CN105316349A - 结核分枝杆菌KatG突变基因及其用途 - Google Patents
结核分枝杆菌KatG突变基因及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105316349A CN105316349A CN201510802206.0A CN201510802206A CN105316349A CN 105316349 A CN105316349 A CN 105316349A CN 201510802206 A CN201510802206 A CN 201510802206A CN 105316349 A CN105316349 A CN 105316349A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- katg
- gene
- mycobacterium tuberculosis
- resistance
- pcr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 49
- 108700019394 Mycobacterium tuberculosis katG Proteins 0.000 title claims abstract description 13
- 102200060009 rs4151030 Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 33
- QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N isoniazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=NC=C1 QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 21
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 20
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 claims description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 11
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 claims description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 20
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 abstract description 12
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 8
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 abstract description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 3
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 12
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 229960003350 isoniazid Drugs 0.000 description 5
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 4
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 3
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 3
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- -1 INH free radical Chemical class 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 244000144992 flock Species 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000008261 resistance mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000029483 Acquired immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 241001037822 Bacillus bacterium Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108030002440 Catalase peroxidases Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150005343 INHA gene Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000012550 audit Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000013332 literature search Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000814 tuberculostatic agent Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000003805 vibration mixing Methods 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了结核分枝杆菌KatG突变基因及其用途<b>，</b>该突变基因与正常KatG基因相比，具有c.906C>A突变位点；本发明用候选基因筛查的方法，对中国33株耐异烟肼结核菌株中进行检测，首次发现该基因突变位点，在耐异烟肼的结核菌株中KatG基因突变c.906C>A具有一定的发生频率，因此Kat基因突变c.906C>A可以作为临床异烟肼耐药菌株耐药分子机制的诊断依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种结核分枝杆菌KatG突变基因，以及用于检测导致结核分枝杆菌异烟肼耐药基因KatG突变c.906C>A的试剂盒，属于结核病耐药基因突变检测技术领域。
背景技术
结核分枝杆菌引发常见的慢性呼吸道传播疾病---结核病，主要累及脏器为肺，此外还会侵犯皮肤、骨骼等全身多个组织和器官，多集中在15-35岁的青壮年发病。核病全球流行，但发展中国家患病人数相对较多，随着结核药物的应用和生活及医疗水平的提高，结核病的发病率有所降低。近年，抗生素滥用、环境污染和艾滋病等原因导致的结核发病率和耐药率均有所增加。根据世界卫生组织（WorldHealthOrganization，WHO）2008年报道，全球结核病的总耐药率高达20%，耐多药率约为5.3%，而我国调查数据显示中国肺结核耐多药率为8.3%，可见我国耐药结核患者的预防和治疗工作刻不容缓。
自1952年发现异烟肼具有全效能杀结核分枝杆菌复合物以来，无论单独或联合应用该药对患者进行治疗，异烟肼（INH）都是抗结核一线药物。目前研究表明KatG基因突变是常见的导致异烟肼耐药的原因之一。KatG基因编码结核菌过氧化氢-过氧化物酶，该酶可激活INH为INH自由基，INH自由基与辅酶I（Nicotinamideadeninedinucleotide，NAD+）形成共价化合物，抑制烯酰基乙酰载体蛋白还原酶（该酶由InhA基因编码）的功能，进而阻止细胞壁分枝菌酸的合成，导致病原菌死亡。若KatG基因发生突变，则会阻止INH转化为活性物质从而失去作用，导致结核菌产生抗药性。目前报道的KatG基因的常见突变为315位（丝氨酸突变为苏氨酸）和463位（精氨酸突变为亮氨酸）的氨基酸改变，不同国家报道的数据表明，超过60%的KatG基因突变发生在氨基酸315位点。同时发现KatG基因存在热点突变区域，在315位氨基酸附近，还存在多个氨基酸位点的突变。我国对结核杆菌耐异烟肼的KatG基因的研究也较多，但是多数研究仅针对315和463两个常见突变位点进行检测，这可能导致一些其他突变热点区的突变位点在检测时被忽视，从而影响临床诊断。
由于全球获得性免疫缺陷（AIDS）患者数量的增多，结核作为机会性致病菌，其发病率也有逐年增多的趋势。因此对结核患者早期进行诊断，并且对耐药结核患者的具体耐药机制进行确诊，提前调整对该类患者的临床用药，将大大缩短临床诊断时间，有助于早期发现其耐药机制，特别是对一些耐多药患者进行突变热点的基因诊断，从而采取有效的临床治疗措施，将大大提高该类患者的治愈率。异烟肼是临床常用抗结核药物之一，也是一线常规用药，因此对结核杆菌耐异烟肼KatG基因的突变热点区进行基因检测，将有利于临床快速诊断和治疗。
经文献检索，未见与本发明检测突变位点相同的公开报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测结核分枝杆菌KatG突变基因的方法，该结核分枝杆菌KatG突变基因具有c.906C>A突变位点，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。
本发明另一目的是提供用于检测结核分枝杆菌KatG突变基因的试剂盒，该试剂盒包括用于检测结核分枝杆菌KatG基因c.906C>A突变的试剂。
所述试剂盒包括核苷酸序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的引物。
本发明通过检测来自耐异烟肼结核菌株的样本中是否存在KatG基因的c.906C>A突变，从而判断该患者耐异烟肼药物的耐药分子机制；其中c.906C>A突变位点为KatG基因的突变，该突变导致KatG基因第302位的丝氨酸（Ser）突变为精氨酸（Arg），这个氨基酸的改变，影响了药物异烟肼转化为活性物质成分，发挥其抗结核分枝杆菌的作用，从而使该菌株产生耐药。
发明人用候选基因筛查的方法，在中国33株耐异烟肼结核菌株中进行检测，在一株耐药结核菌种发现与耐异烟肼相关的KatG基因新突变c.906C>A；该突变的频率为3%，这说明在耐异烟肼的结核菌株中，KatG基因突变c.906C>A具有一定的发生频率，因此Kat基因突变c.906C>A可以作为临床异烟肼耐药菌株耐药分子机制的诊断依据，并且目前，在国际和国内均未见该突变的报道。
本发明用于检测KatG基因突变c.906C>A的试剂盒，包括用于检测KatG基因的突变c.906C>A所需的常规试剂和能选用的用于扩增KatG基因的试剂和PCR引物。
用于检测KatG基因突变c.906C>A的试剂盒，包括以下一种或几种试剂的组合：
（1）从待检样品中提取DNA的试剂；
（2）用于扩增结核菌样本DNA的KatG基因c.906C>A突变的PCR引物和相关的PCR反应试剂；
（3）PCR产物纯化试剂；
（4）对PCR产物进行直接测序的试剂。
用于检测KatG基因突变c.906C>A的试剂盒，所用的PCR引物为：
KatG-F：5’-CCGCCTTTGCTGCTTTCTC-3’
KatG-R：5’-GGGGCTGATCTACGTGAAC-3’；
用于检测KatG基因突变c.906C>A的试剂盒，所述检测PCR扩增产物的试剂选自测序检测试剂、限制性内切酶长度多态性检测试剂、序列特异性引物检测试剂、探针杂交检测试剂及SNP分型检测试剂。
采用PCR扩增-直接测序的方法来检测样本的突变情况，具体操作步骤如下：
（1）采集待测个体的样本，为培养的结核菌样本，提取全基因组DNA；
（2）以提取的DNA为模板，以本发明设计的针对KatG基因c.906C>A突变的引物进行突变区段DNA序列的扩增，得到相应的PCR扩增产物；
（3）将得到的PCR产物纯化后，进行直接测序分析，将所测得的序列与KatG基因的正常序列进行比对，确定c.906C>A突变是否存在；
（4）根据以上实验结果分析患者是否为KatG基因突变c.906C>A导致的耐异烟肼结核分枝杆菌菌株；
（5）按照正常编码序列阅读框对突变序列进行翻译，进一步确定p.S302R突变的存在。
发明人在收集耐药结核分枝杆菌进行实验的过程中，收集到33株耐异烟肼的结核菌株，在取得患者同意的前提下，对患者感染的结核分枝杆菌进行基因检测。同时，我们还收集了患者的基本信息和临床信息，详细询问了其感染和发病过程，建立了结核分枝杆菌耐药株的样本库。将灭活的结核分枝杆菌冻存于-80℃冰箱。用柱吸附的方法提取结核菌的基因组DNA，保存于-40℃冰箱，每份DNA样本具有对应的患者资料和耐药信息。用引物设计软件Primer5和Oligo6设计PCR扩增引物，包括了结核菌KatG基因549位到1531位碱基的DNA片段，用于PCR扩增。PCR扩增产物直接用PCR引物进行正反向测序（测序所用仪器为ABI公司3730型DNA测序仪）。将得到的序列与GenBank中的序列（序列号：KC692358.1）进行比对，确定KatG基因突变c.906C>A的存在，按照开放阅读框进行翻译，确定氨基酸突变p.S302R的存在。
KatG基因c.906C>A突变的核苷酸和氨基酸序列如下：
。
KatG基因c.906C>A突变的核苷酸和氨基酸序列中，用方框标出的是突变的碱基和氨基酸，突变前第302位氨基酸是丝氨酸，突变后为精氨酸。该突变位于KatG基因编码序列的第906位碱基，由野生型的胞嘧啶（C）变为腺嘌呤（A），该突变使野生型的KatG蛋白的第302位丝氨酸突变成精氨酸，导致KatG蛋白的功能发生改变，进而引起异烟肼的耐药。KatG基因突变c.906C>A的检测能够用遗传领域的任意一种点突变检测方法进行，如PCR（聚合酶链反应）-RFLP法（限制性内切酶片段多态性）、PCR-测序法、DNA探针杂交法、位点特异性PCR法、PCR-dHPLC（变性高效液相色谱）、及PCR-SSCP（单链构象多态性）法。
上述方法中得到的PCR产物还能用其他方法进行检测，如DNA杂交探针法。所用探针能是与突变KatG基因核苷酸序列杂交，也可以有两个探针分别与正常或突变的KatG基因核苷酸序列杂交。探针能够选择同位素标记、有色物质标记或荧光物质标记。此外，还能够用位点特异的PCR引物、限制性内切酶或单链构象多态性的方法确定突变。
上述方法中使用的PCR引物依据已知的核苷酸序列进行设计，通常长度为18-25个碱基，GC含量在±45-55%，用引物设计软件Primer5和Oligo6设计PCR扩增引物，本发明中设计的PCR扩增引物序列为：
上游引物：5’-CCGCCTTTGCTGCTTTCTC-3’
下游引物：5’-GGGGCTGATCTACGTGAAC-3’
本发明提供的检查KatG基因c.906C>A突变的试剂盒，试剂盒内应装有用于检测KatG基因c.906C>A突变的试剂，同时提供的是经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品的制造、使用及销售信息。如采用PCR-直接测序法检测KatG基因c.906C>A突变的试剂盒，含有扩增引物、dNTPs、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液及测序所需试剂的一种或多种。本领域技术人员已知，以上组分仅是示意性成分，如扩增引物为本发明中所述的一对引物KatG-F和KatG-R，所述用于PCR反应的DNA聚合酶是能够进行PCR扩增的酶。
本发明的优点在于：
1、试剂盒能够简便、快捷、准确的测定患者KatG基因的突变位点，从而用于耐异烟肼结核患者的诊断和治疗中。
2、能够用于在结核患者中大规模筛查异烟肼耐药率，为诊断结核分枝杆菌患者的感染菌株是否具有异烟肼耐药性提供服务及参考。
3、为耐异烟肼的结核患者进行基因筛查提供准确和简单的方法；并为将来利用这一突变作为检测靶点针对耐药结核病进行治疗奠定坚实的基础。
附图说明
图1为结核分枝杆菌KatG基因突变c.906C>A的序列图；
图2为KatG基因PCR产物电泳检测示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1：采集检测样本
1、收集到33株耐异烟肼的结核菌株，临床患者均为肺结核患者，经药敏异烟肼（INH0.1ug/ml）试验检测结果可知，共获取34株耐异烟肼结核菌株。耐异烟肼患者平均年龄为38.6岁。男性患者占比58.82%（20/34），年龄介于20～69岁，平均年龄为41.6岁；女性患者占比41.18%（14/34），年龄介于14～67岁，平均年龄34.3岁。
实施例2：结核分枝杆菌基因组DNA的提取
1、采用一次性接种环刮取结核菌菌培养菌落置于1.5mlEP管中（尽量不要刮取到培养基）；
2、向菌体沉淀物的离心管中加入500μl细胞悬浮液（先检查是否已加入Lysozyme），使用移液器或漩涡振荡器彻底悬浮结核菌细胞沉淀，37℃温浴30min每隔5-10min颠倒混匀数次，12000rpm（～13400×g）离心2min，尽量吸净上清；
3、向菌体沉淀中加入225μl缓冲液A，振荡至菌体彻底悬浮；
4、向管中加入10μl蛋白酶K溶液，颠倒混匀；
5、加入25μl裂解缓冲液S，颠倒混匀；57℃水浴放置20min，其间颠倒混匀数次；
6、加入250μl缓冲液B，振荡5s充分混匀；
7、加250μl无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，瞬时离心以去除管内壁的水珠；
8、将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中（吸附柱放入收集管中）12000rpm（～13400×g）离心30s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
9、向吸附柱中加入500μl缓冲液C，12000rpm（～13400×g）离心30s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
10、向吸附柱中加入700μl漂洗液W2（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（～13400×g）离心30s，倒掉废液，吸附柱放入收集管中；
11、向吸附柱中加入500μl漂洗液W2，12000rpm（～13400×g）离心30s，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。然后12000rpm（～13400×g）离心2min。将吸附柱置于一个新的1.5ml离心管中，室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
12、将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加135μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm（～13400×g）离心2min，将溶液收集到离心管中，冻于-40℃，待实验研究使用。
实施例3：PCR扩增，电泳结果
以提取的结核分枝杆菌全基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增基因为KatG基因，所用引物5’-CCGCCTTTGCTGCTTTCTC-3’和5’-GGGGCTGATCTACGTGAAC-3’。
PCR扩增体系：2×PCR预混液25μL（含rTaq酶，TAKARA），正反向引物各1μM，模板DNA50ng，加入21μL去离子水。
PCR反应条件为：94度变性5分钟，然后35个循环的（94度变性30秒，50度退火30秒，72度延伸1分30秒），最后终末72度延伸7分钟。扩增产物长度为983bp，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测，选用DL2000型号DNAmarker作为PCR扩增产物对照，配制胶浓度为1.5%的琼脂糖凝胶，120伏恒压条件下，电泳20-30分钟。电泳结束后将琼脂糖凝胶放入EB染液中染色5-10分钟，置于紫外灯下观察电泳条带并进行记录，电泳结果见图2。
实施例4：测序结果
PCR产物送测序公司进行序列测定，测序引物为5’-CCGCCTTTGCTGCTTTCTC-3’，测序后经与结核分枝杆菌标准株序列进行对比，发现突变位点c.906C>A，突变序列见序列表，突变图谱见图1。
序列表
<110>昆明理工大学
<120>结核分枝杆菌KatG突变基因及其用途
<160>3
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<400>1
ccgcctttgctgctttctc19
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<400>2
ggggctgatctacgtgaac19
<210>3
<211>2223
<212>DNA
<213>Mycobacteriumtuberculosis
<400>3
gtgcccgagcaacacccacccattacagaaaccaccaccggagccgctagcaacggctgt60
cccgtcgtgggtcatatgaaataccccgtcgagggcggcggaaaccaggactggtggccc120
aaccggctcaatctgaaggtactgcaccaaaacccggccgtcgctgacccgatgggtgcg180
gcgttcgactatgccgcggaggtcgcgaccatcgacgttgacgccctgacgcgggacatc240
gaggaagtgatgaccacctcgcagccgtggtggcccgccgactacggccactacgggccg300
ctgtttatccggatggcgtggcacgctgccggcacctaccgcatccacgacggccgcggc360
ggcgccgggggcggcatgcagcggttcgcgccgcttaacagctggcccgacaacgccagc420
ttggacaaggcgcgccggctgctgtggccggtcaagaagaagtacggcaagaagctctca480
tgggcggacctgattgttttcgccggcaactgcgcgctggaatcgatgggcttcaagacg540
ttcgggttcggcttcggccgggtcgaccagtgggagcccgatgaggtctattggggcaag600
gaagccacctggctcggcgatgagcgttacagcggtaagcgggatctggagaacccgctg660
gccgcggtgcagatggggctgatctacgtgaacccggaggggccgaacggcaacccggac720
cccatggccgcggcggtcgacattcgcgagacgtttcggcgcatggccatgaacgacgtc780
gaaacagcggcgctgatcgtcggcggtcacactttcggtaagacccatggcgccggcccg840
gccgatctggtcggccccgaacccgaggctgctccgctggagcagatgggcttgggctgg900
aagagatcgtatggcaccggaaccggtaaggacgcgatcaccaccggcatcgaggtcgta960
tggacgaacaccccgacgaaatgggacaacagtttcctcgagatcctgtacggctacgag1020
tgggagctgacgaagagccctgctggcgcttggcaatacaccgccaaggacggcgccggt1080
gccggcaccatcccggacccgttcggcgggccagggcgctccccgacgatgctggccact1140
gacctctcgctgcgggtggatccgatctatgagcggatcacgcgtcgctggctggaacac1200
cccgaggaattggccgacgagttcgccaaggcctggtacaagctgatccaccgagacatg1260
ggtcccgttgcgagataccttgggccgctggtccccaagcagaccctgctgtggcaggat1320
ccggtccctgcggtcagccacgacctcgtcggcgaagccgagattgccagccttaagagc1380
cagatcctggcatcgggattgactgtctcacagctagtttcgaccgcatgggcggcggcg1440
tcgtcgttccgtggtagcgacaagcgcggcggcgccaacggtggtcgcatccgcctgcag1500
ccacaagtcgggtgggaggtcaacgaccccgacggggatctgcgcaaggtcattcgcacc1560
ctggaagagatccaggagtcattcaactccgcggcgccggggaacatcaaagtgtccttc1620
gccgacctcgtcgtgctcggtggctgtgccgccatagagaaagcagcaaaggcggctggc1680
cacaacatcacggtgcccttcaccccgggccgcacggatgcgtcgcaggaacaaaccgac1740
gtggaatcctttgccgtgctggagcccaaggcagatggcttccgaaactacctcggaaag1800
ggcaacccgttgccggccgagtacatgctgctcgacaaggcgaacctgcttacgctcagt1860
gcccctgagatgacggtgctggtaggtggcctgcgcgtcctcggcgcaaactacaagcgc1920
ttaccgctgggcgtgttcaccgaggcctccgagtcactgaccaacgacttcttcgtgaac1980
ctgctcgacatgggtatcacctgggagccctcgccagcagatgacgggacctaccagggc2040
aaggatggcagtggcaaggtgaagtggaccggcagccgcgtggacctggtcttcgggtcc2100
aactcggagttgcgggcgcttgtcgaggtctatggcgccgatgacgcgcagccgaagttc2160
gtgcaggacttcgtcgctgcctgggacaaggtgatgaacctcgacaggttcgacgtgcgc2220
tga2223
Claims (3)
1.一种结核分枝杆菌KatG突变基因，其特征在于：该突变基因具有c.906C>A突变位点，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。
2.权利要求1所述的结核分枝杆菌KatG突变基因在制备用于检测耐异烟肼结核分枝杆菌试剂盒中的应用，所述试剂盒包括用于检测结核分枝杆菌KatG基因c.906C>A突变的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述试剂盒包括核苷酸序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的引物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510802206.0A CN105316349A (zh) | 2015-11-19 | 2015-11-19 | 结核分枝杆菌KatG突变基因及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510802206.0A CN105316349A (zh) | 2015-11-19 | 2015-11-19 | 结核分枝杆菌KatG突变基因及其用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105316349A true CN105316349A (zh) | 2016-02-10 |
Family
ID=55244667
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510802206.0A Pending CN105316349A (zh) | 2015-11-19 | 2015-11-19 | 结核分枝杆菌KatG突变基因及其用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105316349A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105969861A (zh) * | 2016-05-17 | 2016-09-28 | 石河子大学 | 一种用于结核杆菌异烟肼耐药性快速检测的引物及其试剂盒 |
| CN106498069A (zh) * | 2016-11-14 | 2017-03-15 | 昆明理工大学 | 用于检测耐药结核分枝杆菌KatG基因C906A突变的特异性引物 |
| CN110777154A (zh) * | 2019-07-19 | 2020-02-11 | 华大生物科技（武汉）有限公司 | 用于结核分枝杆菌耐药检测的突变基因、及其检测方法和试剂盒 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1311435A (zh) * | 2001-04-13 | 2001-09-05 | 中国科学院上海冶金研究所 | 结核分支杆菌耐药性检测芯片及其制作方法和应用方法 |
| CN104561339A (zh) * | 2015-01-22 | 2015-04-29 | 首都医科大学附属北京胸科医院 | 一种检测来源于结核分枝杆菌的待测dna分子中snp位点的试剂盒 |
-
2015
- 2015-11-19 CN CN201510802206.0A patent/CN105316349A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1311435A (zh) * | 2001-04-13 | 2001-09-05 | 中国科学院上海冶金研究所 | 结核分支杆菌耐药性检测芯片及其制作方法和应用方法 |
| CN104561339A (zh) * | 2015-01-22 | 2015-04-29 | 首都医科大学附属北京胸科医院 | 一种检测来源于结核分枝杆菌的待测dna分子中snp位点的试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| COCKERILL FR 3RD ET AL: "Rapid identification of a point mutation of the Mycobacterium tuberculosis catalase-peroxidase(katG) gene associated with isoniazid resistance", 《J INFECT DIS.》 * |
| 陈玲等: "新rpoB和katG基因突变的检测及其与耐利福平和异烟肼结核分枝杆菌的关系分析", 《中华医学会结核病学分会2010年学术年会论文汇编》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105969861A (zh) * | 2016-05-17 | 2016-09-28 | 石河子大学 | 一种用于结核杆菌异烟肼耐药性快速检测的引物及其试剂盒 |
| CN106498069A (zh) * | 2016-11-14 | 2017-03-15 | 昆明理工大学 | 用于检测耐药结核分枝杆菌KatG基因C906A突变的特异性引物 |
| CN110777154A (zh) * | 2019-07-19 | 2020-02-11 | 华大生物科技（武汉）有限公司 | 用于结核分枝杆菌耐药检测的突变基因、及其检测方法和试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105506118B (zh) | 用于检测cyp2c19基因分型的引物对、荧光探针、试剂盒及方法 | |
| JP2017212993A (ja) | 肝臓病変を評価する方法 | |
| Vrgoc et al. | Interleukin‐17 and Toll‐like Receptor 10 genetic polymorphisms and susceptibility to large joint osteoarthritis | |
| CN104774933A (zh) | 用于检测人il28b基因多态性的引物、试剂盒及方法 | |
| CN103205488B (zh) | 一种预测强直性脊柱炎易感性的方法和试剂 | |
| CN105331623A (zh) | 结核分枝杆菌rpoB突变基因及其用途 | |
| CN105316349A (zh) | 结核分枝杆菌KatG突变基因及其用途 | |
| CN109913482A (zh) | Pik3ca-i874r突变基因及其在乳腺癌辅助诊断中的应用 | |
| CN103820545A (zh) | 用于检测人abcg2基因突变的探针、引物及试剂盒 | |
| CN109593849A (zh) | 一组与结直肠癌相关的血浆LncRNA标记物及其应用 | |
| CN109234282A (zh) | BRCA1基因g.43063754T>G突变体及其在乳腺癌辅助诊断中的应用 | |
| Jiao et al. | Gene analysis of two cases with CisAB/B blood subgroup | |
| CN103710447B (zh) | 一种预测强直性脊柱炎易感性的方法和试剂 | |
| CN103710448B (zh) | 一种预测强直性脊柱炎易感性的方法和试剂盒 | |
| CN105316350A (zh) | 结核分枝杆菌EmbB突变基因及其用途 | |
| CN103667439A (zh) | 可区分hbv b型和非b型的双探针实时定量pcr法 | |
| Wang et al. | A visual detection assay for Helicobacter pylori in saliva based on recombinase-aided amplification and peptide nucleic acid-assisted split DNAzyme probes | |
| CN105671198A (zh) | 检测肝糖原累积症iii型agl基因突变的试剂盒及其应用 | |
| CN110055258A (zh) | 一种乳腺癌相关基因ERBB2位点g.39717320G>A突变体及其应用 | |
| CN103882112B (zh) | 一种预测强直性脊柱炎易感性的试剂及方法 | |
| CN103695549B (zh) | 预测强直性脊柱炎易感性的试剂 | |
| CN103882111B (zh) | 一种预测强直性脊柱炎易感性的试剂 | |
| CN103882113B (zh) | 一种预测强直性脊柱炎易感性的试剂盒 | |
| CN105316348A (zh) | 结核分枝杆菌RpsL突变基因及其用途 | |
| CN103882110B (zh) | 一种检测强直性脊柱炎易感性的试剂 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160210 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |