Sequenzierungsstopplösung zugesetzt,
um die SDA-Reaktion zu stoppen. Als sämtliche Proben gesammelt waren,
wurden sie 3 min in einem kochenden Wasserbad inkubiert, und 5 μl jeder Probe
wurden auf ein 8%-Polyacrylamid-7M-Harnstoff-Sequenziergel geladen.
Nach 50-minütiger
Elektrophorese bei 65 W wurden die radioaktiv markierten Reaktionsprodukte
und unreagierte Sonde auf dem Gel quantifiziert, indem eine Molecular
Dynamics PhosphorimagerTM-Platte 15 min mit
dem Gel exponiert wurde und mittels ImageQuantTM-Software
die Zahl der Zählimpulse
ermittelt wurde, die in den Banden von radioaktiv markiertem Produkt
und Sonde auf der PhosphorimagerTM-Platte
vorhanden waren.
-
1A, 1B, 1C und 1D zeigen
die Ergebnisse, die für
die Verlängerung
jedes der vier Detektorprimer an jedem der vier verschiedenen Modellzielsequenzen
erhalten wurden. In jedem Fall wurde der Detektorprimer mit dem
3'-Nucleotid, welches
das korrekte Gegenstück
zum polymorphen Nucleotid in der Ziel-DNA-Sequenz darstellte, während der
SDA durch die DNA-Polymerase im Vergleich zum Detektorprimer, der
nicht das korrekte 3'-Gegenstück zum polymorphen
Nucleotid in dem Ziel enthielt, bevorzugt verlängert, wie durch die größeren Mengen
des richtigen Detektorprimers nach der Amplifikation belegt ist.
Zum Beispiel wurde der 3'A-Detektorprimer
nur in den SDA-Reaktionen,
welche die T-Zielsequenz enthielten (1A), bevorzugt
verlängert.
Es erfolgte im wesentlichen keine Verlängerung des 3'A-Detektorprimers
an den C-, G- oder A-Zielsequenzen.
Verlängerungsprodukte,
die während
der SDA erzeugt worden waren, umfassten vollständige verlängerte radioaktiv markierte
DNA-Sonden und die für
SDA typischen genickten verlängerten
Amplikons. Desgleichen förderte
das T-Ziel wenig
oder keine Verlängerung
der 3C-, 3G- und 3T-Detektorprimer (1B, 1C und 1D). Ähnliche
Ergebnisse waren bei Verwendung jedes der anderen Detektorprimer in
Zielamplifikationsreaktionen (3C-, 3G- und 3T-Detektorprimer, dargestellt
in 1B, 1C bzw. ID) zu sehen, d.h.,
der Detektorprimer wurde bevorzugt an demjenigen Ziel verlängert, das
zur korrekten 3'-Paarung
an der polymorphen Position in dem Ziel führte. wenn dagegen ein SDA-Amplifikationsprimer
mit einem C am 3'-Terminus
als Detektor-/Amplifikationsprimer in den Amplifikationsreaktionen
verwendet wurde, konnte das Allel nicht identifiziert werden (1E).
Diese Ergebnisse zeigen, dass erfindungsgemäße N/N-3-Detektor-/Signalprimer
in isothermen Amplifikationsreaktionen verwendet werden können, um
das an einer gewählten
Position in einer Zielnucleinsäuresequenz
vorhandene Nucleotid zu identifizieren, während N/N-3-Detektor-/Amplifikationsprimer
für isotherme
Amplifikationsreaktionen nicht effizient zwischen Allelen unterscheiden.
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BEISPIEL 2
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Beispiel
1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass die Detektor-/Signalprimer
derart synthetisiert wurden, dass das variante diagnostische Nucleotid
ein Nucleotid von dem 3'-Terminus des Detektorprimers (N-1)
angeordnet war und die Gesamtlänge
des Detektorprimers um 4 Nucleotide am 5'-Ende gekürzt war. Die Detektorprimer
bildeten außerdem
an der Position drei Nucleotide vom 3'-Terminus des Detektorprimers ein perfektes
Gegenstück
zur Ziel-DNA. Jeder der vier Detektorprimer wurde gesonderten SDA-Reaktionen
zugesetzt, die 104 Moleküle jeder der Zielsequenzen
enthielten. Die Ziele wurde amplifiziert und wie zuvor beschrieben
detektiert. 2A (-1A-Detektorprimer), 2B
(-1C-Detektorprimer), 2C (-1G-Detektorprimer)
und 2D (-1T-Detektorprimer) zeigen die Ergebnisse der Experimente.
In jedem Fall wurde der Detektorprimer während der Amplifikation bevorzugt
an demjenigen Ziel verlängert,
das das perfekte Gegenstück
an der varianten Position enthielt. Signale, die mit dem perfekt
gepaarten Detektorprimer und Ziel erhalten wurden, waren 30-bis 100-mal stärker als
Signals, die mit einem der fehlgepaarten Detektorprimer-/Ziel-Paare
erhalten wurden. Dieser Unterschied im Signal ermöglichte
eine eindeutige Identifizierung des polymorphen Nucleotids in dem
Ziel und steht im Gegensatz zu den Ergebnissen, die von Kwok et
al., oben, für
PCR berichtet wurden, wo eine N-1-Fehlpaarung keine Auswirkung auf
die Ausbeute an PCR-Amplikons hatte.
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Ähnliche
Ergebnisse wurden bei Verwendung eines Detektor-/Signalprimers erhalten, der ein diagnostisches
Nucleotid bei N-1 (G) und eine zweite nichtdiagnostische Fehlpaarung
mit den Zielen bei N-2 (A) aufwies. Dieser Detektorprimer war am
5'-Ende fünf Nucleotide
länger
als der in Beispiel 1 verwendete Detektorprimer. Der Detektorprimer
wurde jeder von vier gesonderten SDA-Reaktionen zugesetzt, die wie
in Beispiel 1 vorbereitet worden waren, und es zeigte sich, dass
er bevorzugt an demjenigen Ziel verlängert wurde, das das korrekte
Gegenstück
zum diagnostischen Nucleotid (C) enthielt. 2E zeigt,
dass das Signal, welches mit dem einfach fehlgepaarten Ziel erhalten
wurde, über
fünfmal
stärker
war als das mit einem der doppelt fehlgepaarten Zielen erhaltene
und dass das C-Allel leicht von den T-, G- und A-Allelen des Ziels
unterschieden werden konnte.
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BEISPIEL 3
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In
den folgenden Experimenten wurden mittels der Detektorprimer der
Erfindung ein Einzelnucleotid-Polymorphismus in Exon 4 des HFE-Gens
(des für
Hämochromatose
verantwortlichen Gens) und das Wildtyp-Allel gleichzeitig während der
Amplifikation in Echtzeit detektiert und identifiziert. Das Wildtyp-Allel
ist ein G bei Nucleotid 845, während
das mutante Allel ein A an dieser Position ist. Dies führt zu einem
Austausch von Cystein gegen Tyrosin an Aminosäureposition 282 im Protein.
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Die
SDA wurde größtenteils
wie in US-Patent 5,846,726 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass
jedes Reaktionsgemisch zwei erfindungsgemäße Detektor/Signalprimer enthielt
(einen für
das mutante Allel spezifischen und einen für das Wildtyp-Allel spezifischen)
und AvaI durch BsoBI ersetzt wurde. Die Endkonzentrationen an Komponenten
in jeder 100-μl-Reaktion
waren 50 mM KiPO4 (pH 7,5), 6,0 mM MgOAc,
jeweils 0,2 mM dTTP, dGTP, dATP, 1,4 mM dCTPαS, 5 μg/ml acetyliertes BSA, 15% (v/v)
Glycerol, 400 ng Lachssperma-DNA, 20 Einheiten exo- Klenow-Bst-Polymerase,
160 Einheiten BsoBI und entweder 0 oder 105 Kopien von
Ziel-DNA. In diesem Beispiel bestand Ziel-DNA aus PCR-Produkten,
die anhand von DNA erzeugt worden waren, welche aus entweder normaler
oder mutanter HFE-Exon-4-DNA
kloniert worden war. Normale HFE-Exon-4-DNA enthält ein G an Nucleotidposition
845 des HFE-Wildtyp-Gens und die mutante HFE-Exon-4-DNA enthielt
einen SNP an dieser Position, bei dem das Nucleotid A war. Jede
Probe enthielt außerdem
zwei Detektor-/Signalprimer (SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:2 unten),
zwei unmarkierte Bumper-Primer (SEQ ID NO:3 und SEQ ID NO:4 unten)
und zwei unmarkierte SDA-Amplifikationsprimer (SEQ ID NO:5 und SEQ
ID NO:6 unten). Unterstrichene Sequenzen bedeuten Komplementarität zur Zielsequenz.
Die Base A an Position N-3, die nicht unterstrichen ist, ist nicht
komplementär
zum entsprechenden Nucleotid in der Zielsequenz. Diese innere Fehlpaarung
verbessert die Selektivität
dieses Detektorprimers für
die Nucleotidposition 845. C* repräsentiert das 3'-terminale Nucleotid (Position N des
Detektorprimers), das mit dem G an Position 845 des Wildtyp-Ziels
paart. T* repräsentiert
das 3'-terminale
Nucleotid, das mit A an Nucleotidposition 845 des mutanten Ziels
(der G845A-Mutation) paart. Kursiv gedruckte Sequenzen repräsentieren
Restriktionsenzym-Erkennungsstellen (RERS). Bei den Amplifikationsprimern
liefert die RERS die Nickstelle, welche die SDA antreibt. Bei den
Detektorprimern wird die RERS von zwei Farbstoffen flankiert, die
ein Donor-/Quencher-Farbstoffpaar
bilden. Während
der Detektor-/Signalprimer
verlängert,
verdrängt
und doppelsträngig
gemacht wird, wird die RERS ebenfalls doppelsträngig und mit dem Restriktionsenzym
spaltbar. Um die Menge an doppelsträngigem Verlängerungsprodukt zu detektieren,
werden die Reaktionsprodukte mit dem entsprechenden Restriktionsenzym
behandelt, um die RERS des Detektorprimers zu spalten. Das Quenching
des Fluoreszenzfarbstoffs verringert sich, sobald die doppelsträngigen Produkte
gespalten werden und das Farbstoffpaar getrennt wird. Der Anstieg
in der Fluoreszenz ist ein Indikator für die erzeugte Menge an verlängertem, doppelsträngigem Detektorprimer.
Wenn der Detektorprimer nicht effizient verlängert wird, bleibt die RERS
einzelsträngig,
wird nicht von dem Restriktionsenzym gespalten, und der Fluoreszenzfarbstoff
bleibt gequencht. Ist kein Fluoreszenzanstieg nachweisbar, so zeigt
dies, dass der Detektorprimer an dem Ziel nicht effizient verlängert wurde.
SEQ
ID NO:1 – Detektorprimer,
spezifisch für
Nucleotid G an Position 845 (Wildtyp):
FAM-TC CTC GAG T(Dabcyl)AT GGG TGC TCC ACC AGG C* (300 nM)
SEQ ID NO:2 – Detektorprimer,
spezifisch für
Nucleotid A an Position 845 (Mutante):
Rox-TT CTC GAG T(Dabcyl)TA
CAT GGG TGC TCC ACC AGG T* (300 nM)
SEQ ID
NO:3 – erster
Bumper-Primer für
Exon 4:
CGA ACC TAA AGA CGT ATT CGG C (50 nM)
SEQ ID NO:4 – zweiter
Bumper-Primer für
Exon 4:
CCC CAA TAG ATT TTC TCA GCT CC (50 nM)
SEQ ID
NO:5 – erster
SDA-Amplifikationsprimer für
Exon 4:
ACC GCA TCG ATT GCA TGT CTC GGG CTG GAT ACC CTT GGC T
SEQ ID NO:6 – zweiter
SDA-Amplifikationsprimer für
Exon 4:
CGA TTC CGC TCC AGA CTT CTC GGG AGA TCA CAA TGA GGG GCT GA
-
Jede
SDA-Reaktion enthielt beide Detektorprimer, die, wie oben gezeigt,
jeweils mit einem anderen Fluorophor markiert waren. Die Reaktionen
wurden in Mikrovertiefungen zusammengemischt, so dass sie sämtliche
Reagenzien außer
Bst und BsoBI enthielten, und die Amplifikation wurde nach Hitzedenaturierung und Äquilibrierung
auf 55°C
durch Zugabe der Enzyme gestartet. Die Mikrovertiefungen wurden
dicht verschlossen und in einem Cytofluor IITM angeordnet,
der so modifiziert worden war, dass er eine Temperaturregelung ermöglichte.
Bandpassfilter wurden verwendet, um die Anregung auf einen für Fluorescein
charakteristischen Wellenlängenbereich
(475-495 nm) und auf einen zweiten, für ROX spezifischen Bereich
(635-655 nm) zu begrenzen. Für
jede Vertiefung erfolgte alle 45 Sekunden eine Fluorescein- und
eine ROX-Ablesung. Die Reaktionen wurden typischerweise 90 min beobachtet.
Kontrollreaktionen enthielten keine Ziel-DNA.
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Die
Ergebnisse sind in 3A, 3B und 3C dargestellt.
Bei Proben, die nur Ziele enthielten, welche von normaler Exon-4-DNA stammten (3A),
stieg die Fluoreszenz mit der Zeit in dem für Fluorescein charakteristischen
Emissionswellenlängenbereich
(FAM, 520-540 nm) stark an, was zeigte, dass der Detektorprimer
SEQ ID NO:1 an diesem Ziel effizient verlängert wurde, und die Anwesenheit
des Wildtyp-Allels erkennen
ließ.
Dagegen blieb bei den normalen Exon-4-Proben die für ROX charakteristische Emissionsfluoreszenz
(635-655 nm) gering,
was zeigte, dass der Detektorprimer SEQ ID NO:2 während der
Amplifikation an dem Ziel nicht effizient verlängert wurde, und die Abwesenheit
des mutanten Allels bestätigte.
Im Gegensatz hierzu war das Fluoreszenzprofil für Proben, die DNA enthielten,
welche von mutanter Exon-4-DNA stammte, und frei von normaler DNA
waren, umgekehrt (3B). Bei diesen Proben stieg
die Fluoreszenz bei den Emissionswellenlängen von ROX stark an, jedoch
nicht bei FAM-Wellenlängen, was
die Anwesenheit des mutanten Allels und die Abwesenheit des Wildtyp-Allels
zeigt. Bei der Probe, die sowohl Wildtyp- als auch mutante DNA enthielt,
stieg die Fluoreszenz in beiden beobachteten Bereichen an, was die
Anwesenheit beider Allele in der Probe zeigt (3C).
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In
einem ähnlichen
Experiment wurde ein alternativer Detektorprimer, der für das Wildtyp-Allel
spezifisch war, getestet und seine Leistung mit dem Detektorprimer
SEQ ID NO:1 verglichen. Der alternative Detektorprimer besaß ein diagnostisches
Nucleotid bei N-2 und ein zweites nichtdiagnostisches Nucleotid
bei N-3 (ein N-2/N-3-Detektorprimer;
FAM-TC CTC GAG T(Dabcyl)AT GGG
TGC TCC ACC TGA C*AC: SEQ
ID NO:14). Außerdem
wurde Amplifikationsprimer SEQ ID NO:5 durch SEQ ID NO:15 (ACG CAG
CAG CAC ACA TTC TCG GGG AAG AGC AGA GAT ATA CGT) ersetzt.
Mittels SEQ ID NO:14 wurden zwei Proben getestet – eine,
die nur Wildtyp-Ziel enthielt und eine andere, die nur mutantes
Ziel enthielt. Jede Testreaktion enthielt SEQ ID NO:14 zur Detektion
des Wildtyp-Allels und SEQ ID NO:2 zur Detektion des mutanten Ziels.
Das SEQ ID NO:1/SEQ 2D NO:2-Detektorprimersystem diente als Kontrollreaktion.
Beobachtet wurde sowohl die Fluorescein- als auch die Rhodaminfluoreszenz,
und für
jede Probe wurden die abgelesenen Fluoreszenzwerte graphisch ausgewertet.
In der das Wildtyp-Ziel enthaltenden Probe wurde der N-2/N-3-Detektorprimer umgewandelt,
was zu einem dreifachen Anstieg der Fluoresceinemission führte. Der
mutanten-spezifische Detektorprimer blieb unumgesetzt, und die Rhodaminemission
war im wesentlichen unverändert.
Bei der Probe, die nur mutantes Ziel enthielt, war das Muster umgekehrt.
Der N-2/N-3-Detektorprimer
wurde nicht umgewandelt, wie durch die unveränderte Fluoresceinemission
angezeigt, die Rhodaminemission von dem mutanten-spezifischen Detektorprimer
stieg jedoch um das Dreifache. Ein Vergleich der Ergebnisse mit
der Kontrollreaktion zeigte, dass die Zielspezifität von SEQ
ID NO:14 etwa der Zielspezifität
von SEQ ID NO:1 entspricht.
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Außerdem wurde
festgestellt, dass ein wildtyp-spezifischer Detektorprimer mit der
Sequenz FAM-TA GCA GTC CCG AGA CTG CT(Dabcyl)A TGG GTG CTC CAC CAG GC* (SEQ ID NO:16) einen empfindlicheren
Nachweis des Wildtyp-Allels gewährleistet
als SEQ ID NO:1, obwohl er etwas weniger spezifisch ist.
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BEISPIEL 4
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Das
Versuchsprotokoll von Beispiel 3 wurde wiederholt, mit der Ausnahme,
dass ein Paar von Amplifikationsprimern, die für Exon 2 des HFE-Gens spezifisch
waren, und Detektor-/Signalprimer
zur Detektion und Identifizierung von Wildtyp- und mutanten Allelen in Exon 2 verwendet
wurden. Das wildtyp-Allel
ist C bei Nucleotid 187. Das mutante Allel weist ein G an dieser
Position auf, was zu einem Austausch von Histidin gegen Lysin bei
Aminosäure
63 im Protein führt.
Diese Detektorprimer wurden dafür
konstruiert, an das Allel zu hybridisieren, das in dem nichtcodierenden
Strang von Exon 2 enthalten ist.
SEQ ID NO:7 – Detektorprimer
für das
Wildtyp-Allel an Nucleotidposition 187 (0187, d.h. G auf dem komplementären Strang):
FAM-TC
CTC GAG T(Dabcyl)TA CCA GCT GTT
CGT GTT CTA TGA TC* (300 nM)
SEQ ID NO:8 – Detektorprimer
für das
mutante Allel an Nucleotidposition 187 (G187, d.h. C auf dem komplementären St rang
)
Rox-TA CCG CAC T(Dabcyl)GR TTA
CCA GCT GTT CGT GTT CTR TAA
TG* (300 nM)
SEQ ID NO:9 – erster Bumper-Primer für Exon 2:
TGA
ACA TGT GAT CCC ACC CT (50 nM)
SEQ ID NO:10 – zweiter
Bumper-Primer für
Exon 2:
CCC CAA TAG ATT TTC TCA GCT CC (50 nM)
SEQ ID
NO:11 – erster
Amplifikationsprimer für
die SDA:
ACC GCA TCG AAT GCA TGT CTC GGG AGC TTT GGG CTA CGT GGA TG
SEQ ID
NO:12 – zweiter
Amplifikationsprimer für
die SDA:
CGA TTC CGC TCC AGA CTT CTC GGG GCT CCA CAC GGC GAC TCT
-
SEQ
ID NO:7 enthielt keine nichtdiagnostische Fehlpaarung mit dem Ziel.
SEQ ID NO:8 enthielt keine RERS, da das ROX/Dabcyl-Farbstoffpaar
bei Bildung des verlängerten,
doppelsträngigen
Detektorprimerprodukts entquencht. Eine Spaltung mit einem Restriktionsenzym
ist nicht erforderlich, um den Fluoreszenzanstieg zu beobachten.
-
Die
Ergebnisse sind in 4A, 4B und 4C für SDA-Reaktionen dargestellt,
die 107 Kopien von Ziel-DNA enthielten,
welche von entweder Wildtyp- oder mutantem Exon 2 stammten. Bei
Proben, die Ziel enthielten, das nur von normaler Exon-2-DNA stammte
(4A), stieg die Fluoreszenz mit der Zeit in dem Emissionswellenlängenbereich
für Fluorescein
stark an, was die Anwesenheit des Wildtyp-Allels anzeigt. Zudem
blieb die Fluoreszenz in dem Emissionswellenlängenbereich für Rhodamin
bei diesen Proben gering, was die Abwesenheit des mutanten Allels
anzeigt. Im Gegensatz hierzu war das Fluoreszenzprofil für Proben,
die DNA enthielten, welche nur von mutantem Exon 2 stammte, umgekehrt
(4B). In diesem Fall stieg die ROX-Fluoreszenz stark
an und blieb die FAM-Fluoreszenz schwach. Bei Proben, die sowohl
Wildtyp- als auch mutante DNA enthielten (4C), stieg
die Fluoreszenz von beiden Fluorophoren stark an, was die Anwesenheit
beider Allele in einer einzigen Probe anzeigt.
-
Außerdem wurde
festgestellt, dass ein Austausch von SEQ ID NO:12 gegen einen Amplifikationsprimer
mit der Sequenz CGA TAC GCT CCT GAC TTC TCG GGA CAA ACG
GCG ACT CTC AT (SEQ ID NO:17) bei der Reaktion eine effizientere
Amplifikation des Exon-2-Ziels
erbringt. Überdies
gewährleistet
ein N-1 Detektorprimer mit der Sequenz Rox-TA GCG CCC GAG CGC T(Dabcyl)AT GTT CGT GTT CTA TGA TC*A (SEQ ID NO:18) eine bessere
Alleldiskriminierung, wenn er in Kombination mit dem alternativen
Amplifikationsprimer SEQ ID NO:17 verwendet wird.
-
BEISPIEL 5
-
Dieses
Beispiel erläutert
die Verwendung von 5'-Schwanzsequenzen
bei Detektorprimern, um Kreuzreaktivität mehrerer allelspezifischer
Sonden in Nucleinsäure-Amplifikationsreaktionen
zu modulieren. Obwohl dieses Beispiel SDA anwendete, sind ähnliche
Ergebnisse für
andere auf dem Fachgebiet bekannte Amplifikationsverfahren einschließlich PCR,
NASBA, 3SR etc. zu erwarten, welche die Verlängerung einer markierten Sonde
oder eines Primers zur Unterscheidung zwischen zwei Allelen beinhalten.
-
Beispiel
3 und 4 beschreiben SDA-Reaktionen, die zwei unterschiedlich markierte
Detektor-/Signalprimer enthalten, einen für das Wildtyp-Allel spezifischen
und einen anderen, der für
ein mutantes Allel spezifisch ist. Somit ist jedes Reaktionsgemisch
in der Lage, das mutante Allel, das Wildtyp-Allel oder beide Allele gleichzeitig
zu detektieren. Die Möglichkeit,
eine Probe auf jedes Allel zu analysieren, ist praktischer und zuverlässiger,
benötigt
weniger Probe und ist weniger kostspielig als die alternative Methode
der Probensplittung und Durchführung
zweier getrennter Eindetektorprimer-Untersuchungen. Es ist jedoch
beobachtet worden, dass in Reaktionsgemischen, die zwei oder mehrere
unterschiedlich markierte Detektorprimer enthalten, von einem Detektorprimer
ein erhöhter
Pegel an falschem, kreuzreaktivem Signal erzeugt werden kann, wenn
das Ziel eines zweiten Detektorprimers anwesend ist. Die Anmelder
glauben, dass diese Kreuzreaktivität durch die gleichzeitige Anwesenheit
beider Detektorprimer im selben Reaktionsgemisch verursacht oder
verschärft
wird, da Kreuzreaktivität
in Eindetektorprimer-Reaktionsgemischen
verringert oder nicht vorhanden ist. Es hat sich herausgestellt,
dass die Kreuzreaktivität
in solchen Mehrdetektorprimer-Reaktionsgemischen beträchtlich
verringert werden kann, wenn man die Detektorprimer so konstruiert,
dass sich die 5'-Schwanzsequenzen
der beiden Detektorprimer wesentlich unterscheiden. Dieses Ergebnis
war unerwartet, da die 5'-Schwänze zu den
ursprünglichen
Zielsequenzen nicht komplementär
sind und sich die allelspezifischen Nucleotide vom 5'-Schwanz entfernt
an oder nahe den 3'-Enden
der Detektorprimer befinden.
-
5 erläutert den
möglichen
Ursprung dieser unerwarteten Kreuzreaktivität, wobei SDA als anschauliches
Beispiel verwendet wird. Das gezeigte "Wildtyp"-Ziel enthält ein C an der zu diagnostizierenden Nucleotidposition.
Der Detektorprimer für
dieses Allel enthält
daher wie dargestellt ein 3'-terminales
G. Zum Zwecke dieser Erläuterung
enthält
das "mutante" Allel (nicht dargestellt)
ein T an der diagnostischen Position, und sein Detektorprimer enthält ein 3'-terminales A. Beide
Detektorprimer sind in der Amplifikationsreaktion anwesend. Während der
Amplifikation hybridisiert der C-spezifische
Detektorprimer an das Ziel und wird verlängert und in die doppelsträngige Form
umgewandelt, die spaltbar ist, so dass das Donor-/Quencher-Farbstoffpaar
getrennt wird. Der resultierende Anstieg in der Fluoreszenz zeigt
die Anwesenheit des C-haltigen Ziels. Die verbleibende doppelsträngige Spezies
erfährt
dann eine lineare Amplifikation, da diese Spezies eine nickbare
Restriktionsstelle enthält.
Die lineare Amplifikation erzeugt eine einzelsträngige Spezies, die ein C an
der diagnostischen Position enthält.
Zwei alternative Reaktionswege sind dann möglich. In einem Fall kann das lineare
Amplifikationsprodukt an den passenden C-spezifischen Detektorprimer
hybridisieren und wie zuvor in gespaltenes Produkt umgewandelt werden,
was das C-spezifische Signal weiter verstärkt. Alternativ kann das lineare
Amplifikationsreaktionsprodukt fälschlich
an den T-spezifischen Detektorprimer hybridisieren. Die einzelne
Fehlpaarung am 3'-Ende des T-spezifischen
Detektorprimers würde
nicht ausreichen, um eine solche irrtümliche Hybridisierung zu verhindern.
Wenn jedoch die 5'-Schwanzsequenzen
der T-spezifischen und C-spezifischen
Detektorprimer identisch sind, könnte
eine Hybridisierung erfolgen und der falsch hybridisierte T-spezifische Detektorprimer
würde schnell
in ein gespaltenes fluoreszierendes Produkt umgewandelt werden, ohne
dass eine Verlängerung
der A:C-Fehlpaarung notwendig wäre.
Dies führt
zu einem Signal, das fälschlicherweise
die Anwesenheit eines T-Nucleotids
an der diagnostischen Position anzeigt. Wenn aber die T-spezifischen
und C-spezifischen Detektorprimer unterschiedliche 5'-Schwanzsequenzen
enthalten, wird ein falsch hybridisierter T-spezifischer Detektorprimer
keine Spaltung erfahren, da der 5'-Schwanz nicht durch Hybridisierung
an das lineare Amplifikationsprodukt in eine doppelsträngige Form
umgewandelt werden kann. Der Detektorprimer würde dann ungespalten bleiben,
selbst wenn er irrtümlich
an Wildtyp-Ziel hybridisiert ist, und es würde kein falsch-positives Signal
erzeugt werden. Bei dem dargestellten Beispiel wäre die Tatsache, dass die beiden
Detektorprimer die gleiche Restriktionsstelle aufweisen, nicht ausreichend,
um eine Hybridisierung der Schwänze
zu ermöglichen,
vorausgesetzt, der Rest der 5'-Schwanzsequenz
ist unterschiedlich.
-
Obwohl 5 einen
Mechanismus der unerwünschten
Erzeugung eines falsch-positiven Signals bei der SDA erläutert, werden
bei anderen Amplifikationsverfahren ähnliche Reaktionen auftreten.
Jedesmal, wenn in einer PCR, NASBA, 3SR, TMA oder einer anderen
Amplifikationsreaktion ein einzelsträngiges C-haltiges Detektorprimer-Verlängerungsprodukt
erzeugt wird, kann es an entweder den C-spezifischen Detektorprimer
(korrekterweise) oder an den T-spezifischen Detektorprimer (fälschlicherweise)
hybridisieren. Wenn die zwei Detektorprimer identische 5'-Schwanzsequenzen
besitzen, wird das Verlängerungsprodukt
an seinem 5'-Ende
zu beiden komplementär
sein und die RERS wird doppelsträngig
und spaltbar sein. Wenn die beiden Detektorprimer unterschiedliche
5'-Schwanzsequenzen
aufweisen, wird keine doppelsträngige
RERS entstehen, wenn der Detektorprimer an das falsche Ziel hybridisiert,
und es wird kein falsch-positives Signal erzeugt werden.
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Um
dieses Phänomen
zu veranschaulichen, wurden vier SDA-Reaktionen zusammengemischt. Sämtliche
Reaktionen enthielten den mutanten-spezifischen Detektorprimer SEQ
ID NO:2 (300 nM). Die Reaktionen 1 und 2 enthielten die wildtyp-spezifische
SEQ ID NO:13 (FAM-TT CTC GAG T(Dabcyl) TA CAT GGG TGC TCC ACC AGG C*
(300 nM), welche dieselbe 5'-Schwanzsequenz
wie SEQ ID NO:2 aufweist. Die Reaktionen 3 und 4 enthielten den
fluoresceinmarkierten wildtyp-spezifischen Detektorprimer SEQ ID
NO:1 (300 nM), bei dem sich die 5'-Schwanzsequenz abgesehen von der RERS
(CTCGAG) von SEQ ID NO:2 unterscheidet. Die Reaktionsgemische enthielten
außerdem
entweder Wildtyp- (Reaktion
1 und 3) oder mutante (Reaktion 2 und 4) Ziel-DNA (105 Kopien pro
Reaktion), die vom Exon 4 des HFE-Gens stammte (siehe Beispiel 3).
Die Reaktionen wurden wie in Beispiel 3 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass
nur Fluorescein-Fluoreszenzemissionen detektiert
wurden.
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Die
Ergebnisse sind in 6 dargestellt. Reaktion 1 erzeugte
einen starken Anstieg der Fluorescein-Fluoreszenz, der die Anwesenheit
des Wildtyp-Allels in dem Ziel anzeigt. Reaktion 2, die nur mutante DNA
enthielt, erzeugte einen geringeren, jedoch bedeutenden Fluoreszenzanstieg,
obwohl keine Wildtyp-DNA vorhanden war. Dieses Signal repräsentiert
die fälschliche
Umwandlung des wildtyp-"spezifischen" Detektorprimers,
möglicherweise
durch den in 5 dargestellten Mechanismus,
da die 5'-Schwanzsequenzen
der beiden in der Reaktion vorhandenen Detektorprimer identisch
waren. Wenn die 5'-Schwanzsequenz
des Wildtyp-Detektorprimers verändert
wurde (SEQ ID NO:1), wurde das kreuzreagierende Signal unterdrückt (Reaktion
4), ohne dass hierdurch das zielspezifische Signal wesentlich beeinträchtigt wurde
(Reaktion 3).
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