CN110863049A - 一种检测dna错配修复通路有效性的探针库、检测方法和试剂盒 - Google Patents
一种检测dna错配修复通路有效性的探针库、检测方法和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种检测DNA错配修复通路有效性的探针库、检测方法和试剂盒，所述探针库由SEQ ID NO.1～140所示探针组成，将该探针库制备成检测试剂盒可用于与DNA错配修复通路相关的基因的检测。使用该探针库对待分析的目标DNA片段进行富集，然后再对富集后的DNA片段通过测序手段进行测序，从而实现对基因检测的有效性。与DNA错配修复通路相关的基因可用于预测肿瘤发生的倾向性、评估肿瘤恶性程度和临床预后、指导新药筛选与研发，因此，本发明对基因功能性的研究方向起到重要的指导意义。
Description
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种检测DNA错配修复通路有效性的探针库、检测方法和试剂盒。
背景技术
DNA一直受到多种内源性及外源性损伤物质的威胁，异常的DNA损伤修复通路与肿瘤发生倾向性及诱导DNA损伤类抗肿瘤药物对细胞的敏感性关系密切。DNA错配修复通路主要修复DNA复制过程中DNA聚合酶校正失误造成的DNA碱基错配，以及核苷酸类化疗药物造成的DNA损伤，是DNA修复机制中最重要的途径之一。修复过程起始于MSH2/MSH6或MSH2/MSH3异源二聚体组成的MutSα或MutSβ复合体结合到错配位点。其中MutSα复合体识别单碱基错配或1-2个核苷酸的插入/删除错误，而MutSβ复合体识别大片段的插入/删除错误。MutS复合体结合到DNA上后发生结构变化并招募MLH1/PMS2或MLH1//PMS1或MLH1/PMS3异源二聚体组成的MutLα或MutLβ或MutLγ复合体。MutS-MutL复合体可以在DNA上左右滑动搜寻DNA断裂处（比如冈崎片段之间形成的缺口或前导链中PMS2诱导形成缺刻），当遇到DNA断裂处后，外切酶EXO1被招募到断裂处开始进行核苷酸剪切直至切掉错配核苷酸为止。EXO1剪切造成的DNA单链由RPA封闭，然后招募DNA复制聚合酶进行缺口填补以及DNA连接酶的缺刻缝合，最终完成损伤修复过程。整个错配修复过程各修复蛋白质分工明细，高度协调，如果过程中某个参与蛋白质发生突变或缺失，则影响修复效率及效果。
合成致死（Synthetic Lethality）的策略近年来在肿瘤的研究中得到广泛应用。合成致死在肿瘤研究中的概念为：当将两个不在同一修复通路中的重要基因的功能抑制掉其中之一时，细胞不会致死，但是将这两个基因的功能都抑制掉后，细胞死亡。在临床上，如果肿瘤细胞中存在其中之一的突变，而正常细胞中该基因正常，我们可以将另外一个基因作为靶点，并将其功能抑制住，达到特异性杀死肿瘤细胞，个体化治疗的目的。
前期研究发现，DNA错配修复通路参与的基因发生胚系遗传突变、特异组织中体细胞突变不仅与直肠癌等肿瘤的发生、治疗效果高度相关，也与神经退行性疾病等非肿瘤疾病的发生存在因果关系。具体来讲，当DNA错配修复系统失效后（MSH2或MLH1等发生突变），细胞中DNA发生突变的几率增加上千倍，并导致微卫星序列不稳定，进而造成林奇综合征（一种遗传学结直肠癌）及遗传性非息肉病性结直肠癌；另外，DNA错配修复系统失效后肿瘤细胞对TMZ、顺铂及核苷酸类似物等化疗药物产生耐药。除此之外，DNA错配修复系统与神经退行性疾病三核苷酸重复序列的延伸也有着紧密联系。因此，DNA错配修复通路参与基因的突变导致修复有效性的改变（减弱或缺失），最终对肿瘤、神经退行性疾病的发生、预后、治疗策略的制定都具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测DNA错配修复通路有效性的探针库、检测方法和试剂盒。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种用于检测DNA错配修复通路有效性的试剂盒，所述的试剂盒包括针对与DNA错配修复通路相关基因的如SEQ ID NO.1～140所示探针组成的探针库。
进一步的，与DNA错配修复通路相关的基因包括LIG1、EXO1、HMGB1、MLH1、MLH3、MSH2、MSH3、MSH6、PCNA、PMS1、PMS2、POLD1、POLD2、POLD3、POLD4、RFC1、RFC2、RFC3、RFC4、RFC5、RPA1、RPA2、RPA3、RPA4。
进一步的，所述基因LIG1对应的探针序列如SEQ ID NO.1～11所示，所述基因EXO1对应的探针序列如SEQ ID NO.12～17所示，所述基因HMGB1对应的探针序列如SEQ IDNO.18所示，所述基因MLH1对应的探针序列如SEQ ID NO.19～25所示，所述基因MLH3对应的探针序列如SEQ ID NO.26～32所示，所述基因MSH2对应的探针序列如SEQ ID NO.33～40所示，所述基因MSH3对应的探针序列如SEQ ID NO.41～51所示，所述基因MSH6对应的探针序列如SEQ ID NO.52～58所示，所述基因PCNA对应的探针序列如SEQ ID NO.59～62所示，所述基因PMS1对应的探针序列如SEQ ID NO.63～68所示，所述基因PMS2对应的探针序列如SEQ ID NO.69～75所示，所述基因POLD1对应的探针序列如SEQ ID NO.76～88所示，所述基因POLD2对应的探针序列如SEQ ID NO.89～93所示，所述基因POLD3对应的探针序列如SEQID NO.94～97所示，所述基因POLD4对应的探针序列如SEQ ID NO.98～100所示，所述基因RFC1对应的探针序列如SEQ ID NO.101～110所示，所述基因RFC2对应的探针序列如SEQ IDNO.111～114所示，所述基因RFC3对应的探针序列如SEQ ID NO.115～118所示，所述基因RFC4对应的探针序列如SEQ ID NO.119～122所示，所述基因RFC5对应的探针序列如SEQ IDNO.123～125所示，所述基因RPA1对应的探针序列如SEQ ID NO.126～131所示，所述基因RPA2对应的探针序列如SEQ ID NO.132～135所示，所述基因RPA3对应的探针序列如SEQ IDNO.136～138所示，所述基因RPA4对应的探针序列如SEQ ID NO.139～140所示。
一种检测与DNA错配修复通路相关的基因的方法，包括以下步骤：
（1）获得受试者的DNA样本库；
（2）将权利要求1所述的试剂盒中SEQ ID NO.1～140所示的全部探针与所述DNA样本库进行杂交；
（3）分离步骤（2）的杂交产物，并释放出与试剂盒中探针杂交的基因片段，采用测序技术对分离出的基因片段进行测序从而检测基因的突变情况。
进一步的，所述步骤（1）中的DNA样本库由双链DNA片段组成；
所述步骤（1）包括以下步骤：提取全基因组DNA，然后将其片段化；或者提取mRNA，将其片段化，然后以该经片段化的mRNA为模板合成双链cDNA。
进一步的，所述步骤（2）中的探针进行选择性标记。
进一步的，所述步骤（2）中的探针进行生物素标记。
有益效果：本发明开发了一种检测DNA错配修复通路有效性的探针库、检测方法和试剂盒，其主要具有以下几方面的意义：
1. 通过对DNA错配修复通路参与基因的变异情况分析，评估人体组织或细胞中DNA错配修复通路的有效性（减弱或缺失），预测肿瘤、神经退行性疾病发生的倾向性，并指导患者采取相应的预防措施。
2. 通过对DNA错配修复通路参与基因的变异情况分析，评估肿瘤患者细胞中DNA错配修复通路的有效性（减弱或缺失），对肿瘤恶性程度、临床预后的评估具有重要的指导意义。
3. 通过对DNA错配修复通路参与基因的变异情况分析，评估肿瘤患者细胞中DNA错配修复通路的有效性（减弱或缺失），对放射、化疗药物选择及治疗策略的制定（如，合成致死方案及药物耐药性等）具有重要指导意义。
4. 通过对DNA错配修复通路参与基因的变异情况分析，评估肿瘤患者细胞中DNA错配修复通路的有效性（减弱或缺失），对新的治疗靶点选择、靶向药物研发等具有重要指导意义。附图说明
图1 为本发明所述检测方法的流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明提供了一种与DNA碱基切除修复通路相关的基因的方法，主要包括以下步骤：
（1）获得受试者的DNA样本库；提取全基因组DNA，然后将其片段化；或者提取mRNA，将其片段化，然后以该经片段化的mRNA为模板合成双链cDNA；
（2）针对要检测的基因片段设计与该基因杂交的DNA探针，从中筛选出多个探针作为DNA探针库；
（3）将DNA探针库与DNA样本库进行杂交，从DNA样本库中富集得到待检测基因的DNA片段；
（4）分离步骤（3）的杂交产物，并释放出与试剂盒中探针杂交的基因片段，采用测序技术对分离出的基因片段进行测序从而检测基因的突变情况。
在实施过程中，可以先将DNA探针库中的各个探针进行生物素标记，然后在杂交后用标记有链霉亲和素的磁珠吸附杂交产物，从磁珠上释放出富集的待检测基因片段，再对基因片段进行测序分析。
具体实验过程如下：
一、准备cDNA/DNA样本库
1. 制备DNA样本库
1.1 DNA提取
采用商品化DNA提取试剂盒提取人的基因组DNA，对提取的DNA使用分光光度定量仪以及凝胶电泳系统检测DNA模板质量和浓度。DNA模板260nm吸光率大于0.05以上，吸光率A260/A280比值在1 .8到2之间为合格。
1.2 DNA片段化
将10μg合格的基因组DNA用TE缓冲液稀释至100μL。使用组织匀浆机将DNA片段化，片段长度为150～200碱基。
采用商品化纯化试剂盒对DNA进行纯化。
1.3 DNA样本库质量检测
用生物分析仪进行DNA定性定量分析，确认DNA片段长度峰值合理。
2. 制备cDNA样本库
2.1 mRNA提取
采用商品化mRNA提取试剂盒提取人的mRNA，对提取的mRNA使用分光光度定量仪以及凝胶电泳系统检测mRNA质量和浓度。吸光率A260/A280比值在1 .8到2之间为合格。
2.2 mRNA片段化
采用商品化试剂盒对mRNA进行片段化；再用商品化试剂盒对mRNA进行过柱纯化。
2.3 用商品化试剂cDNA合成试剂盒合成mRNA的第一链以及第二链cDNA
再用商品化试剂盒对cDNA过柱纯化。
3. cDNA/DNA末端修复
利用Klenow片段、T4 DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶对DNA片段进行末端修复，由于Klenow片段具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’聚合酶活性，但缺少5’-3’外切酶活性。由此，能够方便准确地对DNA片段进行末端修复。将修复后的DNA片段进行过柱纯化。
利用T4聚合酶及Klenow大肠杆菌聚合酶片断，对于cDNA/DNA 5 '突出粘末端补平以及3 ‘突出粘末端打平，产生平末端，用于后续的平端连接。反应在PCR扩增仪中进行，20℃，30min。
表1
4. 在cDNA/DNA样本3'末端加上碱基A
采用具有3’-5’外切酶活性的Klenow，在经末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A，以便获得具有粘性末端A的DNA片段，反应在PCR扩增仪中进行，37℃，30min。将处理后的DNA片段进行过柱纯化。
表2
5. 在cDNA/DNA两端加上接头
表3
6. 分离出合适长度的cDNA片段
使用电泳凝胶对DNA片段进行分离，对照DNA分子量，在凝胶上剪切出150-250碱基的cDNA片段。
采用商品化试剂盒将含有cDNA样本库的凝胶样本过柱纯化。
7. cDNA片段样本库质量检测
使用生物分析仪，进行cDNA定性定量分析，并确认分离出的cDNA片断长度峰值合理。
PCR条件：置于PCR扩增仪中，95℃预变性10秒，95℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸1min，共循环20次（cDNA样本库）或者5-8次（DNA样本库），最后在72℃延伸5分钟。
采用商品化试剂盒对PCR扩增产物过柱纯化。
8. 扩增DNA模板
采用PCR扩增仪对处理后的DNA样本进行聚合酶链反应增加DNA的含量，以满足与探针进行杂交的需求。
表4
PCR条件：置于PCR扩增仪中，95℃预变性10秒，95℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸1min，共循环20次（cDNA样本库）或者5-8次（DNA样本库），最后在72℃延伸5分钟。
采用商品化试剂盒对PCR扩增产物过柱纯化。
9. 扩增后cDNA/DNA样本库质量检测
使用生物分析仪，进行cDNA/DNA定性定量分析，并确认纯化后片段长度峰值合理，约200bp。
二、探针的设计原则
根据人类参考基因组HG19，结合Ensembl、CCDS、Gencode、 VEGA、SNP以及CytoBand数据库，获取本发明所述的与DNA碱基切除修复通路相关的基因及其所有编码序列。
探针的设计主要有以下几个考虑因素：
（1）特异性
严格的特异性参数可以有效的降低非目标区域上的探针结合，但也限制了部分外显子上有较低程度重复性的区域，导致探针设计的覆盖率降低。过于宽松的特异性参数会直接降低目标区域上的数据量，导致捕获效率降低，测序成本上升。因此，一个合理的特异性参数是平衡覆盖率和捕获效率的关键。我们认为一条探针在基因组上的相似性序列不超过3是最佳的特异性参数阈值。
（2）结合稳定性
探针与模板结合能力的指标是最小自由能（ΔG）和解链温度（Tm），由于这两个参数计算起来稍显复杂，一般用更为直接和简便的GC含量来间接表示探针与模板的结合能力。一般来说，GC含量越大，结合稳定性越高。实际上，GC含量越接近50%的探针，其捕获效果越好。GC含量越高，虽然探针与目标DNA片段的结合能力很好，但是与目标DNA片段结合能力最好的是其原始的互补片段（一方面长度一致，另一方面是无突变错配），因此，探针需要更高的浓度来促使其在与DNA互补片段结合的竞争中取得一定优势。
我们会优先设计GC含量接近50% 的探针，对于无法避免的GC极端情况下的探针设计，我们会在探针上增加修饰碱基从而改变GC极端情况。
（3）探针浓度
由上面的结合稳定性可知，不同结合能力的探针，其捕获效果有较大的差异。结合能力太高和太低都不利于捕获，因此，为了达到捕获效率最大程度的均一，需要对于不同GC含量的探针设定不同的浓度。通过对历史捕获数据的归纳总结，我们对不同GC含量的探针设定了不同的探针浓度参数，设定GC含量在40-60%的探针浓度基数为1，那么GC含量在30-40%和60-70%的探针，其浓度基数为1 x 22，GC含量在20-30%和70-80%的探针，其浓度基数为1 x24。
（4）探针位置
1、最佳的探针摆放位置是和目标区域100%重合，但是由于随机打断的文库、序列重复性、GC含量、突变类型等的影响，实际的探针设计策略如下：
2、由于文库一般是通过随机打断的方式产生的，为了最大限度的捕获目标文库，一般会采取tiling的方式来设计探针；
3、如果目标区域上有重复序列区域，那么设计时会在保证目标区域覆盖的情况下，向两侧延伸搜索特异性更好的区域设计探针；
4、如果目标区域上是极端GC区域，那么设计时会在保证目标区域覆盖的情况下，向两侧延伸搜索GC含量更合适的区域设计探针；
对于不同的突变类型，也需要有不同的设计思路：
1、对于超过60bp的插入或者缺失，除了需要覆盖其上的探针之外，还需要在突变断点两侧设计探针，越接近断点越好；
2、对于超过10k bp的CNV区域，最佳的探针设计策略是间隔放置稀疏探针，这样做一方面可检测CNV，另外一方可以降低测序成本；
3、对于融合发生的内含子区域，如果融合位点不确定，那么需要整个内含子全部覆盖；如果融合位点确定，那么需要在融合位点两侧设计探针。
4、对于MSI，STR等短串重复区域，除了覆盖其上的探针之外，还需要在其两侧延伸60bp设计探针。
三、DNA捕获探针杂交
1. 将DNA样本库与生物素化的DNA探针库杂交
将cDNA/DNA样本库与杂交缓冲液混合，反应条件为95℃ 5分钟，之后保持在65℃。反应在PCR扩增仪中进行。
然后将该混合物与探针库混合，反应条件为65℃ 5分钟。将杂交反应置于PCR扩增仪中，65℃孵育24小时。
四、得到经杂交的基因片段
1. 准备链霉亲和素磁珠
使用Dynabeads链霉亲和素磁珠进行杂交产物的分离。将磁珠置于混匀仪上混匀，每个样本需要50μL磁珠。
磁珠洗涤：将混合50μL磁珠和200μL结合缓冲液在混匀仪上混匀，通过外界磁场将磁珠与缓冲液分离纯化，弃掉缓冲液，重复三次。
2. 分离杂交产物
将杂交产物与链霉亲和素磁珠进行充分混合，在室温下振摇30分钟。通过外界磁场将磁珠分离纯化。
向磁珠中加入500μL洗涤缓冲液，在65℃孵育10分钟，通过外界磁场将磁珠分离纯化。以上步骤重复三次。
3. cDNA/DNA富集样本释放
将磁珠与50μL洗脱缓冲液混合，室温孵化10分钟，通过外界磁场将磁珠分离弃掉，收集上清液，上清液即为富集的与DNA碱基切除修复通路相关的基因片段。
五、PCR扩增与纯化
将富集的基因片段进行进一步扩增，为测序仪器上样做准备。
表5
| 反应材料 | 体积（μL） |
| 加上接头后cDNA/DNA样本库 | 20 |
| 10×DNA聚合酶缓冲液 | 5 |
| DNA聚合酶 | 1 |
| 接头正引物 | 1 |
| 接头反引物 | 1 |
| 超纯水 | 总体积补至50μL |
PCR条件：置于PCR扩增仪中，95℃预变性10秒，95℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸1min，共循环20次（cDNA样本库）或者5-8次（DNA样本库），最后在72℃延伸5分钟。
采用商品化试剂盒对PCR扩增产物过柱纯化。
六、采用下一代测序技术检测基因的突变
使用下一代商业化的测序仪器进行测序，测序结果用已有的测序软件分析包进行分析。
实施例1 检测MSH2、MSH3、MLH1、EXO1基因的突变
一、构建样本库
1. DNA的提取
按照常规的组织样本的DNA提取方法采用商品化试剂盒提取样本DNA。
2. DNA片段化
使用DNA破碎仪将DNA样本片段化，使片段长度为150-200bp。
3. DNA样本库质量检测
用生物分析仪进行DNA定性定量分析，确认DNA片段长度峰值合理。
4. DNA末端修补
利用T4聚合酶及Klenow大肠杆菌聚合酶片断，对于DNA 5 '突出粘末端补平以及3 '突出粘末端打平，产生平末端，用于后续的平端连接。反应体系见表1所示，反应在PCR扩增仪中进行，20℃，30min。
5. 在DNA样本3 '末端加上碱基A
反应在PCR扩增仪中进行，37℃，30分钟，反应体系见表2所示。
6. 在DNA两端加上接头
反应体系见表3所示。
7. 扩增获得的DNA片段样本库
聚合酶链反应（PCR），在PCR扩增仪中进行，反应体系见表4所示。
PCR条件：置于PCR扩增仪中，95℃预变性10秒，95℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸1min，共循环20次（cDNA样本库）或者5-8次（DNA样本库），最后在72℃延伸5分钟。
8. 扩增后DNA样本库的质量检测
使用生物分析仪，进行DNA定性定量分析，并确认纯化后片段长度峰值合理，约200bp。
若得到的DNA样本库的浓度较低，须将样品经过真空浓缩机低温干燥（低于45℃），再用无核酸酶水溶解至所需浓度。
二、制备MSH2、MSH3、MLH1、EXO1基因的DNA探针库
根据上述的探针设计方法和思路，设计并合成探针进行试验，在5’端有生物素（Biotin）。
三、将DNA样本库与生物素化的DNA探针库杂交
将DNA样本库与杂交缓冲液（10mM Tris-HCl , 2%牛血清白蛋白, pH8.0）混合（混合后，DNA样本库浓度至多不超过50ng/μL），反应条件为95℃ 5分钟，之后保持在65℃。反应在PCR扩增仪中进行。
然后以DNA样本库：探针库为1:100的摩尔比，将探针库加入上述混合物，反应条件为65℃ 5分钟。将杂交反应置于PCR扩增仪中，65℃孵育24小时。
四、得到经杂交富集的MSH2、MSH3、MLH1、EXO1基因片段
1. 准备链霉亲和素磁珠
使用Dynabeads链霉亲和素磁珠置于混匀仪上混匀，混合50μL磁珠和200μL结合缓冲液（10mM Tris-HCl，2%牛血清白蛋白，pH8.0），在混匀仪上混匀，使用外界磁场将磁珠与缓冲液分离纯化，弃掉缓冲液，重复三次，每次加入200μL结合缓冲液。
2. 分离杂交产物
将步骤三中的杂交反应混合物与步骤四的处理后的链霉亲和素磁珠进行混合，在室温下振摇30分钟。使用外界磁场将磁珠与缓冲液分离纯化，然后向磁珠中加入500微升洗涤缓冲液（磷酸缓冲液，0.1% Tween-20，0.1% SDS，pH7.4），在65℃孵育10分钟，每隔5分钟混匀一次。使用外界磁场将磁珠与缓冲液分离纯化，以上步骤重复三次。
3. 释放富集的DNA样本
将磁珠与50微升洗脱缓冲液（10mM氢氧化钠溶液）混合，室温孵化10分钟，每隔5分钟混匀一次。使用外界磁场将磁珠与缓冲液分离纯化，保留上清液，弃掉磁珠，上清液中即含有富集过的MSH2、MSH3、MLH1、EXO1基因片段DNA样本库。
五、PCR扩增与纯化
将富集DNA样本库进一步扩增，为测序仪器上样做准备，反应体系见表5所示。
PCR条件：置于PCR扩增仪中，95℃预变性10秒，95℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸1min，共循环20次（cDNA样本库）或者5-8次（DNA样本库），最后在72℃延伸5分钟。
六、检测灵敏度的验证
针对通路中MSH2（c.1917T>G）、MSH3（c.235A>G）、MLH1（c.655A>C）、EXO1（c.2276G>A）突变构建了突变型和野生型的质粒，按照突变型在野生型中拷贝数比例混合而不同丰度的样品，采用上述的探针库进行捕获、测序考察灵敏性，每个样本重复测试3次，结果如下：
表6
| 待测基因 | 5%质粒 | 1%质粒 | 0.5%质粒 |
| MSH2 | 5.12% | 1.02% | 0.66% |
| MSH3 | 4.87% | 1.21% | 0.51% |
| MLH1 | 4.96% | 0.97% | 0.58% |
| EXO1 | 5.10% | 0.95% | 0.48% |
从表中可以看出，本发明提供的检测探针库和检测方法能够对低丰度的样本也具有较好的检测灵敏度，能够达到0.5%左右的检测灵敏度水平。
采用优化后的探针库对10例肺癌患者肿瘤样本进行24个通路相关基因的检测，其中4例患者在至少1个通路相关基因中发生外显子区域错义突变（40%），其中2例患者在大于5个通路相关基因中发生外显子区域错义突变（20%）。
序列表
<110> 苏州卫生职业技术学院
<120> 一种检测DNA错配修复通路有效性的探针库、检测方法和试剂盒
<141> 2019-11-30
<160> 140
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 1
cgaataaacc gagggaagcg aagggagatg cccttgtcac tatccacctg cggaagcggg 60
atggagactc ctgcggtcca gccccagcga ccccctgctc 100
<210> 2
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 2
cgatcaccac caggtccagg gtgtcaccca cgccatcaag gtagtccttc ttcagctggg 60
agaaggggag gcaagagatg agaaggggga gcgcccaagg 100
<210> 3
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 3
ggaaaggggc tcacgtacca gggactgcag ggccggcagg gagaagagag atgagacatc 60
tttgtgagaa taaagacaat aagccctaaa tgtgaggcga 100
<210> 4
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 4
cttccagggc gtggatctgt cacgatggga gaagggaggg gaaatcagct gagtcccctc 60
atgtggcctc agctttctct tctgacccca cctgcactgg 100
<210> 5
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 5
cgggaacctc gctggggtgg cgggtgagaa caagataggg gaagcctttc tagaactcac 60
acagtttgga aagagagctc ggcctgctcc cagaagcctg 100
<210> 6
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 6
gtccgctcag ggacctgggg agagagcagg ccagggaagg gggcttgtct gcacctcccc 60
aatcttgcct cctcccttct ctgatctcct cgaccttgat 100
<210> 7
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 7
ctgaggtaga ggacagggag gaggtctgga ggcgacaggg ccaccacgga gcgcagcaag 60
ttgctcagcg tctccaccat ccggagcctg gaggagggga 100
<210> 8
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 8
tccctccttt cctggagccc ctggctcctc ttccttcact tcttttttga ctgctggctt 60
ccggggggct aggaatgaag acagaaaaca gtgggtcttt 100
<210> 9
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 9
ctttctttcg gggtctcctc ttctgacgat agacagaacg gtcagatggc aaaaaaatcc 60
cattgaacct acaagggcat tttgactctg gagacagtct 100
<210> 10
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 10
gtccagggca ggcttctgga agaggaaaga acagttctag agtgagcggg ggaaggaggg 60
actccatttt ccaaaagttg agagtagagg ggactgaaac 100
<210> 11
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 11
gtggaaaaat gacctagagg agcataaaag ggggtaaaaa aaggagaata acagcaccaa 60
taccctgcct atctatgctg tatcctataa cttccttttt 100
<210> 12
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 12
taaaaaggaa gtagagagat ctagaagaga gtaagttaat tctctactta atctctaact 60
tcattgcact aaggtcagac actgtagtct atatgatacc 100
<210> 13
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 13
tgcaagccat aattacagag gactcggatc tcctagcttt tggctgtaaa aaggtactca 60
cctctgacta ctatatatta cttttctatg tagatagtag 100
<210> 14
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 14
tcccatcaaa aggaaactta ttcctctgaa cgcctatgaa gatgatgttg atcctgaaac 60
actaagctac gctgggcagt atcctttctg aaacagaatg 100
<210> 15
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 15
ggttaaatct cccaaggaaa tcatccattg tgaaaagacc aagaagtggt acgtatttca 60
gttttgcaaa atgctggtga atattggtca tatttaaaga 100
<210> 16
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 16
ataatcatat tccaggtgat catattccag acaaggcaac agtgtttaca gatgaagagt 60
cctactcttt tgagagcagc aaatttacaa ggaccatttc 100
<210> 17
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 17
gagaaagcat cataatgccg agaacaagcc ggggttacag atcaaactca atgagctctg 60
gaaaaacttt ggatttaaaa agtgagttgc cttgtttctt 100
<210> 18
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 18
cctttctctt tagcagacat ggtctacaaa ataattattt gtaagtttaa gttgtaacat 60
ttaagtaaat tatcctcaaa accaatgtct tttgctatgt 100
<210> 19
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 19
aggcctgaag ttgattcaga tccaagacaa tggcaccggg atcagggtaa gtaaaacctc 60
aaagtagcag gatgtttgtg cgcttcatgg aagagtcagg 100
<210> 20
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 20
gaagttgttg gcaggtacag tccaaaatct gggagtgggt ctctgagatt tgtcatcaaa 60
gtaatgtgtt ctagtgctca tacattgaac agttgctgag 100
<210> 21
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 21
acatatccaa tgcaaactac tcagtgaaga agtgcatctt cttactcttc atcaaccgta 60
agttaaaaag aaccacatgg gaaatccact cacaggaaac 100
<210> 22
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 22
agcaagctcc tgggctccaa ttcctccagg atgtacttca cccaggtcag ggcgcttctc 60
atccagctac ttctctgggg cctttgaaat gtgcccggcc 100
<210> 23
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 23
ccccccggag aaggatcatt aacctcacta gtgttttgag tctccaggaa gaaattaatg 60
agcagggaca tgagggtacg taaacgctgt ggcctgcctg 100
<210> 24
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 24
aaggacttgc tgaatacatt gttgagtttc tgaagaagaa ggctgagatg cttgcagact 60
atttctcttt ggaaattgat gaggtgtgac agccattctt 100
<210> 25
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 25
agcagtacat atctgaggag tcgaccctct caggccagca ggtacagtgg tgatgcacac 60
tggcacccca ggactaggac aggacctcat acaatcttta 100
<210> 26
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 26
gcaactttcc tgtaagctca ggccatcatt aaacttaatg gcccctaaat gaaagacaga 60
aacaagaagg ttatagtgta tatagtggga aaccaatgct 100
<210> 27
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 27
caaggaccag agaatcacta gtgtctggaa atacaaattc aaggcccaga tcttccagat 60
ttttgtggta acacctaaag agataacctc aaatgttaaa 100
<210> 28
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 28
tgaattttaa ctgctaagct ctcagcctgg ccactgctta catcaacagc aacctagaaa 60
gactcagcaa aatataattg aaattttaat ttttgtgtca 100
<210> 29
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 29
gaaaggaaga acaaggtcgc ttctaaaagg ttgacacctg tactgagacc ctaaatataa 60
gaaagaaaaa cctagaaatg tgaacttaaa atacaagtaa 100
<210> 30
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 30
aggtccaaag gttttctatt aaagagagat aactccttca gggtcatagg actttctctc 60
aaactaggca tctgttgttc taaacaatct tcatccttgg 100
<210> 31
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 31
ccattaacag tagtactttc tttccatatt tctagatcct gcccactctc ctcaaagtga 60
catggtgtct gaaaagggct taaaaacatt tctaaactgg 100
<210> 32
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 32
aatccataaa tttgacaaaa tcgggaacat acgtctttgg ttttagggag ctgaagaacc 60
atggaaccag aaacatcatt tctcaaagag aaagaaatgg 100
<210> 33
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 33
cagtatagag ttgaagttta taagaataga gctggaaata aggcatccaa ggagaatgat 60
tggtatttgg catataaggt aattatcttc ctttttaatt 100
<210> 34
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 34
acctcaaccg gttgttgaaa ggcaaaaagg gagagcagat gaatagtgct gtattgccag 60
aaatggagaa tcaggtacat ggattataaa tgtgaattac 100
<210> 35
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 35
taaccagtgg attaagcagc ctctcatgga taagaacaga atagaggaga ggtatgttat 60
tagtttatac tttcgttagt tttatgtaac ctgcagttac 100
<210> 36
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 36
gacttctcca agtttcagga aatgatagaa acaactttag atatggatca ggtatgcaat 60
atacttttta atttaagcag tagttatttt taaaaagcaa 100
<210> 37
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 37
aagaaaaagt ccttcgtaac aataaaaact ttagtactgt agatatccag aagaatggtg 60
ttaaatttac caacaggttt gcaagtcgtt attatatttt 100
<210> 38
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 38
tttattccta atgacgtata ctttgaaaaa gataaacaga tgttccacat cattactggt 60
aaaaaacctg gtttttgggc tttgtggggg taacgttttg 100
<210> 39
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 39
ccaactgtta ataatctaca tgtcacagca ctcaccactg aagagacctt aactatgctt 60
tatcaggtga agaaaggtat gtactattgg agtactctaa 100
<210> 40
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 40
agttaaaaca gctaaaagct gaagtaatag caaagaataa tagctttgta aatgaaatca 60
tttcacgaat aaaagttact acgtgaaaaa tcccagtaat 100
<210> 41
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 41
ctggcaactc tggtgagttg tgggggattc ttttttctcc tcagtcatgg ctctggtatt 60
ctggaattct ccagagggca gaagagcgta ttagaattgt 100
<210> 42
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 42
tgcagttttg tgtgtggaat gtggatataa gtatagattc tttggggaag atgcagaggt 60
aagtcgtctt ttcaggcact attttatatt tttcttgtct 100
<210> 43
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 43
aaattgactg ccctttatac aaaatctaca cttattggag aagatatcct ttttggacgg 60
gagtttttct cttaaatgat acaagggctt tgttggcagg 100
<210> 44
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 44
aagcctgcag ccagtagagc tgctgcttcc ttcggccttg tccgagcaaa cagaggcgct 60
catccacaga gccacatctg ttaggtaagt tggcacatca 100
<210> 45
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 45
caaacctgag taagtgattc ctccaaaatt aaaaaaaggg ggagcttata ttatgaacat 60
ttcttaaatt gaatttggta gtactatact tagagaagct 100
<210> 46
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 46
agacggaagt taaagaagtg ggtgacccag ccactcctta aattaaggta aaaggaattc 60
tttttggggt gtttaatctg aaattataaa attttgaaat 100
<210> 47
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 47
gaccgttatt ttagaaattc ctgaactcct cagtccagtg gagcattact taaagatact 60
caatgaacaa gctgccaagt aagtaccaga ccctgaattc 100
<210> 48
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 48
attttctaga gtgagtttac aatgaaaaaa tataatctga ctttttgcta tcagaaacag 60
actggaaaaa tctttccatc aaaaagaaaa tagagattac 100
<210> 49
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 49
gtcccaaata atacagattt atcagtaagt accttatgcc aaaaaataag tcgatgataa 60
catcccaaac ttttacatac caaagaaaca tttttataat 100
<210> 50
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 50
ggaattgcca ttgcctatgc tacacttgag tatttcatca gagatgtaag tatccggtaa 60
actgtattta aaaagaaatt aatttgtaaa ttattatttt 100
<210> 51
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 51
gaagaaagca gctcacaagt caaaagagct ggaaggatta ataaatacga aaaggtcaga 60
gtgattatgc tgcatttttt catttgtaat gaaaccttct 100
<210> 52
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 52
cagcccaaca aggggctggg ttagcaaaag gcttttaaag ccatatacag gtaagagtca 60
ctactgccat gtgtgtgtgt ttgtgtgtgt gtgtgtgtgt 100
<210> 53
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 53
aggaagcagt gatgaaataa gcagtggagt gggggatagt gagagtgaag gcctgaacag 60
ccctgtcaaa gttgctcgaa agcggaagag aatggtgact 100
<210> 54
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 54
gagatttagg actctagtgg cacactatcc cccagtacaa gttttatttg aaaaaggaaa 60
tctctcaaag gaaactaaaa caattctaaa gagttcattg 100
<210> 55
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 55
ccgatgggat acagcctttg accatgaaaa ggctcgaaag actggactta ttactcccaa 60
agcaggcttt gactctgatt atgaccaagc tcttgctgac 100
<210> 56
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 56
gaggagcagg aaaatggcaa agcctattgt gtgcttgtta ctggaccaaa tatggggggc 60
aagtctacgc ttatgagaca ggtaactgat tcttaaagtt 100
<210> 57
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 57
gtggatgaat taggtaagac attaaacttc tcatttgaag actatctatc ttaaaaacat 60
ttgtacaaat aactattttt atagaagatt atctgaagta 100
<210> 58
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 58
agcaagagaa tttgagaaga tgaatcagtc actacgatta tttcggtaac taactaacta 60
taatggaatt ataactaact gaccttaagt ttcaaagaaa 100
<210> 59
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 59
ctcagtgcaa aagttagttg aactggttca ttcatctcta tggtaaccta caaaacaaaa 60
gattcatcat tgaaaaacat caagaaagtt gcaatctatt 100
<210> 60
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 60
atagtctgaa actttctcct ggtctaccaa aagaaagcag atgcttttga gaaatactga 60
cacagagttt tgattttctg tagcttcgtg actcggtaaa 100
<210> 61
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 61
gtgtaatgat atcttcattg ccggcgcatt ttagtatttt ggacatacta gaagacagga 60
gacacatgct ttaaaatcaa cgccgtctgc tgaagggctg 100
<210> 62
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 62
ggcctcgttg atgaggtcct tgagtgcctc caacaccttc ttgaggatgg agccctggac 60
caggcgcgcc tcgaacatgg tggcggagtg gcaacaacgc 100
<210> 63
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 63
ttttcgtgga gaagccttgg ggtcaatttg ttgtatagct gaggtaaggt aattatattg 60
gttattttag tgatttcata ttcactgaac attacagtta 100
<210> 64
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 64
tgaaataaaa aagatccaag atctcctcat gagctttggt atccttaaac ctgacttaag 60
gattgtcttt gtacataaca aggtaaacat tattttatct 100
<210> 65
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 65
agatatctta aaggtagtat gctttagaaa aaaaaaatta tttgaattgg aaatttgtca 60
cattgtaaca aggactgctt ccaagaattt gctctaaaat 100
<210> 66
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 66
aatgttgata cttcagtcat tccattccaa aatgatatgc ataatgatga atctggaaaa 60
aacactgatg attgtttaaa tcaccagata agtattggtg 100
<210> 67
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 67
tcaaccaaaa cttgatgaac tccttcagtc ccaaattgaa aaaagaagga gtcaaaatat 60
taaaatggta cagatcccct tttctatgaa aaacttaaaa 100
<210> 68
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 68
gaaattctta atgctatatt aaacagaaat gcaaaggaag tttatgaatg tagacctcgc 60
aaagtgataa gttatttaga ggtacgcatt attttatata 100
<210> 69
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 69
agccctttca gtgactggag ctaaaagaat acaattttga gaaaaatcca tgacttgaca 60
aacacgtttc acttgaaagc tacttaggat gaacatctga 100
<210> 70
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 70
aaatcccagg ttaaactgac caatgatttc catttctgca aacatcgttt tactgcaggt 60
agaaaatgtt aattatcaga cattttacaa gattattttt 100
<210> 71
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 71
agacagcata ccccttttct gtcctagagg gctccttctt ggttctggag tctttgggct 60
gtgaggcttg ttctctgttg tgtgacgaag agaaaaggcc 100
<210> 72
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 72
gtcgattata catgtggtag acctcattca cgagtctgca gacctgcaca aaatacaagg 60
agtagaaaag aataaatgac aaatgttccc agccccccgc 100
<210> 73
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 73
atgcagagca tcggaacagc tcaaaccgta ctcttcacac acggagtcac tagggggcag 60
ctgaacaaaa ggaatgaggc tttgcaactg aaaaaaaaaa 100
<210> 74
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 74
catcgctgtg agagaatacc aggcatggtg tgttcagtga gagacccatg atgttgggca 60
ctgactactc ttttcttcac ttgcttttct ctcaaaattt 100
<210> 75
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 75
tgaaacttca ataagatcca ctccatagtc cttaagcttt agatctagaa agtttaaaat 60
atttacatat ttattaaaaa cggacccatg ctatcagttt 100
<210> 76
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 76
gcccctcatc ttccaacagt tggagattga ccattatgtg ggtgagttta ggggttatgg 60
gtgagtgctg gggccctgcg ctcctggggc agaggccggg 100
<210> 77
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 77
gagtgagtgc tcccccagga tcagcgggtt ggagggtccc ctcgggaggc cattggctgg 60
tcccagcttc ttccatccac aggcatgttt gggtaccacg 100
<210> 78
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 78
cggacatcgt cggctgcaac tggctggagc tcccagctgg gaaatacgcc ctgaggctga 60
aggagaaggt gcagggcttc ccagggcagg gctgggtggg 100
<210> 79
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 79
cgcctggcgc tcaccctgcg gccctgtgcc cccatcctgg gtgccaaggt gcagagctac 60
gagaaggagg aggacctgct gcaggtagct ctcgctccac 100
<210> 80
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 80
cgcgtgcaga tggacatgct gcaggtatgg gcgggaggtg gggtgtgtcc ctgtccttgg 60
aaggccactg cccaggcccg cagcccacca gcccacccac 100
<210> 81
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 81
cgagggtcac tggcgtgccc ctcagctacc tgctcagtcg tggccagcag gtcaaggtcg 60
tatcccagct gttgcggcag gtcagtagcc gagacttgtc 100
<210> 82
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 82
acctgtgtta caccacgctc cttcggcccg ggactgcaca gaaactgggg tatagtgccc 60
aattcagcat gtgtcccccg aggcccatct gggccttccc 100
<210> 83
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 83
ggcgcccagg tgggcaagtt gccgtgcctg gagatctcac aggtgggcac tcgggcccct 60
ggaaggcaac tgggggcagg tgggccccct gtgtaggaga 100
<210> 84
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 84
cggactgggt gtcaggtcac ttcccgtcgc ccatccggct ggagtttgag aaggtgcgtg 60
gctgggtcag gggctctgca tttaggtgcc ctcatcaggg 100
<210> 85
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 85
atcaccaagg agctgacccg cgcggcctcc gactatgccg gcaagcaggc ccacgtggag 60
ctggccgaga ggtcctgcgc ggggcgggtg gcctggccag 100
<210> 86
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 86
tgccgaggct gtgctactgc gtacgggggc accaggggac tgggggcacc ctgggggggc 60
agaggagatc accggcccac cacctgcctc ctctcctgca 100
<210> 87
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 87
gaaggaggtg agagggccgg gaggtgagga ggggccaggt ggggaggcgg gggcgccctg 60
ctcagccgct gccgtcccca ggtatcccat ctgaatgccc 100
<210> 88
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 88
cctggacctg aggcctggtg accttgcaag catcccatgg ggcgggggcg ggaccaggga 60
gaattaataa agttctggac ttttgctata tggtgctttg 100
<210> 89
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 89
ttgtagaagg ggtaacaacc tggaggagaa ggggcagctc tgaggagggt tccgcctcag 60
cactagcact ctgcacagga tgtggggctg cagcccctcc 100
<210> 90
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 90
ttggtgggat caaactcgcc tggcatcacg tccacgggca ctgaggcctg gaaggcacag 60
ggcagggaga gctcacaggg ccccgaagga gccccctaca 100
<210> 91
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 91
gacaccagta gcacaaacct gcgggagaag gtggggtcct ccagggtgcc gagaagggag 60
gcagcccctc ctaggtgcaa ctcaaagatt ccactgacca 100
<210> 92
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 92
ctgggtgtat gtatttactc cgaggaggct gggggagcag gttgtgctgg aatgcagaga 60
caggaggtat aatcttgggg ccagagccca ccaaagctct 100
<210> 93
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 93
tgtgggccct ctgggcagcc tgctcagaaa acatggccac actcctgact tgcttggtcc 60
acacagcttc gcccaggcca aggaggttca ctgcgaaaac 100
<210> 94
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 94
cttgcagaac tgcagcaagt aagcgtctta atgttccttg tgggcttctt tacgaattga 60
ttttgtaaga tgtttacaca gtggctgcct cttaagagtg 100
<210> 95
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 95
atccagcaaa aaagcagagc ctgttaaggt gctgcagaag gaaaaaaaaa ggtaggaaaa 60
ttttgttgct tattggggaa gagtctttac tgggggtgag 100
<210> 96
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 96
ccgtctccac ctcttgaacc agtgccaaag actgagcctg aacctccttc tgtcaaggta 60
aaattatact gggattcttg catgtccatg catcctttgt 100
<210> 97
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 97
tgggcaaagc caacagacag gtgtccatta ctggcttctt ccagaggaaa taaactgcca 60
tctctggtag atcagagact tggagtggtc aagggagaag 100
<210> 98
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 98
accagcgctg cagccgtgtg atccctgcca gggtgggaag aagactctgg agacttgtgg 60
ggggtggggt agagtctgag ctggagaatg tgtgtgttgg 100
<210> 99
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 99
tggggctcct cccctgcaat gacagctgct cttcagtacg aggttggctt cagtctcctg 60
cccctcacct cccagccttc ctcaccaccg ctttgcctct 100
<210> 100
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 100
tccctcctct tcacaaccgg gtaggaatca gtgatgagcc gcttccggcc catggcggcc 60
acccaggcag gcagagaagg aggcaactgc ggggaagagg 100
<210> 101
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 101
ctgtgtctag atgcctttat agcttgaagt gagtatggag taaggtgggc ttccttattg 60
taagctcttg tgaaggctgc tttcacctat atgaaaggag 100
<210> 102
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 102
aaactgggtc atgtaccccc tcatcaactc tccaggaaga acactggcat aaatggcctg 60
aaaaaaaatc aattgcagtc cagaatttat gttccgtaca 100
<210> 103
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 103
atctgacttg tccacaagtg acatgtgagc agtctcctct ccagctgcaa acactttccg 60
ggcaacatca aatgggccct gaaaaaagag agggacacac 100
<210> 104
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 104
cttctttaaa tgcaatagac atcatagcac cctgaaattg acaagggagg agtcctcaat 60
gatttttaac tcatataatc aggtatttta aaaatattta 100
<210> 105
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 105
agaggctgct ccatctgacc caggttgagg agcaatggga tgagacaaaa acaaaataac 60
aattgctcaa aaactgctgc tctgtagaaa attatgtaac 100
<210> 106
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 106
acgctgcttt aaaactagag ccatcatctt tgccggaaaa tttaccaaac tttgctgcta 60
ggaaaaaaga agttccagag tgtcaaccta tatcacctaa 100
<210> 107
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 107
atcagattca acaggccatc ttcatcaata atttttgtcc ccaaggctgc ggcctgttga 60
ttaaaaatgt aaaccatcaa aactgcatcc tgcatcctac 100
<210> 108
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 108
cagaatcttc aggacttaca gactttggga acagggaaag gaaaatgaac aaagtcatac 60
agaattcatg caaaatttaa aatacatatc tagaaataaa 100
<210> 109
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 109
gtcctttcga gcctaaacaa attttaaaag tgtcaaatgt gacaaataat agaaaaacta 60
ttaccataaa atctgttgtt aaaatccatc aaaattttaa 100
<210> 110
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 110
ccaggtttag aagatactgg cagtttttct ggtggctttt tggcattttt tacctgcaac 60
gtctcctctg actctgaatc tgtatgtgag agaaaaataa 100
<210> 111
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 111
tcttctggtg agtagcccag atgccacaag tgagcaagaa tctagacaaa ggagacagaa 60
aaggctgctt accactttaa actgtaagaa gacatgtgat 100
<210> 112
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 112
ggtcagcttt gtgtaccgga ggactgcaca gcgggactga atgggctctg aacagagacg 60
ggacagtagt gaggcttccc tgcagaggcc ggcatcatcc 100
<210> 113
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 113
cctcacaacg tcaatgcccc tgaaagaatg acaggttttt actggcacct tctgagacca 60
attcagttgc cttcacaagg acttttaaac aatcggtata 100
<210> 114
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 114
tgttgggcac atttccttcc cttgcaaaga cctacggcga aaatgatcat taaaaccggt 60
taaaacttgc ttctggatga ctacataaaa aagatagaaa 100
<210> 115
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 115
aactttatgg tgttggagtg gaaaaattga gaattgaaca tcagaccatc acagtaagca 60
tttcactttg aggccctgaa agtaatttat agcggggact 100
<210> 116
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 116
tctacatcta aagtgatccc acctattcgt agtaggtgct tggcggttcg tgtgcctgct 60
cccagcattg aagatgtagg tcaagttaca cttttctgaa 100
<210> 117
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 117
tatctgaggg agactgcaaa tgctattgtc agtcagcaaa ctccacaaag gtaccagtat 60
aaaatgatga cagtaaagct ttcattatca ggatatcata 100
<210> 118
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 118
acttggaagc gtttgtggcc aaattcatgg cactttataa gaagttcatg gaggatggat 60
tggaaggcat gatgttctga cttctgtcag ttattcttgc 100
<210> 119
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 119
aatcctataa taaaaaaaac ttttggtatg atgacttaat attcctttcc ccaaagttag 60
taagctgact ttaccttgac cacagcttct agtttgtcaa 100
<210> 120
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 120
gcttttctta agtctccttc tgacacttta acaagataag ctattccctg aagagaaaag 60
agttgttttt aacctatgat ggccaattaa ggatttataa 100
<210> 121
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 121
tcatagaatc tgcttcatcc agaatcacaa tcttaaaagg cggacacggc ttcccactga 60
ttcagagaaa cacataagag ttgaacatta atatgtatat 100
<210> 122
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 122
ttaagaaatg cttgcatggt acttcaccct ggtcaggtgc aagacagaaa aaaaaagctt 60
ttattgaaac ttttattgcg aatcagcacc ataggaaagc 100
<210> 123
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 123
tcctgaactc atggttcccc gcctggaaca tgtcgtggaa gaagagaagt gagtattttg 60
cgggcctttg gggatggagt gtagtagaaa caggcttgtg 100
<210> 124
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 124
aacatcctgg actggatgtt gaatcaagat ttcaccacag cctacagaag tatcctttct 60
catgacctcc tggccaccga gacctgaagg tggccccagg 100
<210> 125
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 125
cattgctgca tttcaagtca ccagagacct gattgttgca gaggcctaga tgctctgagg 60
gccattcaca attctcaggg ctcagcagtg atgggagaac 100
<210> 126
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 126
aagcagttgg agtgaagatt ggcaatccag tgccctataa tgaaggtaaa atgctttggc 60
gtaggttgta gcactcaaat gaatacctct ttatatattc 100
<210> 127
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 127
cactccttac cagtccaagt gagttgttgc atagagtaag ttcagagtgt acttatgaaa 60
tcggagaagc tattatggac tcttgagtta tttatgcgtg 100
<210> 128
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 128
tcacggggat tgatgacctc gagaacaagt cgaaagactc acttgtaggt aagctcgtgt 60
atgagaagga agagcaggga tgactagctt tctttgcagt 100
<210> 129
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 129
gagcctctcc gtgctgtctt caagcactat cattgcgaat cctgacatcc cagaggccta 60
taagcttcgt ggatggtagg ttttgtgggg ctaaacaaag 100
<210> 130
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 130
agaaagtgat tgatcaacag aatggattgt accgctgtga gaagtgcgac accgaatttc 60
ccaatttcaa gtaccgcatg atcctgtcag taagtagcct 100
<210> 131
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 131
gatctttcat attcagagtc agggtcaaag tggagaccta caacgtaagt aagggcctgg 60
gcagcagggt tggtggtggg gaggtgctgt ttgtcaccta 100
<210> 132
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 132
aaagttcaac ccttcaggtc ttggacaagc cttaatcaaa ttcaacacct gaagattcaa 60
atcagaaaga ttttagcaat tattttggat cagcctcccc 100
<210> 133
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 133
taggtgctct ccctgctgag ggctgaatta agaaataagt tagcaatatt agaaaatcca 60
tcaagttaaa cagtctttac tacttaaaat agctcgttaa 100
<210> 134
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 134
cacaatgtgc tgggctcggg ctctctgaaa agaaaaaaca tgcaaaattc aattaagaaa 60
gtaataacta ccactcattc aacacctgcc atgtgccaag 100
<210> 135
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 135
cctgttttga acaacaggat tagtgcctgt gccacgtccc acgcctccga gaaacccgca 60
ggctcccgga ggcttcgccc cttcaaacac tgcccgagtc 100
<210> 136
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 136
gatctgaaag aaacatttaa gcaaacattt aatctacaat ggaaagttgt aacatcaatt 60
attatctaag atatttttac ctatttcctt tttctcaccc 100
<210> 137
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 137
ccttggcggt tactcttcca accacttcca caattccaga gatttcttca tcaagctaag 60
acacagaaca agacatcgat ttggtgatat cacattttca 100
<210> 138
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 138
agcatgccgg cgttgatgcg cgacctgggc aagtccatca tgtccaccat gattatggtc 60
caagactgcg gctggcggga aacccacgga cgactgaaac 100
<210> 139
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 139
tgtttgaccc tgtgttcaag gttaggggaa ttatagtttc ccaggtctcc atcgtggggg 60
taatcagagg ggcagagaag gcttcaaatc acatttgtta 100
<210> 140
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 140
gggctcagct ctgcgacctt agcgtcaagg ccatcaagga agcgattgat tatctgaccg 60
ttgagggcca catctatccc actgtggatc gggagcattt 100
Claims (7)
1. 一种用于检测DNA错配修复通路有效性的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括针对与DNA错配修复通路相关基因的如SEQ ID NO.1～140所示探针组成的探针库。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测DNA错配修复通路有效性的试剂盒，其特征在于，与DNA错配修复通路相关的基因包括LIG1、EXO1、HMGB1、MLH1、MLH3、MSH2、MSH3、MSH6、PCNA、PMS1、PMS2、POLD1、POLD2、POLD3、POLD4、RFC1、RFC2、RFC3、RFC4、RFC5、RPA1、RPA2、RPA3、RPA4。
3. 根据权利要求1所述的一种用于检测DNA错配修复通路有效性的试剂盒，其特征在于，所述基因LIG1对应的探针序列如SEQ ID NO.1～11所示，所述基因EXO1对应的探针序列如SEQ ID NO.12～17所示，所述基因HMGB1对应的探针序列如SEQ ID NO.18所示，所述基因MLH1对应的探针序列如SEQ ID NO.19～25所示，所述基因MLH3对应的探针序列如SEQ IDNO.26～32所示，所述基因MSH2对应的探针序列如SEQ ID NO.33～40所示，所述基因MSH3对应的探针序列如SEQ ID NO.41～51所示，所述基因MSH6对应的探针序列如SEQ ID NO.52～58所示，所述基因PCNA对应的探针序列如SEQ ID NO.59～62所示，所述基因PMS1对应的探针序列如SEQ ID NO.63～68所示，所述基因PMS2对应的探针序列如SEQ ID NO.69～75所示，所述基因POLD1对应的探针序列如SEQ ID NO.76～88所示，所述基因POLD2对应的探针序列如SEQ ID NO.89～93所示，所述基因POLD3对应的探针序列如SEQ ID NO.94～97所示，所述基因POLD4对应的探针序列如SEQ ID NO.98～100所示，所述基因RFC1对应的探针序列如SEQ ID NO.101～110所示，所述基因RFC2对应的探针序列如SEQ ID NO.111～114所示，所述基因RFC3对应的探针序列如SEQ ID NO.115～118所示，所述基因RFC4对应的探针序列如SEQ ID NO.119～122所示，所述基因RFC5对应的探针序列如SEQ ID NO.123～125所示，所述基因RPA1对应的探针序列如SEQ ID NO.126～131所示，所述基因RPA2对应的探针序列如SEQ ID NO.132～135所示，所述基因RPA3对应的探针序列如SEQ ID NO.136～138所示，所述基因RPA4对应的探针序列如SEQ ID NO.139～140所示。
4.一种检测与DNA错配修复通路相关的基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）获得受试者的DNA样本库；
（2）将权利要求1所述的试剂盒中SEQ ID NO.1～140所示的全部探针与所述DNA样本库进行杂交；
（3）分离步骤（2）的杂交产物，并释放出与试剂盒中探针杂交的基因片段，采用测序技术对分离出的基因片段进行测序从而检测基因的突变情况。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的DNA样本库由双链DNA片段组成；
所述步骤（1）包括以下步骤：提取全基因组DNA，然后将其片段化；或者提取mRNA，将其片段化，然后以该经片段化的mRNA为模板合成双链cDNA。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的探针进行选择性标记。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的探针进行生物素标记。
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