发明内容
针对上述技术问题,本发明人通过大量实验,开发了基于杂交选择而捕获特定基因DNA序列的方法,采用该方法可以获得成几千倍富集的特定目标基因片段,该经富集的目标基因片段样本可以选择性地应用于各种基因检测技术,特别是可以应用下一代测序技术进行基因突变、缺失、增加、和颠换等方面的检测。这种基于杂交选择的靶向捕获,在很多领域极为有用。例如,对于捕获保存久远的DNA,对于临床样本中癌症基因的深度测序,对于罕见基因突变的检测等,由于其特定基因的富集作用,可以获得良好的目标基因片段检测样本,从而应用检测技术、例如下一代测序技术得以检测。
具体而言,本发明的技术方案如下:
一方面,本发明提供了一种富集目标基因片段的方法,所述方法包括以下步骤:
1)获得受试者的DNA样本库;
2)获得能够与目标基因杂交的DNA探针库;
3)使所述DNA探针库与所述DNA样本库进行杂交;和
4)分离步骤3)的杂交产物,然后释放经杂交富集的目标基因片段。
其中,所述步骤1)中的DNA样本库由双链DNA片段组成,并且,所述步骤1)包括:
1-1)提取受试者的全基因组DNA,然后将其片段化;或者
1-2)提取受试者的mRNA,将其片段化,然后以该经片段化的mRNA为模板合成双链cDNA;其中,所述受试者为哺乳动物,优选人,且从受试者的细胞、组织或体液样本中提取全基因组DNA或mRNA。
优选地,所述DNA片段的长度为150-600bp;
进一步优选地,所述DNA片段的长度为150-200bp。
所述步骤2)中的DNA探针库包含多个DNA探针,所述DNA探针通过如下方式获得:
2-1)将目标基因的DNA序列及其两侧的侧翼序列作为目标区域,设计多个能够与目标区域杂交的DNA探针以覆盖所述目标区域全长;和
2-2)在步骤1)获得的DNA探针中,选择退火温度为90-100摄氏度、GC成分为40-60%的DNA探针;以及任选地
2-3)进一步筛选所述DNA探针,使所述目标基因的每个外显子具有至少一个DNA探针。
此外,所述步骤3)包括:
3-1)采用选择性标记标记DNA探针库中的DNA探针;和
3-2)使所述DNA探针库与DNA样本库进行杂交;
优选地,所述步骤3-1)中的选择性标记为生物素。
因此,所述方法的步骤4)中,优选利用DNA探针上的选择性标记分离杂交产物。进一步优选地,所述步骤3-1)中的选择性标记为生物素,所述步骤4)中利用链霉亲和素-生物素的亲和作用分离杂交产物。
本发明提供的基因片段富集方法可以同时针对多个乃至数百个基因进行富集,因此所述目标基因可以为多个。在目标基因为多个的情况下,所述DNA探针库为由针对每个目标基因的探针库组成的混合探针库。优选地,所述目标基因为一个或多个致癌基因。
另一方面,本发明还提供一种检测目标基因的基因结构突变的方法,所述方法包括以下步骤:
1)根据上述方法富集目标基因片段;和
2)检测所述目标基因的基因结构突变。
优选地,所述步骤2)中采用下一代测序技术,通过对富集到的目标基因片段进行测序而检测所述目标基因的结构突变。
以下是本发明的详细描述:
本发明提供一种富集目标基因片段的方法。具体而言,本发明的方法包括:从哺乳动物例如人的细胞、体液或组织样本中提取基因组DNA或mRNA,经处理或合成cDNA,从而获得片段化的双链DNA作为DNA样本库;此外,针对要富集的目标基因,设计与该目标基因杂交的DNA探针,从中筛选出多个探针作为DNA探针库;然后,将该DNA样本库与DNA探针库进行杂交,从而从DNA样本库中富集得到目标基因片段。根据本发明的具体实施方式,可以先将DNA探针库中的各个探针进行生物素化,然后在杂交后用链霉亲和素磁珠吸附杂交产物,再从磁珠上释放出富集的目标基因片段。经适应性处理,可以采用下一代测序基因对目标基因进行基因结构突变的检测,包括单碱基突变、mRNA缺失或增多、mRNA结构颠换、mRNA剪接变化。
下面以富集得到的目标基因片段用于基于下一代测序技术的基因结构突变检测为例,示例性地说明本发明,其中总体工艺流程见图1。
一、准备mRNA/DNA样本库
1.准备基因组DNA样本(采用此种方式获得的DNA样本库称为“源自全基因组的DNA样本库”)
1.1DNA提取
DNA提取,包括新鲜组织,新鲜血液和细胞,固定和石蜡样本,商业化公司提取试剂盒。以上均按说明书指示方法操作。
使用分光光度定量仪以及凝胶电泳系统检测DNA模板质量和浓度。dsDNA模板260nm吸光率大于0.05以上,吸光率A260/A280比值在1.8到2之间为合格。
1.2DNA片段化
将3微克高质量的基因组DNA用低TE缓冲液稀释至120微升。按照组织匀浆机使用说明书,将DNA片段化,片段长度为150-200碱基。
DNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
1.3DNA样本库质量检测
用生物分析仪进行DNA定性定量分析,确认DNA片段长度峰值合理。
2.准备cDNA样本(采用此种方式获得的DNA样本库称为“源自mRNA的DNA样本库”即cDNA样本库)
2.1mRNA提取
mRNA提取,包括新鲜组织,新鲜血液和细胞,固定和石蜡样本,商业化公司提取试剂盒。以上均按说明书指示方法操作。
使用分光光度定量仪以及凝胶电泳系统检测mRNA质量和浓度,吸光率A260/A280比值在1.8到2之间为合格。
2.2mRNA片段化
采用NEBNext RNA Fragmentation系统或者其他商业化公司mRNA片段化试剂盒。
mRNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒
2.3用商业化公司cDNA合成试剂盒进行mRNA合成第一链以及第二链cDNA。
cDNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
3.cDNA/DNA末端修补
利用T4聚合酶及Klenow大肠杆菌聚合酶片断,对于cDNA/DNA5′突出粘末端补平以及3′突出粘末端打平,产生平末端,用于后续的平端连接。反应在PCR扩增仪中进行,20摄氏度,30分钟。
反应材料 |
体积 |
纯化后cDNA/DNA样本库 |
50微升 |
磷酸化反应缓冲液 |
10微升 |
脱氧碱基混合物dNTP(每种10mM) |
4微升 |
T4DNA聚合酶 |
5微升 |
Klenow大肠杆菌聚合酶片段 |
1微升 |
T4多聚核苷酸激酶 |
5微升 |
无核酸酶水 |
总体积补至100微升 |
cDNA/DNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
4.在cDNA/DNA样本3′末端加上碱基A
反应在PCR扩增仪中进行,37℃,30分钟。
cDNA/DNA样本库 |
约30微升 |
10X Klenow大肠杆菌聚合酶缓冲液 |
5微升 |
脱氧碱基dATP(1mM) |
10微升 |
Klenow大肠杆菌聚合酶片段 |
3微升 |
无核酸酶水 |
总体积补至50微升 |
cDNA/DNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
5.在cDNA/DNA两端加上接头
反应材料 |
体积 |
cDNA/DNA样本库 |
约15微升 |
2XT4DNA连接酶缓冲液 |
5微升 |
DNA两端接头 |
6微升 |
T4DNA连接酶 |
3微升 |
无核酸酶水 |
总体积补至50微升 |
cDNA/DNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
如使用mRNA→cDNA,进行6和7;
如果是用基因组DNA,直接跳到8。
6.分离出合适长度的cDNA片段
使用电泳凝胶,对照DNA梯度标准,在凝胶上剪切出150-250碱基cDNA片段。
将含有cDNA样本库的凝胶样本过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
7.cDNA片段样本库质量检测
使用生物分析仪,进行cDNA定性定量分析,并确认分离出的cDNA片断长度峰值合理。
8.扩增DNA模板
聚合酶链反应(PCR),在PCR扩增仪中进行。
PCR条件:置于PCR扩增仪中,98℃预变性30秒,98℃变性30秒,65℃退火30秒,72℃延伸30秒,共循环15次(cDNA样本库)或者4-6次(DNA样本库)。最后在72℃延伸5分钟。
PCR扩增产物过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
9.扩增后cDNA/DNA样本库质量检测
使用生物分析仪,进行cDNA/DNA定性定量分析,并确认纯化后片段长度峰值合理,约200bp。
对于得到的eDNA/DNA样本库,如果cDNA小于30纳克/微升,DNA浓度小于150纳克/微升,须将样品经过真空浓缩机低温干燥(低于45℃),再用无核酸酶水溶解至所需浓度。
二、准备DNA探针库
可以针对以下已知基因中的一种或多种准备DNA探针库:
ABL1 |
LCX |
ELK4 |
RAD51L1 |
CBLB |
NFE2L2 |
GNA11 |
TCL6 |
ABL2 |
LHFP |
ELKS |
RAF1 |
CBLC |
NFIB |
GNAQ |
TET2 |
ACSL3 |
LIFR |
ELL |
RALGDS |
CCDC6 |
NFKB2 |
GNAS |
TFE3 |
AF15Q14 |
LMO1 |
ELN |
RANBP17 |
CCNB1IP1 |
NIN |
GOLGA5 |
TFEB |
AF1Q |
LMO2 |
EML4 |
RAP1GDS1 |
CCND1 |
NKX2-1 |
GOPC |
TFG |
AF3p21 |
LPP |
EP300 |
RARA |
CCND2 |
NONO |
GPC3 |
TFPT |
AF5q31 |
LRIG3 |
EPS15 |
RB1 |
CCND3 |
NOTCH1 |
GPHN |
TFRC |
AKAP9 |
IYL1 |
ERBB2 |
RBM15 |
CCNE1 |
NOTCH2 |
GRAF |
THRAP3 |
AKT1 |
MADH4 |
ERCC1 |
RECQL4 |
CD273 |
NPM1 |
H3F3A |
TIF1 |
AKT2 |
MAF |
ERCC2 |
REL |
CD274 |
NR4A3 |
HCMOGT-1 |
TLX1 |
ALDH2 |
MAFB |
ERCC3 |
RET |
CD74 |
NRAS |
HEAB |
TLX3 |
ALK |
MALT1 |
ERCC4 |
ROS1 |
CD79A |
NSD1 |
HERPUD1 |
TMPRSS2 |
’ALOI7 |
MAML2 |
ERCC5 |
RPL22 |
CD79B |
NTRK1 |
HEY1 |
TNFAIP3 |
APC |
MAP2K4 |
ERG |
RPN1 |
CDH1 |
NTRK3 |
HIP1 |
TNFRSF14 |
ARHGEF12 |
MDM2 |
ETV1 |
RUNDC2A |
CDH11 |
NUMA1 |
HIST1H4I |
TNFRSF17 |
ARHH |
MDM4 |
ETV4 |
RUNX1 |
CDK12 |
NUP214 |
HLF |
TNFRSF6 |
ARID1A |
MDSI |
ETV5 |
RUNX2 |
CDK4 |
NUP98 |
HLXB9 |
top1 |
ARID2 |
MDS2 |
ETV6 |
RUNXBP2 |
CDK6 |
OLIG2 |
HMGA1 |
TP53 |
ARNT |
MECT1 |
EVI1 |
SBDS |
CDKN2A |
OMD |
HMGA2 |
TPM3 |
ASPSCR1 |
MED12 |
EWSR1 |
SDC4 |
CDKN2a(p14) |
P2RY8 |
HNRNPA2B1 |
TPM4 |
ASXL1 |
MEN1 |
EXT1 |
SDH5 |
CDKN2B |
PAFAH1B2 |
HOOK3 |
TPR |
ATF1 |
MET |
EXT2 |
SDHB |
CDKN2C |
PALB2 |
HOXA11 |
TRIM27 |
ATIC |
MITF |
EZH2 |
SDHC |
CDX2 |
PAX3 |
HOXA13 |
TRIM33 |
ATM |
MKL1 |
EZR |
SDHD |
CEBPA |
PAX5 |
HOXA9 |
TRIP11 |
ATRX |
MLF1 |
FACL6 |
SMAD4 |
CEP1 |
PAX7 |
HOXC11 |
TSC1 |
BAP1 |
MLH1 |
FAM22A |
SEP6 |
CHCHD7 |
PAX8 |
HOXC13 |
TSC2 |
BCL10 |
MLL |
FAM22B |
SET |
CHEK2 |
PBRM1 |
HOXD11 |
TSHR |
BCL11A |
MLL2 |
FAM46C |
SETD2 |
CHIC2 |
PBX1 |
HOXD13 |
TTL |
BCL11B |
MLL3 |
FANCA |
SF3B1 |
CHN1 |
PCM1 |
HRAS |
U2AF1 |
BCL2 |
MLLT1 |
FANCC |
SFPQ |
CIC |
PCSK7 |
HRPT2 |
USP6 |
BCL3 |
MLLT10 |
FANCD2 |
SFRS3 |
CIITA |
PDE4DIP |
HSPCA |
VHL |
BCL5 |
MLLT2 |
FANCE |
SH3GL1 |
CLTC |
PDGFB |
HSPCB |
VTI1A |
BCL6 |
MLLT3 |
FANCF |
SIL |
CLTCL1 |
PDGFRA |
IDH1 |
WAS |
BCL7A |
MLLT4 |
FANCG |
SLC34A2 |
CMKOR1 |
PDGFRB |
IDH2 |
WHSC1 |
BCL9 |
MLLT6 |
FBXO11 |
SLC45A3 |
COL1A1 |
PER1 |
IKZF1 |
WHSC1L1 |
BCOR |
MLLT7 |
FBXW7 |
SMARCA4 |
COPEB |
PHF6 |
IL2 |
WIF1 |
BCR |
MN1 |
FCGR2B |
SMARCB1 |
COX6C |
PHOX2B |
IL21R |
WNT1 |
BHD |
MPL |
FEV |
SMO |
CREB1 |
PICALM |
IL6ST |
WRN |
BIRC3 |
MSF |
FGFR1 |
SOCS1 |
CREB3L1 |
PIK3CA |
IL7R |
WT1 |
BLM |
MSH2 |
FGFR1OP |
SOX2 |
CREB3L2 |
PIK3R1 |
IRF4 |
WTX |
BMPR1A |
MSH6 |
FGFR2 |
SRGAP3 |
CREBBP |
PIM1 |
IRTA1 |
WWTR1 |
BRAF |
MSI2 |
FGFR3 |
SRSF2 |
CRLF2 |
PLAG1 |
ITK |
XPA |
BRCA1 |
MSN |
FH |
SS18 |
CRTC3 |
PML |
JAK1 |
XPC |
BRCA2 |
MTCP1 |
FHIT |
SS18L1 |
CTNNB1 |
PMS1 |
JAK2 |
XPO1 |
BRD3 |
MUC1 |
FIP1L1 |
SSH3BP1 |
CYLD |
PMS2 |
JAK3 |
XRCC1 |
BRD4 |
MUTYH |
FLI1 |
SSX1 |
D10S170 |
PMX1 |
JAZF1 |
YWHAE |
BRIP1 |
MYB |
FLJ27352 |
SSX2 |
DAXX |
PNUTL1 |
JUN |
ZNF145 |
BTG1 |
MYC |
FLT3 |
SSX4 |
DDB2 |
POU2AF1 |
KDM5A |
ZNF198 |
BUB1B |
MYCL1 |
FNBP1 |
STK11 |
DDIT3 |
POU5F1 |
KDM5C |
ZNF278 |
C12orf9 |
MYCN |
FOXL2 |
STL |
DDX10 |
PPARG |
KDM6A |
ZNF331 |
C15orf21 |
MYD88 |
FOXO1A |
SUFU |
DDX5 |
PPP2R1A |
KDR |
ZNF384 |
C15orf55 |
MYH11 |
FOXO3A |
SUZ12 |
DDX6 |
PRCC |
KIAA1549 |
ZNF521 |
C16orf75 |
MYH9 |
FOXP1 |
SYK |
DEK |
PRDM1 |
KIF5B |
ZNF9 |
C2orf44 |
MYST4 |
FSTL3 |
TAF15 |
DICER1 |
PRDM16 |
KIT |
ZRSR2 |
CAMTA1 |
NACA |
FUBP1 |
TAL1 |
DNM2 |
PRF1 |
KLK2 |
ATP6V1F |
CANT1 |
NBS1 |
FUS |
TAL2 |
DNMT3A |
PRKAR1A |
KRAS |
BCAT2 |
CARD11 |
NCOA1 |
FVT1 |
TCEA1 |
DUX4 |
PRO1073 |
KTN1 |
LAMP1 |
CARS |
NCOA2 |
GAS7 |
TCF1 |
EBF1 |
PSIP2 |
LAF4 |
PDLA6 |
CBFA2T1 |
NCOA4 |
GATA1 |
TCF12 |
ECT2L |
PTCH |
LASP1 |
PSMC1 |
CBFA2T3 |
NDRG1 |
GATA2 |
TCF3 |
EGFR |
PTEN |
LCK |
VDAC2 |
CBFB |
NF1 |
GATA3 |
TCF7L2 |
EIF4A2 |
PTPN11 |
LCP1 |
WARS |
CBL |
NF2 |
GMPS |
TCL1A |
ELF4 |
RAB5EP |
|
|
探针设计策略见图2。其中,侧翼序列长度为目标区域外的碱基数,大部分时候属于重复或者内含子区域。探针重叠区域为每个探针之间的重叠碱基数目。重叠区域越大,目标区域覆盖率越高;重叠区域越小,甚至探针间隔分布,测序成本则越低。探针长度越长,测序时对于单核苷酸多态性(SNP)的容忍度越高。
具体探针设计模式包括:探针长度与探针重叠/间隔区域长度固定,侧翼序列长度变化。这种模式能够保证一致覆盖,通过多个探针对单个基因的富集能够保证富集度高,相对脱靶率低。
示例性地,最后将探针长度确定为120个碱基,以保证对SNP的容忍度和对基因颠换的敏感性。通过对primer软件的改进,对设计的探针进行分析,以准确的知道探针的退火温度、GC成分连续重复单基数量(如CCCCCCC)。
首先使用了2倍重叠的方法,对500余所选基因(基于mRNA)进行全程覆盖。通过对探针质量的分析,选择了退火温度在90-100度之间,GC成分大致控制在40%-60%之间,并且连续单基数量较少的探针。同时通过对人类基因库的检索,保证所选探针的有较小的脱靶率。
经过筛选,上述五百余个基因共有9748个探针符合标准,通过IDT DNATechnologies,单独合成了每一个探针并用质谱分析保证质量,在5’端有生物素(Biotin)。
通过对外显子的分析,在保证基本每个外显子有一个相吻合的探针的情况下,对9748个探针进行进一步筛选和优化,最后选定3179个探针。
三、DNA捕获探针杂交
1.将DNA样本库与目标区域生物素化的DNA探针库杂交
1.1DNA样本库预处理
将cDNA/DNA样本库与杂交缓冲液混合,反应条件为95℃5分钟,之后保持在65℃。反应在PCR扩增仪中进行。
1.2准备探针库
针对要富集的一个或多个目标基因中的每一个,选择已设计和筛选得到的多个探针,形成针对一个目标基因的探针库,或在同时富集多个目标基因的情况下,形成混合探针库。然后将步骤1.1中的混合物与探针库混合,反应条件为65℃5分钟。将杂交反应置于PCR扩增仪中,65℃孵育24小时。
四、得到经杂交富集的目标基因片段
1.准备链霉亲和素(Streptavidin-Coated)磁珠
使用Dynabeads链霉亲和素磁珠或者其它商业化公司链霉亲和素磁珠。将磁珠置于混匀仪上混匀,每个样本需要50微升磁珠。
磁珠洗涤:混合50微升磁珠和200微升结合缓冲液,在混匀仪上混匀,使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机,将磁珠与缓冲液分离纯化,缓冲液弃掉不用。重复三次,每次加入200微升结合缓冲液。
2.分离杂交产物
混合1中的杂交反应混合物与2中的链霉亲和素磁珠,反复颠倒试管5次。在室温下振摇30分钟。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机,将磁珠分离纯化。
然后向磁珠中加入500微升洗涤缓冲液,在65℃孵育10分钟,每隔5分钟混匀一次。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机,将磁珠分离纯化。
以上步骤重复三次。
3.cDNA/DNA富集样本释放
将磁珠与50微升洗脱缓冲液混合,室温孵化10分钟,每隔5分钟混匀一次。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机,将磁珠分离弃掉。此时上清液中即含有富集过的目标区域cDNA/DNA样本库。
将样本库过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
经过RT-PCR对一些随机所选的基因进行定量,以全基因组为对照,表明上述方法能够将所选目的基因片段富集300-1500倍。
五、PCR扩增与纯化
将富集cDNA/DNA样本库进一步扩增,为测序仪器上样做准备。本步骤可以进行多重标签,进行多重测序,即一次对同时富集多个目标基因得到的富集产物进行测序,以节约成本。
反应材料 |
体积 |
富集cDNA/DNA样本库 |
约30微升 |
10X高准确率超保真DNA聚合酶缓冲液 |
5微升 |
高准确率超保真DNA聚合酶 |
1微升 |
正引物 |
1微升 |
反引物 |
1微升 |
无核酸酶水 |
总体积补至50微升 |
PCR条件:置于PCR扩增仪中,98℃预变性30秒,98℃变性30秒,65℃退火30秒,72℃延伸30秒,共循环15次(cDNA样本库)或者4-6次(DNA样本库)。最后在72℃延伸5分钟。
PCR扩增产物过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
六、采用下一代测序技术检测目标基因的基因结构突变
使用下一代商业化的测序仪器进行测序,如Roche454、Illumina Hiseq等。测序结果用已有的测序软件分析包进行分析。
示例性地,使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS,使用桥式PCR对DNA样本库模板进行扩增:每个DNA样本片段将会在芯片上形成克隆簇,每条泳道上产生数百万这样的克隆簇。使用Illumina HiSeq2000下一代测序系统,PE-90bp其原理是边合成边测序。和传统Sanger方法相比,利用“可逆性末端终结反应”技术,四种dNTP碱基末端被保护基团封闭,并分别以不同颜色荧光标记。
经过QC筛选后,对测序结果使用了Bowtie对所得片段进行序列映射,百分之八十以上的测序片断能够被顺利映射。通过统计分析,百分之九十九以上的碱基被测序覆盖;百分之七十五以上碱基被覆盖六十次以上。
利用Bioconductor软件,成功映射片段进行突变分析。
综上所述,本发明人开发了基于杂交选择而捕获特定基因DNA序列的方法,采用该方法可以获得成几千倍富集的特定目标基因片段,该经富集的目标基因片段样本可以选择性地应用于各种基因检测技术,特别是可以应用下一代测序技术进行基因突变、缺失、增加、和颠换等方面的检测。这种基于杂交选择的靶向捕获,在很多领域极为有用。例如,对于捕获保存久远的DNA,对于临床样本中癌症基因的深度测序,对于罕见基因突变的检测等,由于其特定基因的富集作用,可以获得良好的目标基因片段检测样本,从而应用检测技术、例如下一代测序技术得以检测。
本发明针对现有技术不足,采用对经常突变的基因进行试验优化,最后达到能够同时快捷,高通量的对多个基因(600余个)进行检测,结果准确,可靠。并能对多种基因结构突变进行分析,包括单碱基突变、mRNA缺失或增多、mRNA结构颠换、mRNA剪接变化。
并且,对于将通过本发明的方法富集得到的目标基因片段用于基于下一代测序技术的基因结构突变检测的应用而言,还具有以下有益效果:
使用本发明的基因富集方法,能够一次同时富集多个目标基因,例如同时富集多个癌症基因,然后将富集得到的包含多个经富集癌症基因的DNA进行筛查,从而可以准确地获得多个癌症基因中的各种突变。这种方法需要的样品量少,并且这种能够一次对多个癌症基因进行筛查成功改进了传统检测方法一份样品只能检测一个基因的局限。并且,由于采用下一代测序技术,因此能够一次性检测多种类型基因突变;准确性高,传统技术例如基因芯片技术,通常需要重复两次以上才能确定检测结果,而本发明在一次反应中,对单个碱基进行反复测序,保证了数据的精准度,并且缩短了检测周期;高通量,在一次测序中,通过对样本进行标记,能够对多个样品同时测序;敏感性高,和传统检测技术相比,本发明产生的数据能够达到碱基级的分辨率,使敏感度有了大幅度提高。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。
用以上描述的实验方法,针对所列的500余目标基因,对全基因组或基于mRNA合成的双链cDNA进行了杂交捕获。所用的细胞系为
MDA-MB-231(乳腺癌),HT-29(直肠癌),K-562(血癌),HCT-116(直肠癌),NCI-H1975(非小细胞肺癌)等不同癌症的细胞系。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为常规商店购买得到。
实施例1:采用本发明的方法富集并检测细胞中的KRAS基因
本实施例富集并检测MDA-MB-231细胞系的KRAS基因。
一、准备待检测MDA-MB-231细胞系的DNA样本库
1.提取MDA-MB-231细胞系的全基因组DNA,然后将其片段化(采用此种方式获得的DNA样本库称为“源自全基因组的DNA样本库”)
1.1DNA提取
采用Qiagen Blood&Tissue DNeasy试剂盒(货号:69506),从MDA-MB-231细胞系(人类乳腺癌细胞系,来自ATCC细胞库,货号:HTB-26)提取全基因组DNA。按说明书指示方法操作。
使用分光光度定量仪以及凝胶电泳系统检测DNA的质量和浓度。dsDNA的260nm吸光率大于0.05以上,吸光率A260/A280比值在1.8到2之间为合格。
1.2DNA片段化
将3微克高质量的基因组DNA用低TE缓冲液稀释至120微升。按照组织匀浆机使用说明书,将DNA片段化,使片段长度为150-200碱基。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63880)将DNA过柱纯化。
1.3DNA样本库质量检测
用生物分析仪进行DNA定性定量分析,确认DNA片段长度峰值合理。
2.提取MDA-MB-231细胞系的mRNA,将其片段化,然后合成双链cDNA(采用此种方式获得的DNA样本库称为“源自mRNA的DNA样本库”即cDNA样本库)
2.1mRNA提取
采用Qiagen Rneasy试剂盒(货号:74106),从MDA-MB-231细胞系提取mRNA。按说明书指示方法操作。
使用分光光度定量仪以及凝胶电泳系统检测mRNA质量和浓度,吸光率A260/A280比值在1.8到2之间为合格。
2.2mRNA片段化
采用NEBNext RNA Fragmentation系统或者其他商业化公司mRNA片段化试剂盒,将mRNA片段化。然后使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63880)将mRNA过柱纯化。
2.3合成双链cDNA
以该经片段化的mRNA为模板,使用LifeTechnologies cDNA合成试剂盒(货号:AM1745)合成双链cDNA。
然后使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63880)将cDNA过柱纯化。
3.cDNA/DNA末端修补
利用T4聚合酶及Klenow大肠杆菌聚合酶片断,对于cDNA/DNA5′突出粘末端补平以及3′突出粘末端打平,产生平末端,用于后续的平端连接。反应在PCR扩增仪中进行,20摄氏度,30分钟。
反应材料 |
体积 |
纯化后cDNA/DNA样本库 |
50微升 |
磷酸化反应缓冲液 |
10微升 |
脱氧碱基混合物dNTP(每种10mM) |
4微升 |
T4DNA聚合酶 |
5微升 |
Klenow大肠杆菌聚合酶片段 |
1微升 |
T4多聚核苷酸激酶 |
5微升 |
无核酸酶水 |
总体积补至100微升 |
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63880)将cDNA/DNA过柱纯化。
4.在cDNA/DNA样本3′末端加上碱基A
反应在PCR扩增仪中进行,37℃,30分钟。
反应材料 |
体积 |
cDNA/DNA样本库 |
约30微升 |
10X Klenow大肠杆菌聚合酶缓冲液 |
5微升 |
脱氧碱基dATP(1mM) |
10微升 |
Klenow大肠杆菌聚合酶片段 |
3微升 |
无核酸酶水 |
总体积补至50微升 |
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63880)将cDNA/DNA过柱纯化。
5.在cDNA/DNA两端加上接头
反应材料 |
体积 |
cDNA/DNA样本库 |
约15微升 |
2XT4DNA连接酶缓冲液 |
5微升 |
DNA两端接头 |
6微升 |
T4DNA连接酶 |
3微升 |
无核酸酶水 |
总体积补至50微升 |
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63880)将cDNA/DNA过柱纯化。
6.从获得的cDNA库中分离出合适长度的cDNA片段
使用电泳凝胶,对照DNA梯度标准,在凝胶上剪切出150—250碱基cDNA片段。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63880)将含有cDNA样本库的凝胶样本过柱纯化。
7.cDNA片段样本库质量检测
使用生物分析仪,进行cDNA定性定量分析,并确认分离出的cDNA片断长度峰值合理。
8.扩增步骤5获得的DNA片段样本库或步骤7获得的cDNA片段样本库
聚合酶链反应(PCR),在PCR扩增仪中进行。
PCR条件:置于PCR扩增仪中,98℃预变性30秒,98℃变性30秒,65℃退火30秒,72℃延伸30秒,共循环15次(cDNA样本库)或者4—6次(DNA样本库)。最后在72℃延伸5分钟。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63880)将PCR扩增产物过柱纯化。
9.扩增后cDNA/DNA样本库的质量检测
使用生物分析仪,进行cDNA/DNA定性定量分析,并确认纯化后片段长度峰值合理,约200bp。因此,分别获得了源自全基因组和mRNA的MDA-MB-231细胞系的DNA样本库。’
对于得到的cDNA/DNA样本库,如果cDNA小于30纳克/微升,DNA浓度小于150纳克/微升,须将样品经过真空浓缩机低温干燥(低于45℃),再用无核酸酶水溶解至所需浓度。本实施例的下文将采用获得的源自全基因组的DNA样本库进行富集和检测。
二、针对KRAS基因准备DNA探针库
探针设计策略见图2。侧翼序列长度为目标区域外的碱基数,大部分时候属于重复或者内含子区域。探针重叠区域为每个探针之间的重叠碱基数目。重叠区域越大,目标区域覆盖率越高;重叠区域越小,甚至探针间隔分布,测序成本则越低。探针长度越长,测序时对于单核苷酸多态性(SNP)的容忍度越高。
探针设计模式:探针长度与探针重叠/间隔区域长度固定,侧翼序列长度变化。这种模式能够保证一致覆盖,通过多个探针对单个基因的富集能够保证富集度高,相对脱靶率低。
探针长度最后确定为120个碱基,以保证对SNP的容忍度和对基因颠换的敏感性。通过对primer5软件的改进,我们能够对设计的探针进行分析,以准确的知道探针的退火温度,GC成分,连续重复单基数量(如CCCCCC)。
使用了2倍重叠的方法,对KRAS mRNA(NCBI登录号:NM_004985.3)进行全程覆盖。通过对人类基因库的检索,保证所选探针有较小的脱靶率。经过筛选,首先有67个探针符合标准,通过IDT DNA Technologies,单独合成了每一个探针并用质谱分析保证质量,并在5’端有生物素(Biotin)。
然后,通过对探针碱基的分析,选择退火温度在90-100度之间,GC成分大致控制在40%-60%之间,并且连续单基数量少于4个的探针。通过生物系学分析,排除相近基因及同一家族基因,最后采用29个富集效果明显、脱靶率低的探针。
之后,通过对外显子的分析,在保证基本每个外显子有一个相吻合的探针的情况下,对29个探针进行了筛选和优化,最终共筛选得到10个DNA探针,分别为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.10。
商业合成这些探针。
三、将DNA样本库与生物素化的DNA探针库杂交
将DNA样本库与杂交缓冲液(10mM Tris-HCl,2%牛血清白蛋白,pH8.0)混合(混合后,DNA样本库浓度至多不超过50ng/ul),反应条件为95℃5分钟,之后保持在65℃。反应在PCR扩增仪中进行。
然后以DNA样本库:探针库为1:100的摩尔比,将探针库加入上述混合物,反应条件为65℃5分钟。将杂交反应置于PCR扩增仪中,65℃孵百24小时。
四、得到经杂交富集的KRAS基因片段
1.准备链霉亲和素磁珠
使用Dynabeads(Lifetechnologies,货号:11206D)链霉亲和素磁珠或者其它商业化公司链霉亲和素磁珠。将磁珠置于混匀仪上混匀。
磁珠洗涤:混合50微升磁珠和200微升结合缓冲液(10mM Tris-HCl,2%牛血清白蛋白,pH8.0),在混匀仪上混匀,使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机,将磁珠与缓冲液分离纯化,缓冲液弃掉不用。重复三次,每次加入200微升结合缓冲液。
2.分离杂交产物
混合步骤三中得到的杂交反应混合物与步骤四的1中得到的链霉亲和素磁珠,反复颠倒试管5次。在室温下振摇30分钟。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机,将磁珠分离纯化。
然后向磁珠中加入500微升洗涤缓冲液(磷酸缓冲液,0.1%Tween-20,0.1%SDS,pH7.4),在65℃孵育10分钟,每隔5分钟混匀一次。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机,将磁珠分离纯化。以上步骤重复三次。
3.DNA富集样本释放
将磁珠与50微升洗脱缓冲液(10mM氢氧化钠溶液)混合,室温孵化10分钟,每隔5分钟混匀一次。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机,将磁珠分离弃掉。此时上清液中即含有富集过的KRAS基因片段DNA样本库。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63880)将样本库过柱纯化。
采用RT-PCR荧光定量分析对经探针富集的样本进行KRAS基因片段富集效果的检验。其中,以未富集的全基因组DNA样本库作为对照,内参为b-actin,RT-PCR引物序列为:
SEQ ID NO.11(正向):TGTGGTAGTTGGAGCTGGTG
SEQ ID NO.12(反向):TGTTGGATCATATTCGTCCACAA
结果见图3和下表1。
表1
|
Ct值第一次重复 |
Ct值第二次重复 |
Ct值第三次重复 |
Ct均值 |
Ct差 |
富集倍数 |
未富集样本 |
36.97 |
37.05 |
37.02 |
37.01 |
0 |
1 |
已优化探针 |
23.79 |
23.84 |
23.75 |
23.79 |
13.22 |
9546.50 |
经RT-PCR检测,本发明的探针能够将KRAS基因片段富集9547倍。因此,能够从全基因组中有选择性的检测KRAS基因的相关突变。
此外,发明人还采用获得的源自mRNA的全转录组库DNA样本进行富集和检测,这一样本库与探针库的杂交以及经杂交富集的KRAS基因片段的分离与上文相同。经RT-PCR检测,发现本发明的探针能够将KRAS基因片段富集5649倍。因此,也能够从全转录组中有选择性的检测KRAS基因的相关突变。
五、PCR扩增与纯化
将富集cDNA/DNA样本库进一步扩增,为测序仪器上样做准备。
反应材料 |
体积 |
富集cDNA/DNA样本库 |
约30微升 |
10X高准确率超保真DNA聚合酶缓冲液 |
5微升 |
高准确率超保真DNA聚合酶 |
1微升 |
正引物 |
1微升 |
反引物 |
1微升 |
无核酸酶水 |
总体积补至50微升 |
PCR条件:置于PCR扩增仪中,98℃预变性30秒,98℃变性30秒,65℃退火30秒,72℃延伸30秒,共循环15次(cDNA样本库)或者4-6次(DNA样本库)。最后在72℃延伸5分钟。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63880)将PCR扩增产物过柱纯化。
六、采用下一代测序技术检测KRAS基因的基因结构突变
使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS,使用桥式PCR对DNA样本库模板进行扩增:每个DNA样本片段将会在芯片上形成克隆簇,每条泳道上产生数百万这样的克隆簇。使用Illumina HiSeq2000下一代测序系统,PE-90bp其原理是边合成边测序。和传统Sanger方法相比,利用“可逆性末端终结反应”技术,四种dNTP碱基末端被保护基团封闭,并分别以不同颜色荧光标记。
经过QC筛选后,对测序结果使用了Bowtie对所得片段进行序列映射,百分之八十以上的测序片断能够被顺利映射。通过统计分析,百分之九十九以上的碱基被测序覆盖;百分之七十五以上碱基被覆盖六十次以上。
利用Bioconductor软件,成功映射片段进行突变分析。
测序结果表明,在MDA-MB-231细胞系的KRAS基因中发现一处单碱基突变,为38G>A。结果见图4。图4中正对照为正常人类淋巴B细胞。
经过DNA提取、PCR扩增和Sanger测序法,以上突变已被验证。
实施例2:采用本发明的方法富集并检测细胞中的KRAS基因
本实施例富集并检测HCT-116细胞系的KRAS基因。
利用实施例1中得到的由SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.10组成的探针库,采用和实施例1中相同的方法检测HCT-116细胞系(人类大肠癌细胞系,来自ATCC细胞库,货号:ATCC-CCL-247)的KRAS基因,在HCT-116细胞系的KRAS基因中发现一处单碱基突变,为38G>A。结果见图4。
经过DNA提取,PCR扩增和Sanger测序法,以上突变已被验证。
实施例3:采用本发明的方法富集并检测细胞中的EGFR基因
本实施例检测K-562细胞系的EGFR基因。
一、准备待检测K-562细胞系的DNA样本库
除K-562细胞系(人类慢性白血病细胞系,来自ATCC细胞库,货号:ATCC-CCL-243)不同之外,实验操作与实施例1的第一步骤相同。
二、针对EGFR基因准备DNA探针库
除EGFR mRNA(NCBI登录号:NM_005228.3)不同之外,实验操作与实施例1的第二步骤相同。通过对人类基因库的检索,保证所选探针有较小的脱靶率。经过筛选,首先有85个探针符合标准,通过IDT DNATechnologies,单独合成了每一个探针并用质谱分析保证质量,并在5’端有生物素(Biotin)。
然后,通过对探针碱基的分析,选择退火温度在90-100度之间,GC成分大致控制在40%-60%之间,并且连续单基数量少于4个的探针。通过生物系学分析,排除相近基因及同一家族基因,最后采用26个富集效果明显、脱靶率低的探针。
之后,通过对外显子的分析,在保证基本每个外显子有一个相吻合的探针的情况下,对29个探针进行了筛选和优化,最终共筛选得到10个DNA探针,分别为SEQ ID NO.13至SEQ ID NO.22。
商业合成这些探针。
三、将DNA样本库与生物素化的DNA探针库杂交
实验操作与实施例1的第三步骤相同。
四、得到经杂交富集的EGFR基因片段
实验操作与实施例1的第四步骤相同。
采用RT-PCR荧光定量分析对经探针富集的样本进行EGFR基因片段富集效果的检验。其中,以未富集的全基因组DNA样本库作为对照,内参为b-actin,RT-PCR引物序列为:
SEQ ID NO.23(正向):GCACAGACATGAAGCTGCG
SEQ ID NO.24(反向):GTGGGCAGGTAGGTGAGTTC
结果见图5和下表2。
表2
|
Ct值第一次重复 |
Ct值第二次重复 |
Ct值第三次重复 |
Ct均值 |
Ct差 |
富集倍数 |
未富集样本 |
36.56 |
36.65 |
36.94 |
36.72 |
0 |
1.0 |
已优化探针 |
23.36 |
23.39 |
23.34 |
23.36 |
13.35 |
10430.4 |
经RT-PCR检测,本发明的探针能够将EGFR基因片段富集10430倍。因此,能够从全基因组中有选择性的检测EGFR基因的相关突变。
此外,发明人还采用获得的源自mRNA的全转录组库DNA样本进行富集和检测,这一样本库与探针库的杂交以及经杂交富集的EGFR基因片段的分离与上文相同。经RT-PCR检测,发现本发明的探针能够将EGFR基因片段富集6428倍。因此,也能够从全转录组中有选择性的检测EGFR基因的相关突变。
五、PCR扩增与纯化
实验操作与实施例1的第五步骤相同。
六、采用下一代测序技术检测EGFR基因的基因结构突变
实验操作与实施例1的第六步骤相同。
测序结果表明,在K-562细胞系中发现有EGFR基因扩增。
实施例4:采用本发明的方法富集并检测细胞中的EGFR基因
本实施例检测NCI-H1975细胞系的EGFR基因。
利用实施例3中得到的由SEQ ID NO.13至SEQ ID NO.22组成的探针库,采用和实施例3中相同的方法检测NCI-H1975细胞系(人类肺癌细胞系,来自ATCC细胞库,货号:ATCC-CRL-5908)的EGFR基因,在NCI-H1975细胞系中发现二处EGFR基因单碱基突变,分别为2369C>T,2573T>G。
经过DNA提取,PCR扩增和Sanger测序法,以上突变已被验证。
实施例5:采用本发明的方法富集并检测细胞中的BRAF基因
本实施例富集并检测MDA-MB-231细胞系的BRAF基因。
一、准备待检测MDA-MB-231细胞系的DNA样本库
实验操作与实施例1的第一步骤相同。
二、针对BRAF基因准备DNA探针库
除BRAF mRNA(NCBI登录号:NM_004333.4)不同之外,实验操作与实施例1的第二步骤相同。通过对人类基因库的检索,保证所选探针有较小的脱靶率。经过筛选,首先有24个探针符合标准,通过IDT DNATechnologies,单独合成了每一个探针并用质谱分析保证质量,并在5’端有生物素(Biotin)。
然后,通过对探针碱基的分析,选择退火温度在90-100度之间,GC成分大致控制在40%-60%之间,并且连续单基数量少于4个的探针。通过生物系学分析,排除相近基因及同一家族基因,最后采用13个富集效果明显、脱靶率低的探针。
之后,通过对外显子的分析,在保证基本每个外显子有一个相吻合的探针的情况下,对13个探针进行了筛选和优化,最终共筛选得到6个DNA探针,分别为SEQ ID NO.25至SEQ ID NO.30。
商业合成这些探针。
三、将DNA样本库与生物素化的DNA探针库杂交
实验操作与实施例1的第三步骤相同。
四、得到经杂交富集的BRAF基因片段
实验操作与实施例1的第四步骤相同。
采用RT-PCR荧光定量分析对经探针富集的样本进行BRAF基因片段富集效果的检验。其中,以未富集的全基因组DNA样本库作为对照,内参为b-actin,RT-PCR引物序列为:
SEQ ID NO.31(正向):GTTACCCAGTGGTGTGAGGG
SEQ ID NO.32(反向):TGTGCAGTCTGTCGTGCAAT
结果见图6和下表3。
表3
|
Ct值第一次重复 |
Ct值第二次重复 |
Ct值第三次重复 |
Ct均值 |
Ct差 |
富集倍数 |
未富集样本 |
34.96 |
34.98 |
35.15 |
35.03 |
0 |
1 |
已优化探针 |
22.01 |
22.04 |
21.97 |
22.01 |
13.02 |
8324.2 |
经RT-PCR检测,本发明的探针能够将BRAF基因片段富集8324倍。因此,能够从全基因组中有选择性的检测BRAF基因的相关突变。
此外,发明人还采用获得的源自mRNA的全转录组库DNA样本进行富集和检测,这一样本库与探针库的杂交以及经杂交富集的BRAF基因片段的分离与上文相同。经RT-PCR检测,发现本发明的探针能够将BRAF基因片段富集4296倍。因此,也能够从全转录组中有选择性的检测BRAF基因的相关突变。
五、PCR扩增与纯化
实验操作与实施例1的第五步骤相同。
六、采用下一代测序技术检测BRAF基因的基因结构突变
实验操作与实施例1的第六步骤相同。
测序结果表明,在MDA-MB-231细胞系的BRAF基因中发现一处单碱基突变,为1391G>T。
经过DNA提取、PCR扩增和Sanger测序法,以上突变已被验证。
实施例6:采用本发明的方法富集并检测细胞中的BRAF基因
本实施例富集并检测HT-29细胞系的BRAF基因。
利用实施例5中得到的由SEQ ID NO.25至SEQ ID NO.30组成的探针库,采用和实施例5中相同的方法检测HT-29细胞系(人类结肠癌细胞系,来自ATCC细胞库,货号:ATCC-HTB-38)的BRAF基因,在HT-29细胞系的BRAF基因中发现一处单碱基突变,为1799T>A。
经过DNA提取,PCR扩增和Sanger测序法,以上突变已被验证。
实施例7:采用本发明的方法分别富集并检测细胞中的BCR-ABL融合基因
本实施例分别富集并检测K-562细胞系和MDA-MB-231细胞系的BCR-ABL融合基因。
一、分别准备待检测细胞系的DNA样本库
除K-562细胞系(人类慢性白血病细胞系,来自ATCC细胞库,货号:ATCC-CCL-243)和MDA-MB-231细胞系(人类乳腺癌细胞系,来自ATCC细胞库,货号:HTB-26)不同之外,实验操作与实施例1的第一步骤相同。
二、针对BCR和ABL1基因准备DNA探针库
除BCR和ABL1基因(基于mRNA;BCRNCBI登录号:NM_004327.3,ABL1NCBI登录号:NM_005157.4)不同之外,实验操作与实施例1的第二步骤相同。通过对探针质量的分析,选择了退火温度在90-100度之间,GC成分大致控制在40%-60%之间,并且连续单基数量较少的探针。同时通过对人类基因库的检索,保证所选探针的有较小的脱靶率。
经过筛选,共有123个探针符合标准,通过IDT DNA Technologies,单独合成了每一个探针并用质谱分析保证质量,在5’端有生物素(Biotin)。
使用每个探针分别对全基因组进行了富集和扩增,最后采用了49个富集效果明显,脱靶率低的探针。
之后,通过对外显子的分析,在保证基本每个外显子有一个相吻合的探针的情况下,对49个探针进行了筛选和优化,最终共筛选得到31个DNA探针,分别为SEQ ID NO.33至SEQ ID NO.63。
商业合成这些探针。
三、将DNA样本库与生物素化的DNA探针库杂交
实验操作与实施例1的第三步骤相同。
四、得到经杂交富集的基因片段
实验操作与实施例1的第四步骤相同。
采用RT-PCR荧光定量分析对经探针富集的样本进行基因片段富集效果的检验。其中,以未富集的全基因组DNA样本库作为对照,内参为b-actin,RT-PCR引物序列为:
SEQ ID NO.64(正向):TGAGGATACTGTGCTATGAAA
SEQ ID NO.65(反向):CCTTGCCCGTCGTGTGCTGAAG
经RT-PCR检测,本发明的探针能够将BCR-ABL基因片段富集4598倍。因此,能够从全基因组中有选择性的检测BCR-ABL基因及其相关结构突变。
五、PCR扩增与纯化
实验操作与实施例1的第五步骤相同。
六、采用下一代测序技术检测是否存在BCR-ABL基因或其基因结构突变
实验操作与实施例1的第六步骤相同。
测序结果表明,在K-562细胞系中发现基因融合BCR:ABL,而在MDA-MB-231细胞系中没有检测到突变。通过本发明的方法,K-562的融合点可以准确定位在Chr22:23632743、Chr9:133614146。结果见图7。
经过DNA提取、PCR扩增和Sanger测序法,以上突变已被验证。
实施例8:采用本发明的方法分别富集并检测细胞中的BCR-ABL融合基因
本实施例富集并检测KU812细胞系的BCR-ABL融合基因
利用实施例7中得到的由SEQ ID N0.33至SEQ ID NO.63组成的探针库,采用和实施例7中相同的方法检测KU812细胞系(人类慢性白血病细胞系,来自ATCC细胞库,货号:ATCC-CRL-210)的BCR-ABL基因,在KU812细胞系中发现BCR:ABL基因融合,融合点为Chr22:23632851、Chr9:133650197。
经过DNA提取,PCR扩增和Sanger测序法,以上突变已被验证。
实施例9:
采用本发明提供的富集和检测方法,在MDA-MB-231细胞系中发现四处单碱基突变和一处碱基缺失。四处单碱基突变分别为,BRAF基因1391G>T,KRAS基因38G>A,NF2基因691G>T,TP53基因839G>A。一处碱基缺失为CDKN2A基因1471de1471。
实施例10:
采用本发明提供的富集和检测方法,在HT-29细胞系中发现四处单碱基突变和一处碱基插入。四处单碱基突变分别为,BRAF基因1799T>A,PIK3CA基因1345C>A,SMAD4基因931C>T,TP53基因818G>A。一处碱基插入为APC基因4666_4667insA。
实施例11:
采用本发明提供的富集和检测方法,在K-562细胞系中发现一处单碱缺失,一处碱基插入和一处基因融合。一处碱基缺失为CDKN2A基因1471de1471。一处碱基插入为TP53基因406_407insC。一处基因融合为BCR:ABL。
实施例12:
采用本发明提供的富集和检测方法,在NCI-H1975细胞系中发现五处单碱基突变,分别为,CDKN2A基因205G>T,EFGR基因2369C>T,2573T>G,PIK3CA基因353G>A,TP53基因818G>A。
经过DNA提取,PCR扩增和Sanger测序法,以上突变已被验证。