DE69736637T2 - Multiplex amplifikation kurzer tandem repeat loci - Google Patents

Multiplex amplifikation kurzer tandem repeat loci Download PDF

Info

Publication number
DE69736637T2
DE69736637T2 DE69736637T DE69736637T DE69736637T2 DE 69736637 T2 DE69736637 T2 DE 69736637T2 DE 69736637 T DE69736637 T DE 69736637T DE 69736637 T DE69736637 T DE 69736637T DE 69736637 T2 DE69736637 T2 DE 69736637T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
seq
loci
series
amplified
alleles
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69736637T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69736637D1 (de
Inventor
W. James Madison SCHUMM
A. Katherine Oregon MICKA
R. Dawn DeForest RABBACH
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Promega Corp
Original Assignee
Promega Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=24536076&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DE69736637(T2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Promega Corp filed Critical Promega Corp
Publication of DE69736637D1 publication Critical patent/DE69736637D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE69736637T2 publication Critical patent/DE69736637T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen den Nachweis genetischer Marker in einem genomischen System. Die vorliegende Erfindung betrifft genauer gesagt die gleichzeitige Amplifikation verschiedener multipler polymorpher genetischer Loci unter Verwendung von Polymerasekettenreaktion oder anderen Amplifikationssystemen, um in einer Reaktion die Allele eines jeden im Multiplex-System enthaltenen Locus zu bestimmen.
  • Während der letzten Jahre hat die Entdeckung und Entwicklung polymorpher kurzer Tandemwiederholungen (STRs) als genetische Marker zu einem Fortschritt in der Entwicklung von Kopplungskarten, der Identifikation und Charakterisierung erkrankter Gene sowie der Vereinfachung und Präzision der DNA-Typisierung geführt.
  • Viele Loci, zumindest im menschlichen Genom, enthalten polymorphe STR-Regionen (D. Adamson et al., A collection of ordered tetranucleotide-repeat markers from the human genome, Am. J. Hum. Genet. 57, 619-628 (1995); J. C. Murray et al., A comprehensive human linkage map with centimorgan density, Science 265, 2049-2054 (1994); T. J. Hudson, M. Engelstein, M. K. Lee, E. C. Ho, M. J. Rubenfield, C. P. Adams, D. E. Housman und N. C. Dracopoli, Isolation and chromosomal assignment of 100 highly informative human simple sequence repeat polymorphisms, Genomics 13, 622-629 (1992)). STR-Loci bestehen aus kurzen wiederholenden Sequenzelementen mit einer Länge von 3 bis 7 Basenpaaren. Es wird geschätzt, dass 2.000.000 erwartete trimere und tetramere STRs so häufig wie einmal alle 15 Kilobasen (kb) im menschlichen Genom vorhanden sind (Edwards et al., DNA typing and genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeats, Am. J. Hum. Genet. 49, 746-756 (1991); J. S. Beckman and J. L. Weber, Survey of human and rat microsatellites, Genomics 12, 627-631 (1992)). Beinahe die Hälfte der von Edwards et al. (1991) studierten STR-Loci sind polymorph, was eine reichhaltige Quelle genetischer Marker darstellt.
  • Eine Variation in der Anzahl kurzer Tandemwiederholungseinheiten an einem bestimmten Locus führt zu einer von Allel zu Allel und von Individuum zu Individuum unterschiedlichen Variation der Länge der DNA an diesem Locus. Solch ein Längen-Polymorphismus erinnert an die variable Anzahl an Tandemwiederholungs-(VNTR-)Loci (Y. Nakamura et al., Variable number of tandem repeat (VNTR) markers for human gene mapping, Science 235, 1616-1622 (1987)) und Minisatelliten-Loci (A. J. Jeffreys et al., Hypervariable 'minisatellite' regions in human DNA, Nature 314, 67-73 (1985)), die beide bedeutend längere Wiederholungseinheiten als STR-Loci enthalten. Solch ein Längen-Polymorphismus erinnert ebenso an die Dinucleotid-Wiederholungsform von Mikrosatelliten-Loci (M. Litt und J. A. Luty, A hypervariable microsatellite revealed by in-vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene, Am. J. Hum. Genet. 44, 397-401 (1989); D. Tautz et al., Cryptic simplicity in DNA is a major source of genetic variation, Nature 322, 652-656 (1986); J. L Weber und P. E. May, Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction, Am. J. Hum. Genet. 44, 388-396 (1989); Beckmann und Weber (1992)), eine Form von Mikrosatelliten-Loci mit kürzeren Wiederholungseinheiten als STR-Loci.
  • Polymorphe STR-Loci sind besonders nützliche Marker zur menschlichen Identifikation, für Vaterschaftstests und zur Genkartierung. STR-Loci können mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung spezifischer Primersequenzen amplifiziert werden, die in den die Tandemwiederholung flankierenden Regionen identifiziert werden.
  • Allele dieser Loci werden durch die Anzahl der Kopien der in der amplifizierten Region enthaltenen Wiederholungssequenz differenziert und werden voneinander nach der Trennung mittels Elektrophorese durch jegliches geeignete Verfahren zum Nachweis, unter anderem durch Radioaktivität, Fluoreszenz, Silberfärbung und Färbung, unterschieden.
  • Um Arbeit, Materialien und Analysezeit zu minimieren, ist die gleichzeitige Analyse multipler Loci und/oder mehrerer Proben wünschenswert. Ein Ansatz zum Erreichen dieses Ziels umfasst die gleichzeitige Amplifikation multipler Loci in einer einzigen Reaktion. Solche "Multiplexamplifikationen", wie sie genannt werden, wurden in der Literatur ausführlich beschrieben. Multiplexamplifikationssets zur Analyse von mit menschlichen genetischen Erkrankungen, wie z.B. Duchenne-Muskeldystrophie, in Verbindung gebrachten Genen wurden in großem Rahmen entwickelt (J. S. Chamberlain et al., Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification, Nucleic Acid Res. 16, 11141-11156 (1988); J. S. Chamberlain et al., Multiple PCR for the diagnosis of Duchenne muscular dystrophy, In PCR Protocols, A Guide to Methods and Application, 272-281, D. N. Gelfand et al. (Hrsg.), Academic Press, San Diego, CA (1989); A. H. Beggs et al., Detection of 98 % DMD/BMD gene deletions by PCR, Hum. Genet. 86, 45-48 (1990); P. R. Clemens et al., Carrier detection and prenatal diagnosis in Duchenne and Becker muscular dystrophy families, using dinucleotide repeat polymorphisms, Am. J. Hum. Genet. 49, 951-960 (1991); J. S. Schwartz et al., Fluorescent multiple linkage analysis and carrier detection for Duchenne/Becker's muscular dystrophy, Am J. Hum. Genet. 51, 721-729 (1992); A. E. Covone et al., Screening Duchenne and Becker muscular dystrophy patients for deletions in 30 exons of the dystrophin gene by three-multiplex PCR, Am. J. Hum. Genet. 51, 675-677 (1992)), Lesch-Nyhan-Syndrom (R. A. Gibbs et al., Multiple DNA deletion detection and exon sequencing of the hypoxanthine phosphoribosyltransferase gene in Lesch-Nyhan families, Genomics 7, 235-244 (1990)), zystische Fibrose (X. Estivill et al., Prenatal diagnosis of cystic fibrosis by multiplex PCR of mutation and microsatellite alleles, Lancet 338, 458 (1991); P. Fortina et al., Non-radioactive detection of the most common mutations in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene by multiplex polymerase chain reaction, Hum. Genet. 90, 375-378 (1992); R. M. Ferrie et al., Development, multiplexing and application of ARMS tests for common mutations in the CFTR gene, Am. J. Hum. Genet. 51, 251-262 (1992); N. Morral und X. Estivill, Multiplex PCR amplification of three microsatellites within the CFTR gene, Genomics 51, 1362-1364 (1992)) und Retinoblasma (D. Lohmann et al., Detection of small RB1 gene deletions in retinoblastoma by multiplex PCR and high-resolution gel electrophoresis, Hum. Genet. 89, 49-53 (1992)). Es wurde eine Multiplexamplifikation polymorpher Mikrosatellitenmarker (Clemens et al. (1991); Schwartz et al. (1992); T. H.-M. Huang et al., Genetic mapping of four dinucleotide repeat loci DXS435, DXS45, DSX454, DXS424, on the X chromosome using the multiplex polymerase chain reaction, Genomics 13, 375-380 (1992)) und sogar STR-Marker (A. Edwards et al., Genetic variation at five trimeric and tetrameric tandem repeat loci in four human population groups, Genomics 12, 241-253 (1992); C. P. Kimpton et al., Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci, PCR Methods and Applications 3, 13-22 (1993); H. A. Hammond et al., Evaluation of 13 STR loci for use in personal identification applications, Am. J. Hum. Genet. 55, 175-189 (1994); J. W. Schumm et al., Development of nonisotopic multiplex amplification sets for analysis of polymorphic STR loci, The Fourth International Symposium on Human Identification 1993, 177-187 (1994); N. J. Oldroyd et al., A highly discriminating octoplex short tandem repeat polymerase chain reaction system suitable for human individual identification, Electrophoresis 16, 334-337 (1995)) beschrieben.
  • Diese amplifizierten Produkte werden im Allgemeinen durch eines verschiedener Elektrophoreseverfahren getrennt, die dem Fachmann bekannt sind. Einige wohlbekannte Verfahren zum Nachweisen der amplifizierten Produkte wurden ebenso beschrieben. Während in einigen Fällen eine Ethidiumbromidfärbung oder Silberfärbung der amplifizierten Fragmente verwendet wird, werden in anderen Fällen bevorzugt Verfahren benutzt, die nur einen der beiden Stränge des amplifizerten Materials markieren. Beispiele dafür umfassen radioaktives Markieren oder Fluoreszenzmarkieren von einem der beiden Primer vor der Amplifikation eines Locus. Einer der anspruchsvolleren Ansätze bezüglich des Nachweises ist die Verwendung verschiedener Fluoreszenzmarkierungen, um ein Nachweisen der amplifizierten Materialien zu ermöglichen, die unterschiedliche Loci darstellen, jedoch nach der Elektrophorese im selben Raum vorhanden sind. Die Produkte der verschiedenen Loci werden mit der Verwendung von Filtern oder anderen unterscheidenden Detektoren differenziert, die das Sichtbarmachen von je einer fluoreszierenden Markierung nach der anderen ermöglichen.
  • Es wird auf die internationalen Veröffentlichungen WO 93/18177 und WO 93/18178 von Fortina et al. verwiesen, die unter Verwendung eines allelspezifischen Multiplex polymerasekettenreaktionssystems auf Verfahren und Sets zur Diagnose von Erkrankungen, wie z.B. zystischer Fibrose bzw. β-Thalassämie, gerichtet sind. Gemäß Fortina et al. wurde die Multiplex-PCR auch zur gleichzeitigen Amplifikation mehrerer Targetsequenzen verwendet, was unter Verwendung von zwei Bahnen eines Agarosegels ein Mutanten-Allelscanning ermöglicht.
  • A. Ballabio et al., PCR Tests for Cystic Fibrosis Deletion, Nature 343, 220 (1991), offenbart einen einröhrigen allelspezifischen Multiplex-PCR-Test, der zwei verschiedene farbmarkierte fluoreszierende Primer zum Nachweisen der F508-Mutation der zystischen Fibrose verwendet.
  • Während es Multiplexamplifikationsverfahren für spezifische Loci gibt, ist die Verwendung von Multiplexamplifikationsverfahren zum Nachweisen von Allelen bei anderen Loci-Typen, wie z.B. spezifischen STR-Loci, höchst erwünscht. Ebenso ist die Identifikation von Primern wünschenswert, die eine Multiplexamplifikation solcher Loci ermöglichen.
  • WO 96/10648 offenbart die Multiplexamplifikation kurzer Tandemwiederholungs-Loci.
  • KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, unter Verwendung der PCR oder anderer Amplifikationssysteme ein Verfahren sowie Materialien zur gleichzeitigen Amplifikation mehrerer verschiedener polymorpher kurzer Tandemwiederholungs-(STR-)Loci bereitzustellen, um in einer Reaktion die Allele eines jeden im Multiplex enthaltenen Locus zu bestimmen. Die Multiplexanalyse der Gruppen der hierin offenbarten spezifischen STR-Loci wurden zuvor nach dem Stand der Technik noch nicht beschrieben. Weiters gab es ebenso zuvor noch keine Beschreibung der Sequenzen für viele der im Folgenden hierin offenbarten Primer, von denen für alle gezeigt wurde, dass sie für die Multiplexamplifikation solcher STR-Loci nützlich sind.
  • Es ist ebenso ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren, ein Set und Primer bereitzustellen, die für Multiplexamplifikationen, die spezifizierte Loci umfassen, spezifisch sind.
  • Die vorliegende Erfindung nimmt sich dieses Ziels und anderer Ziele an und betrifft ein Verfahren sowie Materialien zur gleichzeitigen Analyse oder Bestimmung der an jedem einzelnen Locus jedes Multiplex vorhandenen Allele. Im Allgemeinen umfasst das Verfahren dieser Erfindung folgende Schritte: (a) das Erhalten zumindest einer zu analysierenden DNA-Probe, wobei die DNA-Probe zumindest zwei Loci besitzt, die zusammen amplifiziert werden können; (b) das Amplifizieren der STR-Sequenzen der DNA-Probe und (c) das Nachweisen der amplifizierten Materialien auf eine Art und Weise, die die polymorphe Natur der verwendeten Systeme aufzeigt.
  • Genauer gesagt ist das Verfahren dieser Erfindung ein Verfahren des gleichzeitigen Bestimmens der Allele, die in drei Tandemwiederholungs-Loci einer oder mehrerer DNA-Proben vorhanden sind, wobei dieses Verfahren folgende Schritte umfasst:
    • (a) das Erhalten zumindest einer zu analysierenden DNA-Probe, worin die DNA-Probe eine Gruppe von drei Loci besitzt, die zusammen amplifiziert werden können, worin die Gruppe an Loci aus einer hierin offenbarten spezifischen Gruppe oder aus Gruppen an Loci ausgewählt ist;
    • (b) das Coamplifizieren der Gruppe an Loci in einer Multiplexamplifikationsreaktion, worin das Reaktionsprodukt ein Gemisch aus amplifizierten Allelen aus jedem der coamplifizierten Loci in der Gruppe ist; und
    • (c) das Evaluieren der amplifizierten Allele in dem Gemisch, um die an jedem der Loci vorhandenen Allele, die in der Gruppe in der DNA-Probe analysiert werden, zu bestimmen.
  • In einer Ausführungsform dieser Erfindung werden drei STR-Loci zusammen amplifiziert, und die Gruppe der drei coamplifizierten Loci wird aus der Gruppe der Gruppen ausgewählt, die aus folgenden besteht:
    D3S1539, D19S253, D13S317;
    D10S1239, D9S930, D20S481;
    D10S1239, D4S2368, D20S481;
    D10S1239, D9S930, D4S2368;
    D16S539, D7S820, D13S317; und
    D10S1239, D9S930, D13S317.
  • In einer bevorzugteren Ausführungsform des Verfahrens dieser Erfindung besitzt die DNA-Probe vier STR-Loci, die zusammen amplifiziert werden können, und die Gruppe der coamplifizierten Loci wird aus der Gruppe der Loci ausgewählt, die aus folgenden besteht:
    D3S1539, D4S2368, D5S818, D7S820, D9S930, D10S1239,
    D13S317, D14S118, D14S548, D14S562, D16S490, D16S539,
    D16S753, D17S1298, D17S1299, D19S253, D20S481, D22S683,
    HUMCSF1PO, HUMTPOX, HUMTH01, HUMFESFPS, HUMF13A01,
    HUMBFXIII, HUMLIPOL, HUMvWFA31.
  • Die Gruppe von vier STR-Loci, die zusammen amplifiziert werden, ist noch bevorzugter eine Gruppe, die aus den Gruppen von vier Loci ausgewählt wird, die folgende umfassen:
    D3S1539, D7S820, D13S317, D5S818;
    D17S1298, D7S820, D13S317, D5S818;
    D20S481, D7S820, D13S317, D5S818;
    D9S930, D7S820, D13S317, D5S818;
    D10S1239, D7S820, D13S317, D5S818;
    D14S118, D7S820, D13S317, D5S818;
    D14S562, D7S820, D13S317, D5S818;
    D14S548, D7S820, D13S317, D5S818;
    D16S490, D7S820, D13S317, D5S818;
    D17S1299, D7S820, D13S317, D5S818;
    D16S539, D7S820, D13S317, D5S818;
    D22S683, D7S820, D13S317, D5S818;
    D16S753, D7S820, D13S377, D5S818;
    D3S1539, D19S253, D13S317, D20S481;
    D3S1539, D19S253, D4S2368, D20S481;
    D10S1239, D9S930, D4S2368, D20S481; und
    D16S539, D7S820, D13S317, HUMvWFA31.
  • Noch bevorzugter ist die zusammen amplifizierte Gruppe an STR-Loci eine Gruppe aus sechs Loci, die aus den Gruppen der Loci ausgewählt werden, die folgendes umfassen:
    D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO, HUMTPOX;
    und
    D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01, HUMFESFPS.
  • Noch bevorzugter ist die zusammen amplifizierte Gruppe an STR-Loci eine Gruppe aus sieben Loci, die aus den Gruppen der Loci ausgewählt werden, die folgendes umfassen:
    D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO, HUMTPOX, HUMTH01; und
    D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01, HUMFESFPS, HUMBFXIII.
  • Noch bevorzugter ist die zusammen amplifizierte Gruppe an STR-Loci eine Gruppe aus acht Loci, die aus den Gruppen der Loci ausgewählt werden, die folgendes umfassen:
    D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO, HUMTPOX, HUMTH01, HUMvWFA31; und
    D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01, HUMFESFPS, HUMBFXIII, HUMLIPOL.
  • Der Multiplexamplifikationsreaktionsschritt des Verfahrens wird vorzugsweise mit einem Primerpaar durchgeführt, das jeden Locus in der Gruppe der in der Reaktion coamplifizierten Loci flankiert. Noch bevorzugter werden für die Multiplexamplifikationsreaktion Primerpaare ausgewählt, die Allele aus jedem Locus produzieren, die die Allele aus den anderen Loci in der darin coamplifizierten Gruppe nicht überlappen, wenn die Allele durch Gelelektrophorese getrennt werden. Noch bevorzugter wird die Sequenz aus einem eines jeden in der Multiplexamplifikationsreaktion verwendeten Primerpaars aus einer Gruppe an Primersequenzen ausgewählt, die aus den folgenden bestehen:
    Seq.-ID Nr. 1 und Seq.-ID Nr. 2, wenn einer der Loci in der Gruppe D7S820 ist;
    Seq.-ID Nr. 3 und Seq.-ID Nr. 4, wenn einer der Loci in der Gruppe D13S317 ist;
    Seq.-ID Nr. 5 und Seq.-ID Nr. 6, wenn einer der Loci in der Gruppe D5S818 ist;
    Seq.-ID Nr. 7, Seq.-ID Nr. 8 und Seq.-ID Nr. 49, wenn einer der Loci in der Gruppe D3S1539 ist;
    Seq.-ID Nr. 9, Seq.-ID Nr. 10, wenn einer der Loci in der Gruppe D17S1298 ist;
    Seq.-ID Nr. 11, Seq.-ID Nr. 12, Seq.-ID Nr. 52, Seq.-ID Nr. 53, wenn einer der Loci in der Gruppe D20S481 ist;
    Seq.-ID Nr. 13, Seq.-ID Nr. 14, Seq.-ID Nr. 55, Seq.-ID Nr. 61, wenn einer der Loci in der Gruppe D9S930 ist;
    Seq.-ID Nr. 15, Seq.-ID Nr. 16, Seq.-ID Nr. 54, wenn einer der Loci in der Gruppe D10S1239 ist;
    Seq.-ID Nr. 17, Seq.-ID Nr. 18, wenn einer der Loci in der Gruppe D14S118 ist;
    Seq.-ID Nr. 19, Seq.-ID Nr. 20, wenn einer der Loci in der Gruppe D14S562 ist;
    Seq.-ID Nr. 21, Seq.-ID Nr. 22, wenn einer der Loci in der Gruppe D14S548 ist;
    Seq.-ID Nr. 23, Seq.-ID Nr. 24, wenn einer der Loci in der Gruppe D16S490 ist;
    Seq.-ID Nr. 25, Seq.-ID Nr. 26, wenn einer der Loci in der Gruppe D16S753 ist;
    Seq.-ID Nr. 27, Seq.-ID Nr. 28, wenn einer der Loci in der Gruppe D17S1299 ist;
    Seq.-ID Nr. 29, Seq.-ID Nr. 30, Seq.-ID Nr. 58, wenn einer der Loci in der Gruppe D16S539 ist;
    Seq.-ID Nr. 31, Seq.-ID Nr. 32, wenn einer der Loci in der Gruppe D22S683 ist;
    Seq.-ID Nr. 33, Seq.-ID Nr. 34, wenn einer der Loci in der Gruppe HUMCSF1PO ist;
    Seq.-ID Nr. 35, Seq.-ID Nr. 36, wenn einer der Loci in der Gruppe HUMTPOX ist;
    Seq.-ID Nr. 37, Seq.-ID Nr. 38, wenn einer der Loci in der Gruppe HUMTHO1 ist;
    Seq.-ID Nr. 39, Seq.-ID Nr. 40, Seq.-ID Nr. 59, Seq.-ID Nr. 60, wenn einer der Loci in der Gruppe HUMvWFA31 ist;
    Seq.-ID Nr. 41, Seq.-ID Nr. 42, wenn einer der Loci in der Gruppe HUMF13A01 ist;
    Seq.-ID Nr. 43, Seq.-ID Nr. 44, wenn einer der Loci in der Gruppe HUMFESFPS ist;
    Seq.-ID Nr. 45, Seq.-ID Nr. 46, wenn einer der Loci in der Gruppe HUMBFXIII ist;
    Seq.-ID Nr. 47, Seq.-ID Nr. 48, wenn einer der Loci in der Gruppe HUMLIPOL ist;
    Seq.-ID Nr. 50, Seq.-ID Nr. 51, wenn einer der Loci in der Gruppe D19S253 ist;
    Seq.-ID Nr. 56, Seq.-ID Nr. 57, wenn einer der Loci in der Gruppe D4S2368 ist;
  • Im Verfahren dieser Erfindung werden die amplifizierten Allele vorzugsweise durch Vergleichen der amplifizierten Allele mit einem Größenstandard evaluiert, worin der Größenstandard aus der aus einem DNA-Marker und einer Locus-spezifischen Allel-Leiter bestehenden Gruppe von Größenstandards ausgewählt ist. Die Evaluierung der Allele wird vorzugsweise unter Verwendung von Polyacrylamidgel-Elektrophorese durchgeführt, um die Allele zu trennen, wobei ein Polyacrylamidgel aus getrennten Allelen gebildet wird. Die getrennten Allele im Polyacrylamidgel werden vorzugsweise durch Sichtbarmachen der Allele mit geeigneten Verfahren, wie z.B. Silberfärbung, bestimmt, jedoch noch bevorzugter mittels Fluoreszenzanalyse.
  • Die Fluoreszenzanalyse wird vorzugsweise vor der Verwendung in der Reaktion durch Markieren eines Primers eines jeden in der Multiplexamplifikationsreaktion verwendeten Primerpaars mit einer Fluoreszenzmarkierung durchgeführt. Die Fluoreszenzmarkierung, die zur Markierung eines jeden solchen Primers verwendet wird, ist vorzugsweise eine Fluorescein-Markierung oder eine Tetramethylrhodamin-Markierung. Noch bevorzugter werden zumindest zwei verschiedene Markierungen verwendet, um die unterschiedlichen Primer, die in der Multiplexamplifikationsreaktion verwendet werden, zu markieren.
  • Zumindest eine unter Verwendung des Verfahrens dieser Erfindung zu analysierende DNA-Probe ist vorzugsweise aus menschlichem Gewebe isoliert, vorzugsweise Gewebe aus der aus Blut, Samen, Vaginalzellen, Haar, Speichel, Urin, Knochen, bukkalen Proben, Plazentazellen oder Fötuszellen enthaltendem Fruchtwasser und Gemischen aus beliebig vielen der oben genannten Gewebe bestehenden Gruppe.
  • In einer alternativen Ausführungsform ist die Erfindung ein Set zur gleichzeitigen Analyse von STR-Sequenzen in drei Loci, wobei das Set einen Behälter umfasst, der Oligonucleotid-Primerpaare zur Coamplifikation einer Gruppe von drei kurzen Tandemwiederholungs-Loci aufweist, worin die Gruppe an Loci aus den Gruppen an Loci ausgewählt wird, die folgendes umfassen:
    D3S1539, D19S253, D13S317;
    D10S1239, D9S930, D20S481;
    D10S1239, D4S2368, D20S481;
    D10S1239, D9S930, D4S2368;
    D16S539, D7S820, D13S317;
    D10S1239, D9S930, D13S317;
    D3S1539, D7S820, D13S317, D5S818;
    D17S1298, D7S820, D13S317, D5S818;
    D20S481, D7S820, D13S317, D5S818;
    D9S930, D7S820, D13S317, D5S818;
    D10S1239, D7S820, D13S317, D5S818;
    D14S118, D7S820, D13S317, D5S818;
    D14S562, D7S820, D13S317, D5S818;
    D14S548, D7S820, D13S317, D5S818;
    D16S490, D7S820, D13S317, D5S818;
    D17S1299, D7S820, D13S317, D5S818;
    D16S539, D7S820, D13S317, D5S818;
    D22S683, D7S820, D13S317, D5S818;
    D16S753, D7S820, D13S317, D5S818;
    D3S1539, D19S253, D13S317, D20S481;
    D3S1539, D19S253, D4S2368, D20S481;
    D10S1239, D9S930, D4S2368, D20S481;
    D16S539, D7S820, D13S317, HUMvWFA31;
    D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO, HUMTPOX;
    D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01, HUMFESFPS;
    D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO, HUMTPOX, HUMTH01;
    D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01, HUMFESFPS, HUMBFXIII;
    D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO, HUMTPOX, HUMTH01, HUMvWFA31; und
    D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01, HUMFESFPS, HUMBFXIII, HUMLIPOL.
  • Zumindest einer der Primer in jedem Primerpaar, der im Set enthalten ist, besitzt vorzugsweise eine Sequenz, die aus einer der unter der oben stehenden Beschreibung des Verfahrens dieser Erfindung aufgelisteten Sequenzgruppen ausgewählt ist.
  • In einer weiteren dritten Ausführungsform umfasst die Erfindung Primersequenzen und Primerpaare zur Amplifikation spezifischer STR-Loci menschlicher DNA. Die Verwendung der Primer und der Primerpaare dieser Erfindung zur Multiplexanalyse menschlicher DNA wird unten stehend hierin demonstriert. Die Primer dieser Erfindung sind zur Verwendung im Verfahren dieser Erfindung geeignet, worin sie in Abhängigkeit von der Art der Bestimmung der amplifizierten Allele im Evaluierungsschritt des Verfahrens, wie oben angeführt, entweder in markierter oder in unmarkierter Form verwendet werden können.
  • Die vorliegende Erfindung stellt in all ihren verschiedenen, oben stehend kurz beschriebenen Ausführungsformen ein Verfahren mit hohem Durchsatz sowie Materialien zur Detektion und Analyse polymorpher genetischer Marker bereit, und zwar unter Verwendung von spezifischen Kombinationen von Loci und spezifizierten Bedingungen. Durch die Auswahl des geeigneten Detektionsverfahrens für den Evaluierungsschritt können die Materialien und das Verfahren dieser Erfindung in Labors verwendet werden, die nur einen Netzanschluss und ein Standardgerät zur Polyacrylamid-Gelelektrophorese besitzen, oder aber in jenen, die die neueste Ausrüstung zum Fluoreszenz-Gelscanning besitzen, z.B. FluorimagerTM 575 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) oder die Hitachi-FMBIOTM-Fluoreszenzscanner (San Bruno, CA) oder die ABI-373- und ABI-PrismTM-377-DNA-Sequenzierungsautomaten (Applied Biosystems Division, Perkin Elmer, Foster City, CA). Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist daher auf eine Vielzahl an Verwendungen und Labors adaptierbar.
  • Der in der vorliegenden Erfindung spezifizierte Ansatz führt zu einer Zeit-, Arbeits- und Materialersparnis bei der Analyse von Loci, die in den Multiplexen enthalten sind. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglicht eine gemeinsame Ampli fikation von drei oder mehr, sogar von einer Anzahl von acht oder mehr, Loci in einer Röhre unter Verwendung einer einzigen Amplifikationsreaktion anstatt der getrennten Amplifikation eines jeden Locus in separaten Röhren.
  • Die vorliegende Erfindung findet spezifische Anwendung auf dem Gebiet der forensischen Analyse, der Vaterschaftsbestimmung, der Beobachtung von Knochenmarkstransplantationen, der Kopplungskartierung sowie der Detektion genetischer Erkrankungen und von Krebsarten. Durch das Ermöglichen der gleichzeitigen Amplifikation und Analyse von drei oder mehr Loci erhöhen die Materialien und Verfahren der vorliegenden Erfindung die Sicherheit, mit der aus Blut oder anderen Geweben von zwei verschiedenen Individuen isolierte DNA abgeglichen werden kann, signifikant. Die Notwendigkeit, genau zwischen kleinen Gewebemengen unterschiedlicher Individuen zu unterscheiden, ist bei forensischen Anwendungen besonders akut, da viele Verurteilungen (und Freisprüche) auf der DNA-Typisierungsanalyse beruhen, unter anderem auf der Analyse der STR-Loci.
  • Wissenschaftler, besonders Kriminaltechniker, sind sich seit langem der Notwendigkeit, multiple polymorphe DNA-Loci zu analysieren, bewusst, um sicherzustellen, dass eine Übereinstimmung zwischen zwei Gewebsproben statistisch signifikant ist (L. A. Presley et al., The implementation of the polymerase chain reaction (PCR) HLA DQ alpha typing by the FBI laboratory, in: The Third International Symposium on Human Identification 1992, 245-269 (1993); R. A. Bever et al., Characterization of five VNTR loci by Hae III RFLP analysis: application to paternity testing, in: The Second International Symposium on Human Identification 1991, 103-128 (1992)). Bis zu dieser Erfindung gab es jedoch nur wenige Wege zur gleichzeitigen Analyse von drei oder mehr STR-Loci in einer einzigen Reaktion. Um die Bedeutung solcher Multiplex-Möglichkeiten zu verstehen, ist es hilfreich, einige der der DNA-Typisierungsanalyse zu Grunde liegenden mathematischen Prinzipien zu verstehen.
  • Zu Veranschaulichungszwecken wird angenommen, jeder STR-Locus hätte eine Genotyp-Häufigkeit (d.h. Muster von zwei Allelen) von eins zu zehn. Anders ausgedrückt, es wird angenommen, dass die Wahrscheinlichkeit eines übereinstimmenden Typus für eine einzelne STR von zwei nach dem Zufallsprinzip ausgewählten Individuen bei 1/10 liegt. Falls jedoch zwei verschiedene STR-Loci analysiert werden, so verringert sich die Wahrscheinlichkeit einer zufälligen Übereinstimmung mit beiden Systemen auf 1/100. Falls drei STR-Loci analysiert werden, so verringert sich die Wahrscheinlichkeit einer zufälligen Übereinstimmung mit jedem der drei Systeme auf 1/1.000 und so weiter. Es ist daher leicht zu verstehen, wie eine Erhöhung der Anzahl der analysierten STR-Loci auf eine beliebige Anzahl über drei Loci die Wahrscheinlichkeit zufälliger Übereinstimmungen innerhalb der allgemeinen Bevölkerung signifikant verringert, wodurch die Möglichkeit einer genauen Identifikation (oder Elimination) eines Verdächtigen in einem Verbrechen durch das Vergleichen seines Typus mit den Beweisen vom Tatort erhöht wird. Ähnliche Überlegungen können verwendet werden, um festzustellen, dass das Verfahren dieser Erfindung ebenso die Wahrscheinlichkeit einer korrekten Feststellung der Vaterschaft in Vaterschaftsstreitfällen erhöhen würde sowie auch die korrekte Übereinstimmung von Knochenmarksgewebe oder aber die Entwicklung signifikanter Resultate aus Kopplungskartierungsstudien und die Detektion genetischer Erkrankungen und von Krebsarten.
  • Weitere Ziele, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen Beschreibung der Erfindung und den veranschaulichenden Zeichnungen klar ersichtlich.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG(EN)
  • 1 zeigt ein lasergedrucktes Bild, das die Fluoreszenzdetektion der Produkte simultaner Amplifikation der Loci D3S1539, D7S820, D13S317 und D5S818 darstellt, wie sie mit einem FluorimagerTM-Fluoreszenzscanner (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) in Beispiel 1 nachgewiesen werden.
  • 2 zeigt ein lasergedrucktes Bild, das die Fluoreszenzdetektion der Produkte simultaner Amplifikation der Loci D17S1298, D7S820, D13S317 und D5S818 darstellt, wie sie mit einem FluorimagerTM-Fluoreszenzscanner (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) in Beispiel 2 nachgewiesen werden.
  • 3 zeigt ein lasergedrucktes Bild, das die Fluoreszenzdetektion der Produkte simultaner Amplifikation der Loci D17S1298, D7S820, D13S317 und D5S818 darstellt, wie sie mit einem FluorimagerTM-Fluoreszenzscanner (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) in Beispiel 3 nachgewiesen werden.
  • 4 zeigt ein lasergedrucktes Bild, das die Fluoreszenzdetektion der Produkte simultaner Amplifikation der Loci D20S481, D7S820, D13S317 und D5S818 darstellt, wie sie mit einem FluorimagerTM-Fluoreszenzscanner (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) in Beispiel 4 nachgewiesen werden.
  • 5 zeigt ein lasergedrucktes Bild, das die Fluoreszenzdetektion der Produkte simultaner Amplifikation der Loci D20S481, D7S820, D13S317 und D5S818 darstellt, wie sie mit einem FluorimagerTM-Fluoreszenzscanner (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) in Beispiel 5 nachgewiesen werden.
  • 6 zeigt ein lasergedrucktes Bild, das die Fluoreszenzdetektion der Produkte simultaner Amplifikation der Loci D9S930, D7S820, D13S317 und D5S818 darstellt, wie sie mit einem FluorimagerTM-Fluoreszenzscanner (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) in Beispiel 6 nachgewiesen werden.
  • 7 zeigt ein lasergedrucktes Bild, das die Fluoreszenzdetektion der Produkte simultaner Amplifikation der Loci D10S1239, D7S820, D13S317 und D5S818 darstellt, wie sie mit einem FluorimagerTM-Fluoreszenzscanner (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) in Beispiel 7 nachgewiesen werden.
  • 8 zeigt ein lasergedrucktes Bild, das die Fluoreszenzdetektion der Produkte simultaner Amplifikation der Loci D10S1239, D7S820, D13S317 und D5S818 darstellt, wie sie mit einem FluorimagerTM-Fluoreszenzscanner (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) in Beispiel 8 nachgewiesen werden.
  • 9 zeigt ein lasergedrucktes Bild, das die Fluoreszenzdetektion der Produkte simultaner Amplifikation der Loci D14S118, D7S820, D13S317 und D5S818 darstellt, wie sie mit einem FluorimagerTM-Fluoreszenzscanner (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) in Beispiel 9 nachgewiesen werden.
  • 10 zeigt ein lasergedrucktes Bild, das die Fluoreszenzdetektion der Produkte simultaner Amplifikation der Loci D14S562, D7S820, D13S317 und D5S818 darstellt, wie sie mit einem FluorimagerTM-Fluoreszenzscanner (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) in Beispiel 10 nachgewiesen werden.
  • 11 zeigt ein lasergedrucktes Bild, das die Fluoreszenzdetektion der Produkte simultaner Amplifikation der Loci D14S548, D7S820, D13S317 und D5S818 darstellt, wie sie mit einem FluorimagerTM-Fluoreszenzscanner (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) in Beispiel 11 nachgewiesen werden.
  • 12 zeigt ein lasergedrucktes Bild, das die Fluoreszenzdetektion der Produkte simultaner Amplifikation der Loci D16S490, D7S820, D13S317 und D5S818 darstellt, wie sie mit einem FluorimagerTM-Fluoreszenzscanner (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) in Beispiel 12 nachgewiesen werden.
  • 13 zeigt ein lasergedrucktes Bild, das die Fluoreszenzdetektion der Produkte simultaner Amplifikation der Loci D16S753, D7S820, D13S317 und D5S818 darstellt, wie sie mit einem FluorimagerTM-Fluoreszenzscanner (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) in Beispiel 13 nachgewiesen werden.
  • 14 zeigt ein lasergedrucktes Bild, das die Fluoreszenzdetektion der Produkte simultaner Amplifikation der Loci D17S1299, D7S820, D13S317 und D5S818 darstellt, wie sie mit einem FluorimagerTM-Fluoreszenzscanner (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) in Beispiel 14 nachgewiesen werden.
  • 15 zeigt ein lasergedrucktes Bild, das die Fluoreszenzdetektion der Produkte simultaner Amplifikation der Loci D16S539, D7S820, D13S317 und D5S818 darstellt, wie sie mit einem FluorimagerTM-Fluoreszenzscanner (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) in Beispiel 15 nachgewiesen werden.
  • 16 zeigt ein lasergedrucktes Bild, das die Fluoreszenzdetektion der Produkte simultaner Amplifikation der Loci D22S683, D7S820, D13S317 und D5S818 darstellt, wie sie mit einem FluorimagerTM-Fluoreszenzscanner (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) in Beispiel 16 nachgewiesen werden.
  • 17 zeigt ein lasergedrucktes Bild, das die Fluoreszenzdetektion der Produkte simultaner Amplifikation der Loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO ("CSF1PO") und HUMTPOX ("TPOX") darstellt, wie sie mit einem FMBIOTM-FluoreszenzscannerTM (Hitachi Software Engineering, San Bruno, CA) in Beispiel 17 nachgewiesen werden.
  • 18 zeigt ein lasergedrucktes Bild, das die Fluoreszenzdetektion der Produkte simultaner Amplifikation der Loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO ("CSF1PO"), HUMTPOX ("TPOX") und HUMTHO1 ("THO1") darstellt, wie sie mit einem FMBIOTM-FluoreszenzscannerTM (Hitachi Software Engineering, San Bruno, CA) in Beispiel 18 nachgewiesen werden.
  • 19 zeigt ein lasergedrucktes Bild, das die Fluoreszenzdetektion der Produkte simultaner Amplifikation der Loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO ("CSF1PO"), HUMTPOX ("TPOX"), HUMTHO1 ("THO1") und HUMvWFA31 ("vWA") darstellt, wie sie mit einem FMBIOTM-FluoreszenzscannerTM (Hitachi Software Engineering, San Bruno, CA) in Beispiel 19 nachgewiesen werden.
  • 20 zeigt ein lasergedrucktes Bild, das die Fluoreszenzdetektion der Produkte simultaner Amplifikation der Loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01 ("F13A01") und HUMFESFPS ("FESFPS") darstellt, wie sie mit einem FMBIOTM-FluoreszenzscannerTM (Hitachi Software Engineering, San Bruno, CA) in Beispiel 20 nachgewiesen werden.
  • 21 zeigt ein lasergedrucktes Bild, das die Fluoreszenzdetektion der Produkte simultaner Amplifikation der Loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01 ("F13A01"), HUMFESFPS ("FESFPS") und HUMBFXIII ("F13B") darstellt, wie sie mit einem FMBIOTM-FluoreszenzscannerTM (Hitachi Software Engineering, San Bruno, CA) in Beispiel 21 nachgewiesen werden.
  • 22 zeigt ein lasergedrucktes Bild, das die Fluoreszenzdetektion der Produkte simultaner Amplifikation der Loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01 ("F13A01"), HUMFESFPS ("FESFPS"), HUMBFXIII ("F13B") und HUMLIPOL ("LPL") darstellt, wie sie mit einem FMBIOTM-FluoreszenzscannerTM (Hitachi Software Engineering, San Bruno, CA) in Beispiel 22 nachgewiesen werden.
  • 23 zeigt ein lasergedrucktes Bild, das die Fluoreszenzdetektion der Produkte simultaner Amplifikation der Loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO ("CSF1PO"), HUMTPOX ("TPOX"), HUMTHO1 ("THO1") und NUMvWFA31 ("vWA") darstellt, wie sie mit einem FMBIOTM-FluoreszenzscannerTM (Hitachi Software Engineering, San Bruno, CA) in Beispiel 23 nachgewiesen werden.
  • 24 zeigt ein lasergedrucktes Bild, das die Fluoreszenzdetektion der Produkte simultaner Amplifikation der Loci D3S1539, D19S253, D13S317 und D20S481 darstellt, wie sie mit einem FluorimagerTM-Fluoreszenzscanner (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) in Beispiel 24 nachgewiesen werden.
  • 25 zeigt ein lasergedrucktes Bild, das die Fluoreszenzdetektion der Produkte simultaner Amplifikation der Loci D10S1239, D9S930, D4S2368 und D20S481 dar stellt, wie sie mit einem FluorimagerTM-Fluoreszenzscanner (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) in Beispiel 25 nachgewiesen werden.
  • 26 zeigt ein Foto, das die Silberfärbungsdetektion der Produkte simultaner Amplifikation von drei Loci, D16S539, D7S820 und D13S317, in Beispiel 26 darstellt.
  • 27 zeigt ein Foto, das die Silberfärbungsdetektion der Produkte simultaner Amplifikation von vier Loci, D16S539, D7S820, D13S317 und HUMvWFA31 ("vWA"), in Beispiel 27 darstellt.
  • 28 zeigt ein Foto, das die Silberfärbungsdetektion der Produkte simultaner Amplifikation von drei Loci, D10S1239, D9S930 und D13S317, in Beispiel 28 darstellt.
  • 29 zeigt ein Foto, das die Silberfärbungsdetektion der Produkte simultaner Amplifikation von drei Loci, D10S1239, D9S930 und D4S2368, in Beispiel 29 darstellt.
  • 30 zeigt ein Foto, das die Silberfärbungsdetektion der Produkte simultaner Amplifikation von vier Loci, D10S1239, D9S930, D4S2368 und D20S481, in Beispiel 30 darstellt.
  • 31 zeigt ein Foto, das die Silberfärbungsdetektion der Produkte simultaner Amplifikation von drei Loci, D3S1539, D19S253 und D13S317, in Beispiel 31 darstellt.
  • 32 zeigt ein Foto, das die Silberfärbungsdetektion der Produkte simultaner Amplifikation von vier Loci, D3S1539, D19S253, D4S2368 und D20S481, in Beispiel 32 darstellt.
  • 33 zeigt ein Foto, das die Silberfärbungsdetektion der Produkte simultaner Amplifikation von vier Loci, D3S1539, D19S253, D13S317 und D20S481, in Beispiel 33 darstellt.
  • 34 zeigt ein Foto, das die Silberfärbungsdetektion der Produkte simultaner Amplifikation von drei Loci, D10S1239, D9S930 und D20S481, in Beispiel 34 darstellt.
  • 35 zeigt ein Foto, das die Silberfärbungsdetektion der Produkte simultaner Amplifikation von drei Loci, D10S1239, D4S2368 und D20S481, in Beispiel 35 darstellt.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • A. Definitionen
  • Die folgenden Definitionen sollen dabei helfen, ein klares und durchgängiges Verständnis des Umfangs und der Details der Begriffe zu ergeben:
    Allelleiter: ein Standard-Größenmarker, der aus amplifizierten Allelen aus dem Locus besteht.
  • Allel: eine genetische Variation, die mit einem DNA-Segment assoziiert ist, d.h. eine von zwei oder mehreren wechselnden Formen einer DNA-Sequenz, die denselben Locus besetzt.
  • Biochemische Nomenklatur: hierin wird die biochemische Standard-Nomenklatur verwendet, in der die Nucleotidbasen mit Adenin (A); Thymin (T); Guanin (G) und Cytosin (C) benannt werden. Korrespondierende Nucleotide sind z.B. Desoxyguanosin-5'-triphosphat (dGTP).
  • DNA-Polymorphismus: der Zustand, bei dem zwei oder mehr verschiedene Nucleotidsequenzen in einer DNA-Sequenz in derselben Kreuzungspopulation koexistieren.
  • Locus (oder genetischer Locus): eine spezifische Position auf einem Chromosom. Allele eines Locus befinden sich an identischen Stellen auf homologen Chromosomen.
  • Locus-spezifischer Primer: ein Primer, der spezifisch mit einem Abschnitt des besagten Locus oder seinem Komplementärstrang hybridisiert, zumindest für ein Allel des Locus, und unter den Bedingungen, die in dem Amplifikationsverfahren verwendet werden, nicht effizient mit anderen DNA-Sequenzen hybridisiert.
  • Polymerasekettenreaktion (PCR): ein Verfahren, bei dem Zyklen der Denaturierung, Annealing mit Primern und Extension mit DNA-Polymerase verwendet werden, um die Anzahl an Kopien einer Target-DNA-Sequenz um etwa 106-mal oder mehr zu amplifizieren. Das Polymerasekettenreaktionsverfahren zur Amplifikation von Nucleinsäure fällt unter das US-Patent Nr. 4.683.195 und 4.683.202.
  • Polymorphe kurze Tandemwiederholungs-Loci: STR-Loci, bei denen die Anzahl repetitiver Sequenzelemente (und die Reinlänge der Sequenz) in einer bestimmten Region genomischer DNA von Allel zu Allel variiert sowie auch von Individuum zu Individuum.
  • Polymorphismus-Informationsgehalt (PIC): ein Maß der Menge eines Polymorphismus, der an einem Locus vorhanden ist (Botstein et al. (1980)). PIC-Werte reichen von 0 bis 1,0, wobei höhere Werte ein größeres Ausmaß an Polymorphismus anzeigen. Dieses Maß zeigt im Allgemeinen kleinere Werte als das andere normalerweise verwendete Maß, d.h. die Heterozygotie, an. Für hochgradig informative Marker (Heterozygotien, die etwa 70 % übersteigen), ist der Unterschied zwischen Heterozygotie und PIC gering.
  • Primärreaktion: anfängliche Reaktion, die die gereinigte menschliche genomische DNA als Matrize für die PCR verwendet.
  • Primer: zwei einzelsträngige Oligonucleotide oder DNA-Fragmente, die an gegenüberliegende Stränge eines Locus hybridisieren, so dass die 3'-Termini der Primer die größtmögliche Nähe aufweisen.
  • Primerpaar: zwei Primer, umfassend Primer 1, der an einen einzelnen Strang an ein Ende der zu amplifizierenden DNA-Sequenz hybridisiert, und Primer 2, der an das andere Ende auf dem Komplementärstrang der zu amplifizierenden DNA-Sequenz hybridisiert.
  • Primerstelle: der Bereich der Target-DNA, an den ein Primer hybridisiert.
  • Sekundärreaktion: Reamplifikation mit demselben oder einem anderen Primerpaar unter Verwendung einer Verdünnung der Primärreaktion als Matrize für die PCR.
  • Kurze Tandemwiederholungs-Loci (STR-Loci): Regionen des menschlichen Genoms, die kurze repetitive Sequenzelemente mit einer Länge von 3 bis 7 Basenpaaren enthalten.
  • B. Auswahl der Multiplexreaktionsbestandteile
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung zieht die Auswahl einer geeigneten Gruppe an Loci, Primern und Amplifikationsprotokollen in Betracht, um amplifizierte Allele aus mehrfach coamplifizierten Loci zu generieren, die entweder in der Größe nicht überlappen oder die irgendwie markiert sind, um die amplifizierten Allele, die in der Größe überlappen, voneinander unterscheidbar zu machen. Zusätzlich zieht dieses Verfahren die Auswahl von kurzen Tandemwiederholungs-Loci in Betracht, die mit der Verwendung eines einzigen Amplifikationsprotokolls kompatibel sind. Die spezifischen Kombinationen der hierin beschriebenen Loci sind in dieser Anwendung einzigartig. Kombinationen von Loci können aufgrund eines jeden der zwei oben genannten Gründe zurückgewiesen werden oder weil in Kombination einer oder mehrere der Loci keinen ausreichenden Produktertrag generieren oder weil in dieser Reaktion Fragmente produziert werden, die keine authentischen Allele darstellen.
  • Erfolgreiche Kombinationen zusätzlich zu den hierin offenbarten können durch Trial-and-Error-Verfahren von Locuskombinationen, durch Auswahl von Primerpaarsequenzen und durch Anpassung der Primerkonzentrationen erreicht werden, um ein Gleichgewicht zu identifizieren, in dem alle inkludierten Loci amplifiziert werden können. Sind die Verfahren und Materialien dieser Erfindung einmal offenbart, so werden wahrscheinlich verschiedene Verfahren der Selektion von Loci, Primerpaaren und Amplifikationsverfahren zur Verwendung in dem Verfahren und dem Set dieser Erfindung dem Fachmann nahe gelegt. Von all diesen Verfahren wird angenommen, sie wären innerhalb des Umfangs der im Anhang befindlichen Ansprüche.
  • Von besonderer Bedeutung bei der Umsetzung des Verfahrens dieser Erfindung ist die Größenbandbreite der amplifizierten Allele, die von den einzelnen Loci produziert werden, die zusammen in dem Multiplexamplifikationsreaktionsschritt amplifiziert werden. Zur leichteren Analyse mit gegenwärtigen Technologien werden Systeme, die durch die Amplifikation von Fragmenten, die kleiner als 500 Basen sind, nachgewiesen werden können, am meisten bevorzugt. Die am meisten bevorzugten Kombinationen von Loci, Primern und Amplifikationsverfahren werden im oben stehenden Abschnitt "Zusammenfassung der Erfindung" beschrieben.
  • Eine ungeeignete Auswahl an Primern kann zu mehreren unerwünschten Konsequenzen führen, wie z.B. ein Fehlen der Amplifikation, Amplifikation an mehreren Stellen, Primerdimerbildung, unerwünschte Wechselwirkung von Primersequenzen unterschiedlicher Loci, Produktion von Allelen aus einem Locus, die mit Allelen aus einem anderen überlappen, oder der Notwendigkeit für Amplifikationsbedingungen oder -protokolle für andere Loci, die in einem Multiplex inkompatibel sind. Eine Synthese der Primer, die in dem vorliegenden Verfahren verwendet werden, kann unter Verwendung eines jeden beliebigen Standardverfahrens zur Oligonucleotidsynthese durchgeführt werden, das dem Fachmann bekannt ist.
  • C. Verwendung von Multiplexen von drei Loci, um Multiplexe zu entwickeln, die mehr als drei Loci verwenden
  • Ein jedes einer Anzahl verschiedener Verfahren kann verwendet werden, um eine Gruppe an STR-Loci auszuwählen, die unter Verwendung eines Verfahrens der vorliegenden Erfindung zu analysieren sind. Ein bevorzugtes Verfahren zur Entwicklung nützlicher Loci-Gruppen zur Verwendung in diesem Analyseverfahren wird unten stehend beschrieben. Ist ein Multiplex, der drei Loci enthält, entwickelt, so kann dieser als Kern zur Schaffung von Multiplexen verwendet werden, die mehr als drei Loci enthalten. Es werden neue Kombinationen geschaffen, die die ersten drei Loci umfassen. Es wurde z.B. der Kern-Multiplex, der die Loci D7S820, D13S317 und D5S818 enthielt, verwendet, um Derivat-Multiplexe von D16S539, D7S820, D13S317 und D5S818; HUMCSF1PO, HUMTPOX, D16S539, D7S820, D13S317 und D5S818; HUMCSF1PO, HUMTPOX, HUMTHO1, D16S539, D7S820, D13S317 und D5S818; sowie HUMCSF1PO, HUMTPOX, HUMTHO1, HUMvWFA31, D16S539, D7S820, D13S317 und D5S818 zu erzeugen.
  • Es wird die Verwendung von Kern-Gruppen von Loci in Betracht gezogen, um andere geeignete Derivat-Gruppen an STR-Loci für Multiplex-Analysen unter Verwendung des Verfahrens dieser Erfindung herzustellen. Egal, welches Verfahren zur Auswahl der Loci verwendet wird, die mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung analysiert werden, alle für die Multiplex-Analyse ausgewählten Loci sollten folgende Merkmale aufweisen: (1) sie sollten zu minimalem Rutschen führen (z.B. durch falsches Lesen der Wiederholungssequenz während eines Amplifikationsschritts), (2) wenige Artefakte, falls überhaupt, aufgrund der Addition oder der Deletion einer Base zu den amplifizierten Allelen während des Multiplexamplifikationsschritts, (3) wenige Artefakte, falls überhaupt, aufgrund vorzeitiger Termination der Amplifikationsreaktionen durch eine Polymerase und (4) keine "nachgeschleppten" Banden mit kleinerem Molekulargewicht von darauffolgenden Einzelbasen-Deletionen unter einem bestimmten authentischen amplifizierten Allel. Siehe z.B. Schumm et al., Development of Nonisotopic Multiplex Amplifikation Sets for Analysis of Polymorphic STR-Loci, Fourth International Symposium on Human Identification 1993, 177-187 (veröffentlicht von Promega Corp. (1993)).
  • D. Herstellung von DNA-Proben
  • Proben menschlicher genomischer DNA können zur Verwendung im Verfahren dieser Erfindung unter Verwendung eines beliebigen Verfahrens der DNA-Herstellung produziert werden, das mit der Amplifikation eines einzelnen Locus kompatibel ist. Viele solcher Verfahren sind zur Verwendung in der Herstellung genomischer DNA-Proben zur Verwendung in dem Verfahren dieser Erfindung geeignet, unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf, die von P. I. Patel et al., Organization of the HPRT gene and related sequences in the human genome, Somat. Cell Mol. Genet. 10, 483-493 (1984), und P. Gill et al., Forensic application of DNA 'fingerprints', Nature 318, 577-579 (1985), beschriebenen Verfahren der DNA-Probenherstellung.
  • DNA-Konzentrationen können vor der Verwendung in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Verwendung eines beliebigen Standard-Verfahrens der DNA-Detektion gemessen werden. Die DNA-Konzentration wird jedoch vorzugsweise fluorometrisch unter Verwendung eines Messverfahrens, wie z.B. das von C. F. Brunk et al., Assay for nanogram quantities of DNA in cellular homogenates, Anal. Biochem. 92, 4, 497-500 (1979), beschriebene, gemessen. Die DNA-Konzentration wird noch bevorzugter durch Vergleich der Menge der Hybridisierung der DNA-Standards mit einer humanspezifischen Sonde, wie z.B. die von Waye et al. (1979), J. S. Waye et al., Sensitive and specific quantification of human genomic deoxyribonucleic acid (DNA) in forensic science specimens: casework examples, J. Forensic Sci. 36, 1198-1203 (1991), beschriebene, gemessen. Die Verwendung von zu viel Matrizen-DNA in den Amplifikationsreaktionen kann zu Artefakten führen, die als zusätzliche Banden auftreten, die keine wahren Allele darstellen.
  • E. Amplifikation von DNA
  • Ist einmal eine Probe menschlicher genomischer DNA isoliert und ist ihre Konzentration, wie oben beschrieben, bestimmt, so können die Loci, auf die abgezielt wird, in dem Multiplexamplifikationsschritt des vorliegenden Verfahrens coamplifiziert werden. Ein beliebiges einer Anzahl verschiedener Amplifikationsverfahren kann verwendet werden, um die Loci zu amplifizieren, unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf, Polymerasekettenreaktion (PCR) (R. K. Saiki et al., Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia, Science 230, 1350-1354 (1985)), auf Transkription basierende Amplifikation (D. Y. Kwoh und T. J. Kwoh, Target amplification systems in nucleic acid-based diagnostic approaches, American Biotechnology Laboratory (Oktober 1990)) und Strang-Verdrängungs-Amplifikation (SDA) (G. T. Walker et al., Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme-DNA Polymerase system, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 392-396 (1992)). Vorzugsweise wird die DNA-Probe einer PCR-Amplifikation unter Verwendung von Primerpaaren und thermozyklischen Bedingungen unterzogen, die für jeden Locus in der Gruppe spezifisch sind. Am Ende dieser Beschreibung befindet sich ein Verweis auf das Sequenzprotokoll für ausführlichere Informationen über die in den unten stehenden Beispielen verwendeten Primersequenzen, von denen einige Sequenzen alternative Ausführungsformen dieser Erfindung sind.
  • Details über das am meisten bevorzugte Amplifikationsprotokoll für jede der am meisten bevorzugten Kombinationen an Loci zur Verwendung im Verfahren dieser Erfindung sind in den unten stehenden Beispielen zu finden. Es wird ebenso auf die Beispiele für zusätzliche Details über das spezifische Verfahren im Bezug auf jeden Multiplex verwiesen. Die Sequenzen der in den Beispielen verwendeten locusspezifischen Primer umfassen eine Anzahl an Nucleotiden, die unter den in der Hybridisierung verwendeten Bedingungen ausreichen, um mit einem Allel des zu amplifizierenden Locus zu hybridisieren und im Wesentlichen frei von der Amplifikation von Allelen anderer Loci zu sein. Es wird für eine ausführlichere Beschreibung locusspezifischer Primer auf das US-Patent Nr. 5.192.659 an Simons verwiesen.
  • F. Trennung und Detektion von DNA-Fragmenten
  • Ist einmal eine Gruppe amplifizierter Allele durch den Multiplexamplifikationsschritt des vorliegenden Verfahrens hergestellt worden, so werden die amplifizierten Allele evaluiert. Der Evaluierungsschritt dieses Verfahrens kann durch ein beliebiges einer Gruppe verschiedener Mittel erreicht werden, wobei die am meisten bevorzugten davon unten stehend beschrieben werden.
  • Elektrophorese wird vorzugsweise verwendet, um die Produkte der Multiplexamplifikationsreaktion zu trennen, noch bevorzugter wird denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese verwendet (siehe z.B. J. Sambrook et al. in Molecular Cloning – A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 13.45-13.57 (1989)). Die bevorzugtesten Gel-Herstellungs- und Elektrophorese-Verfahren und -Bedingungen zur Verwendung in dem Evaluierungsschritt des Verfahrens dieser Erfindung werden in Beispiel 1 beschrieben. Die Trennung der DNA-Fragmente in einem denaturierenden Polyacrylamidgel passiert basierend auf der Größe der Fragmente.
  • Sind die amplifizierten Allele einmal in einem Polyacrylamidgel getrennt, so können die Allele und jegliche andere DNA im Gel (z.B. DNA-Marker oder eine Allelleiter) danach sichtbar gemacht und analysiert werden. Das Sichtbarmachen der DNA im Gel kann unter Verwendung eines beliebigen einer Anzahl an Verfahren nach dem Stand der Technik erfolgen, unter anderem durch Silberfärbung oder Reporter, wie z.B. Radioisotope, Fluoreszenzmittel, Chemilumineszenzmittel und Enzyme in Kombination mit nachweisbaren Substraten. Silberfärbung ist ein bevorzugtes Verfahren zur Sichtbarmachung von Allelen im Gel (siehe z.B. B. J. Bassam, Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamid gels, Anal. Biochem. 196, 80-83 (1991)). Ein noch bevorzugteres Verfahren ist die Verwendung von radioaktivmarkierten (siehe z.B. Hammond et al. (1994)) oder fluoreszenzmarkierten (siehe z.B. Schumm et al. (1994)) Primern für jeden Locus in der Multiplex-Reaktion, gefolgt von der Detektion der markierten Produkte unter Verwendung eines Autoradiogramms bzw. eines fluorometrischen Detektors.
  • Die in der DNA-Probe vorhandenen Allele werden vorzugsweise durch Vergleich mit einem Größenstandard, wie z.B. einem DNA-Marker oder einer locusspezifischen Allelleiter, bestimmt, um die an jedem Locus in der Probe vorhandenen Allele zu bestimmen. Der bevorzugteste Größenmarker zur Evaluierung einer Multiplexamplifikation, die zwei oder mehr polymorphe STR-Loci enthält, besteht aus einer Kombination von Allelleitern für jeden der zu evaluierenden Loci. Siehe z.B. Beschreibung von Allelleitern und Verfahren der Leiterkonstruktion in Schumm et al., s.o., auf S. 178.
  • Der bevorzugte Größenmarker zur Evaluierung einer Multiplexamplifikation, die zwei oder mehr polymorphe STR-Loci enthält, die unter Verwendung von fluoreszenzmarkierten Primern für jeden Locus hergestellt werden, besteht aus einer Kombination an fluoreszenzmarkierten Allelleitern für die zu evaluierten Loci. Id.
  • Nach der Konstruktion der Allelleitern für einzelne Loci können sie zur gleichen Zeit, zu der es zum Laden der amplifizierten Proben kommt, für die Gelelektrophorese gemischt und geladen werden. Jede Allelleiter co-migriert mit Allelen in der Probe aus dem korrespondierenden Locus.
  • Eine dauerhafte Datenaufzeichnung kann unter Verwendung des Automatischen Prozessorkompatiblen (APC-)Films erreicht werden (STR systems Manual Nr. TMD004, erhältlich von der Promega Corporation, Madison, WI) oder unter Verwendung eines Fluoreszenzdetektionsinstruments (STR systems Manual Nr. TMD006, ebenso von der Promega Corporation, Madison, WI, erhältlich).
  • G. Bevorzugtes Detektionsverfahren: Fluoreszenzdetektion
  • In einer der bevorzugtesten Ausführungsformen des Verfahrens dieser Erfindung wird die Fluoreszenzdetektion verwendet, um die amplifizierten Allele im Gemisch zu evaluieren, das von der Multiplexamplifikationsreaktion produziert wird. Unten stehend ist eine kurze Zusammenfassung der Art und Weise der bevorzugten Durchführung dieses Detektionsverfahrens zu finden.
  • Mit dem Auftreten der automatisierten Fluoreszenz-Bilderzeugung kann eine schnellere Detektion und Analyse der Multiplexamplifikationsprodukte erreicht werden. Für Fluoreszenzanalysen kann ein fluoresceinierter Primer in der Amplifikation eines jeden Locus umfasst sein. Beschreibungen der Verwendung zweier bevorzugter Arten an fluoreszenzmarkierten Primern, fluoresceinmarkierten (FL-) und tetramethylrhodaminmarkierten (TMR-)Primern sind unten stehend in den Beispielen inkludiert. Eine Trennung der amplifizierten Fragmente, die unter Verwendung solcher markierten Primer hergestellt wurden, wird genau auf dieselbe Art und Weise erreicht wie mit dem Silberfärbungs-Detektionsverfahren. Das resultierende Gel kann unter Verwendung eines FluorimagerTM-Analysiergerätes (im Handel bei Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, erhältlich) analysiert werden oder unter Verwendung eines FMBIOTM (im Handel bei Hitachi Corporation, San Bruno, CA, erhältlich), der das Gel scannt und die Daten in sehr kurzer Zeit, z.B. drei bis zwanzig Minuten, digitalisiert.
  • Zusammenfassend wird das Verfahren der vorliegenden Erfindung am bevorzugtesten unter Verwendung der Fluoreszenzdetektion im Evaluierungsschritt durchgeführt. In diesem bevorzugten Detektionsverfahren besitzt einer eines jeden in der Multiplexamplifikationsreaktion verwendeten Primerpaars eine daran angebrachte Fluoreszenzmarkierung, und als ein Resultat sind die in der Amplifikationsreaktion produzierten amplifizierten Allele fluoreszenzmarkiert. In dieser bevorzugtesten Ausführungsform der Erfindung werden die amplifizierten Allele anschließend auf einem Polyacrylamidgel getrennt, und die getrennten Allele werden sichtbar gemacht und unter Verwendung eines Fluoreszenz-Bildanalysegeräts analysiert.
  • Die Fluoreszenzdetektion wird gegenüber radioaktiven Markierungs- und Detektionsverfahren bevorzugt, da sie keine Verwendung radioaktiver Materialien und keine Bewältigung der mit der Verwendung solcher Materialien verbundenen regulatorischen und Sicherheitsprobleme erfordert.
  • Die Fluoreszenzdetektion wird ebenso gegenüber anderen nichtradioaktiven Detektionsverfahren, wie z.B. der Silberfärbung, bevorzugt, da fluoreszierende Detektions verfahren im Allgemeinen weniger Gel-Artefakte als eine Färbung aufweisen. Die geringere Anzahl an Gel-Artefakten ist vorzugsweise in großem Ausmaß auf die Tatsache zurückzuführen, dass nur amplifizierte DNA-Fragmente mit daran gebundenen Markierungen bei der Fluoreszenzdetektion nachgewiesen werden, während jedes in der Multiplexamplifikationsreaktion produzierte amplifizierte DNA-Fragment gefärbt und mit dem Silberfärbungs-Detektionsverfahren nachgewiesen wird. Mit Silberfärbung gefärbte Polyacrylamidgele weisen ebenso aufgrund nichtspezifischer Bindung der Silberfarbe an das Gel selbst einen bedeutend höheren allgemeinen Hintergrund auf, was die Empfindlichkeit reduziert, mit der einzelne DNA-Banden im Gel nachgewiesen werden können. Silberfärbung und fluoreszierende Detektionsverfahren werden unten stehend hierin in zwei Gruppen an Beispielen verglichen.
  • H. Set
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch Sets, die das oben beschriebene Verfahren verwenden. Ein grundlegendes Set umfasst einen Behälter mit einem oder mehr locusspezifischen Primern für jeden Locus. Gegebenenfalls können Anweisungen zum Gebrauch inkludiert sein.
  • Andere optionale Set-Bestandteile können eine auf jeden der spezifizierten Loci gerichtete Allelleiter umfassen sowie eine ausreichende Enzymmenge zur Amplifikation, einen Amplifikationspuffer zur Erleichterung der Amplifikation, eine Ladungslösung zur Herstellung des amplifizierten Materials zur Gelelektrophorese, menschliche genomische DNA als Matrizenkontrolle, einen Größenmarker zur Sicherstellung der Migration der Materialien im Gel, wie erwartet, sowie ein Protokoll und eine Gebrauchsanleitung zur Information des Benutzers und um Fehler im Gebrauch zu vermeiden. Die Mengen der verschiedenen Reagenzien in den Sets können ebenso in Abhängigkeit einer Reihe an Faktoren, wie z.B. der maximalen Empfindlichkeit des Verfahrens, variiert werden. Es liegt im Umfang der vorliegenden Erfindung, Test-Sets zur Verwendung in manuellen Applikationen oder Test-Sets zur Verwendung in automatisierten Detektoren oder Analysegeräten bereitzustellen.
  • BEISPIELE
  • Die folgenden Beispiele werden vorgestellt, um die Vorteile der vorliegenden Erfindung zu veranschaulichen und um einem durchschnittlichen Fachmann bei der Herstellung und Verwendung derselben zu assistieren. Die Beispiele sind keinesfalls in einer anderen Weise dazu gedacht, den Umfang der Offenbarung oder den durch das Patent gewährten Schutz einschränken.
  • Die Isolierung und Quantifizierung genomischer DNA wurde im Wesentlichen wie von C. Puers et al., Identification of repeat sequence heterogeneity at the polymorphic short tandem repeat locus HUMTHO1 [AATG]n and reassignment of alleles in population analysis by using a locusspecific allelic ladder, Am. J. Hum. Genet. 53, 953-958 (1993), beschrieben durchgeführt. Diese Verfahren sind dem Fachmann im Allgemeinen bekannt und sind für die Anwendung der Erfindung bevorzugt, sind jedoch nicht erforderlich dafür.
  • Die Amplifikationsprodukte wurden mittels Elektrophorese durch ein 0,4 mm dickes 4%iges denaturierendes Polyacrylamidgel (19:1-Verhältnis von Acrylamid zu Bis-Acrylamid) getrennt, das 7 M Harnstoff enthielt (Sambrook et al. (1989)) und in Fällen, die eine Silberfärbungsanalyse umfassten, chemisch mit einer Glasplatte vernetzt war (Y. Kobayashi, A method to cast thin sequencing gels, BRL Focus 10, 73-74 (1988)). In Fällen, die eine Fluoreszenzanalyse umfassten, wurde keine solche Vernetzung verwendet. Die DNA-Proben wurden mit 2,5 μl einer Ladungslösung (10 mM NaOH, 95 % Formamid, 0,05 % Bromphenolblau, 0,05 % Xylolcyanol) gemischt, bei 95 °C 2 Minuten lang denaturiert und vor dem Laden auf Eis gekühlt.
  • Nach der Trennung mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurden die amplifizierten Reaktionsprodukte und DNA-Größenmarkerkontrollen unter Verwendung von Silberfärbung, Fluoreszenzdetektion, radioaktiver Detektion oder einer Kombination der oben genannten Detektionsverfahren nachgewiesen. In einigen Beispielen wurden die Reaktionsprodukte und die Größenmarker im Gel mittels Silberfärbung unter Verwendung eines Standardverfahrens zur Färbung und Detektion nachgewiesen, das nach dem Stand der Technik bereits beschrieben wurde (siehe z.B. Bassam et al. (1991)). Permanente Bilder der gefärbten Gele wurden mittels Aussetzen gegenüber dem Automatischen Prozessorkompatiblen Film (APC-Film, Promega Corporation, Kat.-Nr. DQ4411) erreicht. In anderen Beispielen wurde die Detektion durch Fluoreszenzscanning durchgeführt, unter Verwendung eines nach dem Stand der Technik bereits beschriebenen Verfahrens (Schumm et al. (1994)).
  • Jedes unten stehende Beispiel ist ein Beispiel für die Verwendung des Verfahrens dieser Erfindung und in einigen Fällen ein Beispiel für die Verwendung für einen oder mehrere der Primer dieser Erfindung, um gleichzeitig die in zumindest drei kurzen Tandemwiederholungs-Loci vorhandenen Allele aus einer oder mehreren DNA-Proben zu bestimmen. Die Tabellen 1 und 2 fassen zusammen, welche Gruppe an Loci in der Multiplexamplifikationsreaktion, die unten stehend in jedem Beispiel beschrieben wird, coamplifiziert wurde. Die beiden Tabellen geben ebenso an, welches Primerpaar verwendet wurde, um jeden solchen Locus in jeder dieser Multiplex-Reaktion zu amplifizieren. Tabelle 1 listet all die Beispiele auf, in denen Fluoreszenzscanning verwendet wurde, um die amplifizierten Allele aus den hierin beschriebenen Multiplexreaktionen nachzuweisen, während Tabelle 2 die Beispiele auflistet, in denen Silberfärbung verwendet wurde, um die amplifizierten Allele nachzuweisen.
  • Ein Primer von jedem in Tabelle 1 gelisteten Primerpaar wurde vor seiner Verwendung in der Multiplexamplifikationsreaktion fluoreszenzmarkiert. In einigen Fällen wurde eine unterschiedliche Markierung verwendet, um Primer an verschiedene Loci zu markieren, so dass die unter Verwendung der verschiedenen Primer produzierten Allele voneinander unterschieden werden konnten, wenn sie von dem in den unten stehenden Beispielen verwendeten Fluoreszenzscanner gescannt wurden. In den unten stehenden Beispielen wurden zwei unterschiedliche Fluoreszenzmarkierungen verwendet, die als "FL" bezeichnet wurden, um fluoresceinmarkiert darzustellen, und als "TMR", um unten stehend in Tabelle 1 tetramethylrhodaminmarkierte darzustellen. Tabelle 1 zeigt ebenso, welcher Primer eines jeden in der Multiplexamplifikationsreaktion verwendeten Primerpaars in jedem Beispiel so markiert wurde (z.B. "FL- 2" bedeutet, der Primer mit der Seq.-ID Nr. 2 wurde an seinem 5'-Ende mit Fluorescein markiert, bevor er in der Multiplexamplifikationsreaktion verwendet wurde).
  • Dieselben FL- und TMR-Abkürzungen werden in den unten stehenden Beispielen verwendet. Dort wird die Markierungsabkürzung jedoch direkt vor der Seq.-ID Nr. des markierten Primers, der in der darin beschriebenen Amplifikationsreaktion verwendet wird, platziert (z.B. "FL-Seq.-ID Nr. 2" anstelle von "FL-2").
  • In vier unten stehenden Beispielpaaren (Beispiele 2 und 3, 4 und 5, 7 und 8 und 19 und 23) wurde dieselbe Gruppe von Loci unter Verwendung derselben Primer-Gruppe und derselben Fluoreszenzmarkierungen, die kovalent an eines eines jeden Primerpaars für jeden analysierten STR-Locus gebunden sind, analysiert. In jedem der Beispiele wurde jedoch eine andere Gruppe an Primern markiert. Diese Beispielpaare sind hierin inkludiert, um zu zeigen, dass derselbe niedrige Hintergrund und identische Allelbestimmungsresultate unter Verwendung der Fluoreszenzmarkierung als Detektionsverfahren aus derselben Gruppe an Primern erhalten werden können, wobei egal ist, welcher der Primer eines Primerpaars vor der Verwendung in einer Multiplexamplifikationsreaktion des Verfahrens dieser Erfindung markiert ist. TABELLE 1
    Figure 00350001
    Figure 00360001
    Figure 00370001
  • Es ist anzumerken, dass in einigen Fällen dieselbe Gruppe an Loci und dieselbe Gruppe an Primerpaaren in Tabelle 1 und Tabelle 2 auftreten. In solchen Fällen wurde dieselbe Gruppe an Allelen unter Verwendung der Fluoreszenzdetektion bzw. der Silberfärbung analysiert. Hierin sind zwei solche Fälle von Duplikat-Gruppen bereitgestellt, Beispiele 24 und 33 und Beispiele 25 und 30. Diese Beispiele zeigen klar und deutlich, dass mit beiden Verfahren dieselben Resultate erhalten werden können.
  • TABELLE 2
    Figure 00380001
  • BEISPIEL 1
  • Fluoreszenzdetektion von Multiplexamplifikation der Loci D3S1539 D7S820 D13S317 und D5S818
  • In diesem Beispiel wurde eine DNA-Matrize gleichzeitig an den einzelnen Loci D3S1539, D7S820, D13S317 und D5S818 in einem einzigen Reaktionsgefäß amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 25 μl 1 × STR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25 °C), 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl2 und 200 μM von je dATP, dCTP, dGTP und dTTP) unter Verwendung von 5 ng Matrize und 0,04 U Taq-DNA-Polymerase/μl durchgeführt.
  • Ein thermisches Zyklusgerät 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) wurde mit dem folgenden Amplifikationsprotokoll verwendet: 96 °C 2 Minuten lang, danach 10 Zyklen 1 Minute lang bei 94 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 20 Zyklen 1 Minute lang bei 90 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 1 Zyklus 30 Minuten lang bei 60 °C.
  • Acht Amplifikationsprimer wurden in Kombination verwendet, unter anderem 0,25 μM von jedem D3S1539-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 7] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 8], 0,325 μM von jedem D7S820-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 1] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 2], 0,219 μM von jedem D13S317-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 3] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 4], 0,375 μM von jedem D5S818-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 5] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 6].
  • Die amplifizierten Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 32-cm-Gel 45 Minuten lang bei 40 W getrennt, und die Produkte wurden durch Detektion der Fluoreszenzsignale unter Verwendung des FluorimagerTM-Fluoreszenzscanners (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) sichtbar gemacht.
  • Es wird auf 1 Bezug genommen, in der die amplifizierten Fragmente eines jeden Locus dargestellt sind. Die Bahnen 1 bis 5 enthalten DNA-Proben, die gleichzeitig für die Loci D3S1539, D7S820, D13S317 und D5S818 coamplifiziert wurden.
  • BEISPIEL 2
  • Fluoreszenzdetektion der Multiplexamplifikation der Loci D17S1298, D7S820, D13S317 und D5S818
  • In diesem Beispiel wurde eine DNA-Matrize gleichzeitig an den einzelnen Loci D17S1298, D7S820, D13S317 und D5S818 in einem einzigen Reaktionsgefäß amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 25 μl 1x STR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25 °C), 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl2 und 200 μM von je dATP, dCTP, dGTP und dTTP) unter Verwendung von 5 ng Matrize und 0,04 U Taq-DNA-Polymerase/μl durchgeführt. Ein thermisches Zyklusgerät 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) wurde mit dem folgenden Amplifikationsprotokoll verwendet: 96 °C 2 Minuten lang, danach 10 Zyklen 1 Minute lang bei 94 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 20 Zyklen 1 Minute lang bei 90 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 1 Zyklus 30 Minuten lang bei 60 °C.
  • Es wurden acht Amplifikationsprimer in Kombination verwendet, unter anderem 0,25 μM von jedem D17S1298-Primer 1 (Seq.-ID Nr. 9] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 10], 0,325 μM von jedem D7S820-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 1] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 2], 0,219 μM von jedem D13S317-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 3] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 4], 0,375 μM von jedem D5S818-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 5] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 6].
  • Die amplifizierten Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 32-cm-Gel 45 Minuten lang bei 40 W getrennt, und die Produkte wurden durch Detektion der Fluoreszenzsignale unter Verwendung des FluorimagerTM-Fluoreszenzscanners (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) sichtbar gemacht.
  • Es wird auf 2 Bezug genommen, in der die amplifizierten Fragmente eines jeden Locus dargestellt sind. Die Bahnen 1 bis 5 enthalten DNA-Proben, die gleichzeitig für die Loci D17S1298, D7S820, D13S317 und D5S818 coamplifiziert wurden.
  • BEISPIEL 3
  • Fluoreszenzdetektion der Multiplexamplifikation der Loci D17S1298, D7S820, D13S317 und D5S818
  • Die Loci D17S1298, D7S820, D13S317 und D5S818 wurden wie in Beispiel 2 beschrieben amplifiziert, außer dass Seq.-ID Nr. 9 mit FL-Seq.-ID Nr. 9 und FL-Seq.-ID Nr. 10 mit Seq.-ID Nr. 10 ersetzt wurde.
  • Die amplifizierten Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 32-cm-Gel 45 Minuten lang bei 40 W getrennt, und die Produkte wurden durch Detektion der Fluoreszenzsignale unter Verwendung des FluorimagerTM-Fluoreszenzscanners (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) sichtbar gemacht.
  • Es wird auf 3 Bezug genommen, in der die amplifizierten Fragmente eines jeden Locus dargestellt sind. Die Bahnen 1 bis 5 enthalten DNA-Proben, die gleichzeitig für die Loci D17S1298, D7S820, D13S317 und D5S818 coamplifiziert wurden.
  • BEISPIEL 4
  • Fluoreszenzdetektion der Multiplexamplifikation der Loci D20S481, D7S820, D13S317 und D5S818
  • In diesem Beispiel wurde eine DNA-Matrize gleichzeitig an den einzelnen Loci D20S481, D7S820, D13S317 und D5S818 in einem einzigen Reaktionsgefäß amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 25 μl 1x STR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25 °C), 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl2 und 200 μM von je dATP, dCTP, dGTP und dTTP) unter Verwendung von 5 ng Matrize und 0,04 U Taq-DNA-Polymerase/μl durchgeführt. Ein thermisches Zyklusgerät 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) wurde mit dem folgenden Amplifikationsprotokoll verwendet: 96 °C 2 Minuten lang, danach 10 Zyklen 1 Minute lang bei 94 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 20 Zyklen 1 Minute lang bei 90 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 1 Zyklus 30 Minuten lang bei 60 °C.
  • Es wurden acht Amplifikationsprimer in Kombination verwendet, unter anderem 0,25 μM von jedem D20S481-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 11] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 12], 0,325 μM von jedem D7S820-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 1] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 2], 0,219 μM von jedem D13S317-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 3] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 4], 0,375 μM von jedem D5S818-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 5] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 6].
  • Die amplifizierten Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 32-cm-Gel 45 Minuten lang bei 40 W getrennt, und die Produkte wurden durch Detektion der Fluoreszenzsignale unter Verwendung des FluorimagerTM-Fluoreszenzscanners (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) sichtbar gemacht.
  • Es wird auf 4 Bezug genommen, in der die amplifizierten Fragmente eines jeden Locus dargestellt sind. Die Bahnen 1 bis 5 enthalten DNA-Proben, die gleichzeitig für die Loci D20S481, D7S820, D13S317 und D5S818 coamplifiziert wurden.
  • BEISPIEL 5
  • Fluoreszenzdetektion der Multiplexamplifikation der Loci D20S481 D7S820 D13S317 und D5S818
  • Die Loci D20S481, D7S820, D13S317 und D5S818 wurden wie in Beispiel 4 beschrieben amplifiziert, außer dass Seq.-ID Nr. 11 mit FL-Seq.-ID Nr. 11 und FL-Seq.-ID Nr. 12 mit Seq.-ID Nr. 12 ersetzt wurde.
  • Die amplifizierten Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 32-cm-Gel 45 Minuten lang bei 40 W getrennt, und die Produkte wurden durch Detektion der Fluoreszenzsignale unter Verwendung des FluorimagerTM-Fluoreszenzscanners (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) sichtbar gemacht.
  • Es wird auf 5 Bezug genommen, in der die amplifizierten Fragmente eines jeden Locus dargestellt sind. Die Bahnen 1 bis 5 enthalten DNA-Proben, die gleichzeitig für die Loci D20S481, D7S820, D13S317 und D5S818 coamplifiziert wurden.
  • BEISPIEL 6
  • Fluoreszenzdetektion der Multiplexamplifikation der Loci D9S930, D7S820, D13S317 und D5S818
  • In diesem Beispiel wurde eine DNA-Matrize gleichzeitig an den einzelnen Loci D9S930, D7S820, D13S317 und D5S818 in einem einzigen Reaktionsgefäß amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 25 μl 1 × STR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25 °C), 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl2 und 200 μM von je dATP, dCTP, dGTP und dTTP) unter Verwendung von 5 ng Matrize und 0,04 U Taq-DNA-Polymerase/μl durchgeführt. Ein thermisches Zyklusgerät 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) wurde mit dem folgenden Amplifikationsprotokoll verwendet: 96 °C 2 Minuten lang, danach 10 Zyklen 1 Minute lang bei 94 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 20 Zyklen 1 Minute lang bei 90 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 1 Zyklus 30 Minuten lang bei 60 °C.
  • Es wurden acht Amplifikationsprimer in Kombination verwendet, unter anderem 0,70 μM von jedem D9S930-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 13] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 14], 0,325 μM von jedem D7S820-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 1] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 2], 0,22 μM von jedem D13S317-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 3] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 4], 0,375 μM von jedem D5S818-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 5] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 6].
  • Die amplifizierten Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 32-cm-Gel 45 Minuten lang bei 40 W getrennt, und die Produkte wurden durch Detektion der Fluoreszenzsignale unter Verwendung des FluorimagerTM-Fluoreszenzscanners (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) sichtbar gemacht.
  • Es wird auf 6 Bezug genommen, in der die amplifizierten Fragmente eines jeden Locus dargestellt sind. Die Bahnen 1 bis 5 enthalten DNA-Proben, die gleichzeitig für die Loci D9S930, D7S820, D13S317 und D5S818 coamplifiziert wurden.
  • BEISPIEL 7
  • Fluoreszenzdetektion der Multiplexamplifikation der Loci D10S1239, D7S820, D13S317 und D5S818
  • In diesem Beispiel wurde eine DNA-Matrize gleichzeitig an den einzelnen Loci D10S1239, D7S820, D13S317 und D5S818 in einem einzigen Reaktionsgefäß amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 25 μl 1 × STR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25 °C), 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl2 und 200 μM von je dATP, dCTP, dGTP und dTTP) unter Verwendung von 5 ng Matrize und 0,04 U Taq-DNA-Polymerase/μl durchgeführt. Ein thermisches Zyklusgerät 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) wurde mit dem folgenden Amplifikationsprotokoll verwendet: 96 °C 2 Minuten lang, danach 10 Zyklen 1 Minute lang bei 94 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 20 Zyklen 1 Minute lang bei 90 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 1 Zyklus 30 Minuten lang bei 60 °C.
  • Es wurden acht Amplifikationsprimer in Kombination verwendet, unter anderem 0,75 μM von jedem D10S1239-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 15] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 16], 0,325 μM von jedem D7S820-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 1] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 2], 0,22 μM von jedem D13S317-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 3] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 4], 0,375 μM von jedem D5S818-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 5] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 6].
  • Die amplifizierten Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 32-cm-Gel 45 Minuten lang bei 40 W getrennt, und die Produkte wurden durch Detektion der Fluoreszenzsignale unter Verwendung des FluorimagerTM-Fluoreszenzscanners (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) sichtbar gemacht.
  • Es wird auf 7 Bezug genommen, in der die amplifizierten Fragmente eines jeden Locus dargestellt sind. Die Bahnen 1 bis 5 enthalten DNA-Proben, die gleichzeitig für die Loci D10S1239, D7S820, D13S317 und D5S818 coamplifiziert wurden.
  • BEISPIEL 8
  • Fluoreszenzdetektion der Multiplexamplifikation der Loci D10S1239, D7S820, D13S317 und D5S818
  • Die Loci D10S1239, D7S820, D13S317 und D5S818 wurden wie in Beispiel 7 beschrieben amplifiziert, außer dass Seq.-ID Nr. 15 mit FL-Seq.-ID Nr. 15 und FL-Seq.-ID Nr. 16 mit Seq.-ID Nr. 16 ersetzt wurde.
  • Die amplifizierten Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 32-cm-Gel 45 Minuten lang bei 40 W getrennt, und die Produkte wurden durch Detektion der Fluoreszenzsignale unter Verwendung des FluorimagerTM-Fluoreszenzscanners (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) sichtbar gemacht.
  • Es wird auf 8 Bezug genommen, in der die amplifizierten Fragmente eines jeden Locus dargestellt sind. Die Bahnen 1 bis 5 enthalten DNA-Proben, die gleichzeitig für die Loci D10S1239, D7S820, D13S317 und D5S818 coamplifiziert wurden.
  • BEISPIEL 9
  • Fluoreszenzdetektion der Multiplexamplifikation der Loci D14S118, D7S820, D13S317 und D5S818
  • In diesem Beispiel wurde eine DNA-Matrize gleichzeitig an den einzelnen Loci D14S118, D7S820, D13S317 und D5S818 in einem einzigen Reaktionsgefäß amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 25 μl 1 × STR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25 °C), 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl2 und 200 μM von je dATP, dCTP, dGTP und dTTP) unter Verwendung von 5 ng Matrize und 0,04 U Taq-DNA-Polymerase/μl durchgeführt. Ein thermisches Zyklusgerät 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) wurde mit dem folgenden Amplifikationsprotokoll verwendet: 96 °C 2 Minuten lang, danach 10 Zyklen 1 Minute lang bei 94 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 20 Zyklen 1 Minute lang bei 90 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 1 Zyklus 30 Minuten lang bei 60 °C.
  • Es wurden acht Amplifikationsprimer in Kombination verwendet, unter anderem 0,50 μM von jedem D14S118-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 17] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 18], 0,325 μM von jedem D7S820-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 1] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 2], 0,22 μM von jedem D13S317-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 3] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 4], 0,375 μM von jedem D5S818-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 5] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 6].
  • Die amplifizierten Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 32-cm-Gel 45 Minuten lang bei 40 W getrennt, und die Produkte wurden durch Detektion der Fluoreszenzsignale unter Verwendung des FluorimagerTM-Fluoreszenzscanners (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) sichtbar gemacht.
  • Es wird auf 9 Bezug genommen, in der die amplifizierten Fragmente eines jeden Locus dargestellt sind. Die Bahnen 1 bis 5 enthalten DNA-Proben, die gleichzeitig für die Loci D14S118, D7S820, D13S317 und D5S818 coamplifiziert wurden.
  • BEISPIEL 10
  • Fluoreszenzdetektion der Multiplexamplifikation der Loci D14S562, D7S820, D13S317 und D5S818
  • In diesem Beispiel wurde eine DNA-Matrize gleichzeitig an den einzelnen Loci D14S562, D7S820, D13S317 und D5S818 in einem einzigen Reaktionsgefäß amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 25 μl 1 × STR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25 °C), 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl2 und 200 μM von je dATP, dCTP, dGTP und dTTP) unter Verwendung von 5 ng Matrize und 0,04 U Taq-DNA-Polymerase/μl durchgeführt. Ein thermisches Zyklusgerät 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) wurde mit dem folgenden Amplifikationsprotokoll verwendet: 96 °C 2 Minuten lang, danach 10 Zyklen 1 Minute lang bei 94 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 20 Zyklen 1 Minute lang bei 90 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 1 Zyklus 30 Minuten lang bei 60 °C.
  • Es wurden acht Amplifikationsprimer in Kombination verwendet, unter anderem 0,50 μM von jedem D14S562-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 19] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 20], 0,325 μM von jedem D7S820-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 1] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 2], 0,22 μM von jedem D13S317-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 3] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 4], 0,375 μM von jedem D5S818-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 5] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 6].
  • Die amplifizierten Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 32-cm-Gel 45 Minuten lang bei 40 W getrennt, und die Produkte wurden durch Detektion der Fluoreszenzsignale unter Verwendung des FluorimagerTM-Fluoreszenzscanners (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) sichtbar gemacht.
  • Es wird auf 10 Bezug genommen, in der die amplifizierten Fragmente eines jeden Locus dargestellt sind. Die Bahnen 1 bis 5 enthalten DNA-Proben, die gleichzeitig für die Loci D14S562, D7S820, D13S317 und D5S818 coamplifiziert wurden.
  • BEISPIEL 11
  • Fluoreszenzdetektion der Multiplexamplifikation der Loci D14S548, D7S820, D13S317 und D5S818
  • In diesem Beispiel wurde eine DNA-Matrize gleichzeitig an den einzelnen Loci D14S548, D7S820, D13S317 und D5S818 in einem einzigen Reaktionsgefäß amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 25 μl 1 × STR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25 °C), 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl2 und 200 μM von je dATP, dCTP, dGTP und dTTP) unter Verwendung von 5 ng Matrize und 0,04 U Taq-DNA-Polymerase/μl durchgeführt. Ein thermisches Zyklusgerät 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) wurde mit dem folgenden Amplifikationsprotokoll verwendet: 96 °C 2 Minuten lang, danach 10 Zyklen 1 Minute lang bei 94 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 20 Zyklen 1 Minute lang bei 90 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 1 Zyklus 30 Minuten lang bei 60 °C.
  • Es wurden acht Amplifikationsprimer in Kombination verwendet, unter anderem 0,50 μM von jedem D14S548-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 21] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 22], 0,325 μM von jedem D7S820-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 1] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 2], 0,22 μM von jedem D13S317-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 3] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 4], 0,375 μM von jedem D5S818-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 5] und 2 (FL-Seq-ID Nr. 6].
  • Die amplifizierten Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 32-cm-Gel 45 Minuten lang bei 40 W getrennt, und die Produkte wurden durch Detektion der Fluoreszenzsignale unter Verwendung des FluorimagerTM-Fluoreszenzscanners (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) sichtbar gemacht.
  • Es wird auf 11 Bezug genommen, in der die amplifizierten Fragmente eines jeden Locus dargestellt sind. Die Bahnen 1 bis 5 enthalten DNA-Proben, die gleichzeitig für die Loci D14S548, D7S820, D13S317 und D5S818 coamplifiziert wurden.
  • BEISPIEL 12
  • Fluoreszenzdetektion der Multiplexamplifikation der Loci D16S490, D7S820, D13S317 und D5S818
  • In diesem Beispiel wurde eine DNA-Matrize gleichzeitig an den einzelnen Loci D16S490, D7S820, D13S317 und D5S818 in einem einzigen Reaktionsgefäß amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 25 μl 1 × STR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25 °C), 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl2 und 200 μM von je dATP, dCTP, dGTP und dTTP) unter Verwendung von 5 ng Matrize und 0,04 U Taq-DNA-Polymerase/μl durchgeführt. Ein thermisches Zyklusgerät 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) wurde mit dem folgenden Amplifikationsprotokoll verwendet: 96 °C 2 Minuten lang, danach 10 Zyklen 1 Minute lang bei 94 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 20 Zyklen 1 Minute lang bei 90 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 1 Zyklus 30 Minuten lang bei 60 °C.
  • Es wurden acht Amplifikationsprimer in Kombination verwendet, unter anderem 0,50 μM von jedem D16S490-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 23] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 24], 0,325 μM von jedem D7S820-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 1] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 2], 0,22 μM von jedem D13S317-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 3] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 4], 0,375 μM von jedem D5S818-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 5] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 6].
  • Die amplifizierten Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 32-cm-Gel 45 Minuten lang bei 40 W getrennt, und die Produkte wurden durch Detektion der Fluoreszenzsignale unter Verwendung des FluorimagerTM-Fluoreszenzscanners (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) sichtbar gemacht.
  • Es wird auf 12 Bezug genommen, in der die amplifizierten Fragmente eines jeden Locus dargestellt sind. Die Bahnen 1 bis 5 enthalten DNA-Proben, die gleichzeitig für die Loci D16S490, D7S820, D13S317 und D5S818 coamplifiziert wurden.
  • BEISPIEL 13
  • Fluoreszenzdetektion der Multiplexamplifikation der Loci D16S753, D7S820, D13S317 und D5S818
  • In diesem Beispiel wurde eine DNA-Matrize gleichzeitig an den einzelnen Loci D16S753, D7S820, D13S317 und D5S818 in einem einzigen Reaktionsgefäß amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 25 μl 1 × STR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25 °C), 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl2 und 200 μM von je dATP, dCTP, dGTP und dTTP) unter Verwendung von 5 ng Matrize und 0,04 U Taq-DNA-Polymerase/μl durchgeführt. Ein thermisches Zyklusgerät 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) wurde mit dem folgenden Amplifikationsprotokoll verwendet: 96 °C 2 Minuten lang, danach 10 Zyklen 1 Minute lang bei 94 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 20 Zyklen 1 Minute lang bei 90 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 1 Zyklus 30 Minuten lang bei 60 °C.
  • Es wurden acht Amplifikationsprimer in Kombination verwendet, unter anderem 0,50 μM von jedem D16S753-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 25] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 26], 0,325 μM von jedem D7S820-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 1] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 2], 0,22 μM von jedem D13S317-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 3] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 4], 0,375 μM von jedem D5S818-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 5] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 6].
  • Die amplifizierten Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 32-cm-Gel 45 Minuten lang bei 40 W getrennt, und die Produkte wurden durch Detektion der Fluoreszenzsignale unter Verwendung des FluorimagerTM-Fluoreszenzscanners (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) sichtbar gemacht.
  • Es wird auf 13 Bezug genommen, in der die amplifizierten Fragmente eines jeden Locus dargestellt sind. Die Bahnen 1 bis 5 enthalten DNA-Proben, die gleichzeitig für die Loci D16S753, D7S820, D13S317 und D5S818 coamplifiziert wurden.
  • BEISPIEL 14
  • Fluoreszenzdetektion der Multiplexamplifikation der Loci D17S1299, D7S820, D13S317 und D5S818
  • In diesem Beispiel wurde eine DNA-Matrize gleichzeitig an den einzelnen Loci D17S1299, D7S820, D13S317 und D5S818 in einem einzigen Reaktionsgefäß amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 25 μl 1 × STR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25 °C), 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl2 und 200 μM von je dATP, dCTP, dGTP und dTTP) unter Verwendung von 5 ng Matrize und 0,04 U Taq-DNA-Polymerase/μl durchgeführt. Ein thermisches Zyklusgerät 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) wurde mit dem folgenden Amplifikationsprotokoll verwendet: 96 °C 2 Minuten lang, danach 10 Zyklen 1 Minute lang bei 94 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 20 Zyklen 1 Minute lang bei 90 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 1 Zyklus 30 Minuten lang bei 60 °C.
  • Es wurden acht Amplifikationsprimer in Kombination verwendet, unter anderem 0,50 μM von jedem D17S1299-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 27] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 28], 0,325 μM von jedem D7S820-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 1] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 2], 0,22 μM von jedem D13S317-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 3] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 4], 0,375 μM von jedem D5S818-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 5] und 2 (FL-Seq-ID Nr. 6].
  • Die amplifizierten Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 32-cm-Gel 45 Minuten lang bei 40 W getrennt, und die Produkte wurden durch Detektion der Fluoreszenzsignale unter Verwendung des FluorimagerTM-Fluoreszenzscanners (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) sichtbar gemacht.
  • Es wird auf 14 Bezug genommen, in der die amplifizierten Fragmente eines jeden Locus dargestellt sind. Die Bahnen 1 bis 5 enthalten DNA-Proben, die gleichzeitig für die Loci D17S1299, D7S820, D13S317 und D5S818 coamplifiziert wurden.
  • BEISPIEL 15
  • Fluoreszenzdetektion der Multiplexamplifikation der Loci D16S539, D7S820, D13S317 und D5S818
  • In diesem Beispiel wurde eine DNA-Matrize gleichzeitig an den einzelnen Loci D16S539, D7S820, D13S317 und D5S818 in einem einzigen Reaktionsgefäß amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 25 μl 1 × STR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25 °C), 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl2 und 200 μM von je dATP, dCTP, dGTP und dTTP) unter Verwendung von 5 ng Matrize und 0,04 U Taq-DNA-Polymerase/μl durchgeführt. Ein thermisches Zyklusgerät 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) wurde mit dem folgenden Amplifikationsprotokoll verwendet: 96 °C 2 Minuten lang, danach 10 Zyklen 1 Minute lang bei 94 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 20 Zyklen 1 Minute lang bei 90 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 1 Zyklus 30 Minuten lang bei 60 °C.
  • Es wurden acht Amplifikationsprimer in Kombination verwendet, unter anderem 0,60 μM von jedem D16S539-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 29] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 30], 0,325 μM von jedem D7S820-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 1] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 2], 0,22 μM von jedem D13S317-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 3] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 4], 0,50 μM von jedem D5S818-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 5] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 6].
  • Die amplifizierten Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 32-cm-Gel 50 Minuten lang bei 40 W getrennt, und die Produkte wurden durch Detektion der Fluoreszenzsignale unter Verwendung des FluorimagerTM-Fluoreszenzscanners (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) sichtbar gemacht.
  • Es wird auf 15 Bezug genommen, in der die amplifizierten Fragmente eines jeden Locus dargestellt sind. Die Bahnen 1 bis 5 enthalten DNA-Proben, die gleichzeitig für die Loci D16S539, D7S820, D13S317 und D5S818 coamplifiziert wurden.
  • BEISPIEL 16
  • Fluoreszenzdetektion der Multiplexamplifikation der Loci D22S683, D7S820, D13S317 und D5S818
  • In diesem Beispiel wurde eine DNA-Matrize gleichzeitig an den einzelnen Loci D22S683, D7S820, D13S317 und D5S818 in einem einzigen Reaktionsgefäß amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 25 μl 1 × STR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25 °C), 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl2 und 200 μM von je dATP, dCTP, dGTP und dTTP) unter Verwendung von 5 ng Matrize und 0,04 U Taq-DNA-Polymerase/μl durchgeführt. Ein thermisches Zyklusgerät 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) wurde mit dem folgenden Amplifikationsprotokoll verwendet: 96 °C 2 Minuten lang, danach 10 Zyklen 1 Minute lang bei 94 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 20 Zyklen 1 Minute lang bei 90 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 1 Zyklus 30 Minuten lang bei 60 °C.
  • Es wurden acht Amplifikationsprimer in Kombination verwendet, unter anderem 0,50 μM von jedem D22S683-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 31] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 32], 0,325 μM von jedem D7S820-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 1] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 2], 0,22 μM von jedem D13S317-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 3] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 4], 0,375 μM von jedem D5S818-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 5] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 6].
  • Die amplifizierten Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 32-cm-Gel 55 Minuten lang bei 40 W getrennt, und die Produkte wurden durch Detektion der Fluoreszenzsignale unter Verwendung des FluorimagerTM-Fluoreszenzscanners (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) sichtbar gemacht.
  • Es wird auf 16 Bezug genommen, in der die amplifizierten Fragmente eines jeden Locus dargestellt sind. Die Bahnen 1 bis 5 enthalten DNA-Proben, die gleichzeitig für die Loci D22S683, D7S820, D13S317 und D5S818 coamplifiziert wurden.
  • BEISPIEL 17
  • Fluoreszenzdetektion der Multiplexamplifikation der Loci D16S539, D7S820, D13S317 D5S818, HUMCSF1PO und HUMTPOX
  • In diesem Beispiel wurde eine DNA-Matrize gleichzeitig an den einzelnen Loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO und HUMTPOX in einem einzigen Reaktionsgefäß amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 25 μl 1 × STR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25 °C), 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl2 und 200 μM von je dATP, dCTP, dGTP und dTTP) unter Verwendung von 5 ng Matrize und 0,06 U Taq-DNA-Polymerase/μl durchgeführt. Ein thermisches Zyklusgerät 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) wurde mit dem folgenden Amplifikationsprotokoll verwendet: 96 °C 2 Minuten lang, danach 10 Zyklen 1 Minute lang bei 94 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 20 Zyklen 1 Minute lang bei 90 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 1 Zyklus 30 Minuten lang bei 60 °C.
  • Es wurden zwölf Amplifikationsprimer in Kombination verwendet, unter anderem 0,65 μM von jedem D16S539-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 29] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 30], 0,325 μM von jedem D7S820-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 1] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 2], 0,22 μM von jedem D13S317-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 3] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 4], 0,55 μM von jedem D5S818-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 5] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 6], 0,40 μM von jedem HUMCSF1PO-Primer 1 [TMR-Seq.-ID Nr. 33] und 2 [Seq.-ID Nr. 34], 0,40 μM von jedem HUMTPOX-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 35] und 2 [TMR-Seq.-ID Nr. 36].
  • Die amplifizierten Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 32-cm-Gel 50 Minuten lang bei 40 W getrennt, und die Produkte wurden durch Detektion der Fluoreszenzsignale unter Verwendung des FMBIOFluorimagerTM (Hitachi Software Engineering, San Bruno, CA) sichtbar gemacht.
  • Es wird auf 17 Bezug genommen, in der die amplifizierten Fragmente eines jeden Locus in eigenen 505-nm- und 625-nm-Scans auf demselben Gel dargestellt sind, was fluoresceinmarkiertes bzw. tetramethylrhodaminmarkiertes Material zum Vorschein bringt. Die Bahnen 1 bis 4 enthalten DNA-Proben, die gleichzeitig für die Loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO ("CSF1PO") und HUMTPOX ("TPOX") coamplifiziert wurden.
  • BEISPIEL 18
  • Fluoreszenzdetektion der Multiplexamplifikation der Loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO, HUMTPOX und HUMTHO1
  • In diesem Beispiel wurde eine DNA-Matrize gleichzeitig an den einzelnen Loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO, HUMTPOX und HUMTHO1 in einem einzigen Reaktionsgefäß amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 25 μl 1x STR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25 °C), 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl2 und 200 μM von je dATP, dCTP, dGTP und dTTP) unter Verwendung von 5 ng Matrize und 0,07 U Taq-DNA-Polymerase/μl durchgeführt. Ein thermisches Zyklusgerät 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) wurde mit dem folgenden Amplifikationsprotokoll verwendet: 96 °C 2 Minuten lang, danach 10 Zyklen 1 Minute lang bei 94 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 20 Zyklen 1 Minute lang bei 90 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 1 Zyklus 30 Minuten lang bei 60 °C.
  • Es wurden vierzehn Amplifikationsprimer in Kombination verwendet, unter anderem 0,75 μM von jedem D16S539-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 29] und 2 (FL-Seq-ID Nr. 30], 0,40 μM von jedem D7S820-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 1] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 2], 0,30 μM von jedem D13S317-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 3] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 4], 0,60 μM von jedem D5S818-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 5] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 6], 0,30 μM von jedem HUMCSF1PO-Primer 1 [TMR-Seq.-ID Nr. 32] und 2 [Seq.-ID Nr. 34], 0,40 μM von jedem HUMTPOX-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 35] und 2 [TMR-Seq.-ID Nr. 35], 0,40 μM von jedem HUMTHO1-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 37] und 2 [TMR-Seq.-ID Nr. 38].
  • Die amplifizierten Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 32-cm-Gel 50 Minuten lang bei 40 W getrennt, und die Produkte wurden durch Detektion der Fluoreszenzsignale unter Verwendung des FMBIOFluorimagerTM (Hitachi Software Engineering, San Bruno, CA) sichtbar gemacht.
  • Es wird auf 18 Bezug genommen, in der die amplifizierten Fragmente eines jeden Locus in eigenen 505-nm- und 625-nm-Scans auf demselben Gel dargestellt sind, was fluoresceinmarkiertes bzw. tetramethylrhodaminmarkiertes Material zum Vorschein bringt. Die Bahnen 1 bis 5 enthalten DNA-Proben, die gleichzeitig für die Loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO ("CSF1PO"), HUMTPOX ("TPOX") und HUMTHO1 ("THO1") coamplifiziert wurden.
  • BEISPIEL 19
  • Fluoreszenzdetektion der Multiplexamplifikation der Loci D16S539, D7S820, D13S317 D5S818 HUMCSF1PO HUMTPOX HUMTHO1 und HUMvWFA31
  • In diesem Beispiel wurde eine DNA-Matrize gleichzeitig an den einzelnen Loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO, HUMTPOX, HUMTHO1 und HUMvWFA31 in einem einzigen Reaktionsgefäß amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 25 μl 1x STR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25 °C), 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl2 und 200 μM von je dATP, dCTP, dGTP und dTTP) unter Verwendung von 5 ng Matrize und 0,08 U Taq-DNA-Polymerase/μl durchgeführt. Ein thermisches Zyklusgerät 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) wurde mit dem folgenden Amplifikationsprotokoll verwendet: 96 °C 2 Minuten lang, danach 10 Zyklen 1 Minute lang bei 94 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 20 Zyklen 1 Minute lang bei 90 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 1 Zyklus 30 Minuten lang bei 60 °C.
  • Es wurden sechzehn Amplifikationsprimer in Kombination verwendet, unter anderem 0,75 μM von jedem D16S539-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 29] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 30], 0,40 μM von jedem D7S820-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 1] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 2], 0,30 μM von jedem D13S317-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 3] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 4], 0,60 μM von jedem D5S818-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 5] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 6], 0,30 μM von jedem HUMCSF1PO-Primer 1 [TMR-Seq.-ID Nr. 33] und 2 [Seq.-ID Nr. 34], 0,40 μM von jedem HUMTPOX-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 35] und 2 [TMR-Seq.-ID Nr. 36], 0,40 μM von jedem HUMTHO1-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 37] und 2 [TMR-Seq.-ID Nr. 38], 0,40 μM von jedem HUMvWFA31-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 39] und 2 [TMR-Seq.-ID Nr. 40].
  • Die amplifizierten Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 32-cm-Gel 50 Minuten lang bei 40 W getrennt, und die Produkte wurden durch Detektion der Fluoreszenzsignale unter Verwendung des FMBIOFluorimagerTM (Hitachi Software Engineering, San Bruno, CA) sichtbar gemacht.
  • Es wird auf 19 Bezug genommen, in der die amplifizierten Fragmente eines jeden Locus in eigenen 505-nm- und 625-nm-Scans auf demselben Gel dargestellt sind, was fluoresceinmarkiertes bzw. tetramethylrhodaminmarkiertes Material zum Vorschein bringt. Die Bahnen 1 bis 5 enthalten DNA-Proben, die gleichzeitig für die Loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO ("CSF1PO"), HUMTPOX ("TPOX"), HUMTHO1 ("THO1") und HUMvWFA31 ("vWA") coamplifiziert wurden.
  • BEISPIEL 20
  • Fluoreszenzdetektion der Multiplexamplifikation der Loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818. HUMF13AO1 und HUMFESFPS
  • In diesem Beispiel wurde eine DNA-Matrize gleichzeitig an den einzelnen Loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13AO1 und HUMFESFPS in einem einzigen Reaktionsgefäß amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 25 μl 1x STR- Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25 °C), 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl2 und 200 μM von je dATP, dCTP, dGTP und dTTP) unter Verwendung von 5 ng Matrize und 0,06 U Taq-DNA-Polymerase/μl durchgeführt. Ein thermisches Zyklusgerät 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) wurde mit dem folgenden Amplifikationsprotokoll verwendet: 96 °C 2 Minuten lang, danach 10 Zyklen 1 Minute lang bei 94 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 20 Zyklen 1 Minute lang bei 90 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 1 Zyklus 30 Minuten lang bei 60 °C.
  • Es wurden zwölf Amplifikationsprimer in Kombination verwendet, unter anderem 0,75 μM von jedem D16S539-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 29] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 30], 0,40 μM von jedem D7S820-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 1] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 2], 0,30 μM von jedem D13S317-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 3] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 4], 0,60 μM von jedem D5S818-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 5] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 6], 0,10 μM von jedem HUMF13AO1-Primer 1 [TMR-Seq.-ID Nr. 41] und 2 [Seq.-ID Nr. 42], 1,0 μM von jedem HUMFESFPS-Primer 1 [TMR-Seq.-ID Nr. 43] und 2 [Seq.-ID Nr. 44].
  • Die amplifizierten Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 32-cm-Gel 50 Minuten lang bei 40 W getrennt, und die Produkte wurden durch Detektion der Fluoreszenzsignale unter Verwendung des FMBIOFluorimagerTM (Hitachi Software Engineering, San Bruno, CA) sichtbar gemacht.
  • Es wird auf 20 Bezug genommen, in der die amplifizierten Fragmente eines jeden Locus in eigenen 505-nm- und 625-nm-Scans auf demselben Gel dargestellt sind, was fluoresceinmarkiertes bzw. tetramethylrhodaminmarkiertes Material zum Vorschein bringt. Die Bahnen 1 bis 5 enthalten DNA-Proben, die gleichzeitig für die Loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13AO1 ("F13AO1") und HUMFESFPS ("FESFPS") coamplifiziert wurden.
  • BEISPIEL 21
  • Fluoreszenzdetektion der Multiplexamplifikation der Loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13AO1, HUMFESFPS und HUMBFXIII
  • In diesem Beispiel wurde eine DNA-Matrize gleichzeitig an den einzelnen Loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13AO1, HUMFESFPS und HUMBFXIII in einem einzigen Reaktionsgefäß amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 25 μl 1 × STR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25 °C), 0,1 Triton X-100, 1,5 mM MgCl2 und 200 μM von je dATP, dCTP, dGTP und dTTP) unter Verwendung von 5 ng Matrize und 0,07 U Taq-DNA-Polymerase/μl durchgeführt. Ein thermisches Zyklusgerät 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) wurde mit dem folgenden Amplifikationsprotokoll verwendet: 96 °C 2 Minuten lang, danach 10 Zyklen 1 Minute lang bei 94 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 20 Zyklen 1 Minute lang bei 90 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 1 Zyklus 30 Minuten lang bei 60 °C.
  • Es wurden vierzehn Amplifikationsprimer in Kombination verwendet, unter anderem 0,75 μM von jedem D16S539-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 29] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 30], 0,40 μM von jedem D7S820-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 1] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 2], 0,30 μM von jedem D13S317-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 3] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 4], 0,60 μM von jedem D5S818-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 5] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 6], 0,10 μM von jedem HUMF13AO1-Primer 1 [TMR-Seq.-ID Nr. 41] und 2 [Seq.-ID Nr. 42], 1,0 μM von jedem HUMFESFPS-Primer 1 [TMR-Seq.-ID Nr. 43] und 2 [Seq.-ID Nr. 44], 0,50 μM von jedem HUMBFXIII-Primer 1 [TMR-Seq.-ID Nr. 45] und 2 [Seq.-ID Nr. 46].
  • Die amplifizierten Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 32-cm-Gel 50 Minuten lang bei 40 W getrennt, und die Produkte wurden durch Detektion der Fluoreszenzsignale unter Verwendung des FMBIOFluorimagerTM (Hitachi Software Engineering, San Bruno, CA) sichtbar gemacht.
  • Es wird auf 21 Bezug genommen, in der die amplifizierten Fragmente eines jeden Locus in eigenen 505-nm- und 625-nm-Scans auf demselben Gel dargestellt sind, was fluoresceinmarkiertes bzw. tetramethylrhodaminmarkiertes Material zum Vorschein bringt. Die Bahnen 1 bis 5 enthalten DNA-Proben, die gleichzeitig für die Loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13AO1 ("F13AO1"), HUMFESFPS ("FESFPS") und HUMBFXIII ("F13B") coamplifiziert wurden.
  • BEISPIEL 22
  • Fluoreszenzdetektion der Multiplexamplifikation der Loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13AO1, HUMFESFPS, HUMBFXIII und HUMLIPOL
  • In diesem Beispiel wurde eine DNA-Matrize gleichzeitig an den einzelnen Loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13AO1, HUMFESFPS, HUMBFXIII und HUMLIPOL in einem einzigen Reaktionsgefäß amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 25 μl 1 × STR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25 °C), 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl2 und 200 μM von je dATP, dCTP, dGTP und dTTP) unter Verwendung von 5 ng Matrize und 0,08 U Taq-DNA-Polymerase/μl durchgeführt. Ein thermisches Zyklusgerät 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) wurde mit dem folgenden Amplifikationsprotokoll verwendet: 96 °C 2 Minuten lang, danach 10 Zyklen 1 Minute lang bei 94 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 20 Zyklen 1 Minute lang bei 90 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 1 Zyklus 30 Minuten lang bei 60 °C.
  • Es wurden sechzehn Amplifikationsprimer in Kombination verwendet, unter anderem 0,75 μM von jedem D16S539-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 29] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 30], 0,40 μM von jedem D7S820-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 1] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 2], 0,30 μM von jedem D13S317-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 3] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 4], 0,60 μM von jedem D5S818-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 5] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 6], 0,10 μM von jedem HUMF13AO1-Primer 1 [TMR-Seq.-ID Nr. 41] und 2 [Seq.-ID Nr. 42], 1,0 μM von jedem HUMFESFPS-Primer 1 [TMR-Seq.-ID Nr. 43] und 2 [Seq.-ID Nr. 44], 0,50 μM von jedem HUMBFXIII-Primer 1 [TMR-Seq.-ID Nr. 45] und 2 [TMR-Seq.-ID Nr. 46], 0,20 μM von jedem HUMLIPOL-Primer 1 [TMR-Seq.-ID Nr. 47] und 2 [Seq.-ID Nr. 48].
  • Die amplifizierten Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 32-cm-Gel 50 Minuten lang bei 40 W getrennt, und die Produkte wurden durch Detektion der Fluoreszenzsignale unter Verwendung des FMBIOFluorimagerTM (Hitachi Software Engineering, San Bruno, CA) sichtbar gemacht.
  • Es wird auf 22 Bezug genommen, in der die amplifizierten Fragmente eines jeden Locus in eigenen 505-nm- und 625-nm-Scans auf demselben Gel dargestellt sind, was fluoresceinmarkiertes bzw. tetramethylrhodaminmarkiertes Material zum Vorschein bringt. Die Bahnen 1 bis 5 enthalten DNA-Proben, die gleichzeitig für die Loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13AO1 ("HUMF13AO1"), HUMFESFPS ("FESFPS"), HUMBFXIII ("F13B") und HUMLIPOL ("LPL") coamplifiziert wurden.
  • BEISPIEL 23
  • Fluoreszenzdetektion der Multiplexamplifikation der Loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO. HUMTPOX, HUMTHO1 und HUMvWFA31
  • In diesem Beispiel wurde eine DNA-Matrize gleichzeitig an den einzelnen Loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO, HUMTPOX, HUMTHO1 und HUMvWFA31 in einem einzigen Reaktionsgefäß amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 25 μl 1 × STR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25 °C), 0,1 Triton X-100, 1,5 mM MgCl2 und 200 μM von je dATP, dCTP, dGTP und dTTP) unter Verwendung von 5 ng Matrize und 0,08 U Taq-DNA-Polymerase/μl durchgeführt. Ein thermisches Zyklusgerät 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) wurde mit dem folgenden Amplifikationsprotokoll verwendet: 96 °C 2 Minuten lang, danach 10 Zyklen 1 Minute lang bei 94 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 20 Zyklen 1 Minute lang bei 90 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 1 Zyklus 30 Minuten lang bei 60 °C.
  • Es wurden sechzehn Amplifikationsprimer in Kombination verwendet, unter anderem 0,75 μM von jedem D16S539-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 29] und 2 [TMR-Seq-ID Nr. 30], 0,40 μM von jedem D7S820-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 1] und 2 [TMR-Seq-ID Nr. 2], 0,30 μM von jedem D13S317-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 3] und 2 [TMR-Seq-ID Nr. 4], 0,60 μM von jedem D5S818-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 5] und 2 [TMR-Seq-ID Nr. 6], 0,40 μM von jedem HUMCSF1PO-Primer 1 [FL-Seq.-ID Nr. 33] und 2 [Seq.-ID Nr. 34], 0,50 μM von jedem HUMTPOX-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 35] und 2 [FL-Seq.-ID Nr. 36], 0,20 μM von jedem HUMTHO1-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 37] und 2 [FL-Seq.-ID Nr. 38], 0,55 μM von jedem HUMvWFA31-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 39] und 2 [FL-Seq.-ID Nr. 40].
  • Die amplifizierten Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 32-cm-Gel 50 Minuten lang bei 40 W getrennt, und die Produkte wurden durch Detektion der Fluoreszenzsignale unter Verwendung des FMBIOFluorimagerTM (Hitachi Software Engineering, San Bruno, CA) sichtbar gemacht.
  • Es wird auf 23 Bezug genommen, in der die amplifizierten Fragmente eines jeden Locus in eigenen 505-nm- und 625-nm-Scans auf demselben Gel dargestellt sind, was fluoresceinmarkiertes bzw. tetramethylrhodaminmarkiertes Material zum Vorschein bringt. Die Bahnen 1 bis 3 enthalten DNA-Proben, die gleichzeitig für die Loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO ("CSF1PO"), HUMTPOX ("TPOX"), HUMTHO1 ("THO1") und HUMvWFA31 ("vWA") coamplifiziert wurden.
  • BEISPIEL 24
  • Fluoreszenzdetektion der Multiplexamplifikation der Loci D3S1539, D19S253, D13S317 und D20S481
  • In diesem Beispiel wurde eine DNA-Matrize gleichzeitig an den einzelnen Loci D3S1539, D19S253, D13S317 und D20S481 in einem einzigen Reaktionsgefäß amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 25 μl 1 × STR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25 °C), 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl2 und 200 μM von je dATP, dCTP, dGTP und dTTP) unter Verwendung von 5 ng Matrize und 0,04 U Taq-DNA-Polymerase/μl durchgeführt. Ein thermisches Zyklusgerät 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) wurde mit dem folgenden Amplifikationsprotokoll verwendet: 96 °C 2 Minuten lang, danach 10 Zyklen 1 Minute lang bei 94 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 20 Zyklen 1 Minute lang bei 90 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 1 Zyklus 30 Minuten lang bei 60 °C.
  • Es wurden acht Amplifikationsprimer in Kombination verwendet, unter anderem 0,75 μM von jedem D3S1539-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 7] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 492], 0,75 μM von jedem D19S253-Primer 1 [FL-Seq.-ID Nr. 50] und 2 [Seq-ID Nr. 51], 0,50 μM von jedem D13S317-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 3] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 4], 0,50 μM von jedem D20S481-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 52] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 53].
  • Die amplifizierten Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 32-cm-Gel 50 Minuten lang bei 40 W getrennt, und die Produkte wurden durch Detektion der Fluoreszenzsignale unter Verwendung des FluorimagerTM-Fluoreszenzscanners (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) sichtbar gemacht.
  • Es wird auf 24 Bezug genommen, in der die amplifizierten Fragmente eines jeden Locus dargestellt sind. Die Bahnen 1 bis 5 enthalten DNA-Proben, die gleichzeitig für die Loci D3S1539, D19S253, D13S317 und D20S481 coamplifiziert wurden.
  • BEISPIEL 25
  • Fluoreszenzdetektion der Multiplexamplifikation der Loci D10S1239, D9S930, D4S2368 und D20S481
  • In diesem Beispiel wurde eine DNA-Matrize gleichzeitig an den einzelnen Loci D10S1239, D9S930, D4S2368 und D20S481 in einem einzigen Reaktionsgefäß amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 25 μl 1 × STR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25 °C), 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl2 und 200 μM von je dATP, dCTP, dGTP und dTTP) unter Verwendung von 5 ng Matrize und 0,04 U Taq-DNA-Polymerase/μl durchgeführt. Ein thermisches Zyklusgerät 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) wurde mit dem folgenden Amplifikationsprotokoll verwendet: 96 °C 2 Minuten lang, danach 10 Zyklen 1 Minute lang bei 94 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 20 Zyklen 1 Minute lang bei 90 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 1 Zyklus 30 Minuten lang bei 60 °C.
  • Es wurden acht Amplifikationsprimer in Kombination verwendet, unter anderem 0,30 μM von jedem D10S1239-Primer 1 [FL-Seq.-ID Nr. 15] und 2 [Seq-ID Nr. 54], 0,40 μM von jedem D9S930-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 55] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 14], 0,50 μM von jedem D4S2368-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 56] und 2 [FL-Seq-ID Nr. 57], 0,50 μM von jedem D20S481-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 52] und 2 (FL-Seq-ID Nr. 53].
  • Die amplifizierten Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 32-cm-Gel 50 Minuten lang bei 40 W getrennt, und die Produkte wurden durch Detektion der Fluoreszenzsignale unter Verwendung des FluorimagerTM-Fluoreszenzscanners (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) sichtbar gemacht.
  • Es wird auf 25 Bezug genommen, in der die amplifizierten Fragmente eines jeden Locus dargestellt sind. Die Bahnen 1 bis 5 enthalten DNA-Proben, die gleichzeitig für die Loci D10S1239, D9S930, D4S2368 und D20S481 coamplifiziert wurden.
  • BEISPIEL 26
  • Silberdetektion der Multiplexamplifikation der Loci D16S539, D7S820 und D13S317
  • In diesem Beispiel wurde eine DNA-Matrize gleichzeitig an den einzelnen Loci D16S539, D7S820 und D13S317 in einem einzigen Reaktionsgefäß amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 25 μl 1 × STR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25 °C), 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl2 und 200 μM von je dATP, dCTP, dGTP und dTTP) unter Verwendung von 5 bis 25 ng Matrize und 0,03 U Taq-DNA-Polymerase/μl durchgeführt. Ein thermisches Zyklusgerät 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) wurde mit dem folgenden Amplifikationsprotokoll verwendet: 96 °C 2 Minuten lang, danach 10 Zyklen 1 Minute lang bei 94 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 20 Zyklen 1 Minute lang bei 90 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 1 Zyklus 30 Minuten lang bei 60 °C.
  • Es wurden sechs Amplifikationsprimer in Kombination verwendet, unter anderem 0,5 μM von jedem D16S539-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 29] und 2 [Seq-ID Nr. 58], 0,5 μM von jedem D7S820-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 1] und 2 [Seq-ID Nr. 2], 0,5 μM von jedem D13S317-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 3] und 2 [Seq-ID Nr. 4].
  • Die amplifizierten Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 32-cm-Gel 50 Minuten lang bei 40 W getrennt, und die Produkte wurden durch Silberfärbungsanalyse gemäß dem Protokoll von Bassam et al. (1991) sichtbar gemacht.
  • Es wird auf 26 Bezug genommen, in der die amplifizierten Fragmente eines jeden Locus dargestellt sind. Die Bahnen 1 bis 4 enthalten DNA-Proben, die gleichzeitig für die Loci D16S539, D7S820 und D13S317 coamplifiziert wurden, und Bahn 5 zeigt eine Probe ohne DNA-Matrize, die denselben Verfahren unterzogen wurde, d.h. eine negative Kontrolle.
  • BEISPIEL 27
  • Silberdetektion der Multiplexamplifikation der Loci D16S539, D7S820, D13S317 und HUMvWFA31
  • In diesem Beispiel wurde eine DNA-Matrize gleichzeitig an den einzelnen Loci D16S539, D7S820, D13S317 und HUMvWFA31 in einem einzigen Reaktionsgefäß amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 25 μl 1x STR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25 °C), 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl2 und 200 μM von je dATP, dCTP, dGTP und dTTP) unter Verwendung von 5 ng Matrize und 0,04 U Taq-DNA-Polymerase/μl durchgeführt. Ein thermisches Zyklusgerät 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) wurde mit dem folgenden Amplifikationsprotokoll verwendet: 96 °C 2 Minuten lang, danach 10 Zyklen 1 Minute lang bei 94 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 20 Zyklen 1 Minute lang bei 90 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 1 Zyklus 30 Minuten lang bei 60 °C.
  • Es wurden acht Amplifikationsprimer in Kombination verwendet, unter anderem 0,3 μM von jedem D16S539-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 29] und 2 [Seq-ID Nr. 30], 0,3 μM von jedem D7S820-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 1] und 2 [Seq-ID Nr. 2), 0,5 μM von jedem D13S317-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 3] und 2 [Seq-ID Nr. 4], 0,5 μM von jedem HUMvWFA31-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 59] und 2 [Seq-ID Nr. 60].
  • Die amplifizierten Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 32-cm-Gel 50 Minuten lang bei 40 W getrennt, und die Produkte wurden durch Silberfärbungsanalyse gemäß dem Protokoll von Bassam et al. (1991) sichtbar gemacht.
  • Es wird auf 27 Bezug genommen, in der die amplifizierten Fragmente eines jeden Locus dargestellt sind. Die Bahnen 1 bis 3 enthalten DNA-Proben, die gleichzei tig für die Loci D16S539, D7S820, D13S317 und HUMvWFA31 ("vWA") coamplifiziert wurden.
  • BEISPIEL 28
  • Silberdetektion der Multiplexamplifikation der Loci D10S1239, D9S930 und D13S317
  • In diesem Beispiel wurde eine DNA-Matrize gleichzeitig an den einzelnen Loci D10S1239, D9S930 und D13S317 in einem einzigen Reaktionsgefäß amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 25 μl 1 × STR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25 °C), 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl2 und 200 μM von je dATP, dCTP, dGTP und dTTP) unter Verwendung einer unbestimmten Menge ng Matrize und 0,03 U Taq-DNA-Polymerase/μl durchgeführt. Ein thermisches Zyklusgerät 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) wurde mit dem folgenden Amplifikationsprotokoll verwendet: 96 °C 2 Minuten lang, danach 10 Zyklen 1 Minute lang bei 94 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 20 Zyklen 1 Minute lang bei 90 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C.
  • Es wurden sechs Amplifikationsprimer in Kombination verwendet, unter anderem 1,0 μM von jedem D10S1239-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 15] und 2 [Seq-ID Nr. 54], 0,3 μM von jedem D9S930-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 55] und 2 [Seq-ID Nr. 61], 0,5 μM von jedem D13S317-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 3] und 2 [Seq-ID Nr. 4].
  • Die amplifizierten Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 40-cm-Gel 60 Minuten lang bei 60 W getrennt, und die Produkte wurden durch Silberfärbungsanalyse gemäß dem Protokoll von Bassam et al. (1991) sichtbar gemacht.
  • Es wird auf 28 Bezug genommen, in der die amplifizierten Fragmente eines jeden Locus dargestellt sind. Die Bahnen 1 bis 3 enthalten DNA-Proben, die gleichzeitig für die Loci D10S1239, D9S930 und D13S317 coamplifiziert wurden.
  • BEISPIEL 29
  • Silberdetektion der Multiplexamplifikation der Loci D10S1239, D9S930 und D4S2368
  • In diesem Beispiel wurde eine DNA-Matrize gleichzeitig an den einzelnen Loci D10S1239, D9S930 und D4S2368 in einem einzigen Reaktionsgefäß amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 25 μl 1 × STR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25 °C), 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl2 und 200 μM von je dATP, dCTP, dGTP und dTTP) unter Verwendung einer unbestimmten Menge ng Matrize und 0,03 U Taq-DNA-Polymerase/μl durchgeführt. Ein thermisches Zyklusgerät 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) wurde mit dem folgenden Amplifikationsprotokoll verwendet: 96 °C 2 Minuten lang, danach 10 Zyklen 1 Minute lang bei 94 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 20 Zyklen 1 Minute lang bei 90 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 1 Zyklus 30 Minuten lang bei 60 °C.
  • Es wurden sechs Amplifikationsprimer in Kombination verwendet, unter anderem 1,0 μM von jedem D10S1239-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 15] und 2 [Seq-ID Nr. 54], 0,3 μM von jedem D9S930-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 55] und 2 [Seq-ID Nr. 61], 0,15 μM von jedem D4S2368-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 56] und 2 [Seq-ID Nr. 57].
  • Die amplifizierten Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 40-cm-Gel 60 Minuten lang bei 60 W getrennt, und die Produkte wurden durch Silberfärbungsanalyse gemäß dem Protokoll von Bassam et al. (1991) sichtbar gemacht.
  • Es wird auf 29 Bezug genommen, in der die amplifizierten Fragmente eines jeden Locus dargestellt sind. Die Bahnen 1 bis 6 enthalten DNA-Proben, die gleichzeitig für die Loci D10S1239, D9S930 und D4S2368 coamplifiziert wurden.
  • BEISPIEL 30
  • Silberdetektion der Multiplexamglifikation der Loci D10S1239, D9S930, D4S2368 und D20S481
  • In diesem Beispiel wurde eine DNA-Matrize gleichzeitig an den einzelnen Loci D10S1239, D9S930, D4S2368 und D20S481 in einem einzigen Reaktionsgefäß amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 25 μl 1x STR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25 °C), 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl2 und 200 μM von je dATP, dCTP, dGTP und dTTP) unter Verwendung einer unbestimmten Menge ng Matrize und 0,04 U Taq-DNA-Polymerase/μl durchgeführt. Ein thermisches Zyklusgerät 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) wurde mit dem folgenden Amplifikationsprotokoll verwendet: 96 °C 2 Minuten lang, danach 10 Zyklen 1 Minute lang bei 94 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 20 Zyklen 1 Minute lang bei 90 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 1 Zyklus 30 Minuten lang bei 60 °C.
  • Es wurden acht Amplifikationsprimer in Kombination verwendet, unter anderem 1,0 μM von jedem D10S1239-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 15] und 2 [Seq-ID Nr. 54], 4,0 μM von jedem D9S930-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 55] und 2 [Seq-ID Nr. 14], 0,2 μM von jedem D4S2368-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 56] und 2 [Seq-ID Nr. 57], 0,25 μM von jedem D20S481-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 52] und 2 [Seq-ID Nr. 53].
  • Die amplifizierten Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 40-cm-Gel 67 Minuten lang bei 60 W getrennt, und die Produkte wurden durch Silberfärbungsanalyse gemäß dem Protokoll von Bassam et al. (1991) sichtbar gemacht.
  • Es wird auf 30 Bezug genommen, in der die amplifizierten Fragmente eines jeden Locus dargestellt sind. Die Bahnen 1 bis 4 enthalten DNA-Proben, die gleichzeitig für die Loci D10S1239, D9S930, D4S2368 und D20S481 coamplifiziert wurden.
  • BEISPIEL 31
  • Silberdetektion der Multiplexamplifikation der Loci D3S1539, D19S253 und D13S317
  • In diesem Beispiel wurde eine DNA-Matrize gleichzeitig an den einzelnen Loci D3S1539, D19S253 und D13S317 in einem einzigen Reaktionsgefäß amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 25 μl 1x STR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25 °C), 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl2 und 200 μM von je dATP, dCTP, dGTP und dTTP) unter Verwendung von 5,0 ng Matrize und 0,03 U Taq-DNA-Polymerase/μl durchgeführt. Ein thermisches Zyklusgerät 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) wurde mit dem folgenden Amplifikationsprotokoll verwendet: 96 °C 2 Minuten lang, danach 10 Zyklen 1 Minute lang bei 94 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 20 Zyklen 1 Minute lang bei 90 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C.
  • Es wurden sechs Amplifikationsprimer in Kombination verwendet, unter anderem 1,0 μM von jedem D3S1539-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 7] und 2 [Seq-ID Nr. 49], 1,0 μM von jedem D19S253-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 50] und 2 [Seq-ID Nr. 51], 0,5 μM von jedem D13S317-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 3] und 2 [Seq-ID Nr. 4].
  • Die amplifizierten Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 40-cm-Gel 65 Minuten lang bei 60 W getrennt, und die Produkte wurden durch Silberfärbungsanalyse gemäß dem Protokoll von Bassam et al. (1991) sichtbar gemacht.
  • Es wird auf 31 Bezug genommen, in der die amplifizierten Fragmente eines jeden Locus dargestellt sind. Die Bahnen 1 bis 4 enthalten DNA-Proben, die gleichzeitig für die Loci D3S1539, D19S253 und D13S317 coamplifiziert wurden, und Bahn 5 zeigt eine Probe ohne DNA-Matrize, die denselben Verfahren unterzogen wurde, d.h. eine negative Kontrolle.
  • BEISPIEL 32
  • Silberdetektion der Multiplexamplifikation der Loci D3S1539, D19S253, D4S2368 und D20S481
  • In diesem Beispiel wurde eine DNA-Matrize gleichzeitig an den einzelnen Loci D3S1539, D19S253, D4S2368 und D20S481 in einem einzigen Reaktionsgefäß amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 25 μl 1 × STR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25 °C), 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl2 und 200 μM von je dATP, dCTP, dGTP und dTTP) unter Verwendung von 5 ng Matrize und 0,04 U Taq-DNA-Polymerase/μl durchgeführt. Ein thermisches Zyklusgerät 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) wurde mit dem folgenden Amplifikationsprotokoll verwendet: 96 °C 2 Minuten lang, danach 10 Zyklen 1 Minute lang bei 94 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 20 Zyklen 1 Minute lang bei 90 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C.
  • Es wurden acht Amplifikationsprimer in Kombination verwendet, unter anderem 1,0 μM von jedem D3S1539-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 7] und 2 [Seq-ID Nr. 49], 0,5 μM von jedem D19S253-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 50] und 2 [Seq-ID Nr. 51], 0,1 μM von jedem D4S2368-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 56] und 2 [Seq-ID Nr. 57], 0,1 μM von jedem D20S481-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 52] und 2 [Seq-ID Nr. 53].
  • Die amplifizierten Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 40-cm-Gel 65 Minuten lang bei 60 W getrennt, und die Produkte wurden durch Silberfärbungsanalyse gemäß dem Protokoll von Bassam et al. (1991) sichtbar gemacht.
  • Es wird auf 32 Bezug genommen, in der die amplifizierten Fragmente eines jeden Locus dargestellt sind. Die Bahnen 1 bis 4 enthalten DNA-Proben, die gleichzeitig für die Loci D3S1539, D19S253, D4S2368 und D20S481 coamplifiziert wurden, und Bahn 5 zeigt eine Probe ohne DNA-Matrize, die denselben Verfahren unterzogen wurde, d.h. eine negative Kontrolle.
  • BEISPIEL 33
  • Silberdetektion der Multiplexamplifikation der Loci D3S1539, D19S253, D13S317 und D20S481
  • In diesem Beispiel wurde eine DNA-Matrize gleichzeitig an den einzelnen Loci D3S1539, D19S253, D13S317 und D20S481 in einem einzigen Reaktionsgefäß amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 25 μl 1x STR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25 °C), 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl2 und 200 μM von je dATP, dCTP, dGTP und dTTP) unter Verwendung von 0,5 bis 250 ng Matrize und 0,04 U Taq-DNA-Polymerase/μl durchgeführt. Ein thermisches Zyklusgerät 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) wurde mit dem folgenden Amplifikationsprotokoll verwendet: 96 °C 2 Minuten lang, danach 10 Zyklen 1 Minute lang bei 94 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 20 Zyklen 1 Minute lang bei 90 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 1 Zyklus 30 Minuten lang bei 60 °C.
  • Es wurden acht Amplifikationsprimer in Kombination verwendet, unter anderem 0,5 μM von jedem D3S1539-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 7] und 2 [Seq-ID Nr. 49], 0,5 μM von jedem D19S253-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 50] und 2 [Seq-ID Nr. 51], 0,5 μM von jedem D13S317-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 3] und 2 [Seq-ID Nr. 4], 0,2 μM von jedem D20S481-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 52] und 2 [Seq-ID Nr. 53].
  • Die amplifizierten Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 40-cm-Gel 68 Minuten lang bei 60 W getrennt, und die Produkte wurden durch Silberfärbungsanalyse gemäß dem Protokoll von Bassam et al. (1991) sichtbar gemacht.
  • Es wird auf 33 Bezug genommen, in der die amplifizierten Fragmente eines jeden Locus dargestellt sind. Die Bahnen 1 bis 5 enthalten DNA-Proben, die gleichzeitig für die Loci D3S1539, D19S253, D13S317 und D20S481 coamplifiziert wurden, und Bahn 6 zeigt eine Probe ohne DNA-Matrize, die denselben Verfahren unterzogen wurde, d.h. eine negative Kontrolle.
  • BEISPIEL 34
  • Silberdetektion der Multiplexamplifikation der Loci D10S1239, D9S930 und D20S481
  • In diesem Beispiel wurde eine DNA-Matrize gleichzeitig an den einzelnen Loci D10S1239, D9S930 und D20S481 in einem einzigen Reaktionsgefäß amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 25 μl 1x STR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25 °C), 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl2 und 200 μM von je dATP, dCTP, dGTP und dTTP) unter Verwendung von 0,5 bis 250 ng Matrize und 0,03 U Taq-DNA-Polymerase/μl durchgeführt. Ein thermisches Zyklusgerät 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) wurde mit dem folgenden Amplifikationsprotokoll verwendet: 96 °C 2 Minuten lang, danach 10 Zyklen 1 Minute lang bei 94 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 20 Zyklen 1 Minute lang bei 90 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 1 Zyklus 30 Minuten lang bei 60 °C.
  • Es wurden sechs Amplifikationsprimer in Kombination verwendet, unter anderem 1,0 μM von jedem D10S1239-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 15] und 2 [Seq-ID Nr. 54], 4,0 μM von jedem D9S930-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 55] und 2 [Seq-ID Nr. 14] und 0,2 μM von jedem D20S481-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 52] und 2 [Seq-ID Nr. 53].
  • Die amplifizierten Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 40-cm-Gel 68 Minuten lang bei 60 W getrennt, und die Produkte wurden durch Silberfärbungsanalyse gemäß dem Protokoll von Bassam et al. (1991) sichtbar gemacht.
  • Es wird auf 34 Bezug genommen, in der die amplifizierten Fragmente eines jeden Locus dargestellt sind. Die Bahnen 1 bis 5 enthalten DNA-Proben, die gleichzeitig für die Loci D10S1239, D9S930 und D20S481 coamplifiziert wurden, und Bahn 6 zeigt eine Probe ohne DNA-Matrize, die denselben Verfahren unterzogen wurde, d.h. eine negative Kontrolle.
  • BEISPIEL 35
  • Silberdetektion der Multiplexamplifikation der Loci D10S1239, D4S2368 und D20S481
  • In diesem Beispiel wurde eine DNA-Matrize gleichzeitig an den einzelnen Loci D10S1239, D4S2368 und D20S481 in einem einzigen Reaktionsgefäß amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 25 μl 1 × STR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25 °C), 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl2 und 200 μM von je dATP, dCTP, dGTP und dTTP) unter Verwendung von 0,5 bis 250 ng Matrize und 0,03 U Taq-DNA-Polymerase/μl durchgeführt. Ein thermisches Zyklusgerät 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) wurde mit dem folgenden Amplifikationsprotokoll verwendet: 96 °C 2 Minuten lang, danach 10 Zyklen 1 Minute lang bei 94 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 20 Zyklen 1 Minute lang bei 90 °C, 1 Minute lang bei 60 °C, 1,5 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von 1 Zyklus 30 Minuten lang bei 60 °C.
  • Es wurden sechs Amplifikationsprimer in Kombination verwendet, unter anderem 1,0 μM von jedem D10S1239-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 15] und 2 [Seq-ID Nr. 54], 0,2 μM von jedem D4S2368-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 56] und 2 [Seq-ID Nr. 57] und 0,2 μM von jedem D20S481-Primer 1 [Seq.-ID Nr. 52] und 2 [Seq-ID Nr. 53].
  • Die amplifizierten Produkte wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 40-cm-Gel 68 Minuten lang bei 60 W getrennt, und die Produkte wurden durch Silberfärbungsanalyse gemäß dem Protokoll von Bassam et al. (1991) sichtbar gemacht.
  • Es wird auf 35 Bezug genommen, in der die amplifizierten Fragmente eines jeden Locus dargestellt sind. Die Bahnen 1 bis 5 enthalten DNA-Proben, die gleichzeitig für die Loci D10S1239, D4S2368 und D20S481 coamplifiziert wurden, und Bahn 6 zeigt eine Probe ohne DNA-Matrize, die denselben Verfahren unterzogen wurde, d.h. eine negative Kontrolle. SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00760001
    Figure 00770001
    Figure 00780001
    Figure 00790001
    Figure 00800001
    Figure 00810001
    Figure 00820001
    Figure 00830001
    Figure 00840001
    Figure 00850001
    Figure 00860001
    Figure 00870001
    Figure 00880001
    Figure 00890001
    Figure 00900001
    Figure 00910001
    Figure 00920001
    Figure 00930001
    SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00940001
    Figure 00950001
    Figure 00960001
    Figure 00970001
    Figure 00980001
    Figure 00990001
    Figure 01000001
    Figure 01010001
    Figure 01020001
    Figure 01030001
    Figure 01040001
    Figure 01050001
    Figure 01060001
    Figure 01070001
    Figure 01080001
    Figure 01090001
    Figure 01100001
    Figure 01110001

Claims (42)

  1. Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung der Allele, die in kurzen Tandemwiederholungs-Loci von einer oder mehreren DNA-Proben vorhanden sind, umfassend: a. das Bereitstellen von zumindest einer zu analysierenden DNA-Probe, b. das Auswählen einer Reihe an kurzen Tandemwiederholungs-Loci der zu analysierenden DNA-Probe, die zusammen amplifiziert werden können, worin die Reihe an Loci besteht aus: D3S1539, D7S820, D13S317, D5S818; D17S1298, D7S820, D13S317, D5S818; D20S481, D7S820, D13S317, D5S818; D9S930, D7S820, D13S317, D5S818; D10S1239, D7S820, D13S317, D5S818; D14S118, D7S820, D13S317, D5S818; D14S562, D7S820, D13S317, D5S818; D14S548, D7S820, D13S317, D5S818; D16S490, D7S820, D13S317, D5S818; D17S1299, D7S820, D135317, D5S818; D16S539, D7S820, D13S317, D5S818; D22S683, D7S820, D13S317, D5S818; D16S753, D7S820, D13S317, D5S818; D3S1539, D19S253, D13S317, D20S481; D3S1539, D19S253, D4S2368, D20S481; D10S1239, D9S930, D4S2368, D20S481; und D16S539, D7S820, D13S317, HUMvWFA31; c. das Co-Amplifizieren der Reihe an Loci in einer Mehrfachamplifikationsreaktion, worin das Reaktionsprodukt ein Gemisch amplifizierter Allele aus jedem der co-amplifizierten Loci in der Reihe ist; und d. das Evaluieren der amplifizierten Allele im Gemisch, um die an jedem der analysierten Loci in der Reihe innerhalb der DNA-Probe vorhandenen Allele zu bestimmen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Reihe an co-amplifizierten Loci darin ausgewählt ist aus: D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO und HUMTPOX; und D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01 und HUMFESFPS.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Reihe an co-amplifizierten Loci darin ausgewählt ist aus: D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO, HUMTPOX und HUMTH01; Und D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13AO1, HUMFESFPS und HUMBFXIII.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Reihe an co-amplifizierten Loci darin ausgewählt ist aus: D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO, HUMTPOX, HUMTH01 und HUMvWFA31; und D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01, HUMFESFPS, HUMBFXIII und HUMLIPOL.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2, 3 oder 4, worin die Mehrfachamplifikationsreaktion unter Verwendung von Primerpaaren, die die analysierten Loci flankieren, durchgeführt wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, ferner umfassend den Schritt des Selektierens von Primerpaaren für die Mehrfachamplifikationsreaktion, die Allele aus jedem Locus produzieren, die die Allele aus den anderen Loci in der darin co-amplifizierten Reihe nicht überlappen, wenn die Allele durch Gelelektrophorese getrennt werden.
  7. Verfahren nach Anspruch 5, worin zumindest eines von jenen in der Mehrfachamplifikationsreaktion verwendeten Primerpaaren eine Sequenz aufweist, die aus einer der aus: Seq.-ID Nr. 1 und Seq.-ID Nr. 2, wenn einer der Loci in der Reihe D7S820 ist; Seq.-ID Nr. 3 und Seq.-ID Nr. 4, wenn einer der Loci in der Reihe D13S317 ist; Seq.-ID Nr. 5 und Seq.-ID Nr. 6, wenn einer der Loci in der Reihe D5S818 ist; Seq.-ID Nr. 7, Seq.-ID Nr. 8 und Seq.-ID Nr. 49, wenn einer der Loci in der Reihe D3S1539 ist; Seq.-ID Nr. 9 und Seq.-ID Nr. 10, wenn einer der Loci in der Reihe D17S1298 ist; Seq.-ID Nr. 11, Seq.-ID Nr. 12, Seq.-ID Nr. 52, Seq.-ID Nr. 53, wenn einer der Loci in der Reihe D20S481 ist; Seq.-ID Nr. 13, Seq.-ID Nr. 14, Seq.-ID Nr. 55, Seq.-ID Nr. 61, wenn einer der Loci in der Reihe D9S930 ist; Seq.-ID Nr. 15, Seq.-ID Nr. 16, Seq.-ID Nr. 54, wenn einer der Loci in der Reihe D10S1239 ist; Seq.-ID Nr. 17, Seq.-ID Nr. 18, wenn einer der Loci in der Reihe D14S118 ist; Seq.-ID Nr. 19, Seq.-ID Nr. 20, wenn einer der Loci in der Reihe D14S562 ist; Seq.-ID Nr. 21, Seq.-ID Nr. 22, wenn einer der Loci in der Reihe D14S548 ist; Seq.-ID Nr. 23, Seq.-ID Nr. 24, wenn einer der Loci in der Reihe D16S490 ist; Seq.-ID Nr. 25, Seq.-ID Nr. 26, wenn einer der Loci in der Reihe D16S753 ist; Seq.-ID Nr. 27, Seq.-ID Nr. 28, wenn einer der Loci in der Reihe D17S1299 ist; Seq.-ID Nr. 29, Seq.-ID Nr. 30, Seq.-ID Nr. 58, wenn einer der Loci in der Reihe D16S539 ist; Seq.-ID Nr. 31, Seq.-ID Nr. 32, wenn einer der Loci in der Reihe D22S683 ist; Seq.-ID Nr. 33, Seq.-ID Nr. 34, wenn einer der Loci in der Reihe HUMCSF1PO ist; Seq.-ID Nr. 35, Seq.-ID Nr. 36, wenn einer der Loci in der Reihe HUMTPOX ist; Seq.-ID Nr. 37, Seq.-ID Nr. 38, wenn einer der Loci in der Reihe HUMTH01 ist; Seq.-ID Nr. 39, Seq.-ID Nr. 40, Seq.-ID Nr. 59, Seq.-ID Nr. 60, wenn einer der Loci in der Reihe HUMvWFA31 ist; Seq.-ID Nr. 41, Seq.-ID Nr. 42, wenn einer der Loci in der Reihe HUMF13A01 ist; Seq.-ID Nr. 43, Seq.-ID Nr. 44, wenn einer der Loci in der Reihe HUMFESFPS ist; Seq.-ID Nr. 45, Seq.-ID Nr. 46, wenn einer der Loci in der Reihe HUMBFXIII ist; Seq.-ID Nr. 47, Seq.-ID Nr. 48, wenn einer der Loci in der Reihe HUMLIPOL ist; Seq.-ID Nr. 50, Seq.-ID Nr. 51, wenn einer der Loci in der Reihe D19S253 ist; und Seq.-ID Nr. 56, Seq.-ID Nr. 57, wenn einer der Loci in der Reihe D4S2368 ist; bestehenden Sequenzgruppen ausgewählt ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 5, worin die Mehrfachamplifikationsreaktion eine Polymerasekettenreaktion ist.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2, 3 oder 4, worin die amplifizierten Allele durch Vergleichen der amplifizierten Allele mit einem Größenstandard evaluiert werden, worin der Größenstandard aus der aus einem DNA-Marker und einer Locusspezifischen Allel-Leiter bestehenden Gruppe von Größenstandards ausgewählt ist.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 2, 3 oder 4, worin die amplifizierten Allele unter Verwendung von Polyacrylamidgel-Elektrophorese, um die Allele zu trennen, wobei ein Polyacrylamidgel aus getrennten Allelen gebildet wird, evaluiert werden.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, worin die getrennten Allele im Polyacrylamidgel durch Sichtbarmachen der Allele mittels Silberfärbungsanalyse bestimmt werden.
  12. Verfahren nach Anspruch 10, worin Primer, die in der Lage sind, sich an eine Region zu binden, die jeden der Loci in der Reihe flankiert, zur Co-Amplifikation der Loci verwendet werden, worin zumindest einer der Primer, der zur Co-Amplifikation von jedem Locus verwendet wird, eine Fluoreszenzmarkierung aufweist, die kovalent daran gebunden ist, sodass die amplifizierten Allele, die daraus produziert werden, fluoreszenzmarkiert sind, und worin die getrennten Allele im Polyacrylamidgel durch Sichtbarmachen der Allele mittels Fluoreszenzanalyse bestimmt werden.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, worin die Fluoreszenzmarkierung aus der aus Fluorescein und Tetramethylrhodamin bestehenden Gruppe an Markierungen ausgewählt ist.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 2, 3 oder 4, worin die zumindest eine zu analysierende DNA-Probe aus menschlichem Gewebe isoliert wurde, worin das menschliche Gewebe aus der aus Blut, Samen, Vaginalzellen, Haar, Speichel, Urin, Plazentazellen oder Fötuszellen enthaltendem Fruchtwasser und Gemischen aus beliebig vielen der oben genannten Gewebe bestehenden Gruppe an menschlichem Gewebe ausgewählt ist.
  15. Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung der Allele, die in drei kurzen Tandemwiederholungs-Loci von einer oder mehreren DNA-Proben vorhanden sind, umfassend: a. das Bereitstellen von zumindest einer zu analysierenden DNA-Probe, b. das Selektieren einer Reihe von drei Loci der zu analysierenden DNA-Probe, die zusammen amplifiziert werden können, worin die Reihe von drei Loci eine Reihe von drei Loci umfasst, die aus der aus: D3S1539, D19S253, D13S317; D10S1239, D9S930, D20S481; D10S1239, D4S2368, D20S481; D10S1239, D9S930, D4S2368; D16S539, D7S820, D13S317; und D10S1239, D9S930, D13S317; bestehenden Gruppe an Reihen von Loci ausgewählt ist, c. das Co-Amplifizieren der Reihe von drei Loci in einer Mehrfachamplifikationsreaktion, worin das Reaktionsprodukt ein Gemisch ist, das amplifizierte Allele aus jedem der co-amplifizierten Loci in der Reihe von drei Loci umfasst; und d. das Evaluieren der amplifizierten Allele im Gemisch, um zumindest die an jedem der drei analysierten Loci in der Reihe von drei Loci innerhalb der DNA-Probe vorhandenen Allele zu bestimmen.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, worin die Reihe von drei Loci aus der aus: D3S1539, D19S253, D13S317; D10S1239, D9S930, D20S481; D10S1239, D4S2368, D20S481; D10S1239, D9S930, D4S2368; D16S539, D7S820, D13S317; und D10S1239, D9S930, D13S317; bestehenden Gruppe an Reihen von Loci ausgewählt ist.
  17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, worin die Mehrfachamplifikationsreaktion unter Verwendung von drei Primerpaaren erfolgt, worin jedes Primerpaar einen der drei kurzen Tandemwiederholungs-Loci in der Reihe der in der Reaktion co-amplifizierten Loci flankiert.
  18. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, worin jedes der drei in der Mehrfachamplifikationsreaktion verwendeten Primerpaare so entworfen ist, dass es mit einem Allel eines Locus aus der Reihe von Loci, die in der Reaktion co-amplifiziert wurden, hybridisiert, worin: wenn D7S820 einer der Loci in der Reihe von co-amplifizierten Loci ist, zumindest einer der Primer eine aus der aus Seq.-ID Nr. 1 und Seq.-ID Nr. 2 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz aufweist; wenn D13S317 einer der Loci in der Reihe von co-amplifizierten Loci ist, zumindest einer der Primer eine aus der aus Seq.-ID Nr. 3 und Seq.-ID Nr. 4 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz aufweist; wenn D20S481 einer der Loci in der Reihe von co-amplifizierten Loci ist, zumindest einer der Primer eine aus der aus Seq.-ID Nr. 11, Seq.-ID Nr. 12, Seq.-ID Nr. 52, Seq.-ID Nr. 53 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz aufweist; wenn D9S930 einer der Loci in der Reihe von co-amplifizierten Loci ist, zumindest einer der Primer eine aus der aus Seq.-ID Nr. 13, Seq.-ID Nr. 14, Seq.-ID Nr. 55 und Seq.-ID Nr. 61 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz aufweist; wenn D10S1239 einer der Loci in der Reihe von co-amplifizierten Loci ist, zumindest einer der Primer eine aus der aus Seq.-ID Nr. 15, Seq.-ID Nr. 16 und Seq.-ID Nr. 44 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz aufweist; wenn D16S539 einer der Loci in der Reihe von co-amplifizierten Loci ist, zumindest einer der Primer eine aus der aus Seq.-ID Nr. 29 und Seq.-ID Nr. 30 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz aufweist; und wenn D4S2368 einer der Loci in der Reihe von co-amplifizierten Loci ist, zumindest einer der Primer eine aus der aus Seq.-ID Nr. 56 und Seq.-ID Nr. 57 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz aufweist.
  19. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, worin die Mehrfachamplifikationsreaktion eine Polymerasekettenreaktion ist.
  20. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, worin die amplifizierten Allele durch Vergleichen der amplifizierten Allele mit einem Größenstandard evaluiert werden, worin der Größenstandard aus der aus einem DNA-Marker und einer Locus-spezifischen Allel-Leiter bestehenden Gruppe von Größenstandards ausgewählt ist.
  21. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 oder 16, worin die amplifizierten Allele unter Verwendung von Polyacrylamidgel-Elektrophorese, um die Allele zu trennen, wobei ein Polyacrylamidgel aus getrennten Allelen gebildet wird, evaluiert werden.
  22. Verfahren nach Anspruch 21, worin die getrennten Allele im Polyacrylamidgel durch Sichtbarmachen der Allele mittels Silberfärbungsanalyse bestimmt werden.
  23. Verfahren nach Anspruch 21, worin die getrennten Allele im Polyacrylamidgel durch Sichtbarmachen der Allele mittels Fluoreszenzanalyse bestimmt werden.
  24. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, worin die zumindest eine zu analysierende DNA-Probe aus menschlichem Gewebe isoliert wurde, worin das menschliche Gewebe aus der aus Blut, Samen, Vaginalzellen, Haar, Speichel, Urin, Knochen, bukkalem Gewebe, Plazentazellen oder Fötuszellen enthaltendem Fruchtwasser und Gemischen aus beliebig vielen der oben genannten Gewebe bestehenden Gruppe an menschlichem Gewebe ausgewählt ist.
  25. Set zur gleichzeitigen Analyse von kurzen Tandemwiederholungssequenzen, umfassend ein Behältnis, das Oligonucleotidprimer zur Co-Amplifikation einer Reihe von kurzen Tandemwiederholungs-Loci aufweist, worin die Reihe von Loci aus den aus: D3S1539, D19S253, D13S317; D10S1239, D9S930, D20S481; D10S1239, D4S2368, D20S481; D10S1239, D9S930, D4S2368; D16S539, D7S820, D13S317; D10S1239, D9S930, D13S317; D3S1539, D7S820, D13S317, D5S818; D17S1298, D7S820, D13S317, D5S818; D20S481, D7S820, D13S317, D5S818; D9S930, D7S820, D13S317, D5S818; D10S1239, D7S820, D13S317, D5S818; D14S118, D7S820, D13S317, D5S818 D14S562, D7S820, D13S317, D5S818: D14S548, D7S820, D13S317, D5S818: D16S490, D7S820, D13S317, D5S818; D17S1299, D7S820, D13S317, D5S818; D16S539, D7S820, D13S317, D5S818; D22S683, D7S820, D13S317, D5S818; D16S753, D7S820, D13S317, D5S818; D3S1539, D19S253, D13S317, D20S481; D3S1539, D19S253, D4S2368, D20S481; D10S1239, D9S930, D4S2368, D20S481; D16S539, D7S820, D13S317, HUMvWFA31; D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO, HUMTPOX; D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01, HUMFESFPS; D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO, HUMTPOX, HUMTH01; D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01, HUMFESFPS, HUMBFXIII; D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO, HUMTPOX, HUMTH01, HUMvWFA31; und D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01, HUMFESFPS, HUMBFXIII, HUMLIPOL; bestehenden Reihen von Loci ausgewählt ist, worin jeder der Oligonucleotidprimer so entworfen ist, dass er mit einem Allel aus einem der drei Loci in der ausgewählten Reihe von Loci hybridisiert, worin: wenn D7S820 einer der Loci in der Reihe ist, zumindest einer der Primer eine aus der aus Seq.-ID Nr. 1 und Seq.-ID Nr. 2 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz aufweist; wenn D13S317 einer der Loci in der Reihe ist, zumindest einer der Primer eine aus der aus Seq.-ID Nr. 3 und Seq.-ID Nr. 4 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz aufweist; im Fall von D5S818 zumindest einer der Primer eine aus der aus Seq.-ID Nr. 5 und Seq.-ID Nr. 6 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz aufweist; im Fall von D3S153 zumindest einer der Primer eine aus der aus Seq.-ID Nr. 7, Seq.-ID Nr. 8 und Seq.-ID Nr. 49 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz aufweist; im Fall von D17S1298 zumindest einer der Primer eine aus der aus Seq.-ID Nr. 9 und Seq.-ID Nr. 10 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz aufweist; im Fall von D20S481 zumindest einer der Primer eine aus der aus Seq.-ID Nr. 11, Seq.-ID Nr. 12, Seq.-ID Nr. 52, Seq.-ID Nr. 53 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz aufweist; im Fall von D9S930 zumindest einer der Primer eine aus der aus Seq.-ID Nr. 13, Seq.-ID Nr. 14, Seq.-ID Nr. 55, Seq.-ID Nr. 61 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz aufweist; im Fall von D10S1239 zumindest einer der Primer eine aus der aus Seq.-ID Nr. 15, Seq.-ID Nr. 16, Seq.-ID Nr. 54 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz aufweist; im Fall von D14S118 zumindest einer der Primer eine aus der aus Seq.-ID Nr. 17, Seq.-ID Nr. 18 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz aufweist; im Fall von D14S562 zumindest einer der Primer eine aus der aus Seq.-ID Nr. 19, Seq.-ID Nr. 20 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz aufweist; im Fall von D14S548 zumindest einer der Primer eine aus der aus Seq.-ID Nr. 21, Seq.-ID Nr. 22 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz aufweist; im Fall von D16S490 zumindest einer der Primer eine aus der aus Seq.-ID Nr. 23, Seq.-ID Nr. 24 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz aufweist; im Fall von D16S753 zumindest einer der Primer eine aus der aus Seq.-ID Nr. 25, Seq.-ID Nr. 26 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz aufweist; im Fall von D17S1299 zumindest einer der Primer eine aus der aus Seq.-ID Nr. 27, Seq.-ID Nr. 28 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz aufweist; im Fall von D16S539 zumindest einer der Primer eine aus der aus Seq.-ID Nr. 29, Seq.-ID Nr. 30, Seq.-ID Nr. 58 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz aufweist; im Fall von D22S683 zumindest einer der Primer eine aus der aus Seq.-ID Nr. 31, Seq.-ID Nr. 32 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz aufweist; im Fall von HUMCSF1PO zumindest einer der Primer eine aus der aus Seq.-ID Nr. 33, Seq.-ID Nr. 34 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz aufweist; im Fall von HUMTPOX zumindest einer der Primer eine aus der aus Seq.-ID Nr. 35, Seq.-ID Nr. 36 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz aufweist; im Fall von HUMTH01 zumindest einer der Primer eine aus der aus Seq.-ID Nr. 37, Seq.-ID Nr. 38 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz aufweist; im Fall von HUMvWFA31 zumindest einer der Primer eine aus der aus Seq.-ID Nr. 39, Seq.-ID Nr. 40, Seq.-ID Nr. 60 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz aufweist; im Fall von HUMF13A01 zumindest einer der Primer eine aus der aus Seq.-ID Nr. 41, Seq.-ID Nr. 42 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz aufweist; im Fall von HUMFESFPS zumindest einer der Primer eine aus der aus Seq.-ID Nr. 43, Seq.-ID Nr. 44 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz aufweist; im Fall von HUMBFXIII zumindest einer der Primer eine aus der aus Seq.-ID Nr. 45, Seq.-ID Nr. 46 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz aufweist; im Fall von HUMLIPOL zumindest einer der Primer eine aus der aus Seq.-ID Nr. 47, Seq.-ID Nr. 48 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz aufweist; im Fall von D19S253 zumindest einer der Primer eine aus der aus Seq.-ID Nr. 50, Seq.-ID Nr. 51 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz aufweist; im Fall von D4S2368 zumindest einer der Primer eine aus der aus Seq.-ID Nr. 56, Seq.-ID Nr. 57 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz aufweist.
  26. Set nach Anspruch 25, ferner umfassend ein Behältnis, das Reagenzien für zumindest eine Mehrfachamplifikationsreaktion aufweist.
  27. Set nach Anspruch 25, ferner umfassend ein Behältnis mit einer Allel-Leiter.
  28. Set nach Anspruch 27, worin jede Sprosse der Allel-Leiter und zumindest ein Oligonucleotidprimer für jeden der Loci in der Reihe eine daran kovalent gebundene Markierung aufweisen.
  29. Set nach Anspruch 28, worin die Markierung eine Fluoreszenzmarkierung ist.
  30. Set nach Anspruch 29, worin zumindest einer der Oligonucleotidprimer eine andere kovalent daran gebundene Fluoreszenzmarkierung als manche der anderen Primerpaare im Behältnis aufweist.
  31. Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung der in kurzen Tandemwiederholungs-Loci von einer oder mehreren DNA-Proben vorhandenen Allele, umfassend: a. das Bereitstellen von zumindest einer zu analysierenden DNA-Probe, b. das Selektieren einer Reihe von kurzen Tandemwiederholungs-Loci der zu analysierenden DNA-Probe, die zusammen amplifiziert werden können, worin drei der Loci in der Reihe D7S820, D13S317 und D5S818 sind; c. das Co-Amplifizieren der Reihe von Loci in einer Mehrfachamplifikationsreaktion, worin das Reaktionsprodukt ein Gemisch amplifizierter Allele aus jedem der co-amplifizierten Loci in der Reihe ist; und d. das Evaluieren der amplifizierten Allele im Gemisch, um die an jedem der analysierten Loci in der Reihe innerhalb der DNA-Probe vorhandenen Allele zu bestimmen.
  32. Verfahren nach Anspruch 31, worin die Mehrfachamplifikationsreaktion unter Verwendung von Primerpaaren erfolgt, die die analysierten Loci flankieren.
  33. Verfahren nach Anspruch 31 oder 32, ferner den Schritt des Selektierens von Primerpaaren für die Mehrfachamplifikationsreaktion umfassend, die Allele aus jedem Locus produzieren, die die Allele aus den anderen Loci in der darin co-amplifizierten Reihe nicht überlappen, wenn die Allele durch Gelelektrophorese getrennt werden.
  34. Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 33, worin die Mehrfachamplifikationsreaktion eine Polymerasekettenreaktion ist.
  35. Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 33, worin die amplifizierten Allele durch Vergleichen der amplifizierten Allele mit einem Größenstandard evaluiert werden, worin der Größenstandard aus der aus einem DNA-Marker und einer Locusspezifischen Allel-Leiter bestehenden Gruppe von Größenstandards ausgewählt ist.
  36. Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 33, worin die amplifizierten Allele unter Verwendung von Polyacrylamidgel-Elektrophorese, um die Allele zu trennen, wobei ein Polyacrylamidgel aus getrennten Allelen gebildet wird, evaluiert werden.
  37. Verfahren nach Anspruch 36, worin die getrennten Allele im Polyacrylamidgel durch Sichtbarmachen der Allele mittels Silberfärbungsanalyse bestimmt werden.
  38. Verfahren nach Anspruch 36, worin Primer, die in der Lage sind, sich an eine Region zu binden, die jeden der Loci in der Reihe flankiert, zur Co-Amplifikation der Loci verwendet werden, worin zumindest einer der Primer, der zur Co-Amplifikation von jedem Locus verwendet wird, eine Fluoreszenzmarkierung aufweist, die kovalent daran gebunden ist, sodass die amplifizierten Allele, die daraus produziert werden, fluoreszenzmarkiert sind, und worin die getrennten Allele im Polyacrylamidgel durch Sichtbarmachen der Allele mittels Fluoreszenzanalyse bestimmt werden.
  39. Verfahren nach Anspruch 38, worin die Fluoreszenzmarkierung aus der aus Fluorescein und Tetramethylrhodamin bestehenden Gruppe an Markierungen ausgewählt ist.
  40. Verfahren nach Anspruch 36, worin eines der in der Mehrfachamplifikationsreaktion verwendeten Primerpaare eine daran kovalent gebundene Fluoreszenzmarkierung aufweist.
  41. Verfahren nach Anspruch 40, worin die in der Mehrfachamplifikationsreaktion verwendeten markierten Primer dieselbe kovalent daran gebundene Fluoreszenzmarkierung aufweisen.
  42. Set nach Anspruch 29, worin die markierten Oligonucleotidprimer dieselbe kovalent daran gebundene Fluoreszenzmarkierung aufweisen.
DE69736637T 1996-04-15 1997-04-15 Multiplex amplifikation kurzer tandem repeat loci Expired - Lifetime DE69736637T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/632,575 US5843660A (en) 1994-09-30 1996-04-15 Multiplex amplification of short tandem repeat loci
US632575 1996-04-15
PCT/US1997/006293 WO1997039138A1 (en) 1996-04-15 1997-04-15 Multiplex amplification of short tandem repeat loci

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69736637D1 DE69736637D1 (de) 2006-10-19
DE69736637T2 true DE69736637T2 (de) 2007-11-15

Family

ID=24536076

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69736637T Expired - Lifetime DE69736637T2 (de) 1996-04-15 1997-04-15 Multiplex amplifikation kurzer tandem repeat loci

Country Status (11)

Country Link
US (1) US5843660A (de)
EP (2) EP0960207B1 (de)
JP (2) JP3602142B2 (de)
KR (1) KR100290332B1 (de)
CN (2) CN100422339C (de)
AU (1) AU724531B2 (de)
BR (1) BR9708567A (de)
CA (1) CA2251793C (de)
DE (1) DE69736637T2 (de)
ES (1) ES2273367T3 (de)
WO (1) WO1997039138A1 (de)

Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7008771B1 (en) 1994-09-30 2006-03-07 Promega Corporation Multiplex amplification of short tandem repeat loci
CA2118048C (en) * 1994-09-30 2003-04-08 James W. Schumm Multiplex amplification of short tandem repeat loci
US6479235B1 (en) * 1994-09-30 2002-11-12 Promega Corporation Multiplex amplification of short tandem repeat loci
EP2290364A1 (de) 1996-04-25 2011-03-02 BioArray Solutions Ltd. Lichtgesteuerte elektrokinetische Anordnung von Partikeln in der Nähe von Oberflächen
US6156512A (en) * 1996-05-23 2000-12-05 Promega Corp Allelic ladders for short tandem repeat loci
ES2563643T3 (es) * 1997-04-01 2016-03-15 Illumina Cambridge Limited Método de secuenciación de ácido nucleico
US6238863B1 (en) * 1998-02-04 2001-05-29 Promega Corporation Materials and methods for indentifying and analyzing intermediate tandem repeat DNA markers
US6703211B1 (en) 1998-03-13 2004-03-09 Promega Corporation Cellular detection by providing high energy phosphate donor other than ADP to produce ATP
US6235480B1 (en) * 1998-03-13 2001-05-22 Promega Corporation Detection of nucleic acid hybrids
US6391551B1 (en) 1998-03-13 2002-05-21 Promega Corporation Detection of nucleic acid hybrids
US6312902B1 (en) 1998-03-13 2001-11-06 Promega Corporation Nucleic acid detection
US6277578B1 (en) 1998-03-13 2001-08-21 Promega Corporation Deploymerization method for nucleic acid detection of an amplified nucleic acid target
US6268146B1 (en) 1998-03-13 2001-07-31 Promega Corporation Analytical methods and materials for nucleic acid detection
US7090975B2 (en) 1998-03-13 2006-08-15 Promega Corporation Pyrophosphorolysis and incorporation of nucleotide method for nucleic acid detection
US6270973B1 (en) 1998-03-13 2001-08-07 Promega Corporation Multiplex method for nucleic acid detection
US6270974B1 (en) 1998-03-13 2001-08-07 Promega Corporation Exogenous nucleic acid detection
JP3911909B2 (ja) 1999-06-09 2007-05-09 株式会社日立製作所 Ｄｎａ試料調製方法及びｄｎａ試料調製装置
US6533912B2 (en) 1999-07-13 2003-03-18 Molecular Dynamics, Inc. Increased throughput analysis of small compounds using multiple temporally spaced injections
US6605451B1 (en) 2000-06-06 2003-08-12 Xtrana, Inc. Methods and devices for multiplexing amplification reactions
US7087414B2 (en) 2000-06-06 2006-08-08 Applera Corporation Methods and devices for multiplexing amplification reactions
US9709559B2 (en) 2000-06-21 2017-07-18 Bioarray Solutions, Ltd. Multianalyte molecular analysis using application-specific random particle arrays
ES2259666T3 (es) 2000-06-21 2006-10-16 Bioarray Solutions Ltd Analisis molecular de multiples analitos usando series de particulas aleatorias con especificidad de aplicacion.
US20020058265A1 (en) * 2000-09-15 2002-05-16 Promega Corporation Detection of microsatellite instability and its use in diagnosis of tumors
ATE415491T1 (de) * 2000-09-15 2008-12-15 Ventana Med Syst Inc Oligonucleotide zur markierung von oligonukleotidsonden und proteine
US6844152B1 (en) * 2000-09-15 2005-01-18 Promega Corporation Detection of microsatellite instability and its use in diagnosis of tumors
AR031640A1 (es) * 2000-12-08 2003-09-24 Applied Research Systems Amplificacion isotermica de acidos nucleicos en un soporte solido
KR100443569B1 (ko) * 2000-12-15 2004-08-09 학교법인 인하학원 길이다형성 ｄｎａ 염기서열을 이용한 다중 증폭중합효소연쇄반응 조건의 최적화에 의한 개인식별 및친자감별 방법
GB0104690D0 (en) * 2001-02-26 2001-04-11 Cytogenetic Dna Services Ltd Diagnostic test
US7262063B2 (en) 2001-06-21 2007-08-28 Bio Array Solutions, Ltd. Directed assembly of functional heterostructures
GB0119274D0 (en) * 2001-08-08 2001-10-03 Univ Durham Fusion proteins for insect control
US20030082606A1 (en) * 2001-09-04 2003-05-01 Lebo Roger V. Optimizing genome-wide mutation analysis of chromosomes and genes
CA2741049C (en) * 2001-10-15 2019-02-05 Bioarray Solutions, Ltd. Multiplexed analysis of polymorphic loci by probe elongation-mediated detection
US20080138800A1 (en) * 2001-10-15 2008-06-12 Alice Xiang Li Multiplexed analysis of polymorphic loci by concurrent interrogation and enzyme-mediated detection
US20070065830A1 (en) * 2002-09-04 2007-03-22 Children's Hospital Medical Center Of Akron, Inc. Cloning multiple control sequences into chromosomes or into artificial centromeres
US7526114B2 (en) 2002-11-15 2009-04-28 Bioarray Solutions Ltd. Analysis, secure access to, and transmission of array images
US8323897B2 (en) 2002-12-04 2012-12-04 Applied Biosystems, Llc Multiplex amplification of polynucleotides
US7560232B2 (en) * 2002-12-19 2009-07-14 Promega Corporation Methods of capturing, detecting and quantifying RNA:DNA hybrids and a modified RNase H useful therein
WO2005029705A2 (en) 2003-09-18 2005-03-31 Bioarray Solutions, Ltd. Number coding for identification of subtypes of coded types of solid phase carriers
ES2375962T3 (es) 2003-09-22 2012-03-07 Bioarray Solutions Ltd Polielectrolito inmovilizado en superficie con múltiples grupos funcionales capaces de unirse covalentemente a biomoléculas.
US7432362B2 (en) * 2003-09-30 2008-10-07 Reliagene Technologies Inc. Assay for human DNA for gender determination
US7074567B2 (en) * 2003-09-30 2006-07-11 Reliagene Technologies Inc. Assay for human DNA for gender determination
CA2899287A1 (en) 2003-10-28 2005-05-12 Bioarray Solutions Ltd. Optimization of gene expression analysis using immobilized capture probes
AU2004287069B2 (en) 2003-10-29 2009-07-16 Bioarray Solutions, Ltd. Multiplexed nucleic acid analysis by fragmentation of double-stranded DNA
US20050112591A1 (en) * 2003-11-25 2005-05-26 Applera Corporation Novel method for isolating single stranded product
US20050239889A1 (en) * 2004-04-26 2005-10-27 Jean Gosselin In vivo release of endogenous anti-microbial mediators by leukotriene B4 (LTB4) administration
US20060014190A1 (en) * 2004-06-30 2006-01-19 Hennessy Lori K Methods for analyzing short tandem repeats and single nucleotide polymorphisms
US7848889B2 (en) 2004-08-02 2010-12-07 Bioarray Solutions, Ltd. Automated analysis of multiplexed probe-target interaction patterns: pattern matching and allele identification
US20090068646A1 (en) * 2004-10-22 2009-03-12 Promega Corporation Methods and kits for detecting mutations
CN1327005C (zh) * 2004-12-03 2007-07-18 公安部第二研究所 荧光标记短串联重复序列基因座的复合扩增检验系统
US8486629B2 (en) 2005-06-01 2013-07-16 Bioarray Solutions, Ltd. Creation of functionalized microparticle libraries by oligonucleotide ligation or elongation
GB0522310D0 (en) * 2005-11-01 2005-12-07 Solexa Ltd Methods of preparing libraries of template polynucleotides
GB0524069D0 (en) * 2005-11-25 2006-01-04 Solexa Ltd Preparation of templates for solid phase amplification
US20080009420A1 (en) * 2006-03-17 2008-01-10 Schroth Gary P Isothermal methods for creating clonal single molecule arrays
WO2008093098A2 (en) 2007-02-02 2008-08-07 Illumina Cambridge Limited Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates
WO2008124104A1 (en) 2007-04-04 2008-10-16 Network Biosystems Inc. Integrated nucleic acid analysis
CN102177250B (zh) 2008-06-30 2015-05-06 生命科技公司 由粗制核酸样品直接扩增的方法
WO2010038042A1 (en) 2008-10-02 2010-04-08 Illumina Cambridge Ltd. Nucleic acid sample enrichment for sequencing applications
JP2012529908A (ja) 2009-06-15 2012-11-29 ネットバイオ・インコーポレーテッド 法医学的ｄｎａの定量化のための改善された方法
US8182994B2 (en) 2009-09-15 2012-05-22 Illumina Cambridge Limited Centroid markers for image analysis of high denisty clusters in complex polynucleotide sequencing
CA2835620C (en) 2011-05-12 2021-02-23 Netbio, Inc. Methods and compositions for rapid multiplex amplification of str loci
RU2485178C2 (ru) * 2011-07-12 2013-06-20 Олег Евгеньевич Аникеев Способ выделения днк
US9556482B2 (en) 2013-07-03 2017-01-31 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Commerce Mouse cell line authentication
GB201418980D0 (en) 2014-10-24 2014-12-10 Univ Portsmouth Cell assay kit and method
US10253352B2 (en) 2015-11-17 2019-04-09 Omniome, Inc. Methods for determining sequence profiles
US20240093308A1 (en) * 2022-08-01 2024-03-21 Idexx Laboratories, Inc. Human Fractional Abundance Assays

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5192659A (en) * 1989-08-25 1993-03-09 Genetype Ag Intron sequence analysis method for detection of adjacent and remote locus alleles as haplotypes
US5364759B2 (en) * 1991-01-31 1999-07-20 Baylor College Medicine Dna typing with short tandem repeat polymorphisms and identification of polymorphic short tandem repeats
WO1993018178A1 (en) * 1992-03-13 1993-09-16 The Children's Hospital Of Philadelphia DIAGNOSIS OF β-THALASSEMIA USING A MULTIPLEX AMPLIFICATION REFRACTORY MUTATION SYSTEM
WO1993018177A1 (en) * 1992-03-13 1993-09-16 The Children's Hospital Of Philadelphia Diagnosis of cystic fibrosis using allele specific multiplex polymerase chain reactions
US5422252A (en) * 1993-06-04 1995-06-06 Becton, Dickinson And Company Simultaneous amplification of multiple targets
US5599666A (en) * 1994-03-28 1997-02-04 Promega Corporation Allelic ladders for short tandem repeat loci
CA2118048C (en) * 1994-09-30 2003-04-08 James W. Schumm Multiplex amplification of short tandem repeat loci

Also Published As

Publication number Publication date
KR20000005557A (ko) 2000-01-25
EP0960207A4 (de) 2002-04-10
AU3367597A (en) 1997-11-07
EP0960207B1 (de) 2006-09-06
EP0960207A1 (de) 1999-12-01
BR9708567A (pt) 2000-01-04
DE69736637D1 (de) 2006-10-19
AU724531B2 (en) 2000-09-21
CN100422339C (zh) 2008-10-01
EP1715058A2 (de) 2006-10-25
WO1997039138A1 (en) 1997-10-23
JP2000508539A (ja) 2000-07-11
ES2273367T3 (es) 2007-05-01
KR100290332B1 (ko) 2001-06-01
CA2251793A1 (en) 1997-10-23
JP4034293B2 (ja) 2008-01-16
JP2004313199A (ja) 2004-11-11
CN1219972A (zh) 1999-06-16
JP3602142B2 (ja) 2004-12-15
US5843660A (en) 1998-12-01
CN101323880A (zh) 2008-12-17
EP1715058A3 (de) 2008-08-27
CA2251793C (en) 2011-02-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69736637T2 (de) Multiplex amplifikation kurzer tandem repeat loci
DE69821540T2 (de) Mit einem Adapter versehene kompetitive PCR
JP5456950B2 (ja) 短いタンデム反復遺伝子座の多重増幅
US6221598B1 (en) Multiplex amplification of short tandem repeat loci
US7008771B1 (en) Multiplex amplification of short tandem repeat loci
Sprecher et al. General approach to analysis of polymorphic short tandem repeat loci
DE69434314T2 (de) Polymorphismus von mononukleotiden und ihre verwendung in der genanalyse
DE60025840T2 (de) Methode zum nachweis von variationen oder polymorphismen
DE69937447T2 (de) Verfahren zur erkennung von nukleinsäuren
DE10056802A1 (de) Verfahren zur Detektion von Methylierungszuständen zur toxikologischen Diagnostik
DE60014350T2 (de) Verfahren zur erkennung und/oder analyse, unter verwendung von primertechniken, von einfachen nukleotidpolymorphismen in restriktionsfragmenten speziell aus amplifizierten restriktionsfragmenten generiert durch aflp
DE69823372T2 (de) Verfahren und reagentiensatz zur amplifizierung, sequenzierung und typisierung von hla i genen
DE69636725T2 (de) Verfahren zur trennung und/oder erkennung von dns-molekülen
DE60025871T2 (de) Genetisches Screening Verfahren und Vorrichtung
DE60311263T2 (de) Verfahren zur bestimmung der kopienzahl einer nukleotidsequenz
DE60109002T2 (de) Methode zum Nachweis von transkribierten genomischen DNA-Sequenzen
DD283649A5 (de) Verfahren zum nachweis der anwesenheit oder abwesenheit von wenigstens einer nuclotid-varianten in einer oder mehreren nucleinsaueren sowie testsaetze zur durchfuehrung des verfahrens
MXPA98008487A (es) Amplificacion multiplex de sitios de repeticion en tandem cortos
DE19533354A1 (de) Verfahren zum sequenzspezifischen und quantitativen Nachweis von Nucleinsäuren
DE19548590A1 (de) Sequenzspezifischer Nachweis von Nukleinsäuren

Legal Events

Date Code Title Description
8363 Opposition against the patent