WO2012022821A1 - Método para la obtención del perfil genético de un individuo - Google Patents

Método para la obtención del perfil genético de un individuo Download PDF

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WO2012022821A1
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seq
primers
amelogenin
dna
loci
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María de los Ángeles MARTÍNEZ DE PANCORBO GÓMEZ
José María AZNAR OVIEDO
Adrian ODRIOZOLA MARTÍNEZ
David Celorrio Herrera
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Universidad Del País Vasco
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the invention relates to a method to obtain the genetic profile of an individual, to determine kinship relationships between individuals or to identify human remains comprising the analysis of STRs loci in a DNA extract of said individual by at least one reaction. of multiplex amplification by using a set of primer pairs designed specifically for that purpose.
  • This method is applicable in the identification of individuals in the area of forensic genetics, as well as in population genetics, anthropology and biomedicine.
  • STRs Short Tandem Repeats
  • STRs are used in the elaboration of databases of genetic profiles in countries around the world, such as the CODIS database (Combined DNA Index System), which includes the STRs loci CSF1PO, FGA , TH01, TPOX, VWA, D3S 1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51 and D21S11, also included in the United States national database for the search of DNA profiles during the investigation of criminal offenses.
  • CODIS database Combined DNA Index System
  • the European database and the UK database include some of the CODIS STR loci, such as FGA, TH01, VWA, D3S1358, D8S1179, D16S539, D18S51, D21S11 and the amelogenin sex locus ( AMEL), in addition to the locus STRs D2S1338.
  • CODIS STR loci such as FGA, TH01, VWA, D3S1358, D8S1179, D16S539, D18S51, D21S11 and the amelogenin sex locus ( AMEL), in addition to the locus STRs D2S1338.
  • AMEL amelogenin sex locus
  • kits include the 13 CODIS loci; In the case of Identifiler ® it also includes the autosomal loci D2S1338 and D19433, and Powerplex TM 16 includes the autosomal loci Penta E and Penta D.
  • Schilz, F. et al. 2004 (Anthrop. Anz., 4: 369-378) described a multiplex PCR reaction capable of simultaneously amplifying fragments of short length of 16 STRs loci and the amelogenin locus (from 84bp to 275bp).
  • this multiplex reaction only alleles present in at least 1% of the caucasoides were considered, so their use may result in an erroneous genetic profile in 16% of the cases in which the analyzed biological sample comes from an individual of caucasoid origin, error that can even be increased in the analysis of individuals of other ethnic origins.
  • the genetic profile provided by AmpFlSTR ® MiniFiler TM is composed of only 8 STR loci plus amelogenin, so although it has the advantage of making it possible to obtain results in degraded DNA samples that other kits do not allow, their results are insufficient for the determination of the majority of kinship relationships that are common in the identification of remains of missing persons or in cases of serious accidents or catastrophes.
  • US6090558 patent application describes the use of mass spectrometry to detect length variation in nucleotide sequence repeats, such as microsatellites and short tandem repeats, and DNA primers for the analysis of polymorphisms in tandem nucleotide repeats. in specific loci.
  • the amplified genetic loci comprising HUMvWFA31, HUMLIPOL, HUMBFXIII, HUMF13A01, HUMFESFPS, HUMTH01, HUMTPOX, HUMCSF 1PO, D22S683, D20S481, D 19S253, D 17S 1299, D 17S 1298, D16S753, D16S539, D16S490, D14S562, D14S548, D14S118, D13S317 , D10S1239, D9S930, D7S820, D5S818, D4S2368 and D3S1539.
  • Patent application US6479235 describes methods and materials for the simultaneous amplification of at least 13 STRs of the CODIS in a simple multiplex reaction whose amplification sizes exceed 360 bp.
  • Patent application US2003 / 0186272 describes a rapid method for determining the length of fragments of alleles present in a plurality of loci in a sample containing DNA comprising (a) obtaining a sample containing DNA, b) amplifying by PCR multiplex a plurality of loci comprising FGA, vWA, TH01, TPOX, CSF1PO, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51 and D21S11, wherein said multiplex PCR reaction is carried out using a plurality of primer pairs, where at least one primer of each primer pair is labeled with a detectable label, and the amplification produces a mixture of labeled amplicons, and (c) electrophoresis analyzing said mixture of amplicon loci, where said stage of analysis allows the determination of the length of the allele fragments in said plurality of loci of the sample containing DNA.
  • the authors of the present invention have designed two sets of primer pairs that, used in a multiplex amplification reaction on a DNA extract from an individual, allow obtaining genetic profiles with a high discrimination power from highly degraded DNA extracts. , thus overcoming the inconveniences presented by the rest of the prior art methods at the time of Obtain said genetic profiles.
  • the design of the set of primer pairs of the invention was carried out by searching the flanking sequences at each STR locus and subsequently using the Perlprimer program (http: // perlprimer.sourceforge.net/). Once the primer pairs were obtained, an amplification reaction was carried out on a DNA extract using said primer pairs after which, the genetic profile of the individual to whom the DNA extract belonged was obtained with reliability, precision and Discrimination capacity superior to the genetic profiles obtained by other methods.
  • the invention relates to a method to obtain the genetic profile of an individual, to determine kinship relationships between individuals or to identify human remains comprising the analysis of STRs loci in a DNA extract from said individual or said human moieties by at least one multiplex amplification reaction, wherein the primer pairs of said multiplex amplification reaction comprise
  • SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 CSF1PO
  • SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 FGA
  • SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 TPOX
  • SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 D18S51
  • SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 VWA
  • SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 T01
  • SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 D21S11
  • SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 D7S820
  • SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 D2S1338)
  • SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 D13S317)
  • SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 Amelo genina
  • SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 D5S818)
  • the invention in another aspect, relates to a kit comprising primer pairs comprising
  • SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 FGA
  • SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 TPOX
  • SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 D18S51
  • SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 VWA
  • SEQ ID NO: 1 1 and SEQ ID NO: 12 T01
  • SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 D21S11
  • SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 D7S820
  • SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 D2S1338)
  • SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 D13S317)
  • SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 Amelogenin
  • SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 D5S818)
  • the invention relates to the use of a kit according to the present invention to obtain the genetic profile of an individual, to determine kinship relationships between individuals or to identify human remains.
  • the invention relates to a set of primer pairs comprising oligonucleotide pairs SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 (CSF1PO), SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 (FGA) , SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 (D18S51), SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 (VWA), SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 (TH01), SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 (D21 S1 1), SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 (D7S820), SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 (D2S1338), SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 (D13S
  • the invention relates to a set of primer pairs comprising oligonucleotide pairs SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 (CSF1PO), SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 (FGA) , SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 (D18S51), SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 (VWA), SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 (TH01), SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 (D21S11), SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 (D7S820), SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO : 18 (D2S1338), SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 (D13S317), SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 (Amelogenin), SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 (D5S818) ,
  • the invention relates to a pair of primers selected from oligonucleotide pairs consisting of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 (CSF1PO), SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 ( FGA), SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 (D18S51), SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 (VWA), SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 (TH01), SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 (D21S11), SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 (D7S820), SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 (D2S1338), SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 (D13S317), SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 (Amelogenin), SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 ( D5S818), SEQ ID NO
  • the invention relates to an oligonucleotide selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 31, SEQ ID
  • Figure 1 corresponds to a graph called electropherogram showing the genetic profile of an individual for the STRs analyzed by the first set of primer pairs of the invention using an automatic AB3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems ® ) sequence analyzer.
  • Figure 4 panels can be observed, each corresponding to those pairs of primers marked with the same fluorescent locus.
  • Each panel shows the intensity of the signal detected in the Relative Fluorescence Units (RFU, relative fluorescence unit) on the Y axis;
  • the X axis corresponds to the size in base pairs.
  • the first panel corresponds to the results obtained for the products of STRs amplified with primers labeled with 6-FAM TM (directed to the CSF1PO and FGA loci), the second panel to those marked with VIC TM (loci TH01, D21 S1 1 and D7S820), the third NED TM (loci TPOX, VWA and D18S51) and fourth panel results for loci STRs labeled with the fluorochrome PET ® (D2S1338, D13S317, amelogenin, and D5S818) are shown.
  • the bars at the top of each panel correspond to the name of the loci.
  • the rectangles located under the electropherogram peaks show the name of the allele, indicated by a number, its size in base pairs and the signal strength in RFUs.
  • Figure 2 corresponds to a graph called electropherogram showing the genetic profile of an individual for the STRs analyzed by the second set of primers of the invention using an automatic AB3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems ® ) sequence analyzer.
  • panels can be observed, each corresponding to those pairs of primers marked with the same fluorescent locus.
  • Each panel shows the intensity of the signal detected in the Relative Fluorescence Units (RFU, relative fluorescence unit) on the Y axis;
  • the X axis corresponds to the size in base pairs.
  • the first panel corresponds to the results obtained for the products of STRs amplified with primers marked with 6-FAM TM (addressed to loci CSF1PO, D5S818, D7S820 and D21S11), the second panel to those marked with VIC TM (loci TH01, D16S539, D3S1358 and D18S51), the third to NED TM (loci TPOX, VWA, D8S1179 and D19S433) and the fourth panel results for loci STRs labeled with the fluorochrome PET ® (D13S317, amelogenin and FGA) is.
  • the bars at the top of each panel correspond to the name of the loci.
  • the rectangles located under the electropherogram peaks show the name of the allele, indicated by a number, its size in base pairs and the signal strength in RFUs.
  • Figure 3 is a graphical representation showing the comparison of the first set of primer pairs (called I-DNA2) [Panel A] and the design of the second set of primer pairs (called I-DNA-1) [Panel B].
  • the boxes represent the amplified sizes for each locus. Loci marked with different color are presented in different gray scales. The respective tides are indicated in the right part of the Figure.
  • the authors of the present invention have designed two sets of primer pairs that, individually employed in a multiplex amplification reaction on a DNA extract from an individual, allow genetic profiles to be obtained with high reliability and high discrimination power from extracts. of highly degraded DNA, thus overcoming the disadvantages of the rest of the methods of the prior art when obtaining said genetic profiles.
  • the sets of primer pairs of the invention have been designed in such a way that, individually, it is possible to obtain simultaneous analysis of 11 or 14 STRs (Short Tandem Repeats) loci plus the amelogenin locus for sex determination, when an extract of DNA is subjected to a multiplex amplification reaction using one of said sets of primer pairs, and even from highly degraded DNA extracts, where the size of the extracted fragments does not exceed 230 bp. Additionally, the inventors have observed that using both sets of primer pairs in different multiplex amplification reactions on the same extract DNA, provide confirmation of the genetic profile obtained with the set of primer pairs used first, as they comprise pairs of primers directed to the same STRs loci.
  • STRs Short Tandem Repeats
  • a second multiplex amplification reaction it is possible to expand the number of STRs loci analyzed by introducing new pairs of primers aimed at amplifying different loci of those amplified in the first multiplex amplification reaction. These two characteristics allow to improve discrimination power of the genetic profile obtained.
  • 10 duplicate loci are analyzed: (i) 8 of which are genotyped with different primer pairs so that the allelic losses caused when a particular primer does not bind to the target DNA sequence due to some polymorphism; (ii) and the remaining two with identical primers, which provides additional internal control, since the genotypes of both loci must be identical in each of the reactions. It should be mentioned that both sets of primer pairs also present primers aimed at identifying the amelogenin locus for sex determination.
  • the design of the primer pair assemblies of the invention was performed by searching for the flanking sequences at each STR locus and subsequently using the Perlprimer program (http: // perlprimer .sourceforge.net /). Once the primer pairs were obtained, an amplification reaction was carried out on a DNA extract using said primer pairs after which, the genetic profile of the individual to whom the DNA extract belonged was obtained with reliability, precision and Discrimination capacity superior to the genetic profiles obtained by other methods.
  • the terms “genetic profile” and “genetic fingerprint” have the same meaning and can therefore be used interchangeably throughout the description.
  • the “genetic profile” is a set of sequences of characteristic bases of the genetic material that allow differentiating an individual from another.
  • STRs sequences or "STRs loci” means those DNA sequences, also called microsatellites, that contain 4 bp repeats (Butler JM, Biotechniques. 2007 Oct; 43 (4): ii-v .).
  • the analysis of the STRs loci in the genome presents multiple applications that include, but are not limited to, obtaining genetic profiles, kinship diagnoses, determining the origin of a sample or tissue, identification of cadavers, population genetics studies, tests of zygosity in twins, monitoring of bone marrow transplants, evaluation of the traceability of biological samples of human origin, identification of mixtures present in a sample and determination of the number of contributors of human origin to a mixture and their contribution relative to the mixture.
  • PCR corresponds to the polymerase chain reaction acronym whereby millions of copies of the desired DNA regions can be obtained. It is characterized by the use of pairs of primers that delimit the region from which millions of copies will be made, which is also known as "amplifying DNA" during PCR.
  • the PCR is composed of a certain number of cycles, in turn composed of three phases in which the DNA strands are separated, the primers are joined and the new DNA strands are elongated. In each cycle, if the reaction efficiency is 100%, exponential growth of the DNA fragments subject to amplification occurs.
  • multiplex amplification reaction is understood as the PCR reaction in which more than one DNA sequence is amplified in the same reaction, by using two or more pairs of primers in a single tube together with the rest. of the reaction reagents in order to simultaneously amplify multiple DNA sequences.
  • oligonucleotide refers to the sequence of nucleotide bases linked by phospho-diester bonds, usually not greater than 50 nucleotides.
  • primer or “first” or “oligonucleotide”("oligo) is understood as the nucleotide sequence from which DNA polymerase initiates the synthesis of a new DNA molecule.
  • the primers are short nucleotide sequences, approximately 15-24 nucleotides in length that can be aligned with a strand of target DNA thanks to the complementarity of bases to form a hybrid between the primer and the target strand of DNA. Then, the DNA polymerase enzyme can extend the primer along the DNA strand. Methods for preparing and using primers are described, for example in Sambrook et al. (2001) and Ausubel et al. (1999). Pair of primers
  • primer pair or “first pair” is understood as the set of two primers which, when used in the same amplification or PCR reaction, allow multiple copies of a DNA target sequence to be obtained.
  • Each of the primers hybridizes with the target sequence, so that the bounded nucleotide sequence is amplified by each pair of primers.
  • the extent of the primers during the PCR cycles determines the 2 N exponential multiplication of the nucleotide sequence bounded by the primers, N being the number of cycles of the PCR reaction.
  • biological sample means any matter that contains DNA.
  • DNA extract is understood when, after subjecting the biological sample to a method of extraction, separation, purification or cloning of DNA, among others, it is obtained as a result either dry, in solution, bound or not to other molecules, adhered or not to various substances or beds, matter in which the DNA is in a greater relative proportion with respect to the rest of the molecules present, compared to the biological starting sample.
  • DNA extract refers to DNA extracted from any biological sample that contains human DNA, whether from a living or dead individual, fetus, organs, tissues or cells.
  • highly degraded DNA means DNA whose fragments are small in size, preferably, sizes smaller than 300 bp, 290 bp, 280 bp, 270 bp, 260 bp, 250 bp, 240 bp, 230 bp, 220 bp, 210 bp or 200 bp.
  • the term "individual” refers to a human being of any age or race, who in the context of the present invention may be alive or dead.
  • first set of primer pairs of the invention or "I-DNA2"
  • I-DNA2 a set of primer pairs
  • the primer pairs have been designed so that when used together in a multiplex amplification reaction it is possible to obtain the simultaneous analysis of 1 1 STR loci plus the amelogenin locus that determines sex.
  • the STR loci analyzed in the present invention as well as the primer pairs designed for identification are shown in Table 1 (next page).
  • the procedure followed in the design of the first set of primer pairs of the invention is detailed in Example 1.
  • Table 1 Summary of the sequences of the primers in the 5 'to 3' direction designed for the amplification of each STR locus. It also details the minor to major allele of the STR that will be considered by this analysis (column: alleles) as well as the maximum and minimum possible amplification size for each STR.
  • the invention relates to a set of primer pairs comprising the following oligonucleotide pairs SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 (CSFIPO), SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 (FGA), SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 (D18S51), SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 (VWA), SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 (TH01), SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 (D21S11), SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 (D7S820), SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 (D2S 1338), SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 (D13S317), SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 (Amelogenin), and SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO : 24 (D5S818)
  • second set of primer pairs of the invention or "I-DNA1"
  • I-DNA1 a second set of primer pairs characterized by:
  • one of the primers of the pair has a nucleotide sequence different from the nucleotide sequence of the primer pair that amplifies the same locus in the first set of primers.
  • the present invention relates to a set of primer pairs comprising oligonucleotide pairs SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26 (CSFIPO), SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28 ( D5S818), SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 29 (D7S820), SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 31 (D21S11), SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 32 and SEQ ID NO: 33 (VWA ), SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 35 (D8S1179), SEQ ID NO: 36 and SEQ ID NO: 37 (D19S433), SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 38 and SEQ ID NO: 39 (D16S539), SEQ ID NO: 40 and SEQ ID NO: 41 (D3S 1358), SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43 (D18S51), SEQ ID NO: 25
  • Table 2 Summary of the sequence of primers in the 5 'to 3' direction designed for amplification of each STR in the combination called I-DNA1 (column: sequence 5 '- 3'). This same table details the minor to major allele of the STR that will be considered by this analysis (column: alleles) as well as the maximum and minimum possible size for each STR.
  • An additional value of the present invention resides in that when performing two multiplex amplification reactions on the same DNA extract, that is, dividing a single DNA extract into two aliquots and on each aliquot carrying out an amplification reaction using, respectively, , I-DNA2 and I-DNA1, or alternatively, I-DNA1 and IDNA2, is achieved, on the one hand the confirmation of the genetic profile obtained with the set of primer pairs used first, and on the other, it is extended to 15 STRs plus amelogenin the number of STRs loci that configure the genetic profile.
  • the invention relates to a set of primer pairs comprising oligonucleotide pairs SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 (CSF1PO), SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 ( FGA), SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 (D18S51), SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 (VWA), SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 (TH01), SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 (D21S11), SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 (D7S820), SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 (D2S1338), SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 (D13S317), SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 (Amelogenin), SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 ( D5S818), SEQ
  • the invention relates to a pair of primers selected from the oligonucleotide pairs consisting of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 (CSF1PO), SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 ( FGA), SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 (D 18S51), SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 (VWA), SEQ ID NO: 1 1 and SEQ ID NO: 12 (TH01), SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 (D21 S1 1), SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 (D7S820), SEQ ID NO : 17 and SEQ ID NO: 18 (D2S 1338), SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 (D13S317), SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 (Amelogenin), SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 (D5S
  • the invention relates to an oligonucleotide selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 , SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 31, SEQ
  • the uses of the first or second set of primer pairs of the invention include, but are not limited to, obtaining genetic profiles, kinship diagnoses, determining the origin of a sample or tissue, identification of cadavers, genetic studies of populations, tests of zigosity in twins, monitoring of bone marrow transplants, evaluation of traceability of biological samples of human origin, identification of mixtures present in a sample and determination of the number of contributors of human origin to a mixture and their relative contribution to mix. Therefore, in another aspect, the invention relates to the use of the first set of primer pairs of the invention (Table 1) or the second set of primer pairs of the invention (Table 2) to obtain the genetic profile of an individual, to determine kinship relationships between individuals or to identify human remains.
  • Table 1 the first set of primer pairs of the invention
  • Table 2 the second set of primer pairs of the invention
  • the invention relates to a method, hereinafter "method of the invention", to obtain the genetic profile of an individual, to determine kinship relationships between individuals or to identify human remains comprising the analysis of STRs loci in a DNA extract from said individual or said human moieties by at least one multiplex amplification reaction, wherein the primer pairs of said multiplex amplification reaction comprise
  • SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 CSF1PO
  • SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 FGA
  • SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 TPOX
  • SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 D18S51
  • SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 VWA
  • SEQ ID NO: 1 1 and SEQ ID NO: 12 T01
  • SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 D21S11
  • SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 D7S820
  • SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 D2S1338)
  • SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO : 20 D13S317)
  • SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 Amelogenin
  • SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 D5S818)
  • the implementation of the method of the invention requires obtaining a DNA extract that will ultimately come from a biological sample that will be adequately treated to obtain said DNA extract.
  • the DNA extract will come from the individual whose genetic profile is to be obtained, or from the individuals whose kinship relationship wants to be determined.
  • the method of the invention is directed to the identification of human remains, the DNA extract will come from the human remains that are to be identified.
  • human remains includes any biological sample from a dead or living human being, said human residue may be preserved in formol, frozen, dried, fixed in paraffin, in a state of decomposition, degradation and / or rot, among others.
  • biological samples from which DNA can be obtained include, but is not limited to, biological fluids (blood, saliva, urine, sperm, etc.); epidermis, dandruff, hair, feces, a vaginal sample, a tissue sample, burned tissues, etc.
  • biological samples include, among others, root hairs, compact bone, tooth, soft tissues and blood.
  • the DNA extract comes from a sample of blood, hair, saliva, epidermis, sperm, dandruff, a vaginal sample and a tissue sample,
  • Obtaining the biological sample must be done under the conditions and with the appropriate material, such as swabs, tweezers, etc. and each sample must be stored independently in separate and sterile plastic jars or bags, without any preservative, in freezing and properly labeled, avoiding contamination by foreign biological material.
  • DNA extraction may be performed using any method known to those skilled in the art (Sambrook et al, 2001. "Molecular cloning: a Laboratory Manual.”, 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol.
  • the DNA extract is quantified and normalized to obtain equal amounts of DNA in each sample in case the amount of DNA is sufficient for it. In the case of highly degraded samples with poor and / or degraded DNA, it is usual to add as much DNA as possible in the subsequent multiplex PCR reaction.
  • After obtaining the DNA extract from the biological sample it is subjected, at least, to a multiplex amplification reaction using the first set of primer pairs of the invention or, alternatively, the second set of primer pairs of the invention.
  • the amplification of the different STRs loci requires specific reaction conditions and procedures for each of the pairs of primers used, which can be achieved by systematic variation of each parameter.
  • the number of cycles and the alignment temperature used in the PCR reaction must be suitable for obtaining reliable results by using each of the primer pairs of the first or second set of primer pairs of the invention.
  • Parameters such as the concentration of primers are specific to each primer and have been adjusted in the validation of the set of primer pairs.
  • the primers offer results in a wide range of concentrations, although the optimal concentrations for each pair of primers are shown in Tables 3 and 4.
  • Table 4 Summary of the concentrations at which each of the primers is used and the fluorochrome with which the 5 'end of the direct or forward primer (bold numbers) of each pair of primers in the set called I has been marked -DNA1, or second set of primer pairs of the invention.
  • the method of the invention comprises the analysis of STRs loci in a DNA extract by means of a multiplex amplification reaction which, additionally, can comprise a second amplification reaction of said DNA extract. .
  • the analysis of the STRs loci further comprises a second multiplex amplification reaction of the DNA extract from said individual or said human remains, wherein the primer pairs of said second reaction multiplex amplification comprise at least one pair of primers characterized in that:
  • one of the primers of the couple has a nucleotide sequence different from the nucleotide sequence of the couple of primers that amplifies the same locus in the first multiplex amplification reaction.
  • this second amplification reaction on the same DNA extract, that is, on a DNA extract from the same sample from which the DNA extract on which the first multiplex amplification reaction was carried out, is achieved confirmation of the genetic profile obtained with the first mutiplex amplification reaction (carried out by using the first or second set of primer pairs of the invention). Additionally, if desired, it is also possible to expand the number of STRs loci that constitute the genetic profile by adding to the second amplification reaction of new pairs of primers directed to loci other than those amplified in the first amplification reaction.
  • the primer pairs of the second multiplex amplification reaction comprise 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or 9 pairs of primers, each pair of primers characterized in that:
  • - amplify one of the amplified locus in the first multiplex amplification reaction and - one of the primers of the pair has a nucleotide sequence different from the nucleotide sequence of the primer pair that amplifies the same locus in the first amplification reaction.
  • the primer pairs of the second multiplex amplification reaction are selected from the oligonucleotide pairs.
  • SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 CSF1PO
  • SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 FGA
  • SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 D18S51
  • SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 VWA
  • SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 D21S11
  • SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 D7S820
  • SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO : 20 D13S317)
  • SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 Amelogenin
  • SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 D5S818).
  • the second multiplex amplification reaction additionally comprises
  • a multiplex amplification reaction requires a series of reagents, including, but not limited to, the template DNA, the enzyme DNA polymerase, at least two pairs of primers (each primer being each pair complementary to one of the two strands of the DNA), deoxynucleotide triphosphates (dNTPs), magnesium chloride (MgCl 2 ), reaction buffer and optional additives, which can be added separately by mixing in the laboratory or purchased previously mixed, as is the case of Qiagen Multiplex PCR Kit (Qiagen, Valencia, CA), to which the pairs of primers are added in the appropriate concentrations and the template DNA.
  • dNTPs deoxynucleotide triphosphates
  • MgCl 2 magnesium chloride
  • the PCR is carried out in a thermocycler that performs the cycles in the exact times and temperatures programmed, such as the hybridization temperature, which depends on the melting temperature of each of the primers used in the reaction or the temperature of extension.
  • the melting temperature of primers SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 24 (Table 1) is between 58 and 60 ° C, and that of the set of primer pairs shown in Table 2 is between 57 and 63 ° C, as calculated using the Perlprimer software (http://perlprimer.sourceforge.net/).
  • the melting temperature of the multiplex amplification reaction comprising oligonucleotides SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 24 (Table 1) is comprised between 58 and 60 ° C, and / or in case the second multiplex amplification reaction is carried out with all or part of the set of oligonucleotide pairs shown in Table 2, the melting temperature of the second multiplex amplification reaction is between 57 and 63 ° C.
  • the melting temperature will be between 57 and 63 ° C, and if in the second multiplex amplification reaction all or part of the first set of primer pairs of the invention (shown in Table 1), the melting temperature will be between 58 and 60 ° C.
  • the priming of the primers participating in said multiplex amplification reaction can be carried out in order to be able to subsequently detect the amplified fragments.
  • the marking of amplification products can be carried out by conventional methods. Said marking can be direct, for which fluorophores can be used, for example, Cy3, Cy5, fluorescein, alexa, etc., enzymes, for example, alkaline phosphatase, peroxidase, etc., radioactive isotopes, for example, 33P, 1251, etc., or any other marker known to the person skilled in the art.
  • said marking can be indirect through the use of chemical, enzymatic methods, etc .
  • the amplification product may incorporate a member of a specific binding pair, for example, avidin or streptavidin conjugated with a fluorochrome (locus), and the probe binds to the other member of the specific binding pair, for example, biotin (indicator), the reading being carried out by fluorimetry, etc.
  • the amplification product may incorporate a member of a specific binding pair, for example, an anti-digoxigenin antibody conjugated to an enzyme (locus), and the probe binds to the other member of the specific binding pair, for example, digoxigenin (indicator), etc., transforming the enzyme substrate into a luminescent or fluorescent product and, reading by chemiluminescence, fluorimetry, etc.
  • the marking of the amplification product is carried out by the marking, at one of its ends, of one of the oligonucleotides of each pair of primers which, in another even more particular embodiment, the compound employed in the oligonucleotide mapping is selected from the group consisting of a radioisotope, a fluorescent material, digoxigenin and biotin.
  • 5-FAM 5-carboxyfluorescein
  • 6-FAM t-FAM tetrachlorinated analog
  • HEX 6-FAM hexachlorinated analog
  • TAMRA 6-carboxytetra
  • the amplification products or amplicons can be separated.
  • Virtually any conventional method can be used within the scope of the invention to separate the amplification products.
  • Techniques for separating amplification products are widely described in the state of the art, such as in Sambrook et al., 2001 (cited ad supra). Techniques for separating amplification products are, for example, submerged electrophoresis with Methafor gels, polyacrylamide gels electrophoresis, capillary electrophoresis, etc.
  • the size of the separated fragments is identified, for which any of the methods of identification of amplification fragments known in the state of the art can be used, such as hybridization with labeled probes (for example with a fluorophore) which will be detected by a detector and processed by a computer system, staining, for example, with ethidium bromide, silver staining, etc.
  • labeled probes for example with a fluorophore
  • staining for example, with ethidium bromide, silver staining, etc.
  • electropherogram As the expert in the field understands, if this whole process is integrated into a computer system, it can be generate a graph called electropherogram where the size of the amplified fragments can be identified.
  • Applications of the method of the invention include, but are not limited to, the determination of kinship relationships between individuals (Biological Paternity Research or PPI), the identification of human remains (eg, fetal samples, cadaveric remains, remains old etc.), the identification of missing persons (they can group a wide variety of cases, such as people who accidentally disappear, people victims of criminal acts, people victims of war or political conflicts, etc.), identification of accident victims (traffic accidents, air, domestic, major catastrophes, etc.), the resolution of crimes etc.,
  • reference genetic profile is understood as that genetic profile that serves to establish the identity of the genetic profile analyzed by comparison.
  • the genetic reference profile can be Obtain from an undoubted biological sample of relatives of said individual in order to determine the possible relationship between the genetic profile of the individual object of the identification and the genetic profile of reference.
  • the invention relates to a kit useful for the implementation of the method of the invention, comprising the first set of primer pairs of the invention (I-DNA2) or, alternatively, the second set of pairs of primers of the invention (I-DNA1).
  • kit of the invention comprising the pairs of primers comprising
  • SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 CSF1PO
  • SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 FGA
  • SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 TPOX
  • SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 D18S51
  • SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 VWA
  • SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 T01
  • SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 D21S11
  • SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 D7S820
  • SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 D2S1338)
  • SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 D13S317)
  • SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 Amelogenin
  • SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 D5S818)
  • the kit of the invention in addition to comprising the first or second set of primer pairs of the invention, can optionally include the reagents necessary to carry out the multiplex amplification reaction, among the which include, but are not limited to, deoxynucleotide triphosphate (dNTPs), divalent and / or monovalent ions, a buffer solution (buffer) that maintains the proper pH for the functioning of DNA polymerase, DNA polymerase or mixture of different polymerases, etc.
  • dNTPs deoxynucleotide triphosphate
  • buffer solution buffer
  • the kit of the invention does not comprise the reagents necessary to practice the method of the invention, these are commercially available and can be found as part of a kit.
  • any commercially available kit containing the reagents necessary to carry out an amplification reaction can be used successfully in the practice of the method of the invention.
  • these reagents are previously mixed in the Qiagen Multiplex PCR Kit reagent (Qiagen, Valencia, CA), which is used at one fifth of the volume recommended by the manufacturers for PCR reactions in general in combination with the first or second combination of primers at the concentrations previously described, in a final volume of 10 micro liters.
  • the method of the invention may further comprise a second multiplex amplification reaction to amplify another aliquot of the DNA extract, wherein said second multiplex reaction comprises a set of primer pairs in the that, at least, one pair of primers is characterized in that (i) amplifies one of the amplified locus in the first amplification reaction and (ii) one of the primers of the couple has a nucleotide sequence other than the nucleotide sequence of the pair of primers that amplify the same locus in the first amplification reaction.
  • the kit of the invention further comprises the first or second set of primer pairs of the invention, at least one primer pair characterized in that:
  • - amplifies one of the locus amplified by the first or second set of primer pairs of the invention and - one of the primers of the pair has a nucleotide sequence different from the nucleotide sequence of the primer pair that amplifies the same locus in the first or second set of primer pairs of the invention.
  • the kit of the invention comprises, in addition to the first or second set of primer pairs of the invention, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or 9 primer pairs, each pair of primers characterized because:
  • one of the primers of the pair has a nucleotide sequence different from the nucleotide sequence of the primer pair that amplifies the same locus in the first or second set of primer pairs of the invention.
  • said primer pair characterized in that (i) amplifies one of the locus amplified by the first or second set of primer pairs of the invention, and (ii) one of the primers of the pair has a nucleotide sequence other than the nucleotide sequence of the primer pair that amplifies the same locus in the first or second set of primer pairs of the invention, is selected from the group consisting of
  • SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26 CSF1PO
  • SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 47 FGA
  • SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43 D18S51
  • SEQ ID NO: 32 and SEQ ID NO: 33 VWA
  • SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 31 D21 S 11
  • SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 29 D7S820
  • SEQ ID NO : 44 and SEQ ID NO: 45 D13S317)
  • SEQ ID NO: 46 and SEQ ID NO: 22 Amelogenin
  • SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28 D5S818)
  • SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 FGA
  • SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 D18S51
  • SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 VWA
  • SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 D21S11
  • SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 D7S820
  • SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 D13S317)
  • SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 Amelogenin
  • SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 D5S818).
  • kit of the invention further comprises
  • the kit of the invention may comprise pairs of primers already marked, or the reagents necessary to carry out their marking.
  • the different methods that exist in the state of the art to perform the mareaje of the primers, as well as the types of compounds that can be used in said mareaje have been explained previously here.
  • the kit of the invention comprises pairs of primers in which one of the oligonucleotides of each pair is labeled at one of its ends, or the reagents necessary to label the pairs of primers.
  • the compounds employed in the oligonucleotide mapping select from the group consisting of a radioisotope, a fluorescent material, digoxigenin and biotin, which in another even more particular embodiment, the fluorescent material is selects from the group consisting of 5- carboxyfluorescein (5-FAM), 6-FAM, tetrachlorinated t-FAM analog (TET), 6-FAM hexachlorinated analog (HEX), 6-carboxytetramethylrodamine (TAMRA), 6-carboxy- X-rhodamine (ROX), 6-carboxy-4 ', 5' -dichloro-2 ', 7'-dimethoxyfluorescein (JOE), NED (ABI), Cy-3, Cy-5, Cy-5.5, fluorescein-6-isothiocinate (FITC) and tetramethylrodamine-5-isothiocinate (TRITC).
  • 5-FAM 5- carboxyfluorescein
  • 6-FAM tetrach
  • the kit of the invention is useful in the implementation of the method of invention. Therefore, in another aspect, the invention relates to the use of the kit of the invention to obtain the genetic profile of an individual, to determine kinship relationships between individuals or to identify human remains.
  • Peripheral blood samples were taken from 600 healthy individuals: 318 European Caucasians (Basque Country, Spain) and 282 individuals from Colombia (133 Negroids and 149 Hispanics).
  • DNA extraction and quantification DNA extracts from individuals of caucasoid origin were obtained by proteolytic lysis with proteinase K and organic extraction. DNA extracts from biological samples of individuals of black and Hispanic origin were obtained by extraction by QiAamp DNA Micro Kit (Qiagen, CA). All DNA extracts were quantified with PicoGreen ® (Invitrogen).
  • the Perlprimer program http://perlprimer.sourceforge.net/ was used to design new primers that amplify in the case of I-DNA1 14 loci STRs (D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D19S433, D21 S11, CSFIPO, FGA, THO l, TPOX and vWA) plus amelogenin, and in the case of I-DNA2 11 STRs (CSFIPO, FGA, TPOX, D18S51, vWA, THOl, D21S11, D7S820, D2S1338, D13S317, D5S818) plus amelogenin, based on the reference sequences whose Genbank access numbers are collected in Table 5 and in Table 5A for the first and second set of primer pairs, respectively.
  • flanking regions to the STRs analyzed were studied using SNPblast (Vww.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snpblastByChr.html) in order to avoid variable positions in the junction region of all designed primers.
  • the amplifiers range from 49 to 297 bp and 298 bp, in the case of I-DNA1 and I-DNA2 respectively, to cover a large number of alleles contained in the STRBase website [Ruitberg, C.M., D.J. Reeder, and J.M. Butler, 2001. Nucleic Acids Res, 29 (1): 320-2] (Tables 5 and 5A, respectively).
  • the intensity of the amplicons and the absence of unspecific each locus was evaluated by analyzing the PCR products by DHPLC with DNASep Cartridge (Transgenomic WAVE ® System ® 4500, Glasgow, UK). 10 ⁇ of amplified were migrated at 40 ° C in a linear gradient from 38.6 to 61.1% of buffer B (25% acetonitrile and 0.1 M TEAA) for 10 minutes.
  • thermocyclers Biorad TM Icycler, C1000 TM and MyCycler TM (BioRad, Hercules, CA) and GeneAmp ® PCR System 9700 ( Applied Biosystems, Foster City, CA), as well as in different conditions of hybridization temperatures ("annealing temperature”): 57 ° C, 58.9 ° C, 60.5 ° C, 61.8 ° C and 63 ° C , at different numbers of cycles: 28, 29, 30, 31 and 32 cycles and at final extension times of 30, 45, 60 and 90 minutes.
  • annealing temperature 57 ° C, 58.9 ° C, 60.5 ° C, 61.8 ° C and 63 ° C
  • the accuracy of the allelic stairs of I-DNA1 and I-DNA2 was calculated by analyzing 48 replicas of each allele ladder in an ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems ® , Foster City, CA).
  • the accuracy of genotyping of I-DNAl and I-DNA2 was evaluated by analyzing 162 amplified DNA samples under standard conditions, from which the standard deviation in base pairs of each of the alleles was calculated with respect to the allele size of the corresponding allele ladder, by the Genmapper program (Applied Biosystems, Foster City, CA).
  • Tables 5 and 5 A collect a wide range of alleles for each locus included in I-DNAl and I-DNA2, respectively.
  • the alleles described in the main population groups have been considered according to the information collected in STRbase [Ruitberg, C.M., D.J. Reeder, and J.M. Butler, 2001. Nucleic Acids Res, 29 (1): 320-2].
  • 96 primers were designed from which those capable of producing amplifications of the smallest possible size were chosen, which in no case exceeded 300 bp, whose melting temperatures were between 57 , 5 and 62.5 ° C and that hybridize in regions lacking SNPs ⁇ Single Nucleotide Polymorphism) and INDELS (Insertions / deletions) described to date in NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp /).
  • INDELS Inserti / deletions
  • All primer pairs of this invention are different from those used in any of the currently validated kits.
  • various sets of multiplex primers were tested.
  • the allele ranges of adjacent loci in size were spaced in order to avoid overlaps between alleles corresponding to different loci to ensure proper genotyping.
  • He DHPLC analysis allowed to evaluate the absence of nonspecific and the efficiency of amplification for each of the loci tested in multiplex format.
  • primers designed to produce amplifiers of the smallest possible size for D2S 1 138 were designed as this locus is not included in I-DNAl.
  • primers of identical sequence were used to those used in I-DNAl for THOl and TPOX due to their small size of 49 and 51 bp, respectively.
  • singleplex PCR amplifications of each locus were performed, except for THOl and TPOX, previously tested. The PCR products were analyzed by DHPLC to assess the specificity of the primers and the amplification intensity.
  • 2 triplex PCR reactions (Triplex A: TPOX, D18S51 and vWA; Triplex B: TH01, D21S11 and D7S820), a quadruplex PCR reaction (quadruplex C: D2S1338, D13S317, amelogenin and D5S818) and a reaction of Duplex PCR (duplex D: CSFIPO and FGA).
  • the direct primers of the 2 triplex A and B reactions were labeled with NED TM and VIC TM, respectively, the direct primers of the quadruplex C reaction, were labeled with PET ® (Applied Biosystems, Foster City, CA) and the direct primers of the duplex reaction D, were labeled with 6-FAM TM (Table 5A).
  • primers were designed so that a total of 15 STRs loci could be analyzed in two multiplex reactions: (CSFIPO, FGA, TPOX, D18S51, vWA, TH01, D21S11, D7S820, D2S1338, D13S317, D5S818, D8S1179, D19S433, D16S539, D3S1358) plus amelogenin.
  • the first multiplex reaction which uses the set of primers called I-DNA1, allows obtaining the genetic profile of 14 STRs (CSFIPO, D5S818, D7S820, D21 S 1 1, TPOX, VWA, D8S 1 179, D 19S433, TH01, D 16S539, D3 S 1358, D18S51, D13S317, FGA) plus amelogenin.
  • the second multiplex reaction which uses the set of primers called I-DNA2, allows obtaining the genetic profile of 1 1 STRs (CSFIPO, FGA, TPOX, D18S51, vWA, TH01, D21S11, D7S820, D2S1338, D13S317, D5S818) plus amelogenin .
  • PCR parameter optimization The optimization of the amplification parameters such as the optimal concentration of primers, hybridization temperature, number of cycles and extension time, was performed by studying the electropherograms in which the height of the peaks was evaluated, the balance in heterozygosis of them and incomplete adenylation.
  • the concentration of each pair of primers was tested between 0.0375 ⁇ and 0.75 ⁇ , so that in each case, below the optimum concentration an increase in the height of the peaks was observed as that the concentration of primers was increased. While at the same time, in concentrations higher than the one considered optimal, an increase in both imbalance in heterozygosis and incomplete adenylation was detected, as well as in the intensity of the artifacts in I-DNA1 (FAM87, FAM96, FAM158, VIC53, VIC105, VIC121 and VIC180) and in I-DNA2 (FAM91, FAM155, VIC51, VIC179, NED100, NED165, NED179, PET95 and PET97).
  • the intensities of the loci analyzed by I-DNA1 and I-DNA2 were balanced around 2,500 RFUs in the analysis of 1 ng of DNA, to achieve a balance between the intensity of the signal and the absence of overlap between signals corresponding to different fluorochromes.
  • the hybridization temperature of the multiplex PCR reaction was then optimized.
  • the increase in hybridization temperature produced a gradual decrease in both incomplete adenylation and peak height.
  • the best results were obtained at the hybridization temperature of 60.5 ° C, in the case of I-DNA1, and of 58.9 ° C and 60.5 ° C in the case of I-DNA2.
  • the temperature of 60.5 ° C was chosen because it is the most restrictive for I-DNA2 and because it coincides for both systems.
  • the increase in the number of cycles generally increased the height of the peaks and incomplete adenylation. In this sense, the most balanced results corresponded to 30 cycles.
  • the increase in extension time did not produce significant changes in incomplete adenylation; however, the addition of a guanine to the 5 ' end of the first reverse eliminated the effect of adenylation incomplete, even better than the addition of pig-tailing.
  • the addition of said guanine is represented as a G in Tables 1 and 2.
  • the optimal concentration of primers was determined, so that the following average intensities for each color were obtained in the analysis of 1 ng of I-DNAl DNA [6-FAM TM (2243 ⁇ 764 RFUs), VIC TM (2742 ⁇ 748 RFUs), NED TM (2313 ⁇ 426 RFUs) and PET ® (2417 ⁇ 247 RFUs)] and I-DNA2 [6-FAM TM (1933 ⁇ 424 RFUs), VIC TM (2659 ⁇ 428 RFUs), NED TM (2276 ⁇ 100 RFUs) and PET ® (1869 ⁇ 416 RFUs)].
  • I-DNA1 and I-DNA2 have proven to be balanced and specific multiplexes, capable of amplifying 14 STRs and 11 STRs loci, respectively, in addition to the amelogenin locus, from 1 ng of template DNA ( Figures 1 and 2 ), by the following amplification conditions: an initial denaturation cycle for 15 minutes at 95 ° C, 30 cycles of 30 s at 95 ° C, 90 s at 60.5 ° C and 1 minute at 72 ° C, followed by 1 cycle of final extension of 30 minutes at 60 ° C.
  • the accuracy of the allelic stairs of I-DNA1 and I-DNA2 was calculated from the study of allelic stairs analyzed in independent injections.
  • the standard deviation in base pair size was equal to or less than 0.07 bp for both I-DNA1 and I-DNA2.
  • Accuracy was measured by the analysis of 162 caucasoid individuals to calculate the deviation of the allele size of each sample with respect to the allele size of the corresponding allelic ladders. No alleles outside the range of ⁇ 0.40 bp corresponding to each allele of allelic stairs were detected.
  • the optimization of the set of primers has been to analyze the amplified products both separately and in multiplex.
  • the usual procedure consists of analysis of labeled amplicons using a DNA sequencer [Tagliaro, F., et a /., 2010. Electrophoresis, 31 (1): 251-9].
  • DHPLC technology (“Denaturing High-Performance Liquid Chromatography") has been used for the first time to evaluate the intensity of the amplified and determine the absence of nonspecific amplifications.
  • DHPLC technology Denaturing High-Performance Liquid Chromatography
  • I-DNA1 and I-DNA2 have proven to be balanced and specific multiplex reactions, capable of amplifying 14 STRs loci and 11 STRs loci, respectively, in addition to the amelogenin locus.
  • I-DNA1 and I-DNA2 have been verified by concordance studies between the genetic profiles determined by these systems and those obtained by widely used pre-existing systems. In this sense, a 99.9% agreement between I-DNA1 and Identifiler ® (Applied Biosystems, Foster City, CA) was first verified, where the only exception was detected in an individual, genotyped as homozygous by Identifiler ® (Applied Biosystems, Foster City, CA) and as heterozygous for I-DNA1. Likewise, the concordance of 100% of I-DNA2 with respect to Identifiler (Applied Biosystems, Foster City, CA) and 99.9% compared to I-DNA1.
  • I-DNA1 and I-DNA2 constitute systems of high robustness and reliability in obtaining genetic profiles, which makes them useful tools for their use in human identification.
  • the small size of its amplified added to having been designed for optimum complementarity, suggests that the present invention has a high capacity for analysis of loci included in CODIS from small DNA fragments.
  • Validation of the method of the invention comprising two multiplex amplification reactions using sets of primer pairs I-DNA1 and I-
  • DNA2 for use in the analysis of highly degraded DNA samples
  • the following describes the validation of I-DNA1, I-DNA2 and the combination of both reactions according to Scientific Working Group on DNA Analysis Methods (SGWDAM) [Ellegren, H., 2004. Nat Rev Genet., 5 (6) : 435-45] in the analysis of highly degraded DNA samples.
  • This validation has consisted of tests to determine the percentage of stuttering alleles, relative intensity between peaks, mixtures and sensitivity.
  • Peripheral blood samples were taken from 600 healthy individuals: 318 European Caucasians (Basque Country, Spain) and 282 individuals from Colombia (133 Negroids and 149 Hispanics).
  • DNA extracts from individuals of caucasoid origin and paraffin samples were obtained by proteolytic lysis with proteinase K and organic extraction.
  • DNA extracts from biological samples of individuals of black and Hispanic origin were obtained by extraction by QiAamp DNA Micro Kit (Qiagen, CA). The amounts of DNA recommended by the manufacturer were used for the PCR amplification of each type of sample in each case.
  • 1 ng was used in the amplification of DNA from population samples and 1.6 ng of DNA from paraffin samples. All DNA extracts were quantified with PicoGreen ® (Invitrogen).
  • the determination of stuttering alleles in both homozygous and heterozygous individuals that differed in size by more than 4 bp was made by calculating the percentage of the stutter allele's height relative to the actual peak's height.
  • the calculation of the relative intensity of heterozygous peaks (“Peak Height Ratio" or PHR) was done by dividing the height of the smallest of the peaks by the height of the largest of the heterozygotes of each locus.
  • the DNAs selected for the mixture test were chosen for their high heterozygosity, although some of the alleles of the "minor contributor” resided in the stammering allele positions of the "major contributor” alleles (in a mixture composed of the DNAs of two individuals, the "largest contributor” refers to the profile that is found in the highest proportion in the mix).
  • the threshold for the distinction between the "minor contributor” and the stutterer allele of the "largest contributor” of each locus analyzed was set at an intensity equal to the average percentage of stuttered allele plus 3 times its standard deviation.
  • the "minor contributor” was genotyped at a 1: 10 ratio in all the loci included in this reaction, with the exception of loci D19S433 and D7S820 that were genotyped. at a 1: 7 ratio.
  • the "minor contributor” was genotyped up to 1: 15 ratios in CSFIPO, D5S818 and D8S1179 loci, and even at 1: 20 ratios in THOl and TPOX.
  • the minor contributor was genotyped at a 1: 7 ratio in all loci included in this reaction, with the exception of locus D21S 11, which was genotype at a ratio of 1: 5, due to its high stutter percentage and the presence of the VIC179 artifact.
  • the minor contributor was able to genotype up to a 1: 10 ratio in D18S51 and D7S820, 1: 15 in CSFIPO, FGA and D13S317, and even at a 1: 20 ratio in TPOX and TH01.
  • the least amount of DNA that allowed to obtain complete profiles both in the case of I-DNA1 and I-DNA2 was 100 pg.
  • quantities greater than 25 pg of DNA allowed the analysis of 11 STR loci and amelogenin, while the remaining 3 STR loci (D5S818, D3S1358 and D18S51) presented allelic losses due to stochastic effects.
  • quantities greater than 50 pg of DNA allowed the analysis of 8 STR loci and amelogenin, while the remaining 3 STR loci (FGA, D21 SI 1 and D2S1338) presented allelic losses due to stochastic effects.
  • amounts greater than 25pg of DNA allowed the analysis of 5 STR loci (VWA, TH01, D7S820, D 13 S317 and D5S818) and amelogenin, while the rest of STR loci presented allelic losses due to stochastic effects, with the exception of FGA that did not offer results at more than 50 RFUs.
  • I-DNA1 and I-DNA2 from amounts of 100 pg of total DNA, using equally 50 pg in each system, allowed the analysis of 14 STRs and amelogenin loci, 5 of them in duplicate (CSF 1PO, vWA, D13S317, TPOX and D7S820).
  • amounts of 50 pg of total DNA using 25 pg in each system equally, allowed the analysis of 13 STRs and amelogenin loci, 2 of them plus amelogenin in duplicate (D13S317 and vWA).
  • the size of the amplicons of a multiplex STR system is critical for obtaining genetic profiles from highly degraded biological samples [Butler, JM, Y. Shen , and BR McCord, 2003. J Forensic Sci, 48 (5): 1054-64; Coble, M.D. and J.M. Butler, 2005. J Forensic Sci, 50 (1): 43-53].
  • the primer pairs of the present invention are characterized by allowing a high number of STR loci to be analyzed by small amplified amplifiers.
  • Table 1 1 the loci analyzed are detailed both in the STR multiplexes of the prior art and in the method object of the invention, by means of amplifications that do not exceed 200 bp (miniSTRs) or 300 bp (midiSTRs ), as well as those over 300 bp (maxiSTRS).
  • REPLACEMENT SHEET (RULE 26) Table 11. miniSTRs ( ⁇ 200 pbs), midiSTRs ( ⁇ 300 pbs) and maxiSTRs (> 300 pbs), in black, gray and white respectively, analyzed by the main state-of-the-art multiplex STRs as well as by the combinations of reactions and those object of the present invention. In this calculation, high molecular weight alleles of FGA are not considered, as they are highly infrequent, as demonstrated by their absence in the 600 individuals analyzed in examples 1 and 2.
  • Minifiler TM From left to right: Identifiler ® , Minifiler TM, Powerplex 16, Q8, Bioplex-11 TM NGM, Powerplex ESX-17, ESI- Powerplex 17, I-DNA2, I-DNA1 and combinations Powerplex ESX-17 + Powerplex ESX-17, Minifiler TM + Identifiler ®, Minifiler TM + NGM TM and I-DNA1 + I-DNA2. Amplified sizes Minifiler Identifiler TM and ® are approximate, because the exact data have not been published. STR loci included in the CODIS, ECL, in both or in other databases are detailed.
  • I-DNA1 analyzes all the STRs included in the CODIS and 9 of 10 of the ECL, as well as amelogenin, from DNA fragments that do not exceed 300 bp.
  • I-DNA1 stands out as the only system currently available that allows analyzing all the loci included in the CODIS by means of amplicons that do not exceed 300 bp and, like Bioplex-11, analyzes 10 loci included in the CODIS by means of amplicons not exceeding 200 bps.
  • I-DNA2 analyzes 10 and 7 of the STRs included in the CODIS, as well as amelogenin, from DNA fragments that do not exceed 300 and 200 bps, respectively.
  • Minifiler TM + Identifiler ® analyzes the entire CODIS [Luce, C, et al, 2009. J Forensic Sci, 54 (5): 1046-54; Mulero, JJ, et al, 2008. J Forensic Sci, 53 (4): 838-52]; Minifiler TM + NGM TM, analyzes 11 loci included in the CODIS [AmpFISTR® NGM TM PCR Amplification Location User's Guide. Applied Biosystems.
  • REPLACEMENT SHEET (RULE 26) CODIS markers / loci. This combination has a small size of amplicons, so that it has been specifically designed to enable the amplification of 13 STR loci, 12 of them included in the CODIS in DNA fragments that do not exceed 200 bp. It should be noted that the combination of I-DNA1 with I-DNA2, allows to analyze all the loci included in the CODIS by means of amplicons that do not exceed 229 bps.
  • reaction combinations have been designed so that they can allow duplicate genotyping of a certain number of loci.
  • Minifiler TM combined with NGM TM allows duplicate amplification of 2 loci in midiSTR format, while combined with Identifiler ® it extends to 4 the number of loci analyzed in duplicate in midiSTR format. Both combinations allow only genotyping in duplicate of amelogenin in fragments that do not exceed 200 bp.
  • the combination of PowerPlex ® ESX and ESY allows duplicate analysis of 9 loci, 6 included in the CODIS, from fragments that do not exceed 300 bp and 4 loci, included in the CODIS and in the ECL, from fragments that do not exceed 200 bp [Hill, CR, et a / .2010. April 22, Forensic Sci Int Genet].
  • the combination of I-DNA2 with I-DNA1 allows to analyze 10 STRs plus amelogenin loci in duplicate, all of them included in the CODIS, by means of amplicons that do not exceed 300 bp and 5 STRs loci in fragments that do not exceed 200 bp.
  • Identifiler ® and Minifiler ® constitutes the state of the art identification system that shows the highest performance in the analysis of STR loci included in CODIS, based on highly degraded extracts; (Mulero, JJ, et.al. 2008. J Forensic Sci, 53 (4): 838-852 and Luce et al, 2009. J Forensic Sci. 54 (5): 1046-54), considering the STR loci included in the CODIS.
  • Identifiler ® * corresponds to the combined discrimination power of the STRs D3S1358, D5S818, D8S1179, D19S433, TH01, TPOX and VWA loci, those of smaller amplification size in that identification system and therefore those most likely to offer results in he
  • REPLACEMENT SHEET (RULE 26) analysis of highly degraded DNA extracts.
  • Minifiler ® includes the analysis of the remaining 8 STR loci present in Identifiler ® plus amelogenin.
  • Table 15 represents both separately and in combination, the combined probability of coincidence in different population groups of Identifiler ® and Minifiler ® , as well as of I-DNA1 and I-DNA2.
  • the systems compared according to their probability of coincidence, from highest to lowest are: Identifiler ® * , Minifiler ® , I-DNA2, 1- DNA1.
  • the combination of I-DNA1 + I-DNA2 offers the same probability of coincidence as Identifiler ® , and the combination of this with Minifiler TM because in both cases identical STRs loci are analyzed.
  • REPLACEMENT SHEET (RULE 26) allele, so can both results for Identifiler ®, as those that combine the results obtained by combining Identifiler Minifiler ® ® and have been slightly overstated compared to other systems compared.
  • Identifier offers the highest probability of matching the systems compared.
  • Minifiler ® presents similar results to I-DNA2.
  • the combination Identifier ® and Minifiler ® offers a probability of coincidence similar to that obtained by I-DNA1.
  • the combination I-DNA1 and I-DNA2 offer a chance of overlap between 4 and 7 orders of magnitude lower than that obtained by Identifiler ® and Minifiler ® combination, and 4 to 5 orders of magnitude lower than that obtained by I-DNA1.
  • Identifier ® offers the worst results among the systems compared, allowing only the complete analysis of an average of 2.9 STR loci plus amelogenin.
  • Minifiler ® whereby an average of 8.4 loci (7.4 STR loci plus amelogenin) is obtained, as well as I-DNA2, whereby an average of 8.9 loci is obtained, (8 STR loci plus amelogenin , which could be completely genotyped in 6 and partially in 3 of the 10 samples analyzed) offer similar results in terms of the number of loci analyzed.
  • REPLACEMENT SHEET (RULE 26) An average of 11 complete loci (10 STR loci plus amelogenin) is obtained by means of I-DNA1, which constitutes a superior performance to the rest of the systems compared, similar to that obtained by combining Identifiler ® and Min ⁇ ler ® on the same samples. Finally, the combination I-DNAl and I-DNA2 offers the most complete genetic profiles, since it manages to genotypt an average of 14 loci (13 STR loci plus amelogenin).
  • the Identifiler ® and Minifiler ® combination allows genotyping in duplicate only the amelogenin sex locus, through the combination I-DNAl and I-DNA2 the genotyping is obtained in duplicate of 5.8 full loci (5.4 STR loci more amelogenin in 6 cases of the 10 cases analyzed).
  • Table 13 Summary of results obtained after the analysis of 10 paraffin samples from the year 80, using I-DNAl, I-DNA2, I-DNAl + I-DNA2, Min ⁇ ler ® , Identifiler ® and Minifiler ® + Identifiler ® .
  • the figures under each identification system correspond to the number of loci (between STRs and amelogenin) C: completely analyzed, P: partially, N: no result, DC (double check, genotyped by both systems).
  • the PHR values define the balance in the heterozygous amplification.
  • I-DNA1 and DNA2 I-similar to that reported for Minifiler TM and Identifiler ® (Applied Biosystems, Foster City, CA) (85.86%, 87%, 87.87% and 86.87% average observed PHR , respectively).
  • I-DNA1 and I-DNA2 show similar values and a lower standard mean deviation than that reported for Minifiler TM Kit PCR (Applied Biosystems, Foster
  • the detection threshold depends on the number of contributors, their genetic profile and the amount of total DNA [Schlenk, J., et al, 2004. Int J Legal Med, 118 (1): 55-61].
  • I-DNA2 presents in the FGA loci, D13S317 and D7S820, a greater capacity for analysis of mixtures than I-DNAl, while this is lower in the vWA, D21S11 and D5S818 loci.
  • both I-DNAl and I-DNA2 have adequate characteristics both for the determination of the genotypes that make up a mixture, and to estimate the proportion in which they are found.
  • I-DNal and I-DNA2 Compared the sensitivity of I-DNal and I-DNA2 with other multiplex systems including at least 13 loci STRs CODIS such as PowerPlexl6 system (Promega® Corporation, USA) and Identifiler ® (Applied Biosystems, Foster City ,
  • REPLACEMENT SHEET (RULE 26) AC). Both systems require larger amounts of template DNA than I-DNAl (250 pg) [Collins, PJ, et al, 2004. J Forensic Sci, 49 (6): 1265-77; Krenke, BE, et al, 2002. J Forensic Sci, 47 (4): 773-85].
  • PowerPlex ® 16 HS system (Promega® Corporation, USA), has a sensitivity superior to I-DNAl and I-DNA2 by offering complete profiles from amounts of DNA greater than 62.5 pg, although on the contrary it requires amplification of larger to obtain a complete profile, which reduces their performance in the analysis of highly degraded samples, as detailed in the comparative study of the design strategies (PowerPlex ® 16 HS system and PowerPlex ® 16 contain identical sets of primers ).
  • DNA extracts analyzed in forensic laboratories are often characterized by containing very small amounts of DNA, which makes it difficult to obtain genetic profiles with a high probability of coincidence after analysis using a multiplex STR system.
  • the combination of I-DNAl and I-DNA2 has been shown to be more effective in the analysis of scarce amounts of DNA, than the use of a single STR multiplex.
  • I-DNAl and I-DNA2 from 50 pg of DNA distributed in two 25 pg reactions, allows obtaining genetic profiles of 13 STRs loci and amelogenin, of which D13S317, vWA and amelogenin They are genotyped in duplicate. While the use of a single reaction, either I-DNAl or I-DNA2, from amounts of 50 pg of DNA, allows the amplification of 11 or 8 STRs loci plus amelogenin, respectively.
  • Minifiler TM combined with NGM TM allows duplicate amplification of 3 loci in midiSTR format, while combined with Identifiler ® it extends to 6 the number of loci analyzed in duplicate in midiSTR format. Both combinations allow only genotyping in duplicate of amelogenin in fragments that do not exceed 200 bp.
  • the combination of PowerPlex ® ESX and ESY allows duplicate analysis of 10 loci, 7 included in the CODIS and in the ECL, in midiSTR format, and 3 loci, all included in the CODIS and in the ECL, in format miniSTR [Hill, CR, et a / .2010. April 22, Forensic Sci Int Genet].
  • I-DNA1 allows 10 STRs plus amelogenin loci to be analyzed in duplicate, all of them included in the CODIS, thus confirming the genetic profile obtained from DNA fragments that do not exceed 300 bp.
  • This quality is of special interest in the analysis of highly degraded DNA samples and in the LCN genotyping, where the profiles may have reduced reliability due to the low height of the peaks obtained.
  • both I-DNA1 and I-DNA2, as well as the combination of both reactions have a reduced size of amplicons, in such a way that they have been specifically designed so that combined they allow the amplification in duplicate of 5 STR loci, all included in CODIS, from DNA fragments no larger than 200 bp.
  • the combination of I-DNA1 and I-DNA2 constitutes a highly effective tool for the confirmation of genetic profiles obtained by LCN genotyping, and especially from highly degraded samples whose DNA fragments do not exceed
  • REPLACEMENT SHEET (RULE 26) the 300 bp and even the 200 bp, which suggests in this section a greater overall yield of the method of the invention than that of the other combinations of reactions of the state of the art.
  • the size of the amplicons of a STR multiplex system is critical for obtaining genetic profiles from highly degraded biological samples [Budowle, B., A.J. Eisenberg, and A. van Daal, 2009. Croat Med J, 50 (3): 207-17].
  • I-DNA1, 1-DNA2 and the combination of both have been specifically designed to obtain genomic profiles from small DNA fragments.
  • the STR multiplexes of the state of the art are characterized by their inability to analyze the set of loci that constitute the CODIS, from DNA fragments that do not exceed 300 bp.
  • I-DNA1 stands out for being the only STR multiplex that allows analyzing all the loci included in the CODIS by means of amplicons that do not exceed 300 bp and 10 of them by means of amplicons that do not exceed 200 bp.
  • Bioplex-11 analyzes 8 CODIS loci by means of amplifications below 200 bp, although for this purpose it marks part of its primers with biotin which makes it possible to separate the amplified into two portions that are analyzed in independent electrophoresis and therefore allows to include a higher number of loci per PCR reaction. Therefore, it can be affirmed that, I-DNA1 increases the number of total loci and those included in the CODIS analyzed from DNA extracts that do not exceed 300 bp and even 200 bp, by means of a single reaction of PCR and a single capillary electrophoresis.
  • Minifiler TM (Applied Biosystems, Foster City, CA) is the highest performing system in the analysis of CODIS STRs from highly degraded DNA samples. In total, it amplifies 8 STRs plus amelogenin, 7 of them included in the CODIS, from DNA fragments that do not exceed 283 bp and amounts of DNA of 125 pg, while below 100 pg it usually offers partial results [Mulero, JJ, et al, 2008. J Forensic Sci, 53 (4): 838-52]. In comparison, I-DNA1 amplifies 15 loci including the entire CODIS and I-DNA2 12 loci including 10 STRs of the CODIS, both reactions
  • REPLACEMENT SHEET (RULE 26) with a 25 pg template DNA requirement lower than Minifiler. Even from fragments that do not exceed 229 bp, I-DNA2 is able to analyze as many STRs as all of those included in Minifiler TM and I-DNA1 analyzes 5 STRs more than these two reactions.
  • the small size of the I-DNA1 and I-DNA2 amplicons added to their high sensitivity suggest that the usefulness of these systems in analyzing STR loci included in the CODIS, from samples of highly degraded DNA samples and / or scarce, it is superior to the prior art methods.
  • the combinations of STRs multiplexes of the prior art do not allow the analysis of all the loci included in the CODIS by means of amplicons that do not exceed 300 bp, for what the profiles of STRs that provide from highly degraded DNA extracts do not include the 13 STRs of the CODIS and therefore do not allow their comparison with that of all the genotyped STR loci in the millions of genetic profiles stored in said database.
  • Minifiler TM and Identifiler ® constitute the most widely used combination of reactions currently used in the analysis of degraded samples and the one that exhibits the highest performance among the combinations of the state of the art in terms of loci analysis capability included in the CODIS from this type of samples.
  • the combination of I-DNA1 and I-DNA2 has a small size of amplicons, so that it has been specifically designed to analyze the totality of loci included in the CODIS in fragments that do not exceed 229 bp, and even 13 STRs loci between those that include 12 of the 13 of the CODIS (5 of them in duplicate) in DNA fragments that do not exceed 200 bp. In total, this combination analyzes 15 STR loci plus amelogenin, 10 of them plus amelogenin in duplicate, from fragments that do not exceed 300 bp. Therefore, the design strategy of the present invention, in the absence of being able to be compared with the design of the combination Minifiler TM and Identifiler ® , is a
  • REPLACEMENT SHEET (RULE 26) improvement compared to other combinations of reactions developed to date, in performance and reliability, in the analysis of loci included in the CODIS from small DNA fragments.
  • the comparative analysis of the ability to analyze highly degraded DNA samples consisted of the analysis of paraffin samples characterized by the high fragmentation of their DNA, using: I-DNA1, I-DNA2, the combination of both, Identifiler ® and Minifiler TM, as well as the combination of the latter two.
  • Identifiler ® due to the large size of its amplified ones, presents the worst results among all the systems compared, when analyzing 2.9 STR loci, with a probability of coincidence of approximately 10 "2 , which results in an insufficient reaction for its use as an identifying tool from highly degraded DNA.I-DNA2 and Minifiler ® , have a similar performance, both in number of loci analyzed (8 STRs and 7.4 STRs, respectively), and in terms of probability of coincidence, in both cases of approximately 10 "9 .
  • I-DNA1 allows the analysis of 10 STR loci plus amelogenin with a probability of coincidence of 10 "10 and therefore, through the use of I-DNA1 and from identical samples, the genetic profiles with the lowest probability of coincidence are obtained between the systems compared.
  • I-DNA1 even provides genetic profiles of a lower probability of coincidence (10 "I0 -10 " n ) than those provided by the combination of Identifiler ® and Minifiler ® (10 "8 -10 " u ) in 3 of the 4 population groups, so it can be said that I-DNA1 achieves a higher yield than the rest of the methods compared, in terms of ability to analyze loci included in the CODIS from highly degraded DNA samples.
  • the combination I-DNA1 and I-DNA2 offers more complete genetic profiles than the combination of Identifiler ® and Minifiler ® , both in number of loci, when analyzing 13 STR loci plus amelogenin (12 included in the CODIS), regarding the 10 STRs plus amelogenin (8 included in the CODIS), as in the probability of coincidence that reaches values of 10 "14 -10 " 15 , with respect to the 10 "8 -10 " n of the combination of Identifiler ® and Minifiler ® .
  • REPLACEMENT SHEET (RULE 26)
  • Genotyping duplicate of a series of loci STRs to the combination I-DNA1 + I-DNA2 offers higher performance than the combination Minifiler TM + Identifiler ®, for while the latter allows genotyped in duplicate only the amelogenin sex locus
  • the combination I-DNA1 and I-DNA2 allows genotyping in duplicate of 5.4 STR loci that provide in themselves a probability of coincidence of 10 "3 , lower than that obtained in the analysis of the samples of paraffin using Identifiler ® .

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Abstract

MÉTODO PARA LA OBTENCIÓN DEL PERFIL GENETICODE UN INDIVIDUO. La presente invención se relaciona con un método para obtener el perfil genético de un individuo, para determinar relaciones de parentesco entre individuos o para identificar restos humanos,que comprende la identificación de loci STRs en un extracto de ADN procedente de dicho individuo mediante, al menos, una reacción de amplificación multiplex que comprende el uso de un conjunto de parejas de cebadores diseñado específicamente para esa finalidad.

Description

MÉTODO PARA LA OBTENCIÓN DEL PERFIL
GENÉTICO DE UN INDIVIDUO
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se relaciona con un método para obtener el perfil genético de un individuo, para determinar relaciones de parentesco entre individuos o para identificar restos humanos que comprende el análisis de loci STRs en un extracto de ADN de dicho individuo mediante, al menos, una reacción de amplificación multiplex mediante el uso de un conjunto de parejas de cebadores diseñado específicamente para esa finalidad. Dicho método es de aplicación en la identificación de individuos en el área de la genética forense, así como en genética de poblaciones, antropología y biomedicina.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Salvo los gemelos monocigóticos, no existen dos personas cuyo material genético (ADN) nuclear sea idéntico. Determinadas regiones del ADN conocidas como STRs {Short Tándem Repeats) se caracterizan por su alta variabilidad entre individuos y a lo largo de las dos últimas décadas, han constituido el material de elección para la obtención de perfiles genéticos, los cuales pueden emplearse tanto en la identificación de personas como en la determinación de relaciones de parentesco entre individuos. De la misma manera, los STRs se utilizan en la elaboración de bases de datos de perfiles genéticos en países de todo el mundo, como por ejemplo, la base de datos CODIS (Combined DNA Index System), que incluye los loci STRs CSF1PO, FGA, TH01 , TPOX, VWA, D3S 1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51 y D21S11, también incluidos en la base de datos nacional de los Estados Unidos para la búsqueda de perfiles de ADN durante la investigación de delitos criminales. Por otro lado, la base de datos Europea y la base del datos del Reino Unido incluyen algunos de los loci STRs del CODIS, como son FGA, TH01, VWA, D3S1358, D8S1179, D16S539, D18S51, D21S11 y el locus de sexo amelogenina (AMEL), además del locus STRs D2S1338. En la actualidad existen numerosas empresas que comercializan kits para la elaboración de perfiles genéticos. Applied Biosystems® comercializa AmpFISTR® Identifiler® PCR amplification kit (2004, Applied Biosystems®, Foster City, CA) y Promega fabrica PowerPlex™ 16 (2004, Promega® Corporation, USA). Mediante estos kits puede alcanzarse una probabilidad de coincidencia entre los perfiles genéticos de dos individuos de alrededor de uno entre un trillón, tras el análisis de 15 regiones STRs. Ambos kits incluyen los 13 loci del CODIS; en el caso de Identifiler® incluye además los loci autosómicos D2S1338 y D19433, y Powerplex™ 16 incluye los loci autosomicos Penta E y Penta D.
Recientemente se han desarrollado los kits comerciales AmpFISTR® NGM ™ Amplification Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA), PowerPlex® E S X y PowerPlex® ES Y (Promega® Corporation, USA) que permiten analizar algunos de los loci recomendados para ser incluidos en las bases de datos nacionales.
Uno de los principales inconvenientes de estos y otros kits de análisis actuales es su falta de capacidad para proporcionar perfiles genéticos que incluyan la totalidad de los loci recogidos actualmente en el CODIS a partir de de extractos de ADN altamente degradados, lo que disminuye su rendimiento en cuanto a comparación de los resultados obtenidos con los millones de perfiles genéticos disponibles en esta base de datos. La degradación del ADN se caracteriza por una fragmentación general del material genético, donde los fragmentos de ADN pueden rondar las 240 pb mientras que estos kits necesitan al menos de fragmentos de unas 450 pb para el análisis de todos los loci STRs que incluyen. El ADN altamente degradado es una característica de la mayoría de las muestras que se analizan en los laboratorios de genética criminalística. En estos casos se produce la ausencia de resultados o incluso la obtención de resultados erróneos, con las graves repercusiones judiciales y/o personales que ello puede conllevar.
Con la finalidad de conseguir perfiles genéticos de muestras cuyo ADN está muy degradado, se han realizado numerosos esfuerzos para desarrollar reacciones que posibiliten la obtención de perfiles genéticos suficientemente discriminativos en extractos de ADN altamente degradados, (Lygo et al, 1994 Int. J. Legal Med. 107:77-89; Whitaker et al, 1995, BioTechniques 18(4):670-677).
Schilz, F. et al. 2004 (Anthrop. Anz., 4: 369-378) describieron una reacción PCR multiplex capaz de amplificar simultáneamente fragmentos de corta longitud de 16 loci STRs y el locus amelogenina (de 84pb a 275pb). Sin embargo en esta reacción multiplex solo se consideraron alelos presentes al menos en el 1% de los caucasoides, por lo que su utilización puede derivar en un perfil genético erróneo en el 16 % de los casos en que la muestra biológica analizada provenga de un individuo de origen caucasoide, error que puede incluso incrementarse en el análisis de individuos de otros orígenes étnicos.
Okamoto, O. et al. 2003 (Acta Medica Okayama, 57(2): 59-71) describe el empleo del kit comercial PowerPlex™ 16 System para estimar las frecuencias genotípicas y fenotípicas de 15 STRs loci en la población japonesa.
En 2003, John Butler et al., publicaron el desarrollo de reacciones multiplex que analizan entre 3 y 6 loci STRs mediante la amplificación de fragmentos de pequeño tamaño, para su aplicación en extractos de ADN degradado (Butler et al., J. Forensic Sci 48(5): 1054-1064). En 2006 Applied Biosystems comenzó a comercializar AmpFISTR® MiniFiler™ (Mulero et al, J Forensic Sci. 2008 Jul;53(4):838-52, Luce et al, 2009. J Forensic Sci.Sep;54(5): 1046-54), mediante el cual pueden obtenerse resultados con fragmentos de ADN de tamaño reducido. Por contra, el perfil genético proporcionado por AmpFlSTR®MiniFiler™ se compone de solamente 8 loci STRs más amelogenina, por lo que aunque tiene la ventaja de posibilitar la obtención de resultados en muestras de ADN degradadas que otros kits no permiten, sus resultados resultan insuficientes para la determinación de la mayoría de relaciones de parentesco que son habituales en la identificación de restos de personas desaparecidas o en casos de graves accidentes o catástrofes.
En este contexto han surgido numerosas solicitudes de patentes, relacionadas con la obtención de perfiles genéticos mediante el análisis simultáneo de varios loci STRs, que describen nuevos métodos de obtención de perfiles genéticos cada vez más discriminativos basados en el análisis de nuevos STRs además de incluir algunos de los loci STRs analizados hoy día, o bien metodologías capaces de reportar resultados en el análisis de extractos de ADN altamente degradados.
La solicitud de patente US6090558 describe el uso de la espectrometría de masas para detectar la variación de longitud en repeticiones de secuencias de nucleótidos, tales como microsatélites y repeticiones cortas en tándem, y cebadores de ADN para el análisis de polimorfismos en repeticiones de nucleótidos en tándem en loci específicos.
Tanto la solicitud de patente US6479235 como la patente ES2273367 describen la detección de loci genéticos, más específicamente, la amplificación simultánea de múltiples loci genéticos polimórficos diferentes utilizando la reacción en cadena de la polimerasa u otros sistemas de amplificación para determinar en una reacción los alelos de cada locus contenido dentro del sistema multiplex. Los loci genéticos amplificados comprenden HUMvWFA31 , HUMLIPOL, HUMBFXIII, HUMF13A01 , HUMFESFPS, HUMTH01 , HUMTPOX, HUMCSF 1PO, D22S683, D20S481 , D 19S253 , D 17S 1299, D 17S 1298, D16S753, D16S539, D16S490, D14S562, D14S548, D14S118, D13S317, D10S1239, D9S930, D7S820, D5S818, D4S2368 y D3S1539. Aunque analiza un alto número de loci STRs, incluye únicamente 8 de los 13 loci objeto del CODIS, y 3 de los 10 loci incluidos en la base de datos europea, lo que disminuye su rendimiento en cuanto a comparación de los resultados obtenidos con los millones de perfiles genéticos disponibles en las bases de datos existentes.
La solicitud de patente US6479235 describe métodos y materiales para la amplificación simultánea de, al menos, 13 STRs del CODIS en una reacción multiplex sencilla cuyos tamaños de amplificado exceden las 360pb.
La solicitud de patente US2003/0186272 describe un método rápido para determinar la longitud de los fragmentos de los alelos presentes en una pluralidad de loci en una muestra que contiene ADN que comprende (a) obtener una muestra que contiene ADN, b) amplificar mediante PCR multiplex una pluralidad de loci que comprenden FGA, vWA, TH01, TPOX, CSF1PO, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51 y D21S11, donde dicha reacción PCR multiplex se lleva a cabo empleando una pluralidad de parejas de cebadores, donde al menos, un cebador de cada pareja de cebadores está marcado con una etiqueta detectable, y la amplificación produce una mezcla de amplicones marcados, y (c) analizar por electroforesis dicha mezcla de amplicones loci, donde dicha etapa de análisis permite la determinación de la longitud de los fragmentos de los alelos en dicha pluralidad de loci de la muestra que contiene ADN.
Actualmente la obtención de perfiles genéticos mediante el análisis de loci STRs plantea el problema técnico del escaso éxito que presentan la mayoría de las reacciones en el análisis del ADN degradado y el limitado poder de discriminación de las reacciones expresamente diseñadas para este tipo de muestras, en especial en la consecución de perfiles genéticos que incluyan la totalidad de los loci recogidos en el CODIS. Asimismo, la limitada cantidad de ADN presente en las muestras altamente degradadas, dificulta la realización de diferentes reacciones multiplex sobre la misma muestra o la realización de réplicas que ofrezcan una mayor fiabilidad de los resultados obtenidos, por lo cual es de vital importancia utilizar reacciones o combinaciones de reacciones que permitan la obtención de perfiles genéticos compuestos por un gran número de loci STRs, como los contenidos en las principales bases de datos y mediante métodos que garanticen una elevada fiabilidad de los perfiles genéticos obtenidos a partir de extractos de ADN altamente degradados.
Por lo tanto, existe en el estado de la técnica la necesidad de desarrollar métodos para obtener perfiles genéticos, alternativos a los ya existentes, que superen los inconvenientes antes citados y que permitan obtener perfiles genéticos fiables incluso a partir de extractos de ADN altamente degradados.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención han diseñado dos conjuntos de parejas de cebadores que empleados en una reacción de amplificación multiplex sobre un extracto de ADN procedente de un individuo, permiten obtener perfiles genéticos con un alto poder de discriminación a partir de extractos de ADN altamente degradados, superando así los inconvenientes que presentan el resto de métodos del estado de la técnica a la hora de obtener dichos perfiles genéticos. Tal como se muestra en el Ejemplo 1 de la presente solicitud de patente, el diseño del conjunto de parejas de cebadores de la invención se realizó mediante una búsqueda de las secuencias flanqueantes a cada locus STR y posteriormente empleando el programa Perlprimer (http://perlprimer.sourceforge.net/). Una vez obtenidas las parejas de cebadores, se procedió a realizar una reacción de amplificación sobre un extracto de ADN empleando dichas parejas de cebadores tras lo cual, se obtuvo el perfil genético del individuo al que pertenecía el extracto de ADN con una fiabilidad, precisión y capacidad de discriminación superior a los perfiles genéticos obtenidos por otros métodos.
Así, en un primer aspecto, la invención se relaciona con un método para obtener el perfil genético de un individuo, para determinar relaciones de parentesco entre individuos o para identificar restos humanos que comprende el análisis de loci STRs en un extracto de ADN procedente de dicho individuo o dichos restos humanos mediante, al menos, una reacción de amplificación multiplex, en donde las parejas de cebadores de dicha reacción de amplificación multiplex comprenden
- las parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 (CSF1PO), SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 (FGA), SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 (D18S51), SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 (VWA), SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 (TH01), SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 (D21S11), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 (D7S820), SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 (D2S1338), SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 (D13S317), SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 (Amelo genina), y SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 (D5S818), o alternativamente
- las parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 (CSF1PO), SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO : 28 (D5S818), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO : 29 (D7S820), SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 31 (D21 S11), SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33 (VWA), SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 35 (D8S1179), SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37 (D19S433), SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 (TH01), SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39 (D16S539), SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 41 (D3S1358), SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43 (D18S51), SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 (D13S317), SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina), y SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 47 (FGA).
En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit que comprende las parejas de cebadores que comprenden
- las parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 (CSF1PO), SEQ
ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 (FGA), SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 (D18S51), SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 (VWA), SEQ ID NO: 1 1 y SEQ ID NO: 12 (TH01), SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 (D21S11), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 (D7S820), SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 (D2S1338), SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 (D13S317), SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina), y SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 (D5S818), o alternativamente,
- las parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 (CSF1PO), SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 (D5S818), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 29 (D7S820), SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 31 (D21 S1 1), SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33 (VWA), SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 35 (D8S 1 179), SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37 (D19S433), SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 (TH01), SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39 (D16S539), SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 41 (D3S1358), SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43 (D18S51), SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 (D13S317), SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina), y SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 47 (FGA), y opcionalmente, reactivos para llevar a cabo una PCR y/o reactivos para aislar ADN a partir de una muestra biológica.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un kit según la presente invención para obtener el perfil genético de un individuo, para determinar relaciones de parentesco entre individuos o para identificar restos humanos. En otro aspecto, la invención se relaciona con un conjunto de parejas de cebadores que comprende las parejas de oligonucléotidos SEQ ID NO : 1 y SEQ ID NO: 2 (CSF1PO), SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 (FGA), SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 (D18S51), SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 (VWA), SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 (TH01), SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 (D21 S1 1), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 (D7S820), SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 (D2S1338), SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 (D13S317), SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 (Amelo genina), y SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 (D5S818), o alternativamente, las parejas de oligonucléotidos SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 (CSF1PO), SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 (D5S818), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 29 (D7S820), SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 31 (D21S11), SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33 (VWA), SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 35 (D8S1179), SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37 (D19S433), SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39 (D16S539), SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 41 (D3S1358), SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43 (D18S51), SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 (D13S317), SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina), y SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 47 (FGA).
En otro aspecto, la invención se relaciona con un conjunto de parejas de cebadores que comprende las parejas de oligonucléotidos SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 (CSF1PO), SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 (FGA), SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 (D18S51), SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 (VWA), SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 (TH01), SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 (D21S11), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 (D7S820), SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 (D2S1338), SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 (D13S317), SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina), SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 (D5S818), SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 (CSF1PO), SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 (D5S818), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 29 (D7S820), SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 31 (D21S11), SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33 (VWA), SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 35 (D8S1179), SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37 (D19S433), SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39 (D16S539), SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 41 (D3S1358), SEQ ID NO : 42 y SEQ ID NO : 43 (D 1 8S5 1 ), SEQ ID NO : 44 y SEQ ID NO : 45 (D13S317), SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina), y SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 47 (FGA).
En otro aspecto, la invención se relaciona con una pareja de cebadores seleccionada de entre las parejas de oligonucleótidos que consisten en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 (CSF1PO), SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 (FGA), SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 (D18S51), SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 (VWA), SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 (TH01), SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 (D21S11), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 (D7S820), SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 (D2S1338), SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 (D13S317), SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina), SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 (D5S818), SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 (CSF1PO), SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 (D5S818), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 29 (D7S820), SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 31 (D21S11), SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33 (VWA), SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 35 (D8S1179), SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37 (D19S433), SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39 (D16S539), SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 41 (D3S1358), SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43 (D18S51), SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 (D13S317), SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina), y SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 47 (FGA).
El uso, tanto del conjunto de parejas de cebadores como de los cebadores de la invención para obtener el perfil genético de un individuo, para determinar relaciones de parentesco entre individuos o para identificar restos humanos, constituyen aspectos adicionales de la presente invención.
Finalmente, en otro aspecto, la invención se relaciona con un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 47.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 corresponde a un gráfico denominado electroferograma que muestra el perfil genético de un individuo para los STRs analizados mediante el primer conjunto de parejas de cebadores de la invención empleando un analizador automático de secuencias AB3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems®). En la Figura se pueden observar 4 paneles, cada uno correspondiente a aquellas parejas de cebadores marcadas con el mismo locus fluorescente. En cada panel se muestra la intensidad de la señal detectada en Relative Fluorescence Units (RFU, unidad relativa de fluorescencia) en el eje Y; el eje X corresponde al tamaño en pares de bases. Así, el primer panel corresponde a los resultados obtenidos para los productos de STRs amplificados con cebadores marcados con 6-FAM™ (dirigidos a los loci CSF1PO y FGA), el segundo panel a los marcados con VIC™ (loci TH01 , D21 S1 1 y D7S820), el tercero a NED™ (loci TPOX, D18S51 y VWA) y en el cuarto panel se muestran los resultados para los loci STRs marcados con el fluorocromo PET® (D2S1338, D13S317, amelogenina, y D5S818). Las barras situadas en la parte superior de cada panel corresponden al nombre de los loci. Los rectángulos situados bajos los picos del electroferograma muestran el nombre del alelo, indicado por un número, su tamaño en pares de bases y la intensidad de la señal en RFUs.
La Figura 2 corresponde a un gráfico denominado electroferograma que muestra el perfil genético de un individuo para los STRs analizados mediante el segundo conjunto de cebadores de la invención empleando un analizador automático de secuencias AB3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems®). En la Figura se pueden observar 4 paneles, cada uno correspondiente a aquellas parejas de cebadores marcadas con el mismo locus fluorescente. En cada panel se muestra la intensidad de la señal detectada en Relative Fluorescence Units (RFU, unidad relativa de fluorescencia.) en el eje Y; el eje X corresponde al tamaño en pares de bases. Así, el primer panel corresponde a los resultados obtenidos para los productos de STRs amplificados con cebadores marcados con 6-FAM™ (dirigidos a los loci CSF1PO, D5S818, D7S820 y D21S11), el segundo panel a los marcados con VIC™ (loci TH01, D16S539, D3S1358 y D18S51), el tercero a NED™ (loci TPOX, VWA, D8S1179 y D19S433) y en el cuarto panel se muestran los resultados para los loci STRs marcados con el fluorocromo PET® (D13S317, amelogenina y FGA). Las barras situadas en la parte superior de cada panel corresponden al nombre de los loci. Los rectángulos situados bajos los picos del electroferograma muestran el nombre del alelo, indicado por un número, su tamaño en pares de bases y la intensidad de la señal en RFUs.
La Figura 3 es una representación gráfica que muestra la comparación del diseño del primer conjunto de parejas de cebadores (denominado I-DNA2) [Panel A] y el diseño del segundo conjunto de parejas de cebadores (denominado I-DNA-1) [Panel B]. Las cajas representan los tamaños de amplificado para cada locus. Los loci marcados con diferente color se presentan en diferentes escalas de grises. Los respectivos mareajes se señalan en la parte derecha de la Figura.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención han diseñado dos conjuntos de parejas de cebadores que empleados individualmente en una reacción de amplificación multiplex sobre un extracto de ADN procedente de un individuo, permiten obtener perfiles genéticos con gran fiabilidad y un alto poder de discriminación a partir de extractos de ADN altamente degradados, superando así los inconvenientes que presentan el resto de métodos del estado de la técnica a la hora de obtener dichos perfiles genéticos.
Los conjuntos de parejas de cebadores de la invención han sido diseñados de tal manera que, individualmente, es posible obtener el análisis simultáneo de 11 ó 14 loci STRs (Short Tándem Repeats) más el locus amelogenina para la determinación del sexo, cuando un extracto de ADN es sometido a una reacción de amplificación multiplex empleando uno de dichos conjuntos de parejas de cebadores, e incluso a partir de extractos de ADN altamente degradados, en donde el tamaño de los fragmentos extraídos no supera las 230 pb. Adicionalmente, los inventores han observado que empleando ambos conjuntos de parejas de cebadores en diferentes reacciones de amplificación multiplex sobre el mismo extracto de ADN, proporcionan la confirmación del perfil genético obtenido con el conjunto de parejas de cebadores empleado en primer lugar, pues comprenden parejas de cebadores dirigidas a los mismos loci STRs. Adicionalmente, mediante una segunda reacción de amplificación multiplex, es posible ampliar el número de loci STRs analizados mediante la introducción de nuevas parejas de cebadores dirigidas a amplificar distintos loci de los amplificados en la primera reacción de amplificación multiplex. Estas dos características permiten mejorar poder de discriminación del perfil genético obtenido. Además, merece la pena señalar que, mediante el empleo de ambos conjuntos de parejas de cebadores en reacciones de amplificación distintas se analizan 10 loci por duplicado: (i) 8 de los cuales se genotipan con parejas de cebadores diferentes por lo que se reducen las pérdidas alélicas causadas cuando un cebador concreto no se une a la secuencia de ADN diana debido a algún polimorfismo; (ii) y los dos restantes con idénticos cebadores, lo que proporciona un control interno adicional, ya que los genotipos de ambos loci deben ser idénticos en cada una de las reacciones. Cabe mencionar que ambos conjuntos de parejas de cebadores presentan además, cebadores dirigidos a identificar el locus amelogenina para la determinación del sexo.
Tal como se muestra en el Ejemplo 1 de la presente descripción, el diseño de los conjuntos de parejas de cebadores de la invención se realizó mediante una búsqueda de las secuencias flanqueantes a cada locus STR y posteriormente empleando el programa Perlprimer (http://perlprimer.sourceforge.net/). Una vez obtenidas las parejas de cebadores, se procedió a realizar una reacción de amplificación sobre un extracto de ADN empleando dichas parejas de cebadores tras lo cual, se obtuvo el perfil genético del individuo al que pertenecía el extracto de ADN con una fiabilidad, precisión y capacidad de discriminación superior a los perfiles genéticos obtenidos por otros métodos.
Así, en base a estos conjuntos de parejas de cebadores, se han desarrollado los distintos aspectos inventivos que forman parte de la presente invención y que serán descritos en detalle a continuación. Previamente a la descripción de dichos aspectos inventivos, se incluye un listado de definiciones donde se explica el significado de los términos empleados en el contexto de la presente invención para ayudar en la comprensión de la misma. Definiciones un / una
El uso de la palabra "un" o "una" cuando se usa junto con el término "comprender" o "comprende" en las reivindicaciones y/o la descripción puede significar "uno", pero también es consistente con el significado de "uno o más", "al menos uno" y "uno o más de uno".
Perfil Genético
En el contexto de la presente invención, los términos "perfil genético" y "huella genética" tienen el mismo significado por lo que pueden emplearse indistintamente a lo largo de la descripción. El "perfil genético" es un conjunto de secuencias de bases características del material genético que permiten diferenciar a un individuo de otro.
Loci STRs
En la presente invención, el perfil genético se obtiene a partir del análisis de secuencias de bases cortas repetidas en tándem o STRs (del inglés Short Tándem Repeats) que se caracterizan por su alta variabilidad entre individuos. Así, en la presente invención se entiende por "secuencias STRs" o "loci STRs" aquellas secuencias del ADN, también llamadas microsatélites, que contienen repeticiones de 4 pb (Butler JM, Biotechniques. 2007 Oct;43(4):ii-v.).
El análisis de los loci STRs en el genoma presenta múltiples aplicaciones que incluyen, aunque no se limitan a, obtención de perfiles genéticos, diagnósticos de parentesco, determinación del origen de una muestra o tejido, identificación de cadáveres, estudios de genética de poblaciones, pruebas de zigosidad en mellizos, seguimiento de transplantes de médula ósea, evaluación de la trazabilidad de muestras biológicas de origen humano, identificación de mezclas presentes en una muestra y determinación del número de contribuyentes de origen humano a una mezcla y su aportación relativa a la mezcla. PCR
PCR corresponde a las siglas de reacción en cadena de la polimerasa mediante la cual se pueden obtener millones de copias de las regiones de ADN deseadas. Se caracteriza por el empleo de parejas de cebadores que acotan la región de la que se realizarán millones de copias, lo que también se conoce como "amplificar ADN" durante la PCR. La PCR está compuesta por un número determinado de ciclos, compuestos a su vez por tres fases en las que las hebras de ADN se separan, se unen los cebadores y se elongan las nuevas hebras de ADN. En cada ciclo, si la eficiencia de la reacción es del 100% se produce un crecimiento exponencial de los fragmentos de ADN objeto de la amplificación.
Reacción de amplificación multiplex
En la presente invención se entiende por "Reacción de amplificación multiplex" a la reacción PCR en la cual se amplifica más de una secuencia de ADN en una misma reacción, mediante el empleo de dos o más parejas de cebadores en único tubo junto con el resto de los reactivos de la reacción con el fin de amplificar simultáneamente múltiples secuencias de ADN.
Oligonucleótido
El término "oligonucleótido" hace referencia a la secuencia de bases de nucleótidos unidos por enlaces fosfo-diéster, habitualmente no mayor de 50 nucleótidos.
Cebador
En la presente invención se entiende por "cebador" o "primer" u "oligonucleótido" ("oligo") a la secuencia de nucleótidos a partir de la cual la ADN polimerasa inicia la síntesis de una molécula nueva de ADN. Los cebadores son secuencias nucleotídicas cortas, aproximadamente de 15-24 nucleótidos de longitud que se pueden alinear con una hebra de ADN diana gracias a la complementariedad de bases para formar un híbrido entre el cebador y la hebra diana de ADN. Después, el enzima ADN polimerasa puede extender el cebador a lo largo de la hebra diana de ADN. Los métodos para preparar y usar cebadores se describen, por ejemplo en Sambrook et al. (2001) y Ausubel et al. (1999). Pareja de cebadores
En el contexto de la presente invención se entiende por "pareja de cebadores" o "primer pair", al conjunto de dos cebadores que, empleados en una misma reacción de amplificación o PCR, permiten obtener múltiples copias de una secuencia diana de ADN. Cada uno de los cebadores híbrida con la secuencia diana, de manera que se amplifica la secuencia de nucleótidos acotada mediante cada pareja de cebadores. La extensión de los cebadores durante los ciclos de PCR determina la multiplicación exponencial 2N de la secuencia de nucleótidos acotada por los cebadores, siendo N el número de ciclos de la reacción PCR.
Muestra biológica
En el contexto de la presente invención, se entiende por "muestra biológica" cualquier materia que contenga ADN.
Extracto de ADN
En el contexto de la presente invención se entiende "extracto de ADN", cuando tras someter la muestra biológica a un procedimiento de extracción, separación, purificación o clonación de ADN, entre otros, se obtiene como resultado ya sea en seco, en solución, unido o no a otras moléculas, adherido o no a diversas sustancias o lechos, materia en la que el ADN se encuentra en mayor proporción relativa respecto al resto de moléculas presentes, en comparación con la muestra biológica de partida.
Así "extracto de ADN" se refiere al ADN extraído de cualquier muestra biológica que contenga ADN humano, ya sea procedente de un individuo vivo o muerto, feto, órganos, tejidos ó células.
En el contexto de la presente invención, se entiende por "ADN altamente degradado" al ADN cuyos fragmentos son de tamaño reducido, preferiblemente, tamaños menores de 300 pb, de 290 pb, de 280 pb, de 270 pb, de 260 pb, de 250 pb, de 240 pb, de 230 pb, de 220 pb, de 210 pb o de 200 pb. Individuo
El término "individuo" se refiere a un ser humano de cualquier edad o raza, que en el contexto de la presente invención puede estar vivo o muerto.
Cebadores de la invención
Los inventores han diseñado un conjunto de parejas de cebadores, de aquí en adelante, "primer conjunto de parejas de cebadores de la invención" o "I-DNA2", que permite obtener el perfil genético de un individuo a partir de extractos de ADN altamente degradados. Las parejas de cebadores han sido diseñadas de manera que empleadas conjuntamente en una reacción de amplificación multiplex es posible obtener el análisis simultáneo de 1 1 loci STRs más el locus amelogenina que determina el sexo. Los loci STRs analizados en la presente invención así como las parejas de cebadores diseñadas para su identificación se muestran en la Tabla 1 (página siguiente). En el Ejemplo 1 se detalla el procedimiento seguido en el diseño del primer conjunto de parejas de cebadores de la invención.
Tabla 1. Resumen de las secuencias de los cebadores en dirección 5 'a 3 ' diseñados para la amplificación de cada locus STR. Asimismo, se detalla del alelo menor al mayor del STR que será considerado mediante este análisis (columna: alelos) así como el tamaño máximo y mínimo de amplificado posible para cada STR.
Figure imgf000017_0001
5 19 GTTCATTTCTTTAGTGGGCA
D13S317 164-212
17 20 GTCCTTCAACTTGGGTTGAG
X 21 AAAGCTACCACCTCATCCT
Amelogenina 220-226
Y 22 GGCTTGAGGCCAACCAT
6 23 TAGCAAGTATGTGACAAGGG
D5S818 234-282
18 24 GTCAGATGCTAATAGGCTGTT
Así, en un aspecto, la invención se relaciona con un conjunto de parejas de cebadores que comprende las siguientes parejas de oligonucléotidos SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 (CSFIPO), SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 (FGA), SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 (D18S51), SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 (VWA), SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 (TH01), SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 (D21S11), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 (D7S820), SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 (D2S 1338), SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 (D13S317), SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina), y SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 (D5S818).
Por otro lado, los autores de la presente invención han diseñado un segundo conjunto de parejas de cebadores, de aquí en adelante, "segundo conjunto de parejas de cebadores de la invención" o "I-DNA1", caracterizado porque comprende, al menos, una parej a de cebadores caracterizada porque:
- amplifica uno de los locus amplificados por el primer conjunto de parejas de cebadores de la invención y
- uno de los cebadores de la pareja presenta una secuencia de nucleótidos distinta de la secuencia de nucleótidos de la pareja de cebadores que en el primer conjunto de cebadores amplifica el mismo locus.
Mediante el segundo conjunto de parejas de cebadores de la invención se logra genotipar 14 loci STRs más el locus amelogenina. El segundo conjunto de parejas de cebadores, así como los loci STRs que amplifica, se recogen en la Tabla 2 (página siguiente).
Así, en otro aspecto, la presente invención se relaciona con conjunto de parejas de cebadores que comprende las parejas de oligonucléotidos SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 (CSFIPO), SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 (D5S818), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 29 (D7S820), SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 31 (D21S11), SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33 (VWA), SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 35 (D8S1179), SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37 (D19S433), SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39 (D16S539), SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 41 (D3S 1358), SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43 (D18S51), SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 (D13S317), SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina), y SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 47 (FGA).
Tabla 2: Resumen de las secuencia de los cebadores en dirección 5 'a 3 ' diseñados para la amplificación de cada STR en la combinación denominada como I-DNA1 (columna: secuencia 5 '- 3 '). En esta misma tabla se detalla del alelo menor al mayor del STR que será considerado mediante este análisis (columna: alelos) así como el tamaño máximo y mínimo posible para cada STR.
Tamaño de los SEQ ID
LOCUS ALELOS SECUENCIA (5-3 )
amplificados (pb) NO:
6 25 ACTGCCTTCATAGATAGAAGAT
CSF1PO 71-115
15 26 GCCCTGTTCTAAGTACTTCCT
7 27 TTAATAGCAAGTATGTGACAAGG
D5S818 123-171
17 28 GACATTTGTATCTTTATCTGTATCCTT
6 15 GAATTATAACGATTCCACATTTATCC
D7S820 179-219
15 29 ATAAAGGGTATGATAGAACACTTG
24 30 CCCTGATTCTTCAGCTTGTA
D21S11 227-297
38 31 GCAGAGACAGACTAATAGGAGG
6 5 CTTAGGGAACCCTCACTG
TPOX 53-101
16 6 GCAGCGTTTATTTGCCCAA
11 32 TCAGTATGTGACTTGGATTGA
VWA 109-169
24 33 GTAGGTTAGATAGAGATAGGACAGA
8 34 TTGTATTTCATGTGTACATTCGT
D8S1179 177-229
20 35 TTGTGTTCATGAGTATAGTTTCAC
5,2 36 CATGTTGGCACATTCCTG
D19S433 237-295
18.2 37 AGTTCTTTAGCAGTGATTTCTG
5 11 AACACAGACTCCATGGTG
TH01 49-93
14 12 GTTCCTCCCTTATTTCCCT
5 38 CCTCTTCCCTAGATCAATACA
D16S539 101-149
16 39 ATCTGTAAGCATGTATCTATCATC
9 40 TGTAGTGAGCTATGATTCCC
D3S1358 157-205
20 41 GTATTCCCTGTGCCTTTG
7 42 GTCTCAGCTACTTGCAGG
D18S51 213-300
27 43 GGAGATGTCTTACAATAACAGTTG
5 44 CGCCTATCTGTATTTACAAATACAT
D13S317 72-120
17 45 GGACAGAAAGATAGATAGATGATTGAT
X 46 CCCTGGGCTCTGTAAAGA
Amelogenina 121-127
Y 22 GGGCTTGAGGCCAACCAT
16 3 CTCACAGATTAAACTGTAACCA
FGA 135-293
51.2 47 TTGTCTGTAATTGCCAGC Un valor adicional de la presente invención reside en que al realizar dos reacciones de amplificación multiplex sobre el mismo extracto de ADN, es decir, dividir un único extracto de ADN en dos alícuotas y sobre cada alícuota llevar a cabo una reacción de amplificación empleando, respectivamente, I-DNA2 e I-DNA1, o alternativamente, I- DNA1 e IDNA2, se consigue, por un lado la confirmación del perfil genético obtenido con el conjunto de parejas de cebadores empleado en primer lugar, y por otro, se amplía a 15 STRs más amelogenina el número de loci STRs que configuran el perfil genético.
Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un conjunto de parejas de cebadores que comprende las parejas de oligonucléotidos SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 (CSF1PO), SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 (FGA), SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 (D18S51), SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 (VWA), SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 (TH01), SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 (D21S11), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 (D7S820), SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 (D2S1338), SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 (D13S317), SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina), SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 (D5S818), SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 (CSF1PO), SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 (D5S818), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 29 (D7S820), SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 31 (D21S11), SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33 (VWA), SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 35 (D8S1179), SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37 (D19S433), SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39 (D16S539), SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 41 (D3S1358), SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43 (D18S51), SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 (D13S317), SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina), y SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 47 (FGA).
En otro aspecto, la invención se relaciona con una pareja de cebadores seleccionada de entre las parejas de oligonucléotidos que consisten en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 (CSF1PO), SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 (FGA), SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 (D 18S51), SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 (VWA), SEQ ID NO: 1 1 y SEQ ID NO: 12 (TH01), SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 (D21 S1 1), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 (D7S820), SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 (D2S 1338), SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 (D13S317), SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina), SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 (D5S818), SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 (CSF1PO), SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 (D5S818), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 29 (D7S820), SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 31 (D21S11), SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33 (VWA), SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 35 (D8S1179), SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37 (D19S433), SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39 (D16S539), SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 41 (D3S1358), SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43 (D18S51), SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 (D13S317), SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina), y SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 47 (FGA).
En otro aspecto, la invención se relaciona con un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 47.
Uso de los cebadores de la invención
Los diferentes usos que tienen los cebadores de la invención, constituyen aspectos inventivos adicionales de la presente invención.
Así, los usos del primer o del segundo conjunto de parejas de cebadores de la invención incluyen, sin limitarse a, la obtención de perfiles genéticos, diagnósticos de parentesco, determinación del origen de una muestra o tejido, identificación de cadáveres, estudios de genética de poblaciones, pruebas de zigosidad en mellizos, seguimiento de transplantes de médula ósea, evaluación de la trazabilidad de muestras biológicas de origen humano, identificación de mezclas presentes en una muestra y determinación del número de contribuyentes de origen humano a una mezcla y su aportación relativa a la mezcla. Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso del primer conjunto de parejas de cebadores de la invención (Tabla 1) o del segundo conjunto de parejas de cebadores de la invención (Tabla 2) para obtener el perfil genético de un individuo, para determinar relaciones de parentesco entre individuos o para identificar restos humanos. La forma en que el primer y el segundo conjunto de parejas de cebadores de la invención pueden emplearse para los usos arriba indicados, se explica en detalle en el siguiente aspecto inventivo.
Método de la invención
Tal como se ha explicado anteriormente, mediante una reacción de amplificación empleando el primer conjunto de parejas de cebadores de la invención (Tabla 1) es posible llevar a cabo el análisis simultáneo de 1 1 loci STRs más el locus amelogenina en un extracto de ADN altamente degradado para obtener un perfil genético de un individuo. Igualmente, mediante el segundo conjunto de parejas de cebadores de la invención (Tabla 2), es posible llevar a cabo el análisis simultáneo de 14 loci STRs más el locus amelogenina en un extracto de ADN altamente degradado para obtener un perfil genético de un individuo.
Así, en un primer aspecto, la invención se relaciona con un método, de aquí en adelante "método de la invención", para obtener el perfil genético de un individuo, para determinar relaciones de parentesco entre individuos o para identificar restos humanos que comprende el análisis de loci STRs en un extracto de ADN procedente de dicho individuo o dichos restos humanos mediante, al menos, una reacción de amplificación multiplex, en donde las parejas de cebadores de dicha reacción de amplificación multiplex comprenden
- las parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 (CSF1PO), SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 (FGA), SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 (D18S51), SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 (VWA), SEQ ID NO : 1 1 y SEQ ID NO : 12 (TH01 ), SEQ ID NO : 13 y SEQ ID NO : 14 (D21S11), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 (D7S820), SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 (D2S1338), SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 (D13S317), SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina), y SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 (D5S818), o alternativamente
- las parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 (CSF1PO), SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 (D5S818), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 29 (D7S820), SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 31 (D21S11), SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33 (VWA), SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 35 (D8S1179), SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37 (D19S433), SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 (TH01), SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39 (D16S539), SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 41 (D3S1358), SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43 (D18S51), SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 (D13S317), SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina), y SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 47 (FGA).
La puesta en práctica del método de la invención requiere la obtención de un extracto de ADN que procederá, en última instancia, de una muestra biológica que será tratada de forma adecuada para obtener dicho extracto de ADN.
Como entiende el experto en la materia, si el método de la invención está dirigido a obtener el perfil genético de un individuo o la relación de parentesco entre individuos, el extracto de ADN procederá del individuo cuyo perfil genético quiere obtenerse, o de los individuos cuya relación de parentesco quiere determinarse. Sin embargo, si el método de la invención está dirigido a la identificación de restos humanos, el extracto de ADN procederá de los restos humanos que se quieren identificar. En la presente invención, el término "restos humanos" incluye cualquier muestra biológica procedente de un ser humano muerto o vivo, pudiendo estar dicho resto humano conservado en formol, congelado, desecado, fijado en parafina, en estado de descomposición, degradación y/o putrefacción, entre otros.
Ejemplos de muestras biológicas de las que se puede obtener ADN incluyen, sin limitarse a, fluidos biológicos (sangre, saliva, orina, esperma, etc); epidermis, caspa, pelo, heces, una muestra vaginal, una muestra de tejido, tejidos quemados, etc. Las muestras biológicas más adecuadas para la obtención de extractos de ADN útiles en la identificación de restos humanos incluyen, entre otros, pelos con raíz, hueso compacto, diente, tejidos blandos y sangre.
En una realización particular, el extracto de ADN procede de una muestra de sangre, pelo, saliva, epidermis, esperma, caspa, una muestra vaginal y una muestra de tejido,
La obtención de la muestra biológica debe realizarse en las condiciones y con el material adecuado, tales como torundas, pinzas, etc. y cada muestra debe almacenarse independientemente en frascos o bolsas plásticas separadas y estériles, sin ningún tipo de conservante, en congelación y debidamente rotulados, evitando la contaminación por material biológico foráneo.
Una vez que se ha obtenido la muestra del individuo/s o del resto humano, ésta debe ser procesada para obtener el extracto de ADN. La fracción de ADN adecuada para la puesta en práctica del método de la invención es el ADN nuclear. La extracción del ADN puede ser llevado a cabo usando cualquier método conocido por los expertos en la materia (Sambrock et al., 2001. "Molecular cloning: a Laboratory Manual", 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol. 1-3) que incluyen, sin limitarse a, centrifugaciones en gradientes de densidad, extracción en dos fases usando fenol acuoso o cloroformo con etanol, cromatografía en columna, métodos basados en la capacidad del ADN para unirse en superficies de cristal y/o silicatos, como preparaciones de tierra diatomeas o lechos de cristal, empleando kits comerciales, por ejemplo, los kits "Q-Biogene fast DNA kit" o el "QIAamp(R) DNA Blood Mini Kit" (Qiagen, Hilden, Alemania), el "G-Spin IIp" (Intron Biotechnology, Corea), el "Fast Prep System Bio 101" (Qbiogene, Madrid, España), o los métodos descritos en las solicitudes de patente US5.057.426, US4.923.978 y la solicitud de patente europea EP0512767A1.
El extracto de ADN es cuantificado y normalizado para obtener cantidades iguales de ADN en cada muestra en el caso de que la cantidad de ADN sea suficiente para ello. En el caso de muestras altamente degradadas con ADN escaso y/o degradado es habitual añadir la mayor cantidad de ADN posible en la subsiguiente reacción de PCR multiplex. Tras obtener el extracto de ADN de la muestra biológica, éste es sometido, al menos, a una reacción de amplificación multiplex empleando el primer conjunto de parejas de cebadores de la invención o, alternativamente, el segundo conjunto de parejas de cebadores de la invención. La amplificación de los diferentes loci STRs requiere condiciones y procedimientos de reacción específicos para cada una de las parejas de cebadores empleadas, las cuales pueden conseguirse mediante variación sistemática de cada parámetro. El número de ciclos y la temperatura de alineamiento empleada en la reacción de PCR deben de ser adecuados para la obtención de resultados fiables mediante el empleo de cada una de las parejas de cebadores del primer o del segundo conjunto de parejas de cebadores de la invención. Parámetros como la concentración de cebadores son específicos para cada cebador y se han ajustado en la validación del conjunto de parejas cebadores. Los cebadores ofrecen resultados en un amplio rango de concentraciones, aunque las concentraciones óptimas para cada pareja de cebadores se recogen en las Tablas 3 y 4.
Tabla 3. Resumen de las concentraciones a las que se emplea cada uno de los cebadores y el fluorocromo con el que se ha marcado el extremo 5 'del cebador directo o forward (números en negrita) de cada pareja de cebadores en el conjunto denominado I-DNA2, o primer conjunto de parejas de cebadores de la invención.
Figure imgf000025_0001
Tabla 3 (continuación)
Figure imgf000026_0001
Tabla 4. Resumen de las concentraciones a las que se emplea cada uno de los cebadores y el fluorocromo con el que se ha marcado el extremo 5 'del cebador directo ó forward (números en negrita) de cada pareja de cebadores en el conjunto denominado I-DNA1, o segundo conjunto de parejas de cebadores de la invención.
Intervalo Concentración
Concentración óptima de Mareaje
LOCUS SEQ ID NO
de cebadores cebadores fluorescente
(μΜ) (μΜ)
25
CSF1PO 0,14-0,03 0,08
26
27
D5S818 0,25-0,13 0,19
28
6-FAM
15
D7S820 0,19-0,07 0,13
29
30
D21S11 0,16-0,04 0,1
31
5
TPOX 0,14-0,03 0,08
6
32
VWA 0,15-0,03 0,07
33
NED
34
D8S1179 0,15-0,03 0,09
35
36
D19S433 0,25-0,13 0,19
37
11
TH01 0,1-0,03 0,04
12
38
D16S539 0,17-0,05 0,11
39
VIC
40
D3S1358 0,15-0,03 0,09
41
42
D18S51 0,44-0,32 0,38
43
44
D13S317 0,12-0,03 0,06
45
46
Amelogenina 0,17-0,05 0,11 PET
22
3
FGA 0,37-0,25 0,31
47 Tal como se ha indicado al inicio de la presente descripción, el método de la invención comprende el análisis de loci STRs en un extracto de ADN mediante una reacción de amplificación multiplex que, adicionalmente, puede comprender una segunda reacción de amplificación de dicho extracto de ADN.
Así, en una realización particular del método de la invención, el análisis de loci STRs comprende, además, una segunda reacción de amplificación multiplex del extracto de ADN procedente de dicho individuo o dichos restos humanos, en donde las parejas de cebadores de dicha segunda reacción de amplificación multiplex comprenden, al menos, una pareja de cebadores caracterizada porque:
- amplifica uno de los locus amplificados en la primera reacción de amplificación multiplex y
- uno de los cebadores de la pareja presenta una secuencia de nucleótidos distinta de la secuencia de nucleótidos de la pareja de cebadores que en la primera reacción de amplificación multiplex amplifica el mismo locus.
Mediante esta segunda reacción de amplificación sobre el mismo extracto de ADN, es decir, sobre un extracto de ADN procedente de la misma muestra de la que procede el extracto de ADN sobre el que se ha realizado la primera reacción de amplificación multiplex, se consigue la confirmación del perfil genético obtenido con la primera reacción de ampificación mutiplex (llevada a cabo mediante el empleo del primer o el segundo conjunto de parejas de cebadores de la invención). Adicionalmente, si se desea, también es posible ampliar el número de loci STRs que constituyen el perfil genético mediante la adición a la segunda reacción de amplificación de nuevas parejas de cebadores dirigidas a loci distintos de los amplificados en la primera reacción de amplificación.
En otra realización particular de la invención, las parejas de cebadores de la segunda reacción de amplificación multiplex comprenden 2, 3 , 4, 5 , 6 , 7, 8 o 9 parej as de cebadores, cada pareja de cebadores caracterizada porque:
- amplifica uno de los locus amplificados en la primera reacción de amplificación multiplex y - uno de los cebadores de la pareja presenta una secuencia de nucleótidos distinta de la secuencia de nucleótidos de la pareja de cebadores que en la primera reacción de amplificación amplifica el mismo locus.
En otra realización todavía más particular, las parejas de cebadores de la segunda reacción de amplificación multiplex se seleccionan de entre las parejas de oligonucleótidos
- SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 (CSF1PO), SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 47
(FGA), SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43 (D18S51), SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33 (VWA), SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 31 (D21S11), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 29 (D7S820), SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 (D13S317), SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina) y SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 (D5S818), o alternativamente,
- SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 (CSF1PO), SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 (FGA), SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 (D18S51), SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 (VWA), SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 (D21S11), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 (D7S820), SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 (D13S317), SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina) y SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 (D5S818).
En otra realización aún más particular, la segunda reacción de amplificación multiplex adicionalmente comprende
- al menos 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 de las parejas de cebadores seleccionadas de las parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 (TH01), SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 35 (D8S1179), SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37 (D19S433), SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39 (D16S539), y SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 41 (D3S1358), o alternativamente
- al menos 1 , 2 ó 3 de las parejas de cebadores seleccionadas de las parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 1 1 y SEQ ID NO: 12 (TH01), y SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 (D2S1338). Las parejas de cebadores empleadas en la segunda reacción de amplificación multiplex de la realización particular del método de la invención, así como los loci que amplifican, se recogen en las Tablas 1 y 2, y la concentración óptima para cada cebador (ajustada en la validación del conjunto de parejas de cebadores empleados en la segunda reacción de amplificación multiplex) se muestran en las Tablas 3 y 4 (ver páginas anteriores).
Como entiende el experto en la materia, una reacción de amplificación multiplex requiere una serie de reactivos, entre los que se incluyen, sin limitar a, el ADN molde, la enzima ADN polimerasa, al menos, dos parejas de cebadores (siendo cada cebador de cada pareja complementario a una de las dos hebras del ADN), desoxinucleótidos trifosfatos (dNTPs), cloruro de magnesio (MgCl2), buffer de reacción y aditivos opcionales, que pueden añadirse por separado mezclándose en el laboratorio o adquirir previamente mezclados, como es el caso de Qiagen Multiplex PCR Kit (Qiagen, Valencia, CA), al que se le añaden las parejas de cebadores en las concentraciones adecuadas y el ADN molde.
La PCR se lleva a cabo en un termociclador que realiza los ciclos en los tiempos y temperaturas programadas de forma exacta, tales como la temperatura de hibridación, que depende de la temperatura de fusión de cada uno de los cebadores utilizados en la reacción o la temperatura de extensión.
La temperatura de fusión de los cebadores SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 24 (Tabla 1) está comprendida entre 58 y 60°C, y la del conjunto de parejas de cebadores mostrados en la Tabla 2, está comprendida entre 57 y 63°C, según lo calculado mediante el programa informático Perlprimer (http://perlprimer.sourceforge.net/).
Así, en una realización particular del método de la invención, la temperatura de fusión de la reacción de amplificación multiplex que comprende los oligonucleótidos SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 24 (Tabla 1) está comprendida entre 58 y 60°C, y/o en caso de que la segunda reacción de amplificación multiplex se lleve a cabo con todo o parte del conjunto de parejas de oligonucleótidos mostrados en la Tabla 2, la temperatura de fusión de la segunda reacción de amplificación multiplex está comprendida entre 57 y 63°C. Alternativamente, como entiende el experto en la materia, si en el método de la invención se emplea en la primera reacción de amplificación multiplex el segundo conjunto de parejas de cebadores de la invención (mostrados en la Tabla 2), la temperatura de fusión estará comprendida entre 57 y 63°C, y si en la segunda reacción de amplificación multiplex se emplea todo o parte del primer conjunto de parejas de cebadores de la invención (mostrados en la Tabla 1), la temperatura de fusión estará comprendida entre 58 y 60°C.
La amplificación multiplex ya sea el primer conjunto de parejas de cebadores o I-DNA2 (Tabla 1) como el segundo conjunto de parejas de cebadores o I-DNA1 (Tabla 2), ofrece resultados satisfactorios en un amplio rango de temperaturas de hibridación, entre 57-63°C, aunque los mejores resultados en ambos casos, es de 60,5°C. De igual manera, los cebadores ofrecen resultados en un amplio rango de concentraciones, aunque las concentraciones óptimas para cada pareja de cebadores se recogen en las Tablas 3 y 4. Respecto al número de ciclos empleado en la reacción de PCR se obtienen resultados satisfactorios entre 28-32 ciclos, aunque el número de ciclos óptimo es de 30 en ambas reacciones de amplificación multiplex.
Opcionalmente, si se desea, previamente a la reacción de amplificación multiplex, puede llevarse a cabo el mareaje de los cebadores que participan en dicha reacción de amplificación multiplex con el fin de poder detectar posteriormente los fragmentos amplificados. El mareaje de los productos de amplificación puede realizarse por métodos convencionales. Dicho mareaje puede ser directo, para lo cual pueden utilizarse fluoróforos, por ejemplo, Cy3, Cy5, fluoresceína, alexa, etc., enzimas, por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa, etc., isótopos radiactivos, por ejemplo, 33P, 1251, etc., o cualquier otro marcador conocido por el experto en la materia. Alternativamente, dicho mareaje puede ser indirecto mediante el empleo de métodos químicos, enzimáticos, etc.; a modo ilustrativo, el producto de amplificación puede incorporar un miembro de un par de unión específica, por ejemplo, avidina o estreptavidina conjugada con un fluorocromo (locus), y la sonda se une al otro miembro del par de unión específica, por ejemplo, biotina (indicador), efectuándose la lectura mediante fluorimetría, etc., o bien, el producto de amplificación puede incorporar un miembro de un par de unión específica, por ejemplo, un anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con una enzima (locus), y la sonda se une al otro miembro del par de unión específica, por ejemplo, digoxigenina (indicador), etc., transformándose el sustrato de la enzima en un producto luminiscente o fluorescente y , efectuándose la lectura mediante quimio- luminiscencia, fluorimetría, etc.
Así, en una realización particular, el mareaje del producto de amplificación se lleva a cabo mediante el mareaje, en uno de sus extremos, de uno de los oligonucleótidos de cada pareja de cebadores que, en otra realización todavía más particular, el compuesto empleado en el mareaje de los oligonucleótidos se selecciona del grupo que consiste en un radioisótopo, un material fluorescente, digoxigenina y biotina. Ejemplos de materiales fluorescentes que se pueden emplear en el mareaje de oligonucleótidos incluyen, sin limitar a, 5-carboxifluoresceína (5-FAM), 6-FAM, análogo tetraclorinado de t-FAM (TET), análogo hexaclorinado de 6-FAM (HEX), 6-carboxitetrametilrodamina (TAMRA), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxi-4', 5 '-dicloro-2', 7' -dimeto xifluoresceína (JOE), NED, Cy-3, Cy-5, Cy-5.5, fluorescein-6-isotiocinato (FITC) y tetrametilrodamina-5- isotiocinato (TRITC).
Tras finalizar la reacción de amplificación multiplex, si se desea, se puede proceder a separar los productos de amplificación o amplicones. Prácticamente cualquier método convencional puede ser utilizado dentro del marco de la invención para separar los productos de amplificación. Las técnicas para separar los productos de amplificación están ampliamente descritas en el estado de la técnica, como por ejemplo, en Sambrook et al., 2001 (citado ad supra). Técnicas para separar los productos de amplificación son, por ejemplo, electroforesis sumergida con geles de Methafor, electroforesis en geles de poliacrilamida, electroforesis capilar, etc.
Seguidamente a la separación de los productos de amplificación, se procede a identificar el tamaño de los fragmentos separados, para lo cual puede emplearse cualquiera de los procedimientos de identificación de fragmentos de amplificación conocidos del estado de la técnica, tales como hibridación con sondas marcadas (por ejemplo con un fluoróforo) que serán detectadas por un detector y procesadas mediante un sistema informático, tinción, por ejemplo, con bromuro de etidio, tinción de plata, etc. Tal como entiende el experto en la materia, si todo este proceso es integrado en un sistema informático, se puede generar una gráfica denominada electroferograma donde puede identificarse el tamaño de los fragmentos amplificados.
Entre las aplicaciones del método de la invención se incluyen, pero no se limitan a, la determinación de relaciones de parentesco entre individuos (Investigación Biológica de Paternidad o IBP), la identificación de restos humanos (por ejemplo, muestras fetales, restos cadavéricos, restos antiguos etc.), la identificación de personas desaparecidas (pueden agrupar una gran variedad de casos, como personas que desaparecen de forma accidental, personas víctimas de hechos criminales, personas víctimas de conflictos bélicos ó políticos, etc.), identificación de víctimas de accidentes (accidentes de tráfico, aéreos, domésticos, grandes catástrofes, etc.), la resolución de crímenes etc.,
Como sabe el experto en la materia, una vez obtenido el perfil genético del individuo o del resto humano que se quiere identificar, o cuyo parentesco en relación con otro individuo se quiere establecer, se procede comparar el perfil genético obtenido con un perfil genético de referencia. En la presente invención se entiende por "perfil genético de referencia" a aquel perfil genético que sirve para establecer la identidad del perfil genético analizado mediante comparación.
En el caso de que no estuviera disponible un perfil genético de referencia del individuo objeto de la identificación, por ejemplo, un perfil genético obtenido a partir de una muestra biológica de su cepillo de dientes u otros enseres personales, el perfil genético de referencia se puede obtener a partir de una muestra biológica indubitada de parientes de dicho individuo a fin de determinar el posible parentesco entre el perfil genético del individuo objeto de la identificación y el perfil genético de referencia .
Por otro lado, también es posible obtener perfiles genéticos de referencia a partir de bases de datos de personas desaparecidas o a partir de bases de datos internacionales como la base de datos CODIS (Combined DNA Index System). La elección de la procedencia del perfil genético de referencia, es decir, si procede del propio individuo, de familiares o de bases de datos es práctica de rutina para el experto en la materia, por lo que éste sabe elegir sin dificultad el perfil genético de referencia más adecuado según el caso. it de la invención Por otro lado, la invención se relaciona con un kit útil para la puesta en práctica del método de la invención, que comprende el primer conjunto de parejas de cebadores de la invención (I-DNA2) o, alternativamente, el segundo conjunto de parejas de cebadores de la invención (I-DNA1).
Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un kit, de aquí en adelante "kit de la invención", que comprende las parejas de cebadores que comprenden
- las parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 (CSF1PO), SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 (FGA), SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 (D18S51), SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 (VWA), SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 (TH01), SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 (D21S11), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 (D7S820), SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 (D2S1338), SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 (D13S317), SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina), y SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 (D5S818), o alternativamente,
- las parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 (CSF1PO), SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 (D5S818), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 29 (D7S820), SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 31 (D21 S1 1), SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33 (VWA), SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 35 (D8S1179), SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37 (D19S433), SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 (TH01), SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39 (D16S539), SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 41 (D3S1358), SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43 (D 18S51), SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO : 45 (D13S317), SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina), y SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 47 (FGA), y opcionalmente, reactivos para llevar a cabo una PCR y/o reactivos para aislar ADN a partir de una muestra biológica. Como entiende el experto en la materia, el kit de la invención además de comprender el primer o el segundo conjunto de parejas de cebadores de la invención, puede incluir, opcionalmente, los reactivos necesarios para llevar a cabo la reacción de amplificación multiplex, entre los que se incluyen, sin limitar a, desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs), iones divalentes y/o monovalentes, una solución tampón (buffer) que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa, ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas, etc. No obstante, si el kit de la invención no comprende los reactivos necesarios para poner en práctica el método de la invención, éstos están disponibles comercialmente y pueden encontrarse formando parte de un kit. Cualquier kit de los disponibles comercialmente que contenga los reactivos necesarios para llevar a cabo una reacción de amplificación, puede emplearse con éxito en la puesta en práctica del método de la invención. Tal como se muestra en los ejemplos, en el caso de la presente invención estos reactivos se encuentran previamente mezclados en el reactivo Qiagen Multiplex PCR Kit (Qiagen, Valencia, CA), el cual se utiliza a una quinta parte del volumen recomendado por los fabricantes para reacciones de PCR en general en combinación con la primera o segunda combinación de cebadores en las concentraciones previamente descritas, en un volumen final de 10 micro litros.
Sin embargo, tal como se ha mencionado previamente, el método de la invención puede comprender, además, una segunda reacción de amplificación multiplex para amplificar otra alícuota del extracto de ADN, en donde dicha segunda reacción multiplex comprende un conjunto de parejas de cebadores en la que, al menos, una pareja de cebadores se caracteriza porque (i) amplifica uno de los locus amplificados en la primera reacción de amplificación y (ii) uno de los cebadores de la pareja presenta una secuencia de nucleótidos distinta de la secuencia de nucleótidos de la pareja de cebadores que en la primera reacción de amplificación amplifica el mismo locus.
Por lo tanto, en una realización particular, el kit de la invención comprende adicionalmente al primer o al segundo conjunto de parejas de cebadores de la invención, al menos, una pareja de cebadores caracterizada porque:
- amplifica uno de los locus amplificados por el primer o el segundo conjunto de parejas de cebadores de la invención y - uno de los cebadores de la pareja presenta una secuencia de nucleótidos distinta de la secuencia de nucleótidos de la pareja de cebadores que en el primer o el segundo conjunto de parejas de cebadores de la invención amplifica el mismo locus.
En otra realización más particular, el kit de la invención comprende, adicionalmente al primer o al segundo conjunto de parejas de cebadores de la invención, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 parejas de cebadores, cada pareja de cebadores caracterizada porque:
- amplifica uno de los locus amplificados por el primer o el segundo conjunto de parejas de cebadores de la invención, y
- uno de los cebadores de la pareja presenta una secuencia de nucleótidos distinta de la secuencia de nucleótidos de la pareja de cebadores que en el primer o el segundo conjunto de parejas de cebadores de la invención amplifica el mismo locus.
En otra realización todavía más particular, dicha pareja de cebadores caracterizada porque (i) amplifica uno de los locus amplificados por el primer o el segundo conjunto de parejas de cebadores de la invención, y (ii) uno de los cebadores de la pareja presenta una secuencia de nucleótidos distinta de la secuencia de nucleótidos de la pareja de cebadores que en el primer o el segundo conjunto de parejas de cebadores de la invención amplifica el mismo locus, se selecciona del grupo que consiste en
- las parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 (CSF1PO), SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 47 (FGA), SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43 (D18S51), SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33 (VWA), SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 31 (D21 S 11), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 29 (D7S820), SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 (D13S317), SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina) y SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 (D5S818), o alternativamente
- las parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 (CSF1PO), SEQ
ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 (FGA), SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 (D18S51), SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 (VWA), SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 (D21S11), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 (D7S820), SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 (D13S317), SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina) y SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 (D5S818).
En otra realización particular, el kit de la invención comprende, adicionalmente,
- al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 de las parejas de cebadores seleccionadas de las parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 (TH01), SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 35 (D8S1179), SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37 (D19S433), SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39 (D16S 5 39 ) , y S E Q ID NO : 40 y S E Q ID N O : 4 1 (D 3 S 1 3 5 8 ) , o alternativamente
- al menos 1 , 2 o 3 de las parejas de cebadores seleccionadas de las parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 1 1 y SEQ ID NO: 12 (TH01), y SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 (D2S1338).
Por otro lado, como entiende el experto en la materia, el kit de la invención puede comprender parejas de cebadores ya marcados, o los reactivos necesarios para llevar a cabo el mareaje de los mismos. Los distintos métodos que existen en el estado de la técnica para realizar el mareaje de los cebadores, así como los tipos de compuestos que se pueden emplear en dicho mareaje han sido explicados previamente en la presente memoria.
Así, en una realización particular, el kit de la invención comprende parejas de cebadores en donde uno de los oligonucléotidos de cada pareja está marcado en uno de sus extremos, o los reactivos necesarios para marcar las parejas de cebadores.
En una realización todavía más particular del kit de la invención, los compuestos empleados en el mareaje de los oligonucleótidos seleccionan del grupo que consiste en un radioisótopo, un material fluorescente, digoxigenina y biotina, que en otra realización aún más particular, el material fluorescente se selecciona del grupo que consiste en 5- carboxifluoresceína (5-FAM), 6-FAM, análogo tetraclorinado de t-FAM (TET), análogo hexaclorinado de 6-FAM (HEX), 6-carboxitetrametilrodamina (TAMRA), 6-carboxi-X- rodamina (ROX), 6-carboxi-4', 5 '-dicloro-2', 7'-dimetoxifluoresceína (JOE), NED (ABI), Cy-3, Cy-5, Cy-5.5, fluorescein-6-isotiocinato (FITC) y tetrametilrodamina-5-isotiocinato (TRITC).
Tal como se ha mencionado previamente, el kit de la invención es útil en la puesta en práctica del método de invención. Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso del kit de la invención para obtener el perfil genético de un individuo, para determinar relaciones de parentesco entre individuos o para identificar restos humanos.
Los siguientes ejemplos son ilustrativos de la invención y no pretenden ser limitativos de la misma.
EJEMPLOS
En los ejemplos siguientes se realiza la validación de I-DNA1, I-DNA2 y la combinación de ambos sistemas de acuerdo con Scientific Working Group on DNA Analysis Methods (SGWDAM) [Ellegren, H., 2004. Nat Rev Genet., 5(6): 435-45], para su uso en identificación humana (Ejemplo 1) y en el análisis de muestras de ADN altamente degradadas (Ejemplo 2). En el primer ejemplo se detallan la optimización de los conjuntos de cebadores y de los parámetros de las reacciones de PCR, estudios de concordancia, precisión y exactitud, con el objetivo de demostrar que la invención es adecuada para su uso en identificación humana. En el segundo ejemplo, se realiza la comparación de la invención y del resto de métodos del estado de la técnica, en cuanto a los parámetros principales en el análisis de muestras de ADN altamente degradadas tales como el análisis de mezclas, sensibilidad y estrategias de diseño. Así mismo, se realiza una comparación directa de rendimiento en el análisis de un conjunto de muestras de ADN altamente degradadas, entre el método de la invención y el método de mayor rendimiento del estado de la técnica. Los resultados obtenidos demuestran que, el método de la invención constituye una mejora respecto a los métodos del estado de la técnica, en el rendimiento y la fiabilidad de análisis de loci STRs incluidos en el CODIS a partir de muestras de ADN altamente degradadas. EJEMPLO 1
Validación del método de la invención que comprende dos reacciones de
amplificación multiplex empleando los conjuntos de parejas de cebadores I-DNA1 e I-DNA2 para su uso en identificación humana
A continuación se describe la validación de I-DNA1, I-DNA2 y la combinación de ambos sistemas de acuerdo con Scientific Working Group on DNA Analysis Methods (SGWDAM) [Ellegren, FL, 2004. Nat Rev Genet., 5(6): 435-45]. Dicha validación ha consistido en ensayos de optimización de los conjuntos de cebadores, optimización de los parámetros de la PCR, estudios de concordancia, precisión y exactitud. Los resultados obtenidos mostraron que I-DNA1, I-DNA2 y la combinación de ambas, son herramientas adecuadas para la obtención de perfiles genéticos humanos.
MATERIALES Y METODOS
Muestras control de ADN humano
Se utilizaron los ADN controles 9947A del kit AmpFISTR® YFiler (Applied Biosystems, Foster City, CA), Control DNA 007 (Applied Biosystems, Foster City, CA) y K562 (Promega® Corporation, USA) para poner a punto las condiciones de PCR y realizar ensayos de sensibilidad. Estas tres muestras se cuantificaron mediante Quantifiler® Human DNA Quantification Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) en un ABI PRISM® 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA), de acuerdo con las especificaciones del fabricante y fueron diluidas a 1 ng/μΐ.
Muestras de la población
Se tomaron muestras de sangre periférica de 600 individuos sanos: 318 caucasoides europeos (País Vasco, Spain) y 282 individuos de Colombia (133 negroides y 149 hispanos).
Extracción de ADN y cuantificación Los extractos de ADN de los individuos de origen caucasoide se obtuvieron mediante lisis proteolítica con proteinasa K y extracción orgánica. Los extractos de ADN procedentes de las muestras biológicas de los individuos de origen negroide e hispano se obtuvieron mediante extracción por QiAamp DNA Micro Kit (Qiagen, CA). Todos los extractos de ADN se cuantificaron con PicoGreen® (Invitrogen).
Optimización del conjunto de cebadores
Se utilizó el programa Perlprimer (http://perlprimer.sourceforge.net/) para diseñar nuevos cebadores que amplifiquen en el caso de I-DNA1 14 loci STRs (D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D19S433, D21 S11 , CSFIPO, FGA, THO l , TPOX y vWA) más amelogenina, y en el caso de I-DNA2 11 STRs (CSFIPO, FGA, TPOX, D18S51, vWA, THOl, D21S11, D7S820, D2S1338, D13S317, D5S818) más amelogenina, en base a las secuencias de referencia cuyos números de acceso a Genbank se recogen en la Tabla 5 y en la Tabla 5A para el primer y segundo conjunto de parejas de cebadores, respectivamente.
Las regiones flanqueantes a los STR analizados se estudiaron mediante SNPblast (Vww.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snpblastByChr.html) con el fin de evitar posiciones variables en la región de unión de todos los cebadores diseñados. Los amplificados se extienden desde 49 hasta 297pb y 298 pb, en el caso de I-DNA1 y I-DNA2 respectivamente, para abarcar un amplio número de los alelos contenidos en STRBase website [Ruitberg, C.M., D.J. Reeder, y J.M. Butler,2001. Nucleic Acids Res, 29(1): 320-2] (Tablas 5 y 5A, respectivamente) .
La intensidad de los amplicones y la ausencia de inespecíficos de cada locus se evaluó mediante el análisis de los productos de PCR por DHPLC con un DNAsep Cartridge (Transgenomic® WAVE® System 4500, Glasgow, UK). 10 μΐ de amplificado fueron migrados a 40°C en un gradiente lineal desde 38,6 a 61,1 % de buffer B (25 % de acetonitrilo y TEAA 0,1 M) durante 10 minutos.
Para evitar la adenilación incompleta se utilizó la adición tanto de una guanina al extremo 5 ' del cebador inverso como de "pig-tailing" [cola de nucleótidos (5'-GTTTCTT- 3 ') que se añade al extremo 5 ' de un cebador para evitar la adenilación incompleta], (Brownstein, M.J., J.D. Carpten, and J.R. Smith, 1996. Biotechniques, 20(6): 1004-6, 1008-10; Hill CR, B.J., Valone PM, 2009. J Forensic Sci, 54(5): 7; Butler, J.M., Y. Shen, and B.R. McCord, 2003. J Forensic Sci, 48(5): 1054-64).
Amplificación de PCR, electroforesis y análisis de datos
Se emplearon 5μ1 de Qiagen® Master Mix de Qiagen® Multiplex PCR Kit (Qiagen, Valencia, CA), 4 μΐ del mix de cebadores y un 1 μΐ de ADN molde (lng / μΐ). Las concentraciones de cada pareja de cebadores se detallan en las Tablas 3 y 4. Se analizó el rendimiento de la amplificación en diferentes termocicladores: Biorad™ ICycler, C1000™ y Mycycler™ (BioRad, Hercules, CA) y GeneAmp® 9700 PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA), así como en diferentes condiciones de temperaturas de hibridación ("annealing temperature"): 57 °C, 58,9 °C, 60,5 °C, 61,8 °C y 63 °C, a distintos números de ciclos: 28, 29, 30, 31 y 32 ciclos y a tiempos de extensión final de 30, 45, 60 y 90 minutos. Se analizaron 2 μΐ de cada producto de amplificado mezclados con 9 μΐ de Hi- Di™ Formamide (Applied Biosystems®, Foster City, CA) y 0,5 μΐ de GeneScan™ 500 LIZ® Size Standard (Applied Biosystems®, Foster City, CA). Tras la desnaturalización de los amplificados (6 minutos a 95 °C) se enfriaron (4 minutos a 4 °C) y se separaron en un ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems®, Foster City, CA). Los resultados de la electroforesis fueron analizados mediante el software Genmapper versión 4.0 (Applied Biosystems®, Foster City, CA).
Estudios de concordancia
Se compararon perfiles genéticos analizados con I-DNA1, I-DNA2 e Identifiler® (Applied Biosystems, Foster City, CA). Para su análisis mediante I-DNA1 y I-DNA2 se empleó 1 ng de ADN molde de cada individuo. El análisis mediante Identifiler® (Applied Biosystems, Foster City, CA) se realizó según las condiciones óptimas sugeridas por el fabricante.
Precisión y exactitud
La precisión de las escaleras alélicas de I-DNA1 y I-DNA2 se calculó mediante el análisis de 48 réplicas de cada escalera alélica en un ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems®, Foster City, CA). La exactitud del genotipado de I-DNAl y I-DNA2 se evaluó mediante el análisis de 162 muestras de ADN amplificadas en condiciones estándar, de las que se calculó la desviación estándar en pares de bases de cada uno de los alelos respecto al tamaño del alelo de la escalera alélica correspondiente, por el programa Genmapper (Applied Biosystems, Foster City, CA).
RESULTADOS
Optimización de los conjuntos de cebadores
Las Tablas 5 y 5 A (página siguiente) recogen un amplio rango de alelos para cada locus incluido en I-DNAl y I-DNA2, respectivamente. Se han considerado los alelos descritos en los principales grupos poblacionales según la información recogida en STRbase [Ruitberg, C.M., D.J. Reeder, y J.M. Butler,2001. Nucleic Acids Res, 29(1): 320-2].
Tabla 5
N° acceso Intervalo Fragmento Concentración de Marcador
Locus
Genbank alelos de PCR (pb) cebadores (μΜ) fluorescente
CSF1PO X14720 6- 15 75 - 111 0,08
D5S818 AC008512 7- 17 127-167 0,19
6-FAM™
D7S820 AC004848 6- 15 183-219 0,13
D21S11 M84567 24-38 240 - 296 0,1
TPOX M68651 6- 16 61 -89 0,08
VWA M25858 11 -24 121 - 173 0,07
NED™
D8S1179 AF216671 8-20 181 -229 0,09
D19S433 G08036 5,2- 18,2 245 - 297 0,19
TH01 D00269 5- 14 57-93 0,04
D16S539 AC024591 5- 16 105- 149 0,11
VIC™
D3S1358 NT_005997 9-20 161 -205 0,09
D18S51 AP001534 7-27 213-293 0,38
D13S317 AL353628 5- 17 72- 120 0,06
amelogenina Sullivan ef al* X, Y 121,127 0,11 PET®
FGA M64982 16-51,2 151 -293 0,31
* Sullivan KM, et.al.1993. Biotechniques,15(4):636-8,640-1. Tabla 5A
Tamaño Concentración
N° acceso Intervalo Marcador
Locus fragment de cebador
GenBank alelos fluorescente
PCR (pb) μΜ
CSF1PO X14720 5-16 88- 132 0,06
6-FAM™
FGA M64982 12-51,2 140-298 0,08
TPOX M68651 4-16 53- 101 0,1
D18S51 AP001534 7-28,3 109- 196 0,3 NED™
vWA M25858 10-25 212-272 0,18
TH01 D00269 3-14 49-93 0,05
D21S11 M84567 12-39 107-215 0,11 VIC™
D7S820 AC004848 6-15 224 - 260 0,14
D2S1338 AC010136 11 -28 88- 156 0,15
D13S317 AL353628 5-17 164-212 0,15
PET®
amelogenina Sullivan ef al* X, Y 220, 226 0,11
D5S818 AC008512 6-18 234 - 282 0,08
* Sullivan KM, et.al.1993. Biotechniques,15(4):636-8,640-1.
En el caso de I-DNA1 se diseñaron 96 cebadores de entre los que se eligieron aquellos capaces de producir amplificados del menor tamaño posible, que en ningún caso excedieran de 300 pb, cuyas temperaturas de fusión ("melting temperature") estuvieran comprendidas entre 57,5 y 62,5 °C y que hibridaran en regiones carentes de SNPs {Single Nucleotide Polymorphism) e INDELS (Inserciones/deleciones) descrito hasta la fecha en NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/). En la primera fase de optimización se efectuaron amplificaciones PCR singleplex de cada locus. Los productos PCR fueron analizados mediante DHPLC para evaluar la especificidad de los cebadores y la intensidad de amplificación. Todas las parejas de cebadores de esta invención son diferentes a las utilizadas en cualquiera de los kits actualmente validados. En la segunda fase de optimización, se ensayaron diversos conjuntos de cebadores en multiplex. Se espaciaron los rangos de alelos de los loci adyacentes en tamaño con el fin de evitar solapamientos entre alelos correspondientes a loci diferentes para asegurar así un correcto genotipado. El análisis mediante DHPLC permitió evaluar la ausencia de inespecíficos y la eficacia de la amplificación para cada uno de los loci ensayados en formato multiplex. Finalmente, se seleccionaron 3 reacciones de PCR quadruplex (quadruplex A: CSF1PO, D5S818, D7S820 y D21 S 1 1 ; quadruplex B: THOl , D16S539, D3S 1358 y D18S51 ; quaduplex C: TPOX, vWA, D8S1179 y D19S433) y una reacción de PCR triplex (triplex D: D13S317, amelogenina y FGA). Los cebadores directos de las 3 reacciones quadruplex A, B y C se marcaron con 6-FAM™, VIC™ y NED™, respectivamente y los cebadores directos de la reacción triplex D, fueron marcados con PET® (Applied Biosystems, Foster City, CA) (Tabla 5). Por último, se agruparon los distintos conjuntos de cebadores en una única reacción de PCR multiplex que permite la amplificación de 14 loci STRs y amelogenina. En la Figura 3 se representa el resultado final de la estrategia en el diseño de cebadores para I-DNAl .
En el caso de I-DNA2, se diseñaron 78 cebadores capaces de producir amplicones que en ningún caso excedieran las 300 pb y cuyas temperaturas de fusión estuvieran comprendidas entre 57,5 y 62,5 °C. Del mismo modo, los cebadores para I-DNA2 se diseñaron para que su combinación con I-DNAl permitiera el análisis del mayor número de loci miniSTRs posible. Por ello, 9 de los 1 1 loci compartidos por I-DNA2 y I-DNAl (CSF1PO, FGA, D 18 S5 1 , VWA, D21 S 1 1 , D7S 820, D 13 S3 17, D5 S 81 8 y amelogenina) presentan amplicones de tamaños netamente diferentes en ambos sistemas (Tablas 5 y 5A). Así mismo, se diseñaron cebadores capaces de producir amplificados del menor tamaño posible para D2S 1 138 al no estar este locus incluido en I-DNAl . Por otro lado, se utilizaron cebadores de idéntica secuencia a los utilizados en I-DNAl para THOl y TPOX debido a su reducido tamaño de 49 y 51 pb, respectivamente. En la primera fase de la optimización se efectuaron amplificaciones PCR singleplex de cada locus, a excepción de THOl y TPOX, previamente testados. Los productos PCR fueron analizados mediante DHPLC para evaluar la especificidad de los cebadores y la intensidad de amplificación. Cabe destacar que, todas las parejas de cebadores seleccionadas en este trabajo, son diferentes a las empleadas en cualquiera de los métodos del estado de la técnica, excepto las parejas de cebadores utilizadas para la amplificación de THOl y TPOX, también empleadas en I-DNAl . En la segunda fase de optimización se ensayaron diversos conjuntos de cebadores en multiplex, de tal forma que se espaciaron los rangos de alelos de los loci adyacentes en tamaño, con el fin de evitar solapamientos entre alelos correspondientes a diferentes loci. El análisis mediante DHPLC de los productos de PCR de cada uno de los loci ensayados en formato multiplex, permitió evaluar la eficacia de la amplificación y la ausencia de inespecíficos en cada caso.
Finalmente, se seleccionaron 2 reacciones de PCR triplex (Triplex A: TPOX, D18S51 y vWA; Triplex B: TH01, D21S11 y D7S820), una reacción de PCR quadruplex (quadruplex C: D2S1338, D13S317, amelogenina y D5S818) y una reacción de PCR dúplex (dúplex D: CSFIPO y FGA). Los cebadores directos de las 2 reacciones triplex A y B se marcaron con NED™ y VIC™, respectivamente, los cebadores directos de la reacción quadruplex C, fueron marcados con PET® (Applied Biosystems, Foster City, CA) y los cebadores directos de la reacción dúplex D, fueron marcados con 6-FAM™ (Tabla 5A). Por último, los distintos conjuntos de cebadores se agruparon en una única reacción de PCR multiplex que permite amplificar 1 1 loci STRs más amelogenina, mediante amplicones desde 49 hasta 298 pb, para así abarcar un amplio número de alelos (Tabla 5A).
En conclusión, para posibilitar la obtención del perfil genético completo se diseñaron los cebadores de tal modo que pudiesen ser analizados en dos reacciones multiplex un total de 15 loci STRs: (CSFIPO, FGA, TPOX, D18S51, vWA, TH01, D21S11, D7S820, D2S1338, D13S317, D5S818, D8S1179, D19S433, D16S539, D3S1358) más amelogenina. La primera reacción multiplex, que emplea el conjunto de cebadores denominado I-DNA1, permite obtener el perfil genético de 14 STRs (CSFIPO, D5S818, D7S820, D21 S 1 1 , TPOX, VWA, D8S 1 179, D 19S433, TH01 , D 16S539, D3 S 1358, D18S51, D13S317, FGA) más amelogenina. La segunda reacción multiplex, que emplea el conjunto de cebadores denominado I-DNA2, permite obtener el perfil genético de 1 1 STRs (CSFIPO, FGA, TPOX, D18S51, vWA, TH01, D21S11, D7S820, D2S1338, D13S317, D5S818) más amelogenina.
En la Figura 3 se representa el resultado final de la estrategia en el diseño de cebadores para I-DNA2 (A) y I-DNA1 (B).
Optimización de los parámetros de PCR La optimización de los parámetros de amplificación tales como la concentración óptima de cebadores, temperatura de hibridación, número de ciclos y tiempo de extensión, se realizó mediante el estudio de los electroferogramas en los que se evaluó la altura de los picos, el balance en heterocigosis de los mismos y la adenilación incompleta.
En primer lugar, la concentración de cada pareja de cebadores fue testada entre 0,0375 μΜ y 0,75 μΜ, de tal forma que en cada caso, por debajo de la concentración óptima se observó un aumento en la altura de los picos a medida que se aumentaba la concentración de cebadores. Mientras que a su vez, en concentraciones superiores a la considerada óptima se detectó un aumento tanto del desbalance en heterocigosis y de la adenilación incompleta, como de la intensidad de los artefactos en I-DNA1 (FAM87, FAM96, FAM158, VIC53, VIC105, VIC121 y VIC180) y en I-DNA2 (FAM91, FAM155, VIC51, VIC179, NED100, NED165, NED179, PET95 y PET97).
En este sentido, las intensidades de los loci analizados mediante I-DNA1 y I-DNA2 se equilibraron alrededor de 2.500 RFUs en el análisis de 1 ng de ADN, para alcanzar un equilibrio entre la intensidad de la señal y la ausencia de solapamiento entre las señales correspondientes a diferentes fluorocromos.
A continuación se procedió a la optimización de la temperatura de hibridación de la reacción PCR multiplex. El aumento de temperatura de hibridación produjo una disminución gradual tanto de la adenilación incompleta, como de la altura de los picos. Los mejores resultados se obtuvieron a la temperatura de hibridación de 60,5 °C, en el caso de I-DNA1 , y de 58,9°C y 60,5°C en el caso de I-DNA2. Se escogió la temperatura de 60,5°C por ser la más restrictiva para I-DNA2 y por coincidir para ambos sistemas.
Por otro lado, el aumento en el número de ciclos incrementó de forma generalizada la altura de los picos y la adenilación incompleta. En este sentido, los resultados más equilibrados correspondieron a 30 ciclos. Así mismo, el incremento del tiempo de extensión no produjo cambios significativos en la adenilación incompleta; sin embargo, la adición de una guanina al extremo 5 ' del primer reverse eliminó el efecto de la adenilación incompleta, incluso mejor que la adición de pig-tailing. La adición de dicha guanina se representa como una G en las Tablas 1 y 2.
Cabe destacar también que, el empleo de los termocicladores Biorad™ ICycler, C1000™ y Mycycler™ (BioRad, Hercules, CA) y GeneAmp® 9700 PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) no reveló variaciones significativas en cuanto a la calidad de los resultados obtenidos.
Tras la evaluación de todos los parámetros anteriormente mencionados, se llegó a determinar la concentración óptima de cebadores, de tal forma que se obtuvieron las siguientes intensidades medias para cada color en el análisis de 1 ng de ADN de I-DNAl [6-FAM™ (2243 ± 764 RFUs), VIC™ (2742 ± 748 RFUs), NED™ (2313 ± 426 RFUs) y PET® (2417 ± 247 RFUs)] y I-DNA2 [6-FAM™ (1933 ± 424 RFUs), VIC™ (2659 ± 428 RFUs), NED™ (2276 ± 100 RFUs) y PET® (1869 ± 416 RFUs)].
De esta manera, I-DNAl y I-DNA2 han demostrado ser multiplexes balanceadas y específicas, capaces de amplificar 14 loci STRs y 11 loci STRs, respectivamente, además del locus amelogenina, a partir de 1 ng de ADN molde (Figuras 1 y 2), mediante la siguientes condiciones de amplificación: un ciclo de desnaturalización inicial durante 15 minutos a 95 °C, 30 ciclos de 30 s a 95 °C, 90 s a 60,5 °C y 1 minuto a 72 °C, seguidos de 1 ciclo de extensión final de 30 minutos a 60 °C. Además, el hecho de que los cebadores utilizados en ambos sistemas posean características similares de temperatura de fusión (I- DNA1 : 58,8±0,91°C y I-DNA2: 58,9±0,87 °C) y longitud (I-DNAl : 21,3±2,88 pb y I- DNA2: 20,4±2,3 pb), posibilita que puedan ofrecer óptimos resultados en las mismas condiciones de PCR.
Estudios de concordancia
Los estudios de concordancia se llevaron a cabo mediante la comparación de 2430 alíele calis obtenidos por I-DNAl e Identifiler® (Applied Biosystems, Foster City, CA), de 1944 alíele calis obtenidos por I-DNA2 e Identifiler® (Applied Biosystems, Foster City, CA) y la comparación de 6600 alíele calis obtenidos por I-DNA2 y I-DNAl . Se eligió Identifiler® (Applied Biosystems, Foster City, CA) por ser éste un sistema ampliamente utilizado [Hill, C.R., et al, 2007. J Forensic Sci, 52(4): 870-3] y validado [Collins, P.J., et al, 2004. J Forensic Sci, 49(6): 1265-77]. Entre los resultados obtenidos por I-DNA1 e Identifiler® se encontró una única discordancia lo que supone una concordancia del 99,9% entre estos sistemas. Dicha discordancia correspondió a un individuo genotipado como homocigoto (15/15) para D3S 1358 mediante Identifiler® y como heterocigoto (12/15) mediante I-DNA1. La muestra fue analizada por triplicado por ambos sistemas con idénticos resultados. En la comparación de I-DNA2 e Identifiler® (Applied Biosystems, Foster City, CA) no se encontraron discordancias, lo que supone una concordancia del 100 % entre ambos sistemas. Mientras que, la comparación de los perfiles genéticos obtenidos por I-DNA1 y I-DNA2 reveló 6 discordancias, lo que supone una concordancia del 99,9 % entre estos sistemas.
De estas discordancias 2 correspondieron a pérdidas alélicas registrada en el locus vWA de I-DNA2, mientras que 3 discordancias consistieron en diferencias entre ambos sistemas de 2 pb en el tamaño de 1 alelo del locus D18S51 y de 4 pb en 2 alelos del locus D13S317.
Precisión y exactitud
La precisión de las escaleras alélicas de I-DNA1 y I-DNA2 se calculó a partir del estudio de escaleras alélicas analizadas en inyecciones independientes. La desviación estándar del tamaño en pares de bases fue igual o menor a 0,07 pb tanto para I-DNA1 como para I- DNA2. La exactitud fue medida mediante el análisis de 162 individuos caucasoides para calcular la desviación del tamaño de los alelos de cada una de las muestras respecto al tamaño de los alelos de las escaleras alélicas correspondientes. No se detectaron alelos fuera del rango de ±0.40 pb correspondiente a cada alelo de las escaleras alélicas.
DISCUSION
A continuación se discuten los resultados relativos a la validación de I-DNA1 en los ensayos de optimización del conjunto de cebadores, optimización de parámetros de PCR, y estudios de concordancia.
La optimización del conjunto de cebadores ha consistido en analizar los productos de amplificado tanto por separado, como en multiplex. El procedimiento habitual consiste en el análisis de amplicones marcados mediante un secuenciador de ADN [Tagliaro, F., et a/.,2010. Electrophoresis, 31(1): 251-9]. Sin embargo, en esta invención se ha utilizado por primera vez la tecnología DHPLC (del inglés "Denaturing High-Performance Liquid Chromatography") para evaluar la intensidad de los amplificados y determinar la ausencia de amplificaciones inespecíficas. La ventaja de la utilización del análisis mediante DHPLC es que evita la necesidad del mareaje previo de los cebadores. Esta metodología se ha empleado tanto en la primera fase de optimización de los productos de PCR por separado, como en la segunda fase de optimización con el fin adicional de evaluar la ausencia de solapamiento de los productos de PCR. Una vez determinado el mejor conjunto de cebadores para la amplificación multiplex de los 14 loci STRs y amelogenina los 11 loci STRs más amelogenina, según el caso, se marcaron los cebadores mediante fluorocromos. De esta manera, se han marcado únicamente aquellos cebadores que finalmente han sido incluidos en la reacciones denominadas I-DNA1 y I-DNA2. Por lo tanto, el empleo de la tecnología DHPLC en la optimización de la amplificación de las reacciones multiplex supone una alternativa rápida [Shinka, T., et al., 2001. J Hum Genet, 46(5): 263-6] y de reducido coste al análisis de amplicones mediante secuenciador de ADN, ya que evita la necesidad de utilizar cebadores marcados en las primeras fases de la optimización [Devaney, J.M., J.E. Girard, y M.A. Marino, 2000. Anal Chem, 72(4): 858-64].
I-DNA1 y I-DNA2 han demostrado ser reacciones multiplexes balanceadas y específicas, capaces de amplificar 14 loci STRs y 11 loci STRs , respectivamente, además del locus amelogenina. Además el hecho de que los cebadores utilizados en ambos sistemas posean características similares de temperatura de fusión y longitud, posibilita que puedan ofrecer óptimos resultados en las mismas condiciones de PCR.
La Habilidad de I-DNA1 y I-DNA2 ha sido comprobada mediante estudios de concordancia entre los perfiles genéticos determinados por estos sistemas y los obtenidos mediante sistemas preexistentes ampliamente utilizados. En este sentido en primer lugar se constató una concordancia del 99,9 % entre I-DNA1 e Identifiler® (Applied Biosystems, Foster City, CA), donde la única excepción se detectó en un individuo, genotipado como homocigoto por Identifiler® (Applied Biosystems, Foster City, CA) y como heterocigoto por I-DNA1. Así mismo, se constató la concordancia del 100 % de I-DNA2 respecto a Identifiler (Applied Biosystems, Foster City, CA) y del 99,9 % respecto a I-DNA1. Las discordancias detectadas entre I-DNA1 y I-DNA2 consisten en pérdidas alélicas y variaciones de 2-4 pb en el tamaño de los alelos detectados en ambos sistemas. Este tipo de discordancias son las habituales tras el análisis de idénticos STRs con sistemas que emplean diferentes parejas de cebadores (Hill, C.R. et al., 2007. J Forensic Sci, 2007. 52(4): 870-3). Discordancias similares reportadas en otros estudios se debieron a la presencia de mutaciones que probablemente coincidían con la región de unión del extremo 3 ' de uno de los cebadores mientras que las variaciones en el tamaño de alelos probablemente se debieron a la presencia de inserciones y/o deleciones en la región flanqueante a la repetición STR [Budowle, B., et al., 2008. Int J Legal Med, 122(5): 421-7; Zhai, X.D., et al., 2009. Oct 30, Int J Legal Med]. Dichas mutaciones impiden la amplificación de uno de los alelos y en consecuencia originan pérdidas alélicas. En este sentido, los perfiles genéticos obtenidos mediante I-DNA1 y I-DNA2 mostraron una alta fiabilidad, ya que el uso combinado de varias STR multiplex que utilicen diferentes parejas de cebadores para la amplificación de loci STR comunes como I-DNA1 y I-DNA2, ofrece considerables ventajas en identificación humana, al permitir tanto la detección de inserciones/deleciones que puedan afectar al perfil genético obtenido, como la disminución del efecto de estos alelos silentes.
En conclusión, la presente validación ha puesto de manifiesto que I-DNA1 y I-DNA2, así como la combinación de ambas reacciones, constituyen sistemas de elevada robustez y fiabilidad en la obtención de perfiles genéticos, lo que las convierte en herramientas útiles para su utilización en identificación humana. Así mismo, el reducido tamaño de sus amplificados, sumado al haber sido diseñadas para su óptima complementariedad, sugiere que la presente invención posee una elevada capacidad de análisis de loci incluidos en el CODIS a partir de fragmentos de ADN de reducido tamaño.
EJEMPLO 2
Validación del método de la invención que comprende dos reacciones de amplificación multiplex empleando los conjuntos de parejas de cebadores I-DNA1 e I-
DNA2 para su uso en el análisis de muestras de ADN altamente degradadas A continuación se describe la validación de I-DNA1, I-DNA2 y la combinación de ambas reacciones de acuerdo con Scientific Working Group on DNA Analysis Methods (SGWDAM) [Ellegren, H., 2004. Nat Rev Genet., 5(6): 435-45] en el análisis de muestras de ADN altamente degradadas. Dicha validación ha consistido en ensayos de determinación de porcentaje de alelos tartamudos, intensidad relativa entre picos, mezclas y sensibilidad. Así mismo, se realizan dos estudios comparativos de: 1) entre las estrategias de diseño del método objeto de invención y los de los métodos del estado de la técnica y 2) entre la capacidad de análisis de loci incluidos en CODIS a partir de muestras de ADN altamente degradadas del método de la invención y la de Minifiler™ Kit PCR, Identifiler® y la combinación de ambos (Applied Biosystems, Foster City, CA), por ser los métodos del estado de la técnica que mayor rendimiento han demostrado en este aspecto.
Los resultados obtenidos indican que la presente invención que supera al resto de métodos de la técnica en capacidad de análisis de loci incluidos en el CODIS a partir de muestras de ADN altamente degradadas.
MATERIALES Y METODOS
Muestras control de ADN humano
Se utilizaron los ADN controles 9947A del kit AmpFISTR® YFiler (Applied Biosystems, Foster City, CA), Control DNA 007 (Applied Biosystems, Foster City, CA) y K562 (Promega® Corporation, USA) para poner a punto las condiciones de PCR y realizar ensayos de sensibilidad. Estas tres muestras se cuantificaron mediante Quantifiler® Human DNA Quantification Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) en un ABI PRISM® 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA), de acuerdo con las especificaciones del fabricante y fueron diluidas a 1 ng/μΐ.
Muestras de la población
Se tomaron muestras de sangre periférica de 600 individuos sanos: 318 caucasoides europeos (País Vasco, Spain) y 282 individuos de Colombia (133 negroides y 149 hispanos).
Muestras de ADN altamente degradadas. Se tomaron 10 muestras de ADN procedentes de tejidos incluidos en parafina del año 80, originarios de autopsias en las que el tejido permaneció 72-96 horas en formol antes de su inclusión en parafina.
Extracción de ADN y cuantificación
Los extractos de ADN de los individuos de origen caucasoide y de las muestras de parafina, se obtuvieron mediante lisis proteolítica con proteinasa K y extracción orgánica. Los extractos de ADN procedentes de las muestras biológicas de los individuos de origen negroide e hispano se obtuvieron mediante extracción por QiAamp DNA Micro Kit (Qiagen, CA). Se utilizaron las cantidades de ADN recomendadas por el fabricante para la amplificación PCR de cada tipo de muestras en cada caso. Para el análisis mediante el sistema objeto de la presente invención se utilizó 1 ng en la amplificación del ADN procedente de muestras poblacionales y 1,6 ng del ADN de las muestras de parafina. Todos los extractos de ADN se cuantificaron con PicoGreen® (Invitrogen).
Amplificación de PCR, electroforesis y análisis de datos
Se emplearon 5 μΐ de Qiagen® Master Mix de Qiagen® Multiplex PCR Kit (Qiagen, Valencia, CA), 4 μΐ del mix de cebadores y un 1 μΐ de ADN molde. Las concentraciones de cada pareja de cebadores se detallan en las Tablas 3 y 4. Las reacciones de amplificación PCR se realizaron en un termociclador Mycycler™ (BioRad, Hercules, CA) en las siguientes condiciones: un ciclo de desnaturalización inicial durante 15 minutos a 95 °C, 30 ciclos de 30 s a 95 °C, 90 s a 60,5 °C y 1 minuto a 72 °C, seguidos de 1 ciclo de extensión final de 30 minutos a 60 °C. Se analizaron 2 μΐ de cada producto de amplificado mezclados con 9 μΐ de Hi-Di™ Formamide (Applied Biosystems®, Foster City, CA) y 0,5 μΐ de GeneScan™ 500 LIZ® Size Standard (Applied Biosystems®, Foster City, CA). Tras la desnaturalización de los amplificados (6 minutos a 95 °C) se enfriaron (4 minutos a 4 °C) y se separaron en un ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems®, Foster City, CA). Los resultados de la electroforesis fueron analizados mediante el software Genmapper versión 4.0 (Applied Biosystems®, Foster City, CA). Determination del porcentaje de alelos tartamudos, intensidad relativa de picos heterocigotos y mezclas
La determinación de alelos tartamudos tanto en individuos homocigotos como heterocigotos que diferían en tamaño en más de 4 pb se efectuó calculando el porcentaje de la altura del pico del alelo tartamudo respecto a la altura del pico real. El cálculo de la intensidad relativa de picos heterocigotos (del inglés "Peak Height Ratio" ó PHR) se realizó dividiendo la altura del menor de los picos entre la altura del mayor de los heterocigotos de cada locus.
Los estudios de mezclas consistieron en establecer un umbral basado en el porcentaje de alelo tartamudo para la distinción entre el alelo tartamudo y "minor contributor" (en una mezcla compuesta por los ADNs de dos individuos, el "minor contributor" se refiere al perfil que en menor proporción contribuye a la mezcla). Para comprobar la eficacia de dicho umbral, se mezclaron dos muestras de ADN a las siguientes proporciones (1 : 1, 1 :3, 1 :5, 1 :7, 1 : 10, 1 : 15, 1 :20, 3 : 1 , 5 : 1 , 7: 1 , 10: 1 , 15 : 1 y 20: 1), manteniendo la cantidad de ADN molde final en 1 ng.
Sensibilidad
Con el fin de determinar la sensibilidad de I-DNA1, I-DNA2 y la de ambos en combinación, se analizaron por triplicado los ADN controles 9947A del kit AmpFISTR® YFiler (Applied Biosystems, Foster City, CA), Control DNA 007 (Applied Biosystems, Foster City, CA) y K562 (Promega® Corporation, USA). Se utilizaron concentraciones de ADN de 30 ng, 20 ng, 10 ng, 1,6 ng, 1 ng, 400 pg, 200 pg, 100 pg, 50 pg y 25 pg.
RESULTADOS
Determinación del porcentaje de alelos tartamudos, intensidad relativa de picos heterocigotos y mezclas
Los picos correspondientes a alelos tartamudos, resultado del deslizamiento de la polimerasa (en inglés, "strand slippage"), habitualmente se traducen en un pico 4 pb menor que el alelo real. Los resultados para cada locus tras el análisis de 162 individuos de origen caucasoide correspondientes a I-DN A 1 y I-DNA2, se recogen en las Tablas 6 y 7 , respectivamente (página siguiente). El menor valor medio se observó en TH01 en ambos casos (4,0 ± 2,1 y 4,3 ± 1 ,6, respectivamente), mientras que el mayor también se observó en ambos casos en D21 S 11 (1 1,4±2,2 y 12,9±2,9, respectivamente). En todos los loci se observa que cuanto mayor es el número de repeticiones de sus alelos mayor es el porcentaje de alelos tartamudos.
Tabla 6: Porcentaje de alelos tartamudos (%) de loci STRs analizados con I-DNAl
Tamaño Desviación
I-DNA1 Media Mediana Mínimo Máximo muestral estándar
CSF1 PO 209 6,3 5,4 2,6 2,7 13,0
D13S317 276 6,2 6,1 2,3 2,0 13,2
D16S539 202 9,4 9,3 1 ,3 6,6 12,6
D18S59 270 8,6 8,5 2,0 5,2 12,7
D19S433 272 8,5 8,4 1 ,4 5,9 12,5
D21S11 240 11 ,4 11 ,2 2,2 7,7 16,9
D3S1358 258 10,1 10,2 1 ,9 6,1 14,1
D5S818 200 5,7 6,7 3,4 5,0 10,9
D7S820 279 7,2 7,0 2,1 2,8 12,4
D8S1179 233 9,2 8,9 2,2 5,2 15,0
FGA 269 8,4 8,4 2,0 3,9 12,9
TH01 254 4,0 3,8 2,1 0,8 11 ,2
TPOX 228 4,2 3,9 1 ,6 1 ,0 9,3 vWA 275 8,7 9,2 3,1 1 ,0 14,6
Tabla 7. Porcentaje de alelos tartamudos de los STR analizados mediante I-DNA2.
Tamaño Desviación
I-DNA2 Media Mediana Mínimo Máximo muestral estándar
CSF1 PO 262 10,6 10,3 2,2 6,9 16,6
D13S317 264 5,6 5,7 1 ,8 2,2 9,4
D18S59 272 8,5 8,3 2,1 4,9 12,7
D21S11 172 12,9 12,6 2,9 7,8 18,2
D2S1338 270 10,8 10,7 2,1 6,6 14,8
D5S818 247 6,8 6,9 1 ,7 3,4 10,8
D7S820 255 7,6 7,6 2,4 3,2 13,7
FGA 243 12,1 12,0 3,0 6,9 17,8
TH01 264 4,3 4,5 1 ,6 1 ,3 7,4
TPOX 263 5,4 4,9 1 ,7 3,2 10,4
Vwa 240 9,4 9,7 2,8 3,0 14,8
El cálculo de la Altura Relativa entre Picos (PHR) ofreció bajos valores de desviación estándar así como valores de mediana muy cercanos a la media en cada uno de los loci analizados en 600 individuos, tanto en I-DNAl como en I-DNA2 (Tablas 8 y 9, respectivamente). En el caso concreto de I-DNAl , todas las medias superan el 80 % con desviaciones estándar comprendidas entre 7,2 y 1 1,4. En general, I-DNAl presenta buen balance de los alelos en heterocigosis. La única excepción es el locus D13S317 se observa una media de 75,8 % con una desviación estándar de 14,8. I-DNA2 también presenta buen balance de los alelos en heterocigosis, ya que muestra bajos valores de desviación estándar (8,6 - 11,6), así como valores de mediana muy cercanos a las correspondientes medias (82,7 - 90,5 %).
Tabla 8: Intensidad relativa entre picos para cada locus STR analizado con I-DNA1
Tamaño
IDNA1 Media Mediana SD* Mínimo Máximo muestral
CSF1 PO 390 84,2 86,3 11 ,4 49,0 100,0
D13S317 437 75,8 77,2 14,8 40,7 99,8
D16S539 429 92,1 94,1 7,2 63,7 100,0
D18S59 473 84,0 85,6 8,5 55,9 100,0
D19S433 430 81 ,7 83,7 8,9 51 ,7 99,6
D21S11 445 85,7 87,4 9,9 49,1 99,6
D3S1358 424 89,1 90,3 7,5 58,8 100,0
D5S818 399 84,2 85,7 10,4 52,7 100,0
D7S820 430 89,2 91 ,0 9,2 58,0 100,0
D8S1179 421 81 ,9 84,1 11 ,2 50,5 99,7
FGA 475 88,0 89,7 8,0 59,8 99,8
TH01 436 90,9 94,6 9,7 57,2 100,0
TPOX 359 88,2 90,6 10,1 54,3 99,9 vWA 457 87,1 88,1 8,3 60,2 99,9
D: desviación estándar
Tabla 9. Intensidad relativa de picos para cada locus STR analizado con I-DNA2.
Tamaño Desviación
I-DNA2 Media Mediana Mínimo Máximo muestral estándar
CSF1 PO 397 88,9 90,7 9,2 57,7 100,0
D13S317 420 83,9 86,2 9,9 54,2 100,0
D18S51 462 87,1 88,6 9,0 52,4 99,8
D21S11 443 85,8 88,2 10,9 52,8 100,0
D2S1338 473 84,6 86,7 10,2 53,2 99,8
D5S818 389 85,9 87,8 8,9 54,8 100,0
D7S820 409 88,7 91 ,0 8,6 60,1 99,9
FGA 461 90,0 94,0 10,0 59,2 100,0
TH01 424 90,5 95,3 10,5 56,7 100,0
TPOX 348 88,2 91 ,8 11 ,6 46,0 100,0 vWA 429 82,7 83,3 10,8 51 ,0 100,0
Los ADNs seleccionados para el ensayo de mezclas fueron elegidos por su elevada heterocigosidad, aunque algunos de los alelos del "minor contributor" residían en las posiciones de alelos tartamudos de los alelos del "mayor contributor" (en una mezcla compuesta por lo ADNs de dos individuos, el "mayor contributor" se refiere al perfil que en mayor proporción se encuentra en la mezcla). El umbral para la distinción entre el "minor contributor" y el alelo tartamudo del "mayor contributor" de cada locus analizado se estableció en una intensidad igual a la media de porcentaje de alelo tartamudo más 3 veces su desviación estándar.
Teniendo en cuenta dicho umbral, en el caso de I-DNA1 se logró genotipar el "minor contributor" a una proporción 1 : 10 en la totalidad de los loci incluidos en esta reacción, con excepción de los loci D19S433 y D7S820 que se lograron genotipar a una proporción 1 :7. El "minor contributor" se logró genotipar hasta proporciones de 1 : 15 en los loci CSFIPO, D5S818 y D8S1179, e incluso a proporciones de 1 :20 en THOl y TPOX.
En el caso de I-DNA2, se logró genotipar el minor contributor a una proporción 1 :7 en la totalidad de los loci incluidos en esta reacción, con la excepción del locus D21S 11 , que se genotipo a una proporción de 1 :5, debido a su elevado porcentaje de stutter y a la presencia del artefacto VIC179. El minor contributor se alcanzó a genotipar hasta una proporción 1 : 10 en D18S51 y D7S820, de 1 : 15 en CSFIPO, FGA y D13S317, e incluso a una proporción 1 :20 en TPOX y TH01.
Sensibilidad
La menor cantidad de ADN que permitió obtener perfiles completos tanto en el caso de I-DNA1 como de I-DNA2 fue 100 pg. Mediante I-DNA1 cantidades superiores a 25 pg de ADN permitieron el análisis de 11 loci STR y amelogenina, mientras que los 3 loci STR restantes (D5S818, D3S1358 y D18S51) presentaron pérdidas alélicas por efectos estocásticos.
Mediante I-DNA2 cantidades superiores a 50 pg de ADN posibilitaron el análisis de 8 loci STR y amelogenina, mientras que, los 3 loci STR restantes (FGA, D21 S I 1 y D2S1338) presentaron pérdidas alélicas por efectos estocásticos. Así mismo, cantidades superiores a 25pg de ADN, permitieron el análisis de 5 loci STR (VWA, TH01, D7S820, D 13 S317 y D5S818) y amelogenina, mientras que el resto de loci STR presentaron pérdidas alélicas por efectos estocásticos, a excepción de FGA que no ofreció resultados a más de 50 RFUs.
Por otro lado, la combinación de I-DNA1 e I-DNA2 a partir de cantidades de 100 pg de ADN totales, mediante la utilización por igual de 50 pg en cada sistema, posibilitó el análisis de 14 loci STRs y amelogenina, 5 de ellos por duplicado (CSF 1PO, vWA, D13S317, TPOX y D7S820). A su vez, cantidades de 50 pg de ADN totales, mediante la utilización por igual de 25 pg en cada sistema, permitió el análisis de 13 loci STRs y amelogenina, 2 de ellos más amelogenina por duplicado (D13S317 y vWA).
Estudio comparativo de las estrategias de diseño de los conjuntos de cebadores de la presente invención respecto a los métodos del estado de la técnica
Como ya se ha explicado en el apartado dedicado a los antecedentes de la invención, el tamaño de los amplicones de un sistema STR multiplex, es crítico para la obtención de perfiles genéticos a partir de muestras biológicas altamente degradadas [Butler, J.M., Y. Shen, y B.R. McCord, 2003. J Forensic Sci, 48(5): 1054-64; Coble, M.D. y J.M. Butler, 2005. J Forensic Sci, 50(1): 43-53].
Las parejas de cebadores de la presente invención, se caracterizan por permitir analizar un alto número de loci STR mediante amplificados de reducido tamaño. En la Tabla 1 1 (página siguiente), se detallan los loci analizados tanto en las STR multiplexes del estado de la técnica como en el método objeto de invención, mediante amplificados que no superen las 200 pb (miniSTRs) o las 300 pb (midiSTRs), así como aquellos mayores de 300 pb (maxiSTRS). Con el fin de evaluar las estrategias de diseño seguidas por las diferentes STRs multiplexes, en cuanto al análisis de loci incluidos en el CODIS a partir de muestras de ADN altamente degradadas, se detallan los loci STRs incluidos en las diferentes bases de datos.
Figure imgf000057_0001
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) Tabla 11. miniSTRs (< 200 pbs), midiSTRs (< 300 pbs) y maxiSTRs (> 300 pbs), en negro, gris y blanco respectivamente, analizados por las principales STRs multiplexes del estado de la técnica así como por las combinaciones de reacciones y aquellas objeto de la presente invención. En este cálculo no se consideran los alelos de alto peso molecular de FGA, por ser altamente infrecuentes, como ha sido demostrado por su ausencia en los 600 individuos analizados en los ejemplos 1 y 2. De izquierda a derecha: Identifiler®, Minifiler™, Powerplex 16, Q8, Bioplex-11, NGM™, Powerplex ESX-17, Powerplex ESI- 17, I-DNA2, I-DNA1 y las combinaciones Powerplex ESX-17+Powerplex ESX-17, Minifiler™ +Identifiler®, Minifiler™+NGM™ y I-DNA1+I-DNA2. Los tamaños de amplificado para Minifiler™ e Identifiler® son aproximados, debido a que los datos exactos no han sido publicados. Se detallan los loci STRs incluidos en el CODIS, ECL, en ambas o en otras bases de datos.
I-DNA1 analiza la totalidad de los STRs incluidos en el CODIS y 9 de 10 de la ECL, así como amelogenina, a partir de fragmentos de ADN que no superen las 300 pb. I-DNA1 destaca por ser el único sistema disponible en la actualidad que permite analizar la totalidad de los loci incluidos en el CODIS mediante amplicones que no superen las 300 pb y al igual que Bioplex-11, analiza 10 loci incluidos en el CODIS mediante amplicones que no superen las 200 pbs. I-DNA2 analiza 10 y 7 de los STRs incluidos en el CODIS, así como amelogenina, a partir de fragmentos de ADN que no superen las 300 y las 200 pbs, respectivamente.
Las combinaciones de STRs multiplexes del estado de la técnica presentan el siguiente rendimiento a partir de fragmentos que no superen las 300 pb: Minifiler™ + Identifiler®, analiza la totalidad del CODIS [Luce, C, et al, 2009. J Forensic Sci, 54(5): 1046-54; Mulero, J.J., et al, 2008. J Forensic Sci, 53(4): 838-52]; Minifiler™+NGM™, analiza 11 loci incluidos en la CODIS [AmpFISTR® NGM™ PCR Amplifícation it User's Guide. Applied Biosystems. 2009]; y PowerPlex® ESX+PowerPlex® ESY, analiza 8 loci incluidos en el CODIS [Hill, C.R., et a/.2010. April 22, Forensic Sci Int Genet]. En este sentido, la combinación de I-DNA1 con I-DNA2, permite analizar 15 loci STR más amelogenina a partir de fragmentos que no superen las 300 pb, e incluye la totalidad de los
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) marcadores/loci del CODIS. Esta combinación presenta un reducido tamaño de amplicones, de tal forma que ha sido específicamente diseñada para posibilitar la amplificación de 13 loci STRs, 12 de ellos incluidos en el CODIS en fragmentos de ADN que no superen las 200 pb. Cabe señalar que la combinación de I-DNA1 con I-DNA2, permite analizar la totalidad de los loci incluidos en el CODIS mediante amplicones que no superen las 229 pbs.
Así mismo, las combinaciones de reacciones han sido diseñadas de forma que puedan permitir el genotipado por duplicado de cierto número de loci. Minifiler™ combinado con NGM™ permite la amplificación por duplicado de 2 loci en formato midiSTR, mientras que combinado con Identifiler® amplía a 4 el número de loci analizados por duplicado en formato midiSTR. Ambas combinaciones permiten únicamente el genotipado por duplicado de amelogenina en fragmentos que no superen las 200 pb. Por otro lado, la combinación de PowerPlex® ESX y ESY, posibilita el análisis por duplicado de 9 loci, 6 incluidos en el CODIS, a partir de fragmentos que no superen las 300 pb y de 4 loci, incluidos en el CODIS y en la ECL, a partir de fragmentos que no superen las 200 pb [Hill, C.R., et a/.2010. April 22, Forensic Sci Int Genet]. La combinación de I-DNA2 con I- DNA1, permite analizar 10 loci STRs más amelogenina por duplicado, todos ellos incluidos en el CODIS, mediante amplicones que no superen las 300 pb y 5 loci STRs en fragmentos que no superen las 200 pb.
Estudio comparativo de la capacidad de análisis de muestras de ADN altamente degradadas de los conjuntos de cebadores de la presente invención respecto a los métodos del estado de la técnica.
El análisis en conjunto de Identifiler® y Minifiler® constituye el sistema de identificación del estado de la técnica que mayor rendimiento presenta en el análisis de loci STRs incluidos en el CODIS, a partir de extractos altamente degradados; (Mulero, J. J., et.al. 2008. J Forensic Sci, 53(4): 838-852 y Luce et al, 2009. J Forensic Sci. 54(5):1046- 54), considerando los loci STRs incluidos en el CODIS. Identifiler®* corresponde al poder de discriminación combinado de los loci STRs D3S1358, D5S818, D8S1179, D19S433, TH01, TPOX y VWA, aquellos de menor tamaño de amplificado en ese sistema de identificación y por tanto los que más probabilidad tendrán de ofrecer resultados en el
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) análisis de extractos de ADN altamente degradados. Minifiler® comprende el análisis de los 8 loci STRs restantes presentes en Identifiler® más amelogenina.
En la Tabla 15 se representa tanto por separado como en combinación, la probabilidad de coincidencia combinada en distintos grupos poblaciones de Identifiler® y Minifiler®, así como de I-DNA1 e I-DNA2.
Tabla 15. Probabilidad de coincidencia combinada de Identifiler®*(sin incluir los loci analizados mediante Minifiler), Minifiler®, I-DNA1 , 1-DNA2 e Identifiler® (Id) ó la combinación entre I-DNA1 + I-DNA2 (ya que incluyen idénticos loci STRs).
Sistemas AfroNativos
americanos Caucasoides americanos Hispanos
Identifiler18* 2,01 E-08 6.10E-08 7.32E-08 1.75E-07
Minifiler® 6.52E-11 8,21 E-11 1.05E-10 2.08E-10
I-DNA2 5.64E-14 1.22E-13 1.74E-13 6.11 E-13
I-DNA1 5.69E-17 1.86E-16 2,01 E-16 8.43E-16
Id /I-DNA1+2 1.31 E-18 5,01 E-18 7.65E-18 3.62E-17
Como se observa en la Tabla 15, los sistemas comparados ordenados en función de su probabilidad de coincidencia, de mayor a menor son: Identifiler®*, Minifiler®, I-DNA2, 1- DNA1. La combinación de I-DNA1+I-DNA2 ofrece la misma probabilidad de coincidencia que Identifiler®, y que la combinación de éste con Minifiler™ debido a que en ambos casos se analizan idénticos loci STRs.
La comparación de la capacidad de análisis de muestras altamente degradadas del sistema objeto de la invención respecto al sistema de mayor rendimiento del estado de la técnica, se realizó mediante el análisis por las 4 reacciones multiplexes, de 10 muestras de ADN procedentes de tejidos incluidos en parafina de autopsias del año 80. Los resultados en cuanto a probabilidad de coincidencia y número de loci STRs de los perfiles obtenidos mediante cada sistema se detallan respectivamente en las Tablas 12 y 13. Se han considerado los alelos que superaban las 40RFUs (Relative Units of Fluorescence). Al no disponer de muestras de referencia se ha tomado como análisis completo de un STR aquellos casos en los que se ha logrado obtener dos alelos para una misma muestra o cuando en todos los resultados obtenidos se ha detectado un único alelo. En el caso de D19S433, debido a que no se han conseguido resultados más que mediante Identifiler®, se han tomado como resultados completos aquellos casos en los que se ha detectado un único
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) alelo, por lo que puede que tanto los resultados para Identifíler®, como aquellos que combinan los resultados obtenidos mediante la combinación de Identifíler® y Minifiler® hayan sido ligeramente sobreestimados respecto al resto de sistemas comparados.
Tabla 12. Probabilidad de coincidencia promedio tras el análisis por diferentes sistemas de identificación de muestras de ADN procedentes de parafina del año 80. 1-DNA1+I-DNA2 DC, se refiere a la probabilidad de coincidencia de aquellos loci analizados por duplicado al combinar I-
DNA1 e I-DNA2.
AfroNativos
Sistemas Caucasoides Hispanos
americanos americanos
Identifíler® 0.018606312 0.025840157 0.021707915 0.025506154
Minifiler® 3.50657E-09 3.19672E-09 4.04664E-09 5.8364E-09
I-DNA2 2.48349E-10 8.20714E-10 1.30969E-09 3.82184E-09 ldentifiler®+Minifiler® 3.46271 E-11 6,55755E-11 8.1612E-11 1.4143E-10
I-DNA1 5.37458E-11 9.90932E-11 1.18376E-10 1.71206E-10
I-DNA1+I-DNA2 1.11032E-15 3.11562E-15 4.73925E-15 1.93533E-14 l-DNA 1 +I-DNA2 DC 0.003101053 0.004306698 0.003617991 0.004251035
Como se observa en la Tabla 12, Identifíler ofrece la mayor probabilidad de coincidencia de los sistemas comparados. Minifiler® a su vez, presenta resultados similares a I-DNA2. La combinación Identifíler® y Minifiler® ofrece una probabilidad de coincidencia similar a la obtenida mediante I-DNA1. Por su parte la combinación I-DNA1 e I-DNA2 ofrecen una probabilidad de coincidencia entre 4 y 7 órdenes de magnitud menor que la obtenida mediante la combinación Identifíler® y Minifiler®, y entre 4 y 5 órdenes de magnitud menor que la obtenida mediante I-DNA1.
Del mismo modo, en cuanto al número de loci STRs analizados (Tabla 13, página siguiente) Identifíler® ofrece los peores resultados entre los sistemas comparados, al permitir tan solo el análisis completo de un promedio de 2,9 loci STRs más amelogenina. Tanto Minifiler®, mediante el cual se obtiene un promedio de 8,4 loci (7,4 loci STRs más amelogenina), como I-DNA2, mediante el cual se obtiene un promedio de 8,9 loci, (8 loci STRs más amelogenina, la que se ha podido genotipar completamente en 6 y parcialmente en 3 de las 10 muestras analizadas) ofrecen resultados similares en cuanto a número de loci analizados.
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) Mediante I-DNAl se obtiene un promedio de 11 loci completos (10 loci STR más amelogenina), lo que constituye un rendimiento superior al resto de sistemas comparados, similar al obtenido mediante la combinación de Identifiler® y Minifíler® sobre las mismas muestras. Por último la combinación I-DNAl e I-DNA2 ofrece los perfiles genéticos más completos, ya que consigue genotipar un promedio de 14 loci (13 loci STR más amelogenina). Además mientras que la combinación Identifiler® y Minifíler® permite genotipar por duplicado únicamente el locus de sexo amelogenina, mediante la combinación I-DNAl e I-DNA2 se obtiene el genotipado por duplicado de 5,8 loci completos (5,4 loci STR más amelogenina en 6 casos de los 10 casos analizados).
Tabla 13. Resumen de resultados obtenidos tras el análisis de 10 muestras de parafina del año 80, mediante I-DNAl, I-DNA2, I-DNAl +I-DNA2, Minifíler®, Identifiler® y Minifiler®+Identifiler®. Los cifras bajo cada sistema de identificación corresponden al n° de loci (entre STRs y amelogenina) C: analizados completamente, P:parcialmente, N:sin resultado, DC (doble chequeo, genotipado por ambos sistemas).
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) TABLA 13
Figure imgf000063_0001
2 9 1 2 11 1 3 14 1 1 6 1 9 0 0 2 1 13 10 1 5 1 0
3 9 0 3 11 1 3 14 1 1 6 0 8 1 0 2 1 13 9 2 5 1 0
4 7 2 3 11 1 3 14 1 1 4 2 8 1 0 4 0 12 11 1 4 1 0
5 9 1 2 12 0 3 15 0 1 6 1 9 0 0 5 0 11 13 0 3 1 0
6 10 0 2 12 0 3 15 0 1 7 0 9 0 0 5 0 11 13 0 12 1 0
7 10 1 1 12 0 3 15 0 1 7 1 7 2 0 3 1 12 9 3 4 1 0
8 10 1 1 10 1 4 13 1 7 1 9 0 0 4 2 10 12 2 2 1 0
9 9 1 2 12 1 2 15 0 1 6 2 8 1 0 4 0 12 11 1 4 1
10 9 2 1 12 0 3 15 0 1 6 2 9 0 0 7 0 9 15 0 1 1 0
PROMEDIO 8.9 1 2.1 11 0.7 3 14 0.5 1.1 5.8 1.2 8.4 0.5 0 3.9 0.5 12 11 1.1 4.5 1 0
DISCUSION
A continuación se discuten los resultados relativos a la validación de I-DNA1, 1-DNA2 y de la combinación de ambos, en los ensayos de determinación del porcentaje de alelos tartamudos, intensidad relativa de picos heterocigotos (PHR), mezclas y sensibilidad. Asi mismo se discuten los resultados obtenidos en los estudios comparativos del método de la invención y de los métodos del estado de la técnica, tanto respecto a la estrategia de diseño como respecto a la capacidad de análisis de loci incluidos en el CODIS a partir de muestras de ADN altamente degradadas.
La estimación de la capacidad analítica de un sistema multiplex requiere valorar su sensibilidad en el análisis de mezclas. Antes de proceder al ensayo de mezclas es necesario evaluar los resultados obtenidos para porcentaje de alelos tartamudos y PHR [Budowle, B., Onorato, A. J., Callaghan, T. F., Della Manna, A., Gross, A. M., Guerrieri, R. A., Luttman, J. C, & McClure, D. L. 2009b. J Forensic Sci. 54(4): 810-821]. Un porcentaje de alelos tartamudos elevado puede conducir a equívocos en la interpretación de mezclas al contundirse con el "minor contributor" [Walsh PS, F.N., Reynolds R., 1996. Nucleic Acids Res, 24(14): 2807-12]. De la misma forma, la variabilidad intermuestra en el porcentaje de alelos tartamudos puede afectar al rendimiento en la resolución de mezclas. Los valores porcentaje de alelos tartamudos de media, mediana, desviación estándar, valores mínimos y máximos del método de la invención, se ajustan a los obtenidos por otros grupos de investigación en la validación de sistemas de identificación como Minifiler® [Mulero, J.J., et ai, 2008. J Forensic Sci, 53(4): 838-52] y genRESMPX-3 [Schlenk, J., et al, 2004. Int J Legal Med, 118(1): 55-61]. En conjunto, los bajos porcentajes de alelos tartamudos obtenidos para I-DNA1 y I-DNA2 ayudan al correcto genotipado de las muestras, así como en la interpretación de mezclas.
Por otro lado los valores de PHR definen el balance existente en la amplificación de heterocigotos. Para I-DNA1 y I-DNA2 se observa una PHR media similar a la reportada para Minifiler™ e Identifiler® (Applied Biosystems, Foster City, CA) (85,86%, 87%, 87,87% y 86,87%, respectivamente). En cuanto a la homogeneidad de PHR en los diferentes loci, I-DNA1 y I-DNA2 muestran valores similares y una menor desviación media estándar que la reportada para Minifiler™ Kit PCR (Applied Biosystems, Foster
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) City, CA) (9,65 y 9,95, frente a 33,47, respectivamente) [Mulero, J.J., et al, 2008. J Forensic Sci, 53(4): 838-52]. No se ha comparado I-DNAl y I-DNA2 con Identifíler® (Applied Biosystems, Foster City, CA) porque no se han reportado datos de desviación estándar.
En el análisis de mezclas, el umbral de detección depende del número de contribuyentes, del perfil genético de los mismos y de la cantidad de ADN total [Schlenk, J., et al, 2004. Int J Legal Med, 118(1): 55-61]. El bajo porcentaje de alelos tartamudos, alto valor de PHR y bajo valor de desviación estándar del mismo, determinan que en mezclas de dos contribuyentes, tanto I-DNAl como I-DNA2 permitan la detección de un "minor contributor" a 1:20. I-DNA2 presenta en los loci FGA, D13S317 y D7S820, una mayor capacidad de análisis de mezclas que I-DNAl, mientras que ésta es inferior en los loci vWA, D21S11 y D5S818.
Por lo tanto, el uso de ambos sistemas sobre una misma mezcla de ADN de dos componentes, incrementa la capacidad de determinación de los perfiles individuales respecto a la obtenida mediante la utilización de un único sistema. Así pues cabe considerar que, tanto I-DNAl como I-DNA2 y en especial la combinación de ambos, presentan características adecuadas tanto para la determinación de los genotipos que componen una mezcla, como para estimar la proporción en la que estos se encuentran.
La sensibilidad de una STR multiplex es determinante en la obtención de perfiles de STRs con la suficiente probabilidad de coincidencia [Budowle, B., A.J. Eisenberg, y A. van Daal, 2009. Croat Med J, 50(3): 207-17]. Por ello en la presente invención, se han perseguido aquellas condiciones experimentales en las que I-DNAl y I-DNA2 ofrecen una alta sensibilidad. Ambas permiten la obtención de perfiles completos a partir de cantidades de ADN de 100 pg, I-DNAl de 14 loci STR más amelogenina y I-DNA2 11 loci STR más amelogenina. I-DNAl incluso posibilita el análisis de 12 loci en muestras con cantidades de ADN en el rango de 25 a 100 pg.
Se ha comparado la sensibilidad de I-DNAl y I-DNA2 con la de otros sistemas multiplex que incluyen al menos los 13 loci STRs del CODIS, tales como PowerPlexl6 system (Promega® Corporation, USA) e Identifíler® (Applied Biosystems, Foster City,
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) CA). Ambos sistemas requieren cantidades mayores de ADN molde que I-DNAl (250 pg) [Collins, P.J., et al, 2004. J Forensic Sci, 49(6): 1265-77; Krenke, B.E., et al, 2002. J Forensic Sci, 47(4): 773-85]. PowerPlex® 16 HS system (Promega® Corporation, USA), posee una sensibilidad superior a I-DNAl y a I-DNA2 al ofrecer perfiles completos a partir de cantidades de ADN superiores a 62,5 pg, aunque por el contrario requiere de amplificados de mayor tamaño para la obtención de un perfil completo, lo que reduce su rendimiento en el análisis de muestras altamente degradadas, como se detalla en el estudio comparativo de las estrategias de diseño (PowerPlex® 16 HS system y PowerPlex® 16 contienen idénticos conjuntos de cebadores).
Otros sistemas multiplex de amplia utilización son genRESMPX-3 (Serac, Homburg, Germany), AmpFISTR Profiler Plus y AmpFISTR Cofiler multiplex Systems (Applied Biosystems, Foster City, CA), que también requieren de cantidades mayores de ADN molde que I-DNAl (120 pg el primero [Schlenk, J., et al, 2004. Int J Legal Med, 118(1): 55-61] y 160 pg el segundo y el tercero [LaFountain MJ, S.M., Svete PA, Walkinshaw MA y Buel E, 2001. J Forensic Sci, 46: 9]).
Los extractos de ADN analizados en laboratorios forenses se caracterizan frecuentemente por contener cantidades muy reducidas de ADN, lo que dificulta la obtención de perfiles genéticos de elevada probabilidad de coincidencia tras su análisis mediante un sistema STR multiplex. En este sentido, la combinación de I-DNAl y I- DNA2 se ha mostrado más eficaz en el análisis de cantidades escasas de ADN, que la utilización de una única STR multiplex.
Así pues, el análisis combinado de I-DNAl y I-DNA2 a partir de 50 pg de ADN repartidos en dos reacciones de 25 pg, permite la obtención de perfiles genéticos de 13 loci STRs y amelogenina, de los cuales D13S317, vWA y amelogenina se genotipan por duplicado. Mientras que el uso de una única reacción, bien I-DNAl ó I-DNA2, a partir de cantidades de 50 pg de ADN, posibilita la amplificación de 11 u 8 loci STRs más amelogenina, respectivamente.
La progresiva mejora de la sensibilidad en el análisis de ADN extremadamente escaso se ha debido principalmente al elevado rendimiento del genotipado LCN (Low Copy
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) Number). Es importante remarcar que el genotipado LCN no muestra la misma fíabilidad que el genotipado convencional y que su aplicación conlleva un mayor riesgo de error y de contaminación [Budowle, B., A.J. Eisenberg, y A. van Daal, 2009. Croat Med J, 50(3): 207-17], por lo que la fíabilidad del genotipado LCN se basa en la realización de varias réplicas de forma que el alelo que haya sido registrado al menos dos veces, sea incorporado a la tabla de resultados [Taberlet, P., et al, 1996. Nucleic Acids Res, 24(16): 3189-94].
En este sentido, el principal inconveniente de las combinaciones de reacciones del estado de la técnica es el reducido número de loci que comparten, tanto en formato midiSTR (< 300 pb) como miniSTR (< 200 pb). Así, Minifiler™ combinado con NGM™ permite la amplificación por duplicado de 3 loci en formato midiSTR, mientras que combinado con Identifiler® amplia a 6 el número de loci analizados por duplicado en formato midiSTR. Ambas combinaciones permiten únicamente el genotipado por duplicado de amelogenina en fragmentos que no superen las 200 pb. La combinación de PowerPlex® ESX y ESY, posibilita el análisis por duplicado de 10 loci, 7 incluidos en el CODIS y en la ECL, en formato midiSTR, y de 3 loci, todos ellos incluidos en el CODIS y en la ECL, en formato miniSTR [Hill, C.R., et a/.2010. April 22, Forensic Sci Int Genet].
La combinación de I-DNA1 con I-DNA2, permite analizar 10 loci STRs más amelogenina por duplicado, todos ellos incluidos en el CODIS, por lo que permite confirmar el perfil genético obtenido a partir de fragmentos de ADN que no superen las 300 pb. Esta cualidad es de especial interés en el análisis de muestras de ADN altamente degradadas y en el genotipado LCN, donde los perfiles pueden presentar una reducida fíabilidad debido a la escasa altura de los picos obtenidos. Así mismo, tanto I-DNA1 y I- DNA2, como la combinación de ambas reacciones, presentan un reducido tamaño de amplicones, de tal forma que han sido específicamente diseñadas para que combinadas posibiliten la amplificación por duplicado de 5 loci STRs, todos incluidos en el CODIS, a partir de fragmentos de ADN no mayores de 200 pb.
Por tanto, en base a la sensibilidad y a los loci midiSTRs y miniSTRs analizados por duplicado, la combinación de I-DNA1 y I-DNA2 constituye una herramienta altamente eficaz para la confirmación de perfiles genéticos obtenidos mediante genotipado LCN, y en especial a partir de muestras altamente degradados cuyos fragmentos de ADN no superen
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) las 300 pb e incluso las 200 pb, lo que sugiere en este apartado un mayor rendimiento global del método de la invención que el del resto de las combinaciones de reacciones del estado de la técnica.
El tamaño de los amplicones de un sistema STR multiplex es crítico para la obtención de perfiles genéticos a partir de muestras biológicas altamente degradadas [Budowle, B., A.J. Eisenberg, y A. van Daal, 2009. Croat Med J, 50(3): 207-17]. Tal y como se observa en el estudio comparativo de estrategias de diseño I-DNA1, 1-DNA2 y la combinación de ambas, han sido específicamente diseñadas para la obtención de perfiles genómicos a partir de fragmentos de ADN de pequeño tamaño.
Las STR multiplexes del estado de la técnica se caracterizan por su incapacidad de analizar el conjunto de loci que constituyen el CODIS, a partir de fragmentos de ADN que no superen las 300 pb. I-DNA1 destaca por ser la única STR multiplex que permite analizar la totalidad de los loci incluidos en el CODIS mediante amplicones que no superen las 300 pb y 10 de ellos mediante amplicones que no superen las 200 pb.
Cabe señalar que Bioplex-11 analiza 8 loci del CODIS mediante amplificados inferiores a 200 pb, si bien para ello marca parte de sus cebadores con biotina lo que posibilita separar los amplificados en dos porciones que son analizadas en electroforesis independientes y por tanto permite incluir un mayor número de loci por reacción de PCR. Por lo tanto se puede afirmar que, I-DNA1 aumenta el número de loci totales y así como de aquellos incluidos en del CODIS analizados a partir de extractos de ADN que no superen las 300 pb e incluso las 200 pb, mediante una única reacción de PCR y una única electroforesis capilar.
Minifiler™ (Applied Biosystems, Foster City, CA) es el sistema de mayor rendimiento en el análisis de STRs del CODIS a partir de muestras de ADN altamente degradadas. En total amplifica 8 STRs más amelogenina, 7 de ellos incluidos en el CODIS, a partir de fragmentos de ADN que no superen las 283 pb y cantidades de ADN de 125 pg, mientras que por debajo de 100 pg suele ofrecer resultados parciales [Mulero, J.J., et al, 2008. J Forensic Sci, 53(4): 838-52]. En comparación, I-DNA1 amplifica 15 loci incluyendo la totalidad del CODIS y I-DNA2 12 loci incluyendo 10 STRs del CODIS, ambas reacciones
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) con un requerimiento de ADN molde 25 pg inferior a Minifiler . Incluso a partir de fragmentos que no superen las 229pb, I-DNA2 es capaz de analizar tantos STRs como la totalidad de los incluidos en Minifiler™ y I-DNA1 analiza 5 STRs más que estas dos reacciones. En síntesis, el reducido tamaño de los amplicones de I-DNA1 y I-DNA2 sumado a su alta sensibilidad, sugieren que la utilidad de estos sistemas al analizar loci STRs incluidos en el CODIS, a partir de muestras de muestras de ADN altamente degradadas y/o escasas, es superior al de los métodos del estado de la técnica.
Así mismo, con la excepción de la combinación Minifiler™ e Identifiler®, las combinaciones de STRs multiplexes del estado de la técnica, no permiten el análisis de la totalidad de los loci incluidos en el CODIS mediante amplicones que no superen las 300 pb, por lo que los perfiles de STRs que proporcionan a partir de extractos de ADN altamente degradados no incluyen los 13 STRs del CODIS y por tanto, no permiten su comparación con la de la totalidad de los loci STRs genotipados en los millones de perfiles genéticos almacenados en dicha base de datos. De este modo, Minifiler™ e Identifiler® constituyen la combinación de reacciones más ampliamente utilizada actualmente en el análisis de muestras degradadas y la que presenta un mayor rendimiento entre las combinaciones del estado de la técnica en cuanto a capacidad de análisis de loci incluidos en el CODIS a partir de este tipo de muestras. Sin embargo, no es posible determinar con exactitud el tamaño mínimo requerido de fragmentos de ADN para analizar la totalidad de loci incluidos en el CODIS mediante el uso combinado de Minifiler™ e Identifiler®, debido a que no han sido publicados y a que los cebadores de estas reacciones utilizan conectores peptídicos que alteran la movilidad electroforética de los amplificados. Según la información gráfica publicada dicho tamaño mínimo es de aproximadamente 255 pb.
La combinación de I-DNA1 y I-DNA2 presenta un reducido tamaño de amplicones, de tal forma que ha sido específicamente diseñada para analizar la totalidad de loci incluidos en el CODIS en fragmentos que no superen las 229 pb, e incluso 13 loci STRs entre los que se incluyen 12 de los 13 del el CODIS (5 de ellos por duplicado) en fragmentos de ADN que no superen las 200 pb. En total, esta combinación analiza 15 loci STR más amelogenina, 10 de ellos más amelogenina por duplicado, a partir de fragmentos que no superen las 300 pb. Por lo tanto, la estrategia de diseño de la presente invención, a falta de poder compararse con el diseño de la combinación Minifiler™ e Identifiler®, supone una
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) mejora respecto al resto de combinaciones de reacciones desarrolladas hasta la fecha, en rendimiento y fiabilidad, en el análisis de loci incluidos en el CODIS a partir de fragmentos de ADN de reducido tamaño.
El análisis comparativo de la capacidad de análisis de muestras de ADN altamente degradadas, consistió en el análisis de muestras de parafina caracterizadas por la elevada fragmentación de su ADN, mediante: I-DNA1, I-DNA2, la combinación de ambas, Identifiler® y Minifiler™, así como de la combinación de estas dos últimas.
Identifiler®, debido al gran tamaño de sus amplificados, presenta los peores resultados de entre todos los sistemas comparados, al analizar 2,9 loci STRs, con una probabilidad de coincidencia de aproximadamente 10"2, por lo que resulta una reacción insuficiente para su uso como herramienta identificativa a partir de ADN altamente degradado. I-DNA2 y Minifiler®, presentan un rendimiento similar, tanto en número de loci analizados (8 STRs y 7,4 STRs, respectivamente), como en cuanto a probabilidad de coincidencia, en ambos casos de aproximadamente 10"9.
I-DNA1, permite el análisis de 10 loci STR más amelogenina con una probabilidad de coincidencia de 10" 10 y por lo tanto, mediante el uso de I-DNA1 y a partir de idénticas muestras, se obtienen los perfiles genéticos de menor probabilidad de coincidencia entre los sistemas comparados. I-DNA1 incluso proporciona perfiles genéticos de menor probabilidad de coincidencia (10"I0-10"n) que los proporcionados por la combinación de Identifiler® y Minifiler® (10"8-10"u) en 3 de los 4 grupos poblacionales, por lo que se puede afirmar que I-DNA1 alcanza un mayor rendimiento que el resto de métodos comparados, en cuanto a capacidad de análisis de loci incluidos en el CODIS a partir de muestras de ADN altamente degradadas.
Así mismo, la combinación I-DNA1 e I-DNA2 ofrece perfiles genéticos más completos que la combinación de Identifiler® y Minifiler®, tanto en número de loci, al analizar 13 loci STR más amelogenina (12 incluidos en el CODIS), respecto a los 10 STRs más amelogenina (8 incluidos en el CODIS), como en probabilidad de coincidencia que alcanza valores de 10"14-10"15, respecto a los 10"8-10"n de la combinación de Identifiler® y Minifiler®.
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) Del mismo modo, en cuanto al genotipado por duplicado de una serie de loci STRs a la combinación I-DNA1+I-DNA2, ofrece un mayor rendimiento que la combinación Minifiler™+Identifiler®, pues mientras que ésta última permite genotipar por duplicado únicamente el locus de sexo amelogenina, la combinación I-DNA1 e I-DNA2 permite el genotipado por duplicado de 5,4 loci STR que proporcionan en sí mismos una probabilidad de coincidencia de 10"3, menor que la obtenidas en el análisis de las muestras de parafína mediante Identifiler®.
En conclusión, los resultados obtenidos en la presente validación tanto en los ensayos de mezclas y sensibilidad, como en los estudios comparativos de estrategias de diseño y de análisis de muestras de ADN altamente degradadas, demuestran que la presente invención, constituye una mejora sustancial respecto al estado de la técnica en cuanto a rendimiento y a fiabilidad en análisis de loci STRs incluidos en el CODIS a partir de muestras de ADN altamente degradadas.
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26)

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un método para obtener el perfil genético de un individuo, para determinar relaciones de parentesco entre individuos o para identificar restos humanos que comprende el análisis de loci STR en un extracto de ADN procedente de dicho individuo o dichos restos humanos mediante, al menos, una reacción de amplificación multiplex, en donde las parejas de cebadores de dicha reacción de amplificación multiplex comprenden
- las parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 (CSF1PO), SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 (FGA), SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 (D18S51), SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 (VWA), SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 (TH01), SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 (D21S11), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 (D7S820), SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 (D2S1338), SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 (D13S317), SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina), y SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 (D5S818), o alternativamente
- las parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 (CSF1PO), SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 (D5S818), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 29 (D7S820), SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 31 (D21S11), SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33 (VWA), SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 35 (D8S1179), SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37 (D19S433), SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 (TH01), SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39 (D16S539), SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 41 (D3S1358), SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43 (D18S51), SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 (D13S317), SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina), y SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 47 (FGA).
2. Método según la reivindicación 1, en donde el análisis de loci STRs comprende, además, una segunda reacción de amplificación multiplex del extracto de ADN procedente de dicho individuo o dichos restos humanos, en donde las parejas de cebadores de dicha segunda reacción de amplificación multiplex comprenden, al menos, una pareja de cebadores caracterizada porque:
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) - amplifica uno de los locus amplificados en la primera reacción de amplificación y
- uno de los cebadores de la pareja presenta una secuencia de nucleótidos distinta de la secuencia de nucleótidos de la pareja de cebadores que en la primera reacción de amplificación amplifica el mismo locus.
3. Método según la reivindicación 2, en donde las parejas de cebadores de la segunda reacción de amplificación multiplex comprenden 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 parejas de cebadores, cada pareja de cebadores caracterizada porque:
- amplifica uno de los locus amplificados en la primera reacción de amplificación y
- uno de los cebadores de la pareja presenta una secuencia de nucleótidos distinta de la secuencia de nucleótidos de la pareja de cebadores que en la primera reacción de amplificación amplifica el mismo locus.
4. Método según la reivindicación 2 ó 3, en donde las parejas de cebadores de la segunda reacción de amplificación multiplex se seleccionan de entre las parejas de oligonucleótidos
- SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 (CSF1PO), SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 47
(FGA), SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43 (D18S51), SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33 (VWA), SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 31 (D21S11), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 29 (D7S820), SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 (D13S317), SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina) y SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 (D5S818), o alternativamente,
- SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 (CSF1PO), SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 (FGA), SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 (D18S51), SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 (VWA), SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 (D21S11), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 (D7S820), SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 (D13S317), SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina) y SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 (D5S818).
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26)
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde la segunda reacción de amplificación multiplex adicionalmente comprende
- al menos 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 de las parejas de cebadores seleccionadas de las parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 (TH01), SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 35 (D8S1179), SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37 (D19S433), SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39 (D16S539), y SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 41 (D3S1358), o alternativamente
- al menos 1, 2 ó 3 de las parejas de cebadores seleccionadas de las parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 (TH01), y SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 (D2S1338).
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la temperatura de fusión de la reacción de amplificación multiplex que comprende los oligonucleótidos SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 24 está comprendida entre 58 y 60°C.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la temperatura de fusión de la reacción de amplificación multiplex que comprende los oligonucleótidos SEQ ID NO: 25 a SEQ ID NO: 47 está comprendida entre 57 y 63 °C.
8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde uno de los oligonucléotidos de cada pareja de cebadores está marcado en uno de sus extremos.
9. Método según la reivindicación 8, en donde los compuestos empleados en el mareaje de los oligonucleótidos seleccionan del grupo que consiste en un radioisótopo, un material fluorescente, digoxigenina y biotina.
10. Método según la reivindicación 9, en donde el material fluorescente se selecciona del grupo que consiste en 5-carboxifluoresceína (5-FAM), 6-FAM, análogo tetraclorinado de t-FAM (TET), análogo hexaclorinado de 6-FAM (HEX), 6- carboxitetrametilrodamina (TAMRA), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxi-4', 5'-
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) dicloro-2', 7'-dimetoxifluoresceína (JOE), NED (ABI), Cy-3, Cy-5, Cy-5.5, fluorescein-6-isotiocinato (FITC) y tetrametilrodamina-5-isotiocinato (TRITC).
11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el extracto de ADN procede de una muestra de sangre, pelo, saliva, epidermis, esperma, caspa, cenizas, una muestra vaginal y una muestra de tejido.
12. Kit que comprende las parejas de cebadores que comprenden
- las parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 (CSF1PO), SEQ
ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 (FGA), SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 (D18S51), SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 (VWA), SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 (TH01), SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 (D21S11), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 (D7S820), SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 (D2S1338), SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 (D13S317), SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina), y SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 (D5S818), o alternativamente,
- las parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 (CSF1PO), SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 (D5S818), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 29 (D7S820), SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 31 (D21S11), SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33 (VWA), SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 35 (D8S1179), SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37 (D19S433), SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 (TH01), SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39 (D16S539), SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 41 (D3S1358), SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43 (D18S51), SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 (D13S317), SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina), y SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 47 (FGA), y opcionalmente, reactivos para llevar a cabo una PCR y/o reactivos para aislar ADN a partir de una muestra biológica.
13. Kit según la reivindicación 12, que comprende adicionalmente, al menos, una pareja de cebadores caracterizada porque:
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) - amplifica uno de los locus amplificados por las parejas de cebadores de la reivindicación 12 y
- uno de los cebadores de la pareja presenta una secuencia de nucleótidos distinta de la secuencia de nucleótidos de las parejas de cebadores de la reivindicación 12 que amplifica el mismo locus.
14. Kit según la reivindicación 13, que comprende, adicionalmente, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 parejas de cebadores, cada pareja de cebadores caracterizada porque
- amplifica uno de los locus amplificados por las parejas de cebadores de la reivindicación 12 y
- uno de los cebadores de la pareja presenta una secuencia de nucleótidos distinta de las secuencias de nucleótidos de la pareja de cebadores de la reivindicación 12 que amplifica el mismo locus.
15. Kit según la reivindicación 13 ó 14, en donde las parejas de cebadores se seleccionan del grupo que consiste en
- las parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 (CSF1PO),
SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 47 (FGA), SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43 (D18S51), SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33 (VWA), SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 31 (D21S11), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 29 (D7S820), SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 (D13S317), SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina) y SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 (D5S818), o alternativamente
- las parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 (CSF1PO), SEQ
ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 (FGA), SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 (D18S51), SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 (VWA), SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 (D21S11), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 (D7S820), SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 (D13S317), SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina) y SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 (D5S818).
16. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 que comprende, adicionalmente,
- al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 de las parejas de cebadores seleccionadas de las parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 11
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) y SEQ ID NO: 12 (TH01), SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 35 (D8S1179), SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37 (D19S433), SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39 (D16S539), y SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 41 (D3S1358), o alternativamente
- al menos 1, 2 o 3 de las parejas de cebadores seleccionadas de las parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 (TH01), y SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 (D2S1338).
17. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, que además, comprende, los reactivos necesarios para marcar las parejas de cebadores.
18. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, en donde uno de los oligonucléotidos de cada pareja de cebadores está marcado en uno de sus extremos.
19. Kit según la reivindicación 17 ó 18, en donde los compuestos empleados en el mareaje de los oligonucleótidos seleccionan del grupo que consiste en un radioisótopo, un material fluorescente, digoxigenina y biotina.
20. Kit según la reivindicación 19, en donde el material fluorescente se selecciona del grupo que consiste en 5-carboxifluoresceína (5-FAM), 6-FAM, análogo tetraclorinado de t-FAM (TET), análogo hexaclorinado de 6-FAM (HEX), 6- carboxitetrametilrodamina (TAMRA), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxi-4', 5'- dicloro-2', 7'-dimetoxifluoresceína (JOE), NED (ABI), Cy-3, Cy-5, Cy-5.5, fluorescein-6-isotiocinato (FITC) y tetrametilrodamina-5-isotiocinato (TRITC).
21. Uso de un kit según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 20 para obtener el perfil genético de un individuo, para determinar relaciones de parentesco entre individuos o para identificar restos humanos.
22. Un conjunto de parejas de cebadores que comprende las parejas de oligonucléotidos SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 (CSF1PO), SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 (FGA), SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 (D18S51),
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 (VWA), SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 (TH01), SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 (D21S11), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 (D7S820), SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 (D2S1338), SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 (D13S317), SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina), y SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 (D5S818).
23. Un conjunto de parejas de cebadores que comprende las parejas de oligonucléotidos SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 (CSF1PO), SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 (D5S818), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 29 (D7S820), SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 31 (D21S11), SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33 (VWA), SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 35 (D8S1179), SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37 (D19S433), SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39 (D16S539), SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 41 (D3S1358), SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43 (D18S51), SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 (D13S317), SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina), y SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 47 (FGA).
24. Un conjunto de parejas de cebadores que comprende las parejas de oligonucléotidos SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 (CSF1PO), SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 (FGA), SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 (D18S51), SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 (VWA), SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 (TH01), SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 (D21S11), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 (D7S820), SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 (D2S1338), SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 (D13S317), SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina), SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 (D5S818), SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 (CSF1PO), SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 (D5S818), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 29 (D7S820), SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 31 (D21S11), SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33 (VWA), SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 35 (D8S1179), SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37 (D19S433), SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39 (D16S539), SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 41 (D3S1358), SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43 (D18S51), SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 (D13S317), SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina), y SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 47 (FGA).
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26)
25. Uso de un conjunto de parejas de cebadores según la reivindicación 22, 23 ó 24 para obtener el perfil genético de un individuo, para determinar relaciones de parentesco entre individuos o para identificar restos humanos.
26. Una pareja de cebadores seleccionada de entre las parejas de oligonucleótidos que consisten en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 (CSF1PO), SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 (FGA), SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (TPOX), SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 (D18S51), SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 (VWA), SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 (TH01), SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 (D21S11), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 (D7S820), SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 (D2S1338), SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 (D13S317), SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina), SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 (D5S818), SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 (CSF1PO), SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 (D5S818), SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 29 (D7S820), SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 31 (D21S11), SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33 (VWA), SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 35 (D8S1179), SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37 (D19S433), SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39 (D16S539), SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 41 (D3S1358), SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43 (D18S51), SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 (D13S317), SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 22 (Amelogenina), y SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 47 (FGA).
27. Uso de una pareja de cebadores según la reivindicación 26 para obtener el perfil genético de un individuo, para determinar relaciones de parentesco entre individuos o para identificar restos humanos.
28. Un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42,
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 47.
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26)
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