CN112831550A - Tert基因启动子突变实时荧光定量pcr检测试剂及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及TERT基因启动子突变实时荧光定量PCR检测试剂及方法，其中引物包括序列如SEQ ID No.1的正向引物和序列如SEQ ID No.2的反向引物；探针包括序列如SEQ ID No.3的C250T位点野生型探针、序列如SEQID No.4的C250T位点突变型探针、序列如SEQ ID No.5的C228T位点野生型探针和序列如SEQ ID No.6的C228T位点突变型探针；C250T位点野生型探针和C228T位点野生型探针的5’端标记有FAM荧光基团，C250T位点野生型探针和C228T位点野生型探针的3’端标记有MGB淬灭基团；C250T位点突变型探针和C228T位点突变型探针的5’端标记有VIC荧光基团，C250T位点突变型探针和C228T位点突变型探针的3’端标记有MGB淬灭基团。本发明能够实现TERT基因启动子突变的实时荧光定量PCR检测，检测速度快，判断方便，检测敏感性好，对检测样本要求低。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及TERT基因启动子突变实时荧光定量PCR检测试剂及方法。
背景技术
TERT(telomerase reverse transcriptase，端粒酶逆转录酶)基因是端粒酶起作用的关键结构和主要调控亚单位，通过逆转录端粒酶RNA模板序列，合成端粒DNA重复序列并添加到染色体末端，从而弥补了端粒在细胞分裂中的消耗。研究表明，TERT基因启动子突变参与黑色素瘤、脂肪瘤、甲状腺癌、肝细胞瘤、神经胶质瘤等多种肿瘤的发生和发展过程。TERT基因启动子突变主要发生在C250T和C228T两个位点上，两个位点均发生了胞嘧啶核苷酸c被胸腺嘧啶核苷酸t置换的点突变，两个位点的突变会增加TERT启动子的转录活性，使TERT表达上调，使得肿瘤细胞能够突破分裂周期的限制，因此促进肿瘤的发生和发展。
目前，TERT基因启动子突变常用的检测方法是Sanger测序法，Sanger测序法的原理是在作为扩增原料的四种脱氧核苷酸(dNTP)中混入限量的缺少延伸所需3’-OH基团的双脱氧核苷酸(ddNTP)作为链终止剂，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处结束，然后对所得的一系列核苷酸进行电泳检测，从而获得可见的DNA碱基序列。但Sanger测序法对组织要求高，操作复杂，敏感性仅为10～20％，容易检测失败或造成污染。
聚合酶链式反应(PCR)是一种体外扩增DNA或RNA的分子生物学技术，具有扩增速度快等优点。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR步骤通常包括：双链模板DNA解离呈单链，单链与引物配对结合，在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，按碱基互补配对和半保留复制原理，合成新的与模板DNA链互补的半保留复制链，如此重复循环能够将基因扩增放大几百万倍目前也存在利用PCR进行基因突变检测的方法，但大多检测敏感性不高，现有技术中一些文献公开了采用巢式PCR来提高检测敏感性，但巢式PCR操作复杂，且容易放大污染，对检测样本要求高；一些文献采用PCR-Sanger法进行测序，但这种方法操作麻烦，成本高。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供TERT基因启动子突变实时荧光定量PCR检测试剂及方法，能够实现TERT基因启动子突变的实时荧光定量PCR检测，检测速度快，判断方便，检测敏感性好，对检测样本要求低，成本低。
为实现本发明的目的，本发明提供了TERT基因启动子突变实时荧光定量PCR检测试剂，其包括引物和探针；引物包括序列如SEQ ID No.1所示的正向引物和序列如SEQ IDNo.2所示的反向引物；探针包括序列如SEQ ID No.3所示的C250T位点野生型探针、序列如SEQ ID No.4所示的C250T位点突变型探针、序列如SEQ ID No.5所示的C228T位点野生型探针和序列如SEQ ID No.6所示的C228T位点突变型探针；C250T位点野生型探针和C228T位点野生型探针的5’端标记有FAM荧光基团，C250T位点野生型探针和C228T位点野生型探针的3’端标记有MGB淬灭基团；C250T位点突变型探针和C228T位点突变型探针的5’端标记有VIC荧光基团，C250T位点突变型探针和C228T位点突变型探针的3’端标记有MGB淬灭基团。其中，SEQ ID No.1为5’-tcctgccccttcaccttc-3’；SEQ ID No.2为5’-aaggaaggggaggggct-3’；SEQ ID No.3为5’-ccgacccctcccg-3’；SEQ ID No.4为5’-ccgaccccttccg-3’；SEQ IDNo.5为5’-ccagccccctccg-3’；SEQ ID No.6为5’-ccagccccttccg-3’。
进一步的技术方案是，TERT基因启动子突变实时荧光定量PCR检测试剂还包括dNTP、DNA聚合酶、缓冲液和ddH2O，PCR反应缓冲液包含Mg2+离子。
为实现本发明的目的，本发明还提供了TERT基因启动子突变实时荧光定量PCR检测方法，其包括以下步骤：步骤1：在反应容器中加入上述任一方案所述的TERT基因启动子突变实时荧光定量PCR检测试剂和待检测的DNA，进行扩增反应和实时荧光检测；步骤2：根据扩增曲线判断突变情况。
进一步的技术方案是，在步骤2中，根据扩增曲线获得Ct值，根据Ct值判断判断突变情况。
与现有技术相比，本发明能够取得以下有益效果：
本发明的TERT基因启动子突变实时荧光定量PCR检测试剂及由其实现的TERT基因启动子突变实时荧光定量PCR检测方法，能够提高检测速度，判断方便，改善检测敏感性，对检测样本要求低，同时检测可以在全封闭状态下进行，无污染风险。具体地，本发明根据TERT的野生基因及突变基因设计了1对引物及4条探针，用于对提取的组织DNA进行扩增，根据扩增曲线获得Ct值即可判断突变情况，操作简单，成本低。本发明的TERT基因启动子突变实时荧光定量PCR检测试剂和方法适用于疾病诊断目的和非疾病诊断目的TERT基因启动子检测。
附图说明
图1是本发明实施例敏感性测试的扩增曲线图。图中A为突变型质粒含量分别为1％的待测样品的扩增曲线，B为突变型质粒含量分别为2％的待测样品的扩增曲线，C为突变型质粒含量分别为5％的待测样品的扩增曲线，D为突变型质粒含量分别为10％的待测样品的扩增曲线，E为突变型质粒含量分别为15％的待测样品的扩增曲线。
以下结合附图以及具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
具体实施方式
本实施例为了实现TERT基因启动子突变实时荧光定量PCR检测方法，根据TERT基因启动子的野生型及突变型设计了TERT基因启动子突变实时荧光定量PCR检测试剂。TERT基因启动子的野生型质粒的基因序列如SEQ ID No.7所示，TERT基因启动子的突变型质粒的基因序列如SEQ ID No.8所示。
SEQ ID No.7为
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SEQ ID No.8为
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TERT基因有两个snp位点，即C250T位点和C228T位点，如上述SEQ ID No.7和SEQID No.8中带下划线的碱基位置，碱基由c突变为t。本实施例根据该两个snp位点，设计了1对引物及4条探针，试剂中还可以包括dNTP、DNA聚合酶(例如Taq DNA聚合酶)、PCR反应缓冲液(含Mg2+)和ddH2O，构成TERT基因启动子突变实时荧光定量PCR检测的试剂体系。检测时将提取的组织DNA与上述试剂混合后进行PCR反应，通过检测系统对PCR反应容器内样品的荧光信号进行实时检测，得到扩增曲线，即可进行判断。
具体地，本实施例的TERT基因启动子实时荧光定量PCR检测方法所设计的引物和探针如下表1所示。
表1TERT基因启动子突变实时荧光定量PCR检测试剂的引物和探针
其中，正向引物和反向引物能够与TERT基因紧密互补，引物不会与TERT基因的非目标位点结合而导致错配，且引物自身、正向引物与反向引物之间以及引物与探针之间不会形成稳固的发夹结构或二聚体而影响引物与待测基因的结合，从而使得扩增反应具有较高的扩增效率。此外，引物长度适中，避免非特异性配对，且引物分子稳定，易于合成。引物扩增跨度覆盖C250T位点和C228T位点，无需多对引物，避免了多对引物竞争的问题。
4条探针与野生型和突变型的C250T位点和C228T位点处对应的序列段完全匹配，4条探针检测两个位点的突变情况，提高检测灵敏度。与snp位点对应的碱基位于探针的中间略靠近3’端的位置，使得从引物延伸的复制链未完全延伸到snp位点时仍可激发荧光信号，提高了检测灵敏度。探针的两端分别标记一个荧光基团和一个淬灭基团，当PCR扩增时，DNA聚合酶将探针酶切降解，使荧光基团与淬灭基团分离，荧光基团能够发射出荧光信号，荧光信号的强度与扩增反应产物的量同步，从而实现定性定量分析。本实施例选择合适的探针的长度，探针的特异性强、准确性高，且易于合成。MGB淬灭基团本身不带颜色，不影响荧光信号检测。且MGB淬灭基团能够结合到DNA的小沟部位，与普通的淬灭基团相比探针与靶序列结合更加稳定，Tm值也更高。探针还具有合适的碱基C和G含量，提高Tm值。这些探针分子结构的设计使得探针的Tm值高于引物的Tm值，探针在退火时能够更好地优先于引物与靶序列结合，提高了荧光定量分析的精确度。FAM和VIC分别标记野生型和突变型的5’端，FAM和VIC波长稳定，不会相互覆盖，有利于检测。
通过上述引物与探针的配合，获得了特异性好、灵敏性高、扩增效率高的TERT基因启动子突变实时荧光定量PCR检测试剂，其用于TERT基因启动子突变实时荧光定量PCR检测，与待检测的DNA混合即可进行实时荧光定量PCR检测，具有操作简单等优点。
具体地，在TERT基因启动子突变实时荧光定量PCR检测试剂中，正向引物和反向引物的浓度分别在0.05～1μmol/L的范围内，C250T位点野生型探针、C250T位点突变型探针、C228T位点野生型探针和C228T位点突变型探针的浓度分别在0.1～0.6μmol/L的范围内，dNTP的浓度在20～200μmol/L的范围内，Mg离子的浓度在0.5～2mmol/L的范围内，DNA聚合酶的浓度在2.5～5U/μl，ddH2O的用量根据实际的试剂液体体积和各物料浓度要求补充添加。该试剂与待检测DNA的用量关系为20～25μl试剂：5～20ng DNA。
TERT基因启动子突变实时荧光定量PCR检测方法耗时少于2个小时，主要包括以下步骤：
步骤1：在反应容器中加入TERT基因启动子突变实时荧光定量PCR检测试剂和提取的组织DNA，然后进行扩增反应和实时荧光检测，将荧光信号值的实时变化显示为扩增曲线。其中DNA与各物料的添加顺序可以根据需要进行调整，例如加入DNA后，最后再滴加ddH2O调整体系的液体体积。实时荧光检测可以对FAM和VIC两种荧光信号进行检测，VIC荧光信号的扩增曲线可以用于判断突变情况，FAM荧光信号的扩增曲线可以作为参考和对比。
步骤2：根据扩增曲线判断突变情况。例如对于不存在突变的DNA样品，扩增曲线没有Ct值或Ct值过高。例如对于存在突变的DNA样品，可以根据扩增曲线获得Ct值，根据所述Ct值判断突变情况，Ct值高则突变基因数量少，Ct值低则突变基因数量大，可以通过比较所测样品的Ct值与预设Ct值，判断是否存在突变以及突变程度。Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设置阈值时所经历的循环数。
作为一个具体实施例，包含待检测DNA的反应物的溶液总体积为25μl。其中DNA的加入量为2μl，浓度是10ng/μl。在总反应物体系中，正向引物和反向引物的浓度分别为0.4μmol/L，C250T位点野生型探针、C250T位点突变型探针、C228T位点野生型探针和C228T位点突变型探针的浓度分别为0.4μmol/L。扩增反应的步骤包括：
1.DNA的预变性：加热至95℃维持2min，使DNA完全解链。
2.重复循环以下步骤进行扩增，进行约40个循环例如40～45个循环：
2.1变性：加热至95℃维持20s，使待检测的DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，形成单链。
2.2退火和延伸：温度降至64℃，维持45s，使得引物与DNA单链的互补序列配对结合，然后在DNA聚合酶的作用下，dNTP为原料，DNA的靶序列为模板，合成DNA半保留复制链。
上述TERT基因启动子突变实时荧光定量PCR检测方法的检测通量可以根据实际需要进行调整，例如可以在同一时间段内检测一个或多个样品，检测通量可以从单例到90例。
对以上检测方法进行验证：
(1)敏感性验证：将购买获得的TERT基因启动子的野生型质粒与突变型质粒混合，形成突变型质粒在质粒混合物中质量含量分别为1％、2％、5％、10％及15％的待测样品，每个待测样品按照上述方法进行实时荧光定量PCR检测。
检测结果的VIC荧光信号的扩增曲线如图1所示，突变型质粒含量为5％的待测样品可见明确S型扩增曲线，Ct值为33。突变型质粒含量为10％和15％的待测样品也有明显的S型扩增曲线，Ct值比突变型质粒含量为5％的待测样品更低，且突变型质粒含量越高，Ct值越低。突突变型质粒含量为1％和2％的待测样品也有S型扩增曲线，Ct值比突变型质粒含量为5％的待测样品的Ct值更高。在对实际提取的组织DNA的检测过程中，Ct值高于35则难以判断是由样品本身突变还是污染导致的Ct值，即Ct值高于35后将难以判断检测的基因是否突变。采用本实施例的TERT基因启动子实时荧光定量PCR检测的试剂和方法检测提取的组织DNA时，将Ct值高于35的样品判断为阴性(即判断为TERT基因启动子没有突变)，将Ct值低于35的样品判断为阳性(即判断为TERT基因启动子存在突变)。可见，本实施例的检测敏感性可达5％。
(2)准确性验证：选取采用Sanger测序检测的脑胶质瘤组织286例，其中Sanger测序成功270例，失败16例，提取DNA，按上述方法进行实时荧光定量PCR检测，分析实时荧光定量PCR检测法与Sanger测序法的检查结果一致性。
该270例Sanger测序成功的标本中，5例实时荧光定量PCR检测失败，共有265例标本同时完成Sanger及实时荧光定量PCR测序检测。对于Sanger测序和实时荧光定量PCR检测均成功的265例，Sanger测序和实时荧光定量PCR法检测的结果如下表2所示。其中，94.33％(250/265)检测结果一致，仅有5.66％(15/265)两种方法检测结果存在差异。可见，本实施例的实时荧光定量PCR检测法与Sanger测序法检测结果一致性高，本实施例的实时荧光定量PCR法可以代替现有的Sanger测序法用于TERT基因启动子C250T和C228T位点的突变。
表2 Sanger和实时荧光定量PCR法检测结果分析
(3)特异性验证：挑选30例正常人外周血白细胞，提取基因组DNA，按上述方法进行实时荧光定量PCR检测。
检测结果是，在正常人外周血白细胞DNA的扩增曲线中未见任何非特异性扩增。这表明了本实施例的TERT基因启动子实时荧光定量PCR检测试剂和方法具有良好的特异性。
(4)重复性验证：挑选接近于阳性阈值的Ct值＝30的DNA标本3例，每一例重复10次按上述方法进行实时荧光定量PCR检测，观察每次的Ct值。
检测结果是，Ct值在30处的DNA标本Ct值检测结果重叠性良好。
(5)抗干扰性验证：将PCR反应缓冲液、引物及探针等试剂原料分别放置于4℃及-20℃冰箱15天，然后按上述方法进行实时荧光定量PCR检测，观察其PCR扩增效果。
检测结果是，放置于4℃及-20℃环境的引物、探针及PCR反应缓冲液等均可正常使用。可见，本实施例的TERT基因启动子突变实时荧光定量PCR检测试剂及方法有良好的抗干扰性，试剂能够存放，使用方便。
最后需要强调的是，以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山市博爱医院
<120> TERT基因启动子突变实时荧光定量PCR检测试剂及方法
<130>
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcctgcccct tcaccttc 18
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 5
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<212> DNA
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<400> 7
cgggttcgtc cccagccgcg tctacgcgcc tccgtcctcc ccttcacgtc cggcattcgt 60
ggtgcccgga gcccgacgcc ccgcgtccgg acctggaggc agccctgggt ctccggatca 120
ggccagcggc caaagggtcg ccgcacgcac ctgttcccag ggcctccaca tcatggcccc 180
tccctcgggt taccccacag cctaggccga ttcgacctct ctccgctggg gccctcgctg 240
gcgtccctgc accctgggag cgcgagcggc gcgcgggcgg ggaagcgcgg cccagacccc 300
cgggtccgcc cggagcagct gcgctgtcgg ggccaggccg ggctcccagt ggattcgcgg 360
gcacagacgc ccaggaccgc gcttcccacg tggcggaggg actggggacc cgggcacccg 420
tcctgcccct tcaccttcca gctccgcctc ctccgcgcgg accccgcccc gtcccgaccc 480
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ggccccgccc tctcctcgcg gcgcgagttt 570
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<212> DNA
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<400> 8
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tccctcgggt taccccacag cctaggccga ttcgacctct ctccgctggg gccctcgctg 240
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cttccgggtc cccggcccag ccccttccgg gccctcccag cccctcccct tcctttccgc 540
ggccccgccc tctcctcgcg gcgcgagttt 570
Claims (4)
1.TERT基因启动子突变实时荧光定量PCR检测试剂，其特征在于包括引物和探针；
所述引物包括序列如SEQ ID No.1所示的正向引物和序列如SEQ ID No.2所示的反向引物；SEQ ID No.1为5’-tcctgccccttcaccttc-3’；SEQ ID No.2为5’-aaggaaggggaggggct-3’；
所述探针包括序列如SEQ ID No.3所示的C250T位点野生型探针、序列如SEQ ID No.4所示的C250T位点突变型探针、序列如SEQ ID No.5所示的C228T位点野生型探针和序列如SEQ ID No.6所示的C228T位点突变型探针；SEQ ID No.3为5’-ccgacccctcccg-3’；SEQ IDNo.4为5’-ccgaccccttccg-3’；SEQ ID No.5为5’-ccagccccctccg-3’；SEQ ID No.6为5’-ccagccccttccg-3’；
所述C250T位点野生型探针和所述C228T位点野生型探针的5’端标记有FAM荧光基团，所述C250T位点野生型探针和所述C228T位点野生型探针的3’端标记有MGB淬灭基团；所述C250T位点突变型探针和所述C228T位点突变型探针的5’端标记有VIC荧光基团，所述C250T位点突变型探针和所述C228T位点突变型探针的3’端标记有MGB淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的TERT基因启动子突变实时荧光定量PCR检测试剂，其特征在于还包括dNTP、DNA聚合酶、PCR反应缓冲液和ddH2O，PCR反应缓冲液包含Mg2+离子。
3.TERT基因启动子突变实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤1：在反应容器中加入权利要求1或2所述的TERT基因启动子突变实时荧光定量PCR检测试剂和待检测的DNA，进行扩增反应和实时荧光检测；
步骤2：根据扩增曲线判断突变情况。
4.根据权利要求3所述的TERT基因启动子突变实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：
在所述步骤2中，根据扩增曲线获得Ct值，根据所述Ct值判断突变情况。
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