CN112626211A - 快速检测alk基因融合突变的引物对、探针、试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及数字PCR技术领域，尤其是指快速检测ALK基因融合突变的引物对、探针、试剂盒及其使用方法，所述引物对和探针根据待测靶标区域设计：所述待测靶标区域的筛选来自ALK基因mRNA断裂位置之前的5'端和之后的3'端的至少二个相邻外显子区域；所述待测靶标区域不含有SNP位点、无重复序列和GC含量为40‑60％；所述引物对和探针地长度范围为10‑30bp，更优选地为15‑25bp，使引物Tm值为40‑70℃，探针Tm值达到60‑75℃。本发明能够准确发现导致ALK基因转录异常的基因融合，而且实验操作简单，检测周期短，性价比高。
Description
技术领域
本发明涉及数字PCR技术领域，尤其是指快速检测ALK基因融合突变的引物对、探针、试剂盒及其使用方法。
背景技术
间变性淋巴瘤激酶(Anaplastic lymphoma kinase,ALK)位于细胞膜上，分为跨膜区、胞外受体区和胞内激酶区，正常情况下经细胞外的配体将2个ALK蛋白偶联后激活胞内信号通路，促进细胞生长。一旦ALK基因发生融合突变后，蛋白可自行激活，胞内酪氨酸激酶呈现高表达活性。在中国非小细胞肺癌(NSCLC)患者中ALK融合突变率约为5.3％。目前已报道的与ALK基因融合的伴侣基因有EML4、KIF5B、TFG、KLC1、PTPN3、HIP1等30多种，其中EML4-ALK融合约占所有ALK融合81％，融合形式发现已有30多种。
尽管通过荧光原位杂交(FISH)、免疫组化(ICH)、逆转录荧光PCR(RT-PCR)和二代测序(NGS)等检测方法，可以实现ALK融合突变的检测，但是这些方法都有不同程度的漏检，有些方法的检测流程复杂。ALK基因主要在人胎儿时期表达，出生后只有神经系统少量表达，而在正常肺组织并不表达，其3'端酪氨酸激酶区可与多个伴侣基因发生融合，使ALK基因的3'端实现高表达。正是基于ALK基因融合后这一表达特点，本发明设计了通过检测ALK基因mRNA的断裂位点之后的3'端表达量与断裂位点之前的5'端表达量的定量差异来检测融合突变。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供快速检测ALK基因融合突变的引物对、探针、试剂盒及其使用方法，能够准确发现导致ALK基因转录异常的基因融合，而且实验操作简单，检测周期短，性价比高。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
快速检测ALK基因融合突变的引物对和探针，所述引物对和探针根据待测靶标区域设计：所述待测靶标区域的筛选来自ALK基因mRNA断裂位置之前的5'端和之后的3'端的至少二个相邻外显子区域；所述待测靶标区域不含有SNP位点、无重复序列和GC含量为40-60％；所述引物对和探针地长度范围为10-30bp，更优选地为15-25bp，使引物Tm值为40-70℃，探针Tm值达到60-75℃。
优选地，ALK基因mRNA断裂位置之前的5'端和之后的3'端外显子区的上游引物和下游引物分别位于待测靶标区域的两端，所述上游引物、下游引物或探针的部分序列跨所述二个相邻外显子拼接区域，使上下游引物之间的待扩增靶标区域至少包括一个所述二个相邻外显子拼接区域；所述ALK基因mRNA断裂位置之前的5'端和之后的3'端外显子区的探针分别用不同的荧光基团进行标记。
优选地，所述ALK基因mRNA断裂位置之后的3'端外显子区的引物对和探针，引物和探针的位置可以在20外显子之后的区域；所述的ALK基因mRNA断裂位置之前的5'端外显子区的引物对和探针，引物和探针的位置可以在20外显子之前的区域；所述ALK基因mRNA断裂位置之后的3'端外显子区的引物和探针，其中ALK基因上游引物位于ALK基因外显子23，下游引物位于ALK基因外显子24，所述探针位于ALK基因外显子23-24拼接区域。
优选地，所述的ALK基因mRNA断裂位置之后的3'端外显子区的上游引物为SEQ IDNO:1 CTGAACAGGACGAACTGGATT；所述ALK基因mRNA断裂位置之后的3'端外显子区的下游引物为SEQ ID NO:2 CATTGTTCGCTGCATTGGG；所述ALK基因mRNA断裂位置之后的3'端外显子区的探针为SEQ ID NO:3 TCATGGAAGCCCTGATCATCAGCA。
优选地，所述ALK基因mRNA断裂位置之后的5'端外显子区的引物和探针，其中ALK基因上游引物位于ALK基因外显子16，下游引物位于ALK基因外显子17，所述探针位于ALK基因外显子16-17拼接区域；所述的ALK基因mRNA断裂位置之后的5'端外显子区的上游引物为SEQ ID NO:4 CCCAGGCCATGAAGAAGT；所述ALK基因mRNA断裂位置之后的5'端外显子区的下游引物为SEQ ID NO:5 CAATGCAGCCTCAAACAATGAC；所述ALKALK基因mRNA断裂位置之后的5'端外显子区的探针为SEQ ID NO:6 CAGGTGGAGGAGGCGGAGGATAT。
根据快速检测ALK基因融合突变的引物对和探针，提供一种试剂盒，试剂盒还包括ddPCR Master Mix。
包括快速检测ALK基因融合突变的引物对和探针的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：获得肿瘤组织RNA样本；
S2：使用上述引物对、探针或试剂盒对RNA样本进行数字PCR反应；
S3：根据所述数字PCR地扩增结果，判读样本是否发生ALK基因融合突变。
优选地，所述判读样本是否发生ALK基因融合突变的标准为：考察3'端拷贝数C3与5'端拷贝数C5的值及其比值R；
当C3和C5中的最小值Min>4时，如果R值大于15或者小于1/15，则ALK融合为阳性，否则融合为阴性；
当C3和C5中的最小值0<Min<＝4，则R大于30或者小于1/30为阳性；
当C3和C5中的最小值min＝0，则C3和C5中的最大值Max(C3，C5)>100为阳性。。
本发明的有益效果：
ALK基因上游引物和下游引物分别位于待扩增靶标区域地两端，所述待扩增靶标区域为ALK基因断裂位置(通常在20外显子处)的3'端后面的RNA区域。除了神经系统少量表达，ALK基因表达量自出生后下降至低水平，在正常肺组织中并不表达，因此，在正常情况下，ALK基因的RNA在肺组织中含量很低，但当其3'端(即酪氨酸激酶区)发生断裂(通常在20外显子处)后，可与多种伴侣发生融合，这些伴侣基因的强启动子使ALK基因的3'端实现高表达。而且只有ALK基因的酪氨酸激酶区发生高表达后，则靶向药物ALK抑制剂对其产生作用，具有较好的治疗效果。因此，通过检测ALK基因断裂位点之后的外显子的表达量，则可以判断ALK基因是否发生融合。即：当ALK基因发生融合时，则断裂点3'端之后的外显子(包括酪氨酸激酶区)发生高表达；而ALK基因未发生融合时，则断裂点3'端之后的外显子(包括酪氨酸激酶区)不发生高表达。所述上游引物、下游引物和/或探针的部分序列跨所述二个相邻外显子拼接区域，使上下游引物之间的待扩增靶标区域至少包括一个所述二个相邻外显子拼接区域；这样将更特异性检测RNA分子，因为在DNA分子中，上述上下游引物之间的待扩增靶标区域至少包括一个所述二个相邻外显子拼接区域的设计方案，将使扩增产物至少包括一个内含子区域(即两个相邻外显子之间就是内含子区域，在RNA转录时该内含子被剪切掉)，这样由于内含子一般都比较长(大于1kb)，因此，其扩增产物很难被扩增出来，这样就可以排除DNA对检测干扰，提高检测的特异性。
本发明的方法不受融合伴侣和融合位点影响，能够准确发现导致ALK基因转录异常的基因融合，同时检测已知和未知融合变异，避免假阴性，而且实验操作简单，检测周期短，性价比高，为靶向药物ALK抑制剂的临床治疗应用提供指导。
附图说明
图1临床样本A的ddPCR扩增结果。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例与附图对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
实施例1
检测样本处理与RNA的提取
1)检测样本包括新鲜肿瘤组织、冰冻切片组织、石蜡包埋组织或切片；
2)对于新鲜肿瘤组织或冰冻切片组织：先要把细胞分散处理，每10-20mg组织加300μL裂解液，用研磨杵将组织彻底研磨；随后向匀浆液中加入590μL无核酶水和10μL蛋白酶K，混匀后56℃处理10-20min，之后离心取上清，按照RNA prep pure Tissue Kit试剂盒(TIANGEN)操作提取总RNA。
3)对于石蜡包埋组织或切片：取2-8张5-10μM厚的切片，迅速置于1.5mL无核酶水的离心管中，加入1mL二甲苯，涡旋振荡混匀，离心后弃上清，然后加入1mL无水乙醇，涡旋振荡混匀，离心后弃上清，沉淀按照FFPE总RNA提取试剂盒操作提取总RNA。
4)最终提取后的RNA洗脱液保存在-80℃条件下，备用实施例2
实施例2
微液滴数字PCR检测ALK融合基因型
1)微液滴数字PCR检测ALK融合基因型过程
用于检测的微液滴数字PCR反应条件如下：配制反转录ddPCR(RT-ddPCR)扩增体系，所用引物探针序列见表1
RT-ddPCR扩增反应混合物包括：1×逆转录酶mix(Bio-Rad)、2×MasterMix预混合液(Bio-Rad)、1×稳定剂(Bio-Rad)、加入引物探针混合液，分别为200-1000nM(ALK-F1，ALK-R1，ALK-F2，ALK-R2)、检测探针各100-800nM(ALK-Pb1，ALK-Pb2)。模板RNA加入1-100ng，补水到30μL，将试剂混匀。
将装有配制好的20μL数字PCR混合液的PCR板、新的96孔PCR板、枪头、微滴发生卡和微滴生成油装入AutoDG自动化微滴发生器(Bio-Rad)，用于制备PCR微反应微滴。
将装有PCR微反应液滴的96孔PCR板用封板膜进行热封，生成的微反应液滴数量为10000～20000个。
将96孔PCR板放入PCR仪按照下面条件进行扩增反应：50℃逆转录15分钟，95℃预变性10分钟；94℃变性30秒，57℃退火/延伸1分钟，共进行40个循环，10℃保持。
PCR扩增反应后的产物进行信号收集和数据分析。通过FAM通道和VIC通道拷贝数比值来检测ALK融合基因型，样本A的具体扩增结果见图1。
2)结果分析
表2 ALK的检测结果
| 样本名称 | 5'端拷贝数(C5) | 3'端拷贝数(C3) | R值(C3/C5) | 判读结果 |
| 临床样本A | 79.5 | 273 | 3.43 | ALK融合阴性 |
| 临床样本B | 21.6 | 332 | 15.37 | ALK融合阳性 |
最后需要说明，上述描述仅为本发明的优选实施例，本领域的技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 杭州求臻医学检验实验室有限公司
<120> 快速检测ALK基因融合突变的引物对、探针、试剂盒及其使用方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
Cys Thr Gly Ala Ala Cys Ala Gly Gly Ala Cys Gly Ala Ala Cys Thr
1 5 10 15
Gly Gly Ala Thr Thr
20
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
Cys Ala Thr Thr Gly Thr Thr Cys Gly Cys Thr Gly Cys Ala Thr Thr
1 5 10 15
Gly Gly Gly
<210> 3
<211> 24
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
Thr Cys Ala Thr Gly Gly Ala Ala Gly Cys Cys Cys Thr Gly Ala Thr
1 5 10 15
Cys Ala Thr Cys Ala Gly Cys Ala
20
<210> 4
<211> 18
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
Cys Cys Cys Ala Gly Gly Cys Cys Ala Thr Gly Ala Ala Gly Ala Ala
1 5 10 15
Gly Thr
<210> 5
<211> 22
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
Cys Ala Ala Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys Ala Ala Ala Cys
1 5 10 15
Ala Ala Thr Gly Ala Cys
20
<210> 6
<211> 23
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 6
Cys Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Cys Gly Gly
1 5 10 15
Ala Gly Gly Ala Thr Ala Thr
20
Claims (8)
1.快速检测ALK基因融合突变的引物对和探针，其特征在于：所述引物对和探针根据待测靶标区域设计：
所述待测靶标区域的筛选来自ALK基因mRNA断裂位置之前的5'端和之后的3'端的至少二个相邻外显子区域；所述待测靶标区域不含有SNP位点、无重复序列和GC含量为40-60％；所述引物对和探针地长度范围为10-30bp，更优选地为15-25bp，使引物Tm值为40-70℃，探针Tm值达到60-75℃。
2.根据权利要求1所述的快速检测ALK基因融合突变的引物对、探针、试剂盒及其使用方法，其特征在于：ALK基因mRNA断裂位置之前的5'端和之后的3'端外显子区的上游引物和下游引物分别位于待测靶标区域的两端，所述上游引物、下游引物或探针的部分序列跨所述二个相邻外显子拼接区域，使上下游引物之间的待扩增靶标区域至少包括一个所述二个相邻外显子拼接区域；所述ALK基因mRNA断裂位置之前的5'端和之后的3'端外显子区的探针分别用不同的荧光基团进行标记。
3.根据权利要求1所述的快速检测ALK基因融合突变的引物对和探针，其特征在于：所述ALK基因mRNA断裂位置之后的3'端外显子区的引物对和探针，引物和探针的位置可以在20外显子之后的区域；所述的ALK基因mRNA断裂位置之前的5'端外显子区的引物对和探针，引物和探针的位置可以在20外显子之前的区域；所述ALK基因mRNA断裂位置之后的3'端外显子区的引物和探针，其中ALK基因上游引物位于ALK基因外显子23，下游引物位于ALK基因外显子24，所述探针位于ALK基因外显子23-24拼接区域。
4.根据权利要求1所述的快速检测ALK基因融合突变的引物对和探针，其特征在于：所述的ALK基因mRNA断裂位置之后的3'端外显子区的上游引物为SEQ ID NO:1CTGAACAGGACGAACTGGATT；所述ALK基因mRNA断裂位置之后的3'端外显子区的下游引物为SEQ ID NO:2CATTGTTCGCTGCATTGGG；所述ALK基因mRNA断裂位置之后的3'端外显子区的探针为SEQ ID NO:3TCATGGAAGCCCTGATCATCAGCA。
5.根据权利要求1所述的快速检测ALK基因融合突变的引物对和探针，其特征在于：所述ALK基因mRNA断裂位置之后的5'端外显子区的引物和探针，其中ALK基因上游引物位于ALK基因外显子16，下游引物位于ALK基因外显子17，所述探针位于ALK基因外显子16-17拼接区域；所述的ALK基因mRNA断裂位置之后的5'端外显子区的上游引物为SEQ ID NO:4CCCAGGCCATGAAGAAGT；所述ALK基因mRNA断裂位置之后的5'端外显子区的下游引物为SEQID NO:5CAATGCAGCCTCAAACAATGAC；所述ALKALK基因mRNA断裂位置之后的5'端外显子区的探针为SEQ ID NO:6CAGGTGGAGGAGGCGGAGGATAT。
6.根据权利要求1-5所述的快速检测ALK基因融合突变的引物对和探针，提供一种试剂盒，其特征在于：试剂盒还包括ddPCR Master Mix。
7.根据权利要求1-6所述的包括快速检测ALK基因融合突变的引物对和探针的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：获得肿瘤组织RNA样本；
S2：使用上述引物对、探针或试剂盒对RNA样本进行数字PCR反应；
S3：根据所述数字PCR地扩增结果，判读样本是否发生ALK基因融合突变。
8.根据权利要求7所述的包括快速检测ALK基因融合突变的引物对和探针的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述判读样本是否发生ALK基因融合突变的标准为：考察3'端拷贝数C3与5'端拷贝数C5的值及其比值R；
当C3和C5中的最小值Min>4时，如果R值大于15或者小于1/15，则ALK融合为阳性，否则融合为阴性；
当C3和C5中的最小值0<Min<＝4，则R大于30或者小于1/30为阳性；
当C3和C5中的最小值min＝0，则C3和C5中的最大值Max(C3，C5)>100为阳性。
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