CN103013988A - 一种判定中国人群tnip1单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮的关联性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了判定中国人群TNIP1单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮的关联性的方法。本发明是采用非标记探针高分辨率溶解曲线法检测位于TNIP1内含子上的SNPrs7708392的基因型，检测结果显示，新发现位于rs7708392上游5bp处尚未报道的SNPrs79937737，而且SNPrs7708392和SNPrs79937737与中国人SLE发病率都不相关。

Description

一种判定中国人群TNIP1单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮的关联性的方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及判定中国人群TNIP1单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮的关联性的方法。 

背景技术

    系统性红斑狼疮（SLE）是一种累及身体多系统多器官的复杂免疫系统疾病。遗传和环境因素共同影响SLE的发生发展过程。随着全基因组关联分析（GWAS）的兴起，现已发现一系列SLE相关基因，如MHC、BLK、ITGAM、STAT4、IRF5、BANK1及ETS1等。尽管如此，SLE发病机理仍不是很清楚。在这些候选基因中，TNF诱导蛋白3（TNFAIP3）结合蛋白1（TNIP1）的基因多态性与诸多自身免疫系统疾病（如SLE、银屑病等）的发病率显著相关。TNIP1作为NF-kB的负调节因子，在免疫系统稳态维持中扮演十分重要的角色。TNIP1通过直接与TNFAIP3和IkB的g亚基相互作用和抑制NF-kB前体蛋白p105的剪切来负性调控NF-kB信号通路。 

Gateva等研究发现位于TNIP1内含子上（染色体位置为5q33.1）的SNP rs7708392（C/G）与欧洲人群SLE的发病率有明显相关性。但是这一关联在中国人群中是否存在尚不清楚。 

发明内容

本发明的目的在于根据现有技术中存在的不足，提供一种判定中国人群TNIP1单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮的关联性的方法。 

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现： 

一个新的SNPrs79937737，它位于TNIP1基因的内含子区域，位于第5染色体第150437672核苷酸位置，其前端250个碱基序列如SEQ ID NO:6所示，其后端250个碱基序列如SEQ ID NO:7所示。

一种判定中国人群TNIP1单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮的关联性的方法，所述方法是非标记探针高分辨率溶解曲线法，所述SNP为SNPrs7708392和SNPrs79937737。 

作为更进一步的优选方案，上述方法包括如下步骤： 

（1）基因分型：取外周血基因组DNA，鉴定其基因型；

（2）统计学分析：采用卡平方检验或Fisher精确检验比较次要等位基因频率来分析SNP是否与疾病相关以及所采集的样本是否符合Hardy-Weinberg平衡，用OR值及95%置信区间的方式表示SNP与疾病之间的关联程度，用SHEsis软件进行连锁不平衡及单倍型分析，P值小于0.05认为是有统计学意义；

（3）统计分析显示，SNPs rs7708392和rs79937737的基因型频在SLE病例组和正常对照组中都符合Hardy–Weinberg平衡，但这两个位点的基因型频率和等位基因频率在SLE病例组和正常组中并没有显著性差异，单倍型分析显示SNPs rs7708392与rs79937737并不处于连锁不平衡状态，这两个SNP所产生的单倍型在SLE病例组和正常组中也都没有显著性差异。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： 

本发明是采用非标记探针高分辨率溶解曲线法检测位于TNIP1内含子上的SNPrs7708392的基因型，检测结果显示，新发现位于rs7708392上游5bp处尚未报道的SNPrs79937737，而且SNPrs7708392和SNPrs79937737与中国人SLE发病率都不相关。

附图说明

    图1是用总探针进行非标记探针高分辨率溶解曲线法分析样本的基因型。（A）探针区和非探针区的熔融曲线图；（B）标准化后的溶解曲线图显示六种基因型；（C）标准化后的差异曲线图显示六种基因型； 

图2是对探针去基因序列进行测序的结果，显示两个位点存在突变；

图3是引物及总探针、子探针的序列及位置；

图4是用子探针进行非标记探针高分辨率溶解曲线法分析样本的基因型，其中（B）用子探针1进行分析时的探针区和非探针区的熔融曲线图；（C）用子探针1进行分析时的标准化后的溶解曲线图；（D）用子探针1进行分析时的标准化后的差异曲线图；

图5是用子探针进行非标记探针高分辨率溶解曲线法分析样本的基因型，其中（E）用子探针2进行分析时的探针区和非探针区的熔融曲线图；（F）用子探针2进行分析时的标准化后的溶解曲线图；（G）用子探针2进行分析时的标准化后的差异曲线图。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。 

实施例

研究人群 

我们在北京大学深圳医院收集根据美国风湿病学会（ACR）标准确诊的285例SLE病人（男，26例，女，259例；年龄中位数为29岁；年龄跨度在12–55岁之间）和336例正常人（男，28例，女，308例；年龄中位数为28岁；年龄跨度在17–46岁之间）。所有正常人均无SLE家族史或患其他SLE相关的疾病。本研究获得深圳医院伦理委员会同意及所有参与者的知情同意。

基因型鉴定 

采用Innogent的全基因组DNA提取试剂盒（Innogent，China），根据试剂盒说明书要求提取所收集的外周血基因组DNA。采用非标记探针高分辨率溶解曲线的方法鉴定样本的基因型。方法简述如下：首先进行不对称PCR，20 mL体系含基因组DNA模板20 ng，1′PCR缓存液（Takara，Japan），200 mM dNTPs，0.5 U rTaq DNA聚合酶（Takara，Japan），0.05 mM正向引物，0.5 mM反向引物和0.5 mM C3封闭的探针。PCR反应在Bio-Rad S1000 PCR仪上进行（Bio-Rad, 美国）。PCR扩增条件如下：94℃预变性2分钟，继之进行50个循环，包括94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s，最后72℃延伸5 min。反应结束后，转移10 mL PCR产物到HR-1专用的毛细管中，再加入1 mL LCGreen Plus染料（Idaho Technology, USA）后，进行高分辨率溶解曲线分析。溶解温度从55℃上升到90℃，以0.3℃/s的升温速度采集溶解曲线。用LightScanner软件（Idaho Technology, USA）分析所获得的高分辨率溶解曲线。实验所用的引物和探针均由LightScanner probe design软件设计（Idaho Technology, USA）。引物和探针的序列如下：正向引物SEQ ID NO:1，反向引物 SEQ ID NO:2及三个C3封闭的非标记探针probe SEQ ID NO:3；probe-1 SEQ ID NO:4；probe-2 SEQ ID NO:5。这些引物和探针所在的位置如图2所示。

统计分析 

采用卡平方检验或Fisher精确检验比较次要等位基因频率（MAF）在病例组与正常组之间的差异来分析SNP是否与疾病相关以及所采集的样本是否符合Hardy-Weinberg平衡。用OR值及95%置信区间的方式表示SNP与疾病之间的关联程度。用SHEsis软件进行连锁不平衡及单倍型分析。P<0.05差异有统计学意义。

结果

非标记探针高分辨率溶解曲线是近年来发展起来的一种高效廉价的SNP检测方法。与普通高分辨率溶解曲线分析相比，此法利用一小段非标记C3封闭探针来放大突变位置的信息，使得突变位点溶解曲线产生较显著性偏移，产生较好的基因型区分度。通常，此方法获得的溶解曲线能明显区分三种类型基因型（野生型，杂合突变及纯合突变）。但是，我们在采用这一方法来检查SNP rs7708392的基因型时发现6种曲线类型（如图1~2），提示我们探针所检测的DNA片段上存在可能不止一个突变位点。随后，DNA测序结果证实在SNP rs7708392上游5 bp处存在一个新的SNP。我们把这个新发现的SNP序列赋予序号rs79937737。为了使检测方法能够准确鉴定这两个SNP的基因型，我们重新设计2个探针分别针对这两个SNP。探针序列和位置如图2所示。溶解曲线分析显示这两个探针能够准确有效的分别区分这两个SNP的基因型（图3~5）。随后，我们用这两个探针分别检测所有SLE病例组和正常对照组样本。

    统计分析显示，SNPs rs7708392和rs79937737的基因型频在SLE病例组和正常对照组中都符合Hardy–Weinberg平衡。但这两个位点的基因型频率和等位基因频率在SLE病例组和正常组中并没有显著性差异（表1）。单倍型分析显示SNPs rs7708392与rs79937737并不处于连锁不平衡状态（r²=0.02）。此外，这两个SNP所产生的单倍型在SLE病例组和正常组中也都没有显著性差异（表2）。 

表1 

表2

讨论

与其他传统的SNP筛查技术相比，高分辨率溶解曲线分析是一种强大、廉价的新SNP检测技术。但这种方法在鉴定野生型和纯合突变上存在明显不足，因为纯合突变所造成的溶解曲线偏移（通常小于0.4℃）在现有技术条件下很难被准确检测出来。采用小片段C3封闭的探针与待测的SNP位点相匹配，可将纯合突变所造成的温度偏移放大到3~4℃。这样的温度差异很容易就被常规的溶解曲线分析仪器所区分。此外，倘若探针上存在未知突变，通过此方法也能很容易检测到。在本研究中，我们在溶解曲线上发现6种曲线类型（图1~2）。这与以往的基因型鉴定大不相同。尽管现有的手段依然不能够准确判断每种探针峰型所代表的基因型，非标记探针高分辨率溶解曲线分析在鉴定和发现新的SNP上依然很有潜在应用价值。

    作为NF-kB的负调控因子，TNIP1在NF-kB信号通路所介导的固有免疫和适应性免疫中发挥着重要作用。但TNIP1在自身免疫病SLE发病过程中的作用直到最近才被认识到。GWAS分析发现欧洲人群中位于TNIP1基因上的SNP rs7708392与SLE发病率有密切相关性。最近报道也显示该SNP在日本人群中也与SLE发病相关联。然而，我们的实验结果与现有的这些报道并不一致。这些差异可能是人种的不同所致。有趣的是，我们发现位于SNP rs7708392上游5 bp左右的位置还存在一个新未被鉴定的SNP（rs79937737）。虽然这两个SNP只有5bp的距离，但两者并不处于连锁不平衡状态，提示rs79937737是进化上新近产生的突变。是否SNP rs79937737在其他种族的人群中也存在需要在今后进一步确定。 

结论 

非标记探针的高分辨率溶解曲线是一种高效准确的SNP筛查方法。在中国人群中，SNP rs7708392与rs79937737均与SLE的发病率不相关联。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  深圳北京大学香港科技大学医学中心

 

<120>  一种判定中国人群TNIP1单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮的关联性的方法

 

<130> 

 

<160>  7    

 

<170>  PatentIn version 3.2

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  正向引物

 

<400>  1

tggtcaattc tcccaaccga                                                 20

 

 

<210>  2

<211>  21

<212>  DNA

<213>  反向引物

 

<400>  2

acttcaaggt cagaccctaa a                                               21

 

 

<210>  3

<211>  30

<212>  DNA

<213>  总探针

 

<400>  3

gctgattcca gttattgtga ctagtctact                                      30

 

 

<210>  4

<211>  25

<212>  DNA

<213>  子探针1序列

 

<400>  4

cgaggagagg ctgattccaa ttatt                                           25

 

 

<210>  5

<211>  29

<212>  DNA

<213>  子探针2序列

 

<400>  5

ttattgtgac tagtctacta agttccaga                                       29

 

 

<210>  6

<211>  250

<212>  DNA

<213>  SNP rs79937737前端250个碱基序列

 

<400>  6

actggcacca ccaccatcca ctggatcgga tgctctggag ttgcagccca gcaatctgtg     60

 

tttaacaacc accctctacc tccatcccca ggattgtgat gcatgctcat gtttgtgaac    120

 

caactgctct gaccatttcc caatgctgct aaggagaaaa atcaacattt ctatgtctgg    180

 

tatcaaaatc ttttagggtc tttcccaggc caactggtca attctcccaa ccgaggagag    240

 

gctgattcca                                                           250

 

 

<210>  7

<211>  250

<212>  DNA

<213>  SNP rs79937737后端250个碱基序列

 

<400>  7

ttattgtgac tagtctacta agttccagaa gagacccagg ttccactctg cactttgtca     60

 

tttttttagg gtctgacctt gaagtcactt ccctccagaa gacccctcca accatctggt    120

 

gcccccaaat tactctgcac tccagttata cctatgccaa tccgactcat ttggcactta    180

 

ctggcacaca atgcctttca ggtcacactc atagcacatc tccccatttg accaaaagtt    240

 

cctggaaggc                                                           250

Claims (3)

1.一个新的SNPrs79937737，其特征在于位于TNIP1基因的内含子区域，位于第5染色体第150437672核苷酸位置，其前端250个碱基序列如SEQ ID NO:6所示，其后端250个碱基序列如SEQ ID NO:7所示，此SNP的特征为A/G多态性。

2.一种判定中国人群TNIP1单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮的关联性的方法，其特征在于所述方法是非标记探针高分辨率溶解曲线法，所述SNP为SNPrs7708392和SNPrs79937737。

3.根据权利要求2所述判定中国人群TNIP1单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮的关联性的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

（1）基因分型：取外周血基因组DNA，鉴定其基因型；

（2）统计学分析：采用卡平方检验或Fisher精确检验比较次要等位基因频率来分析SNP是否与疾病相关以及所采集的样本是否符合Hardy-Weinberg平衡，用OR值及95%置信区间的方式表示SNP与疾病之间的关联程度，用SHEsis软件进行连锁不平衡及单倍型分析，P值小于0.05认为是有统计学意义；

（3）统计分析显示，SNPs rs7708392和rs79937737的基因型频在SLE病例组和正常对照组中都符合Hardy–Weinberg平衡，但这两个位点的基因型频率和等位基因频率在SLE病例组和正常组中并没有显著性差异，单倍型分析显示SNPs rs7708392与rs79937737并不处于连锁不平衡状态，这两个SNP所产生的单倍型在SLE病例组和正常组中也都没有显著性差异。

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