JP2002530121A - 短いタンデム反復遺伝子座の多重増幅 - Google Patents
短いタンデム反復遺伝子座の多重増幅Info
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Abstract
Description
号である、米国特許出願第08/632575号の部分継続出願であり、この出
願は、1998年12月1日に発行され、1994年9月30日に出願された米
国特許出願第08/316544号の部分継続である。これらの出願の全開示は
、ここで参考として組み込む。
明は、より詳細には、複数の(multiple)異なる多型遺伝子座の同時増
幅に関し、1度の反応で、多重系(multiplex system)の中に
含まれる各遺伝子座の対立遺伝子を決定する、ポリメラーゼ連鎖反応又は他の増
幅システムを使用する。
され、またウマ、イヌ、他の動物及び農作物の系統を確認するのにも使用される
。また、DNAタイピングは、一般に、人間の残留物の特定を要求する犯罪現場
や他の現場で見つかった、血液、唾液、精液及び他の組織のソースを特定するの
に使用される。また、DNAタイピングは、臨床的場面で使用され、骨髄移植の
成功又は失敗及び特定の癌組織の存在を決定する。DNAタイピングは、一般に
「マーカー」と呼ばれる、重要な特徴を持つゲノムDNAの対立遺伝子の分析を
含む。今日使用されている多くのタイピング方法は、集団の中で少なくとも2つ
の異なる形態を表すことが知られている1以上のDNAマーカー領域の長さ及び
/又は配列の違いを検出及び分析するように特別に設計されている。このような
長さ及び/又は配列の変異は、「多型」と呼ばれる。このような変異が生ずるD
NA領域(即ち、遺伝子座)は、「多型遺伝子座」と呼ばれる。本発明の方法と
材料は、DNAの複数の遺伝子座の検出で使用するために設計され、DNAの複
数の遺伝子座のいくつか又はすべては、多型遺伝子座である。
学的分析のために集められた組織サンプルの同定といった、同一性用途での使用
が長く捜し求められていた。このようなマーカー及びマーカーを分析するための
方法の発見と開発は、この数年に渡っていくつかの開発段階を経てきた。
列多型性であり、サザンハイブリダイゼーションアッセイによってしばしば検出
された。制限酵素消化DNAを放射性プローブで分析するのに使用されるように
設計されている、このようなマーカーの同定を記述する参考文献の例については
、Southern、E.M.(1975)、J.Mol.Biol.98(3
):503−507;Schummら(1988)、American Jou
rnal of Human Genetics 42:143−159;及び
Wyman,A.and White,R.(1980)Proc.Natl.
Acad.Sci,U.S.A.77:6754−6758を参照されたい。
olymorphismであり、特に、「タンデム反復の変数」(VNTR)マ
ーカー(Nakamura Y.ら、(1987)、Science 235:
1616−1622;及びWhiteらに発行された(1990)米国特許第4
963663号明細書;Whiteらに発行された(1995)米国特許第49
63663号の継続出願である米国特許5411859号明細書)、及び「ミニ
サテライト」マーカー(Jeffreysら(1985a)、Nature 3
14:67−73;Jeffreysら(1985b)Nature 316:
76−79.、Jeffreysによる発明に対する米国特許第5175082
号明細書)である。VNTR及びミニサテライトマーカーの両方とも、タンデム
様式で繰り返されたほとんど同一の配列領域を含む。中心的な反復配列は、長さ
が10〜70塩基であり、「ミニサテライト」反復と呼ばれる短い中心的な反復
配列と、VNTRと呼ばれる長い反復とを持つ。人間集団の異なる個人には、異
なる反復数が含まれる。VNTRマーカーは、一般に、塩基置換多型性よりもは
るかに高い多型であり、時々、単一の遺伝子座で40以上までの対立遺伝子を示
す。しかしながら、制限酵素消化の長たらしいプロセスと次のサザンハイブリダ
イゼーション分析は、いまなお、このようなマーカーの検出と分析が要求される
。
よる米国特許第4683202号明細書)技術とVNTR遺伝子座(Kasai
,K.ら(1990)Journal Forensic Science 3
5(5):1196−1200)とを連結することを含む。サザントランスファ
ーの必要なしで検出することができる、増幅され得るVNTR遺伝子座が発見さ
れた。増幅生成物は、アガロース又はポリアクリルアミドゲルを通して分離され
、増幅中の放射能混合によって、又は、銀又は臭化エチジウムの後染色によって
検出される。しかしながら、PCRは、比較的小さいDNAセグメントを確実に
増幅するのに使用され、即ち長さ3000塩基以下のDNAセグメントとを確実
に増幅するだけである。Ponce,MとMicol,L.(1992) NA
R 20(3):623;Decorte R,ら(1990)DNA Cel
l Biol.9(6):461−469)を参照されたい。従って、ごくわず
かにしか増幅され得るVNTRは開発されなかった。
は、連鎖地図、同定と病気の遺伝子の特徴づけ、及びDNAタイピングの単純化
と精度の発達における進歩を刺激した。特に、ジヌクレオチド反復を含む多型マ
ーカー(Litt及びLuty(1989)Am J. Hum Genet
3(4):599−605;Tautz,D(1989)NAR 17:646
3−6471;Weber及びMay(1989) Am J Hum Gen
et 44:388−396;ドイツ特許第DE 38 34 636 C2号
明細書、発明者Tautz,D;Weber,L.により出願された米国特許第
5582979号明細書)、3つ又は4つのヌクレオチドの反復単位を持つST
R(Edwards,A.,ら(1991)Am.J.Hum.Genet 4
9:746−756;Hammond,H.A.,ら(1994)Am.J.H
um.Genet.55:175−189;Fregeau,C.J.;及びF
ourney,R.M.(1993) Bio Techniques 15(
1):100−119.;Schumm,J.W.ら(1994)in The
Fourth International Symposium on H
uman Identification 1993、pp.177−187(
pub.by Promega Corp.,1994);及びCaskeyら
による米国特許第5364759号明細書;Tautz,Dによるドイツ特許第
DE 38 34 636 C2号明細書)、及び5〜7塩基反復単位を持つS
TR(例えば、Edwardsら(1991)Nucleic Acids R
es.19:4791;Chenら(1993)Genomics 15(3)
:621−5;Haradaら(1994)Am.J.Hum.Genet.5
5:175−189;Comingsら(1995)、Genomics 29
(2):390−6;及びUtah Marker Development
Group(1995),Am.J.Genet.57:619−628;及び
Jurka及びPethiyagoda(1995)J.Mol.Evol.4
0:120−126)参照のこと)の発見と発達で、以前の方法の不完全なもの
の多くが克服された。STRマーカーは、一般的に、VNTRマーカーよりも短
く、たいていのVNTRマーカーよりも増幅におけるよりよい基質になる。
各遺伝子座で増幅された対立遺伝子は、長さの変異に基づいて区別される。一般
的に、実証的なSTR遺伝子座は、VNTR遺伝子座よりも、個々の遺伝子座で
多型が少ない。従って、単一の増幅反応及び分離において複数のSTR系を増幅
及び検出して、同時にいくつかの遺伝子座に対する情報を得ることが望ましい。
いくつかの遺伝子座を含む系は、多重系と呼ばれ、11個までの別個のSTR遺
伝子座を含む多くのこのような系が記述された。例えば、Proceeding
s:Amerian Academy of Forensic Scienc
es(Feb.9−14、1998)、Schumm,James W.ら、P
.53、B88;Id.Gibson,Sandra D.ら、p.53,B8
9;Id.,Lazaruk,Katherineら、p.51,B83;Sp
arkes,R.ら、Int J Legal Med (1996)109:
186−194;AmpFlSTR ProfilerTM PCR Ampli
fication Kit User’s Manual(1997),pub
.by Perkin−Elmer Corp.,i−viii及び1−1 t
o 1−10;AmpFlSTR Profiler PlusTM PCR A
mplification Kit User‘s Manual(1997)
、pub.by PerkiN−Elmer Corp.,i viii及び1
−1 to 1−10;AmpFlSTR COfilerTM PCR Amp
lification Kit User Bulletin(1998)、p
ub.by Perkin−Elmer Corp.i−iii及び1−1 t
o 1−10;9th International Symposium o
n Human Identification(October 7−10,
1998)、pub.by Promega Corp.,Staub,Ric
k W.ら、Poster Abstract 15;Id.,Willard
,Jeanne M.ら、Poster Abstract 73;及びId.
,Walsh,P.Seanら、Speaker Abstract for
8:50am−9:20am,Thursday,October 8,199
8を参照されたい。
bp)の小さな生成物を生成するように設計でき、各遺伝子座からの対立遺伝子
は、しばしば、100bp未満の領域の中に含まれる。これによって、PCRプ
ライマーの慎重な設計によって、同一ゲル又はキャピラリー電気泳動でいくつか
の系の同時電気泳動分析ができるので、個々の系からのすべての潜在的増幅生成
物は、他の系の対立遺伝子座の範囲と重複しない。これらの系の設計は、幾分、
単一ゲル又はキャピラリーの複数の遺伝子座の分離における困難性によって制限
される。これは、異なるサイズのフラグメントの特別の圧縮があるために発生し
、特に、ゲル又はキャピラリー中の長いフラグメントは、即ち、従来技術による
DNAフラグメントの分離に対する手段が一般に使用される。
DIS」)、即ちDNAタイピング情報のデータベースを確立して維持する。地
方の、州の、国の法律の施行機関は、CODISシステムを使用して、犯罪場面
で集められた犯罪科学で用いるDNA証拠をデータベース中のDNA情報と合わ
せる。CODIS及び他の国のデータベースシステムは、これらの機関が、凶暴
な犯罪を解決するのに使用するための有効な道具であることが立証された。(例
えば、Niezgoda,Stephen,in Cambridge Hea
lthtech Institute’s Second Annual Co
nference on DNA Frensics;Science,Evi
dence,and Future Prospects(Nov.17−18
、1998)、pp.1−21.;Niezgoda、Stephen in
Proceedings From The Eighth Internat
ional Simposium on Human Identificat
ion 1997、pub.by Promega Corporation(
1998)、pp 48−49;Frazier,Rachel R.E.ら、
Id.,pp.56−60;Niezgoda,S.J.profiles i
n DNA 1(3):12−13;Werrett,D.J.and Spa
rkes,R.in Speaker Abstracts:9th Inte
rnational Symposium on Human Identif
ication(Oct.7−10,1998)pp.5−6を参照されたい。
)最近まで、特定のVNTR遺伝子座の分析から得られた制限酵素断片長多型(
「RFLP」)データのみが、データベースの中心的要素と考えられていた。F
BIは、最近、CODISデータベース中に含まれるべきものとして13個の多
型STR遺伝子座を特定した。13個のCODIS STR遺伝子座は、HUM
CSF1PO、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179
、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、HUMFI
BRA、HUMTH01、HUMTPOX及びHUMvWFA31である。(B
udowle,Bruce and Moretti,Tamyra in S
peaker Abstracts:9th International S
imposium on Human Identification(Oct
.7−10,1998)pp.7−8を参照されたい。) VNTR及びSTR
マーカーデータの両方とも、一般に、CODISデータベースに保存されている
。(例えば、Niezgoda,Stephen in Second Ann
ual Conference on DNA Forensics,supr
aを参照されたい。)本発明がなされるまで、単一の反応で共増幅され、その後
分析できる遺伝子座の数は、制限されていた。詳細には、13個以上のSTR遺
伝子座、ましてCODISデータベースでの使用のために特定された13個の多
型STR遺伝子座の多重増幅での使用のための材料及び方法は、開発されていな
かった。
体分析(multiplex analysis)での使用のために設計され、
DNAには、異なるソースの変異からの一本鎖及び2本鎖DNAが含まれる。本
発明は、現在の技術を越える有意な改良を示し、識別、精度及び連鎖解析におけ
るDNAプロファイリングへの処理量、刑事裁判、親子鑑定、及び他の法廷の、
医学的な及び遺伝的な特定用途の増加した能力を導く。
供することであり、遺伝子座は、複数の異なる多型の短いタンデム反復(STR
)遺伝子座を含み、単一の多重反応で、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動又
は他の分離方法及び検出方法と組み合わせてPCR又は他の増幅反応システムを
使用し、多重反応で増幅された各遺伝子座の対立遺伝子の相対的な長さを分析し
、比較する。ここで開示された遺伝子座の組の多重体分析は、従来技術において
まだ記述されていない。また、ここで以下に開示されるプライマーの多くの配列
は、従前に記述されたことはなく、これらのプライマーの記述のすべては、開示
された遺伝子座の組の多重増幅において有用であることが分る。
幅に対して特異的なプライマーを提供することである。
lex)の個々の遺伝子座に存在する対立遺伝子を同時に分析し、決定するため
の方法及び材料に関する。一般に、本発明の方法は、(a)分析すべき少なくと
も1つのDNAサンプルを得る工程であって、DNAサンプルは、共増幅され得
る、少なくとも13個の遺伝子座を有する工程と、(b)DNAサンプルの少な
くとも13個の遺伝子座を共増幅する工程と、(c)使用される系の多型性を示
す型で、増幅された材料を検出する工程とを含む。
に存在する対立遺伝子を同時に決定する方法であり、以下の工程を含む。 (a)分析すべき少なくとも1つのDNAサンプルを得る工程 (b)DNAサンプルの一組の対立遺伝子を選択する工程であって、共増幅で
きる、少なくとも13個のタンデム反復遺伝子座を含む工程 (c)多重増幅反応で組の中の遺伝子座を共増幅する工程であって、反応生成
物が、組の中の共増幅された各遺伝子座から増幅された対立遺伝子の混合物であ
る工程 (d)混合物中の増幅された対立遺伝子を評価して、DNAサンプル中の、組
の中の分析された各遺伝子座に存在する対立遺伝子を決定する工程 少なくとも13個の短いタンデム反復遺伝子座の少なくとも4個が、以下の遺伝
子座及びこれらの任意の組合せに係る遺伝子座であることが好ましい。 D3S1539、D4S2368、D5S818、D7S820、D9S930
、D10S1239、D13S317、D14S118、D14S548、D1
4S562、D16S490、D16S539、D16S753、D17S12
98、D17S1299、D19S253、D20S481、D22S683、
HUMCSF1PO、HUMTPOX、HUMTH01、HUMF13A01、
HUMBFXIII、HUMLIPOL及びHUMvWFA31 本発明の別の態様において、方法の工程(b)で選択された遺伝子座の組は、1
3個のCODIS STR 遺伝子座(即ち、D3S1358、D5S818、
D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S5
1、D21S11、HUMCSF1PO、HUMFIBRA、HUMTH01、
HUMTPOX、及びHUMvWFA31)を含み、本発明の方法を使用して、
遺伝子座自体又は追加の遺伝子座と共に、共増幅され、分析される。
するためのキットであり、分析すべきゲノムDNAの一組の遺伝子座を共増幅す
るためのオリゴヌクレオチドプライマーを含み、遺伝子座の組は、同一の多重反
応で共増幅され得る少なくとも13個の短いタンデム反復遺伝子を含み、プライ
マーは、1以上の容器の中にある。更に好ましくは、キットは、ヒトゲノムDN
Aの少なくとも13個の遺伝子座の一組を共増幅するためのオリゴヌクレオチド
プライマー対を含み、遺伝子座の組は、D3S1358、D5S818、D7S
820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D
21S11、HUMCSF1PO、HUMFIBRA、HUMTH01、HUM
TPOX、及びHUMvWFA31を含む。
めのプライマー配列とプライマー対である。ヒトDNAの多重体分析に対する本
発明のプライマーとプライマー対の使用は、ここで、以下に説明される。本発明
のプライマーは、本発明の方法での使用に適合し、プライマーは、以下に示した
、標識された形態で使用され、方法の評価工程を補助する。
析における時間、仕事及び材料の節約を生む。本発明の方法により、分離チュー
ブで又は小さい遺伝子座群で個々に各遺伝子座を増幅する代わりに、13個以上
、16個以上もの遺伝子座を、単一の増幅反応を用いて1本のチューブで共増幅
することができる。
伝病と癌の検出の分野において特有の用途を有する。本発明の13個の方法によ
って、あるDNAが同一人の異なるサンプルから調製されたDNAとマッチする
ことができる確実性を有意に増加する。非常に少ないDNA量を含むサンプル間
で正確にマッチする、又は区別する必要性は、特に、犯罪科学の用途で急がれ、
ここでは、多くの有罪(及び無罪)は、DNAタイピング分析で変わる。
的に有意であることを確実にするために、DNAの多重多型遺伝子座を分析する
必要を長く理解していた。(Presley,L.A.ら、in The Th
ird International Symposium on Human
Identification 1992,pp.245−269(pub.
by Promega Corp.,1993);Bever, R.A.,ら
、in The Second International Symposi
um on Human Identification 1991、pp.1
03−128.(pub.by Promega Corp.,1992)を参
照されたい。)しかしながら、本発明がなされるまで、単一の反応で13個以上
のSTR遺伝子座を同時に分析できなかった。このような多重性能の重要性を理
解することは、DNAタイピング分析の後のいくつかの数学的処理を理解するの
を助ける。
子座2個のパターン)を有すると想定する。換言すれば、2つの無作為に選択さ
れた個体が、1つのSTRについてマッチする型を有する機会は、1/10であ
ると想定する。しかしながら、2つの異なるSTR遺伝子座を分析した場合、両
方の系との無作為マッチングする機会は、1/100である。3つのSTR遺伝
子座を分析する場合、3つの系の各々の無作為マッチングする機会は、1/10
00等である。従って、分析されるSTR遺伝子座の数を増加すると、一般の個
体群の中で無作為マッチングの見込みが減ることは簡単に分り、その機会を増加
することによって、犯罪場面の証拠と個人の型を比較することで、犯罪現場での
容疑者の存在を正確に特定することができる。同様の理由は、本発明の方法も、
父系において被疑父親を正確に特定、骨髄組織の正しい適合、連鎖地図研究の有
意な結果の展開、及び遺伝病と癌の検出等の可能性を見込みを増加させることを
結論付けるのに使用できる。
ード及び図面から明らかである。
ることにおいて補助するものであり、本発明を記述し、定義するのに使用される
。 「対立遺伝子ラダー(allelic ladder)」;遺伝子座から増幅
された対立遺伝子を含むスタンダードサイズマーカー。 「対立遺伝子(allele)」;DNAセグメントに関連する遺伝的変異で
あり、即ち、同じ遺伝子座を占有するDNA配列の2つ以上の別形態の1つ。 「生化学的命名法(biochemical nomenclature)」
;標準生化学的命名法は、ここで使用され、ヌクレオチドの塩基は、アデニン(
A)、チミン(T)、グアニン(G)及びシトシン(C)と呼ばれる。対応する
ヌクレオチドは、例えば、デオキシグアノシン−5’−トリフォスフェート(d
GTP)である。 「DNA多型(DNA polymorphism)」;DNA配列の2以上
の異なるヌクレオチド配列が、同じ雑種群の中に共存する状態。 「座(locus)」又は「遺伝子座(genetic locus)」;染
色体上の特異的な場所。遺伝子座の対立遺伝子は、相同染色体上の同じ位置に位
置する。 「遺伝子座特異的プライマー(locus−specific primer
)」;少なくとも遺伝子座の1つの対立遺伝子に対して、示された遺伝子座又は
その相補鎖の一部で特異的にハイブリダイズするプライマーで、かつ、増幅法を
用いた状態の下で、他のDNA配列で有効にハイブリダイズしない。 「ペンタヌクレオチドタンデム反復(pentanucleotide ta
ndem repeat)」;下記に定義されたSTR多型のサブクラス。別に
詳述されていなければ、「ペンタヌクレオチドタンデム反復」の用語は、反復単
位が5塩基配列である完全STR、及び少なくとも1つの反復単位が、5塩基反
復である不完全STRを含む。 「ポリメラーゼ連鎖反応(polymerase chain reacti
on)」又は「PCR」;変性、プライマーでのアニーリング、DNAポリメラ
ーゼでの伸長のサイクルが、約106回以上目的のDNA配列のコピーの数を増
幅するのに使用される技術。核酸増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応プロセスは
、米国特許第4683195号及び第4683202号明細書によってカバーさ
れており、プロセスの記述に対して、ここで参考として組み込む。 「多型の短いタンデム反復遺伝子座(polymorphic short
tandem repeat loci)」;下記に定義された、STR遺伝子
座で、ゲノムDNAの特別領域の繰り返し配列エレメントの数(及び配列の最終
的な長さ)が、対立遺伝子から対立遺伝子、及び個体から個体に変異する。 「多型情報量(polymorphism information con
tent)」又は「PIC」;遺伝子座に存在する多型の量の測定(Boste
inら、1980)。PICは、多型のより大きな程度を示すより高い値で、0
〜1.0の範囲を評価する。この測定は、一般に、測定に通常使用される他のも
のよりも小さい値を表示し、即ち、 異型接合性;高い有益な(約70%を超える異型接合性)マーカーに対して、異
型接合性とPICとの違いは僅かである。 「プライマー(primer)」;プライマーの3’末端が、DNAポリメラ
ーゼ酵素を使用する重合部位として作用するといった方法での、遺伝子座のDN
A鎖でハイブリダイズする1本鎖オリゴヌクレオチド又はDNAフラグメント。 「プライマー対(primer pair)」;2つのプライマーを含み、プ
ライマー1は、増幅すべきDNA配列の一方の端の1本鎖にハイブリダイズし、
プライマー2は、増幅すべきDNA配列の相補鎖上のもう一方の端でハイブリダ
イズする。 「プライマー部位(primer site)」;プライマーがハイブリダイ
ズする目的DNAの領域。 「短いタンデム反復遺伝子座(short tandem repeat l
oci)」又は「STR遺伝子座(STR loci)」;長さが3〜7塩基対
の短い、繰り返し配列エレメントを含むゲノムDNA領域。また、STRという
用語はゲノムDNAの領域を含み、単一の3〜7塩基配列よりもタンデム又は介
在塩基を伴って繰り返される。STRで少なくとも1度繰り返された各配列は、
ここで、「反復単位」と呼ばれる。
erfect)又は不完全(imperfect)の、2つの一般的なカテゴリ
ーに分けられる。「完全」STRという用語は、ここで使用されるときは、少な
くとも2度のタンデムで、繰り返される単一の3〜7塩基反復単位、例えば(A
AAAT)2を含む2本鎖DNAの領域を意味する。「不完全」STRという用
語は、ここで使用されるときは、完全な反復単位の少なくとも2つのタンデム反
復と、不完全な反復単位の少なくとも1つの反復を含むDNAの領域をいい、こ
こで、不完全反復単位は、完全反復単位の配列における、1、2、3、又は4つ
の塩基の挿入、欠失、又は置換、例えば、(AAAAT)12(AAAAAT)5
AAT(AAATT)4を生じるDNA配列を含む。不完全STR配列毎には少
なくとも1つの完全STR配列が含まれる。詳細には、各STR配列は、完全又
は不完全のいかんにかかわらず、タンデムで少なくとも2度現れる少なくとも1
つの反復単位配列、即ち以下の式(I)で表すことのできる反復単位配列を含む
。 (AwGxTyCz)n (I) ここで、A、G、T及びCは、どんな順でも存在するヌクレオチドを示し、w、
x、y及びzは、配列の各ヌクレオチドの数を示し、0〜7の範囲で変化し、w
+x+y+zの合計は3〜7の範囲であり、nは、タンデムで繰り返される配列
回数の数を示し、少なくとも2である。
ずるのに適切な、遺伝子座の組、プライマー及び増幅プロトコルを選択し、好ま
しくは共増幅される遺伝子座は、サイズで重複せず、より好ましくは、共増幅さ
れる遺伝子座は、サイズが重複する異なる遺伝子座の対立遺伝子間を識別するこ
とを可能にする方法で、ラベルされる。加えて、この方法は、単一の増幅プロト
コルでの使用に融和性のある、短いタンデム反復遺伝子座を選択することを企図
する。ここで説明される遺伝子座の特定の組合せは、この用途において唯一のも
のである。遺伝子座の組合せは、前述の2つの理由のどちらかによって、又はこ
れと組合せて、1以上の遺伝子座が、十分な生成物収量を生成せず又は真の対立
遺伝子を表現しないフラグメントがこの反応で生成しない理由によって、却下さ
れるかもしれない。
、プライマー対の配列の選択、含まれるすべての遺伝子座が増幅できるような平
衡を特定するプライマー濃度の調整によって、生じることができる。本発明の方
法及び材料が一旦開示されれば、本発明の方法及びキットに使用する遺伝子座、
プライマー対及び増幅技術の様々な方法が当業者に対して示唆されていると考え
られる。すべてのこのような方法は、添付したクレームの範囲内にあることが企
図される。
の遺伝子座から調製される、共増幅された対立遺伝子座のサイズ範囲である。現
在技術によって分析を容易にするためには、500塩基よりも小さいフラグメン
トの増幅によって検出できるシステムが、最も好ましい。
子座の選択で始まり、遺伝子座は、単一の多重増幅反応で共増幅される。本発明
の方法の多重増幅反応で遺伝子座を増幅するのに使用される遺伝子座とオリゴヌ
クレオチドプライマーとの選択は、これ以後に記述され、以下の実施例で説明さ
れる。
座の多重体の使用 いずれの異なる技術も、本発明に使用する一組の遺伝子座を選択するのに使用
することができる。この分析方法で使用する遺伝子座の有用な組を開発するため
の好ましい技術の1つが以下に記述される。3つのSTR遺伝子座を含む多重体
が一旦開発されれば、3つより多いの遺伝子座を含む多重体を作る核として使用
できる。従って、3つより多い遺伝子座の新しい組合せは、始めの3つの遺伝子
座を含んで作られる。例えば、遺伝子座D7S820、D13S317及びD5
S818を含む核となる多重体を使って、以下の誘導多重体を生成した。 D16S539、D7S820、D13S317及びD15S818 HUMCSF1PO、HUMTPOX、D16S539、D7S820、D1
3S317及びD5S818 HUMCSF1PO、HUMTPOX、HUMTH01、D16S539、D
7S820、D13S317及びD5S818 HUMCSF1PO、HUMTPOX、HUMTH01、HUMvWFA31
、D16S539、D7S820、D13S317及びD5S818 D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S3
17、D16S539、D18S51、D21S11、HUMCSF1PO、H
UMFIBRA、HUMTH01、HUMTPOX及びHUMvWFA31 S159、HUMCSF1PO、D16S539、D7S820、D13S3
17及びD5S818 D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S3
17、D16S539、D18S51、D21S11、HUMCSF1PO、H
UMFIBRA、HUMTH01、HUMTPOX及びHUMvWFA31 D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S3
17、D16S539、D18S51、D21S11、HUMCSF1PO、H
UMFIBRA、HUMTH01、HUMTPOX、HUMvWFA31、G4
75、S159及びアメロゲニン
適切なSTR遺伝子座の組の誘導体を生成するのに使用されることを企図する。
本発明の方法を使用して分析される遺伝子座を選択するために使用されるどんな
方法にもかかわらず、多重体分析のために選択された遺伝子座のすべては、以下
の特徴を共有する。(1)遺伝子座は、評価できるだけの十分な増幅生成物を調
製する。(2)遺伝子座は、多重増幅工程中の増幅された対立遺伝子座への塩基
の付加(又は塩基の付加なし)による人工産物でさえ、ほとんど生成しない。(
3)遺伝子座は、ポリメラーゼによる増幅反応の未熟終結による人工産物でさえ
、ほとんど生成しない。(4)遺伝子座は、供給された真の増幅された対立遺伝
子の下流の継続的な1塩基欠失から、より小さい分子量の「引きずった(tra
iling)」バンドをほとんど又はまったく生成しない。例えば、Schum
mら、Fourth International Symposium on
Human Identification 1993、pp.177−18
7(pub.by Promega Corp.,1994)を参照されたい。
は、本発明の分析方法の好ましい態様によれば、ヒトゲノムDNAの13個以上
の遺伝子座の選択又は多重体分析に適用できる。上述の特定された遺伝子座のど
んな組でも、本発明に従った多重体分析に適合し、提供された遺伝子座の組は、
少なくとも13個のSTR遺伝子座を含む。より好ましくは、本発明に従って分
析された少なくとも13個のSTR遺伝子座の少なくとも4つは、以下の遺伝子
座及びこれらの任意の組合せに係る遺伝子座から選択される。 D3S1539、D4S2368、D5S818、D7S820、D9S930
、D10S1239、D13S317、D14S118、D14S548、D1
4S562、D16S490、D16S539、D16S753、D17S12
98、D17S1299、D19S253、D20S481、D22S683、
HUMCSF1PO、HUMTPOX、HUMTH01、HUMF13A01、
HUMBFXIII、HUMLIPOL及びHUMvWFA31 更により好ましくは、本発明に従って分析された遺伝子座の組は、13個のCO
DIS遺伝子座のすべて、即ち、D3S1358、D5S818、D7S820
、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S
11、HUMCSF1PO、HUMFIBRA、HUMTH01、HUMTPO
X、及びHUMvWFA31を含む。
とも1つは、長さが5〜7塩基又は塩基対の反復単位を持つSTR遺伝子座であ
り、より好ましくは、ペンタヌクレオチド反復を持つSTR遺伝子座である。米
国特許出願第09/018584号明細書で説明されているので、ここに参考と
して組み込み、このような中間の長さの反復を持つ遺伝子座は、人工産物につい
て最小の発生率で増幅され、例えば、反復のずれによる。ペンタヌクレオチド反
復を持つ3つのこのような遺伝子座、G475、C221及びS159は、直ち
に上記で特定された遺伝子座の組に含まれる。「G475」、「C221」及び
「S159」の用語は、ここで使われ、特定されたペンタヌクレオチド反復遺伝
子に割り当てられた名前をいい、上に参考として組み込まれた、米国特許出願第
09/018584号明細書に記述される。それぞれの名前は、特定された各ペ
ンタヌクレオチド遺伝子座からのクローンに一致する。G475クローンの配列
は、配列ID番号34として上記米国明細書に記述され、配列ID番号108と
して本明細書で特定される。C221クローンの配列は、配列ID番号2として
上記米国明細書に記述され、配列ID番号109として本明細書で特定される。
S159クローンの配列は、配列ID番号26として上記米国明細書で記述され
、配列番号110として本明細書で特定される。また、G475、C221及び
S159の増幅に使用する特定された個々のプライマーとプライマー対は、本発
明に従って共増幅され分析される少なくとも13個の遺伝子座の組の中の同じ遺
伝子座を増幅するのに使用される。
組は、少なくとも13個のSTR遺伝子座に加えて少なくとも1つの遺伝子座を
含む。好ましくは、この追加の遺伝子座は、配列多型を含み、又は1個体のDN
Aを、個体群の他の個体のDNAから分離する、別の特徴を含む。より好ましく
は、追加の遺伝子座は、分析されるDNAサンプルのソースの性を同定する遺伝
子座である。DNAサンプルがヒトゲノムDNAの場合、アメロゲニン遺伝子座
といった性同定遺伝子座が、本発明の方法に従って共増幅及び分析のために選択
されることが好ましい。アメロゲニン遺伝子座は、HUMAMELY(男性のD
NAに含まれるY染色体上の遺伝子座を同定するのに使用される場合)、又はH
UMAMELX(男性又は女性のDNAのX染色体上の遺伝子座を同定するのに
使用される場合)としてGenBankによって同定される。アメロゲニン遺伝
子座は、少なくとも13個の短いタンデム反復遺伝子座の組と同じ多重体増幅反
応で共増幅される場合、多重体増幅反応でこの特定の遺伝子座を増幅するのに使
用される少なくとも1つのプライマーの配列は、配列ID番号86、105及び
87及びこれらの任意の組合せに係る配列を有することが好ましい。
組で共増幅する各遺伝子座に適合できるプライマーを決定することができる。多
重反応で使用されるプライマーの配列の選択に注意すべきである。プライマーの
不適切な選択は、増幅の不足、複数の部位での増幅、プライマーのダイマー形成
、異なる遺伝子座のプライマー配列の望ましくない相互作用、別の遺伝子座の対
立遺伝子と重複するある遺伝子座の対立遺伝子の生成、又は多重体に不適合な異
なる遺伝子座に対する増幅の条件又はプロトコルの必要性といった、いくつかの
望ましくない効果を生む。好ましくは、本発明の方法で使用されるプライマー又
は本発明のキットに含まれるプライマーは、以下の選択プロセスに従って選択さ
れる。
れ、選択するプライマー配列の反復プロセスを使用すること、選択された遺伝子
座の共増幅のプライマーを混合すること、遺伝子座を共増幅すること、次に共増
幅された生成物を分離し検出することによって開発され選択される。当初、この
プロセスは、しばしば、不均衡な型(即ち、他の遺伝子座の生成物収量よりもい
くつかの遺伝子座の生成物収量が高い)で増幅された対立遺伝子を生じ、また、
対立遺伝子自体を表現しない増幅生成物を生成する。これらの余分なフラグメン
トは、上述した原因のかなり多くのものから生ずる。
イマーは、同じ又は他の遺伝子座のプライマーと一緒に使用して、余分なフラグ
メントの増幅に寄与するプライマーを特定する。1つ以上のフラグメントを生成
する2つのプライマーが一旦特定されると、1対のみ又は多重系(又は多重系の
サブセット)のどちらにおいても、一方又は両方の寄与物は、変更され再試験さ
れる。このプロセスは、余分なフラグメントのない又は多重系の余分なフラグメ
ントの許容できるレベルの増幅された対立遺伝子座の生成物収量の評価まで繰り
返される。
とによって除かれる。この変化は、検出工程での反対のプライマーの生成物を示
す。この新たな標識されたプライマーは、真の対立遺伝子を生成する、先にラベ
ルされたプライマーよりもさらに高い忠実度で真の対立遺伝子を増幅し、全増幅
生成物のほとんどの割合を占める。
かで行うが、好ましくは、その選択後に行う。一般的に、特定の遺伝子座に対す
るプライマー濃度の増加は、その遺伝子座に対して生じる生成物の量を増加する
。しかしながら、これは、相互に反復するプロセスであり、1つの遺伝子座の収
量を増加することによって、1つ以上の他の遺伝子座の収量が減少するからであ
る。その上、プライマーは、直ちに他の遺伝子座の収量と相互に作用する。プラ
イマー濃度の直線的な増加は、対応する遺伝子座における生成物収量の直線的増
加を必ずしも生じない。
って影響され、例えば使用された鋳型の量、増幅サイクルの数、温度サイクルプ
ロトコルのアニーリング温度及びサイクルプロセスの終りでの余分な伸張工程の
包含と排除といったパラメータに影響される。すべての対立遺伝子座及び遺伝子
座に渡る平衡でさえ、一般的に、達成されない。
セスであってもよい。即ち、まず、少数の遺伝子座における多重系を開発するこ
とが可能であり、即ちこの系は、増幅の余分なフラグメントを逃れるか又はほと
んど逃れる。この系のプライマーは、1つ以上の追加の遺伝子座のプライマーと
結合してもよい。この拡張されたプライマーの組合せは、増幅の余分なフラグメ
ントを生成するかも知れないし又は生成しないかもしれない。順番に、新しいプ
ライマーは、導入されて評価されてもよい。
定されるまで繰り返され、完全なプライマーの組は、上述したように、共増幅の
ために選択された少なくとも13個の遺伝子座を共増幅するのに使用される。多
くの異なるプライマーの組を、特定の遺伝子座の組を増幅するのに開発できるこ
とがわかる。
オチド合成の標準的な手順を用いて実施される。好ましくは、各遺伝子座に対す
る少なくとも1つのプライマーは、以下のセクションFで述べるように、色素ラ
ベルと共有結合される。
るのに適切であると決定されたプライマーの配列のリストを提供する。好ましく
は、表1に挙げられた少なくとも1つのプライマーは、上述の、共増幅及び分析
のために選択された少なくとも1つの遺伝子座を増幅するのに使用される。他の
プライマーによって、プライマーが以下に挙げられた遺伝子座の同時増幅に適切
であることを特定できることがわかる。
増幅に適合性のあるDNA調製方法を使用する。このような多くの方法は、当業
者に公知である。この例として、フェノール抽出によるDNA精製(Sambr
ook,J.,ら(1998)Molecular Cloning: A L
aboratory Manual,Second Edition,Cold
Spring Harbor Laboratory Press,Cold
Spring Harbor,New York.,pp.9.14−9.1
9)、及び塩析による部分的精製(Miller,S.ら(1998)Nucl
.Acids Res.16:1215)又はチレックス(chelex)(W
alshら、(1991) Bio Techniques 10:506−5
13,Comey,ら(1994)Forensic Sci.39:1254
)及び未処理血液を使用する未精製材料の遊離(Burckhardt,J(1
994) PCR Methods and Applications 3:
239−243,McCabe,Edward R.B.,(1991) PC
R Methods and Applications 1:99−106,
Mordvag,Byorn−Yngvar(1992) Bio Techn
iques 12:4 pp.490−492)によるDNA精製が挙げられる
が、これらに限定されない。
ノムDNAである場合、そのDNAは、好ましくは、血液、精液、膣細胞、毛、
唾液、尿、骨、口内サンプル、胎盤細胞又は胎児細胞を含む羊水、絨毛膜絨毛、
及び上記に挙げた組織の混合物又はこれらの任意の組合せに係る組合せから選択
された組織から調製される。
DNA定量の標準的な方法を使用する。このような場合、好ましくは、DNA濃
度は、Sambrook,J.ら(1989),supra,Appendix
E.5によって記述された分光光度計測定によって決定するか、又は例えばB
runk C.F.,ら(1979),Anal Biochem 92:49
7−500によって記述された測定技術を使用して蛍光定量的に決定される。よ
り好ましくは、DNA濃度は、ヒト特異的プローブでDNAスタンダードのハイ
ブリダイゼーションの量を比較することによって測定され、例えばWaye,J
.S.ら(1991)“Sensitive and specific qu
antification of human genomic deoxyr
ibonucleic acid (DNA) in forensic sc
ience specimens:casework examples”,J
.Forensic Sci.,36:1198−1203に記述されている。
増幅反応における非常に多量の鋳型DNAの使用は、真の対立遺伝子を表さない
過剰なバンドとして示される人工産物を生成する。
の多重増幅工程で共増幅される。多くの異なる増幅方法の一つは、遺伝子座を増
幅するのに使用され、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(Saiki,R.K.
,ら(1985),Science 230:1350−1354)、増幅の基
礎を形成する転写(Kwoh,D.Y.及びKwoh,T.J.(1990),
American Biotechnology Laboratory,Oc
tober,1990)及び鎖置換増幅(strand displaceme
nt amplification)(SDA)(Walker,G.T.,ら
(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.89:3
92−396)を含むが、これらに限定されない。好ましくは、DNAサンプル
は、組の各遺伝子座に特異的なプライマー対を使用してPCR増幅にかけられる
。参考に、以下の実施例で使用されるプライマー配列の詳細において、本明細書
の最後に配列一覧表にし、プライマー配列のいくつかは、本発明の別の態様であ
る。
と共有結合し、蛍光色素ラベルが更に好ましい。プライマー及びプライマーに結
合された色素は、好ましくは、多重増幅反応のために選択され、例えば、好まし
くは、対立遺伝子がゲルまたはキャピラリー電気泳動で分離される場合、1色で
標識された各遺伝子座のプライマーを使用して増幅された対立遺伝子は、同じ色
で標識されたプライマーを使用して共増幅された組の他の遺伝子座の対立遺伝子
と重複しないことが好ましい。
子座のための少なくとも1つのプライマーは、反応で使用されるよりも先に、蛍
光ラベルで標識される。本発明で使用するプライマーへの結合に適切な蛍光ラベ
ルは、市販で入手できる。例えば、PE Biosystems and Mo
lecular Probesのフルオレセインラベル及びカルボキシテトラメ
チルローダミンラベル及びこれらの化学的誘導体を参照されたい。最も好ましく
は、少なくとも3つの異なるラベルが、多重増幅反応に使用される異なるプライ
マーを標識するのに使用される。サイズマーカーが多重反応を評価するために含
まれる場合、サイズマーカーを調製するのに使用されるプライマーは、反応で重
要な遺伝子座を増幅するのに使用されるプライマーと異なるラベルで標識される
ことが好ましい。
しい増幅プロトコルの詳細は、以下の実施例で与えられる。また、各多重体に関
する特別の手順の付加的な詳細については、実施例を参照されたい。実施例で使
用される遺伝子座特異的プライマーの配列は、多くのヌクレオチドを含み、ヌク
レオチドは、ハイブリダイゼーションで使用される条件下で、増幅され且つ他の
遺伝子座の対立遺伝子の増幅の本質的にない遺伝子座の対立遺伝子とハイブリダ
イズするのに十分である。Simonsの米国特許第5192659号明細書が
参考になり、明細書の教示を、遺伝子座特異的プライマーのより詳細な開示にお
ける参考として、ここで組み込む。
増幅された対立遺伝子が評価される。この方法の評価工程は、多くの異なる方法
によって行われるが、最も好ましい方法は、以下に記述される。
に好ましくは、キャピラリー電気泳動(例えば、Buel,Ericら(199
8)Journal of Forensic Sciences;43:(1
)pp.164−170を参照されたい)又は、変性ポリアクリルアミドゲル電
気泳動(例えば、Sambrook,J.ら(1989)in Molecul
ar Cloning−A Laboratory Manual,2nd E
dition Cold Spring Harbor Laboratory
Press,pp.13.45−13.57を参照されたい)である。本発明
の方法の評価工程での使用に適切なゲル調製及び電気泳動手順と条件は、以下の
実施例で説明される。変性ポリアクリルアミドゲル及びキャピラリー電気泳動で
のDNAフラグメントの分離は、第1にフラグメントサイズに基づいて起こる。
立遺伝子及び他のDNA(例えば、DNAサイズマーカー又は対立遺伝子ラダー
)は、視覚化され、分析される。ゲル中のDNAの視覚化は、多くの従来技術の
いずれか一つを使用して行われ、例えば、銀染色や、ラジオアイソトープ、蛍光
剤、化学発光剤及び検出可能な基質と組み合わせた酵素といったレポーターを含
む。しかしながら、13個又はそれ以上の遺伝子座を含む多重体の検出に好まし
い方法は、蛍光であり(例えば、上記Schumm,J.W.ら Procce
dings from the Eigth International S
ymposium on Human Identification,(pu
b.1998 by Promega Corporation)pp.78−
84;Buel,Ericら(1998),を参照されたい)、多重反応の各遺
伝子座のプライマーは、蛍光検出器を使用する標識生成物の検出によって追跡さ
れる。遺伝子座を視覚化する従来技術の方法を記述する、上記に引用された参考
文献を、ここに参考として組み込む。
座特異的対立遺伝子ラダーといったサイズスタンダードとの比較によって決定さ
れ、サンプル中の各遺伝子座に存在する対立遺伝子を決定する。2つ以上の多重
STR遺伝子座を含む多重増幅の評価における最も好ましいサイズマーカーは、
評価される各遺伝子座の対立遺伝子ラダーの組合せを含む。例えば、Puers
,Christophら(1993)Am J.Hum Genet.53:9
53−958,Puers,Christoph,ら(1994)Genomi
cs 23:260−264を参照されたい。また、STR遺伝子座の検出の使
用に適切な対立遺伝子ラダーの開示、及びそれに開示されたラダー作製の方法に
おいて、米国特許第5599666号、同第5674686号及び同第5783
406号明細書を参照されたい。
入が起こると同時に、これらの対立遺伝子ラダーを混合し、ゲル電気泳動におい
て装入してもよい。各対立遺伝子ラダーは、対応する遺伝子座のサンプルの対立
遺伝子と一緒に移動する。
クリルアミドゲルの同じレーン又は同じキャピラリーで進むように設定されたサ
イズマーカーの特定タイプを使用して評価される。このインターナルレーンスタ
ンダードは、好ましくは、既知の長さの一連のフラグメントを含む。更に好まし
くは、インターナルレーンスタンダードは、増幅反応で他の色素と区別できる蛍
光色素で標識される。
増幅されたサンプル又は対立遺伝子ラダーと混合され、ゲル電気泳動の異なるレ
ーンでの移動の比較、又はキャピラリー電気泳動の異なるキャピラリーでの移動
の比較のための電気泳動に装入される。インターナルレーンスタンダードの移動
の変化は、分離媒体の性能の変化を示す。対立遺伝子ラダーでこの差と相関を定
量化することよって、未知のサンプルの対立遺伝子のサイズ決定の訂正ができる
。
生成された混合物の中の増幅対立遺伝子を評価するのに使用される。以下は、好
ましい検出方法が実施される方法の概要である。
なわれる。蛍光分析において、1つの蛍光標識プライマーは、各遺伝子座の増幅
に含まれる。好ましくは、本発明の使用に適合する蛍光標識プライマーは、例え
ば、以下の実施例で説明されるように、フルオレセイン標識(FL−)、カルボ
キシテトラメチルローダミン標識(TMR−)、及び5,6−カルボキシローダ
ミン6G標識(R6G)プライマーを含む。このように標識されたプライマーを
使用する増幅フラグメント生成物の分離は、好ましくは、スラブゲル電気泳動又
はキャピラリー電気泳動で行われる。分離フラグメントの結果は、例えば、AB
I PRISM(登録商標)310 Genetic Analyzer、AB
I PRISM 377 DNA Sequencer(Applied Bi
osystems Division,Perkin Elmer、Foste
r City、CA)、又はHitachi FMBIO(登録商標)II F
luorescent Scanner(Hitachi Software
Engineering Ameria,Ltd.South San Fra
ncisco,CA)といった蛍光検出装置を使用して分析される。
実施される。この好ましい検出方法において、多重増幅反応で使用される各プラ
イマー対の一方または両方は、プライマー対に結合された蛍光ラベルを有し、そ
の結果、増幅反応から生成された増幅対立遺伝子は、蛍光標識される。本発明の
最も好ましいこの態様において、増幅された対立遺伝子は、キャピラリー電気泳
動で同時に分離され、分離された対立遺伝子は、蛍光イメージアナライザーを使
用して視覚化され、分析される。
要求されず、及びこのような材料の使用に付随する規制の問題及び安全性の問題
のすべてを要求されないからである。
色といった検出方法以上に好ましく、一般的に、蛍光の検出方法は、銀染色より
増幅人工産物を示さないからである。人工産物が少ないのは、一部分には、結合
標識を持つDNAの増幅鎖だけが蛍光検出で検出され、一方、多重増幅反応から
生成されたDNAの各増幅対立遺伝子の両方の鎖が、銀染色の検出方法を使用し
て染色され、検出されることによる。
は、1以上の遺伝子座特異的プライマーを有する容器を含む。任意で使用説明書
を含んでもよい。
幅のための十分な量の酵素、増幅を促進する増幅緩衝液、電気泳動用の増幅され
た材料を分離するための添加液、鋳型コントロールとしてのゲノムDNA、分離
媒体中で先行して材料が移動することを保証するサイズマーカー、及び使用者を
教育し、使用中の失敗を防ぐためのプロトコルとマニュアルを含んでもよい。ま
た、キットの様々な試薬の量は、多くの要因、例えば工程の最適感度といった要
因によって変化する。手動で使用するためのテストキットや自動検出又は分析で
使用するためのテストキットを提供することは、本発明の範囲内である。
び使用において補助するために提示される。実施例は、例示として意図され、特
許によって認められる本発明の範囲を何ら制限するものではない。
養細胞から調製され、Miller and Dykes in (Mille
r,S.ら(1998)Nucl. Acids Res.16:1215)に
よって記述された標準的な手順を用いた。ここで記述された単離及び定量方法は
、一般に、当業者に公知であり、好ましくは、本発明の適用において、要求され
ない。
以上のDNAサンプルから、少なくとも13個の遺伝子座に存在する対立遺伝子
を同時に決定する。以下の共増幅された遺伝子座の各組は、CODISシステム
における使用のために特定された13個の短いタンデム反復遺伝子座(即ち、D
3S1358、HUMTH01、D21S11、D18S51、HUMvWFA
31、D8S1179、HUMTPOX、HUMFIBRA、D5S818、D
13S317、D7S820、D16S539、及びHUMCSF1PO)を含
む。また、以下の共増幅された遺伝子座のいくつかの組は、1つ以上の追加の短
いタンデム反復遺伝子座、例えば、ペンタヌクレオチド反復を持つ遺伝子座(例
えば、G475、S159、又はC221)及び非STR遺伝子座、すなわちア
メロゲニンを含む。
されたことを要約する。また、この表は、プライマー対が、このような各多重反
応でこのような各遺伝子座を増幅するのに使用されることを示す。表2に挙げら
れた各プライマー対の1つのプライマーは、多重増幅反応で使用される前に、蛍
光標識される。いくつかの場合では、異なるラベルが、異なる遺伝子座に対する
プライマーを標識するのに使用され、異なるプライマーを使用して生成された対
立遺伝子は、レーザー活性蛍光検出装置で検出される場合に、別の対立遺伝子か
ら区別できる。
示す「FL」、カルボキシテトラメチルローダミン標識を示す「TMR」、5,
6−カルボキシローダミン6Gを示す「R6G」として、以下に、表2に記述さ
れる。また、表2は、多重増幅反応で使用されるプライマーの各対のプライマー
が、各実施例で標識されたことを示す(例えば、「FL−69」は、配列ID番
号69を有するプライマーが、多重増幅反応で使用される前にフルオレセインで
5’末端に標識されたことを意味する)。しかしながら、各実施例の本文におい
て、ラベルの略語は、本文に記載された増幅反応で使用される標識プライマーの
配列ID番号の直前に配置される(例えば、「FL−2」の代わりに「FL−配
列ID番号2」)。
S1358、HUMTH01、D21S11、D18S51、HUMvWFA3
1、D8S1179、HUMTPOX、HUMFIBRA、D5S818、D7
S820、D13S317、D16S539、及びHUMCSF1POで同時に
増幅した。PCR増幅を、25μlの1×Gold ST*R緩衝液(50mM
KCl、10mM Tris−HCl(25℃でpH8.3)、0.1%Tr
iton X−100、1.5mM MgCl2、160μg/ml BSA
及び各200μMのdATP、dCTP、dGTP及びdTTP)中で実施し、
1ngの鋳型及び3.25UのAmpliTaq Gold(登録商標)DNA
ポリメラーゼを使用した。GeneAmp(登録商標)PCR System
9600(Perkin Elmer、Foster City,CA)を、以
下の増幅プロトコルで使用した。96℃で12分、次に、94℃で30秒、68
秒で58℃にし、30秒保持、50秒で70℃にし、45秒保持を10サイクル
、続いて、30秒で90℃、60秒で58℃にし、30秒保持、50秒で70℃
にし、45秒保持を20サイクル、続いて、60℃で30分を1サイクル行なっ
た。
の各D3S1358プライマー1[配列ID番号68]及び2[FL−配列ID
番号69]、0.08μMの各HUMTH01プライマー1[FL−配列ID番
号66]及び2[配列ID番号67]、0.3μMの各D21S11プライマー
1[配列ID番号64]及び2[FL−配列ID番号65]、0.2μMの各D
18S51プライマー1[FL−配列ID番号62]及び2[TMR−配列ID
番号63]、1.1μMの各HUMvWFA31プライマー1[配列ID番号7
6]及び2[TMR−配列ID番号40]、1.8μMの各D8S1179プラ
イマー1[配列ID番号74]及び2[TMR−配列ID番号75]、0.6μ
Mの各HUMTPOXプライマー1[配列ID番号72]及び2[TMR−配列
ID番号73]、2.4μMの各HUMFIBRAプライマー1[TMR−配列
ID番号70]及び2[配列ID番号71]、0.2μMの各D5S818プラ
イマー1[配列ID番号84]及び2[R6G−配列ID番号85]、0.1μ
Mの各D13S317プライマー1[配列ID番号82]及び2[R6G−配列
ID番号83]、0.2μMの各D7S820プライマー1[R6G−配列ID
番号80]及び2[配列ID番号81]、0.15μMの各D16S539プラ
イマー1[配列ID番号29]及び2[R6G−配列ID番号79]、0.2μ
Mの各HUMCSF1POプライマー1[配列ID番号77]及び2[R6G−
配列ID番号78]を含む。
yzerを使用して分離した。DNAサンプルを、24μlの添加液(脱イオン
ホルムアミド)と1.0μlのインターナルレーンサイズスタンダードと一緒に
混合し、95℃で3分間変性させ、注入の前に氷で冷却した。分離は、47cm
×50μmキャピラリーで、Performance Optimized P
olymer 4(POP−4)(Perkin Elmer Biosyst
ems,Foster City,CA)を使用して行なった。製造業者のGe
neScan(登録商標)ランモジュールGS STR POP4(ld.)(
1ml)を使用した。電気泳動の条件は、5秒の注入、注入kVは15.0、泳
動kVは15.0、泳動温度は60℃、泳動時間は28分、及び仮フィルターA
を使用、であった。
alyzerで分離され検出された各遺伝子座の増幅されたフラグメントをスキ
ャニングした結果のプリントアウトである。図1Aは、遺伝子座D3S1358
、HUMTH01、D21S11、D18S51、HUMvWFA31、D8S
1179、HUMTPOX、HUMFIBRA、D5S818、D7S820、
D13S317、D16S539及びHUMCSF1POにおける同時に共増幅
されたDNAサンプルの増幅生成物を示す。パネルAに示されたピークは、フル
オレセインで標識され、パネルBに示されるピークは、カルボキシテトラメチル
ローダミンで標識され、パネルCに示されるピークは、5、6カルボキシローダ
ミン6Gで標識される。
されたサンプルと同じ方法で調製されたサンプルをスキャニングした結果のプリ
ントアウトである。この図のピークは、色素コンジュゲーション及び精製の手順
から生ずる、及び不確定な原因から生ずる、バックグラウンド生成物である。
1358、HUMTH01、D21S11、D18S51、G475、アメロゲ
ニン、HUMvWFA31、D8S1179、HUMTPOX、HUMFIBR
A、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、HUMC
SF1PO及びS159で同時に増幅した。PCR増幅を、25μlの1×Go
ld ST*R緩衝液(50mM KCl、10mM Tris−HCl(25
℃でPH8.3)、0.1%Triton X−100、1.5mM MgCl 2 、160μg/ml BSA及び200μMの各dATP、dCTP、dGT
P及びdTTP)で行ない、1ngの鋳型、及び4UのAmpliTaq Go
ld DNAポリメラーゼを使用した。GeneAmp PCR System
9600(Perkin Elmer,Foster City,CA)を、
以下の増幅プロトコルで使用した。96℃で12分、次に、94℃で30秒、6
8秒で58℃にし、30秒保持、50秒で70℃にし、45秒保持を10サイク
ル、続いて、90℃で30秒、60秒で58℃にし、30秒保持、50秒で70
℃にし、45秒保持を20サイクル、続いて、60℃で30分を1サイクル行な
った。
の各D3S1358プライマー1[配列ID番号68]及び2[FL−配列ID
番号69]、0.08μMの各HUMTH01プライマー1[FL−配列ID番
号66]及び2[配列ID番号67]、0.3μMの各D21S11プライマー
1[配列ID番号64]及び2[FL−配列ID番号65]、0.2μMの各D
18S51プライマー1[FL−配列ID番号62]及び2[配列ID番号63
]、0.24μMの各G475プライマー1[FL−配列ID番号88]及び2
[配列ID番号89]、0.6μMの各アメロゲニンプライマー1[TMR−配
列ID番号86]及び2[配列ID番号87]、1.1μMの各HUMvWFA
31プライマー1[配列ID番号76]及び2[TMR−配列ID番号40]、
1.8μMの各D8S1179プライマー1[配列ID番号74]及び2[TM
R−配列ID番号75]、0.6μMの各HUMTPOXプライマー1[配列I
D番号72]及び2[TMR−配列ID番号73]、2.4μMの各HUMFI
BRAプライマー1[TMR−配列ID番号70]及び2[配列ID番号71]
、0.2μMの各D5S818プライマー1[配列ID番号84]及び2[R6
G−配列ID番号85]、0.1μMの各D13S317プライマー1[配列I
D番号82]及び2[R6G−配列ID番号83]、0.2μMの各D7S82
0プライマー1[R6G−配列ID番号80]及び2[配列ID番号81]、0
.15μMの各D16S539プライマー1[配列ID番号29]及び2[R6
G−配列ID番号79]、0.2μMの各HUMCSF1POプライマー1[配
列ID番号77]及び2[R6G−配列ID番号78]、0.1μMの各S15
9プライマー1[配列ID番号90]及び2[R6G−配列ID番号91]を含
む。
c Analyzerを使用して分離した。DNAサンプルを、24μlの添加
液(脱イオンホルムアミド)と1.0μlのインターナルレーンサイズスタンダ
ードを混合し、95℃で3分間変性させ、注入の前に氷で冷却した。分離は、4
7cm×50μmキャピラリーで、Performance Optimize
d Polymer 4(POP−4)(Perkin Elmer Bios
ystems,Foster City,CA)を使用して行なった。製造業者
のGeneScanランモジュールGS STR POP4(ld.)(1ml
)Aを使用した。電気泳動の条件は、5秒の注入、注入kVは15.0、泳動k
Vは15.0、泳動温度は60℃、泳動時間は28分、及び仮フィルターAを使
用、であった。
ic Analyzerで分離され検出された各遺伝子座の増幅されたフラグメ
ントをスキャニングした結果のプリントアウトである。図2Aは、遺伝子座D3
S1358、HUMTH01、D21S11、D18S51、G475、アメロ
ゲニン、HUMvWFA31、D8S1179、HUMTPOX、HUMFIB
RA、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、HUM
CSF1PO及びS159における同時に共増幅されたDNAサンプルの増幅生
成物を示す。パネルAに示されたピークは、フルオレセインで標識され、パネル
Bに示されるピークは、カルボキシテトラメチルローダミンで標識され、パネル
Cに示されるピークは、5、6カルボキシローダミン6Gで標識される。
されたサンプルと同じ方法で調製されたサンプルをスキャニングした結果のプリ
ントアウトである。この図のピークは、色素コンジュゲーション及び精製の手順
から生ずる、及び不確定な原因から生ずる、バックグラウンド生成物である。
を、ABI PRISM(登録商標)377 DNA Sequencerを使
用して分離した。これを、0.2mm厚さの、5%Long Ranger(商
標出願中)Acrylamide(FMC BioProducts、Rock
land、ME)、7Mのウレアゲルを使用して実施した。DNAサンプルを、
1.5μlの添加液(88.25%ホルムアミド、4.1mM EDTA、15
mg/mlブルーデキストラン)及び0.5μlのインターナルレーンサイズス
タンダードと混合し、95℃で2分間変性させ、装入する前に氷で冷却した。電
気泳動を、Prerun(PR GS 36A−2400)及びRun(GS
36A−2400)用の、製造業者のGeneScan(登録商標)モジュール
を使用して行なった。泳動時間は3時間で、仮フィルターAを用いた。
ncerで分離され検出された各遺伝子座の増幅されたフラグメントをスキャニ
ングした結果のプリントアウトである。図3Aは、遺伝子座D3S1358、H
UMTH01、D21S11、D18S51、G475、アメロゲニン、HUM
vWFA31、D8S1179、HUMTPOX、HUMFIBRA、D5S8
18、D7S820、D13S317、D16S539、HUMCSF1PO及
びS159における同時に共増幅されたDNAサンプルの増幅生成物を示す。パ
ネルAに示されたピークは、フルオレセインで標識され、パネルBに示されるピ
ークは、カルボキシテトラメチルローダミンで標識され、パネルCに示されるピ
ークは、5、6カルボキシローダミン6Gで標識される。
されたサンプルと同じ方法で調製されたサンプルをスキャニングした結果のプリ
ントアウトである。この図のピークは、色素コンジュゲーション及び精製の手順
から生ずる、及び不確定な原因から生ずる、バックグラウンド生成物である。
TH01、D21S11、D18S51、G475、アメロゲニン、HUMvW
FA31、D8S1179、HUMTPOX、HUMFIBRA、D5S818
、D7S820、D13S317、D16S539、HUMCSF1PO及びS
159又はこれらの任意の組合せに係る遺伝子座から選択されたの3つの異なる
遺伝子座の各々で同時に各々増幅した。各遺伝子座の組合せの増幅において、単
一の反応容器に5ngの鋳型を含め、反応容器に、25μlの1×Gold S
T*R緩衝液(50mM KCl、10mM Tris−HCl(25℃でPH
8.3)、0.1%Triton X−100、1.5mM MgCl2、16
0μg/ml BSA及び200μMの各dATP、dCTP、dGTP及びd
TTP)を含めた。
Elmer,Foster City,CA)を、以下の増幅プロトコルで使用
した。96℃で12分、次に、94℃で30秒、68秒で58℃にし、30秒保
持、50秒で70℃にし、45秒保持を10サイクル、続いて、90℃で30秒
、60秒で58℃にし、30秒保持、50秒で70°にし、45秒保持を22サ
イクル、続いて、60℃で30分を1サイクル行なった。
の各D3S1358プライマー1[配列ID番号68]及び2[FL−配列ID
番号69]、0.2μMの各HUMTH01プライマー1[FL−配列ID番号
66]及び2[配列ID番号67]、1.0μMの各D21S11プライマー1
[配列ID番号64]及び2[FL−配列ID番号65]、1.0μMの各D1
8S51プライマー1[FL−配列ID番号62]及び2[配列ID番号63]
、2.8μMの各G475プライマー1[FL−配列ID番号88]及び2[配
列ID番号89]、0.2μMの各アメロゲニンプライマー1[TMR−配列I
D番号86]及び2[配列ID番号87]、0.3μMの各HUMvWFA31
プライマー1[配列ID番号76]及び2[TMR−配列ID番号40]、1.
5μMの各D8S1179プライマー1[配列ID番号74]及び2[TMR−
配列ID番号75]、0.2μMの各HUMTPOXプライマー1[配列ID番
号72]及び2[TMR−配列ID番号73]、2.0μMの各HUMFIBR
Aプライマー1[TMR−配列ID番号70]及び2[配列ID番号71]、0
.55μMの各D5S818プライマー1[配列ID番号84]及び2[FL−
配列ID番号85]、1.1μMの各D13S317プライマー1[配列ID番
号82]及び2[FL−配列ID番号83]、1.7μMの各D7S820プラ
イマー1[FL−配列ID番号80]及び2[配列ID番号81]、3.3μM
の各D16S539プライマー1[配列ID番号29]及び2[FL−配列ID
番号79]、0.5μMの各HUMCSF1POプライマー1[配列ID番号7
7]及び2[FL−配列ID番号78]、2.0μMの各S159プライマー1
[配列ID番号90]及び2[FL−配列ID番号91]を含んでいた。
Gold(登録商標)DNA ポリメラーゼ及び遺伝子座D3S1358、HU
MTH01、D21S11、D18S51、G475、アメロゲニン、HUMv
WFA31、D8S1179、HUMTPOX及びHUMFIBRAにおける上
述の濃度で使用される各遺伝子座のプライマーを使用して増幅した。第2の遺伝
子座の組合せにおいて、上に記述された濃度で、32個のすべてのプライマー及
び4UのAmpliTag Gold DNAポリメラーゼを、単一の反応容器
中の16個のすべての遺伝子座D3S1358、HUMTH01、D21S11
、D18S51、G475、アメロゲニン、HUMvWFA31、D8S117
9、HUMTPOX、HUMFIBRA、D5S818、D7S820、D13
S317、D16S539、HUMCSF1PO及びS159でDNA鋳型を増
幅するのに使用した。第3の組合せにおいて、各鋳型を、1.5UのAmpli
Taq Gold DNAポリメラーゼ及び遺伝子座D5S818、D7S82
0、D13S317、D16S539、HUMCSF1PO及びS159におけ
る上述の濃度で使用される各遺伝子座のプライマーを使用して増幅した。
mm厚さの4%変性ポリアクリルアミドゲル(アクリルアミドとビスアクリルア
ミドの割合が19:1)を通る電気泳動で分離し、このゲルは、2枚のガラスプ
レートに化学的に架橋していた(Kobayashi,Y.(1988)、BR
L Focus 10:73−74)。DNAサンプルを、3.5μlの添加液
(10mM NaOH、95%ホルムアミド、0.05%ブロモフェノールブル
ー)及び0.5μlのインターナルレーンサイズスタンダードと混合して、95
℃で2分間変性し、装入する前に氷で冷却した。分離した生成物は、Hitac
hi FMBIO II フルオレセントスキャナー(Hitachi Sof
tware Enginnering America,Ltd.South
San Francisco,CA)を使用して蛍光シグナルの検出によって視
覚化した。それぞれ505nm及び585nmでのバンドパスフィルターを、フ
ルオレセイン標識遺伝子座及びカルボキシテトラメチルローダミン標識遺伝子座
のそれぞれの検出に使用した。650nmのバンドパスフィルターを、インター
ナルレーンスタンダードの検出に使用した(サイズスタンダードデータは示さな
かった)。
たい。図4Aは、ポリアクリルアミドゲルの同じレーンの、505nmスキャン
(フルオレセインチャンネル)の結果を、図4Bは、585nmスキャン(カル
ボキシテトラメチルローダミンチャンネル)の結果を示す。各DNA鋳型におい
て、レーン1は、遺伝子座D3S1358、HUMTH01、D21S11、D
18S51、G475、アメロゲニン、HUMvWFA31、D8S1179、
HUMTPOX及びHUMFIBRAにおける同時に共増幅したDNAサンプル
の結果を示す。レーン2は、遺伝子座D3S1358、HUMTH01、D21
S11、D18S51、G475、アメロゲニン、HUMvWFA31、D8S
1179、HUMTPOX、HUMFIBRA、D5S818、D13S317
、D7S820、D16S539、HUMCSF1PO及びS159における同
時に共増幅したDNAサンプルの結果を示す。レーン3は、遺伝子座D5S81
8、D13S317、D7S820、D16S539、HUMCSF1PO及び
S159における同時に共増幅したDNAサンプルの結果を示す。
TH01、D21S11、D18S51、G475、アメロゲニン、HUMvW
FA31、D8S1179、HUMTPOX、HUMFIBRA、D5S818
、D7S820、D13S317、D16S539、HUMCSF1PO及びS
159又はこれらの任意の組合せの遺伝子座から選択された2つの異なる遺伝子
座の各組合せで各々同時に増幅した。各遺伝子座の組合せの増幅には、単一の反
応容器に5ngの鋳型を含み、反応容器に、25μlの1×Gold ST*R
緩衝液(50mM KCl、10mMTris−HCl(25℃でpH8.3)
、0.1%のTritonX−100、1.5mM MgCl2、160μg/
ml BSA及び200μMの各dATP、dCTP、dGTP及びdTTP)
を含めた。
Elmer、Foster City、CA)を、以下の増幅プロトコルで使
用した。96℃で12分、次に、94℃で30秒、68秒で58℃にし、30秒
保持、50秒で70℃にし、45秒保持を10サイクル、続いて、90℃で30
秒、60秒で58℃にし、30秒保持、50秒で70℃にし、45秒保持を22
サイクル、次に60℃で30分を1サイクル行なった。
の各D3S1358プライマー1[配列ID番号68]及び2[FL−配列ID
番号69]、0.2μMの各HUMTH01プライマー1[FL−配列ID番号
66]及び2[配列ID番号67]、1.0μMの各D21S11プライマー1
[配列ID番号64]及び2[FL−配列ID番号65]、1.0μMの各D1
8S51プライマー1[FL−配列ID番号62]及び2[配列ID番号63]
、2.8μMの各G475プライマー1[配列ID番号88]及び2[FL−配
列ID番号94]、0.2μMの各アメロゲニンプライマー1[TMR−配列I
D番号86]及び2[配列ID番号87]、0.3μMの各HUMvWFA31
プライマー1[配列ID番号76]及び2[TMR−配列ID番号40]、1.
5μMの各D8S1179プライマー1[配列ID番号74]及び2[TMR−
配列ID番号75]、0.2μMの各HUMTPOXプライマー1[配列ID番
号72]及び2[TMR−配列ID番号73]、2.0μMの各HUMFIBR
Aプライマー1[TMR−配列ID番号70]及び2[配列ID番号71]、0
.55μMの各D5S818プライマー1[配列ID番号84]及び2[FL−
配列ID番号85]、1.1μMの各D13S317プライマー1[配列ID番
号82]及び2[FL−配列ID番号83]、1.7μMの各D7S820プラ
イマー1[FL−配列ID番号80]及び2[配列ID番号81]、3.3μM
の各D16S539プライマー1[配列ID番号29]及び2[FL−配列ID
番号79]、0.5μMの各HUMCSF1POプライマー1[配列ID番号7
7]及び2[FL−配列ID番号78]、2.0μMの各S159プライマー1
[配列ID番号95]及び2[FL−配列ID番号96]を含む。
11、D18S51、G475、アメロゲニン、HUMvWFA31、D8S1
179、HUMTPOX及びHUMFIBRAにおける上述の濃度で使用される
各遺伝子座のプライマーを使用して各鋳型を増幅した。2番目の遺伝子座の組合
せにおいて、上に記述した濃度で、32個のすべてのプライマー及び4UのAm
pliTaq GoldTM DNAポリメラーゼを使用して、単一の反応容器に
入っている16個のすべての遺伝子座D3S1358、HUMTH01、D21
S11、D18S51、G475、アメロゲニン、HUMvWFA31、D8S
1179、HUMTPOX、HUMFIBRA、D5S818、D7S820、
D13S317、D16S539、HUMCSF1PO及びS159でDNA鋳
型を増幅した。
。
い。図5Aは、ポリアクリルアミドゲルの同じレーンの、505nmスキャン(
フルオレセインチャンネル)の結果を、図5Bは、585nmスキャン(カルボ
キシテトラメチルローダミンチャンネル)の結果を示す。各鋳型において、レー
ン1は、遺伝子座D3S1358、HUMTH01、D21S11、D18S5
1、G475、アメロゲニン、HUMvWFA31、D8S1179、HUMT
POX及びHUMFIBRAにおける同時に共増幅したDNAサンプルの結果を
示し、レーン2は、遺伝子座D3S1358、HUMTH01、D21S11、
D18S51、G475、アメロゲニン、HUMvWFA31、D8S1179
、HUMTPOX、HUMFBIRA、D5S818、D13S317、D7S
820、D16S539、HUMCSF1PO及びS159における同時に共増
幅したDNAサンプルの結果を示す。レーン3は、遺伝子座D5S818、D1
3S317、D7S820、D16S539、HUMCSF1PO及びS159
における同時に共増幅したDNAサンプルの結果を示す。
TH01、D21S11、D18S51、S159、アメロゲニン、HUMvW
FA31、D8S1179、HUMTPOX、HUMFIBRA、D5S818
、D7S820、D13S317、D16S539、HUMCSF1PO及びC
221又はこれらの任意の組合せの遺伝子座から選択された3つの異なる遺伝子
座の各組合せで各々同時に増幅した。各遺伝子座の組合せの増幅には、単一の反
応容器に10ngの鋳型を含め、反応容器に、25μlの1×Gold ST*
R緩衝液(50mM KCl、10mMTris−HCl(25℃でpH8.3
)、0.1%のTritonX−100、1.5mM MgCl2、160μg
/ml BSA及び200μMの各dATP、dCTP、dGTP及びdTTP
)を含めた。
Elmer、Foster City、CA)を、以下の増幅プロトコルで使
用した。96℃で12分、次に、94℃で30秒、68秒で60℃にし、30秒
保持、50秒で70℃にし、45秒保持を10サイクル、続いて、90℃で30
秒、60秒で60℃にし、30秒保持、50秒で70℃にし、45秒保持を20
サイクル、次に60℃で30分を1サイクル行なう。
各D3S1358プライマー1[配列ID番号106]及び2[FL−配列ID
番号69]、0.3μMの各HUMTH01プライマー1[FL−配列ID番号
38]及び2[配列ID番号103]、2.0μMの各D21S11プライマー
1[配列ID番号64]及び2[FL−配列ID番号65]、0.3μMの各D
18S51プライマー1[FL−配列ID番号101]及び2[配列ID番号1
02]、2.0μMの各S159プライマー1[配列ID番号92]及び2[F
L−配列ID番号93]、0.15μMの各アメロゲニンプライマー1[TMR
−配列ID番号105]及び2[配列ID番号87]、1.0μMの各HUMv
WFA31プライマー1[配列ID番号76]及び2[TMR−配列ID番号4
0]、1.25μMの各D8S1179プライマー1[TMR−配列ID番号1
04]及び2[配列ID番号75]、0.75μMの各HUMTPOXプライマ
ー1[TMR−配列ID番号72]及び2[配列ID番号73]、1.5μMの
各HUMFIBRAプライマー1[TMR−配列ID番号70]及び2[配列I
D番号107]、0.55μMの各D5S818プライマー1[配列ID番号8
4]及び2[FL−配列ID番号85]、1.1μMの各D13S317プライ
マー1[配列ID番号3]及び2[FL−配列ID番号4]、1.7μMの各D
7S820プライマー1[FL−配列ID番号80]及び2[配列ID番号81
]、3.3μMの各D16S539プライマー1[FL−配列ID番号29]及
び2[配列ID番号97]、0.25μMの各HUMCSF1POプライマー1
[配列ID番号77]及び2[FL−配列ID番号98]、1.0μMの各C2
21プライマー1[FL−配列ID番号99]及び2[配列ID番号100]を
含んでいた。
S11、D18S51、S159、アメロゲニン、HUMvWFA31、D8S
1179、HUMTPOX及びHUMFIBRAにおける上述の濃度で使用され
る各遺伝子座のプライマーを使用して各鋳型を増幅した。2番目の遺伝子座の組
合せにおいて、上に記述した濃度で、32個のすべてのプライマー及び4UのA
mpliTaq GoldTM DNAポリメラーゼを使用して、単一の反応容器
に入っている16個のすべての遺伝子座D3S1358、HUMTH01、D2
1S11、D18S51、S159、アメロゲニン、HUMvWFA31、D8
S1179、HUMTPOX、HUMFIBRA、D5S818、D7S820
、D13S317、D16S539、HUMCSF1PO及びC221でDNA
鋳型を増幅した。3番目の組合せにおいて、各鋳型を、1.5UのAmplit
aq GoldTM DNAポリメラーゼ及び遺伝子座D5S818、D7S82
0、D13S317、D16S539、HUMCSF1PO及びC221におけ
る上述の濃度で使用される各遺伝子座のプライマーを使用して増幅した。
Cl、10mM Tris−HCl(25℃でpH8.3)、0.1%のTri
ton X−100、1.5mM MgCl2及び200μMの各dATP、d
CTP、dGTP及びdTTP)で1:4に希釈した以外は、実施例4で上述し
たのと同様に分離し、検出した。希釈した増幅生成物(2.5μl)を、2.5
μlの添加液(10mM NaOH、95%ホルムアミド、0.05%ブロモフ
ェノールブルー)と混合し、インターナルレーンスタンダードなしで、95℃で
2分間変性し、装入する前に氷で冷却した。
い。図6Aは、ポリアクリルアミドゲルの同じレーンの、505nmスキャン(
フルオレセインチャンネル)の結果を、図6Bは、585nmスキャン(カルボ
キシテトラメチルローダミンチャンネル)の結果を示す。各DNA鋳型において
、レーン1は、遺伝子座D3S1358、HUMTH01、D21S11、D1
8S51、S159、アメロゲニン、HUMvWFA31、D8S1179、H
UMTPOX及びHUMFIBRAにおける同時に共増幅したDNAサンプルの
結果を示し、レーン2は、遺伝子座D3S1358、HUMTH01、D21S
11、D18S51、G475、アメロゲニン、HUMvWFA31、D8S1
179、HUMTPOX、HUMFBIRA、D5S818、D13S317、
D7S820、D16S539、HUMCSF1PO及びC221における同時
に共増幅したDNAサンプルの結果を示す。レーン3は、遺伝子座D5S818
、D13S317、D7S820、D16S539、HUMCSF1PO及びC
221における同時に共増幅したDNAサンプルの結果を示す。
れた、ヒトゲノムDNAのサンプルの遺伝子座D3S1539、D5S818、
D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S5
1、D21S11、HUMCSF1PO、HUMFIBRA、HUMTH01、
HUMTPOX、及びHUMvWFA31の同時増幅の生成物の3色蛍光検出の
出力のプロットである。
ルサンプルの3色蛍光検出の出力のプロットである。
た、ヒトゲノムDNAのサンプルの遺伝子座D3S1358、D5S818、D
7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51
、D21S11、HUMCSF1PO、HUMFIBRA、HUMTH01、H
UMTPOX、HUMvWFA31、G475、S159及びアメロゲニンの同
時増幅の生成物の3色蛍光検出の出力のプロットである。
ロールサンプルの3色蛍光検出の出力のプロットである。
出されたヒトゲノムDNAサンプルの遺伝子座D3S1358、D5S818、
D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S5
1、D21S11、HUMCSF1PO、HUMFIBRA、HUMTH01、
HUMTPOX、HUMvWFA31、G475、S159及びアメロゲニンの
同時増幅の生成物の3色蛍光検出の出力のプロットである。
ロールサンプルの3色蛍光検出の出力のプロットである。
キャナーのフルオレセインチャンネル(図4A)及びカルボキシテトラメチルロ
ーダミンチャンネル(図4B)を用いて検出された、遺伝子座D3S1358、
D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S53
9、D18S51、D21S11、HUMCSF1PO、HUMFIBRA、H
UMTH01、HUMTPOX、HUMvWFA31、G475、S159及び
アメロゲニンの同時増幅の生成物のフルオレセント検出の結果のレーザープリン
ト像である。
キャナーのフルオレセインチャンネル(図5A)及びカルボキシテトラメチルロ
ーダミンチャンネル(図5B)を用いて検出された、遺伝子座D3S1358、
D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S53
9、D18S51、D21S11、HUMCSF1PO、HUMFIBRA、H
UMTH01、HUMTPOX、HUMvWFA31、G475、S159及び
アメロゲニンの同時増幅の生成物のフルオレセント検出の結果のレーザープリン
ト像である。
キャナーのフルオレセインチャンネル(図6A)及びカルボキシテトラメチルロ
ーダミンチャンネル(図6B)を用いて検出された、遺伝子座D3S1358、
D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S53
9、D18S51、D21S11、HUMCSF1PO、HUMFIBRA、H
UMTH01、HUMTPOX、HUMvWFA31、C221、S159及び
アメロゲニンの同時増幅の生成物のフルオレセント検出の結果のレーザープリン
ト像である。
Claims (40)
- 【請求項1】 1以上のDNAサンプルから、一組の遺伝子座に存在する対
立遺伝子を同時に決定する方法であって、 (a)分析すべき少なくとも1つのDNAサンプルを得る工程と、 (b)前記DNAサンプルの一組の遺伝子座を選択する工程であって、共増幅
できる、少なくとも13個のタンデム反復遺伝子座を含む工程と、 (c)多重増幅反応で前記組の中の遺伝子座を共増幅する工程であって、反応
生成物が、前記組の中の共増幅された各遺伝子座から増幅された対立遺伝子の混
合物である工程と、 (d)前記混合物中の前記増幅された対立遺伝子を評価して、前記DNAサン
プル中の、前記組の中の分析された各遺伝子座に存在する対立遺伝子を決定する
工程と、 を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項2】 前記少なくとも13個の短いタンデム反復遺伝子座の、少な
くとも4個が、D3S1539、D4S2368、D5S818、D7S820
、D9S930、D10S1239、D13S317、D14S118、D14
S548、D14S562、D16S490、D16S539、D16S753
、D17S1298、D17S1299、D19S253、D20S481、D
22S683、HUMCSF1PO、HUMTPOX、HUMTH01、HUM
F13A01、HUMBFXIII、HUMLIPOL及びHUMvWFA31
からなる群より選ばれる、請求項1記載の方法。 - 【請求項3】 工程(b)で選択される前記遺伝子座の組が、前記13個の
短いタンデム反復遺伝子座D3S1358、D5S818、D7S820、D8
S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、
HUMCSF1PO、HUMFIBRA、HUMTH01、HUMTPOX、及
びHUMvWFA31を含む、請求項2記載の方法。 - 【請求項4】 工程(b)で選択される前記組における、前記少なくとも1
3個の短いタンデム反復遺伝子座の少なくとも1つが、ペンタヌクレオチドタン
デム反復遺伝子座である、請求項1記載の方法。 - 【請求項5】 前記ペンタヌクレオチドタンデム反復遺伝子座が、G475
、C221及びS159からなる群から選ばれる、請求項4記載の方法。 - 【請求項6】 工程(b)で選択される前記遺伝子座の組が、工程(a)で
提供される前記DNAの少なくとも1つのソースの性を同定するのに使用される
遺伝子座を更に含む、請求項1記載の方法。 - 【請求項7】 工程(a)で提供される前記DNAの前記少なくとも1つの
ソースが、ヒトであって、かつヒトの性を同定するのに使用される遺伝子座が、
アメロゲニン遺伝子座である、請求項6記載の方法。 - 【請求項8】 前記アメロゲニン遺伝子座が、配列ID番号86、87、及
び105からなる群より選ばれる配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを
使用して共増幅される、請求項7記載の方法。 - 【請求項9】 前記多重増幅反応が、以下の配列群の少なくとも1つから選
択される配列を有する、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用
して行なわれる、請求項1記載の方法。 前記組の遺伝子座の1つがD7S820の場合に、配列ID番号1、2、80及
び81 前記組の遺伝子座の1つがD13S317の場合に、配列ID番号3、4、82
及び83 前記組の遺伝子座の1つがD5S818の場合に、配列ID番号5、6、84及
び85 前記組の遺伝子座の1つがD3S1539の場合に、配列ID番号7、8及び4
9 前記組の遺伝子座の1つがD17S1298の場合に、配列ID番号9及び10 前記組の遺伝子座の1つがD20S481の場合に、配列ID番号11、12、
52及び53 前記組の遺伝子座の1つがD9S930の場合に、配列ID番号13、14、5
5及び61 前記組の遺伝子座の1つがD10S1239の場合に、配列ID番号15、16
及び54 前記組の遺伝子座の1つがD14S118の場合に、配列ID番号17及び18 前記組の遺伝子座の1つがD14S562の場合に、配列ID番号19及び20 前記組の遺伝子座の1つがD14S548の場合に、配列ID番号21及び22 前記組の遺伝子座の1つがD16S490の場合に、配列ID番号23及び24 前記組の遺伝子座の1つがD16S753の場合に、配列ID番号25及び26 前記組の遺伝子座の1つがD17S1299の場合に、配列ID番号27及び2
8 前記組の遺伝子座の1つがD16S539の場合に、配列ID番号29、30、
58、79及び97 前記組の遺伝子座の1つがD22S683の場合に、配列ID番号31及び32 前記組の遺伝子座の1つがHUMCSF1POの場合に、配列ID番号33、3
4、77、78及び98 前記組の遺伝子座の1つがHUMTPOXの場合に、配列ID番号35、36、
72及び73 前記組の遺伝子座の1つがHUMTH01の場合に、配列ID番号37、38、
66、67及び103 前記組の遺伝子座の1つがHUMvWFA31の場合に、配列ID番号39、4
0、59、60及び76 前記組の遺伝子座の1つがHUMF13A01の場合に、配列ID番号41及び
42 前記組の遺伝子座の1つがHUMFESFPSの場合に、配列ID番号43及び
44 前記組の遺伝子座の1つがHUMBFXIIIの場合に、配列ID番号45及び
46 前記組の遺伝子座の1つがHUMLIPOLの場合に、配列ID番号47及び4
8 前記組の遺伝子座の1つがD19S253の場合に、配列ID番号50及び51 前記組の遺伝子座の1つがD4S2368の場合に、配列ID番号56及び57 前記組の遺伝子座の1つがD18S51の場合に、配列ID番号62、63、1
01及び102 前記組の遺伝子座の1つがD21S11の場合に、配列ID番号64及び65 前記組の遺伝子座の1つがD3S1538の場合に、配列ID番号68、69及
び106 前記組の遺伝子座の1つがHUMFIBRAの場合に、配列ID番号70、71
及び107 前記組の遺伝子座の1つがD8S1179の場合に、配列ID番号74、75及
び104 前記組の遺伝子座の1つがアメロゲニンの場合に、配列ID番号86、87及び
105 前記組の遺伝子座の1つがG475の場合に、配列ID番号88、89及び94 前記組の遺伝子座の1つがS159の場合に、配列ID番号90、91、、92
、93、95及び96 前記組の遺伝子座の1つがC221の場合に、配列ID番号99及び100 - 【請求項10】 ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びキャピラリーゲル電
気泳動からなる群より選ばれる分離手段を使用して、前記増幅された対立遺伝子
が、工程(d)での評価の前に分離される、請求項1記載の方法。 - 【請求項11】 前記多重増幅反応が、分析される前記少なくとも13個の
遺伝子座をフランキングする、少なくとも13対のオリゴヌクレオチドプライマ
ーを使用して行なわれる、請求項1記載の方法。 - 【請求項12】 前記遺伝子座の組が、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して共
増幅される、請求項11記載の方法。 - 【請求項13】 工程(b)の前記多重反応で共増幅された各遺伝子座が、
前記遺伝子座をフランキングする1対のプライマーを使用して共増幅され、各対
の少なくとも1つのプライマーが、該プライマーに共有結合した蛍光標識を有す
る、請求項11記載の方法。 - 【請求項14】 前記標識されたプライマーの少なくとも3つが、該プライ
マーに共有結合した異なる蛍光標識を有する、請求項13記載の方法。 - 【請求項15】 分析すべき前記少なくとも1つのDNAサンプルが、ヒト
組織から調製され、該ヒト組織が、血液、精液、膣細胞、毛、唾液、尿、胎盤細
胞又は胎児細胞を含む羊水及び上記に列挙した組織のいずれかの混合物を含むヒ
ト組織からなる群より選ばれる、請求項1記載の方法。 - 【請求項16】 前記増幅された対立遺伝子が、前記増幅された遺伝子をサ
イズスタンダードと比較することによって評価され、該サイズスタンダードが、
DNAマーカー及び遺伝子座特異的対立遺伝子ラダーからなるサイズスタンダー
ドの群より選ばれる、請求項1記載の方法。 - 【請求項17】 1以上のDNAサンプルから、一組の遺伝子座に存在する
対立遺伝子を同時に特定する方法であって、 (a)分析すべき少なくとも1つのDNAサンプルを得る工程と、 (b)前記DNAサンプルの1組の遺伝子座を選択する工程であって、短いタ
ンデム反復遺伝子座D3S1358、D5S818、D7S820、D8S11
79、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、HUM
CSF1PO、HUMFIBRA、HUMTH01、HUMTPOX及びHUM
vWFA31を含む工程と、 (c)多重増幅反応で前記組の遺伝子座を共増幅する工程であって、反応生成
物は、前記組の各共増幅された遺伝子座から増幅された対立遺伝子の混合物であ
る工程と、 (d)前記混合物中の前記増幅された対立遺伝子を評価して、前記DNAサン
プル中の、前記組の中の分析された各遺伝子座に存在する対立遺伝子を決定する
工程と、 を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項18】 前記多重増幅反応が、工程(b)で選択された前記少なく
とも13個の遺伝子座の組のうち少なくとも1つの遺伝子座に対し、少なくとも
1つのプライマーを使用して行なわれ、前記プライマーが、以下のプライマー配
列群の1つから選択される配列を有する、請求項17記載の方法。 前記組における遺伝子座の1つがD18S51の場合に、配列ID番号62、
63、101及び102 遺伝子座D21S11において、配列ID番号64及び65 遺伝子座HUMTH01において、配列ID番号37、38、66、67及び1
03 遺伝子座D3S1358において、配列ID番号68、69及び106 遺伝子座HUMFIBRAにおいて、配列ID番号70、71及び107 遺伝子座HUMTPOXにおいて、配列ID番号35、36、72及び73 遺伝子座D8S1179において、配列ID番号74、75及び104 遺伝子座HUMvWFA31において、配列ID番号39、40、59、60及
び76 遺伝子座HUMCSF1POにおいて、配列ID番号33、34、77、78及
び98 遺伝子座D16S539において、配列ID番号29、30、58、79及び9
7 遺伝子座D7S820において、配列ID番号1、2、80及び81 遺伝子座D13S317において、配列ID番号3、4、82及び83 遺伝子座D5S818において、配列ID番号5、6、84及び85 - 【請求項19】 前記工程(a)で選択される遺伝子座の組が、更にG47
5、S159、C221及びアメロゲニンからなる遺伝子座の群から選ばれる、
少なくとも1つの追加の遺伝子座を含む、請求項17記載の方法。 - 【請求項20】 前記多重増幅反応が、以下の配列群の少なくとも1つから
選択される配列を有する、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーを使
用して行なわれる、請求項19記載の方法。 前記組の遺伝子座の1つがG475である場合に、配列ID番号88、89及び
94 前記組の遺伝子座の1つがS159である場合に、配列ID番号90、91、
92、93、95及び96 前記組の遺伝子座の1つがC221である場合に、配列ID番号99及び10
0 前記組の遺伝子座の1つがアメロゲニン遺伝子座である場合に、配列ID番号
86、87及び105 - 【請求項21】 前記多重増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応である、請求
項17記載の方法。 - 【請求項22】 前記増幅された対立遺伝子が、該増幅された対立遺伝子を
サイズスタンダードと比較することによって評価され、該サイズスタンダードが
、DNAマーカー及び遺伝子座特異的対立遺伝子ラダーからなるサイズスタンダ
ードの群より選ばれる、請求項17記載の方法。 - 【請求項23】 分析すべき前記少なくとも1つのDNAサンプルが、ヒト
組織から調製され、該ヒト組織は、血液、精液、膣細胞、毛、唾液、尿、骨、口
内サンプル、胎盤細胞又は胎児細胞を含む羊水及び上記に列挙した組織のいずれ
かの混合物を含むヒト組織からなる群より選ばれる、請求項17記載の方法。 - 【請求項24】 1以上のヒトゲノムDNAサンプルから、遺伝子座の一組
に存在する対立遺伝子を同時に特定する方法であって、 (a)分析すべき少なくとも1つのヒトゲノムDNAサンプルを得る工程と、 (b)多重増幅反応で該ヒトゲノムDNAサンプルの少なくとも16個の遺伝
子座の一組において遺伝子座を共増幅する工程であって、該遺伝子座の組が、D
3S1358、HUMTH01、D21S11、D18S51、G475、アメ
ロゲニン、HUMvWFA31、D8S1179、HUMTPOX、HUMFI
BRA、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、HU
MCSF1PO及びS159を含み、反応生成物は、前記組の各共増幅された遺
伝子座から増幅された対立遺伝子の混合物である工程と、 (c)前記混合物中の前記増幅された対立遺伝子を評価する工程であって、ヒ
トゲノムDNAサンプルの、前記少なくとも16個の遺伝子座の各々における対
立遺伝子の存在を決定する工程と、 を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項25】 前記多重増幅反応が、工程(b)で選択された16個のプ
ライマーの組における各遺伝子座をフランキングするプライマーの少なくとも1
対を使用して行なわれる、請求項24記載の方法。 - 【請求項26】 前記多重増幅反応が、工程(b)で共増幅された少なくと
も16個の遺伝子座の前記組における少なくとも1つの遺伝子座に対して、少な
くとも1つのプライマーを使用して行なわれ、前記プライマーが、以下のプライ
マー配列群の1つから選択される配列を有する、請求項24記載の方法。 前記組の遺伝子座の1つが、D18S51の場合に、配列ID番号62、63
、101及び102 遺伝子座D21S11において、配列ID番号64及び65 遺伝子座HUMTH01において、配列ID番号37、38、66、67及び1
03 遺伝子座D3S1358において、配列ID番号68、69及び106 遺伝子座HUMFIBRAにおいて、配列ID番号70、71及び107 遺伝子座HUMTPOXにおいて、配列ID番号35、36、72及び73 遺伝子座D8S1179において、配列ID番号74、75及び104 遺伝子座HUMvWFA31において、配列ID番号39、40、59、60及
び76 遺伝子座HUMCSF1POにおいて、配列ID番号33、34、77、78及
び98 遺伝子座D16S539において、配列ID番号29、30、58、79及び9
7 遺伝子座D7S820において、配列ID番号1、2、80及び81 遺伝子座D13S317において、配列ID番号3、4、82及び83 遺伝子座D5S818において、配列ID番号5、6、84及び85 遺伝子座G475において、配列ID番号88、89及び94 遺伝子座S159において、配列ID番号90、91、92、93、95及び
96 アメロゲニン遺伝子座において、配列ID番号86、87及び105 - 【請求項27】 1以上のヒトゲノムDNAサンプルから、一組の遺伝子
座に存在する対立遺伝子を同時に特定する方法であって、 (a)分析すべき少なくとも1つのヒトゲノムDNAを得る工程と、 (b)多重増幅反応で、前記ヒトゲノムDNAサンプルの少なくとも16個の遺
伝子座の一組における遺伝子座を共増幅する工程であって、該遺伝子座の組は、
D3S1348、HUMTH01、D21S11、D18S51、S159、ア
メロゲニン、HUMvWFA31、D8S1179、HUMTPOX、HUMF
IBRA、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、H
UMCSF1PO及びC221を含み、反応生成物は、前記組の各共増幅された
遺伝子座から共増幅された対立遺伝子の混合物である工程と、 (c)該混合物中の増幅対立遺伝子を評価して、前記ヒトゲノムDNAサンプル
の少なくとも16個の遺伝子座の各々に存在する対立遺伝子を決定する工程と、
を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項28】 前記多重増幅反応は、工程(b)で選択された16個の
プライマーの組の各遺伝子座をフランキングする少なくとも1対のプライマーを
使用して行なう、請求項27記載の方法。 - 【請求項29】 前記多重増幅反応は、工程(b)で共増幅された少なく
とも16個の遺伝子座の組の少なくとも1つの遺伝子座に対し、少なくとも1つ
のプライマーを使用して行なわれ、該プライマーは、以下のプライマー配列の1
つから選択される配列を有する、請求項27記載の方法。 遺伝子座D18S51において、配列ID番号62、63、101及び102
遺伝子座D21S11において、配列ID番号64及び65 遺伝子座HUMTH01において、配列ID番号37、38、66、67及び1
03 遺伝子座D3S1358において、配列ID番号68、69及び106 遺伝子座HUMFIBRAにおいて、配列ID番号70、71及び107 遺伝子座HUMTPOXにおいて、配列ID番号35、36、72及び73 遺伝子座D8S1179において、配列ID番号74、75及び104 遺伝子座HUMvWFA31において、配列ID番号39、40、59、60及
び76 遺伝子座HUMCSF1POにおいて、配列ID番号33、34、77、78及
び98 遺伝子座D16S539において、配列ID番号29、30、58、79及び9
7 遺伝子座D7S820において、配列ID番号1、2、80及び81 遺伝子座D13S317において、配列ID番号3、4、82及び83 遺伝子座D5S818において、配列ID番号5、6、84及び85 遺伝子座S159において、配列ID番号90、91、92、93、95及び
96 遺伝子座C221において、配列ID番号99及び100 アメロゲニン遺伝子座において、配列ID番号86、87及び105 - 【請求項30】 ゲノムDNAの一組の遺伝子座を同時に分析するキットで
あって、分析すべきゲノムDNAの一組の遺伝子座を共増幅するためのオリゴヌ
クレオチドプライマーを含み、前記遺伝子座の組が、共増幅することができる少
なくとも13個の短いタンデム反復遺伝子座を含み、該プライマーは、1以上の
容器にあることを特徴とするキット。 - 【請求項31】 前記キット中の前記オリゴヌクレオチドプライマーのすべ
てが、1つの容器の中にある、請求項30記載のキット。 - 【請求項32】 前記ゲノムDNAが、ヒトゲノムDNAであり、共増幅で
きる少なくとも13個の短いタンデム反復遺伝子座が、D3S1358、D5S
818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D
18S51、D21S11、HUMCSF1PO、HUMFIBRA、HUMT
H01、HUMTPOX及びHUMvWFA31を含む、請求項31記載のキッ
ト。 - 【請求項33】 前記遺伝子座の組の1つの遺伝子座を共増幅するための少
なくとも1つのプライマーが、以下のプライマー配列の群の1つから選択される
配列を有する、請求項30記載のキット。 D18S51において、配列ID番号62、63、101及び102 D21S11において、配列ID番号64及び65 HUMTH01において、配列ID番号66、67、38及び103 D3S1358において、配列ID番号68、69及び106 HUMFIBRAにおいて、配列ID番号70、71及び107 HUMTPOXにおいて、配列ID番号72及び73 D8S1179において、配列ID番号74、75及び104 HUMvWFA31において、配列ID番号76及び40 HUMCSF1POにおいて、配列ID番号77、78及び98 D16S539において、配列ID番号29、79及び97 D7S820において、配列ID番号80及び81 D13S317において、配列ID番号3、4、82及び83 D5S818において、配列ID番号84及び85 - 【請求項34】 少なくとも1多重増幅反応に対する試薬を更に含む、請求
項30記載のキット。 - 【請求項35】 対立遺伝子ラダーを有する容器を更に含む、請求項30記
載のキット。 - 【請求項36】 前記対立遺伝子ラダーの各ラング及び前記組の各遺伝子座
に対する少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーが、それぞれ、これら
に共有結合した蛍光標識を有し、かつオリゴヌクレオチドプライマーの少なくと
も2つが、容器中の他のプライマーと比べて、該プライマーに共有結合した異な
る蛍光標識を有する、請求項35記載のキット。 - 【請求項37】 ゲノムDNAの遺伝子座の一組を同時に分析するためのキ
ットであって、分析すべき前記ゲノムDNAの一組の遺伝子座を共増幅するため
のオリゴヌクレオチドプライマーを含み、前記プライマーが、1以上の容器にあ
り、かつ共増幅できる少なくとも16個の遺伝子座の一組を共増幅するように設
計され、前記少なくとも16個の遺伝子座の組が、D3S1358、HUMTH
01、D21S11、D18S51、G475、アメロゲニン、HUMvWFA
31、D8S1179、HUMTPOX、HUMFIBRA、D5S818、D
7S820、D13S317、D16S539、HUMCSF1PO及びS15
9を含むことを特徴とするキット。 - 【請求項38】 ゲノムDNAの遺伝子座の一組を同時に分析するためのキ
ットであって、分析すべき前記ゲノムDNAの一組の遺伝子座を共増幅するため
のオリゴヌクレオチドプライマーを含み、前記プライマーが、1以上の容器にあ
り、かつ共増幅できる少なくとも16個の遺伝子座の一組を共増幅するように設
計され、前記少なくとも16個の遺伝子座の組が、D3S1358、HUMTH
01、D21S11、D18S51、S159、アメロゲニン、HUMvWFA
31、D8S1179、HUMTPOX、HUMFIBRA、D5S818、D
7S820、D13S317、D16S539、HUMCSF1PO及びC22
1を含むことを特徴とするキット。 - 【請求項39】 1以上のDNAサンプルから一組の遺伝子座に存在する対
立遺伝子を同時に決定する方法であって、 (a)分析すべき少なくとも1以上のDNAサンプルを得る工程と、 (b)共増幅できる少なくとも13個の短いタンデム反復遺伝子座を含む前記
DNAサンプルの一組の遺伝子座を選択する工程であって、少なくとも13個の
短いタンデム反復遺伝子座の少なくとも4個が、 D3S1539、D4S2368、D5S818、D7S820、D9S93
0、D10S1239、D13S317、D14S118、D14S548、D
14S562、D16S490、D16S539、D16S753、D17S1
298、D17S1299、D19S253、D20S481、D22S683
、HUMCSF1PO、HUMTPOX、HUMTH01、HUMF13A01
、HUMBFXIII、HUMLIPOL及びHUMvWFA31 からなる群より選ばれる工程と、 (c)多重増幅反応で前記組の遺伝子座を共増幅する工程であって、反応生成
物が、前記組の各共増幅された遺伝子座から増幅された対立遺伝子の混合物であ
る工程と、 (d)前記混合物中の増幅対立遺伝子を評価して、前記DNAサンプル中の、
前記組で分析された各遺伝子座に存在する対立遺伝子を決定する工程と、 を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項40】 ゲノムDNAの一組の対立遺伝子を同時に分析するための
キットであって、分析すべき前記ゲノムDNAの一組の遺伝子座を共増幅するた
めのオリゴヌクレオチドプライマーを含み、該プライマーは、1以上の容器にあ
り、該プライマーは、共増幅できる少なくとも13の遺伝子座の組を共増幅する
ように設計され、少なくとも13個の短いタンデム反復遺伝子座の少なくとも4
個が、 D3S1539、D4S2368、D5S818、D7S820、D9S930
、D10S1239、D13S317、D14S118、D14S548、D1
4S562、D16S490、D16S539、D16S753、D17S12
98、D17S1299、D19S253、D20S481、D22S683、
HUMCSF1PO、HUMTPOX、HUMTH01、HUMF13A01、
HUMBFXIII、HUMLIPOL及びHUMvWFA31 からなる群より選ばれることを特徴とするキット。
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