CN110240999A - 一种提高循环肿瘤dna检出率的检测装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种提高循环肿瘤DNA检出率的检测装置及方法。所述检测装置包括：模板制备单元，用于制备抛锚搭桥模板；分子延伸单元，用于利用抛锚搭桥模板将循环肿瘤DNA分子片段进行延伸，所述抛锚搭桥模板的长度长于所述循环肿瘤DNA分子片段；模板清除单元，用于清除所述抛锚搭桥模板，获得延伸后的循环肿瘤DNA分子片段，所述延伸后的循环肿瘤DNA分子片段能够被PCR方法扩增。本发明检测装置及方法使得循环肿瘤DNA分子的检测灵敏度提高了三倍左右，这对于目前的循环肿瘤DNA分子检测技术是一个很重要的进步。

Description

一种提高循环肿瘤DNA检出率的检测装置及方法

技术领域

本发明涉及癌症相关领域。具体涉及一种提高循环肿瘤DNA检出率的检测装置及方法。

背景技术

恶性肿瘤，也就是癌症对于人类健康是一种主要威胁。目前，肿瘤诊断主要依然于各种病理学方法，其中组织活检被认为是肿瘤诊断的金标准。然而，由于样品获得的限制以及较低的敏感度，组织活检作为肿瘤诊断有相当的局限性。在肿瘤生长过程中，一些肿瘤细胞会从其原发位置脱离，并释放到循环系统，成为循环肿瘤细胞(CTC)。此外，在循环系统中也存在来自肿瘤细胞的基因组DNA，即ctDNA。来自肿瘤细胞的，和癌症发生相关的基因组DNA上的突变，存在于ctDNA中，因此，是否能够检测到ctDNA的存在，是至关重要的第一步。

在循环系统中，除了有些晚期癌症，大多数情况下，ctDNA只占血液中无细胞循环DNA(ccfDNA)的很小的一部分。正是由于ctDNA的含量低，就需要无论是灵敏度，还是特异性都很高的检测方法，才能可靠地检测出ctDNA的量。

在ctDNA检测技术方面，可以分为基于PCR和基于NGS两大类，即使是基于NGS的检测方法，也包含了一个PCR扩增的过程。然而，ctDNA是以DNA片段方式存在于血液中，平均长度约160个核苷酸，其断裂的位点是随机的。而一个PCR反应则需要完整的，连续的DNA序列才能扩增，因此很多ctDNA分子不可能被检测出。所以，假如有一个技术能够使得不可检出的ctDNA，转变成可检出的ctDNA，就能够大大地提高ctDNA检测灵敏度。

发明内容

鉴于上述问题，本发明的第一个目的在于提供一种提高循环肿瘤DNA检出率的检测装置。

本发明的第二个目的在于提供一种提高循环肿瘤DNA检出率的方法。

本项发明“抛锚搭桥”技术可以将大多数无法检测的ctDNA片段转化为可检测的分子，从而大大提高了检测血液中低含量ctDNA的灵敏度。这对于将来设计ctDNA检测方法，无论是基于PCR的方法，还是基于NGS的方法，对于提高检测的灵敏度都有非常重要的意义。经过本发明的“抛锚搭桥”技术，可检出的ctDNA部分，从少于30％增加到大于85％。

为实现上述第一个目标，本发明采用了如下的技术方案：

一种提高循环肿瘤DNA检出率的检测装置，所述检测装置包括：

模板制备单元：用于制备抛锚搭桥模板，所述抛锚搭桥模板为包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链；

分子延伸单元：用于利用抛锚搭桥模板将循环肿瘤DNA分子片段进行延伸，所述抛锚搭桥模板的长度长于所述循环肿瘤DNA分子片段的长度；

模板清除单元：所述循环肿瘤DNA分子片段完成延伸后，用于清除所述抛锚搭桥模板，获得延伸后的循环肿瘤DNA分子片段，所述延伸后的循环肿瘤DNA分子片段能够被PCR方法扩增。

优选地，模板制备单元中，制备所述抛锚搭桥模板采用克隆包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的方法或者合成循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的方法。

优选地，所述克隆包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的方法包括：

高温处理将包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列双链解开，得到包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链；

加入捕获引物，所述捕获引物与所述包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列单链的末端互相配对结合，所述捕获引物的一端具有生物素；

加入链亲和素磁珠，所述链亲和素磁珠与所述捕获引物一端的生物素结合，在磁场的作用下，所述链亲和素磁珠带着捕获引物以及包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链沉降，收集沉降物以得到末端结合有捕获引物的包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链；

高温处理将相互配对结合的包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链与捕获引物解开，在磁场的作用下，所述链亲和素磁珠带着捕获引物沉降，收集上清液，即获得纯化后的包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链，即为抛锚搭桥模板。

优选地，所述克隆包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的方法中：

所述包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列单链为包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的正链；

所述捕获引物为15-45个核苷酸长的DNA寡聚物，所述捕获引物序列与包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的负链的3’末端一致，所述捕获引物的5’端具有生物素。

优选地，分子延伸单元中，利用抛锚搭桥模板将循环肿瘤DNA分子片段进行延伸的过程为：将所述抛锚搭桥模板与所述循环肿瘤DNA分子片段进行混合，加入A，C，G，T四种脱氧核糖核苷三磷酸、聚合酶以及聚合酶缓冲液，加热后退火，使得所述抛锚搭桥模板与所述循环肿瘤DNA分子片段有效配对结合，所述循环肿瘤DNA分子片段在末端发生扩展。

优选地，所述抛锚搭桥模板与所述循环肿瘤DNA分子片段的加入比例为10-1000：1。

优选地，所述抛锚搭桥模板为包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的正链；所述抛锚搭桥模板与所述循环肿瘤DNA分子片段的负链有效配对结合，使得所述循环肿瘤DNA分子片段负链的3’末端发生扩展。

优选地，分子延伸单元中，循环进行利用所述抛锚搭桥模板将循环肿瘤DNA分子片段进行延伸的步骤。

优选地，模板清除单元中，所述循环肿瘤DNA分子片段完成延伸后，清除所述抛锚搭桥模板的过程为：

高温处理将延伸后的循环肿瘤DNA分子片段与抛锚搭桥模板解开，向体系中加入捕获引物以及链亲和素磁珠，所述捕获引物与所述抛锚搭桥模板的末端互相配对结合，所述链亲和素磁珠与所述捕获引物一端的生物素结合；在磁场的作用下，所述链亲和素磁珠带着所述捕获引物以及所述抛锚搭桥模板沉降，收集上清液，即获得延伸后的循环肿瘤DNA分子片段。

优选地，所述抛锚搭桥模板为包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的正链；

所述捕获引物为15-45个核苷酸长的DNA寡聚物，所述捕获引物序列与抛锚搭桥模板的3’末端一致，所述捕获引物的5’端具有生物素。

为实现上述第二个目标，本发明采用了如下的技术方案：

一种提高循环肿瘤DNA检出率的方法，包括如下步骤：

步骤A：制备抛锚搭桥模板，所述抛锚搭桥模板为包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链；

步骤B：利用抛锚搭桥模板将循环肿瘤DNA分子片段进行延伸，所述抛锚搭桥模板的长度长于所述循环肿瘤DNA分子片段；

步骤C：所述循环肿瘤DNA分子片段完成延伸后，清除所述抛锚搭桥模板，获得延伸后的循环肿瘤DNA分子片段，所述延伸后的循环肿瘤DNA分子片段能够被PCR方法扩增。

如上所述的利用抛锚搭桥模板将循环肿瘤DNA分子片段进行延伸的过程，可称为本发明的“抛锚搭桥”过程。本发明所述的提高循环肿瘤DNA检出率的方法也可称为“抛锚搭桥”方法。

优选地，步骤A中，制备所述抛锚搭桥模板采用克隆包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的方法或者合成包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的方法。

即，所述抛锚搭桥模板可以是克隆后包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链，也可以是合成的包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链。

优选地，所述克隆包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的方法包括：

高温处理将包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的双链解开，得到包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链；

加入捕获引物，所述捕获引物与所述包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链的末端互相配对结合，所述捕获引物的一端具有生物素；

加入链亲和素磁珠，所述链亲和素磁珠与所述捕获引物一端的生物素结合，在磁场的作用下，所述链亲和素磁珠带着捕获引物以及包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链沉降，收集沉降物以得到末端结合有捕获引物的包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链；

高温处理将相互配对结合的包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链与捕获引物解开，在磁场的作用下，所述链亲和素磁珠带着捕获引物沉降，收集上清液，即获得纯化后的包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链，即为抛锚搭桥模板。

上述克隆包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的方法中：

所述包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链为包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的正链；

所述捕获引物为15-45个核苷酸长的DNA寡聚物，所述捕获引物序列与包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的负链的3’末端一致，所述捕获引物的5’端具有生物素。

所述捕获引物在本发明中有两个作用：一是用于制备以及纯化单链的抛锚搭桥模板；二是在循环肿瘤DNA分子完成延伸后，用于清除抛锚搭桥模板。

包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的正负链的5’末端，均含有一小段基因组序列，分别称为正向引物(正链的5’末端)和反向引物(负链的5’末端)，两个引物均位于循环肿瘤DNA序列的外侧，通常为20个核苷酸长左右。

两个引物，均含有额外的6个核苷酸，和特定的一些限制性内切酶的识别顺序一致，以便于用限制性内切酶来回收包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列。

优选地，步骤B中，利用抛锚搭桥模板将循环肿瘤DNA分子片段进行延伸的过程为：将所述抛锚搭桥模板与所述循环肿瘤DNA分子片段进行混合，加入A，C，G，T四种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、聚合酶以及聚合酶缓冲液，加热后退火，使得所述抛锚搭桥模板与所述循环肿瘤DNA分子片段有效配对结合，并且使得所述循环肿瘤DNA分子片段在末端发生扩展。

优选地，所述抛锚搭桥模板与所述循环肿瘤DNA分子片段的加入比例为10-1000：1。

优选地，所述抛锚搭桥模板为包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的正链；所述抛锚搭桥模板能够与所述循环肿瘤DNA分子片段的负链有效配对结合，使得所述循环肿瘤DNA分子片段负链的3’末端发生扩展，即新的DNA序列添加到循环肿瘤DNA分子的负链的3’末端。

优选地，步骤B中，循环进行利用所述抛锚搭桥模板将循环肿瘤DNA分子片段进行延伸的步骤。

上述的循环肿瘤DNA分子延伸反应，没有循环次数的限制，可以进行一次或者多次。次数越多，循环肿瘤DNA分子片段的延伸效率越高。

优选地，步骤C中，所述循环肿瘤DNA分子片段完成延伸后，清除所述抛锚搭桥模板的过程为：

高温处理将延伸后的循环肿瘤DNA分子片段与抛锚搭桥模板解开，向体系中加入捕获引物以及链亲和素磁珠，所述捕获引物与所述抛锚搭桥模板的末端互相配对结合，所述链亲和素磁珠与所述捕获引物一端的生物素结合；在磁场的作用下，所述链亲和素磁珠带着所述捕获引物以及所述抛锚搭桥模板沉降，收集上清液，即获得延伸后的循环肿瘤DNA分子片段。

本发明的“抛锚搭桥”检测装置及方法可以运用定量PCR的方法测定其效率，其中的抛锚搭桥模板可以用Sanger测序法进行验证。经验证，经过本发明的抛锚搭桥后，可检出的ctDNA部分，从少于30％增加到大于85％。

有益效果

在本发明专利中，阐述了一种叫“抛锚搭桥”的技术方案，即在每个ctDNA分子的末端加上核苷酸。经过“抛锚搭桥”处理后，更多的ctDNA分子可以被PCR方法扩增，因此更多的ctDNA分子可以通过PCR或NGS方法检测。所以，“抛锚搭桥”法可以使得ctDNA的检测灵敏度提高了三倍左右，这对于目前的ctDNA检测技术是一个很重要的进步。

附图说明

图1示出了本发明实施例1中的包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的示意图。

图2示出了设计本发明实施例1中的捕获引物的示意图。

图3示出了本发明实施例1中循环肿瘤DNA分子可检出比例的示意图。

图4示出了本发明实施例1中抛锚搭桥过程示意图。

具体实施方式

为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细描述。在这些附图中，对于相同或者相当的构成要素，标注相同标号。以下仅为本发明的最佳实施方式，本发明并不仅限于下述内容。

实施例1

附图中的数字所代表的含义为：

1-包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的正链，即抛锚搭桥模板；2-包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的负链；3-内含子部分；4-外显子部分；5-正向引物；6-反向引物；7-生物素；8-捕获引物；9-循环肿瘤DNA分子负链A；10-循环肿瘤DNA分子负链B；11-循环肿瘤DNA分子负链C；12-循环肿瘤DNA分子负链D；13-循环肿瘤DNA分子负链E；14-断裂位点；15-癌症相关突变；16-延伸序列。

一种提高循环肿瘤DNA检出率的方法，所述方法包括：

步骤A：制备抛锚搭桥模板，所述抛锚搭桥模板为包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链；

步骤B：利用抛锚搭桥模板将循环肿瘤DNA分子片段进行延伸，所述抛锚搭桥模板的长度长于所述循环肿瘤DNA分子片段；

步骤C：所述循环肿瘤DNA分子片段完成延伸后，清除所述抛锚搭桥模板，获得延伸后的循环肿瘤DNA分子片段，所述延伸后的循环肿瘤DNA分子片段能够被PCR方法扩增。

步骤A中，制备所述抛锚搭桥模板采用克隆包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的方法或者合成包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的方法。

本实施例中，制备抛锚搭桥模板采用克隆包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的方法，所述克隆包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的方法包括：

高温处理将包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的双链解开，得到包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链；

加入捕获引物，所述捕获引物与所述包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链的末端互相配对结合，所述捕获引物的一端具有生物素；

加入链亲和素磁珠，所述链亲和素磁珠与所述捕获引物一端的生物素结合，在磁场的作用下，所述链亲和素磁珠带着捕获引物以及包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链沉降，收集沉降物以得到末端结合有捕获引物的循环肿瘤DNA分子单链；

高温处理将相互配对结合的包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链与捕获引物解开，在磁场的作用下，所述链亲和素磁珠带着捕获引物沉降，收集上清液，即获得纯化后的包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链，即为抛锚搭桥模板。

所述包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链为其正链。

然而，如果负链也可以在某些情况下使用，例如，如果突变经常出现在exon的5'区域。抛锚搭桥模板无论是用正链，还是用负链，在原理上没有差别。

所述捕获引物为25-30个核苷酸长的DNA寡聚物。

在抛锚搭桥模板选择正链的前提下，所述捕获引物序列与包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的负链的3’末端一致，所述捕获引物的5’端具有生物素。

采用克隆的方法制备抛锚搭桥模板的具体的操作步骤如下述S1-S6步骤：

S1.用正常人细胞基因组DNA作为材料，用PCR方法扩增约200bp长的特定的一些基因组区域，这些区域包含了部分或者一个完整的外显子，以及外显子周围的一些内含子区域，其中的外显子覆盖了与某些特定癌症发生相关的突变热点。这里用的所有PCR引物的5’端，含有额外的6个核苷酸，和特定的一些限制性内切酶的识别顺序一致，以便于回收基因组DNA片段。

S2.连接PCR产物到TA克隆载体上，连接反应物转化大肠杆菌。挑选白色克隆做细菌培养，抽提质粒DNA，用Sanger方法检验插入的DNA片段序列。带有正确顺序的质粒DNA，再用限制性内切酶把基因组DNA片段切下来，用琼脂糖凝胶分离，并纯化基因组DNA片段。

S3.合成一系列25-30bp长的DNA寡聚物，这些寡聚物的5’端带有生物素，其顺序和相应基因组片段的负链的3’端的最后的序列一致，这些寡聚物称之为“捕获引物”。

S4.从步骤2回收的DNA片段，在95℃高温下变性处理2分钟，然后马上放进水浴以免两条单链重新配对。然后，加入从步骤3获得的捕获引物，在50℃孵育5分钟，促使捕获引物和基因组DNA片段的正链结合。加入链亲和素磁珠，在37℃孵育5分钟。转移小管至磁场，室温下静止2分钟，让磁珠沉到小管底部，在按照磁珠供应商提高的方法洗涤3次，扔掉每次洗涤过程中的上清液。

S5.加入100微升TE缓冲液，在95℃高温处理磁珠2分钟，然后马上转移到冰浴中。转移小管至磁场，室温下静止2分钟，让磁珠沉到小管底部，收集上层水相。现在上清液里，含有基因组DNA片段的正链，即为“抛锚搭桥”模板。

S6.重复步骤4和步骤5，以尽可能彻底地去掉负链，得到纯化的含有正常人细胞基因组DNA片段的正链，即抛锚搭桥模板。

需要说明的是，在本实施例中，上述含有正常人细胞的基因组DNA，其基因组序列和所述循环肿瘤DNA分子序列大致是一样的，唯一的区别在于循环肿瘤DNA分子的序列中带有突变，而正常人细胞的基因组DNA序列中没有突变。因此，上述含有正常人细胞的基因组DNA片段的正链，即可认为是包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链，即为抛锚搭桥模板。

图1示出了本发明实施例中的包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的示意图。

图1中，该基因序列包括正链1(黑色线)和负链(灰色线)，其中正链1(黑色线)和负链(灰色线)都包含外显子部分4(粗线)和内含子部分3(细线)。其中，正链1即为本实施例所述的抛锚搭桥模板。

在该图中，正链1的5’末端的一小段序列，被称为正向引物5，图中黑色圆圈圈出部分的放大，即代表正向引物5。负链2的5’末端的一小段序列，被称为反向引物6，图中黑色圆圈圈出部分的放大，即代表反向引物6。

正向引物5和反向引物6均含有约20bp长的基因组序列，两个引物的5’端均加了6个核苷酸，分别为不同限制性内切酶的识别序列。

图2示出了本发明实施例中捕获引物的设计示意图。

图2中，该捕获引物8位于包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的负链2的3’端，因此能和包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的正链1结合，也即能与抛锚搭桥模板1结合。在捕获引物8的5’端，加上一个生物素7，能和带有链亲和素的磁珠紧密结合。

步骤B中，利用抛锚搭桥模板将循环肿瘤DNA分子片段进行延伸的过程为：将所述抛锚搭桥模板与所述循环肿瘤DNA分子片段进行混合，加入A，C，G，T四种脱氧核糖核苷三磷酸、聚合酶以及聚合酶缓冲液，加热后退火，使得所述抛锚搭桥模板与所述循环肿瘤DNA分子片段有效配对结合，所述循环肿瘤DNA分子片段在末端发生扩展。

所述抛锚搭桥模板为包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的正链；所述抛锚搭桥模板能够与所述循环肿瘤DNA分子片段的负链有效配对结合，使得所述循环肿瘤DNA分子片段负链的3’末端发生扩展。

该过程具体为下述S7步骤：

S7.混合从S6步骤得到的抛锚搭桥模板和从血浆抽提得到的DNA样品，其中的比例按照100个抛锚搭桥模板分子对一个血浆DNA分子。加入高保真DNA聚合酶Phusion，聚合酶缓冲液和dNTP。

步骤C中，所述循环肿瘤DNA分子片段完成延伸后，清除所述抛锚搭桥模板的过程为：

高温处理将延伸后的循环肿瘤DNA分子片段与抛锚搭桥模板解开，向体系中加入捕获引物以及链亲和素磁珠，所述捕获引物与所述抛锚搭桥模板的末端互相配对结合，所述链亲和素磁珠与所述捕获引物一端的生物素结合；在磁场的作用下，所述链亲和素磁珠带着所述捕获引物以及所述抛锚搭桥模板沉降，收集上清液，即获得延伸后的循环肿瘤DNA分子片段。该过程具体为下述S8步骤：

S8.搭桥完毕后，需要清除反应液中的抛锚搭桥模板。为此，在95℃高温处理2分钟，然后马上转移到冰浴中。加入捕获引物和磁珠，37℃孵育5分钟。转移小管至磁场，室温下静止2分钟，让磁珠沉到小管底部，收集上层水相。现在上清液里，含有完成“抛锚搭桥“的DNA样品。

图3示出了本发明实施例中ctDNA可检出比例的示意图。

在图3中，抛锚搭桥模板1以黑色线表示，而循环肿瘤DNA分子负链以灰色线表示(9-13分别代表A-E五个循环肿瘤DNA分子负链)；外显子部分4以粗线表示，而内含子部分3以细线表示。PCR反应的产物长度约为120bp，即图中两条竖线之间的区域。图中显示了5个ctDNA分子负链9-13。圆圈标出的部分代表基因断裂位点14。其中4个(A分子负链9,B分子负链10,C分子负链11,D分子负链12)的随机断裂点14位于PCR产物内，因此不能被PCR扩增，即不能被检出；只有一个ctDNA分子负链，即E分子负链13，含完整的PCR产物的序列，因此可以被扩增，即可以被检出。图中的椭圆圈表示能被检出的ctDNA分子中癌症相关突变15。

图4示出了本发明实施例中抛锚搭桥过程示意图。

循环肿瘤DNA分子负链A-E(图中9-13)代表来自不同癌细胞的分子负链，假如有突变，那么在A-E分子负链里，这些癌症相关突变15在同一个位置，而且突变种类也必须一样。

在图4中，ctDNA分子负链(9-13)的5’部分和抛锚搭桥模板1(图中黑色线表示)配对结合后，在聚合酶反应体系里实施延伸，延伸序列16用间断线表示。

其结果是3个原先不能被扩增的ctDNA分子负链(9，10和11)，由于在3’段进行了延伸，现在可以被扩增，即可以被检出。只有ctDNA分子负链12，因为突变位于需要被延伸的3’一侧，即使经过了末端延伸，依然不能被检出。

为了进一步得到“抛锚搭桥”的效率，本实施例中，还采用了PCR方法测定“抛锚搭桥“的效果，用正常人细胞的基因组DNA作为待抛锚搭桥的测试样品进行了分析。

首先，基因组DNA用超声把正常人细胞的基因组DNA打断成平均约150bp长的片段，未经过超声处理的同量DNA作为对照。本申请选择了和癌症发生相关的12个位点，包括了BRAF，CTNNB1，EGFR，FGFR3，GNAS，IDH1，JAK2，KRAS，MED12，p53，PIK3CA，SMAD4。用实施例中所述方法对超声处理过的随机断裂的DNA进行“抛锚搭桥”过程，以测定抛锚搭桥的效率测定。每个与癌症发生相关的位点的测定包括了0，1，2，3次“抛锚搭桥”反应，用未处理过的完整基因组DNA作为参照，每个反应都重复三次，取平均值。用定量PCR的方法测定“抛锚搭桥”效率，即完整基因组DNA的相对量为100％，其它的均以基因组DNA的百分比显示。定量PCR的条件为：95℃ 1分钟热激活DNA聚合酶以后，95℃ 20秒，55℃20秒，72℃ 30秒，总共进行40个循环。

表1示出经过0，1，2，3轮抛锚搭桥过程后能被PCR方法扩增从而被检出的循环肿瘤DNA分子中与癌症相关位点的百分比数据。

表1经过0-3轮抛锚搭桥过程后所检出的与癌症相关位点的百分比数据

上述数据显示出：未经过“抛锚搭桥”处理，与癌症相关位点的可检出率从12.5％到30.1％，平均为20％；经过一次“抛锚搭桥”后，其可检出率从51.8％到68.2％，提高到平均为59.6％；经过二次“抛锚搭桥”后，其可检出率从75.4％到86.6％，提高到平均为81.9％；经过三次“抛锚搭桥”后，其可检出率从81.5％到91.6％，提高到平均为86.3％。

本实施例中的“抛锚搭桥”技术可以将大多数无法检测的ctDNA片段转化为可检测的分子，从而大大提高了检测血液中低含量ctDNA的灵敏度。这对于将来设计ctDNA检测方法，无论是基于PCR的方法，还是基于NGS的方法，对于提高检测的灵敏度都有非常重要的意义。该技术在有关肿瘤DNA临床检测领域中具有广泛的应用前景。

实施例2

本实施例涉及一种提高循环肿瘤DNA检出率的检测装置，所述检测装置包括：

模板制备单元：用于制备抛锚搭桥模板，所述抛锚搭桥模板为包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链；

分子延伸单元：用于利用抛锚搭桥模板将循环肿瘤DNA分子片段进行延伸，所述抛锚搭桥模板的长度长于所述循环肿瘤DNA分子片段的长度；

模板清除单元：所述循环肿瘤DNA分子片段完成延伸后，用于清除所述抛锚搭桥模板，获得延伸后的循环肿瘤DNA分子片段，所述延伸后的循环肿瘤DNA分子片段能够被PCR方法扩增。

优选地，模板制备单元中，制备所述抛锚搭桥模板采用克隆包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的方法或者合成循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的方法。

优选地，所述克隆包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的方法包括：

高温处理将包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列双链解开，得到包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链；

加入捕获引物，所述捕获引物与所述包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列单链的末端互相配对结合，所述捕获引物的一端具有生物素；

加入链亲和素磁珠，所述链亲和素磁珠与所述捕获引物一端的生物素结合，在磁场的作用下，所述链亲和素磁珠带着捕获引物以及包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链沉降，收集沉降物以得到末端结合有捕获引物的包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链；

高温处理将相互配对结合的包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链与捕获引物解开，在磁场的作用下，所述链亲和素磁珠带着捕获引物沉降，收集上清液，即获得纯化后的包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链，即为抛锚搭桥模板。

优选地，所述克隆包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的方法中：

所述包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列单链为包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的正链；

所述捕获引物为15-45个核苷酸长的DNA寡聚物，所述捕获引物序列与包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的负链的3’末端一致，所述捕获引物的5’端具有生物素。

优选地，分子延伸单元中，利用抛锚搭桥模板将循环肿瘤DNA分子片段进行延伸的过程为：将所述抛锚搭桥模板与所述循环肿瘤DNA分子片段进行混合，加入A，C，G，T四种脱氧核糖核苷三磷酸、聚合酶以及聚合酶缓冲液，加热后退火，使得所述抛锚搭桥模板与所述循环肿瘤DNA分子片段有效配对结合，所述循环肿瘤DNA分子片段在末端发生扩展。

优选地，所述抛锚搭桥模板与所述循环肿瘤DNA分子片段的加入比例为10-1000：1。

优选地，所述抛锚搭桥模板为包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的正链；所述抛锚搭桥模板与所述循环肿瘤DNA分子片段的负链有效配对结合，使得所述循环肿瘤DNA分子片段负链的3’末端发生扩展。

优选地，分子延伸单元中，循环进行利用所述抛锚搭桥模板将循环肿瘤DNA分子片段进行延伸的步骤。

优选地，模板清除单元中，所述循环肿瘤DNA分子片段完成延伸后，清除所述抛锚搭桥模板的过程为：

高温处理将延伸后的循环肿瘤DNA分子片段与抛锚搭桥模板解开，向体系中加入捕获引物以及链亲和素磁珠，所述捕获引物与所述抛锚搭桥模板的末端互相配对结合，所述链亲和素磁珠与所述捕获引物一端的生物素结合；在磁场的作用下，所述链亲和素磁珠带着所述捕获引物以及所述抛锚搭桥模板沉降，收集上清液，即获得延伸后的循环肿瘤DNA分子片段。

优选地，所述抛锚搭桥模板为包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的正链；

所述捕获引物为15-45个核苷酸长的DNA寡聚物，所述捕获引物序列与抛锚搭桥模板的3’末端一致，所述捕获引物的5’端具有生物素。

本实施例中的检测装置，可按照如实施例1所述的方式进行应用，关于该检测装置的具体技术细节以及所达到的技术效果，参照实施例1，在此不做重复说明。

以上实施方式仅仅是为了说明本发明的原理而采用的示例性实施方式，然而本发明并不局限于此。对于本领域内的普通技术人员而言，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进。这些变型和改进也视为本发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种提高循环肿瘤DNA检出率的检测装置，其特征在于，所述检测装置包括：

模板制备单元，制备抛锚搭桥模板，所述抛锚搭桥模板为包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链；

分子延伸单元，利用抛锚搭桥模板将循环肿瘤DNA分子片段进行延伸，所述抛锚搭桥模板的长度长于所述循环肿瘤DNA分子片段的长度；

模板清除单元，所述循环肿瘤DNA分子片段完成延伸后，清除所述抛锚搭桥模板，获得延伸后的循环肿瘤DNA分子片段，所述延伸后的循环肿瘤DNA分子片段能够被PCR方法扩增。

2.根据权利要求1所述的提高循环肿瘤DNA检出率的检测装置，其特征在于：

模板制备单元中，制备所述抛锚搭桥模板采用克隆包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的方法或者合成循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的方法。

3.根据权利要求2所述的提高循环肿瘤DNA检出率的检测装置，其特征在于，

所述克隆包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的方法包括：

高温处理将包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列双链解开，得到包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链；

加入捕获引物，所述捕获引物与所述包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列单链的末端互相配对结合，所述捕获引物的一端具有生物素；

加入链亲和素磁珠，所述链亲和素磁珠与所述捕获引物一端的生物素结合，在磁场的作用下，所述链亲和素磁珠带着捕获引物以及包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链沉降，收集沉降物以得到末端结合有捕获引物的包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链；

高温处理将相互配对结合的包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链与捕获引物解开，在磁场的作用下，所述链亲和素磁珠带着捕获引物沉降，收集上清液，即获得纯化后的包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链，即为抛锚搭桥模板。

4.根据权利要求3所述的提高循环肿瘤DNA检出率的检测装置，其特征在于，

所述克隆包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的方法中：

所述包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列单链为包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的正链；

所述捕获引物为15-45个核苷酸长的DNA寡聚物，所述捕获引物序列与包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的负链的3’末端一致，所述捕获引物的5’端具有生物素。

5.根据权利要求1所述的提高循环肿瘤DNA检出率的检测装置，其特征在于：

分子延伸单元中，利用抛锚搭桥模板将循环肿瘤DNA分子片段进行延伸的过程为：将所述抛锚搭桥模板与所述循环肿瘤DNA分子片段进行混合，加入A，C，G，T四种脱氧核糖核苷三磷酸、聚合酶以及聚合酶缓冲液，加热后退火，使得所述抛锚搭桥模板与所述循环肿瘤DNA分子片段有效配对结合，所述循环肿瘤DNA分子片段在末端发生扩展。

6.根据权利要求5所述的提高循环肿瘤DNA检出率的检测装置，其特征在于：

所述抛锚搭桥模板与所述循环肿瘤DNA分子片段的加入比例为10-1000：1。

7.根据权利要求5所述的提高循环肿瘤DNA检出率的检测装置，其特征在于：

所述抛锚搭桥模板为包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的正链；所述抛锚搭桥模板与所述循环肿瘤DNA分子片段的负链有效配对结合，使得所述循环肿瘤DNA分子片段负链的3’末端发生扩展。

8.根据权利要求1所述的提高循环肿瘤DNA检出率的检测装置，其特征在于：

分子延伸单元中，循环进行利用所述抛锚搭桥模板将循环肿瘤DNA分子片段进行延伸的步骤。

9.根据权利要求1所述的提高循环肿瘤DNA检出率的检测装置，其特征在于：

模板清除单元中，所述循环肿瘤DNA分子片段完成延伸后，清除所述抛锚搭桥模板的过程为：

高温处理将延伸后的循环肿瘤DNA分子片段与抛锚搭桥模板解开，向体系中加入捕获引物以及链亲和素磁珠，所述捕获引物与所述抛锚搭桥模板的末端互相配对结合，所述链亲和素磁珠与所述捕获引物一端的生物素结合；在磁场的作用下，所述链亲和素磁珠带着所述捕获引物以及所述抛锚搭桥模板沉降，收集上清液，即获得延伸后的循环肿瘤DNA分子片段。

10.根据权利要求9所述的提高循环肿瘤DNA检出率的检测装置，其特征在于：

所述抛锚搭桥模板为包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的正链；

所述捕获引物为15-45个核苷酸长的DNA寡聚物，所述捕获引物序列与抛锚搭桥模板的3’末端一致，所述捕获引物的5’端具有生物素。

11.一种提高循环肿瘤DNA检出率的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤A：制备抛锚搭桥模板，所述抛锚搭桥模板为包含循环肿瘤DNA分子的一段基因组序列的单链；

步骤B：利用抛锚搭桥模板将循环肿瘤DNA分子片段进行延伸，所述抛锚搭桥模板的长度长于所述循环肿瘤DNA分子片段的长度；

步骤C：所述循环肿瘤DNA分子片段完成延伸后，清除所述抛锚搭桥模板，获得延伸后的循环肿瘤DNA分子片段，所述延伸后的循环肿瘤DNA分子片段能够被PCR方法扩增。