DE60127244T2

DE60127244T2 - Spezifische multiplex-analyse von nukleinsäuren

Info

Publication number: DE60127244T2
Application number: DE60127244T
Authority: DE
Inventors: Dr. Bernadette Reuber; Dr.Stephanie Weber (Nee Muck); Dr. Olaf Weiner; Rudolf Zirwes
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2000-03-24
Filing date: 2001-03-26
Publication date: 2007-11-22
Anticipated expiration: 2021-03-27
Also published as: WO2001071028A2; EP1272673B1; DE60127244D1; AU2001256220A1; WO2001071028A3; ATE356885T1; EP1272673A2; DK1272673T3

Description

Die vorliegende Erfindung gibt eine neue Art von Amplifikations- und Nachweisverfahren an, das eine homogene Multiplexanalyse von Nucleinsäuresequenzen und den Nachweis von Einzelnucleotidpolymorphismen und Nucleotidsequenzänderungen, wie Punktmutationen, Allelvarianten, Deletionen, Insertionen, Repeats und/oder Inversionen, erlaubt. Zusätzlich kann die Erfindung für die Quantifizierung von Nucleinsäuren und die Genotypbestimmung nützlich sein.
Homogene Assays zum Nachweis von Nucleinsäuresequenzen, insbesondere zum Nachweis von Einzelnucleotidpolymorphismen (SNPs), sind ein entscheidendes Werkzeug der Genanalyse und wurden zu kommerziellen Produkten insbesondere für die klinische Diagnostik entwickelt. SNPs sind evolutionsstabile Punktmutationen, die alle 500 bis 1000 DNA-Basen über das ganze menschliche Genom verstreut sind und daher die häufigste genetische Variation in menschlichen Populationen darstellen (Cooper et al., Hum Genet 1985, 69: 201–205; Collins et al., Genome Res 1998, 8: 1229–1231). Das Genom von zwei beliebigen, nicht miteinander verwandten Individuen unterscheidet sich schätzungsweise in wenigstens drei Millionen Nucleotidpositionen, von denen sich ungefähr 500 000 in codierenden Bereichen befinden. Die Verfügbarkeit der vollständigen Sequenz des humanen Genoms (International Human Genome Sequencing Consortium, Nature 2001, 409: 860–921) liefert jetzt die Basis für die Erstellung einer Ganzgenom-SNP-Karte, eines wirkungsvollen Werkzeugs für die Genanalyse, das die Assoziation von SNPs mit vielen Krankheitseigenschaften enthüllen wird und vielversprechend bezüglich der Optimierung der Entwicklung neuer Wirkstoffe und der Individualisierung der klinischen Diagnostik und Therapeutik ist (Bentley, Med Res Rev 2000, 20: 189–196; Pfost et al., Trends Biotechnol 2000, 18: 334–338; Schork et al., Clin Genet 2000, 58: 250–264). Zukünftige Entwicklungen werden sich auf die Identifizierung und/oder Durchmusterung von wenigen Dutzend bis zu Hunderten von SNPs konzentrieren, die für bestimmte Krankheitsbereiche (z.B. Krebs, neurodegenerative oder kardiovaskuläre Krankheit) relevant sind, anstatt bei jedem Individuum Ganzgenom-SNP-Scans durchzuführen. Verfahren, die die Anforderungen dieser Entwicklungen erfüllen, müssen flexible und schnelle Assays, einen mittleren bis hohen Durchsatz und eine qualitative hochwertige Genotypbestimmung für interessierende SNPs ermöglichen. Zu den zur Zeit angewendeten Verfahren zur Analyse von Nucleinsäuresequenzen, insbesondere zur Analyse von SNPs, gehören die Analyse des Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus von Produkten der Polymerase-Kettenreaktion (RFLP-PCR), die Hybridisierung mit allelspezifischen Oligonucleotiden (Nickerson et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 8923–8927; Saiki et al., Proc Natl Acad Sci USA 1989, 86: 6230–6234; de Verlaan et al., Gene 1986, 50: 313–320; Wallace et al., Nucleic Acids Res 1981, 9: 879–894; Zhang et al., Nucleic Acids Res 1991, 19: 3929–3933), allelspezifische PCR (Gibbs et al., Nucleic Acids Res 1989, 17: 2437–2448; Newton et al., Nucleic Acids Res 1989, 17: 2503–2516), Oligonucleotid-Ligierungsassay (Grossman et al., Nucleic Acids Res 1994, 22: 4527–4534; Landegren et al., Science 1988, 241: 1077–1080), allelspezifische Ligase-Kettenreaktion (Abravaya et al., Nucleic Acids Res 1995, 23: 675–682; Barany, Proc Natl Acad Sci USA 1991, 88: 189–193; Wu und Wallace, Genomics 1989, 4: 560–569), Chiparrays hoher Dichte für die allelspezifische Hybridisierungsanalyse (Wang et al., Science 1998, 280: 1077–1082; Yershov et al., Proc Natl Acad Sci USA 1996, 93: 4913–4918), der 5'-Nuclease-Assay (Holland et al.; Proc Natl Acad Sci USA 1991, 88: 7276–7280; Lee et al., Biotechniques 1999, 27: 342–349; Livak, Genet Anal 1999, 14: 143–149; Livak et al., PCR Methods Appl 1995, 4: 357–362), der matrizengesteuerte Farbstoff-Terminator-Einbauassay (Chen und Kwok, Nucleic Acids Res 1997, 25: 347–353; Chen et al., Genome Res 1999, 9: 492–498, und Proc Natl Acad Sci USA 1997, 94: 10756–10761), der Molecular-Beacon-allelspezifische-Oligonucleotidassay (Marras et al., Genet Anal 1999, 14: 151–156; Tyagi und Kramer, Nat Biotechnol 1996, 14: 303–308), der allelspezifische Fluoreszenzenergietransfer(LightCycler)-Assay (Bernard et al., Anal Biochem 1998, 255: 101–107; Lay und Wittwer, Clin Chem 1997, 43: 2262–2267), der strukturspezifische invasive Endonuclease-Spaltungsassay (Lyamichev et al., Nat Biotechnol 1999, 17: 292– 296) und der Pyrosequenzierungsassay (Ahmadian et al., Anal Biochem 2000, 280: 103–110, Alderborn et al., Genome Res 2000, 10: 1249–1258).
Bei den meisten der Verfahren werden zur Zeit makroskopische Fluoreszenztechniken eingesetzt, die konventionelle Fluoreszenzintensität, Fluoreszenzpolarisierung, Energieübertragung oder Fluoreszenz-Quenching umfassen und die die mittlere Fluoreszenzausstrahlung aus der Menge der emittierenden Fluorophore messen. Dagegen werden bei der Einzelmolekülnachweistechnik Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) (Eigen und Rigler, Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91: 5740–5747; Elson und Magde, Biopolymers 1974, 13: 1–27, Magde et al., Phys Rev Lett 1972, 29: 705–708, und Biopolymers 1974, 13: 29–61) statistisch Proben von den Fluoreszenzfluktuationen einzelner Moleküle in diskreten Zeitintervallen mit einer zeitlichen Auflösung von bis zu Nanosekunden und darunter genommen. Dann werden viele solche Nachweisereignisse gemittelt, um die Eigenschaften des ganzen Assaysystems zu definieren. Eine Analyse von Einzelmolekülereignissen wird mit Hilfe einer konfokalen Optik mit einem Beleuchtungs/Beobachtungsvolumen von ungefähr 0,24 fl (10^–15 Liter) erreicht und hat gegenüber herkömmlichen makroskopischen Fluoreszenzverfahren mehrere Vorteile. Zum Beispiel werden Probleme, die aus der Sondenadsorption, der Autofluoreszenz von Reaktionskomponenten oder von Reaktionsgefäßen stammen, sowie innere Filtereffekte praktisch beseitigt. Dies führt zu einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis und einer maximalen Empfindlichkeit, die vom Assayvolumen im Wesentlichen unabhängig ist und eine spätere Assayminiaturisierung bis zu 1 ml oder darunter erlaubt, eine wesentliche Vorbedingung einer Hochdurchsatzanalyse. Die Autokorrelation von Fluoreszenzfluktuationen liefert mehrere Fluoreszenzparameter einschließlich der mittleren Anzahl und der Translationsdiffusionszeiten von fluoreszierenden Molekülen im konfokalen Beleuchtungs/Beobachtungs-Volumen. FCS wurde erfolgreich angewendet, um so verschiedene molekulare Wechselwirkungen wie Wirkstoff/Target-Wechselwirkungen zu messen (Auer et al., Drug Discovery Today 1998, 3: 457–465; Sterner und Henco, J Recept Signal Transduct Res 1997, 17: 511–520), enzymatische und Bindungsstudien (Kettling et al., Proc Natl Acad Sci USA 1998, 95: 1416–1420; Meyer-Almes und Auer, Biochemistry 2000, 39: 13261–13268) sowie Proteinaggregationsstudien (Pitschke et al., Nat Med 1998, 4: 832–834, Tjernberg et al., Chem Biol 1999, 6: 53–62). Außerdem wurde gezeigt, dass FCS gut für die qualitative und quantitative Nucleinsäureanalyse (Bjorling et al., Biochemistry 1998, 37: 12971–12978; Kinjo, BioTechniques 1998, 25: 705–6; Kinjo et al., Anal Biochem 1998, 260: 166–172; Kinjo und Rigler, Nucleic Acids Res 1995, 23: 1795–1799; Rigler et al., J Biotechnol 1998, 63: 97–109; Walter et al., Proc Natl Acad Sci USA 1996, 93: 12805–12810; Weiner et al., Digestion 2000, 61: 84–89) und für den indirekten Nachweis von Punktmutationen in Genen (Kinjo and Nishimura, Bioimaging 1997, 5: 134–138) geeignet ist.
Das Europäische Patent Nr. 332435 ("Method of detecting nucleotide sequences") von Zeneca Ltd., London, und Newton et al. (Nucleic Acid Res 1989, 17: 2503–16) beschreiben ein Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit von wenigstens einer Nucleotidsequenzvariation. Dieses Verfahren ist als ARMS (amplification refractory mutation system) bekannt. Die Grundlage der Erfindung, wie sie im Europäischen Patent Nr. 332435 beschrieben ist, besteht darin, dass Oligonucleotide mit einem fehlgepaarten 3'-Rest unter geeigneten Bedingungen nicht als Primer in einer PCR-Reaktion funktionieren. Das Verfahren umfasst (i) das In-Kontakt-Bringen einer Nucleinsäureprobe mit einem diagnostischen Primer, der zu einem diagnostischen Teil einer Zielnucleinsäuresequenz im Wesentlichen komplementär ist, wodurch eine Verlängerung des diagnostischen Primers an einer Zielmatrize unter geeigneten Bedingungen nur erreicht wird, wenn ein terminales Nucleotid des diagnostischen Primers entweder zu einem vermuteten abweichenden Nucleotid oder einem entsprechenden normalen Nucleotid der Zielnucleinsäuresequenz komplementär ist, und (ii) das Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Verlängerungsprodukts. Gemäß der im Europäischen Patent Nr. 332435 beschriebenen Erfindung umfasst ein bevorzugtes Verfahren zum Nachweisen von und Unterscheiden zwischen mehreren Amplifikationsprodukten, die durch das Verfahren erzeugt werden, das Auswählen der Position der Amplifikationsprimer auf der Zielnucleinsäuresequenz, so dass die Länge jedes Amplifikationsprodukts verschieden ist. Dementsprechend kann dies erreicht werden, indem man den Abstand der Amplifikationsprimer von der Position der Markierungsprimer variiert, so dass jede Nucleotidvariante mit einem Amplifikationsprodukt unterschiedlicher Länge assoziiert ist. Die Amplifikationsprodukte unterschiedlicher Länge können dann durch etablierte Elektrophoresetechniken nachgewiesen werden. Die oben beschriebene Nachweistechnik hat jedoch den Nachteil, dass sie zeitraubend und nichthomogen ist und mehrere manuelle Arbeitsschritte erfordert. Außerdem kann die Technik nur für die gleichzeitige Durchmusterung einer Probe von Zielnucleinsäuresequenzen entweder auf die Anwesenheit oder auf die Abwesenheit von Nucleinsäurevarianten in mehreren, aber unterschiedlichen Positionen auf den Zielnucleinsäuresequenzen verwendet werden, während eine gleichzeitige Analyse von mehreren Nucleotidvarianten, die sich in einer definierten einzigen Position befinden, nicht möglich ist. Weiterhin ermöglicht die im Europäischen Patent Nr. 332435 beschriebene Erfindung keine Quantifizierung von Zielnucleinsäuresequenzen.
Die internationale Anmeldung WO 98/24928 offenbart ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von chromosomalen Abnormitäten, die mit einem Zustand bei einem Probanden verbunden sind und jeweils durch wenigstens eine charakteristische Nucleinsäuresequenz definiert sind. Das Verfahren umfasst das Durchführen eines Multiplexmolekularamplifikationsverfahrens mit einer Probe von Nucleinsäuren, wobei das Verfahren die Verwendung von wenigstens 7 jeweils unterschiedlichen Primern in einem einzigen Reaktionsgemisch umfasst, wobei jeder der Primer ein Ende wenigstens einer charakteristischen Nucleinsäuresequenz definiert. Wenigstens einer der Primer definiert die ersten Enden von wenigstens zwei charakteristischen Nucleinsäuresequenzen, wobei die zwei Sequenzen in ihren entgegengesetzten Enden durch jeweils unterschiedliche Primer definiert sind, die aus dem Rest der Primer ausgewählt sind, wodurch die Zahl der amplifizierten charakteristischen Nucleinsäuresequenzen, die nach dem Abschluss der Amplifikationsreaktion nachgewiesen werden können, wenigstens 1/2 × n + 1 beträgt.
Die Veröffentlichung von Boldt B. et al., "One-tube method for complete HPA-1 genotyping by PCR using sequence-specific primers", British Journal of Haematology, 1997, 99, 968–973, beschreibt ein Verfahren zur gleichzeitigen und vollständigen Genotypbestimmung bei der interessierender Allele in einer einzigen PCR unter Verwendung einer rekombinanten Matrize, die nur durch die sequenzspezifischen Primer amplifiziert werden kann.
In dem Artikel von Echevarria J. et al. "Simultaneous detection and identification of human parainfluenza viruses 1, 2 and 3 from clinical samples by multiplex PCR", Journal of Clinical Microbiology, Mai 1998, S. 1388–1391, sind Multiplex-RT-PCR-Assays offenbart, bei denen ein Gemisch von drei Paaren von Primern für die primäre Amplifikation verwendet wird. Eine zweite Amplifikation wurde zur Typbestimmung mit einem Gemisch von geschachtelten Primern durchgeführt, die gegebenenfalls mit einem fluoreszierenden Mittel gekoppelt sind.
WO 96/40995 offenbart Verfahren zum Nachweisen und Quantifizieren von Gensequenzen, wie mutierten Genen und Onkogenen, in biologischen Flüssigkeiten. Die Flüssigkeitsprobe wird erhalten, deproteiniert, und die in der Probe vorhandene DNA wird extrahiert. Dann wird die DNA unter Verwendung eines Amplifikationsverfahrens, wie PCR oder LCR, amplifiziert, um die mutierte Gensequenz zu amplifizieren. In einer Ausführungsform wird die DNA vor oder während des Amplifikationsverfahrens mit einer Peptidnucleinsäure in Kontakt gebracht.
WO 97/42345 beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von diagnostischen Basensequenzen in einer Probennucleinsäure sowie diagnostische Primer mit einem nichtkomplementären Schwanz, die Tag- und Detektorbereiche umfassen, zur Verwendung in dem Verfahren. Das Verfahren ist in Kombination mit dem Amplification Refractory Mutation System (ARMS) zum Nachweis von abweichenden diagnostischen Basensequenzen vor einem Hintergrund von normalen diagnostischen Basensequenzen von Nutzen.
Die vorliegende Erfindung überwindet die oben beschriebenen Beschränkungen und verwendet eine homogene, empfindliche, einfache und arbeitssparende Technik zur Multiplexanalyse von Nucleinsäuresystemen, die GALIOS (gene amplification and labeling in one system) genannt wird. Das neue Verfahren ist für den direkten Nachweis von bekannten SNPs, Punktmutationen, Allelvarianten, Deletionen, Insertionen, Repeats und/oder Inversionen besonders gut geeignet. Die vorliegende Erfindung verwendet ein Verfahren, das die hohen Spezifitäten einer halbgeschachtelten (semi-nested) Polymerase-Kettenreaktion (Haff, PCR Methods Appl 1994, 3: 332–337) mit einem verbesserten Verfahren der nucleotidvariantenspezifischen Amplifikation verwendet. Das verbesserte nucleotidvariantenspezifische Amplifikationsverfahren ist durch die Verwendung von wenigstens zwei im Wesentlichen ähnlichen, aber unterscheidbaren Markierungsprimern für die Analyse einer Zielnucleinsäuresequenz gekennzeichnet. Das erfindungsgemäße Verfahren liefert gegenüber anderen Systemen den Vorteil, dass es die Amplifikation, Markierung und Messung in einem homogenen Format ermöglicht. Gemäß der vorliegenden Erfindung können mehrfache Reaktionsprodukte direkt und gleichzeitig in einem Misch-und-miss-Format ohne irgendwelche Postamplifikationsverarbeitungs- oder physikalischen Trennschritte gemessen, analysiert und quantifiziert werden. Die Messung erfolgt vorzugsweise durch die Technik der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS).
Gemäß einem Merkmal der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit von abweichenden Nucleotiden innerhalb von Zielnucleinsäuresequenzen angegeben, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(i) Herstellen eines Reaktionsgemischs, das Folgendes umfasst: Nucleosidtriphosphate oder funktionelle Derivate davon; ein Polymerisationsmittel; wenigstens ein Paar von zielspezifischen Amplifikationsprimern, die mit Zielnucleinsäuresequenzen hybridisieren können; wenigstens ein Satz Markierungsprimer, wobei jeder Satz aus wenigstens zwei Typen von Markierungsprimern besteht, die mit entsprechenden Zielnucleinsäuresequenzen 3' von den Amplifikationsprimern hybridisieren können, so dass jeder Satz Markierungsprimer relativ zu dem entsprechenden Paar von Amplifikationsprimern halbgeschachtelt (semi-nested) ist, und wobei die halbgeschachtelten Markierungsprimer in niedrigeren Konzentrationen vorhanden sind als das Paar von Amplifikationsprimern, wobei die wenigstens zwei Typen von Markierungsprimern eines Satzes Markierungsprimer dadurch gekennzeichnet sind, dass sie im Wesentlichen ähnliche Nucleotidsequenzen haben, abgesehen von wenigstens dem 3'-terminalen Nucleotid, das für jeden Typ von Markierungsprimer verschieden und zu dem abweichenden Nucleotid komplementär ist, wodurch ein verlängerter Markierungsprimer synthetisiert wird, wenn das 3'-terminale Nucleotid des Markierungsprimers komplementär zu dem entsprechenden Nucleotid in der Zielnucleinsäuresequenz ist, und wodurch im Wesentlichen kein oder nur ein vernachlässigbarer Hintergrund von verlängertem Markierungsprimer synthetisiert wird, wenn das terminale Nucleotid nicht komplementär zu dem entsprechenden Nucleotid in der Zielnucleinsäuresequenz ist, und jeder Typ von Markierungsprimer weiterhin dadurch gekennzeichnet ist, dass er eine andere und unterscheidbare Markierung trägt. Das Reaktionsgemisch umfasst weiterhin wenigstens eine Probe von Nucleinsäuresequenzen.
(ii) Durchführen einer Amplifikationsreaktion unter Bedingungen, die die Hybridisierung der Amplifikationsprimer und der Markierungsprimer, entweder zusammen oder nacheinander, an die entsprechenden Zielnucleinsäuresequenzen ermöglichen, und Fördern der Polymerisation; und
(iii) Messen spezieller Eigenschaften der Typen von Markierungsprimern während oder nach der Beendigung der Amplifikationsreaktion, wobei die spezifischen Eigenschaften auf eine Verlängerung oder Nichtverlängerung der Markierungsprimer hinweisen, wodurch die Anwesenheit oder Abwesenheit eines abweichenden Nucleotids innerhalb einer Zielnucleinsäuresequenz nachgewiesen wird.

Man sollte sich darüber im Klaren sein, dass gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren ein Verlängerungsprodukt des Markierungsprimers synthetisiert wird, wenn das 3'-terminale Nucleotid des Markierungsprimers komplementär zu dem entsprechenden Nucleotid der Zielnucleinsäuresequenz ist. Es sei weiterhin angemerkt, dass der Ausdruck "halbgeschachtelt" in Bezug auf den Markie rungsprimer bedeutet, dass jeder Typ von Markierungsprimer innerhalb des Bereichs der Zielnucleinsäuresequenz, die von dem Paar von Amplifikationsprimern eingerahmt und amplifiziert wird, assoziiert oder hybridisiert. Jedes Paar von Amplifikationsprimern besteht aus einem Stromaufwärts- und einem entsprechenden Stromabwärts-Amplifikationsprimer, die den zu analysierenden Bereich auf der Zielnucleinsäuresequenz einrahmen (siehe 1 zur Veranschaulichung). Der hier verwendete Ausdruck "Zielnucleinsäuresequenz" bezieht sich auf eine bestimmte interessierende Nucleinsäuresequenz, von der man annimmt oder weiß, dass sie ein abweichendes Nucleotid enthält. Der hier verwendete Ausdruck "abweichendes Nucleotid" ist definiert als Nucleotid, das auf einer definierten Position innerhalb einer Zielnucleinsäuresequenz enthalten ist und von dem man annimmt oder weiß, dass es abweicht. Dies bedeutet, dass ein abweichendes Nucleotid eines von vier möglichen Nucleotiden (Adenosin, Guanosin, Cytidin und Thymidin) umfassen kann. In der Praxis der Erfindung kann ein abweichendes Nucleotid zum Beispiel eine Punktmutation, Deletion, Insertion, Inversion oder einen Einzelnucleotidpolymorphismus (SNP) umfassen. Verschiedene Allele eines Gens können durch die An- oder Abwesenheit eines abweichendes Nucleotids definiert werden. Man sollte sich weiterhin darüber im Klaren sein, dass eine Probe von Zielnucleinsäuresequenzen eine gemischte Population von Zielnucleinsäuremolekülen enthalten kann, die wenigstens zwei verschiedene Nucleinsäuresequenzen repräsentieren, wobei sich die Zielnucleinsäuresequenzen wenigstens in ihrer Nucleotidzusammensetzung auf der Position, die durch das entsprechenden komplementäre 3'-terminale Nucleotid des Markierungsprimers definiert ist, voneinander unterscheiden. Folglich kann das Reaktionsgemisch ein Gemisch von wenigstens zwei Typen von verlängerten und amplifizierten Markierungsprimern enthalten, wobei die multiplen amplifizierten Typen von Markierungsprimern anhand ihrer verschiedenen Marker unterscheidbar sind. In der Praxis sind Polymorphismen, bei denen mehr als zwei der vier möglichen Nucleotide an einer gegebenen Einzelbasenstelle vorhanden sein können, einer qualitativen und quantitativen Analyse mit dem beschriebenen Verfahren zugänglich. Das Reaktionsgemisch umfasst auch Nucleosidtriphosphate oder funktionelle Derivate davon. Wie der Ausdruck hier verwendet wird, können Nucleosidtriphosphate oder funktionelle Derivate davon in ein Verlänge rungs- oder Amplifikationsprodukt eingebaut werden. Funktionelle Derivate von Nucleosidtriphosphaten umfassen zum Beispiel synthetische Nucleotide mit modifizierten Baseneinheiten und/oder modifizierten Zuckereinheiten.
In einer bevorzugten Ausführungsform gibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren an, wie es oben beschrieben ist, bei dem die Konzentration jedes Markierungsprimers 0,1- bis 300mal, vorzugsweise 5- bis 30mal, niedriger ist als die Konzentration des wenigstens einen Paars von Amplifikationsprimern. Bei dem hier beschriebenen Verfahren werden vorzugsweise wenigstens ein Paar von Zielnucleinsäuresequenz-spezifischen Amplifikationsprimern in hohen Konzentrationen (z.B. 150 bis 300 nM) und wenigstens zwei Typen von halbgeschachtelten nucleotidvariantenspezifischen Markierungsprimern in wesentlich niedrigeren Konzentrationen (z.B. 1 bis 10 nM) in einer einzigen Amplifikationsreaktion, z.B. PCR, eingesetzt. Während der Reaktion wird der interessierende Zielbereich unabhängig von der variablen Nucleotidsequenz amplifiziert, während die geschachtelten Markierungsprimer mit hoher Effizienz, die nur von der abweichenden Nucleotidsequenz abhängt, verlängert werden. Da die 3'-terminalen Basen der Markierungsprimer zu der jeweiligen zu analysierenden variablen Nucleotidsequenz komplementär sind, erfolgt nur dann eine Verlängerung des Markierungsprimers durch die Polymerase, wenn die 3'-terminale Base des Markierungsprimers spezifisch mit der komplementären Base in der Zielnucleinsäuresequenz hybridisiert. Wenn dagegen die 3'-terminale Base des Markierungsprimers nicht richtig mit der Zielnucleinsäuresequenz assoziiert wird, ist die spezifische Verlängerung beeinträchtigt. Dennoch kann im Falle von hohen DNA-Konzentrationen in der Amplifikationsreaktion eine unspezifische Amplifikation stattfinden. Um die unspezifische Verlängerung zu minimieren, sind die halbgeschachtelten Markierungsprimer in niedrigeren Konzentrationen vorhanden als das Paar von Amplifikationsprimern. Aufgrund ihrer hohen Konzentration dominieren die Amplifikationsprimer die früheren PCR-Zyklen, während die niedrig konzentrierten Markierungsprimer vorwiegend in späteren PCR-Stadien verlängert werden, wodurch sie ein zeitlich und räumlich halbgeschachteltes Primersystem bilden. Dieses Merkmal hat den Vorteil, dass es zu hohen Signal- Rausch-Verhältnissen, einer sehr hohen Spezifität und einer minimalen Gefahr, falsch positive Ergebnisse zu erhalten, führt.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält jeder Markierungsprimer wenigstens eine der folgenden Markierungen: Fluoreszenzfarbstoffe, Chemilumineszenzmarker, Elektrolumineszenzmarker, Affinitäts- oder Bindungsmarker, positionsspezifische Marker oder Marker mit spezifischen physikalischen Eigenschaften, wie unterschiedlicher Größe, Masse oder Drehrichtung.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthalten die Markierungsprimer Fluoreszenzfarbstoffe und jeder Typ von Markierungsprimer ist mit einem anderen Fluoreszenzfarbstoff markiert, so dass jeder Typ von Markierungsprimer durch unterschiedliche Anregungs- und/oder Emissionsspektren, Lebensdauereigenschaften, Polarisationseigenschaften, Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer(FRET)-Eigenschaften, Quantenausbeuten, Photostabilität oder Triplettzahl der Fluorochrome gekennzeichnet ist.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Marker permanent oder temporär an den Markierungsprimer, vorzugsweise das 5'-Ende des Markierungsprimers, gebunden. Die Verfahren des Bindens, Befestigens oder Konjugierens des Markers mit dem Markierungsprimer hängen von der Art des Markers und der Position des Markers auf dem Markierungsprimer ab und sind in der Technik bekannt. Markierungsprimer und Amplifikationsprimer bestehen aus Oligonucleotiden, die typischerweise 15 bis 30 Nucleotide enthalten. Je nach der besonderen Komplexität der Zielsequenz, der Assoziationstemperatur und anderen variablen Faktoren können die Primer jedoch auch mehr oder weniger Nucleotide enthalten. Die Primer können aus Phosphodiester-Oligonucleotiden oder modifizierten Oligonucleotiden, wie Methylphosphonaten, Phosphotriestern, Phosphorothioaten, Phosphoramidaten, PNAs, Nichtphosphat-Internucleosidbindungen oder Gemischen davon bestehen.
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Amplifikationsreaktion und die anschließende gleichzeitige Messung der spezifischen Eigenschaften der multiplen Reaktionsprodukte in einem homogenen Format, d.h. in einem einzigen Reaktionsröhrchen, durchgeführt. Man wird sich leicht darüber im Klaren sein, dass diese Ausführungsform den Vorteil eines erhöhten Probendurchsatzes und von potentiellen Kosten- und Zeitersparnissen hat.
In einer weiteren Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens ist das Polymerisationsmittel ein Enzym. Die Synthese von Primer-Verlängerungsprodukten kann zum Beispiel durch E.-coli-DNA-Polymerase I, Klenow-Polymerase, Phage-T4-DNA-POlymerase oder andere DNA-Polymerasen erfolgen. Ein bevorzugtes Enzym ist eine thermostabile DNA-Polymerase. Es ist besonders wünschenswert, eine thermostabile DNA-Polymerase zu verwenden, der die 5'→3'-Exonuclease-Aktivität fehlt, z.B. eine verkürzte Form von T.-aquaticus-DNA-Polymerase (Lawyer et al., J Biol Chem 1989, 264: 6427–6437; Lawyer et al., PCR Method Appl 1993, 2: 275–287). Bei Verwendung eines solchen Enzyms unterliegen die Markierungsprimer keinem Exonuclease-Abbau ausgehend von dem markertragenden 5'-terminalen Ende des Markierungsprimers während der Amplifikationsreaktion.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen die Zielnucleinsäuresequenzen vorzugsweise genomische DNA. Außerdem können die Zielnucleinsäuresequenzen cDNA, einzelsträngige DNA, doppelsträngige DNA, Plasmid-DNA und Gemische von DNA mit anderen Molekülen umfassen. Weiterhin können Zielnucleinsäuresequenzen aus RNA bestehen. Wenn RNA das Ausgangsmaterial für die Analyse ist, können eine reverse Transcriptionsreaktion und eine Amplifikationsreaktion in derselben Reaktion durchgeführt werden. Die Herkunft der Zielnucleinsäuresequenzen ist vorzugsweise human, aber sie können auch von anderen Organismen, wie anderen Säugern, Vertebraten, Invertebraten, Pilzen, Hefe, Bakterien, Viren und Pflanzen, stammen. Die Zielnucleinsäuresequenzen können vorzugsweise aus Blut erhalten und extrahiert werden. Sie können weiterhin aus anderem zugänglichem Gewebematerial und Körperflüssigkeiten, wie Gewebebiopsien, Tumormaterial, Haut, Haar, Sperma, Speichel, Nabelschnurblut, Liquor und Amnionflüssigkeit, erhalten werden. Noch eine weitere Quelle für Zielnucleinsäuresequenzen kann Zellkulturmaterial sein. Die Extraktion kann nach mehreren Techniken durchgeführt werden, die dem Fachmann bekannt sind (siehe Sambrook und Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2000).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann das Messen der speziellen Eigenschaften der Amplifikationsreaktionsprodukte durch mehrere verschiedene Techniken erfolgen. Zum Beispiel können chromatographische Techniken, wie HPLC, FPLC, Kapillarelektrophorese oder Gelelektrophorese, eingesetzt werden. Massenspektroskopische oder elektrochemische Techniken können ebenfalls verwendet werden. Die Messung kann während (d.h. Echtzeitanalyse) oder nach der PCR-Amplifikation (d.h. Endpunktanalyse) durchgeführt werden. Je nach der Natur der Markierung ermöglicht die Erfindung die Verwendung von fluorimetrischen, chromatographischen oder physikalischen Nachweissystemen, um den Grad der Verlängerung der Markierungsprimer zu messen. In der bevorzugten Ausführungsform ist eine fluorimetrische Analyse für die Messung der Amplifikationsreaktionsprodukte erwünscht. Die Messung kann auf einer Fluoreszenzpolarisationsanalyse, Fluoreszenzanisotropieanalyse, Fluoreszenzintensitätsanalyse, Fluoreszenzintensitätsverteilungsanalyse, Fluoreszenzlebensdaueranalyse, Fluoreszenzdichroismusanalyse, Fluoreszenz-Resonanzenergie-Transfer-Analyse, spektroskopischen Analyse von Anregungs- und/oder Emissionsspektren oder vorzugsweise Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) beruhen. Sie kann auch auf Kombinationen dieser auf Fluoreszenz beruhenden Techniken beruhen. Weiterhin kann eine fluorimetrische Analyse auch in einem konfokalen Fluoreszenzsystem durchgeführt werden. Für die Multiplexanalyse einer homogenen Amplifikationsreaktion werden Fluoreszenzmarker mit unterscheidbaren optischen Parametern, wie Anregungsspektren, Emissionsspektren, Fluoreszenzlebensdauer, Polarisation, Quantenausbeuten, Photostabilität oder Triplettzahl der Fluorochrome, verwendet. Im Falle von Größen- oder Massenmarkern ist die Spektroskopie ein bevorzugtes Nachweissystem.
In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst die Messung des Verlängerungsgrads eines Markierungsprimers den qualitativen Nachweis von abweichenden Nucleotiden, die innerhalb einer Probe von Zielnucleinsäuresequenzen enthalten sind. Gemäß dieser Ausführungsform zeigt ein verlängerter Markierungsprimer die Anwesenheit eines abweichenden Nucleotids an, und ein nicht verlängerter Markierungsprimer zeigt die Abwesenheit eines abweichenden Nucleotids an.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfasst die Messung der Mengen der verlängerten Markierungsprimer die Quantifizierung von Zielnucleinsäuresequenzen. Dieses Merkmal ist besonders nützlich für die Genotypbestimmung an Proben von Zielnucleinsäuresequenzen. Gemäß dieser Ausführungsform kann die Quantifizierung zum Beispiel erreicht werden durch (i) Berechnen des Verhältnisses der Werte von individuell aufgezeichneten Signalen (Signal A/Signal B) oder (ii) durch Subtrahieren des Werts von Signal B von dem Wert von Signal A.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von einem oder mehreren abweichenden Nucleotiden, die mit einem ererbten oder erworbenen Zustand bzw. Krankheit assoziiert sind, verwendet werden.
Außerdem kann das Verfahren gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung auch zum diagnostischen Durchmustern von vielen Proben von Zielnucleinsäuresequenzen auf ererbte oder erworbene Zustände oder Krankheiten verwendet werden. Das Verfahren erlaubt weiterhin das Durchmustern auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von einem oder mehreren abweichenden Nucleotiden, die eine Prädisposition zum Erwerb eines bestimmten Zustands oder einer bestimmten Krankheit anzeigen können.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Verfahren verwendet werden, um Zielnucleinsäuresequenzen zu quantifizieren, insbesondere um den Genotyp von Zielnucleinsäuresequenzen zu bestimmen. Das Verfahren kann auch für die Bestimmung der Konzentration von DNA oder RNA, mRNA oder viraler DNA oder RNA in einer Probe geeignet sein. Die Verwendung des Verfahrens zu Quantifizierungszwecken kann vorzugsweise für die Bestimmung der Kopienzahl von Zielnucleinsäuresequenzen wünschenswert sein, insbesondere in Proben, die aus Tumorgewebe stammen. Um bei der praktischen Durchführung der Erfindung den Quantifizierungsbereich des Verfahrens zu erhöhen, kann eine Probe von Zielnucleinsäuresequenzen mit einer definierten Menge von künstlich hergestellten Nucleinsäuren als internen Standards gemischt werden. Dann werden alle vorhandenen Nucleinsäuresequenzen durch eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder Reverse Transcription/Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) coamplifiziert, wobei identische Paare von Amplifikationsprimern, aber ziel- und interner-Standard-spezifische Markierungsprimer verwendet werden. Die verschiedenen Typen von Markierungsprimern innerhalb der Reaktion unterscheiden sich durch ihre Marker. Die Mengen beider Typen von Amplifikationsprodukten werden zum Beispiel durch Fluoreszenz oder chromatographisches Auslesen bestimmt. Wenn die Amplifikationskinetik in die Plateauphase eintritt, wird die enzymatische Amplifikationseffizienz beider Targets reduziert. Der Vergleich des interner-Standard-spezifischen Signals mit und ohne Zielnucleinsäuresequenzen spiegelt die Amplifikationseffizienz des gesamten Systems wider. Eine Korrelation der Menge der amplifizierten Produkte mit der gesamten Amplifikationseffizienz ermöglicht eine Verlängerung des Quantifizierungsbereichs.
In einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Kit zum Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit von abweichenden Nucleotiden innerhalb einer Probe von Zielnucleinsäuresequenzen in einem Verfahren gemäß der Erfindung bereit, wobei der Kit Folgendes umfasst: (i) Nucleosidtriphosphate oder funktionelle Derivate davon, ein Polymerisationsmittel, wenigstens ein Paar von zielspezifischen Amplifikationsprimern, die mit einer Zielnucleinsäuresequenz hybridisieren können, wenigstens einen Satz Markierungsprimer, wobei jeder Satz aus wenigstens zwei Typen von Markierungsprimern besteht, die mit einer entsprechenden Zielnucleinsäuresequenz 3' von den Amplifikationsprimern hybridisieren können, so dass jeder Satz Markierungsprimer relativ zu dem entsprechenden Paar von Amplifikationsprimern halbgeschachtelt (semi-nested) ist, und wobei die halbgeschachtelten Markierungsprimer in niedrigeren Konzentrationen vorhanden sind als das Paar von Amplifikationsprimern, wobei die wenigstens zwei Typen von Markierungsprimern eines Satzes Markierungsprimer dadurch gekennzeichnet sind, dass sie im Wesentlichen ähnliche Nucleotidsequenzen haben, abgesehen von wenigstens dem 3'-terminalen Nucleotid, das für jeden Typ von Markierungsprimer verschieden und zu dem abweichenden Nucleotid komplementär ist, wodurch ein verlängerter Markierungsprimer synthetisiert wird, wenn das 3'-terminale Nucleotid des Markierungsprimers komplementär zu dem entsprechenden Nucleotid in der Zielnucleinsäuresequenz ist, und jeder Typ von Markierungsprimer weiterhin dadurch gekennzeichnet ist, dass er eine andere und unterscheidbare Markierung trägt. Wenn der Kit der vorliegenden Erfindung vorzugsweise für die Quantifizierung von Zielnucleinsäuresequenzen verwendet wird, kann es wünschenswert sein, Nucleinsäuresequenzen als interne Standards mitzuverwenden. Solche internen Standards sind künstlich hergestellte Nucleinsäuresequenzen, die mit einer amplifizierten Zielnucleinsäuresequenz im Wesentlichen identisch sind. Um vergleichbare enzymatische Amplifikationseigenschaften von Zielnucleinsäuresequenz und entsprechender, als interner Standard dienender Nucleinsäuresequenz zu gewährleisten, sollte der veränderte Sequenzbereich so klein wie möglich sein, zum Beispiel 1 bis 50 Nucleotide, vorzugsweise 1 bis 20, am meisten bevorzugt 1 bis 4 Nucleotide. Im Falle von längeren Stücken mit veränderter Sequenz sollte die Sequenz verwürfelt (scrambled) sein. Dies bedeutet, dass die Nucleinsäuresequenz so verändert wird, dass die Gesamtnucleotidzusammensetzung (G,C,A,T-Gehalt) im Wesentlichen unverändert bleibt. Im Falle von DNA-Zielnucleinsäuresequenzen ist ein interner DNA-Standard bevorzugt, und im Falle von RNA-Zielnucleinsäuresequenzen ist ein interner RNA-Standard bevorzugt.
Die obigen und weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung von Figuren und den folgenden Beispielen hervor. Das Verfahren der Erfindung wird anhand der Beispielanalyse von drei SNPs veranschaulicht, die mit einem erhöhten Risiko der Tiefvenenthrombose assoziiert sind, der V_Leiden-G₁₆₉₁-Übergang (Zoller et al., J Clin Invest 1994, 94: 2521–2524), der G₂₀₂₁₀A-Polymorphismus im Prothrombin-Gen (Poort et al., Blood 1996, 88: 3698–3703) und die C₆₇₇-Mutation im Gen für 5,10-Methylentetrahydrofolat-Reductase (MTHFR) (Frosst et al., Nat Genet 1995, 10: 111–113).
Beispiel
Die Spezifität, Reproduzierbarkeit, Präzision und Robustheit des erfindungsgemäßen Verfahrens werden anhand der Analyse von drei SNPs aufgezeigt, die mit einem erhöhten Risiko der Tiefvenenthrombose assoziiert sind, der Faktor V_Leiden-G₁₆₉₁A-Übergang (Bertina et al., Nature 1994, 369: 64–67; Zoller und Dahlback, Lancet 1994, 343: 1536–1538; Zoller et al., J Clin Invest 1994, 94: 2521–2524), der G₂₀₂₁₀A-Polymorphismus im Prothrombin-Gen (Degen und Davie, Biochemistry 1987, 26: 6165–6177; Martinelli et al., N Engl J Med 1998, 338: 1793–1797; Poort et al., Blood 1996, 88: 3698–3703) und die C₆₇₇-Mutation im Gen für 5,10-Methylentetrahydrofolat-Reductase (MTHFR) (Fodinger et al., J Nephrol 2000, 13: 20–33; Frosst et al., Nat Genet 1995, 10: 111–113).
Experimentelle Verfahren:

(1) Blutproben und DNA-Präparation: EDTA-Blutproben wurden von einer Blutbank erhalten und bei –20 °C aufbewahrt. Genomische DNA wurde aus Vollblut gewonnen, wobei man den QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendete. DNA wurde durch Messen der Extinktion bei 260 nm quantifiziert, und die Reinheit von Nucleinsäuren wurde durch Überwachen der 260 nm/280 nm-Extinktionsverhältnisse gemessen.
(2) Primergestaltung: Amplifikations- und Markierungsprimer wurden unter Verwendung von Primer Premier Software, Version 5.00 (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA), gestaltet. Für die Reaktionsbedingungen wurden die Default-Einstellungen im Programm verwendet, und für die Primerselektion wurden die folgenden Parameter eingestellt: Primerlänge = 20 ± 5 bp; Primer-Schmelztemperaturbereich Tm) = 47–62 °C, Primer-GC-Gehalt = 40–65%. Wenn notwendig, wurden zusätzliche Parameter eingestellt, um die Primerselektion zu optimieren. Allelspezifische Markierungsprimer wurden mit der 3'-terminalen Base direkt an der polymorphen Stelle positioniert. In Tabelle 1 sind die Nucleinsäuresequenzen der Amplifikations- und Markierungsprimer aufgeführt, die für den Nachweis der jeweiligen Polymorphismen ausgewählt wurden. Alle Primer wurden durch Interactiva (Ulm, Deutschland) synthetisiert. Markierungsprimer, die Wildtyp-Allele ansprechen, wurden durch Standard-Phosphoramidit-Chemie mit TAMRA 5'-markiert, auf mutante Allele gerichtete Markierungsprimer wurden über einen C6-Linker am 5'-Terminus mit N-Hydroxysuccinimid-aktiviertem EVObIue^TM50 (EVOTEC Biosystems, Hamburg, Deutschland) verknüpft.
(3) Assaybedinqungen für GALIOS: Alle PCR-Reaktionen wurden in einem endgültigen Volumen von 50 ml durchgeführt, wobei das GeneAmp PCR System 9700 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt, Deutschland) verwendet wurde. DNA-Proben wurden in doppelten Parallelansätzen amplifiziert und direkt nach dem zyklischen Temperaturwechsel ohne Reinigungsschritte durch FCS analysiert. Für die Faktor-V-Genotypbestimmung bestand die GALIOS-Reaktion aus 1 × Amplifikationspuffer [20 mM Tris-HCl, pH 8,9, 10 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 100 mg/ml BSA, 0,05% Tween-20], 4 mM MgCl₂, 0,2 mM von jedem dNTP, 5% DMSO, 1 E Q-BioTaq (Q-BIOgene, Heidelberg, Deutschland) und 5 ng genomischer DNA. Die Konzentrationen des Amplifikations- und des Markierungsprimers betrugen 300 nM bzw. 10 nM. Für die zyklischen Temperaturwechsel wurde das folgende Profil verwendet: am Anfang 1 min Denaturierung bei 94 °C, dann 40 Cyclen, die aus 94 °C während 10 s, 55 °C während 10 s und 72 °C während 10 s bestanden. Die Proben wurden 5 min lang auf 72 °C gehalten, bevor sie vor der Analyse auf 4 °C gehalten wurden. Im Falle der Prothrombin-Genotypbestimmung enthielt das GALIOS-Reaktionsgemisch 1 × Amplifikationspuffer (dieselbe Zusammensetzung, wie sie oben beschrieben ist), 1,5 mM MgCl₂, 0,2 mM von jedem dNTP, 1 E Q-BioTaq und 10 ng genomische DNA. Der Amplifikations- und der Markierungsprimer wurden in Konzentrationen von 300 nM bzw. 5 nM verwendet. Eine PCR wurde mit den folgenden Temperaturwechselbedingungen durchgeführt: 1 min bei 94 °C, dann 40 Zyklen bei 94 °C während 10 s, 50 °C während 35 s und 72 °C während 20 s. Die endgültige Verlängerung erfolgte bei 72 °C während 5 min. Für die MTHFR-Genotypbestimmung enthielt das GALIOS-Reaktionsgemisch 1 × Amplifikationspuffer (dieselbe Zusammensetzung, wie sie oben beschrieben ist), 1,5 mM MgCl₂, 0,2 mM von jedem dNTP, 1 E Q-BioTaq und 25 ng genomische DNA. Die Primerkonzentrationen waren wie bei der Faktor-V-Genotypbestimmung. Die zyklischen Temperaturwechsel umfassten: 1 min bei 94 °C, dann 40 Zyklen bei 94 °C während 25 s, 55 °C während 25 s und 72 °C während 1 min. Die endgültige Verlängerung erfolgte bei 72 °C während 5 min.
(4) Assaybedinqunaen für PCR/allelspezifische Restriktionsanalyse (PCR-ASRA): Für die Faktor-V-Genotypbestimmung wurde eine PCR-Reaktion in einem endgültigen Volumen von 50 ml durchgeführt, das aus Folgendem bestand: 1 × Amplifikationspuffer [20 mM Tris-HCl, pH 8,9, 10 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 100 mg/ml BSA, 0,05% Tween-20], 4 mM MgCl₂, 0,4 mM von jedem dNTP, 5% DMSO, 300 nM Sense-Primer (5'-GGGCTAATAGGACTACTTCTAATC-3'), 300 nM Antisense-Primer (5'-AGCCAGGAGACCTAACAT-3'), 1 E Q-BioTaq und 300 ng genomische DNA. Eine PCR-Amplifizierung wurde unter Verwendung der folgenden Temperaturwechselbedingungen erreicht: am Anfang 5 min Denaturierung bei 94 °C, dann 40 Zyklen bei 94 °C während 45 s, 55 °C während 45 s und 72 °C während 30 s. Schließlich wurde ein Verlängerungsschritt bei 72 °C während 5 min durchgeführt. Das amplifizierte 135-bp-PCR-Produkt wurde durch Ethanolfällung gereinigt und bei 37 °C während 1,5 Stunden mit 10 E MnlI (New England Biolabs GmbH, Frankfurt, Deutschland) verdaut. Die verdauten Proben wurden durch Elektrophorese in einem 3%igen TAE-Agarose-Gel, das mit Ethidiumbromid angefärbt war, analysiert. Eine 100-bp-DNA-Leiter (Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland) wurde als Größenmarker verwendet.
(5) Datenerfassung und -analyse: Nach den zyklischen Temperaturwechseln wurden 5 ml von jedem PCR-Reaktionsgemisch durch Agarose-Gel-Elektrophorese analysiert, um die erfolgreiche PCR-Amplifikation zu messen. Von jedem PCR-Reaktionsgemisch wurden 20 ml ohne Post-PCR-Modifikation in 96-Napf-Mikroplatten (UniView^TM, Whatman via Merck Eurolab, Bochum, Deutschland) übergeführt. FCS-Messungen wurden mit einem modifizierten konfokalen Mikroskop des Typs Olympus IX50 (Olympus, Hamburg, Deutschland) durchgeführt, das mit Standardfiltersätzen für die Anregung mit einem Helium-Neon-Laser (entweder 543- oder 632-nm-Linie, 40 mW, Uniphase), Objektiv UApo 40x/1.15W, Blende 50 μm, ausgestattet war. Jedes PCR-Reaktionsgemisch wurde fünfmal während jeweils 4 Sekunden sowohl bei 543 nm als auch bei 632 nm gemessen. Aus dem Photonenzählsignal wurde die Autokorrelationskurve berechnet und mit der Autokorrelationsfunktion G(t) bewertet, wobei man ein Zweikomponentenmodell verwendete, das dem freien und dem verlängerten Primer entspricht (Schwille et al., Biophys J 1997, 72: 1878–1886):
wobei T der mittlere Anteil der Farbstoffmoleküle im Triplettzustand mit der Relaxationszeit t ist, N die gesamte mittlere Anzahl der fluoreszierenden Moleküle im Beobachtungsvolumen ist, Y der relative Anteil des verlängerten Primers ist, t_free und t_polyDiffusionszeiten der freien die mittleren Primer bzw. der verlängerten Primer (d.h. des PCR-Produkts) durch das konfokale Beobachtungsvolumen definieren. Der Parameter S = r₀/z₀ beschreibt das Verhältnis des Radius des Nachweisbereichs zu seiner Länge, wobei r₀ und z₀ der laterale und der axiale Radius sind, die das ellipsoide konfokale Beobachtungsvolumen definieren (d.h. die Abstände zwischen der Koordinate, wo die Gauss-Verteilung des Emissionslichts ihren Maximalwert erreicht, und dem Punkt, wo die Lichtintensität auf 1/e² dieses Maximalwerts abgenommen hat). Die FCS-Datenbewertung wurde mit der Software FCS+plus (Version 1.00, EVOTEC BioSystems, Hamburg, Deutschland) durchgeführt und lieferte translationale Diffusionszeiten und relative Anteile von fluoreszierenden Primern und PCR-Produkten. Der relative Anteil an PCR-Produkt aus 10 Messungen (die aus doppelten PCR-Reaktionen, die jeweils fünfmal gemessen wurden, resultieren) wurde als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) berechnet. Dies geschah getrennt für Messungen, die bei 543 nm oder 632 nm erhalten wurden. Schließlich wurde das 543/632-Verhältnis aus dem entsprechenden Mittelwert jeder (doppelten) Sonde berechnet. Die Standardabweichung (SD_x,y) des 543/632-Verhältnisses wurde berechnet gemäß:
wobei x (y) für den Mittelwert bei 543 (632) nm steht und SD_x (SD_y) für die entsprechende SD steht. Die 95%-Konfidenzintervalle der 543/632-Verhältnisse wurden berechnet als:

Ergebnisse und Analyse:
Die Anwendbarkeit des Verfahrens der Erfindung (GALIOS) zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von abweichenden Nucleotiden wurde untersucht, indem man es mit einem bewährten Verfahren zur Genotypbestimmung verglich. Eine Probe von genomischen Zielnucleinsäuresequenzen mit bekannten allelischen Konstitutionen an der polymorphen G₁₆₉₁A-Stelle (d.h. dem abweichenden Nucleotid) des Faktor-V-Gens (wt: G/G; hz: G/A; mut: A/A) wurde parallel durch (1) herkömmliche PCR-Amplifikation und anschließende allelspezifische Restriktionsanalyse (PCR-ASRA) und durch (2) das GALIOS-Verfahren untersucht. Für PCR-ASRA wurde ein 135-bp-Bereich, der den G₁₆₉₁A-Polymorphismus des Faktor-V-Gens enthielt, ausgehend von den Zielnucleinsäurese quenzen amplifiziert und wurde anschließend mit MnlI verdaut (3A, 3B). Da der G₁₆₉₁A-Übergang eine MnlI-Restriktionsstelle im Faktor-V-Gen zerstört, blieb das aus den mutanten Zielnucleinsäuresequenzen erhaltene Amplifikationsprodukt unverdaut, während im Falle von Wildtyp-Zielnucleinsäuresequenzen das Amplifikationsprodukt in ein 43-bp- und ein 92-bp-Fragment geschnitten wurde. Der MnlI-Verdau des Amplifikationsprodukts, das aus heterozygoten Zielnucleinsäuresequenzen erhalten wurde, ergab drei DNA-Fragmente von 43 bp, 92 bp und 135 bp. Zur Genotypbestimmung durch das GALIOS-Verfahren wurden dieselben Proben von genomischen Zielnucleinsäuresequenzen und einer negativen Kontrolle (die keine Zielnucleinsäuresequenzen enthielt) in doppelten Parallelansätzen nach dem GALIOS-Verfahren amplifiziert. Nach 40 zyklischen Temperaturwechseln wurden die Reaktionsgemische ohne Post-PCR-Verarbeitung, physikalische Trennung oder Verdünnungsschritte durch Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (3C) analysiert. Das Volumen des Nachweisfelds bei 543 nm und 632 nm wurde durch Messen von 5 nM TAMRA bzw. 5 nM EVO-blue^TM50 bestimmt. Das Verhältnis des Radius des konfokalen Nachweisvolumens zu seiner Länge, S; betrug 6,9 bei 543 nm und 3,4 bei 632 nm. Die translationale Diffusionszeit der freien Markierungsprimer, τ_free die anhand der negativen GALIOS-Kontrollreaktion definiert ist, betrug 0,153 ms bei 543 nm und 0,342 ms bei 632 nm. Die translationale Diffusionszeit des fluoreszierenden 314-bp-Amplifikationsprodukts, τ_poly, wurde durch Kurvenanpassung der Autokorrelationsdaten mit festen Werten für S und τ_free bewertet und ergaben 1,348 ms bei 543 nm und 2,073 ms bei 632 nm. Da die translationalen Diffusionszeiten von nichtverlängerten Primern und amplifizierten Produkten sowohl bei 543 nm als auch bei 632 nm eindeutig unterscheidbar waren, war es möglich, die Anteile der amplifizierten Produkte zu quantifizieren. Alle Proben wurden fünfmal während jeweils 4 Sekunden bei 543 nm und 632 nm gemessen. Die Werte von 5, τ_free und τ_poly wurden im Anpassungsalgorithmus festgehalten, wie es oben beschrieben ist, um die Zahl der freien Parameter zu reduzieren und die Anteile der Fraktionen der amplifizierten Produkte zu quantifizieren. Die Mittelwerte ± SD der relativen Anteile des fluoreszierenden Amplifikationsprodukts wurden für jeden Genotyp berechnet. Die Reaktionen, die Faktor-V-Wildtyp-Zielnucleinsäuresequenzen enthielten, ergaben 42,85 ± 1,77% Amplifikationsprodukt bei 543 nm, aber nur 4,14 ± 0,61% Amplifikationsprodukt bei 632 nm. Heterozygote Zielnucleinsäuresequenzen in Bezug auf den Faktor-V-G₁₆₉₁A-Polymorphismus ergaben bei beiden Wellenlängen erhebliche Amplifikationsproduktanteile, 31,50 ± 1,30% bei 543 nm und 52,40 ± 1,10% bei 632 nm. Zielnucleinsäuresequenzen, die nur das mutante Faktor-V_Leiden-Allel enthielten, hatten Amplifikationsproduktwerte von nur 2,52 ± 0,99% bei 543 nm, aber 61,95 ± 0,29% bei 632 nm. Die Kontrollreaktionen, die keine Zielnucleinsäuresequenzen enthielten, hatten bei beiden Wellenlängen nur sehr geringe Hintergrund-Amplifikationsproduktanteile: 1,83 ± 0,11% bei 543 nm und 1,24 ± 0,94% bei 632 nm. In allen Fällen waren die Amplifikationsproduktwerte, die eine allelspezifische Primerverlängerung anzeigten, wenigstens 15mal so hoch wie das entsprechende Hintergrundrauschen bei der jeweiligen Wellenlänge. Durch Berechnung der 543/632-Verhältnisse der Amplifikationsproduktwerte aus jeder doppelten Probe wurden repräsentative Werte für jeden Genotyp erhalten (3D). Insgesamt waren die nach dem Verfahren der Erfindung erhaltenen Ergebnisse der Genotypbestimmung mit den durch das PCR-ASRA-Genotyp-Bestimmungsverfahren erhaltenen Ergebnissen vergleichbar. Um die Spezifität des Verfahrens der Erfindung weiter zu bewerten, wurden 18 Proben von Zielnucleinsäuresequenzen mit bekannten Faktor-V-Genotypen, sechs Proben für jeden Genotyp, in doppelten Parallelansätzen amplifiziert und analysiert, wie es oben beschrieben ist. Allen 18 Proben wurde der korrekte Genotyp zugeordnet. Falsch positive oder falsch negative Genotypbestimmungen wurden nicht beobachtet. 4A zeigt Mittelwerte ± SD von relativen Amplifikationsproduktanteilen für jeden Genotyp: Wildtyp (543 nm): 44,79 ± 4,0%; Wildtyp (632 nm) 4,22 ± 3.03%; heterozygot (543 nm): 33,04 ± 4,55%; heterozygot (632 nm) 41,98 ± 4,88%; Mutante (543 nm): 4.09 ± 2,38%; Mutante (632 nm) 64,05 ± 4,63%. Die mittleren 543/632-Verhältnisse ± SD der Amplifikationsproduktfraktionen waren wiederum für jeden Genotyp unterschiedlich: 10,61 ± 5,13 für den Wildtyp, 0,79 ± 0,08 für heterozygote und 0,06 ± 0,04 mit mutante Proben von Zielnucleinsäuresequenzen.
Die Reproduzierbarkeit und Präzision des Verfahrens der Erfindung wurden untersucht, indem man jeden der drei verschiedenen Faktor-V-Genotypen in 36 unabhängigen Experimenten analysierte: 18 Proben von Zielnucleinsäuresequenzen (sechs Proben für jeden Genotyp) wurden parallel durch drei verschiedene Experimentatoren an zwei aufeinanderfolgenden Tagen analysiert. Die gesamte Testmenge umfasste 108 einzelne Reaktionen, und jede einzelne Probe von Zielnucleinsäuresequenzen wurde sechsmal einer Genotypbestimmung unterzogen. Alle Reaktionen führten zu einer korrekten Genotypbestimmung. Diese Ergebnisse unterstreichen die sehr hohe Reproduzierbarkeit (100%) der Genotypbestimmung nach dem Verfahren der Erfindung. In 4B sind die mittleren 543/632-Verhäeltnisse ± SD für jeden Genotyp aufgeführt. Bei 95% Konfidenz liegen die 543/632-Verhältnisse für Faktor-V-Wildtyp-, heterozygote und mutante Proben im Bereich von 9,49 bis 12,49, 0,63 bis 0,67 bzw. 0,03 bis 0,05. Diese Daten zeigen, dass die erhaltenen Ergebnisse in hohem Maße reproduzierbar und genau waren, obwohl die Assays an verschiedenen tagen durch verschiedene Experimentatoren an verschiedenen Proben von Zielnucleinsäuresequenzen für einen gegebenen Genotyp durchgeführt wurden.
Weiterhin wurde die Spezifität des Verfahrens der Erfindung untersucht, indem man 9 genomische Proben von Zielnucleinsäuresequenzen (3 Proben für jeden Faktor-V-Genotyp) in Gegenwart eines ca. 250fachen molaren Überschusses von genomischer DNA von Saccharomyces cerevisiae analysierte (5). Die Ergebnisse der Genotypbestimmung waren in allen Fällen korrekt und ergaben Werte, die mit denen, die aus Kontrollreaktionen ohne 5.-cerevisiae-DNA erhalten wurden, praktisch identisch waren. Die Daten zeigten, dass das Verfahren der Erfindung hochgradig spezifisch ist und selbst in Gegenwart eines hohen Hintergrunds von kontaminierender DNA eindeutige Ergebnisse liefert.
In einer anderen Gruppe von Experimenten wurde die Robustheit der Genotypbestimmung durch das Verfahren der Erfindung nach Zugabe von unterschiedlichen Mengen von Zielnucleinsäuresequenzen untersucht. Drei Proben für jeden Faktor-V-Genotyp wurden nach dem Verfahren der Erfindung analysiert. Die Menge der Zielnucleinsäuresequenzen variierte von 2,5 bis 7,5 ng pro Assay. Wie in 6 gezeigt ist, hatte die Änderung der Gesamtmenge der Zielnuclein säuresequenzen um ±50% keine signifikanten Wirkungen auf die Qualität und Quantität des Fluoreszenzsignals.
Um zu bestätigen, dass das Verfahren der Erfindung im Allgemeinen für den Nachweis von Einzelnucleotidpolymorphismen (SNP) geeignet ist, wurden zwei zusätzliche SNPs, von denen wie bei dem Faktor-V_Leiden-G₁₆₉₁A-Polymorphismus berichtet wurde, dass sie eine Rolle bei der Prädisposition zu Tiefvenenthrombose spielen, analysiert: Der G₂₀₂₁₀A-Polymorphismus im Prothrombin-Gen und die C₆₇₇T-Mutation im Gen für 5,10-Methylentetrahydrofolat-Reductase (MTHFR).
Für beide SNPs wurden 18 Proben von Zielnucleinsäuresequenzen mit bekannten Genotypen (sechs Proben für jeden Genotyp) amplifiziert und gemäß der experimentellen Strategie, die oben für Faktor V beschrieben ist, analysiert. Alle 36 Genotypen wurden korrekt ohne falsch positive oder falsch negative Bestimmungen zugeordnet. 7 (A, C) zeigt den Mittelwert ± SD der relativen Amplifikationsproduktanteile für jeden Genotyp von Prothrombin bzw. MTHFR. Die Reproduzierbarkeit und Präzision der Prothrombin- und MTHFR-Genotypbestimmung durch das Verfahren der Erfindung wurden mit demselben Versuchsaufbau analysiert, wie er oben für Faktor V beschrieben ist: Jeder Genotyp von jedem Polymorphismus wurde 36mal unabhängig untersucht, mit sechs einzelnen Bestimmungen für jede Probe von Zielnucleinsäuresequenzen. Alle 216 Reaktionen ergaben ein korrektes SNP-Scoring. Bei 95% Konfidenz lagen die Werte für Wildtyp-, heterozygote und mutante Proben im Bereich von 9,77–14,57, 1,00–1,12 bzw. 0,10–0,14 für Prothrombin und 10,96–15,50, 0,96–1,04 bzw. 0,10–0,11 für MTHFR (7B, 7D).
Beschreibung der Figuren:
1 zeigt eine Ausführungsform des Prinzips des erfindungsgemäßen GALIOS-Verfahrens für die Analyse von abweichenden Nucleinsäuresequenzen. Genspezifische Amplifikationsprimer (F, R) amplifizieren Wildtyp- und mutante Allele mit gleicher Effizienz. Allelspezifische Markierungsprimer (L1, L2) werden an verschiedene und unterscheidbare Fluoreszenzmarker gebunden und amplifi zieren nur das Allel mit dem entsprechenden abweichenden Nucleotid gleichzeitig effizient. Dies führt zu einer allelspezifischen Akkumulation von fluoreszenten Amplifikationsprodukten, die vorzugsweise durch Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie nachweisbar sind.
2 zeigt das Ausleseergebnis der Analyse des Faktor-V-Polymorphismus durch GALIOS unter Verwendung von Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS). A) Die relativen Mengen der beiden markierungsprimer und ihrer Verlängerungsprodukte werden durch das vorliegende Verfahren bestimmt. Die drei Faktor-V-Genotypen (AA, AB, BB) sind auf der x-Achse dargestellt, und die entsprechenden Mengen des Verlängerungsprodukts (Fluoreszenzsignal in relativen Einheiten) sind auf der y-Achse gezeigt. Die schwarzen Balken zeigen die TAMRA-markierten Produkte (angeregt bei 543 nm), und die schraffierten Balken zeigen die mit EVOblue^TM 50 markierten Produkte (angeregt bei 632 nm), die in derselben Reaktion amplifiziert wurden. B) Zum Zwecke einer bequemeren Genotypbestimmung werden die gemessenen Fluoreszenzsignale für die TAMRA-markierten Moleküle durch das Fluoreszenzsignal für die mit EVOblue^TM 50 markierten Produkte dividiert. Die erhaltenen Werte ermöglichen eine eindeutige und hochspezifische Genotypbestimmung.
3 zeigt die Analyse des G₁₆₉₁A-Polymorphismus des Faktor-V-Gens durch herkömmliche Amplifikation und anschließende allelspezifische Restriktionsanalyse (PCR-ASRA) und nach dem Verfahren der Erfindung (GALIOS). A) Schematische Darstellung des MnlI-Restriktionsverdaus. Ein 135-bp-Amplifikationsprodukt aus dem Wildtypallel wird zu einem 43-bp- und einem 92-bp-Fragment geschnitten, während das aus dem mutanten Allel erhaltene Amplifikationsprodukt unverdaut bleibt. B) Analyse der MnlI-Restriktion durch Agarose-Gel-Elektrophorese. Spur 1, 8: 100-bp-DNA-Leiter. Spur 2–7: PCR-Produkte aus genomischer DNA, und zwar Wildtyp wt (2, 3), heterozygot hz (4, 5) oder mutant mut (6, 7) in Bezug auf den Faktor-V-G₁₆₉₁A-Polymorphismus vor (2, 4, 6) und nach (3, 5, 7) MnlI-Verdau. Alle Proben ergaben die erwarteten Restriktionsfragmentmuster, d.h. 92 bp und 43 bp für den Wildtyp; 135 bp, 92 bp und 43 bp für heterozygote und 135 bp für mutante DNA. C) GALIOS-Genotypbestimmung des Faktor-V-G₁₆₉₁A-Polymorphismus. Mittelwerte ± SD von relativen Fraktionen von fluoreszierendem PCR-Produkt, die bei 543 nm und 632 nm erhalten wurden, für jeden Faktor-V-Genotyp (wt, hz, mut) und für eine negative Kontrolle ohne Matrize (n.c.). D) Mittlere 543/632-Verhältnisse ± SD und entsprechende 95%-Konfidenzintervalle für jeden Faktor-V-Genotyp.
4 zeigt Daten für die Spezifität, Reproduzierbarkeit und Präzision des Verfahrens der Erfindung. A) Sechs genomische DNA-Proben wurden für jeden Faktor-V-Genotyp analysiert. Die Graphik zeigt Mittelwerte ± SD von relativen Anteilen von fluoreszierenden Amplifikationsprodukten, die bei 543 nm und 632 nm erhalten wurden, für jeden Genotyp. B) Mittlere 543/632-Verhältnisse ± SD und entsprechende 95%-Konfidenzintervalle für jeden Faktor-V-Genotyp sind aufgeführt. Die Daten wurden aus n = 36 unabhängigen Bestimmungen für jeden Genotyp erhalten.
5 zeigt die Spezifität des GALIOS-Verfahrens in Gegenwart einer kontaminierenden Matrize. Die GALIOS-Genotypbestimmung wurde parallel mit humaner genomischer DNA und mit einem Gemisch von humaner genomischer DNA und kontaminierender S.-cerevisiae-DNA (jeweils 5 ng) durchgeführt. Dies stellt einen 250fachen molaren Überschuss von S.-cerevisiae-DNA gegenüber humaner genomischer DNA dar. Drei genomische DNA-Proben für jeden Genotyp wurden getestet. Die Daten stellen Mittelwerte ± SD von Fluoreszenzsignalen für jeden Genotyp dar.
6 zeigt exemplarisch die Robustheit des GALIOS-Verfahrens zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit von abweichenden Nucleotiden. Die Menge der Zielnucleinsäuresequenzen in dem Assay wurde um ± 50% gegenüber der optimalen Konzentration (5 ng) variiert. Für jeden Genotyp wurden drei genomische DNA-Proben analysiert. Die Daten stellen Mittelwerte ± SD von Fluoreszenzsignalen für jeden Genotyp dar.
7 zeigt die Ergebnisse der GALIOS-Genotypbestimmung des Prothrombin-G₂₀₂₁₀A- und des MTHFR-C₆₇₇T-Polymorphismus. A, C) Sechs genomische DNA- Proben für jeden Prothrombin- (A) oder für jeden MTHFR-Genotyp (C) wurden in doppelten Parallelansätzen analysiert. Die Graphik zeigt Mittelwerte ± SD von relativen Anteilen von fluoreszierenden PCR-Produkten, die bei 543 nm und bei 632 nm erhalten wurden. B, D) Mittlere 543/632-Verhältnisse ± SD und entsprechende 95%-Konfidenzintervalle für jeden Prothrombin- (B) und MTHFR-Genotyp (D) sind aufgeführt. Die Daten wurden aus n = 36 unabhängigen Bestimmungen für jeden Genotyp erhalten.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit von abweichenden Nucleotiden innerhalb von Zielnucleinsäuresequenzen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (i) Herstellen eines Reaktionsgemischs, umfassend: • Nucleosidtriphosphate oder funktionelle Derivate davon; • ein Polymerisationsmittel; • wenigstens ein Paar von zielspezifischen Amplifikationsprimern, die mit Zielnucleinsäuresequenzen hybridisieren können; • wenigstens ein Satz Markierungsprimer, wobei jeder Satz aus wenigstens zwei Typen von Markierungsprimern besteht, die mit entsprechenden Zielnucleinsäuresequenzen 3' von den Amplifikationsprimern hybridisieren können, so dass jeder Satz Markierungsprimer relativ zu dem entsprechenden Paar von Amplifikationsprimern halbgeschachtelt (semi-nested) ist, und wobei die halbgeschachtelten Markierungsprimer in niedrigeren Konzentrationen vorhanden sind als das Paar von Amplifikationsprimern; wobei die wenigstens zwei Typen von Markierungsprimern eines Satzes Markierungsprimer dadurch gekennzeichnet sind, dass sie im Wesentlichen ähnliche Nucleotidsequenzen haben, abgesehen von wenigstens dem 3'-terminalen Nucleotid, das für jeden Typ von Markierungsprimer verschieden und zu dem abweichenden Nucleotid komplementär ist, wodurch ein verlängerter Markierungsprimer synthetisiert wird, wenn das 3'-terminale Nucleotid des Markierungsprimers komplementär zu dem entsprechenden Nucleotid in der Zielnucleinsäuresequenz ist, und wodurch im Wesentlichen kein oder nur ein vernachlässigbarer Hintergrund von verlängertem Markierungsprimer synthetisiert wird, wenn das terminale Nucleotid nicht komplementär zu dem entsprechenden Nucleotid in der Zielnucleinsäuresequenz ist, und jeder Typ von Markierungsprimer weiterhin dadurch gekennzeichnet ist, dass er eine andere und unterscheidbare Markierung trägt; und • wenigstens eine Probe von Zielnucleinsäuresequenzen; (ii) Durchführen einer Amplifikationsreaktion unter Bedingungen, die die Hybridisierung der Amplifikationsprimer und der Markierungsprimer, entweder zusammen oder nacheinander, an die entsprechenden Zielnucleinsäuresequenzen ermöglichen, und Fördern der Polymerisation; und (iii) Messen spezieller Eigenschaften der Typen von Markierungsprimern während oder nach der Beendigung der Amplifikationsreaktion, wobei die spezifischen Eigenschaften auf eine Verlängerung oder Nichtverlängerung der Markierungsprimer hinweisen, wodurch die Anwesenheit oder Abwesenheit eines abweichenden Nucleotids innerhalb einer Zielnucleinsäuresequenz nachgewiesen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Konzentration jedes Markierungsprimers 0,1- bis 300mal, vorzugsweise 5- bis 30mal, niedriger ist als die Konzentration jedes Amplifikationsprimers.
Verfahren gemäß Anspruch 1 und 2, wobei jeder Markierungsprimer wenigstens eine Markierung enthält, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Fluoreszenzfarbstoffen, Chemilumineszenzmarkern, Elektrolumineszenzmarkern, Affinitäts- oder Bindungsmarkern, positionsspezifischen Markern und/oder Markern mit spezifischen physikalischen Eigenschaften, wie unterschiedlicher Größe, Masse oder Drehrichtung, besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 3, wobei die Markierungsprimer Fluoreszenzfarbstoffe enthalten und wobei jeder Typ von Markierungsprimer mit einem anderen Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, so dass jeder Typ von Markierungsprimer durch unterschiedliche Anregungs- und/oder Emissionsspektren, Lebensdauereigenschaften, Polarisationseigenschaften, Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer(FRET)-Eigenschaften, Quantenausbeuten, Photostabilität oder Triplettzahl der Fluorochrome gekennzeichnet ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 4, wobei der Marker permanent oder temporär an den Markierungsprimer, vorzugsweise das 5'-Ende des Markierungsprimers, gebunden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 5, wobei die Amplifikationsreaktion und das Messen in einem homogenen Format durchgeführt werden.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 6, wobei das Polymerisationsmittel ein Enzym ist, vorzugsweise eine DNA-Polymerase, vorzugsweise eine thermostabile DNA-Polymerase, am meisten bevorzugt eine thermostabile DNA-Polymerase, der die 5'→3'-Exonuclease-Aktivität fehlt.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 7, wobei die Probe von Zielnucleinsäuresequenzen aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus genomischer DNA, cDNA, einzelsträngiger DNA, doppelsträngiger DNA, Plasmid-DNA, RNA, Gemischen von DNA mit anderen Molekülen, DNA oder RNA aus menschlichen Quellen oder anderen Quellen, wie Säugern, Wirbeltieren, Wirbellosen, Bakterien, Viren, Hefen, Pilzen oder Pflanzen, besteht.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 8, wobei das Messen der speziellen Eigenschaften der Amplifikationsreaktionsprodukte durch chromatographische Techniken, wie HPLC, FPLC, Kapillarelektrophorese, Gelelektrophorese, oder durch massenspektroskopische oder elektrochemische Techniken oder vorzugsweise durch Fluoreszenztechniken, wie Fluoreszenzpolarisationsspektroskopie, Fluoreszenzlebensdauerspektroskopie, Fluoreszenzintensitätsverteilungsanalyse (FIDA), Fluoreszenzdichroismusanalyse, Fluoreszenzintensitätsanalyse, Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer(FRET)-Analyse, spektroskopische Analyse von Anregungs- und/oder Emissionsspektren oder insbesondere durch Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie erfolgt.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 9, wobei das Messen des Verlängerungsgrads eines Markierungsprimers insofern den qualitativen Nachweis von abweichenden Nucleotiden innerhalb einer Probe von Zielnucleinsäuresequenzen umfasst, als ein verlängerter Markierungsprimer die Anwesenheit eines abweichenden Nucleotids anzeigt und ein nicht verlängerter Markierungsprimer die Abwesenheit eines abweichenden Nucleotids anzeigt.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 9, wobei das Messen der Menge der verlängerten Markierungsprimer die Quantifizierung von Zielnucleinsäuresequenzen, insbesondere die Genotypbestimmung von Proben von Zielnucleinsäuresequenzen, umfasst, vorzugsweise (i) durch Berechnen des Verhältnisses der Werte von individuell aufgezeichneten Signalen (Signal A/Signal B) oder (ii) durch Subtrahieren des Werts von Signal B von dem Wert von Signal A.
Verwendung des Verfahrens gemäß den Ansprüchen 1 bis 11 zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von einem oder mehreren abweichenden Nucleotiden, die mit einem ererbten oder erworbenen Zustand bzw. Krankheit assoziiert sind.
Verwendung des Verfahrens gemäß den Ansprüchen 1 bis 11 zum diagnostischen Durchmustern von Proben von Zielnucleinsäuresequenzen auf ererbte oder erworbene Zustände und Krankheiten und zum Durchmustern auf Prädispositionen für solche Zustände und Krankheiten.
Verwendung des Verfahrens gemäß den Ansprüchen 1 bis 11 zum Quantifizieren von Zielnucleinsäuresequenzen, insbesondere zur Genotypbestimmung von Zielnucleinsäuresequenzen, zum Bestimmen der Konzentration von DNA oder RNA oder mRNA oder viraler RNA in einer Probe oder zum Bestimmen der Kopienzahl von Zielnucleinsäuresequenzen, insbesondere zum Bestimmen der Kopienzahl von Zielnucleinsäuresequenzen in Proben, die von Tumorgewebe abgeleitet sind.
Kit zum Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit von abweichenden Nucleotiden innerhalb einer Probe von Zielnucleinsäuresequenzen in einem Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 11, wobei der Kit Folgendes umfasst: • Nucleosidtriphosphate oder funktionelle Derivate davon; • ein Polymerisationsmittel; • wenigstens ein Paar von zielspezifischen Amplifikationsprimern, die mit Zielnucleinsäuresequenzen hybridisieren können; • wenigstens ein Satz Markierungsprimer, wobei jeder Satz aus wenigstens zwei Typen von Markierungsprimern besteht, die mit entsprechenden Zielnucleinsäuresequenzen 3' von den Amplifikationsprimern hybridisieren können, so dass jeder Satz Markierungsprimer relativ zu dem entsprechenden Paar von Amplifikationsprimern halbgeschachtelt (semi-nested) ist, und wobei die halbgeschachtelten Markierungsprimer in niedrigeren Konzentrationen vorhanden sind als das Paar von Amplifikationsprimern; wobei die wenigstens zwei Typen von Markierungsprimern eines Satzes Markierungsprimer dadurch gekennzeichnet sind, dass sie im Wesentlichen ähnliche Nucleotidsequenzen haben, abgesehen von wenigstens dem 3'-terminalen Nucleotid, das für jeden Typ von Markierungsprimer verschieden und zu dem abweichenden Nucleotid komplementär ist, wodurch ein verlängerter Markierungsprimer synthetisiert wird, wenn das 3'-terminale Nucleotid des Markierungsprimers komplementär zu dem entsprechenden Nucleotid in der Zielnucleinsäuresequenz ist, und wodurch im Wesentlichen kein oder nur ein vernachlässigbarer Hintergrund von verlängertem Markierungsprimer synthetisiert wird, wenn das terminale Nucleotid nicht komplementär zu dem entsprechenden Nucleotid in der Zielnucleinsäuresequenz ist, und jeder Typ von Markierungsprimer weiterhin dadurch gekennzeichnet ist, dass er eine andere und unterscheidbare Markierung trägt.
Kit gemäß Anspruch 15, der wenigstens eine Probe von internen Standardnucleinsäuresequenzen umfasst.