CN115927564B - 一种检测生物样本中基因融合的引物组合、试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测生物样本中基因融合的引物组合、试剂盒及方法，属于基因组学技术领域。所述引物组合包括靶向至少一种目标基因的靶向引物组合，所述目标基因包括ALK、ROS1、RET、NTRK1、NTRK2和NTRK3。利用本发明的引物组合，能够解决探针捕获法精度不高、分析准确性较低的问题。并且利用本发明的引物组合、试剂盒和方法，可以用于检测未知融合基因。

Description

一种检测生物样本中基因融合的引物组合、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于基因组学技术领域，具体地，涉及一种检测生物样本中基因融合的引物组合、试剂盒及方法。

背景技术

融合基因，是指将两个或多个基因的编码区首尾相连，置于同一套调控序列(包括启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子等)控制之下，构成的嵌合基因。融合基因是肿瘤产生的重要原因，实体瘤中最常见融合基因是酪氨酸激酶(如ALK、ROS1和RET等)，融合突变导致下游细胞信号通路激活，细胞无限增殖。融合基因检测，目前主要检测方法包括荧光原位杂交(FISH)、聚合酶链反应(PCR)、免疫组化(IHC)和高通量测序(NGS)等几种方法，从DNA、RNA和蛋白质等水平进行检测。现阶段基于NGS检测的方法有两种：

1、基于DNA层面，使用探针捕获方法获得融合基因序列，可以检测未知融合类型，但是存在以下技术难点：

1)融合基因检测要覆盖非常冗长且含有大量重复序列的内含子区域才能准确地找到融合断裂点；2)高GC含量不利于探针有效捕获目标区域片断；3)不同基因的内含子含有非常相似的重复序列，这一特征不利于序列准确对比，影响检测准确性；4)复杂的转录或转录后的剪接加工过程，可能会影响基因的融合。

2、基于RNA层面，使用多重聚合酶链式反应(PCR)方法扩增靶向融合基因，但是无法检测未知融合基因，某些融合基因的伙伴基因较多，发生频率较为一致，多重PCR方法难以完全覆盖。

发明内容

为了解决上述技术问题中的至少一个，本发明采用的技术方案如下：

本发明第一方面提供一种检测生物样本中基因融合的引物组合，包括靶向至少一种目标基因的靶向引物组合，靶向引物包括基因靶向区域序列，所述基因靶向区域序列的设计原则为：

(1)基因靶向序列设计在融合基因断点30～100bp区域内；

(2)基因靶向区域长度为15-30nt，Tm值为60-70之间，GC含量为35～65％；

(3)基因靶向区域不会与非靶向区域结合，不存在稳定的二级结构。

在本发明中，基因融合是指一个基因在某一点上异常断裂，与另一个基因融合，形成一个由两个原本相距遥远的基因组成的杂交基因。基因融合也被称为基因重排，即基因在染色体上的排列顺序发生变化。

在本发明的一些实施方案中，所述目标基因包括ALK、ROS1、RET、NTRK1、NTRK2和NTRK3。

ALK是一种受体酪氨酸激酶，属于胰岛素受体超家族。人ALK基因位于2号染色体p23.2-p23.1，编码1620个氨基酸，经过翻译后修饰生成200～220kDa的成熟ALK蛋白。ALK在神经系统的发育和功能中扮演重要角色，在小肠、睾丸、前列腺及结肠中也有表达，但其在正常淋巴组织、肺及其他组织中不表达。ALK基因融合是指ALK发生断裂并与其他基因融合，翻译后ALK融合蛋白构象改变，影响自身磷酸化，而导致肿瘤的发生。

任选地，靶向ALK的基因靶向区域序列选自SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所中的至少一种，优选地为两种，分别靶向ALK的20和6号外显子。

ROS1属于胰岛素受体家族的一种单体型受体酪氨酸激酶。其在人类中的生物学作用尚未明确，仍然是一个“孤儿”受体酪氨酸激酶，目前尚未找到已知的配体。ROS1基因最初是于1986年在鸟肉瘤病毒(UR2)发现的具有独特致癌作用的基因序列。2007年科学家首次在非小细胞肺癌(NSCLC)中发现ROS1基因重排，并在卵巢癌、胃癌、大肠癌等恶性肿瘤中也同样观察到该靶点基因融合现象。

任选地，靶向ROS1的基因靶向区域序列选自SEQ ID No.8～SEQ ID No.12中的至少一种，优选地，为5种，分别靶向ROS1的32、34、35和36号外显子。

RET(Rearranged during Transfection)基因定位于第10号染色体长臂(10q11.21)，其DNA全长约为60Kb，含有21个外显子，其编码的RET蛋白属于受体酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinase，RTK)蛋白家族，是由1143个跨膜氨基酸残基构成的蛋白聚合体，具有RTK的经典结构：一个富含半胱氨酸的钙粘连素样细胞外区、一个跨膜区和一个具有催化酪氨酸激酶作用的细胞内区。RET融合均为体细胞融合，至今未发现胚系RET融合。不同的染色体间易位或染色体内倒位、串联重复或中间缺失可导致基因融合。RET原癌基因能与多种基因发生融合，常以本身断裂再与另一基因接合的方式，导致RET的激酶结构域编码区的3’端与多种异源上游伴侣基因的5’端发生融合，重组成一个新的基因(融合基因)。

任选地，靶向RET的基因靶向区域序列选自SEQ ID No.13～SEQ ID No.15中的至少一种；优选地，为3种，分别靶向RET的11、12和7号外显子。

TRK(tropomyosin-related kinase，原肌球蛋白相关激酶)蛋白是一类神经生长因子受体，属于酪氨酸激酶，TRK家族共包含3个高度同源的蛋白——TRKA、TRKB、TRKC，这三个蛋白分别由NTRK1、NTRK2和NTRK3基因编码。TRK与细胞增殖、分化、代谢、凋亡等密切相关。

任选地，靶向NTRK1的基因靶向区域序列选自SEQ ID No.16～SEQ ID No.18中的至少一种；优选地，为3种，分别靶向NTRK1的9、10和4号外显子。

任选地，靶向NTRK2的基因靶向区域序列选自SEQ ID No.19和SEQ ID No.20中的至少一种；优选地，为2种，分别靶向NTRK2的13和16号外显子。

任选地，靶向NTRK3的基因靶向区域序列选自SEQ ID No.21和SEQ ID No.22中的至少一种；优选地，为2种，分别靶向NTRK3的4和6号外显子。

进一步地，所述目标基因还包括TBP和/或HMBS。TBP和HMBS为内参基因。

更进一步地，靶向TBP的基因靶向区域序列如SEQ ID No.23所示；靶向HMBS的基因靶向区域序列如SEQ ID No.24所示。

在本发明的一些实施方案中，所述靶向引物还包括通用区域序列，所述靶向引物由所述通用区域序列和所述基因靶向区域序列按5'-3'顺序连接，其中，所述通用区域序列如SEQ ID No.5所示。

本发明第二方面提供一种检测生物样本中基因融合的试剂盒，包括本发明第一方面任一所述的引物组合。

在本发明的一些方案中，所述试剂盒还包括第一扩增引物、第二扩增引物、第一接头引物和第二接头引物，所述第一扩增引物、第二扩增引物、第一接头引物和第二接头引物的序列分别如SEQ ID No.1～SEQ ID No.4所示。

当试剂盒中包括第一扩增引物、第二扩增引物、第一接头引物和第二接头引物时，基因靶向区域在设计时还不能与第一扩增引物、第二扩增引物、第一接头引物或第二接头引物形成稳定的二级结构。

本发明第三方面提供一种基于高通量测序检测生物样本中基因融合的方法，包括以下步骤：

S1，获得所述生物样本的RNA样本并进行片段化处理，然后进行反转录得到cDNA；

S2，cDNA产物进行二链合成，末端修复，利用第一接头引物和第二接头引物添加接头；

S3，利用本发明第一方面包括通用区域序列的引物组合和第一扩增引物对连接产物进行第一PCR扩增，得到第一PCR扩增产物；

S4，利用第一扩增引物和第二扩增引物对所述第一PCR扩增产物进行第二PCR扩增，纯化后得到第二PCR产物，即为测序文库；

S5，对步骤S4所述的测序文库进行高通量测序，根据测序结果判断是否存在基因融合，

所述第一扩增引物、第二扩增引物、第一接头引物和第二接头引物分别如SEQ IDNo.1～SEQ ID No.4所示。

在本发明的一些实施方案中，步骤S2中，将第一接头引物和第二接头引物按1：1混合得到接头混合溶液，按下表体系进行反应配制：

名称	体积(μL)
		二链合成产物	60
连接缓冲液	30
		连接酶	5
接头混合溶液	1
		无核酸酶水	4

接头连接反应程序：20℃15分钟，4℃保持。

在本发明的一些实施方案中，步骤S3中，所述第一PCR扩增反应体系如下表：

第一PCR扩增反应程序为：98℃5分钟；98℃10秒，60℃4分钟，72℃30秒，15个循环；72℃5分钟，4℃保持。得到第一PCR扩增产物。

在本发明的一些实施方案中，步骤S4中，所述第二PCR扩增按下表进行反应体系配制：

名称	体积(μL)
		第一PCR扩增产物	27
第一扩增引物	1.5
		第二扩增引物	1.5

第二PCR扩增的反应程序为：98℃2分钟；98℃10秒，60℃30秒，72℃30秒，15个循环；72℃5分钟，4℃保持。

在本发明的一些实施方案中，步骤S6中，利用比对软件对测序数据进行分析，得到比对基因位置、基因融合、支持数信息，根据支持数信息进行判定，若大于预设阈值，则判定为基因融合。

在本发明的一些实施方案中，所述方法为非诊断和治疗目的的。

本发明的有益效果

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

利用本发明的引物组合，解决了探针捕获法的精度不高，分析准确性较低的问题。

利用本发明的引物组合、试剂盒和方法，可以用于检测未知融合基因。

具体实施方式

除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的相关术语的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。

本申请中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数(例如1.1，1.5等)的范围，则适当地将1个单位看作0.0001，0.001，0.01或者0.1。对于包含小于10(例如1到5)的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本申请中。

术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本申请中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本申请中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，出来对操作性能所必要的那些，术语“基本上由……组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由……组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均按照《分子克隆实验指南》(第四版)(J.萨姆布鲁克、M.R.格林，2017)一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。其他实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1引物设计

本实施例针对临床上癌症病人发生的融合基因(包括ALK、ROS1、RET、NTR K1、NTRK2和NTRK3融合基因)以及2个内参基因TBP、HMBS设计引物，对20例非小细胞肺癌样本进行融合检测。

本实施设计的引物按功能区分可分为三类，分别为靶向引物、扩增引物和接头引物。

扩增引物、接头引物取自Illumina公布的的文档(Illumina Adaptor Sequencer，文档编号#1000000002694)。扩增引物和接头引物序列分别如下(5'-3')：

扩增引物1：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID No.1)

扩增引物2：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA(SEQ ID No.2)

接头引物1：GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC(SEQ ID No.3)

接头引物2：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID No.4)

靶向引物由通用区域和基因靶向区域组成。

其中，通用区域序列为：CCTTGGCACCCGAGAATTCCA(SEQ ID No.5)。

基因靶向区域序列设计原则：

(4)获取融合基因靶向序列，靶向引物区域需设计在融合断点30～100bp区域内；

(5)基因靶向区域长度控制在15-30nt，Tm值控制在60-70之间，GC含量在35～65％。

(6)基因靶向区域结合特异性评估后需满足不存在非靶向区域，不存在稳定的二级结构。

(7)基因靶向区域不能与接头引物、扩增引物形成稳定的二级结构。

依据基因靶向区域序列设计筛选原则，得到以下引物用于测试：

根据通过通用区域序列和基因靶向区域序列，合成得到靶向引物，靶向引物组合可以制备成用于检测融合基因的试剂盒。

实施例2基于NGS检测融合基因的文库构建

具体操作步骤如下：

(1)反转录

取8.5μL体积质量为100ng的总RNA，加入8.5μL2×Frag/Prime Buffer，85℃放置8分钟后冰上放置，此为片段化产物。

利用RNA建库试剂盒(翊圣生物、12301ES96)按下表体系进行反转录：

名称	体积(μL)
		反转录缓冲液	6
反转录酶	2
		片段化产物	17

反转录的条件为：25℃保持10分钟；42℃保持30分钟；然后升温至70℃保持15分钟；最后4℃保温。得到的cDNA进行2链合成。

(2)二链合成

利用RNA建库试剂盒(翊圣生物、12301ES96)按下表进行反应体系配制：

名称	体积(μL)
		二链合成缓冲液	30
二链合成酶	5
		反转录产物	25

二链合成的条件为：16℃保持30分钟；然后升温至72℃保持15分钟；最后4℃保温。2链合成产物用于添加接头。

(3)添加接头引物

接头引物1、接头引物2引物浓度为15μM。两者按1:1进行混合得到接头混合溶液。

按下表体系进行反应配制：

名称	体积(μL)
		二链合成产物	60
连接缓冲液	30
		连接酶	5
接头混合溶液	1
		无核酸酶水	4

接头连接反应程序：20℃15分钟，4℃保持。

(4)PCR扩增

将上述接头连接后的产物进行磁珠纯化。

使用靶向引物、扩增引物进行PCR反应，引物浓度范围为100nM，靶向引物进行等比例混合得到，扩增引物使用扩增引物1。

反应体系如下表：

名称	体积(μL)
		PCR扩增缓冲液	15
靶向引物混合溶液	1
		扩增引物1	1
接头连接纯化产物	10

PCR反应程序为：98℃5分钟；98℃10秒，60℃4分钟，72℃30秒，15个循环；72℃5分钟，4℃保持。得到特异性扩增产物。

(8)扩增产物放大PCR

对特异性扩增产物进行产物放大扩增，需要使用扩增引物1和扩增引物2，引物浓度为15μM。

按下表进行反应体系配制：

名称	体积(μL)
		特异性扩增产物	27
扩增引物1	1.5
		扩增引物2	1.5

PCR反应程序为：98℃2分钟；98℃10秒，60℃30秒，72℃30秒，15个循环；72℃5分钟，4℃保持。

对扩增产物进行磁珠纯化，然后进行文库定量。

实施例3文库测序

文库进行上机测序，测序数据使用比对软件进行分析，得到基因坐标、融合形式及支持数。若发生融合，需要满足支持数＞20条。

分析结果如下：

结果表明，利用实施例1的靶向引物组合可检出常见融合基因如，EML4-ALK E13:A20、EML4-ALK E6:A20、EML4-ALK E18:A20，也可检出未知型如EML4-ALK E21:A20、HIPI-ALK E28:A20。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (2)

1. 一种非诊断目的的基于高通量测序检测生物样本中基因融合的方法，其特征在于，所述基因融合为EML4-ALK E21:A20或HIPI-ALK E28:A20，所述方法包括以下步骤：

S1，获得所述生物样本的RNA样本并进行片段化处理，然后进行反转录得到cDNA；

S2，cDNA产物进行二链合成，末端修复，利用第一接头引物和第二接头引物添加接头；

S3，利用靶向目标基因的靶向引物组合和第一PCR扩增引物对连接产物进行第一PCR扩增，得到第一PCR扩增产物；

S4，利用第一扩增引物和第二扩增引物对所述第一PCR扩增产物进行第二PCR扩增，纯化后得到第二PCR产物，即为测序文库；

S5，对步骤S4所述的测序文库进行高通量测序，根据测序结果判断是否存在基因融合，

其中，所述靶向引物包括基因靶向区域序列和通用区域序列，所述靶向引物由所述通用区域序列和所述基因靶向区域序列按5'-3'顺序连接，所述通用区域序列如SEQ ID No.5所示；靶向ALK基因的基因靶向区域序列靶向ALK基因的第20号外显子，靶向EML4基因的基因靶向区域序列靶向EML4基因的第21号外显子，靶向HIPI基因的基因靶向区域序列靶向HIPI基因的第28号外显子，所述第一扩增引物、第二扩增引物、第一接头引物和第二接头引物的序列分别如SEQ ID No. 1~SEQ ID No. 4所示，靶向ALK基因的基因靶向区域序列如SEQ ID No. 6所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S6中，利用比对软件对测序数据进行分析，得到比对基因位置、基因融合、支持数信息，根据支持数信息进行判定，若大于预设阈值，则判定为基因融合。