CN113151435A - 一种定性检测hla-b*1502等位基因的试剂盒及方法 - Google Patents

一种定性检测hla-b*1502等位基因的试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及检测HLA‑B*1502基因多态性的荧光PCR试剂盒和检测方法。包括检测HLA‑B*1502基因多态性的上下游引物和探针，还包括特异性检测的上下游引物和探针，以及检测内参基因的上下游引物和探针。利用本发明能够准确、灵敏、特异的从HLA‑B*1502基因多态的基因型中检测出目的基因的变异。

Description

一种定性检测HLA-B*1502等位基因的试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及分子生物学和医学领域，具体涉及HLA-B*1502等位基因检测试剂、试剂盒和检测方法。
背景技术
随着基因检测技术的成熟，药物基因组学领域得到了迅猛发展，越来越多的药物基因组生物标记物及其检测方法相继涌现。药物基因组学已成为指导临床个体化用药、评估严重药物不良反应发生风险、指导新药研发和评价新药的重要工具，部分上市的新药仅限于特定基因型的适应症患者。美国FDA已批准在140余种药物的药品标签中增加药物基因组信息，涉及的药物基因组生物标记物42个。此外，部分行业指南也将部分非FDA批准的生物标记物及其特性(如MGMT基因甲基化)的检测列入疾病的治疗指南。药物反应相关基因及其表达产物的分子检测是实施个体化药物治疗的前提。
癫痫是一种世界范围内常见的神经系统疾病，通常需要进行长期的抗癫痫治疗。在我国约有癫痫患者近千万，且以每年新增40万的速率递增。治疗癫痫的方法以药物治疗为主，其中使用较多的为芳香族抗癫痫药，该类药物因具有类似的化学结构并均携带苯环而命名。临床实践中通，芳香族抗癫痫药物常见的不良反应包括皮疹、镇静、嗜睡、头晕、共济失调、认知障碍等，且可导致严重的皮肤不良反应史蒂文斯约翰综合征SJS或中毒性表皮松解坏死TEN，其致死率高达30％～40％，避免SJS/TEN的发生是芳香族抗癫痫药物治疗过程中的重大挑战之一。近年的研究表明，由芳香族抗癫痫药物所致的严重皮肤不良反应SJS或TEN与患者HLA-B*1502等位基因存在一定的相关性。
HLA抗原是人类主要组织相容性复合体(MHC)的表达产物，在免疫系统中主要负责细胞之间的相互识别和诱导免疫反应，调节免疫应答的功能。HLA位于人类6号染色体短臂的21.31区，约含360万个碱基对，是目前已知的人类染色体中基因密度最高、多态性最丰富的区域，分为HLA-Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类基因。经典的HLA-Ⅰ类基因包括HLA-A、HLA-B和HLA-C三类，经典的Ⅱ类基因一般指DR、DP和DQ，HLA-Ⅲ类基因与前两类不同，除包含肿瘤坏死因子(Tumour Necrosis Fa ctor，TNF)基因、淋巴毒素α(lymphotoxin alpha，LTA)基因、热休克蛋白基因等具有免疫相关功能的基因外，还包括许多非免疫相关基因。其中HLA-B是人类基因组中多态性最高的基因，已有超过1800个变异型被报道，HLA-B*1502是HLA-B基因的一个基因型，其多态性与亚裔患者使用芳香族抗癫痫药物时导致严重皮肤不良反应SJS/TEN的风险具有密切相关性。根据国家卫生计生委医政医管局印发的《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南》(试行)指出携带HLA-B*1502等位基因者慎用卡马西平和苯妥英，表明携带HLA-B*1502等位基因者使用芳香族抗癫痫药物治疗时患严重皮肤不良反应SJS/TEN的风险更高。美国FDA已批准在卡马西平药品说明书中增加汉族及东南亚裔人群在服用卡马西平前进行HLA-B*1502等位基因筛查的建议，HLA-B*1502阳性的个体应慎用卡马西平，以避免出现严重的皮肤毒性反应。
由此可见，检测HLA-B*1502等位基因的多态性对减少药物不良反应、提高治疗效果有着重要意义。目前市场上国内市场上常用的上述基因检测方法主要有PCR-SSP法、PCR-SSOP法、SYBR Green I及Taqman荧光定量PCR法等。PCR-SSP(sequence specific primer)即序列特异引物引导的PCR反应，是目前被广泛采用的检测方法，其基本方法是设计一系列等位基因型特异性引物，获得相应的特异性扩增产物，并用琼脂糖凝胶电泳检测。此方法成本低，但操作复杂，不能一步获取结果，且准确度和灵敏度有待提高。无法自动获取结果，准确度也有待提高。SSOP即多聚酶链反应寡聚核苷酸探针杂交，反向杂交法操作繁琐，耗时长，需严格控制实验条件，否则会导致错配，影响结果准确性。SYBR Green是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其与DNA的结合是非特异性的，此方法虽然操作简便、快速，但缺乏特异性，准确性差。Taqman荧光定量PCR法是在反应体系中加入荧光分子，设计一对HLA-B*1502特异性引物及相应探针，通过荧光信号的按比例增加来反应DNA量的增加，从而对PCR产物进行实时检测。克服了以上不足，操作简便快速，特异性、准确性高，并可实现高通量检测。
目前，市场上还没有利用荧光PCR技术进行HLA-B*1502基因分型的检测试剂盒。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种高效、快速、特异性强，准确度高的定性检测HLA-B*1502基因性的荧光PCR试剂盒，解决现有技术中成本高、周期长、特异性不强等问题。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种高效快速定性检测HLA-B*1502基因多态性的荧光PCR试剂盒，包括PCR检测试剂，所述PCR检测试剂包括：检测HLA-B*1502的引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；以及检测HLA-B*1502的探针SEQ ID NO.3，探针核酸序列5’采用FAM、TET、VIC、HEX和ROX中的一种修饰，探针核酸序列3’采用MGB、TAMRA、BHQ1基团的一种修饰。
检测HLA-B*1502引物SEQ ID NO.1为1502上游引物F1：
SEQ ID NO.1：CGCGAGTCCGAGGATAGC
检测HLA-B*1502引物SEQ ID NO.2为1502下游引物R1：
SEQ ID NO.2：GTTGTAGTACCGCGCAGGT
检测HLA-B*1502的特异性探针SEQ ID NO.3为1502探针P1：
SEQ ID NO.3：CCGGAACACACAGATCTCC
进一步的，鉴于HLA-B*15:15/31在中国人群中高等位基因频率，需在外显子3区的280-336区域设计相关引物以排除假阳性，与此同时又可排除HLA-B*15:55/223/384特异性位点。检测HLA-B*1502的特异性引物对的上游引物SEQ ID NO.4和下游引物SEQ ID NO.5；检测HLA-B*1502的探针SEQ ID NO.6。
探针核酸序列5’采用FAM、TET、VIC、HEX和ROX中的一种修饰，探针核酸序列3’采用MGB、TAMRA、BHQ1基团的一种修饰。
检测HLA-B*1502特异性引物SEQ ID NO.4为1502上游引物F2：
SEQ ID NO.4：TGTCACATCATCAAGAGGA
检测HLA-B*1502特异性引物SEQ ID NO.5为1502下游引物R2：
SEQ ID NO.5：TGATCTGAGCCGCCGTGT
检测HLA-B*1502的特异性探针SEQ ID NO.6为1502探针P2：
SEQ ID NO.6：TCCGCGGGTATGACCAGTCCGCCTA
所述试剂盒还包括检测人HLA-B*1502等位基因的内控引物对的上游引物SEQ IDNO.7和下游引物SEQ ID NO.8及相应的荧光探针SEQ ID NO.9，序列如下：
SEQ ID NO.7：TTGTGGGCTGTAATCATCGTCTA
SEQ ID NO.8：GTTCTCTTTCACTGACATCTGCAAA
SEQ ID NO.9：CCCACACAAATCTCTCCCTGGCATTG
进一步的，检测HLA-B*1502的引物对和探针、区分HLA-B*1502特异性的引物对和探针及内控引物对和探针都加入在同一只PCR预混液中。
进一步的，所述试剂盒还包括具有抗PCR抑制剂的PCR预混液，所述预混液包括Buffer、dNTP、MgCl2、PCR增强剂等；所述试剂盒还包括Taq聚合酶。
进一步的，所述试剂盒还包括样本处理试剂用于人全血样本处理。
进一步的，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述对照为人类白细胞抗原B5801/5701/1502核酸检测国家参考品，用于评价试剂盒的准确性、特异性和检测限。
一种高效快速定性检测HLA-B*1502基因多态性的方法，包括如下步骤：
步骤1：样本快速处理：取80μL全血于1.5mL离心管中，加入1mL纯化水，涡旋振荡混匀后，于12000×g离心1min。吸弃上清，加入50μL样本处理液，剧烈涡旋，使沉淀充分重悬，得到血液预处理物。
步骤2：将17.6μl的PCR预混液与0.4μl Taq酶充分混合到PCR八联管中，并取步骤1中所得血液预处理物样本2μl加入八联管，混匀后进行PCR扩增。
步骤3：设置PCR反应程序和反应参数：
第一阶段：预变性95℃，5min；
第二阶段：预扩增5个循环，不采集信号：95℃，15s；℃，15s；
第三阶段：95℃，15s；56℃，15s，采集信号，40个循环。
进一步的，阳性检测结果判定值如下：
内参CT值≤35；
两个目的基因检测通道CT值均≤35，且阳性对照品CT≤35，阴性对照品CT＞35或为Undet.，观察目的基因扩增曲线和内参扩增曲线是否形成对数扩增的“S”形曲线，是则HLA-B*1502基因检测为阳性。
本发明的有益技术效果：
本发明提供的一种高效快速定性检测HLA-B*1502基因多态性的荧光PCR试剂盒及方法，采用荧光PCR法，根据靶基因序列设计的特异性扩增引物对和荧光探针，进行实时检测和特异性扩增，能够准确、灵敏、特异的从HLA-B*1502基因多态的基因型中检测出目的基因的变异。
本发明提供的一种高效快速定性检测HLA-B*1502基因多态性的荧光PCR试剂盒及方法。检测试剂具有较强的抗PCR抑制能力及多重PCR功能，使血液样本可免核酸提取，通过简单快速的粗处理即可进行扩增，通过一对引物和探针对目的基因的检测，并且加入一对引物和探针对其他特异性位点进行区分，避免假阳性。同时加入内参引物和探针，可排除HLA-B*1502基因假阴性的现象，可一次检测判定结果，方便快速，提高准确性。
本发明提供的一种高效快速定性检测HLA-B*1502基因多态性的荧光PCR试剂盒及方法，检测时无需经过gDNA提取纯化，只需将临床全血样本进行简单快速的预处理，然后加入到检测试剂中，通过对目的片段的特异性扩增，即可判快速准备读出样本HLA-B*1502的基因型，可用于临床中检测。
本发明提供的一种高效快速定性检测HLA-B*1502基因多态性的荧光PCR试剂盒及方法，检测引物和探针价格低廉，且无需进行测序，减少实验成本，缩短检测周期，实现高通量检测，大大提高检测效率。
附图说明
图1：HLA-B*1502阳性临床样本检测。
图2：HLA-B*1502阴性临床样本检测。
图3：HLA-B*1502阴性临床样本检测。
图4：10copies/μL HLA-B*1502质粒DNA样本检测。
具体实施方式
为了使本发明的技术方法、优势及目的更加清晰易懂，下面结合具体实施例及相关附图，对本发明进行详细的说明。此处描述的实施例仅用于解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1：试剂盒的开发设计
1.引物探针的设计与确认
本发明主要通过NCBI中的dbMHC数据库将HLA-B*1502等位基因序列与HLA-B其他基因序列进行比对，HLA-B基因序列的主要研究区域为Exon2+Exon3区，因其表达产物是编码与肽结合的α链，从而参与介导有抗原呈递细胞存在的特异性免疫应答，从比对结果也可以得出其特异性位点区域都存在于HLA-B等位基因的第2和第3外显子。因此将HLA-B等位基因的第2和第3外显子区域单独列为研究对象。
选出的目标序列必须包含外显子2区的129-201区域，共72bp；
HLA-B*15:214/302N/358的外显子2区和3区序列与HLA-B*15:02:01完全一致；(3个)
HLA-B*15:130/149的特异性位点包含在129-201区域内；
鉴于HLA-B*15:13在在中国人群中高等位基因频率，需包含外显子2区的223-268区域设计相关引物，也可排除HLA-B:15:330/357/418/89:01/89:02；
鉴于HLA-B*15:15/31在中国人群中高等位基因频率，需在外显子3区的280-336区域设计相关引物排除假阳性，与此同时可排除HLA-B*15:55/223/384。
剩下的21个等位基因在可接受风险内。
因此，在上述高频突变及同源序列高度相似的区域分别设计外显子2区检测HLA-B*1502基因的正向引物1(1502-F1)SEQ ID NO.1和反向引物1(1502-R1)SEQ ID NO.2及检测HLA-B*1502基因的探针1(1502-P1)SEQ ID NO.3，序列如下：
SEQ ID NO.1：CGCGAGTCCGAGGATAGC
SEQ ID NO.2：GTTGTAGTACCGCGCAGGT
SEQ ID NO.3：CCGGAACACACAGATCTCC
进一步的，在外显子3区的280-336区域设计特异性引物避免假阳性，检测HLA-B*1502的特异性引物正向引物2(1502-F2)SEQ ID NO.4和反向引物2(1502-R2)SEQ ID NO.5及检测HLA-B*1502的探针2(1502-P2)SEQ ID NO.6，序列如下：
SEQ ID NO.4：TGTCACATCATCAAGAGGA
SEQ ID NO.5：TGATCTGAGCCGCCGTGT
SEQ ID NO.6：TCCGCGGGTATGACCAGTCCGCCTA
进一步，为了实时对荧光PCR反应体系和实验操作过程进行内部质控，避免因漏检或样本质量问题带来的假阴性现象，本发明还设计管家基因ALB基因的内控引物对(ALB-F)SEQ ID NO.7和(ALB-R)SEQ ID NO.8及相应的荧光探针(ALB-P)SEQ ID NO.9，序列如下：
SEQ ID NO.7：TTGTGGGCTGTAATCATCGTCTA
SEQ ID NO.8：GTTCTCTTTCACTGACATCTGCAAA
SEQ ID NO.9：CCCACACAAATCTCTCCCTGGCATTG
通过对上述引物对和TaqMan荧光检测探针的筛选和体系的优化，建立了实时荧光PCR检测体系，利用一管反应液即可实现对HLA-B*1502等位基因的高灵敏度和高特异性检测，避免假阴性及假阳性结果出现，准确区分HLA-B*1502基因与其他多态性位点和同源序列。经过试验验证，最终确定检测HLA-B*1502等位基因的特异性检测引物包括正向引物1(1502-F1)、正向引物2(1502-F2)、反向引物1(1502-R1)、反向引物2(1502-R2)和检测探针1(1502-P1)、检测探针2(1502-P2)，以及内控正向引物(ALB-F)、内控反向引物(ALB-R)、和检测探针(ALB-P)。
阳性、阴性对照品的来源：根据CYP2C19药物代谢酶基因多态性检测试剂技术指导原则，体外诊断试剂盒若有国家开发的标准品，需使用国家推行的标准品，故本发明中的阳性、阴性对照品来自人类白细胞抗原B5801/5701/1502核酸检测国家参考品，用于评价试剂盒的准确性、特异性和检测限。
荧光PCR预混液组成如表1所述。
表1PCR预混液组成
Figure BDA0002837742190000071
Figure BDA0002837742190000081
实施例2采用实时荧光PCR检测HLA-B*1502基因多态性的方法
样本处理及检测
临床样本EDTA抗凝全血，取80μL于1.5mL离心管中，加入1mL纯化水，涡旋振荡混匀后，于12000×g离心1min。吸弃上清，加入50μL样本处理液，剧烈涡旋，使沉淀充分重悬，得到血液预处理物。
按照如下体系进行反应液配制：
名称 体积
PCR预混液 17.6μl
Taq酶 0.4μl
模板 2μl
按照样本例数进行放大配制，并同时加入阳性、阴性对照品。阳性对照品的工作浓度为1x104copies/μl,阴性对照品的工作浓度为1x106copies/μl,。
反应程序
Figure BDA0002837742190000082
结果判读
反应结束后，根据扩增曲线，划定适合基线(一般起始设定为3，终止设定为15)和荧光阈值(一般将阈值划定在扩增曲线对数形式下指数增长期的中间)，得到不同通道的CT值。
质控标准
对照品 检验标准
阴性对照品 无扩增，CT＞35或为Undet.
阳性对照品 CT≤35
内参 CT≤35
结果报告
Figure BDA0002837742190000091
实施例3本发明试剂盒对临床血液样本的检测
按照实施例2中的检测方法采用荧光PCR技术对214例临床样本EDTA抗凝全血进行检测，样本处理、检测方法及结果判读均与实施例2无异。结果与Sanger测序法进行对比全部一致，说明本发明试剂盒准确性符合要求。分别对检测得到的HLA-B*1502阳性和阴性样本结果进行附图说明。
实施例4本发明试剂盒及方法的特异性检测
HLA-B是人类基因组中多态性最高的基因，已有超过1800个变异型被报道。本实施例通过NCBI中的dbMHC数据库将HLA-B*1502等位基因序列与HLA-B其他基因序列进行比对，比对结果得到表2中与HLA-B*1502高度同源的基因位点，并将下列特异性位点的序列用现有的基因技术合成质粒，用本发明试剂盒进行检测，检测结果需与表3中一致，则说明本试剂盒可以准确区分与HLA-B*1502高度相似的同源性序列，特异性极高。
表2与HLA-B*1502高度相似的同源性序列及特异性位点
Figure BDA0002837742190000101
表3特异性质粒样本型别
Figure BDA0002837742190000102
结果见表4：
表4：本发明试剂盒检测特异性样本的判读结果
Figure BDA0002837742190000111
上述结果表明，本发明的试剂盒能正确、准确区分与HLA-B*1502高度相似的同源性序列及特异性位点，特异性极高。
实施例5本发明试剂盒及方法灵敏度的检测
将HLA-B*1502基因质粒用TE(PH＝8.0)进行梯度稀释至105、104、1000、100、10copies/μl，以此为模板，按实施例5中的方法进行实时荧光PCR扩增反应，检测结果如图4所示。由图4可见本发明的荧光PCR方法灵敏度高，10copies/μL基因DNA即可检出。该检测结果表明本发明所建立的HLA-B*1502等位基因运用实时荧光PCR检测方法及其试剂盒检测灵敏度高，与现有技术相比，能有效避免假阴性。
序列表
<110> 杭州百迈生物股份有限公司
<120> 一种定性检测HLA-B*1502等位基因的试剂盒及方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(AmbystArtificial Sequence)
<400> 1
cgcgagtccg aggatagc 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(AmbystArtificial Sequence)
<400> 2
gttgtagtac cgcgcaggt 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(AmbystArtificial Sequence)
<400> 3
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<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(AmbystArtificial Sequence)
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tgtcacatca tcaagagga 19
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<212> DNA
<213> 人工合成(AmbystArtificial Sequence)
<400> 5
tgatctgagc cgccgtgt 18
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成(AmbystArtificial Sequence)
<400> 6
tccgcgggta tgaccagtcc gccta 25
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成(AmbystArtificial Sequence)
<400> 7
ttgtgggctg taatcatcgt cta 23
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成(AmbystArtificial Sequence)
<400> 8
gttctctttc actgacatct gcaaa 25
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成(AmbystArtificial Sequence)
<400> 9
cccacacaaa tctctccctg gcattg 26

Claims (8)

1.一种检测HLA-B*1502等位基因的试剂盒，其特征在于，包括检测HLA-B*1502的上游引物SEQ ID NO.1、下游SEQ ID NO.2和探针SEQ ID NO.3，所述序列分别是：
SEQ ID NO.1：CGCGAGTCCGAGGATAGC
SEQ ID NO.2：GTTGTAGTACCGCGCAGGT
SEQ ID NO.3：CCGGAACACACAGATCTCC。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括检测HLA-B*1502特异性的上游引物SEQ ID NO.4，下游引物SEQ ID NO.5和探针SEQ ID NO.6，所述序列分别是：
SEQ ID NO.4：TGTCACATCATCAAGAGGA
SEQ ID NO.5：TGATCTGAGCCGCCGTGT
SEQ ID NO.6：TCCGCGGGTATGACCAGTCCGCCTA。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括内控检测上游引物SEQID NO.7、下游引物SEQ ID NO.8和探针SEQ D NO.9，所述序列分别是：SEQ ID NO.7：TTGTGGGCTGTAATCATCGTCTA
SEQ ID NO.8：GTTCTCTTTCACTGACATCTGCAAA
SEQ ID NO.9：CCCACACAAATCTCTCCCTGGCATTG。
4.根据权利要求1至3之一所述的试剂盒，其特征在于，探针核酸序列5’采用FAM、TET、VIC、HEX和ROX中的一种修饰，探针核酸序列3’采用MGB、TAMRA、BHQ1基团中的一种修饰。
5.一种检测HLA-B*1502基因多态性的方法，包括如下步骤：
步骤1：对临床样本血液样本进行简单预处理，获得血液预处理样本；
步骤2：将步骤1中的血液预处理样本与检测HLA-B*1502基因多态性的PCR反应试剂混匀，混匀后按预先设定的PCR反应程序进行PCR扩增；
步骤3：结果判读；
所述基因多态性的PCR反应试剂包括检测HLA-B*1502的上游引物SEQ ID NO.1、下游SEQ ID NO.2和探针SEQ ID NO.3，所述序列分别是：
SEQ ID NO.1：CGCGAGTCCGAGGATAGC
SEQ ID NO.2：GTTGTAGTACCGCGCAGGT
SEQ ID NO.3：CCGGAACACACAGATCTCC。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述基因多态性的PCR反应试剂还包括区分HLA-B*1502特异性的上游引物SEQ ID NO.4，下游引物SEQ ID NO.5和探针SEQ ID NO.6，所述序列分别是：
SEQ ID NO.4：TGTCACATCATCAAGAGGA
SEQ ID NO.5：TGATCTGAGCCGCCGTGT
SEQ ID NO.6：TCCGCGGGTATGACCAGTCCGCCTA。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述结果判读的阳性结果为检测通道CT值≤35，特异性位点检测通道CT值≤35且内参CT值≤35，则HLA-B*1502基因检测为阳性。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，阳性对照品CT≤35，阴性对照品CT＞35或为Undet.，则HLA-B*1502基因检测为阳性。
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