CN105420361B - 基于酶切灵敏检测人类egfr基因突变的方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

为了克服现有方法及试剂盒的不足,本发明提供了一种基于酶切灵敏检测人类EGFR基因突变的方法及其试剂盒，属于基因突变检测领域。本发明通过在EGFR基因片段扩增体系中引入耐热DNA连接酶和针对突变位点处的特定连接引物组，可以基于扩增片段条带直接判定野生型样本或使得低突变含量样品其最终的PCR产物中突变片段的比例高于50%；然后通过变性和退火，制备在突变位点处含有错配构造的DNA片段杂交样品，从而利用错配切除酶实现对杂合基因片段样品的有效检测。本发明方法及试剂盒可以基于酶切检测出样本中含量低至1%的EGFR基因突变，准确率极高，检测时间较短且费用低廉，适合于临床检测。

Description

基于酶切灵敏检测人类EGFR基因突变的方法及试剂盒
技术领域
本发明属于基因突变检测领域，尤其涉及基于酶切灵敏检测人类EGFR基因突变的方法和试剂盒。
背景技术
人类表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR）是一种由原癌基因C-erbB-1(HER-1)编码的具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，广泛表达于大部分正常上皮细胞中。然而在许多实体肿瘤（如非小细胞肺癌）中往往存在EGFR高表达或异常表达的情况，这与肿瘤细胞的增殖、血管生成、侵袭、转移及凋亡的抑制有关，因此EGFR已经成为相关肿瘤（尤其是非小细胞肺癌）靶向治疗的一个重要靶点。目前应用于临床的EGFR靶向药物包括:EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKIs,如吉非替尼即易瑞沙和厄罗替尼即特罗凯)，以及EGFR单克隆抗体如西妥昔单抗。大量研究表明, 吉非替尼（Gefitinib）和厄罗替尼（Erlotinib）的疗效与EGFR基因尤其是其18-21号外显子的突变状况密切相关。携带EGFR基因突变的肺癌患者对酪氨酸激酶抑制剂高度敏感，患者将得到很大的受益；反之野生型基因的患者将基本不受益，因此EGFR基因检测作为非小细胞肺癌等癌症靶向药物选用的前提被列入了最新的NCCN（美国国家综合癌症网络）肿瘤临床实践指南。
目前报导的EGFR基因突变检测方法包括Sanger测序、Scorpions-ARMS、TaqMan-qPCR、DHPLC、PCR-SSCP/RFLP等,其中在科研和临床中较为常用的方法为Sanger测序法和Scorpions-ARMS(Scorpions，蝎形探针；Amplification refractory mutation system,扩增阻滞突变系统)法。Sanger测序法是基因突变/多样性检测的金标准，具有技术和平台成熟、结果准确和全面等优点；然而Sanger测序法主要的不足在于检测灵敏度约只有10-20%左右（即突变基因含量要大于10%甚至20%才能被可靠检出），且检测过程繁琐、检测时间长（大致需要2天），这制约了其临床应用。基于Scorpions-ARMS法开发的如德国Qiagen公司的EGFR检测试剂盒，可同时检测EGFR基因的29种常见突变,具有灵敏度高（可测出低至1%水平的突变）、操作简单、快速检测等优点；然而该类进口试剂盒检测成本过高（每份标本需3000-5000元）限制了其临床的推广和应用。
发明内容
为了克服现有人类EGFR基因突变检测方法和试剂盒的不足, 本发明的目的之一在于提供一种基于酶切灵敏检测人类EGFR基因突变的试剂盒；本发明的另一个目的在于提供一种基于酶切的灵敏检测人类EGFR基因突变的方法。
由于在EGFR基因片段的扩增体系中加入了针对突变位点的连接引物和耐热DNA连接酶，导致样品中的野生型EGFR基因片段的扩增将受到有效的抑制，而突变型的扩增则基本不受影响；因此使得突变含量低至1%的样品其最终的扩增产物中突变片段的比例高于50%，从而保证了酶切对于杂合基因片段体系的有效检测。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：
首先，本发明涉及一种基于酶切灵敏检测人类EGFR基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括10×PCR缓冲液、10×耐热DNA连接酶缓冲液、dNTPs、8条扩增引物、9条连接引物、耐热DNA连接酶、DNA聚合酶、10×错配切除酶缓冲液和错配切除酶；所述8条扩增引物其序列如SEQ.ID NO.1- SEQ.ID NO.8所示，其中SEQ.ID NO.1和SEQ.ID NO.2、SEQ.ID NO.3和SEQ.ID NO.4 、SEQ.ID NO.5和SEQ.ID NO.6、SEQ.ID NO.7和SEQ.ID NO.8分别用于靶向第18、19、20、21号外显子片段的扩增；所述9条连接引物其核苷酸序列如SEQ.ID NO.9-SEQ.ID NO.17所示，所述连接引物其5’端第一个核苷酸均进行磷酸化修饰，其中SEQ.IDNO.9靶向第18号外显子的3种突变位点，SEQ.ID NO.10靶向第19号外显子的19种突变位点，SEQ.ID NO.11-SEQ.ID NO.15靶向第20号外显子的5种突变位点，SEQ.ID NO.16-SEQ.IDNO.17靶向第21号外显子的2种突变位点；所述错配切除酶为T7核酸内切酶I或芹菜Cel I酶，酶活单位不低于500单位/mL。
其实，本发明实现涉及一种基于酶切灵敏检测人类EGFR基因突变的方法，通过在EGFR基因片段扩增体系中引入耐热DNA连接酶和针对突变位点处的特定连接引物组，可以基于扩增片段条带直接判定野生型样本或使得低突变含量样品其最终的PCR产物中突变片段的比例高于50%；然后通过变性和退火，制备在突变位点处含有错配构造的DNA片段杂交样品，从而利用错配切除酶实现对杂合基因片段样品的有效检测。
更具体地，基于酶切灵敏检测人类EGFR基因突变的方法及其试剂盒，具体步骤和本发明试剂盒相关内容如下：
（1）样本采集和基因组DNA提取
采集或取出待测生物样本如患者的肿瘤组织或外周血等，利用相应的试剂盒提取其基因组DNA。
（2）EGFR基因特定片段扩增
采用本发明试剂盒分别配制EGFR基因外显子组合的含连接酶扩增体系即正常体系，一共需要配制5管；所配制的5管扩增体系除了扩增引物和连接引物不同外其余均相同，如表1所示：
表1 EGFR基因外显子正常扩增体系（25uL）
同时配制对应的不含连接引物、耐热DNA连接酶缓冲液和耐热DNA连接酶这三种组分的对照扩增体系5管，体系配制参照表1，所缺组分添加量由灭菌去离子水替补，其余组分同对应的正常体系。
共5管正常体系（含连接酶扩增体系）和5管对照体系（不含连接酶扩增体系）在基因扩增仪上进行EGFR基因片段的扩增，扩增条件均为：95℃预变性5-10min；94℃变性15-30s，50-53℃退火45-90s，72℃延伸1-2min，循环30-36次；72℃终延伸10-12min。
（3）扩增产物的电泳分析
所有的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在0.5ug/ml 的EB 溶液中染色20min并用清水脱色后置于凝胶成像系统上拍照和分析。在对照体系成功扩增出目的基因片段的情况下，以电泳图谱中的DNA Marker条带为标准，选取正常体系中出现目的扩增产物条带明亮即其浓度不低于5ng/uL的那些管，以及和其对应的对照体系扩增产物管备用。
（4）DNA片段杂交样品的制备
将（3）中选取的各正常体系及其对应的对照体系的扩增产物，混合于新的PCR管中配制混合DNA片段体系，将其置于PCR仪上进行变性和退火，从而获得DNA片段杂交样品；
将（3）中选取的各正常体系及其对应的对照体系的扩增产物，按照一定体积比混合于新的PCR管中，添加一定量的PCR缓冲液和去离子水后在PCR仪上进行变性和退火，从而获得DNA片段杂交样本。
（5）DNA片段杂交样品的酶切分析
利用可以有效识别并切除DNA双链上错配位点的酶（简称错配切除酶）处理（4）中制备的DNA片段杂交样本，反应后将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，以DNA Marker为参照，分析得到的实际酶切带型和对应的理论酶切带型的一致性情况。
（6）EGFR突变结果判定
以DNA Marker条带为标准，在对照体系正常扩增的情况下，如果正常体系中的各目的扩增片段条带微弱即其浓度明显低于5ng/uL，则无需进行酶切和后续操作直接判定样品的EGFR基因检测结果为阴性即野生型；如果某些目的条带明亮即其浓度不低于5ng/uL，且酶切产物电泳带型和对应的理论酶切带型一致的话，则判定样品的EGFR基因检测结果为阳性即突变型,突变类型以对应的理论酶切带型代表的突变为准；如果目的条带明亮即其浓度不低于5ng/uL，但无显见的酶切带型出现或出现的酶切带型与对应的理论酶切带型不一致的话，则判定样品此次EGFR基因检测结果为无法判断，需要重新测定。
其中，步骤（1）中样本的采集对象若为肿瘤患者则应在其充分知情同意的前提下进行；采集或取出的组织样本包括但不限定于新鲜组织、冰冻组织、甲醛浸泡组织和甲醛固定石蜡包埋组织切片，血液样本包括但不限定于新鲜血液、血浆和血清，其它生物样本包括但不限定于胸水、腹水和肿瘤脱落细胞，样本采集或取用量等取样要求和前处理按照对应的基因组提取试剂盒执行；提取样本基因组DNA后，利用琼脂糖凝胶电泳或吸亮度法评估其提取量（浓度）和纯度，需要保证EGFR基因片段的有效扩增：如基因组DNA的提取量不少于200ng，纯度以OD260/ OD280在1.8-2.0之间为宜。
其中，步骤（2）中采用的本发明试剂盒的组分如表2所示：
表2 本发明试剂盒组分
表2中，编号1-7的组分是用于步骤（2）中的目的片段扩增的，编号8和9两种组分是用于步骤（5）中的酶切反应的。其中10×PCR缓冲液是由100mmol/L Tris-HCl（pH=8.3）、500mmol/L KCl和15mmol/L MgCl2组成；10×耐热DNA连接酶缓冲液为200 mM Tris-HCl、250 mM 乙酸钾、100 mM 乙酸镁、10 mM NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）、100 mM DTT（二硫苏糖醇）、1% Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚），pH=7.6；dNTPs是由dATP、dTTP、dCTP和dGTP各2.5mmol/L混合而成的；8条扩增引物序列如SEQ.ID NO.1-SEQ.ID NO.8所示，对应于EGFR基因的第18、19、20和21号外显子的扩增，每个外显子各自都有一对扩增引物（正向引物和反向引物），每条扩增引物的浓度均为10umol/L；对应于EGFR基因的第18、19、20和21号外显子，每个外显子各自都有一条或一组靶向其上目标位点（即属可发生29种常见突变的位点）处的连接引物，合计共9条连接引物，序列如SEQ.ID NO.9-SEQ.ID NO.17所示，每条连接引物的浓度均为10umol/L；耐热DNA连接酶的酶活力单位浓度不低于4000U/uL，在正常体系下95℃保温1h酶活力不低于原酶活的60%；DNA聚合酶的酶活力单位浓度为5U/uL，具有耐热性能，若具备高保真性能则效果更好。
表2中，错配切除酶是指可以特异和高效地识别异源双链DNA的突变位点（包括各种点突变和小片段的插入/缺失）并在突变处进行切割，使之形成两段小的DNA片段的一类酶，目前商品化的有T7核酸内切酶I、芹菜Cel I酶等；1单位酶活定义为在 50μl反应体系中37℃下保温1小时可将1μg长为100bp的含有错配的DNA片段中的90%以上酶切成两个短片段所需要的酶量，所用酶酶活单位不低于500单位/ml；错配切除酶切缓冲液是指商品化错配切除酶自带的酶切缓冲液，以NEB公司的T7核酸内切酶I为例，10×酶切缓冲液为500mMNaCl、100mM Tris-HCl、100mM MgCl2、10mM DTT，pH7.9。
其中，步骤（2）中外显子组合的扩增引物和连接引物及相关信息如表3所示：
表3 EGFR外显子的扩增引物、连接引物以及相应的信息
如表3所示，采用组合多重扩增可以在保证29种突变检测的前提下，最大程度减少所需要的检测管数，从而简化操作和节约成本；表3最后一列中用加号表示连接，加号左右的数字则是酶切形成的两段产物的理论大小；第19号外显子的19种突变是相互重叠的，其酶切产物其中一段理论大小介于196-200bp之间，另外一段对应地介于282-278bp之间，总长合起来为478bp；无需具体指明是那种突变，并不影响结果的分析。对应于表3，扩增引物和连接引物的序列及靶向信息如表4所示：
表4 扩增引物和连接引物序列及靶向信息
表4中SEQ.ID NO.9-SEQ.ID NO.17这9条连接引物在使用其5’端的第一个核苷酸均进行磷酸化修饰。
其中，步骤（2）中提供的是针对25uL的体系的组分及含量，可以作为其它体系如50uL等体系的配制依据。
其中，步骤（3）中对照体系扩增出的目的片段其电泳条带亮度用肉眼观察，应不低于DNA Marker的标准条带亮度（一般约为5-10ng/uL）则表示扩增效果良好；此外由DNAMarker各标准条带的浓度，如某一片段为5ng/uL，则在同样上样量的情况下，对于正常体系扩增产物，只选取肉眼识别亮度至少与该标准条带相当的目的条带所对应的扩增产物管以进行后续分析；换言之，目的条带明亮即表示其对应的目的扩增产物浓度应该不低于5ng/uL；如确实需要则可借助凝胶成像系统自带的软件或者美国BioRad公司的Quantity-one等凝胶分析软件进行条带亮度分析；对于某一正常体系管，与其对应的对照体系管是指含同样扩增引物的对照管。
其中，步骤（4）中用于变性退火反应的混合DNA片段体系配制如表5（以20uL体系为例）所示，添加PCR缓冲液的目的是在退火阶段促进DNA双链的复性。
表5 混合DNA片段体系（20uL）
其中，步骤（4）中混合DNA片段体系的变性退火过程为：将 PCR 反应管置于PCR仪中 98℃孵育3-5min，之后停止加热并在PCR 仪中放置至少15min使之缓慢冷却。
其中，步骤（5）中使用的错配切除酶可以是T7核酸内切酶I或芹菜Cel I酶等，这些酶可以特异和高效地识别异源双链DNA上的突变位点（包括8种点突变和十几个碱基以内小片段的插入/缺失）并在突变处进行切割，使之形成两段小的DNA片段。目前这两种酶均有商品化生产，酶切体系配制和处理条件为：取4.5-8ul步骤（4）中的DNA片段杂交样品到新的无菌PCR管中，加入0.1-0.25ul T7核酸内切酶I/芹菜Cel I酶和1ul 10×酶缓冲液，用水补足10uL；将PCR管放入PCR仪中进行酶切操作，程序为：37℃保温30min-60min进行酶切反应，80℃保温10min灭酶，即得到了酶切产物。
其中，步骤（5）中理论酶切带型如表3最后一列（杂交片段酶切产物理论大小）所示，从中可见每管中的各突变酶切带型都有足够的区分度。考虑到错配切除酶的实际作用效果以及琼脂糖凝胶电泳的分辨率，这边更注重的是酶切的带型标准而非单纯的片段精确大小，因此有几个碱基的偏差并不会影响带型的判断。实际酶切带型则是以DNA Marker的条带梯度为参照经过初步分析得出，必要时可以借助凝胶成像系统自带的软件或者美国BioRad公司的Quantity-one等凝胶分析软件进行条带大小分析得到较为准确的实际酶切带型。
其中，步骤（5）和（6）中理论酶切带型作为判断突变类型的依据，而针对EGFR基因第18号外显子上的3种突变和第19号外显子上的19种突变（详见表3），本发明方法和试剂盒只各设计了一条连接引物，因此对于这两者本发明只判断是否是在目的位点处发生突变，并不指明具体的突变类型。由于这两者其上各突变的毗邻或重叠，因此采用简并设计使得检测操作简化、成本得以有效控制，然而这并不影响临床上的用药指导判断。而对于第20、21号外显子，由于各突变分散因此只能逐一设计连接引物，因此本发明指明其具体的突变类型。
其中，步骤（6）中根据得到的样品EGFR基因检测结果后，对照现有的临床结论或科研研究成果，临床医生告知对应的肿瘤患者预测其接受靶向药物治疗的受益情况。
其中，步骤（6）中肿瘤患者包括非小细胞肺癌但不限定于此，靶向药物包括吉非替尼和厄罗替尼但不限定于此。针对非小细胞肺癌，EGFR各单一突变和靶向药物吉非替尼和厄罗替尼使用的受益情况为：20外显子发生T790M突变和插入，将预测TKI药物的耐药或者无效；其余突变均预测TKI药物治疗有效。
其中，步骤（6）中如果需要重新检测EGFR基因突变情况（即无显见的酶切带型出现或出现的酶切带型与对应的理论酶切带型不一致时）的，若再次采用本发明方法检测仍无法判定突变情况的，则可以建议改用其它测定方法。
本发明的有益效果是，基于酶切灵敏检测人类EGFR基因突变的方法及其试剂盒，由于在EGFR基因片段扩增体系中引入针对突变位点的特定连接引物和耐热DNA连接酶的体系，极大抑制了样品中的野生型EGFR基因的扩增，可以基于扩增片段条带直接判定野生型样本；或使得低突变含量样品其最终的PCR产物中突变片段的比例高于50%，从而保证了酶切对于杂合基因片段体系的有效检测；本发明方法及试剂盒可以基于酶切检测出样本中含量低至1%的EGFR基因突变，准确率极高，检测时间较短且费用低廉，适合于临床检测。
附图说明
图1是本发明基于连接抑制方法的原理示意图。图中“野”代表野生型基因组模板，“突”代表突变型基因组模板（其上的米字符号代表突变位点），I、II、III、VI和V代表的步骤分别是变性、退火、延伸、变性退火操作和酶切操作，箭头代表扩增引物及其延伸方向，半圆形环代表连接引物（其上的实心原点代表磷酸化修饰），三角形代表DNA聚合酶，圆圈代表DNA连接酶，退火50℃前的波浪号代表约等于，退火阶段连接引物左端翘起表示其和突变位点不配对，延伸阶段扩增引物延伸出的虚线箭头代表DNA链延伸，延伸阶段闭环连接引物是由于连接酶将与野生型模板互补并且毗连的连接引物两端连接起来而形成的，连接引物右上角的倾斜虚箭头代表开环连接引物脱离突变型基因组模板。在变性退火步骤中，野生型基因片段和突变型基因片段形成了杂交双链，在突变位点处形成了错配的构造。经过酶切操作后，含有错配突变的杂交双链在其错配处被切成两段短的双链。
图2是EGFR20的T790M突变杂合体样本扩增产物的电泳图谱。M代表DNA Marker，图中标出了相关的两条标准条带250bp和500bp，紧接着左边Marker的1-5泳道分别为对照体系的1-5管的扩增产物样品；紧接着右边Marker的6-10泳道为正常体系的1-5管的扩增产物样品；“选取”标识表示选择正常体系的第3管和对照体系的第3管备用。
图3是DNA片段杂交样品的酶切图谱。M代表DNA Marker，图中标出了相关的三条标准条带100bp、250bp和500bp，紧接着DNA Marker的分别是DNA片段杂交样品和其酶切产物。图中1、2、3分别用于标识酶切产物形成的三条条带。
具体实施方式
一、基于酶切灵敏检测人类EGFR基因突变的方法及其试剂盒的原理
酶切如限制性内切酶酶切是基因多样性/突变检测的一种简便和经济的方法，用于酶切的目的基因片段是通过靶向其两端保守区域的引物对扩增得到的；对于复合模板如杂合子来源的核酸样本，若其中的扩增片段含量低则难以通过酶切法准确识别该片段。肿瘤是体细胞疾病，由于体细胞突变组分只占临床等样本中的一部分，除此之外还可能存在大量的野生型基因，因此采用常规的酶切法无法保证此类样本基因突变检测的灵敏度需求。
针对常规酶切法在EGFR基因突变检测中的不足，本发明提出了连接抑制的方法进行改进，图1是其原理示意图。本发明以EGFR基因的29种常见突变为对象，设计了靶向各突变位点处的连接引物（SEQ.ID NO.9- SEQ.ID NO.17），使得各对连接引物的5’端和3’端序列和野生型基因对应突变位点的区域毗邻互补（连接引物形成的环状构造两端和模板完全互补并且毗邻）。由于在EGFR基因外显子的扩增体系中引入了耐热的DNA连接酶，则退火阶段（～50℃）时DNA连接酶将会连接位于野生型模板上的毗邻互补的连接引物两端从而形成闭环的连接引物，而由于与突变型模板结合的连接引物两端在毗邻处（即突变位点处）没有和模板完全互补则不被连接。当体系处于下一阶段即72℃延伸时，由于结合于野生型模板上的长闭环连接引物退火温度高于72℃，因此仍位于原处从而阻止野生型模板的扩增；而对于突变型模板，由于结合的是连接引物两端短的区域，其退火温度均低于60℃，则在72℃的温度下开环连接引物将和模板分离，因而不会阻碍模板的扩增。
假定肿瘤样本基因组中野生型模板的含量有100，突变模板含量只有1，目的片段以2的指数次方进行扩增；如果以连接引物对于野生型模板扩增的平均抑制效率仅为20%，则野生型目的片段的扩增产量为100×[2×(1-20%)]n（n为扩增循环数）,突变型目的片段的扩增产量为2n；经过21个循环，突变型目的片段的含量将超过野生型目的片段。由此可知通过本发明方法将使得最终样品中的野生型EGFR基因片段的扩增受到有效的抑制，而突变型的扩增则基本不受影响；因此使得突变含量低至1%的样品其最终的扩增产物中突变片段的比例高于50%。在此基础上，通过混合对照体系和正常体系扩增产物，并经变性和退火操作，制备在突变位点处含有错配构造的DNA片段杂交样品，从而实现了错配切除酶对于杂合基因片段样品的有效检测。
由于是先通过正常体系扩增产物电泳检测情况识别突变发生位点所在的区域，进而决定酶切操作的进行的；因此一般仅需要一次酶切或无需进行酶切从而有效降低了检测成本。此外由于有对照体系扩增产物做为杂交样品的本底，因此本发明方法可以有效排除EGFR外显子的多态性位点而只检测突变位点。本发明首次构建了循环DNA聚合和循环DNA连接联合体系，并且进一步优化了聚合和连接联合体系中各组分的含量和比例，最终结合设计的靶向常见的EGFR基因突变位点处的连接引物将其引入到EGFR基因突变的检测中；此外利用简单的变性退火操作使得突变以错配构造的形式显现，进而利用错配切除酶实现简便的酶切检测。其中的各技术参数及应用构成了对应于本发明方法的试剂盒。
二、实施例
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于此。
本实施例以健康人血细胞扩增得到的EGFR基因片段为野生型模板，将其克隆到大肠杆菌工程菌中；利用重叠延伸PCR获得突变型的EGFR基因片段，将其克隆到大肠杆菌工程菌中，由此分别构建了EGFR基因野生型和突变型细胞系，在此基础上建立基于酶切灵敏检测人类EGFR基因突变的方法及其试剂盒。主要包括以下步骤：
（1）试剂盒中各组分的选用。
本发明试剂盒各组分选用信息如表6所示。
表6 试剂盒组分选用信息
表6组分中，rTaq DNA聚合酶的酶活力单位浓度为5U/uL，Taq DNA连接酶的酶活力单位浓度为4000U/uL，两者均具有良好的耐热性能，T7核酸内切酶I的酶活力单位浓度为10000U/mL。
（2）杂合样本制备和基因组DNA提取
采用本发明扩增引物，参照文献（肖莉 ,EGFR基因缺失突变检测新技术及其应用于游离DNA检测的可行性 .苏州大学博士学位论文，2014；赵静，非小细胞肺癌EGFR基因突变检测试剂盒的开发.北京协和医学院博士学位论文，2011）中的方法构建含有EGFR基因第18-21四个外显子野生型和其上常见的29种突变型的E.coli DH5α工程菌细胞系，通过TA克隆、蓝白斑筛选和测序鉴定获取转入目的片段的阳性E.coli DH5α克隆子。然后用LB液体培养基培养阳性克隆子，按照EGFR基因第18-21四个外显子野生型菌等比例混合得到总的野生型菌（下面简称野生型菌），按总的野生型菌：突变型菌浓度比为100：1混合即得到了含有1%突变细胞比例的杂合体样本。本实施例选择的是EGFR20即第20号外显子的T790M(6240)这一突变类型的混合菌样本，共三组平行。采用TaKaRa公司的MiniBEST Bacteria GenomicDNA Extraction Kit Ver.3.0提取样本的基因组DNA，共得到50uL。各样本基因组DNA的电泳未出现降解且亮度很好，证明提取效果良好；经测定提取量为1-2ug，A260/A280均位于1.8-2.0之间，符合扩增所需的量和纯度。
（3）EGFR基因特定片段扩增
对于每个样本，采用本发明试剂盒分别配制上述的5管扩增体系，各管体系使用的扩增引物和连接引物组参照表3，其余组分均相同如表7所示：
表7 EGFR基因外显子扩增体系（25uL）
同时配制对应的5管不含连接引物、耐热DNA连接酶缓冲液和耐热DNA连接酶这三种组分的对照扩增体系，扩增引物参照表3，体系配制参照表7，所缺组分添加量由灭菌去离子水替补。
对于每个样本，共5管正常体系（含连接酶体系）和5管对照体系（不含连接酶体系）在基因扩增仪上进行EGFR基因片段的扩增，扩增条件均为：95℃预变性5min；94℃变性10s，50℃退火30s，72℃延伸1min，循环32次；72℃终延伸10min。
（4）扩增产物的电泳分析
所有的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在0.5ug/ml 的EB 溶液中染色20min并用清水脱色后置于凝胶成像系统上拍照和分析。电泳图谱如图2所示，左右1-5泳道分别为对照体系和正常体系的1-5管的扩增产物。以北京天根公司的D2000 DNA Marker条带为标准（普通条带浓度约为10ng/uL），EGFR20的T790M突变的对照体系均可以成功扩增出目的基因片段，其亮度肉眼显见与DNA Marker的一般条带相近即其目的扩增产物浓度明显高于5ng/uL；而正常体系中只有第3管的扩增产物条带明亮，肉眼显见与DNA Marker的一般条带相近即其目的扩增产物浓度明显高于5ng/uL，而其余4管的扩增产物条带肉眼显见非常微弱（浓度明显远低于5ng/uL）。三组平行结果一样，因此均选取正常体系的第3管和对照体系的第3管备用。
（5）DNA片段杂交样品的制备
将（4）中选取的正常体系和对照体系的扩增产物，按照10uL正常体系扩增产物、5uL对照体系扩增产物、2uL 10×PCR缓冲液和3 uL去离子水共20 uL添加到PCR管中。将PCR 反应管置于PCR仪中 98℃孵育5min，之后停止加热并在PCR 仪中放置30min使之缓慢冷却，即制得DNA片段杂交样品。
（6）DNA片段杂交样品的酶切分析
取8uL步骤（5）中的DNA片段杂交样品到新的无菌PCR管中，加入0.25uL T7核酸内切酶I和1uL 10×T7核酸内切酶I缓冲液，用水补足10uL；将PCR管放入PCR仪中进行酶切操作，程序为：37℃保温60min进行酶切反应，80℃保温10min灭酶，即得到了酶切产物。将10uL酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，同时也包括酶切前样品即DNA片段杂交样品，电泳结果如图3所示。酶切产物一共得到了三条条带，标记为1的条带同DNA片段杂家样品条带一致，应该是样品未完全酶切导致的；条带2和3是新产生的，参照DNA Marker，条带3的片段大小符合100bp，条带2的片段大小符合350bp，即带型符合EGFR20的T790M(6240)突变的理论酶切带型。其余两组平行的结果也一样。
（7）样品EGFR突变结果判定
以DNA Marker条带为标准，在对照体系正常扩增的情况下，鉴于第3管即EGFR20的T790M(6240)突变检测体系出现明显扩增产物，且由其和对应对照体系制备的DNA片段杂交样品经T7核酸内切酶I酶切，酶切产物的带型同T790M(6240)突变的理论酶切带型一致，因此判定所检测样品含有EGFR20的T790M(6240)突变。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建医科大学
<120> 基于酶切灵敏检测人类EGFR基因突变的方法及试剂盒
<160> 17
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgtctggca ctgctttcca 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tctcacagga ccactgatta c 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aatatcagcc ttaggtgcg 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccagtaattg cctgtttcc 19
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgcgtcttc acctggaa 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gggacaggca ctgatttg 18
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atacgagcac ctctggact 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tccttacttt gcctccttc 19
<210> 9
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gctccggtgc gttcggcacg cagcactgac ccttttggaa gcactgaccc ttttggaagc 60
actgaccctt ttggagaatt caaaaagatc aaagtgctgg 100
<210> 10
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gggggtccat ggctctgaac ctccagcact gacccttttg gaagcactga cccttttgga 60
agcactgacc cttttggacc cgtcgctatc aaggaattaa ga 102
<210> 11
<211> 91
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ccagcgtgga caacccccag cactgaccct tttggaagca ctgacccttt tggaagcact 60
gacccttttg gacaggaagc ctacgtgatg g 91
<210> 12
<211> 91
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cgtggacaac ccccacgcag cactgaccct tttggaagca ctgacccttt tggaagcact 60
gacccttttg gaaagcctac gtgatggcca g 91
<210> 13
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gcagctcatg cccttcgcag cactgaccct tttggaagca ctgacccttt tggaagcact 60
gacccttttg gacaccgtgc agctcatcac 90
<210> 14
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ccacgtgtgc cgcctgcagc actgaccctt ttggaagcac tgaccctttt ggaagcactg 60
acccttttgg agccagcgtg gacaaccc 88
<210> 15
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ggacaacccc cacgtgtcag cactgaccct tttggaagca ctgacccttt tggaagcact 60
gacccttttg gactacgtga tggccagcgt 90
<210> 16
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ggccaaactg ctgggtgcag cactgaccct tttggaagca ctgacccttt tggaagcact 60
gacccttttg gagtcaagat cacagatttt gggct 95
<210> 17
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gctgggtgcg gaagagacag cactgaccct tttggaagca ctgacccttt tggaagcact 60
gacccttttg gaagattttg ggctggccaa act 93

Claims (2)

1.基于酶切检测人类 EGFR 基因突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括10×PCR缓冲液、10×耐热 DNA 连接酶缓冲液、dNTPs、8条扩增引物、9 条连接引物、耐热 DNA 连接酶、DNA 聚合酶、10×错配切除酶缓冲液和错配切除酶 ；所述8 条扩增引物其序列如SEQ.ID NO.1-SEQ.ID NO.8所示，其中SEQ.ID NO.1和SEQ.ID NO.2、SEQ.ID NO.3 和SEQ.ID NO.4、SEQ.ID NO.5 和 SEQ.ID NO.6、SEQ.ID NO.7 和SEQ.ID NO.8 分别用于靶向第18、 19、20、21 号外显子片段的扩增；所述 9 条连接引物其核苷酸序列如 SEQ.ID NO.9-SEQ.ID NO.17 所示，所述连接引物其5’端第一个核苷酸均进行磷酸化修饰，其中SEQ.IDNO.9 靶向 第18号外显子的3 种突变位点，SEQ.ID NO.10 靶向第19号外显子的19种突变位点，SEQ. ID NO.11-SEQ.ID NO.15 靶向第20号外显子的5种突变位点，SEQ.ID NO.16-SEQ.ID NO.17 靶向第21号外显子的2 种突变位点；
所述错配切除酶为T7核酸内切酶I或芹菜Cel I 酶，酶活单位不低于500 单位/mL。
2.根据权利要求 1 所述的基于酶切检测人类EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于：所述 10×PCR 缓冲液是由 100mmol/L Tris-HCl、500mmol/L KCl 和 15mmol/L MgCl2组成，pH=8.3 ；所述10×耐热DNA连接酶缓冲液的配制为 ：20 mM Tris-HCl、25 mM 乙酸钾、10 mM 乙酸镁、1 mM 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD、10 mM 二硫苏糖醇DTT、0.1% Triton X-100，pH=7.6 ；所述 dNTPs 是由 dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP 各 2.5mmol/L 混合而成的；所述扩增引 物的浓度均为10umol/L；所述连接引物的浓度均为10umol/L；所述耐热 DNA 连接酶的酶活力单位浓度不低于4000U/uL，在正常体系下 95℃保温 1h 酶活力不低于原酶活的 60% ；所述DNA聚合酶的酶活力单位浓度为5U/uL，具有耐热性能。
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