CN106967810A - 一种检测fgfr3基因突变以诊断膀胱癌的方法及试剂盒 - Google Patents
一种检测fgfr3基因突变以诊断膀胱癌的方法及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种通过分子生物学检测手段诊断膀胱癌的技术,具体提供一种通过检测FGFR3基因突变以诊断膀胱癌的方法及试剂盒,其包括FGFR3基因的外显子7、外显子10和外显子15进行检测,以确定上述外显子中是否存在突变。经过双盲筛试验,本发明所述试剂盒对膀胱癌的阳性检出率为91.18%、假阳性率为3.23%,具有良好的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明属于疾病临床诊断领域,具体涉及一种通过分子生物学检测手段诊断膀胱癌的技术,尤其涉及一种通过检测FGFR3基因突变以诊断膀胱癌的方法及试剂盒。
背景技术
膀胱尿路上皮癌是泌尿道的最常见的恶性肿瘤。癌发病率水平在全国32个肿瘤登记处的合计为6.69/10万,占全部恶性肿瘤新发病例的2.52%。按性别统计,膀胱癌男、女性发病率分别为10.10/10万和3.20/10万,男性是女性的3.16倍。膀胱癌死亡率水平在全国32个肿瘤登记中为2.53/10万,占全部恶性肿瘤死亡总数的1.47%。
FGFR3可导致酪氨酸激酶受体基因激活,触发几种下游激酶途径,导致细胞转化。是尿路上皮癌的最常见的突变,FGFR3突变被发现于80%的低度恶性膀胱性尿路上皮癌和20%的高度恶性膀胱尿路上皮癌中,总突变率为40-50%。现在已经被认定为膀胱癌的驱动突变,其突变的检测为膀胱癌的诊断提供了较好的目标基因。
目前临床上通过尿液进行膀胱癌的早期诊断的方法主要包括:尿液分析、尿脱落细胞分析,超声、CT或MRI成像等。特异性膀胱肿瘤标志物是实现快速、便捷、检测的重要手段,CN106093389A、CN103018461B等致力于通过血清学方法对尿样进行检测来诊断膀胱癌;CN104620109A、CN105779641A、CN105229169A等主要在基因水平通过检测膀胱肿瘤标志物诊断膀胱癌。
然而,现有技术中膀胱癌肿瘤标记物众多,各检测指标的检测效果和检出率变异较大。一方面,为使检测结果具有临床诊断意义,必须要综合使用大量标记物,但另一方面,应用了大量标记物不但费时耗力、价格昂贵,而且各标记物的诊断结果之间往往不一致难以给出具有临床价值的诊断结论。此较成熟的无创筛查和监测膀胱癌尿基标记物,如食品和药物管理局(FDA)批准的Immunocy,核基质蛋白22,和荧光原位杂交(FISH)具有较为确定的临床诊断意义,然而仍需要更方便、快捷,临床意义明确的诊断方法。
发明内容
针对现有技术中的不足,本发明所要解决的技术问题是提供一种临床价值明确,操作简单快捷、结果直观可靠、以尿液为检测材料的无创伤膀胱癌早期临床诊断方法和试剂盒。
发明概述
一方面,本发明提供FGFR3基因的检测试剂在制备膀胱癌诊断试剂盒中的应用,其中所述FGFR3基因检测试剂选自由以下组成的组:外显子7的检测试剂、外显子10的检测试剂和外显子15的检测试剂,优选所述检测试剂为实时荧光PCR试剂。
本发明所述的应用,其中针对每种外显子的检测试剂都包括一组探针和引物,所述探针包括供体探针和受体探针,其中供体探针3’端标记有荧光供体,所述受体探针的5’端标记有荧光受体、3’端进行磷酸化修饰;上游引物和下游引物分别位于探针结合位点的两侧。
本发明所述的应用,其中外显子7的检测试剂能够检测FGFR3基因外显子7中248-249位点的突变,外显子10的检测试剂能够检测FGFR3基因外显子10中366-379位点的突变,外显子15的检测试剂能够检测FGFR3基因外显子15中650-653位点的突变。
本发明所述的应用,其中外显子7的检测试剂包括SEQ ID NO:1-2、外显子10的检测试剂包括SEQ ID NO:3-4、外显子15的检测试剂包括SEQ ID NO:5-6。
本发明所述的应用,其中外显子7的检测试剂还包括SEQ ID NO:7-8、外显子10的检测试剂还包括SEQ ID NO:9-10、外显子15的检测试剂还包括SEQ ID NO:11-12。
第二方面,本发明提供一种实时荧光PCR检测试剂盒,其特征在于包括FGFR3基因检测试剂,所述FGFR3基因检测试剂选自由以下组成的组:外显子7检测试剂、外显子10检测试剂和外显子15检测试剂,优选所述检测试剂为实时荧光PCR试剂。
本发明所述试剂盒,其中针对每种外显子的检测试剂都包括一组探针和引物,所述探针包括供体探针和受体探针,其中供体探针3’端标记有荧光供体,所述受体探针的5’端标记有荧光受体、3’端进行磷酸化修饰;上游引物和下游引物分别位于探针结合位点的两侧。
本发明所述的试剂盒,其中外显子7的检测试剂能够检测FGFR3基因外显子7中248-249位点的突变,外显子10的检测试剂能够检测FGFR3基因外显子10中366-379位点的突变,外显子15的检测试剂能够检测FGFR3基因外显子15中650-653位点的突变。
本发明所述的试剂盒,其中外显子7的检测试剂包括SEQ ID NO:1-2、外显子10的检测试剂包括SEQ ID NO:3-4、外显子15的检测试剂包括SEQ ID NO:5-6。
本发明所述的试剂盒,其中外显子7的检测试剂还包括SEQ ID NO:7-8、外显子10的检测试剂还包括SEQ ID NO:9-10、外显子15的检测试剂还包括SEQ ID NO:11-12。
发明详述
除另有说明以外,本发明所用术语均是本领域常规的含义,对术语的解释可参考例如萨姆布鲁克等主编的《分子克隆(第三版)》。对本发明的技术内容进行详述如下:
第一方面,本发明提供了一种检测FGFR3基因外显子7中的248-249位点突变、外显子10中366-379位点突变、外显子15中650-653位点突变的试剂盒,所述试剂盒含有特异性识别FGFR3基因外显子突变的荧光标记探针。
本发明中,当检测FGFR3基因存在突变时,突变特异性探针与基因组DNA特异性结合,而野生型DNA则因为有单点的不配对,形成“泡”,从而显示较低的熔点。
在膀胱癌FGFR3基因外显子突变中,特异性FGFR3基因外显子7的突变占50-80%,外显子10占15-40%,外显子15占5-10%。发明人进一步发现,三型突变之和约占膀胱癌FGFR3突变的99%。在此研究基础上,可以实现对膀胱癌的精准检测。
根据本发明,所述试剂盒含有特异性识别FGFR3基因外显子7中248-249位点突变、外显子10中366-379位点突变、外显子15中650-653位点突变或其组合的荧光标记探针。
具体地,所述试剂盒可以只含有特异性识别FGFR3基因外显子7中248-249位点突变的荧光标记探针,可以只含有特异性识别FGFR3基因外显子10中366-379位点突变的荧光标记探针,也可以只含有特异性识别FGFR3基因外显子15中650-653位点突变的荧光标记探针,或者是同时含有特异性识别三种或其中两型位点突变的荧光标记探针。
本发明中,当采用同时含有识别FGFR3特异性三型外显子基因突变的三对荧光标记探针时,相比采用单一的荧光标记探针,其能够大大增加对膀胱癌FGFR3基因外显子突变的检测效率,并提高检测准确率,使检测准确率接近99%。
根据本发明,所述荧光标记探针含有供体探针和受体探针,例如特异性识别FGFR3基因外显子7中248-249位点突变的供体探针,含有特异性识别FGFR3基因外显子7中248-249位点突变的受体探针;特异性识别外显子10中366-379位点突变的供体探针,特异性识别外显子10中366-379位点突变的受体探针;含有特异性识别外显子15中650-653位点突变的供体探针,特异性识别外显子15中650-653位点突变的受体探针。
本发明中特异性识别FGFR3基因外显子7中248-249位点突变的供体探针,其核苷酸序列含有如SEQ ID NO.1所示的片段,所述特异性识别FGFR3基因外显子7中248-249位点突变的受体探针的核苷酸序列含有如SEQ ID NO.2所示的片段;
本发明中特异性识别FGFR3基因外显子10中366-379位点突变的供体探针的核苷酸序列含有如SEQ ID NO.3所示的片段,所述特异性识别外显子10中366-379位点突变的受体探针的核苷酸序列含有如SEQ ID NO.4所示的片段。
本发明中特异性识别FGFR3基因外显子15中650-653位点突变的供体探针的核苷酸序列含有如SEQ ID NO.5所示的片段,所述特异性识别外显子15中650-653位点突变的受体探针的核苷酸序列含有如SEQ ID NO.6所示的片段。
本发明中,所述SEQ ID NO.1-6荧光标记探针含有的氨基酸序列优选采用如下序列:
SEQ ID NO.1:5’-ACAGAGCGCTCCCCGCACCGG-Flc-3’
SEQ ID NO.2:5’-Lc640-ATCCTGCAGGCGGGGCTGCCG-Phos-3’
SEQ ID NO.3:5’-GAGCTGGTGGAGGCTGACGAG-Flc-3’
SEQ ID NO.4:5’-Lc640-GGCAGTGTGTATGCAGGCATCC-Phos-3’
SEQ ID NO.5:5’-GACCCCCACCCCCGCACCC-Flc-3’
SEQ ID NO.6:5’-Lc640-GGCCGGGCTCACGTTGGTCGTCTTC-Phos-3’
此外本发明中特异性识别FGFR3基因外显子7中248-249位点突变的核苷酸序列含有如SEQ ID NO.7-8所示的片段
本发明中特异性识别FGFR3基因外显子10中366-379位点突变的核苷酸序列含有如SEQ ID NO.9-10所示的片段
本发明中特异性识别FGFR3基因外显子15中650-653位点突变的核苷酸序列含有如SEQ ID NO.11-12所示的片段
本发明中含有的检测FGFR3基因三型突变的特异性引物序列如下;
SEQ ID NO.7:5’-GAGCGTCATCTGCCCC-3’
SEQ ID NO.8:5’-GTCACTGCGTGTCGGGGT-3’
SEQ ID NO.9:5’-AGGCCTCAACGCCCATGT-3’
SEQ ID NO.10:5’-GAGCCCAGGCCTTTCTTG-3’
SEQ ID NO.11:5’-AGGCCTCAACGCCCATGT-3’
SEQ ID NO.12:5’-GAGCCCAGGCCTTTCTTG-3’
根据本发明,所述试剂盒含有检测FGFR3的Master Mix,例如还含有实时荧光定量PCR技术中涉及到的OneTaq DNA聚合酶、dNTPs。本发明中的Master Mix试剂浓度和反应参数均经过优化和验证,并含有阳性和阴性对照DNA样本。
本发明中,所有试剂包括荧光标记探针、特异性引物、PCR缓冲液和dNTPs(除酶之外)均已混合,作为“主液”,不需要单独配制,极大地方便用户操作。
本发明中所述Master Mix为4×浓度,其包括优化后的PCR反应所需缓冲液、dNTPs和One Taq DNA聚合酶。
根据本发明,所述dNTPs的浓度为0.05-1μM,例如可以是0.05μM、0.06μM、0.08μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM或1μM,以及上述数值之间的具体点值,限于篇幅及出于简明的考虑,本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
本发明中,所述dNTPs的浓度优选为0.1-0.8μM,进一步优选为0.2μM。
根据本发明,所述DNA聚合酶的浓度为0.5-8U/mg,例如可以是0.5U/mg、0.6U/mg、0.7U/mg、0.8U/mg、1U/mg、1.2U/mg、1.5U/mg、2U/mg、2.5U/mg、3U/mg、3.5U/mg、4U/mg、4.5U/mg、5U/mg、5.5U/mg、6U/mg、6.5U/mg、7U/mg、7.5U/mg或8U/mg,以及上述数值之间的具体点值,限于篇幅及出于简明的考虑,本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
本发明中,所述DNA聚合酶优选为One Taq DNA聚合酶,其浓度优选为0.5-8U/mg,进一步优选为1.5U/mg。
根据本发明,所述试剂盒还含有介绍该试剂盒的使用说明书。
第二方面,本发明提供了一种利用如第一方面所述的用于检测FGFR3基因突变的试剂盒在非疾病诊断和治疗目的中检测FGFR3基因突变的方法,其包括以下步骤:
(1)从筛选的病例尿液样本中离心提取尿液细胞;
(2)从尿液细胞中提取全基因组DNA 5-20ng,利用含有SEQ ID NO.7-8,SEQ IDNO.9-10,SEQ ID NO.11-12所示片段的特异性引物对所述模板DNA进行实时PCR扩增;
(3)将步骤(2)扩增后的片段分别加入含有如SEQ ID NO.1-2,SEQ ID NO.3-4,SEQID NO.5-6所示片段的荧光标记探针或其混合物中进行加温熔解;
(4)通过得到的PCR产物的熔解曲线来判断FGFR3基因的突变情况。
根据本发明,所述检测FGFR3基因外显子突变的方法主要用于膀胱癌的诊断和治疗,在具体检测时,可以从尿液离心沉淀细胞中检测FGFR3基因外显子7、10、15的特异性突变,也可以是从膀胱组织活检标本中实现对FGFR3基因外显子7、10、15的特异性突变的检测,对于检测样品以及模板DNA的来源也可以采用其它途径。
本发明中,步骤(1)所述待测样品优选为尿液细胞离心沉淀物和/或膀胱组织,因此,所述模板DNA优选来自于尿液细胞沉淀物和/或膀胱组织活检标本。
根据本发明,步骤(2)所述实时PCR扩增的条件为:
(a)95℃预变性4min,1循环;
(b)94℃变性20s、58℃退火20s、68℃延伸40s,50个循环;
(c)37℃延伸30s,1循环。
根据本发明,步骤(3)所述加温熔解的条件为:95℃1min,62℃30s,45℃30s,40℃2min,再以0.1℃/秒的速度升高至70℃。
本发明中,所述试剂盒由特异性DNA引物和荧光标记的激发探针与被激发探针构成,被激发探针3’磷酸化以防止其延伸,在PCR反应过程中,如无目标点突变,则探针与DNA100%互补,从而表现为一定的温度融解。
根据本发明,步骤(4)所述判断FGFR3基因的突变情况的方法为:
当预测熔点(55.7℃)±1℃范围内出现熔融曲线峰,则待测样品含有FGFR3三型突变之一或其组合的细胞克隆。
当预测熔点(52.8℃)±1℃范围内出现熔融峰,而(55.7℃)±1℃缺乏熔融曲线峰时,则待测样本为含有野生型细胞群。
当两个熔融曲线峰存在,分别位于(55.7℃)±1℃和(52.8℃)±1℃,则待测样本含有混合细胞群,即含有相应突变克隆,三型突变以及野生型非突变细胞。
第三方面,本发明提供了如第一方面所述的用于检测FGFR3基因外显子三型突变的试剂盒在用于非疾病诊断和治疗目的的检测FGFR3基因外显子7中248-249位点突变、外显子10中366-379位点突变、外显子15中650-653位点突变或其组合突变中的应用。
与现有技术相此,本发明的优点在于:
(1)三型突变的组合,覆盖率高,有效弥补了单一靶标荧光定量PCR的不足。经验证,FGFR3基因外显子三型突变的组合,即外显子7中248-249位点突变、外显子10中366-379位点突变、外显子15中650-653位点突变,在膀胱癌群体中的阳性率超过了90%,而假阳性率仅在6%左右,针对上述位点进行检测能够有效的实现膀胱癌的筛选。
(2)融合了普通荧光PCR检测和多重荧光PCR检测的优点。引物探针的设计中采用了相同的荧光标记方案,同时使扩增产物大小相似,既避免了多重荧光PCR中采用多种荧光的技术复杂性,又确保了对多种靶标的同时检测。只要三个外显子中任意一个携带突变,就能获得阳性结果。
(3)结果判断简单、明确。由于本申请虽然针对三个外显子靶标进行检测,三个外显子靶标中1个、2个或3个存在突变都表现为阳性结果,没有突变则为阴性结果。不需要对每个靶标的检测结果引入复杂的结果分析模型进行分析即可做出诊断,特别适用于快速筛查。
附图说明
图1:为本发明试剂盒检测原理图。
图2:阳性对照样本(膀胱癌细胞系)的检测结果,出现55.7℃的熔融曲线峰。
图3:正常尿液样本检测结果,出现52.8℃的熔融曲线峰。
图4:早期膀胱癌患者尿液样本检测结果,形成两个分别对应55.7℃、52.8℃的熔融曲线峰。
具体实施方式
以下结合具体实施例,进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
用于检测FGFR3基因外显子7突变的试剂盒,其包括:
(1)特异性识别FGFR3基因外显子7中248-249位点突变的荧光标记探针,其供体探针和受体探针的核苷酸序列如下:
248-249位点突变的供体探针:5’-ACAGAGCGCTCCCCGCACCGG-Flc-3’
248-249位点突变的受体探针:5’-Lc640-ATCCTGCAGGCGGGGCTGCCG-Phos-3’
(2)检测FGFR3基因外显子7中248-249位点突变的特异性引物,其核苷酸序列如下:
上游引物:5’-GAGCGTCATCTGCCCC-3’
下游引物:5’-GTCACTGCGTGTCGGGGT-3’
(3)Master Mix,其包括:1PCR缓冲液、0.2μM的dNTPs、1.5U/mg的one Taq DNA聚合酶和10ng的DNA模板;
(4)使用说明书一份。
实施例2
用于检测FGFR3基因外显子10中366-379位点突变的试剂盒,其包括:
(1)特异性识别FGFR3基因外显子10中366-379位点突变的荧光标记探针,其供体探针和受体探针的核苷酸序列如下:
366-379位点突变的供体探针:5’-GAGCTGGTGGAGGCTGACGAG-Flc-3’
366-379位点突变的受体探针:5’-Lc640-GGCAGTGTGTATGCAGGCATCC-Phos-3’
(2)检测FGFR3基因外显子10中366-379位点突变的特异性引物,其核苷酸序列如下:
上游引物:5’-AGGCCTCAACGCCCATGT-3’
下游引物:5’-GAGCCCAGGCCTTTCTTG-3’
(3)Master Mix,其包括:1PCR缓冲液、0.2μM的dNTPs、1.5U/mg的one Taq DNA聚合酶和10ng的DNA模板;
(4)使用说明书一份。
实施例3
用于检测FGFR3基因外显子15中650-653位点突变的试剂盒,其包括:
(1)特异性识别FGFR3基因外显子15中650-653位点突变的荧光标记探针,其供体探针和受体探针的核苷酸序列如下:
650-653位点突变的供体探针:5’-GACCCCCACCCCCGCACCC-Flc-3’
650-653位点突变的受体探针:5’-Lc640-GGCCGGGCTCACGTTGGTCGTCTTC-Phos-3’
(2)检测FGFR3基因外显子15中650-653位点突变的特异性引物,其核苷酸序列如下:
上游引物:5’-AGGCCTCAACGCCCATGT-3’
下游引物:5’-GAGCCCAGGCCTTTCTTG-3’
(3)Master Mix,其包括:1PCR缓冲液、0.2μM的dNTPs、1.5U/mg的one Taq DNA聚合酶和10ng的DNA模板;
(4)使用说明书一份。
实施例4
联合检测FGFR3基因外显子7、10、15突变的试剂盒。
(1)特异性识别FGFR3基因外显子7中248-249位点突变、外显子10中366-379位点突变、外显子15中650-653位点突变的荧光标记探针。
外显子7中第248-249位点突变的供体探针:5’-ACAGAGCGCTCCCCGCACCGG-Flc-3’;
外显子7中第248-249位点突变的受体探针:5’-Lc640-ATCCTGCAGGCGGGGCTGCCG-Phos-3’;
外显子10中第366-379位点突变的供体探针:5’-GAGCTGGTGGAGGCTGACGAG-Flc-3’;
外显子10中第366-379位点突变的受体探针:5’-Lc640-GGCAGTGTGTATGCAGGCATCC-Phos-3’;
外显子15中第650-653位点突变的供体探针:5’-GACCCCCACCCCCGCACCC-Flc-3’;
外显子15中第650-653位点突变的受体探针:5’-Lc640-GGCCGGGCTCACGTTGGTCGTCTTC-Phos-3’;
所述6种荧光标记探针混合包装于同一容器中。
(2)同时扩增FGFR3基因外显子7、10、15突变片段的试剂盒。
外显子7突变片段上游引物:5’-GAGCGTCATCTGCCCC-3’
外显子7突变片段下游引物:5’-GTCACTGCGTGTCGGGGT-3’
外显子10突变片段上游引物:5’-AGGCCTCAACGCCCATGT-3’
外显子10突变片段下游引物:5’-GAGCCCAGGCCTTTCTTG-3’
外显子15突变片段上游引物:5’-AGGCCTCAACGCCCATGT-3’
外显子15突变片段下游引物:5’-GAGCCCAGGCCTTTCTTG-3’
所述三对引物混合包装于同一容器中。
(3)Master Mix,其包括:1PCR缓冲液、0.2μM的dNTPs、1.5U/mg的one Taq DNA聚合酶和10ng的DNA模板;
(4)使用说明书一份。
实施例5
利用实施例1-4的试剂盒检测FGFR3基因点突变进行检测,包括以下步骤:
(1)提取待测样品的尿液,离心提取尿液细胞,提取细胞全DNA,利用含有特异性引物对模板DNA进行实时PCR扩增;
PCR扩增反应体系如下:1PCR缓冲液、0.2μM的dNTPs、1.5U/mg的one Taq DNA聚合酶、10ng的DNA模板、特异性引物、供体探针和受体探针;
PCR反应条件如下:
(2)将步骤(1)扩增后的片段加入特异性荧光标记探针进行加温熔解;
加温熔解反应条件如下:
(3)通过得到的PCR产物的熔解曲线来判断FGFR3基因的位点突变情况。
检测原理如图1所示,从图1可以说明当检测FGFR3存在位点突变时,突变特异性探针与基因组DNA特异性结合,而野生型DNA则因为有单点的不配对,而形成“泡”,从而显示较低的熔点。
检测结果如图2-4所示,如果目的基因FGFR3上存在上述点突变,探针与扩增产物之间完全配对熔解温度较高,为55.7℃;如果目的基因FGFR3无上述点突变存在,则在探针与DNA之间出现单个非互补硷基,融解温度较低,为52.8℃。如果同时出现55.7℃的熔解峰和52.8℃的熔解峰,则表明样本中即存在FGFR3上述位点的发生突变的癌变细胞,也存在FGFR3上述位点未发生突变的野生型正常细胞。
实施例6:
临床样本双盲筛检测
采集68例临床确诊患有早期膀胱癌患者的尿液样本,以30例正常人体检留存尿液样本作为对照,进行检测。以实施例1的试剂盒进行检测,检出55例阳性样本,检出率为80.88%;以实施例2的试剂盒进行检测,检出8例阳性样本,检出率为11.76%;以实施例3的试剂盒进行检测,检出6例阳性样本,检出率为8.22%。
以实施例4的试剂盒进行检测,检出62例阳性样本,综合检出率为91.18%;30个正常样本中2例检出阳性,假阳性率约为3.23%。上述结果表明,同时对FGFR3基因外显子7、10、15的突变进行检测是最优选的技术方案,检出率高、假阳性率低特别适合于膀胱癌的临床筛查。
上述说明并非对本发明的限制,本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内,作出的变化、改型、添加或替换,也应属于本发明的保护范围,本发明的保护范围以权利要求书为准。
序 列 表
<110> 申请人名称
<120> 一种检测FGFR3基因突变以诊断膀胱癌的方法及试剂盒
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acagagcgct ccccgcaccg g 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atcctgcagg cggggctgcc g 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gagctggtgg aggctgacga g 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggcagtgtgt atgcaggcat cc 22
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gacccccacc cccgcaccc 19
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggccgggctc acgttggtcg tcttc 25
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gagcgtcatc tgcccc 16
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gtcactgcgt gtcggggt 18
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
aggcctcaac gcccatgt 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gagcccaggc ctttcttg 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
aggcctcaac gcccatgt 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gagcccaggc ctttcttg 18
Claims (10)
1.FGFR3基因的检测试剂在制备膀胱癌诊断试剂盒中的应用,其中所述FGFR3基因检测试剂选自由以下组成的组:外显子7的检测试剂、外显子10的检测试剂和外显子15的检测试剂。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于针对每种外显子的检测试剂都包括一组探针和引物,所述探针包括供体探针和受体探针,其中供体探针3’端标记有荧光供体,所述受体探针的5’端标记有荧光受体、3’端进行磷酸化修饰;上游引物和下游引物分别位于探针结合位点的两侧。
3.如权利要求1或2所述的应用,其特征在于外显子7的检测试剂能够检测FGFR3基因外显子7中248-249位点的突变,外显子10的检测试剂能够检测FGFR3基因外显子10中366-379位点的突变外显子15的检测试剂能够检测FGFR3基因外显子15中650-653位点的突变。
4.如权利要求1或2任一所述的应用,其特征在于外显子7的检测试剂包括SEQ ID NO:1-2、外显子10的检测试剂包括SEQ ID NO:3-4、外显子15的检测试剂包括SEQ ID NO:5-6。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于外显子7的检测试剂还包括SEQ ID NO:7-8、外显子10的检测试剂还包括SEQ ID NO:9-10、外显子15的检测试剂还包括SEQ ID NO:11-12。
6.一种实时荧光PCR检测试剂盒,其特征在于包括FGFR3基因检测试剂,所述FGFR3基因检测试剂选自由以下组成的组:外显子7检测试剂、外显子10检测试剂和外显子15检测试剂,优选所述检测试剂为实时荧光PCR试剂。
7.如权利要求6所述试剂盒,其特征在于针对每种外显子的检测试剂都包括一组探针和引物,所述探针包括供体探针和受体探针,其中供体探针3’端标记有荧光供体,所述受体探针的5’端标记有荧光受体、3’端进行磷酸化修饰;所述引物包括上游引物和下游引物,上游引物和下游引物分别位于探针结合位点的两侧。
8.如权利要求6或7所述的试剂盒,其特征在于外显子7的检测试剂能够检测FGFR3基因外显子7中248-249位点的突变,外显子10的检测试剂能够检测FGFR3基因外显子10中366-379位点的突变,外显子15的检测试剂能够检测FGFR3基因外显子15中650-653位点的突变。
9.如权利要求6或7所述的试剂盒,其特征在于外显子7的检测试剂包括SEQ ID NO:1-2、外显子10的检测试剂包括SEQ ID NO:3-4、外显子15的检测试剂包括SEQ ID NO:5-6。
10.如权利要求9所述的试剂盒,其特征在于外显子7的检测试剂还包括SEQ ID NO:7-8、外显子10的检测试剂还包括SEQ ID NO:9-10、外显子15的检测试剂还包括SEQ ID NO:11-12。
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