CN113215317A

CN113215317A - 牛结节性皮肤病病毒野毒株的微滴数字pcr检测引物、探针、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN113215317A
Application number: CN202110534923.5A
Authority: CN
Inventors: 曹立辉
Original assignee: Guangzhou Yoyoung Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Yoyoung Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-05-17
Filing date: 2021-05-17
Publication date: 2021-08-06

Abstract

本发明公开了一种牛结节性皮肤病病毒野毒株的微滴数字PCR检测引物、探针、试剂盒及其应用，本发明通过设计筛选得了用于鉴定牛结节性皮肤病病毒野毒的引物探针组，进一步的摸索了引物和探针的浓度，找到了最适的引物和探针的工作浓度，以提高ddPCR的扩增效率。本发明还提供了具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、可实现精确定量的微滴式数字化PCR试剂盒，用于牛结节性皮肤病病毒野毒的检测，可直接定量，无需标准曲线、操作简便、结果准确可靠，特别适合现场检测。对于牛结节性皮肤病病毒野毒的防控具有重大的应用价值，有助于从源头控制疫情、有效预防牛结节性皮肤病病毒的大规模爆发。

Description

牛结节性皮肤病病毒野毒株的微滴数字PCR检测引物、探针、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于动物病毒分子生物学检测方法领域，具体涉及一种牛结节性皮肤病病毒野毒株的微滴数字PCR检测引物、探针及其应用。

背景技术

牛结节性皮肤病(lumpy skin disease，LSD)是由痘病毒科(Poxviridae)、山羊痘病毒属(Capripoxvirus，CaPV)的牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus，LSDV)引起的，以患牛发热、皮肤、黏膜、器官表面广泛性结节、淋巴结肿大、皮肤水肿为特征的传染病，世界动物卫生组织(OIE)将该病列为必须通报的疫病，我国暂对其按二类动物疫病进行管理，并采取相应防控措施。

该病自然感染潜伏期2～5周，通常为7d。病牛体温升高，可达41℃以上，呈持续稽留热型。初期表现为鼻炎、结膜炎、角膜炎。感染后第4～12天体表皮肤出现硬实圆形隆起结节，直径1～5cm，触摸有痛感，尤其在头部、颈部、胸部、会阴、乳房和四肢部位明显。泌乳牛可发生乳房炎，泌乳量下降，孕牛发生流产，公牛病后不育，肉牛生产性能下降，皮张无法利用。另外，该病主要通过病畜及其畜产品的直接接触传播，也可以通过媒介生物和各种载体的携带而间接传播，且具有一定的季节性。在品种、公母和年龄大小方面无明显的易感性差别。根据这些流行病学、临床症状和病理变化特征可以进行初步诊断，但确诊需要进一步进行实验室病原学和血清学技术检测。

目前，我国对LSD的诊断技术研究较少，只是在1978年采用病毒分离、电镜观察、动物接种等方法对我国首例LSDV感染病例进行了报道。在诊断方法上，我国重点对与LSDV同属的GTPV和SPPV进行了研究，己建立了检测山羊痘病毒、绵羊痘病毒P32基因的PCR方法和重组抗原的间接ELISA方法。由于山羊痘病毒属由山羊痘、绵羊痘和结节性皮肤病病毒3个种组成，其基因组保守程度高达96～97％，这为开发高特异性、高敏感性诊断检测方法带来了困难，也更加凸显了研发不同类型诊断技术方法的重要性和紧迫性。

数字化PCR(DigitalPCR，dPCR)的概念早在1999年就由BertVogelstein采用并发表相关文献，其初衷是为了能够从临床样品(如尿液、淋巴液、血浆、粪便等)大量的正常体细胞中检测出微量的突变细胞，但由于当时能用于稀释样品的耗材只是384孔板，因此还不能非常好地体现数字PCR的核心理念——“无限稀释”(terminaldilution)。Bio-Rad公司的QX200系统核心的微滴化技术能够将一份样品分成20,000个纳升级的微滴，本质上将传统定量PCR的一个test变成20,000个test，大大提高了核酸序列检测的灵敏度和精准度，是对“无限稀释”这一概念的完美演绎，其方法原理可称为微滴式数字化PCR(DropletDigitalPCR，ddPCR)。QX200ddPCR系统包括两台仪器：微滴发生器和微滴分析仪，及其相关的耗材。微滴发生器将每个样品分成20,000个均匀的纳升级微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。每个微滴都作为一个独立的PCR反应器。随后微滴转移至96孔PCR板上，开展终点PCR扩增。采用微滴分析仪(dropletreader)逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。与传统的定量PCR相比，数字PCR的精确度和灵敏度更佳。利用微滴式数字PCR技术，研究人员可以检测稀有突变，精确测定拷贝数变异，并对基因表达进行绝对定量。凭借QX200系统的高灵敏度，研究人员如今可检测浓度低至1/1,000,000的靶分子。

目前针对牛结节性皮肤病病毒野毒株尚没有理想的微滴数字PCR检测方法，因此需要提供一种牛结节性皮肤病病毒野毒株微滴数字PCR检测引物、探针及其应用以解决现有技术的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种针对牛结节性皮肤病病毒野毒株的微滴数字PCR检测引物、探针、试剂盒及应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种引物，所述引物用于检测牛结节性皮肤病病毒野毒株，所述引物的核苷酸序列为：

LSDV-F：5’-ATTTAATTTGGGAYGATAACAACG-3’(SEQ ID NO:1)；

LSDV-R：5’-ACAACTCAAATCGTTAGGYGGT-3’(SEQ ID NO:2)。

本发明的第二个方面，提供一种探针，所述探针用于检测牛结节性皮肤病病毒野毒株，所述探针的核苷酸序列为：

LSDV-P：5’-TATGATTTACCACCTAATGATAGTGT-3’(SEQ ID NO:3)。

在本发明的一些实施方式中，所述探针5′端标记荧光发射基团，3′端标记淬灭基团。

在本发明的一些实施方式中，所述荧光发射基团选自FAM、HEX、TET、NED、ROX、CY5、CY3、Texas Red、TFAM、SYBR Green I、VIC或JOE中的任一种；所淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、Dabcyl、Eclipse或NFQ-MGB中的任一种。

在本发明的一些优选实施方式中，所述荧光发射基团为FAM；所述淬灭基团为BHQ1。

本发明的第三个方面，提供一种检测试剂，所述检测含有本发明第一个方面所述的引物和/或本发明第二个方面所述的探针。

本发明的第四个方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含本发明第三个方面所述的检测试剂。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒中上游引物、下游引物、探针以预混液的形式包装于所述试剂盒中。

在本发明的一些实施方式中个，所述试剂盒中包含：预混液、微滴发生油、阴性对照、阳性对照。

在本发明的一些实施方式中，所述预混液包括：ddPCR Supermix for probes、上游引物、下游引物、探针。

进一步地，本发明还提供本发明第一个方面所述引物或本发明第二个方面所述探针或本发明第三个方面所述检测试剂或本发明第四个方面所述试剂盒在检测牛结节性皮肤病病毒野毒株中的应用。

本发明还提供一种检测牛结节性皮肤病病毒野毒株的方法，其特征在于，包含以下步骤：

(1)提取待测样品的DNA；

(2)以步骤(1)的DNA为模板，利用本发明第一个方面所述引物和本发明第二个方面所述探针或本发明第三个方面所述组合物或本发明第四个方面所述试剂盒进行微滴数字PCR检测判定检测结果。

在本发明的一些实施方式中，步骤(2)所述微滴数字PCR扩增的条件为：95℃预变性10min；94℃变性30sec、55～58℃退火60sec，共40个循环；98℃10min。

在本发明的一些优选实施方式中，步骤(2)所述微滴数字PCR扩增的条件为：95℃预变性10min；94℃变性30sec、56℃退火60sec，共40个循环；98℃10min。

在本发明的一些优选实施方式中，所述微滴数字PCR扩增的条件中升降温速度设置为2℃/sec。

在本发明的一些实施方式中，所述微滴数字PCR的反应体系为：10μL 2×ddPCRSupermix for Probes、1.8μL 10μM上游引物、1.8μL 10μM下游引物、0.5μL 10μM探针、2μLDNA模板，加水至20μL。

在本发明的一些实施方式中，步骤(2)所述检测结果的判定标准为：如果待测样品的荧光基团的检测结果为阳性、待测样品含有牛结节性皮肤病病毒野毒，如果待测样品的荧光基团的检测结果为阴性、待测样品不含有牛结节性皮肤病病毒野毒。

在本发明的一些优选实施方式中，所待测样品中含有牛结节性皮肤病病毒野毒，可进一步根据牛结节性皮肤病病毒野毒阳性微滴的数量得到待测样品中牛结节性皮肤病病毒野毒的含量。

在本发明的一些实施方式中，所述微滴数字PCR为一步法数字PCR。

在本发明的一些实施方式中，所述待测样品为血液、皮肤、唾液、鼻拭子、病变皮肤或结痂样品。

本发明的有益效果是：

本发明设计筛选得了用于鉴定牛结节性皮肤病病毒野毒的最佳引物探针组，进一步的摸索了引物和探针的浓度，找到了最适的引物和探针的工作浓度，以提高ddPCR的扩增效率。本发明还提供了具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、可实现精确定量的微滴式数字化PCR试剂盒，用于牛结节性皮肤病病毒野毒的检测，可直接定量，无需标准曲线、操作简便、结果准确可靠，特别适合现场检测。对于牛结节性皮肤病病毒野毒的防控具有重大的应用价值，有助于从源头控制疫情、有效预防牛结节性皮肤病病毒的大规模爆发。

附图说明

图1为牛结节性皮肤皮病毒野毒的探针序列与山羊痘、绵羊痘序列对比图。

图2为牛结节性皮肤病病毒微滴数字PCR退火温度的优化图。从左到右依次是：60℃、59℃、58℃、57℃、56℃、55℃。

图3为牛结节性皮肤病病毒微滴数字PCR引物浓度的优化图。从左到右依次是：体系1、体系2、体系3、体系4。

图4为牛结节性皮肤病病毒微滴数字PCR探针浓度的优化图。从左到右依次是：体系5、体系6、体系7、体系8。

图5为微滴数字PCR扩增不同浓度模板的微滴散点图。从左到右对应的依次是：阴性对照、质粒8：1×10^-8ng/μL、质粒7：1×10^-7ng/μL、质粒6：1×10^-6ng/μL、质粒5：1×10^-5ng/μL。

图6为实施例3中试剂盒的特异性检测图。从左到右对应依次是：阴性对照、山羊痘病毒、绵羊痘病毒、牛痘病毒和猪痘病毒、牛结节性皮肤病病毒及阳性对照。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

数字PCR均采用Bio-Rad La boratories,Inc.的QX200Droplet Digital PCR系统，包括两个仪器：QX200微滴生成仪和QX200微滴分析仪。热封仪为PX1TMPCR热封仪，微滴发生卡为DG8TM微滴发生卡(8×3)，底座为发生卡底座，微滴发生油为微滴发生油(用于探针)，以及2×ddPCR Supermix for Probes均购自Bio-Rad Laboratories,Inc.。

实施例1引物与探针的设计及阳性质粒的构建

1、引物与探针的设计

本实施例通过对LSDV野毒株基因的DNA序列与疫苗株及山羊痘和绵羊痘的基因序列进行分析比较，结果见图1，选定LSDV野毒株基因与疫苗株及山羊痘和绵羊痘的基因序列插入的26个碱基序列作为探针序列，其中，特异性引物由交付于广州艾基生物公司合成，探针交付于湖州河马生物公司合成。通过大量序列获取、分析、比对以及预实验，设计并初步筛选得到两条引物和一条探针，优选的特异性引物及探针的核苷酸序列如下：

上游引物：LSDV-F为：5’-ATTTAATTTGGGAYGATAACAACG-3’(SEQ ID NO:1)；

下游引物：LSDV-R为：5’-ACAACTCAAATCGTTAGGYGGT-3’(SEQ ID NO:2)；

探针：LSDV-P：5’-TATGATTTACCACCTAATGATAGTGT-3’(SEQ ID NO:3)。

LSDV-P的5’末端标记荧光基团FAM，3’末端标记荧光淬灭基团BHQ1。

2、阳性质粒的构建

LSDV阳性质粒交付于安徽通用有限公司合成，该阳性质粒中含有LSDV的基因片段序，将该基因片段构建至载体pEGM-T easy中，制备成LSDV阳性质粒。具体序列及载体信息如表1所示。

表1 LSDV阳性质粒构建的序列及载体信息

合成含有牛结节性皮肤病病毒野毒株的阳性片段质粒稀释不同梯度后作为模板，分别采用各个引物探针组进行实时荧光定量PCR。

qPCR的反应体系(20μL)：

10μL Probe qPCR Master Mix，10μM上游引物溶液1.8μL，10μM下游引物溶液1.8μL，10μM探针溶液0.5μL，模板2μL，余量为水。

qPCR的反应程序：95℃10min；95℃30s、58℃1min，40个循环。

实施例2数字PCR中相关反应参数的优化

(一)退火温度的优化

1、取合成的含牛结节病皮肤病病毒野毒株基因组DNA为模板，稀释至10^-7ng/μL。

2、以步骤1稀释的基因组DNA为模板，采用引物探针组LSDV-F/R/P进行数字PCR。

1)配制如下体系(20μL)：10μL 2×ddPCR Supermix for Probes，1.8μL LSDV-F，1.8μL LSDV-R，0.5μL LSDV-P，2μL模板，用RNase Free dH₂O补足20μL。体系中，引物探针的使用浓度均为10μM。

2)取微滴发生卡固定于底座上，中间一排的8个孔内每孔加入20μL步骤1)配制的体系，底部一排的8个孔内每孔加入70μL微滴发生油，然后将固定有微滴发生卡的底座放置于微滴生成仪中形成微滴(微滴生成于微滴发生卡顶部一排的8个孔内)。

3)取一个96孔板(命名为96孔板Ⅰ)，完成步骤2)后，从微滴发生卡顶部一排的8个孔中，每个孔取40μL，以一一对应的方式加入96孔板Ⅰ的8个孔中，用热封仪进行封膜。

4)将完成步骤3)的各个96孔板置于不同的PCR仪中，进行PCR扩增。PCR扩增程序：95℃预变性10min；95℃变性30sec、退火60sec，共40个循环；98℃10min。采用的升降温速度设置为2℃/sec。96孔板Ⅰ至96孔板Ⅵ所在的PCR仪，依次设置如下退火温度：55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃。

5)完成步骤4)后，取96孔板，在微滴分析仪中进行检测，显示蓝色荧光的微滴为牛结节性皮肤病病毒野毒阳性的微滴，结果见图2。

其中从图2可以看出，采用60℃的退火温度，每微升模板中，牛结节性皮肤病病毒野毒株的检测值为0copies。采用59℃的退火温度，每微升模板中，牛结节性皮肤病病毒野毒株的检测值为1.9copies。采用58℃的退火温度，每微升模板中，牛结节性皮肤病病毒野毒株的检测值为2.5copies。采用57℃的退火温度，每微升模板中，牛结节性皮肤病病毒野毒株的检测值为3.2copies。采用56℃的退火温度，每微升模板中，牛结节性皮肤病病毒野毒株的检测值为4.4copies。采用55℃的退火温度，每微升模板中，牛结节性皮肤病病毒野毒株为4.2copies。采用56℃的退火温度，扩增效率最高。结果表明，退火温度可以选择55～58℃，最优退火温度为56℃。

(二)引物、探针浓度优化

2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用引物探针组LSDV-F/R/P组成的引物组合进行数字PCR。

1)配制不同体系，先固定探针的量进行引物浓度的优化，筛选出最佳引物体系后再固定引物的量进行探针浓度的优化，具体见表2和表3，其中表格中的数字为各个组分的加入体积，单位为μL。

表2微滴数字PCR不同引物浓度体系

组份及体系	体系1	体系2	体系3	体系4
					LSDV-F	1.0	1.2	1.4	1.6
LSDV-R	1.0	1.2	1.4	1.6
					LSDV-P	0.5	0.5	0.5	0.5
2×ddPCR Supermix for probes	10	10	10	10
					RNAse Free dH<sub>2</sub>O	5.5	5.1	4.7	4.3
模板	2	2	2	2
					总体积	20	20	20	20

表3微滴数字PCR不同探针浓度体系

组份及体系	体系5	体系6	体系7	体系8
					LSDV-F	1.2	1.2	1.2	1.2
LSDV-R	1.2	1.2	1.2	1.2
					LSDV-P	0.5	0.6	0.7	0.8
2×ddPCR Supermix for probes	10	10	10	10
					RNAse Free dH<sub>2</sub>O	5.1	5.0	4.9	4.8
模板	2	2	2	2
					总体积	20	20	20	20

3)取96孔板，完成步骤2)后，从微滴发生卡顶部一排的8个孔中，每个孔取40μL，以一一对应的方式加入96孔板的8个孔中，用热封仪进行封膜。

4)将完成步骤3)的各个96孔板置于不同的PCR仪中，进行PCR扩增。

PCR扩增程序：95℃预变性10min；95℃变性30sec、56℃退火60sec，共40个循环；98℃10min。采用的升降温速度设置为2℃/sec。

5)完成步骤4)后，取96孔板，在微滴分析仪中进行检测，显示蓝色荧光的微滴为牛结节皮肤病野毒阳性的微滴。结果见图3和图4，其中图3为引物浓度的优化图，从左到右对应依次是：体系1、体系2、体系3、体系4。图4为探针浓度优化图，从左到右对应依次是：体系5、体系6、体系7、体系8。可以看出：

采用体系1，每微升模板中，牛结节皮肤病野毒的检测值为1.5copies。

采用体系2，每微升模板中，牛结节皮肤病野毒的检测值为1.6copies。

采用体系3，每微升模板中，牛结节皮肤病野毒的检测值为1.2copies。

采用体系4，每微升模板中，牛结节皮肤病野毒的检测值为1.4copies。

采用体系5，每微升模板中，牛结节皮肤病野毒的检测值为6.3copies。

采用体系6，每微升模板中，牛结节皮肤病野毒的检测值为1.6copies。

采用体系7，每微升模板中，牛结节皮肤病野毒的检测值为1.3copies。

采用体系8，每微升模板中，牛结节皮肤病野毒的检测值为4copies。

结果表明，反应体系中，扩增效果最好的是体系5，最优的引物探针量为：LSDV-F1.2μL、LSDV-R 1.2μL、LSDV-P 0.5μL，引物探针使用浓度均为10μmoL/L。

(三)模板浓度的优化

将4μg LSDV阳性质粒加入40μL TE(Tris-EDTA buffer solution)进行溶解，用Nano Drop标定阳性质粒的浓度，再用TE将阳性质粒稀释至10ng/μL，再10倍稀释至1ng/μL，随后10倍依次稀释至如下浓度梯度，并记为相应的质粒：质粒1：1×10^-1ng/μL；质粒2：1×10^-2ng/μL；质粒3：1×10^-3ng/μL；质粒4：1×10^-4ng/μL；质粒5：1×10^-5ng/μL；质粒6：1×10^- ⁶ng/μL；质粒7：1×10^-7ng/μL；质粒8：1×10^-8ng/μL。

数字PCR阳性体系的数量不得超过总体系数量的80％，如果核酸的浓度过高，微滴不能满足泊松分布，定量的结果将显著偏离真实值，无法实现ddPCR的准确定量。当ddPCR样本浓度过高超过ddPCR的检测范围时，需要先对样本进行稀释再进行检测，ddPCR的检测范围时一般为1-10⁴copies/μL，根据片段大小3184bp及质粒浓度1ng/μL对应的拷贝数为2.9×10⁸copies/μL，所以分别将质粒稀释后的4种不同浓度的质粒(质粒5：1×10^-5ng/μL；质粒6：1×10^-6ng/μL；质粒7：1×10^-7ng/μL；质粒8：1×10^-8ng/μL)为模板，采用最佳的引物探针体系LSDV-F/R/P进行数字PCR检测，具体见表4，单位为μL。

表4微滴数字PCR不同模板浓度体系

4)将完成步骤3)的各个96孔板置于不同的PCR仪中，进行PCR扩增。PCR扩增程序：95℃预变性10min；95℃变性30sec、56℃退火60sec，共40个循环；98℃10min。采用的升降温速度设置为2℃/sec。

5)完成步骤4)后，取96孔板，在微滴分析仪中进行检测，显示蓝色荧光的微滴为牛结节性皮肤病病毒野毒阳性的微滴，结果见图5。

其中从图5可以看出：对牛结节性皮肤病病毒的最佳检测浓度为1×10^-8ng/μL～1×10^-6ng/μL。

实施例3试剂盒的制备

(一)各个试剂的配制

溶液A为一步法ddPCR探针法预混液。每900μL溶液A的组成如下：500μL 2×ddPCRSupermix for Probes，90μL LSDV-F溶液中上游引物的浓度为10μM，90μL溶液中LSDV-R的浓度为10μM，25μL LSDV-P溶液(LSDV-P溶液中LSDV-P的浓度为10μM/L)，195μLRNase FreedH₂O补足900μL。

溶液B为微滴发生油。

溶液C为阳性对照。溶液C的制备方法：合成含有牛结节性皮肤病毒野毒株的基因组DNA，使用Tris-EDTA缓冲液(pH8.0、0.01M)稀释，使其浓度为100个拷贝数/微升。

溶液D为阴性对照。溶液D为RNase Free dH₂O。

(二)微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒的组装

试剂盒组成如下：溶液A、溶液B、溶液C、溶液D，分别独立包装。

(三)试剂盒的使用方法

待测样品为血清，还可以为唾液、鼻拭子、病变皮肤或结痂样品等。

1、提取待测样品的DNA，将DNA或其稀释液作为模板溶液。待测样品为待测病毒时，提取基因组DNA。待测样品为待测血清、唾液/鼻拭子、病变皮肤或结痂样品时，提取总DNA。

2、取18μL溶液A，加入2μL模板溶液。用等体积溶液D代替模板溶液作为阴性对照处理。用等体积溶液C代替模板溶液作为阳性对照处理。

3、取微滴发生卡固定于底座上，中间一排的8个孔内每孔加入20μL步骤2配制的体系，底部一排的8个孔内每孔加入70μL溶液B，然后将固定有微滴发生卡的底座放置于微滴生成仪中形成微滴(微滴生成于微滴发生卡顶部一排的8个孔内)。

4、取96孔板，完成步骤3后，从微滴发生卡顶部一排的8个孔中，每个孔取40μL，以一一对应的方式加入96孔板的8个孔中，用热封仪进行封膜。

5、将完成步骤4的96孔板置于PCR仪中，进行PCR扩增。

PCR扩增程序：95℃预变性10min；94℃变性30sec、56℃退火60sec，共40个循环；98℃10min。采用的升降温速度设置为2℃/sec。

6、完成步骤5后，取96孔板，在微滴分析仪中进行检测，显示蓝色荧光的微滴为牛结节皮肤病野毒。

试验成立条件：每微升阳性对照中，牛结节皮肤病野毒的检测值为10000±100拷贝数；每微升阴性对照中，牛结节皮肤病野毒的检测值为0。

在阴性对照同时成立后：如果模板中检测到牛结节皮肤病野毒阳性的微滴，说明待测样品中含有牛结节皮肤病野毒，可根据阳性微滴数量得到牛结节皮肤病野毒的拷贝数；如果模板中没有检测到牛结节皮肤病野毒阳性的微滴，说明待测样品中不含有牛结节皮肤病野毒。

实施例4特异性实验

待测样品分别为牛结节性皮肤病病毒、山羊痘病毒、绵羊痘病毒、牛痘病毒和猪痘病毒，采用实施例3制备的试剂盒，按照试剂盒的使用方法进行检测。结果如图6所示。

从结果可以看出，可以检测到牛结节性皮肤病毒阳性的微滴，未检测到山羊痘病毒、绵羊痘病毒、牛痘病毒和猪痘病毒的阳性微滴。说明实施例3制备的试剂盒对牛结节性皮肤病病毒特异性。

上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州悦洋生物技术有限公司

<120> 牛结节性皮肤病病毒野毒株的微滴数字PCR检测引物、探针、试剂盒及其应

用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atttaatttg ggaygataac aacg 24

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acaactcaaa tcgttaggyg gt 22

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tatgatttac cacctaatga tagtgt 26

<210> 4

<211> 169

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gaaaatggat gtaccacaaa tacaggtgaa gaaaatttaa tttgggacga taacaacgtt 60

tatgatttac cacctaatga tagtgtttat gatttaccac ctaacgattt gagttgtaac 120

aacgattgtg tttatacatt accagatgac aatgtttcaa acatagagg 169

Claims

1.一种引物，所述引物用于检测牛结节性皮肤病病毒野毒株，所述引物的核苷酸序列为：

LSDV-F：5’-ATTTAATTTGGGAYGATAACAACG-3’(SEQ ID NO:1)；

LSDV-R：5’-ACAACTCAAATCGTTAGGYGGT-3’(SEQ ID NO:2)。

2.一种探针，所述探针用于检测牛结节性皮肤病病毒野毒株，所述探针的核苷酸序列为：

LSDV-P：5’-TATGATTTACCACCTAATGATAGTGT-3’(SEQ ID NO:3)。

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针的5’端标记荧光发射基团，3’端标记淬灭基团；

所述荧光发射基团选自FAM、HEX、TET、NED、ROX、CY5、CY3、Texas Red、TFAM、SYBR GreenI、VIC或JOE中的任一种，优选为FAM；

所淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、Dabcyl、Eclipse或NFQ-MGB中的任一种，优选为BHQ1。

4.一种检测试剂，含有权利要求1所述的引物和/或权利要求2～3任一项所述的探针。

5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求4所述的检测试剂。

6.权利要求1所述引物或权利要求2～3任一项所述探针或权利要求4所述检测试剂或权利要求5所述试剂盒在检测牛结节性皮肤病病毒野毒株中的应用。

7.一种检测牛结节性皮肤病病毒野毒株的方法，其特征在于，包含以下步骤：

(1)提取待测样品的DNA；

(2)以步骤(1)的DNA为模板，利用权利要求1所述引物和权利要求2～3任一项所述探针或权利要求4所述检测试剂或权利要求5所述试剂盒进行微滴数字PCR检测。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述微滴数字PCR扩增的条件为：95℃预变性10min；94℃变性30sec、55～58℃退火60sec，共40个循环；98℃10min。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述微滴数字PCR的反应体系为：10μL 2×ddPCR Supermix for Probes、1.8μL 10μM上游引物LSDV-F、1.8μL 10μM下游引物LSDV-R、0.5μL 10μM探针LSDV-P、2μL DNA模板，加水至20μL。

10.根据权利要求7～9任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述检测结果的判定标准为：

若待测样品的荧光基团的检测结果为阳性、待测样品含有牛结节性皮肤病病毒野毒，若待测样品的荧光基团的检测结果为阴性、待测样品不含有牛结节性皮肤病病毒野毒；

优选地若待测样品中含有牛结节性皮肤病病毒野毒，可进一步根据牛结节性皮肤病病毒野毒阳性微滴的数量得到待测样品中牛结节性皮肤病病毒野毒的含量。