CN106148516A - 一种用于检测tert基因启动子突变的试剂盒及其检测方法和应用 - Google Patents

一种用于检测tert基因启动子突变的试剂盒及其检测方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106148516A
CN106148516A CN201610497978.2A CN201610497978A CN106148516A CN 106148516 A CN106148516 A CN 106148516A CN 201610497978 A CN201610497978 A CN 201610497978A CN 106148516 A CN106148516 A CN 106148516A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sudden change
test kit
gene promoter
tert gene
probe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610497978.2A
Other languages
English (en)
Inventor
邓友平
王红卫
张绍波
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou Jienuowei Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Suzhou Jienuowei Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou Jienuowei Biotechnology Co Ltd filed Critical Suzhou Jienuowei Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201610497978.2A priority Critical patent/CN106148516A/zh
Publication of CN106148516A publication Critical patent/CN106148516A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于临床医学基因检测技术，具体涉及一种用于检测TERT基因启动子突变的试剂盒及其检测方法和应用，所述试剂盒含有特异性识别TERT基因启动子C228T位点突变、C250T位点突变或其组合的荧光标记探针、一对TERT特异性引物以及所需的所有试剂的Master mix。本发明提供了TERT基因启动子的特异性C228T和C250T型突变，二型突变之和约占膀胱癌TERT突变的100％；且检测方法标准化，试剂经过优化验证，价格低廉，而且反应体系中所有成分均预先混合，最大限度地简化了操作过程并避免操作失误。利用本发明提供的试剂盒检测TERT基因启动子突变时，影响因素少，检测精准，操作简单，检测结果容易解读，为临床医学上提供了快速从尿液检测膀胱癌的可靠方法。

Description

一种用于检测TERT基因启动子突变的试剂盒及其检测方法和 应用
技术领域
本发明属于临床医学基因检测技术领域，尤其涉及一种用于检测TERT基因启动子突变的试剂盒及其检测方法和应用。
背景技术
膀胱尿路上皮癌是泌尿道的最常见的恶性肿瘤。癌发病率水平在全国32个肿瘤登记处的合计为6.69/10万，占全部恶性肿瘤新发病例的2.52％。按性别统计，膀胱癌男、女性发病率分别为10.10/10万和3.20/10万，男性是女性的3.16倍。膀胱癌死亡率水平在全国32个肿瘤登记中为2.53/10万，占全部恶性肿瘤死亡总数的1.47％。此癌多数组织学表现为分化良好的乳头状病变。尿细胞学在诊断高级别肿瘤中有较高的灵敏度和特异性，但是在检测高分化低级别肿瘤时表现较差，其灵敏度和特异性较低，尤其以伴有非肿瘤性病变，如感染时为甚。目前常用的方法是尿液细胞学检查。虽说尿细胞学在高级别肿瘤检测中具有合理的灵敏度和特异性，但是其检测低级别肿瘤常有困难，其灵敏度和特异性均较低。目前应用的尿基肿瘤标记物，包括食品和药物管理局(FDA)批准的Immunocy，核基质蛋白22，和荧光原位杂交(FISH)具有较高的灵敏度和特异性。但是各项检查性能不一致，价格高昂，受标本因素影响较大，妨碍了其广泛的临床使用。
端粒反转录酶(TERT)激活性突变导致端粒酶的表达增加，是尿路上皮癌的最常见的突变，出现于80％的膀胱癌中，而且与癌的分化水平无关。现在已经被认定为膀胱癌的驱动突变，其突变的检测为膀胱癌的诊断提供了较好的目标基因。
TERT启动子突变发生于致癌过程早期，结合膀胱癌的外生性倾向，使细胞极易于脱落于尿液中，为TERT突变经尿液脱落细胞诊断膀胱癌成为可能。TERT突变的检测不但可用于临床诊断和筛查，而且极为适合复发监测。
现有的无创筛查和监测膀胱癌尿基标记物，包括食品和药物管理局(FDA)批准的试验Immunocy，核基质蛋白22(NMP22)，UroVysion原位荧光杂交具有70％的总灵敏度和高达89％的特异性。但是各项检查性能不一致，价格相对昂贵，妨碍了其广泛的临床使用。
端粒酶逆转录酶的启动子(TERT)基因激活性突变在导致端粒酶的表达增加，是膀胱癌的致癌驱动因子。TERT启动子突变被发现于80％的膀胱性尿路上皮癌，并且与肿瘤分级分期无关，是一个理想的诊断和监测指标。
CN 104805206A公开了检测TERT基因突变的试剂盒及其检测方法，试剂盒含有针对TERT基因突变位点的LNA锁核酸修饰的特异探针，该特异探针能够与野生型DNA结合，能检出含0.01％TERT基因突变DNA的样本、最低检出限为2-5拷贝。但是该试剂盒反应体系复杂，影响因素多，每一因子均可对反应结果和解读产生影响，难以解读；貌似可以探知几乎所有突变，然而混合的多重PCR不能明确病人为何种突变，尚需要测序来确定具体突变，如果用单纯PCR，则需要做多次PCR反应，工作量大。
发明内容
为解决现有技术中存在的不足，本发明应用实时PCR融解技术来检测TERT基因启动子突变。本发明设计至少一对探针和一对引物以及Master Mix，用于检测特异性C228T和/或C250T型突变，二型突变之和约占膀胱癌TERT突变的100％；且检测方法试剂简单，价格低廉，而且试剂盒设计最大限度地减少了需要现场配制反应成分，所有步骤和相应试剂浓度，反应参数和判定标准均经过优化和验证；反应体系简单，最大限度地减少了影响因素。本发明提供的检测方法具有精准、操作简单以及价格低廉等特点，为临床医学上从尿液沉淀细胞中快速检测膀胱癌奠定了基础。
第一方面，本发明提供了一种检测TERT基因启动子突变的试剂盒，所述试剂盒含有特异性识别TERT基因启动子突变的荧光标记探针。
本发明中，当检测TERT基因启动子存在突变时，突变特异性探针与基因组DNA特异性结合，而野生型DNA则因为有单点的不配对，形成“泡”，从而显示较低的熔点。
发明人意外发现，在膀胱癌TERT基因突变中，特异性C228T型突变约占膀胱癌TERT突变的98％；发明人进一步发现，在膀胱癌TERT基因突变中还存在另外一类突变，即C250T型突变，该突变与C228T型突变之和占所有膀胱癌TERT突变的比例接近100％。在此研究基础上，可以实现对膀胱癌的精准检测。
根据本发明，所述试剂盒含有特异性识别TERT基因启动子C228T位点突变、C250T位点突变或其组合的荧光标记探针。
具体地，所述试剂盒可以只含有特异性识别TERT基因启动子C228T位点突变的荧光标记探针，也可以只含有特异性识别TERT基因启动子C250T位点突变的荧光标记探针，或者是同时含有特异性识别TERT基因启动子C228T位点突变和C250T位点突变的两对荧光标记探针。
本发明中，当采用同时含有特异性识别TERT基因启动子C228T位点突变和C250T位点突变的两对荧光标记探针时，相比采用单一的荧光标记探针，其能够大大增加对膀胱癌TERT基因启动子突变的检测效率，并提高检测准确率，使检测准确率接近100％。
根据本发明，所述荧光标记探针含有供体探针和受体探针，例如特异性识别TERT基因启动子C228T位点突变的荧光标记探针含有特异性识别TERT基因启动子C228T位点突变的供体探针和特异性识别TERT基因启动子C228T位点突变的受体探针；特异性识别TERT基因启动子C250T位点突变的荧光标记探针含有特异性识别TERT基因启动子C250T位点突变的供体探针和特异性识别TERT基因启动子C250T位点突变的受体探针。
本发明中的特异性识别TERT基因启动子C228T位点突变的供体探针，其核苷酸序列含有如SEQ ID NO.1所示的片段，特异性识别TERT基因启动子C228T位点突变的受体探针的核苷酸序列含有如SEQ ID NO.2所示的片段。
本发明中的特异性识别TERT基因启动子C250T位点突变的供体探针，其核苷酸序列含有如SEQ ID NO.3所示的片段，特异性识别TERT基因启动子C250T位点突变的受体探针的核苷酸序列含有如SEQ ID NO.4所示的片段。
本发明中，所述SEQ ID NO.1-4所示的氨基酸序列如下：
SEQ ID NO.1：CGTCCCGACCCCTCCCGGGTC
SEQ ID NO.2：CCCAGCCCCTTCCGGGCCCT
SEQ ID NO.3：CGTCCCGACCCCTTCCGGGTC
SEQ ID NO.4：GCCCAGCCCCCTCCGGGCCCT
本发明中，所述荧光标记探针含有的氨基酸序列优选采用如下序列：
C228T突变的供体探针：5’-CGTCCCGACCCCTCCCGGGTC-Flc-3’
C228T突变的受体探针：5’-Lc640-GCCCAGCCCCTTCCGGGCCCT-Phos-3’
C250T突变的供体探针：5’-CGTCCCGACCCCTTCCGGGTC-Flc-3’
C250T突变的受体探针：5’-Lc640-GCCCAGCCCCCTCCGGGCCCT-Phos-3’
根据本发明，所述试剂盒还含有一对检测TERT基因启动子突变的特异性引物，该特异性引物的核苷酸序列含有如SEQ ID NO.5-6所示的片段。
本发明中，所述SEQ ID NO.5-6所示的氨基酸序列如下：
SEQ ID NO.5：CCCTTCACCTTCCAGCTC
SEQ ID NO.6：AGCGCTGCCTGAAACTGG
本发明中，所述特异性引物的核苷酸序列优选采用如下序列：
上游引物：5’-CCCTTCACCTTCCAGCTC-3’
下游引物：5’-AGCGCTGCCTGAAACTGG-3’
根据本发明，所述试剂盒含有检测TERT的Master Mix，例如还含有PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2和DNA聚合酶。本发明中的Master Mix试剂浓度和反应参数均经过优化和验证，并含有阳性和阴性对照DNA样本。
本发明中，所有试剂包括荧光标记探针、特异性引物、PCR缓冲液和dNTPs(除酶之外)均已混合，作为“主液”，不需要单独配制，极大地方便用户操作。
本发明中所述Master Mix为4×浓度，其包括优化后的PCR反应所需缓冲液、dNTPs和One Taq DNA聚合酶。
根据本发明，所述dNTPs的浓度为0.05-1μM，例如可以是0.05μM、0.06μM、0.08μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM或1μM，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
本发明中，所述dNTPs的浓度优选为0.1-0.8μM，进一步优选为0.2μM。
根据本发明，所述DNA聚合酶的浓度为0.5-8U/mg，例如可以是0.5U/mg、0.6U/mg、0.7U/mg、0.8U/mg、1U/mg、1.2U/mg、1.5U/mg、2U/mg、2.5U/mg、3U/mg、3.5U/mg、4U/mg、4.5U/mg、5U/mg、5.5U/mg、6U/mg、6.5U/mg、7U/mg、7.5U/mg或8U/mg，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
本发明中，所述DNA聚合酶优选为One Taq DNA聚合酶，其浓度优选为1-5U/mg，进一步优选为1.5U/mg。
根据本发明，所述试剂盒还含有介绍该试剂盒的使用说明书。
第二方面，本发明提供了一种利用如第一方面所述的用于检测TERT基因启动的试剂盒在非疾病诊断和治疗目的中检测TERT基因启动子突变的方法，其包括以下步骤：
(1)从待测样品中提取模板DNA 5-20ng，利用含有SEQ ID NO.5-6所示片段的特异性引物对所述模板DNA进行实时PCR扩增；
(2)将步骤(1)扩增后的片段加入含有如SEQ ID NO.1-2所示片段的荧光标记探针、含有如SEQ ID NO.3-4所示片段的荧光标记探针或其混合物中进行加温熔解；
(3)通过得到的PCR产物的熔解曲线来判断TERT基因的突变情况。
根据本发明，所述检测TERT基因启动子突变的方法主要用于膀胱癌的诊断和治疗，在具体检测时，可以从尿液离心沉淀细胞中检测TERT基因启动子突变C228T和C250T，也可以是从膀胱组织活检标本中实现对TERT基因启动子突变C228T和C250T的检测，对于检测样品以及模板DNA的来源也可以采用其它途径。
本发明中，步骤(1)所述待测样品优选为尿液细胞离心沉淀物和/或膀胱组织，因此，所述模板DNA优选来自于尿液细胞沉淀物和/或膀胱组织活检标本。
根据本发明，步骤(1)所述实时PCR扩增的条件为：
(a)95℃预变性4min，1循环；
(b)94℃变性20s、62℃退火20s、68℃延伸40s，55个循环；
(c)37℃延伸30s，1循环。
根据本发明，步骤(2)所述加温熔解的条件为：95℃1min，62℃30s，45℃30s，40℃2min，再以0.1℃/秒的速度升高至70℃。
本发明中，所述试剂盒由特异性DNA引物和荧光标记的激发探针与被激发探针构成，被激发探针3’磷酸化以防止其延伸，在PCR反应过程中，如无目标点突变，则探针与DNA100％互补，从而表现为一定的温度融解。
根据本发明，步骤(3)所述判断TERT基因的突变情况的方法为：
当预测熔点(63℃)±2.5℃范围内出现熔融曲线峰，则待测样品含有C228T位点突变、C250T位点突变或其组合突变细胞克隆。
当预测熔点(58℃)±2.5℃范围内出现熔融峰，而(63℃)±2.5℃缺乏熔融曲线峰时，则检测样品不含突变的细胞群。
当多个熔融曲线峰存在，分别位于(58℃)±2.5℃和(63℃)±2.5℃，则待测样本含有混合细胞群，即含有相应突变克隆，C228T或C250T以及野生型非突变细胞。
第三方面，本发明提供了如第一方面所述的用于检测TERT基因启动子突变的试剂盒在用于非疾病诊断和治疗目的的检测C228T位点突变、C250T位点突变或其组合突变中的应用。
本发明中，所述C228T和C250T位点的突变占其他所有膀胱癌TERT突变的比例接近100％。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明设计仅需两对荧光标记探针和一对引物，所发现为特异性C228T和C250T型突变，其总和约占膀胱癌TERT突变的近100％；
(2)本发明方法试剂简单，价格低廉，而且反应体系中所有成分均经过优化和验证，试剂预先混合，将操作误差影响降到最低；
(3)本发明方法检测精准，操作简单，价格低廉，为临床医学上快速检测膀胱癌奠定了基础。
附图说明
图1为本发明试剂盒检测原理图；
图2为本发明试剂盒检测结果图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
用于检测TERT基因启动子突变的试剂盒，其包括：
(1)特异性识别TERT基因启动子C228T位点突变的荧光标记探针，其供体探针和受体探针的核苷酸序列如下：
C228T突变的供体探针：5’-CGTCCCGACCCCTCCCGGGTC-Flc-3’
C228T突变的受体探针：5’-Lc640-GCCCAGCCCCTTCCGGGCCCT-Phos-3’
(2)检测TERT基因启动子C228T位点突变的特异性引物，其核苷酸序列如下：
上游引物：5’-CCCTTCACCTTCCAGCTC-3’
下游引物：5’-AGCGCTGCCTGAAACTGG-3’
(3)Master Mix，其包括：1×PCR缓冲液、0.2μM的dNTPs、1.5U/mg的one Taq DNA聚合酶和10ng的DNA模板；
(4)使用说明书一份。
实施例2
用于检测TERT基因启动子突变的试剂盒，其包括：
(1)特异性识别TERT基因启动子C250T位点突变的荧光标记探针，其供体探针和受体探针的核苷酸序列如下：
C250T突变的供体探针：5’-CGTCCCGACCCCTTCCGGGTC-Flc-3’
C250T突变的受体探针：5’-Lc640-GCCCAGCCCCCTCCGGGCCCT-Phos-3’
(2)检测TERT基因启动子C250T位点突变的特异性引物，其核苷酸序列如下：
上游引物：5’-CCCTTCACCTTCCAGCTC-3’
下游引物：5’-AGCGCTGCCTGAAACTGG-3’
(3)Master Mix，其包括：1×PCR缓冲液、0.2μM的dNTPs、1.5U/mg的one Taq DNA聚合酶和10ng的DNA模板；
(4)使用说明书一份。
实施例3
用于检测TERT基因启动子突变的试剂盒，其包括：
(1)特异性识别TERT基因启动子C228T位点突变的荧光标记探针，其供体探针和受体探针的核苷酸序列如下：
C228T突变的供体探针：5’-CGTCCCGACCCCTCCCGGGTC-Flc-3’
C228T突变的受体探针：5’-Lc640-GCCCAGCCCCTTCCGGGCCCT-Phos-3’
(2)特异性识别TERT基因启动子C250T位点突变的荧光标记探针，其供体探针和受体探针的核苷酸序列如下：
C250T突变的供体探针：5’-CGTCCCGACCCCTTCCGGGTC-Flc-3’
C250T突变的受体探针：5’-Lc640-GCCCAGCCCCCTCCGGGCCCT-Phos-3’
(3)检测TERT基因启动子C250T位点突变的特异性引物，其核苷酸序列如下：
上游引物：5’-CCCTTCACCTTCCAGCTC-3’
下游引物：5’-AGCGCTGCCTGAAACTGG-3’
(4)Master Mix，其包括：1×PCR缓冲液、0.2μM的dNTPs、1.5U/mg的one Taq DNA聚合酶和10ng的DNA模板；
(5)使用说明书一份。
实施例4
与实施例3相比，除Master Mix包括：1×PCR缓冲液、0.05μM的dNTPs、0.8U/mg的one Taq DNA聚合酶和15ng的DNA模板以外，其它与实施例3相同。
实施例5
与实施例3相比，除Master Mix包括：1×PCR缓冲液、1μM的dNTPs、0.5U/mg的oneTaq DNA聚合酶和20ng的DNA模板以外，其它与实施例3相同。
实施例6
与实施例3相比，除Master Mix包括：1×PCR缓冲液、0.6μM的dNTPs、8U/mg的oneTaq DNA聚合酶和5ng的DNA模板以外，其它与实施例3相同。
实施例7
利用实施例1的试剂盒检测TERT基因启动子突变，包括以下步骤：
(1)提取待测样品的尿液，离心提取尿液细胞，提取细胞全DNA，利用含有SEQ IDNO.5-6所示片段的特异性引物对模板DNA进行实时PCR扩增；
上游引物：5’-CCCTTCACCTTCCAGCTC-3’(SEQ ID NO.5)；
下游引物：5’-AGCGCTGCCTGAAACTGG-3’(SEQ ID NO.6)；
PCR扩增反应体系如下：1×PCR缓冲液、0.2μM的dNTPs、1.5U/mg的one Taq DNA聚合酶、10ng的DNA模板、特异性引物、供体探针和受体探针；
PCR反应条件如下：
(2)将步骤(1)扩增后的片段加入特异性识别TERT基因启动子C228T位点突变的荧光标记探针进行加温熔解；
C228T突变的供体探针：5’-CGTCCCGACCCCTCCCGGGTC-Flc-3’
C228T突变的受体探针：5’-Lc640-GCCCAGCCCCTTCCGGGCCCT-Phos-3’
加温熔解反应条件如下：
(3)通过得到的PCR产物的熔解曲线来判断TERT基因的突变情况。
检测原理如图1所示，从图1可以说明当检测TERT基因启动子存在突变时，突变特异性探针与基因组DNA特异性结合，而野生型DNA则因为有单点的不配对，而形成“泡”，从而显示较低的熔点。
检测结果如图2所示，从图2可以看出，如果目的基因TERT无点突变存在，则在探针与DNA之间出现单个非互补硷基，融解温度下降。
实施例8
利用实施例2的试剂盒检测TERT基因启动子突变，包括以下步骤：
(1)提取待测样品的尿液，离心提取尿液细胞，提取细胞全DNA，利用含有SEQ IDNO.5-6所示片段的特异性引物对模板DNA进行实时PCR扩增；
上游引物：5’-CCCTTCACCTTCCAGCTC-3’(SEQ ID NO.5)；
下游引物：5’-AGCGCTGCCTGAAACTGG-3’(SEQ ID NO.6)；
PCR扩增反应体系如下：1×PCR缓冲液、0.2μM的dNTPs、1.5U/mg的one Taq DNA聚合酶、10ng的DNA模板、特异性引物、供体探针和受体探针；
PCR反应条件如下：
(2)将步骤(1)扩增后的片段加入特异性识别TERT基因启动子C250T位点突变的荧光标记探针进行加温熔解；
C250T突变的供体探针：5’-CGTCCCGACCCCTTCCGGGTC-Flc-3’
C250T突变的受体探针：5’-Lc640-GCCCAGCCCCCTCCGGGCCCT-Phos-3’
加温熔解反应条件如下：
(3)通过得到的PCR产物的熔解曲线来判断TERT基因的突变情况。
实施例9
利用实施例3的试剂盒检测TERT基因启动子突变，包括以下步骤：
(1)提取待测样品的尿液，离心提取尿液细胞，提取细胞全DNA，利用含有SEQ IDNO.5-6所示片段的特异性引物对模板DNA进行实时PCR扩增；
上游引物：5’-CCCTTCACCTTCCAGCTC-3’(SEQ ID NO.5)；
下游引物：5’-AGCGCTGCCTGAAACTGG-3’(SEQ ID NO.6)；
PCR扩增反应体系如下：1×PCR缓冲液、0.2μM的dNTPs、1.5U/mg的one Taq DNA聚合酶、10ng的DNA模板、特异性引物、供体探针和受体探针；
PCR反应条件如下：
(2)将步骤(1)扩增后的片段加入特异性识别TERT基因启动子C228T和C250T位点突变的荧光标记探针进行加温熔解；
C228T突变的供体探针：5’-CGTCCCGACCCCTCCCGGGTC-Flc-3’
C228T突变的受体探针：5’-Lc640-GCCCAGCCCCTTCCGGGCCCT-Phos-3’
C250T突变的供体探针：5’-CGTCCCGACCCCTTCCGGGTC-Flc-3’
C250T突变的受体探针：5’-Lc640-GCCCAGCCCCCTCCGGGCCCT-Phos-3’
加温熔解反应条件如下：
(3)通过得到的PCR产物的熔解曲线来判断TERT基因的突变情况。
应用例：
通过对120例膀胱癌患者和120正常例人对照的尿液沉渣细胞的TERT基因突变的检测，并经测序验证，其中在尿液细胞中的敏感性：81.25％；特异性：100％；正确阳性率：100％；正确阴性率：92.3％。在TERT突变的膀胱癌中，C228T型突变约占膀胱癌TERT突变的98％；C250T型突变占2％。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测TERT基因启动子突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有特异性识别TERT基因启动子突变的荧光标记探针。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有特异性识别TERT基因启动子C228T位点突变、C250T位点突变或其组合的荧光标记探针；
优选地，所述荧光标记探针含有供体探针和受体探针；
优选地，所述特异性识别TERT基因启动子C228T位点突变的供体探针的核苷酸序列含有如SEQ ID NO.1所示的片段，所述特异性识别TERT基因启动子C228T位点突变的受体探针的核苷酸序列含有如SEQ ID NO.2所示的片段；
优选地，所述特异性识别TERT基因启动子C250T位点突变的供体探针的核苷酸序列含有如SEQ ID NO.3所示的片段，所述特异性识别TERT基因启动子C250T位点突变的受体探针的核苷酸序列含有如SEQ ID NO.4所示的片段。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有检测TERT基因启动子突变的特异性引物；
优选地，所述特异性引物的核苷酸序列含有如SEQ ID NO.5-6所示的片段。
4.根据权利要求1-3之一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2和DNA聚合酶；
优选地，所述dNTPs的浓度为0.05-1μM，优选为0.1-0.8μM，进一步优选为0.2μM；
优选地，所述DNA聚合酶的浓度为0.5-8U/mg，优选为1-5U/mg，进一步优选为1.5U/mg。
5.根据权利要求1-4之一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有使用说明书。
6.一种利用如权利要求1-5之一所述的用于检测TERT基因启动子突变的试剂盒在非疾病诊断和治疗目的中检测TERT基因启动子突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从待测样品中提取模板DNA 5-20ng，利用含有SEQ ID NO.5-6所示片段的特异性引物对所述模板DNA进行实时PCR扩增；
(2)将步骤(1)扩增后的片段加入含有如SEQ ID NO.1-2所示片段的荧光标记探针、含有如SEQ ID NO.3-4所示片段的荧光标记探针或其混合物中进行加温熔解；
(3)通过得到的PCR产物的熔解曲线来判断TERT基因的突变情况。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述待测样品为尿液细胞离心沉淀物和/或膀胱组织；
优选地，步骤(1)所述实时PCR扩增的条件为：
(a)95℃预变性4min，1循环；
(b)94℃变性20s、62℃退火20s、68℃延伸40s，55个循环；
(c)37℃延伸30s，1循环。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述加温熔解的条件为：95℃1min，62℃30s，45℃30s，40℃2min，再以0.1℃/秒的速度升高至70℃。
9.根据权利要求6-8之一所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述判断TERT基因的突变情况的方法为：
当预测熔点(63℃)±2.5℃范围内出现融解曲线峰，则待测样品含有C228T位点突变、C250T位点突变或其组合突变细胞克隆；
当预测熔点(58℃)±2.5℃范围内出现峰值，则待测样本为含有野生型细胞群。
10.根据权利要求1-5之一所述的用于检测TERT基因启动子突变的试剂盒在用于非疾病诊断和治疗目的的检测C228T位点突变、C250T位点突变或其组合突变中的应用。
CN201610497978.2A 2016-06-29 2016-06-29 一种用于检测tert基因启动子突变的试剂盒及其检测方法和应用 Pending CN106148516A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610497978.2A CN106148516A (zh) 2016-06-29 2016-06-29 一种用于检测tert基因启动子突变的试剂盒及其检测方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610497978.2A CN106148516A (zh) 2016-06-29 2016-06-29 一种用于检测tert基因启动子突变的试剂盒及其检测方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106148516A true CN106148516A (zh) 2016-11-23

Family

ID=57350401

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610497978.2A Pending CN106148516A (zh) 2016-06-29 2016-06-29 一种用于检测tert基因启动子突变的试剂盒及其检测方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106148516A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106967810A (zh) * 2017-04-14 2017-07-21 上海汇真生物科技有限公司 一种检测fgfr3基因突变以诊断膀胱癌的方法及试剂盒
CN111560436A (zh) * 2020-05-28 2020-08-21 郑成云 一种tert突变检测试剂盒及在肿瘤无创诊断中的应用
WO2021073029A1 (zh) * 2019-10-17 2021-04-22 湖南大地同年生物科技有限公司 一种膀胱癌驱动基因点突变和甲基化联合辅助诊断方法、试剂盒、系统及应用
CN112831550A (zh) * 2021-04-09 2021-05-25 中山市博爱医院 Tert基因启动子突变实时荧光定量pcr检测试剂及方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104805206A (zh) * 2015-04-29 2015-07-29 苏州工业园区为真生物医药科技有限公司 检测tert基因启动子突变的试剂盒及其检测方法
CN105331699A (zh) * 2015-11-05 2016-02-17 北京泛生子基因科技有限公司 检测人tert基因启动子突变的探针法及其试剂盒
CN105586422A (zh) * 2016-02-19 2016-05-18 苏州捷诺威生物科技有限公司 一种检测tert基因启动子突变的试剂盒、其检测方法及应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104805206A (zh) * 2015-04-29 2015-07-29 苏州工业园区为真生物医药科技有限公司 检测tert基因启动子突变的试剂盒及其检测方法
CN105331699A (zh) * 2015-11-05 2016-02-17 北京泛生子基因科技有限公司 检测人tert基因启动子突变的探针法及其试剂盒
CN105586422A (zh) * 2016-02-19 2016-05-18 苏州捷诺威生物科技有限公司 一种检测tert基因启动子突变的试剂盒、其检测方法及应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ELAINE LYON: "Mutation detection using fluorescent hybridization probes and melting curve analysis", 《EXPERT REVIEW OF MOLECULAR DIAGNOSTICS》 *
怕西恩等: "《分子微生物学诊断原理与实践》", 31 August 2008, 中山大学出版社 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106967810A (zh) * 2017-04-14 2017-07-21 上海汇真生物科技有限公司 一种检测fgfr3基因突变以诊断膀胱癌的方法及试剂盒
CN106967810B (zh) * 2017-04-14 2020-07-24 上海汇真生物科技有限公司 一种检测fgfr3基因突变以诊断膀胱癌的方法及试剂盒
WO2021073029A1 (zh) * 2019-10-17 2021-04-22 湖南大地同年生物科技有限公司 一种膀胱癌驱动基因点突变和甲基化联合辅助诊断方法、试剂盒、系统及应用
CN111560436A (zh) * 2020-05-28 2020-08-21 郑成云 一种tert突变检测试剂盒及在肿瘤无创诊断中的应用
CN112831550A (zh) * 2021-04-09 2021-05-25 中山市博爱医院 Tert基因启动子突变实时荧光定量pcr检测试剂及方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Stutterheim et al. PHOX2B is a novel and specific marker for minimal residual disease testing in neuroblastoma
US7709233B2 (en) Method enabling use of extracellular RNA extracted from plasma or serum to detect, monitor or evaluate cancer
KR101987358B1 (ko) 신규한 간암 진단용 바이오 마커 및 이의 용도
CN106148516A (zh) 一种用于检测tert基因启动子突变的试剂盒及其检测方法和应用
CN105586422A (zh) 一种检测tert基因启动子突变的试剂盒、其检测方法及应用
US20090136942A1 (en) Analysis of Extracellular RNA
CN104593520B (zh) 一种肺癌miRNA检测试剂盒及其miRNA的应用
CN104805206A (zh) 检测tert基因启动子突变的试剂盒及其检测方法
CN106795563A (zh) 用于快速并且灵敏地检测热点突变的方法
CN105745335A (zh) 用于对cMET核酸进行多模态分析的组合物及方法
US20090111097A1 (en) Comparative Analysis of Extracellular RNA Species
US11279982B2 (en) EGFR assay
CN106480201A (zh) 乳腺癌转移评估试剂盒
JP6453781B2 (ja) ヒトｐｉ３ｋｃａ（ｐｉｋ３ｃａ）遺伝子変異検出のための方法及び組成物
CN105705655A (zh) 用于对nras和braf核酸进行多重分析的组合物及方法
Zaytseva et al. Methodological challenges of digital PCR detection of the histone H3 K27M somatic variant in cerebrospinal fluid
CN103103259A (zh) 确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法、试剂盒以及引物
CN107641649B (zh) 检测微卫星nr27位点稳定性的引物对、试剂盒及方法
CN106967810A (zh) 一种检测fgfr3基因突变以诊断膀胱癌的方法及试剂盒
CN104450702B (zh) 一种血清miRNA生物标志物组合物与应用
WO2020134950A1 (zh) 用于肺结节良恶性鉴别的基因突变/融合组合及试剂盒
CN108424962A (zh) 系膜增生性肾小球肾炎的miRNA检测标志物及其诊断试剂盒
CN106460047B (zh) 用于鉴定癌前结肠直肠息肉和结肠直肠癌的方法及试剂盒
WO2016205911A1 (pt) Método de detecção in vitro de câncer de tireoide em um paciente, método in vitro de diferenciação entre câncer de tireoide e tecido de tireoide normal ou de lesões benignas de tireoide, uso de um conjunto de genes, método de obtenção de dados para direcionamento do tratamento do cancer de tireoide, kit laboratorial e dispositivo para classificar uma amostra biológica de glândula tireoide como maligna ou benigna
CN102676661B (zh) 基于荧光偏振的ERCC1基因第ll8位密码子单核苷酸多态性均相检测法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: 201203 Shanghai city Pudong New Area free trade zone Zuchongzhi Road No. 865 building 4

Applicant after: Shanghai Hui Sheng Biotechnology Co., Ltd.

Address before: Xinghu Street Industrial Park of Suzhou city in Jiangsu province 215000 No. 218 building 610 room B2

Applicant before: SUZHOU JIENUOWEI BIOTECHNOLOGY CO., LTD.

RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20161123