CN104694622A - 检测K-ras基因突变的探针、引物、试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种检测K-ras基因突变的探针，该探针是与K-ras基因第13位密码子的突变型序列特异性结合的Taqman MGB荧光探针。本发明还公开了一种检测K-ras基因突变的引物及试剂盒，该试剂盒包括：与K-ras基因第13位密码子的突变型序列特异性结合的Taqman MGB荧光探针；用于扩增包含K-ras基因第13位密码子的核苷酸序列的引物对；针对野生型K-ras基因第13位密码子GGC设计的PNA。本发明还公开了一种K-ras基因突变的双荧光标记探针实时定量检测方法。本发明的试剂盒和检测方法，能同时定性和定量检测K-ras基因第13位密码子的突变，且灵敏度高、操作简便，具有广阔的应用前景。

Description

检测K-ras基因突变的探针、引物、试剂盒及方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，应用于生物科学研究和临床分子诊断，具体涉及一种检测K-ras基因第13位密码子突变的探针、引物、试剂盒及方法。
背景技术
K-ras基因(GenBank:NC_000012)突变在多种癌症中都有表达，如胰腺癌、结肠癌、血癌、甲状腺癌、胆管癌、肺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、皮肤癌、精原细胞癌等，其中，K-ras基因突变尤其在胰腺癌及结肠癌的发生发展中起重要作用。已有文献报道，在胰腺癌组织、胰液或粪便、血液中、结肠癌组织中可检测出K-ras基因第12、13或61密码子点突变。研究表明，检测体细胞DNA中K-ras基因突变与否，可作为胰腺癌早期诊断的一种方法。95％的胰腺癌患者组织中存在K-ras基因突变，被认为是胰腺癌的早期事件，在一些实验中发现慢性胰腺炎、胆道结石及表面健康正常人等人群中也存在K-ras基因突变，通过单纯的定性分析，敏感性较差，无法区分疾病人群，定量分析能更好反映突变程度，以便于良恶性鉴别。目前临床应用较多的K-ras基因突变检测方法为限制性片断长度多态性分析法(RFLP法)、扩增受阻突变体系法(ARMS法)和高分辨率熔解曲线法(HRM)。
RFLP法：原理是将PCR与限制性酶切相结合的方法。第一步PCR引物(K1-上游:5′-CTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGACCT-3′与K2-下游:5′-TCAAAGAATGGTCCTGGACC-3′)通过单一碱基错配，在K-ras基因第12密码子上游引入BstNI酶切位点，第一步PCR反应中野生型与突变型基因同比扩增，之后内切酶BstNI破坏了野生型片断，在第二步PCR时主要就只能扩增突变型基因片断，使突变型基因片断“信号放大”，从而提高了检测基因突变的敏感性。该方法的缺点是：1.步骤烦琐,耗时费力，需要2天时间才能完成鉴定；2.这种方法只能作定性研究，只能明确是否存在K-ras基因突变，无法实现定量检测；3.存在第一轮酶切不完全及开放操作导致的假阳性；4.检测灵敏度有限，无法实现较低含量的检测(参见文献Watanabe H,et al.Detection of K-ras point mutations at codon 12in pure pancreatic juice for thediagnosis of pancreatic cancer by PCR-RFLP analysis,Pancreas 1996；12:18－24)。
ARMS法：原理是根据3′端错配原则，在进行扩增反应时,若3′端碱基对形成错配，链延伸反应就会因3′，5′二磷酸二酯键形成的障碍而受阻，因此，只有模板链是特定的等位基因时，才会检测出特异的扩增产物。在ARMS的反应体系中，引物上标记2个不同荧光素，或加入荧光探针等方法都是以实时荧光PCR为基础的基因分型方法。该方法的缺点是：1.每种特异性引物或探针只能针对某一种基因突变类型进行鉴定，而K-ras基因在第12、13密码子的突变类型可有十余种，需要逐一检测；2.可能出现由于单一碱基错配造成的假阳性；3.无法避免引物错配导致的假阳性结果出现(参见文献Fox JC,et al.The detection of K-rasmutations in colorectal cancer using the amplification-refractory mutation system,Br J Cancer 1998；77:1267-74)。
HRM法：本原理是根据不同核酸分子的GC含量、GC分布及碱基互补性差异，双链DNA分子在加热变性时会有自己熔解曲线的形状和位置，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度高，依据高性能荧光染料释放荧光信号，进而实现达到对单个碱基差异的区分。在SNP的检测中，SNP位点由于不匹配双链DNA在升温过程中会先解开，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不同SNP位点、杂合子与否等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM分析能够有效区分不同SNP位点与不同基因型。HRM检测不受突变碱基位点和种类的局限，可以对未知突变、已知突变进行筛查、扫描，亦可用于短片段重复序列的分析。该方法缺点是必须依赖高精度PCR仪(LightCycler 480和Rotor-Gene 6000)和饱和性染料(LC Green、Eva Green等)，同时其检测灵敏度为3％，无法检出更低量的突变，使其应用受到限制(Soulieres D,Greer W,Magliocco A M,Huntsman D,YoungS,Tsao M S,et al.KRAS mutation testing in the treatment of metastatic colorectalcancer with anti-EGFR therapies[J].Curr Oncol,2010,17Suppl 1:S31-S40)。
肽核酸(PNA)是一类人工合成的、结构上类似于DNA及RNA的核酸类似物，呈电中性，其骨架由2-氨乙基甘氨酸取代了DNA的磷酸二酯糖，能侵入DNA双链形成稳定的PNA-DNA双螺旋而不发生静电排斥，因此可以用来抑制野生型K-ras基因的扩增反应。其较之传统DNA探针具有不少优点：1.PNA-DNA结合十分稳定，正确配对的DNA/PNA的稳定性远远高于相应的DNA/DNA，同时在PCR反应过程中PNA亦不会被其他酶所降解。2.对于错配的PNA/DNA，一个碱基的错配能造成其融解温度下降9-10℃左右。目前，肽核酸作为一种分子生物学工具已在疾病的诊断、治疗等领域得到应用(参见文献：张兵波等，PNA探针与DNA探针的系统比较A Systemic Comparison between PNA Probe and DNA Probe，《高分子通报》2006；9：62-68；Egholm M，et al.PNA hybridizes to complementary oligonucleotides obeying theWatson-Crick hydrogen-bonding rules，Nature,1993,365:566～568)。
发明内容
本发明要解决目前检测K-ras基因突变的方法存在不能同时定性和定量、操作繁琐、灵敏度低的技术问题，提供一种检测K-ras基因第13位密码子突变的探针、引物、试剂盒及方法，该方法通过一次PCR反应就能确定K-ras基因第13位密码子突变类型和突变量，且操作简便、灵敏度高。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
在本发明的一个方面，提供了一种检测K-ras基因突变的探针，该探针是与K-ras基因第13位密码子的突变型序列特异性结合的Taqman MGB荧光探针，所述K-ras基因第13位密码子的突变型选自：AGC、CGC、TGC、GAC、GCC、GTC。
Taqman探针只与模板特异性结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5’端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等，3’端标记有淬灭基团(Quencher,Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到模板结合的探针，其3’→5’外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。
Taqman MGB荧光探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB(Minor Groove Binder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高10℃左右。因此，为了获得同样的Tm值，Taqman MGB探针可以比普通的Taqman探针设计得更短。
优选的，本发明探针包括SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示序列的探针，其中，SEQ ID NO:2探针是和K-ras基因第13位密码子AGC、CGC、TGC三种突变类型(即13密码子第1个碱基突变)特异性结合的兼并探针，SEQ ID NO:3探针是和K-ras基因第13位密码子GAC、GCC、GTC三种突变类型(即13密码子第2个碱基突变)特异性结合的兼并探针，该SEQ ID NO:2探针上标记的荧光与SEQ ID NO:3探针上标记的荧光不同，在本发明的一个实施例中，SEQ IDNO:2探针两端分别标记报告基团FAM及淬灭基团MGB，SEQ ID NO:3探针两端分别标记报告基团VIC及淬灭基团MGB。
在本发明的另一方面，还提供了一种检测K-ras基因突变的引物，所述引物用于扩增包含K-ras基因第13位密码子的核苷酸序列，该引物包括SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示序列的引物对。
在本发明的另一方面，还提供了一种检测K-ras基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括：
与K-ras基因第13位密码子突变型序列特异性结合的Taqman MGB荧光探针，所述K-ras基因第13位密码子的突变型选自：AGC、CGC、TGC、GAC、GCC、GTC；
用于扩增包含K-ras基因第13位密码子的核苷酸序列的引物对；
针对野生型K-ras基因第13位密码子GGC设计的PNA。
优选的，所述试剂盒包括：
SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示序列的探针；
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示序列的引物对；
SEQ ID NO:1所示序列的PNA。
优选的，所述试剂盒还包括：K-ras基因第13位密码子的野生型和突变型标准品。
在本发明的另一方面，还提供了一种检测K-ras基因突变的方法，包括以下步骤：
针对野生型的K-ras基因第13位密码子GGC设计PNA；
针对K-ras基因第13位密码子的AGC、CGC、TGC、GAC、GCC、GTC六种突变型设计TaqmanMGB荧光探针，并设计一对引物，该引物用于扩增包含K-ras基因第13位密码子的核苷酸序列；
利用所述PNA、Taqman MGB荧光探针、以及引物，对已知突变量的质粒标准品进行实时定量PCR检测，根据检测结果制出标准曲线；
对待测样本DNA进行实时定量PCR检测，根据标准曲线，以及Taqman MGB探针荧光的类别，判别K-ras基因第13位密码子的突变量和突变类型。
优选的，所述PNA如SEQ ID NO:1所示，所述Taqman MGB荧光探针包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示序列的探针，所述引物包括SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示序列的引物对。
在本发明的另一方面，还提供了一种上述试剂盒在制备诊断肿瘤的产品中的应用。
本发明试剂盒可用于检测人体各种组织(如肿瘤组织)和样品(如血液、脱落细胞、痰液、尿液、胰液和粪便)中的K-ras基因突变存在情况及含量。在本发明的一个具体实施例中，以胰腺癌细胞株为待测样本，验证本发明试剂盒的检测效果。
本发明采用联合肽核酸(PNA)的双荧光标记探针实时定量PCR法检测K-ras基因第13位密码子点突变量和突变类型，该K-ras基因是从粪便、组织、组织液、细胞珠及血液中提取的DNA中的基因，含有一定量的野生型K-ras基因序列，故设计利用PNA序列钳制第13位密码子野生型的K-ras基因扩增，而使突变序列得到有效显著扩增；同时设计针对第13位密码子不同突变类型的两种兼并探针，并分别标记不同荧光，借此突变探针对扩增的突变序列数量和类型进行信号显示。在样品检测实施中，平行检测已知突变类型和突变量的质粒标准品，由此根据标准曲线和荧光类型判别出K-ras基因突变量和突变类型。因此本发明是一种操作简便、灵敏度高、特异性高的K-ras基因实时定量检测方法，可实时定量检测K-ras基因第13位密码子的突变量和突变类型。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明K-ras-M13-FAM probe探针对13密码子第1个碱基三种突变类型(AGC、TGC、CGC)和野生型(GGC)的甄别检测及特异性检测结果图；
图2是本发明K-ras-M13-VIC probe探针对13密码子第2个碱基三种突变类型(GAC、GTC、GCC)和野生型(GGC)的甄别检测及特异性检测结果图；
图3是本发明K-ras基因第13密码子第1个碱基突变的FAM型标准品(A)和第2个碱基突变的VIC标准品(B)梯度稀释扩增曲线和标准曲线图。
具体实施方式
K-ras基因突变为许多恶性肿瘤的遗传致病特征，但目前普遍应用的K-ras基因突变检测方法为限制性片断长度多态性分析法、扩增受阻突变体系法和高分辨率熔解曲线，这些方法敏感性有限，且不能同时定性和定量检测K-ras基因的突变。本发明提供了一种能同时定性和定量检测K-ras基因第13位密码子突变的探针、引物、试剂盒及方法，该方法设计针对野生型K-ras基因第13位密码子的PNA及相应的突变检测探针K-ras-M13-FAM probe探针和K-ras-M13-VIC probe探针；利用PNA钳制野生型K-ras基因第13位密码子扩增及应用突变探针进行信号显示，对已知突变量的质粒标准品进行实时定量PCR检测，得出标准曲线和荧光类型；提取、纯化待测样本DNA，测定浓度，进行实时定量PCR检测，根据标准曲线和荧光类型，判别K-ras基因第13位密码子的突变量和突变类型，该方法敏感性高、操作简便。
下面以胰腺癌细胞株作为实施例，详细阐述本发明的探针、引物、试剂盒及方法。
实施例1
1.主要试剂来源：
1.1设计PNA
PNA是针对野生型K-ras基因第12、13密码子设计的PNA，由韩国panagene公司合成，其组成为：NH2-CCTACGCCACCAGCTCC-COOH(SEQ ID NO:1)。
1.2设计Taqman MGB探针
K-ras-M13-FAM probe探针和K-ras-M13-VIC probe探针由美国AppliedBiosystems公司合成，其组成分别为：
K-ras-M13-FAM probe探针：
FAM－TTGCCTACGCDACCAGCTCCAACT–MGB(SEQ ID NO:2)(注D代表A或G或T)；
K-ras-M13-VIC probe探针：
VIC－TTGCCTACGDCACCAGCTCCAACT–MGB(SEQ ID NO:3)(注D代表A或G或T)。
1.3PCR引物
PCR引物由美国AppliedBiosystems公司合成。
上游引物F：5′-CCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTC-3′(SEQ ID NO:4)；
下游引物R：5′-TTCTGAATTAGCTGTATCGTCAAGG-3′(SEQ ID NO:5)。
1.4TaqMan基因表达试剂盒(TaqMan Gene Expression Master Mix)
购买于美国Applied Biosystems公司。
1.5K-ras基因第13密码子阴性(野生型)和阳性(6种突变型)标准品
K-ras基因第13密码子野生型标准品GGC和K-ras基因第13密码子突变型标准品GAC、GCC、GTC、AGC、CGC、TGC由上海Invitrogen公司合成，合成的序列分别构建如pMD18-T载体中。采用该6种突变型密码子，是因为氨基酸主要由密码子的前2个碱基决定，第3位碱基的改变，通常不引起氨基酸的改变，即密码子第3位发生改变时，密码子的意义不变，如UUA改为UUG时，其决定的氨基酸仍是亮氨酸。因此，本发明K-ras基因第13密码子突变型标准品是对野生型密码子GGC的前2个碱基进行突变的6种突变型密码子，其基因序列组成分别如下：
1.5.1GGC野生型：
ATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAA(SEQ ID NO:6)；
1.5.2GAC突变型：
ATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGACGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAA(SEQ ID NO:7)；
1.5.3GCC突变型：
ATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGCCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAA(SEQ ID NO:8)；
1.5.4GTC突变型：
ATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGTCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAA(SEQ ID NO:9)；
1.5.5AGC突变型：
ATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTAGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAA(SEQ ID NO:10)；
1.5.6CGC突变型：
ATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTCGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAA(SEQ ID NO:11)；
1.5.7TGC突变型：
ATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTTGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAA(SEQ ID NO:12)。
将模板倍比稀释为106、105、104、103、102、101、0拷贝，作为标准品模板。
2.TaqMan MGB探针实时定量实验
该方法选用针对K-ras基因靶序列的特异性Taqman MGB探针。K-ras-M13-FAM probe探针两端分别以报告基团FAM及淬灭基团MGB标记，其特异性和K-ras基因13密码子AGC、CGC、TGC三种突变类型相结合；K-ras-M13-VIC probe探针两端分别以报告基团VIC及淬灭基团MGB标记，其特异性和K-ras基因13密码子GAC、GCC、GTC三种突变类型相结合。同样地，实验中PNA能将野生型基因钳制而抑制PCR反应的进行，但对突变基因无作用，因而仪器所检测的荧光量仅反应突变基因的拷贝量。该方法特异性高，由于不受引物二聚体影响，定量将更加准确。
2.1反应体系及反应条件
仪器选用ABI公司的7500型实时定量PCR仪。
反应体系包括：TaqMan Gene Expression Master Mix 7.5μl，引物F、R(序列如上述1.3)1.5μl(10pmol/μl)，PNA2.5μl(2.5pmol/μl)，MGB探针(序列如上述1.2)各1μl(10pmol/μl)，DNA标准品模板为2×105、2×104、2×103、2×102、100、50拷贝和阴性(野生型质粒2×105拷贝)1.5μl，用无菌双蒸水定容至15μl。
PCR反应条件:95℃预变性10m，之后95℃变性10s，70℃PNA结合10s，55℃退火5s，72℃延伸30s，共50个循环。
2.2根据对阳性和阴性标准品的检测评价该检测方法的特异性
根据对PCR标准品的阳性和阴性标准品检验，评价K-ras-M13-FAM probe探针和K-ras-M13-VIC probe探针的特异性(见图1、图2)。如图1所示，K-ras-M13-FAM probe探针能够检测出AGC、CGC、TGC三种K-ras基因13密码子突变而无法检测出GAC、GCC、GTC其他三种K-ras基因13密码子突变类型。如图2所示，K-ras-M13-VIC probe探针能够检测出GAC、GCC、GTC三种K-ras基因13密码子突变而无法检测出AGC、CGC、TGC其他三种K-ras基因13密码子突变类型。由此可见K-ras-M13-FAM probe探针和K-ras-M13-VIC probe具有较高的特异性和敏感性。
2.3K-ras基因突变类型的判定方法
根据实时定量PCR反应结束后，可由待测样本发出荧光的不同来判断K-ras基因突变类型。检测不到有效荧光信号的为野生型K-ras基因；检测到FAM荧光的K-ras基因突变为AGC、CGC、TGC类型；检测到VIC荧光的K-ras基因突变为GAC、GCC、GTC类型。根据实验中收集到的荧光类别，可分辨K-ras基因的突变类型。
2.4K-ras基因定量方法
将含有K-ras基因第13位密码子AGC、CGC、TGC三种突变类型(即13密码子第1个碱基突变)的质粒标准品定义为FAM型标准品，同时将含有K-ras基因第13位密码子GAC、GCC、GTC三种突变类型(即13密码子第2个碱基突变)的质粒标准品定义为VIC型标准品。在同一反应管中或不同反应管中，将FAM型标准品和VIC型标准品梯度分别稀释为2×105、2×104、2×103、2×102、100、50拷贝和阴性(野生型质粒2×105拷贝)1.5μl作为模板，分别进行PCR检测。反应结束后，利用两组标准品分别制作标准曲线，如图3A为FAM型标准品曲线和图3B为VIC型标准品曲线，对待检样本进行定量分析，可实时定量检测K-ras基因13密码子突变量。图3A所示的标准曲线中，横坐标为：拷贝数的对数值；纵坐标为：Ct值；Slope：-3.36；Intercept：42.71；EFF％：98.52；R2：0.991。图3B所示的标准曲线中，横坐标为：拷贝数的对数值；纵坐标为：Ct值；Slope：-3.30；Intercept：43.61；EFF％：100.87；R2：0.987。
3.选取胰腺癌细胞株SW1990(既往测序证实为K-ras基因13密码子突变)和BxPc(既往测序证实为K-ras基因13密码子野生型)进行K-ras基因突变检测
3.1基因组DNA抽提：分别取1×105的SW1990和BxPc细胞，用PBS洗3遍后，离心取成沉淀，选用市售的Qiangen公司基因组DNA抽提试剂盒，按说明书进行基因组DNA抽提，用100ulTE溶解DNA，分装于-80℃保存。
3.3DNA浓度测定
应用Nano Drop ND-1000全波长紫外/可见光扫描分光光度计测出浓度，调整DNA浓度为25ng/ul。
3.4样本进行K-ras基因的PNA钳制定量PCR法检测
按照2.1、2.3和2.4的方法，对SW1990和BxPc细胞DNA样品进行6次重复检测，依据荧光信号判断突变类型，同时参照标准曲线，计算突变拷贝数。
4.结果分析
经过检测及数据转换，SW1990为K-ras基因13密码子突变，突变量为50％±10％；同时检测到BxPc为野生型。进一步证实对于K-ras基因13密码子突变的双荧光标记探针实时定量检测的方法在现实实际中有可操作性，同时具有科学性。本实施例仅以胰腺癌细胞株为检测样本，对本发明的技术方案进行了验证，但是根据本发明的公开，也可以对人体各种组织(如肿瘤组织)和样品(如血液、脱落细胞、痰液、尿液、胰液和粪便)中的K-ras基因突变存在情况及含量同时检测。

Claims (10)

1.一种检测K-ras基因突变的探针，其特征在于，所述探针是与K-ras基因第13位密码子的突变型序列特异性结合的Taqman MGB荧光探针，所述K-ras基因第13位密码子的突变型选自：AGC、CGC、TGC、GAC、GCC、GTC。
2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述探针包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示序列的探针。
3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述SEQ ID NO:2探针上标记的荧光与SEQID NO:3探针上标记的荧光不同。
4.一种检测K-ras基因突变的引物，其特征在于，所述引物用于扩增包含K-ras基因第13位密码子的核苷酸序列，该引物包括SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示序列的引物对。
5.一种检测K-ras基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
与K-ras基因第13位密码子的突变型序列特异性结合的Taqman MGB荧光探针，所述K-ras基因第13位密码子的突变型选自：AGC、CGC、TGC、GAC、GCC、GTC；
用于扩增包含K-ras基因第13位密码子的核苷酸序列的引物对；
针对野生型K-ras基因第13位密码子GGC设计的PNA。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示序列的探针；
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示序列的引物对；
SEQ ID NO:1所示序列的PNA。
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：K-ras基因第13位密码子的野生型和突变型标准品。
8.一种检测K-ras基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
针对野生型的K-ras基因第13位密码子GGC设计PNA；
针对K-ras基因第13位密码子的AGC、CGC、TGC、GAC、GCC、GTC六种突变型设计TaqmanMGB荧光探针，并设计一对引物，该引物用于扩增包含K-ras基因第13位密码子的核苷酸序列；
利用所述PNA、Taqman MGB荧光探针、以及引物，对已知突变量的质粒标准品进行实时定量PCR检测，根据检测结果制出标准曲线；
对待测样本DNA进行实时定量PCR检测，根据标准曲线，以及Taqman MGB探针荧光的类别，判别K-ras基因第13位密码子的突变量和突变类型。
9.根据权利要求8所述的检测K-ras基因突变的方法，其特征在于，所述PNA如SEQ IDNO:1所示，所述Taqman MGB荧光探针包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示序列的探针，所述引物包括SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示序列的引物对。
10.权利要求5所述检测K-ras基因突变的试剂盒在制备诊断肿瘤的产品中的应用。
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