CN112359145B - 快速检测甲型流感、乙型流感和新型冠状病毒的多重引物及试剂盒 - Google Patents

快速检测甲型流感、乙型流感和新型冠状病毒的多重引物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种快速检测甲型流感、乙型流感和新型冠状病毒的多重引物及试剂盒，涉及分子生物学检测技术及分子诊断领域。本发明的基于用反转录热对流实时荧光PCR的方法，针对甲型流感病毒、乙型流感病毒和新型冠状病毒各自保守区域开发的特异性多重快速诊断体系，同时还检测人内源基因进行样本质控。该多重引物和试剂盒的特异性好、灵敏度高，还具有简便、快速和实用的特点，满足出入境和现场环境下对甲型流感病毒、乙型流感病毒和新型冠状病毒的检测需要。

Description

快速检测甲型流感、乙型流感和新型冠状病毒的多重引物及 试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术及分子诊断领域，特别是涉及一种快速检测甲型流感、乙型流感和新型冠状病毒的多重引物及试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒肺炎是一种急性感染性肺炎，其病原体是一种新型冠状病毒，2020年1月12日被世界卫生组织命名为“2019-nCoV”。该病毒传染能力强，感染人后初始症状多为发热、乏力和干咳，并逐渐出现呼吸困难等严重表现，多数预后良好，但部分严重病例可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡，因此对感染者、携带者和疑似人群进行准确检测对疫情防控至关重要。
同为呼吸道易传染病原体的流行性感冒病毒(Influenza viruses,Flu)，简称流感病毒，是引起流行性感冒的病原体，流行性感冒是由甲(A)、乙(B)、丙(C)三型流感病毒分别引起的急性呼吸道传染病，它传染性强、传播快、潜伏期短、发病率高。人流感主要是甲型流感病毒和乙型流感病毒引起的，甲型流感病毒比较容易发生变异，流感大流行就是甲型流感病毒出现新亚型或旧亚型重现引起的，乙型病毒通常引起局限性流行。
当下，新型冠状病毒快速蔓延时期也正是流感高发期，新型冠状病毒与流感病毒传播方式相同、感染后部分症状相同或相似，甚至部分患者出现混合感染，难以通过临床表现、胸部影像学进行鉴别。新冠疫情防控所面临一个重要问题就是把新冠肺炎病毒感染者和流感病毒感染者分开。因此为达到精准区分、分类治疗及避免交叉感染，开发同时检测流感病毒和新冠病毒的产品具有重要意义。
目前市场上常见的新型冠状病毒核酸检测产品或新型冠状病毒和流感病毒多重检测产品多为普通荧光PCR法检测产品，耗时长，除核酸提取外扩增检测过程基本需要1.5～2h，且对实验室环境要求较高。
因此，本发明意于开发一种快速、灵敏度高、特异性强的新冠流感多重核酸检测试剂盒，具有可运用于检验所、出入境、口岸等现场快速检测的优势。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，提供一种快速检测甲型流感、乙型流感和新型冠状病毒的多重引物，该多重引物是针对甲型流感病毒、乙型流感病毒和新型冠状病毒各自保守区域开发设计，并同时检测人内源基因进行样本质控，可适用于反转录热对流实时荧光PCR的方法，扩增甲型流感病毒、乙型流感病毒和新型冠状病毒高保守区，22min内即可结束反应，具有高效、灵敏度高的特点。
一种快速检测甲型流感、乙型流感和新型冠状病毒的多重引物，包括：甲型流感病毒M基因、乙型流感病毒NS基因、新型冠状病毒N基因以及人源性内参基因的特异性引物对和特异性探针；
所述甲型流感病毒M基因特异性引物对为：
正向引物：5’-ACTTGAAGATGTCTTTGCAGGGA-3’(SEQ ID NO.1)；
反向引物：5’-TGGGCACGGTGAGCGTGAACA-3’(SEQ ID NO.2)；
所述甲型流感病毒M基因特异性探针为：
5’-ACACCGATCTTGAGGTTCTCATGGAAT-3’(SEQ ID NO.3)；
所述乙型流感病毒NS基因特异性引物对为：
正向引物：5’-CACTGATGATCTTACAGTGGAG-3’(SEQ ID NO.4)；
反向引物：5’-ACCGCAGTTTCAGCTGCTCG-3’(SEQ ID NO.5)；
所述乙型流感病毒NS基因特异性探针为：
5’-ATGAAGAAGATGGCCATCGGATCCTCAAC-3’(SEQ ID NO.6)；
所述新型冠状病毒N基因特异性引物对为：
正向引物：5’-ACGTGGTCCAGAACAAACCCA-3’(SEQ ID NO.7)；
反向引物：5’-GAACGCTGAAGCGCTGGG-3’(SEQ ID NO.8)；
所述新型冠状病毒N基因特异性探针为：
5’-ACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACTGA-3’(SEQ ID NO.9)；
所述人源性内参基因特异性引物对为：
正向引物：5’-GCCACCACTGCCCTGATGTGC-3’(SEQ ID NO.10)；
反向引物：5’-GCCCTGCTGCGGTGTGATGGG-3’(SEQ ID NO.11)；
所述人源性内参基因特异性探针为：
5’-ATCCTGCTGGTGGGCACCAAGAAGGAC-3’(SEQ ID NO.12)。
上述多重引物，是基于用反转录热对流实时荧光PCR的方法，针对甲型流感病毒、乙型流感病毒和新型冠状病毒各自保守区域开发的特异性多重快速诊断体系，同时还检测人内源基因进行样本质控。该多重引物的特异性好、灵敏度高，还具有简便、快速和实用的特点，满足出入境和现场环境下对甲型流感病毒、乙型流感病毒和新型冠状病毒的检测需要。
在其中一个实施例中，所述甲型流感病毒M基因特异性探针在5’端标记FAM荧光基团，在3’端标记BHQ1淬灭基团；
所述乙型流感病毒NS基因特异性探针在5’端标记HEX荧光基团，在3’端标记BHQ1淬灭基团；
所述新型冠状病毒N基因特异性探针在5’端标记Texas Red荧光基团，在3’端标记BHQ2淬灭基团；
所述人源性内参基因特异性探针在5’端标记CY5荧光基团，在3’端标记BHQ2淬灭基团。
本发明还提供一种上述快速检测甲型流感、乙型流感和新型冠状病毒的多重引物作为热对流实时荧光检测试剂在甲型流感病毒、乙型流感病毒和新型冠状病毒检测中的应用，以待测样品的RNA为模板，利用所述多重引物进行扩增和热对流实时荧光检测。
本发明还提供一种上述快速检测甲型流感、乙型流感和新型冠状病毒的多重引物在制备特异性多重检测甲型流感病毒、乙型流感病毒和新型冠状病毒试剂中的应用。
本发明还提供一种用于检测甲型流感、乙型流感和新型冠状病毒的试剂盒，包括试剂Ⅰ和试剂Ⅱ；所述试剂Ⅰ包括Taq聚合酶、MgCl2、dNTPs和上述多重引物；所述试剂Ⅱ为快速逆转录酶。
在其中一个实施例中，所述试剂Ⅰ中，Taq聚合酶的浓度为0.03～0.05U/μL，MgCl2的浓度为4～5mM，dNTPs的浓度为0.15～0.25mM，所述甲型流感病毒M基因特异性引物对、乙型流感病毒NS基因特异性引物对、新型冠状病毒N基因特异性引物对、人源性内参基因特异性引物对的浓度均为0.3～0.5μM，所述甲型流感病毒M基因特异性探针、乙型流感病毒NS基因特异性探针、新型冠状病毒N基因特异性探针、人源性内参基因特异性探针的浓度均为0.1～0.3μM。
在其中一个实施例中，所述试剂Ⅱ为冻干形态的快速逆转录酶，所述冻干形态的快速逆转录酶的总量为1400～1600U。
在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品，所述阴性质控品为生理盐水，所述阳性质控品为包括甲型流感病毒M基因目的片段的假病毒、乙型流感病毒NS基因目的片段的假病毒、新型冠状病毒N基因目的片段的假病毒和人源性内参基因目的片段。
在其中一个实施例中，所述假病毒的浓度为1.0×102～1.0×104copies/μL。
在其中一个实施例中，所述试剂盒的PCR扩增条件为：50℃反转录3min，95℃2min，60℃退火，热对流PCR反应50个循环。
本发明提供的试剂盒反应试剂和操作过程与一般PCR相同，其区别在于，热对流PCR检测方法结合热对流PCR仪，利用液体在高低不同温度之间可形成从高温自动向低温湍流的原理，设置双层金属板，上层为退火温度(低温)，下层为变性温度(高温)；扩增溶液体系可自动在管内实现循环，从而达到不断变性、退火的PCR扩增循环过程。使用热对流PCR实现稳定扩增存在困难，比如热对流流体路径很难保证是规则的，这就导致无法保证反应体系能充分完成变性、退火和延伸三大步骤，往往存在扩增效率偏低、扩增特异性差及管间差异大等问题。热对流PCR中对反应试剂特别是引物、探针等特异性试剂的设计要求更高。
本发明提供的试剂盒中进行待检标本检测时需要同时进行两种质控品的检测，并且要求阴阳质控品检测结果需在同一次实验中同时满足：阳性质控品甲型流感病毒、乙型流感病毒、新型冠状病毒及内参基因通道有明显扩增曲线，且Ct值≤34；阴性质控品甲型流感病毒、乙型流感病毒、新型冠状病毒及内参基因通无扩增曲线，或Ct值＞40，待检标本的检测结果才有效。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的快速检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及新型冠状病毒的引物组，特异性强，与多种其他常见呼吸道病原体无交叉反应，对于普通流感和新型冠状病毒的辅助诊断及指导临床用药具有较高的参考价值。
本发明的用于多重快速检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及新型冠状病毒的试剂盒，灵敏度高，甲型流感病毒、乙型流感病毒、新型冠状病毒(2019-nCoV)的检出限均为1copies/μL；因具备快速高效逆转录酶及快速高效聚合酶、特异性强的多重引物探针，结合热对流PCR仪器具备的超快速升降温功能，其完成快速检测时间与普通实时荧光PCR相比从100～120min可缩短至22min，大大提高了检测效率。在具备核酸检测高灵敏度及准确性的优势下，又具有快速、可现场检测等POCT产品特点，使得本发明能达到快速辅助诊断流感病毒和新型冠状病毒感染、区分、避免交叉感染作用，可用于检验所、海关口岸等现场甲型流感病毒、乙型流感病毒和新型冠状病毒的快速检测，采样方便，适于推广应用。
附图说明
图1为甲型流感病毒、乙型流感病毒及新型冠状病毒多重引物探针组合1(包括SEQID NO.1～SEQ ID NO.12)试验扩增结果图，甲型流感病毒、乙型流感病毒核酸浓度为1.0×104copies/μL，新型冠状病毒核酸浓度为5.0×101copies/μL；
图2为甲型流感病毒、乙型流感病毒及新型冠状病毒多重引物探针组合2(包括SEQID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ IDNO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48)试验扩增结果图，甲型流感病毒、乙型流感病毒核酸浓度为1.0×104copies/μL，新型冠状病毒核酸浓度为5.0×101copies/μL；
图3为甲型流感病毒、乙型流感病毒及新型冠状病毒多重引物探针组合3(包括SEQID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33、SEQID NO.37、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39)试验扩增结果图，甲型流感病毒、乙型流感病毒核酸浓度为1.0×104copies/μL，新型冠状病毒核酸浓度为5.0×101copies/μL；
图4为甲型流感病毒、乙型流感病毒及新型冠状病毒核酸10倍倍比稀释浓度分别为1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100copies/μL的扩增结果图；
图5为均稀释至1.0×103copies/μL的地方性人类冠状病毒(HKU1，OC43，NL63和229E)、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒、呼吸道合胞病毒A型、呼吸道合胞病毒B型、人腺病毒(ADV3)、人腺病毒(ADV7)、人腺病毒(ADV55)、副流感病毒2型、柯萨奇病毒B、EB病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、脑膜炎双球菌、风疹病毒、腮腺炎病毒的特异性检测结果图；
图6为甲型流感病毒、乙型流感病毒及新型冠状病毒核酸稀释至1.0×102copies/μL重复16反应的重复性检测结果图；
图7为18例临床样本检测结果图；
图8为20例临床样本检测结果图；
图9为15例临床样本检测结果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1
特异性引物探针的设计和优化。
参照流感诊疗指南及新型冠状病毒诊疗指南，核酸检测是判断感染新冠病毒确诊的金标准，为了确保甲型流感病毒、乙型流感病毒及新型冠状病毒的检出，根据这三种病原体的核酸序列，分析其基因的保守区域，最终选定在甲型流感病毒M基因、乙型流感病毒NS基因及新型冠状病毒N基因的保守区域分别设计引物探针，为获得特异性及灵敏度较好的多重引物探针体系组合，共设计了包括60条引物28条探针，并组合多重试验。同时，设计人源内参基因对标本采集、核酸提取过程及PCR扩增过程进行监控。
在上述引物、探针设计过程中，尽量避免发卡结构、引物内部二聚体、引物间二聚体以及碱基错配的形成。通过对NCBI Blast在线数据库对上述设计的甲型流感病毒、乙型流感病毒及新型冠状病毒的特异性引物和探针序列进行特异比对分析。此外，多重扩增技术的难点还有同一体系中的不同引物间的竞争性抑制会影响扩增效率外，不同引物对的非特异结合也会影响扩增效率，并且引物探针组数量越多，非特异结合越复杂。在常规实时荧光定量PCR上进通过多轮筛选和优化后，再通过反转录热对流PCR进行测试，最终确定了一套灵敏度和特异性最优的引物、探针序列。由于内容过多，选择部分结果进行呈现，部分引物探针如下表1所示，部分引物探针组合试验结果如图1、图2所示。
表1.本实施例设计部分引物与探针
Figure GDA0002892201410000051
Figure GDA0002892201410000061
Figure GDA0002892201410000071
基于上述大量工作，最终优选出特异性好、扩增效率高的甲型流感病毒、乙型流感病毒及新型冠状病毒引物探针组合(包括内参)如表2所示。
表2.本发明所使用的引物与探针
Figure GDA0002892201410000072
具体的，SEQ ID NO.3、NO.6、NO.9、NO.12所示探针中5’端标记有荧光报告基团选自下组：FAM、HEX、JOE、ROX、Texas Red、CY3、CY5，3’端标记有淬灭基团选自下组：TAMARA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB。其中甲型流感病毒探针序列SEQ ID NO.3的5’端荧光基团为FAM，3’端标记淬灭基团为BHQ1；乙型流感病毒探针序列SEQ ID NO.6的5’端荧光基团为HEX，3’端标记淬灭基团为BHQ1；新型冠状病毒探针序列SEQ ID NO.9的5’端荧光基团为Texas Red，3’端标记淬灭基团为BHQ2；人源性内参探针序列SEQ ID NO.12的5’端荧光基团为CY5，3’端标记淬灭基团为BHQ2。
其中，甲型流感病毒M基因目的片段序列如下：
AGCAAAAGCAGGTTGATATTGAAAGATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGTACGTTCTCTCTATCGTCCCGTCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGATCGCACAGAGACTTGAAGATGTCTTTGCAGGGAAGAACACCGATCTTGAGGTTCTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTAAGGGGATTTTAGGATTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGGGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAATGCTCTTAATGGGAACGGAGATCCAAATAACATGGACAAAGCAGTTAAACTGTATAGGAAGCTTAAGAGGGAGATAACATTCCATGGGGCCAAAGAAATAGCACTCAGTTATTCTGCTGGTGCACTTGCCTGTTGTATGGGCCTCATATACAACAGGATGGGGGCTGTGACCACTGAAGTGGCATTTGGCCTGGTATGCGCAACCTGTGAACAGATTGCTGACTCCCAGCATCGGTCTCATAGGCAAATGGTGACAACAACCAATCCACTAATCAGACATGAGAACAGAATGGTTCTAGCCAGCACTACAGCTAAGGCTATGGAGCAAATGGCTGGATCGAGTGAGCAAGCAGCAGAGGCCATGGATATTGCTAGTCAGGCCAGGCAAATGGTGCAGGCGATGAGAACCGTTGGGACTCATCCTAGCTCCAGTGCTGGTCTAAAAGATGATCTTCTTGAAAATTTACAGGCCTATCAGAAACGAATGGGGGTGCAGATGCAACG(SEQ ID NO.49)
乙型流感病毒NS基因目的片段序列如下：
CCCCTCAACACCAGAGAGGTGCCTTGATGACATAGAGGAAGAACCAGAGGATGTTGATGGCCCAACTGAAATAGTATTAAGGGACATGAACAACAAAGATGCAAGGCAAAAGATAAAGGAGGAAGTAAACACTCAGAAAGAAGGGAAGTTCCGTTTGACAATAAAAAGGGATATGCGTAATGTATTGTCCTTGAGAGTGTTGGTAAATGGAACATTCCTCAAACACCCCAATGGATACAAGTCCTTATCAACTCTGCATAGATTGAATGCATATGACCAGAGTGGAAGGCTTGTTGCTAAACTTGTTGCCACTGATGATCTTACAGTGGAGGATGAAGAAGATGGCCATCGGATCCTCAACTCACTCTTCGAGCGTCTCAATGAAGGACATTCAAAGCCAATTCGAGCAGCTGAAACTGCGGTGGGAGTCTTATCCCAATTTGGTCAAGAGCACCGATTATCACCAGAAGAGGGAGACAATTAGATTGGTCACGGAAGAACTTTATCTTTTAAGTAAAAGAATTGATGATAACATACTATTCCACAAAACAATGATAGCTAACAGCTCCATAATAGCTGACATGGTTGTATCATTATCATTATTAGAAACATTGTATGAAATGAAGGATGTGGTTGAAGTGTACAGCAGGCAGTGCTTGTGA(SEQ ID NO.50)
新型冠状病毒N基因目的片段序列如下：
GCAATCCTGCTAACAATGCTGCAATCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAATGTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCTTCTAAGAAGCCTCGGCAAAAACGTACTGCCACTAAAGCATACAATGTAACACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACGTGGTTGACCTACACAGGTGCCATCAAATTGGATGACAAAGATCCAAATTTCAAAGATCAAGTCATTTTGCTGAATAAGCATATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAGAAGGCTGATGAAACTCAAGCCTTACCGCAGAGACAGAAGAAACAGCAAACTGTGACTCTTCTTCCTGCTGCAGATTTGGATGATTTCTCCAAACAATTGCAACAA(SEQ ID NO.51)
人源性内参片段序列如下：
GCTACACAACTAACGCTTTCCCCAAAGAGTACATCCCCACCGTGTTCGACAATTACAGCGCGCAGAGCGCAGTTGACGGGCGCACAGTGAACCTGAACCTGTGGGACACTGCGGGCCAGGAGGAGTATGACCGCCTCCGTACACTCTCCTACCCTCAGACCAACGTTTTCGTCATCTGTTTCTCCATTGCCAGTCCGCCGTCCTATGAGAACGTGCGGCACAAGTGGCATCCAGAGGTGTGCCACCACTGCCCTGATGTGCCCATCCTGCTGGTGGGCACCAAGAAGGACCTGAGAGCCCAGCCTGACACCCTACGGCGCCTCAAGGAGCAGGGCCAGGCGCCCATCACACCGCAGCAGGGCCAGGCACTGGCCAAGCAGATCCACGCTGTGCGCTACCTCGAATGCTCAGCCCTGCAACAGGATGGTGTCAAGGAAGTGTTCGCCGAGGCTGTCCGGGCTGTGCTCAACCCCACGCCGATCAAGCGTGGGCGGTCCTGCATCCTCTTGTGACCCTGGCACTTGGCTTGGAGGCTGCCCCTGCCCTCCCCCCACCAGTTGTGCCTTGGTGCCTTGTCCGCCTCAGCTGTGCCTTAAGGACTAATTCTGGCACCCCTTTCCAGGGGGTTCCCTGAATGCCTTTTTCTCTGAGTGCCTTTTTCTCCTTAAGGAGGCCTGCAGAGAAAGGGGCTTTGGGCTCTGCCCCCCTCTGCTTGGGAACACTGGGTATTCTC(SEQ ID NO.52)
实施例2
一种用于多重快速检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及新型冠状病毒的试剂盒，包括：
试剂Ⅰ(735μl)：Taq聚合酶(0.04U/uL)、MgCl2(4.5mM)、dNTPs(0.2mM)，以及甲型流感病毒、乙型流感病毒及新型冠状病毒的引物浓度均为0.4μM，探针浓度为0.25μM。
试剂Ⅱ(1500U)：冻干形态的快速逆转录酶。
阴性质控品：生理盐水。
阳性质控品：含甲型流感病毒、乙型流感病毒、新型冠状病毒及内参基因目的片段的假病毒，假病毒浓度为1.0×102～1.0×104copies/μL。
实施例3
用于多重快速检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及新型冠状病毒的试剂盒的检测方法。
1、标本类型：口咽拭子、鼻咽拭子。
2、核酸提取：
采用商品化RNA提取试剂盒，如基于硅胶膜离心柱法的核酸提取试剂或基于磁珠法核酸提取的试剂，并按试剂盒说明书进行操作，最后收集到80μl RNA溶液，直接进行检测或保存于-80℃。阴性质控品、阳性质控品均需进行提取。
3、扩增反应：
每管完整的检测体系应包括14.7μL试剂I、0.3μL试剂II(为冻干形态，使用前先加入20μLdepc水溶解，冰上放置10min以上方可使用)、5μL质控品或待检样本核酸。具体可按照以下操作步骤进行检测：
3.1试剂准备：
初次使用该试剂盒时，首先向试剂II(冻干)中加入20μLdepc水溶解，冰上放置10min以上方可使用。
3.2体系配置：
根据检测所需总反应数N(包括待检样本数、1份阴性质控品、1份阳性质控品)，计算所需试剂I(14.7μL/test)、试剂II(0.3μL/test)的总量，混匀后再分装到特制的PCR反应管中。
3.3加样：
向已分装有试剂的PCR反应管中分别加入阴性质控品，样本RNA溶液，阳性质控品，加样量均为5μL，盖紧管盖，混匀，离心收集溶液置管底。
3.4上机扩增检测：
50℃3min，95℃2min，60℃退火，热对流PCR反应50个循环，总时长22min。选择FAM通道、HEX通道、Texas Red通道和CY5通道，进行检测。
3.5结果分析：
反应结束后保存检测数据文件，查看各样品曲线情况，在样本孔可查看相应检测结果。有明显扩增曲线的反应孔且CT<34即为阳性结果，无明显扩增曲线的反应孔即为阴性结果。
实施例4
灵敏度检测。
使用甲型流感病毒、乙型流感病毒及新型冠状病毒培养物测定浓度后，稀释到合适浓度后再进行10倍倍比稀释，浓度分别为1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100copies/μL。
用上述确定的检测体系和循环参数对上述甲型流感病毒、乙型流感病毒及新型冠状病毒培养物稀释的6个梯度浓度进行检测。结果显示灵敏度数据为1.0×100copies/μL，表明该检测方法具较高的灵敏度，检测结果如图4所示。
实施例5
特异性检测。
将地方性人类冠状病毒(HKU1，OC43，NL63和229E)、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒、呼吸道合胞病毒A型、呼吸道合胞病毒B型、人腺病毒(ADV3)、人腺病毒(ADV7)、人腺病毒(ADV55)、副流感病毒2型、柯萨奇病毒B、EB病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、脑膜炎双球菌、风疹病毒、腮腺炎病毒的病原体培养物或假病毒稀释至1.0×103copies/μL作为特异性检测样本进行检测，检测结果如图5所示(图中出现的扩增曲线为阳性质控品扩增曲线)。
检测结果表明，地方性人类冠状病毒(HKU1，OC43，NL63和229E)、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒、呼吸道合胞病毒A型、呼吸道合胞病毒B型、人腺病毒(ADV3)、人腺病毒(ADV7)、人腺病毒(ADV55)、副流感病毒2型、柯萨奇病毒B、EB病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、脑膜炎双球菌、风疹病毒、腮腺炎病毒，共22种病原体，检测结果均为阴性，阴阳性质控品正常检出，表明本发明的试剂盒特异性良好。
实施例6
重复性检测。
选取甲型流感病毒、乙型流感病毒及新型冠状病毒培养物稀释到1.0×104、1.0×102copies/μL，采用上述试剂盒及循环参数，进行重复测试，每个浓度重复16次。检测结果如表2，扩增曲线选取1.0×102copies/μL展示，如图6。
表3.重复性检测结果
1.0×10<sup>4</sup>copies/μL 1.0×10<sup>2</sup>copies/μL
甲型流感病毒 阳性率100％，CV:1.23％ 阳性率100％，CV:3.87％
乙型流感病毒 阳性率100％，CV:1.54％ 阳性率100％，CV:4.2％
新型冠状病毒 阳性率100％，CV:1.07％ 阳性率100％，CV:3.07％
实施例7
临床样本检测。
1、样本处理
取灭活并经临床确认为甲型流感病毒的口咽拭子样本8例、鼻咽拭子4例，乙型流感病毒的口咽拭子样本10例、鼻咽拭子7例，新型冠状病毒口咽拭子样本5例及19例阴性临床样本，使用商业化的试剂盒并按照试剂盒说明书进行核酸提取，阴阳质控品参与提取。
2、试剂准备
2.1从试剂盒中取出试剂I和试剂II，试剂I室温融化后振荡混匀，8000rpm离心数秒后放置在冰上备用。试剂II首次使用前先加入20μLdepc水溶解，冰上放置10min备用。
2.2根据待测样本数N+1((N＝待测样本个数+阴性质控品+阳性质控品)配制反应试剂。单人份扩增体系配制如下：
表4.扩增体系
Figure GDA0002892201410000111
2.3取N个专用PCR反应管，使用细长枪头进行PCR反应液分装，每管15μL。
3、加样
于上述反应管中分别加入经提取的阴性质控品、待测标本核酸、阳性质控品各5μL，盖紧管盖，8500rpm离心2min，离心完成后注意观察反应管中是否存在肉眼可见气泡，如有需重复一次离心。如无肉眼可见气泡，将各反应管放入便携式超高速实时荧光定量PCR仪(阿赫姆生物系统公司)中。
4、扩增
程序设置为：50℃反转录3min，95℃预变性2min，60℃退火，热对流PCR反应50个循环，约22min。选择FAM通道、HEX通道、Texas Red通道和CY5通道，进行检测。
5、结果判定与分析
反应结束后保存检测数据文件，根据分析后图像调节阈值线，用户可根据实际情况自行调整5％～10％。
5.1阳性判断值
5.1.1阴性质控品：FAM、HEX、Texas Red、CY5检测通道无明显扩增曲线，或Ct值>40；
阳性质控品：FAM、HEX、Texas Red、CY5检测通道有明显扩增曲线，Ct值≤34；
以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
5.1.2各通道CT值≤40，扩增曲线为典型“S”型，则相应靶标基因检测结果为阳性。
5.2结果分析
5.2.1检测样本的CY5内参基因通道CT值≤40，在阈值线以上的扩增曲线为典型“S”型，否则该次实验视为无效。CT值≤40，扩增曲线为典型“S”型，相应靶标基因检测结果为阳性。
5.2.2若检测样本的Cy5通道有扩增曲线，且Ct值≤40；FAM、HEX、Texas Red检测通道均无明显扩增曲线或Ct值>40，可判样本为Flu A、Flu B、2019-nCoV阴性。
5.2.3若检测样本的Cy5通道有扩增曲线，且Ct值≤40；FAM、HEX、Texas Red任一或多个通道扩增曲线Ct值≤40，可判样本相应通道靶标基因检测结果为阳性。
5.2.4 FAM、HEX或Texas Red检测通道为阳性时，由于体系的竞争关系，Cy5通道结果可能为阴性，可根据FAM、HEX或Texas Red检测结果判断样本的阴阳性。
5.2.5本发明检测已灭活并经临床确认的53例样本，其中内参通道(CY5通道)阳性扩增结果53例、阴性扩增结果0例，甲型流感病毒检测通道(FAM通道)阳性扩增结果12例、阴性扩增结果41例，乙型流感病毒检测通道(HEX通道)阳性扩增结果17例、阴性扩增结果24例，新型冠状病毒检测通道(Texas Red通道)阳性扩增结果5例、阴性扩增结果48例，与临床确认结果的阴阳符合率为100％。检测结果如图7、图8、图9所示。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州领上源生物科技有限公司
<120> 快速检测甲型流感、乙型流感和新型冠状病毒的多重引物及试剂盒
<160> 52
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acttgaagat gtctttgcag gga 23
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgggcacggt gagcgtgaac a 21
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acaccgatct tgaggttctc atggaat 27
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cactgatgat cttacagtgg ag 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
accgcagttt cagctgctcg 20
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgaagaaga tggccatcgg atcctcaac 29
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acgtggtcca gaacaaaccc a 21
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaacgctgaa gcgctggg 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
accaggaact aatcagacaa ggaactga 28
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gccaccactg ccctgatgtg c 21
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gccctgctgc ggtgtgatgg g 21
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atcctgctgg tgggcaccaa gaaggac 27
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aagcaggttg atattgaaa 19
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tccatgagaa cctcaagatc ggt 23
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gtcgaaacgt acgttctctc tatcgtc 27
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aatcctgtca cctctgacta ag 22
<210> 17
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ccatgttatt tggatctccg tt 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
taggatttgt gttcacgctc accgtgcc 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ctgctggtgc acttgcctgt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ccatcctgtt gtatatgagg cccata 26
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ctcataggca aatggtgaca aca 23
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cactcagtta ttctgctggt gc 22
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tatgagaccg atgctgggag t 21
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ttgcctgttg tatgggcctc atataca 27
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
acaagtcctt atcaactctg cat 23
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
aggatccgat ggccatcttc ttca 24
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gattgaatgc atatgaccag agtggaag 28
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
atcttacagt ggaggatgaa ga 22
<210> 29
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ggataagact cccaccgc 18
<210> 30
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ccatcggatc ctcaactcac tcttcga 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
cgattatcac cagaagaggg a 21
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
agctattatg gagctgttag 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
caattagatt ggtcacggaa gaacttta 28
<210> 34
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agagcaccga ttatcaccag aaga 24
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<212> DNA
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accatgtcag ctattatgga g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gattggtcac ggaagaactt tatct 25
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tcggcagacg tggtccaga 19
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<212> DNA
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<400> 38
ttccgaagaa cgctgaagcg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
tgtaatcagt tccttgtctg attagtt 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
cggtgatgct gctcttgctt 20
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<212> DNA
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<400> 41
cagatttctt agtgacagtt tgg 23
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<211> 29
<212> DNA
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<400> 42
ctgctgcttg acagattgaa ccagcttga 29
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
tgatgctgct cttgctttgc t 21
<210> 44
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
agcagcagat ttcttagtga cag 23
<210> 45
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
tgacagattg aaccagcttg agagcaa 27
<210> 46
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gccgcaaatt gcacaatttg cc 22
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
aatttggatc tttgtcatcc aat 23
<210> 48
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
agcgcttcag cgttcttcgg aatgtcg 27
<210> 49
<211> 774
<212> DNA
<213> A型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 49
agcaaaagca ggttgatatt gaaagatgag tcttctaacc gaggtcgaaa cgtacgttct 60
ctctatcgtc ccgtcaggcc ccctcaaagc cgagatcgca cagagacttg aagatgtctt 120
tgcagggaag aacaccgatc ttgaggttct catggaatgg ctaaagacaa gaccaatcct 180
gtcacctctg actaagggga ttttaggatt tgtgttcacg ctcaccgtgc ccagtgagcg 240
gggactgcag cgtagacgct ttgtccaaaa tgctcttaat gggaacggag atccaaataa 300
catggacaaa gcagttaaac tgtataggaa gcttaagagg gagataacat tccatggggc 360
caaagaaata gcactcagtt attctgctgg tgcacttgcc tgttgtatgg gcctcatata 420
caacaggatg ggggctgtga ccactgaagt ggcatttggc ctggtatgcg caacctgtga 480
acagattgct gactcccagc atcggtctca taggcaaatg gtgacaacaa ccaatccact 540
aatcagacat gagaacagaa tggttctagc cagcactaca gctaaggcta tggagcaaat 600
ggctggatcg agtgagcaag cagcagaggc catggatatt gctagtcagg ccaggcaaat 660
ggtgcaggcg atgagaaccg ttgggactca tcctagctcc agtgctggtc taaaagatga 720
tcttcttgaa aatttacagg cctatcagaa acgaatgggg gtgcagatgc aacg 774
<210> 50
<211> 662
<212> DNA
<213> B型流感病毒(Influenza B virus)
<400> 50
cccctcaaca ccagagaggt gccttgatga catagaggaa gaaccagagg atgttgatgg 60
cccaactgaa atagtattaa gggacatgaa caacaaagat gcaaggcaaa agataaagga 120
ggaagtaaac actcagaaag aagggaagtt ccgtttgaca ataaaaaggg atatgcgtaa 180
tgtattgtcc ttgagagtgt tggtaaatgg aacattcctc aaacacccca atggatacaa 240
gtccttatca actctgcata gattgaatgc atatgaccag agtggaaggc ttgttgctaa 300
acttgttgcc actgatgatc ttacagtgga ggatgaagaa gatggccatc ggatcctcaa 360
ctcactcttc gagcgtctca atgaaggaca ttcaaagcca attcgagcag ctgaaactgc 420
ggtgggagtc ttatcccaat ttggtcaaga gcaccgatta tcaccagaag agggagacaa 480
ttagattggt cacggaagaa ctttatcttt taagtaaaag aattgatgat aacatactat 540
tccacaaaac aatgatagct aacagctcca taatagctga catggttgta tcattatcat 600
tattagaaac attgtatgaa atgaaggatg tggttgaagt gtacagcagg cagtgcttgt 660
ga 662
<210> 51
<211> 782
<212> DNA
<213> 新型冠状病毒(Coronavirus)
<400> 51
gcaatcctgc taacaatgct gcaatcgtgc tacaacttcc tcaaggaaca acattgccaa 60
aaggcttcta cgcagaaggg agcagaggcg gcagtcaagc ctcttctcgt tcctcatcac 120
gtagtcgcaa cagttcaaga aattcaactc caggcagcag taggggaact tctcctgcta 180
gaatggctgg caatggcggt gatgctgctc ttgctttgct gctgcttgac agattgaacc 240
agcttgagag caaaatgtct ggtaaaggcc aacaacaaca aggccaaact gtcactaaga 300
aatctgctgc tgaggcttct aagaagcctc ggcaaaaacg tactgccact aaagcataca 360
atgtaacaca agctttcggc agacgtggtc cagaacaaac ccaaggaaat tttggggacc 420
aggaactaat cagacaagga actgattaca aacattggcc gcaaattgca caatttgccc 480
ccagcgcttc agcgttcttc ggaatgtcgc gcattggcat ggaagtcaca ccttcgggaa 540
cgtggttgac ctacacaggt gccatcaaat tggatgacaa agatccaaat ttcaaagatc 600
aagtcatttt gctgaataag catattgacg catacaaaac attcccacca acagagccta 660
aaaaggacaa aaagaagaag gctgatgaaa ctcaagcctt accgcagaga cagaagaaac 720
agcaaactgt gactcttctt cctgctgcag atttggatga tttctccaaa caattgcaac 780
aa 782
<210> 52
<211> 733
<212> DNA
<213> 人源性内参片段
<400> 52
gctacacaac taacgctttc cccaaagagt acatccccac cgtgttcgac aattacagcg 60
cgcagagcgc agttgacggg cgcacagtga acctgaacct gtgggacact gcgggccagg 120
aggagtatga ccgcctccgt acactctcct accctcagac caacgttttc gtcatctgtt 180
tctccattgc cagtccgccg tcctatgaga acgtgcggca caagtggcat ccagaggtgt 240
gccaccactg ccctgatgtg cccatcctgc tggtgggcac caagaaggac ctgagagccc 300
agcctgacac cctacggcgc ctcaaggagc agggccaggc gcccatcaca ccgcagcagg 360
gccaggcact ggccaagcag atccacgctg tgcgctacct cgaatgctca gccctgcaac 420
aggatggtgt caaggaagtg ttcgccgagg ctgtccgggc tgtgctcaac cccacgccga 480
tcaagcgtgg gcggtcctgc atcctcttgt gaccctggca cttggcttgg aggctgcccc 540
tgccctcccc ccaccagttg tgccttggtg ccttgtccgc ctcagctgtg ccttaaggac 600
taattctggc acccctttcc agggggttcc ctgaatgcct ttttctctga gtgccttttt 660
ctccttaagg aggcctgcag agaaaggggc tttgggctct gcccccctct gcttgggaac 720
actgggtatt ctc 733

Claims (9)

1.一种快速检测甲型流感、乙型流感和新型冠状病毒的多重引物，其特征在于，包括：甲型流感病毒M基因、乙型流感病毒NS基因、新型冠状病毒N基因以及人源性内参基因的特异性引物对和特异性探针；
所述甲型流感病毒M基因特异性引物对为：
正向引物：5’-ACTTGAAGATGTCTTTGCAGGGA-3’(SEQ ID NO.1)；
反向引物：5’-TGGGCACGGTGAGCGTGAACA-3’(SEQ ID NO.2)；
所述甲型流感病毒M基因特异性探针为：
5’-ACACCGATCTTGAGGTTCTCATGGAAT-3’(SEQ ID NO.3)；
所述乙型流感病毒NS基因特异性引物对为：
正向引物：5’-CACTGATGATCTTACAGTGGAG-3’(SEQ ID NO.4)；
反向引物：5’-ACCGCAGTTTCAGCTGCTCG-3’(SEQ ID NO.5)；
所述乙型流感病毒NS基因特异性探针为：
5’-ATGAAGAAGATGGCCATCGGATCCTCAAC-3’(SEQ ID NO.6)；
所述新型冠状病毒N基因特异性引物对为：
正向引物：5’-ACGTGGTCCAGAACAAACCCA-3’(SEQ ID NO.7)；
反向引物：5’-GAACGCTGAAGCGCTGGG-3’(SEQ ID NO.8)；
所述新型冠状病毒N基因特异性探针为：
5’-ACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACTGA-3’(SEQ ID NO.9)；
所述人源性内参基因特异性引物对为：
正向引物：5’-GCCACCACTGCCCTGATGTGC-3’(SEQ ID NO.10)；
反向引物：5’-GCCCTGCTGCGGTGTGATGGG-3’(SEQ ID NO.11)；
所述人源性内参基因特异性探针为：
5’-ATCCTGCTGGTGGGCACCAAGAAGGAC-3’(SEQ ID NO.12)。
2.根据权利要求1所述的多重引物，其特征在于，所述甲型流感病毒M基因特异性探针在5’端标记FAM荧光基团，在3’端标记BHQ1淬灭基团；
所述乙型流感病毒NS基因特异性探针在5’端标记HEX荧光基团，在3’端标记BHQ1淬灭基团；
所述新型冠状病毒N基因特异性探针在5’端标记Texas Red荧光基团，在3’端标记BHQ2淬灭基团；
所述人源性内参基因特异性探针在5’端标记CY5荧光基团，在3’端标记BHQ2淬灭基团。
3.权利要求1或2所述的快速检测甲型流感、乙型流感和新型冠状病毒的多重引物在制备特异性多重检测甲型流感病毒、乙型流感病毒和新型冠状病毒试剂中的应用。
4.一种用于检测甲型流感、乙型流感和新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，包括试剂Ⅰ和试剂Ⅱ；所述试剂Ⅰ包括Taq聚合酶、MgCl2、dNTPs和权利要求1或2所述的多重引物；所述试剂Ⅱ为快速逆转录酶。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂Ⅰ中，Taq聚合酶的浓度为0.03～0.05U/μL，MgCl2的浓度为4～5mM，dNTPs的浓度为0.15～0.25mM，所述甲型流感病毒M基因特异性引物对、乙型流感病毒NS基因特异性引物对、新型冠状病毒N基因特异性引物对、人源性内参基因特异性引物对的浓度均为0.3～0.5μM，所述甲型流感病毒M基因特异性探针、乙型流感病毒NS基因特异性探针、新型冠状病毒N基因特异性探针、人源性内参基因特异性探针的浓度均为0.1～0.3μM。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂Ⅱ为冻干形态的快速逆转录酶，所述冻干形态的快速逆转录酶的总量为1400～1600U。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品，所述阴性质控品为生理盐水，所述阳性质控品为包括甲型流感病毒M基因目的片段的假病毒、乙型流感病毒NS基因目的片段的假病毒、新型冠状病毒N基因目的片段的假病毒和人源性内参基因目的片段。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述假病毒的浓度为1.0×102～1.0×104copies/μL。
9.根据权利要求4～8任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的PCR扩增条件为：50℃反转录3min，95℃2min，60℃退火，热对流PCR反应50个循环。
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