CN116103388B - 一种用于着床前胚胎atxn3基因检测的试剂盒、系统和方法 - Google Patents

一种用于着床前胚胎atxn3基因检测的试剂盒、系统和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种实现着床前胚胎ATXN3基因检测的试剂盒、系统和方法，试剂盒包括用于扩增(CAG)n序列的引物对，引物对包括下游引物和荧光基团修饰的上游引物；系统包括：样本预处理装置，用于从外滋养层细胞获得核酸样本；特定核酸序列扩增装置，使用试剂盒对ATXN3基因中包含(CAG)n序列的部分进行扩增；以及判断装置，以便对所述扩增得到的产物进行分析对比，得到n的数值；方法包括：裂解外滋养层细胞获得mRNA，使用mRNA反转录引物进行反转录，然后使用反转录得到的cDNA产物和随机引物进行扩增，得到核酸样本；使用本发明的试剂盒与所述核酸样本进行目标序列的扩增；对扩增得到的产物进行毛细管电泳，然后进行分析，得到n。

Description

一种用于着床前胚胎ATXN3基因检测的试剂盒、系统和方法
技术领域
本发明涉及生物医疗领域，本申请属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于转录组mRNA对着床前胚胎ATXN3基因检测的试剂盒、系统和方法。
背景技术
脊髓小脑共济失调(spinocerebellar ataxias，SCA)是一组存在高度临床异质性和遗传异质性的神经系统退行性疾病，呈常染色体显性遗传。临床上主要表现为慢性进行性加重的小脑共济失调，并可能伴有不同程度眼外肌麻痹、吞咽困难、构音障碍、锥体系和锥体外系症状、周围神经病变和自主神经功能障碍等。SCA的全球发病率约为0.03‰，已发现超过40种亚型，其中共济失调蛋白3(SCA3)，又被称为Machado-Joseph Disease(MJD)，的全球发病率最高，并且也是我国最常见的亚型，占我国所有SCA患者的48-73％。本病目前发病机制尚不清楚，并且临床主要进行对症治疗，尚无有效的治疗药物。因此，对SCA3患者进行遗传学诊断，并在此基础上进行胚胎着床前遗传学诊断，是从出生缺陷一级预防层面降低SCA3发病率，减少患儿的出生，减轻家庭和社会负担的根本措施。
共济失调蛋白3的编码基因ATXN3的10号外显子区域的(CAG)n三核苷酸重复序列异常扩展是导致SCA3的主要原因。ATXN3基因位于14号染色体q32.1区域，包含12个外显子，其中10号外显子存在(CAG)n的动态变化区域。由ATXN3基因编码的共济失调蛋白3是一种重要的去泛素化酶,普遍表达于人体的神经元和非神经元各组织，参与基因转录、蛋白代谢、磷酸化以及自身泛素化水平的调节。对于中国人群的大样本测序研究发现，中国人群正常CAG重复范围是13次至49次，而异常的重复次数范围为52至91次。
目前SCA3成人ATXN3基因检测的样本来源于外周血，提取后可获得几微克基因组DNA，后续采用连接有荧光基团的引物通过PCR结合毛细管电泳的方法进行检测。着床前胚胎中ATXN3基因检测样本是来自于囊胚期胚胎外滋养层活检的细胞。相较于成人通过外周血基因组DNA检测，胚胎活检获得的细胞数量少，获得基因组DNA量在皮克级别，在全基因组扩增过程中存在脱扣的可能，并且ATXN3基因的(CAG)n重复动态变化区为高GC区域，增大了检测的困难性。因此，目前对于胚胎中ATXN3基因的检测主要方法是对全基因组文库构建后进行二代测序，通过男女双方单核苷酸多态性进行家系连锁分析，间接判断胚胎是否携带ATXN3基因变异，对于无遗传家族史的SCA3患者，无法通过家系的连锁分析对胚胎进行间接检测。
目前现有方法尚不能通过对胚胎的ATXN3基因(CAG)n动态重复位点进行直接检测，需要能够对胚胎的ATXN3基因进行检测的方法和试剂盒。
另外，人工授精产生的受精卵的基因检测，一直受到样本量过低的限制，很难开展，要么过于昂贵，例如单细胞测序，要么现有方法无法进行，所以也需要一种廉价、易操作的方法，可以对着床前胚胎进行基因检测的方法和系统。
发明内容
为了解决前述的问题，第一方面，本发明提供一种实现着床前胚胎ATXN3基因检测的试剂盒，其包括用于扩增的引物对，所述引物对包括下游引物和荧光基团修饰的上游引物，
所述上游引物的序列设计成：
位于ATXN3基因的外显子1至9中(CAG)n序列上游的任意位置；
所述下游引物的序列设计成：
位于ATXN3基因的外显子11至12中(CAG)n序列上游的任意位置。
可选地，所述上游引物的序列位于ATXN3基因的外显子9或者跨外显子8和9，所述下游引物的序列位于ATXN3基因的外显子11。
优选地，引物的核苷酸个数为15-25，GC含量在40-60％。
可选地，本发明的试剂盒中，所述引物对为选自以下任一引物对：
第一引物对：
第一上游引物：与SEQ ID No：1具有至少90％或95％序列同一性，SEQ IDNo：1的核苷酸序为GCAAGGTAGTTCCAGAAACA，
第一下游引物：所述下游引物的序列与SEQ ID No：2具有至少90％或95％序列同一性，SEQ ID No：2的核苷酸序列为TCTAAAGACATGGTCACAGC；
第二引物对：
第二上游引物：与SEQ ID No：3具有至少90％或95％序列同一性，SEQ IDNo：3的核苷酸序为TCAGAAGAGCTTCGGAAGAGA，
第二下游引物：与SEQ ID No：4具有至少90％或95％序列同一性，SEQ IDNo：4的核苷酸序列为AGCTGCCTGAAGCATGTC。
优选地，
第一引物对：
第一上游引物：GCAAGGTAGTTCCAGAAACA(SEQ ID No：1)，第一下游引物：TCTAAAGACATGGTCACAGC(SEQ ID No：2)；
第二引物对：
第二上游引物：TCAGAAGAGCTTCGGAAGAGA(SEQ ID No：3)，第二下游引物：AGCTGCCTGAAGCATGTC(SEQ ID No：4)。
可选地，本发明的试剂盒中，所述荧光基团为FAM，FAM是一种具有共轭双键体系结构的化合物，在受到492nm波长的光激发后，可发出518nm的发射波长。
本发明的试剂盒，还可以包括反转录引物。
可选的，所述反转录引物为polyT，对含有PolyA尾的完整mRNA末端起始反转录反应，使mRNA反转成cDNA；
第二方面，本发明提供一种检测着床前胚胎ATXN3基因中(CAG)n序列重复次数n的方法，其包括以下步骤：
裂解外滋养层细胞获得mRNA，使用所述mRNA和反转录引物进行反转录，然后使用所述反转录得到的cDNA产物和随机引物进行扩增，得到核酸样本；
使用本发明的权利要求1至3中任一项所述的试剂盒与所述核酸样本进行目标序列的扩增；
对所述扩增得到的产物进行毛细管电泳，然后进行分析，得到n。
可选地，所述反转录引物是polyT或针对所述ATXN3的反转录引物。
第三方面，本发明提供用于着床前胚胎ATXN3基因检测的系统，其包括：
样本预处理装置，所述样本预处理装置用于从外滋养层细胞获得核酸样本；
特定核酸序列扩增装置，所述特定核酸序列扩增装置与所述核酸提取装置相连，用于使用本发明的试剂盒对ATXN3基因中包含(CAG)n序列的部分进行扩增；
以及
判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便对所述扩增得到的产物进行分析对比，得到n的数值。
进一步地，所述样本预处理装置包括：
细胞裂解单元，所述细胞裂解单元中使得所述外滋养层细胞得到充分裂解，暴露出其中的mRNA；
反转录单元，所述反转录单元与所述细胞裂解单元相连，用于对所述mRNA进行反转录反应，继而获得cDNA；
核酸扩增单元，所述核酸扩增单元中使用随机引物对所述所述cDNA进行扩增，得到所述核酸样本。
进一步地，所述判断装置包括：
毛细管电泳单元，所述毛细管电泳单元用于对所述特定核酸序列扩增装置扩增得到的产物进行毛细电泳，得到电泳数据；
分析单元，所述分析单元对于所述电泳数据进行分析，得到得到n的数值。
优选地，所述分析单元为GeneMarker3.0软件。
第四方面，本发明提供一种从mRNA水平对着床前的胚胎进行目标基因序列检测的方法，其特征在于，包括
S1：裂解外滋养层细胞获得mRNA，使用polyT或针对所述目标基因序列设计的反转录引物进行逆转录，得到cDNA，然后使用随机引物对所述cDNA进行扩增，得到核酸样本；
S2：使用所述核酸样本和针对所述目标基因序列设计的扩增引物对进行扩增，得到经扩增的DNA样本；
S3：对S2的所述DNA样本进行测序和/或毛细管电泳，然后进行数据分析，得出结论。
第五方面，本发明提供一种对着床前的胚胎进行目标基因序列检测的系统，其特征在于，
包括：
测序装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便对所述扩增得到的产物进行测序和序列分析。
样本预处理装置，所述样本预处理装置用于从外滋养层细胞获得核酸样本；
特定核酸序列扩增装置，所述特定核酸序列扩增装置与所述核酸提取装置相连，使用所述核酸样本和针对所述目标基因序列设计的扩增引物对进行扩增，得到经扩增的DNA样本；
以及
判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便对所述扩增得到的DNA样本进行测序和/或毛细管电泳。
进一步地，所述样本预处理装置包括：
细胞裂解单元，所述细胞裂解单元中使得所述外滋养层细胞得到充分裂解，暴露出其中的mRNA；
反转录单元，所述反转录单元与所述细胞裂解单元相连，用于对所述mRNA进行反转录反应，继而获得cDNA；
核酸扩增单元，所述核酸扩增单元中使用随机引物对所述所述cDNA进行扩增，得到所述核酸样本。
进一步地，所述判断装置包括：
毛细管电泳单元，所述毛细管电泳单元用于对所述特定核酸序列扩增装置扩增得到的产物进行毛细电泳，得到电泳数据；
分析单元，所述分析单元对于所述电泳数据进行分析，得到得到n的数值。
或者，所述判断装置包括：测序仪。
本发明的优点至少包括以下：
1、提供了一种稳定、廉价、易操作的对实现着床前胚胎进行基因检测的方法，该方法采用转录组水平的扩增与测序，克服了检测样本数量过低，无法直接进行DNA检测的技术难题，可以对在着床前胚胎中高表达的基因进行检测；
2、解决了现有技术检测胚胎中高重复次数(CAG)n片段的难度过大的障碍，可以对于着床前胚胎(体外)进行检测；
3、可应用于微量的检测样本，解决了全基因组DNA扩增过程中存在脱扣的可能，因为单个细胞的基因组DNA含量约6皮克(皮克级别)，远低于成人通过外周血提取的DNA含量(微克级别)，容易导致脱扣，无法检测；
4、解决无遗传家族史的SCA3患者无法通过家系的连锁分析对胚胎进行间接检测的问题；
5、提供从转录组mRNA水平提供实现着床前胚胎ATXN3基因(CAG)n复杂动态变异检测的试剂盒和系统，提高在着床前胚胎中检测的精准率。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是实施例3的家系胚胎1毛细管电泳峰图；
图2是实施例3的家系胚胎2毛细管电泳峰图；
图3是实施例3的家系胚胎3毛细管电泳峰图；
图4是实施例4的家系胚胎1毛细管电泳峰图；
图5是实施例4的家系胚胎2毛细管电泳峰图；
图6是实施例4的家系胚胎3毛细管电泳峰图；
图7是实施例4的家系胚胎4毛细管电泳峰图；
图8是本发明的第一引物对和第二引物对在ATXN3基因上的位置示意图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明提供了一种试剂盒，其包括荧光基团FAM修饰的上游引物和下游引物，所述上游引物的序列与SEQ ID No：1具有至少90％序列同一性，所述下游引物的序列与SEQ IDNo：2具有至少90％序列同一性；SEQ ID No：1的核苷酸序为GCAAGGTAGTTCCAGAAACA，SEQ IDNo：2的核苷酸序列为TCTAAAGACATGGTCACAGC。
实施例2
本发明还提供了一种试剂盒，其包括荧光基团FAM修饰的上游引物和下游引物，所述上游引物的序列与SEQ ID No：3具有至少90％序列同一性，所述下游引物的序列与SEQID No：4具有至少90％序列同一性；SEQ ID No：3的核苷酸序为TCAGAAGAGCTTCGGAAGAGA，SEQ ID No：4的核苷酸序列为AGCTGCCTGAAGCATGTC。
实施例3
本发明所提供的一种用于着床前胚胎ATXN3基因检测的方法，具体包括以下几个步骤：
S1：裂解活检获得的外滋养层细胞获得mRNA，使用所述mRNA和反转录引物进行反转录，然后使用所述反转录得到的cDNA产物和随机引物进行扩增，得到核酸样本；
S2：使用本发明的试剂盒与前述核酸样本进行目标序列的扩增；
S3：将S2的扩增产物进行毛细管电泳；
S4：分析步骤S3中的数据及计算结果。
在本申请的一个具体实施方式中，步骤S1具体包括如下步骤：
S1-1：胚胎细胞样本的获取及储存：通过单精子注射的方式获得受精卵，对囊胚进行外滋养层细胞活检，获得3-5个细胞的样本。将获得的细胞样本收集于裂解液(由RNA酶抑制剂、Triton X-100、无核酸酶水、dNTP配制而成)，可储存于-80℃冰箱；
S1-2：细胞裂解：充分震荡30-60秒，72℃孵育3分钟使细胞充分裂解；
S1-3：反转录：在裂解后的样本中加入反转录混合液，将转录组mRNA反转录为cDNA。反转录混合液组成包括：SuperScript II逆转录酶、SuperScript II第一链缓冲液(5×)、RNA酶抑制剂、0.1M DTT、甜菜碱Betaine(5M)、MgCl2(1M)。反转录产物置于4℃保存；
S1-4：cDNA的扩增：对S1-3获得的cDNA中加入2×KAPA缓冲液、寡核苷酸随机引物、无核酸酶水，进行PCR扩增。
S1-5：产物纯化：使用0.8×Agencourt AMPure XP Beads(Beckman Coulter)对扩增后获得的产物进行纯化，得到纯度较高的cDNA样本。
S2：步骤S2使用在转录组水平设计2对带有FAM荧光基团的引物对，具体序列如下：
引物对1上游引物的核苷酸序列：(FAM)GCAAGGTAGTTCCAGAAACA
引物对1下游引物的核苷酸序列：TCTAAAGACATGGTCACAGC
引物对2上游引物的核苷酸序列：(FAM)
TCAGAAGAGCTTCGGAAGAGA
引物对2下游引物的核苷酸序列：AGCTGCCTGAAGCATGTC
以S1中获得的纯化后产物cDNA为模板，使用引物对1或引物对2对目标区域进行扩增。PCR体系包括：PCR扩增试剂18μL(包含dNTP、DNA聚合酶、镁离子等)，cDNA模板1-2μL，上下游引物各0.5μL。PCR扩增具体程序如下：98℃2分钟，35个循环(98℃30秒，57℃30秒，72℃45秒)，72℃5分钟，4℃保持。
S3：步骤S3的毛细管电泳具体包括如下步骤：
S3-1：扩增产物稀释：将步骤S3获得的目标区域PCR产物进行稀释；
S3-2：配置混合液：将GS500-LIZ内标与高度去离子甲酰胺(HIDI)按1:90的体积比配置混合液。将混合液与步骤S4-1中的稀释后的扩增产物按照V:V＝9:1的比例混合制成上机混合液；
S3-3：预变性：配置好的上机混合液在PCR仪上运行程序95℃4分钟后，迅速置于冰水混合物中急速冷却5分钟，进行变性处理；
S3-4：毛细管电泳：上机混合液使用ABI 3500xl Dx测序仪进行检测，采用G5颜色分组，在ABI 3500xl Dx测序仪中的分型参数设置具体如下：检测恒温OVEN_Temperature60℃，检测孔温度Detection Cell Temperature 50℃；预电泳电压PreRun_Voltage19.5kV，预电泳时间PreRun_Time 180秒；注入电压Injection_Voltage为1.2kV；注入时间Injection_Time为10秒；第一次读数First_ReadOut_Time 200ms；第二次读数Second_ReadOut_Time 200ms；电泳电压Run_Voltage 19.5kV；突跳步数Voltage_Number_of_steps设置为30步；突跳电压Voltage_steps_Interval设置为15秒；电压容差Voltage_Tolerance设置为0.7kV；日期延迟Data_Delay 1s；电泳时Run_Time 1330秒。
S3-5：数据分析采用GeneMarker3.0软件对分型结果进行判读，分析方法采用该软件默认设置(GS500)。具体数据分析步骤如下：本次PCR反应中使用FAM荧光基团对ATXN3基因进行标记，载入待分析样本PCR扩增体系的电泳数据“show color”选择“blue”；扩增目的片段的侧翼长度为156bp，依据公式计算(CAG)n重复数＝(峰值-156)/3。第一个最高峰所对应的CAG重复数为第一个等位基因，之后如果还有荧光串峰，则选取五指峰中的最高峰所对应的CAG重复数作为第二个等位基因；根据ATXN3基因两个峰所对应的数值，计算其(CAG)n重复数。
实施例4
在一个体外实验中使用实施例1的试剂盒进行实施例3描述的方法：
男方有SCA3家族史，男方及男方母亲被诊断为SCA3。经基因检测男方ATXN3基因(CAG)n重复数为17/71；女方正常，重复数为14/14。男女双方通过单基因病胚胎植入前遗传学检测技术进行SCA3疾病阻断。
1.样本获取：经单精子显微注射后获得受精卵，最终共有3枚受精卵发育至囊胚(对应对的胚胎分别编号1、2、3)，分别对其进行囊胚外滋养层细胞活检，胚胎1收集3个细胞；胚胎2收集3个细胞；胚胎3收集7个细胞，将3个胚胎收集到的细胞样本分别置于裂解液(由RNA酶抑制剂、Triton X-100、无核酸酶水、dNTP配制而成)中，-80℃保存。
2.胚胎细胞样本的裂解、mRNA反转录、cNDA扩增以及纯化
2.1将胚胎1、胚胎2、胚胎3的细胞样本充分震荡30-60秒，然后72℃孵育3分钟，使细胞充分裂解；
2.2反转录：在充分裂解后的3个胚胎样本中加入配好的反转录混合液，将转录组mRNA反转录为cDNA，反转录程序为：25℃5分钟，42℃60分钟，50℃30分钟，70℃10分钟，4℃保存；
2.3cDNA的扩增：在步骤2.2获得3个胚胎样本的cDNA中加入2×KAPA缓冲液、寡核苷酸随机引物、无核酸酶水配成扩增体系。具体PCR程序如下：95℃3分钟，16个循环(98℃20秒，67℃15秒，72℃5分钟)，72℃5分钟，4℃保持。
2.4目标区域扩增：使用步骤2.3中胚胎1、2、3的cDNA的PCR产物为模板，对目标区域进行扩增，PCR混合液成分包括：擎科2×无色Mix、引物对1、反应酶、1-2ul模板。具体PCR程序如下：95℃3分钟，16个循环(98℃20s，67℃15s，72℃5分钟)，72℃5分钟，4℃保持。
2.5使用0.8×Agencourt AMPure XP Beads(Beckman Coulter)对3个胚胎样本cDNA扩增后的产物进行纯化，最终溶解于30μL无核酸酶水中。
3.目标区域PCR扩增
使用本发明的试剂盒中的上游引物(带FAM荧光基团)和下游引物分别对3个胚胎进行目标区域PCR扩增。由PCR缓冲液1、上游引物和下游引物、无核酸酶水、1-2μL模板配成PCR体系，扩增程序为：98℃2分钟，38个循环(98℃30秒，57℃30秒，68℃45秒)，68℃5分钟，4℃保持。
4.毛细管电泳
4.1扩增产物稀释：将步骤3.获得的3个胚胎样本的目标区域PCR产物进行稀释。
4.2配置混合液：将GS500-LIZ内标与高度去离子甲酰胺(HIDI)按1:90的体积比配置混合液。将混合液与步骤S4.1中稀释后的扩增产物按照V:V＝9:1的比例混合制成上机混合液。
4.3预变性：配置好的上机混合液在PCR仪上运行程序95℃4分钟后，迅速置于冰水混合物中急速冷却5分钟，进行变性处理。
4.4毛细管电泳：上机混合液使用ABI 3500xl Dx测序仪进行检测，采用G5颜色分组，在ABI 3500xl Dx测序仪中的分型参数设置具体如下：检测恒温OVEN_Temperature 60℃，检测孔温度Detection Cell Temperature 50℃；预电泳电压PreRun_Voltage 19.5kV，预电泳时间PreRun_Time 180s；注入电压Injection_Voltage为1.2kV；注入时间Injection_Time为10s；第一次读数First_ReadOut_Time 200ms；第二次读数Second_ReadOut_Time 200ms；电泳电压Run_Voltage 19.5kV；突跳步数Voltage_Number_of_steps设置为30步；突跳电压Voltage_steps_Interval设置为15s；电压容差Voltage_Tolerance设置为0.7kV；日期延迟Data_Delay 1s；电泳时Run_Time 1330s。
5.数据分析
数据分析采用GeneMarker3.0软件对3个胚胎的分型结果进行判读，分析方法采用该软件默认设置(GS500)。具体数据分析步骤如下：PCR反应中使用FAM荧光基团对ATXN3基因进行标记，载入待分析样本PCR扩增体系的电泳数据“show color”选择“blue”；胚胎1、2、3的毛细管电泳结果如图1至图3所示。扩增目的片段的侧翼长度为156bp，依据公式计算(CAG)n重复数＝(峰值-156)/3。第一个最高峰所对应的CAG重复数为第一个等位基因，之后如果还有荧光串峰，则选取五指峰中的最高峰所对应的CAG重复数作为第二个等位基因；根据ATXN3基因两个峰所对应的数值，计算(CAG)n重复数如下：胚胎1为13/69，胚胎2为13/69，胚胎3为13/69。胚胎1、2、3均携带ATXN3基因(CAG)n重复数异常致病变异。
实施例5
在又一个体外实验中使用实施例1的试剂盒进行实施例2描述的方法：
男方存在SCA3家族史。男方和男方母亲均诊断为SCA3疾病。男女双方及男方父母均进行了基因检测，提示男方及其母亲均携带ATXN3基因变异。其中男方(CAG)n重复数为26/64次；女方正常，(CAG)n重复数为14/26次。男女双方通过单基因病胚胎植入前遗传学检测技术进行SCA3疾病阻断。
1.样本获取：
经单精子显微注射后获得受精卵，共有4枚受精卵发育至囊胚期(对应对的胚胎分别编号1、2、3、4)进行活检。对其进行囊胚外滋养层细胞活检，胚胎1收集3个细胞；胚胎2收集3个细胞；胚胎3收集5个细胞；胚胎4收集5个细胞。将这4个胚胎收集到的细胞样本分别置于裂解液中，-80℃保存。
2.胚胎细胞样本的裂解、mRNA反转录、cDNA扩增以及纯化
2.1胚胎细胞样本的裂解：将胚胎1、胚胎2、胚胎3、胚胎4的细胞样本充分震荡30-60秒，72℃孵育3分钟，使细胞充分裂解。
2.2反转录：在充分裂解后的4个胚胎样本中分别加入配好的反转录体系，将转录组mRNA反转录为cDNA，具体反转录程序：25℃5分钟，42℃60分钟，50℃30分钟，70℃10分钟，4℃保存。
2.3cDNA的扩增：在步骤2.2中获得的4个胚胎样本cDNA中分别加入PCR反应混合液(由2×KAPA缓冲液、寡核苷酸随机、PCR反应酶配制)进行cDNA的扩增，具体扩增程序如下：95℃3分钟，16个循环(98℃20秒，67℃15秒，72℃5分钟)，72℃5分钟，4℃保持。
2.4cDNA扩增产物纯化：使用0.8×Agencourt AMPure XP Beads磁珠分别对4个胚胎样本cDNA扩增后的产物进行纯化，最终溶解于30μL无核酸酶水中。
3.目标区域PCR扩增
使用本发明的试剂盒中引物对1的上游(带FAM荧光基团)和下游引物分别对4个胚胎进行目标区域PCR扩增。由擎科2×无色Mix、上游和下游引物、无核酸酶水、1-2μL模板配成PCR体系，扩增程序为：98℃2分钟，38个循环(98℃30秒，57℃30秒，68℃45秒)，68℃5分钟，4℃保持。
4.进行毛细管电泳
4.1扩增产物稀释：将步骤3.中4个胚胎样本的PCR产物进行稀释。
4.2配置混合液：将GS500-LIZ内标与高度去离子甲酰胺(HIDI)按1:90的体积比配置内标缓冲液。将内标缓冲液与步骤S4-1中的稀释后的扩增产物按照V:V＝9:1的比例混合制成上机混合液。
4.3预变性：配置好的上机混合液在PCR仪上运行程序95℃4分钟后，迅速置于冰水混合物中急速冷却5分钟，进行变性处理。
4.4毛细管电泳：上机混合液使用ABI 3500xl Dx测序仪进行检测，采用G5颜色分组，在ABI 3500xl Dx测序仪中的分型参数设置具体如下：检测恒温OVEN_Temperature 60℃，检测孔温度Detection Cell Temperature 50℃；预电泳电压PreRun_Voltage 19.5kV，预电泳时间PreRun_Time 180s；注入电压Injection_Voltage为1.2kV；注入时间Injection_Time为10s；第一次读数First_ReadOut_Time 200ms；第二次读数Second_ReadOut_Time 200ms；电泳电压Run_Voltage 19.5kV；突跳步数Voltage_Number_of_steps设置为30步；突跳电压Voltage_steps_Interval设置为15s；电压容差Voltage_Tolerance设置为0.7kV；日期延迟Data_Delay 1s；电泳时Run_Time 1330s。
5.数据分析
数据分析采用GeneMarker3.0软件对4个胚胎的分型结果进行判读，分析方法采用该软件默认设置(GS500)。具体数据分析步骤如下：本次PCR反应中使用FAM荧光基团对ATXN3基因进行标记，载入待分析样本PCR扩增体系的电泳数据“show color”选择“blue”；扩增目的片段的侧翼长度为156bp，依据公式计算(CAG)n重复数＝(峰值-156)/3。胚胎1、2、3、4的毛细管电泳结果分别如图4-7所示。第一个最高峰所对应的CAG重复数为第一个等位基因，之后如果还有荧光串峰，则选取五指峰中的最高峰所对应的(CAG)n重复数作为第二个等位基因；根据ATXN3基因两个峰所对应的数值，计算各胚胎(CAG)n重复数，胚胎1为24/24，胚胎2为24/24，胚胎3为24/62，胚胎4为24/62。结果提示胚胎1和2的ATXN3基因(CAG)n重复区未见异常，胚胎3和4胚胎均携带ATXN3基因(CAG)n重复数异常致病变异。

Claims (5)

1.一种用于着床前胚胎ATXN3基因检测的试剂盒，其特征在于，包括用于扩增(CAG)n序列的引物对，所述引物对包括下游引物和荧光基团修饰的上游引物，所述引物对为选自以下任一引物对：
第一引物对：
第一上游引物：GCAAGGTAGTTCCAGAAACA（SEQ ID No：1），
第一下游引物：TCTAAAGACATGGTCACAGC（SEQ ID No：2）；
第二引物对：
第二上游引物：TCAGAAGAGCTTCGGAAGAGA（SEQ ID No：3），
第二下游引物：AGCTGCCTGAAGCATGTC（SEQ ID No：4）。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光基团为FAM。
3.一种用于着床前胚胎ATXN3基因检测的系统，其特征在于，
包括：
样本预处理装置，所述样本预处理装置用于从外滋养层细胞获得核酸样本；
特定核酸序列扩增装置，所述特定核酸序列扩增装置与所述样本预处理装置相连，用于使用权利要求1或2所述的试剂盒对ATXN3基因中包含(CAG)n序列的部分进行扩增；
以及
判断装置，所述判断装置与所述特定核酸序列扩增装置相连，以便对所述扩增得到的产物进行分析对比，得到n的数值；
其中所述样本预处理装置包括：
细胞裂解单元，所述细胞裂解单元中使得所述外滋养层细胞得到充分裂解，暴露出其中的mRNA；
反转录单元，所述反转录单元与所述细胞裂解单元相连，用于对所述mRNA进行反转录反应，继而获得cDNA；
核酸扩增单元，所述核酸扩增单元中使用随机引物对所述所述cDNA进行扩增，得到所述核酸样本。
4.根据权利要求3所述的系统，其特征在于，所述判断装置包括：
毛细管电泳单元，所述毛细管电泳单元用于对所述特定核酸序列扩增装置扩增得到的产物进行毛细电泳，得到电泳数据；
分析单元，所述分析单元对于所述电泳数据进行分析，得到得到n的数值。
5.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，所述分析单元为GeneMarker3.0软件。
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