CN108624662A - 稀有基因突变的检测 - Google Patents

Abstract

本文涉及稀有基因突变的检测方法，其利用高选择性基因突变检测引物和阻物，通过特异性抑制野生型扩增，达到富集稀有突变产物的目的。本文所述方法、引物和阻物特别适用于NGS技术对cfDNA中的稀有基因突变进行高效低成本的检测。

Description

稀有基因突变的检测

技术领域

本文涉及基因突变的检测，尤其涉及选择性富集稀有基因突变的方法，相应的富集体系，该富集体系中的引物和阻物。

背景技术

基因突变是指基因组DNA分子发生的碱基序列的变异现象。从分子水平上看，基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。基因突变的研究已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展，尤其是第二代测序技术(NextGeneration Sequencing,NGS)的建立，使基因突变检测进入了一个高通量的新时期。但是在野生型模板的较高背景下，不管是传统的qPCR检测技术还是NGS技术，针对较低含量的基因突变的检测能力都有限。

稀有基因突变，是指存在于大量野生基因序列背景中的极为稀少的基因突变。稀有基因突变最为常见的例子就是发生在肿瘤细胞中的低频基因变异，许多引起肿瘤的体细胞突变都是掺杂在野生型细胞内的，所得到的DNA样本中会带有大量野生型DNA，基因突变的含量常常都在10％以下或者更低。在临床中，癌症初期病人和治疗前后的肿瘤病人，病人血液中会含有少量的肿瘤突变DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)，并且ctDNA的含量随肿瘤负荷和治疗反应而发生变化，通常都在1％以下或甚至更低。这些ctDNA携带了与肿瘤细胞中一样的基因突变信息，同样可以用于肿瘤的早期检测、靶向用药和预后检测。另外，ctDNA是无创取样，从突变信息上说更能反映肿瘤基因突变的全貌，因此，以ctDNA为检测对象的液体活检技术具有其优越性，应用也越来越受到重视。

目前稀有突变检测方法中，主要有作为“金标准”的Sanger基因测序。但是Sanger测序的灵敏度有限，在大量野生型基因的背景下，Sanger测序仅能检测到含有5％的突变，所以不适于对ctDNA的检测。目前，定量qPCR也是常用的稀有突变检测方法，可以用于肿瘤细胞基因突变检测，对ctDNA基因突变的检测，也显示一定的能力。但是，这些qPCR技术存在通量小，单个成本高，分辨能力有限，样本消耗量大的缺点，不利于广泛应用。

靶向NGS技术是目前最为大家认可的用于检测ctDNA的技术。由于ctDNA含量很低，靶向NGS需要选择性设计检测位点组合(panel)，通过采用探针捕获或者Ampliseq扩增技术来对待测区域进行富集和建库，以提高数据有效率。但是，对低频的突变，这些富集方法并不能提高检测的灵敏性，只能依靠加深测序深度(对相同模板的读取次数)才能完成对稀有突变的检测。例如，对含量为0.1％的突变，就需要10000x以上的测序深度才能检测出来。因测序芯片容量和成本限制，对低于0.1％的突变，NGS就面临挑战。如何在保证待测区域得到富集的前提下，进一步提高稀有突变的比率以降低对测序深度的依赖，就成为提高NGS灵敏性和降低测序成本的关键。

发明内容

本文提供一种聚合酶链式反应(PCR)方法，其可以用于对稀有基因突变进行检测，所述稀有基因突变例如是突变频率为0.1％或更低的目标基因突变。根据本文所述方法，在第一轮扩增中对所有包含突变所在位点的模板进行扩增，不区分其序列是野生型还是突变型；在第二轮扩增中通过抑制野生型扩增，来选择性扩增突变型序列。这样一来，可以达到富集稀有突变产物的目的。因此，用本文的方法可以实现NGS对ctDNA等样本中稀有突变的高效、低成本检测。

在一个具体实施方案中，本文所述的PCR方法，在第一轮扩增中依次包括变性、引物退火、和延伸的步骤，但不含有阻物；在第二轮扩增中依次包括变性、阻物退火、引物退火、和延伸的步骤。

本文还提供一种设计PCR引物和阻物的方法，包括：根据目标基因突变位点设计相应的正向引物与反向引物，所述的正向引物位于突变位点的上游，反向引物位于突变位点的下游；以及，根据目标基因突变位点设计阻物，使阻物选择性结合野生型模板，以阻止引物与该野生型模板的结合，从而抑制野生型模板的扩增。

在具体实施方案中，所述阻物序列覆盖基因突变位点。阻物的5’-末端与正向引物的3’-末端或与反向引物的3’-末端有重叠，与模板结合的阻物可以通过这个重叠区阻止引物与该模板的退火。阻物的3’-末端被常规技术封闭，使得与阻物结合的模板无法进行PCR的延伸反应。

本文还提供一种PCR引物和阻物的组合，其针对每一种基因突变有一对引物和一种阻物，所述的一对引物包括位于突变位点上游的正向引物和位于突变位点下游的反向引物，无论是正向引物或是反向引物都不覆盖所述突变位点；所述的一种阻物覆盖所述突变位点、但与该位点的野生型配对、与该位点的突变型不能配对，且该阻物在5’-端与针对同一基因突变的正向或反向引物的3’-端有重叠，使得阻物与野生型模板的结合能阻止有重叠的引物与相同模板的结合，该阻物在3’-端被封闭，导致不能被延伸。

本文还提供一种PCR扩增体系，其中针对每一种基因突变具有如上所述的引物和阻物的组合。优选地，所述体系中的聚合酶是高保真DNA聚合酶。

在具体实施方案中，本文所述的针对同一种基因突变的引物和阻物具有如下的Tm值：阻物与野生型模板结合后的解链温度(Tm-BW)>(高于)引物与模板的解链温度(Tm-Po或Tm-Pn)>(高于)阻物与突变型模板结合后的解链温度(Tm-BM)。在另外的具体实施方案中，所述Tm-BW高出Tm-Po或Tm-Pn约2℃或以上。在另外的具体实施方案中，所述Tm-BW比Tm-BM高出3℃或更多。在又一具体实施方案中，所述每一种无重叠的引物的解链温度(Tm-Pn)不低于与其对应的有重叠的引物的解链温度(Tm-Po)。

本文还提供一种检测稀有基因突变的方法，其采用本文所述的任何一种或更多种引物-阻物组合来进行本文所述的任一种PCR方法。

本文涉及的技术方案详述如下。

引物

为了实现本文所述的第一轮PCR扩增，根据每一突变所在位点的上游和下游序列设计成对的正向引物和反向引物。这些引物的序列不覆盖该突变所在位点。每一引物的长度通常不超过30个碱基，优选不超过25个碱基，更优选不超过20个碱基。成对的正反向引物导致扩增得到的序列大小通常为60～200个碱基对(bp)，更优选为60～120bp，还更优选为60～90bp，以最大效率地利用模板，例如游离DNA(cell-free DNA,cfDNA)模板或ctDNA。

优选地，成对的正、反引物在PCR体系中的浓度彼此相同或基本相同，例如，反向引物的浓度为正向引物浓度的100％±50％以内，更优选100％±20％以内，或正向引物的浓度为反向引物浓度的100％±50％以内，更优选100％±20％以内。

可以有不止一对如上所述的正反向引物，来扩增相同模板上的不同突变位点。这样可以提高样本利用率。所述不止一对正反向引物彼此不互相干扰，且在PCR体系中的浓度相同或基本相同，所述“基本相同”的含义如上述。

阻物

为了实现本文所述的第二轮PCR扩增，根据目标突变位点来设计阻物(blocker)。阻物的序列覆盖突变位点，并且在突变位点处与野生型配对、与突变型错配。

阻物5’-端与正向引物3’-端或与反向引物3’-端有重叠区，例如有1～10个碱基重叠，更优选2～10个碱基重叠，还更优选2～6个碱基重叠。优选地，所述重叠区在所述阻物的5’-最末端和/或在所述引物的3’-最末端。与模板结合的阻物可以通过该重叠区来阻止该有重叠区的引物与该模板的退火。因此，阻物可以视为一种特殊形式的引物。突变所在位点虽然被阻物序列覆盖，但位于该重叠区以外。该阻物与该有重叠区的引物的方向一致。

阻物3’-末端被封闭，使得阻物在与模板结合后不会被延伸。末端封闭的技术是本领域已知的。例如，用3’-C3碳臂或3’-磷酸基团来封闭PCR延伸反应所必需的3’-羟基，或者用另外一整个核苷酸反向连接使得整个序列的两端都是5’-端，等等。

因阻物与突变型模板存在一个或更多的碱基错配，导致其解链温度下降。在本文中，阻物与其相应的野生型模板结合后的解链温度(Tm-BW)比该阻物与突变型模板结合后的解链温度(Tm-BM)高出3℃以上，例如高出3～16℃，优选高出3～12℃，更优选高出3～10℃。这样一来，阻物在与野生型模板退火的温度并不与突变型模板退火。

阻物的长度和位置可以根据阻物的GC含量来调整，以使不同阻物的Tm-BW彼此相同或相近(±2℃)，从而保证在阻物退火温度点上，多重反应体系中的所有阻物都能与其对应的野生型模板退火。

在优选的具体实施方式中，本文所述的阻物是线性阻物。

退火温度

退火温度是单链开始互补配对形成双链的起始温度。这时的反应体系中既有解链成为单链的模板DNA，也有本身就是单链的引物。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞，所以引物与模板互补配对的概率会大大超过模板与模板互补配对的概率。另外，引物也可能在随机碰撞过程中与其它引物或与无关模板发生非特异性结合。理想的退火是要尽量使得单链模板与引物互补配对、减少单链模板与单链模板的互补配对、以及引物与引物或者引物与无关模板的非特异性结合。

本文中，阻物退火温度是指阻物与野生型模板退火的温度，引物退火温度是指成对引物中的上下游引物都与模板退火的温度。为了使阻物与野生型模板先结合而阻止后续的引物与模板结合，本文中，阻物退火温度比引物退火温度高，使得在阻物退火温度，阻物能与野生型模板退火，而引物不能与模板退火；然后，当温度降低到引物退火温度时，野生型模板上能与引物结合的区域被阻物封闭，只有突变型模板具有能与引物结合的区域并因此发生退火。

解链温度(melting temperature,Tm)是退火温度的一个参考依据。Tm是50％的引物(或本文所述阻物)和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm由片段长度和碱基构成决定的。片段越长和/或GC含量越高，需要的Tm值越高。Tm值可以用计算机程序确定，所述计算机程序例如OligoAnalyzer 3.1(Integrated DNA Technologies,Inc.)。根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm可能有较大差异。引物的退火温度一般比该引物的Tm低10℃以内，例如低5℃以内，甚至低1～2℃。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。

为简便起见，本文中关于解链温度的描述用到以下简写：

Tm-BW：阻物与野生型模板结合后的解链温度。

Tm-BM：阻物与突变型模板结合后的解链温度。

Tm-Po：有重叠区的引物与模板结合后的解链温度。

Tm-Pn：无重叠区的引物与模板结合后的解链温度。

在本文中，针对同一个突变位点，引物和阻物的Tm具有下列关系：Tm-BW比Tm-BM高出3℃以上，优选高出3～16℃，更优选高出3～12℃，更优选高出3～10℃，更优选高出4～10℃，从而在阻物与野生型模板退火的温度，阻物不与突变型模板退火；Tm-BW比Tm-Po和/或比Tm-Pn高出2℃以上，优选高出2～16℃，更优选高出2～10℃，更优选高出2℃但不到5℃，更优选高出2～4.5℃，还更优选高出2～4℃，还更优选高出2～3℃，从而在阻物与野生型模板退火的温度，任一种引物都不与模板退火；Tm-Po和Tm-Pn都高于本文所述的引物退火温度，例如高出1～10℃，优选高出3～10℃，更优选高出3～6℃，从而在引物退火温度，成对引物中的正反向引物都能发生退火；在优选实施方案中，Tm-Po等于或不低于Tm-Pn。

在具体实施方式中，针对同一个突变位点，引物和阻物的Tm值由高到低的顺序为Tm-BW>Tm-Po>Tm-BM且Tm-BW>Tm-Pn>Tm-BM，从而当反应体系的温度从高位的变性温度下降时，先到达阻物与野生型模板退火的温度，使得阻物与野生型模板退火，留下的单链模板为突变型模板，再到达正反向引物与模板退火的温度，使得正反向引物与单链形式的突变型模板退火，当温度再提升至延伸温度时，由于野生型模板被阻物阻挡，无法进行延伸，只有突变型模板不受阻物阻挡，能够被延伸，结果突变型模板得到扩增。

本文中，不同Tm进行比对时，指的是用同一种方法确定的Tm之间进行比对。

基因扩增方法

本文所述的基因扩增方法，具体例如PCR方法，一般包括两轮扩增。

在第一轮扩增中，采用上游正向引物与下游反向引物，对包括突变型位点的基因片段以及包括相应野生型位点的基因片段不加区别地进行扩增，使得第一轮PCR扩增后，野生型和突变型都得到扩增。

在第二轮扩增中，采用同样的正向引物和反向引物，以及特异性抑制野生型模板扩增的阻物，来特异性扩增突变型模板。

优选地，第二轮扩增以第一轮扩增的产物为模板。更优选地，两轮扩增连续进行。

阻物在第二轮扩增即将开始之前或开始之时引入到扩增体系中，利用引物与阻物的Tm值差异，设置两个不同的退火温度，导致阻物对引物与模板的结合产生阻碍，从而选择性地扩增突变型序列。这样可以大大提升稀有突变片段在扩增产物中的比率。更具体地，对于每个突变而言，第一轮PCR中只有一个针对引物的退火温度，PCR扩增对野生型和突变型模板没有选择性；在第二轮PCR中，有两个退火温度，一个是针对阻物退火(具体是阻物与野生型模板退火)，另一个针对引物退火，且阻物退火温度比引物退火温度高，这样第二轮PCR就对模板有选择性，只有突变型才得到扩增。由于PCR反应中的退火步骤一般是从高温变性把温度降到退火温度来进行，故在本文所述PCR方法的第二轮扩增中，随着反应温度从变性温度的下降，先降到阻物退火温度，具体是阻物与野生型模板退火的温度，然后再进一步降到引物退火温度。即，在第二轮扩增中，阻物退火先于引物退火。因此，在更具体实施方案中，第二轮扩增步骤依次是变性、阻物退火、引物退火、以及延伸；相应的第一轮扩增步骤依次是变性、引物退火、以及延伸。

本文中，除非特别说明，阻物退火是指阻物与野生型模板退火；阻物退火温度是指阻物与野生型模板退火的温度。

在第二轮扩增的阻物退火温度点和引物退火温度点上，阻物因与突变型碱基有错配，均不能与突变型模板结合。这样，在引物退火温度点上，与阻物有重叠的引物可以与突变型模板结合，启动PCR反应并延伸，从而引起突变型的扩增。

根据具体实施方案，本文所述第一轮扩增的反应体系中，只有针对每一种基因突变的成对引物，不含有针对该基因突变的阻物；在第二轮扩增的反应体系中，具有针对每一种基因突变的成对引物以及一种阻物。换而言之，阻物在每一个循环的第一轮扩增后再加入到反应体系中，可以是即将进行第二轮扩增之前或者第二轮扩增开始之时。

由于其3’-末端被封闭，阻物可以与模板结合但不能参与延伸反应，所以其数量和浓度在反应体系中基本不发生变化。本领域技术人员能够理解，阻物对于野生型模板过量，可以保证其抑制效率。例如，阻物用量可以是反应体系中模板的起始含量乘以第一轮扩增循环数的乘积的倍数，例如为该乘积的1～1000倍，优选10～1000倍，更优选10～500倍，还更优选10～100倍。为便于计算和实际操作，在具体实施方案中，PCR体系中采用的阻物浓度跟对应的引物的浓度基本相同，例如为1～4倍，优选1～2倍。

在具体实施方式中，第一轮和第二轮扩增均采用高保真DNA聚合酶。

一般地，第一轮和第二轮扩增的循环数分别可以为1～45。本领域技术人员可根据原始模板性质、浓度和含量以及阻物用量不同而定，甚至可以将两轮扩增合并成含有阻物的一轮扩增。

多重PCR

如果样本中有2种或更多种基因突变，则本文所述的PCR反应体系中可包括针对每一种基因突变的一对引物和一种阻物的组合(简称“引物-阻物组合”)。相应地，第一轮和/或第二轮扩增为多重PCR，以2对或2对以上的正反向引物来扩增不同的稀有突变位点。

在目前NGS技术对ctDNA检测需要比较大的测序深度的情形下，本文所述的PCR方法尤其显出其操作简便的优势以及成本优势，仅需要为每一突变设计一对引物和一条阻物，无需复杂的反应体系或反应条件，即可实现选择性的突变型扩增，还可以降低NGS检测对测序深度的依赖。

样本

本文所述的PCR方法可以用于检测稀有基因突变，特别是检测cfDNA或ctDNA中的稀有突变，例如肿瘤基因突变。相应地，本文方法所检测的样品优选是含有cfDNA或ctDNA的样品。目前的精确测序ctDNA存在至少两个明显的技术障碍：首先是血浆中的ctDNA含量极低，在某些早期肿瘤患者中甚至少于0.1％，对确定这样的稀有突变的存在常常需要达到10000X或者更高的测序深度；其次是NGS测序背景噪声很高，用常规建库测序方法肿瘤突变信号完全淹没在背景噪声中。本文所述技术方案在解决这两个问题方面，具有独特的优势。首先，通过第一轮PCR扩增，可以显著提高目标序列在整个测序文库中的比率，从而有效地降低了背景噪音，同时也避免了NGS的假阴性结果。其次，通过第二轮突变选择性的扩增，显著提高了稀有突变对野生型的比率，例如对稀有突变的敏感性提升到0.001％甚至更低，从而也大大降低了对测序深度的要求。这样，本文所述方法在提高检测灵敏性和准确性的同时，也显著降低了测序和分析成本，在肿瘤液体活检的临床应用方面具有明显的优势。例如，本文方法所检测的稀有突变位点可以是肿瘤基因体细胞突变位点，如SNV和Indel等形式。

更具体举例地，本文涉及的技术方案包括：

1.一种基因扩增方法，尤其是PCR方法，其包括：

(1)第一轮扩增，采用上游正向引物和下游反向引物，对包括突变型位点的基因片段以及包括相应野生型位点的基因片段不加区别地进行扩增；

(2)第二轮扩增，采用同样的正向引物和反向引物，以及特异性抑制野生型模板扩增的阻物，来特异性扩增突变型模板。

2.项1所述的方法，其中的第二轮扩增包括两个退火温度，阻物退火温度和引物退火温度，且阻物退火温度比引物退火温度高。

3.项2所述的方法，其中阻物退火温度比引物退火温度高出2℃以上，优选高出2℃但不到5℃，更优选高出2～4.5℃，还更优选高出2～4℃，还更优选高出2～3℃。

4.项1～3任一所述的方法，其中在第二轮扩增的两个退火温度，阻物都不与突变型模板退火。

5.项1～4任一所述的方法，其中阻物在第二轮扩增开始前或开始之时加入至反应体系中。

6.项1～5任一所述的方法，其中第一轮扩增依次包括变性、引物退火、和延伸，但不含有阻物；第二轮扩增依次包括变性、阻物退火、引物退火、和延伸。

7.项1～6任一所述的方法，其中阻物的用量是反应体系中模板起始含量乘以第一轮扩增循环数所得乘积的倍数，例如为该乘积的1～1000倍，优选10～1000倍，更优选10～500倍，还更优选10～100倍。

8.项1～7任一所述的方法，其中针对同一种突变的成对引物彼此浓度相同或基本相同。

9.项1～8任一所述的方法，其中的第一轮和/或第二轮扩增为多重PCR，以1对或1对以上的正反向引物来扩增不同的突变位点。

10.项9所述的方法，其中针对不同突变位点的引物在PCR体系中的浓度彼此相同或基本相同。

11.项9所述的方法，其中针对不同突变位点的引物在PCR体系中不会相互干扰。

12.项1～11任一所述的方法，其中的起始模板为cfDNA或ctDNA。

13.项1～12任一所述的方法，其中的第一轮和第二轮扩增均采用高保真DNA聚合酶。

14.PCR引物和阻物的组合，其特征在于，针对每一基因突变位点有正向引物、反向引物和阻物，其中：

正向引物对应于突变位点的上游序列，反向引物对应于突变位点的下游序列，两种引物本身都不覆盖突变位点；

阻物覆盖突变位点且在突变位点处与野生型配对、与突变型不能配对，阻物的3’-末端被封闭，阻物的5’-端与正向引物的3’-端或与反向引物的3’-端有重叠。

15.项14所述的组合，其中所述重叠为1-10个碱基重叠，更优选2-10个碱基重叠，还更优选2-6个碱基重叠。

16.项14或15所述的组合，其中所述重叠区位于阻物的5’最末端，或引物的3’最末端，或阻物的5’最末端且引物的3’最末端。

17.项14～16任一所述的组合，其中阻物与有重叠的引物方向一致。

18.项14～17任一所述的组合，其中阻物为线性。

19.项14～18任一所述的组合，其中引物和阻物的Tm值由高到低的顺序为，阻物与野生型模板结合后的解链温度>(高于)引物与模板的解链温度>(高于)阻物与突变型模板结合后的解链温度(Tm-BM)。

20.项14～19任一所述的组合，其中所述引物的解链温度为有重叠的引物的解链温度(Tm-Po)和/或无重叠的引物的解链温度(Tm-Pn)。

21.项14～20任一所述的组合，其中Tm-BW高出Tm-Po或Tm-Pn约2℃以上，使得在阻物退火温度，引物不与模板发生退火。

22.项14～21任一所述的组合，其中所述Tm-BW比Tm-BM高出3℃或更多，例如高出3-10℃，高出4-10℃。

23.项14～22任一所述的组合，其中Tm-BM与Tm-Po和/或Tm-Pn的差距确保在第二轮扩增的两个退火温度下，阻物都不与突变型模板发生退火。

24.项14～23任一所述的组合，所述Tm-Pn与Tm-Po相同或基本相同，例如，差别不超过2℃。

25.项14～24任一所述的组合，其中Tm-Pn和Tm-Po均在引物退火温度之上，例如，高出1-10℃，优选高出3-10℃，更优选高出3-6℃。

26.项14～25任一所述的组合，由所述正向引物和反向引物扩增出的基因片段大小为60-200bp，优选60-120bp，更优选60-90bp。

27.项1～13任一所述的方法，采用项14～26任一所述的引物-阻物组合来进行。

本文中，除非特别指明，“基本”是指数值范围上下波动50％，优选波动20％，更优选波动15％，更优选波动10％。

本文中，除非特别指明，所提及的所有数值范围，都是连续的范围，而不是仅限于这些数值范围中的整数点。

总之，本文涉及一种高选择性地扩增稀有基因突变的方法，通过特异的阻物来抑制野生型扩增，达到富集稀有突变产物的目的，从而实现对稀有突变的高效检测。本文的基因突变检测方法具有高特异性，针对野生型模板的阻物对可以耐受高拷贝数的野生型模板。同时，本文所述方法可以同时检测到多个位点的个位数拷贝的突变型模板，例如可有效检出突变含量为1/10000的模板，具有很高的灵敏度；也可以针对具体的稀有突变，例如0.1％的稀有突变，以比现有技术更小的测序深度(例如小100倍)进行有效检测。而且，本文所述基因检测方法只要知晓野生型基因中容易发生突变的位点，无需事先知晓基因突变后的序列，就能进行检测，因此，本文所述技术可以同时检测在阻物覆盖区的多个已知突变位点，也可以发现已知突变位点处或其附近的新的基因突变形式。

以上只是本文所述技术方案的具体举例，只要阻物符合上述要求，本发明同样适应于除本文所述以外的其它基因突变的检测，也适应于其它基因分型等基因检测的应用平台。下面详细描述本文所述技术方案的具体实施方式，它们不应构成对本发明范围的限制。

附图说明

图1示本文所述PCR的一个示意图举例。为便于说明，本示意图采用了第一轮扩增20个循环和第二轮扩增15个循环的体系。图1A中，第一轮PCR只含有正反向引物和DNA模板，长黑实线表示目标DNA片段，“X”表示稀有突变位置，单片箭头表示引物。图1B显示，经第一轮PCR扩增后，野生型和突变型都得到扩增。图1C表示，第一轮PCR结束后加入已带3’端封闭的阻物，带圈短黑实线表示阻物。在第二轮PCR的阻物退火温度下，阻物与野生型模板稳定结合，因为引物的Tm值低，这时引物不能与模板结合。然后，在引物的退火温度，已经与野生型模板稳定结合的阻物通过其5’末端与正向引物3’末端相重叠的碱基来抑制该正向引物与野生型模板的结合，从而阻止了野生型序列的扩增；但因为阻物不能与突变型模板结合，所以阻物不能阻止正向引物与突变型模板的结合，突变型序列得以扩增。图1D中，长黑实线表示目标DNA片段，“X”表示稀有突变位置，显示经过第二轮PCR后，突变型模板得到选择性地扩增。

图2示PCR扩增的温度和循环参数设置。本示意图中，第一轮PCR采用20个循环，第二轮PCR采用15个循环。第一轮PCR中只有一个针对引物的退火温度，PCR的扩增对野生型模板和突变型模板没有选择性。在第二轮PCR中，有阻物退火和引物退火，且阻物退火温度比引物退火温度高，这样第二轮PCR就对模板有选择性，只有突变型模板才得到扩增。

图3示阻物有效抑制野生型模板的扩增。本示例显示EGFR-Ex19del野生型模板加入阻物前后的Ct值的变化。Ct值(Cycle threshold)代表每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。ΔRn表示反应管内减去本底信号后的荧光信号，ΔRn阈值一般控制在扩增曲线的指数增长阶段范围之内，利用ΔRn阈值线与扩增曲线的交叉点确定Ct值。本示图中，ΔRn阈值线为5000，对应的含有阻物的反应管Ct值为30，不含阻物的反应管Ct值为21，两者相差9个循环(ΔCt＝9)。在指数曲线阶段，扩增按2ⁿ进行，两管起始模板数量相同，而含有阻物的反应管多用了9个循环才达到5000的ΔRn阈值线，由此可知含有阻物的反应管的扩增抑制效率为512(2⁹＝512)倍。另外，该图还显示，由于阻物的阻碍作用，含有阻物的扩增曲线不再是典型的S型曲线。

图4示阻物不影响突变型模板的扩增。本示例中，EGFR-Ex19del纯合突变型模板加入阻物前后的Ct值没有明显变化。由于阻物没有影响扩增，扩增曲线保持典型的S型曲线。

具体实施方式

以下通过举例进一步说明本文公开的技术方案。

如图1所示，针对待检测的目标基因突变位点设计相应的上游正向引物、下游反向引物和覆盖突变位点的阻物。上下游引物不存在对野生型和突变型的选择性。阻物针对野生型设计，与突变型模板存在错配。上游引物的3’-末端与阻物的5’-末端有2～6核苷酸(nt)的重叠，阻物的3’-末端被PO₄基团封闭。如图2所示，第一轮PCR中只有一个针对引物的退火温度(54℃)，比正向引物的解链温度(Tm-Po)低1～5℃，退火时间为20s；第二轮PCR中有两个退火温度，一个是58℃(时间30s)，针对阻物退火，另一个是54℃(时间20s)，跟第一轮相同，针对引物退火。这样一来，在第二轮PCR中，阻物就对模板有选择性，可以稳定结合野生型模板并阻止其扩增，最终只有突变型才得到扩增。

选取KRAS第2号外显子G12D突变和EGFR第19号外显子的一个INDEL缺失，第20号外显子T790M，第21号外显子L858R这四种体细胞突变为研究对象。相应的引物和阻物见表1：

表1用于检测EGFR基因4种体细胞突变的引物和阻物

表2引物和阻物的Tm(℃)

序列	Tm-Po	序列	Tm-Pn	序列	Tm-BW	Tm-BM
							SEQ ID NO:1	57.2	SEQ ID NO:2	57.2	SEQ ID NO:3	62	54.9
SEQ ID NO:4	57.7	SEQ ID NO:5	58.5	SEQ ID NO:6	61.9	40.9
							SEQ ID NO:7	57.6	SEQ ID NO:8	57.3	SEQ ID NO:9	61.4	53.3
SEQ ID NO:10	56.6	SEQ ID NO:11	58.5	SEQ ID NO:12	61	53.8

为了考察该方法的灵敏性和有效性，先对这4种阻物进行单一PCR对比实验。在含有纯合野生型模板的PCR体系中加入阻物，与没有加入阻物的PCR比较Ct值的差异，以观察阻物的效率。

在对这4种突变的20μL SyBr Green PCR反应体系中，含有20ng片段化的人基因组野生型模板(购自未因生物公司，产品号为HD780，其中含有100％野生型模板)，75mM Tris-HCl,0.01％Tween 20，50mM KCl,1U热启动Taq酶(高保真，Life Technologies)，2.5mM Mg2+，200nM阻物,200nM上游引物和200nM下游引物。相应不含阻物的反应管作为对照。PCR反应程序为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃30秒，54℃25秒，72℃20秒，40个循环。

图3显示结果：与不加阻物的PCR扩增相比，针对这四种野生型模板，加入阻物后的Ct值都有不同程度的增加，无模板的阴性对照未出现扩增曲线。在本试验中，PCR结果显示4种阻物对其相应的野生型模板的抑制效率在100-500倍之间。实验结果与理论推测较一致，说明该技术具有较高的特异性，即野生型模板的扩增被有效抑制。

为进一步观察该方法的特异性，用各自含有一种纯合突变的4种克隆片段(100％突变型，TAKARA公司合成)作为模板，分别加入各自对应的阻物，按上述条件进行PCR扩增，并与不含阻物的PCR反应比较。图4结果显示，含有阻物的PCR反应与不含阻物的PCR反应其Ct曲线基本一致，说明阻物对突变型模板的扩增没有抑制作用。

为了检测该方法对NGS分析稀有突变的有效性，采用含有0.1％频率的上述4种突变的cfDNA阳性标准品(未因生物公司，产品号为HD780，其中含有0.1％稀有基因突变和100％野生型模板)为模板，按上述PCR体系，进行两轮多重PCR扩增。第一轮用20个循环，不含阻物。第二轮用15个循环，含有400nM的阻物(对照不含有阻物)。PCR产物经过纯化建库等操作，最后在DA8600平台(达安基因)上进行测序分析，并与不含阻物的对照作比较。

测序结果表明，在10000X测序深度的情况下，不含有阻物时，这4种频率为0.1％的基因突变的实际检测频率在0至0.12％之间(突变型读数与野生型读数的比率)；而在含有阻物时，实际检测到的频率到达8％-32％。这说明，在阻物存在的情况下，这些突变型模板被选择性地富集了80至320倍。可见，在10000X测序深度的情形下，通过对突变型的上百倍富集，本文所述的技术方案可以高效检测到0.001％频率的突变；而如果是检测0.1％频率的基因突变，通过对突变型的上百倍富集，所需要的测序深度可以下降到100X以内，由此显著降低NGS检测的数据量和检测成本。

综上所述，本发明采用突变位点特异的阻物来阻止野生型模板的扩增，并实现对模板中稀有突变的富集，从而高选择性地检测稀有突变。对稀有突变的上百倍的富集，不但显著提高检测灵敏度，同时也大大降低了对NGS测序深度的要求，因而也大大降低了NGS测序的成本。

以上只是本发明技术方案的具体举例，只要阻物符合上述要求，本发明同样适应于除本实施例外的其它基因突变的检测，也适应于其它基因分型等基因检测的应用平台。因此，本发明的保护范围不限于实施例。

序列表

<110> 陈汉奎

<120> 稀有基因突变的检测

<160> 12

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KRAS-G12D正向引物

<400> 1

aatataaact tgtggtagtt gg 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KRAS-G12D反向引物

<400> 2

cacaaaatga ttctgaatta gc 22

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KRAS-G12D阻物

<400> 3

ttggagctgg tggcg 15

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFR-Ex19del正向引物

<400> 4

ttaaaattcc cgtcgctat 19

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFR-Ex19del反向引物

<400> 5

agaaactcac atcgaggatt t 21

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFR-Ex19del阻物

<400> 6

cgctatcaag gaattaagag aagc 24

<210> 7

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFR-T790M正向引物

<400> 7

accgtgcarc tcatc 15

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFR-T790M反向引物

<400> 8

ttcccggaca tagtcc 16

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFR-T790M阻物

<400> 9

catcacgcag ctcatgc 17

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFR-L858R正向引物

<400> 10

catgtcaaga tcacagattt 20

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFR-L858R反向引物

<400> 11

tccttacttt gcctcctt 18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFR-L858R阻物

<400> 12

gattttgggc tggccaaa 18

18

Claims (9)

1.一种基因扩增方法，包括：

(1)第一轮扩增，采用上游正向引物和下游反向引物，对包括突变型位点的基因片段以及包括相应野生型位点的基因片段不加区别地进行扩增；

(2)第二轮扩增，采用同样的正向引物和反向引物，以及特异性抑制野生型模板扩增的阻物，来特异性扩增突变型模板。

2.权利要求1所述的方法，其中的第二轮扩增包括两个退火温度，阻物退火温度和引物退火温度，且阻物退火温度比引物退火温度高。

3.权利要求1或2所述的方法，其中阻物在第二轮扩增开始前或开始之时加入至反应体系中。

4.权利要求1～3任一所述的方法，其中针对同一种突变的成对引物彼此浓度相同或基本相同。

5.权利要求1～4任一所述的方法，其中的第一轮和/或第二轮扩增为多重PCR，以2对或2对以上的正反向引物来扩增不同的突变位点。

6.权利要求5所述的方法，其中针对不同突变位点的引物在反应体系中的浓度彼此相同或基本相同。

7.用于基因扩增的引物和阻物的组合，其特征在于，针对每一基因突变位点有正向引物、反向引物和阻物，其中：

正向引物对应于突变位点的上游序列，反向引物对应于突变位点的下游序列，两种引物本身都不覆盖突变位点；

阻物覆盖突变位点且在突变位点处与野生型配对、与突变型不配对，阻物的3’-末端被封闭，阻物的5’-端与正向或反向引物的3’-端有重叠。

8.权利要求7所述的组合，其中阻物与野生型模板结合后的解链温度(Tm-BW)比有重叠的引物的解链温度(Tm-Po)高出2℃以上。

9.权利要求7或8所述的组合，其中所述Tm-BW比阻物与突变型模板结合后的解链温度(Tm-BM)高出3℃以上。