CN104830852B - 一种检测hla‑b*15:02等位基因的多重实时荧光pcr方法 - Google Patents
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Abstract
本发明在使用TaqMan探针检测法的基础上，设计了两对高特异性扩增HLA‑B*15：02等位基因的引物探针组合。在此基础之上，使用内参基因β‑Actin的引物及探针，将两对目的基因特异性引物、探针与内参基因引物、探针加入同一管中进行多重荧光PCR反应，通过荧光扩增曲线分析结果。本发明具有特异性高、灵活快速、高通量、无污染、分辨率高、可实时监测反应进程等特点，可适用于人体外周血、唾液中全基因组DNA样本的HLA‑B*15:02等位基因的检测。
Description
技术领域
本发明属于药物基因诊断领域，具体涉及一种检测HLA-B*15:02等位基因的方法及其引物以及探针设计。
背景技术
HLA是指人类白细胞抗原，由人类第6号染色体短臂一群密切连锁的复等位基因编码，包括100多个基因座位，现已发现9000多个等位基因，全长3600kb，是当前已知的人类染色体中基因密度最高，也是多态性最为丰富的区域。世界卫生组织HLA因子命名委员会命名的HLA等位基因已达到5000多个；鉴于HLA系统的高度多态性和复杂性，决定了HLA等位基因的检测方法不同于普通多态性位点的检测。
卡马西平为三环类抗惊厥药，被广泛用于治疗癫痫、三叉神经、躁狂抑郁症等疾病；由于这些药被广泛用于相应的病症治疗中，其不良反应也日益凸显。研究表明，人类白细胞抗原B家族的HLA-B*15:02基因和卡马西平(carbamazepine CBZ)药物所诱发的Stevens Johnson综合征(SJS)有很强的相关性。卡马西平所致的SJS患者中HLA位点等位基因的出现频率增加，特别是HLA-B*15:02，几乎存在于100％卡马西平导致的SJS患者体内，而在普通人群中只有8.6％的检出率。美国食品药品监督管理局(FDA)将HLA-B*15:02列为卡马西平诱导SJS-TEN的基因关联生物标记物，并告诫HLA-B*15:02等位基因阳性患者服用卡马西平可能发生严重和潜在致命的皮肤不良反应，并推荐亚裔血统患者开始使用卡马西平前，需进行HLA-B*15:02等位基因的检测。
目前常用HLA基因型检测方法主要有PCR-SSP(序列特异性引导的聚合酶链式反应)、PCR-SBT(基于测序分型的聚合酶链式反应)和RT-PCR(荧光定量PCR反应)等检测方法。其中PCR-SSP技术则需要进行凝胶电泳实验，因此该技术在操作过程中易造成二次污染、时间长，同时在PCR过程中多对引物易造成二聚体等非目的基因产物，从而易造成假阳性结果。PCR-SBT方法是对于HLA基因进行测序，从而确定具体HLA基因型，但其检测的操作繁琐，耗时长，成本高昂，而且测序结果会出现套峰，不适合对于临床样本的快速指导。而RT-PCR(荧光定量PCR反应)以高通量、快速简便，无污染，可实时监测反应进程等优点已经成为HLA-B*15:02检测的主要手段。目前虽有基于RT-PCR方法的检测HLA-B*15:02的试剂盒，但试剂盒涵盖的基因型较少，操作繁琐，要多管反应，容易出现假阳性和污染，远远不能满足快速、简便、高特异性检测HLA-B*15:02基因的需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种高通量、特异性好，快速简便的检测HLA-B*15:02基因型方法，有利于在HLA-B*15:02等位基因分型基础上指导卡马西平的安全用药。
本发明提供的定性HLA-B*15:02基因的TaqMan探针检测方法，首先通过与HLA-B其它同源性等位基因序列对比。根据序列比对结果，发现HLA-B*15:02与多个HLA-B等位基因具有很高的同源性，尤其是HLA-B*15等位基因，而这些特异性的位点分布在多个外显子和内含子区域中。因此，为了保证HLA-B*15:02检测方法的特异性，至少需要设计两对特异性引物和探针，其中第一对特异性引物(上游引物为ARMS引物)和探针分布在外显子2和内含子2区域中，扩增的DNA片段长度为132bp，第二对特异性引物(下游引物为ARMS引物)和探针分布在外显子5和内含子5区域中，扩增的DNA片段长度为125bp；本发明结合等位基因阻滞突变系统(ARMS)的方法，设计TaqMan探针检测的特异性引物以及探针，值得注意的是探针和引物设计的位置基本能够排除其它HLA-B等位基因的结合、识别。采用三重通道荧光检测法将两对特异性引物与探针以及内参基因的引物与探针加入同一反应管中，在荧光PCR仪上扩增DNA片段，通过扩增曲线分析结果，来判断未知样本是否携带HLA-B*15:02等位基因。
为实现以上发明目的，本发明所提供的检测人类白细胞抗原HLA-B*15:02基因型的技术方案如下：
第一条上游引物Fp1:5’-GACCGGACCACACAGATCCC-3’
第一条下游引物Rp1:5’-ATGGGGAGTCGTGACCTG-3’
第一条探针probe1：5’-HEX-ACCTGCGCGGCTACTACAACC-BHQ2-3’；
第二条上游引物Fp2：5’-TGATGTGTAGGAGGAAGAGC-3’
第二条下游引物Rp2:5’-AACCATCAAGGCGATACATGTG-3’
第二条探针probe2：5’-Cy5-TGTGAGGATGCTTCCCA-BHQ2-3’
其中，HEX为6-carboxy-hexachlorofluorescein；Cy5为Cyanine5；BHQ2为BlackHole Quencher-2。
该检测方法主要包括以下环节：
(1)针对HLA-B*15:02等位基因设计特异性引物和探针，按照权利要求1所述的引物探针组合；并设计内参基因的引物和探针；
(2)获得抽提的待测样本基因组DNA；
(3)在同一个反应体系中，将待测样本基因组DNA与所述引物探针组合以及内参基因的引物和探针按照确定比例混合；
(4)通过Applied Biosystem 7500或者LightCycler System480进行实时定量荧光PCR检测，其中分别利用FAM、HEX/VIC和Cy5荧光通道进行多通道荧光采集；
(5)分析判断待测样本是否携带HLA-B*15:02等位基因。
基于上述方案，本发明还进一步作如下优化设计：
环节(1)中设计内参基因β-actin引物和探针为：
上游引物Actin-F:5’-CAGCAGATGTGGATCAGCAAG-3’
下游引物Actin-R:5’-GCATTTGCGGTGGACGAT-3’
探针probe:5’-FAM-AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC–BHQ2-3’
其中，FAM为6-carboxyfluorescein。
使用Premix Ex Taq试剂盒(TaKaRa)进行扩增，所述反应体系以20μL计，则包括：10μL Premix Ex Taq(2×)，HLA-B*15:02特异性第一条上游引物Fp1:50nM，第一条下游引物Rp1:50nM，第一条特异性探针probe1:50nM，第二条上游引物Fp2:100nM，第二条下游引物Rp2:100nM，第二条特异性探针probe2:50nM以及β-Actin基因特异性上游引物Fp:50nM，下游引物Rp:50nM，探针probe:50nM；然后加入待测样本基因组DNA约10ng，补充PCR等级的水至终体积20μL；扩增程序为：95℃预变性30s；95℃5s～10sec，60℃34s～40sec，共计35～40个循环。
目的基因和内参基因的特异性引物和探针在荧光PCR仪上加入同一管中进行扩增，但是用三个通道进行荧光的采集；内参基因作为质控，必须出现荧光扩增曲线；在内参基因观察到扩增曲线的前提下，特异性探针必须同时扩增到曲线，则判定待测样本携带HLA-B*15:02等位基因。
本发明的优点主要有：
1、简便快速、高通量、无污染，安全性
基于实时荧光PCR实验设计及反应特点，本发明将引物、dNTPs、PCR缓冲液和TaqMan探针预先混合，可大大节省实验操作时间和工作量。并且，发明将目的基因与内参基因的引物和探针在一管反应中进行，整个实验及分析在一个半小时内就可全部结束。可直接根据荧光扩增曲线来确定分型结果，不涉及任何对人体有毒害作用的化学试剂。
本发明方法可一次进行96例或者384例样本的高通量检测，适用于临床分子诊断。同时，本实验方法较传统HLA基因分型方法，未涉及多重扩增，反复开盖，实验闭管操作，避免反应产物二次污染。
2、特异性、灵敏度高、检测结果可靠
由于采取高特异性的引物和探针的双保险设计，灵敏度和特异性均有很大的提供；本发明中，只需10ng-20ng基因组DNA便可进行准确的HLA-B*15:02等位基因分型检测，相比传统的PCR-SSP技术，大大提高了检测的灵敏度。其中，最低检测样本量只需要0.1ng基因组DNA就能准确得到HLA-B*15:02的检测结果。本发明样本结果通过PCR-SBT进行验证，一致率达到100％，保证了检测结果的可靠性。
3、成本低、经济适用
由于本发明具有高通量的特点，相比于传统HLA检测方法，每个反应管的成本低，只需消耗少量仅需少量检材即可完成实验检测所需。同时，本发明可用于检测人类全血、组织等全基因组DNA样本，覆盖范围广，适用于临床样本筛选。
附图说明
图1为利用FAM通道、HEX/VIC通道和Cy5通道进行三重通道荧光采集的实时定量扩增结果。
图2为利用10ng/μL的HLA-B*15:02标准阳性样本DNA系列稀释后在HEX/VIC荧光通道中的实时扩增曲线，样本系列稀释倍数分别为1:10，1:20，1:50，1:100，1:200，1:1000，其中未携带HLA-B*15:02等位基因的阴性样本及NTC在检测灵敏度反应中作为对照。
图3为利用10ng/μL的HLA-B*15:02标准阳性样本DNA系列稀释后在Cy5荧光通道中的实时扩增曲线，样本系列稀释倍数分别为1:10，1:20，1:50，1:100，1:200，1:1000，其中未携带HLA-B*15:02等位基因的阴性样本及NTC在检测灵敏度反应中作为对照。
具体实施方式
实施例 TaqMan探针法检测HLA-B*15:02等位基因
1、DNA样本的提取及稀释
按常规方法获得用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的真空采血管采集静脉血后，使用QIAamp DNA Mini Blood Kit(德国Qiagen公司)试剂盒提取DNA；将已提取的DNA使用NanoDrop 2000进行浓度测定(A260/280＝1.95～2.15)。用上述方法，分别测得200例布依族DNA样本浓度，然后使用PCR等级的H2O将样本稀释至10ng/μL。
2、设计引物和探针
在多态性位点集中的区域，利用ARMS方法设计HLA-B*15:02的特异性引物:
第一条上游引物F1：5’-GACCGGACCACACAGATCCC-3’；
第一条下游引物R1：5’-ATGGGGAGTCGTGACCTG-3’；
第一条荧光探针probe1:5’-HEX-ACCTGCGCGGCTACTACAACC–BHQ2-3’；
第二条上游引物F2：5’-TGATGTGTAGGAGGAAGAGC-3’；
第二条下游引物R2：5’-AACCATCAAGGCGATACATGTG-3’；
第二条荧光探针probe2：5’-Cy5-TGTGAGGATGCTTCCCA–BHQ2-3’；
另外在β-Actin基因上设计内参引物：
上游引物Actin-F:5’-CAGCAGATGTGGATCAGCAAG-3’；
下游引物Actin-R:5’-GCATTTGCGGTGGACGAT-3’；
荧光探针probe:5’-FAM-AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC–BHQ2-3’；
其中，FAM为6-carboxyfluorescein；Cy5为Cyanine5；HEX为6-carboxy-hexachlorofluorescein；BHQ2为Black Hole Quencher-2。
委托上海某公司合成。
3、样本检测
在荧光定量PCR仪上，将目的基因和内参基因(β-Actin)的引物、探针同时加入一个管中，分别利用FAM通道、HEX/VIC通道和CY5通道进行三通道荧光采集；
使用Premix Ex Taq试剂盒(TaKaRa)进行扩增，反应体系(20μL)包括：10μLPremix Ex Taq(2×)，HLA-B*15:02特异性第一条上游引物Fp1:50nM，第一条下游引物Rp1:50nM，第一条特异性探针probe1:50nM，第二条上游引物Fp2:100nM，第一条下游引物Rp2:100nM，第一条特异性探针probe2:50nM以及β-Actin基因特异性上游引物Fp:50nM，下游引物Rp:50nM，探针probe:50nM；然后加入待测样本基因组DNA约10ng，补充PCR等级的水至终体积20μL；用于检测HLA-B*15:02等位基因分型的扩增程序：95℃预变性30s；95℃5s；60℃34s-40s，共计35-40个循环。
4、结果分析
将目的基因和内参基因的特异性引物和探针在荧光定量PCR仪上进行一管扩增，用三个通道进行荧光的采集。内参基因作为质控，必须出现荧光扩增曲线，在内参基因观察到扩增曲线的前提下，两对特异性探针必须同时扩增到曲线，则判断待测样本携带HLA-B*15:02等位基因。本发明中，荧光扩增曲线达到阈值以上，则代表该目的片段的特异性引物及探针与DNA模板结合，并且引物能够顺利延伸，引物覆盖区域的碱基序列与模板序列一致，且探针覆盖范围内碱基与模板序列也一致，如图1。
实施例HLA-B*15:02基因型特异引物灵敏度检测
1、DNA样本的提取及稀释
按常规方法获得用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的真空采血管采集静脉血后，使用QIAamp DNA Mini Blood Kit(德国Qiagen公司)试剂盒提取DNA；将已提取的DNA使用NanoDrop 2000进行浓度测定(A260/280＝1.95～2.15)。用上述方法，分别测得200例布依族DNA样本浓度，然后使用PCR等级的H2O将样本稀释至10ng/μL。
2、设计引物和探针
在多态性位点集中的区域，利用ARMS方法设计HLA-B*15:02的特异性引物:
第一条上游引物F1：5’-GACCGGACCACACAGATCCC-3’；
第一条下游引物R1：5’-ATGGGGAGTCGTGACCTG-3’；
第一条荧光探针probe1:5’-HEX-ACCTGCGCGGCTACTACAACC–BHQ2-3’；
第二条上游引物F2：5’-TGATGTGTAGGAGGAAGAGC-3’；
第二条下游引物R2：5’-AACCATCAAGGCGATACATGTG-3’；
第二条荧光探针probe2：5’-Cy5-TGTGAGGATGCTTCCCA–BHQ2-3’；
另外在β-Actin基因上设计内参引物：
上游引物Actin-F：5’-CAGCAGATGTGGATCAGCAAG-3’；
下游引物Actin-R：5’-GCATTTGCGGTGGACGAT-3’；
荧光探针probe：5’-FAM-AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC–BHQ2-3’；
其中，FAM为6-carboxyfluorescein；Cy5为Cyanine5；HEX为6-carboxy-hexachlorofluorescein；BHQ2为Black Hole Quencher-2。
委托上海某公司合成。
3、样本检测
在荧光定量PCR仪上，将目的基因和内参基因(β-Actin)的引物、探针同时加入一个管中，分别利用FAM通道、HEX/VIC通道和CY5通道进行三通道荧光采集；
使用Premix Ex Taq试剂盒(TaKaRa)进行扩增，反应体系(20μL)包括：10μLPremix Ex Taq(2×)，HLA-B*15:02特异性第一条上游引物Fp1:50nM，第一条下游引物Rp1:50nM，第一条特异性探针probe1:50nM，第二条上游引物Fp2:100nM，第二条下游引物Rp2:100nM，第二条特异性探针probe2:50nM以及β-Actin基因特异性上游引物Fp:50nM，下游引物Rp:50nM，探针probe:50nM；然后加入待测样本基因组DNA约10ng，补充PCR等级的水至终体积20μL；用于检测HLA-B*15:02等位基因分型的扩增程序：95℃预变性30s；95℃5s；60℃34s-40s，共计35-40个循环。
4、实验结果
HLA-B*15:02标准样品DNA系列稀释后实时扩增结果见图2和图3。由这两个图可以看出，标准样品系列稀释倍数1:10，1:20，1:50，1:100，1:200，1:1000后，在HEX/VIC荧光通道中的最低检测线为0.1ng，相应的在Cy5荧光通道中的最低检测线为0.01ng。综合两者的灵敏度结果，本发明由此可检测低至0.1ng DNA左右的样本。
验证实验：100例样本进行SBT测序与HLA-B*15:02基因检测方法比较
从350例样本中随机抽取100例样本，将其送至GenDx公司进行SBT金标准测序，测序结果用Excel表格进行展示，以便对本发明实验结果进行复核。将SBT测序结果与本发明的检测方法结果进行比对(见表1)，发现两者之间的阴、阳性符合率均为100％。
表1
Claims (5)
1.用于多重荧光PCR反应高特异性扩增HLA-B*15:02等位基因的特异性引物探针组合，其特征在于，包括以下引物和探针序列：
第一条上游引物Fp1:5’-GACCGGACCACACAGATCCC-3’
第一条下游引物Rp1:5’-ATGGGGAGTCGTGACCTG-3’
第一条探针probe1：5’-HEX-ACCTGCGCGGCTACTACAACC-BHQ2-3’；
第二条上游引物Fp2：5’-TGATGTGTAGGAGGAAGAGC-3’
第二条下游引物Rp2:5’-AACCATCAAGGCGATACATGTG-3’
第二条探针probe2：5’-Cy5-TGTGAGGATGCTTCCCA-BHQ2-3’
其中，HEX为6-carboxy-hexachlorofluorescein；Cy5为Cyanine5；BHQ2为Black HoleQuencher-2。
2.一种检测HLA-B*15:02等位基因的TaqMan探针实时荧光PCR方法，用于非疾病诊断目的，主要包括以下环节：
(1)针对HLA-B*15:02等位基因的序列特点，设计特异性引物和探针，即权利要求1所述的引物探针组合；并设计内参基因的引物和探针；
(2)获得抽提的待测样本基因组DNA；
(3)在同一个反应体系中，将待测样本基因组DNA与所述引物探针组合以及内参基因的引物和探针按照确定比例混合；
(4)通过Applied Biosystem 7500或者LightCycler System480进行实时定量荧光PCR检测，其中分别利用FAM通道、HEX/VIC通道和Cy5通道进行多荧光通道信号采集；
(5)分析判断待测样本是否携带HLA-B*15:02等位基因。
3.根据权利要求2所述的检测HLA-B*15:02等位基因的TaqMan探针实时荧光PCR方法，其特征在于,设计内参基因β-Actin引物和探针为：
上游引物Actin-F:5’-CAGCAGATGTGGATCAGCAAG-3’
下游引物Actin-R:5’-GCATTTGCGGTGGACGAT-3’
探针probe:5’-FAM-AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC–BHQ2-3’
其中，FAM为6-carboxyfluorescein。
4.根据权利要求3所述的检测HLA-B*15:02等位基因的TaqMan探针实时荧光PCR方法，其特征在于：使用Premix Ex Taq试剂盒(TaKaRa)进行扩增，所述反应体系以20μL计，则包括：10μL Premix Ex Taq(2×)，HLA-B*15:02特异性第一条上游引物Fp1:50nM，第一条下游引物Rp1:50nM，第一条特异性探针probe1:50nM，第二条上游引物Fp2:100nM，第二条下游引物Rp2:100nM，第二条特异性探针probe2:50nM以及β-Actin基因特异性上游引物Fp:50nM，下游引物Rp:50nM，探针probe:50nM；然后加入待测样本基因组DNA约10ng，补充PCR等级的水至终体积20μL；扩增程序为：95℃预变性30s；95℃5s～10sec，60℃34s～40sec，共计35～40个循环。
5.根据权利要求4所述的检测HLA-B*15:02等位基因的TaqMan探针实时荧光PCR方法，其特征在于：目的基因和内参基因的特异性引物和探针在荧光PCR仪上加入同一管中进行扩增，但是用三个通道进行荧光的采集；内参基因作为质控，必须出现荧光扩增曲线；在内参基因观察到扩增曲线的前提下，特异性探针必须同时扩增出具有设定荧光值的荧光曲线，则判定待测样本携带有HLA-B*15:02等位基因。
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Denomination of invention: A multiplex real-time fluorescent PCR method for detecting HLA-B * 15:02 alleles Effective date of registration: 20210819 Granted publication date: 20180406 Pledgee: Bank of Chongqing Co.,Ltd. Xi'an Qujiang New Area sub branch Pledgor: SHAANXI LIFEGEN Co.,Ltd. Registration number: Y2021980007995 |
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