CN103305617A - 一种检测低含量基因突变的pcr扩增方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测低含量基因突变的PCR扩增方法及其应用。揭示了一种检测低含量基因突变样本中基因突变的方法，该方法可应用于选择性扩增较高野生型模板背景下的突变型基因，使PCR产物中突变型基因得到富集，从而实现对低含量基因突变的有效检测。本发明为基因突变检测提供了一种简单、廉价、高效且灵敏度高、结果稳定的方法。

Description

一种检测低含量基因突变的PCR扩增方法及其应用

技术领域

本发明属于基因检测领域；更具体地，本发明涉及一种新的PCR扩增方法，尤其涉及一种在高野生型DNA背景下，选择性扩增低含量基因突变DNA的PCR扩增方法，及其在基因突变检测中的应用。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)在1985年由美国Kary BMullis教授发明，该技术采用一对寡核苷酸引物，通过变性、退火、延伸三个循环步骤，可使目标DNA片段呈指数扩增，从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力。PCR技术是一个极其灵敏的信号放大系统，能将极微弱的基因信号检测出来，目前在分子生物学、医学、微生物学、遗传学等领域广泛使用。

DNA分子中发生碱基对的增添、缺失或替换，而引起的基因结构的改变，称为基因突变。通过检测样品中是否存在某些核酸序列变异，可以判断检测对象是否携带突变基因、患有某种疾病或处于某种遗传状态。因此基因突变检测技术已经广泛应用于生命科学研究的众多领域，包括病原微生物的鉴定、分型和耐药性检测，肿瘤患者的药效预测，疾病诊断与预后等。

检测基因突变的方法多种多样，其中应用比较广泛的临床或实验室诊断方法有以下两类：①PCR产物直接测序法，通过PCR扩增出包含待测位点的基因片段后，采用Sanger测序、焦磷酸测序等方法测定位点的核酸序列，以明确是否存在基因突变及相应的突变类型。②荧光PCR检测法，设计针对目标突变位点的特异性引物或特异性荧光探针，通过检测PCR扩增过程中的荧光信号来鉴别基因突变，如ARMS(Amplification Refractory Mutation System)法、TaqMan荧光探针法等。其中PCR产物直接测序法可获得目标位点的核酸序列信息，是基因突变检测的金标准。

Sanger测序法是目前应用最广泛的一种PCR产物测序方法。其基本原理是进行DNA合成反应时，正常掺入dNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)会使DNA链延伸，如果掺入双脱氧核苷酸(ddNTP)，则会终止DNA链的延伸，从而得到以共同引物为5’端，以双脱氧核苷酸为3’端的一系列长度不等的DNA片段。这些片段经过平板胶电泳或毛细管电泳得到分离，通过分析电泳条带获得核酸序列信息。该方法的缺点是灵敏度偏低，突变基因需要超过20%才能检测到突变信号。

焦磷酸测序法是一种新型PCR产物测序法，它采用一对PCR引物(其中一条生物素标记)扩增出目标基因片段后，分离出其中一条单链DNA；再加入测序引物与单链DNA特异性结合，通过四种酶(DNA聚合酶、硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶)的级联反应，将引物延伸过程中产生的焦磷酸(PPi)转化成光信号，通过分析光信号的强度，确定目标位点的核酸序列。常规焦磷酸测序法对突变型的检测灵敏度约为5%，即PCR产物中突变型的比例需达到5%以上方可有效检测。

对于一般的遗传性突变，纯合型突变比例为100%，杂合型突变比例为50%，无论是直接测序法还是荧光PCR法，均可以对突变型和野生型进行很好的区分。然而对于病原体的耐药性突变，以及肿瘤组织样本中的体细胞突变，突变型所占的比例存在不确定性。以肿瘤基因突变检测为例，待测样本通常为石蜡组织切片，其中既包含肿瘤细胞，又混杂了大量的正常细胞，而且并不一定所有的肿瘤细胞都带有突变，突变比例高的可以达到20%以上，突变比例低的可能在1%以下。常规的PCR直接测序法对于突变含量偏低样本的检测能力有限。

因此，本领域亟需开发针对低含量基因突变的PCR扩增方法，以解决现有技术中的检测难题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测低含量基因突变的PCR扩增方法及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种检测低含量基因突变样本中基因突变的方法，所述方法包括：

(1)以待测基因为模板，以分别互补于突变位点上游和下游的一对扩增引物进行PCR扩增，同时加入覆盖突变位点的抑制性寡核苷酸，

其中，所述抑制性寡核苷酸的特征是：

(a)序列中相应于待测突变位点的碱基位于寡核苷酸的中部(优选中间碱基±3个碱基位置；更优选中间碱基±2个碱基位置)；

(b)5’或3’端附近位置存在1-4个(较佳地1-2个)与野生型基因中相应碱基不配对的碱基(较佳地，若5’或3’端存在2个不配对碱基，则它们位于5’和3’端各1个)，其它碱基与野生型基因中相应碱基配对；

(c)其3’末端缺少形成磷酸二酯键的羟基；

其中，所述扩增引物中，一条引物位于所述抑制性寡核苷酸5’端上游，且其3’端有2-10个(较佳地为4-6个)碱基与所述抑制性寡核苷酸的5’端2-10个(较佳地为4-6个)碱基互补于野生型基因模板上相同的位置；另一条引物位于所述抑制性寡核苷酸3’端下游，且其与所述抑制性寡核苷酸互补于野生型基因模板上不同的位置；和

(2)对(1)的PCR扩增产物进行序列分析和/或序列鉴定，确定待测基因是否发生突变。

在本发明的另一方面，提供一种从低含量基因突变样本中富集突变基因的方法，所述方法包括：

以待测基因为模板，以分别互补于突变位点上游和下游的一对扩增引物进行PCR扩增，同时加入覆盖突变位点的抑制性寡核苷酸，

其中，所述抑制性寡核苷酸的特征是：

(a)序列中相应于待测突变位点的碱基位于寡核苷酸的中部(优选中间碱基±3个碱基位置；更优选中间碱基±2个碱基位置)；

(b)5’或3’端附近位置存在1-4个(较佳地1-2个)与野生型基因中相应碱基不配对的碱基(较佳地，若5’或3’端存在2个不配对碱基，则它们位于5’和3’端各1个)，其它碱基与野生型基因中相应碱基配对；

(c)其3’末端缺少形成磷酸二酯键的羟基；

其中，所述扩增引物中，一条引物位于所述抑制性寡核苷酸5’端上游，且其3’端有2-10个(较佳地为4-6个)碱基与所述抑制性寡核苷酸的5’端2-10个(较佳地为4-6个)碱基互补于野生型基因模板上相同的位置；另一条引物位于所述抑制性寡核苷酸3’端下游，且其与所述抑制性寡核苷酸互补于野生型基因模板上不同的位置；和

(2)获得PCR扩增产物，其中富集了突变基因。

在一个优选例中，步骤(1)的(b)中，所述的5’或3’端附近位置是：从5’或3’末端碱基起算，第2-6个(较佳地为3-5个)碱基处；和/或

步骤(1)中，所述抑制性寡核苷酸的长度10-40bp；较佳地为15-35bp；更佳地为20-30bp。

在另一优选例中，步骤(1)的(c)中，在3’末端进行化学修饰，使之缺少形成磷酸二酯键的羟基；较佳地，所述的化学修饰包括：3’磷酸化、3’氨基化、3’巯基化，荧光标记；更佳地为3’磷酸化修饰。

在另一优选例中，步骤(1)中，抑制性寡核苷酸与野生型基因模板的解链温度(Tm-W)、位于所述抑制性寡核苷酸5’端上游的扩增引物的解链温度(Tm-F)、抑制性寡核苷酸与突变型基因模板的解链温度(Tm-M)依次降低。

在另一优选例中，抑制性寡核苷酸与野生型基因模板的解链温度优选为58-62℃；和/或

所述的抑制性寡核苷酸与突变型基因模板的解链温度比所述的抑制性寡核苷酸与野生型基因模板的解链温度低6℃或6℃以上；较佳地低10℃或10℃以上；和/或

所述的位于所述抑制性寡核苷酸5’端上游的扩增引物的解链温度比所述的抑制性寡核苷酸与野生型基因模板的解链温度低1-4℃；较佳地低1-3℃。

在另一优选例中，所述的PCR扩增包括变性、引物退火和引物延伸的循环过程；在适当的退火温度条件下，抑制性寡核苷酸优先结合野生型基因模板，导致位于所述抑制性寡核苷酸5’端上游的扩增引物的3’端无法与野生型基因模板结合，从而抑制野生型基因的扩增；抑制性寡核苷酸与突变型基因模板不能结合，突变型基因正常扩增；较佳地，所述的适当的退火温度为：位于所述抑制性寡核苷酸5’端上游的扩增引物的解链温度(Tm-F)、抑制性寡核苷酸与突变型基因模板的解链温度(Tm-M)之间的温度。

在另一优选例中，步骤(2)中，所述序列分析和/或序列鉴定方法包括(但不限于)：Sanger测序法、焦磷酸测序法、新一代测序法(NGS)、荧光PCR法、基因芯片检测、膜杂交检测。

在另一优选例中，所述基因突变包括(但不限于)：点突变、缺失突变或插入突变。

在另一优选例中，所述的检测低含量基因突变的方法不是疾病诊断方法。

在本发明的另一方面，提供所述的检测低含量基因突变样本中突变基因的方法在基因突变检测中的应用。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、本发明中所使用的抑制性寡核苷酸结构示意图。抑制性寡核苷酸和野生型DNA之间有2个不配对碱基，PCR扩增时可以与野生型DNA模板结合；抑制性寡核苷酸和突变型DNA之间存在3个不配对碱基，PCR扩增时不能与突变型DNA模板结合。

图2、本发明PCR扩增示意图。

图3、本发明用于焦磷酸测序法检测基因突变的示意图。

图4(A)、常规PCR方法对KRAS野生型样本的测序图谱。

图4(B)、本发明PCR方法对KRAS野生型样本的测序图谱。

图4(C)、常规PCR方法对KRAS突变型样本(含0.5%突变)的测序图谱。

图4(D)、本发明PCR方法对KRAS突变型样本(含0.5%突变)的测序图谱。

图4(E)、常规PCR方法对KRAS突变型样本(含2.5%突变)的测序图谱。

图4(F)、本发明PCR方法对KRAS突变型样本(含2.5%突变)的测序图谱。

图4(G)、常规PCR方法对KRAS突变型样本(含5%突变)的测序图谱。

图4(H)、本发明PCR方法对KRAS突变型样本(含5%突变)的测序图谱。

图4(I)、常规PCR方法对KRAS突变型样本(含25%突变)的测序图谱。

图4(J)、本发明PCR方法对KRAS突变型样本(含25%突变)的测序图谱。

图4(K)、常规PCR方法对KRAS突变型样本(含50%突变)的测序图谱。

图4(L)、本发明PCR方法对KRAS突变型样本(含50%突变)的测序图谱。

图5(A)、常规PCR方法对EGFR野生型样本的测序图谱。

图5(B)、本发明PCR方法对EGFR野生型样本的测序图谱。

图5(C)、常规PCR方法对EGFR突变型样本(含0.5%突变)的测序图谱。

图5(D)、本发明PCR方法对EGFR突变型样本(含0.5%突变)的测序图谱。

图5(E)、常规PCR方法对EGFR突变型样本(含5%突变)的测序图谱。

图5(F)、本发明PCR方法对EGFR突变型样本(含5%突变)的测序图谱。

图5(G)、常规PCR方法对EGFR突变型样本(含25%突变)的测序图谱。

图5(H)、本发明PCR方法对EGFR突变型样本(含25%突变)的测序图谱。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，揭示了一种检测低含量基因突变样本中基因突变的方法，该方法可应用于选择性扩增较高野生型模板背景下的突变型基因，使PCR产物中突变型基因得到富集，从而实现对低含量基因突变的有效检测。本发明为基因突变检测提供了一种简单、廉价、高效且灵敏度高、结果稳定的方法。

如本文所用，碱基的“配对”或“匹配”是指两条核苷酸序列中相应的碱基构成了键(如氢键)的连接，例如“A”与“T”之间可形成键。两条序列中足够多(如多于60%的核苷酸是配对的)核苷酸的“匹配”使得两条序列发生互补。

如本文所用，“互补”是指两条单链的核苷酸的序列可以以一种可预见的方式发生相互作用，形成双链结构。相互“互补”的序列通常是指将5’-3’方向的序列转换为其3’-5’方向的序列(如5’ATCG3’→GCTA)，然后再取其互补序列(如GCTA→5’CGAT3’)。

如本文所用，“解链温度(Tm)”或“熔解温度(Tm)”指总的DNA双螺旋结构解开一半时的温度，不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G-C含量越高则Tm值越高，成正比关系。

如本文所用，所述的“低含量基因突变样本”是指一种含量较为复杂的基因样本，其中含有野生型基因以及发生基因突变的基因，例如，突变型基因的含量占野生型和突变型总含量的0.5%、2.5%、5%、25%、50%、60%、70%或80%。

本发明的技术方案的原理是：在PCR扩增体系中，设计一条覆盖目标突变位点的抑制性寡核苷酸和一对不覆盖突变位点的PCR扩增引物。在适当的退火温度条件下，抑制性寡核苷酸优先结合野生型基因模板，导致正向引物的3’端无法与基因模板结合，从而抑制野生型DNA的扩增；抑制性寡核苷酸与突变型基因模板不能结合，突变型DNA可以正常扩增，结果使PCR产物中的突变型DNA的含量得到富集。

一种抑制性寡核苷酸的结构如图1所示，待测突变位点位于抑制性寡核苷酸的中部，在靠近5’和3’端，各包含一个不配对碱基，其它位置的碱基可与野生型基因模板配对。抑制性寡核苷酸和野生型基因模板之间有2个不配对碱基，PCR扩增时可以与野生型基因模板结合；抑制性寡核苷酸和突变型DNA之间存在3个不配对碱基，PCR扩增时不能与突变型基因模板结合。抑制性寡核苷酸的3’末端经过化学修饰，缺少形成磷酸二酯键的羟基，不能引导DNA链的合成。

本发明所述抑制性寡核苷酸长度为10-40bp，优选为15-35bp，更优选20-30bp。待测突变位点位于抑制性寡核苷酸的中部，优选为中间±3个碱基位置；更优选中间±2个碱基位置。5’和3’端的不配对碱基距离相应末端的距离为2-6bp，优选为3-5bp。较佳地，所述抑制性寡核苷酸中间与野生型基因模板的连续配对区长度为14-22bp，优选为16-20bp。

使所述抑制性寡核苷酸的3’末端缺少形成磷酸二酯键的羟基的方法没有特别的限制，可以采用本领域已知的任何方法。较佳地可以采用的化学修饰包括：3’磷酸化、3’氨基化、3’巯基化以及各种荧光标记等，优选地为3’磷酸化修饰。

作为本发明的优选方式，所述的抑制性寡核苷酸与野生型基因模板之间存在2个不配对碱基，二者之间的解链温度(Tm-W)优选在58-62℃。抑制性寡核苷酸与突变型DNA之间存在3个不配对碱基，所以抑制性寡核苷酸与突变型DNA的解链温度(Tm-M)低于Tm-W，通过调整5’和3’端不配对碱基的类型，以及与突变位点的距离，使Tm-M比Tm-W低6℃以上，优选为10℃以上。

本发明所使用的一对PCR引物分别位于待测突变位点的上游和下游，其中一条正向引物的3’端与抑制性寡核苷酸的5’端具有一段重叠区(即它们与野生型基因模板发生互补的区域是一致的)，重叠区的长度为2-10个碱基，优选为4-6个碱基。正向引物的解链温度(Tm-F)要求比Tm-W低1-4℃，较佳地1-3℃，以保证抑制性寡核苷酸能与野生型基因模板优先结合，从而起到阻止正向引物与野生型DNA结合的效果。

为了保证PCR体系中添加的抑制性寡核苷酸不会影响突变型DNA的扩增，要求PCR扩增反应的退火温度设定在Tm-F和Tm-M之间。在此退火条件下，抑制性寡核苷酸能与野生型基因模板结合，但不能与突变型基因模板结合。对于野生型基因模板，优先结合的抑制性寡核苷酸可以阻止正向引物的3’端与基因模板结合，PCR扩增受到抑制。对于突变型基因模板，因为抑制性寡核苷酸不能与之结合，正向引物可以顺利结合突变型DNA，所以突变型DNA的扩增不受影响。这种偏相性扩增突变型DNA的结果导致产物中突变型DNA的含量得到富集，如图2所示。

本发明人长期研究发现，对于PCR体系中添加的一个抑制性寡核苷酸，如果只存在中间位置突变位点的碱基差异，那么抑制性寡核苷酸与野生型和突变型基因模板的结合能力差别不大，在PCR扩增过程中无法达到既抑制野生型扩增，又不影响突变型扩增的效果。因此，本发明人设计了所述的抑制性寡核苷酸，在其5’和3’端附近各引入1个不配对碱基(或在5’或3’端附近引入1个不配对碱基，如本发明实施例2的情况)，二者之间存在一段与野生型完全配对的序列(优选14-22bp，更优选为16-20bp)，可以保证抑制性寡核苷酸与野生型DNA之间有足够的结合能力。但对于突变型DNA来说，抑制性寡核苷酸上存在3个不配对的碱基，相邻不配对碱基之间的配对区都较短(7-9bp)，结果导致二者之间的结合能力显著下降。在适当的退火温度条件下，抑制性寡核苷酸可以达到抑制野生型扩增，而不影响突变型扩增的效果。

依据本发明设计的抑制性寡核苷酸和引物进行PCR扩增时，对于其它一些PCR扩增条件没有特别的限制，反应液中引物浓度、Mg²⁺浓度、dNTP、DNA聚合酶、PCR缓冲液等组分与普通PCR相同。抑制性寡核苷酸的用量一般为引物用量的1-10倍，优选1.5-6倍；更优选为2-4倍。通常情况下，随着PCR体系中抑制性寡核苷酸浓度的增加，对突变型DNA的富集作用会增强。

本发明针对的基因突变包括单碱基变异、缺失、插入等多种形式。若缺失或插入片段涉及到多个碱基，在保证抑制性寡核苷酸不与突变型DNA结合的前提下，可以去除位于寡核苷酸5’或3’端的1个或2个不配对碱基。

本发明的PCR扩增方法适用于检测低含量的基因突变，其扩增产物可结合焦磷酸测序法、Sanger测序法等对目标位点进行序列分析，以确定是否存在基因突变，以及相应的突变类型。也可在PCR扩增过程中，结合使用荧光探针或荧光染料来鉴别是否存在基因突变。该方法可以大大提高基因突变检测的灵敏度，实现对低含量基因突变样本的有效检测。

作为一种选择方式，可应用焦磷酸测序法检测基因突变，如图3所示。其中抑制性寡核苷酸的3’端进行磷酸化修饰，不能引导DNA链的合成。反向引物的5’端进行生物素标记，用于分离单链DNA。另外在紧邻突变位点的位置，设计一条测序引物，用于焦磷酸测序。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1、KRAS基因12和13密码子基因突变实例

本实施例以本发明方法设计PCR引物和抑制性寡核苷酸，结合PCR扩增技术和焦磷酸测序技术来检测KRAS基因12和13密码子基因突变。

1、引物和抑制性寡核苷酸的设计

根据GeneBank数据库公布的KRAS基因序列(ID号：3845)设计引物和抑制性寡核苷酸，参考序列如下(SEQ ID NO:1)：

ATTTTGTAAG GTATTTTGAA ATAATTTTTC ATATAAAGGT GAGTTTGTAT

TAAAAGGTAC TGGTGGAGTA TTTGATAGTG TATTAACCTT ATGTGTGACA

TGTTCTAATA TAGTCACATT TTCATTATTT TTATTATAAG GCCTGCTGAA

AATGACTGAA TATAAACTTG TGGTAGTTGG AGCT GTAGGCAAGA

GTGCCTTGAC GATACAGCTA ATTCAGAATC ATTTTGTGGA CGAATATGAT

CCAACAATAG AGGTAAATCT TGTTTTAATA TGCATATTAC TGGTGCAGGA

CCATTCTTTG ATACAGATAA AGGTTTCTCT GACCATTTTC ATGAGTACTT

其中KRAS基因12和13密码子的野生型序列为GGT GGC，常见的突变型包括12AGT、12CGT、12TGT、12GAT、12GCT、12GTT和13GAC等7种。按照本发明前文所述的引物设计原则，设计一对PCR引物、一条抑制性寡核苷酸和一条测序引物，上下游引物分别命名为KRAS-F1和KRAS-R1，抑制性寡核苷酸命名为KRAS-M，测序引物命名为KRAS-S1，具体序列如下：

KRAS-F1：ACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTG(SEQ ID NO:2)；

KRAS-R1：AATGGTCCTGCACCAGTAA(5’端生物素标记)(SEQ ID NO:3)；

KRAS-M：AGTaGGAGCT

TCGTAGGtAAG(3’端磷酸化修饰)(SEQID NO:4)；

KRAS-S1：TTGTGGTAGTTGGAGCT(SEQ ID NO:5)。

其中KRAS-F1的3’端与KRAS-M的5’端存在5个碱基的重叠区域，可互补于野生型模板上相同的位置(下划线标示)，KRAS-M的近5’和近3’端各包含1个与野生型不配对碱基(小写字母表示)，12和13密码子上的突变位点以方框标示。

PCR扩增引物Tm值如表1。

表1

2、肿瘤组织样本DNA的制备

取临床确诊的结直肠癌石蜡组织样本，制成5-10um的切片。取切片3-5张至1.5mL离心管中，加入1ml二甲苯脱蜡后，离心收集沉淀；加入1ml无水乙醇，震荡混匀，离心弃上清液，室温或37℃晾干残留的乙醇；加入180μlDNA提取液和20μl蛋白酶K溶液，充分混匀，56℃消化至没有可见组织块；加入300μl GDT缓冲液，混匀后70℃孵育10分钟；加入300μl无水乙醇，混匀后转移至离心柱中，8000转/分钟离心1分钟，弃收集管内的滤液；向离心柱内加入700μl洗涤液PW，8000转/分钟离心1分钟，弃滤液；向离心柱内加入700μl洗涤液WA，8000转/分钟离心1分钟，弃滤液；甩干离心柱中残留液体(12000转/分钟离心2分)；向离心柱内的膜中央加入100μlDNA洗脱液，室温放置1分钟后8000转/分钟离心2分钟，所得样本即为肿瘤组织DNA样本。测定OD值后将样本DNA稀释至浓度为10ng/uL备用。

3、不同含量KRAS突变阳性样本的制备

根据GeneBank数据库公布的KRAS基因12和13密码子的野生型序列，人工合成一段野生型KRAS基因序列和一段12密码子GGT>GAT突变序列。将野生型和突变型配比稀释至突变型的含量分别占0.5%、2.5%、5%、25%和0%。

4.PCR扩增

PCR反应体系如下：

PCR反应条件设置为：①95℃预变性3分钟；②95℃变性10秒，56℃退火20秒，72℃延伸30秒，共50个循环；③72℃延伸5分钟。

5、焦磷酸测序分析

向40uL PCR产物中加入40uL结合缓冲液(含2uLStreptavidinSepharoseBeads)，室温振荡混和5-10min，使KRAS-R1引物上标记的生物素与Streptavidin结合；然后采用焦磷酸测序仪配套的单链纯化装置从PCR反应液中分离单链DNA：PCR产物先经70%乙醇清洗5-10秒后，转至Denatureationbuffe中清洗5-10秒，再转至洗涤缓冲液中清洗10秒，将分离得到的单链DNA转移到40uL测序反应液中(含测序引物KRAS-S1的浓度为0.4umol/L)，80℃温浴3-4min后装冷却至室温，置于焦磷酸测序仪进行测序分析。

6、特异性分析

取健康人全血样本50例，以及Sanger测序法验证为KRAS野生型的结直肠癌石蜡组织样本50例，提取DNA后，分别采用本发明设计的PCR体系和常规PCR体系(不添加抑制性寡核苷酸KRAS-M)进行扩增，产物进行焦磷酸测序分析。

图4(A)为常规PCR方法对KRAS野生型样本的测序图谱。

图4(B)为本发明PCR方法对KRAS野生型样本的测序图谱。

两组PCR产物的测序结果均为KRAS野生型，表明本发明的PCR体系中添加的抑制性寡核苷酸KRAS-M不会影响野生型样本的检测。

7、灵敏度分析

取突变百分含量分别为0.5%、2.5%、5%、25%和50%的12GAT突变型样本，分别采用本发明设计的PCR体系和常规PCR体系(不添加抑制性寡核苷酸KRAS-M)进行扩增，产物进行焦磷酸测序分析。

图4(C)为常规PCR方法对KRAS突变型样本(含0.5%突变)的测序图谱。

图4(D)为本发明PCR方法对KRAS突变型样本(含0.5%突变)的测序图谱。

图4(E)为常规PCR方法对KRAS突变型样本(含2.5%突变)的测序图谱。

图4(F)为本发明PCR方法对KRAS突变型样本(含2.5%突变)的测序图谱。

图4(G)为常规PCR方法对KRAS突变型样本(含5%突变)的测序图谱。

图4(H)为本发明PCR方法对KRAS突变型样本(含5%突变)的测序图谱。

图4(I)为常规PCR方法对KRAS突变型样本(含25%突变)的测序图谱。

图4(J)为本发明PCR方法对KRAS突变型样本(含25%突变)的测序图谱。

图4(K)为常规PCR方法对KRAS突变型样本(含50%突变)的测序图谱。

图4(L)为本发明PCR方法对KRAS突变型样本(含50%突变)的测序图谱。

结果表明，常规PCR体系只能检测出突变含量≥5%的阳性样本，对于突变含量为0.5%和2.5%的样本，其检测结果与野生型无差异。而按本发明所述设计的新PCR体系，可以富集PCR产物中突变型的含量。样本中突变型的含量越低，富集效果越显著。根据检测到的突变峰信号值，可以计算出突变型的富集倍数，具体情况见表2。

表2

样本中突变DNA含量	扩增产物中突变DNA含量	富集突变型倍数
			0.5%	20.5%	41

2.5%	34.7%	13.9
			5%	52.2%	10.4
25%	76.6%	3.1
			50%	96.2%	1.9

进一步检测突变含量为0.5%的7种不同突变型样本，结果焦磷酸测序法测得的突变信号峰值均>10%，报告为KRAS突变阳性。表明新的检测体系对7种不同KRAS突变型的检测灵敏度至少可达到0.5%。

实施例2、EGFR基因19外显子E746-A75缺失突变检测实例

本实施例以本发明方法设计PCR引物和抑制性寡核苷酸，结合PCR扩增技术和焦磷酸测序技术来检测EGFR基因19外显子E746-A75缺失突变。

1．引物和抑制性寡核苷酸的设计

根据GeneBank数据库公布的EGFR基因序列(ID号：1956)设计引物和抑制性寡核苷酸，参考序列如下(SEQ ID NO:6)：

GGCTCCACAG CCCCAGTGTC CCTCACCTTC GGGGTGCATC GCTGGTAACA

TCCACCCAGA TCACTGGGCA GCATGTGGCA CCATCTCACA ATTGCCAGTT

AACGTCTTCC TTCTCTCTCT GTCATAGGGA CTCTGGATCC CAGAAGGTGA

GAAAGTTAAA ATTCCCGTCG CTATCAA

AACATCTC

CGAAAGCCAA CAAGGAAATC CTCGATGTGA GTTTCTGCTT TGCTGTGTGG

GGGTCCATGG CTCTGAACCT CAGGCCCACC TTTTCTCATG TCTGGCAGCT

GCTCTGCTCT AGACCCTGCT CATCTCCACA TCCTAAATGT TCACTTTCTA

按照本发明前文所述的引物设计原则，设计一对PCR引物、一条抑制性寡核苷酸和一条测序引物，上下游引物分别命名为EGFR-19-F1和EGFR-19-R1，抑制性寡核苷酸命名为EGFR-M，测序引物命名为EGFR-S1，具体序列如下：

EGFR-F1：TTAAAATTCCCGTCGCTATC(SEQ ID NO:7)；

EGFR-R1：GCAAAGCAGAAACTCACA(5’端生物素标记)(SEQ ID NO:8)；

EGFR-M：CTAgCAAAACATC(3’端磷酸化修饰)(SEQ ID NO:9)；

EGFR-S1：TCCCGTCGCTATCAA(SEQ ID NO:10)。

其中EGFR-F1的3’端与EGFR-M的5’端存在5个碱基的重叠区域，可互补于野生型模板上相同的位置(下划线标示)，EGFR-M的近5’端包含1个不配对碱基(小写字母表示)，E746-A75缺失突变以方框标示。

PCR扩增引物Tm值如表3。

表3

2、肿瘤组织样本DNA的制备

取临床确诊的非小细胞肺癌石蜡组织样本，制成5-10um的切片。取切片3-5张至1.5mL离心管中，加入1ml二甲苯脱蜡后，离心收集沉淀；加入1ml无水乙醇，震荡混匀，离心弃上清液，室温或37℃晾干残留的乙醇；加入180μlDNA提取液和20μl蛋白酶K溶液，充分混匀，56℃消化至没有可见组织块；加入300μl GDT缓冲液，混匀后70℃孵育10分钟；加入300μl无水乙醇，混匀后转移至离心柱中，8000转/分钟离心1分钟，弃收集管内的滤液；向离心柱内加入700μl洗涤液PW，8000转/分钟离心1分钟，弃滤液；向离心柱内加入700μl洗涤液WA，8000转/分钟离心1分钟，弃滤液；甩干离心柱中残留液体(12000转/分钟离心2分)；向离心柱内的膜中央加入100μl DNA洗脱液，室温放置1分钟后8000转/分钟离心2分钟，所得样本即为肿瘤组织DNA样本。测定OD值后将样本DNA稀释至浓度为10ng/uL备用。

3、低含量EGFR突变阳性样本的制备

根据GeneBank数据库公布的EGFR基因19外显子野生型序列和E746-A75缺失突变序列，人工合成一段野生型EGFR基因序列和一段E746-A75缺失突变序列。将野生型和突变型配比稀释至突变型的含量分别占0.5%、2.5%、5%、25%和50%。

4、PCR扩增

PCR反应体系如下：

PCR反应条件设置为：①95℃预变性3分钟；②95℃变性10秒，56℃退火20秒，72℃延伸30秒，共50个循环；③72℃延伸5分钟。

5、焦磷酸测序分析

向40uL PCR产物中加入40uL结合缓冲液(含2uL StreptavidinSepharoseBeads)，室温振荡混和5-10 min，使EGFR-R1引物上标记的生物素与Streptavidin结合；然后采用焦磷酸测序仪配套的单链纯化装置从PCR反应液中分离单链DNA：PCR产物先经70%乙醇清洗5-10秒后，转至Denatureationbuffe中清洗5-10秒，再转至Washing buffer中清洗10秒，将分离得到的单链DNA转移到40uL测序反应液中(含测序引物EGFR-S1的浓度为0.4umol/L)，80℃温浴3-4min后装冷却至室温，置于焦磷酸测序仪进行测序分析。

6、特异性分析

取健康人全血样本50例，以及Sanger测序法验证为EGFR野生型的非小细胞肺癌石蜡组织样本50例，提取DNA后，分别采用本发明设计的PCR体系和常规PCR体系(不添加抑制性寡核苷酸EGFR-M)进行扩增，产物进行焦磷酸测序分析。

图5(A)为常规PCR方法对EGFR野生型样本的测序图谱。

图5(B)为本发明PCR方法对EGFR野生型样本的测序图谱。

两组PCR产物的测序结果均为EGFR野生型，表明本发明的PCR体系中添加的抑制性寡核苷酸EGFR-M不会影响野生型样本的检测。

7、灵敏度分析

取突变百分含量分别为0.5%、2.5%、5%、25%和50%的E746-A75缺失突变型样本，分别采用本发明设计的PCR体系和常规PCR体系(不添加抑制性寡核苷酸EGFR-M)进行扩增，产物进行焦磷酸测序分析。

图5(C)为常规PCR方法对EGFR突变型样本(含0.5%突变)的测序图谱。

图5(D)为本发明PCR方法对EGFR突变型样本(含0.5%突变)的测序图谱。

图5(E)为常规PCR方法对EGFR突变型样本(含5%突变)的测序图谱。

图5(F)为本发明PCR方法对EGFR突变型样本(含5%突变)的测序图谱。

图5(G)为常规PCR方法对EGFR突变型样本(含25%突变)的测序图谱。

图5(H)为本发明PCR方法对EGFR突变型样本(含25%突变)的测序图谱。

测序结果表明常规PCR体系只能检测出突变含量≥5%的阳性样本，突变百分含量<5%的样本，其检测结果与野生型无差异。而按本发明所述设计的新PCR体系,可以富集PCR产物中突变型的含量。样本中突变型的含量越低，富集效果越显著。根据检测到的突变峰信号值，可以计算出突变型的富集倍数，具体情况见表4。

表4

样本中突变DNA含量扩增产物中突变DNA含量	富集突变型倍数
		0.5%22.5%	45
2.5%47.1%	18.8
		5%56.7%	11.3
25%100%	4
		50%100%	2

焦磷酸测序法结果表明，新的检测体系对EGFR基因19外显子E746-A75缺失突变的检测灵敏度至少可达到0.5%。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种检测低含量基因突变样本中基因突变的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)以待测基因为模板，以分别互补于突变位点上游和下游的一对扩增引物进行PCR扩增，同时加入覆盖突变位点的抑制性寡核苷酸，

其中，所述抑制性寡核苷酸的特征是：

(a)序列中相应于待测突变位点的碱基位于寡核苷酸的中部；

(b)5’或3’端附近位置存在1-4个与野生型基因中相应碱基不配对的碱基，其它碱基与野生型基因中相应碱基配对；

(c)其3’末端缺少形成磷酸二酯键的羟基；

其中，所述扩增引物中，一条引物位于所述抑制性寡核苷酸5’端上游，且其3’端有2-10个碱基与所述抑制性寡核苷酸的5’端2-10个碱基互补于野生型基因模板上相同的位置；另一条引物位于所述抑制性寡核苷酸3’端下游，且其与所述抑制性寡核苷酸互补于野生型基因模板上不同的位置；和

(2)对(1)的PCR扩增产物进行序列分析和/或序列鉴定，确定待测基因是否发生突变。

2.一种从低含量基因突变样本中富集突变基因的方法，其特征在于，所述方法包括：

以待测基因为模板，以分别互补于突变位点上游和下游的一对扩增引物进行PCR扩增，同时加入覆盖突变位点的抑制性寡核苷酸，

其中，所述抑制性寡核苷酸的特征是：

(a)序列中相应于待测突变位点的碱基位于寡核苷酸的中部；

(b)5’或3’端附近位置存在1-4个与野生型基因中相应碱基不配对的碱基，其它碱基与野生型基因中相应碱基配对；

(c)其3’末端缺少形成磷酸二酯键的羟基；

其中，所述扩增引物中，一条引物位于所述抑制性寡核苷酸5’端上游，且其3’端有2-10个碱基与所述抑制性寡核苷酸的5’端2-10个碱基互补于野生型基因模板上相同的位置；另一条引物位于所述抑制性寡核苷酸3’端下游，且其与所述抑制性寡核苷酸互补于野生型基因模板上不同的位置；和

(2)获得PCR扩增产物，其中富集了突变基因。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)的(b)中，所述的5’或3’端附近位置是：从5’或3’末端碱基起算，第2-6个碱基处；和/或

步骤(1)中，所述抑制性寡核苷酸的长度10-40bp；较佳地为15-35bp；更佳地为20-30bp。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)的(c)中，在3’末端进行化学修饰，使之缺少形成磷酸二酯键的羟基；较佳地，所述的化学修饰包括：3’磷酸化、3’氨基化、3’巯基化，荧光标记；更佳地为3’磷酸化修饰。

5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，抑制性寡核苷酸与野生型基因模板的解链温度、位于所述抑制性寡核苷酸5’端上游的扩增引物的解链温度、抑制性寡核苷酸与突变型基因模板的解链温度依次降低。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，抑制性寡核苷酸与野生型基因模板的解链温度优选为58-62℃；和/或

所述的抑制性寡核苷酸与突变型基因模板的解链温度比所述的抑制性寡核苷酸与野生型基因模板的解链温度低6℃或6℃以上；较佳地低10℃或10℃以上；和/或

所述的位于所述抑制性寡核苷酸5’端上游的扩增引物的解链温度比所述的抑制性寡核苷酸与野生型基因模板的解链温度低1-4℃；较佳地低1-3℃。

7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增包括变性、引物退火和引物延伸的循环过程；在适当的退火温度条件下，抑制性寡核苷酸优先结合野生型基因模板，导致位于所述抑制性寡核苷酸5’端上游的扩增引物的3’端无法与野生型基因模板结合，从而抑制野生型基因的扩增；抑制性寡核苷酸与突变型基因模板不能结合，突变型基因正常扩增；较佳地，所述的适当的退火温度为：位于所述抑制性寡核苷酸5’端上游的扩增引物的解链温度、抑制性寡核苷酸与突变型基因模板的解链温度之间的温度。

8.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述序列分析和/或序列鉴定方法包括：Sanger测序法、焦磷酸测序法、新一代测序法、荧光PCR法、基因芯片检测、膜杂交检测。

9.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述基因突变包括：点突变、缺失突变或插入突变。

10.权利要求1-9任一所述的检测低含量基因突变样本中突变基因的方法在基因突变检测中的应用。

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