CN109680061A - 与人膀胱癌相关的遗传标记、其检测方法及用途 - Google Patents

与人膀胱癌相关的遗传标记、其检测方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种与人膀胱癌相关的遗传标记、其检测方法及用途，所述遗传标记位于ZNF83基因序列内，在该遗传标记处发生基因突变，突变位点选自chr19:57808752T>A、chr19:57808761T>C和chr19:57808819G>T中的一个或多个。ZNF83基因的突变是膀胱癌预后差的指标之一；ZNF83基因的突变可以作为膀胱癌诊断的一个辅助指标；ZNF83基因可以作为治疗膀胱癌的一个新的作用靶点。

Description

与人膀胱癌相关的遗传标记、其检测方法及用途
技术领域
本发明涉及肿瘤技术领域，具体涉及与人膀胱癌相关的遗传标记、其检测方法及用途。
背景技术
在全世界各个国家和地区，膀胱癌是一种最常见泌尿生殖系统恶性肿瘤。据估计，仅在2008年单年度就有386300例新发病例和150200例死亡病例。过去的研究表明，膀胱癌是一个具有较高异质性的疾病，它有两个不同亚型(浅表型和侵入型)，其临床表现多变和遗传背景复杂。最近，我们开展的一项研究结果表明，在膀胱移行细胞癌中，有八个染色质重塑基因(UTX，MLL-MLL3，CREBBP-EP300，NCOR1，ARIDIA和CHD6)存在频发突变。然而，目前我们对膀胱癌的体细胞突变情况仍缺乏系统的认识，我们对膀胱癌发生过程中的关键“驱动基因”也知之甚少。
在过去的几年中，一些与膀胱癌进程相关的分子标志物如细胞增殖(EFGR)、新生血管形成(如HIF-lα)、细胞粘附(如钙粘附素和β-链蛋白)、细胞凋亡(如Bcl-2)和细胞周期控制(P53)等推动着膀胱癌的临床实践向前发展。但是多变量分析证明p53并不能作为独立的预后指标。虽然肿瘤的分期以及肿瘤的病理学分级仍被认为是最可信的临床结果预测指标。然而，其它一些肿瘤研究却表明，用分子标志物判断生存预后要比病理学分级更好。为了证明在预后生存方面分子标志物优于病理学分级，在这项发明中，我们并不是简单的选择性的测试几个基因序列，而是以全基因组mRNA表达谱为基础尽可能找出与预后有关的所有基因。
为了确定这些突变基因与膀胱癌发生的相关性，我们采用过去研究中所描述的统计学方法分析了每个基因的体细胞突变率是否显著高于整个基因组的背景突变率。通过该分析，我们一共发现了37个显著突变基因(图1)，其中包括7个已知膀胱癌的基因(Tp53，HRAS，FGFR3，PIK3CA，RB1，KRAS和TSCl)以及我们过去所发现的八个染色质重塑基因(UTX，MLL-MLL3，CREBBP-EP300，NCOR1，ARIDIA和CHD6)。此外，我们还分析了染色质重塑相关基因和基因家族的突变情况，并在膀胱癌中观察到多个其他染色质重塑基因的频发突变，包括组蛋白脱甲基酶基因UTX/UTY(30％)，核染色质重塑基因ARID1A/4A(17％)，组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因MLL/MLL3/MLLS(16％)，组蛋白乙酞转移酶基因EP300/400(15％)，SWI/SNF复合体相关基因SMARCA4/Cl(7％)和组蛋白脱甲基酶基因JARID1A/B(6％)。
发明内容
本申请提供一种与人膀胱癌相关的遗传标记、其检测方法及用途。
根据第一方面，一种实施例中提供一种与人膀胱癌相关的遗传标记，位于ZNF83基因序列内，在该遗传标记处发生基因突变，突变位点选自chr19:57808752T>A、chr19:57808761T>C和chr19:57808819G>T中的一个或多个。
根据第二方面，一种实施例中提供一种检测ZNF83基因突变的方法，包括如下步骤：
(1)分别提取肿瘤组织DNA和外周血DNA；
(2)对步骤(1)中提取的两种DNA分别进行全基因组测序和全外显子测序；
(3)对步骤(2)的测序结果进行全外显子组序列比对与体细胞突变检测，得到突变基因；
(4)采用Sanger测序来验证步骤(3)所得突变基因的体细胞替换、插入和/或缺失；
(5)突变基因为显著突变基因的鉴定。
进一步地，所述基因突变位点选自chr19:57808752T>A、chr19:57808761T>C和chr19:57808819G>T中的一个或多个。
进一步地，所述步骤(2)中的全基因组测序方式为双末端测序，测序读长为100bp。
进一步地，所述步骤(2)中的全外显子组测序过程包括对肿瘤组织DNA和外周血DNA进行随机打断，捕获全外显子组序列；全外显子组测序方式为双末端测序，测序读长为100bp。
进一步地，所述步骤(3)具体包括：
(a)去除含有测序接头和包含五个以上未知碱基的低质量序列，用BWA在容缺口模式下将其余的高质量双末端测序序列比对到人类参考基因组；
(b)随后用基因组分析工具包GATK对BWA的比对结果进行局部重新比对；
(c)根据BWA的比对结果，利用VarSCan找出所有潜在的体细胞替换位点。
进一步地，所述步骤(4)具体包括：
对肿瘤组织DNA与外周血DNA分别进行PCR扩增，扩增产物经Sanger测序得到突变位点。
进一步地，所述PCR扩增的引物为：
正向引物：5′-GGAAAGACATGAAAGCCACGA-3′(SEQ ID NO：1)；
反向引物：5′-TGTGAGAATTGTGCCAGAAGAC-3′(SEQ ID NO：2)。
进一步地，所述步骤(5)的鉴定过程包括：
根据外显子组测序中找到的同义突变数量来计算样本的背景突变率bi，其计算公式为bi＝1.4×mi/ni，其中i为每一突变类别，该类突变数目的观测值为mi，该类核苷酸在肿瘤样本中成功测序8X的总碱基数为ni；1.4为HaPMaP数据库中非同义突变比同义突变的比值；基因g作为随机突变基因的概率，采用似然比检验来确定每个基因的P值，当P<0.01时为显著突变基因。
根据第三方面，一种实施例中提供一种由第二方面的方法检测得到的ZNF83基因突变序列和/或突变位点。
根据第四方面，一种实施例中提供一种如第一方面的与人膀胱癌相关的遗传标记在检测膀胱癌中的应用；优选地，所述膀胱癌为膀胱移行细胞癌。
本发明中，ZNF83基因的突变是膀胱癌预后差的指标之一；ZNF83基因的突变可以作为膀胱癌诊断的一个辅助指标；ZNF83基因可以作为治疗膀胱癌的一个新的作用靶点。
附图说明
图1示出了ZNF83基因的突变情况。
图2为ZNF83基因突变与膀胱癌患者临床特征及预后的相关性。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
在本发明中，通过大规模基因组测序研究，我们在膀胱癌中发现了一个新的基因ZNF83，具有高达18/99的突变率，通过详细的文献检索，却尚未发现任何与膀胱癌相关的报道。我们进一步分析ZNF83基因的突变情况：在ZNF83基因上共有6个突变位点，其中大部分为错义突变。在这6个突变位点中有3个热点突变位点(在2例以上的样本中都出现突变的位点)：chr19:57808752T>A，对应的氨基酸序列E293V，突变率为16/26；chr19:57808761T>C，对应的氨基酸序列K290R，突变率为7/26；以及chr19:57808819G>T，对应的氨基酸序列H271N，突变率为2/26。并且这3个位点上的突变都是错义突变，各位点突变造成其编码的ZNF83蛋白的氨基酸序列发生改变：谷氨酸替换为缬氨酸，赖氨酸替换为精氨酸，组氨酸替换为天冬氨酸，这些氨基酸序列的改变很可能导致ZNF83蛋白正常的生物学功能被破坏。在此发现的基础上，我们进一步进行了临床样品分析，通过临床样本的验证和随访发现，ZNF83基因突变与膀胱移行细胞癌患者的预后较差相关，以上结果提示ZNF83基因突变及功能异常是导致膀胱移行细胞癌发生发展的重要原因，可以用于膀胱癌的检测和预后判断。
此外，本发明通过基于序列的分析，我们揭示了在膀胱癌患者中ZNF83的表达降低，并确定ZNF83的蛋白表达可以作为膀胱癌患者重要的并且独立的预后评价指标。虽然病理TNM分期可以预测T1和T2或T1和T3生存差异，但是分子标记却能够预测T2和T3患者生存差异，这个不能通过TNM分期来预测。本发明的结果不仅描述了膀胱癌的分子特性，并且提供了膀胱癌的潜在的预后标志物。更重要的是，为功能与临床验证提供了一个丰富的案例。
本发明的检测ZNF83基因突变的方法包括如下步骤：(1)从膀胱癌患者的肿瘤组织和外周血中分别提取肿瘤组织DNA和外周血DNA；(2)对步骤(1)中提取的两种DNA分别进行全基因组测序和全外显子测序；(3)对步骤(2)的测序结果进行全外显子组序列比对与体细胞突变检测，得到突变基因；(4)采用sanger测序来验证步骤(3)所得突变基因的体细胞替换和插入与缺失；(5)突变基因为显著突变基因的鉴定。
在本发明的检测ZNF83基因突变的方法中，步骤(2)中的全基因组测序过程为用Illumina公司的HISeq2000平台对从膀胱癌患者的肿瘤组织和外周血中分别提取肿瘤组织DNA和外周血DNA，测序方式为双末端测序，测序读长为100bp。步骤(2)中的全外显子组测序过程为对从膀胱癌患者的肿瘤组织和外周血中分别提取肿瘤组织DNA和外周血DNA进行随机打断后，按照Agilent Technologies说明书提供的实验流程，采用Sure select HumanAll Exon50Mb Kit来捕获全外显子组序列；全外显子组测序平台是Illumina公司的HISeq2000平台，测序方式为双末端测序，测序读长为100bp。
在本发明的检测ZNF83基因突变的方法中，步骤(3)中对步骤(2)的测序结果进行全外显子组序列比对与体细胞突变检测的过程为：(A)去除含有测序接头和包含五个以上未知碱基的低质量序列，用BWA在容缺口模式下将其余的高质量双末端测序序列比对到NCBI人类参考基因组hg18；(B)随后用基因组分析工具包GATK对BWA的比对结果进行了局部重新比对；(C)根据BWA的比对结果，利用VarScan找出了所有潜在的体细胞替换位点。
基本排除所有的生殖细胞突变的参数及过滤条件包括：肿瘤样本和匹配的血液样本在突变位点的基因组位置必须有足够的覆盖深度；对于一个给定的基因组位置，肿瘤和血液样本平均碱基质量值应不小于15；变异型应至少被肿瘤标本的20％的总读取数支持，而在血液样本没有高质量的变异支持读取也被认为是变异型；在肿瘤组织中，支持突变的序列应不少于三条。
采用上述过滤条件，基于GATK局部重新比对的结果，找出了所有可能的插入或缺失类型体细胞突变；为进一步降低假阳性，用SAMtools软件包来检测肿瘤组织中包括单核苷酸变异和插入与缺失的所有变异，排除了满足以下任何一个过滤条件的所有体细胞变异：一致序列Phred质量值或SNP质量值<20；比对质量值<30；只发生于一条DNA链上的变异；单碱基替换位点周围30bp范围内存在可疑的插入或者缺失位点。
将所获得的体细胞突变与单核昔酸多态性数据库dbSNP132和1000人基因组计划中获得的SNP数据集进行了比较，排除在上述数据库中记录的所有位点，得到剩余的变异。
在本发明的检测ZNF83基因突变的方法中，步骤(4)中采用Sanger测序来验证步骤(3)所得突变基因的体细胞替换和插入与缺失的过程为：对肿瘤组织DNA与外周血DNA分别进行PCR扩增，扩增产物经Sanger测序得到突变位点。
在本发明的检测ZNF83基因突变的方法中，PCR扩增的引物为：
正向引物：5′-GGAAAGACATGAAAGCCACGA-3′(SEQ ID NO：1)；
反向引物：5′-TGTGAGAATTGTGCCAGAAGAC-3′(SEQ ID NO：2)。
在本发明的检测ZNF83基因突变的方法中，PCR扩增的热循环条件为：94℃5分钟酶的活性化反应；94℃30秒、65℃30秒和72℃30秒，共35个循环；72℃10分钟；PCR反应体系为：2ul dNTP、2ul 11OX PCRBuffer、1ul TF(1uM)、1ul TR(10uM)、1ul DNA模板、12.5ul dH2O(灭菌蒸馏水)和0.5ul TaKaRa TaqHS。
在本发明的检测ZNF83基因突变的方法中，步骤(5)中显著基因的鉴定过程为：根据外显子组测序中找到的同义突变数量来计算样本的背景突变率，背景突变率bi计算公式为bi＝1.4X mi/ni，其中i为每一突变类别，该类突变数目的观测值为mi，该类核苷酸在肿瘤样本中成功测序超过8X的总碱基数为ni；1.4为HaPMaP数据库中非同义突变比同义突变的比值；基因g作为随机突变基因的概率pg值为7类突变的概率之积，其中7为同义突变的7个不同的类别；采用似然比检验来确定每个基因的P值，当P<0.01时为显著突变基因。上述技术方案中，检测ZNF83基因突变的方法检测得到ZNF83基因突变序列。上述技术方案中ZNF83基因突变序列在检测膀胱癌中的应用，优选地，所述膀胱癌为膀胱移行细胞癌。
目前研究发现一些与膀胱癌进程相关的分子标志物，但是多变量分析证明这些已知标志物并不能作为独立的预后指标。虽然肿瘤的分期以及肿瘤的病理学分级仍被认为是最可信的临床结果预测指标。然而，其它一些肿瘤研究却表明，用分子标志物判断生存预后要比病理学分级更好。为了证明在预后生存方面分子标志物优于病理学分级，在本发明中，我们并不是简单的选择性的测试几个基因序列，而是以全基因组mRNA表达谱为基础尽可能找出与预后有关的所有基因。此外，除了基因的表达量，基因突变作为肿瘤的诊断和预后判断更具有可操作性以及可靠性。基于本项目庞大数据量和详实的临床资料，通过特定的统计学方法寻找到的高频率热点突变，同时具有显著生物学功能，因此概括起来，本发明具有的优点如下：ZNF83基因的突变是膀胱癌预后差的指标之一；ZNF83基因的突变可以作为膀胱癌诊断的一个辅助指标；ZNF83基因可以作为治疗膀胱癌的一个新的作用靶点。
以下通过实施例详细说明本发明的技术方案，应当理解实施例仅是示例性的，不能理解为对本发明保护范围的限制。
1、样本来源与及选择标准：
通过泌尿生殖系统癌症基因组联盟(UCGC)的中国成员机构，从新诊断的患者中获取肿瘤样本和与其匹配的外周血或正常对照组(相邻的形态正常的膀胱组织)。按照伦理审查委员会规定的制度，每个病人在招聘研究之前均签署了知情同意书。患者的详细的临床资料。所有的标本在收集后用液氮速冻并立即储存在-80℃用于进一步研究。苏木精一伊红(HE)染色切片均由两个病理医生在显微镜下独立地进行评估。在本研究中，我们只选取了膀胱癌细胞纯度超过85％的组织用于DNA提取和后续的测序。
样本的选择标准：(1)所有99例患者(患者情况见表1所示)在术前都未经放疗或化疗；(2)患者都是由中山肿瘤中心确诊的；(3)样本组织都是新鲜组织，切下后30分钟内放入RNA1ater中，并在4℃冷藏过夜，其后-80℃低温储存；(4)经HE染色，肿瘤细胞超过80％的肿瘤组织；(5)正常膀胱组织在病理学检查中显示正常组织无肿瘤细胞污染；(6)年龄大于18岁。
表1
2、主要试剂和仪器：
Sureselect Human All Exon5OMb Kit；TruseqRNA样品制备试剂盒(I11umina公司)；Dua196-well Gene Amp PCR System9700(Applied Biosystems)；373Ox1DNA分析仪(Applied Biosystems)；Epi Tect Bisulfite Kit(Qiagen，Hilden，德国)；HotstarTaqDNA聚合酶(Qiagen，Hilden，德国)；SYBRpremixExTaqII(TAKARA)试剂；Gene Amp PCRSystem9700thermalcycler(Life Technologies)。
3、操作步骤：
(1)基因组DNA提取和基于I1lumina公司测序平台的全基因组和全外显子组测序：DNA提取：根据说明书提供的实验步骤，提取表1中99例膀胱癌患者的肿瘤组织和匹配的外周血样本的基因组DNA，构建DNA文库；全基因组测序所使用的测序平台是I1lumina公司的HISeq2000平台，测序方式为双末端测序，测序读长为100bp；全外显子组测序：对来自同一批99对肿瘤、血液样本的基因组DNA进行随机打断后，按照说明书提供的实验流程，采用Sureselet Human All Exon50MbKit来捕获全外显子组序列。全外显子组测序所使用的测序平台是I1lumina公司的HISeq2000平台，测序方式为双末端测序，测序读长为100bp。
(2)全外显子组序列比对与体细胞突变检测：
1)去除含有测序接头和包含五个以上未知碱基的低质量序列以后，我们使用BWA在容缺口模式下将其余的高质量双末端测序序列比对到NCBI人类参考基因组(hg18)；
2)随后我们使用基因组分析工具包(GATK)对BWA的比对结果进行了局部重新比；
3)根据BWA的比对结果，利用Varscan(v2.2)找出了所有潜在的体细胞替换位；
(3)采用Sanger测序来验证体细胞替换和插入与缺失：
通过基于PCR扩增的Sanger测序来验证非沉默体细胞替换和插入与缺失。我们采用Primer3针对所有可能的体细胞突变位点来设计PCR扩增引物，PCR引物如：正向引物：5′-GGAAAGACATGAAAGCCACGA-3′(SEQ ID NO：1)；反向引物：5′-TGTGAGAATTGTGCCAGAAGAC-3′(SEQ ID NO：2)所示(每对引物加入相应配对的肿瘤样本)，PCR引物首先被用来扩增肿瘤组织的DNA；PCR扩增实验均在Dua196well Gene Amp PCR System9700(Applied Biosystems)系统完成，每个反应中都加入了来自不同个体的20ng模板DNA。在热循环仪上进行PCR扩增，热循环条件为：94℃5分钟酶的活性化反应；94℃30秒、65℃30秒和72℃30秒，共35个循环；72℃10分钟；将获得的PCR产物在4℃保存。通过上述PCR扩增得到肿瘤组与正常对照组的PCR产物。扩增出的PCR片断送到深圳华大基因研究院完成测序。所有测序结果都由测序分析软件5.2版本(Applied Biosystems)完成分析。如果肿瘤中突变被成功验证，相同的引物对被用来扩增同一个体的血液DNA，以确定该突变是否为体细胞突变。
(4)显著突变基因的鉴定：
根据外显子组测序中找到的同义突变数量来估计99例样本的背景突变率，其定义公式为：所观察到的同义突变率乘以HaPMaP数据库中非同义突变比同义突变的比值。简而言之，就是根据突变的相邻序列和突变类型，将同义突变分为7个不同的类别。
为了检验某一基因的非沉默突变率(非同义突变)是否明显高于背景突变率，采用从外显子测序数据中得到验证的突变数据进行计算。然后，根据Sjoblom，T.等研究者所建立的统计方法来依次估算每个基因可能作为随机突变基因的概率。具体地说，采用二项分布作为统计模型，以bi作为二项分布中事件的成功概率，以此来估算基因g每类突变发生数量的机率(pgi)。每类突变成功测序的核昔酸数量为99例肿瘤样本中该类突变覆盖深度足够(超过8X)的核昔酸总数。基因g作为随机突变基因的概率(pg)值为7类突变的概率之积。根据Gad Gets等研究者确定的方法，我们采用似然比检验来确定。每个基因的P值。我们将显著突变基因定义为:在99例样本中至少5例发生突变并且其非同义突变率显著高于背景突变率(P<0.01)。
表2示出了ZNF83基因突变位点在每个肿瘤样本中的情况。
表2
4.验证步骤：扩大样本验证ZNF83基因突变
1)运用Primers.o(Premier Biosoft)设计引物：正向引物：5′-GGAAAGACATGAAAGCCACGA-3′(SEQID NO：1)；反向引物：5′-TGTGAGAATTGTGCCAGAAGAC-3′(SEQ ID NO：2)，来独立扩增ZNF83基因3号到35号外显子之间的编码序列。
2)利用Dua196-well Gene Amp PCR System 9700(Applied Biosystems)设备，在另外50例膀胱癌患者的肿瘤组织和匹配的血液样本进行PCR扩增，利用3730xlDNAAnalyzer(APPlied Biosystems)系统来对样本进行测序并通过测序分析软件对测序结果进行分析。表明ZNF83在正常组织中没有发现变异，在膀胱癌组织中检测有变异。
在新发现的突变基因中，ZNF83基因的非同义突变率显著性最高，ZNF83基因的非同义突变率显著高于随机发生的同义突变(P＝0.02)。ZNF83是一个位于19号染色体上的基因，其编码产物是与细胞周期纺锤体检验点功能相关的聚合体的组成部分，该聚合体在细胞分裂过程中调节姐妹染色单体的分离。
我们利用Sanger测序在另外50例膀胱癌病人的肿瘤组织及匹配的正常对照中进一步分析了STAGZ基因的全部外显子序列，结果在4个肿瘤样品中发现了5个体细胞突变。我们还采用亚硫酸氢盐测序技术在19例膀胱癌患者中分析了ZNF83启动子的甲基化状态。相对于正常样本，我们发现三例肿瘤ZNF83启动子甲基化。为了明确ZNF83变异情况和个体生存之间的联系，我们采用KaPlan-Meier生存分析方法进行分析，发现与野生型个体相比，ZNF83体细胞变异的个体预后更差。同样，不论在浅表型或侵入性亚型膀胱癌中，ZNF83体细胞突变都与患者生存率显著相关(P<0.001)，这提示ZNF83突变是一个预测膀胱癌预后差的独立因子。
图2示出了ZNF83基因突变与膀胱癌患者临床特征及预后的相关性。通过对来自TCGA大数据分析，表明在膀胱癌中，ZNF83基因低表达与膀胱癌病理分级高、恶性程度高、患者预后差有显著相关性。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 吕兆洁
<120> 与人膀胱癌相关的遗传标记、其检测方法及用途
<130> 17I25013
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggaaagacat gaaagccacg a 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgtgagaatt gtgccagaag ac 22

Claims (10)

1.与人膀胱癌相关的遗传标记，其特征在于，所述遗传标记位于ZNF83基因序列内，在该遗传标记处发生基因突变，突变位点选自chr19:57808752T>A、chr19:57808761T>C和chr19:57808819G>T中的一个或多个。
2.一种检测ZNF83基因突变的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)分别提取肿瘤组织DNA和外周血DNA；
(2)对步骤(1)中提取的两种DNA分别进行全基因组测序和全外显子测序；
(3)对步骤(2)的测序结果进行全外显子组序列比对与体细胞突变检测，得到突变基因；
(4)采用Sanger测序来验证步骤(3)所得突变基因的体细胞替换、插入和/或缺失；
(5)突变基因为显著突变基因的鉴定。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述基因突变位点选自chr19:57808752T>A、chr19:57808761T>C和chr19:57808819G>T中的一个或多个。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的全基因组测序方式为双末端测序，测序读长为100bp；
优选地，所述步骤(2)中的全外显子组测序过程包括对肿瘤组织DNA和外周血DNA进行随机打断，捕获全外显子组序列；全外显子组测序方式为双末端测序，测序读长为100bp。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括：
(a)去除含有测序接头和包含五个以上未知碱基的低质量序列，用BWA在容缺口模式下将其余的高质量双末端测序序列比对到人类参考基因组；
(b)随后用基因组分析工具包GATK对BWA的比对结果进行局部重新比对；
(c)根据BWA的比对结果，利用VarSCan找出所有潜在的体细胞替换位点。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)具体包括：
对肿瘤组织DNA与外周血DNA分别进行PCR扩增，扩增产物经Sanger测序得到突变位点。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的引物为：
正向引物：5′- GGAAAGACATGAAAGCCACGA-3′（SEQ ID NO：1）；
反向引物：5′-TGTGAGAATTGTGCCAGAAGAC-3′（SEQ ID NO：2）。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)的鉴定过程包括：
根据外显子组测序中找到的同义突变数量来计算样本的背景突变率bi，其计算公式为bi=1.4×mi/ni，其中i为每一突变类别，该类突变数目的观测值为mi，该类核苷酸在肿瘤样本中成功测序8X的总碱基数为ni；1.4为HaPMaP数据库中非同义突变比同义突变的比值；基因g作为随机突变基因的概率，采用似然比检验来确定每个基因的P值，当P<0.01时为显著突变基因。
9.由权利要求2-8中任一项所述的方法检测得到的ZNF83基因突变序列和/或突变位点。
10.如权利要求1所述的与人膀胱癌相关的遗传标记在检测膀胱癌中的应用；优选地，所述膀胱癌为膀胱移行细胞癌。
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