CN106520919A

CN106520919A - 一种检测目标核酸序列变异体的组合物和方法及试剂盒

Info

Publication number: CN106520919A
Application number: CN201610872112.5A
Authority: CN
Inventors: 王大永; 毕万里; 崔恒进
Original assignee: SUZHOU NUHIGH BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SUZHOU NUHIGH BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2016-09-30
Filing date: 2016-09-30
Publication date: 2017-03-22
Also published as: WO2018059525A1

Abstract

本发明涉及分子生物学领域，公开了一种用于检测目标核酸序列变异体的组合物和方法及试剂盒。本发明将具有特殊结构的封闭探针与具有选择性的检测探针一起使用，封闭探针优先与目标核酸序列的野生型变异体结合，而选择性的检测探针优先与目标核酸序列的突变型变异体结合，通过PCR反应富集核酸样品中的目标核酸序列的突变型变异体，最终通过检测探针的检测信号的变化来检测扩增子，达到高选择性检测的目的，其对缺失突变、插入突变的检测效果更显著。

Description

一种检测目标核酸序列变异体的组合物和方法及试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种检测目标核酸序列变异体的组合物和方法，本发明还涉及检测目标核酸变异体的试剂盒，广泛应用于核酸扩增、基因变异体体外诊断、基因分型等领域。

背景技术

基因突变(gene mutation)是由于DNA分子中发生碱基对的增添、缺失或改变而引起的基因结构的改变。基因突变分为两种，性细胞突变以及体细胞突变。性细胞突变是指发生在性细胞的突变，是可遗传的突变类型。除性细胞外的体细胞发生的突变不会造成后代的遗传改变，却可以引起当代某些细胞的遗传结构发生改变。绝大部分体细胞突变无表型效应。体细胞突变是一种稀有突变，体细胞突变存在于大量的野生型背景DNA序列中，相对于野生型背景序列的含量，体细胞突变含量很少。如肿瘤患者组织和外周血内含有少量的肿瘤细胞DNA，初期出现的细菌和病毒耐药情况等。体细胞突变常与疾病的发病相关，可以作为疾病发病的标记物、预后判断的主要标志以及用药指导的标志物。因此，体细胞突变的检测对于疾病的诊疗和预后评价具有重要的意义。

目前体细胞突变的检测方法主要有DNA测序法、RFLP-PCR方法、PCR夹子方法(PCRclamping method)、探针扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutationsystem,ARMS)、数字PCR、竞争性等位基因特异性荧光探针PCR法(Competitive Allele-Specific Taqman PCR，CAST PCR)等，这些检测方法均具有各自的优缺点。

DNA测序法是进行突变检测的可靠方法，也是使用较多的方法。测序法对取材和技术要求比较高，最重要的是，由于测序方法本身的限制，灵敏度不高，只能对含量大于20％的目标核酸序列突变型变异体进行检测。

RFLP-PCR方法通过在PCR反应之前或是在PCR反应的过程中使用限制性内切酶，除去了与目标核酸序列突变型变异体相似的野生型变异体，从而达到扩增并富集目标核酸片段的突变型变异体的目的。基于此方法有多种变化，包括限制性酶切位点突变分析PCR(RSM-PCR)方法，通过在突变位点基于引物连接的扩增(APRIL-ATM)方法等等。虽然这类方法具有设计简单和成本低廉的优点，并且在一些特定的实验中具有较好的选择性，但是它依赖于突变位点附近具有限制性内切酶酶切位点，在具体应用中，这类方法的选择性有限。

PCR夹子方法(PCR clamping method)通过抑制目标核酸序列的野生型变异体的扩增来达到选择性扩增待检测目标片段的目的。使用肽核酸(PNA)或使用锁核酸(LNA)的方法分别在文献[Henrik et al.,Nucleic Acid Research 21:5332-5336(1993)]和[Luo etal.,Nucleic Acid Research Vol.34,No 2e12(2006)]中公开。但是，由于目标核酸序列的野生型变异体与突变型变异体只有1个或2个或3个碱基不同，肽核酸或锁核酸也易与突变型变异体结合，从而产生假阴性结果。

数字PCR(digital PCR)通过稀释模板和增加PCR反应的数目来检测少量目标核酸序列突变型变异体[Vogelstein B,Kinzler KW.Digital PCR.Proc NatlAcadSciUSA1999；96:9236-41]。理论上，当核酸模板稀释到每个PCR反应中仅有一个或没有核酸模板时，这个PCR反应中要么没有扩增，要么扩增野生型模板或扩增突变型模板。结合相应的检测方法即可以达到检测少量突变型变异体的目标。理论上，该方法通过增加PCR反应的数量选择性是无限的。但是在实际操作中，选择性不仅受限于Taq DNA聚合酶的保真性限制，也受限于同时能进行的PCR数目。虽然有报道基于数字PCR的方法具有高选择性，如[Bielas JH,Loeb LA.Quantification of random genomic mutations.Nat Methods2005；2:285-90]所公开的内容。但该法通常需要专门的仪器并借助芯片技术，过程非常繁琐复杂，成本较高。

探针扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS),又名等位基因特异PCR(allele specific PCR,AS-PCR)，原理为：利用Taq DNA聚合酶缺少3’-5’外切酶活性，PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，针对不同的已知突变，设计适当的引物以检测出突变基因。该方法的主要限制因素是，若突变的位点为弱错配碱基序列，ARMS引物不能有效区分目标核酸序列的野生型变异体和突变型变异体，从而使该方法的选择性受到影响。此外，在检测常见的EGFR突变的14种缺失突变时，采用AS-PCR方法需要14条ARMS引物才可实现检测[US Premarket ApprovalApplication number：150047(2016)]。

竞争性等位基因特异性荧光探针PCR法(Competitive Allele-Specific TaqManPCR，CAST PCR)，其通过封闭探针阻碍野生型变异体的扩增，同时运用ARMS引物选择性放大突变型变异体，两者的结合使用在一定程度上降低了ARMS引物与野生型变异体错误结合的几率，但该技术使用非选择性的公共探针，缺少对突变型变异体的有效选择性检测。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种检测目标核酸序列变异体的方法，本发明所述检测方法将具有特殊结构的封闭探针与选择性检测探针一起使用，达到高选择性检测的目的，其对缺失突变、插入突变的检测效果更显著。

本发明的另一个目的是提供一种检测目标核酸序列变异体的检测试剂盒，其对缺失突变、插入突变的检测效果更显著。

根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种检测目标核酸序列变异体的组合物。所述组合物可以包括：(a)封闭探针，与所述目标核酸序列的野生型变异体特异性结合，且其3’末端修饰有阻止其延伸的寡聚核苷酸；(b)检测探针，与所述目标核酸序列的突变型变异体特异性结合，并能产生检测信号；(c)引物，与所述目标核酸序列的野生型变异体和突变型变异体的共用引物。

本发明进一步地，所述封闭探针3’末端通过非羟基基团修饰阻止其延伸，所述非羟基基团包括但不局限于磷酸化、氨基、脱氧、卤代、C3 Spacer、C6 Spacer修饰。

本发明进一步地，所述封闭探针含有核酸双链稳定因子。

本发明进一步地，所述核酸双链稳定因子位于封闭探针5’端以外位置，包括但不限于碱基的修饰，碱基类似物的使用，核酸骨架的改变，糖基的修饰，优先为锁核酸(lockednucleic acids,LNA)、肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)。

本发明进一步地，所述核酸双链稳定因子位于封闭探针5’端，为DNA小沟结合物/类似物(minor groove binder,MGB)中的一种或一种以上的组合。

本发明进一步地，所述封闭探针5’末端含有抑制核酸酶水解的修饰因子。

本发明进一步地，所述修饰因子包括碱基类似物、核酸骨架、脱氧核糖类似物、肽核酸或硫代磷酸酯。

本发明进一步地，所述检测探针5’末端标记有荧光报告基团，3’末标记有荧光淬灭基团。

进一步地，所述荧光报告基团选自FAM、TET、HEX、JOE、CY3、CY5、ROX或Texas Red；所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2或CY5。

本发明进一步地，所述组合物还包括聚合酶，dNTP，和/或适合于PCR扩增的其它试剂或缓冲剂。

本发明还提供一种检测目标核酸序列变异体的方法，该方法将待测核酸样品与上述检测目标核酸序列变异体的组合物混合，进行扩增反应通过检测检测探针的检测信号的变化来检测扩增子，从而检测待测核酸样品中的目标核酸的突变型变异体。

本发明进一步地，还包括通过检测探针的检测信号的变化来定量突变型变异体。

本发明进一步地，所述扩增反应包括但不限于等温扩增技术、聚合酶链式反应(PCR)，所述等温扩增技术包括但不限于环介导等温扩增技术(LAMP)、依赖于核酸序列的扩增技术(NASBA)、滚环扩增技术(RCA)、单引物等温扩增技术(SPIA)、依赖于解旋酶的等温扩增技术(HAD)、链替代扩增技术(SDA)、快速等温检测放大技术(RIDA)、切刻内切酶核酸恒温扩增技术(NEMA)。

本发明进一步地，所述扩增反应是实时荧光定量PCR。

本发明进一步地，所述突变型变异体为点突变、插入突变、缺失突变。

根据本发明的第二个方面，本发明提供一种检测目标核酸序列变异体的检测试剂盒，该试剂盒包括如下成分：封闭探针、检测探针和引物；

所述封闭探针与所述目标核酸序列的野生型变异体特异性结合，且其3’末端修饰有阻止其延伸的寡聚核苷酸；

所述检测探针与所述目标核酸序列的突变型变异体特异性结合，并能产生检测信号；

所述引物为所述目标核酸序列的野生型变异体和突变型变异体的共用引物。

本发明进一步地，所述封闭探针3’末端进行非羟基基团修饰，包括但不局限于磷酸化、氨基、脱氧、卤代、C3 Spacer、C6 Spacer修饰。

本发明进一步地，所述封闭探针含有核酸双链稳定因子。

本发明进一步地，所述反应混合物还包括聚合酶，dNTP，和/或适合于PCR扩增的其它试剂或缓冲剂。

本发明具有下述积极效果：

1、选择性能优越：本发明将选择性扩增和选择性检测结合使用，封闭探针优先与野生型变异体结合，选择性检测探针优先与突变型变异体结合，即使用封闭探针结合目标核酸序列的野生型变异体，使得野生型变异体在扩增反应中不能被有效扩增，从而选择性扩增目标核酸序列的突变型变异体，形成突变型变异体扩增子。同时选择性检测探针与突变型变异体结合，通过检测探针荧光信号的变化来检测突变型变异体扩增子，因此即使有野生型变异体未被封闭探针结合，形成野生型变异体扩增子，由于其不能与选择性检测探针结合，也不能产生检测信号，从而阻止封闭探针结合突变型变异体，解除了封闭探针对突变型变异体的抑制，避免了假阴性结果。因此本方法可以在大量野生型变异体中检测到微量的突变型变异体。传统的等位基因特异性PCR(AS-PCR)方法，使用3’末端错配的引物一旦错误的延伸就相当于人为的引入突变型的变异体，这种人为引入的突变型变异体在随后的每一轮循环中被作为突变型变异体被扩增，而本发明不存在这一问题，在本发明中，即使野生型变异体在PCR一轮反应中得到了扩增，但是扩增产物在下一轮反应中仍然容易被Blocker结合而无法高效扩增，从而高效的抑制了野生型变异体的扩增效率，同时选择性检测探针的使用实现了选择性检测。

2、体系简单，不容易有副反应：由于本发明采用公用引物，因此只需1对引物即可同时检测多种缺失和/或插入突变，可以有效避免多条引物间形成二聚体。比如采用ARMSPCR方法在检测常见的EGFR突变的14种缺失突变时，需要14条ARMS引物才可实现检测[USPremarket Approval Application number：150047(2016)]，而采用本发明的技术仅需要1条引物即可实现对所有缺失突变的检测，有效避免多条引物间二聚体的形成，从而减少副反应的发生，提高扩增检测效率，增强检测灵敏度。

3、应用广泛，本发明可广泛的应用于核酸扩增，肿瘤体外诊断，基因分型等领域。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1突变序列(EGFR2235-2249del15)和野生型序列在加入选择性检测探针情况下的扩增图；

图2突变序列(EGFR2235-2249del15)、野生型序列和两种序列的混合序列在加入封闭探针、选择性检测探针情况下的扩增图；

图3突变序列(EGFR2236-2253del18)和野生型序列在加入选择性检测探针情况下的扩增图；

图4突变序列(EGFR2236-2253del18)、野生型序列和两种序列的混合序列在加入封闭探针、选择性检测探针情况下的扩增图；

图5突变序列(EGFR 2319-2320insCAC)对应的野生型序列在有封闭探针和无封闭探针情况下的扩增图；

图6突变序列(EGFR 2319-2320insCAC)、野生型序列和两种序列的混合序列在加入封闭探针、选择性检测探针情况下的扩增图；

图7突变序列(EGFR2310-2311insGGT)对应的野生型序列在有封闭探针和无封闭探针情况下的扩增图；

图8突变序列(EGFR2310-2311insGGT)、野生型序列和两种序列的混合序列在加入封闭探针、选择性检测探针情况下的扩增图；

具体实施方式

为了检测存在于大量非待检测核酸变异体中的少量待检测核酸变异体，发明人进行了大量的研究工作，并提出了本发明技术方案。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

一方面，本发明提供了一种检测目标核酸序列变异体的组合物。所述组合物可以包括：(a)封闭探针，与所述目标核酸序列的野生型变异体特异性结合，且其3’末端修饰有阻止其延伸的寡聚核苷酸；(b)检测探针，与所述目标核酸序列的突变型变异体特异性结合，并能产生检测信号；(c)引物，与所述目标核酸序列的野生型变异体和突变型变异体的共用引物。

在一些实施方案中，所述封闭探针3’末端通过非羟基基团修饰阻止其延伸，所述非羟基基团包括但不局限于磷酸化、氨基、脱氧、卤代、C3 Spacer、C6 Spacer修饰。

在一些实施方案中，所述封闭探针含有核酸双链稳定因子。

在一些实施方案中，所述核酸双链稳定因子位于封闭探针5’端以外位置，包括但不限于碱基的修饰、碱基类似物的使用、核酸骨架的改变、糖基的修饰。

在一些优选实施方案中，所述核酸双链稳定因子为锁核酸(locked nucleicacids,LNA)、肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)。

在一些实施方案中，所述核酸双链稳定因子位于封闭探针5’端，为DNA小沟结合物/类似物(minor groove binder,MGB)中的一种或一种以上的组合。

在一些实施方案中，所述封闭探针5’末端含有抑制核酸酶水解的修饰因子。

其中所述修饰因子包括碱基类似物、核酸骨架(肽核酸或硫代磷酸酯)、脱氧核糖类似物、肽核酸或硫代磷酸酯。

在一些实施方案中，所述组合物还包括聚合酶，dNTP，和/或适合于PCR扩增的其它试剂或缓冲剂。

本发明进一步地，所述检测探针5’末端标记有荧光报告基团，3’末标记有荧光淬灭基团。进行荧光定量的检测方法时探针完整时，5’端的荧光报告基团受到3’端荧光淬灭基团的制约，不能发出荧光。而检测探针与目标核酸序列的突变型变异体结合后，当PCR扩增时，Taq酶的3'－5'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，5’端的荧光报告基团便会游离出来，发出荧光，通过荧光定量PCR达到检测荧光的目的。

另一方面，本发明还提供一种检测目标核酸序列变异体的方法，将待测核酸样品与上述检测目标核酸序列变异体的组合物混合，进行扩增反应通过检测检测探针的检测信号的变化来检测扩增子，从而检测待测核酸样品中的目标核酸的突变型变异体。

进一步的，还可以通过检测探针的检测信号的变化来定量突变型变异体。

在一些实施方案中，所述扩增反应包括但不限于等温扩增技术、聚合酶链式反应(PCR)。

进一步的，所述等温扩增技术包括但不限于环介导等温扩增技术(LAMP)、依赖于核酸序列的扩增技术(NASBA)、滚环扩增技术(RCA)、单引物等温扩增技术(SPIA)、依赖于解旋酶的等温扩增技术(HAD)、链替代扩增技术(SDA)、快速等温检测放大技术(RIDA)、切刻内切酶核酸恒温扩增技术(NEMA)。

在一些优选实施方案中，所述扩增反应为实时荧光定量PCR。

在一些实施方案中，所述突变型变异体为点突变、插入突变、缺失突变。

在一些实施方案中，所述封闭探针含有核酸双链稳定因子。

在一些实施方案中，所述检测探针5’末端标记有荧光报告基团，3’末标记有荧光淬灭基团。

在一些实施方案中，所述组合物还包括聚合酶，dNTP，和/或适合于PCR扩增的其它试剂或缓冲剂。如甘油、Tris·HCl、KCl、MgCl₂等。

除非特别定义，本专利所有的科学或技术专业词汇均与本领域大部分一般人员的普通理解一致。以下的文献中本领域中大部分专业名词的一般定义：[Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994)]；[The CambridgeDictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988)]；[The Glossary ofGenetics,5th Ed.,R.Rieger et al.(eds.),Springer Verlag(1991)]；[Hale&Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)]除非另外定义，本专利中所使用的专业名词与上述文献中对该专业名词描述一致。

名词“核苷酸”一般指的是一个核苷通过酯键与一个酸性分子或基团相连而形成的化合物，例如，核苷的磷酸酯，通常有一个、两个或三个磷酸基团共价连接在核苷的糖基团的5号位上。在一些情况下，核苷酸的定义还包括一些典型核苷酸的同系物或类似物。

名词“寡聚核苷酸”指的是一种核苷酸之间通过共价键相连形成的多聚体。一个寡聚核苷酸通常包括至少3个核苷酸。在某些情况下，寡聚核苷酸也有可能包含有磷氨[Beaucage et al.(1993)Tetrahedron 49(10):1925]，硫代磷酸酯[Mag et al.(1991)Nucleic Acids Res.19:1437；and U.S.Pat.No.5644048)]，二硫代磷酸酯[Briu et al.(1989)J.Am.Chem.Soc.111:2321]，O-甲基磷氨连接[Eckstein,Oligonucleotides andAnalogues:A Practical Approach,Oxford University Press(1992))]，肽核酸骨架连接[Egholm(1992)J.Am.Chem.Soc.114:1895]。其他的寡聚核苷酸还包括那些带正电的骨架[Denpcy et al.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:6097]，非离子型骨架(U.S.Pat.Nos.5386023,5637684,5602240,5216141和4469863)和非核糖骨架(U.S.Pat.Nos.5235033和5034506)。寡聚核苷酸包含一个或多个碳环糖也在核酸的定义中[Jenkins et al.(1995)Chem.Soc.Rev.pp.169-176]。那些为了提高分子在特定条件下的稳定性或者为了对寡聚核苷酸进行标签等目的在核糖-磷酸骨架上进行修饰的情况也包含在寡聚核苷酸的定义范围内。寡聚核苷酸还可能包括各种空间子(spacer)修饰，例如C3Spacer，C9 Spacer，C18 Spacer等。

名词“核酸”包括脱氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)，DNA-RNA杂交体，寡聚核苷酸，适配体(aptamers)，肽核酸(PNAs)，PNA-DNA杂交体，PNA-RNA杂交体等等。包括一切线性形式(单链或双链)或分支状形式的共价相连的核苷酸。一个典型的核酸通常是单链或者双链的，并包含磷酸二脂键。

名词“目标核酸序列”指的是待扩增的一段核酸序列，该序列作为核酸扩增的模板。

名词“核酸序列变异体”、“核酸变异体”指的是一段特定的核酸序列，不同变异体之间存在差别，这种差别可以是单个或多个碱基的不同，也可以是插入、缺失、易位或者以上所有类型的组合。

名词“野生型变异体”指的是自然存在的“正常”的基因序列，它在大多数群体中同一基因序列出现频率最高的序列。

名词“突变型变异体”指的是相比于“野生型变异体”不同的核酸序列。这种不同可以是单个或多个碱基的不同，也可以是插入或缺失或者以上所有类型的组合，例如，肿瘤细胞中突变的核酸序列。在一些实施例中，相较于野生型变异体，突变型变异体所占比例很少。

名词“扩增”指的是目的核酸片段在核酸聚合酶的作用下数目变多的过程，包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)，连接酶链式反应(LCR)，核酸序列基础扩增(NASBA)，转录介导扩增(TMA)，环介导等温扩增(LAMP)，链置换扩增(SDA)，解旋酶依赖扩增(HDA)等。

在本发明实施例中，扩增指的是聚合酶链式反应(PCR)。模板变性解链，寡聚核苷酸引物与模板退火杂交，伴随着核苷酸加入的延伸，如此反复循环一定轮数，实现目的核苷酸片段的增多。

名词“突变”指细胞中的遗传基因发生的改变。它包括单个碱基改变所引起的点突变，或多个碱基的缺失、重复和插入。

本专利中的“核酸双链稳定因子”指的是可以帮助稳定核酸双链结构的化合物或基团，它可以是锁核酸，也可以是肽核酸或者是DNA小沟结合物。优选的，修饰是DNA小沟结合物。之前有文献报告DNA小沟结合物分子可以显著的提高杂交核酸二聚体的退火温度，通常DNA小沟结合物连接在寡聚核苷酸片段的3’端。由于连接DNA小沟结合物可以显著的提高杂交核酸二聚体的退火温度，不同的核酸变异体与修饰的寡聚核苷酸片段互补程度不同而产生较大的退火温度的差异，从而产生不同的阻碍核酸聚合酶延伸的效果。本发明中，优选的，DNA小沟结合物连接在寡聚核苷酸的5’端。

名词“小沟结合物”指的是能与DNA小沟相结合的化合物。DNA双螺旋的表面有两条沟，分别命名为大沟和小沟。DNA大沟相比于DNA小沟拥有更多的氢键供体、受体、电荷等信息，并且细胞内蛋白更喜好识别大沟内的位点来调控基因的表达或者行使其他的细胞内功能。

DNA小沟是自然界中一些抗生素的靶点，比如纺锤霉素(netropsin)，远霉素(distamycin)。这两种化合物结合DNA的解离常数均为10～5M数量级，并且表现出对DNAAT-rich区域的偏好性。这两种化合物在选择性，毒性等方面具有一定的局限。研究人员找到了许多类似的化合物用来克服这些局限性，比如以下综述文献中提及的化合物[Sondhiet al.(Curr.Med.Chem.4,313(1997))，[Reddy et al.(Pharmacology&Therapeutics 84,1(1999)],Wemmer(Biopolymers 52,197(2001)]，[Dervan(Bioorg.Med.Chem.9,2215(2001)]。

还有一些化合物据称更喜好结合DNA GC碱基对区域，比如以下文献中提及的化合物[Anti-Cancer Drug Design 5,3(1990)]，[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,7586(1992)]，[Biochemistry 32,4237(1993)]，[Science 266,647(1994)]，[Anti-Cancer Drug Design10,155(1995)]，[Bioorg Med.Chem.8,985(2000)]，[Mol.Biol.34,357(2000)]。不同的纺锤霉素(netropsin)，远霉素(distamycin)的类似物被发现，例如[J Am.Chem.Soc.114(15),5911(1992)]，[Biochemistry 31,8349(1992)]，[Bioconjugate Chem.5,475(1994)]，[Biochem.Biophys.Res.Commun.222,764(1996)]，[J Med.Chem.43,3257(2000)]，[Tetrahedron 56,5225(2000)]，[Molecular Pharmacology 54,280(1998)]，[Bioorg Med.Chem.Lett.6(18),2169(1996)]，[J.Med.Chem.45,805(2002)]，[Bioorg.Med.Chem.Lett.12,2007(2002)]，(international patent applications WO97/28123,WO 98/21202,WO 01/74898and WO 02/00650,US patent numbers 4,912,199,5,273,991,5,637,621,5,698,674and 5,753,629)。纺锤霉素(netropsin)，远霉素(distamycin)的多肽同系物被以下专利WO/2003/059881公开。

名词“测序法”是指分析特定核酸片段的碱基序列，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤的(G)排列方式。Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤的(G)结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。在循环阵列合成测序法中，序列都是在荧光或者化学发光物质的协助下,通过读取DNA聚合酶或DNA连接酶将碱基连接到DNA链上过程中释放出的光学信号而间接确定的。新型纳米孔测序法(nanoporesequencing)是采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现测序的。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，而不同的单个碱基的带电性质不一样，通过电信号的差异就能检测出通过的碱基类别，从而实现测序。核酸测序方法有多种，并且新的方法在不断的被开发中。

在本发明实施例中，核酸扩增实验是荧光定量PCR实验。在荧光定量PCR反应中，衡量扩增的参数是Ct值，较早的Ct值反应的是信号更快的达到阈值。扩增样品中不同核酸变异体之间的Ct差值，往往反映了扩增体系对不同核酸变异体扩增效率的差异，进一步反应了扩增体系的选择性。

对扩增产物的检测在本领域中也有很多方法。这些方法包括使用荧光标记的探针，或者各种与核酸结合的染料。这些检测可以是特异性的检测核酸变异体中一种或者多种，也可以是非选择性的检测所有核酸信号。对扩增产物的检测可以发生在扩增反应完成之后，比如通过凝胶电泳的方法，或者对核酸进行染色的方法。另外，对扩增产物的检测也可以发生在扩增反应的过程之中。

实施例1：使用本发明所述的方法实现对缺失突变的选择性扩增与检测

在这个实施例中，两种目标核酸序列的变异体分别加入的量为100copies和10⁶copies，一种变异体是一个质粒DNA中插入了EGFR 2235-2249del15突变序列，而另一个变异体是相同的质粒但插入了EGFR野生型序列。

EGFR突变序列为：

TTCGGGGTGCATCGCTGGTAACATCCACCCAGATCACTGGGCAGCATGTGGCACCATCTCACAATTGCCAGTTAACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGTGGGGGTCCATGGCTCTGAACCTCAGGCCCACCTTTTCTCATGTCTGGCAGCTGCTCTGCTCTAGACCCTGCTCATCTCCACATCCTAAATGTTCACTTTC

EGFR野生型序列为：

TTCGGGGTGCATCGCTGGTAACATCCACCCAGATCACTGGGCAGCATGTGGCACCATCTCACAATTGCCAGTTAACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGTGGGGGTCCATGGCTCTGAACCTCAGGCCCACCTTTTCTCATGTCTGGCAGCTGCTCTGCTCTAGACCCTGCTCATCTCCACATCCTAAATGTTCACTTTC

正向引物序列为：DF-GACTCTGGATCCCAGAAGGTGA

反向引物序列为：DR-GGGCCTGAGGTTCAGAGCC

封闭探针序列为：DB-GGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAA(5’端MGB修饰，3’端C3Spacer)

检测探针序列为：DPF1-TCGCTATCAAAACATCT(5’端FAM，3’端MGB)

PCR反应体系为25μl，每个反应体系中含有2％甘油，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM，正向引物、反向引物各200nM，检测探针200nM，封闭探针500nM和1个单位的热启动TaqDNA聚合酶。其中1个单位是指在72℃30分钟掺入10nmol dNTPs所需要的酶量。

使用罗氏LightCycler 480荧光定量PCR仪进行PCR反应和后续的数据分析。PCR热循环条件为95℃，10min；50循环(95℃，15s；60℃，40s，单循环)；37℃，30s。

实验结果见图1和图2，实验的结果通过在465nM-510nM的荧光变化来体现的。

图1中可见10⁶copies野生型模板在加入检测探针后扩增效率极低，基本无扩增，由此表明检测探针具有极强的检测选择性。

图2中可见10⁶copies野生型模板在加入封闭探针及检测探针后完全无扩增。封闭探针与检测探针共存时突变型模板与混合型模板(100copies突变型与10⁶copies野生型)均得到有效扩增，封闭探针的存在不会干扰突变型模板的检测，同时检测探针的存在也不会干扰封闭探针对野生型模板的结合。

实施例2：使用本发明所述的方法实现对缺失突变的选择性扩增与检测

在这个实施例中，两种目标核酸序列的变异体分别加入的量为100copies和10⁶copies，一种变异体是一个质粒DNA中插入了EGFR 2236-2253del18突变序列，而另一个变异体是相同的质粒但插入了EGFR野生型序列。

EGFR突变序列为：

TTCGGGGTGCATCGCTGGTAACATCCACCCAGATCACTGGGCAGCATGTGGCACCATCTCACAATTGCCAGTTAACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGTCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGTGGGGGTCCATGGCTCTGAACCTCAGGCCCACCTTTTCTCATGTCTGGCAGCTGCTCTGCTCTAGACCCTGCTCATCTCCACATCCTAAATGTTCACTTTC

EGFR野生型序列为：

正向引物序列为：DF-GACTCTGGATCCCAGAAGGTGA

反向引物序列为：DR-GGGCCTGAGGTTCAGAGCC

检测探针序列为：DPF2-TCGCTATCAAGTCTCCGAAAGCCAACA(5’端FAM，3’端BHQ1)

PCR反应体系为25μl，每个反应体系中含有2％甘油，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM，正向引物、反向引物各200nM，检测探针200nM，封闭探针500nM和1个单位的热启动TaqDNA聚合酶。

使用罗氏LightCycler 480荧光定量PCR仪进行PCR反应和后续的数据分析。PCR热循环条件为95℃，10min；50循环(95℃，15s；60℃，40s，单循环)；37℃,30s。

实验结果见图3和图4，实验的结果通过在465nM-510nM的荧光变化来体现的。

图3中可见10⁶copies野生型模板在加入检测探针后扩增效率极低，基本无扩增，由此表明检测探针具有极强的检测选择性。

图4中可见10⁶copies野生型模板在加入封闭探针及检测探针后完全无扩增。封闭探针与检测探针共存时突变型模板与混合型模板(100copie突变型与10⁶copies野生型)均得到有效扩增，封闭探针的存在不会干扰突变型模板的检测，同时检测探针的存在也不会干扰封闭探针对野生型模板的结合。

实施例3：使用本发明所述的方法实现对插入突变的选择性扩增与检测

在这个实施例中，两种目标核酸序列的变异体分别加入的量为100copies和10⁶copies，一种变异体是一个质粒DNA中插入了EGFR 2319-2320insCAC突变序列，而另一个变异体是相同的质粒但插入了EGFR野生型序列。

EGFR突变序列为：

GCTTTTCCTCCATGAGTACGTATTTTGAAACTCAAGATCGCATTCATGCGTCTTCACCTGGAAGGGGTCCATGTGCCCCTCCTTCTGGCCACCATGCGAAGCCACACTGACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGATCGCAAAGGTAATCAGGGAAGGGAGATACGGGGAGGGGAGATAAGGAGCCAGGATCCT

EGFR野生型序列为：

GCTTTTCCTCCATGAGTACGTATTTTGAAACTCAAGATCGCATTCATGCGTCTTCACCTGGAAGGGGTCCATGTGCCCCTCCTTCTGGCCACCATGCGAAGCCACACTGACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGATCGCAAAGGTAATCAGGGAAGGGAGATACGGGGAGGGGAGATAAGGAGCCAGGATCCT

正向引物序列为：INF-CTACGTGATGGCCAGCGTG

反向引物序列为：INR-CATTCATGCGTCTTCACCTGG

封闭探针序列为：INB-ACAACCCCCACGTGT(5’端MGB修饰，3’端C3 Spacer)

检测探针序列为：INPH1-CCCCACCACGTGTGC(5’端HEX，3’端MGB)

使用罗氏LightCycler 480荧光定量PCR仪进行PCR反应和后续的数据分析。PCR热循环条件为95℃，10min；50循环(95℃，15s；60℃，40s，循环)；37℃,30s。

实验结果见图5和图6，实验的结果通过在533nM-580nM的荧光变化来体现的。

图5中可见在无封闭探针的时候10⁶copies野生型模板扩增明显，而加入封闭探针后基本无扩增。

图6中可见在封闭探针与检测探针共存时突变型模板的扩增效果与混合型模板(100copies突变型与10⁶copies野生型)的扩增效果类似，封闭探针的存在不会干扰突变型模板的检测，同时检测探针的存在也不会干扰封闭探针对野生型模板的结合。

上述实验结果说明使用本发明所述的方法实现了对插入突变的选择性扩增与选择性检测。

实施例4：使用本发明所述的方法实现对插入突变的选择性扩增与检测

在这个实施例中，两种目标核酸序列的变异体分别加入的量为100copies和10⁶copies，一种变异体是一个质粒DNA中插入了EGFR 2310-2311insGGT序列，而另一个变异体是相同的质粒但插入了EGFR野生型序列。

EGFR突变序列为：

GCTTTTCCTCCATGAGTACGTATTTTGAAACTCAAGATCGCATTCATGCGTCTTCACCTGGAAGGGGTCCATGTGCCCCTCCTTCTGGCCACCATGCGAAGCCACACTGACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACGGTAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGATCGCAAAG

EGFR野生型序列为：

正向引物序列为：INF-CTACGTGATGGCCAGCGTG

反向引物序列为：INR-CATTCATGCGTCTTCACCTGG

检测探针序列为：INPH2-GTGGACGGTAACCC(5’端HEX，3’端MGB)

实验结果见图7和图8，实验的结果通过在533nM-580nM的荧光变化来体现的。

图7中可见在无封闭探针的时候10^⁶野生型模板扩增明显，而加入封闭探针后基本无扩增。

图8中可见在封闭探针与检测探针共存时野生型模板的扩增效果与混合型模板(100copies突变型与10⁶copies野生型)的扩增效果类似，封闭探针的存在不会干扰突变型模板的检测，同时检测探针的存在也不会干扰封闭探针对野生型模板的结合。

上述实验结果说明使用本发明提供的方法实现了对插入突变的选择性扩增与选择性检测。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种用于检测目标核酸序列变异体的组合物，包括：封闭探针、检测探针和引物；

2.根据权利要求1所述的组合物，所述封闭探针3’末端的修饰选自磷酸化、氨基、脱氧、卤代、C3Spacer、C6Spacer。

3.根据权利要求1所述的组合物，所述封闭探针还含有核酸双链稳定因子。

4.根据权利要求3所述的组合物，所述核酸双链稳定因子位于封闭探针5’末端以外位置，选自碱基的修饰、碱基类似物的使用、核酸骨架的改变、糖基的修饰。

5.根据权利要求4所述的组合物，所述核酸双链稳定因子为锁核酸、肽核酸。

6.根据权利要求3所述的组合物，所述核酸双链稳定因子位于封闭探针5’末端，为DNA小沟结合物/类似物中的一种或一种以上的组合。

7.根据权利要求3所述的组合物，所述封闭探针5’末端含有抑制核酸酶水解的修饰因子。

8.根据权利要求7所述的组合物，所述修饰因子选自碱基类似物、核酸骨架、脱氧核糖类似物。

9.根据权利要求1所述的组合物，所述检测探针5’末端标记有荧光报告基团，3’末标记有荧光淬灭基团。

10.根据权利要求9所述的组合物，所述荧光报告基团选自FAM、TET、HEX、JOE、CY3、CY5、ROX或Texas Red；所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2或CY5。

11.根据权利要求1所述的组合物，还包括聚合酶，dNTP，和/或适合于PCR扩增的其它试剂或缓冲剂。

12.一种用于检测目标核酸序列变异体的方法，将待测核酸样品与权利要求1-11任意一项所述的组合物混合，进行扩增反应通过检测检测探针的检测信号的变化来检测扩增子，从而检测待测核酸样品中的目标核酸的突变型变异体。

13.根据权利要求12所述的方法，所述扩增反应选自等温扩增技术、聚合酶链式反应(PCR)。

14.根据权利要求13所述的方法，所述等温扩增技术选自环介导等温扩增技术(LAMP)、依赖于核酸序列的扩增技术(NASBA)、滚环扩增技术(RCA)、单引物等温扩增技术(SPIA)、依赖于解旋酶的等温扩增技术(HAD)、链替代扩增技术(SDA)、快速等温检测放大技术(RIDA)、切刻内切酶核酸恒温扩增技术(NEMA)。

15.根据权利要求12所述的方法，所述扩增反应是实时荧光定量PCR。

16.根据权利要求12所述的方法，所述突变型变异体为点突变、插入突变或缺失突变。

17.一种用于检测目标核酸序列变异体的试剂盒，包括如下成分：封闭探针、检测探针和引物；

18.根据权利要求17所述的试剂盒，所述封闭探针3’末端的修饰选自磷酸化、氨基、脱氧、卤代、C3Spacer、C6Spacer。

19.根据权利要求17所述的试剂盒，所述封闭探针还含有核酸双链稳定因子。

20.根据权利要求19所述的试剂盒，所述核酸双链稳定因子位于封闭探针5’末端以外位置，选自碱基的修饰、碱基类似物的使用、核酸骨架的改变、糖基的修饰。

21.根据权利要求20所述的试剂盒，所述核酸双链稳定因子为锁核酸、肽核酸。

22.根据权利要求21所述的试剂盒，所述核酸双链稳定因子位于封闭探针5’末端，为DNA小沟结合物/类似物中的一种或一种以上的组合。

23.根据权利要求17所述的试剂盒，所述封闭探针5’末端含有抑制核酸酶水解的修饰因子。

24.根据权利要求23所述的试剂盒，所述修饰因子选自碱基类似物、核酸骨架、脱氧核糖类似物。

25.根据权利要求17所述的试剂盒，所述检测探针5’末端标记有荧光报告基团，3’末标记有荧光淬灭基团。

26.根据权利要求25所述的试剂盒，所述荧光报告基团选自FAM、TET、HEX、JOE、CY3、CY5、ROX或Texas Red；所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2或CY5。

27.根据权利要求17所述的试剂盒，还包括聚合酶，dNTP，和/或适合于PCR扩增的其它试剂或缓冲剂。