JP5456950B2 - 短いタンデム反復遺伝子座の多重増幅 - Google Patents
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Description
(a)分析すべき少なくとも1つのDNAサンプルを得る工程
(b)DNAサンプルの一組の対立遺伝子を選択する工程であって、共増幅できる、少なくとも13個のタンデム反復遺伝子座を含む工程
(c)多重増幅反応で組の中の遺伝子座を共増幅する工程であって、反応生成物が、組の中の共増幅された各遺伝子座から増幅された対立遺伝子の混合物である工程
(d)混合物中の増幅された対立遺伝子を評価して、DNAサンプル中の、組の中の分析された各遺伝子座に存在する対立遺伝子を決定する工程
少なくとも13個の短いタンデム反復遺伝子座の少なくとも4個が、以下の遺伝子座及びこれらの任意の組合せに係る遺伝子座であることが好ましい。
D3S1539、D4S2368、D5S818、D7S820、D9S930、D10S1239、D13S317、D14S118、D14S548、D14S562、D16S490、D16S539、D16S753、D17S1298、D17S1299、D19S253、D20S481、D22S683、HUMCSF1PO、HUMTPOX、HUMTH01、HUMF13A01、HUMBFXIII、HUMLIPOL及びHUMvWFA31
本発明の別の態様において、方法の工程(b)で選択された遺伝子座の組は、13個のCODIS STR 遺伝子座(即ち、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、HUMCSF1PO、HUMFIBRA、HUMTH01、HUMTPOX、及びHUMvWFA31)を含み、本発明の方法を使用して、遺伝子座自体又は追加の遺伝子座と共に、共増幅され、分析される。
A.定義
以下の定義は、以下の用語の範囲及び詳細の、明確な矛盾の無い理解を提供することにおいて補助するものであり、本発明を記述し、定義するのに使用される。
「対立遺伝子ラダー(allelic ladder)」;遺伝子座から増幅された対立遺伝子を含むスタンダードサイズマーカー。
「対立遺伝子(allele)」;DNAセグメントに関連する遺伝的変異であり、即ち、同じ遺伝子座を占有するDNA配列の2つ以上の別形態の1つ。 「生化学的命名法(biochemical nomenclature)」;標準生化学的命名法は、ここで使用され、ヌクレオチドの塩基は、アデニン(A)、チミン(T)、グアニン(G)及びシトシン(C)と呼ばれる。対応するヌクレオチドは、例えば、デオキシグアノシン−5’−トリフォスフェート(dGTP)である。
「DNA多型(DNA polymorphism)」;DNA配列の2以上の異なるヌクレオチド配列が、同じ雑種群の中に共存する状態。
「座(locus)」又は「遺伝子座(genetic locus)」;染色体上の特異的な場所。遺伝子座の対立遺伝子は、相同染色体上の同じ位置に位置する。
「遺伝子座特異的プライマー(locus−specific primer)」;少なくとも遺伝子座の1つの対立遺伝子に対して、示された遺伝子座又はその相補鎖の一部で特異的にハイブリダイズするプライマーで、かつ、増幅法を用いた状態の下で、他のDNA配列で有効にハイブリダイズしない。
「ペンタヌクレオチドタンデム反復(pentanucleotide tandem repeat)」;下記に定義されたSTR多型のサブクラス。別に詳述されていなければ、「ペンタヌクレオチドタンデム反復」の用語は、反復単位が5塩基配列である完全STR、及び少なくとも1つの反復単位が、5塩基反復である不完全STRを含む。
「ポリメラーゼ連鎖反応(polymerase chain reaction)」又は「PCR」;変性、プライマーでのアニーリング、DNAポリメラーゼでの伸長のサイクルが、約106回以上目的のDNA配列のコピーの数を増幅するのに使用される技術。核酸増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応プロセスは、米国特許第4683195号及び第4683202号明細書によってカバーされており、プロセスの記述に対して、ここで参考として組み込む。
「多型の短いタンデム反復遺伝子座(polymorphic short tandem repeat loci)」;下記に定義された、STR遺伝子座で、ゲノムDNAの特別領域の繰り返し配列エレメントの数(及び配列の最終的な長さ)が、対立遺伝子から対立遺伝子、及び個体から個体に変異する。
「多型情報量(polymorphism information content)」又は「PIC」;遺伝子座に存在する多型の量の測定(Bosteinら、1980)。PICは、多型のより大きな程度を示すより高い値で、0〜1.0の範囲を評価する。この測定は、一般に、測定に通常使用される他のものよりも小さい値を表示し、即ち、
異型接合性;高い有益な(約70%を超える異型接合性)マーカーに対して、異型接合性とPICとの違いは僅かである。
「プライマー(primer)」;プライマーの3’末端が、DNAポリメラーゼ酵素を使用する重合部位として作用するといった方法での、遺伝子座のDNA鎖でハイブリダイズする1本鎖オリゴヌクレオチド又はDNAフラグメント。 「プライマー対(primer pair)」;2つのプライマーを含み、プライマー1は、増幅すべきDNA配列の一方の端の1本鎖にハイブリダイズし、プライマー2は、増幅すべきDNA配列の相補鎖上のもう一方の端でハイブリダイズする。
「プライマー部位(primer site)」;プライマーがハイブリダイズする目的DNAの領域。
「短いタンデム反復遺伝子座(short tandem repeat loci)」又は「STR遺伝子座(STR loci)」;長さが3〜7塩基対の短い、繰り返し配列エレメントを含むゲノムDNA領域。また、STRという用語はゲノムDNAの領域を含み、単一の3〜7塩基配列よりもタンデム又は介在塩基を伴って繰り返される。STRで少なくとも1度繰り返された各配列は、ここで、「反復単位」と呼ばれる。
(AwGxTyCz)n (I)
ここで、A、G、T及びCは、どんな順でも存在するヌクレオチドを示し、w、x、y及びzは、配列の各ヌクレオチドの数を示し、0〜7の範囲で変化し、w+x+y+zの合計は3〜7の範囲であり、nは、タンデムで繰り返される配列回数の数を示し、少なくとも2である。
本発明の方法は、複数の共増幅される遺伝子座から増幅された対立遺伝子を生ずるのに適切な、遺伝子座の組、プライマー及び増幅プロトコルを選択し、好ましくは共増幅される遺伝子座は、サイズで重複せず、より好ましくは、共増幅される遺伝子座は、サイズが重複する異なる遺伝子座の対立遺伝子間を識別することを可能にする方法で、ラベルされる。加えて、この方法は、単一の増幅プロトコルでの使用に融和性のある、短いタンデム反復遺伝子座を選択することを企図する。ここで説明される遺伝子座の特定の組合せは、この用途において唯一のものである。遺伝子座の組合せは、前述の2つの理由のどちらかによって、又はこれと組合せて、1以上の遺伝子座が、十分な生成物収量を生成せず又は真の対立遺伝子を表現しないフラグメントがこの反応で生成しない理由によって、却下されるかもしれない。
いずれの異なる技術も、本発明に使用する一組の遺伝子座を選択するのに使用下ることかでさる。この分析万法で便用する遺伝子座の有用な組を開発するための好ましい技術の1つが以下に記述される。3つのSTR遺伝子座を含む多重体が一旦開発されれば、3つより多いの遺伝子座を含む多重体を作る核として使用できる。従って、3つより多い遺伝子座の新しい組合せは、始めの3つの遺伝子座を含んで作られる。例えば、遺伝子座D7S820、D13S317及びD5S818を含む核となる多重体を使って、以下の誘導多重体を生成した。
D16S539、D7S820、D13S317及びD15S818
HUMCSF1PO、HUMTPOX、D16S539、D7S820、D13S317及びD5S818
HUMCSF1PO、HUMTPOX、HUMTH01、D16S539、D7S820、D13S317及びD5S818
HUMCSF1PO、HUMTPOX、HUMTH01、HUMvWFA31、D16S539、D7S820、D13S317及びD5S818
D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、HUMCSF1PO、HUMFIBRA、HUMTH01、HUMTPOX及びHUMvWFA31
S159、HUMCSF1PO、D16S539、D7S820、D13S317及びD5S818
D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、HUMCSF1PO、HUMFIBRA、HUMTH01、HUMTPOX及びHUMvWFA31
D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、HUMCSF1PO、HUMFIBRA、HUMTH01、HUMTPOX、HUMvWFA31、G475、S159及びアメロゲニン
D3S1539、D4S2368、D5S818、D7S820、D9S930、D10S1239、D13S317、D14S118、D14S548、D14S562、D16S490、D16S539、D16S753、D17S1298、D17S1299、D19S253、D20S481、D22S683、HUMCSF1PO、HUMTPOX、HUMTH01、HUMF13A01、HUMBFXIII、HUMLIPOL及びHUMvWFA31
更により好ましくは、本発明に従って分析された遺伝子座の組は、13個のCODIS遺伝子座のすべて、即ち、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、HUMCSF1PO、HUMFIBRA、HUMTH01、HUMTPOX、及びHUMvWFA31を含む。
単一の多重反応での共増幅のための一組の遺伝子座が一旦特定されると、その組で共増幅する各遺伝子座に適合できるプライマーを決定することができる。多重反応で使用されるプライマーの配列の選択に注意すべきである。プライマーの不適切な選択は、増幅の不足、複数の部位での増幅、プライマーのダイマー形成、異なる遺伝子座のプライマー配列の望ましくない相互作用、別の遺伝子座の対立遺伝子と重複するある遺伝子座の対立遺伝子の生成、又は多重体に不適合な異なる遺伝子座に対する増幅の条件又はプロトコルの必要性といった、いくつかの望ましくない効果を生む。好ましくは、本発明の方法で使用されるプライマー又は本発明のキットに含まれるプライマーは、以下の選択プロセスに従って選択される。
ゲノムDNAサンプルは、本発明の方法に使用するために調製され、DNAの増幅に適合性のあるDNA調製方法を使用する。このような多くの方法は、当業者に公知である。この例として、フェノール抽出によるDNA精製(Sambrook,J.,ら(1998)Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York.,pp.9.14−9.19)、及び塩析による部分的精製(Miller,S.ら(1998)Nucl.Acids Res.16:1215)又はチレックス(chelex)(Walshら、(1991) Bio Techniques 10:506−513,Comey,ら(1994)Forensic Sci.39:1254)及び未処理血液を使用する未精製材料の遊離(Burckhardt,J(1994) PCR Methods and Applications 3:239−243,McCabe,Edward R.B.,(1991) PCR Methods and Applications 1:99−106,Mordvag,Byorn−Yngvar(1992) Bio Techniques 12:4 pp.490−492)によるDNA精製が挙げられるが、これらに限定されない。
ゲノムDNAのサンプが一旦調製されると、目的にされた遺伝子座は、本発明の多重増幅工程で共増幅される。多くの異なる増幅方法の一つは、遺伝子座を増幅するのに使用され、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(Saiki,R.K.,ら(1985),Science 230:1350−1354)、増幅の基礎を形成する転写(Kwoh,D.Y.及びKwoh,T.J.(1990),American Biotechnology Laboratory,October,1990)及び鎖置換増幅(strand displacement amplification)(SDA)(Walker,G.T.,ら(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.89:392−396)を含むが、これらに限定されない。好ましくは、DNAサンプルは、組の各遺伝子座に特異的なプライマー対を使用してPCR増幅にかけられる。参考に、以下の実施例で使用されるプライマー配列の詳細において、本明細書の最後に配列一覧表にし、プライマー配列のいくつかは、本発明の別の態様である。
一組の増幅された対立遺伝子が本発明の多重増幅工程から一旦調製されると、増幅された対立遺伝子が評価される。この方法の評価工程は、多くの異なる方法によって行われるが、最も好ましい方法は、以下に記述される。
本発明の方法の最も好ましい態様の一つ、蛍光検出は、多重増幅反応によって生成された混合物の中の増幅対立遺伝子を評価するのに使用される。以下は、好ましい検出方法が実施される方法の概要である。
また、本発明は、上述のプロセスを利用するキットに関する。基本的なキットは、1以上の遺伝子座特異的プライマーを有する容器を含む。任意で使用説明書を含んでもよい。
この実施例において、DNA鋳型を、単一の反応容器で、個々の遺伝子座D3S1358、HUMTH01、D21S11、D18S51、HUMvWFA31、D8S1179、HUMTPOX、HUMFIBRA、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、及びHUMCSF1POで同時に増幅した。PCR増幅を、25μlの1×Gold ST*R緩衝液(50mM KCl、10mM Tris−HCl(25℃でpH8.3)、0.1%Triton X−100、1.5mM MgCl2、160μg/ml BSA 及び各200μMのdATP、dCTP、dGTP及びdTTP)中で実施し、1ngの鋳型及び3.25UのAmpliTaq Gold(登録商標)DNAポリメラーゼを使用した。GeneAmp(登録商標)PCR System 9600(Perkin Elmer、Foster City,CA)を、以下の増幅プロトコルで使用した。96℃で12分、次に、94℃で30秒、68秒で58℃にし、30秒保持、50秒で70℃にし、45秒保持を10サイクル、続いて、30秒で90℃、60秒で58℃にし、30秒保持、50秒で70℃にし、45秒保持を20サイクル、続いて、60℃で30分を1サイクル行なった。
この実施例において、DNA鋳型を、単一反応容器で、個々の遺伝子座D3S1358、HUMTH01、D21S11、D18S51、G475、アメロゲニン、HUMvWFA31、D8S1179、HUMTPOX、HUMFIBRA、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、HUMCSF1PO及びS159で同時に増幅した。PCR増幅を、25μlの1×Gold ST*R緩衝液(50mM KCl、10mM Tris−HCl(25℃でPH8.3)、0.1%Triton X−100、1.5mM MgCl2、160μg/ml BSA及び200μMの各dATP、dCTP、dGTP及びdTTP)で行ない、1ngの鋳型、及び4UのAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼを使用した。GeneAmp PCR System 9600(Perkin Elmer,Foster City,CA)を、以下の増幅プロトコルで使用した。96℃で12分、次に、94℃で30秒、68秒で58℃にし、30秒保持、50秒で70℃にし、45秒保持を10サイクル、続いて、90℃で30秒、60秒で58℃にし、30秒保持、50秒で70℃にし、45秒保持を20サイクル、続いて、60℃で30分を1サイクル行なった。
この実施例において、DNA鋳型を、実施例2と同様に増幅した。増幅生成物を、ABI PRISM(登録商標)377 DNA Sequencerを使用して分離した。これを、0.2mm厚さの、5%Long Ranger(商標出願中)Acrylamide(FMC BioProducts、Rockland、ME)、7Mのウレアゲルを使用して実施した。DNAサンプルを、1.5μlの添加液(88.25%ホルムアミド、4.1mM EDTA、15mg/mlブルーデキストラン)及び0.5μlのインターナルレーンサイズスタンダードと混合し、95℃で2分間変性させ、装入する前に氷で冷却した。電気泳動を、Prerun(PR GS 36A−2400)及びRun(GS 36A−2400)用の、製造業者のGeneScan(登録商標)モジュールを使用して行なった。泳動時間は3時間で、仮フィルターAを用いた。
この実施例において、2つのDNA鋳型を、遺伝子座D3S1358、HUMTH01、D21S11、D18S51、G475、アメロゲニン、HUMvWFA31、D8S1179、HUMTPOX、HUMFIBRA、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、HUMCSF1PO及びS159又はこれらの任意の組合せに係る遺伝子座から選択されたの3つの異なる遺伝子座の各々で同時に各々増幅した。各遺伝子座の組合せの増幅において、単一の反応容器に5ngの鋳型を含め、反応容器に、25μlの1×Gold ST*R緩衝液(50mM KCl、10mM Tris−HCl(25℃でPH8.3)、0.1%Triton X−100、1.5mM MgCl2、160μg/ml BSA及び200μMの各dATP、dCTP、dGTP及びdTTP)を含めた。
この実施例において、2つのDNA鋳型を、遺伝子座D3S1358、HUMTH01、D21S11、D18S51、G475、アメロゲニン、HUMvWFA31、D8S1179、HUMTPOX、HUMFIBRA、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、HUMCSF1PO及びS159又はこれらの任意の組合せの遺伝子座から選択された2つの異なる遺伝子座の各組合せで各々同時に増幅した。各遺伝子座の組合せの増幅には、単一の反応容器に5ngの鋳型を含み、反応容器に、25μlの1×Gold ST*R緩衝液(50mM KCl、10mMTris−HCl(25℃でpH8.3)、0.1%のTritonX−100、1.5mM MgCl2、160μg/ml BSA及び200μMの各dATP、dCTP、dGTP及びdTTP)を含めた。
この実施例において、2つのDNA鋳型を、遺伝子座D3S1358、HUMTH01、D21S11、D18S51、S159、アメロゲニン、HUMvWFA31、D8S1179、HUMTPOX、HUMFIBRA、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、HUMCSF1PO及びC221又はこれらの任意の組合せの遺伝子座から選択された3つの異なる遺伝子座の各組合せで各々同時に増幅した。各遺伝子座の組合せの増幅には、単一の反応容器に10ngの鋳型を含め、反応容器に、25μlの1×Gold ST*R緩衝液(50mM KCl、10mMTris−HCl(25℃でpH8.3)、0.1%のTritonX−100、1.5mM MgCl2、160μg/ml BSA及び200μMの各dATP、dCTP、dGTP及びdTTP)を含めた。
Claims (12)
- 1以上のDNAサンプルから、一組の遺伝子座に存在する対立遺伝子を同時に決定する方法であって、
(a)分析すべきDNAサンプルの一組の遺伝子座を選択する工程であって、前記一組の遺伝子座が、共増幅できる13個の短いタンデム反復遺伝子座を含む工程と、
(b)多重増幅反応で前記組の中の遺伝子座を共増幅する工程であって、反応生成物が、前記組の中の共増幅された各遺伝子座から増幅された対立遺伝子の混合物である工程と、
(c)前記混合物中の前記増幅された対立遺伝子を評価して、前記DNAサンプル中の、前記組の中の分析された各遺伝子座に存在する対立遺伝子を決定する工程と、
を含み、
前記13個の短いタンデム反復遺伝子座が、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、HUMCSF1PO、HUMTPOX、HUMTH01、HUMvWFA31、D3S1358、D8S1179、D18S51、D21S11及びHUMFIBRAであることを特徴とする方法。
- 工程(a)で選択される前記遺伝子座の組が、工程(a)で提供される前記DNAの少なくとも1つのソースの性を同定するのに使用される遺伝子座を更に含む、請求項1記載の方法。
- 工程(a)で提供される前記DNAの前記少なくとも1つのソースが、ヒトであって、かつヒトの性を同定するのに使用される遺伝子座が、アメロゲニン遺伝子座である、請求項2記載の方法。
- 前記アメロゲニン遺伝子座が、配列ID番号86、87、及び105からなる群より選ばれる配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを使用して共増幅される、請求項3記載の方法。
- 前記多重増幅反応が、以下の配列群の少なくとも1つから選択される配列を有する、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して行なわれる、請求項1記載の方法。
前記組の遺伝子座の1つがD7S820の場合に、配列ID番号80及び81
前記組の遺伝子座の1つがD13S317の場合に、配列ID番号3、4、82及び83前記組の遺伝子座の1つがD5S818の場合に、配列ID番号84及び85
前記組の遺伝子座の1つがD16S539の場合に、配列ID番号29、79及び97
前記組の遺伝子座の1つがHUMCSF1POの場合に、配列ID番号77、78及び98
前記組の遺伝子座の1つがHUMTPOXの場合に、配列ID番号72及び73
前記組の遺伝子座の1つがHUMTH01の場合に、配列ID番号38、66、67及び103
前記組の遺伝子座の1つがHUMvWFA31の場合に、配列ID番号40及び76
前記組の遺伝子座の1つがD18S51の場合に、配列ID番号62、63、101及び102
前記組の遺伝子座の1つがD21S11の場合に、配列ID番号64及び65
前記組の遺伝子座の1つがD3S1358の場合に、配列ID番号68、69及び106
前記組の遺伝子座の1つがHUMFIBRAの場合に、配列ID番号70、71及び107、及び
前記組の遺伝子座の1つがD8S1179の場合に、配列ID番号74、75及び104
- ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びキャピラリーゲル電気泳動からなる群より選ばれる分離手段を使用して、前記増幅された対立遺伝子が、工程(c)での評価の前に分離される、請求項1記載の方法。
- 前記多重増幅反応が、分析される前記遺伝子座をフランキングする、少なくとも13対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して行なわれる、請求項1記載の方法。
- 前記遺伝子座の組が、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して共増幅される、請求項7記載の方法。
- 工程(b)の前記多重反応で共増幅された各遺伝子座が、前記遺伝子座をフランキングする1対のプライマーを使用して共増幅され、各対の少なくとも1つのプライマーが、該プライマーに共有結合した蛍光標識を有する、請求項7記載の方法。
- 前記標識されたプライマーの少なくとも3つが、該プライマーに共有結合した異なる蛍光標識を有する、請求項9記載の方法。
- 分析すべき前記少なくとも1つのDNAサンプルが、ヒト組織から調製され、該ヒト組織が、血液、精液、膣細胞、毛、唾液、尿、胎盤細胞又は胎児細胞を含む羊水及び上記に列挙した組織のいずれかの混合物を含むヒト組織からなる群より選ばれる、請求項1記載の方法。
- 前記増幅された対立遺伝子が、前記増幅された遺伝子をサイズスタンダードと比較することによって評価され、該サイズスタンダードが、DNAマーカー及び遺伝子座特異的対立遺伝子ラダーからなるサイズスタンダードの群より選ばれる、請求項1記載の方法。
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