JP2002530121A - 短いタンデム反復遺伝子座の多重増幅 - Google Patents

短いタンデム反復遺伝子座の多重増幅

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Abstract

(57)【要約】 単一の多重反応で、ゲノムＤＮＡの少なくとも１３個の遺伝子座の同時増幅における使用のための方法及び材料が、このような反応の生成物の分析で使用するための方法及び材料とともに開示される。本発明には、少なくとも１３個の短いタンデム反復遺伝子座の同時増幅における方法及び材料が含まれ、結合ＤＮＡインデックスシステム（ＣＯＤＩＳ）データベースとして使用される核になる遺伝子座として、アメリカ連邦捜査局によって特に選択された、１３個のこのような遺伝子座の分析のための特定の材料及び方法も含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【関連出願の相互参照】
この出願は、１９９６年４月１５日に出願され現在米国特許第５８４３６６０
号である、米国特許出願第０８／６３２５７５号の部分継続出願であり、この出
願は、１９９８年１２月１日に発行され、１９９４年９月３０日に出願された米
国特許出願第０８／３１６５４４号の部分継続である。これらの出願の全開示は
、ここで参考として組み込む。
【０００２】
【連邦政府主催の研究開発に関する申告】
適用はない。
【０００３】
【発明の分野】
本発明は、一般的に、ゲノム系におけるゲノムマーカーの検出に関する。本発
明は、より詳細には、複数の（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）異なる多型遺伝子座の同時増
幅に関し、１度の反応で、多重系（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｓｙｓｔｅｍ）の中に
含まれる各遺伝子座の対立遺伝子を決定する、ポリメラーゼ連鎖反応又は他の増
幅システムを使用する。
【０００４】
【発明の背景】
ＤＮＡタイピングは、一般に、人間の子供の親であることを特定するのに使用
され、またウマ、イヌ、他の動物及び農作物の系統を確認するのにも使用される
。また、ＤＮＡタイピングは、一般に、人間の残留物の特定を要求する犯罪現場
や他の現場で見つかった、血液、唾液、精液及び他の組織のソースを特定するの
に使用される。また、ＤＮＡタイピングは、臨床的場面で使用され、骨髄移植の
成功又は失敗及び特定の癌組織の存在を決定する。ＤＮＡタイピングは、一般に
「マーカー」と呼ばれる、重要な特徴を持つゲノムＤＮＡの対立遺伝子の分析を
含む。今日使用されている多くのタイピング方法は、集団の中で少なくとも２つ
の異なる形態を表すことが知られている１以上のＤＮＡマーカー領域の長さ及び
/又は配列の違いを検出及び分析するように特別に設計されている。このような
長さ及び/又は配列の変異は、「多型」と呼ばれる。このような変異が生ずるＤ
ＮＡ領域（即ち、遺伝子座）は、「多型遺伝子座」と呼ばれる。本発明の方法と
材料は、ＤＮＡの複数の遺伝子座の検出で使用するために設計され、ＤＮＡの複
数の遺伝子座のいくつか又はすべては、多型遺伝子座である。
【０００５】 長さ又は配列に関して十分な多型の遺伝子マーカーにおいて、親子鑑定や法医
学的分析のために集められた組織サンプルの同定といった、同一性用途での使用
が長く捜し求められていた。このようなマーカー及びマーカーを分析するための
方法の発見と開発は、この数年に渡っていくつかの開発段階を経てきた。
【０００６】 最初に特定されたＤＮＡ変異マーカーは、単一の塩基置換であり、即ち単一配
列多型性であり、サザンハイブリダイゼーションアッセイによってしばしば検出
された。制限酵素消化ＤＮＡを放射性プローブで分析するのに使用されるように
設計されている、このようなマーカーの同定を記述する参考文献の例については
、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｅ．Ｍ．（１９７５）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８（３
）：５０３−５０７；Ｓｃｈｕｍｍら（１９８８）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４２：１４３−１５９；及び
Ｗｙｍａｎ，Ａ．ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，Ｒ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．７７：６７５４−６７５８を参照されたい。
【０００７】 次世代のマーカーは、サイズ変異体であり、即ち長さ多型（ｌｅｎｇｔｈ ｐ
ｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍであり、特に、「タンデム反復の変数」（ＶＮＴＲ）マ
ーカー（Ｎａｋａｍｕｒａ Ｙ．ら、（１９８７）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：
１６１６−１６２２；及びＷｈｉｔｅらに発行された（１９９０）米国特許第４
９６３６６３号明細書；Ｗｈｉｔｅらに発行された（１９９５）米国特許第４９
６３６６３号の継続出願である米国特許５４１１８５９号明細書）、及び「ミニ
サテライト」マーカー（Ｊｅｆｆｒｅｙｓら（１９８５ａ）、Ｎａｔｕｒｅ ３
１４：６７−７３；Ｊｅｆｆｒｅｙｓら（１９８５ｂ）Ｎａｔｕｒｅ ３１６：
７６−７９．、Ｊｅｆｆｒｅｙｓによる発明に対する米国特許第５１７５０８２
号明細書）である。ＶＮＴＲ及びミニサテライトマーカーの両方とも、タンデム
様式で繰り返されたほとんど同一の配列領域を含む。中心的な反復配列は、長さ
が１０〜７０塩基であり、「ミニサテライト」反復と呼ばれる短い中心的な反復
配列と、ＶＮＴＲと呼ばれる長い反復とを持つ。人間集団の異なる個人には、異
なる反復数が含まれる。ＶＮＴＲマーカーは、一般に、塩基置換多型性よりもは
るかに高い多型であり、時々、単一の遺伝子座で４０以上までの対立遺伝子を示
す。しかしながら、制限酵素消化の長たらしいプロセスと次のサザンハイブリダ
イゼーション分析は、いまなお、このようなマーカーの検出と分析が要求される
。
【０００８】 次の進歩は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．Ｂ．らに
よる米国特許第４６８３２０２号明細書）技術とＶＮＴＲ遺伝子座（Ｋａｓａｉ
，Ｋ．ら（１９９０）Ｊｏｕｒｎａｌ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３
５（５）：１１９６−１２００）とを連結することを含む。サザントランスファ
ーの必要なしで検出することができる、増幅され得るＶＮＴＲ遺伝子座が発見さ
れた。増幅生成物は、アガロース又はポリアクリルアミドゲルを通して分離され
、増幅中の放射能混合によって、又は、銀又は臭化エチジウムの後染色によって
検出される。しかしながら、ＰＣＲは、比較的小さいＤＮＡセグメントを確実に
増幅するのに使用され、即ち長さ３０００塩基以下のＤＮＡセグメントとを確実
に増幅するだけである。Ｐｏｎｃｅ，ＭとＭｉｃｏｌ，Ｌ．（１９９２） ＮＡ
Ｒ ２０（３）：６２３；Ｄｅｃｏｒｔｅ Ｒ，ら（１９９０）ＤＮＡ Ｃｅｌ
ｌ Ｂｉｏｌ．９（６）：４６１−４６９）を参照されたい。従って、ごくわず
かにしか増幅され得るＶＮＴＲは開発されなかった。
【０００９】 近年、遺伝子マーカーとして多型の短いタンデム反復（ＳＴＲ）の発見と発達
は、連鎖地図、同定と病気の遺伝子の特徴づけ、及びＤＮＡタイピングの単純化
と精度の発達における進歩を刺激した。特に、ジヌクレオチド反復を含む多型マ
ーカー（Ｌｉｔｔ及びＬｕｔｙ（１９８９）Ａｍ Ｊ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ
３（４）：５９９−６０５；Ｔａｕｔｚ，Ｄ（１９８９）ＮＡＲ １７：６４６
３−６４７１；Ｗｅｂｅｒ及びＭａｙ（１９８９） Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎ
ｅｔ ４４：３８８−３９６；ドイツ特許第ＤＥ ３８ ３４ ６３６ Ｃ２号
明細書、発明者Ｔａｕｔｚ，Ｄ；Ｗｅｂｅｒ，Ｌ．により出願された米国特許第
５５８２９７９号明細書）、３つ又は４つのヌクレオチドの反復単位を持つＳＴ
Ｒ（Ｅｄｗａｒｄｓ，Ａ．，ら（１９９１）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ ４
９：７４６−７５６；Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｈ．Ａ．，ら（１９９４）Ａｍ．Ｊ．Ｈ
ｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５５：１７５−１８９；Ｆｒｅｇｅａｕ，Ｃ．Ｊ．；及びＦ
ｏｕｒｎｅｙ，Ｒ．Ｍ．（１９９３） Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５（
１）：１００−１１９．；Ｓｃｈｕｍｍ，Ｊ．Ｗ．ら（１９９４）ｉｎ Ｔｈｅ
Ｆｏｕｒｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｈ
ｕｍａｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ １９９３、ｐｐ．１７７−１８７（
ｐｕｂ．ｂｙ Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，１９９４）；及びＣａｓｋｅｙら
による米国特許第５３６４７５９号明細書；Ｔａｕｔｚ，Ｄによるドイツ特許第
ＤＥ ３８ ３４ ６３６ Ｃ２号明細書）、及び５〜７塩基反復単位を持つＳ
ＴＲ（例えば、Ｅｄｗａｒｄｓら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．１９：４７９１；Ｃｈｅｎら（１９９３）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １５（３）
：６２１−５；Ｈａｒａｄａら（１９９４）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５
５：１７５−１８９；Ｃｏｍｉｎｇｓら（１９９５）、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２９
（２）：３９０−６；及びＵｔａｈ Ｍａｒｋｅｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
Ｇｒｏｕｐ（１９９５），Ａｍ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．５７：６１９−６２８；及び
Ｊｕｒｋａ及びＰｅｔｈｉｙａｇｏｄａ（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．４
０：１２０−１２６）参照のこと）の発見と発達で、以前の方法の不完全なもの
の多くが克服された。ＳＴＲマーカーは、一般的に、ＶＮＴＲマーカーよりも短
く、たいていのＶＮＴＲマーカーよりも増幅におけるよりよい基質になる。
【００１０】 ＳＴＲ遺伝子座は、増幅され得るＶＮＴＲ遺伝子座と同様であり、このような
各遺伝子座で増幅された対立遺伝子は、長さの変異に基づいて区別される。一般
的に、実証的なＳＴＲ遺伝子座は、ＶＮＴＲ遺伝子座よりも、個々の遺伝子座で
多型が少ない。従って、単一の増幅反応及び分離において複数のＳＴＲ系を増幅
及び検出して、同時にいくつかの遺伝子座に対する情報を得ることが望ましい。
いくつかの遺伝子座を含む系は、多重系と呼ばれ、１１個までの別個のＳＴＲ遺
伝子座を含む多くのこのような系が記述された。例えば、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ
ｓ：Ａｍｅｒｉａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ（Ｆｅｂ．９−１４、１９９８）、Ｓｃｈｕｍｍ，Ｊａｍｅｓ Ｗ．ら、Ｐ
．５３、Ｂ８８；Ｉｄ．Ｇｉｂｓｏｎ，Ｓａｎｄｒａ Ｄ．ら、ｐ．５３，Ｂ８
９；Ｉｄ．，Ｌａｚａｒｕｋ，Ｋａｔｈｅｒｉｎｅら、ｐ．５１，Ｂ８３；Ｓｐ
ａｒｋｅｓ，Ｒ．ら、Ｉｎｔ Ｊ Ｌｅｇａｌ Ｍｅｄ （１９９６）１０９：
１８６−１９４；ＡｍｐＦｌＳＴＲ ＰｒｏｆｉｌｅｒTM ＰＣＲ Ａｍｐｌｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｍａｎｕａｌ（１９９７），ｐｕｂ
．ｂｙ Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ．，ｉ−ｖｉｉｉ及び１−１ ｔ
ｏ １−１０；ＡｍｐＦｌＳＴＲ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ ＰｌｕｓTM ＰＣＲ Ａ
ｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｕｓｅｒ‘ｓ Ｍａｎｕａｌ（１９９７）
、ｐｕｂ．ｂｙ ＰｅｒｋｉＮ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ．，ｉ ｖｉｉｉ及び１
−１ ｔｏ １−１０；ＡｍｐＦｌＳＴＲ ＣＯｆｉｌｅｒTM ＰＣＲ Ａｍｐ
ｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｕｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ（１９９８）、ｐ
ｕｂ．ｂｙ Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ．ｉ−ｉｉｉ及び１−１ ｔ
ｏ １−１０；９ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏ
ｎ Ｈｕｍａｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｏｃｔｏｂｅｒ ７−１０，
１９９８）、ｐｕｂ．ｂｙ Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔａｕｂ，Ｒｉｃ
ｋ Ｗ．ら、Ｐｏｓｔｅｒ Ａｂｓｔｒａｃｔ １５；Ｉｄ．，Ｗｉｌｌａｒｄ
，Ｊｅａｎｎｅ Ｍ．ら、Ｐｏｓｔｅｒ Ａｂｓｔｒａｃｔ ７３；及びＩｄ．
，Ｗａｌｓｈ，Ｐ．Ｓｅａｎら、Ｓｐｅａｋｅｒ Ａｂｓｔｒａｃｔ ｆｏｒ
８：５０ａｍ−９：２０ａｍ，Ｔｈｕｒｓｄａｙ，Ｏｃｔｏｂｅｒ ８，１９９
８を参照されたい。
【００１１】 ＳＴＲ遺伝子座を伴う増幅プロトコルは、一般的に長さ６０〜５００塩基対（
ｂｐ）の小さな生成物を生成するように設計でき、各遺伝子座からの対立遺伝子
は、しばしば、１００ｂｐ未満の領域の中に含まれる。これによって、ＰＣＲプ
ライマーの慎重な設計によって、同一ゲル又はキャピラリー電気泳動でいくつか
の系の同時電気泳動分析ができるので、個々の系からのすべての潜在的増幅生成
物は、他の系の対立遺伝子座の範囲と重複しない。これらの系の設計は、幾分、
単一ゲル又はキャピラリーの複数の遺伝子座の分離における困難性によって制限
される。これは、異なるサイズのフラグメントの特別の圧縮があるために発生し
、特に、ゲル又はキャピラリー中の長いフラグメントは、即ち、従来技術による
ＤＮＡフラグメントの分離に対する手段が一般に使用される。
【００１２】 アメリカ連邦捜査局（ＦＢＩ）は、結合ＤＮＡインデックスシステム（「ＣＯ
ＤＩＳ」）、即ちＤＮＡタイピング情報のデータベースを確立して維持する。地
方の、州の、国の法律の施行機関は、ＣＯＤＩＳシステムを使用して、犯罪場面
で集められた犯罪科学で用いるＤＮＡ証拠をデータベース中のＤＮＡ情報と合わ
せる。ＣＯＤＩＳ及び他の国のデータベースシステムは、これらの機関が、凶暴
な犯罪を解決するのに使用するための有効な道具であることが立証された。（例
えば、Ｎｉｅｚｇｏｄａ，Ｓｔｅｐｈｅｎ，ｉｎ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｈｅａ
ｌｔｈｔｅｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ Ｓｅｃｏｎｄ Ａｎｎｕａｌ Ｃｏ
ｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ ＤＮＡ Ｆｒｅｎｓｉｃｓ；Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｅｖｉ
ｄｅｎｃｅ，ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ（Ｎｏｖ．１７−１８
、１９９８）、ｐｐ．１−２１．；Ｎｉｅｚｇｏｄａ、Ｓｔｅｐｈｅｎ ｉｎ
Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｆｒｏｍ Ｔｈｅ Ｅｉｇｈｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔ
ｉｏｎａｌ Ｓｉｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ １９９７、ｐｕｂ．ｂｙ Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（
１９９８）、ｐｐ ４８−４９；Ｆｒａｚｉｅｒ，Ｒａｃｈｅｌ Ｒ．Ｅ．ら、
Ｉｄ．，ｐｐ．５６−６０；Ｎｉｅｚｇｏｄａ，Ｓ．Ｊ．ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｉ
ｎ ＤＮＡ １（３）：１２−１３；Ｗｅｒｒｅｔｔ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ Ｓｐａ
ｒｋｅｓ，Ｒ．ｉｎ Ｓｐｅａｋｅｒ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ：９ｔｈ Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｉｄｅｎｔｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ（Ｏｃｔ．７−１０，１９９８）ｐｐ．５−６を参照されたい。
）最近まで、特定のＶＮＴＲ遺伝子座の分析から得られた制限酵素断片長多型（
「ＲＦＬＰ」）データのみが、データベースの中心的要素と考えられていた。Ｆ
ＢＩは、最近、ＣＯＤＩＳデータベース中に含まれるべきものとして１３個の多
型ＳＴＲ遺伝子座を特定した。１３個のＣＯＤＩＳ ＳＴＲ遺伝子座は、ＨＵＭ
ＣＳＦ１ＰＯ、Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１７９
、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ２１Ｓ１１、ＨＵＭＦＩ
ＢＲＡ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭＴＰＯＸ及びＨＵＭｖＷＦＡ３１である。（Ｂ
ｕｄｏｗｌｅ，Ｂｒｕｃｅ ａｎｄ Ｍｏｒｅｔｔｉ，Ｔａｍｙｒａ ｉｎ Ｓ
ｐｅａｋｅｒ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ：９ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓ
ｉｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｏｃｔ
．７−１０，１９９８）ｐｐ．７−８を参照されたい。） ＶＮＴＲ及びＳＴＲ
マーカーデータの両方とも、一般に、ＣＯＤＩＳデータベースに保存されている
。（例えば、Ｎｉｅｚｇｏｄａ，Ｓｔｅｐｈｅｎ ｉｎ Ｓｅｃｏｎｄ Ａｎｎ
ｕａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ ＤＮＡ Ｆｏｒｅｎｓｉｃｓ，ｓｕｐｒ
ａを参照されたい。）本発明がなされるまで、単一の反応で共増幅され、その後
分析できる遺伝子座の数は、制限されていた。詳細には、１３個以上のＳＴＲ遺
伝子座、ましてＣＯＤＩＳデータベースでの使用のために特定された１３個の多
型ＳＴＲ遺伝子座の多重増幅での使用のための材料及び方法は、開発されていな
かった。
【００１３】 本発明の材料及び方法は、様々なタイプのＤＮＡの特定の多型遺伝子座の多重
体分析（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ａｎａｌｙｓｉｓ）での使用のために設計され、
ＤＮＡには、異なるソースの変異からの一本鎖及び２本鎖ＤＮＡが含まれる。本
発明は、現在の技術を越える有意な改良を示し、識別、精度及び連鎖解析におけ
るＤＮＡプロファイリングへの処理量、刑事裁判、親子鑑定、及び他の法廷の、
医学的な及び遺伝的な特定用途の増加した能力を導く。
【００１４】
【発明の概要】
従って、本発明の目的は、遺伝子座の組の同時増幅における方法及び材料を提
供することであり、遺伝子座は、複数の異なる多型の短いタンデム反復（ＳＴＲ
）遺伝子座を含み、単一の多重反応で、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動又
は他の分離方法及び検出方法と組み合わせてＰＣＲ又は他の増幅反応システムを
使用し、多重反応で増幅された各遺伝子座の対立遺伝子の相対的な長さを分析し
、比較する。ここで開示された遺伝子座の組の多重体分析は、従来技術において
まだ記述されていない。また、ここで以下に開示されるプライマーの多くの配列
は、従前に記述されたことはなく、これらのプライマーの記述のすべては、開示
された遺伝子座の組の多重増幅において有用であることが分る。
【００１５】 また、本発明の目的は、方法、キット及び詳細に示した遺伝子座を含む多重増
幅に対して特異的なプライマーを提供することである。
【００１６】 これら及び他の目的は、本発明によって取り組まれ、各多重体（ｍｕｌｔｉｐ
ｌｅｘ）の個々の遺伝子座に存在する対立遺伝子を同時に分析し、決定するため
の方法及び材料に関する。一般に、本発明の方法は、（ａ）分析すべき少なくと
も１つのＤＮＡサンプルを得る工程であって、ＤＮＡサンプルは、共増幅され得
る、少なくとも１３個の遺伝子座を有する工程と、（ｂ）ＤＮＡサンプルの少な
くとも１３個の遺伝子座を共増幅する工程と、（ｃ）使用される系の多型性を示
す型で、増幅された材料を検出する工程とを含む。
【００１７】 1つの態様において、本発明は、１以上のＤＮＡサンプルから一組の遺伝子座
に存在する対立遺伝子を同時に決定する方法であり、以下の工程を含む。 （ａ）分析すべき少なくとも１つのＤＮＡサンプルを得る工程 （ｂ）ＤＮＡサンプルの一組の対立遺伝子を選択する工程であって、共増幅で
きる、少なくとも１３個のタンデム反復遺伝子座を含む工程 （ｃ）多重増幅反応で組の中の遺伝子座を共増幅する工程であって、反応生成
物が、組の中の共増幅された各遺伝子座から増幅された対立遺伝子の混合物であ
る工程 （ｄ）混合物中の増幅された対立遺伝子を評価して、ＤＮＡサンプル中の、組
の中の分析された各遺伝子座に存在する対立遺伝子を決定する工程 少なくとも１３個の短いタンデム反復遺伝子座の少なくとも４個が、以下の遺伝
子座及びこれらの任意の組合せに係る遺伝子座であることが好ましい。 Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ４Ｓ２３６８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ９Ｓ９３０
、Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１４Ｓ１１８、Ｄ１４Ｓ５４８、Ｄ１
４Ｓ５６２、Ｄ１６Ｓ４９０、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１６Ｓ７５３、Ｄ１７Ｓ１２
９８、Ｄ１７Ｓ１２９９、Ｄ１９Ｓ２５３、Ｄ２０Ｓ４８１、Ｄ２２Ｓ６８３、
ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭＦ１３Ａ０１、
ＨＵＭＢＦＸＩＩＩ、ＨＵＭＬＩＰＯＬ及びＨＵＭｖＷＦＡ３１ 本発明の別の態様において、方法の工程（ｂ）で選択された遺伝子座の組は、１
３個のＣＯＤＩＳ ＳＴＲ 遺伝子座（即ち、Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ５Ｓ８１８、
Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５
１、Ｄ２１Ｓ１１、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、ＨＵＭＴＨ０１、
ＨＵＭＴＰＯＸ、及びＨＵＭｖＷＦＡ３１）を含み、本発明の方法を使用して、
遺伝子座自体又は追加の遺伝子座と共に、共増幅され、分析される。
【００１８】 更なる特徴において、本発明は、ゲノムＤＮＡの一組の遺伝子座を同時に分析
するためのキットであり、分析すべきゲノムＤＮＡの一組の遺伝子座を共増幅す
るためのオリゴヌクレオチドプライマーを含み、遺伝子座の組は、同一の多重反
応で共増幅され得る少なくとも１３個の短いタンデム反復遺伝子を含み、プライ
マーは、１以上の容器の中にある。更に好ましくは、キットは、ヒトゲノムＤＮ
Ａの少なくとも１３個の遺伝子座の一組を共増幅するためのオリゴヌクレオチド
プライマー対を含み、遺伝子座の組は、Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ
８２０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ
２１Ｓ１１、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭ
ＴＰＯＸ、及びＨＵＭｖＷＦＡ３１を含む。
【００１９】 更になる特徴において、本発明は、ヒトＤＮＡの特異的遺伝子座を増幅するた
めのプライマー配列とプライマー対である。ヒトＤＮＡの多重体分析に対する本
発明のプライマーとプライマー対の使用は、ここで、以下に説明される。本発明
のプライマーは、本発明の方法での使用に適合し、プライマーは、以下に示した
、標識された形態で使用され、方法の評価工程を補助する。
【００２０】 本発明の詳細に述べられるアプローチは、多重体の中に含まれる遺伝子座の分
析における時間、仕事及び材料の節約を生む。本発明の方法により、分離チュー
ブで又は小さい遺伝子座群で個々に各遺伝子座を増幅する代わりに、１３個以上
、１６個以上もの遺伝子座を、単一の増幅反応を用いて１本のチューブで共増幅
することができる。
【００２１】 本発明は、犯罪科学分析、親子決定、骨髄移植モニタリング、連鎖地図及び遺
伝病と癌の検出の分野において特有の用途を有する。本発明の１３個の方法によ
って、あるＤＮＡが同一人の異なるサンプルから調製されたＤＮＡとマッチする
ことができる確実性を有意に増加する。非常に少ないＤＮＡ量を含むサンプル間
で正確にマッチする、又は区別する必要性は、特に、犯罪科学の用途で急がれ、
ここでは、多くの有罪（及び無罪）は、ＤＮＡタイピング分析で変わる。
【００２２】 科学者、特に犯罪科学者は、ＤＮＡの２つのサンプル間のマッチングが、統計
的に有意であることを確実にするために、ＤＮＡの多重多型遺伝子座を分析する
必要を長く理解していた。（Ｐｒｅｓｌｅｙ，Ｌ．Ａ．ら、ｉｎ Ｔｈｅ Ｔｈ
ｉｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｈｕｍａｎ
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ １９９２，ｐｐ．２４５−２６９（ｐｕｂ．
ｂｙ Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，１９９３）；Ｂｅｖｅｒ， Ｒ．Ａ．，ら
、ｉｎ Ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉ
ｕｍ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ １９９１、ｐｐ．１
０３−１２８．（ｐｕｂ．ｂｙ Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，１９９２）を参
照されたい。）しかしながら、本発明がなされるまで、単一の反応で１３個以上
のＳＴＲ遺伝子座を同時に分析できなかった。このような多重性能の重要性を理
解することは、ＤＮＡタイピング分析の後のいくつかの数学的処理を理解するの
を助ける。
【００２３】 説明のため、各ＳＴＲ遺伝子座に、１０のうち１の頻度で遺伝子型（即ち、遺伝
子座２個のパターン）を有すると想定する。換言すれば、２つの無作為に選択さ
れた個体が、１つのＳＴＲについてマッチする型を有する機会は、１／１０であ
ると想定する。しかしながら、２つの異なるＳＴＲ遺伝子座を分析した場合、両
方の系との無作為マッチングする機会は、１／１００である。３つのＳＴＲ遺伝
子座を分析する場合、３つの系の各々の無作為マッチングする機会は、１／１０
００等である。従って、分析されるＳＴＲ遺伝子座の数を増加すると、一般の個
体群の中で無作為マッチングの見込みが減ることは簡単に分り、その機会を増加
することによって、犯罪場面の証拠と個人の型を比較することで、犯罪現場での
容疑者の存在を正確に特定することができる。同様の理由は、本発明の方法も、
父系において被疑父親を正確に特定、骨髄組織の正しい適合、連鎖地図研究の有
意な結果の展開、及び遺伝病と癌の検出等の可能性を見込みを増加させることを
結論付けるのに使用できる。
【００２４】 本発明の更なる目的、特徴及び利益は、本発明の実施における以下のベストモ
ード及び図面から明らかである。
【００２５】 ［発明の詳細な説明］ Ａ．定義 以下の定義は、以下の用語の範囲及び詳細の、明確な矛盾の無い理解を提供す
ることにおいて補助するものであり、本発明を記述し、定義するのに使用される
。 「対立遺伝子ラダー（ａｌｌｅｌｉｃ ｌａｄｄｅｒ）」；遺伝子座から増幅
された対立遺伝子を含むスタンダードサイズマーカー。 「対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）」；ＤＮＡセグメントに関連する遺伝的変異で
あり、即ち、同じ遺伝子座を占有するＤＮＡ配列の２つ以上の別形態の１つ。 「生化学的命名法（ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）」
；標準生化学的命名法は、ここで使用され、ヌクレオチドの塩基は、アデニン（
Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）と呼ばれる。対応する
ヌクレオチドは、例えば、デオキシグアノシン−５’−トリフォスフェート（ｄ
ＧＴＰ）である。 「ＤＮＡ多型（ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）」；ＤＮＡ配列の２以上
の異なるヌクレオチド配列が、同じ雑種群の中に共存する状態。 「座（ｌｏｃｕｓ）」又は「遺伝子座（ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｏｃｕｓ）」；染
色体上の特異的な場所。遺伝子座の対立遺伝子は、相同染色体上の同じ位置に位
置する。 「遺伝子座特異的プライマー（ｌｏｃｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ
）」；少なくとも遺伝子座の１つの対立遺伝子に対して、示された遺伝子座又は
その相補鎖の一部で特異的にハイブリダイズするプライマーで、かつ、増幅法を
用いた状態の下で、他のＤＮＡ配列で有効にハイブリダイズしない。 「ペンタヌクレオチドタンデム反復（ｐｅｎｔａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔａ
ｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ）」；下記に定義されたＳＴＲ多型のサブクラス。別に
詳述されていなければ、「ペンタヌクレオチドタンデム反復」の用語は、反復単
位が５塩基配列である完全ＳＴＲ、及び少なくとも１つの反復単位が、５塩基反
復である不完全ＳＴＲを含む。 「ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉ
ｏｎ）」又は「ＰＣＲ」；変性、プライマーでのアニーリング、ＤＮＡポリメラ
ーゼでの伸長のサイクルが、約１０6回以上目的のＤＮＡ配列のコピーの数を増
幅するのに使用される技術。核酸増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応プロセスは
、米国特許第４６８３１９５号及び第４６８３２０２号明細書によってカバーさ
れており、プロセスの記述に対して、ここで参考として組み込む。 「多型の短いタンデム反復遺伝子座（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｓｈｏｒｔ
ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ ｌｏｃｉ）」；下記に定義された、ＳＴＲ遺伝子
座で、ゲノムＤＮＡの特別領域の繰り返し配列エレメントの数（及び配列の最終
的な長さ）が、対立遺伝子から対立遺伝子、及び個体から個体に変異する。 「多型情報量（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃｏｎ
ｔｅｎｔ）」又は「ＰＩＣ」；遺伝子座に存在する多型の量の測定（Ｂｏｓｔｅ
ｉｎら、１９８０）。ＰＩＣは、多型のより大きな程度を示すより高い値で、０
〜１．０の範囲を評価する。この測定は、一般に、測定に通常使用される他のも
のよりも小さい値を表示し、即ち、 異型接合性；高い有益な（約７０％を超える異型接合性）マーカーに対して、異
型接合性とＰＩＣとの違いは僅かである。 「プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）」；プライマーの３’末端が、ＤＮＡポリメラ
ーゼ酵素を使用する重合部位として作用するといった方法での、遺伝子座のＤＮ
Ａ鎖でハイブリダイズする１本鎖オリゴヌクレオチド又はＤＮＡフラグメント。 「プライマー対（ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒ）」；２つのプライマーを含み、プ
ライマー１は、増幅すべきＤＮＡ配列の一方の端の１本鎖にハイブリダイズし、
プライマー２は、増幅すべきＤＮＡ配列の相補鎖上のもう一方の端でハイブリダ
イズする。 「プライマー部位（ｐｒｉｍｅｒ ｓｉｔｅ）」；プライマーがハイブリダイ
ズする目的ＤＮＡの領域。 「短いタンデム反復遺伝子座（ｓｈｏｒｔ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ ｌ
ｏｃｉ）」又は「ＳＴＲ遺伝子座（ＳＴＲ ｌｏｃｉ）」；長さが３〜７塩基対
の短い、繰り返し配列エレメントを含むゲノムＤＮＡ領域。また、ＳＴＲという
用語はゲノムＤＮＡの領域を含み、単一の３〜７塩基配列よりもタンデム又は介
在塩基を伴って繰り返される。ＳＴＲで少なくとも１度繰り返された各配列は、
ここで、「反復単位」と呼ばれる。
【００２６】 本発明の材料と方法を使用して分析されたＳＴＲ遺伝子座の配列は、完全（ｐ
ｅｒｆｅｃｔ）又は不完全（ｉｍｐｅｒｆｅｃｔ）の、２つの一般的なカテゴリ
ーに分けられる。「完全」ＳＴＲという用語は、ここで使用されるときは、少な
くとも２度のタンデムで、繰り返される単一の３〜７塩基反復単位、例えば（Ａ
ＡＡＡＴ）2を含む２本鎖ＤＮＡの領域を意味する。「不完全」ＳＴＲという用
語は、ここで使用されるときは、完全な反復単位の少なくとも２つのタンデム反
復と、不完全な反復単位の少なくとも１つの反復を含むＤＮＡの領域をいい、こ
こで、不完全反復単位は、完全反復単位の配列における、１、２、３、又は４つ
の塩基の挿入、欠失、又は置換、例えば、（ＡＡＡＡＴ）12（ＡＡＡＡＡＴ）5
ＡＡＴ（ＡＡＡＴＴ）4を生じるＤＮＡ配列を含む。不完全ＳＴＲ配列毎には少
なくとも１つの完全ＳＴＲ配列が含まれる。詳細には、各ＳＴＲ配列は、完全又
は不完全のいかんにかかわらず、タンデムで少なくとも２度現れる少なくとも１
つの反復単位配列、即ち以下の式（Ｉ）で表すことのできる反復単位配列を含む
。 （ＡwＧxＴyＣz）n （Ｉ） ここで、Ａ、Ｇ、Ｔ及びＣは、どんな順でも存在するヌクレオチドを示し、ｗ、
ｘ、ｙ及びｚは、配列の各ヌクレオチドの数を示し、０〜７の範囲で変化し、ｗ
＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計は３〜７の範囲であり、ｎは、タンデムで繰り返される配列
回数の数を示し、少なくとも２である。
【００２７】 Ｂ．多重反応成分の選択 本発明の方法は、複数の共増幅される遺伝子座から増幅された対立遺伝子を生
ずるのに適切な、遺伝子座の組、プライマー及び増幅プロトコルを選択し、好ま
しくは共増幅される遺伝子座は、サイズで重複せず、より好ましくは、共増幅さ
れる遺伝子座は、サイズが重複する異なる遺伝子座の対立遺伝子間を識別するこ
とを可能にする方法で、ラベルされる。加えて、この方法は、単一の増幅プロト
コルでの使用に融和性のある、短いタンデム反復遺伝子座を選択することを企図
する。ここで説明される遺伝子座の特定の組合せは、この用途において唯一のも
のである。遺伝子座の組合せは、前述の２つの理由のどちらかによって、又はこ
れと組合せて、１以上の遺伝子座が、十分な生成物収量を生成せず又は真の対立
遺伝子を表現しないフラグメントがこの反応で生成しない理由によって、却下さ
れるかもしれない。
【００２８】 ここで開示されたものの他に成功する組合せは、遺伝子座の組合せの試行錯誤
、プライマー対の配列の選択、含まれるすべての遺伝子座が増幅できるような平
衡を特定するプライマー濃度の調整によって、生じることができる。本発明の方
法及び材料が一旦開示されれば、本発明の方法及びキットに使用する遺伝子座、
プライマー対及び増幅技術の様々な方法が当業者に対して示唆されていると考え
られる。すべてのこのような方法は、添付したクレームの範囲内にあることが企
図される。
【００２９】 本発明の方法の実施で特に重要なのは、多重増幅反応工程で共増幅される個々
の遺伝子座から調製される、共増幅された対立遺伝子座のサイズ範囲である。現
在技術によって分析を容易にするためには、５００塩基よりも小さいフラグメン
トの増幅によって検出できるシステムが、最も好ましい。
【００３０】 本発明の方法の実施は、少なくとも１３個のＳＴＲ遺伝子座を含む一組の遺伝
子座の選択で始まり、遺伝子座は、単一の多重増幅反応で共増幅される。本発明
の方法の多重増幅反応で遺伝子座を増幅するのに使用される遺伝子座とオリゴヌ
クレオチドプライマーとの選択は、これ以後に記述され、以下の実施例で説明さ
れる。
【００３１】 Ｃ．３つより多いの遺伝子座を使用して多重体を開発するための、３つの遺伝子
座の多重体の使用 いずれの異なる技術も、本発明に使用する一組の遺伝子座を選択するのに使用
することができる。この分析方法で使用する遺伝子座の有用な組を開発するため
の好ましい技術の１つが以下に記述される。３つのＳＴＲ遺伝子座を含む多重体
が一旦開発されれば、３つより多いの遺伝子座を含む多重体を作る核として使用
できる。従って、３つより多い遺伝子座の新しい組合せは、始めの３つの遺伝子
座を含んで作られる。例えば、遺伝子座Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５
Ｓ８１８を含む核となる多重体を使って、以下の誘導多重体を生成した。 Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ１５Ｓ８１８ ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＴＰＯＸ、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１
３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８ ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ
７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８ ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭｖＷＦＡ３１
、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８ Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１３Ｓ３
１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ２１Ｓ１１、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、Ｈ
ＵＭＦＩＢＲＡ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭＴＰＯＸ及びＨＵＭｖＷＦＡ３１ Ｓ１５９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３
１７及びＤ５Ｓ８１８ Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１３Ｓ３
１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ２１Ｓ１１、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、Ｈ
ＵＭＦＩＢＲＡ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭＴＰＯＸ及びＨＵＭｖＷＦＡ３１ Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１３Ｓ３
１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ２１Ｓ１１、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、Ｈ
ＵＭＦＩＢＲＡ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｇ４
７５、Ｓ１５９及びアメロゲニン
【００３２】 核となる遺伝子座の組は、本発明の方法を使用する多重体分析における、他の
適切なＳＴＲ遺伝子座の組の誘導体を生成するのに使用されることを企図する。
本発明の方法を使用して分析される遺伝子座を選択するために使用されるどんな
方法にもかかわらず、多重体分析のために選択された遺伝子座のすべては、以下
の特徴を共有する。（１）遺伝子座は、評価できるだけの十分な増幅生成物を調
製する。（２）遺伝子座は、多重増幅工程中の増幅された対立遺伝子座への塩基
の付加（又は塩基の付加なし）による人工産物でさえ、ほとんど生成しない。（
３）遺伝子座は、ポリメラーゼによる増幅反応の未熟終結による人工産物でさえ
、ほとんど生成しない。（４）遺伝子座は、供給された真の増幅された対立遺伝
子の下流の継続的な１塩基欠失から、より小さい分子量の「引きずった（ｔｒａ
ｉｌｉｎｇ）」バンドをほとんど又はまったく生成しない。例えば、Ｓｃｈｕｍ
ｍら、Ｆｏｕｒｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ
Ｈｕｍａｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ １９９３、ｐｐ．１７７−１８
７（ｐｕｂ．ｂｙ Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，１９９４）を参照されたい。
【００３３】 上述した、少なくとも３つの遺伝子座の組を特定するのに使用される同じ技術
は、本発明の分析方法の好ましい態様によれば、ヒトゲノムＤＮＡの１３個以上
の遺伝子座の選択又は多重体分析に適用できる。上述の特定された遺伝子座のど
んな組でも、本発明に従った多重体分析に適合し、提供された遺伝子座の組は、
少なくとも１３個のＳＴＲ遺伝子座を含む。より好ましくは、本発明に従って分
析された少なくとも１３個のＳＴＲ遺伝子座の少なくとも４つは、以下の遺伝子
座及びこれらの任意の組合せに係る遺伝子座から選択される。 Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ４Ｓ２３６８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ９Ｓ９３０
、Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１４Ｓ１１８、Ｄ１４Ｓ５４８、Ｄ１
４Ｓ５６２、Ｄ１６Ｓ４９０、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１６Ｓ７５３、Ｄ１７Ｓ１２
９８、Ｄ１７Ｓ１２９９、Ｄ１９Ｓ２５３、Ｄ２０Ｓ４８１、Ｄ２２Ｓ６８３、
ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭＦ１３Ａ０１、
ＨＵＭＢＦＸＩＩＩ、ＨＵＭＬＩＰＯＬ及びＨＵＭｖＷＦＡ３１ 更により好ましくは、本発明に従って分析された遺伝子座の組は、１３個のＣＯ
ＤＩＳ遺伝子座のすべて、即ち、Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０
、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ２１Ｓ
１１、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭＴＰＯ
Ｘ、及びＨＵＭｖＷＦＡ３１を含む。
【００３４】 好ましくは、本発明の多重反応の共増幅のために選択された遺伝子座の少なく
とも１つは、長さが５〜７塩基又は塩基対の反復単位を持つＳＴＲ遺伝子座であ
り、より好ましくは、ペンタヌクレオチド反復を持つＳＴＲ遺伝子座である。米
国特許出願第０９／０１８５８４号明細書で説明されているので、ここに参考と
して組み込み、このような中間の長さの反復を持つ遺伝子座は、人工産物につい
て最小の発生率で増幅され、例えば、反復のずれによる。ペンタヌクレオチド反
復を持つ３つのこのような遺伝子座、Ｇ４７５、Ｃ２２１及びＳ１５９は、直ち
に上記で特定された遺伝子座の組に含まれる。「Ｇ４７５」、「Ｃ２２１」及び
「Ｓ１５９」の用語は、ここで使われ、特定されたペンタヌクレオチド反復遺伝
子に割り当てられた名前をいい、上に参考として組み込まれた、米国特許出願第
０９／０１８５８４号明細書に記述される。それぞれの名前は、特定された各ペ
ンタヌクレオチド遺伝子座からのクローンに一致する。Ｇ４７５クローンの配列
は、配列ＩＤ番号３４として上記米国明細書に記述され、配列ＩＤ番号１０８と
して本明細書で特定される。Ｃ２２１クローンの配列は、配列ＩＤ番号２として
上記米国明細書に記述され、配列ＩＤ番号１０９として本明細書で特定される。
Ｓ１５９クローンの配列は、配列ＩＤ番号２６として上記米国明細書で記述され
、配列番号１１０として本明細書で特定される。また、Ｇ４７５、Ｃ２２１及び
Ｓ１５９の増幅に使用する特定された個々のプライマーとプライマー対は、本発
明に従って共増幅され分析される少なくとも１３個の遺伝子座の組の中の同じ遺
伝子座を増幅するのに使用される。
【００３５】 更に好ましくは、本発明に従って共増幅と分析のために選択された遺伝子座の
組は、少なくとも１３個のＳＴＲ遺伝子座に加えて少なくとも１つの遺伝子座を
含む。好ましくは、この追加の遺伝子座は、配列多型を含み、又は１個体のＤＮ
Ａを、個体群の他の個体のＤＮＡから分離する、別の特徴を含む。より好ましく
は、追加の遺伝子座は、分析されるＤＮＡサンプルのソースの性を同定する遺伝
子座である。ＤＮＡサンプルがヒトゲノムＤＮＡの場合、アメロゲニン遺伝子座
といった性同定遺伝子座が、本発明の方法に従って共増幅及び分析のために選択
されることが好ましい。アメロゲニン遺伝子座は、ＨＵＭＡＭＥＬＹ（男性のＤ
ＮＡに含まれるＹ染色体上の遺伝子座を同定するのに使用される場合）、又はＨ
ＵＭＡＭＥＬＸ（男性又は女性のＤＮＡのＸ染色体上の遺伝子座を同定するのに
使用される場合）としてＧｅｎＢａｎｋによって同定される。アメロゲニン遺伝
子座は、少なくとも１３個の短いタンデム反復遺伝子座の組と同じ多重体増幅反
応で共増幅される場合、多重体増幅反応でこの特定の遺伝子座を増幅するのに使
用される少なくとも１つのプライマーの配列は、配列ＩＤ番号８６、１０５及び
８７及びこれらの任意の組合せに係る配列を有することが好ましい。
【００３６】 Ｄ．プライマーの選択 単一の多重反応での共増幅のための一組の遺伝子座が一旦特定されると、その
組で共増幅する各遺伝子座に適合できるプライマーを決定することができる。多
重反応で使用されるプライマーの配列の選択に注意すべきである。プライマーの
不適切な選択は、増幅の不足、複数の部位での増幅、プライマーのダイマー形成
、異なる遺伝子座のプライマー配列の望ましくない相互作用、別の遺伝子座の対
立遺伝子と重複するある遺伝子座の対立遺伝子の生成、又は多重体に不適合な異
なる遺伝子座に対する増幅の条件又はプロトコルの必要性といった、いくつかの
望ましくない効果を生む。好ましくは、本発明の方法で使用されるプライマー又
は本発明のキットに含まれるプライマーは、以下の選択プロセスに従って選択さ
れる。
【００３７】 好ましくは、プライマーは、本発明の多重系での使用のために開発及び選択さ
れ、選択するプライマー配列の反復プロセスを使用すること、選択された遺伝子
座の共増幅のプライマーを混合すること、遺伝子座を共増幅すること、次に共増
幅された生成物を分離し検出することによって開発され選択される。当初、この
プロセスは、しばしば、不均衡な型（即ち、他の遺伝子座の生成物収量よりもい
くつかの遺伝子座の生成物収量が高い）で増幅された対立遺伝子を生じ、また、
対立遺伝子自体を表現しない増幅生成物を生成する。これらの余分なフラグメン
トは、上述した原因のかなり多くのものから生ずる。
【００３８】 多重系からこのような余分なフラグメントを除くために、組全体の個々のプラ
イマーは、同じ又は他の遺伝子座のプライマーと一緒に使用して、余分なフラグ
メントの増幅に寄与するプライマーを特定する。１つ以上のフラグメントを生成
する２つのプライマーが一旦特定されると、１対のみ又は多重系（又は多重系の
サブセット）のどちらにおいても、一方又は両方の寄与物は、変更され再試験さ
れる。このプロセスは、余分なフラグメントのない又は多重系の余分なフラグメ
ントの許容できるレベルの増幅された対立遺伝子座の生成物収量の評価まで繰り
返される。
【００３９】 時折、余分なフラグメントは、プライマー対の反対のプライマーを標識するこ
とによって除かれる。この変化は、検出工程での反対のプライマーの生成物を示
す。この新たな標識されたプライマーは、真の対立遺伝子を生成する、先にラベ
ルされたプライマーよりもさらに高い忠実度で真の対立遺伝子を増幅し、全増幅
生成物のほとんどの割合を占める。
【００４０】 プライマー濃度の決定は、最終のプライマー配列の選択前又は選択後のどちら
かで行うが、好ましくは、その選択後に行う。一般的に、特定の遺伝子座に対す
るプライマー濃度の増加は、その遺伝子座に対して生じる生成物の量を増加する
。しかしながら、これは、相互に反復するプロセスであり、１つの遺伝子座の収
量を増加することによって、１つ以上の他の遺伝子座の収量が減少するからであ
る。その上、プライマーは、直ちに他の遺伝子座の収量と相互に作用する。プラ
イマー濃度の直線的な増加は、対応する遺伝子座における生成物収量の直線的増
加を必ずしも生じない。
【００４１】 また、遺伝子座と遺伝子座の平衡は、増幅プロトコルの多くのパラメータによ
って影響され、例えば使用された鋳型の量、増幅サイクルの数、温度サイクルプ
ロトコルのアニーリング温度及びサイクルプロセスの終りでの余分な伸張工程の
包含と排除といったパラメータに影響される。すべての対立遺伝子座及び遺伝子
座に渡る平衡でさえ、一般的に、達成されない。
【００４２】 また、多重系の開発のプロセスは、上述とは別の意味で、相互に反復するプロ
セスであってもよい。即ち、まず、少数の遺伝子座における多重系を開発するこ
とが可能であり、即ちこの系は、増幅の余分なフラグメントを逃れるか又はほと
んど逃れる。この系のプライマーは、１つ以上の追加の遺伝子座のプライマーと
結合してもよい。この拡張されたプライマーの組合せは、増幅の余分なフラグメ
ントを生成するかも知れないし又は生成しないかもしれない。順番に、新しいプ
ライマーは、導入されて評価されてもよい。
【００４３】 上述の１つ以上の相互に反復する選択プロセスは、完全なプライマーの組が特
定されるまで繰り返され、完全なプライマーの組は、上述したように、共増幅の
ために選択された少なくとも１３個の遺伝子座を共増幅するのに使用される。多
くの異なるプライマーの組を、特定の遺伝子座の組を増幅するのに開発できるこ
とがわかる。
【００４４】 本発明の方法で使用されるプライマーの合成は、当業者に公知のオリゴヌクレ
オチド合成の標準的な手順を用いて実施される。好ましくは、各遺伝子座に対す
る少なくとも１つのプライマーは、以下のセクションＦで述べるように、色素ラ
ベルと共有結合される。
【００４５】 以下の表１は、表中に挙げられた対応する多型ＳＴＲ遺伝子座の増幅に使用す
るのに適切であると決定されたプライマーの配列のリストを提供する。好ましく
は、表１に挙げられた少なくとも１つのプライマーは、上述の、共増幅及び分析
のために選択された少なくとも１つの遺伝子座を増幅するのに使用される。他の
プライマーによって、プライマーが以下に挙げられた遺伝子座の同時増幅に適切
であることを特定できることがわかる。
【表１】
【表２】
【００４６】 Ｅ．ＤＮＡサンプルの調製 ゲノムＤＮＡサンプルは、本発明の方法に使用するために調製され、ＤＮＡの
増幅に適合性のあるＤＮＡ調製方法を使用する。このような多くの方法は、当業
者に公知である。この例として、フェノール抽出によるＤＮＡ精製（Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ，Ｊ．，ら（１９９８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．，ｐｐ．９．１４−９．１
９）、及び塩析による部分的精製（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．ら（１９９８）Ｎｕｃｌ
．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６:１２１５）又はチレックス（ｃｈｅｌｅｘ）（Ｗ
ａｌｓｈら、（１９９１） Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １０：５０６−５
１３，Ｃｏｍｅｙ，ら（１９９４）Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉ．３９：１２５４
）及び未処理血液を使用する未精製材料の遊離（Ｂｕｒｃｋｈａｒｄｔ，Ｊ（１
９９４） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ３：
２３９−２４３，ＭｃＣａｂｅ，Ｅｄｗａｒｄ Ｒ．Ｂ．，（１９９１） ＰＣ
Ｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １：９９−１０６，
Ｍｏｒｄｖａｇ，Ｂｙｏｒｎ−Ｙｎｇｖａｒ（１９９２） Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ １２：４ ｐｐ．４９０−４９２）によるＤＮＡ精製が挙げられる
が、これらに限定されない。
【００４７】 本発明の方法を使用して分析された少なくとも１つのＤＮＡサンプルがヒトゲ
ノムＤＮＡである場合、そのＤＮＡは、好ましくは、血液、精液、膣細胞、毛、
唾液、尿、骨、口内サンプル、胎盤細胞又は胎児細胞を含む羊水、絨毛膜絨毛、
及び上記に挙げた組織の混合物又はこれらの任意の組合せに係る組合せから選択
された組織から調製される。
【００４８】 任意に、ＤＮＡ濃度は、本発明の方法を用いる前に測定され、当業者に公知の
ＤＮＡ定量の標準的な方法を使用する。このような場合、好ましくは、ＤＮＡ濃
度は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９），ｓｕｐｒａ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ
Ｅ．５によって記述された分光光度計測定によって決定するか、又は例えばＢ
ｒｕｎｋ Ｃ．Ｆ．，ら（１９７９），Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ９２：４９
７−５００によって記述された測定技術を使用して蛍光定量的に決定される。よ
り好ましくは、ＤＮＡ濃度は、ヒト特異的プローブでＤＮＡスタンダードのハイ
ブリダイゼーションの量を比較することによって測定され、例えばＷａｙｅ，Ｊ
．Ｓ．ら（１９９１）“Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｑｕ
ａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ｄｅｏｘｙｒ
ｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ （ＤＮＡ） ｉｎ ｆｏｒｅｎｓｉｃ ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ：ｃａｓｅｗｏｒｋ ｅｘａｍｐｌｅｓ”，Ｊ
．Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉ．，３６：１１９８−１２０３に記述されている。
増幅反応における非常に多量の鋳型ＤＮＡの使用は、真の対立遺伝子を表さない
過剰なバンドとして示される人工産物を生成する。
【００４９】 Ｆ． ＤＮＡの増幅 ゲノムＤＮＡのサンプが一旦調製されると、目的にされた遺伝子座は、本発明
の多重増幅工程で共増幅される。多くの異なる増幅方法の一つは、遺伝子座を増
幅するのに使用され、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．
，ら（１９８５），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３５０−１３５４）、増幅の基
礎を形成する転写（Ｋｗｏｈ，Ｄ．Ｙ．及びＫｗｏｈ，Ｔ．Ｊ．（１９９０），
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｏｃ
ｔｏｂｅｒ，１９９０）及び鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅ
ｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．Ｔ．，ら
（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：３
９２−３９６）を含むが、これらに限定されない。好ましくは、ＤＮＡサンプル
は、組の各遺伝子座に特異的なプライマー対を使用してＰＣＲ増幅にかけられる
。参考に、以下の実施例で使用されるプライマー配列の詳細において、本明細書
の最後に配列一覧表にし、プライマー配列のいくつかは、本発明の別の態様であ
る。
【００５０】 好ましくは、各遺伝子座における少なくとも１つのプライマーは、色素ラベル
と共有結合し、蛍光色素ラベルが更に好ましい。プライマー及びプライマーに結
合された色素は、好ましくは、多重増幅反応のために選択され、例えば、好まし
くは、対立遺伝子がゲルまたはキャピラリー電気泳動で分離される場合、１色で
標識された各遺伝子座のプライマーを使用して増幅された対立遺伝子は、同じ色
で標識されたプライマーを使用して共増幅された組の他の遺伝子座の対立遺伝子
と重複しないことが好ましい。
【００５１】 本発明の方法の特にこのましい態様において、多重反応で共増幅された各遺伝
子座のための少なくとも１つのプライマーは、反応で使用されるよりも先に、蛍
光ラベルで標識される。本発明で使用するプライマーへの結合に適切な蛍光ラベ
ルは、市販で入手できる。例えば、ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓのフルオレセインラベル及びカルボキシテトラメ
チルローダミンラベル及びこれらの化学的誘導体を参照されたい。最も好ましく
は、少なくとも３つの異なるラベルが、多重増幅反応に使用される異なるプライ
マーを標識するのに使用される。サイズマーカーが多重反応を評価するために含
まれる場合、サイズマーカーを調製するのに使用されるプライマーは、反応で重
要な遺伝子座を増幅するのに使用されるプライマーと異なるラベルで標識される
ことが好ましい。
【００５２】 本発明の方法で使用する最も好ましい遺伝子座の各組合せにおける、最も好ま
しい増幅プロトコルの詳細は、以下の実施例で与えられる。また、各多重体に関
する特別の手順の付加的な詳細については、実施例を参照されたい。実施例で使
用される遺伝子座特異的プライマーの配列は、多くのヌクレオチドを含み、ヌク
レオチドは、ハイブリダイゼーションで使用される条件下で、増幅され且つ他の
遺伝子座の対立遺伝子の増幅の本質的にない遺伝子座の対立遺伝子とハイブリダ
イズするのに十分である。Ｓｉｍｏｎｓの米国特許第５１９２６５９号明細書が
参考になり、明細書の教示を、遺伝子座特異的プライマーのより詳細な開示にお
ける参考として、ここで組み込む。
【００５３】 Ｇ． ＤＮＡフラグメントの分離及び検出 一組の増幅された対立遺伝子が本発明の多重増幅工程から一旦調製されると、
増幅された対立遺伝子が評価される。この方法の評価工程は、多くの異なる方法
によって行われるが、最も好ましい方法は、以下に記述される。
【００５４】 好ましくは、電気泳動は、多重増幅反応の生成物を分離するのに使用され、更
に好ましくは、キャピラリー電気泳動（例えば、Ｂｕｅｌ，Ｅｒｉｃら（１９９
８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；４３：（１
）ｐｐ．１６４−１７０を参照されたい）又は、変性ポリアクリルアミドゲル電
気泳動（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９）ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅ
ｄｉｔｉｏｎ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１３．４５−１３．５７を参照されたい）である。本発明
の方法の評価工程での使用に適切なゲル調製及び電気泳動手順と条件は、以下の
実施例で説明される。変性ポリアクリルアミドゲル及びキャピラリー電気泳動で
のＤＮＡフラグメントの分離は、第１にフラグメントサイズに基づいて起こる。
【００５５】 増幅された遺伝子座が一旦分離されると、次に、ゲル又はキャピラリー中の対
立遺伝子及び他のＤＮＡ（例えば、ＤＮＡサイズマーカー又は対立遺伝子ラダー
）は、視覚化され、分析される。ゲル中のＤＮＡの視覚化は、多くの従来技術の
いずれか一つを使用して行われ、例えば、銀染色や、ラジオアイソトープ、蛍光
剤、化学発光剤及び検出可能な基質と組み合わせた酵素といったレポーターを含
む。しかしながら、１３個又はそれ以上の遺伝子座を含む多重体の検出に好まし
い方法は、蛍光であり（例えば、上記Ｓｃｈｕｍｍ，Ｊ．Ｗ．ら Ｐｒｏｃｃｅ
ｄｉｎｇｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｅｉｇｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓ
ｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，（ｐｕ
ｂ．１９９８ ｂｙ Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）ｐｐ．７８−
８４；Ｂｕｅｌ，Ｅｒｉｃら（１９９８），を参照されたい）、多重反応の各遺
伝子座のプライマーは、蛍光検出器を使用する標識生成物の検出によって追跡さ
れる。遺伝子座を視覚化する従来技術の方法を記述する、上記に引用された参考
文献を、ここに参考として組み込む。
【００５６】 好ましくは、ＤＮＡサンプルに存在する対立遺伝子は、ＤＮＡマーカーや遺伝子
座特異的対立遺伝子ラダーといったサイズスタンダードとの比較によって決定さ
れ、サンプル中の各遺伝子座に存在する対立遺伝子を決定する。２つ以上の多重
ＳＴＲ遺伝子座を含む多重増幅の評価における最も好ましいサイズマーカーは、
評価される各遺伝子座の対立遺伝子ラダーの組合せを含む。例えば、Ｐｕｅｒｓ
，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈら（１９９３）Ａｍ Ｊ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．５３：９
５３−９５８，Ｐｕｅｒｓ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈ，ら（１９９４）Ｇｅｎｏｍｉ
ｃｓ ２３：２６０−２６４を参照されたい。また、ＳＴＲ遺伝子座の検出の使
用に適切な対立遺伝子ラダーの開示、及びそれに開示されたラダー作製の方法に
おいて、米国特許第５５９９６６６号、同第５６７４６８６号及び同第５７８３
４０６号明細書を参照されたい。
【００５７】 個々の遺伝子座の対立遺伝子ラダーの作製に続いて、増幅されたサンプルの装
入が起こると同時に、これらの対立遺伝子ラダーを混合し、ゲル電気泳動におい
て装入してもよい。各対立遺伝子ラダーは、対応する遺伝子座のサンプルの対立
遺伝子と一緒に移動する。
【００５８】 本発明の多重反応の生成物は、インターナルレーンスタンダード、即ちポリア
クリルアミドゲルの同じレーン又は同じキャピラリーで進むように設定されたサ
イズマーカーの特定タイプを使用して評価される。このインターナルレーンスタ
ンダードは、好ましくは、既知の長さの一連のフラグメントを含む。更に好まし
くは、インターナルレーンスタンダードは、増幅反応で他の色素と区別できる蛍
光色素で標識される。
【００５９】 インターナルレーンスタンダードの作製に続いて、このスタンダードもまた、
増幅されたサンプル又は対立遺伝子ラダーと混合され、ゲル電気泳動の異なるレ
ーンでの移動の比較、又はキャピラリー電気泳動の異なるキャピラリーでの移動
の比較のための電気泳動に装入される。インターナルレーンスタンダードの移動
の変化は、分離媒体の性能の変化を示す。対立遺伝子ラダーでこの差と相関を定
量化することよって、未知のサンプルの対立遺伝子のサイズ決定の訂正ができる
。
【００６０】 Ｈ．好ましい検出技術：蛍光検出 本発明の方法の最も好ましい態様の一つ、蛍光検出は、多重増幅反応によって
生成された混合物の中の増幅対立遺伝子を評価するのに使用される。以下は、好
ましい検出方法が実施される方法の概要である。
【００６１】 自動化蛍光イメージングの出現で、多重増幅生成物のより早い検出と分析が行
なわれる。蛍光分析において、１つの蛍光標識プライマーは、各遺伝子座の増幅
に含まれる。好ましくは、本発明の使用に適合する蛍光標識プライマーは、例え
ば、以下の実施例で説明されるように、フルオレセイン標識（ＦＬ−）、カルボ
キシテトラメチルローダミン標識（ＴＭＲ−）、及び５，６−カルボキシローダ
ミン６Ｇ標識（Ｒ６Ｇ）プライマーを含む。このように標識されたプライマーを
使用する増幅フラグメント生成物の分離は、好ましくは、スラブゲル電気泳動又
はキャピラリー電気泳動で行われる。分離フラグメントの結果は、例えば、ＡＢ
Ｉ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＡＢ
Ｉ ＰＲＩＳＭ ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅ
ｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、又はＨｉｔａｃｈｉ ＦＭＢＩＯ（登録商標）ＩＩ Ｆ
ｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ａｍｅｒｉａ，Ｌｔｄ．Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａ
ｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）といった蛍光検出装置を使用して分析される。
【００６２】 概要中、本発明の方法は、最も好ましくは、検出工程として蛍光検出を用いて
実施される。この好ましい検出方法において、多重増幅反応で使用される各プラ
イマー対の一方または両方は、プライマー対に結合された蛍光ラベルを有し、そ
の結果、増幅反応から生成された増幅対立遺伝子は、蛍光標識される。本発明の
最も好ましいこの態様において、増幅された対立遺伝子は、キャピラリー電気泳
動で同時に分離され、分離された対立遺伝子は、蛍光イメージアナライザーを使
用して視覚化され、分析される。
【００６３】 蛍光検出は、放射性標識の方法及び検出以上に好ましく、放射性材料の使用を
要求されず、及びこのような材料の使用に付随する規制の問題及び安全性の問題
のすべてを要求されないからである。
【００６４】 また、標識プライマーを使用する蛍光検出は、他の非放射性の、例えば、銀染
色といった検出方法以上に好ましく、一般的に、蛍光の検出方法は、銀染色より
増幅人工産物を示さないからである。人工産物が少ないのは、一部分には、結合
標識を持つＤＮＡの増幅鎖だけが蛍光検出で検出され、一方、多重増幅反応から
生成されたＤＮＡの各増幅対立遺伝子の両方の鎖が、銀染色の検出方法を使用し
て染色され、検出されることによる。
【００６５】 Ｉ．キット また、本発明は、上述のプロセスを利用するキットに関する。基本的なキット
は、１以上の遺伝子座特異的プライマーを有する容器を含む。任意で使用説明書
を含んでもよい。
【００６６】 他の任意のキット構成物は、特定の各遺伝子座に関する対立遺伝子ラダー、増
幅のための十分な量の酵素、増幅を促進する増幅緩衝液、電気泳動用の増幅され
た材料を分離するための添加液、鋳型コントロールとしてのゲノムＤＮＡ、分離
媒体中で先行して材料が移動することを保証するサイズマーカー、及び使用者を
教育し、使用中の失敗を防ぐためのプロトコルとマニュアルを含んでもよい。ま
た、キットの様々な試薬の量は、多くの要因、例えば工程の最適感度といった要
因によって変化する。手動で使用するためのテストキットや自動検出又は分析で
使用するためのテストキットを提供することは、本発明の範囲内である。
【００６７】
【実施例】
以下の実施例において、本発明の利点を説明し、及び当業者が本発明を製造及
び使用において補助するために提示される。実施例は、例示として意図され、特
許によって認められる本発明の範囲を何ら制限するものではない。
【００６８】 以下の実施例でアッセイされたヒトゲノムＤＮＡサンプルは、血液又は組織培
養細胞から調製され、Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｄｙｋｅｓ ｉｎ （Ｍｉｌｌｅ
ｒ，Ｓ．ら（１９９８）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：１２１５）に
よって記述された標準的な手順を用いた。ここで記述された単離及び定量方法は
、一般に、当業者に公知であり、好ましくは、本発明の適用において、要求され
ない。
【００６９】 以下の各実施例は、本発明の方法を用いた例であり、ヒトゲノムＤＮＡの１つ
以上のＤＮＡサンプルから、少なくとも１３個の遺伝子座に存在する対立遺伝子
を同時に決定する。以下の共増幅された遺伝子座の各組は、ＣＯＤＩＳシステム
における使用のために特定された１３個の短いタンデム反復遺伝子座（即ち、Ｄ
３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、ＨＵＭｖＷＦＡ
３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ
１３Ｓ３１７、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１６Ｓ５３９、及びＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ）を含
む。また、以下の共増幅された遺伝子座のいくつかの組は、１つ以上の追加の短
いタンデム反復遺伝子座、例えば、ペンタヌクレオチド反復を持つ遺伝子座（例
えば、Ｇ４７５、Ｓ１５９、又はＣ２２１）及び非ＳＴＲ遺伝子座、すなわちア
メロゲニンを含む。
【００７０】 表２は、遺伝子座の組が、以下の各実施例で記述される多重増幅反応で共増幅
されたことを要約する。また、この表は、プライマー対が、このような各多重反
応でこのような各遺伝子座を増幅するのに使用されることを示す。表２に挙げら
れた各プライマー対の１つのプライマーは、多重増幅反応で使用される前に、蛍
光標識される。いくつかの場合では、異なるラベルが、異なる遺伝子座に対する
プライマーを標識するのに使用され、異なるプライマーを使用して生成された対
立遺伝子は、レーザー活性蛍光検出装置で検出される場合に、別の対立遺伝子か
ら区別できる。
【００７１】 ３種の異なる蛍光ラベルは、以下の実施例で使用され、フルオレセイン標識を
示す「ＦＬ」、カルボキシテトラメチルローダミン標識を示す「ＴＭＲ」、５，
６−カルボキシローダミン６Ｇを示す「Ｒ６Ｇ」として、以下に、表２に記述さ
れる。また、表２は、多重増幅反応で使用されるプライマーの各対のプライマー
が、各実施例で標識されたことを示す（例えば、「ＦＬ−６９」は、配列ＩＤ番
号６９を有するプライマーが、多重増幅反応で使用される前にフルオレセインで
５’末端に標識されたことを意味する）。しかしながら、各実施例の本文におい
て、ラベルの略語は、本文に記載された増幅反応で使用される標識プライマーの
配列ＩＤ番号の直前に配置される（例えば、「ＦＬ−２」の代わりに「ＦＬ−配
列ＩＤ番号２」）。
【表３】
【表４】
【表５】
【００７２】
【実施例１】 ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標） ３１０ Ｇｅｎｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ で検出された、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１ ８Ｓ５１、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩ ＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、及び ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯの多重増幅の蛍光検出 この実施例において、ＤＮＡ鋳型を、単一の反応容器で、個々の遺伝子座Ｄ３
Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、ＨＵＭｖＷＦＡ３
１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７
Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、及びＨＵＭＣＳＦ１ＰＯで同時に
増幅した。ＰＣＲ増幅を、２５μｌの１×Ｇｏｌｄ ＳＴ*Ｒ緩衝液（５０ｍＭ
ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．３）、０．１％Ｔｒ
ｉｔｏｎ Ｘ−１００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１６０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ
及び各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）中で実施し、
１ｎｇの鋳型及び３．２５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡ
ポリメラーゼを使用した。ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ
９６００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を、以
下の増幅プロトコルで使用した。９６℃で１２分、次に、９４℃で３０秒、６８
秒で５８℃にし、３０秒保持、５０秒で７０℃にし、４５秒保持を１０サイクル
、続いて、３０秒で９０℃、６０秒で５８℃にし、３０秒保持、５０秒で７０℃
にし、４５秒保持を２０サイクル、続いて、６０℃で３０分を１サイクル行なっ
た。
【００７３】 ２６個の増幅プライマーを、組み合わせて使用し、そのなかに、０．１２μＭ
の各Ｄ３Ｓ１３５８プライマー１［配列ＩＤ番号６８］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ
番号６９］、０．０８μＭの各ＨＵＭＴＨ０１プライマー１［ＦＬ−配列ＩＤ番
号６６］及び２［配列ＩＤ番号６７］、０．３μＭの各Ｄ２１Ｓ１１プライマー
１［配列ＩＤ番号６４］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号６５］、０．２μＭの各Ｄ
１８Ｓ５１プライマー１［ＦＬ−配列ＩＤ番号６２］及び２［ＴＭＲ−配列ＩＤ
番号６３］、１．１μＭの各ＨＵＭｖＷＦＡ３１プライマー１［配列ＩＤ番号７
６］及び２［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号４０］、１．８μＭの各Ｄ８Ｓ１１７９プラ
イマー１［配列ＩＤ番号７４］及び２［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号７５］、０．６μ
Ｍの各ＨＵＭＴＰＯＸプライマー１［配列ＩＤ番号７２］及び２［ＴＭＲ−配列
ＩＤ番号７３］、２．４μＭの各ＨＵＭＦＩＢＲＡプライマー１［ＴＭＲ−配列
ＩＤ番号７０］及び２［配列ＩＤ番号７１］、０．２μＭの各Ｄ５Ｓ８１８プラ
イマー１［配列ＩＤ番号８４］及び２［Ｒ６Ｇ−配列ＩＤ番号８５］、０．１μ
Ｍの各Ｄ１３Ｓ３１７プライマー１［配列ＩＤ番号８２］及び２［Ｒ６Ｇ−配列
ＩＤ番号８３］、０．２μＭの各Ｄ７Ｓ８２０プライマー１［Ｒ６Ｇ−配列ＩＤ
番号８０］及び２［配列ＩＤ番号８１］、０．１５μＭの各Ｄ１６Ｓ５３９プラ
イマー１［配列ＩＤ番号２９］及び２［Ｒ６Ｇ−配列ＩＤ番号７９］、０．２μ
Ｍの各ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯプライマー１［配列ＩＤ番号７７］及び２［Ｒ６Ｇ−
配列ＩＤ番号７８］を含む。
【００７４】 増幅した生成物を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌ
ｙｚｅｒを使用して分離した。ＤＮＡサンプルを、２４μｌの添加液（脱イオン
ホルムアミド）と１．０μｌのインターナルレーンサイズスタンダードと一緒に
混合し、９５℃で３分間変性させ、注入の前に氷で冷却した。分離は、４７ｃｍ
×５０μｍキャピラリーで、Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｐ
ｏｌｙｍｅｒ ４（ＰＯＰ−４）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して行なった。製造業者のＧｅ
ｎｅＳｃａｎ（登録商標）ランモジュールＧＳ ＳＴＲ ＰＯＰ４（ｌｄ．）（
１ｍｌ）を使用した。電気泳動の条件は、５秒の注入、注入ｋＶは１５．０、泳
動ｋＶは１５．０、泳動温度は６０℃、泳動時間は２８分、及び仮フィルターＡ
を使用、であった。
【００７５】 図１Ａは、上述のように、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎ
ａｌｙｚｅｒで分離され検出された各遺伝子座の増幅されたフラグメントをスキ
ャニングした結果のプリントアウトである。図１Ａは、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８
、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ
１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、
Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９及びＨＵＭＣＳＦ１ＰＯにおける同時に共増幅
されたＤＮＡサンプルの増幅生成物を示す。パネルＡに示されたピークは、フル
オレセインで標識され、パネルＢに示されるピークは、カルボキシテトラメチル
ローダミンで標識され、パネルＣに示されるピークは、５、６カルボキシローダ
ミン６Ｇで標識される。
【００７６】 図１Ｂは、増幅反応にＤＮＡ鋳型を使用しないことを除けば、図１Ａでスキャン
されたサンプルと同じ方法で調製されたサンプルをスキャニングした結果のプリ
ントアウトである。この図のピークは、色素コンジュゲーション及び精製の手順
から生ずる、及び不確定な原因から生ずる、バックグラウンド生成物である。
【００７７】
【実施例２】 ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０ Ｇｅｎｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒで 検出された、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８ Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵ ＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７ 、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＳ１５９の多重増幅の蛍光検出 この実施例において、ＤＮＡ鋳型を、単一反応容器で、個々の遺伝子座Ｄ３Ｓ
１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲ
ニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲ
Ａ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣ
ＳＦ１ＰＯ及びＳ１５９で同時に増幅した。ＰＣＲ増幅を、２５μｌの１×Ｇｏ
ｌｄ ＳＴ*Ｒ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５
℃でＰＨ８．３）、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ 2 、１６０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ及び２００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰ）で行ない、１ｎｇの鋳型、及び４ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏ
ｌｄ ＤＮＡポリメラーゼを使用した。ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ
９６００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を、
以下の増幅プロトコルで使用した。９６℃で１２分、次に、９４℃で３０秒、６
８秒で５８℃にし、３０秒保持、５０秒で７０℃にし、４５秒保持を１０サイク
ル、続いて、９０℃で３０秒、６０秒で５８℃にし、３０秒保持、５０秒で７０
℃にし、４５秒保持を２０サイクル、続いて、６０℃で３０分を１サイクル行な
った。
【００７８】 ３２個の増幅プライマーを、組み合わせて使用し、そのなかに、０．１２μＭ
の各Ｄ３Ｓ１３５８プライマー１［配列ＩＤ番号６８］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ
番号６９］、０．０８μＭの各ＨＵＭＴＨ０１プライマー１［ＦＬ−配列ＩＤ番
号６６］及び２［配列ＩＤ番号６７］、０．３μＭの各Ｄ２１Ｓ１１プライマー
１［配列ＩＤ番号６４］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号６５］、０．２μＭの各Ｄ
１８Ｓ５１プライマー１［ＦＬ−配列ＩＤ番号６２］及び２［配列ＩＤ番号６３
］、０．２４μＭの各Ｇ４７５プライマー１［ＦＬ−配列ＩＤ番号８８］及び２
［配列ＩＤ番号８９］、０．６μＭの各アメロゲニンプライマー１［ＴＭＲ−配
列ＩＤ番号８６］及び２［配列ＩＤ番号８７］、１．１μＭの各ＨＵＭｖＷＦＡ
３１プライマー１［配列ＩＤ番号７６］及び２［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号４０］、
１．８μＭの各Ｄ８Ｓ１１７９プライマー１［配列ＩＤ番号７４］及び２［ＴＭ
Ｒ−配列ＩＤ番号７５］、０．６μＭの各ＨＵＭＴＰＯＸプライマー１［配列Ｉ
Ｄ番号７２］及び２［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号７３］、２．４μＭの各ＨＵＭＦＩ
ＢＲＡプライマー１［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号７０］及び２［配列ＩＤ番号７１］
、０．２μＭの各Ｄ５Ｓ８１８プライマー１［配列ＩＤ番号８４］及び２［Ｒ６
Ｇ−配列ＩＤ番号８５］、０．１μＭの各Ｄ１３Ｓ３１７プライマー１［配列Ｉ
Ｄ番号８２］及び２［Ｒ６Ｇ−配列ＩＤ番号８３］、０．２μＭの各Ｄ７Ｓ８２
０プライマー１［Ｒ６Ｇ−配列ＩＤ番号８０］及び２［配列ＩＤ番号８１］、０
．１５μＭの各Ｄ１６Ｓ５３９プライマー１［配列ＩＤ番号２９］及び２［Ｒ６
Ｇ−配列ＩＤ番号７９］、０．２μＭの各ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯプライマー１［配
列ＩＤ番号７７］及び２［Ｒ６Ｇ−配列ＩＤ番号７８］、０．１μＭの各Ｓ１５
９プライマー１［配列ＩＤ番号９０］及び２［Ｒ６Ｇ−配列ＩＤ番号９１］を含
む。
【００７９】 増幅された生成物を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して分離した。ＤＮＡサンプルを、２４μｌの添加
液（脱イオンホルムアミド）と１．０μｌのインターナルレーンサイズスタンダ
ードを混合し、９５℃で３分間変性させ、注入の前に氷で冷却した。分離は、４
７ｃｍ×５０μｍキャピラリーで、Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｏｐｔｉｍｉｚｅ
ｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ ４（ＰＯＰ−４）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して行なった。製造業者
のＧｅｎｅＳｃａｎランモジュールＧＳ ＳＴＲ ＰＯＰ４（ｌｄ．）（１ｍｌ
）Ａを使用した。電気泳動の条件は、５秒の注入、注入ｋＶは１５．０、泳動ｋ
Ｖは１５．０、泳動温度は６０℃、泳動時間は２８分、及び仮フィルターＡを使
用、であった。
【００８０】 図２Ａは、上述のように、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒで分離され検出された各遺伝子座の増幅されたフラグメ
ントをスキャニングした結果のプリントアウトである。図２Ａは、遺伝子座Ｄ３
Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロ
ゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢ
ＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭ
ＣＳＦ１ＰＯ及びＳ１５９における同時に共増幅されたＤＮＡサンプルの増幅生
成物を示す。パネルＡに示されたピークは、フルオレセインで標識され、パネル
Ｂに示されるピークは、カルボキシテトラメチルローダミンで標識され、パネル
Ｃに示されるピークは、５、６カルボキシローダミン６Ｇで標識される。
【００８１】 図２Ｂは、増幅反応にＤＮＡ鋳型を使用しないことを除けば、図２Ａでスキャン
されたサンプルと同じ方法で調製されたサンプルをスキャニングした結果のプリ
ントアウトである。この図のピークは、色素コンジュゲーション及び精製の手順
から生ずる、及び不確定な原因から生ずる、バックグラウンド生成物である。
【００８２】
【実施例３】 ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで検出 された、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５ １、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴ ＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ １６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＳ１５９の多重増幅の蛍光検出 この実施例において、ＤＮＡ鋳型を、実施例２と同様に増幅した。増幅生成物
を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを使
用して分離した。これを、０．２ｍｍ厚さの、５％Ｌｏｎｇ Ｒａｎｇｅｒ（商
標出願中）Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、Ｒｏｃｋ
ｌａｎｄ、ＭＥ）、７Ｍのウレアゲルを使用して実施した。ＤＮＡサンプルを、
１．５μｌの添加液（８８．２５％ホルムアミド、４．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５
ｍｇ／ｍｌブルーデキストラン）及び０．５μｌのインターナルレーンサイズス
タンダードと混合し、９５℃で２分間変性させ、装入する前に氷で冷却した。電
気泳動を、Ｐｒｅｒｕｎ（ＰＲ ＧＳ ３６Ａ−２４００）及びＲｕｎ（ＧＳ
３６Ａ−２４００）用の、製造業者のＧｅｎｅＳｃａｎ（登録商標）モジュール
を使用して行なった。泳動時間は３時間で、仮フィルターＡを用いた。
【００８３】 図３Ａは、上述のように、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅｒで分離され検出された各遺伝子座の増幅されたフラグメントをスキャニ
ングした結果のプリントアウトである。図３Ａは、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、Ｈ
ＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭ
ｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８
１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及
びＳ１５９における同時に共増幅されたＤＮＡサンプルの増幅生成物を示す。パ
ネルＡに示されたピークは、フルオレセインで標識され、パネルＢに示されるピ
ークは、カルボキシテトラメチルローダミンで標識され、パネルＣに示されるピ
ークは、５、６カルボキシローダミン６Ｇで標識される。
【００８４】 図３Ｂは、増幅反応にＤＮＡ鋳型を使用しないことを除けば、図３Ａでスキャン
されたサンプルと同じ方法で調製されたサンプルをスキャニングした結果のプリ
ントアウトである。この図のピークは、色素コンジュゲーション及び精製の手順
から生ずる、及び不確定な原因から生ずる、バックグラウンド生成物である。
【００８５】
【実施例４】 Ｈｉｔａｃｈｉ ＦＭＢＩＯ（登録商標）ＩＩ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｓ ｃａｎｎｅｒで検出された、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１ Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ １１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、 Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＳ１５９の多重増幅 の蛍光検出 この実施例において、２つのＤＮＡ鋳型を、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭ
ＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷ
ＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８
、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＳ
１５９又はこれらの任意の組合せに係る遺伝子座から選択されたの３つの異なる
遺伝子座の各々で同時に各々増幅した。各遺伝子座の組合せの増幅において、単
一の反応容器に５ｎｇの鋳型を含め、反応容器に、２５μｌの１×Ｇｏｌｄ Ｓ
Ｔ*Ｒ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でＰＨ
８．３）、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１６
０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ及び２００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄ
ＴＴＰ）を含めた。
【００８６】 ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を、以下の増幅プロトコルで使用
した。９６℃で１２分、次に、９４℃で３０秒、６８秒で５８℃にし、３０秒保
持、５０秒で７０℃にし、４５秒保持を１０サイクル、続いて、９０℃で３０秒
、６０秒で５８℃にし、３０秒保持、５０秒で７０°にし、４５秒保持を２２サ
イクル、続いて、６０℃で３０分を１サイクル行なった。
【００８７】 ３２個の増幅プライマーを、以下の濃度で使用し、その中に、０．２２５μＭ
の各Ｄ３Ｓ１３５８プライマー１［配列ＩＤ番号６８］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ
番号６９］、０．２μＭの各ＨＵＭＴＨ０１プライマー１［ＦＬ−配列ＩＤ番号
６６］及び２［配列ＩＤ番号６７］、１．０μＭの各Ｄ２１Ｓ１１プライマー１
［配列ＩＤ番号６４］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号６５］、１．０μＭの各Ｄ１
８Ｓ５１プライマー１［ＦＬ−配列ＩＤ番号６２］及び２［配列ＩＤ番号６３］
、２．８μＭの各Ｇ４７５プライマー１［ＦＬ−配列ＩＤ番号８８］及び２［配
列ＩＤ番号８９］、０．２μＭの各アメロゲニンプライマー１［ＴＭＲ−配列Ｉ
Ｄ番号８６］及び２［配列ＩＤ番号８７］、０．３μＭの各ＨＵＭｖＷＦＡ３１
プライマー１［配列ＩＤ番号７６］及び２［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号４０］、１．
５μＭの各Ｄ８Ｓ１１７９プライマー１［配列ＩＤ番号７４］及び２［ＴＭＲ−
配列ＩＤ番号７５］、０．２μＭの各ＨＵＭＴＰＯＸプライマー１［配列ＩＤ番
号７２］及び２［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号７３］、２．０μＭの各ＨＵＭＦＩＢＲ
Ａプライマー１［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号７０］及び２［配列ＩＤ番号７１］、０
．５５μＭの各Ｄ５Ｓ８１８プライマー１［配列ＩＤ番号８４］及び２［ＦＬ−
配列ＩＤ番号８５］、１．１μＭの各Ｄ１３Ｓ３１７プライマー１［配列ＩＤ番
号８２］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号８３］、１．７μＭの各Ｄ７Ｓ８２０プラ
イマー１［ＦＬ−配列ＩＤ番号８０］及び２［配列ＩＤ番号８１］、３．３μＭ
の各Ｄ１６Ｓ５３９プライマー１［配列ＩＤ番号２９］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ
番号７９］、０．５μＭの各ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯプライマー１［配列ＩＤ番号７
７］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号７８］、２．０μＭの各Ｓ１５９プライマー１
［配列ＩＤ番号９０］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号９１］を含んでいた。
【００８８】 第１の遺伝子座の組合せにおいて、各鋳型を、２．５ＵのＡｍｐｌｉＴａｇ
Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡ ポリメラーゼ及び遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵ
ＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖ
ＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ及びＨＵＭＦＩＢＲＡにおける上
述の濃度で使用される各遺伝子座のプライマーを使用して増幅した。第２の遺伝
子座の組合せにおいて、上に記述された濃度で、３２個のすべてのプライマー及
び４ＵのＡｍｐｌｉＴａｇ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼを、単一の反応容器
中の１６個のすべての遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１
、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７
９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３
Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＳ１５９でＤＮＡ鋳型を増
幅するのに使用した。第３の組合せにおいて、各鋳型を、１．５ＵのＡｍｐｌｉ
Ｔａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ及び遺伝子座Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２
０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＳ１５９におけ
る上述の濃度で使用される各遺伝子座のプライマーを使用して増幅した。
【００８９】 増幅生成物を、７Ｍ尿素を含む（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９））０．４
ｍｍ厚さの４％変性ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミドとビスアクリルア
ミドの割合が１９：１）を通る電気泳動で分離し、このゲルは、２枚のガラスプ
レートに化学的に架橋していた（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｙ．（１９８８）、ＢＲ
Ｌ Ｆｏｃｕｓ １０：７３−７４）。ＤＮＡサンプルを、３．５μｌの添加液
（１０ｍＭ ＮａＯＨ、９５％ホルムアミド、０．０５％ブロモフェノールブル
ー）及び０．５μｌのインターナルレーンサイズスタンダードと混合して、９５
℃で２分間変性し、装入する前に氷で冷却した。分離した生成物は、Ｈｉｔａｃ
ｈｉ ＦＭＢＩＯ ＩＩ フルオレセントスキャナー（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆ
ｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｎｅｒｉｎｇ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｌｔｄ．Ｓｏｕｔｈ
Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を使用して蛍光シグナルの検出によって視
覚化した。それぞれ５０５ｎｍ及び５８５ｎｍでのバンドパスフィルターを、フ
ルオレセイン標識遺伝子座及びカルボキシテトラメチルローダミン標識遺伝子座
のそれぞれの検出に使用した。６５０ｎｍのバンドパスフィルターを、インター
ナルレーンスタンダードの検出に使用した（サイズスタンダードデータは示さな
かった）。
【００９０】 各増幅反応から生じるフラグメントを表示する、図４Ａ及び図４Ｂを参照され
たい。図４Ａは、ポリアクリルアミドゲルの同じレーンの、５０５ｎｍスキャン
（フルオレセインチャンネル）の結果を、図４Ｂは、５８５ｎｍスキャン（カル
ボキシテトラメチルローダミンチャンネル）の結果を示す。各ＤＮＡ鋳型におい
て、レーン１は、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ
１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、
ＨＵＭＴＰＯＸ及びＨＵＭＦＩＢＲＡにおける同時に共増幅したＤＮＡサンプル
の結果を示す。レーン２は、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１
Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ
１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ１３Ｓ３１７
、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＳ１５９における同
時に共増幅したＤＮＡサンプルの結果を示す。レーン３は、遺伝子座Ｄ５Ｓ８１
８、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及び
Ｓ１５９における同時に共増幅したＤＮＡサンプルの結果を示す。
【００９１】
【実施例５】 Ｈｉｔａｃｈｉ ＦＭＢＩＯ（登録商標）ＩＩ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｓ ｃａｎｎｅｒで検出された、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１ Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ １１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、 Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＳ１５９の多重増幅 の蛍光検出 この実施例において、２つのＤＮＡ鋳型を、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭ
ＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷ
ＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８
、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＳ
１５９又はこれらの任意の組合せの遺伝子座から選択された２つの異なる遺伝子
座の各組合せで各々同時に増幅した。各遺伝子座の組合せの増幅には、単一の反
応容器に５ｎｇの鋳型を含み、反応容器に、２５μｌの１×Ｇｏｌｄ ＳＴ*Ｒ
緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．３）
、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１６０μｇ／
ｍｌ ＢＳＡ及び２００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）
を含めた。
【００９２】 ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を、以下の増幅プロトコルで使
用した。９６℃で１２分、次に、９４℃で３０秒、６８秒で５８℃にし、３０秒
保持、５０秒で７０℃にし、４５秒保持を１０サイクル、続いて、９０℃で３０
秒、６０秒で５８℃にし、３０秒保持、５０秒で７０℃にし、４５秒保持を２２
サイクル、次に６０℃で３０分を１サイクル行なった。
【００９３】 ３２個の増幅プライマーを、以下の濃度で使用し、その中に、０．２２５μＭ
の各Ｄ３Ｓ１３５８プライマー１［配列ＩＤ番号６８］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ
番号６９］、０．２μＭの各ＨＵＭＴＨ０１プライマー１［ＦＬ−配列ＩＤ番号
６６］及び２［配列ＩＤ番号６７］、１．０μＭの各Ｄ２１Ｓ１１プライマー１
［配列ＩＤ番号６４］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号６５］、１．０μＭの各Ｄ１
８Ｓ５１プライマー１［ＦＬ−配列ＩＤ番号６２］及び２［配列ＩＤ番号６３］
、２．８μＭの各Ｇ４７５プライマー１［配列ＩＤ番号８８］及び２［ＦＬ−配
列ＩＤ番号９４］、０．２μＭの各アメロゲニンプライマー１［ＴＭＲ−配列Ｉ
Ｄ番号８６］及び２［配列ＩＤ番号８７］、０．３μＭの各ＨＵＭｖＷＦＡ３１
プライマー１［配列ＩＤ番号７６］及び２［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号４０］、１．
５μＭの各Ｄ８Ｓ１１７９プライマー１［配列ＩＤ番号７４］及び２［ＴＭＲ−
配列ＩＤ番号７５］、０．２μＭの各ＨＵＭＴＰＯＸプライマー１［配列ＩＤ番
号７２］及び２［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号７３］、２．０μＭの各ＨＵＭＦＩＢＲ
Ａプライマー１［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号７０］及び２［配列ＩＤ番号７１］、０
．５５μＭの各Ｄ５Ｓ８１８プライマー１［配列ＩＤ番号８４］及び２［ＦＬ−
配列ＩＤ番号８５］、１．１μＭの各Ｄ１３Ｓ３１７プライマー１［配列ＩＤ番
号８２］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号８３］、１．７μＭの各Ｄ７Ｓ８２０プラ
イマー１［ＦＬ−配列ＩＤ番号８０］及び２［配列ＩＤ番号８１］、３．３μＭ
の各Ｄ１６Ｓ５３９プライマー１［配列ＩＤ番号２９］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ
番号７９］、０．５μＭの各ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯプライマー１［配列ＩＤ番号７
７］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号７８］、２．０μＭの各Ｓ１５９プライマー１
［配列ＩＤ番号９５］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号９６］を含む。
【００９４】 最初の遺伝子座の組合せにおいて、２．５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ ＧｏｌｄTM ＤＮＡポリメラーゼ及び遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ
１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１
１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ及びＨＵＭＦＩＢＲＡにおける上述の濃度で使用される
各遺伝子座のプライマーを使用して各鋳型を増幅した。２番目の遺伝子座の組合
せにおいて、上に記述した濃度で、３２個のすべてのプライマー及び４ＵのＡｍ
ｐｌｉＴａｑ ＧｏｌｄTM ＤＮＡポリメラーゼを使用して、単一の反応容器に
入っている１６個のすべての遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１
Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ
１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、
Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＳ１５９でＤＮＡ鋳
型を増幅した。
【００９５】 増幅された生成物の分離及び視覚化は、実施例４に記述したものと同じである
。
【００９６】 各増幅反応で生じるフラグメントを表示する、図５Ａ及び図５Ｂを参照された
い。図５Ａは、ポリアクリルアミドゲルの同じレーンの、５０５ｎｍスキャン（
フルオレセインチャンネル）の結果を、図５Ｂは、５８５ｎｍスキャン（カルボ
キシテトラメチルローダミンチャンネル）の結果を示す。各鋳型において、レー
ン１は、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５
１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴ
ＰＯＸ及びＨＵＭＦＩＢＲＡにおける同時に共増幅したＤＮＡサンプルの結果を
示し、レーン２は、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、
Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９
、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＢＩＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ７Ｓ
８２０、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＳ１５９における同時に共増
幅したＤＮＡサンプルの結果を示す。レーン３は、遺伝子座Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ１
３Ｓ３１７、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＳ１５９
における同時に共増幅したＤＮＡサンプルの結果を示す。
【００９７】
【実施例６】 Ｈｉｔａｃｈｉ ＦＭＢＩＯ（登録商標）ＩＩ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｓ ｃａｎｎｅｒで検出された、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１ Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｓ１５９、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ １１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、 Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＣ２２１の多重増幅 の蛍光検出 この実施例において、２つのＤＮＡ鋳型を、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭ
ＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｓ１５９、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷ
ＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８
、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＣ
２２１又はこれらの任意の組合せの遺伝子座から選択された３つの異なる遺伝子
座の各組合せで各々同時に増幅した。各遺伝子座の組合せの増幅には、単一の反
応容器に１０ｎｇの鋳型を含め、反応容器に、２５μｌの１×Ｇｏｌｄ ＳＴ*
Ｒ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．３
）、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１６０μｇ
／ｍｌ ＢＳＡ及び２００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ
）を含めた。
【００９８】 ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を、以下の増幅プロトコルで使
用した。９６℃で１２分、次に、９４℃で３０秒、６８秒で６０℃にし、３０秒
保持、５０秒で７０℃にし、４５秒保持を１０サイクル、続いて、９０℃で３０
秒、６０秒で６０℃にし、３０秒保持、５０秒で７０℃にし、４５秒保持を２０
サイクル、次に６０℃で３０分を１サイクル行なう。
【００９９】 ３２個の増幅プライマーを、以下の濃度で使用し、その中に、０．７５μＭの
各Ｄ３Ｓ１３５８プライマー１［配列ＩＤ番号１０６］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ
番号６９］、０．３μＭの各ＨＵＭＴＨ０１プライマー１［ＦＬ−配列ＩＤ番号
３８］及び２［配列ＩＤ番号１０３］、２．０μＭの各Ｄ２１Ｓ１１プライマー
１［配列ＩＤ番号６４］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号６５］、０．３μＭの各Ｄ
１８Ｓ５１プライマー１［ＦＬ−配列ＩＤ番号１０１］及び２［配列ＩＤ番号１
０２］、２．０μＭの各Ｓ１５９プライマー１［配列ＩＤ番号９２］及び２［Ｆ
Ｌ−配列ＩＤ番号９３］、０．１５μＭの各アメロゲニンプライマー１［ＴＭＲ
−配列ＩＤ番号１０５］及び２［配列ＩＤ番号８７］、１．０μＭの各ＨＵＭｖ
ＷＦＡ３１プライマー１［配列ＩＤ番号７６］及び２［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号４
０］、１．２５μＭの各Ｄ８Ｓ１１７９プライマー１［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号１
０４］及び２［配列ＩＤ番号７５］、０．７５μＭの各ＨＵＭＴＰＯＸプライマ
ー１［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号７２］及び２［配列ＩＤ番号７３］、１．５μＭの
各ＨＵＭＦＩＢＲＡプライマー１［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号７０］及び２［配列Ｉ
Ｄ番号１０７］、０．５５μＭの各Ｄ５Ｓ８１８プライマー１［配列ＩＤ番号８
４］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号８５］、１．１μＭの各Ｄ１３Ｓ３１７プライ
マー１［配列ＩＤ番号３］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号４］、１．７μＭの各Ｄ
７Ｓ８２０プライマー１［ＦＬ−配列ＩＤ番号８０］及び２［配列ＩＤ番号８１
］、３．３μＭの各Ｄ１６Ｓ５３９プライマー１［ＦＬ−配列ＩＤ番号２９］及
び２［配列ＩＤ番号９７］、０．２５μＭの各ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯプライマー１
［配列ＩＤ番号７７］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号９８］、１．０μＭの各Ｃ２
２１プライマー１［ＦＬ−配列ＩＤ番号９９］及び２［配列ＩＤ番号１００］を
含んでいた。
【０１００】 １番目の遺伝子座の組合せにおいて、２．５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ TM ＤＮＡポリメラーゼ及び遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１
Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｓ１５９、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ
１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ及びＨＵＭＦＩＢＲＡにおける上述の濃度で使用され
る各遺伝子座のプライマーを使用して各鋳型を増幅した。２番目の遺伝子座の組
合せにおいて、上に記述した濃度で、３２個のすべてのプライマー及び４ＵのＡ
ｍｐｌｉＴａｑ ＧｏｌｄTM ＤＮＡポリメラーゼを使用して、単一の反応容器
に入っている１６個のすべての遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２
１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｓ１５９、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８
Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０
、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＣ２２１でＤＮＡ
鋳型を増幅した。３番目の組合せにおいて、各鋳型を、１．５ＵのＡｍｐｌｉｔ
ａｑ ＧｏｌｄTM ＤＮＡポリメラーゼ及び遺伝子座Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２
０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＣ２２１におけ
る上述の濃度で使用される各遺伝子座のプライマーを使用して増幅した。
【０１０１】 増幅生成物は、増幅生成物の各サンプルを１倍のＳＴＲ緩衝液（５０ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．３）、０．１％のＴｒｉ
ｔｏｎ Ｘ−１００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2及び２００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄ
ＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）で１：４に希釈した以外は、実施例４で上述し
たのと同様に分離し、検出した。希釈した増幅生成物（２．５μｌ）を、２．５
μｌの添加液（１０ｍＭ ＮａＯＨ、９５％ホルムアミド、０．０５％ブロモフ
ェノールブルー）と混合し、インターナルレーンスタンダードなしで、９５℃で
２分間変性し、装入する前に氷で冷却した。
【０１０２】 各増幅反応で生じるフラグメントを表示する、図６Ａ及び図６Ｂを参照された
い。図６Ａは、ポリアクリルアミドゲルの同じレーンの、５０５ｎｍスキャン（
フルオレセインチャンネル）の結果を、図６Ｂは、５８５ｎｍスキャン（カルボ
キシテトラメチルローダミンチャンネル）の結果を示す。各ＤＮＡ鋳型において
、レーン１は、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１
８Ｓ５１、Ｓ１５９、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｈ
ＵＭＴＰＯＸ及びＨＵＭＦＩＢＲＡにおける同時に共増幅したＤＮＡサンプルの
結果を示し、レーン２は、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ
１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１
１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＢＩＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ１３Ｓ３１７、
Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＣ２２１における同時
に共増幅したＤＮＡサンプルの結果を示す。レーン３は、遺伝子座Ｄ５Ｓ８１８
、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＣ
２２１における同時に共増幅したＤＮＡサンプルの結果を示す。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 実施例１でＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０ 遺伝子分析装置で検出さ
れた、ヒトゲノムＤＮＡのサンプルの遺伝子座Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ５Ｓ８１８、
Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５
１、Ｄ２１Ｓ１１、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、ＨＵＭＴＨ０１、
ＨＵＭＴＰＯＸ、及びＨＵＭｖＷＦＡ３１の同時増幅の生成物の３色蛍光検出の
出力のプロットである。
【図１Ｂ】 増幅反応においてゲノムＤＮＡなしで、図１Ａと同じ方法で扱ったコントロー
ルサンプルの３色蛍光検出の出力のプロットである。
【図２Ａ】 実施例２でＡＢＩＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０ 遺伝子分析装置で検出され
た、ヒトゲノムＤＮＡのサンプルの遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ
７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１
、Ｄ２１Ｓ１１、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、ＨＵＭＴＨ０１、Ｈ
ＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｇ４７５、Ｓ１５９及びアメロゲニンの同
時増幅の生成物の３色蛍光検出の出力のプロットである。
【図２Ｂ】 増幅反応においてゲノムＤＮＡ基質なしで、図２Ａと同じ方法で扱ったコント
ロールサンプルの３色蛍光検出の出力のプロットである。
【図３Ａ】 実施例３でＡＢＩＰＲＩＳＭ（登録商標）３７７ ＤＮＡシークエンサーで検
出されたヒトゲノムＤＮＡサンプルの遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ５Ｓ８１８、
Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５
１、Ｄ２１Ｓ１１、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、ＨＵＭＴＨ０１、
ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｇ４７５、Ｓ１５９及びアメロゲニンの
同時増幅の生成物の３色蛍光検出の出力のプロットである。
【図３Ｂ】 増幅反応においてゲノムＤＮＡ基質なしで、図３Ａと同じ方法で扱ったコント
ロールサンプルの３色蛍光検出の出力のプロットである。
【図４Ａ及び図４Ｂ】 実施例４で記述された、日立ＦＭＢＩＯ（登録商標）ＩＩ フルオレセントス
キャナーのフルオレセインチャンネル（図４Ａ）及びカルボキシテトラメチルロ
ーダミンチャンネル（図４Ｂ）を用いて検出された、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、
Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３
９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ２１Ｓ１１、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｈ
ＵＭＴＨ０１、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｇ４７５、Ｓ１５９及び
アメロゲニンの同時増幅の生成物のフルオレセント検出の結果のレーザープリン
ト像である。
【図５Ａ及び図５Ｂ】 実施例５で記述された、日立ＦＭＢＩＯ（登録商標）ＩＩ フルオレセントス
キャナーのフルオレセインチャンネル（図５Ａ）及びカルボキシテトラメチルロ
ーダミンチャンネル（図５Ｂ）を用いて検出された、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、
Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３
９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ２１Ｓ１１、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｈ
ＵＭＴＨ０１、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｇ４７５、Ｓ１５９及び
アメロゲニンの同時増幅の生成物のフルオレセント検出の結果のレーザープリン
ト像である。
【図６Ａ及び図６Ｂ】 実施例６で記述された、日立ＦＭＢＩＯ（登録商標）ＩＩ フルオレセントス
キャナーのフルオレセインチャンネル（図６Ａ）及びカルボキシテトラメチルロ
ーダミンチャンネル（図６Ｂ）を用いて検出された、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、
Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３
９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ２１Ｓ１１、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｈ
ＵＭＴＨ０１、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｃ２２１、Ｓ１５９及び
アメロゲニンの同時増幅の生成物のフルオレセント検出の結果のレーザープリン
ト像である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 スプレッチャー シンシア ジェイ アメリカ合衆国 ウィスコンシン州 53711 マディソン サウス ウイットニ ー ウェイ 2121 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CA25 CA26 CB01 CB03 CB07 CB13 CB14 CB16 DA12 DA13 DA14 DA80 FB02 FB05 FB06 FB07 JA04 JA20 4B024 AA11 CA01 CA09 HA12 4B063 QA01 QA17 QA19 QQ42 QR08 QR42 QR55 QR62 QS25 QS34 QS36 QX02

Claims (40)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 １以上のＤＮＡサンプルから、一組の遺伝子座に存在する対
    立遺伝子を同時に決定する方法であって、 （ａ）分析すべき少なくとも１つのＤＮＡサンプルを得る工程と、 （ｂ）前記ＤＮＡサンプルの一組の遺伝子座を選択する工程であって、共増幅
    できる、少なくとも１３個のタンデム反復遺伝子座を含む工程と、 （ｃ）多重増幅反応で前記組の中の遺伝子座を共増幅する工程であって、反応
    生成物が、前記組の中の共増幅された各遺伝子座から増幅された対立遺伝子の混
    合物である工程と、 （ｄ）前記混合物中の前記増幅された対立遺伝子を評価して、前記ＤＮＡサン
    プル中の、前記組の中の分析された各遺伝子座に存在する対立遺伝子を決定する
    工程と、 を含むことを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 前記少なくとも１３個の短いタンデム反復遺伝子座の、少な
    くとも４個が、Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ４Ｓ２３６８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０
    、Ｄ９Ｓ９３０、Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１４Ｓ１１８、Ｄ１４
    Ｓ５４８、Ｄ１４Ｓ５６２、Ｄ１６Ｓ４９０、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１６Ｓ７５３
    、Ｄ１７Ｓ１２９８、Ｄ１７Ｓ１２９９、Ｄ１９Ｓ２５３、Ｄ２０Ｓ４８１、Ｄ
    ２２Ｓ６８３、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭ
    Ｆ１３Ａ０１、ＨＵＭＢＦＸＩＩＩ、ＨＵＭＬＩＰＯＬ及びＨＵＭｖＷＦＡ３１
    からなる群より選ばれる、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 工程（ｂ）で選択される前記遺伝子座の組が、前記１３個の
    短いタンデム反復遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８
    Ｓ１１７９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ２１Ｓ１１、
    ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭＴＰＯＸ、及
    びＨＵＭｖＷＦＡ３１を含む、請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 工程（ｂ）で選択される前記組における、前記少なくとも１
    ３個の短いタンデム反復遺伝子座の少なくとも１つが、ペンタヌクレオチドタン
    デム反復遺伝子座である、請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記ペンタヌクレオチドタンデム反復遺伝子座が、Ｇ４７５
    、Ｃ２２１及びＳ１５９からなる群から選ばれる、請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】 工程（ｂ）で選択される前記遺伝子座の組が、工程（ａ）で
    提供される前記ＤＮＡの少なくとも１つのソースの性を同定するのに使用される
    遺伝子座を更に含む、請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】 工程（ａ）で提供される前記ＤＮＡの前記少なくとも１つの
    ソースが、ヒトであって、かつヒトの性を同定するのに使用される遺伝子座が、
    アメロゲニン遺伝子座である、請求項６記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記アメロゲニン遺伝子座が、配列ＩＤ番号８６、８７、及
    び１０５からなる群より選ばれる配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを
    使用して共増幅される、請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記多重増幅反応が、以下の配列群の少なくとも１つから選
    択される配列を有する、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用
    して行なわれる、請求項１記載の方法。 前記組の遺伝子座の１つがＤ７Ｓ８２０の場合に、配列ＩＤ番号１、２、８０及
    び８１ 前記組の遺伝子座の１つがＤ１３Ｓ３１７の場合に、配列ＩＤ番号３、４、８２
    及び８３ 前記組の遺伝子座の１つがＤ５Ｓ８１８の場合に、配列ＩＤ番号５、６、８４及
    び８５ 前記組の遺伝子座の１つがＤ３Ｓ１５３９の場合に、配列ＩＤ番号７、８及び４
    ９ 前記組の遺伝子座の１つがＤ１７Ｓ１２９８の場合に、配列ＩＤ番号９及び１０ 前記組の遺伝子座の１つがＤ２０Ｓ４８１の場合に、配列ＩＤ番号１１、１２、
    ５２及び５３ 前記組の遺伝子座の１つがＤ９Ｓ９３０の場合に、配列ＩＤ番号１３、１４、５
    ５及び６１ 前記組の遺伝子座の１つがＤ１０Ｓ１２３９の場合に、配列ＩＤ番号１５、１６
    及び５４ 前記組の遺伝子座の１つがＤ１４Ｓ１１８の場合に、配列ＩＤ番号１７及び１８ 前記組の遺伝子座の１つがＤ１４Ｓ５６２の場合に、配列ＩＤ番号１９及び２０ 前記組の遺伝子座の１つがＤ１４Ｓ５４８の場合に、配列ＩＤ番号２１及び２２ 前記組の遺伝子座の１つがＤ１６Ｓ４９０の場合に、配列ＩＤ番号２３及び２４ 前記組の遺伝子座の１つがＤ１６Ｓ７５３の場合に、配列ＩＤ番号２５及び２６ 前記組の遺伝子座の１つがＤ１７Ｓ１２９９の場合に、配列ＩＤ番号２７及び２
    ８ 前記組の遺伝子座の１つがＤ１６Ｓ５３９の場合に、配列ＩＤ番号２９、３０、
    ５８、７９及び９７ 前記組の遺伝子座の１つがＤ２２Ｓ６８３の場合に、配列ＩＤ番号３１及び３２ 前記組の遺伝子座の１つがＨＵＭＣＳＦ１ＰＯの場合に、配列ＩＤ番号３３、３
    ４、７７、７８及び９８ 前記組の遺伝子座の１つがＨＵＭＴＰＯＸの場合に、配列ＩＤ番号３５、３６、
    ７２及び７３ 前記組の遺伝子座の１つがＨＵＭＴＨ０１の場合に、配列ＩＤ番号３７、３８、
    ６６、６７及び１０３ 前記組の遺伝子座の１つがＨＵＭｖＷＦＡ３１の場合に、配列ＩＤ番号３９、４
    ０、５９、６０及び７６ 前記組の遺伝子座の１つがＨＵＭＦ１３Ａ０１の場合に、配列ＩＤ番号４１及び
    ４２ 前記組の遺伝子座の１つがＨＵＭＦＥＳＦＰＳの場合に、配列ＩＤ番号４３及び
    ４４ 前記組の遺伝子座の１つがＨＵＭＢＦＸＩＩＩの場合に、配列ＩＤ番号４５及び
    ４６ 前記組の遺伝子座の１つがＨＵＭＬＩＰＯＬの場合に、配列ＩＤ番号４７及び４
    ８ 前記組の遺伝子座の１つがＤ１９Ｓ２５３の場合に、配列ＩＤ番号５０及び５１ 前記組の遺伝子座の１つがＤ４Ｓ２３６８の場合に、配列ＩＤ番号５６及び５７ 前記組の遺伝子座の１つがＤ１８Ｓ５１の場合に、配列ＩＤ番号６２、６３、１
    ０１及び１０２ 前記組の遺伝子座の１つがＤ２１Ｓ１１の場合に、配列ＩＤ番号６４及び６５ 前記組の遺伝子座の１つがＤ３Ｓ１５３８の場合に、配列ＩＤ番号６８、６９及
    び１０６ 前記組の遺伝子座の１つがＨＵＭＦＩＢＲＡの場合に、配列ＩＤ番号７０、７１
    及び１０７ 前記組の遺伝子座の１つがＤ８Ｓ１１７９の場合に、配列ＩＤ番号７４、７５及
    び１０４ 前記組の遺伝子座の１つがアメロゲニンの場合に、配列ＩＤ番号８６、８７及び
    １０５ 前記組の遺伝子座の１つがＧ４７５の場合に、配列ＩＤ番号８８、８９及び９４ 前記組の遺伝子座の１つがＳ１５９の場合に、配列ＩＤ番号９０、９１、、９２
    、９３、９５及び９６ 前記組の遺伝子座の１つがＣ２２１の場合に、配列ＩＤ番号９９及び１００
  10. 【請求項１０】 ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びキャピラリーゲル電
    気泳動からなる群より選ばれる分離手段を使用して、前記増幅された対立遺伝子
    が、工程（ｄ）での評価の前に分離される、請求項１記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記多重増幅反応が、分析される前記少なくとも１３個の
    遺伝子座をフランキングする、少なくとも１３対のオリゴヌクレオチドプライマ
    ーを使用して行なわれる、請求項１記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記遺伝子座の組が、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して共
    増幅される、請求項１１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 工程（ｂ）の前記多重反応で共増幅された各遺伝子座が、
    前記遺伝子座をフランキングする１対のプライマーを使用して共増幅され、各対
    の少なくとも１つのプライマーが、該プライマーに共有結合した蛍光標識を有す
    る、請求項１１記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記標識されたプライマーの少なくとも３つが、該プライ
    マーに共有結合した異なる蛍光標識を有する、請求項１３記載の方法。
  15. 【請求項１５】 分析すべき前記少なくとも１つのＤＮＡサンプルが、ヒト
    組織から調製され、該ヒト組織が、血液、精液、膣細胞、毛、唾液、尿、胎盤細
    胞又は胎児細胞を含む羊水及び上記に列挙した組織のいずれかの混合物を含むヒ
    ト組織からなる群より選ばれる、請求項１記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記増幅された対立遺伝子が、前記増幅された遺伝子をサ
    イズスタンダードと比較することによって評価され、該サイズスタンダードが、
    ＤＮＡマーカー及び遺伝子座特異的対立遺伝子ラダーからなるサイズスタンダー
    ドの群より選ばれる、請求項１記載の方法。
  17. 【請求項１７】 １以上のＤＮＡサンプルから、一組の遺伝子座に存在する
    対立遺伝子を同時に特定する方法であって、 （ａ）分析すべき少なくとも１つのＤＮＡサンプルを得る工程と、 （ｂ）前記ＤＮＡサンプルの１組の遺伝子座を選択する工程であって、短いタ
    ンデム反復遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１
    ７９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ２１Ｓ１１、ＨＵＭ
    ＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭＴＰＯＸ及びＨＵＭ
    ｖＷＦＡ３１を含む工程と、 （ｃ）多重増幅反応で前記組の遺伝子座を共増幅する工程であって、反応生成
    物は、前記組の各共増幅された遺伝子座から増幅された対立遺伝子の混合物であ
    る工程と、 （ｄ）前記混合物中の前記増幅された対立遺伝子を評価して、前記ＤＮＡサン
    プル中の、前記組の中の分析された各遺伝子座に存在する対立遺伝子を決定する
    工程と、 を含むことを特徴とする方法。
  18. 【請求項１８】 前記多重増幅反応が、工程（ｂ）で選択された前記少なく
    とも１３個の遺伝子座の組のうち少なくとも１つの遺伝子座に対し、少なくとも
    １つのプライマーを使用して行なわれ、前記プライマーが、以下のプライマー配
    列群の１つから選択される配列を有する、請求項１７記載の方法。 前記組における遺伝子座の１つがＤ１８Ｓ５１の場合に、配列ＩＤ番号６２、
    ６３、１０１及び１０２ 遺伝子座Ｄ２１Ｓ１１において、配列ＩＤ番号６４及び６５ 遺伝子座ＨＵＭＴＨ０１において、配列ＩＤ番号３７、３８、６６、６７及び１
    ０３ 遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８において、配列ＩＤ番号６８、６９及び１０６ 遺伝子座ＨＵＭＦＩＢＲＡにおいて、配列ＩＤ番号７０、７１及び１０７ 遺伝子座ＨＵＭＴＰＯＸにおいて、配列ＩＤ番号３５、３６、７２及び７３ 遺伝子座Ｄ８Ｓ１１７９において、配列ＩＤ番号７４、７５及び１０４ 遺伝子座ＨＵＭｖＷＦＡ３１において、配列ＩＤ番号３９、４０、５９、６０及
    び７６ 遺伝子座ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯにおいて、配列ＩＤ番号３３、３４、７７、７８及
    び９８ 遺伝子座Ｄ１６Ｓ５３９において、配列ＩＤ番号２９、３０、５８、７９及び９
    ７ 遺伝子座Ｄ７Ｓ８２０において、配列ＩＤ番号１、２、８０及び８１ 遺伝子座Ｄ１３Ｓ３１７において、配列ＩＤ番号３、４、８２及び８３ 遺伝子座Ｄ５Ｓ８１８において、配列ＩＤ番号５、６、８４及び８５
  19. 【請求項１９】 前記工程（ａ）で選択される遺伝子座の組が、更にＧ４７
    ５、Ｓ１５９、Ｃ２２１及びアメロゲニンからなる遺伝子座の群から選ばれる、
    少なくとも１つの追加の遺伝子座を含む、請求項１７記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記多重増幅反応が、以下の配列群の少なくとも１つから
    選択される配列を有する、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを使
    用して行なわれる、請求項１９記載の方法。 前記組の遺伝子座の１つがＧ４７５である場合に、配列ＩＤ番号８８、８９及び
    ９４ 前記組の遺伝子座の１つがＳ１５９である場合に、配列ＩＤ番号９０、９１、
    ９２、９３、９５及び９６ 前記組の遺伝子座の１つがＣ２２１である場合に、配列ＩＤ番号９９及び１０
    ０ 前記組の遺伝子座の１つがアメロゲニン遺伝子座である場合に、配列ＩＤ番号
    ８６、８７及び１０５
  21. 【請求項２１】 前記多重増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応である、請求
    項１７記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記増幅された対立遺伝子が、該増幅された対立遺伝子を
    サイズスタンダードと比較することによって評価され、該サイズスタンダードが
    、ＤＮＡマーカー及び遺伝子座特異的対立遺伝子ラダーからなるサイズスタンダ
    ードの群より選ばれる、請求項１７記載の方法。
  23. 【請求項２３】 分析すべき前記少なくとも１つのＤＮＡサンプルが、ヒト
    組織から調製され、該ヒト組織は、血液、精液、膣細胞、毛、唾液、尿、骨、口
    内サンプル、胎盤細胞又は胎児細胞を含む羊水及び上記に列挙した組織のいずれ
    かの混合物を含むヒト組織からなる群より選ばれる、請求項１７記載の方法。
  24. 【請求項２４】 １以上のヒトゲノムＤＮＡサンプルから、遺伝子座の一組
    に存在する対立遺伝子を同時に特定する方法であって、 （ａ）分析すべき少なくとも１つのヒトゲノムＤＮＡサンプルを得る工程と、 （ｂ）多重増幅反応で該ヒトゲノムＤＮＡサンプルの少なくとも１６個の遺伝
    子座の一組において遺伝子座を共増幅する工程であって、該遺伝子座の組が、Ｄ
    ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメ
    ロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩ
    ＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵ
    ＭＣＳＦ１ＰＯ及びＳ１５９を含み、反応生成物は、前記組の各共増幅された遺
    伝子座から増幅された対立遺伝子の混合物である工程と、 （ｃ）前記混合物中の前記増幅された対立遺伝子を評価する工程であって、ヒ
    トゲノムＤＮＡサンプルの、前記少なくとも１６個の遺伝子座の各々における対
    立遺伝子の存在を決定する工程と、 を含むことを特徴とする方法。
  25. 【請求項２５】 前記多重増幅反応が、工程（ｂ）で選択された１６個のプ
    ライマーの組における各遺伝子座をフランキングするプライマーの少なくとも１
    対を使用して行なわれる、請求項２４記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記多重増幅反応が、工程（ｂ）で共増幅された少なくと
    も１６個の遺伝子座の前記組における少なくとも１つの遺伝子座に対して、少な
    くとも１つのプライマーを使用して行なわれ、前記プライマーが、以下のプライ
    マー配列群の１つから選択される配列を有する、請求項２４記載の方法。 前記組の遺伝子座の１つが、Ｄ１８Ｓ５１の場合に、配列ＩＤ番号６２、６３
    、１０１及び１０２ 遺伝子座Ｄ２１Ｓ１１において、配列ＩＤ番号６４及び６５ 遺伝子座ＨＵＭＴＨ０１において、配列ＩＤ番号３７、３８、６６、６７及び１
    ０３ 遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８において、配列ＩＤ番号６８、６９及び１０６ 遺伝子座ＨＵＭＦＩＢＲＡにおいて、配列ＩＤ番号７０、７１及び１０７ 遺伝子座ＨＵＭＴＰＯＸにおいて、配列ＩＤ番号３５、３６、７２及び７３ 遺伝子座Ｄ８Ｓ１１７９において、配列ＩＤ番号７４、７５及び１０４ 遺伝子座ＨＵＭｖＷＦＡ３１において、配列ＩＤ番号３９、４０、５９、６０及
    び７６ 遺伝子座ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯにおいて、配列ＩＤ番号３３、３４、７７、７８及
    び９８ 遺伝子座Ｄ１６Ｓ５３９において、配列ＩＤ番号２９、３０、５８、７９及び９
    ７ 遺伝子座Ｄ７Ｓ８２０において、配列ＩＤ番号１、２、８０及び８１ 遺伝子座Ｄ１３Ｓ３１７において、配列ＩＤ番号３、４、８２及び８３ 遺伝子座Ｄ５Ｓ８１８において、配列ＩＤ番号５、６、８４及び８５ 遺伝子座Ｇ４７５において、配列ＩＤ番号８８、８９及び９４ 遺伝子座Ｓ１５９において、配列ＩＤ番号９０、９１、９２、９３、９５及び
    ９６ アメロゲニン遺伝子座において、配列ＩＤ番号８６、８７及び１０５
  27. 【請求項２７】 １以上のヒトゲノムＤＮＡサンプルから、一組の遺伝子
    座に存在する対立遺伝子を同時に特定する方法であって、 （ａ）分析すべき少なくとも１つのヒトゲノムＤＮＡを得る工程と、 （ｂ）多重増幅反応で、前記ヒトゲノムＤＮＡサンプルの少なくとも１６個の遺
    伝子座の一組における遺伝子座を共増幅する工程であって、該遺伝子座の組は、
    Ｄ３Ｓ１３４８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｓ１５９、ア
    メロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦ
    ＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｈ
    ＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＣ２２１を含み、反応生成物は、前記組の各共増幅された
    遺伝子座から共増幅された対立遺伝子の混合物である工程と、 （ｃ）該混合物中の増幅対立遺伝子を評価して、前記ヒトゲノムＤＮＡサンプル
    の少なくとも１６個の遺伝子座の各々に存在する対立遺伝子を決定する工程と、
    を含むことを特徴とする方法。
  28. 【請求項２８】 前記多重増幅反応は、工程（ｂ）で選択された１６個の
    プライマーの組の各遺伝子座をフランキングする少なくとも１対のプライマーを
    使用して行なう、請求項２７記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記多重増幅反応は、工程（ｂ）で共増幅された少なく
    とも１６個の遺伝子座の組の少なくとも１つの遺伝子座に対し、少なくとも１つ
    のプライマーを使用して行なわれ、該プライマーは、以下のプライマー配列の１
    つから選択される配列を有する、請求項２７記載の方法。 遺伝子座Ｄ１８Ｓ５１において、配列ＩＤ番号６２、６３、１０１及び１０２
    遺伝子座Ｄ２１Ｓ１１において、配列ＩＤ番号６４及び６５ 遺伝子座ＨＵＭＴＨ０１において、配列ＩＤ番号３７、３８、６６、６７及び１
    ０３ 遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８において、配列ＩＤ番号６８、６９及び１０６ 遺伝子座ＨＵＭＦＩＢＲＡにおいて、配列ＩＤ番号７０、７１及び１０７ 遺伝子座ＨＵＭＴＰＯＸにおいて、配列ＩＤ番号３５、３６、７２及び７３ 遺伝子座Ｄ８Ｓ１１７９において、配列ＩＤ番号７４、７５及び１０４ 遺伝子座ＨＵＭｖＷＦＡ３１において、配列ＩＤ番号３９、４０、５９、６０及
    び７６ 遺伝子座ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯにおいて、配列ＩＤ番号３３、３４、７７、７８及
    び９８ 遺伝子座Ｄ１６Ｓ５３９において、配列ＩＤ番号２９、３０、５８、７９及び９
    ７ 遺伝子座Ｄ７Ｓ８２０において、配列ＩＤ番号１、２、８０及び８１ 遺伝子座Ｄ１３Ｓ３１７において、配列ＩＤ番号３、４、８２及び８３ 遺伝子座Ｄ５Ｓ８１８において、配列ＩＤ番号５、６、８４及び８５ 遺伝子座Ｓ１５９において、配列ＩＤ番号９０、９１、９２、９３、９５及び
    ９６ 遺伝子座Ｃ２２１において、配列ＩＤ番号９９及び１００ アメロゲニン遺伝子座において、配列ＩＤ番号８６、８７及び１０５
  30. 【請求項３０】 ゲノムＤＮＡの一組の遺伝子座を同時に分析するキットで
    あって、分析すべきゲノムＤＮＡの一組の遺伝子座を共増幅するためのオリゴヌ
    クレオチドプライマーを含み、前記遺伝子座の組が、共増幅することができる少
    なくとも１３個の短いタンデム反復遺伝子座を含み、該プライマーは、１以上の
    容器にあることを特徴とするキット。
  31. 【請求項３１】 前記キット中の前記オリゴヌクレオチドプライマーのすべ
    てが、１つの容器の中にある、請求項３０記載のキット。
  32. 【請求項３２】 前記ゲノムＤＮＡが、ヒトゲノムＤＮＡであり、共増幅で
    きる少なくとも１３個の短いタンデム反復遺伝子座が、Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ５Ｓ
    ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ
    １８Ｓ５１、Ｄ２１Ｓ１１、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、ＨＵＭＴ
    Ｈ０１、ＨＵＭＴＰＯＸ及びＨＵＭｖＷＦＡ３１を含む、請求項３１記載のキッ
    ト。
  33. 【請求項３３】 前記遺伝子座の組の１つの遺伝子座を共増幅するための少
    なくとも１つのプライマーが、以下のプライマー配列の群の１つから選択される
    配列を有する、請求項３０記載のキット。 Ｄ１８Ｓ５１において、配列ＩＤ番号６２、６３、１０１及び１０２ Ｄ２１Ｓ１１において、配列ＩＤ番号６４及び６５ ＨＵＭＴＨ０１において、配列ＩＤ番号６６、６７、３８及び１０３ Ｄ３Ｓ１３５８において、配列ＩＤ番号６８、６９及び１０６ ＨＵＭＦＩＢＲＡにおいて、配列ＩＤ番号７０、７１及び１０７ ＨＵＭＴＰＯＸにおいて、配列ＩＤ番号７２及び７３ Ｄ８Ｓ１１７９において、配列ＩＤ番号７４、７５及び１０４ ＨＵＭｖＷＦＡ３１において、配列ＩＤ番号７６及び４０ ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯにおいて、配列ＩＤ番号７７、７８及び９８ Ｄ１６Ｓ５３９において、配列ＩＤ番号２９、７９及び９７ Ｄ７Ｓ８２０において、配列ＩＤ番号８０及び８１ Ｄ１３Ｓ３１７において、配列ＩＤ番号３、４、８２及び８３ Ｄ５Ｓ８１８において、配列ＩＤ番号８４及び８５
  34. 【請求項３４】 少なくとも１多重増幅反応に対する試薬を更に含む、請求
    項３０記載のキット。
  35. 【請求項３５】 対立遺伝子ラダーを有する容器を更に含む、請求項３０記
    載のキット。
  36. 【請求項３６】 前記対立遺伝子ラダーの各ラング及び前記組の各遺伝子座
    に対する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーが、それぞれ、これら
    に共有結合した蛍光標識を有し、かつオリゴヌクレオチドプライマーの少なくと
    も２つが、容器中の他のプライマーと比べて、該プライマーに共有結合した異な
    る蛍光標識を有する、請求項３５記載のキット。
  37. 【請求項３７】 ゲノムＤＮＡの遺伝子座の一組を同時に分析するためのキ
    ットであって、分析すべき前記ゲノムＤＮＡの一組の遺伝子座を共増幅するため
    のオリゴヌクレオチドプライマーを含み、前記プライマーが、１以上の容器にあ
    り、かつ共増幅できる少なくとも１６個の遺伝子座の一組を共増幅するように設
    計され、前記少なくとも１６個の遺伝子座の組が、Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ
    ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ
    ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ
    ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＳ１５
    ９を含むことを特徴とするキット。
  38. 【請求項３８】 ゲノムＤＮＡの遺伝子座の一組を同時に分析するためのキ
    ットであって、分析すべき前記ゲノムＤＮＡの一組の遺伝子座を共増幅するため
    のオリゴヌクレオチドプライマーを含み、前記プライマーが、１以上の容器にあ
    り、かつ共増幅できる少なくとも１６個の遺伝子座の一組を共増幅するように設
    計され、前記少なくとも１６個の遺伝子座の組が、Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ
    ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｓ１５９、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ
    ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ
    ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＣ２２
    １を含むことを特徴とするキット。
  39. 【請求項３９】 １以上のＤＮＡサンプルから一組の遺伝子座に存在する対
    立遺伝子を同時に決定する方法であって、 （ａ）分析すべき少なくとも１以上のＤＮＡサンプルを得る工程と、 （ｂ）共増幅できる少なくとも１３個の短いタンデム反復遺伝子座を含む前記
    ＤＮＡサンプルの一組の遺伝子座を選択する工程であって、少なくとも１３個の
    短いタンデム反復遺伝子座の少なくとも４個が、 Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ４Ｓ２３６８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ９Ｓ９３
    ０、Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１４Ｓ１１８、Ｄ１４Ｓ５４８、Ｄ
    １４Ｓ５６２、Ｄ１６Ｓ４９０、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１６Ｓ７５３、Ｄ１７Ｓ１
    ２９８、Ｄ１７Ｓ１２９９、Ｄ１９Ｓ２５３、Ｄ２０Ｓ４８１、Ｄ２２Ｓ６８３
    、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭＦ１３Ａ０１
    、ＨＵＭＢＦＸＩＩＩ、ＨＵＭＬＩＰＯＬ及びＨＵＭｖＷＦＡ３１ からなる群より選ばれる工程と、 （ｃ）多重増幅反応で前記組の遺伝子座を共増幅する工程であって、反応生成
    物が、前記組の各共増幅された遺伝子座から増幅された対立遺伝子の混合物であ
    る工程と、 （ｄ）前記混合物中の増幅対立遺伝子を評価して、前記ＤＮＡサンプル中の、
    前記組で分析された各遺伝子座に存在する対立遺伝子を決定する工程と、 を含むことを特徴とする方法。
  40. 【請求項４０】 ゲノムＤＮＡの一組の対立遺伝子を同時に分析するための
    キットであって、分析すべき前記ゲノムＤＮＡの一組の遺伝子座を共増幅するた
    めのオリゴヌクレオチドプライマーを含み、該プライマーは、１以上の容器にあ
    り、該プライマーは、共増幅できる少なくとも１３の遺伝子座の組を共増幅する
    ように設計され、少なくとも１３個の短いタンデム反復遺伝子座の少なくとも４
    個が、 Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ４Ｓ２３６８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ９Ｓ９３０
    、Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１４Ｓ１１８、Ｄ１４Ｓ５４８、Ｄ１
    ４Ｓ５６２、Ｄ１６Ｓ４９０、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１６Ｓ７５３、Ｄ１７Ｓ１２
    ９８、Ｄ１７Ｓ１２９９、Ｄ１９Ｓ２５３、Ｄ２０Ｓ４８１、Ｄ２２Ｓ６８３、
    ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭＦ１３Ａ０１、
    ＨＵＭＢＦＸＩＩＩ、ＨＵＭＬＩＰＯＬ及びＨＵＭｖＷＦＡ３１ からなる群より選ばれることを特徴とするキット。
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