CN103667439A - 可区分hbv b型和非b型的双探针实时定量pcr法 - Google Patents

可区分hbv b型和非b型的双探针实时定量pcr法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种双探针实时荧光定量PCR方法，更具体涉及一种可区分HBVB型和非B型的双探针实时定量PCR法。本发明建立了一种基于型特异性碱基设计的双探针实时定量PCR法，适用于B、C基因型流行的亚洲和太平洋地区HBV感染者HBV核酸定量的同时进行粗略基因分型，并且避免了其他少见基因型的漏检。该方法包括以下步骤：（1）设计保守引物，及针对B型和非B型的Taqman探针；（2）提取血清样本中HBVDNA；（3）双探针实时荧光定量PCR,同时对HBVDNA进行分型和定量。本发明建立的双探针实时定量PCR法准确、灵敏、特异、重复性好，可以同时进行HBVDNA的定量检测和基因分型，适合于临床推广。

Description

可区分HBV B型和非B型的双探针实时定量PCR法
技术领域
本发明涉及一种双探针实时荧光定量PCR方法，更具体涉及一种可区分HBV B型和非B型的双探针实时定量PCR法。 
  
背景技术
乙型肝炎病毒感染严重威胁着人类的健康，可引起急慢性乙型肝炎、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌等肝脏疾病。目前全球有超过3.5亿的慢性HBV感染者，每年死于HBV感染所致的终末期肝病和肝癌的人数超过100万人，快速、准确地诊断乙型肝炎对于其治疗及预后有着重要意义。 
发明内容
外周血HBV DNA的存在是诊断HBV感染最直接可靠的指标，也是慢性乙型肝炎诊断和治疗过程中重要的监测项目。当前，HBV依据其基因组异质性≥8％至少可以分为A～I 9个基因型，不同的基因型呈显著的地域性分布，在HBV高度流行的亚洲和太平洋地区以B基因型和C基因型为主，兼有少量的其他基因型（例如D型）。近年来，研究表明不同的基因型和疾病的进展、抗病毒治疗的效果及临床预后有一定的相关性，B基因型感染者比C基因型感染者较早出现HBeAg血清学转换，较少进展为肝硬化和肝癌，而且对干扰素治疗的应答率较高。因此，在亚太地区，将B基因型和非B基因型区分开来对于HBV感染后疾病进展的风险预测和治疗方案的选择具有重要意义。更重要的是，在进行抗病毒治疗的患者中发现了“基因型漂移”的现象，可能与机体的免疫状况和药物抗病毒压力有关。因此，在监测患者体内HBV DNA的量的变化的同时有必要实时监测HBV基因型,这样可以更好地动态地指导抗病毒治疗，及时调整治疗方案，也可以更好地预测预后及转归。 
目前，HBV DNA定量主要有实时PCR、分子杂交定量等方法，HBV基因分型主要有测序法、PCR-RFLP等方法。其中测序法是基因分型的“金标准”，但其价格较贵，对混合型的检出能力较差，限制了其在临床上的广泛应用；此外，如果分别进行HBV DNA定量检测和基因分型，既费时、费力，又增加患者负担。鉴于此，本发明建立了一种基于型特异性碱基设计的双探针实时定量PCR法，适用于B、C基因型流行的亚洲和太平洋地区HBV感染者HBV核酸定量的同时进行粗略基因分型，并且避免了其他少见基因型的漏检。 
发明内容    
基于上述目的，本发明建立了一种可区分HBV B型和非B型的双探针实时定量PCR法。
本发明采取的技术方案如下： 
一种可区分HBV B型和非B型的双探针实时定量PCR法，包括以下步骤：（1）通过对已明确基因型的HBV全基因组序列进行比对，选择保守区设计保守引物，即上游引物F和下游引物R，同时选择型特异性碱基聚集区设计针对B型和非B型的Taqman探针，其中B型探针5′端标记Hex荧光基团，非B型探针5′端标记FAM荧光基团，两者3′端均标记猝灭基团；（2）提取血清样本中HBV DNA；（3）双探针实时荧光定量PCR：保守引物能扩增所有基因型HBV DNA，而B型探针只能结合B基因型HBV DNA，非B型探针能结合余下所有基因型HBV DNA，然后在PCR反应进行时，Taqman探针被Taq酶水解而发出荧光，通过监测扩增曲线，并记录荧光阈值,同时对HBV DNA进行分型和定量。
所述双探针实时荧光定量PCR的反应体系： 2×Premix Ex Taq 10μl，20μmol/L上游引物F 0.2μl，20μmol/L下游引物R 0.2μl，20 μmol/L B型探针0.3μl，20 μmol/L非B型探针0.3μl，50×ROX 0.4μl，模板2μl，ddH2O 6.6μl，总体积20μl；反应条件：95℃ 30s → 95℃ 5s，60℃ 30s 40个循环，在60℃选择Hex和FAM通道采集荧光信号，分别代表B基因型和非B基因型扩增，结果用ABI StepOne plus软件确定各样品的循环阈值。 
上述涉及的引物如下： 
上游引物F
CTAGACTCGTGGTGGACTTCTC，
下游引物R
ATGAGGCATAGCAGCAGGAT，
B型探针
非B型探针
以B基因型质粒作为B型扩增的标准品，C基因型质粒作为非B型扩增的标准品，分别绘制B基因型和非B基因型标准曲线，通过标准曲线对未知样品定量；同时对HBV DNA进行分型，若仅在Hex通道检出红色扩增曲线为B基因型，若仅在FAM通道检出绿色扩增曲线为非B基因型；若同时在Hex和FAM通道检出扩增曲线为混合基因型。
为了测试本发明的实用性，本申请人做了一系列有益的试验如下： 
1.  双探针实时荧光定量PCR法的建立
选择保守区设计引物，选择型特异性碱基聚集区设计针对B基因型和非B基因型的Taqman探针，建立能在1个反应体系能够对HBV DNA进行定量并区分B基因型和非B基因型的方法。
2.  双探针实时荧光定量PCR法的方法学评价 
评价双探针实时荧光定量PCR法的线性范围、检测下限、灵敏度、特异性、重复性等指标。
3.  双探针实时荧光定量PCR法检测效能评价及其初步临床应用 
以凯杰公司HBV DNA核酸定量检测试剂盒作为HBV DNA定量参照方法，申友公司HBV基因分型试剂盒为HBV基因分型参照方法，同双探针实时荧光定量PCR法平行检测539例HBV感染者血清标本，评价本发明方法定量和分型的准确性。
其结果如下： 
1.  成功建立双探针实时荧光定量PCR法
本发明的双探针实时荧光定量PCR法能够对HBV DNA进行定量并且能够区分B基因型和非B基因型HBV。在Hex通道检出典型扩增曲线为B基因型；在FAM通道检出典型扩增曲线为非B基因型；同时在Hex和FAM通道检出典型扩增曲线为混合基因型。
2.  双探针实时荧光定量PCR法方法学评价 
双探针实时荧光定量PCR法检测B、非B基因型的灵敏度均为500kIU/L；线性范围均为103～109 IU/ml；混合基因型达到10％时就能检测出来；批内和批间CV在0.84％～2.80％之间；对其他病毒感染者和健康志愿者血清检测结果均为阴性。
3.  双探针实时荧光定量PCR法检测效能评价及其初步临床应用 
509例HBV DNA阳性检测结果，基因分型结果与HBV测序分型试剂盒总符合率为93.5％（476/509，kappa=0.876, P<0.05）；DNA定量结果与凯杰HBV核酸定量测定试剂盒定量结果有很好的相关性（R 2 =0.94，P<0.05），且经Bland-Altman分析，95.7％(487/509)的值在95％一致性界限以内，两种方法HBV DNA定量一致性较好。
509例HBV DNA阳性结果中,检出B基因型275例（54.03%）、C基因型201例（39.49%）、B/C混合基因型33例（6.48%），DNA载量分别为5.51（4.23～6.74）、5.94（4.52～7.58）、5.33（4.25～6.31）IU/ml，C基因型感染者DNA水平高于B基因型和B/C混合基因型感染者（P均＜0.05）；B基因型的血清HBeAg阳性率（54.91%）低于C基因型（64.18%）和B/C混合基因型（78.13%）（P均＜0.05），C基因型与B/C混合型HBeAg阳性率无统计学差异（P=0.194）；乙型肝炎携带组、慢性乙型肝炎组、肝硬化组、肝癌组、表面抗原携带组DNA载量分别为7.92（7.56～8.36）、6.27（5.15～6.96）、4.71（4.18～5.65）、3.41（3.04～4.51）、3.54（3.09～4.35）IU/ml，乙型肝炎携带组DNA水平显著高于其他4组（P均＜0.001）；慢性乙型肝炎组DNA水平与肝硬化组、肝癌组、表面抗原携带组差异均有统计学意义（P均＜0.001）；肝硬化组DNA水平与肝癌组和表面抗原携带组差异也有统计学意义（P均＜0.05）；而肝癌组DNA水平与表面抗原携带组的差异无统计学意义（P=0.556）。 
本发明的显著优点：本发明建立的双探针实时定量PCR法准确、灵敏、特异、重复性好，可以同时进行HBV DNA的定量检测和基因分型，适合于临床推广。 
附图说明
图1为普通PCR扩增目的片段电泳图，其中：目的片段为182bp，C1～C6泳道为C基因型标本，B6～B1泳道为B基因型标本。 
图2为双探针实时荧光定量PCR典型扩增曲线图，左侧为Hex通道（B基因型）典型扩增曲线，右侧为FAM通道（非B基因型）典型扩增曲线。 
图3为双探针实时荧光定量PCR标准曲线图，左侧为B 基因型标准曲线，右侧为非B基因型标准曲线。 
图4为双探针实时荧光定量PCR检测不同浓度标准品的扩增曲线图，左图为B基因型质粒标准品扩增曲线，右图为C基因型质粒标准品扩增曲线；两图中从左到右扩增曲线的标准品浓度分别为109~103 IU/ml。 
图5中A表示定量分型双探针实时PCR法灵敏度：B、C基因型质粒能稳定检测的最低浓度均为500 IU/ml；图5中 B表示108IU/ml不同比例混合型质粒标准品扩增曲线：图5中 B上图为C基因型质粒占优势时，不同比例B基因型质粒扩增曲线；图5中 B下图为B基因型质粒占优势时，不同比例C基因型质粒扩增曲线。 
图6为双探针实时荧光定量PCR与凯杰核酸定量试剂盒测定DNA结果的相关性。 
图7为本发明与凯杰核酸定量试剂测定DNA结果一致性评价，其中：±1.96 SD：差值均数±1.96倍差值的标准差。 
具体实施方式
材料与方法
一、实验材料
1. 对象
2012年2月至2012年12月福建医科大学附属第一医院住院和门诊HBV感染者539例，经血清学检测均为HBsAg、HBeAg或者HBeAb阳性，并排除甲、丙、戊型肝炎病毒感染和其他肝脏病变；男395例,年龄（37±13）岁，女144例，年龄（36±13）岁；均符合2010慢性乙型肝炎防治指南及第五届全国传染病和寄生虫病学术会议制定的病毒性肝炎防治方案诊断标准。此外, 选取HBsAg阴性的丙型肝炎病毒感染、单纯疱疹病毒感染、人类乳头瘤病毒感染者各5例，其相应核酸检测均为阳性；另选择肝功能正常的健康志愿者5名。所有待检者均取静脉血5 ml,静置15 min，13 000 × g离心10 min后，取血清-80℃保存待测。
 2.主要试剂
病毒基因组核酸提取试剂盒              上海捷瑞生物工程有限公司
DNA  Marker                          天根生化（北京）有限公司
TaKaRa Taq TM                                            宝生物工程（大连）有限公司
2×Premix Ex TaqTM                     宝生物工程（大连）有限公司
琼脂糖（Agarose）                      上海生工生物工程公司
大肠埃希菌DH5α感受态细胞            宝生物工程（大连）有限公司
高纯质粒小量制备试剂盒                天根生化（北京）有限公司
HBV DNA核酸定量检测试剂盒           深圳凯杰生物工程公司
HBV DNA荧光定量PCR检测试剂盒      湖南圣湘生物科技有限公司
HBV测序分型试剂盒                    上海申友公司
HBV DNA国家标准品GBW（E）090031   卫生部临检中心。
 3.主要实验仪器
StepOne plus 型荧光定量PCR仪         美国ABI公司
LightCycler 480实时荧光定时PCR仪     瑞士罗氏公司
WD-9413B 凝胶成像分析仪             北京六一仪器厂
DYY-7C 型电泳仪                     北京六一仪器厂
SW-CJ-ZF型医用超净工作台            苏州净化设备有限公司生产
DK-8D 型电热恒温水槽                上海精宏实验设备有限公司
HDYD-2004B水平摇床                 北京六一仪器厂
超低温冰箱                           青岛海尔股份有限公司
微量移液枪                           德国Eppendorf公司
漩涡混合器                           上海医大仪器厂
台式高速离心机                       德国Eppendorf公司
AU2700全自动生化分析仪              日本OLYMPUS公司
ARCHITECHi2000全自动免疫分析仪     美国雅培公司。
二．实验方法
1. 引物和探针的设计
从GenBank数据库中查找提交的已明确基因型的HBV全基因组序列（A～I型），用DNAman软件比对，找型特异性碱基聚集区，设计针对B基因型和非B基因型的Tqaman探针（B基因型探针5′端标记Hex荧光基团，非B基因型探针5′端标记FAM荧光基团，两者3′端均标记猝灭基团）；之后选取保守区，设计针对A～I基因型的保守引物，保守区能扩增所有基因型模板，而型特异性探针与对应的基因型扩增产物结合后，在PCR反应进行时，被Taq酶水解而发出荧光。扩增片段长度为182bp，所有引物和探针均经BLAST验证。
 2.  HBV基因组DNA的提取
抽提HBV DNA采用上海捷瑞生物工程有限公司的病毒基因组DNA提取试剂盒（离心柱型），按试剂说明书操作如下：
2.1. 将冻存于-80℃的上述研究对象的血清取出，置于室温完全融化，旋窝振荡器混匀，瞬时离心，甩去管壁残留液体。
 2.2 在1.5 ml离心管中加入200 μl上述血清，加入400 μl DVI Buffer，混匀；加入3 μl Proteinase K，混匀，55℃保温5 min。 
 2.3 加入260 μl无水乙醇，混匀，然后用1 ml Tip头将样品全部转移到GENCLEAN柱，柱子放入2.0 ml Collection Tube。 
 2.4 用台式离心机，10,000 rpm，室温离心1 min。 
 2.5 取下GENCLEAN柱，弃去离心管中的废液。将柱子放回同一根离心管中，加入500 μl Wash solution，10,000 rpm，室温离心1 min。 
 2.6 重复步骤5一次。 
 2.7 取下GENCLEAN柱，弃去离心管中的全部废液。将柱子放回同一根离心管中，10,000 rpm，室温离心1 min，以除去残留的Wash solution。 
 2.8 将柱子放入新的无菌的1.5 ml 离心管中，在柱子中央加入30 μl Elution Buffer，室温放置2 min。 
 2.9 10,000 rpm，室温离心1min。离心管中的液体即为病毒DNA。用紫外分光光度计测定抽提DNA纯度和浓度，-20℃保存。-20 ℃保存备用。 
 3.常规PCR
3.1. 1反应体系
表1 常规PCR反应体系
3.1. 2扩增条件                                                                                                             
94℃ 1min → {94℃ 30s，60℃ 30s,72℃ 1min} 35个循环 → 72℃ 5min。
 4.质粒标准品
B、C基因型HBV DNA全长质粒由福建医科大学分子医学研究中心林旭教授惠赠。其中B基因型质粒作为B型（Hex通道）扩增的标准品，C基因型质粒作为非B型（FAM通道）扩增的标准品。
 4.1转化
4.1.1 将冻存于-80℃的1管大肠埃希菌DH5α感受态细胞（100 μl）置于0℃冰浴解冻，加入B、C全长质粒，双手轻轻将菌液混匀，置冰浴盆内冰浴30min。同时设阴性（感受态细胞悬液不加入外源DNA）及阳性对照（感受态细胞悬液加入采用插入DNA对照建立的连接反应产物）。
 4.1.2将EP管放42℃水浴箱中热休克60～90 S（禁止摇动）,快速放入冰浴盆冰浴1～2 min,使细胞冷却 
4.1.3 重复上述步骤一次。
 4.1.4向每个离心管中加入890 ul 37 ℃无菌预热的LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃摇床振荡培养1h（150 rpm/min），使菌体复苏。 
 4.1.5IPTG-X-gal平板制备：在含氨苄或卡那抗生素平板上，滴加40 ??L的X-gal储液及5 ??L的IPTG储液(怕体积过小影响涂布均匀，可适当稀释后再涂布)，涂布均匀后晾干后使用。在临使用前提前2h制备,并在37 ℃孵育放置，使培养基表面的液体完全被吸收后，待用。 
 4.1.6取出温箱中的培养皿，将转化菌全部加入，用无菌的弯头玻棒均匀涂布，正放于37℃温箱2h，待转化产物完全被培养基吸收后倒置过夜。 
 4.2阳性克隆筛选
37℃培养过夜后，置于4℃显色2小时，阳性对照培养基上有大量的白色菌落出现，阴性对照培养基上无菌落出现；实验反应管培养基上可有蓝白两种颜色的菌落，根据克隆技术的原理，白色菌落为已有插入片段的阳性克隆。
 4.3菌落PCR鉴定和培养
    用无菌枪头挑取B、C基因型单个菌落，在20 μl无菌纯水中混匀，取10 μl混合液接种到5 ml LB液体培养基（含100 μg/ml氨苄青霉素）中，37℃恒温摇床中振荡过夜，待提质粒；取2 μl混合液作为模板，进行PCR扩增，扩增产物进行2%的琼脂糖凝胶电泳，观察有无目的条带出现。菌落PCR鉴定为阳性的，提取质粒进一步鉴定。
 4.4质粒的抽提
采用北京天根生化有限公司的高纯质粒小量制备试剂盒抽提质粒，具体步骤如下：
4.4.1 柱平衡步骤：向吸附柱CP3（吸附柱放入收集管中）加入500 μl的平衡液BL，12000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
 4.4.2取1～5 ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12000 rpm离心1 min，尽量吸取上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。 
 4.4.3向留有菌体沉淀的离心管中加入250 μl溶液P1（预先加入RNaseA）使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮沉淀。 
 4.4.4向离心管中加入250 μl溶液P2，温和地上下翻转6～8次使菌体充分分裂。 
 4.4.5向离心管中加入350 μl溶液P3，立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12000 rpm离心10 min，此时在离心管底部形成沉淀。 
 4.4.6将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12000 rpm离心30～60 s，倒掉收集管中的废液，将吸收柱CP3放入收集管中。 
 4.4.7向吸附柱CP3中入600 μl漂洗液PW（预先已加入无水乙醇），12000 rpm离心30～60 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。 
 4.4.8重复步骤7。 
 4.4.9将吸附柱CP3放入收集管中，12000 rpm离心2 min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。 
 4.4.10将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50～100μl洗脱缓冲液EB，室温放置2 min，12000 rpm离心2 min 将质粒溶液收集到离心管中，可立即用于实验或-20℃保存。 
 4.5质粒测序鉴定
用上下游引物作为B、C质粒的测序引物，将抽提质粒送交上海生工生物工程技术服务有限公司测序，并将序列测定结果与GenBank上序列进行比较。
 4.6重组质粒及其转化菌株的保存
经鉴定的质粒直接冻存于-20℃冰箱，同时将质粒转化菌株接种于含100μg/ml Amp的LB培养液中，37℃振荡培养至OD600≈0.6时，加入等体积的30%的灭菌甘油，混匀后，-80℃保存。
 4.7质粒的定量及标定
4.7.1 质粒的拷贝数定量
将提取的质粒基因组DNA取10μl 加入90μl ddH2O，用Eppendorf紫外分光光度计测其OD值，分析样品的DNA浓度和纯度。采用一个样本连续检测三次260nm、280nm紫外吸收值，按照1OD＝50ng/ul换算再乘以稀释倍数10得到 DNA浓度，260nm/280nm光吸收值可以显示DNA纯度。
 4.7.2溯源至国际单位
标准血清采用HBV DNA国家标准品GBW（E）090031，其量值为1.03×106 IU/ml，可溯源到第一代HBV DNA国际一级标准物质。
用上海捷瑞生物工程有限公司的病毒基因组DNA提取试剂盒抽提标准血清，然后用湖南圣湘公司HBV核酸定量测定试剂盒将标准血清DNA和稀释至106 copies/ml的B、C基因型质粒同时在LightCycler荧光定量PCR仪上进行检测(参数设定、操作步骤和结果判定均参照仪器及试剂盒说明书)，从而根据标准血清的IU值，将copies/ml换算为国际单位IU/ml。 
 5.双探针实时荧光定量PCR体系的建立
5.1检测原理
本研究通过对大量HBV全基因组序列进行比对，选择保守区设计引物，然后选择型特异性碱基聚集区分别设计针对B基因型和除B基因型以外基因型（简称非B型）的Taqman探针（B型探针5′端标记Hex荧光基团，非B型探针5′端标记FAM荧光基团）。保守引物可以扩增A～I型HBV DNA，而B型探针只能结合B基因型HBV DNA，非B型探针能结合余下所有基因型HBV DNA。PCR扩增时，Taq酶的5′～3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。
 5.2反应体系
表2 同时定量分型实时荧光PCR体系
Figure DEST_PATH_IMAGE004
5．3  反应条件
95℃ 30s → {95℃ 5s，60℃ 30s} 40个循环。 
在60℃选择Hex和FAM通道采集荧光信号，分别代表B基因型和非B基因型扩增，结果用ABI StepOne plus软件确定各样品的循环阈值（Cycle threshold，Ct）。 
 5．4 标准曲线的建立：
将B、C基因型质粒标准品稀释为9个浓度（1011~103 IU/ml）作为模板，分别按以上反应体系进行双探针实时定量PCR，分别绘制B基因型和非B基因型标准曲线,通过标准曲线对未知样品定量。
 6.方法学评价实验：
对建立的双探针实时定量PCR技术进行方法学评价，包括线性范围、重复性、特异性、灵敏度及线性范围等。
 6.1线性范围: 以梯度稀释的B、C基因型重组质粒为模板，按上述双探针实时定量PCR反应体系和条件条件在StepOne plus PCR仪上扩增，选取有典型“S”形扩增曲线且Ct值与质粒标准品起始浓度存在良好线性关系的浓度范围为本发明方法的线性范围。 
 6.2灵敏度：用低浓度的B、C基因型质粒标准品对本发明方法进行重复验证，找到在最优反应条件下能够稳定检测的最低浓度，为该方法的灵敏度。 
 6.3特异性：取丙型肝炎病毒感染者、单纯疱疹病毒感染者、人类乳头瘤病毒感染者、健康志愿者血清各5份抽提DNA，取2 μl上机检测,以检测本发明方法对HBV DNA是否为特异性扩增。 
 6.4检测混合型标本的能力：取108 IU/ml浓度的B、C基因型质粒标准品，分别按照不同比例混合，测试本发明方法能够检出的最低混合型比例。 
 6.5重复性：取高、中、低3份不同浓度的B、C基因型质粒标准品（107、105、103 IU/ml）作同批次20次重复和不同批次20次重复，分别计算批内及批间Ct值CV，以验证方法的重复性。 
 6.6试剂稳定性：我们将除了Premix Ex TaqTM（2×）和模板以外的试剂配制成工作液（包括引物、探针、双蒸水、ROX），用不同条件下的工作液检测不同浓度的质粒标准品来验证试剂的稳定性，计算Ct值CV，以验证试剂稳定性。 
 7．方法学比较实验: 
以深圳凯杰生物工程公司HBV核酸定量检测试剂盒为HBV DNA定量参照方法（检测线性范围1×103~1×108 IU/ml），上海申友公司HBV基因分型试剂盒（DNA测序法）为HBV基因分型参照方法（可区分出HBV A~I基因型），同本发明的双探针实时荧光定量PCR法平行测定临床标本，评价本发明方法定量和分型的准确性。本发明双探针实时荧光定量PCR法用B、C基因型全长质粒标准品分别制作标准曲线，通过监测扩增曲线，并记录荧光阈值（Ct）,同时对HBV DNA进行分型和定量。本发明的实时PCR法采用HBV核酸定量测定试剂盒在LightCycler荧光定量PCR仪上进行；测序法采用HBV测序分型试剂盒在3130 DNA测序仪上进行，参数设定、操作步骤和结果判定均参照仪器及试剂盒说明书。
三、统计学分析
用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。HBV DNA定量测定结果呈偏态分布，用中位数和四分位数间距[M（P 25～P 75）]表示，本发明分型定量双探针实时荧光PCR法与凯杰公司实时 PCR法定量结果的线性相关强度分析采用Pearson相关分析，结果的一致性评价采用Bland-Altman分析；与申友公司基因分型试剂盒（DNA测序法）分型结果的符合率比较采用kappa一致性检验；不同基因型HBeAg阳性率的比较采用
Figure DEST_PATH_IMAGE006
检验；各型间和各组间DNA水平比较采用Kruskal-Wallis H检验，进一步两两比较采用Mann-Whitney U检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。 
实验结果
一、   引物和探针的设计
    从GenBank数据库中下载提交的已明确基因型的891条HBV全基因组序列（A～I型），用DNAman软件比对，对其同源性进行分析，找型特异性碱基聚集区，设计针对B基因型和非B基因型的Tqaman探针（B基因型探针5′端标记Hex荧光基团，非B基因型探针5′端标记FAM荧光基团）；之后选取保守区，设计针对A～I基因型的保守引物，保守区能扩增所有基因型模板，而型特异性探针只能与对应的基因型扩增产物结合。引物和探针由大连宝生物公司合成（表3）。
表3 保守引物和型特异性探针 
Figure DEST_PATH_IMAGE001
注：下划线部分为型特异性碱基
二、普通PCR扩增结果
分别扩增B、C基因型HBV DNA，之后取10 μl 扩增产物于98 V电压下2%琼脂糖凝胶电泳40min，置于WD-9413B 凝胶成像分析仪中观察电泳结果（图1）。C6～C1泳道为C基因型标本，B6～B1泳道为B基因型标本，扩增序列的片段大小分别为182bp，与设计目的片段大小一致，并且无引物二聚体和非特异性扩增，引物特异性较好。
三、质粒测序鉴定
用上下游引物作为B、C质粒的测序引物，与所设计探针一致。
四、    同时双探针实时荧光定量PCR方法的建立及方法学评价
1. 典型扩增曲线：
用本发明双探针实时荧光定量PCR检测HBV DNA标本，若仅在Hex通道检出红色扩增曲线为B基因型；若仅在FAM通道检出绿色扩增曲线为非B基因型；若同时在Hex和FAM通道检出扩增曲线为混合基因型（图2）。
 2.标准曲线
2.1 质粒标准品的定量
鉴定无误后，将冻存于-80℃的菌种（菌液B、菌液C）分别接种于LB培养液中进行增殖，之后用质粒小量抽提试剂盒抽提，所得产物B、C基因型质粒用Eppendorf核酸蛋白测定仪测定， B重组质粒浓度为96.5 g/ul，OD260/OD280=1.89； C重组质粒浓度为86.5 ng/ul，OD260/OD280=1.85；根据以下公式将质粒浓度换算为拷贝数。
Figure DEST_PATH_IMAGE010
， 
用上海捷瑞生物工程有限公司的病毒基因组DNA提取试剂盒抽提标准血清，然后用湖南圣湘公司HBV核酸定量测定试剂盒将标准血清DNA和106 copies/ml的B、C基因型质粒同时在LightCycler荧光定量PCR仪上进行检测，将标准质粒的单位转换成国际单位IU/ml，1IU/ml=2.15copies/ml。
 2.2标准曲线的建立
分别以10倍倍比稀释的B、C质粒标准品（1011~103IU/ml）为模板，在实时荧光定量PCR仪上进行扩增。以Ct值为纵坐标，以不同浓度的对数值为横坐标，分别建立B基因型和非B基因型的标准曲线。B基因型标准曲线为Y=-3.32X +44.898，回归系数R2=0.999，扩增效率为100.21％；非B基因型标准曲线为Y=-3.29X +43.122，回归系数R2=0.998，扩增效率为101.358％（图3）。
 3.方法学评价：
3.1 线性范围
用本发明双探针实时荧光定量PCR检测梯度稀释的B、C基因型质粒标准品，结果显示在103~1011 IU/ml范围内 B、C基因型质粒标准品的Ct值与该标准品模板起始浓度存在良好的线性关系，扩增曲线均呈典型“S”形，故认为本发明双探针实时荧光定量PCR法检测线性范围为103~109 IU/ml（图4）。
 3.2灵敏度
本发明双探针实时荧光定量PCR法能稳定检测最低浓度B、C基因型质粒标准品均为500 IU/ml（图5A），故本法的灵敏度为500 IU/ml。
 3.3检测混合型标本的能力：
如图5B所示，本发明双探针实时荧光定量PCR法能稳定检测出优势基因型中低达10％的劣势基因型：上图为C基因型质粒占优势时，不同比例B基因型质粒扩增曲线；下图为B基因型质粒占优势时，不同比例C基因型质粒扩增曲线。
 3.4特异性
用本发明双探针实时荧光定量PCR法对HBsAg阴性HCV感染者、单纯疱疹病毒感染者、人类乳头瘤病毒感染者和肝功能正常健康志愿者血清标本各5份进行检测，均为阴性结果，未形成典型扩增曲线，说明该方法检测HBV DNA具有特异性。
 3.5重复性
取高、中、低3份不同浓度的B、C基因型质粒标准品（107、105、103 IU/ml）作同批次20次重复和不同批次20次重复，B基因型质粒标准品高、中、低浓度的批内CV分别为0.84％、2.69％和1.70％，批间 CV为1.58％、2.15％和2.24％；C基因型质粒标准品高、中、低浓度的批内CV分别为1.54％、1.37％和1.56％，批间CV为2.80％、2.13％和2.08％，表明该方法重复性较好。
 3.6试剂稳定性
将工作液分别按以下条件处理：-20℃保存36小时、-20℃保存5天、-20℃光照2小时、反复冻融5次，检测不同浓度的B、C基因型质粒标准品的Ct值，其变异系数均＜2％（表4）。说明试剂稳定性较好，光照和反复冻融对其性能影响较小。
表4 不同条件下工作液检测质粒标准品Ct值变异系数 
Figure DEST_PATH_IMAGE012
五、    方法学比较
用本发明双探针实时荧光定量PCR法检测539例HBsAg阳性的血清标本，其中509例HBV DNA大于检测限；同时用凯杰公司HBV DNA核酸定量检测试剂盒和申友公司HBV基因分型试剂盒对该509例标本进行测定，评价本发明方法定量和分型的准确性。
 1.分型结果与商品化测序试剂盒比较
本发明方法检出B基因型275例（54.0％），非B基因型201例（39.5％），混合基因型33例（6.5％），与申友公司测序试剂盒检测结果（B基因型282例，C基因型227例，混合基因型未检出）比较，符合率为93.5％（476/509，kappa=0.876,P＜0.01）。表明2种方法有较好的一致性。
 2. DNA定量结果与商品试剂盒比较：
2.1 线性相关强度分析
本发明双探针实时荧光定量PCR法与凯杰公司HBV核酸定量试剂盒定量结果的线性相关强度分析采用Pearson相关分析（图6）：本发明检测509例HBV感染者标本的DNA定量结果[5.81（4.35～6.95）IU/ml]与凯杰公司HBV核酸定量试剂盒DNA定量结果[5.84（4.60～7.08）IU/ml]呈显著相关关系（R 2=0.94,P＜0.05）。
 2.2结果一致性评价
本发明双探针实时荧光定量PCR法与凯杰公司HBV核酸定量试剂盒定量结果的一致性评价采用Bland-Altman分析：以本发明方法与凯杰公司试剂盒DNA定量结果的平均值为横坐标，以它们的差值d为纵坐标，标绘出散点图，并以差值的均数±1.96倍差值的标准差为95％一致性界限（图7）。由图可见，95.7％(487/509)的值在95％一致性界限以内，说明两种方法HBV DNA定量一致性较好。
  
                         SEQUENCE LISTING
<110>  福建医科大学附属第一医院
<120>  可区分HBV B型和非B型的双探针实时定量PCR法
<160>  4     
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  1
ctagactcgt ggtggacttc tc  22
<210>  2
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  2
atgaggcata gcagcaggat  20
<210>  3
<211>  26
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  3
tcgcagtccc aaatctccag tcactc 26
<210>  4
<211>  23
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  4
tcgcagtccc caacctccaa tca 23。
SEQUENCE LISTING
 
<110>  福建医科大学附属第一医院
<120>  可区分HBV B型和非B型的双探针实时定量PCR法
<160>  4    
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  1
ctagactcgt ggtggacttc tc  22
 
<210>  2
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  2
atgaggcata gcagcaggat  20
 
<210>  3
<211>  26
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  3
tcgcagtccc aaatctccag tcactc 26
 
<210>  4
<211>  23
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  4
tcgcagtccc caacctccaa tca 23
 
 

Claims (4)

1.一种可区分HBV B型和非B型的双探针实时定量PCR法，其特征在于：包括以下步骤：（1）通过对已明确基因型的HBV全基因组序列进行比对，选择保守区设计保守引物，即上游引物F和下游引物R，同时选择型特异性碱基聚集区设计针对B型和非B型的Taqman探针，其中B型探针5′端标记Hex荧光基团，非B型探针5′端标记FAM荧光基团，两者3′端均标记猝灭基团；（2）提取血清样本中HBV DNA；（3）双探针实时荧光定量PCR：保守引物能扩增所有基因型HBV DNA，而B型探针只能结合B基因型HBV DNA，非B型探针能结合余下所有基因型HBV DNA，然后在PCR反应进行时，Taqman探针被Taq酶水解而发出荧光，通过监测扩增曲线，并记录荧光阈值,同时对HBV DNA进行分型和定量。
2.根据权利要求1所述的双探针实时荧光定量PCR方法，其特征在于：双探针实时荧光定量PCR的反应体系： 2×Premix Ex Taq 10μl，20μmol/L上游引物F 0.2μl，20μmol/L下游引物R 0.2μl，20 μmol/L B型探针0.3μl，20 μmol/L非B型探针0.3μl，50×ROX 0.4μl，模板2μl，ddH2O 6.6μl，总体积20μl；反应条件：95℃ 30s ，95℃ 5s、60℃ 30s 40个循环，在60℃选择Hex和FAM通道采集荧光信号，分别代表B基因型和非B基因型扩增，结果用ABI StepOne plus软件确定各样品的循环阈值。
3.根据权利要求1所述的可区分HBV B型和非B型的双探针实时定量PCR法，其特征在于：涉及的引物如下：
上游引物F
CTAGACTCGTGGTGGACTTCTC，
下游引物R
ATGAGGCATAGCAGCAGGAT，
B型探针
TCGCAGTCCCAAATCTCCAGTCACTC， 
非B型探针
TCGCAGTCCCCAACCTCCAATCA。
4.根据权利要求1所述的可区分HBV B型和非B型的双探针实时定量PCR法，其特征在于：以B基因型质粒作为B型扩增的标准品，C基因型质粒作为非B型扩增的标准品，分别绘制B基因型和非B基因型标准曲线，通过标准曲线对未知样品定量；同时对HBV DNA进行分型，若仅在Hex通道检出红色扩增曲线为B基因型，若仅在FAM通道检出绿色扩增曲线为非B基因型；若同时在Hex和FAM通道检出扩增曲线为混合基因型。
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