CN108012546A - Snp rs12603226作为nafld的预测性标记物 - Google Patents

Snp rs12603226作为nafld的预测性标记物 Download PDF

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    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Abstract

本发明涉及用于预测个体中疾病的危险因子、发生和发展的方法，包括检测在来自接受检查的个体的核酸样品中一种或多种多态性的等位基因状态。本发明涉及特别是与发展已知为NAFLD(非酒精性脂肪性肝病)的疾病或更简单地非酒精性脂肪性肝炎的风险相关联的单核苷酸基因多态性(SNP，单核苷酸多态性)。在这种特定的情况下，SNP，rs12603226，存在于ZNF624人类基因中，从未被描述与NAFLD相关联和用于预测所述疾病，使得可能在一般群体中或者在已经处于风险的类别(例如肥胖个体)中，鉴定具有发展NAFLD和与其相关疾病的更高倾向性的个体。

Description

SNP RS12603226作为NAFLD的预测性标记物
技术领域
本发明涉及用于预测发展非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和与其相关联疾病的风险的用途或SNP(单核苷酸多态性)。
现有技术
在过去被认为是良性病况，实际上NAFLD现在被认为是器官损伤的更大原因之一并且据估计在未来几年中，它将是肝脏移植的主要指标之一(Dutkowski,P.等人,Gastroenterology 2015Feb；148(2):307-23.)。NAFLD实际上遵循进展通过炎性阶段的发展过程，被称为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)至纤维化、肝硬化以及可能地肝癌(Brunt,Nat.Rev.Gastroenterol.Hepatol.2010；7:195)。NAFLD的特征在于肝脏中甘油三酯的过量积聚，是一种包含不同形式的肝脏损伤的多因子疾病，所述肝脏损伤如单纯的脂肪变性或脂肪性肝炎或NASH(非酒精性脂肪性肝炎)，与纤维化相关联(Brunt,Nat.Rev.Gastroenterol.Hepatol.2010；7:195)。对于NAFLD的组织学特征的详细描述见Brunt,2010(如上)。
许多临床研究已经表明环境因子(例如，不适当的生活方式)和遗传因子都是NAFLD的最大风险因子(Anstee,Q.M.,Day,C.P.,Nat.Rev.Gastroenterol.Hepatol.2013Nov；10(11):645-55)。
NAFLD是西方国家中慢性肝病的主要原因，并且预期将成为肝硬化的主要原因，使得需要在未来二十年中求助于肝脏移植。具有NAFLD的大多数患者还存在代谢风险因子，例如肥胖、2型糖尿病和血脂异常。内脏脂肪的累积，代谢综合症和胰岛素抗性的存在是发展NAFLD的其它主要风险因子(Masuoka,H.C.和Chalasani,No.Ann.No.Y.Acad.Sci.(2013)1281:106-12)。只有一定比例的患肝脂肪变性的患者(20％左右)随时间发展NASH。后者具有发展肝硬化和肝癌的高风险(Masuoka,H.C.等人,(2013)如上)。在几乎所有情况下，NAFLD是无症状的和无声的疾病。其事实上经常通过存在异常的肝生物化学测试(通常作为例行检查执行)来得到诊断。
由于这些特性，NAFLD经常被忽略或低估，并且在肝脏已经受到损害并且经常在肝活检后NASH的组织学特征明显的时候，发生偶然的诊断(Brunt,2010,参见上文；Masuoka,H.C.等人，2013，参见上文)。只能通过对肝脏活检的组织学分析保证对NASH以及存在肝硬化和炎症的适当诊断。然而，由于它的高成本以及最重要的是由于其侵入性，而难以付诸于活检；除了这一点之外，操作者的技术和经验是对于正确进行活检、取样和最终诊断的重要可变性因子(Masuoka,H.C.等人,(2013),参见上文)，并且只有微小部分(大约1/50,000)的肝脏通过活检取样而进行取样，有助于该程序的极端临界值。因此，近年来的研究已经集中于鉴定用于对NAFLD的早期诊断和预后的生物标志物(Fitzpatrick,E.和Dhawan,A.(2014)World J.Gastroenterol.20:10851-10863)。
通过定义，如果标记物对鉴定患病患者是足够灵敏的，如果标记物是足够特异性的以足够的效率将患病患者与健康患者区分开，如果标记物的存在与疾病发展的概率高度相关，如果对标记物水平的分析不是极其昂贵或难以实施，并且总之如果这样分析是可重复的，则是标记物。找到能够提供关于NAFLD以及与该疾病相关联的组织学特征的信息的非侵入的、诊断性的和预后性的标记物具有重大的临床意义(Fitzpatrick,E.和Dhawan,A.(2014),参见上文)。
近来，出现了对临床实践具有重大影响的两种类型的非侵入性标记物：第一种是与所述疾病的发病机理严格相关的系统标记物(例如：透明质酸和细胞角蛋白18)(Fitzpatrick,E.和Dhawan,A.(2014),参见上文)；第二种是遗传标记物。实际上，一种用于评估个体中NAFLD的发生和发展的风险的方法包括检测核酸样品中的一个或多个多态性的等位基因状态(Nobili,V,等人；J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr.；2014May；58(5):632-6)。
多态性是以大于1％的频率存在于群体中的DNA序列中的变化；特别地单核苷酸多态性或SNP定义为在群体中存在的单一DNA碱基的“变体”(Gusella,J.F.；Annual Reviewof Biochemistry；July 1986；Vol 55:831-854)。这些可以在基因组中的任何点找到，在编码和非编码部分都可以，但仍然具有保护和调节的作用。这些变体涉及疾病的发展、对药物的应答、对感染的应答、暴露于化学试剂等。
当被单独考虑时，SNP通常具有与其与疾病的统计相关性相关联的可变预测性“权重”，但是通过分析一个个体的基因组中的几个SNP，它们可以提供更大的预测价值，其特征在于更高的特异性和灵敏度，尤其在复杂疾病如NAFLD和心血管疾病中(Vasan,R.S.,Circulation 2006May 16；113(19):2335-62)。
流行病学、家族和双胞胎研究已经证明一些SNP(遗传变体)在疾病的严重程度和从NAFLD到NASH的进展中都起到一定的作用(Dongiovanni,P等人Genetic Predispositionin NAFLD and NASH:Impact of Severity of Liver Disease and Response toTreatment；Curr.Pharm.Des.2013Sept.；19(29):521495238)。
目前用于预测NAFLD的SNP，KLF-6rs3750861、PNPLA-3rs738409、LIPIN-1rsl3412852、SOD-2rs4880(Nobili.V.等人J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr.2014May；58(5):632-6)和TM6SF2rs58542926(Sookoian,S.等人,Hepatology,2015Feb；61(2):515-25)与所述疾病具有可变的相关性，相关性仍然不足够严格，还需要找到以与所述疾病具有更强相关性而对NAFLD具有预测性的其他SNP，从而改善现有的预测工具。
迄今为止，对用于倾向于NAFLD的相关SNP的搜索已经针对在功能上涉及所述疾病的分子发病机理的基因。但是，如从其它疾病中已知的那样，在外显子或内显子区域中可能存在变体等位基因，其仍未知的，但能够促进NAFLD表型的发生。
最近，已经证明了一种被称为ZNF267的属于“Kruppel样锌指”蛋白的蛋白质的功能(Schnabl,B.等人Int.J.Clin.Exp.Pathol.2011；4(7):661-6)。该研究报道了与具有健康肝脏的患者相比，在患NAFLD的患者肝脏中蛋白质ZNF267的表达增加。至今还很少地描述ZNF蛋白质在NAFLD中的作用，这部分地是因为其一般功能也是知之甚少。当对报道在遭受NAFLD的肥胖患者中的基因表达谱的数据库进行搜索时(Www.ncbi.nlm.nih.gov/geoprofiles；www.genecards.org),将针对6个ZNF蛋白的编码转录物的数据合并。在遭受NAFLD的肥胖患者中，特别地减少了一种转录物(图1)。
该转录物编码蛋白质ZNF624，其RNA在多种组织中表达，包括肝脏(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/tools/profileGraph.cgi？ID＝GDS 4881:8013035)。已经鉴定和研究了编码ZNF624的基因的区域中的不同等位基因变体，但本发明人知道迄今为止还没有涉及SNP rs12603226的等位基因频率的研究，发现SNP rs12603226在染色体17上ZFN624基因内的内含子区域NM020787.3中位置16626253中，已经在一般人群中得到了报道。
本发明人知道，迄今为止在文献中没有描述该蛋白的功能的文章或报告在一般群体中其编码基因中存在的可能SNP的等位基因频率的任何研究(Nobili,V.等人,J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr.2014May；58(5):632-6)。
发明概述
现已发现ZNF624基因的SNP rs12603226，当以纯合TT基因型存在时，与NAFLD具有非常显著的相关性，其比迄今描述的对于已知SNP(例如KLF-6rs3750861PNLA-3rs738409LIPIN-1rs13412852SOD-2rs4880)与所述疾病的相关性更强。在我们研究中，与健康个体相比，纯合TT状态实际上在具有NAFLD的个体中有非常更高的发生率。
因此，本发明的目的涉及在ZFN624基因内的NM020787.3内含子区域中位置16626253中染色体17的rsl263226中的SNP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi？rs＝12603226)，其中A碱基被T碱基所取代。这种变化当在个体中为纯合的时候，与发展NAFLD的高风险相关联。
本发明的另一目的是用于预测个体中非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的风险增加的方法，其包括在从来自个体的生物样品中获得的核酸中对SNP rs12603226进行基因分型的阶段，并且其中纯合TT等位基因的存在表明发展NAFLD的风险增加。
根据本发明的详细描述，进一步的目的将是清楚的。
附图简述
图1：在没有NAFLD的肥胖个体和在具有NAFLD的肥胖个体中，肝脏中的ZNF624mRNA的表达。在没有NAFLD的肥胖个体和在具有NAFLD的肥胖个体中的ZNF624mRNA沿Y轴显示。
发明详述
在本发明的范围内提供以下定义。
多态性是指两个或更多个不同基因组或个体之间发生两个可替换的基因组序列。
多态性位点是指其中存在变化的基因座。所述多态性位点具有至少两个等位基因，每个等位基因在所选群体中以特定频率存在。
等位基因是指核苷酸序列可在同一染色体位点采用的可替换形式中的一种。
单核苷酸多态性(SNP)是指包含具有两种可替换的等位基因的单一核苷酸的多态性位点。
基因型是指对个体中基因组序列的等位基因状态的描述。
引物是指可变长度的寡核苷酸，其作为用于在PCR(聚合酶链式反应)中合成核酸的起始点。
探针是指与互补靶核酸杂交的可变长度的寡核苷酸。
靶序列是指待分析并包括目的多态性位点的核酸的区域。
进行基因分型是指确定个体中SNP的等位基因状态的过程。
等位基因频率是指测量群体中的等位基因的相对频率，其表示为比例或百分比值。
基因型频率是指群体中存在的基因型的频率或比例。
气球样变性(ballooning)是指肝细胞的肿胀，具有清晰稀薄的胞质，深染色的核，特征在于炎症性细胞如淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的渗透的小叶炎症，以及由于肝细胞周围存在的胶原蛋白引起的纤维化。
BMI(身体质量指数)是指对身体质量的一般评价，作为肥胖症的间接指标。以kg/m2表示的BMI是通过将以kg表示的体重除以以m表示的高度的平方而计算的。根据世界卫生组织所定义的标准(http；//www.who.int/en/)解释BMI，该标准建立了BMI的分类：
严重体重不足(BMI＜16.00)，体重不足(16.00＜BMI＜18.49)，正常体重(18.50＜BMI＜24.99)，超重(25.00＜BMI＜29.99)，1类肥胖(30.00＜BMI＜34.99)，2类肥胖(35.00＜BMI＜39.99)，3类肥胖(BMI≥40.00)。
在婴儿和青少年中，BMI显著地在于尤其是与性别和年龄相关联的可感知的可变性，并且优选地使用以百分位数作为参考的图形(Cole等人,BMJ 2000,May 6；320(7244):1240-3)和以下细分进行分类：体重不足(＜第5百分位数)，正常体重(>第5百分位数，<第85百分位数)，超重风险(>第85百分位数，<第90百分位数)，超重/肥胖(>第90百分位数)。
本发明人现在已经研究了在ZNF624基因的编码和非编码区域中的不同变体等位基因(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/？term＝ZNF624+human)，位于染色体17上，并且已经令人惊奇地发现在ZNF624基因组序列中存在的多态性中的一种与NAFLD及其进展之间的强相关性。具体地，本发明人已经分析了在ZFN624基因的内含子区域NM020787.3中位置16626253中发现的SNP rsl2603226(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/？term＝rs12603226)的等位基因频率。
如本领域技术人员已知的，SNP可以具有两个不同的等位基因，每一个对应于在DNA(A、G、C、T)中存在的核苷酸，在SNP rs12603226的情况下，在腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)之间可替换。迄今为止，本发明人知道没有对上述SNP的等位基因频率的研究。
可以通过本领域技术人员已知的不同方法来实施确定基因组的特定位置中的特定核苷酸的过程(Chen,X.,Sullivan,P.F.,Pharmacogenomics J.2003；3(2):77-96；Marnellos,G.,Curr.Opin.Drug Discov.Devel.2003May；6(3):317-21)(Chen等人,Pharmacogenomics J.2003April；3(2):197-205)。
下面的表1通过非限制性实施例列出了通常用于对SNP进行基因分型的一些方法。
表1
本发明人已经分析了SNP rs1263226的等位基因频率。对衍生自248个健康个体和具有组织学确认的NAFLD的152个患者的400个生物样品针对SNP rs1263226进行基因分型。
使用5'核酸酶测定法也称为等位基因区分测定法(LifeTechnologies)，遵循制造商说明书进行基因分型。测试使得可能在两个等位基因之间进行区分，使得利用TaqDNA聚合酶的5′-3'核酸酶活性引起等位基因特异性荧光探针从DNA释放。
对基因型的分析(表2)揭示了TT基因型在遭受NAFLD的个体中比在健康个体群体中具有更大的表现。事实上，如对基因型的频率分析所表明的，AT杂合子在一般健康群体中更频繁，而TT纯合子在具有NAFLD的个体中更频繁。从对观察到的基因型频率的分析衍生得到数据(表2)表明纯合T等位基因的存在代表了所述疾病和与其相关联的其它共病的风险因子。
对该SNP的分析更准确地鉴定了处于来自该疾病的遗传风险的个体并且比之前描述的SNP具有更高的相关性。
例如，在PNLPLA3基因中存在的SNP rs738409迄今已经是用于预测NAFLD的最重要的多态性；如在文献(Valenti等人,Hepatology 2010Apr；51(4):1209-17)中报导的，被认为是倾向性(GG)的基因型在具有NAFLD的个体中具有12％-14％的频率，相比于一般群体中其存在于大约3％的病例中。
在SNP rs12603226的情况下，本发明人已经令人惊奇地发现倾向性基因型(TT)在具有NAFLD的个体中存在于91％的病例中，相比于对照群体(约7％的病例)。作为本发明主题的SNP rs12603226的倾向性基因型(TT)与所述疾病之间的相关性(91％)比NAFLD和PNLPLA3基因中存在的rs738409标记物之间的相关性(14％)高非常多。因此，本发明人已经证明对于rs12603226的TT纯合性现在代表了比当前用于预测目的的标记物更可靠的用于预测发展NAFLD的遗传风险的标记物。
基于所进行的研究结果，开发了用于预测对NAFLD的倾向性的方法。
该方法提供了以下基本阶段：
-在从来自个体的生物样品获得的核酸上对SNP rs12603226进行基因分型；
-分析基因型。
TT等位基因纯和性表明了发展NAFLD的风险增加；
AT等位基因杂合性表明了发展NAFLD的风险更低。
进行基因分型是本领域技术人员已知的技术。
以下实施例将被认为是本发明的说明性的，并不限制其相应的范围。
实施例
所检验群体的表征
400个唾液样品，其中152个样品从具有NAFLD并通过肝脏活检验证的患者获得，以及248个样品从健康个体获得，用于对SNP rsl2603226进行基因分型。
将遭受NAFLD/NASH，并对用于确定脂肪变性的次级原因(例如，饮酒，肝炎，CMV，EBV，影响脂肪变性的药物：丙戊酸钠、胺碘酮、泼尼松，肝脏的自身免疫疾病等)的一个或多个试验是阳性的所有的个体从研究中排除。
在该研究中包括的是处于BMI＞第90百分位数(超重/肥胖)在6-14岁患NAFLD的个体。对于组织学表征(包括脂肪变性、炎症、肝细胞的气球样变性和纤维化等)，参考由National Institute of Health资助的NASH Clinical Research Network的NAFLDScoring System(Kleiner,D.E.,Hepatology 2005；41:1313-21)。在健康个体的情况下，考虑的年龄(6-16年的年龄；平均值：11)和BMI在第5百分位数至第84百分位数(正常体重)之间。
DNA的提取
在进行基因分型SNP rs12603226(等位基因区别)之前，使用QIAamp DNA MiniKit(Qiagen，代码：51304)从生物样品中提取DNA，根据制造商的用于从所述口腔棉条中取出的说明。
使用NanoDrop(Thermo Scientific)分光光度计，在选择用于核酸的应用后并对光学表面进行清洗后，对所获得的DNA进行定量；首先进行1.5μl无菌去离子水的空白；然后从各样品中提取1.5μl的DNA，使用260/280和230/260的比率评价DNA浓度和纯度。将样品保持在-20℃，并随后用于基因分型反应。
用于对SNP rsl2603226进行扩增和检测的方法
使用5'核酸酶测定法(Life Technologies)来确定SNP rs12603226的等位基因状态。简言之，使用用于所研究区域的成对特异性引物扩增两个SNP等位基因，并且两个TaqMan等位基因特异性探针用于检测靶多态性(rs12603226SNP A/T)。TaqMan探针含有在5'末端部分上的“报告子染料”(特异于A等位基因；FAMTM特异于祖先T等位基因)和在末端3'部分上的“淬灭器”(MGB小结合沟)。在扩增期间，将每个探针(具有特定“报告子”的特异性等位基因)结合到等位基因中一个。当进行扩增时，Taq聚合酶切下与靶连接的探针，产生荧光的发射(其通过软件进行记录和解释)。只存在VIC荧光表明A等位基因的纯合状态；仅存在FAM表明T等位基因的纯合状态；存在VIC和FAM两种信号表明杂合状态，即存在A和T两种等位基因。
探针和引物的设计：
使用Custom TaqMan Design Tool(Life Technologies)设计引物和探针：
●用于检测A等位基因序列(SEQ ID NO.1)的加荧光素的VIC-MGB探针：CCCAGCCAAATTTATGA
●用于检测T等位基因序列(SEQ ID NO.2)的6FAM-MGB加荧光素的探针：CCCAGCCAATTTTATGA
●FORWARD引物(SEQ ID NO.3)：CAGGCGTGAGCCACTGT
●REVERSE引物(SEQ ID NO.4)：
GACAAATCATACTGCTTAAAAGTGGGTTT
使用15ng的基因组DNA在12μl的最终体积中进行反应，使用由制造商提供的混合物(Genotyping Master Mix-life Technologies代码：4371355)以及上述引物和探针。使用HT 7900Fast Real Time PCR系统(Applied Biosystems)以及如下计划所示的热方案进行样品的扩增：
预PCR读取：60℃x 1分钟
(保持阶段)
保持阶段：95℃x 10分钟
循环阶段：
后PCR：60℃x 1分钟
(保持阶段)
使用ABI PRISM SDS软件版本2.2(Applied Biosystems，Foster City，CA)分析得到的结果，并显示在表2中。
统计分析
表2示出了通过对SNP rs12603226的分析发现的基因型频率。
表2
分析来自我们研究的数据中的基因型频率和比例，明显的是TT基因型与NAFLD相关。实际上，与健康个体的对照组(19/248；7.66％)相比，91.45％具有NAFLD/NASH的个体(139/152)表现出TT基因型，而与健康个体组(229/248；92.34％)相比，仅(13/152)8.55％具有NAFLD的个体表现出AT基因型，证实了我们的假设：ZNF624基因的rs12603226的TT基因型与NAFLD和与其相关疾病相关联。
在进行基因分型后，使用X2测试和比值比(OR)的计算用于对所获得的数据的显著性进行统计学评估。
X2测试用于评估TT基因型与NAFLD的发展之间的关联性。在统计中，使用X2测试来测试两组，群体或标准之间存在至少一种关联性的假设。在我们的研究中获得的X2测试的高值(表3)表明所获得的结果不是由于随机性而得到的，并且在TT基因型的存在和NAFLD的发展之间有强烈的关联性。
在统计中，计算比值比(OR)指数用于随机对比研究中来定义两个因子之间的因果比(例如：风险因子和特定疾病的发展)，以验证存在风险因子或任何其它变量是否可引起特定的效果，建立多少个病例和对照与在特定的研究中考虑的假设风险因子相接触。在NAFLD/NASH个体中所述风险的频率因子(TT基因型的存在)与健康个体组(对照)中的所述因子的频率相比较，使用比值比(OR)计算来验证存在于遭受NAFLD的个体中的风险因子(TT基因型)的几率与存在于“对照”个体中的风险因子(TT基因型)的几率相比较。
具有值<1的OR指数表明负关联(即，考虑的因子可以是保护性的)，而OR>1值表明正关联(即，考虑的因子可以导致疾病的发展)。所述值从值1偏离越多，关联性越强(在这两种情况中)。所获得的高的正OR值(OR＝128.9；表3)显示在TT基因型的存在和NAFLD之间有强烈的统计关联性。
因此，可以说通过X2测试和比值比指数的计算获得的数据是统计学显著的，在这两种情况下的p值或p-值都低于0.05，这是统计学显著的。因此，可以断定TT基因型的存在和NALFD之间有强烈的关联性。
表3：X2测试和比值比(OR)
TT AT 合计
NAFLD/NASH患者(案例) 139 13 152
健康患者(对照) 19 229 248
合计 158 242 400
X2值：276.8；
p-值＜0.0001
比值比：128.9
95％置信区间：62-269
p-值＜0.0001
(置信区间描述了与取样方法相关联的不确定性。在统计学中，当估计参数时，仅仅鉴定单一值经常是不够；因此，为了能够估计这样的参数，使用被定义为置信区间的那个参数的似然值的范围。可以通过计算置信区间来量化估计的不确定性。Altman将95％的区间定义为“其中我们可以确定在95％的时间中群体的值都落在其内的区间”。
N.B.：OR(比值比)、标准误差和95％CI(置信区间，其描述了与取样方法相关联的不确定性)根据Altman，1991来计算。
综上所述，对rs12603226的等位基因状态的研究使得可以识别处于发展NAFLD和与其相关联疾病的最大风险中的那些个体。
具体地，从我们对SNP rs12603226的研究中，清楚的是T等位基因(TT基因型)的纯合存在与NAFLD的发生和进展密切相关。实际上，在91.45％患NAFLD的个体中检测到TT基因型。因此，对rs12603226的等位基因状态的研究可被用作评估NAFLD和与其相关联疾病的发展和进展的风险的遗传标记物。
 序列表
<110> Orga Bio Human S.r.l.
<120> SNP RS12603226作为NAFLD的预测性标记物
<130> IIC172687
<141> 2016-08-04
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 合成的
<400> 1
cccagccaaa tttatga 17
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 合成的
<400> 2
cccagccaat tttatga 17
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 合成的
<400> 3
caggcgtgag ccactgt 17
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的
<400> 4
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Claims (5)

1.包含SNP rs12603226的核苷酸片段，用于确定非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，其中患NAFLD的个体中的T碱基具有比健康患者更高的频率，并且A碱基具有比健康患者更低的频率。
2.用于预测在个体中非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的风险增加的方法，其包括在从来自个体的生物样品中获得的核酸上对SNP rs12603226进行基因分型的阶段，并且其中存在等位基因纯合性TT表明发展NAFLD的风险增加。
3.根据权利要求2所述的方法，其进一步包括对与NAFLD相关联的一个或多个SNP进行基因分型的阶段，所述SNP选自：KLF-6 rs3750861，其中倾向性基因型为CC；PNPLA-3rs738409，其中倾向性基因型为CG或GG；LIPIN-1 rs13412852，其中倾向性基因型为CC或CT；SOD-2 rs4880，其中倾向性基因型为TT；TM6SF2 rs58542926，其中倾向性基因型为TT或CT。
4.权利要求2或3的方法，其中NAFLD的风险是与所述疾病的发展、进化或进展相关的风险。
5.权利要求2-4中任一项的方法，其中发展NAFLD的风险与选自肝脏的纤维化、脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎，肝硬化或肝癌的疾病的发展或进化或进展相关联。
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