CN110373454A - 一种联合检测egfr基因突变的试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种联合检测人类EGFR基因突变检测试剂盒，本发明包括的引物和探针包括SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:32；可以对EGFR1基因上T790M、L858R、19del、G719X，S768I和L861Q突变进行检测，可以在一个反应管中同时检测出多种突变；灵敏度较高，可以检测出3‑10拷贝数；高特异性，10ng/ul野生型质粒不会产生非特异性信号；检测快速高效，操作简单，费用低廉。

Description

一种联合检测EGFR基因突变的试剂盒及方法

本申请主张中国在先申请，申请号201910238686.0申请日：2019年3月27日的优先权。

技术领域

本发明涉及生物技术和医学领域，具体涉及基于荧光探针和聚合酶链式反应(PCR)的EGFR基因突变检测试剂盒及方法。

背景技术

目前，肺癌已成为全球癌症死亡的首要原因，全球每年新发病例150万，严重威胁人类健康。在肺癌患者中，非小细胞肺癌(NSCLC)约占85％，且就诊时80％已失去手术或放射治疗最佳机会，致使其长期生存率低，疗效令人堪忧。ⅢB/Ⅳ期非小细胞肺癌2年生存率仅10.20％，中位生存时间仅10-12月。因此，人们需要不断研究新的治疗方法以提高肺癌治疗的有效率，其中以分子靶向治疗为代表的新治疗方法，为晚期NSCLC的治疗带来了新的希望和曙光。

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是目前NSCLC治疗最重要的分子靶点，其是原癌基因C-erbB-1(HER-1)的表达产物，基因定位于第7号染色体短臂(7p12)，全长200Kb，由28个外显子组成。C-ErbB-1的编码产物EGFR为含有1210个氨基酸残基的单一多肽链前体，其中24个氨基酸为信号肽段，在翻译加工时被裂解，故成熟的EGFR是由1186个氨基酸组成的酪氨酸蛋白激酶，分子量约为170KDa。肺腺癌患者EGFR基因敏感性突变阳性率在亚裔人群和我国均为50％左右。随着对非小细胞肺癌发病机制进一步的研究以及对其分子生物学行为的深入探讨，有针对性的分子药物靶向治疗成为治疗晚期非小细胞肺癌很有前景的治疗方式。表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(epidermalgrowth factor receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)包括厄洛替尼(erlotinib)和吉非替尼(gefitinib)等，在治疗晚期NSCLC方面发挥了很重要的作用，效果显著，现已成为一线药物，为患者的治疗带来的很大的希望，广泛受到大家的认可。EGFR-TKIs在改善晚期非小细胞肺癌患者总生存期和无进展生存期方面有很显著的作用，然而，经过一段时间的临床治疗后，发现有一大部分患者会对EGFR-TKIs产生耐药性，大大限制了临床的应用，所以进一步分析研EGFR表达于正常上皮细胞表面，而在一些肿瘤细胞中经常过表达，与肿瘤细胞的转移、侵润、预后差有关。EGFR常发生突变，其酪氨酸激酶区域的突变主要发生在18-21号外显子，在中国肺癌患者中，EGFR突变率占30-50％，其中19和21号(L858R,L861I)外显子突变率占总突变率的90％左右，18号外显子突变占总突变率的5％左右，20号外显子上T790M突变占突变率的5％左右。

目前EGFR基因突变的检测方法主要包括以下几种：

(1)Sanger测序法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见DNA碱基序列的一种方法。测序的过程检测周期较长且较繁琐，消费昂贵，通量不高，灵敏度较小，只能检测突变比例在10％-20％以上的基因突变，因此不适用于临床上大量样本的分析与研究。

(2)限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析技术是分子生物学的重要分析方法之一，用于检测DNA序列多态性。PCR-RFLP是将PCR技术、RFLP分析与电泳方法联合应用，先将待测的靶DNA片段进行复制扩增，然后应用DNA限制性内切酶对扩增产物进行酶切，最后经电泳分析靶DNA片段是否被切割而分型的方法，该方法实验操作较繁琐，耗时较长，非闭管操作，容易引起污染造成假阳性。

(3)高分辨率熔解曲线(high-resolution melting，HRM)是一种通过饱和染料结合于PCR扩增产物实时监控其形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，具有较高的敏感性，在5％左右，但是不能判定阳性结果中基因突变的具体位置，还需要通过测序法或其他方法来进行确认。

(4)扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system，ARMS)是根据引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能进行有效扩增的原理，因为PCR扩增时Taq DNA聚合酶缺乏3’端到5’端的外切酶活性，不能及时修正3’端的错配碱基，使得PCR反应无法继续。基于此，设计针对基因突变位点的引物序列，一个与正常基因序列互补，一个与突变基因序列互补，则可以分别检测突变的基因和未突变的基因的量，该检测方法的灵敏度在1％左右。但是该方法引物中一个碱基不匹配并不能完全阻断野生型基因的扩增，可能存在假阳性的风险。

肽核酸(Peptide Nucleic Acid，PNA)，是具有肽键骨架的DNA类似物，其主链骨架是由N(2-氨基乙基)-甘氨酸与核酸碱基通过亚甲基羰基连接而成的，可特异性地与DNA或RNA杂交，形成稳定的三链复合物结构DNA/(PNA)₂，不易被蛋白酶和核酸酶降解，受盐浓度影响小，一个PNA碱基的错配会使其Tm值降低8-20℃，能够排除非特异的结合。

本发明提供一种高灵敏度和搞特异性的用于检测人类EGFR基因突变的试剂盒，结合ARMS和PNA探针两种技术。该试剂盒通过采用设计一段涵盖突变位点的14-20bp长度的PNA探针，其序列与野生型序列完全匹配，当PCR的模板为野生型时，PNA与其完全匹配，引物延伸受阻，扩增受到强烈的抑制作用，而当模板为突变型时，PNA与其会产生错配，杂交能力消失，引物延伸不受到影响，扩增反应可正常进行，应用此方法可以很大程度上提高反应的特异性，检测基因突变的灵敏度一般在0.01％左右。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测EGFR各突变位点的检测试剂盒，包括19号外显子缺失，21外显子L858R替代突变，T790M耐药突变以及L861Q，G719X，S768I等罕见突变的检测。检测结果可供临床医生为肺癌患者选择靶向药作为参考依据。

本发明的技术方案的原理在于设计针对野生型EGFR基因(包括18-21外显子)序列的核肽酸PNA探针或阻断剂，它们能与野生型基因特异性结合，阻断野生型基因的扩增，目的是为了在EGFR突变基因存在的情况下不干扰突变基因的扩增，即可以将EGFR基因突变型和野生型区分开。

本发明的技术方案如下：

用于检测EGFR基因(包括18-21外显子)6种突变的具体的引物探针序列以及阴性质控和阳性质控的引物序列如下表所示：

所述TaqMan探针5’端连接荧光报告基团，如FAM,VIC,ROX,CY5或HEX，3’端连接荧光淬灭基团BHQ。

优选的，所述试剂盒包括引物对，TaqMan探针，PNA探针，阻断剂Blocker，qPCR缓冲液，dNTPs，MgCl₂，TaqDNA聚合酶，各组分的最终浓度比例为：

优选的，所述试剂盒25ul体系PCR反应体系为：

组分	加样量
		qPCR缓冲液	5ul
dNTPs	2ul
		MgCl<sub>2</sub>	2ul
Forward Primer/Reverse Primer	0.3-0.6ul
		TaqMan探针	0.3-0.6ul
TaqDNA聚合酶	0.5-2U
		阻断剂Blocker/PNA探针	0.3-0.6ul
模板DNA	1ul
		ddH<sub>2</sub>0	Available

优选的，所述试剂盒25ul体系PCR反应条件为：95℃，10min/95℃，10s/60℃，30s。

本发明的目的在于提供一种用于肿瘤早期筛查或诊断多种基因联合突变快速检测的试剂盒，包括EGFR基因上19号外显子缺失(E746-A750)，21外显子L858R替代突变，T790M耐药突变以及L861Q，G719X，S768I等罕见突变的检测。包括以下几个步骤：

(1)以NCBI上公布的人类EGFR基因序列为野生型基因序列，以EGFR基因上18-21外显子上各突变位点为基础设计相应的特异性引物探针以及阻断剂。

(2)提取待检样本中基因组DNA，包括组织和血液样本。

(3)根据PCR扩增反应体系按比例配制试剂。

(4)在实时荧光定量PCR仪上设置反应条件，进行PCR扩增实验，根据仪器上显示的Ct值来判断检测的结果：检测报告荧光基团信号强度，以FAM和HEX等信号达到设定阈值(Ct>20)表明检测DNA在允许范围之内，荧光信号结果可信，以FAM信号达到设定阈值的Ct值为阴性阳性判断的标准，Ct值为0或大于35：阴性；Ct值小于28。

本发明的特点在于：①采用PNA探针和阻断剂特异性结合野生型序列，提高了检测突变基因的特异性，野生型样本不会产生非特异性信号；②可以一管检测出多种突变基因；③灵敏度高，可以检出含0.05％突变的基因；④检测速度快，操作简单，价格低廉。

附图说明

图1为EGFR基因上T790M突变检测的扩增曲线；图中，①是100％突变型质粒的扩增曲线，②为野生型质粒的扩增曲线，③为空白对照(ddH20)的扩增曲线；

图2为EGFR基因上L858R突变检测的扩增曲线；图中，①是100％突变型质粒的扩增曲线，②为野生型质粒的扩增曲线，③为空白对照(ddH20)的扩增曲线；

图3为PNA探针阻断19号外显子野生型序列效果图；图中，①是反应体系中不加PNA探针野生型质粒的扩增曲线，②是反应体系中加入PNA探针野生型质粒的扩增曲线，③为空白对照(ddH20)的扩增曲线；

图4为EGFR基因上T790M突变检测限研究的扩增曲线；图中，①至⑤是经野生型梯度稀释含100％，10％，0.5％，0.1％，0.05％突变型质粒的扩增曲线，⑥为野生型质粒的扩增曲线，⑦为空白对照(ddH₂0)的扩增曲线；

图5为EGFR基因上L858R突变检测限研究的扩增曲线；图中，①至⑤是经野生型梯度稀释含100％，10％，0.5％，0.1％，0.05％突变型质粒的扩增曲线，⑥为野生型质粒的扩增曲线，⑦为空白对照(ddH20)的扩增曲线；

图6为EGFR基因上19号外显子缺失突变[E746-A750(1)]突变检测限研究检测的扩增曲线；图中，①至⑤是经野生型梯度稀释含100％，10％，0.5％，0.1％，0.05％突变型质粒的扩增曲线，⑥为野生型质粒的扩增曲线，⑦为空白对照(ddH20)的扩增曲线；

图7为EGFR基因上19号外显子缺失突变[E746-A750(1)]检测限研究的扩增曲线；图中，①至⑤是经野生型梯度稀释含100％，10％，0.5％，0.1％，0.05％突变型质粒的扩增曲线，⑥为野生型质粒的扩增曲线，⑦为空白对照(ddH20)的扩增曲线；

图8为EGFR基因上L861Q，G719X，S768I突变检测的扩增曲线；图中，①②③是分别是L861Q，G719X，S768I 100％突变型质粒的扩增曲线，④为野生型质粒的扩增曲线，⑤为空白对照(ddH20)的扩增曲线。

具体实施方式

以下具体的实施例是对试剂盒的研发过程进行具体的描述，仅限于说明，不限制试剂盒本身的范围。

本发明针对目前肺癌中EGFR基因上几种主要的突变方式，联合检测T790M，L858R，19del，L861Q，G719X，S768I等6种突变方式进行肺癌的早期筛查或诊断。针对目前的诊断方法灵敏度低，检测繁琐耗时长，无法满足临床检测的实际需求，针对以上问题，设计出针对检测以上6种基因突变方式的特异性引物和探针。

本发明的特点在于设计一段能与EGFR基因野生型序列(含各突变位点)特异性结合的探针序列，有效的阻遏野生型序列的扩增，与此同时，没有影响突变型序列的扩增。应用上述基本原理，设计出检测上述基因突变的探针，通过采用实时荧光定量PCR反应体系，实现多个基因联合的高灵敏度检测。

实施例1人类EGFR基因突变检测方法的建立

(1)检测样本DNA的提取

检测样本包括细胞悬浮液、病理组织或血液样本，其中血液样本不少于200ul，按以下步骤进行提取：加入适量蛋白酶K、磁珠，细胞样本和400ul裂解液，62℃水浴10min，12000g离心1min，弃掉上清液，加入清洗液，短时离心，重复一遍，自然晾干，加入50-100ul洗脱液洗脱，离心，-20℃储存备用。

(2)构建阴性质控和阳性质控

以NCBI上公布的人类EGFR基因序列为野生型基因序列，以EGFR基因上18-21外显子上各突变位点为基础设计相应的特异性引物探针，以基因工程构建阴性质粒和阳性质粒。以人类基因组DNA为野生型模板以基因工程构建野生型质粒，以H1975,PC9,HCC827等细胞株提取突变模板以基因工程构建突变型质粒，建立荧光PCR检测EGFR基因6种突变的反应体系，并将此体系用于EGFR突变检测。

(3)引物和探针的设计与合成

EGFR突变位点的确定与引物探针的设计：针对EGFR基因的19～21号外显子区域，在突变位点两端的保守区域设计PCR引物和Taqman探针，由Primer Express 3.0.1软件合成，其中设计一条ARMS引物，使其3’末端最后一个碱基位于点突变位点上并与突变型基因匹配，且另外在19和21号外显子突变附近设计一条PNA或Blocker，序列与EGFR野生型基因完全匹配，引物探针由国内某专业企业公司合成的。

(4)实时荧光定量PCR反应液的配制以及反应体系和反应条件的确定

所提DNA溶于TE Buffer(10mM Tris-Hcl,1mM EDTA,PH8.0)中，稀释成1-10ng/ul作为模板使用。模板用于荧光PCR扩增，PCR扩增体系为：

组分	总体积25ul
		1×缓冲液	5ul
各引物	0.5ul
		各探针	0.5ul
Taq酶	2U
		dNTPs	0.5-1umol
MgCl<sub>2</sub>	0.1-1umol
		模板DNA	5ul
ddH<sub>2</sub>0	Available

PCR扩增条件为：95℃预变性10min，95℃变性10s，60℃退火延伸30s，40个循环，在退火时收集并检测FAM，VIC，HEX或ROX荧光信号。

(5)检测荧光信号，根据Ct值做出结果判断的标准

检测FAM和HEX荧光信号Ct值，根据荧光PCR仪显示的Ct值来判断结果：检测反应体系的FAM和HEX荧光信号Ct值，当HEX荧光信号Ct值达到阈值时，说明DNA符合条件，在允许范围之内，FAM荧光信号检测的结果可信，以FAM信号达到设定阈值的Ct值为阴性阳性判断的标准，Ct值为0或大于35：阴性；Ct值小于28。

(6)EGFR突变基因定量检测

结果显示，T790M，L858R，19del，L861Q，G719X，S768I阳性检出率为100％，所有EGFR野生型核酸样本的检测结果均为阴性，阴性符合率100％，诊断阳性检测结果见图1-2。

本试剂盒人类EGFR突变位点包括：

实施例2人类EGFR野生型基因组DNA中EGFR基因突变的检测限实验

取人EGFR野生型质粒，人EGFR各突变型基因质粒以及TE Buffer缓冲液，制备同时含10ng/ul的人EGFR野生型DNA及含量分别为为野生型的10％、0.5％、0.1％、0.01％的人EGFR各突变型基因质粒的检测限参考品，记录阳性检出率，实验中阳性检出率至少为95％且突变型所占比例最低设定为检测限。

结果显示，检测6ng/ul人野生型基因组DNA中所含EGFR基因6种突变的含量的检测限均不低于0.05％。检测结果见图4-7。

Claims (7)

1.一种联合检测人类EGFR基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括TaqMan探针，PNA探针，阻断剂Blocker，引物对，阳性质控和阴性质控。

2.如权利要求1所述的TaqMan探针，其特征在于，其探针序列为SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20的至少15个连续核苷酸。探针5’端被荧光报告基团FAM和VIC等修饰，3’端被荧光淬灭基团MGB，BHQ1等修饰。

3.如权利要求1所述的PNA探针，其特征在于，其探针序列为SEQ ID NO:10的至少15个连续核苷酸，探针无任何修饰，与包含突变位点野生型EGFR序列完全互补配对。

4.如权利要求1所述的21外显子阻断剂Blocker，其特征在于，其序列为SEQ ID NO:11的至少15个连续核苷酸。

5.如权利要求1所述的引物对具体包括：

(1)针对20号外显子T790M替代突变的引物对序列分别包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的至少连续15个核苷酸；

(2)针对21号外显子L858R替代突变的引物对序列分别包括SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的至少连续15个核苷酸；

(3)针对19号外显子缺失的引物对序列分别包括SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的至少连续15个核苷酸；

(4)针对G719X，S768I，L861Q罕见突变的引物对序列分别包括SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19的至少连续15个核苷酸。

6.如权利要求1所述的阳性质控和阴性质控，其特征在于，阳性质控其序列分别是SEQID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32。

7.一种联合检测人类EGFR基因突变检测的方法，其特征在于，包括以下几个方面：

(1)获得EGFR野生型和突变型细胞株核酸样本，作为PCR模板，构建相应的载体质粒，作为阴性质控品和阳性质控品；

(2)如权利要求2，3，4和5所述，TaqMan探针，PNA探针，阻断剂Blocker,引物对，阳性质控和阴性质控，按照25ul Q-PCR反应体系混匀，进行实时荧光定量PCR反应。EGFR突变样本和野生型样本按1/1，1/10，1/100，1/1000，1/10000比例稀释混匀，绘制标准曲线图；

(3)获得医院非小细胞肺癌患者组织标本，用磁珠法提取核酸样本，进行荧光定量PCR反应，根据标准曲线系数，获得患者EGFR基因突变量。